CN105940103B - 哌可酸4位羟化酶和利用该酶的4-羟基氨基酸的制造法 - Google Patents

哌可酸4位羟化酶和利用该酶的4-羟基氨基酸的制造法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及下述(A)、(B)和(C)所例示的哌可酸4位羟化酶蛋白质，其具有在α‑酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L‑哌可酸而生成反式‑4‑羟基‑L‑哌可酸的活性；以及一种4‑羟基氨基酸的制造方法，其特征在于，使该哌可酸4位羟化酶蛋白质或含有该哌可酸4位羟化酶蛋白质的细胞、该细胞的制备物或对该细胞进行培养而得到的培养液与α‑氨基酸发生作用而生成4‑羟基氨基酸。(A)具有序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列的多肽；(B)具有在序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列中缺失、置换和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽；或(C)具有与序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽。

Description

哌可酸4位羟化酶和利用该酶的4-羟基氨基酸的制造法
技术领域
本发明涉及利用新型哌可酸4位羟化酶的4-羟基氨基酸的制造法。
背景技术
氨基酸羟化酶是在药品的中间体等的制造中有用的酶，已报道了脯氨酸4位羟化酶(非专利文献1)、L-异亮氨酸双加氧酶(非专利文献2)等的存在。作为具有哌可酸的羟化能力的酶，已报道了几种脯氨酸羟化酶具有使L-哌可酸的3位或5位羟化的能力(非专利文献3)，但迄今为止还没有使哌可酸的4位羟化的酶的报道例。
序列号2、4、6、8、10或12所记载的氨基酸序列分别与基于尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)Fo5176、米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株、产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)Wisconsin 54-1255株、玉米赤霉菌(Gibberella zeae：别名Fusariumgraminearum(禾谷镰孢菌))PH-1株、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)Naragc5株、构巢曲霉(Aspergillus nidulans：别名Emericella nidulans(构巢裸胞壳))FGSCA4株的基因组序列信息而预测为对蛋白质进行编码的DNA序列的翻译氨基酸序列GenBank登录号EGU81245、XP_001827566、XP_002558179、XP_383389、ELA34460和XP_659994相同。由于任一种蛋白质均来源于霉菌，因此，存在的情况下，表达后为受到了糖链修饰的状态的可能性高，但还没有实际进行分离等而确认其存在的报道例，关于它们的功能也完全不清楚。
光学活性4-羟基氨基酸是作为药品的中间体等有用的物质。例如，(4S)-羟基-L-哌可酸可用作Rho激酶抑制剂的前体(专利文献1)，(4S)-羟基-D-哌可酸可用作作为NMDA受体抑制剂的CGS-20281的前体(非专利文献4)。另外，(4R)-羟基-L-脯氨酸可用作作为缓激肽B2受体抑制剂的醋酸艾替班特的前体(非专利文献5)，(4R)-羟基-D-脯氨酸可用作Xa因子抑制剂的前体(专利文献2)。此外，L-高丝氨酸可用作作为ACE抑制剂的奥马屈拉的前体(专利文献3)，4-羟基-L-亮氨酸可用作作为亲环蛋白抑制剂的SCY-635的前体(非专利文献6)。
作为光学活性4-羟基氨基酸的合成法，例如，关于(4S)-羟基-L-哌可酸、(4S)-羟基-D-哌可酸，报道了使3-丁烯醇和光学活性的C-氨基羰基硝酮或C-烷氧基羰基硝酮立体选择性地环化的方法(非专利文献7)。另外，关于(4R)-羟基-L-脯氨酸，报道了利用指孢囊菌(Dactylosporangium)属RH1株来源的脯氨酸4位羟化酶由L-脯氨酸进行合成的方法(非专利文献1)，关于(4R)-羟基-D-脯氨酸，报道了经由α,β-二脱氢氨基酸的方法(非专利文献8)。此外，关于L-高丝氨酸，报道了通过使用重组大肠杆菌的发酵进行合成的方法(专利文献4)，关于4-羟基-L-亮氨酸，报道了利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)2e2株来源的L-异亮氨酸双加氧酶由L-亮氨酸进行合成的方法(非专利文献2)。
但是，这些方法分别存在原料昂贵且工序数多、可应用的化合物种类少、纯化的负荷大等问题，要求更高效的合成法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-514720号公报
专利文献2：日本特表2009-526813号公报
专利文献3：日本特开平7-48259号公报
专利文献4：WO2013/134625号小册子
非专利文献
非专利文献1：Shibasaki等、Appl.Environ.Microbiol.,1999,65,4028
非专利文献2：Hibi等、Appl.Environ.Microbiol.,2011,77,6926
非专利文献3：Klein等、Adv.Synth.Catal.,2011,353,1375
非专利文献4：Occhiato等、SYNTHESIS,2009,3611
非专利文献5：Bork等、Nat.Rev.Drug Discov.,2008,7,801
非专利文献6：Hopkins等、Antimicrobial.Agents Chemother.,2010,54,660
非专利文献7：Cordero等、Eur.J.Org.Chem.,2006,3235
非专利文献8：Kimura等、Bull.Chem.Soc.Jpn.,2002,75,2517
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供新型哌可酸4位羟化酶(ピペコリン酸4位水酸化酵素)和能够廉价且简便地制造4-羟基氨基酸、特别是光学活性4-羟基氨基酸的新方法。
用于解决问题的方法
本发明人们为了解决上述问题，对光学活性4-羟基氨基酸的制造方法进行了深入研究，结果发现，迄今尚无以蛋白质形式被分离的报道、功能不清楚的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)Fo5176株来源的蛋白质FOXB_08233及其同源蛋白质具有α-酮戊二酸依赖性的哌可酸4位羟化酶活性。而且发现，通过使用编码这些蛋白质的DNA制作转化体并使该转化体细胞、其制备物和/或培养液与各种氨基酸发生作用，能够以高光学纯度得到各种光学活性4-羟基氨基酸。本发明是基于这些发现而完成的。
即，本发明的主旨如下。
[1]一种哌可酸4位羟化酶蛋白质，其具有在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L-哌可酸而生成反式-4-羟基-L-哌可酸的活性。
[2]如[1]所述的哌可酸4位羟化酶蛋白质，其选自由下述(A)、(B)和(C)组成的组：
(A)具有序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列的多肽；
(B)具有在序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列中缺失、置换和/或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽；或
(C)具有与序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽。
[3]如[2]所述的哌可酸4位羟化酶蛋白质，其利用不具有糖基化能力的宿主以重组蛋白质的形式制造而成。
[4]一种4-羟基氨基酸的制造方法，其特征在于，使[1]～[3]中任一项所述的哌可酸4位羟化酶蛋白质或含有该哌可酸4位羟化酶蛋白质的细胞、该细胞的制备物或对该细胞进行培养而得到的培养液与α-氨基酸发生作用而生成4-羟基氨基酸。
[5]如[4]所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，上述α-氨基酸由下述通式(I)表示，上述4-羟基氨基酸由下述通式(II)表示，
Figure GDA0001066564800000041
式(I)中，R1、R2、R3、R4和R5分别表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，R2可以与R5或氨基的氮原子键合而形成环结构，
Figure GDA0001066564800000042
式(II)中，R1、R2、R3、R4和R5分别表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，R2可以与R5或氨基的氮原子键合而形成环结构。
[6]如[4]所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，上述α-氨基酸为哌可酸，上述4-羟基氨基酸为4-羟基-L-哌可酸。
[7]如[4]～[6]中任一项所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，含有上述哌可酸4位羟化酶的细胞是被编码哌可酸4位羟化酶蛋白质的DNA转化了的细胞。
[8]如[7]所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，编码上述哌可酸4位羟化酶蛋白质的DNA选自由下述(D)、(E)和(F)组成的组：
(D)具有序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列的DNA；
(E)包含在序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列中置换、缺失或添加了1个或几个碱基的碱基序列、且编码具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽的DNA；
(F)包含在严格条件下与序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列的互补链杂交的碱基序列、且编码具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽的DNA。
[9]一种微生物，其为被选自由下述(D)、(E)和(F)组成的组中的编码哌可酸4位羟化酶蛋白质的DNA转化了的微生物：
(D)具有序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列的DNA；
(E)包含在序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列中置换、缺失或添加了1个或几个碱基的碱基序列、且编码具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽的DNA；
(F)包含在严格条件下与序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列的互补链杂交的碱基序列、且编码具有哌可酸4位羟化酶活性的多肽的DNA。
[10]如[9]所述的微生物，其选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和棒状杆菌属。
发明效果
根据本发明，能够高效地制造各种4-羟基氨基酸。特别是能够以高光学纯度高效地制造作为药物中间体有用的(4S)-羟基-L-哌可酸、(4S)-羟基-D-哌可酸等光学活性4-羟基氨基酸。
附图说明
图1是示出使经pFoPA4H转化了的大肠杆菌与L-脯氨酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
图2是示出使经pFoPA4H转化了的大肠杆菌与L-亮氨酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
图3是示出使经pFoPA4H转化了的大肠杆菌与L-哌可酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
图4是示出使经pEnPA4H转化了的大肠杆菌与D-脯氨酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
图5是示出使经pEnPA4H转化了的大肠杆菌与(S)-2-氨基丁酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
图6是示出使将pFoPA4H转化了的大肠杆菌与L-哌可酸反应而得到的反应产物的1H-NMR分析结果的图(半色调画像)。
图7是示出使经pFoPA4H转化了的大肠杆菌与L-哌可酸反应而得到的反应产物的13C-NMR分析结果的图(半色调画像)。
图8是示出使由经pEnPA4H转化了的大肠杆菌得到的无细胞提取液与(5S)-羟基-L-哌可酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
图9是示出使由经pAoPA4H进行了转化的大肠杆菌得到的无细胞提取液(上)或由经pEnPA4H进行了转化的大肠杆菌得到的无细胞提取液(下)与(4R)-羟基-L-脯氨酸反应而得到的反应液的LC-MS分析结果的图。
具体实施方式
以下，详细地对本发明进行说明。
<哌可酸4位羟化酶和使用哌可酸4位羟化酶的4-羟基氨基酸的制造方法>
本发明的哌可酸4位羟化酶为具有序列号2、4、6、8、10、12、16或18所记载的氨基酸序列的物质、或者作为该氨基酸序列的同源物且具有哌可酸4位羟化酶活性的物质。
序列号2、4、6、8、10或12所记载的氨基酸序列分别来源于尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)c8D株、米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株、产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)Wisconsin 54-1255株、玉米赤霉菌(Gibberella zeae：别名Fusariumgraminearum(禾谷镰孢菌))PH-1株、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)Naragc5株、构巢曲霉(Aspergillus nidulans：别名Emericella nidulans(构巢裸胞壳))FGSCA4株，是本发明中被鉴定为哌可酸4位羟化酶的蛋白质的氨基酸序列。序列号16或18所记载的氨基酸序列是经由从日本国内的土壤样品中直接回收的DNA的解析而得到的序列，是本发明中被鉴定为哌可酸4位羟化酶的蛋白质的氨基酸序列。序列号16所记载的氨基酸序列与Variovorax paradoxus EPS(争论贪噬菌EPS)来源的功能未知蛋白质(GenBank登录号YP_004156498)显示出97％的同源性，但尚无确认其功能的报道例。另外，序列号18所记载的氨基酸序列与Burkholderia sp A1(伯克霍尔德氏菌A1)来源的功能未知蛋白质(GenBank登录号WP_029951026)显示出50％的同源性，但尚无确认其功能的报道例。
任一种序列仅根据序列信息均难以推测为哌可酸的羟化酶，本发明中首次鉴定为哌可酸4位羟化酶。
需要说明的是，哌可酸4位羟化酶可以使用多种。
本说明书中，哌可酸4位羟化酶活性是指，在α-酮戊二酸和二价铁的存在下向L-哌可酸的4位的碳原子上附加羟基而生成反式-4-羟基-L-哌可酸的活性。这样的活性可以通过如下方法来确认：在含有L-哌可酸作为底物、且进一步含有α-酮戊二酸和二价铁作为辅因子的反应体系中，作为酶对目的蛋白质、表达该蛋白质的细胞或其制备物起作用，如后述的实施例那样测定反式-4-羟基-L-哌可酸的生成。
作为具有本发明的序列号2、4、6、8、10、12、16或18所记载的氨基酸序列的哌可酸4位羟化酶的同源物，只要保持哌可酸4位羟化酶活性，可以列举具有在序列号2、4、6、8、10、12、16或18所记载的氨基酸序列中缺失、置换或添加了1个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质。在此，“1个或几个氨基酸”是指例如1～100个、优选1～50个、更优选1～20个、进一步优选1～10个、特别优选1～5个氨基酸。
另外，只要保持哌可酸4位羟化酶活性，上述同源物也可以为与序列号2、4、6、8、10、12、16或18所示的氨基酸序列全长具有至少80％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的蛋白质。
本发明中可使用的哌可酸4位羟化酶也可以由上述的微生物纯化得到，但也可以通过利用PCR、杂交等公知的方法对编码哌可酸4位羟化酶的DNA进行克隆化、并使其在适当的宿主中表达来得到。
作为编码哌可酸4位羟化酶的DNA，可以列举例如包含序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列的DNA。
另外，只要编码具有哌可酸4位羟化酶活性的蛋白质，也可以为包含序列号1、3、5、7、9、11、15或17的碱基序列的DNA的同源物。作为这样的同源物，可以列举例如包含在序列号1、3、5、7、9、11、15或17的碱基序列中置换、缺失或添加了1个或几个碱基的碱基序列的DNA。
在此所述的1个或几个碱基为例如1～300个、优选1～150个、更优选1～60个、进一步优选1～30个、特别优选1～15个碱基。
此外，只要编码具有哌可酸4位羟化酶活性的蛋白质，上述DNA的同源物也可以为在严格条件下与序列号1、3、5、7、9、11、15或17的碱基序列的互补链杂交的DNA。在此，作为“严格条件”，可以列举例如包括在0.1×SSC(saline-sodium citrate，柠檬酸钠缓冲液)、0.1％SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)、60℃的条件下进行清洗的条件。
本领域技术人员可以通过使用定点诱变法(Nucleic Acids Res.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A PracticalApproach IRL Press pp.200(1991))等向序列号1、3、5、7、9、11、15或17的DNA等中适当导入置换、缺失、插入和/或添加突变来得到如上所述的DNA同源物。
另外，也可以基于序列号2、4、6、8、10、12、16或18的氨基酸序列或其一部分、序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列或其一部分，对例如日本DNA数据库(DNADatabank of JAPAN，DDBJ)等数据库进行同源检索，获取哌可酸4位羟化酶活性的氨基酸信息或对其进行编码的DNA的碱基序列信息。
本发明的4-羟基氨基酸的制造方法中，可以将哌可酸4位羟化酶直接用于反应，但优选使用含有哌可酸4位羟化酶的细胞、该细胞的制备物或对该细胞进行培养而得到的培养液。
作为含有哌可酸4位羟化酶的细胞，可以使用原本就具有哌可酸4位羟化酶的微生物等的细胞，但优选使用利用编码哌可酸4位羟化酶的基因进行了转化的细胞。
作为含有哌可酸4位羟化酶的细胞的制备物，可以使用例如将该细胞利用丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯等有机溶剂、表面活性剂进行处理而得到的制备物、进行冷冻干燥处理而得到的制备物、利用物理方法或酶进行破碎而得到的制备物等细胞制备物、将细胞中的酶级分以粗制物或纯化物的形式取出而得到的制备物、以及进一步将这些制备物固定到以聚丙烯酰胺胶、卡拉胶等为代表的载体上而得到的制备物等。
将如上所述分离得到的、编码哌可酸4位羟化酶的DNA以能够表达的方式插入到公知的表达载体中，由此提供哌可酸4位羟化酶表达载体。然后，利用该表达载体对宿主细胞进行转化，由此能够得到导入有编码哌可酸4位羟化酶的DNA的转化体。转化体也可以通过将编码哌可酸4位羟化酶的DNA利用同源重组等方法以能够表达的方式组入宿主的染色体DNA中来得到。
作为转化体的制作方法，具体而言，可以例示如下方法：将编码哌可酸4位羟化酶的DNA导入到在微生物等的宿主细胞中稳定存在的质粒载体、噬菌体载体、病毒载体中，将所构建的表达载体导入到该宿主细胞中，或者直接将该DNA导入到宿主基因组中，对其遗传信息进行转录、翻译。此时，优选在宿主中将适当的启动子连接于DNA的5’-侧上游，进一步，更优选将终止子连接于3’-侧下游。作为这样的启动子和终止子，只要是已知在用作宿主的细胞中发挥功能的启动子和终止子则没有特别限定，例如，在“微生物学基础讲座8基因工程·共立出版”等中详细地记述了能够在宿主微生物中利用的载体、启动子和终止子。
作为用于表达哌可酸4位羟化酶的作为转化对象的宿主微生物，只要宿主本身不会给α-氨基酸的反应带来不利影响则没有特别限定，具体而言可以列举如下所示的微生物。
属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌属(Pseudomonas)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属等的已确立了宿主载体系统的细菌。
属于红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等的已确立了宿主载体系统的放线菌。
属于酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、耶氏酵母(Yarrowia)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、汉逊酵母(Hansenula)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属等的已确立了宿主载体系统的酵母。
属于脉孢菌(Neurospora)属、曲霉(Aspergillus)属、头孢菌(Cephalosporium)属、木霉菌(Trichoderma)属等的已确立了宿主载体系统的霉菌。
用于制作转化体的步骤、适合于宿主的重组载体的构建和宿主的培养方法可以按照分子生物学、生物工程、基因工程的领域中常用的技术来进行(例如，分子克隆(Molecular Cloning)中记载的方法)。
以下，具体地列举优选的宿主微生物、各微生物的优选的转化方法、载体、启动子、终止子等的示例，但本发明不限定于这些示例。
在埃希氏菌属、特别是大肠杆菌(Escherichia coli)中，作为质粒载体，可以列举pBR、pUC系质粒，可以列举lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、来源于λ噬菌体PL、PR等的启动子等。另外，作为终止子，可以列举trpA来源、噬菌体来源、rrnB核糖体RNA来源的终止子等。
在芽孢杆菌属中，作为载体，可以列举pUB110系质粒、pC194系质粒等，另外，也可以整合到染色体中。作为启动子和终止子，可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等的酶基因的启动子、终止子等。
在假单胞菌属中，作为载体，可以列举在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等中已确立的一般的宿主载体系统、参与甲苯化合物的分解的质粒、以TOL质粒为基础的广宿主载体(包含来源于RSF1010等的自主复制所需要的基因)pKT240(Gene,26,273-82(1983))。
在短杆菌属、特别是乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，作为载体，可以列举pAJ43(Gene 39,281(1985))等质粒载体。作为启动子和终止子，可以利用在大肠杆菌中使用的各种启动子和终止子。
在棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，作为载体，可以列举pCS11(日本特开昭57-183799号公报)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等质粒载体。
在酵母(Saccharomyces)属、特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为载体，可以列举YRp系、YEp系、YCp系、YIp系质粒。另外，可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等的各种酶基因的启动子、终止子。
在裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属中，作为载体，可以列举Mol.Cell.Biol.6,80(1986)中记载的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)来源的质粒载体。特别是pAUR224，其由宝酒造销售，可以容易地利用。
在曲霉(Aspergillus)属中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等在霉菌中被研究得最多，能够用于向质粒、染色体中的整合，能够利用菌体外蛋白酶、淀粉酶来源的启动子(Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989))。
作为上述微生物中特别优选的微生物，可以列举不具有糖基化能力的埃希氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和棒状杆菌属的微生物。
另外，除了上述以外，已确立了适于各种微生物的宿主载体系统，可以对它们进行适当使用。
另外，除了微生物以外，在植物、动物中已确立了各种宿主载体系统，特别是确立了使用蚕的在昆虫等动物中(Nature 315,592-594(1985))或在菜籽、玉米、马铃薯等植物中大量表达异种蛋白质的系统、以及使用大肠杆菌无细胞提取液或小麦胚芽等的无细胞蛋白质合成系统的系统，可以适当地加以利用。
使哌可酸4位羟化酶、含有该酶的细胞、该细胞的制备物或培养液在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于作为反应底物的α-氨基酸，由此生成4-羟基氨基酸。
在此，作为反应底物的α-氨基酸只要在4位具有能够取代为羟基的氢原子则没有特别限制，可以例示下述通式(I)所表示的化合物。另外，作为4-羟基氨基酸，可以例示下述通式(II)所表示的化合物。需要说明的是，α-氨基酸和4-羟基氨基酸优选为L体或D体，但也可以为外消旋体。
Figure GDA0001066564800000141
通式(I)和(II)中，R1、R2和R5分别表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，R3和R4分别表示氢原子、碳原子数1～3的烷基或羟基。R2可以与R5或氨基的氮原子键合而形成环结构。
作为具体的α-氨基酸的种类，可以列举例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸(R2与氨基的氮原子键合而形成了5元环)、α-氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、哌可酸(R2与R5键合而形成了6元环)、3-羟基脯氨酸、3-羟基哌可酸、5-羟基哌可酸等，特别优选为哌可酸。
反应在含有α-氨基酸、α-酮戊二酸、二价铁离子和哌可酸4位羟化酶或含有哌可酸4位羟化酶的细胞、该细胞的制备物或培养物的水性介质中、或该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。
作为水性介质，可以列举水或缓冲液。在此，作为缓冲液，只要是不抑制哌可酸4位羟化酶的活性的缓冲液则没有特别限制，可以例示例如磷酸缓冲液、MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸)缓冲液等。作为有机溶剂，可以使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等反应底物的溶解度高的溶剂。另外，作为有机溶剂，还可以使用对于反应副产物的除去等具有效果的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。
成为反应底物的α-氨基酸，通常以底物浓度为0.01％w/v～90％w/v、优选为0.1％w/v～30％w/v的范围使用。反应底物可以在反应开始时一次性地添加，但从减少存在酶的底物抑制的情况下的影响的观点、提高产物的蓄积浓度的观点出发，优选连续地或间歇地进行添加。
反应所需要的α-酮戊二酸通常以与底物为等摩尔或等摩尔以上、优选为等摩尔～1.2倍摩尔的范围添加。α-酮戊二酸可以在反应开始时一次性地添加，但从减少对酶存在抑制作用的情况下的影响的观点、提高产物的蓄积浓度的观点出发，优选连续地或间歇地进行添加。或者，也可以添加葡萄糖、L-谷氨酸等宿主能够进行代谢的廉价化合物来代替α-酮戊二酸，使宿主代谢，将在该过程中产生的α-酮戊二酸用于反应。
反应所需要的二价铁离子通常以0.01mmol/L～100mmol/L、优选0.1mmol/L～10mmol/L的范围使用。二价铁离子通常在反应开始时一次性地添加来进行使用，但在反应中被氧化为三价铁离子、或者形成沉淀而减少的情况下，补充添加也是有效果的。另外，在哌可酸4位羟化酶、含有该酶的细胞、该细胞的制备物或培养液中已经含有足够的二价铁离子的情况下，也可以不添加。
反应在通常在4℃～60℃、优选为10℃～45℃的反应温度下在通常为pH3～11、优选为pH5～8的条件下进行。反应时间通常为约1小时～约72小时。
关于向反应液中添加的细胞和/或该细胞制备物的量，在添加细胞的情况下，向反应液中按照该细胞的浓度以湿菌体重计通常为约0.1％w/v～约50％w/v、优选为1％w/v～20％w/v的方式添加，在使用细胞制备物的情况下，求出细胞制备物的酶的比活性，以添加时达到上述细胞浓度的量进行添加。
通过本发明的方法生成的4-羟基氨基酸可以在反应结束后利用离心分离、膜处理等分离出反应液中的菌体、蛋白质等，之后通过将利用1-丁醇、叔丁醇等有机溶剂进行的提取、蒸馏、使用离子交换树脂或硅胶等的柱层析法、等电点处的析出或利用一盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等进行的析出等适当组合来进行纯化。
[实施例]
以下，利用实施例进一步详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于此。
实施例1
<哌可酸4位羟化酶基因表达质粒的构建>
(1)基因的克隆
基于编码尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)Fo5176来源的假定蛋白质FOXB_08233的基因序列，设计、合成出用于扩增假定蛋白质FOXB_08233同源基因的全长的引物BOF1和BOR1。将各自的碱基序列示于序列表的序列号13和14。
将尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)c8D在马铃薯葡萄糖(Potato dextrose)液体培养基(日本BD公司制造)下培养一夜，使用DNeasy血液和组织试剂盒(DNeasy Blood&Tissue Kit)(キアゲン公司制造)从所得到的菌体中制备出染色体DNA。
以所制备的各菌株来源的染色体DNA作为模板，以序列号13和14的寡核苷酸作为引物，利用聚合酶链式反应(PCR)分别扩增出约1kbp的DNA片段。PCR使用Tks Gflex DNA聚合酶(宝生物公司制造)，按照附带的操作说明书的条件实施反应。温度程序为：在95℃保持1分钟保持后，将(98℃、10秒；56.5℃、15秒；68℃、40秒)重复35个循环，在72℃保持3分钟后结束。将解析所得到的DNA序列的结果示于序列号1，另外，将该DNA序列所编码的氨基酸序列示于序列号2。
(2)表达用质粒的制备
将上述(1)中得到的DNA片段利用限制性酶BamHI和HindIII进行消化，使用Ligation-Convenience试剂盒(日本基因公司制造)，导入到利用限制性酶BamHI和HindIII进行了消化的质粒载体pQE80L(キアゲン公司制造)中。以下，将所得到的质粒称为pFoPA4H。另外，由DNA2.0公司合成序列号3、5、7、9和11的DNA序列，并由该公司插入到表达质粒pJexpress411中。以下，将所得到的质粒分别称为pAoPA4H、pPcPA4H、pGzPA4H、pCgPA4H和pEnPA4H。
实施例2
<哌可酸4位羟化酶的活性评价>
使用实施例1中得到的6种质粒、pFoPA4H、pAoPA4H、pPcPA4H、pGzPA4H、pCgPA4H和pEnPA4H，按照常规方法对大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta 2(DE3)(默克密理博公司制造)进行转化。所得到的重组大肠杆菌分别使用含有卡那霉素50mg/L、氯霉素15mg/L、IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)1mmol/L的液体LB培养基在30℃振荡培养，在培养第20小时收集菌体。
使用所得到的菌体，在含有α-酮戊二酸15mmol/L、抗坏血酸5mmol/L、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐5mmol/L、FeSO4·7H2O 0.5mmol/L、柠檬酸3mmol/L、各种底物化合物10mmol/L的50mmol/L MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸)缓冲液中在20℃、pH6的条件下反应21小时。
将反应后的反应液利用下述条件的高效液相色谱(HPLC)进行分析。
柱：CHIRALPAK AD-3(4.6×250mm、大赛璐化学公司制造)
洗脱液：己烷:乙醇:三氟乙酸＝95:5:0.1
流速：0.8ml/分钟
温度：30℃
检测：UV 210nm
实施例3
<反应产物的鉴定>
将实施例2中得到的反应液使用沃特世公司的AccQ标签(AccQ·Tag)法制成衍生物后，用下述条件的高效液相色谱质谱仪(LC-MS)进行分离分析，由此测定氨基酸的反应产物。
柱：XBridge C18 5μm(2.1×150mm、沃特世公司制造)
洗脱液A：乙酸铵(10mmol/L、pH 5)
洗脱液B：甲醇(0～0.5分钟(0％→1％)，0.5～18分钟(1％→5％)，18～19分钟(5％→9％),19～29.5分钟(9％→17％)，29.5～40分钟(17％→60％),40～43分钟(60％))
流速：0.3ml/分钟
温度：30℃
检出：质谱仪
关于使用6种大肠杆菌得到的反应液，将在LC-MS分析中确认到出现新的峰的底物氨基酸示于表1。确认到这些新反应产物的分子量均比底物增加16，由此认为均为在底物中添加了氧原子的化合物。
表1
Figure GDA0001066564800000191
将(1)含有利用pFoPA4H进行了转化的大肠杆菌和L-脯氨酸的反应液的LC-MS分析结果示于图1。反应产物的峰显示出与反式-4-羟基-L-脯氨酸的标准物质相同的保留时间，由此推定该反应产物为反式-4-羟基-L-脯氨酸。该结果在使用利用pAoPA4H或pEnPA4H进行了转化的大肠杆菌时也同样。
将(2)含有利用pFoPA4H进行了转化的大肠杆菌和L-亮氨酸的反应液的LC-MS分析结果示于图2。反应产物的峰显示出与反式-4-羟基-L-亮氨酸的标准物质相同的保留时间，由此推定该反应产物为反式-4-羟基-L-亮氨酸。该结果在使用利用pAoPA4H、pPcPA4H、pGzPA4H、pCgPA4H或pEnPA4H进行了转化的大肠杆菌时也同样。
将(3)使利用pFoPA4H转化后的大肠杆菌与L-哌可酸反应而得到的反应产物利用下述条件的高效液相色谱(HPLC)进行了分离。
柱：TSKgel Amide80(7.8×300mm、东曹公司制造)
洗脱液：乙酸铵(10mmol/L、pH 5):乙腈＝15:85
流速：2.3ml/分钟
温度：40℃
检测：UV 210nm
回收含有反应产物的洗脱液，利用离心蒸发器进行减压干燥。将残留物利用重水悬浮后，测定核磁共振谱。
根据1H-NMR(图6)、13C-NMR(图7)解析的结果所得到的化学位移值和HH-COSY、CH-HMQC解析的结果所得到的相关性、以及文献信息(Molnar,T.等、2008,Bioorg.Med.Chem.Lett.,18,6290)，鉴定出该反应产物为反式-4-羟基-L-哌可酸。
将含有利用pFoPA4H进行了转化的大肠杆菌和L-哌可酸的反应液的LC-MS分析结果示于图3。作为反应产物的反式-4-羟基-L-哌可酸的峰在10.9分洗脱。该结果在使用利用pAoPA4H、pPcPA4H、pGzPA4H、pCgPA4H或pEnPA4H进行了转化的大肠杆菌时也同样。
将(4)含有利用pEnPA4H进行了转化的大肠杆菌和D-脯氨酸的反应液的LC-MS分析结果示于图4。反应产物的峰显示出与顺式-4-羟基-D-脯氨酸的标准物质相同的保留时间，由此推定该反应产物为顺式-4-羟基-D-脯氨酸。
将(5)含有利用pEnPA4H进行了转化的大肠杆菌和(S)-2-氨基丁酸的反应液的LC-MS分析结果示于图5。反应产物的峰显示出与L-高丝氨酸的标准物质相同的保留时间，由此推定该反应产物为L-高丝氨酸。
实施例4
<哌可酸4位羟化酶的羟化为羟基氨基酸的羟化活性评价>
使用由实施例2中得到的菌体得到的无细胞提取液，在含有α-酮戊二酸15mmol/L、抗坏血酸5mmol/L、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐5mmol/L、FeSO4·7H2O 0.5mmol/L、柠檬酸3mmol/L、各种底物化合物10mmol/L的50mmol/L MES缓冲液中，在20℃、pH6的条件下反应21小时。反应后的反应液利用实施例2中记载的条件的高效液相色谱(HPLC)进行分析。
关于使用2种无细胞提取液得到的反应液，将在LC-MS分析中确认到出现新的峰的底物的羟基氨基酸示于表2。确认到这些新反应产物的分子量比底物增加16，由此认为均为在羟基氨基酸上添加了氧原子而得到的二羟基氨基酸。
表2
质粒 底物氨基酸(反应产物增加的分子量)
pFoPA4H (5S)-羟基-L-哌可酸(16)
pAoPA4H (5S)-羟基-L-哌可酸(16)
pPcPa4H (5S)-羟基-L-哌可酸(16)
pGzaP4H (5S)-羟基-L-哌可酸(16)
pCgPA4H (5S)-羟基-L-哌可酸(16)
pEnPA4H (5S)-羟基-L-哌可酸(16)、(3R)-羟基-L-脯氨酸(16)
实施例5
＜哌可酸4位羟化酶基因表达质粒的构建＞
根据从土壤样品中直接回收的DNA的序列解析的结果，发现了认为可能是氨基酸羟化酶的基因的序列号15和17。将各自所编码的氨基酸序列示于序列号16和18。
通过PCR分别扩增出约1kbp的DNA片段。对于所得到的片段，按照实施例1中记载的方法导入到pQE80L(キアゲン公司制造)中。以下，将所得到的质粒分别称为pVsPA4H和pBsPA4H。
实施例6
＜哌可酸4位羟化酶的活性评价＞
使用实施例5中得到的2种质粒pVsPA4H和pBsPA4H，按照常规方法对大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta 2(DE3)(默克密理博公司制造)进行转化。将所得到的重组大肠杆菌分别使用含有氨苄青霉素50mg/L、氯霉素15mg/L、IPTG 1mmol/L的液体LB培养基在30℃下振荡培养，在培养第20小时收集菌体。使用由所得到的菌体得到的无细胞提取液，在含有α-酮戊二酸15mmol/L、抗坏血酸5mmol/L、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐5mmol/L、FeSO4·7H2O 0.5mmol/L、柠檬酸3mmol/L、底物化合物(L-哌可酸)10mmol/L的50mmol/L MES缓冲液中，在20℃、pH6的条件下反应21小时。
将反应后的反应液利用上述的高效液相色谱(HPLC)进行分析。其结果，在任一反应液中均确认到与反式-4-羟基-L-哌可酸的分子量一致的化合物。
Figure IDA0001066564810000011
Figure IDA0001066564810000021
Figure IDA0001066564810000031
Figure IDA0001066564810000041
Figure IDA0001066564810000051
Figure IDA0001066564810000061
Figure IDA0001066564810000071
Figure IDA0001066564810000081
Figure IDA0001066564810000091
Figure IDA0001066564810000101
Figure IDA0001066564810000111
Figure IDA0001066564810000121
Figure IDA0001066564810000131
Figure IDA0001066564810000141
Figure IDA0001066564810000151
Figure IDA0001066564810000161
Figure IDA0001066564810000171
Figure IDA0001066564810000181
Figure IDA0001066564810000191
Figure IDA0001066564810000201
Figure IDA0001066564810000211
Figure IDA0001066564810000221
Figure IDA0001066564810000231
Figure IDA0001066564810000241
Figure IDA0001066564810000251
Figure IDA0001066564810000261
Figure IDA0001066564810000271

Claims (8)

1.一种哌可酸4位羟化酶蛋白质，其具有在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L-哌可酸而生成反式-4-羟基-L-哌可酸的活性，所述哌可酸4位羟化酶蛋白质为由序列号18所表示的氨基酸序列构成的多肽，并且是未附加糖链的重组蛋白。
2.一种4-羟基氨基酸的制造方法，其特征在于，使哌可酸4位羟化酶蛋白质或含有该哌可酸4位羟化酶蛋白质的细胞、该细胞的制备物或对该细胞进行培养而得到的培养液与α-氨基酸发生作用而生成4-羟基氨基酸，所述哌可酸4位羟化酶蛋白质具有在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L-哌可酸而生成反式-4-羟基-L-哌可酸的活性，是由序列号2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列构成的多肽，并且是未附加糖链的重组蛋白。
3.如权利要求2所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，
所述α-氨基酸由下述通式(I)表示，所述4-羟基氨基酸由下述通式(II)表示，
Figure FDA0002948716320000011
式(I)中，R1、R2和R5分别表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，R3和R4分别表示氢原子、碳原子数1～3的烷基或羟基，R2可以与R5或氨基的氮原子键合而形成环结构，
Figure FDA0002948716320000012
式(II)中，R1、R2和R5分别表示氢原子或碳原子数1～3的烷基，R3和R4分别表示氢原子、碳原子数1～3的烷基或羟基，R2可以与R5或氨基的氮原子键合而形成环结构。
4.如权利要求2所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，所述α-氨基酸为哌可酸，所述4-羟基氨基酸为4-羟基-L-哌可酸。
5.如权利要求2～4中任一项所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，含有所述哌可酸4位羟化酶的细胞是被编码哌可酸4位羟化酶蛋白质的DNA转化了的细胞。
6.如权利要求5所述的4-羟基氨基酸的制造方法，其中，编码所述哌可酸4位羟化酶蛋白质的DNA为由序列号1、3、5、7、9、11、15或17所表示的碱基序列构成的DNA。
7.一种不具有糖基化能力的微生物，其为被编码哌可酸4位羟化酶蛋白质的DNA转化了的微生物，所述DNA为由序列号17所表示的碱基序列构成的DNA。
8.如权利要求7所述的微生物，其选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和棒状杆菌属。
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