JPWO2020075788A1

JPWO2020075788A1 - トリコデルマ・リーセイの変異株およびタンパク質の製造方法

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Publication number: JPWO2020075788A1
Application number: JP2019567763A
Authority: JP
Inventors: 雄介加川; 紳吾平松; 山田　勝成; 勝成山田
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2021-09-02
Also published as: US20210388410A1; BR112021006248A2; CN112805366A; WO2020075788A1

Abstract

本発明は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株であり、好ましくは、さらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに下記に示す変異を有する変異株に関し、当該変異株を用いて培養液中の培養液の粘度を低く保ちながらタンパク質、特にセルラーゼを生産することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、培養液の粘度を低く保つことができ、タンパク質の製造能が向上するトリコデルマ・リーセイの変異株および当該変異株を用いたタンパク質の製造方法に関する。

トリコデルマ・リーセイは、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、トリコデルマ・リーセイを用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。トリコデルマ・リーセイは、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導物質として、タンパク質の中でも特に糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する。セルラーゼ製造量を強化するため、古くよりセルラーゼ製造を制御する因子の過剰発現、欠損をはじめとする遺伝子の改変、培養条件の最適化などの検討が多々行われている。

一方で、トリコデルマ属菌は生育やタンパク質の製造に酸素を必須とする好気性糸状菌に属している。また、トリコデルマ属菌は液体培地で培養すると、増殖に伴い培養液の粘度が高まるという特徴を有している。培養液の粘度が高まると、酸素や栄養素の分布が不均一になるため、トリコデルマ属菌を培養する際には、培養液を撹拌したり、酸素供給量を増加させたりして培養中の溶存酸素飽和度の低下を防ぎ、一定以上に維持する必要がある。また、培養槽が大型化すると、酸素移動容量係数が低くなるため、培養中の溶存酸素飽和度を一定以上に保つためには、さらに撹拌数や酸素供給量を増やす必要がある。しかしながら、撹拌数を増やすと、菌体に大きなせん断ダメージを与えてしまうという課題があり、酸素供給量を増やすためにはより大きなエネルギーが必要になるという課題もある。

特許文献１から６では、それぞれトリコデルマ属菌のＳｆｂ３、Ｍｐｇ１、Ｇａｓ１、Ｓｅｂ１、Ｃｒｚ１およびＴｐｓ１のタンパク質の破壊または生成を減少させることにより、変異前の親株と比較して深部培養における好気性発酵時の溶存酸素量を低い撹拌数で維持することが可能になると開示されている。また、特許文献７には、トリコデルマ属菌のＢＸＬ１遺伝子を破壊すると、培養液の溶存酸素飽和度の低下を抑制することができると記載されている。

特表２０１３−５３３７５１号公報特表２０１４−５１３５２９号公報特表２０１４−５１３５３０号公報特表２０１４−５１３５３１号公報特表２０１４−５１３５３２号公報特表２０１４−５１３５３３号公報国際公開第２０１７／１７０９１７号

上記のとおり、トリコデルマ・リーセイを用いてタンパク質の製造をするにあたり、培養液中の溶存酸素濃度の低下を抑制し、一定以上に保つことは非常に重要である。本発明者らは、トリコデルマ・リーセイを用いた液体培養によるタンパク質の製造の際に、培養液の粘度を低く保つことができれば、培養スケールを大型化した場合でも、攪拌に必要なエネルギーを低減することができると共に、培養液中の溶存酸素飽和度の低下を抑制することもできると考えた。

そこで本発明では、培養液の粘度が低下するトリコデルマ・リーセイの変異株の取得および当該トリコデルマ・リーセイの変異株を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者は、培養液の粘度を低く保つことが可能となるトリコデルマ・リーセイの遺伝子を特定するために鋭意検討した結果、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株、好ましくはさらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに変異を有する変異株を培養することにより、培養液の粘度を低く保つことができるようになり、さらに培養液中の溶存酸素飽和度の低下を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１４）で構成される。
（１）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、トリコデルマ・リーセイの変異株。
（２）前記変異が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端側より１７９１番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン酸以外のアミノ酸残基への変異である、（１）に記載の変異株。
（３）さらに配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、（１）または（２）に記載の変異株。
（４）前記変異が、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１３７番目で翻訳が終了するストップコドン変異である、（３）に記載の変異株。
（５）さらに配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、（１）〜（４）のいずれかに記載の変異株。
（６）前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、（５）に記載の変異株。
（７）前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２９７番目のアスパラギン酸残基でのフレームシフト変異である、（５）または（６）に記載の変異株。
（８）さらに配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸配列に変異を有する、（１）〜（７）のいずれかに記載の変異株。
（９）前記変異が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおけるＮ末端側より１８４番目のセリン残基のセリン以外のアミノ酸残基への変異である、（８）に記載の変異株。
（１０）さらに配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、（１）〜（９）のいずれかに記載の変異株。
（１１）前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＦａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、（１０）に記載の変異株。
（１２）前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２５７番目のイソロイシン残基でのフレームシフト変異である、（１０）または（１１）に記載の変異株。
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。

本発明のトリコデルマ・リーセイの変異株は、変異導入前のトリコデルマ・リーセイ親株と比較して培養液の粘度を低く保つことが可能であり、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制することができる。さらに、タンパク質、特にセルラーゼの製造量も向上するという予想外の効果も得られる。

トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４−Ｈ株の培養液中の粘度（相対値）の経時的な推移トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４−Ｈ株の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４−Ｉ株の培養液中の粘度（相対値）の経時的な推移トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４−Ｉ株の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４−Ｊ株の培養液中の粘度（相対値）の経時的な推移トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４−Ｊ株の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移

本発明は、もともとタンパク質の製造能に優れる微生物であるトリコデルマ・リーセイの親株に変異を導入することによって、培養液の粘度を低く保つことができることを特徴としている。本発明で用いるトリコデルマ・リーセイの親株は野生株に制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良されたトリコデルマ・リーセイの変異株も親株として好ましく用いることができる。例えば、トリコデルマ・リーセイの変異株には、変異剤や紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の製造性が向上した変異株を上記親株として利用することができる。上記親株として用いる変異株の具体例は、トリコデルマ・リーセイの先祖にあたるトリコデルマ・パラリーセイ（ＡＴＣＣＭＹＡ−４７７７）、トリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ−８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１−３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８，８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１−４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ−３−７株、ＲｕｔＣ−３０株はＡＴＣＣ（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。

本発明は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株であり、好ましくは、さらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに下記に示す変異を有する変異株である。これら変異株については、本明細書中では、本発明の変異株と記載する場合がある。また、前記変異導入前の株については、本明細書中では親株と記載する場合がある。そして本発明の変異株は、親株と比較して、培養液の粘度が低下し、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制される。これにより、通気撹拌に必要なエネルギーや、回転数を低減させることができる。また、撹拌の回転数を低く設定できるため、菌糸への剪断ダメージを低減させることもできる。特に、大きなスケールでの培養の際には、通気に必要なブロワや撹拌モーターの容量、撹拌エネルギーの削減につながるためさらに効果的である。

以下、本発明の変異株が有する各ポリペプチドの変異について、具体的に説明する。

配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長４，３７３アミノ酸のポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つＤｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎ（ＥＧＲ５１７８７）としても登録されている。Ｄｙｎｅｉｎは、真核生物に見られるモータータンパク質の１種であり、ＡＴＰの加水分解により得られたエネルギーにより、マイクロチューブをはじめとする細胞骨格を構成する微小管上に沿って移動するタンパク質である。Ｄｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎは、Ｄｙｎｅｉｎを構成する重鎖であり、ダイニンの主な骨格を形成し、ＡＴＰの加水分解により得られたエネルギーを運動に変換する機能を担うタンパク質である（ＤＥｓｈｅｌ，Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｄｙｎｅｉｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｎｏｒｍａｌｎｕｃｌｅａｒｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｉｎｙｅａｓｔ，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ, Ｖｏｌｕｍｅ９０，１９９３，Ｉｓｓｕｅ２３，Ｐ１１１７２−１１１７６）。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が有する配列番号３で表される塩基配列が挙げられる。

配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損または低下させる方法としては、Ｄｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎの全欠損、Ｄｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎの一部欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。

Ｄｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎの欠損とは、そのポリペプチドが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には配列番号８で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＤｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。

Ｄｙｎｅｉｎｈｅａｖｙｃｈａｉｎを構成するアミノ酸配列に変異を有するとは、アミノ酸の欠失、置換、または付加のいずれであってもよい。好ましくは、配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１，７９１番目のアスパラギン酸残基の、アスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基への変異であり、変異後のアミノ酸残基は特に限定されないが、アスパラギンへ変異していることがより好ましい。配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１，７９１番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号３で表される塩基配列のうち、５，５４１番目の塩基であるグアニンがアデニンへの変異した配列が挙げられる。当該変異により、配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１，７９１番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸からアスパラギンへ変異する。

また、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても、当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。

配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。

配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長８６１アミノ酸のポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４４８９６）としても登録されている。Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎは、転写因子であるＧＡＬ４に内在するＤＮＡへ結合するＺｎ２Ｃｙｓ６モチーフからなる２つのヘリックスからなるモチーフを持つことから、ＤＮＡへ結合するタンパク質であり、転写因子の機能を有すると推定される。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイ配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。

配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎの全欠損、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎの一部欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。

Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎの欠損とは、そのポリペプチドが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。

ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣＤＤＳｅａｒｃｈＲｅｓｕｌｔｓによれば、Ｎ末端側から２７２〜３０７番目のアミノ酸残基はＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメイン、Ｎ末端側から３８８〜８０５番目のアミノ酸残基はｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎであると開示されており、これらのいずれかのドメイン内に位置するアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下させることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列において、４１１番目のグアニンがアデニンへ置換したことにより、ストップコドンが挿入される変異が挙げられ、当該変異により、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１３７番目で翻訳は終了し、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｂｉｎｕｃｌｅａｒＺｎｃｌｕｓｔｅｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎの機能を担うＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよびｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎを構成するアミノ酸配列が消失することから、本来のタンパク質としての機能は消失する。

また、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。

配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。

配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長１，１３８アミノ酸のポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４５９２６）としても登録されている。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から４６８〜７２１番目のアミノ酸残基はＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲＳ）、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＩ）−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインと開示されている。この記載により、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、リボヌクレアーゼと複合体を形成し、ＲＮＡの安定化などに関与すると推定される。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が有する配列番号２で表される塩基配列が挙げられる。

配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインの全欠損、Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインの一部欠損をさせるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には配列番号７表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。

Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインの欠損とは、そのドメインが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせことを指す。さらに具体的には、配列番号７で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。

配列番号７で表されるアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する具体例としては、配列番号２で表される塩基配列において、９８８番目にアデニンが１塩基挿入したことによるフレームシフト変異が挙げられる。当該変異により、配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２９７番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアルギニンへ置換し、以降フレームシフトの結果、Ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインを構成するアミノ酸配列は消失し、それにより、本来のタンパク質としての機能は欠損または低下する。

また、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させてもよく、具体的には配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。

配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。

配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長９３７アミノ酸のポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４８３６９）としても登録されている。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から７６〜１０８番目のアミノ酸残基は、転写因子であるＧＡＬ４が持つＤＮＡへ結合するＺｎ２Ｃｙｓ６モチーフからなる２つのヘリックスからなるドメインと、Ｎ末端側から３０３〜６８１番目のアミノ酸残基は、ｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインを有すると開示されている。この記載により、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも糸状菌の転写調節に関与していると推定される。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が有する配列番号４で表される塩基配列が挙げられる。

配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよび／またはｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの全欠損、ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよび／またはｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの一部欠損、ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインとの立体配置関係の変化、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損させるような変異を導入する方法が挙げられる。

ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよび／またはｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの欠損とは、そのドメインが全て無くなる、一部がなくなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には、配列番号９で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインまたはｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。

ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインとの立体配置関係の変化とは、ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインとの間に位置するアミノ酸配列において、アミノ酸の欠失、置換、または付加が起こる変異によって行われる。ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインやｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインは、タンパク質ドメインと呼ばれ、タンパク質ドメインはタンパク質の配列構造の一部を構成し、機能を持った存在である。ドメインが複数ある場合には、複数のドメインからなる立体構造がタンパク質の立体構造の一部を構成するため、ドメイン同士の立体配置が変化すると、タンパク質の立体構造が変化し、タンパク質の機能が低下する。

以上のように、ドメインのアミノ酸配列自体にアミノ酸の欠失、置換、または付加などの変異が起こらない場合でも、２つのドメインの間に位置するアミノ酸配列にアミノ酸の欠失、置換、または付加などの変異が起こることによって、タンパク質の機能が低下することが知られている。ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸は、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１０９〜３０２番目のアミノ酸配列の領域を指す。

ＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸配列に変異を有するとは、アミノ酸の欠失、置換または付加のいずれであってもよい。好ましくは、配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１８４番目のセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に変異していることが好ましく、変異後ののアミノ酸残基は特に限定されないが、アスパラギンへ変異していることが好ましい。配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１８４番目のセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号４で表される塩基配列のうち、５５０番目の塩基であるアデニンがシトシンへの変異した配列が挙げられる。当該変異により、配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１８４番目のアミノ酸残基がセリンからアルギニンへ変異する。

また、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても、当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。

配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が欠損または低下しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。

配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長３４２アミノ酸のポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ５３１４２）としても登録されている。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から１４７〜２６４番目のアミノ酸残基はＦａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインを有すると開示されている。この記載により、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ゼアキサンチン合成などに関与するβ−ｃａｒｏｔｅｎｅｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、Ｃ−５ｓｔｅｒｏｌｄｅｓａｔｕｒａｓｅ、Ｃ−４ｓｔｅｒｏｌｍｅｔｈｙｌｏｘｉｄａｓｅなどの機能を持つと推定される。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が有する配列番号５で表される塩基配列が挙げられる。

配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、Ｆａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインの全欠損、Ｆａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインの一部欠損、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。

Ｆａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインの欠損とは、そのドメインが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＦ−ｂｏｘドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。

Ｆａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメイン内に位置するアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号５で表される塩基配列において、７６９番目にグアニンが１塩基挿入したことによるフレームシフト変異が挙げられる。当該変異により、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２５７番目のアミノ酸がイソロイシンからアスパラギン酸へ置換し、以降フレームシフトの結果、Ｆａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインを構成するアミノ酸配列が短くなり、本来の機能は消失すると推測される。

その他、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。または欠損させることができる。

配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。

上記遺伝子への変異導入は、当業者にとって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、あるいはトランスポゾンによる変異など、既存の遺伝子変異方法を用いることができる。

本発明の変異株は、前述の通り配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株であり、好ましくは、さらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに前述の変異を有する変異株であるが、これら変異の組み合わせとしては以下の組み合わせが挙げられる。

配列番号８および６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８および７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、６および７およびで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、６および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、６および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、７および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、７および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、６、７および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、６、７および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、６、９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号８、７、９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

配列番号６〜１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。

前述の組み合わせの変異株は、当業者にとって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、あるいはトランスポゾンによる変異など、既存の遺伝子変異方法によって取得できるが、好ましくは、親株となるトリコデルマ・リーセイの胞子に対して、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、紫外線などを用いて遺伝子変異処理を行い、得られた変異株の遺伝子を解析して、上記の変異を有する変異株をスクリーニングすることで取得できる。

本発明の変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、培養液の粘度が低下し、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制することができる。これにより、通期撹拌に必要なエネルギーや、回転数を低減させることができる。また、撹拌の回転数を低く設定できるため、菌糸への剪断ダメージを低減させることもできる。特に、大きなスケールでの培養の際には、通気に必要なブロワや撹拌モーターの容量、撹拌エネルギーの削減に繋がるため、更に効果的である。更には、本発明の変異株は、当該変異導入前と親株と比較して、タンパク質の製造能が向上するため、本発明の変異株の培養液は、同一の培養条件にて得られた当該変異導入前の親株の培養液と比較して、タンパク質濃度が増加する。また、タンパク質が酵素の場合には、酵素の比活性が増加する。ここで、タンパク質濃度の増加率や酵素の比活性の増加率は、増加していれば特に限定されないが、２０％以上であることが好ましい。

本発明において、培養液の粘度は以下の条件で測定した値を用い、粘度の比較は以下の条件で測定した値のうち最大値同士を比較する。まず、評価対象とするトリコデルマ・リーセイの変異株と親株の胞子を前培養培地１ｍＬあたり１．０×１０^５胞子となるよう前培養培地（具体的な培地組成の一例は、実施例中の表１のとおり。）へ接種し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて菌体量が１１ｇ／Ｌ前後になるまで培養を行う。次に、１００ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）になるようＡｒｂｏｃｅｌＢ８００（レッテンマイヤー社製）を添加した表２で示した本培養培地に対し、１０％（ｖ／ｖ）になるよう前培養培地を接種させ、５Ｌジャーファーメンターを用い、深部培養を行う。培養液の粘度の測定は、デジタル回転粘度計を用いる。デジタル回転粘度計は、予め０点校正を行う。培養開始から、１７、２４、４１、４８、６５、７２、８９、１１１時間後、または、培養開始から、２４、４８、７１、８９、１１３、１３７時間後の採取直後の培養液をそれぞれ指定の容器に１６ｍＬ採取し、培養液にスピンドルを浸して０．３ｒｐｍの回転数にて回転させ、この時のスピンドルに働く粘性抵抗であるトルクを室温条件下にて測定することにより、培養液の粘度を測定する。粘度の単位は、センチポアズ（ｃＰ）とする。１ポアズは、流体内に１ｃｍにつき１ｃｍ／秒の速度勾配があるとき、その速度勾配の方向に垂直な面において速度の方向１ｃｍ^２につき１ダインの力の大きさの応力が生ずる粘度と定義される。デジタル回転粘度計には、ＤＶ２Ｔ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）、スピンドルには、ＵＬＡＤＡＰＴＯＲ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）などを用いることができる。

本発明のトリコデルマ・リーセイの変異株は、当該変異導入前の親株を同様の条件で培養した場合と比較すると、培養液の粘度が低くなり、培養中の粘度の最大値が、好ましくは８０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは６０％以上、最も好ましくは、５０％以上低くなる。また、絶対値では、本発明の変異株の培養中の粘度の最大値が、親株と比べて、好ましくは１００ｃＰ以上、より好ましくは２００ｃＰ以上、より好ましくは４００ｃＰ以上、より好ましくは５００ｃＰ以上、さらに好ましくは６００ｃＰ以上、さらに好ましくは７００ｃＰ以上、さらに好ましくは８００ｃＰ以上、さらに好ましくは９００ｃＰ以上、特に好ましくは１，０００ｃＰ以上低くなる。

培養液中の溶存酸素飽和度は、培養液中の酸素利用速度を測定することによって算出することができる。本発明における酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）は、培養開始後２４時間後の単位時間当たりの培養液１Ｌ当たりの酸素消費速度のことを指す。具体的な算出方法は、培養条件を一定に保って培養を行い、培養開始後２４時間時点で酸素の供給を止め、溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）の値（ＤＯ値）を１０秒間ごとにプロットし、その曲線の中で対数的に減少している３点以上のプロットについて、その傾き（Ａ）（単位；ＤＯ／ｓｅｃ）を求める。酸素利用速度の算出には式は以下に示す式１を用いる。

酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）＝（−Ａ）×（１／３２）×６０×６０・・・（式１）。

ＤＯ値の測定には市販のＤＯ計を使用することができる。使用するＤＯ計には特に制限はなく、ＤＯ値を正確に測定できるものであれば良い。例として、密閉型ＤＯ電極（エイブル株式会社製）や溶存酸素センサー（メトラー・トレド株式会社製）などが挙げられる。ＤＯ計は予め０点校正とスパン校正を行っておく。０点校正は亜硫酸ソーダ２％溶液を使用して行う。スパン校正は実際に培養する条件において菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が飽和になるまで待ち、その後計器の指示値が安定していることを確認し、その温度での飽和溶存酸素に合わせて校正を行う。また、培養槽を加圧してＤＯ測定を行う際は、圧補正を行う必要がある。さらに、培養槽が大きい場合は静水圧補正を行う必要がある。補正を行う際には、以下に示す式２を用いて算出する。

Ｄ＝ＤＯ（１＋α＋β）・・・（式２）
Ｄ：補正した飽和溶存酸素
ＤＯ：１気圧、純水中での飽和溶存酸素
α：ゲージ圧（ｋｇ／ｃｍ^２）
β：静水圧（ＤＯ計取り付け位置の液深（ｍ）／１０）。

溶存酸素飽和度は、菌を含まない培地を用いてｐＨや温度を培養条件に設定し、空気を通気した際の溶存酸素の飽和状態を１００％とした場合の、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出する。溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）は、水中に溶解している酸素の濃度を表す。飽和溶存酸素とは、実際に培養を行なう培養条件において、菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が一定になった状態での溶存酸素のことを指す。また、溶存酸素飽和度を算出する際は、培養期間中に通気条件など培養条件を変化させることはしないこととする。酸素要求性が低下すると、溶存酸素飽和度は増加する。溶存酸素飽和度は以下の式３に従って算出する。

溶存酸素飽和度（％）＝（培養中の溶存酸素）／（培養開始前の飽和溶存酸素）×１００・・・（式３）。

溶存酸素飽和度を比較する場合には、最小値同士を比較する。

酸素利用速度や、溶存酸素飽和度を比較する場合には、培地、酸素供給量、撹拌速度、温度、培養容量、植菌量などの培養条件を揃えて測定した結果を用いる。測定の際の植菌量は本培養液に対し、１０％（ｖ／ｖ）程度が好ましい。

本発明の変異株と、親株の溶存酸素を同様の条件で培養すると、変異株は、親株に比べて溶存酸素飽和度の最小値が高くなり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは６％以上、さらに好ましくは７％以上、さらに好ましくは８％以上、さらに好ましくは９％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１１％以上、さらに好ましくは１２％以上、さらに好ましくは１３％以上、さらに好ましくは１４％以上、特に好ましくは１５％以上高くなる。

本発明の変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、増殖能が低下しないことが好ましい。増殖能の差は菌体量を測定することで比較することができる。菌体量は、乾燥菌体重量として測定する。培養液１０ｍＬを定性ろ紙（グレード４、ＧＥヘルスケア社）を用いて吸引ろ過し、残渣をろ紙ごと一緒に１００℃にて乾燥させる。そして、重量を測定し、ろ過前後のろ紙の重量差を乾燥菌体重量とする。

本発明の変異株は、前述の変異以外にも、タンパク質製造量の向上および／または培養液の粘度が低下し培養液中の溶存酸素飽和度の低下が抑制される変異を有していてもよい。具体的には、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２２、２４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異が挙げられる。

配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ５０６５４として登録されている。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から９５〜２７７番目のアミノ酸残基はＭｉｄｄｌｅｄｏｍａｉｎｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ４Ｇドメイン（以降ＭＩＦ４Ｇドメインと記載する。）、Ｎ末端側から３８０番目〜４８５番目のアミノ酸残基はＭＡ−３ドメインを有すると開示されている。ＭＩＦ４ＧおよびＭＡ−３の両ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する機能を有することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，１２２６５−１２２７２（２００５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，１４７−１５６（２００７））。これらの記載により配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくともＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合する機能を有すると推定される。

配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１２で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ５０６５４の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ５０６５４が有するＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ−３ドメインの全欠損、ＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ−３ドメインの一部欠損、ＭＩＦ４ＧドメインとＭＡ−３ドメインとの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１２で表される塩基配列において、１，０３９番目から１，０４４番目のいずれかの塩基が欠失する変異が挙げられる。

配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。

配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４４４１９として登録されている。配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から２６番目〜４９９番目のアミノ酸残基は「Ｓｕｇａｒ（ａｎｄｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインを有すると開示されている。この記載により配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも菌体の内側と外側の間における糖の輸送に関与していると推定される。

配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１４で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４４４１９の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４４４１９が有するＳｕｇａｒ（ａｎｄｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの全欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの一部欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄｏｔｈｅｒ）Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１４で表される塩基配列において、１，４１５番目に１１塩基が挿入する変異が挙げられる。

配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性およびβ−グルコシダーゼの比活性が向上する。

配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｂｅｔａ−ａｄａｐｔｉｎｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔのＥＧＲ４８９１０として登録されている。配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、真核生物に広く保存されているクラスリンと結合する細胞内外や菌体内外の輸送に関与する小胞を構成するアダプタープロテインを構成するタンパク質のひとつである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０１,１４１０８−１４１１３（２００４））。

配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１６で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４８９１０の遺伝子変異とは、配列番号１６で表される塩基配列において、１，０８０番目の塩基であるシトシンがアデニンへの変異が挙げられる。

配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有することにより、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有さないトリコデルマ・リーセイと比較し、液体培養時の培養液の粘性が低下する。

配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４５８２８として登録されている。配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から８６番目〜１８６番目のアミノ酸残基はｈｅａｔｓｈｏｃｋｆａｃｔｏｒ（ＨＳＦ）−ｔｙｐｅＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインと開示されている。ＨＳＦ−ｔｙｐｅＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインは、ヒートショックプロテインの発現を制御する転写因子であるＨＳＦをコードする遺伝子の上流域に結合する機能を有することが知られている（Ｃｅｌｌ，６５（３），３６３−３６６（１９９１））。

配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１８で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４５８２８の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４５８２８が有するＨＳＦ−ｔｙｐｅＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインの全欠損、ＨＳＦ−ｔｙｐｅＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインの一部欠損、ＨＳＦ−ｔｙｐｅＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させることができる。配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１８で表される塩基配列において、８５番目にグアニン１塩基が挿入するフレームシフトを引き起こす変異が挙げられる。

配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。

配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４７１５５）としても登録されている。配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から３６２番目〜５５３番目のアミノ酸残基はＴＬＤドメインと開示されている。ＴＬＤドメインは機能未知である。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２０で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４７１５５の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４７１５５が有するＴＬＤドメインの全欠損、ＴＬＤドメインの一部欠損、ＴＬＤドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号２０で表される塩基配列において、６番目に配列番号２１で表される４６塩基が挿入するフレームシフト変異が挙げられる。

配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。

配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４８０５６）としても登録されている。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｔｒｉｅｖａｌＴｏｏｌによれば、Ｎ末端側から１３０番目〜１７２番目のアミノ酸残基はＦ−ｂｏｘドメインと開示されている。Ｆ−ｂｏｘドメインは、細胞周期を制御するタンパク質内に見られるドメインであることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５，２４１７−２４２２（１９９８））。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２３で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４８０５６の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４８０５６が有するＦ−ｂｏｘドメインの全欠損、Ｆ−ｂｏｘドメインの一部欠損、Ｆ−ｂｏｘドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号２３で表される塩基配列において、４９９番目のシトシンが一塩基欠損するフレームシフト変異が挙げられる。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。

配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイＱＭ６ａ株が持つｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆａｍｉｌｙ４１，ｐａｒｔｉａｌ（ＥＧＲ４６４７６）としても登録されている。ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆａｍｉｌｙ４１は、２量体の複合体で構成されているタンパク質（ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，２７，２０８０−２７８８（２００８））であり、翻訳直後の新生タンパク質がゴルジ複合体を通過する過程において、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をアミノ酸残基であるセリンまたはスレオニン残基に転移させる機能（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１１，２８０−２８１（１９９５））を有している。配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２５で表される塩基配列が挙げられる。
ＥＧＲ４６４７６の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４６４７６が有するｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆａｍｉｌｙ４１，ｐａｒｔｉａｌの全欠損、ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆａｍｉｌｙ４１，ｐａｒｔｉａｌの一部欠損、ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｆａｍｉｌｙ４１，ｐａｒｔｉａｌの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号２５で表される塩基配列において、６，２６１番目のシトシンがアデニンへ変異することによりストップコドンが挿入する変異が挙げられる。配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。

また、本発明は前記変異株を培養する工程を含むタンパク質の製造方法に関する。

本発明でトリコデルマ・リーセイを培養する培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ・リーセイは、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。

本発明の方法では、菌体外に分泌されるタンパク質と効率的に製造することができる。製造されるタンパク質は特に制限はないが、好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ等の糖化酵素であり、さらに好ましくはセルラーゼである。

本発明で製造されるセルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）などが挙げられる。

前述の通り、本発明の変異株のタンパク質製造能の向上を確認するためのセルラーゼのタンパク質濃度および比活性の向上の確認は、これらの加水分解酵素の比活性のいずれかが向上していることにより確認する。

セルラーゼのタンパク質濃度は以下の通り測定を行う。本発明の方法でトリコデルマ・リーセイを培養することにより得られた培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をセルラーゼ溶液とする。ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔＢｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて糖化酵素溶液に含まれるタンパク質濃度を算出する。

β−グルコシダーゼ比活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させる。次に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。

β−キシロシダーゼ比活性は以下の方法で測定する。まず、１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させる。次に、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。

セロビオハイドロラーゼ比活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させる。次にその後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に、１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。

本発明のトリコデルマ・リーセイの変異株の培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ・リーセイの変異株である場合は、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１〜２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３〜１．５ｖｖｍがより好ましく、０．５〜１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５〜３５℃程度が好ましく、２５〜３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０〜７．０が好ましく、ｐＨ４．０〜６．０がより好ましい。培養時間は、タンパク質が生産される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行える時間であれば特に制限はないが、通常、２４〜２８８時間、好ましくは２４〜２４０時間、より好ましくは３６〜２４０時間、さらに好ましくは３６〜１９２時間である。

培養工程の培地組成は、トリコデルマ・リーセイがタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、トリコデルマ・リーセイの周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができる。また、培地には、タンパク質を製造させるための誘導物質を添加してもよい。

本発明によりセルラーゼを製造する場合には、培地にラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養することができる。また、セルロースやキシランは、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類され、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としてはビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが挙げられる。

また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。

トリコデルマ・リーセイの変異株を培養した培養液に含まれるタンパク質を回収する方法は特に限定されないが、トリコデルマ・リーセイの菌体を培養液から除去し、タンパク質を回収することができる。菌体の除去方法としては、遠心分離法、膜分離法、フィルタープレス法などが例として挙げられる。

また、トリコデルマ・リーセイの変異株を培養した培養液から菌体を除去せずに、タンパク質の溶解液として利用する場合には、培養液中でトリコデルマ・リーセイの変異株が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。

タンパク質がセルラーゼのような酵素の場合には、上記のように菌体を除去又は生育していないように処理した培養液を、そのまま酵素液として利用することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

＜参考例１＞タンパク質濃度測定条件
使用するタンパク質濃度測定試薬：ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔＢｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製
測定条件
測定温度：室温
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
糸状菌の培養液：５μＬ
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。

＜参考例２＞溶存酸素飽和度の算出
溶存酸素飽和度は、菌を含まない培地を用いてｐＨや温度を培養条件に設定し、空気を通気した際の溶存酸素の飽和状態を１００％とした場合の、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出した。ＤＯ計は密閉型溶存酸素電極ＳＤＯＣ−１２Ｆ−Ｌ１２０（エイブル株式会社製）を使用した。

＜参考例３＞培養液の粘度の測定
採取した培養液の粘度を測定するため、培養開始３９、４８、６２、７２、８６、９６、１１１時間経過後の培養液をデジタル回転粘度計ＤＶ２ＴとスピンドルＬＶ−１（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社製）を使用し、回転数を０．３ｒｐｍに設定した際の粘度（ｃＰ）を求めた。

＜参考例４＞菌体量の測定
培養液中に含まれる菌体量を測定するため、培養液をろ紙で吸引ろ過し、吸引ろ過前後のろ紙の乾燥菌体重量の差を菌体量とした。

＜参考例５＞セルラーゼの比活性の測定条件
（β−グルコシダーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。

（β−キシロシダーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。

（セロビオハイドロラーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。

＜実施例１＞配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
（変異株の作製方法）
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号１で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ（遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号２６で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号１で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。

具体的には、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号２７および２８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＫｐｎＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号２９および３０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＫｐｎＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号２６で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）の記載通りに行う。

＜実施例２＞配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
（変異株の作製方法）
配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号２で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号３１で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号２で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。

具体的には、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号３２および３３で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号３４および３５で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＳｗａＩとＡｓｃＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＳｗａＩとＡｓｃＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＡｓｃＩで処理し、配列番号３１で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）の記載通りに行う。

＜実施例３＞配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
（変異株の作製方法）
配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号３で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号３６で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号３で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。

具体的には、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号３７および３８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号３９および４０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号３６で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）の記載通りに行う。

（変異株の作製・評価）
前述の方法に従って、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株ＱＭ９４１４−Ｊ株を取得した。

＜実施例４＞配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
（変異株の作製方法）
配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号４で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号４１で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号４で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。

具体的には、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号４２および４３で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号４４および４５で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号４１で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）の記載通りに行う。

＜実施例５＞配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
（変異株の作製方法）
配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号５で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号４６で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号５で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。

具体的には、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号４７および４８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号４９および５０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＳａｌＩとＳｐｈＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＳａｌＩとＳｐｈＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｈＩで処理し、配列番号４６で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト−ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）の記載通りに行う。

＜実施例６＞トリコデルマ・リーセイの変異株の培養試験
（前培養）
実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の胞子を１．０×１０^７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを表１に示した１Ｌバッフル付フラスコへ入れた２５０ｍＬの前培養培地へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行う。コントロールとして、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株を用い、以下同様の実験操作を行う。

（本培養）
ＡｒｂｏｃｅｌＢ８００（レッテンマイヤー社）を表２で示した本培養培地に添加し、５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）を用い、深部培養検討を行う。

トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株および実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の前培養液２５０ｍＬをＡｒｂｏｃｅｌＢ８００が添加された本培養培地２．５Ｌに接種する。

培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養を行う。

（培養液の採取）
培養開始から、培養終了時の１２０時間経過後まで経時的に培養液をそれぞれ２０ｍＬ採取する。採取した培養液の１部は、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得る。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いる。

（タンパク質濃度の測定）
参考例１で記載した手法を用い、培養開始１２０時間経過後に採取した培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度を測定する。その結果、実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液におけるタンパク質濃度は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の培養液におけるタンパク質濃度と比較して高くなる。特に、実施例３にて取得した配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたＱＭ９４１４−Ｊ株は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株と比較して相対値でタンパク質濃度は１．３倍高かった。

（培養液中の溶存酸素飽和度の測定）
参考例２で記載した手法を用い、実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液中の経時的な溶存酸素飽和度を測定する。その結果、実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液中の溶存酸素飽和度は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株よりも高くなる。

また、ＱＭ９４１４と実施例３にて取得したＱＭ９４１４−Ｊ株の培養液中の溶存酸素の経時的変化を図６に示す。ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４−Ｊ株の培養液中の溶存酸素濃度は、それぞれ培養開始から８０時間前後、６０時間前後で最小値となり、ＱＭ９４１４−Ｊ株の最小溶存酸素濃度は、親株のＱＭ９４１４の最小溶存酸素濃度よりも２０％程度高くなった。

（培養液の粘度の測定）
参考例３で記載した手法を用い、実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液中の経時的な粘度を測定する。その結果、実施例１〜５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の最大粘度は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株よりも低くなる。

また、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の値を１とした場合の、実施例３にて取得したＱＭ９４１４−Ｊ株の粘度の相対値を図５に示す。その結果、ＱＭ９４１４−Ｊ株の培養期間中の培養液の粘度は、ＱＭ９４１４株よりも低くなった。ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４−Ｊ株の培養液における粘度は、培養開始から７１時間経過前後で最大となった。ＱＭ９４１４−Ｊ株の最大粘度は、親株のＱＭ９４１４株の最大粘度の４０％程度まで低下した。

（菌体量の測定）
参考例４で記載した手法を用い、実施例６（前培養）の培養直後の菌体量を測定する。その結果、配列番号６〜１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株とトリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株間で菌体量の差は確認できない。特に、実施例３にて取得した配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたＱＭ９４１４−Ｊ株は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株と比較して、菌体量の差を確認することはできなかった。

（酵素活性の測定）
参考例５の条件で、培養途中に採取した培養液におけるセルラーゼの比活性として、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドラーゼの比活性をそれぞれ測定する。比活性は、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定し、１分間あたり１μｍｏｌの基質を遊離する活性を１Ｕとして算出する。その結果、配列番号６〜１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液における上記３種類の比活性は、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の培養液における比活性と比較して高くなる。特に、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株と比較して、実施例３にて取得したＱＭ９４１４−Ｊ株は相対値でβ−グルコシダーゼ比活性は１．２倍、β−キシロシダーゼ比活性は１．２倍、セロビオハイドロラーゼ比活性は１．１倍高かった。

＜実施例７＞配列番号６〜８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の継代株であるＱＭ９４１４−Ｇ株に対し、遺伝子変異処理を行って変異株であるＱＭ９１４１−Ｈ株を取得した。遺伝子変異処理は、ＱＭ９４１４−Ｇ株の胞子を、表１に示す前培養培地１ｍＬあたり１．０ｘ１０^５胞子になるよう接種し、前培養培地１５ｍＬを半日培養した後に遠心分離を行い、胞子を回収した。そして、回収した胞子をトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて１０ｍＬの胞子溶液になるよう懸濁し、そこへトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１．０ｇ／Ｌになるよう溶解させたＮＴＧ溶液を０．５ｍＬ添加し、２８℃、１００分間、遺伝子変異処理を行った。遺伝子変異処理した胞子は、遠心分離にて回収した後に、トリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、最終的にトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）１０ｍＬにて懸濁したものを遺伝子変異処理胞子とした。

その遺伝子変異処理胞子を、結晶セルロースを添加して調製した寒天培地へ添加し、コロニー周囲に生じるセルラーゼによる結晶セルロース分解領域であるハロの大きさを指標とし、ハロの大きかったＱＭ９４１４−Ｈ株を選抜した。

ＱＭ９４１４−Ｇ株とＱＭ９４１４−Ｈ株の遺伝子解析の結果、ＱＭ９４１４−Ｇ株では配列番号６〜１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子が保持されていたが、ＱＭ９４１４−Ｈ株では以下の（１）〜（３）に記す３箇所の変異を確認することができた。
（１）配列番号１で表される塩基配列の４１１番目のグアニンがアデニンへ変異していた。当該変異は、配列番号６で表されるアミノ酸配列の１３７番目にストップコドンを挿入させる変異である。
（２）配列番号２で表される塩基配列の９８８番目にアデニンが１塩基挿入されていた。当該変異は、配列番号７で表されるアミノ酸配列の２９７番目からフレームシフトを挿入させる変異である。
（３）配列番号３で表される塩基配列の５，５４１番目のグアニンがアデニンに変異していた。当該変異は、配列番号８で表されるアミノ酸配列の１，７９１番目のアスパラギン酸をアスパラギンへ置換する変異である。

＜実施例８＞トリコデルマ・リーセイの変異株の培養試験
実施例７で取得したＱＭ９４１４−Ｈ株について、実施例６と同様の方法で培養を行い、参考例２と参考例３の条件で、培養液中の最大粘度（ｃＰ）および培養液中の最小溶存酸素飽和度（％）を測定した。コントロールには、ＱＭ９４１４−Ｇ株を用いた。ＱＭ９４１４−Ｇ株の値を１とした場合の、ＱＭ９４１４−Ｈ株の粘度の相対値を図１に示す。また、培養期間中の、ＱＭ９４１４−Ｇ株と、ＱＭ９４１４−Ｈ株の溶存酸素の経時的変化を図２に示す。

これらの結果、ＱＭ９４１４−Ｈ株の培養期間中の培養液の粘度は、ＱＭ９４１４−Ｇ株よりも低くなった。ＱＭ９４１４−Ｈ株とＱＭ９４１４−Ｇ株の培養液における粘度は、培養開始からそれぞれ２４時間経過時前後、４１時間経過時前後で最大となった。ＱＭ９４１４−Ｈ株の最大粘度は、親株のＱＭ９４１４−Ｇ株の最大粘度の４０％程度まで低下した。

培養液中の溶存酸素濃度も、ＱＭ９４１４−Ｈ株では、ＱＭ９４１４−Ｇ株に比べて高くなった。ＱＭ９４１４−Ｈ株とＱＭ９４１４−Ｇ株の培養液中の溶存酸素濃度は、ともに培養開始後３６時間経過時前後で最小値となり、ＱＭ９４１４−Ｈ株の３６経過時の溶存酸素濃度は、親株のＱＭ９４１４−Ｇ株と比べて２５％程度高くなった。

＜実施例９＞配列番号９、１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の継代株であって実施例７で取得したＱＭ９４１４−Ｈ株に対し、遺伝子変異処理を行って変異株であるＱＭ９１４１−Ｉ株を取得した。遺伝子変異処理は、ＱＭ９４１４−Ｈ株の胞子を、表１に示す前培養培地１ｍＬあたり１．０ｘ１０^５胞子になるよう接種し、前培養培地１５ｍＬを半日培養した後に遠心分離を行い、胞子を回収した。そして、回収した胞子をトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて１０ｍＬの胞子溶液になるよう懸濁し、そこへトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１．０ｇ／Ｌになるよう溶解させたＮＴＧ溶液を０．５ｍＬ添加し、２８℃、１００分間、遺伝子変異処理を行った。遺伝子変異処理した胞子は、遠心分離にて回収した後に、トリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、最終的にトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）１０ｍＬにて懸濁したものを遺伝子変異処理胞子とした。その遺伝子変異処理胞子を、結晶セルロースを添加して調製した寒天培地へ添加し、コロニー周囲に生じるセルラーゼによる結晶セルロース分解領域であるハロの大きさを指標とし、ハロの大きかったＱＭ９４１４−Ｉ株を選抜した。

ＱＭ９４１４−Ｈ株とＱＭ９４１４−Ｉ株の遺伝子解析の結果、ＱＭ９４１４−Ｈ株では配列番号９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子が保持されていたが、ＱＭ９４１４−Ｉ株では以下に記す２箇所の変異を確認することができた。
（１）配列番号４で表される塩基配列の５５０番目のアデニンがシトシンに変異していた。当該変異は、配列番号９で表されるアミノ酸配列の１８４番目のセリンをアルギニンへ置換する変異である。
（２）配列番号５で表される塩基配列の７６９番目にグアニンが１塩基挿入されていた。当該変異は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列の２５７番目にからフレームシフトを挿入させる変異である。

＜実施例１０＞トリコデルマ・リーセイの変異株の培養試験
実施例９で取得したＱＭ９４１４−Ｉ株について、実施例６と同様の方法で培養を行い、参考例１、参考例２、参考例３、参考例５の条件で、培養液における培養液中の最大粘度、培養液中の最小溶存酸素飽和度、タンパク質濃度、セルラーゼの比活性をそれぞれ測定した。コントロールには、ＱＭ９４１４−Ｈ株を用いた。ＱＭ９４１４−Ｈ株の値を１とした場合の、ＱＭ９４１４−Ｉ株の粘度の相対値を図３に示す。また、培養期間中の、ＱＭ９４１４−Ｈ株と、ＱＭ９４１４−Ｉ株の溶存酸素の経時的変化を図４に示す。

これらの結果、ＱＭ９４１４−Ｉ株の培養液中の粘度は、ＱＭ９４１４−Ｈ株よりも低くなった。ＱＭ９４１４−Ｉ株とＱＭ９４１４−Ｈ株の培養液における粘度は、培養開始から２４時間経過時前後で最大となった。ＱＭ９４１４−Ｉ株の２４時間経過時の粘度は、親株であるＱＭ９４１４−Ｈ株の７５％程度まで低下した。

培養液中の溶存酸素濃度も、ＱＭ９４１４−Ｉ株では、ＱＭ９４１４−Ｈ株に比べて高くなった。ＱＭ９４１４−Ｈ株と、ＱＭ９４１４−Ｉ株の培養液中の溶存酸素濃度は、ともに３６時間経過時前後で最小値となり、ＱＭ９４１４−Ｉ株の３６時間経過時の溶存酸素濃度は、親株のＱＭ９４１４−Ｈ株と比べて３７％程度高くなった。

また、ＱＭ９４１４−Ｈ株と比較して、ＱＭ９４１４−Ｉ株は、タンパク質濃度は１．１１倍、β−グルコシダーゼ比活性は１．０７倍、β−キシロシダーゼ比活性は１．４０倍、セロビオハイドロラーゼ比活性は１．０３倍高くなった。

Claims

配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、トリコデルマ・リーセイの変異株。
前記変異が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端側より１７９１番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン酸以外のアミノ酸残基への変異である、請求項１に記載の変異株。
さらに配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、請求項１または２に記載の変異株。
前記変異が、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１３７番目で翻訳が終了するストップコドン変異である、請求項３に記載の変異株。
さらに配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の変異株。
前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＬｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｌｉｋｅｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、請求項５に記載の変異株。
前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２９７番目のアスパラギン酸残基でのフレームシフト変異である、請求項５または６に記載の変異株。
さらに配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＧＡＬ４−ｌｉｋｅＺｎ２Ｃｙｓ６ｂｉｎｕｃｌｅａｒｃｌｕｓｔｅｒＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｍｉｄｄｌｅｈｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸配列に変異を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の変異株。
前記変異が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおけるＮ末端側より１８４番目のセリン残基のセリン以外のアミノ酸残基への変異である、請求項８に記載の変異株。
さらに配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の変異株。
前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＦａｔｔｙａｃｉｄｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、請求項１０に記載の変異株。
前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２５７番目のイソロイシン残基でのフレームシフト変異である、請求項１０または１１に記載の変異株。
請求項１から１２のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
請求項１から１２のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。