JP2005253432A - タンパク質の生産方法、並びにそれに使用するための組成物、試薬及びキット - Google Patents

Abstract

【課題】 無細胞タンパク質合成系において、タンパク質を可溶状態で合成するタンパ
ク質の生産方法を提供する。
【解決手段】 無細胞抽出液中でタンパク質をコードする遺伝子と分子シャペロン活性
を有するＰＰＩａｓｅを共存させて、該遺伝子を発現させ、該ＰＰＩａｓｅの作用によっ
て目的のタンパク質を可溶状態で合成する。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅと
して、古細菌由来のＰＰＩａｓｅ等が用いられる。当該ＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活
性の発現にＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を必要としないので、従来の分子シャペロン
を用いる系に比べてタンパク質合成が簡便かつ経済的に行える。
【選択図】 図１

Description

本発明はタンパク質の生産方法、並びにそれに使用するための組成物、試薬及びキット
に関し、さらに詳細には、無細胞タンパク質合成系において分子シャペロン活性を有する
ＰＰＩａｓｅの作用によってタンパク質を可溶状態で合成するタンパク質の生産方法、並
びにそれに用いるための組成物、試薬及びキットに関する。

近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後の研究は遺伝子の発現産物であ
るタンパク質の網羅的な機能解析へと進むと考えられている。そして、個々のタンパク質
の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで生
命現象解明の一助としようとする研究が急速に増えつつある。

一般に、あるタンパク質の性質を決定しようとする場合は、まずそのタンパク質を一定
量確保する必要がある。そのための方法としては、そのタンパク質をコードする遺伝子を
取得し、当該遺伝子を組換えＤＮＡ技術によって大量発現させ、組換えタンパク質として
得る方法が好んで用いられている。そして、その具体的な方法としては、インビボ（ｉｎ
ｖｉｖｏ）の系である宿主細胞系とインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の系である無細胞
タンパク質合成系の２つがある。

宿主細胞系は、宿主となる細胞内にて遺伝子を発現させるものであり、例えば、目的の
タンパク質をコードする遺伝子をベクターに組込み、当該ベクターをバクテリア、酵母、
昆虫細胞等の宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換し、宿主細胞内で当該遺伝子を発現
させて、目的のタンパク質を組換えタンパク質として得るものである。この宿主細胞系は
、一部のタンパク質においては工業レベルの高生産に成功しているが、細胞毒性があるタ
ンパク質の場合は生産が困難であったり、簡便性に欠ける等の問題点を有している。一方
、無細胞タンパク質合成系（無細胞翻訳系、インビトロ翻訳系、あるいはインビトロトラ
ンスレーションともいう）は、無細胞抽出液に目的のタンパク質をコードする遺伝子を添
加し、試験管内で当該遺伝子を発現させてタンパク質を合成し、目的のタンパク質を組換
えタンパク質として得るものである。無細胞タンパク質合成系は、一定の条件下で反応を
数時間行うだけの簡便なタンパク質合成法であるため、ハイスループットなタンパク質の
生産方法として期待されている。また、細胞毒性があるタンパク質であっても問題なく合
成することができ、さらに非天然アミノ酸の導入やタンパク質の修飾が行いやすいという
特長も有している。したがって、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成は、タン
パク質の網羅的解析を行うための重要な技術の一つとなっている。

組換えタンパク質の性質や機能を正しく評価する際は、そのタンパク質が、正しい立体
構造を有するように折り畳み反応（フォールディング）が行われること、すなわち正常型
タンパク質として取得されていることが必要である。そして、正常型タンパク質は通常は
可溶性である。しかしながら、異種生物由来のタンパク質を宿主発現系や無細胞タンパク
質合成系で生産しようとする場合、その目的のタンパク質が正しく折り畳まれず、正しい
立体構造を有しない異常型タンパク質としてしか合成できないケースにしばしば遭遇する
。さらに、このような異常型タンパク質は可溶性ではなく封入体と呼ばれる不溶性の凝集
体として発現することが多い。そして、いったん封入体となった異常型タンパク質を折り
畳み直して（リフォールディングという）正しい立体構造に戻すことは困難な作業であり
、成功しないことが多い。このように、目的のタンパク質の折り畳み反応が正確に行われ
るようにタンパク質合成を制御することは、タンパク質の性質や機能を正しく評価する上
で極めて重要である。

無細胞タンパク質合成系において上記の問題を解決する方法として、反応液中に「タン
パク質折り畳み因子」と呼ばれるタンパク質を添加する方法がすでに提案されている。タ
ンパク質折り畳み因子は、非酵素的に働く「分子シャペロン」と酵素的に働く「フォルダ
ーゼ」に分類される。分子シャペロンの例としては大腸菌由来のタンパク質であるＤｎａ
Ｊ、ＤｎａＫ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ等があり、これらの分子シャペロンは
いずれもタンパク質の凝集形成を抑制し、折り畳みを介助する機能を有することが知られ
ている。一方、フォルダーゼとしては、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下ＰＤＩと称する。）や、ペプチ
ジルプロリルシストランスイソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔ
ｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、ＰＰＩａｓｅと称する。）がよく知られている。
このうち、ＰＤＩはタンパク質の分子間又は分子内ジスルフィド結合の形成などに関与す
る酵素である。一方ＰＰＩａｓｅは、細胞内でフォールディング途上の標的タンパク質に
作用して、標的タンパク質のプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性
化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。すなわち、ＰＤＩとＰ
ＰＩａｓｅはいずれもフォルダーゼの一種であるが、その作用は全く異なる。

分子シャペロンやＰＤＩを組換えタンパク質のフォールディングに適用した例として、
下記の特許文献に記載されている例がある。まず特許文献１には、大腸菌のＳ３０無細胞
抽出液中でロダネーゼ遺伝子を発現させる際に、分子シャペロンであるＤｎａＪ、Ｄｎａ
Ｋ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳの効果を検討し、これら５種類の分子シャペロ
ンを全て添加した場合に、ロダネーゼがその酵素活性を保持した正常型タンパク質として
可溶状態で発現された旨が記載されている。また特許文献２には、大腸菌のＳ３０無細胞
抽出液中でマンガンペルオキシダーゼの遺伝子を発現させる際に、分子シャペロンである
ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ及びＧｒｏＥＳ、並びにフォルダーゼであるウシ由来Ｐ
ＤＩ及びカビ由来ＰＤＩの効果を検討し、ＤｎａＫ単独、ＧｒｏＥＬ＋ＧｒｏＥＳ、Ｄｎ
ａＫ＋ＤｎａＪ＋ＧｒｏＥＬ＋ＧｒｏＥＳ、ウシ由来ＰＤＩ単独、カビ由来ＰＤＩ単独の
いずれを添加した場合でも、マンガンペルオキシダーゼがその酵素活性を保持した正常型
タンパク質として可溶状態で発現された旨が記載されている。以上のように、タンパク質
折り畳み因子に属する一部のタンパク質は、無細胞タンパク質合成系の反応液中に添加さ
れることにより、目的タンパク質の凝集を防ぎ、正しい立体構造を有するように目的タン
パク質を折り畳み、可溶状態で正常型タンパク質として合成することを可能としている。

フォルダーゼの一種であるＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈ
ｉｌｉｎ）型及びパーブリン（Ｐａｒｖｕｌｉｎ）型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型
ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６に結合して活性が阻害されるＰＰＩａ
ｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害剤である
シクロスポリンに結合して活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方
、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグ
ロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害されるものである。これら３種類のＰＰＩ
ａｓｅについては、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどないことが知られている。

上記した分子シャペロンの作用を表現するために、「分子シャペロン活性」なる語が用
いられている。分子シャペロン活性は、変性したタンパク質を元の正常型にリフォールデ
ィングさせる活性、又は変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性と定義され
る。後者の活性については、変性したタンパク質が不可逆的に凝集することを抑制すれば
、そのタンパク質は正しい立体構造をとる方向へ進み、結果的に正しくフォールディング
されるという知見に基づき、分子シャペロン活性の一つとして定義されている。そして、
一部のＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性の他に分子シャペロン活性をも有することが知ら
れている。例えば、下記の非特許文献１〜３には、古細菌由来のＰＰＩａｓｅが分子シャ
ペロン活性を有することが記載されている。すなわち、これらの古細菌由来ＰＰＩａｓｅ
は、分子シャペロン活性とＰＰＩａｓｅ活性の両方を有する多機能タンパク質である。

特表平８‐５０８６５１号公報 特開２００３‐１１６５９０号公報 古谷（Ｆｕｒｕｔａｎｉ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３９巻、第４５３頁以下、２０００年 井手野（Ｉｄｅｎｏ）ら、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６７巻、第３１３９頁以下、２０００年 井手野（Ｉｄｅｎｏ）ら、アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第４６４頁以下、２００２年

分子シャペロンであるＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ又はＧｒｏＥＳが標
的のタンパク質を正常型タンパクとして正しく折り畳むためには、高エネルギー物質であ
るＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を必要とする。したがって、無細胞タンパク質合成系
で分子シャペロン活性を機能させるためには、十分な量のヌクレオチド３リン酸をあらか
じめ加えておくか、途中で不足分を補充する必要がある。しかし、ヌクレオチド３リン酸
は非常に高価であり、長い時間あるいは大きいスケールで大量に使用することは経済性の
面で好ましくない。また、反応液中のＡＴＰ濃度が低下した場合、分子シャペロンが有す
るタンパク質の折り畳み促進効果が停止してしまい、逆に標的タンパク質の折り畳み中間
体を捕捉し、正しい立体構造を有するタンパク質の合成を抑制してしまう。

さらに、ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳは併用して使用することが望ましく、この際、Ｇｒｏ
ＥＬ分子又はＧｒｏＥＳ分子は目的のタンパク質分子と１：１の割合で結合して作用する
。しかし、ＧｒｏＥＬは分子量約６００００の各サブユニット１４〜１８個からなる巨大
なタンパク質であり、折り畳み反応を行うためには目的タンパク質に比して重量換算で大
量のＧｒｏＥＬが必要である。同様に、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、及びＧｒｐＥにおいても折
り畳み反応のためにはこれら３種を併用して用いることが望ましいが、ＤｎａＫの分子量
が約７００００であることを勘案すると、やはり重量換算で大量の分子を必要とする。し
たがって、これらのタンパク質を折り畳み反応に使用するためにはその用量が多大となり
、簡便性と経済性の両面で好ましくない。

一方、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの場合は、その分子シャペロン活性の
発現のためにＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を必要としない。さらに、ＰＰＩａｓｅは
分子量が約１００００〜５５０００程度であり単量体又は２量体のものが多いため、折り
畳み反応の際に必要とされる量は重量換算において少ない。しかしながら、分子シャペロ
ン活性を有するＰＰＩａｓｅの無細胞タンパク質合成における効果は明らかではない。

本発明の目的は、無細胞タンパク質合成系において、分子シャペロン活性を有するＰＰ
Ｉａｓｅの作用によってタンパク質を可溶状態で合成することができる簡便性と経済性に
優れたタンパク質の生産方法、並びにそれに用いるための組成物、試薬及びキットを提供
することにある。

上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、無細胞抽出液中でタンパク質
をコードする遺伝子と分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを共存させて、該遺伝子
を発現させ、該ＰＰＩａｓｅの作用によって前記タンパク質を可溶状態で合成することを
特徴とするタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法においては、無細胞タンパク質合成系でタンパク質をコ
ードする遺伝子と分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを共存させ、該ＰＰＩａｓｅ
の作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成する。すなわち、本発明のタンパク質
の生産方法においては、ＰＰＩａｓｅの分子シャペロン活性を利用するので、従来の分子
シャペロンとは異なりその活性発現のためにＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を必要とし
ない。さらに、従来の分子シャペロンのようにＡＴＰの不足による目的タンパク質の折り
畳み促進効果の停止や折り畳み中間体の捕捉といった問題も生じない。さらに、ＰＰＩａ
ｓｅはその分子量が約１００００〜５５０００程度と従来の分子シャペロンに比べて小さ
いので、本発明のタンパク質の生産方法に使用する際には重量換算においてきわめて少量
で目的のタンパク質に作用することができる。したがって、従来の分子シャペロンに比べ
てより簡便且つ経済的に可溶状態でタンパク質を合成することができる。さらに、本発明
のタンパク質の生産方法では、分子シャペロン活性とＰＰＩａｓｅが本来持つＰＰＩａｓ
ｅ活性との相乗効果により、従来の分子シャペロン（分子シャペロン活性のみを有する）
に比べて目的のタンパク質をさらに確実にフォールディングさせることができる。

また請求項２に記載の発明は、前記ＰＰＩａｓｅがＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであること
を特徴とする請求項１に記載のタンパク質の生産方法である。

分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅにおいても上記した３種類、すなわち、ＦＫ
ＢＰ型、シクロフィリン型、パーブリン型に分類することができる。そして本発明のタン
パク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしてＦＫＢＰ型ＰＰＩ
ａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状
態で合成することができる。

また請求項３に記載の発明は、前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが古細菌由来ＦＫＢＰ型Ｐ
ＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法である。

古細菌由来のＰＰＩａｓｅはＦＫＢＰ型であり、分子シャペロン活性を有している。そ
して本発明のタンパク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有する古細菌由来ＦＫＢＰ
型ＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質
を可溶状態で合成することができる。

また請求項４に記載の発明は、前記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがショートタイ
プＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の生産方
法である。

古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅはその分子量の大きさでショートタイプとロングタ
イプに区別される。このうち、ショートタイプのＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性が高
く、目的のタンパク質をフォールディングする際には特に好適である。したがって、本発
明のタンパク質の生産方法においては、目的のタンパク質をより確実にフォールディング
でき、可溶状態で合成することができる。

また請求項５に記載の発明は、前記ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＭｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来であることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の生
産方法である。

Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌はショートタイプのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを
有し、当該ＰＰＩａｓｅは高い分子シャペロン活性を有している。したがって、本発明の
タンパク質の生産方法においては、目的のタンパク質をより確実にフォールディングでき
、可溶状態で合成することができる。

また請求項６に記載の発明は、前記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがロングタイプ
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の生産方法
である。

ロングタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅにおいても、分子シャペロン活性を
有している。そして本発明のタンパク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有する古細
菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作
用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することができる。

また請求項７に記載の発明は、前記ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＰｙｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ属細菌由来のものであることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質の生産
方法である。

Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌はロングタイプのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを有し、当
該ＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有している。そして本発明のタンパク質の生産方
法は、分子シャペロン活性を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来ロングタイプＦＫＢ
Ｐ型ＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク
質を可溶状態で合成することができる。

また請求項８に記載の発明は、前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがトリガーファクタータイ
プＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法である。

古細菌由来以外のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、トリガーファクタータイプ、Ｆｋ
ｐＡタイプ及びＦＫＢＰ５２タイプのものが存在する。そして本発明のタンパク質の生産
方法は、分子シャペロン活性を有するトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅを用いるも
のであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成すること
ができる。

また請求項９に記載の発明は、前記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅが大腸菌由
来のものであることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質の生産方法である。

大腸菌はＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしてトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅを有し
、当該ＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有している。そして本発明のタンパク質の生
産方法は、分子シャペロン活性を有する大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓ
ｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で
合成することができる。

また請求項１０に記載の発明は、前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＦｋｐＡタイプＰＰＩ
ａｓｅであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓ
ｅとしてＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によ
って目的のタンパク質を可溶状態で合成することができる。

また請求項１１に記載の発明は、前記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅが大腸菌由来のもの
であることを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質の生産方法である。

大腸菌はＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしてＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅを有し、当該ＰＰ
Ｉａｓｅは分子シャペロン活性を有している。そして本発明のタンパク質の生産方法は、
分子シャペロン活性を有する大腸菌由来ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅを用いるものであり
、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することができる
。

また請求項１２に記載の発明は、前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＦＫＢＰ５２タイプＰ
ＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓ
ｅとしてＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用
によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することができる。

また請求項１３に記載の発明は、前記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅがヒト由来のも
のであることを特徴とする請求項１２に記載のタンパク質の生産方法である。

ヒトはＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしてＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅを有し、当該Ｐ
ＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有している。そして本発明のタンパク質の生産方法は
、分子シャペロン活性を有するヒト由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅを用いるもので
あり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することがで
きる。

また請求項１４に記載の発明は、前記ＰＰＩａｓｅがシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅで
あることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の生産方法である。

本発明においては、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして上記した３種類の
分類のうち、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅを用いる。すなわち本発明のタンパク質の生
産方法は、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしてシクロフィリン型ＰＰＩａｓ
ｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で
合成することができる。

また請求項１５に記載の発明は、前記シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅがＣｙＰ４０タイ
プＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１４に記載のタンパク質の生産方法である
。

シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅの一種としては、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅがある
。そして本発明のタンパク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有するシクロフィリン
型ＰＰＩａｓｅとしてＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａ
ｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することができる。

また請求項１６に記載の発明は、前記ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅがヒト由来のもの
であることを特徴とする請求項１５に記載のタンパク質の生産方法である。

ヒトはシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅとしてＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅを有し、当
該ＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有している。そして本発明のタンパク質の生産方
法は、分子シャペロン活性を有するヒト由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅを用いるもの
であり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することが
できる。

また請求項１７に記載の発明は、前記ＰＰＩａｓｅがパーブリン型ＰＰＩａｓｅである
ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の生産方法である。

本発明においては、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして上記した３種類の
分類のうち、パーブリン型ＰＰＩａｓｅを用いる。すなわち本発明のタンパク質の生産方
法は、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとしてパーブリン型ＰＰＩａｓｅを用い
るものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成する
ことができる。

また請求項１８に記載の発明は、前記パーブリン型ＰＰＩａｓｅがＳｕｒＡタイプＰＰ
Ｉａｓｅであることを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質の生産方法である。

パーブリン型ＰＰＩａｓｅの一種としては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅがある。そし
て本発明のタンパク質の生産方法は、分子シャペロン活性を有するパーブリン型ＰＰＩａ
ｓｅとしてＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅを用いるものであり、当該ＰＰＩａｓｅの作用に
よって目的のタンパク質を可溶状態で合成することができる。

また請求項１９に記載の発明は、前記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅが大腸菌由来のもの
であることを特徴とする請求項１８に記載のタンパク質の生産方法である。

大腸菌はパーブリン型ＰＰＩａｓｅとしてＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅを有し、当該Ｐ
ＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有している。そして本発明のタンパク質の生産方法は
、分子シャペロン活性を有する大腸菌由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅを用いるもので
あり、当該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を可溶状態で合成することがで
きる。

また請求項２０に記載の発明は、無細胞抽出液が大腸菌由来のものであることを特徴と
する請求項１乃至１９のいずれかに記載のタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法においては、無細胞タンパク合成系で特に実績がある大
腸菌の無細胞抽出液を用いる。したがって、遺伝子の転写及び翻訳がより確実に行われ、
さらに分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの作用によってより確実に可溶状態でタ
ンパク質を合成することができる。

また請求項２１に記載の発明は、前記タンパク質が抗体の一部又は全部であることを特
徴とする請求項１乃至２０のいずれかに記載のタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法においては、抗体の一部又は全部をコードする遺伝子を
無細胞タンパク質合成系にて発現させ、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの作用
させて可溶状態で抗体を合成する。かかる構成により、活性型の抗体を短時間で大量に得
ることができる。

また請求項２２に記載の発明は、前記ＰＰＩａｓｅに代わって分子シャペロン活性を有
するドメインに限定されたポリペプチドを使用することを特徴とする請求項１乃至２１の
いずれかに記載のタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法においては、完全長のＰＰＩａｓｅの代わりにその一部
である分子シャペロン活性を有するドメインに限定されたポリペプチドを用いる。当該ポ
リペプチドは完全長のＰＰＩａｓｅに比べて分子量が小さいので、重量換算においてきわ
めて少量で目的のタンパク質に作用することができる。

また請求項２３に記載の発明は、無細胞抽出液に分子シャペロン活性を有するＰＰＩａ
ｓｅを添加し、次いでタンパク質をコードする遺伝子を添加することを特徴とする請求項
１乃至２２のいずれかに記載のタンパク質の生産方法である。

本発明のタンパク質の生産方法においては、無細胞抽出液に分子シャペロン活性を有す
るＰＰＩａｓｅを添加し、次いでタンパク質のコードする遺伝子を添加する。かかる構成
により、合成直後のタンパク質に分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅが直ちに作用
することができ、より確実に可溶状態で目的のタンパク質を合成することができる。

また請求項２４に記載の発明は、請求項２３に記載のタンパク質の生産方法に使用する
ための組成物であって、無細胞抽出液と、タンパク質をコードする遺伝子と、分子シャペ
ロン活性を有するＰＰＩａｓｅを含むことを特徴とするタンパク質生産用組成物である。

本発明のタンパク質生産用組成物においては、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓ
ｅ（限定されたポリペプチドを含む）を含み、該ＰＰＩａｓｅの作用によって目的のタン
パク質を可溶状態で合成することができる。本発明の組成物はＡＴＰ等のヌクレオチド３
リン酸を含む必要がなく、経済的である。

また請求項２５に記載の発明は、請求項２３に記載のタンパク質の生産方法に使用する
ための試薬であって、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを少なくとも含むことを
特徴とするタンパク質生産用試薬である。

本発明のタンパク質生産用試薬は分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（限定され
たポリペプチドを含む）を含む。したがって、無細胞抽出物とタンパク質をコードする遺
伝子を含む組成物に本発明の試薬を添加することによって、目的のタンパク質を可溶状態
で合成することができる。

また請求項２６に記載の発明は、請求項２３に記載に記載のタンパク質の生産方法に使
用するためのキットであって、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを少なくとも含
むタンパク質生産用試薬と、無細胞抽出液を含むことを特徴とするタンパク質生産用キッ
トである。

本発明のタンパク生産用キットにおいては、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ
（限定されたポリペプチドを含む）を少なくとも含むタンパク質生産用試薬と無細胞抽出
液が含まれている。したがって、目的のタンパク質をコードする遺伝子を用意するだけで
、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質生産を簡便に行うことができる。

本発明により、無細胞タンパク質合成系において、分子シャペロン活性を有するＰＰＩ
ａｓｅの作用によってタンパク質を可溶状態で合成することができる簡便性と経済性に優
れたタンパク質の生産方法、並びにそれに用いるための組成物、試薬及びキットが提供さ
れた。

以下に、本発明を実施するための最良の形態について、詳細に説明する。

本発明のタンパク質の生産方法においては、無細胞抽出液、タンパク質をコードする遺
伝子及び分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの３つの要素が必須である。まず、第
１の要素である分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅについて、その分類と特徴を順
次説明する。既述のように、一般にＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ
ＢＰ型、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に大きく分類される。ＦＫＢＰ型は
、さらに古細菌由来、トリガーファクタータイプ、ＦｋｐＡタイプ及びＦＫＢＰ５２タイ
プに大別される。そしてさらに、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅはショートタイプ
とロングタイプに大別される。一方、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅについては、その一
分類としてＣｙＰ４０タイプがある。さらに、パーブリン型ＰＰＩａｓｅについては、そ
の一分類としてＳｕｒＡタイプがある。本発明においては、分子シャペロン活性を有する
ＰＰＩａｓｅであれば、以上のすべてのタイプのＰＰＩａｓｅが使用可能であり、当該Ｐ
ＰＩａｓｅの作用によって目的のタンパク質を無細胞タンパク質合成系において可溶状態
で合成することができる。

まず古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのうちのショートタイプとは、その分子量が
１６０００〜１８０００程度のものをいう。一方、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ
のうちのロングタイプとは、その分子量が２６０００〜３３０００程度のものをいう。古
細菌由来のＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有することが分かっており、ショートタ
イプとロングタイプのいずれのＰＰＩａｓｅも分子シャペロン活性を有する。さらにその
分子シャペロン活性の発現にはＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を必要としない。このう
ち、ショートタイプのＰＰＩａｓｅはより強い分子シャペロン活性を有するので、無細胞
タンパク合成系で使用する場合には有利である。一方、ロングタイプのＰＰＩａｓｅはシ
ョートタイプのＰＰＩａｓｅほど分子シャペロン活性が強くないが、それでも実用上は十
分な活性を有しているので、やはり本発明に使用可能である。なお、上記したショートタ
イプ及びロングタイプの分子量はこれまでに知られているものの値であり、この値を外れ
る分子量をもつ古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでも分子シャペロン活性を有する限り
本発明に使用可能である。

本発明に使用される分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの由来となる古細菌とし
ては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈ
ａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ
属、Ａｅｒｏｐｕｒｕｍ属、Ｐｕｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｆｅ
ｒｒｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｍ
ｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属が挙げられる。ここ
で、本発明に使用できる古細菌由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの例として、
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のＰＰＩａｓｅの遺伝子の塩基配列及び推定され
るアミノ酸配列を配列番号１に、そのアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。同様に、古
細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの例として、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌
由来のＰＰＩａｓｅの遺伝子の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号３に、そ
のアミノ酸配列のみを配列番号４に示す。なお、他の古細菌由来ショートタイプＦＫＢＰ
型ＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有
すると考えられる。さらに、他の古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのアミ
ノ酸配列は配列番号４に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。

次に、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの一種であるトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅに
ついて説明する。ここで、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅとは、バクテリア由来
であり且つリボゾーム結合活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをいう。トリガーファク
タータイプＰＰＩａｓｅはその分子量が４６０００〜５００００程度のものが一般的であ
る。そしてトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅは古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ
と同様に、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性として分子シャペロン活性を有する。トリ
ガーファクタータイプＰＰＩａｓｅはＮ末端ドメイン、中間ドメイン及びＣ末端ドメイン
の３つのドメインからなることが分かっているが（ツァルント（Ｚａｒｎｔ）ら、ジャー
ナル オブ モレキュラー バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ），第２７１巻，第８２７頁以下，１９９７年 に記載）、このうち分
子シャペロン活性を司っているのはＮ末端ドメイン及び／又はＣ末端ドメインであると考
えられている。したがって、トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅを本発明に使用する
ときは、全長を有する完全型トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの他に、Ｎ末端ドメ
イン及び／又はＣ末端ドメインのみに限定されたポリペプチドである改変型トリガーファ
クタータイプＰＰＩａｓｅも使用可能である。すなわち、完全型トリガーファクタータイ
プＰＰＩａｓｅを用いるときは、分子シャペロン活性とＰＰＩａｓｅ活性の両方を有する
のでそれらの相乗効果が期待でき、一方、改変型トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ
を用いるときは、分子量が小さくなるのでその使用量が少なくて済むという利点を有する
。

トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅはほとんどすべてのバクテリアや一部のマイコ
プラズマ類で見つかっている。本発明に使用されるトリガーファクタータイプＰＰＩａｓ
ｅの由来となるバクテリア等としては、例えば、大腸菌、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎ
ｉｔａｌｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔ
ｅｒｉｃａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｌｅｐｒａｅ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅ
ｒｉａｅのものが挙げられる。ここで、本発明に使用できるトリガーファクタータイプＰ
ＰＩａｓｅの例として、大腸菌由来のトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの遺伝子の
塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号５に、そのアミノ酸配列のみを配列番号
６に示す。大腸菌由来のトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅはその分子量が４８００
０程度である。なお、他のトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列は配列
番号６に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。

次に、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの別の一種であるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅについて
説明する。ここで、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅとは、グラム陰性バクテリアのペリプラ
ズムに存在するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをいう。ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅはその分子
量が２７０００〜３００００程度のものが一般的である。そしてＦｋｐＡタイプＰＰＩａ
ｓｅは古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様に、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性
として分子シャペロン活性を有する。ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅはＮ末端ドメイン及び
Ｃ末端ドメインの２つのドメインからなることが分かっているが（アリエ（Ａｒｉｅ）ら
，モレキュラー マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ），第３９巻，第１９９頁以下，２００１年 に記載）、このうち分子シャペロン活性
を司っているのはＮ末端ドメインであると考えられている。したがって、ＦｋｐＡタイプ
ＰＰＩａｓｅを本発明に使用するときは、全長を有する完全型ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓ
ｅの他に、Ｎ末端ドメインのみに限定されたポリペプチドである改変型ＦｋｐＡタイプＰ
ＰＩａｓｅも使用可能である。すなわち、完全型ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅを用いると
きは、分子シャペロン活性とＰＰＩａｓｅ活性の両方を有するのでそれらの相乗効果が期
待でき、一方、改変型ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅを用いるときは、分子量が小さくなる
のでその使用量が少なくて済むという利点を有する。

本発明に使用されるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの由来となるグラム陰性バクテリアと
しては、例えば、大腸菌、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｉｕｍ、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、
Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃ
ｅａｒｕｍが挙げられる。ここで、本発明に使用できるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの例
として、大腸菌由来のＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅの遺伝子の塩基配列及び推定されるア
ミノ酸配列を配列番号７に、そのアミノ酸配列のみを配列番号８に示す。大腸菌由来のＦ
ｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅはその分子量が２９０００程度である。なお、他のＦｋｐＡタ
イプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列は配列番号８に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有
すると考えられる。

次に、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのさらに別の一種であるＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓ
ｅについて説明する。ここで、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅとは、真核生物由来であ
り、分子量が４７０００〜５５０００程度で、ＦＫ５０６結合活性を有すると推定される
ドメインがＮ末端側から２個連なっており、Ｃ末端側にはヒートショックタンパク質の一
種であるＨＳＰ９０と結合することができるテトラトリコペプチドリピート（ＴＰＲ）と
呼ばれる繰り返し配列を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをいう。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰ
Ｉａｓｅは、さらにＣ末端側にカルモジュリン結合部位を有することが多い。そしてＦＫ
ＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅは古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様に、ＰＰＩａｓ
ｅ活性とは独立した活性として分子シャペロン活性を有する。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩ
ａｓｅはＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの２つのドメインからなることが分かってい
るが（アリエら，モレキュラー マイクロバイオロジー，第３９巻，第１９９頁以下，２
００１年 に記載）、このうち分子シャペロン活性を司っているのはＣ末端ドメインであ
ると考えられている。したがって、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅを本発明に使用する
ときは、全長を有する完全型ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅの他に、Ｃ末端ドメインの
みに限定されたポリペプチドである改変型ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅも使用可能で
ある。すなわち、完全型ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅを用いるときは、分子シャペロ
ン活性とＰＰＩａｓｅ活性の両方を有するのでそれらの相乗効果が期待でき、一方、改変
型ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅを用いるときは、分子量が小さくなるのでその使用量
が少なくて済むという利点を有する。

本発明に使用されるＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅの由来となる真核生物としては、
例えば、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、ラットが挙げられる。本発明に使用できるＦＫＢ
Ｐ５２タイプＰＰＩａｓｅの例として、ヒト由来のＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅの遺
伝子の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号９に、そのアミノ酸配列のみを配
列番号１０に示す。ヒト由来のＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅはその分子量が５２００
０程度である。なお、他のＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列は配列番号１
０に示されるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。

次に、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅの一種であるＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅにつ
いて説明する。ここで、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅとは、真核生物由来であり、分子
量が３８０００〜４２０００程度であり、シクロフィリンと相同的なドメインをＮ末端側
に有し、さらにＣ末端側にＴＰＲを有するシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅをいう。そして
ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様に、ＰＰＩａ
ｓｅ活性とは独立した活性として分子シャペロン活性を有する。ＣｙＰ４０タイプＰＰＩ
ａｓｅはＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの２つのドメインからなることが分かってい
るが（ギャラット（Ｇａｌａｔ）、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（Ｐｅ
ｐｔｉｄｙｌ−Ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ），オックスフ
ォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ），１９９８年 に
記載）、このうち分子シャペロン活性を司っているのはＣ末端ドメインであると考えられ
ている。したがって、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅを本発明に使用するときは、全長を
有する完全型ＦＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの他に、Ｃ末端ドメインのみに限定された
ポリペプチドである改変型ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅも使用可能である。すなわち、
完全型ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅを用いるときは、分子シャペロン活性とＰＰＩａｓ
ｅ活性の両方を有するのでそれらの相乗効果が期待でき、一方、改変型ＣｙＰ４０タイプ
ＰＰＩａｓｅを用いるときは、もはやＰＰＩａｓｅ活性はなく分子シャペロン活性のみを
有するが、分子量が小さくなるのでその使用量が少なくて済むという利点を有する。

本発明に使用されるＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの由来となる真核生物としては、例
えば、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、ラットが挙げられる。本発明に使用できるＣｙＰ４
０タイプＰＰＩａｓｅの例として、ヒト由来のＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの遺伝子の
塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号１１に、そのアミノ酸配列のみを配列番
号１２に示す。ヒト由来のＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅはその分子量が４００００程度
である。なお、他のＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列は配列番号１２に示さ
れるアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。

最後に、パーブリン型ＰＰＩａｓｅの一種であるＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅについて
説明する。ここで、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅとは、グラム陰性バクテリアのペリプラ
ズムに存在するパーブリン型ＰＰＩａｓｅをいう。ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅはその分
子量が４５０００〜５００００程度のものが一般的である。そしてＳｕｒＡタイプＰＰＩ
ａｓｅは古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと同様に、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活
性として分子シャペロン活性を有する。ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅはＮ末端ドメイン及
びＣ末端ドメインの２つのドメインからなることが分かっているが、このうち分子シャペ
ロン活性を司っているのはＮ末端ドメインであると考えられている（ベーレンス（Ｂｅｈ
ｒｅｎｎｓ）ら、ジ エンボ ジャーナル（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ），第２
０巻，第２８５頁以下，２００１年 に記載）。したがって、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓ
ｅを本発明に使用するときは、全長を有する完全型ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの他に、
Ｎ末端ドメインのみに限定されたポリペプチドである改変型ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ
も使用可能である。すなわち、完全型ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅを用いるときは、分子
シャペロン活性とＰＰＩａｓｅ活性の両方を有するのでそれらの相乗効果が期待でき、一
方、改変型ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅを用いるときは、もはやＰＰＩａｓｅ活性はなく
分子シャペロン活性のみを有するが、分子量が小さくなるのでその使用量が少なくて済む
という利点を有する。

本発明に使用されるＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの由来となるグラム陰性バクテリアと
しては、例えば、大腸菌、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｉｕｍ、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、
Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃ
ｅａｒｕｍが挙げられる。ここで、本発明に使用できるＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの例
として、大腸菌由来のＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの遺伝子の塩基配列及び推定されるア
ミノ酸配列を配列番号１３に、そのアミノ酸配列のみを配列番号１４に示す。大腸菌由来
のＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅはその分子量が４７０００程度である。なお、他のＳｕｒ
ＡタイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列は配列番号１４に示されるアミノ酸配列と高い相同
性を有すると考えられる。

なお、上記した各タイプのＰＰＩａｓｅとアミノ酸配列において相同性を有し、分子シ
ャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであれば、それらは実質的に同一であり、すべて本発
明に使用することができる。すなわち、ワイルドタイプの分子シャペロン活性を有するＰ
ＰＩａｓｅと、実質的に同等の機能を有していれば、構成アミノ酸の一部を別のアミノ酸
置換したものであってもよい。すなわち、ワイルドタイプのＰＰＩａｓｅに対し、そのア
ミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個
（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好
ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１
〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ま
しくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミ
ノ酸が他のアミノ酸で置換された、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであればよ
い。

本発明のタンパク質の生産方法において使用するＰＰＩａｓｅの使用量は、添加した遺
伝子の発現量、すなわち目的のタンパク質の合成量によって適宜選択すればよい。そのた
めには、あらかじめその無細胞タンパク質合成系での発現量を測定しておくことが好まし
い。例えば、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを添加しない系で無細胞タンパク
質合成を行ってみて、封入体として得られる目的タンパク質の合成量を測定し、そのモル
数を算出する。そして、本発明のタンパク質の生産方法である分子シャペロン活性を有す
るＰＰＩａｓｅを添加する系でタンパク質合成において、そのモル数のタンパク質をフォ
ールディングするために必要な量、例えば１〜２０倍モル量のＰＰＩａｓｅを無細胞抽出
液に添加すればよい。

分子シャペロン活性の測定方法としては、例えば、以下の方法がある。すなわち、ロダ
ネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等
をモデル酵素とし（河田、バイオサイエンスとインダストリー 第５６巻，第５９３頁以
下，１９９８年 に記載）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処
理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生
率や、変性タンパク質の凝集の抑制率でその検定対象物の分子シャペロン活性を評価する
ことができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネー
ゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、メソッヅ イン モレキュラー
バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），第４０
巻，第３６１頁以下，１９９５年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方
法としては田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２６９巻
，第８５２９頁以下，１９９４年）等が挙げられる。

次に、本発明のタンパク質の生産方法における第２の要素である無細胞抽出液について
説明する。本発明のタンパク質の生産方法に使用される無細胞抽出液の由来としては、大
腸菌、小麦胚芽、昆虫細胞、ウサギ網状赤血球等が代表的であり、さらに他の真生細菌や
古細菌などの原核生物の細胞、酵母、植物、動物などの真核生物の細胞も使用可能である
。また、目的タンパク質及びその遺伝子の種類によって適したものを選択することもでき
る。例えば、目的タンパク質がバクテリア由来のものであれば、大腸菌由来の無細胞抽出
液が好適である。同様に、目的タンパク質が植物あるいは植物ウイルス由来のものであれ
ば、小麦胚芽由来の無細胞抽出液が好適である。同様に、目的タンパク質が動物あるいは
動物ウイルス由来のものであれば、ウサギ網状赤血球由来の無細胞抽出液が好適である。
無細胞抽出液の調製は、例えば、各細胞を破砕して遠心分離等の操作で上清画分を回収す
ることにより得ることができる。なお、無細胞抽出液を調製する際の細胞破砕方法は公知
の方法を使用することができ、例えば機械的破砕法を使用することができる。機械的破砕
法の例としては、ホモジナイザーによる破砕、圧力変化による破砕、超音波による破砕等
が挙げられる。また、機械的破砕法以外の方法、例えば低張処理や酵素処理も使用可能で
ある。また、自家調製ではなく市販されている各種の無細胞抽出液を使用することもでき
る。

次に、本発明のタンパク質の生産方法における第３の要素であるタンパク質をコードす
る遺伝子について説明する。本発明のタンパク質の生産方法に使用するタンパク質をコー
ドする遺伝子は、プラスミドに挿入された状態や、ＰＣＲ等で増幅したＤＮＡ断片内に含
まれている状態で添加することができる。この際、当該遺伝子の上流にプロモーター配列
とＳＤ配列が配置されることが望ましく、さらに下流にターミネーター配列を配置しても
よい。好ましいプロモーター配列とターミネーター配列の例としては、Ｔ７プロモーター
及びＴ７ターミネーターが挙げられる。また、使用する無細胞抽出液が真核生物由来の場
合は、転写されたｍＲＮＡの５’末端にキャップ構造を付与できるように遺伝子を構成す
ることが好ましい。当該遺伝子がコードするタンパク質、すなわち本発明のタンパク質の
生産方法によって可溶状態で合成されるタンパク質の例としては、各種の酵素類、イムノ
グロブリン、ウイルス由来タンパク質（外被タンパク質、コアタンパク質、プロテアーゼ
、インテグラーゼ等）、成長因子（増殖因子）類、各種ホルモン・サイトカイン、Ｇタン
パク質共役型受容体等の膜受容体などが挙げられる。イムノグロブリンの例としては、Ｉ
ｇＧ、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ）₂フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げ
られる。ウイルスの例としては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイル
ス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルスが挙げられる。成長因子
の例としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子
（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子・栄養因子（ＮＧ
Ｆ又はＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）が挙げ
られる。ホルモン・サイトカインの例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェ
ロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニ
ー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヒト成
長ホルモン、アルブミンが挙げられる。

本発明のタンパク質の生産方法で無細胞タンパク質合成を行う際は、その反応液（組成
物）に上記の３要素の他にタンパク質合成をさらに向上させるためのものを含めることが
できる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼの基質となる各種ヌクレオチ
ド３リン酸（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）、各種アミノ酸、各種ｔＲＮＡ、リボゾ
ームフラクション、各種リン酸化酵素等をエネルギー再生因子としてさらに添加すること
ができる。例えば、プロモーター配列にＴ７プロモーターを使用する場合は、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼを加えることが好ましい。また、大腸菌由来の無細胞抽出液を使用するが、
遺伝子の使用コドンが大腸菌におけるレアコドンを含む場合は、レアコドンに対応するｔ
ＲＮＡを添加することが好ましい。

無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質生産のシステムは、バッチ式と連続式があ
る。バッチ式は最も容易なシステムで、閉鎖系で合成反応を行うものである。一方、連続
式は、限外ろ過膜を介して反応液にヌクレオチド３リン酸等の基質類を連続的に添加し、
あるいは反応液から老廃物を連続的に除去するもので、２つの方式がある。一つはＣＦＣ
Ｆシステム（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ）で
あり、もう一つはＣＥＣＦシステム（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｅｌ
ｌ−Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ）であるが、後者のＣＥＣＦシステムが好んで用いられてい
る。本発明のタンパク質の生産方法は、いずれのシステムにも適用可能である。すなわち
、バッチ式であれば、反応液中に分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを添加し、そ
のままタンパク質合成反応を行えばよい。必要に応じてＰＰＩａｓｅを反応中にさらに添
加することもできる。またＣＥＣＦシステムの場合は、バッチ式と同様に反応液中に分子
シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを添加しておけば、ＰＰＩａｓｅは限外ろ過膜を通
過することなく反応液中に留まるので、連続的にＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用さ
せることができる。ＣＦＣＦシステムの場合は、限外ろ過膜をＰＰＩａｓｅが通過しない
ような工夫が必要であるが、担体やその限外ろ過膜内側にＰＰＩａｓｅを固定化すること
で対応可能である。

本発明のタンパク質生産用組成物は、上記した３つの要素、すなわち、無細胞抽出液と
タンパク質をコードする遺伝子と分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（限定された
ポリペプチドを含む）とを少なくとも含むものである。無細胞抽出液、タンパク質をコー
ドする遺伝子、及び分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、上記したすべてのもの
が使用可能である。さらに本発明のタンパク質生産用組成物は、上記の３要素の他に、Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、各種ヌクレオチド３リン酸、各種アミノ酸、各種ｔＲＮＡ、リボゾー
ムフラクション、各種リン酸化酵素等を含んでいてもよい。

分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（限定されたポリペプチドを含む）を有効成
分として、無細胞タンパク質合成系に使用するための試薬を調製することができる。本発
明のタンパク質生産用試薬は、少なくとも分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを含
むものである。さらに本発明のタンパク質生産用試薬は、その他の成分として安定化剤等
を含むものでもよい。安定化剤としては、一般にタンパク質の安定化剤として用いられて
いるものを使用することができ、アルブミン、糖類、ポリオール類、アミノ酸類、適宜の
塩などを用いることができる。また本発明のタンパク質生産用試薬の形状は、水溶液でも
よいし凍結乾燥物でもよい。凍結乾燥物の場合は適宜の緩衝液で溶解して使用することに
なる。本発明のタンパク質生産用試薬は、市販の無細胞タンパク質合成用キットを使用す
るときでも、その反応液に別途添加して使用することができ、より簡便に目的のタンパク
質を可溶状態で合成することができる。

また、本発明のタンパク質の生産方法を簡便に行うために、必要な試薬類をまとめてキ
ットとすることができる。本発明のタンパク質生産用キットは、上記した本発明のタンパ
ク質生産用試薬と無細胞抽出液を少なくとも含むものである。さらに本発明のタンパク質
生産用キットは、その他の試薬類として、各種ヌクレオチド３リン酸、各種アミノ酸、各
種ｔＲＮＡ、発現用のプラスミドベクター、反応用チューブ等を含むものでもよい。

以下に、本発明を実施例をもって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。

まず、本実施例で使用されるＰＣＲ用の各プライマーについて、ターゲット遺伝子、プ
ライマーの名称、プライマーの塩基配列、塩基配列に含まれる制限酵素サイト、及び対応
する配列表の配列番号を表１に示す。

（実施例１）古細菌由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの発現系構築
ＤＳＭより入手したＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ＤＳＭカタ
ログ番号２６６１）の菌懸濁液をそれぞれ約５０μＬ（５０ｍｍ³）採取し、１５０００
ｒｐｍ×５分間遠心分離することにより、菌体を回収した。ＴＥ緩衝液５００μＬにて菌
体を２回洗浄した後、０．１％ＳＤＳを含むＴＥ緩衝液に懸濁し、９５℃にて６０分間溶
菌処理を行った。等量のＴＥ緩衝液飽和フェノール及びクロロホルムにて除タンパク処理
を行った後、エタノール沈殿を行いゲノムＤＮＡを得た。

配列番号１に示すＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＰＰＩａｓ
ｅ（以下、ＭＪＦＫＳと称する）遺伝子の塩基配列情報を元にプライマーを設計し、それ
らのプライマー対と得られたゲノムＤＮＡでＰＣＲを行い、ＭＪＦＫＳ遺伝子を増幅する
ことを試みた。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示すＭＪＦＫＳ‐Ｆ１（配列番号１
５）及びＭＪＦＫＳ‐Ｒ１（配列番号１６）をそれぞれ用いた。表１に示すように、これ
らのプライマーはその配列中にＮｄｅＩ又はＢａｍＨＩの制限酵素サイトを含んでいる。
ＰＣＲ法によって得られた各々の増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動により分離後、
目的のＤＮＡ断片を含むバンド部分を切り出し、フェノール・クロロホルム処理及びエタ
ノール沈殿により目的ＤＮＡの抽出を行った。抽出したＤＮＡを滅菌水に溶解し、各約１
０〜１００ｎｇに対して１０倍量のｐＴ７ｂｌｕｅＴプラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社）を加え、さらに１６℃にて１時間処理することによりＤＮＡ断片をｐＴ７ｂｌｕｅ
Ｔプラスミドベクターにライゲーションした。このライゲーション反応液をコンピテント
セル大腸菌ＪＭ１０９株に加えることによりトランスフォーメーションした。これら菌株
の懸濁液を１００μｇ／ｍＬアンピシリンナトリウム、１００μＭ（１００μｍｏｌｅ／
Ｌ） ＩＰＴＧ及び０．００４％ Ｘ−Ｇａｌを含有するＬＢ寒天培地に接種し、一晩３
７℃にて培養して複数の白色コロニーを得た。

得られた複数の白色コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、各プラスミドＤＮＡを鋳
型とするＰＣＲを行った。プライマーは上記と同様に表１に示されるＭＪＦＫＳ‐Ｆ１（
配列番号１５）及びＭＪＦＫＳ‐Ｒ１（配列番号１６）を用いた。その結果、ＤＮＡ断片
が増幅されたプラスミドを保有していた白色コロニーを陽性コロニーとした。その陽性コ
ロニーから得たプラスミドＤＮＡを回収した後、そのプラスミドＤＮＡを鋳型とし、ＢＩ
Ｇ Ｄｙｅ（ＰＥＲＫＩＮ‐ＥＬＭＥＲ社）を用いたシーケンス反応を行うことにより、
プラスミドに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列用のプライマー
は同社製のＴ７プロモータープライマー及びＵ−１９リバースプライマーを用いた。決定
した塩基配列をデータベース上のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉの
ゲノムＤＮＡの塩基配列と比較した結果、得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、配列番号１
に示すＭＪＦＫＳ遺伝子の塩基配列と相違ないことを確認した。以上のようにして、ＭＪ
ＦＫＳ遺伝子を得た。

得られたＭＪＦＫＳ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡについて、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ、
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ又はＮｏｔＩの各制限酵素にて切断処理を行った。なお、これ
らの制限酵素サイトは表１に示す各プライマーの塩基配列に含まれている。切断処理した
ＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動により分離・抽出した後、あらかじめ制限酵素
処理したｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にライゲーションした。得
られたライゲーション反応液をコンピテントセル大腸菌ＪＭ１０９株に加えることにより
大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォーメーションした後、ＭＪＦＫＳ遺伝子を含む陽性コ
ロニーからプラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドにてコンピテントセル大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をトランスフォーメーションし、ＭＪＦＫＳ遺
伝子を含む組換え大腸菌を得た。

（実施例２）古細菌由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの調製
実施例１で得られた組換え大腸菌を用いてＭＪＦＫＳの発現を試みた。２Ｌ容の三角フ
ラスコに７００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌ バクトトリ
プトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７．５）を仕込み
、実施例１で得られた組換え大腸菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養
（１１０ｒｐｍ）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０分間）にて菌体を回収した
。得られた菌体を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２
０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて一晩凍結保存した。凍結した菌体を融解した後に超音波破
砕し、遠心分離して得られた上清（菌体破砕液）を下記に示した（ａ）〜（ｄ）に示す条
件のカラムクロマトグラフィーでカラム精製を繰り返し、ＭＪＦＫＳの精製標品を得た。
精製標品をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分析したところ、ＭＪＦＫＳが単一のバンドとして検出さ
れた。

（各カラムクロマトグラフィーの条件）
（ａ）の条件は以下のとおりである。
カラム： ＤＥＡＥ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ カラム（直径２６ｍｍ×長さ４０ｃｍ、東ソ
ー社）
溶離液
Ａ液：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
溶出条件
０−３００分：Ｂ液０→１００％の直線グラジエント溶出
３００−４２０分：Ｂ液１００％のイソクラティック溶出
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃

（ｂ）の条件は以下のとおりである。
カラム：ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ カラム（直径２６
ｍｍ×長さ６０ｃｍ、アマシャムファルマシアバイオテク社）
溶離液：０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０
）
溶出条件
イソクラティック溶出
流速：３ｍＬ／分
カラム温度：２５℃

（ｃ）の条件は以下のとおりである。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（直径７．５ｍｍ×長さ７．５ｃｍ
、東ソー社）
溶離液
Ａ液：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
溶出条件
０−１０分：Ｂ液０％（Ａ液１００％）のイソクラティック溶出
１０−６０分：Ｂ液０→１００％の直線グラジエント溶出
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃

（ｄ）の条件は以下のとおりである。
カラム：ＨｉＬｏａｄ ｐｈｅｎｙｌカラム（直径１６ｍｍ×長さ１０ｃｍ、アマシャム
ファルマシアバイオテク社）
溶離液
Ａ液：１．８Ｍ 硫酸アンモニウムを含む１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）
Ｂ液：１００ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
溶出条件
０−１０分：Ｂ液０％（Ａ液１００％）のイソクラティック溶出
１０−１２０分：Ｂ液０→１００％の直線グラジエント溶出
１２０−１８０分：Ｂ液１００％のイソクラティック溶出
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：２５℃

（実施例３）他のＰＰＩａｓｅの発現系構築及び調製
古細菌由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしてＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒ
ｉｋｏｓｈｉｉ由来ＰＰＩａｓｅ(ＰｈＦＫ)を、トリガータイプＰＰＩａｓｅ(ＴＦ)、Ｆ
ｋｐＡ型ＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅとしてそれぞれ大腸菌由来のもの
を、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅとしてそれぞれ
ヒト由来のものを、それぞれ実施例１及び２と同様の手順で発現系を構築し、調製した。
すなわち、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＪＣＭカタログ番号９９７４
、ＤＳＭカタログ番号１２４２８）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されるＰｈＦＫ
−Ｆ１（配列番号１７）及びＰｈＦＫ−Ｒ１（配列番号１８）のプライマー対を用いてＰ
ＣＲを行い、ＰｈＦＫ遺伝子（配列番号３）の取得を試みた。同様に、大腸菌ＪＭ１０９
株（タカラバイオ社）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示されるＴＦ−Ｆ１（配列番号
１９）及びＴＦ−Ｒ１（配列番号２０）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＴＦ遺伝
子（配列番号５）の取得を試みた。同様に、大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡを鋳型と
し、表１に示されるＦＫＰＡ−Ｆ１（配列番号２１）及びＦＫＰＡ−Ｒ１（配列番号２２
）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＦｋｐＡ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子（配列番号７）
の取得を試みた。同様に、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、
表１に示されるＦＫＢＰ５２−Ｆ１（配列番号２３）及びＦＫＢＰ５２−Ｒ１（配列番号
２４）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ遺伝子（
配列番号９）の取得を試みた。同様に、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、表１に
示されるＣＰ４０−Ｆ１（配列番号２５）及びＣＰ４０−Ｒ１（配列番号２６）のプライ
マー対を用いてＰＣＲを行い、ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ遺伝子（配列番号１１）の
取得を試みた。同様に、大腸菌ＪＭ１０９株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示される
ＳＵＲ−Ｆ１（配列番号２７）及びＳＵＲ−Ｒ１（配列番号２８）のプライマー対を用い
てＰＣＲを行い、ＳｕｒＡ型ＰＰＩａｓｅ遺伝子（配列番号１３）の取得を試みた。なお
、表１に示すように、各プライマーの塩基配列には制限酵素サイトが含まれている。

以下の手順は全て実施例１及び２に記載の方法と同様にして行った。まず各ＤＮＡを鋳
型とし、各プライマー対を用いてＰＣＲを行って増幅されたＤＮＡ断片を実施例１と同様
の方法で単離・精製し、ｐＴ７ｂｌｕｅＴプラスミドベクターにライゲーションした後、
大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフォーメンションして陽性コロニーを得た。各陽性コロニ
ーから得られたプラスミドＤＮＡに対してシーケンス反応を行って、挿入されたＤＮＡ断
片の塩基配列を決定し、その塩基配列がデータベースの各ＰＰＩａｓｅ遺伝子の塩基配列
（配列番号３、５、７、９、１１、１３又は１５）と相違ないことを確認した。実施例１
と同様の方法で、得られた各ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡについて、各プ
ライマーにその認識サイトが含まれる制限酵素で処理し、ｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡ
にライゲーションして、各ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを取得した。この
プラスミドＤＮＡにて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をトランスフォーメーションした。次
に、実施例２と同様の方法で、各組換え大腸菌を培養して菌体を取得した。得られた菌体
を超音波破砕し、得られた菌体抽出液を上記（ａ）〜（ｄ）の各種クロマトグラフィーで
分離・精製し、各ＰＰＩａｓｅの精製標品を得た。

（実施例４）ｓｃＦｖの発現ベクターの構築
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントの発現プラスミドｐＡＡＬＳＣ（
伊庭ら ジーン（Ｇｅｎｅ）、第１９４巻、第３５頁以下、１９９７年 に記載）を鋳型
とし、表１に示したＳｃＦ−Ｆ３（配列番号２９）及びＳｃＦ−Ｒ３（配列番号３０）を
プライマーとしてＰＣＲを行い、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃＦｖフラグメントの
遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングによりｐ
Ｔ７ｂｌｕｅベクターにライゲーションし、制限酵素ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩで処理後、あ
らかじめ同制限酵素により処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドベクターにライゲーシ
ョンすることで、上記ｓｃＦｖの発現プラスミドを構築した。

（実施例５）ｓｃＦｖの無細胞合成に及ぼすＰＰＩａｓｅの影響
実施例４で構築したｓｃＦｖ発現プラスミドにて、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ ｓｃ
Ｆｖフラグメントを無細胞タンパク質合成系にて発現させることを試みた。無細胞抽出液
として、ロシュダイアグノスティック社製大腸菌無細胞抽出液ＲＴＳ１００ Ｅ.ｃｏｌ
ｉ ＨＹ Ｋｉｔに含まれているものを使用した。すなわち、キットに含まれている大腸
菌由来の無細胞抽出液を含む反応液３５μＬに、実施例４で調製した上記ｓｃＦｖ発現プ
ラスミド０．５μｇを添加し、さらに実施例２及び３で調製した各ＰＰＩａｓｅを最終濃
度１μＭとなるように添加した。最終の反応容量は４５μＬとした。各反応液を３０℃に
て６時間インキュベートし、ｓｃＦｖの無細胞合成反応を行った。各反応液を遠心分離に
て上清画分と沈殿画分に分離し、その上清５μＬをＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供し、ｓｃＦｖの
合成量を評価した。ｓｃＦｖの合成量は、電気泳動ゲルをＣＢＢ染色した後、上清画分に
発現したｓｃＦｖのバンド密度をデンシトメータで定量した。比較例としてＰＰＩａｓｅ
を含まない反応系についても同時に評価した。評価結果を図１に示す。各ＰＰＩａｓｅを
添加した場合に上清画分に合成されるｓｃＦｖの量は、各ＰＰＩａｓｅ添加しなかった場
合と比較して有意に向上した。特に、ＭＪＦＫＳを添加した系の合成量が優れていた。な
お、ＰＰＩａｓｅを含まない比較例の系では、合成されたｓｃＦｖの大半が封入体となっ
て沈殿画分に存在していた。以上のように、分子シャペロン活性を有する各ＰＰＩａｓｅ
の作用によって、無細胞タンパク質合成系でｓｃＦｖを可溶状態で合成することができた
。

（実施例６）ロダネーゼの発現ベクターの構築
実施例３と同様の方法で、好熱菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘのロダネーゼ発現
ベクターを構築した。まず、理化学研究所（ＪＣＭ）から入手した超好熱菌Ａｅｒｏｐｙ
ｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ（ＪＣＭカタログ番号９８２０。ＤＳＭカタログ番号１１８７９と
同じ。）の菌ペレットより実施例１と同様の方法でゲノムＤＮＡを調製した。得られたゲ
ノムＤＮＡを鋳型として表１に示したＡｐＴＳ‐Ｆ１（配列番号３１）及びＡｐＴＳ‐Ｒ
１（配列番号３２）プライマーとして用いるＰＣＲ法によりＡｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒ
ｎｉｘ由来のロダネーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお表１に示すように、Ａ
ｐＴＳ‐Ｆ１の５'末端側及びＡｐＴＳ‐Ｒ１の３'末端側にはそれぞれ制限酵素サイトが
ある。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、あらかじめ
同制限酵素により処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドベクターにライゲーションする
ことで、上記ロダネーゼの発現プラスミドを構築した。

（実施例７）ロダネーゼの無細胞合成に及ぼすＰＰＩａｓｅの影響
超好熱菌由来ロダネーゼの無細胞タンパク質合成系において古細菌由来ショートタイプ
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの影響を評価した。無細胞合成系は実施例５と同様にＲＴＳ１０
０ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔを使用した。実施例６で調製した上記ロダネーゼの発現
プラスミド０．５μｇをキットに含まれている大腸菌由来の無細胞抽出液に添加し、実施
例２で調製したＭＪＦＫＳを最終濃度０〜５μＭとなるように添加した（０は無添加）。
実施例５と同様の方法でロダネーゼの無細胞タンパク質合成を行い、上清中のロダネーゼ
の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて評価した。評価結果を図２に示す。すなわち、ＭＪＦＫＳが
０〜１μＭの濃度範囲では、上清中のロダネーゼ量がＭＪＦＫＳの濃度に依存して向上し
た。一方、ＭＪＦＫＳが１〜５μＭの濃度範囲では上清中のロダネーゼ量はほとんど変化
がなく、可溶状態のロダネーゼ合成量は最大に達していると思われた。以上より、分子シ
ャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであるＭＪＦＫＳの作用によって、無細胞タンパク質
合成系でロダネーゼを可溶状態で合成することができた。

（実施例８）分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを含むタンパク質生産用試薬の調
製
実施例２で得られたＭＪＦＫＳの精製標品を脱塩、濃縮及び乾燥した。得られたＭＪＦ
ＫＳ乾燥品を２０μＭの濃度になるように５０ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）
に溶解し、ＭＪＦＫＳを含むタンパク質生産用試薬を調製した。

（実施例９）分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを含むタンパク質生産用キットの
構築
以下の構成にて、タンパク質生産用キット（１０回分）を構築した。本キットの輸送及
び保存の温度は−８０℃以下とした。
（キットの構成）
１．大腸菌Ｓ３０無細胞抽出液 ２５μＬ×１０本
２．２０μＭ ＭＪＦＫＳ溶液（１０倍濃度） ５０μＬ×１本
３．アミノ酸混合液（１０倍濃度） ５０μＬ×１本
４．ヌクレオチド混合液（１０倍濃度） ５０μＬ×１本
５．２００μＬ容ポリプロピレン製マイクロチューブ×１０本
このうち、アミノ酸混合液は２０種の必須アミノ酸を各５ｍＭの濃度で含むものである。
また、ヌクレオチド混合液はＲＮＡ合成の際の基質であり、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及び
ＣＴＰを各１０〜１５ｍＭの濃度で含むものである。ポリプロピレン製マイクロチューブ
は滅菌処理され、さらにＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの不活化処理をされたものである。

無細胞タンパク質合成系でｓｃＦｖを合成する際の各ＰＰＩａｓｅの影響を示すグラフである。 無細胞タンパク質合成系でロダネーゼを合成する際のＭＪＦＫＳの影響を示すグラフである。

Claims (26)

1. 無細胞抽出液中でタンパク質をコードする遺伝子と分子シャペロン活性を有するＰＰＩ
   ａｓｅを共存させて、該遺伝子を発現させ、該ＰＰＩａｓｅの作用によって前記タンパク
   質を可溶状態で合成することを特徴とするタンパク質の生産方法。
2. 前記ＰＰＩａｓｅがＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１に記載の
   タンパク質の生産方法。
3. 前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴と
   する請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
4. 前記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであ
   ることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の生産方法。
5. 前記ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来
   であることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質の生産方法。
6. 前記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである
   ことを特徴とする請求項３に記載のタンパク質の生産方法。
7. 前記ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌由来のもので
   あることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質の生産方法。
8. 前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅであることを特
   徴とする請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
9. 前記トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅが大腸菌由来のものであることを特徴とす
   る請求項８に記載のタンパク質の生産方法。
10. 前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請
    求項２に記載のタンパク質の生産方法。
11. 前記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅが大腸菌由来のものであることを特徴とする請求項１
    ０に記載のタンパク質の生産方法。
12. 前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とす
    る請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
13. 前記ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅがヒト由来のものであることを特徴とする請求項
    １２に記載のタンパク質の生産方法。
14. 前記ＰＰＩａｓｅがシクロフィリン型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１に
    記載のタンパク質の生産方法。
15. 前記シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅがＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅであることを特徴
    とする請求項１４に記載のタンパク質の生産方法。
16. 前記ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅがヒト由来のものであることを特徴とする請求項１
    ５に記載のタンパク質の生産方法。
17. 前記ＰＰＩａｓｅがパーブリン型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１に記載
    のタンパク質の生産方法。
18. 前記パーブリン型ＰＰＩａｓｅがＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅであることを特徴とする
    請求項１７に記載のタンパク質の生産方法。
19. 前記ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅが大腸菌由来のものであることを特徴とする請求項１
    ８に記載のタンパク質の生産方法。
20. 無細胞抽出液が大腸菌由来のものであることを特徴とする請求項１乃至１９のいずれか
    に記載のタンパク質の生産方法。
21. 前記タンパク質が抗体の一部又は全部であることを特徴とする請求項１乃至２０のいず
    れかに記載のタンパク質の生産方法。
22. 前記ＰＰＩａｓｅに代わって分子シャペロン活性を有するドメインに限定されたポリペ
    プチドを使用することを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載のタンパク質の生
    産方法。
23. 無細胞抽出液に分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを添加し、次いでタンパク質
    をコードする遺伝子を添加することを特徴とする請求項１乃至２２のいずれかに記載のタ
    ンパク質の生産方法。
24. 請求項２３に記載のタンパク質の生産方法に使用するための組成物であって、無細胞抽
    出液と、タンパク質をコードする遺伝子と、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを
    含むことを特徴とするタンパク質生産用組成物。
25. 請求項２３に記載のタンパク質の生産方法に使用するための試薬であって、分子シャペ
    ロン活性を有するＰＰＩａｓｅを少なくとも含むことを特徴とするタンパク質生産用試薬
    。
26. 請求項２３に記載に記載のタンパク質の生産方法に使用するためのキットであって、分
    子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを少なくとも含むタンパク質生産用試薬と、無細
    胞抽出液を含むことを特徴とするタンパク質生産用キット。

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