KR102289258B1 - 상승된 수준의 외인성 샤페론을 갖는 세포 추출물을 이용한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서의 생물학적 활성 단백질의 발현 - Google Patents

상승된 수준의 외인성 샤페론을 갖는 세포 추출물을 이용한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서의 생물학적 활성 단백질의 발현 Download PDF

Info

Publication number
KR102289258B1
KR102289258B1 KR1020157032515A KR20157032515A KR102289258B1 KR 102289258 B1 KR102289258 B1 KR 102289258B1 KR 1020157032515 A KR1020157032515 A KR 1020157032515A KR 20157032515 A KR20157032515 A KR 20157032515A KR 102289258 B1 KR102289258 B1 KR 102289258B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
leu
ala
glu
lys
Prior art date
Application number
KR1020157032515A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160002913A (ko
Inventor
앨리스 얌
댄 그로프
패트릭 리버스
크리스토퍼 디. 타노스
Original Assignee
서트로 바이오파마, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서트로 바이오파마, 인크. filed Critical 서트로 바이오파마, 인크.
Publication of KR20160002913A publication Critical patent/KR20160002913A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102289258B1 publication Critical patent/KR102289258B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y502/00—Cis-trans-isomerases (5.2)
    • C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
    • C12Y502/01008—Peptidylprolyl isomerase (5.2.1.8), i.e. cyclophilin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
    • C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명의 개시는 세포 비함유 합성 시스템에서 적절하게 폴딩된 생물학적 활성의 관심 단백질의 발현을 개선시키기 위한 방법 및 시스템을 기재한다. 상기 방법 및 시스템은 활성 산화적 인산화 시스템을 갖는 박테리아 세포 비함유 추출물을 이용하며, 외인성 단백질 샤페론을 포함한다. 외인성 단백질 샤페론은 세포 비함유 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아에 의해 발현될 수 있다. 외인성 단백질 샤페론은 단백질 이황화물 이소메라제 및/또는 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제일 수 있다. 본 발명자는 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 조합이 적절하게 폴딩된 생물학적 활성의 관심 단백질의 양에서 상승작용적 증가를 발생시키는 것을 발견하였다.

Description

상승된 수준의 외인성 샤페론을 갖는 세포 추출물을 이용한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서의 생물학적 활성 단백질의 발현{EXPRESSION OF BIOLOGICALLY ACTIVE PROTEINS IN A BACTERIAL CELL-FREE SYNTHESIS SYSTEM USING CELL EXTRACTS WITH ELEVATED LEVELS OF EXOGENOUS CHAPERONES}
관련 출원의 전후-참조
본 출원은 2013년 4월 19일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/813,914호, 및 2014년 2월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 61/937,069호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 특허 각각의 개시내용은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로서 제공된 "서열 목록", 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 언급
기계 포맷 IBM-PC의 MS-Windows 작업 시스템에서 73,728 바이트 크기로 2014년 4월 16일에 생성된 파일 -58-2PC.TXT로 기록된 서열 목록은 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 배경
박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서의 단백질의 발현은 재조합 표적 단백질을 발현시키기 위한 잘 확립된 기술이다. 단백질에 따라 변경된 특성을 갖는 박테리아 세포 비함유 합성 시스템을 제공하기 위해 관심 단백질을 발현하거나 과다발현하는 박테리아로부터 추출이 이루어질 수 있다. 그러나, 박테리아 성장 동안의 단백질의 과발현은 종종 박테리아에 대한 더 느린 성장 속도 및 박테리아로부터 제조된 추출물에서의 더 낮은 단백질 합성 활성을 발생시킨다.
추가로, 상기 추출물로부터의 재조합 단백질의 발현은 종종 부적절한 폴딩 및 생물학적 활성의 손실을 발생시킨다. 단백질 샤페론의 사용은 단백질의 적절한 폴딩 및 생물학적 활성을 개선시킬 수 있다. 따라서, 샤페론을 과발현하는 박테리아로부터 제조되는 재조합 단백질을 발현시키기 위한 개선된 박테리아 세포 추출물이 필요하며, 상기 추출물은 많은 양의 적절하게 폴딩된 단백질을 합성할 수 있다. 이들 및 다른 필요가 하기 기재되는 바와 같은 본 발명에 의해 제공된다.
발명의 개요
본 발명의 개시는 세포 비함유 합성 시스템에서 생물학적으로 활성이고/이거나 적절하게 폴딩된 관심 단백질의 발현을 개선시키기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 세포 비함유 합성 시스템은 활성 산화적 인산화 시스템 및 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 성분을 갖는 박테리아 추출물을 포함한다. 세포 비함유 합성 시스템은 외인성 단백질 샤페론을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 외인성 단백질 샤페론은 박테리아 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아에 의해 발현된다.
따라서, 한 양태에서,
i) 활성 산화적 인산화 시스템을 갖고, 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 포함하는 박테리아 추출물을 제조하는 단계로서, 상기 추출물이 제조되는 박테리아가 추출물 리터 당 적어도 약 1 gm의 농도의 외인성 단백질 샤페론을 발현하는 단계;
ii) 박테리아 추출물과 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 조합시켜 박테리아 세포 비함유 합성 시스템을 생성시키는 단계; 및
iii) 적어도 약 100 mg/L의 농도로 관심 단백질의 발현을 가능케 하는 조건하에서 박테리아 세포 비함유 합성 시스템을 인큐베이션시키는 단계를 포함하는,
박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 생물학적 활성 단백질의 발현 수준을 개선시키는 방법이 기재된다.
두번째 양태에서,
i) 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 함유하는 활성 산화적 인산화 시스템을 갖는 박테리아의 세포 비함유 추출물로서, 외인성 단백질 샤페론이 추출물 리터 당 적어도 1 gm의 수준으로 박테리아에서 발현되는, 박테리아의 세포 비함유 추출물; 및
ii) 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템이 기재되며,
상기 박테리아 세포 비함유 합성 시스템은 적어도 약 100 mg/L의 농도로 관심 단백질을 발현한다.
세번째 양태에서,
i) 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산, 리보솜, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 포함하는 박테리아 추출물을 제조하는 단계로서, 상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제가 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질의 발현을 개선시키기에 충분한 농도로 존재하는 단계;
ii) 박테리아 추출물과 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 조합시키는 단계; 및
iii) 관심 단백질의 발현 및 적절한 폴딩을 가능케 하는 조건하에서 박테리아 추출물과 핵산을 인큐베이션시키는 단계를 포함하는,
박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질을 발현시키는 방법이 기재된다.
네번째 양태에서,
i) 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 함유하고, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 추가로 포함하는 활성 산화적 인산화 시스템을 갖는 박테리아의 세포 비함유 추출물로서, 상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스/트랜스 이소메라제가 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질의 발현을 개선시키기에 충분한 농도로 존재하는, 박테리아의 세포 비함유 추출물; 및
ii) 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템이 기재되며,
상기 박테리아 세포 비함유 합성 시스템은 적어도 약 100 mg/L의 농도로 관심 단백질을 발현한다.
다섯번째 양태에서,
i) 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 단백질 DsbC를 발현하는 핵산으로 E. 콜리 세포를 형질전환시키는 단계; 및
ii) 적어도 1 mg/ml의 세포내 농도로 DsbC 단백질의 과발현을 가능케 하는 조건하에서 형질전환된 E. 콜리 세포를 배양하는 단계를 포함하는,
E. 콜리 세포 배양물의 생활력 및/또는 성장 속도를 개선시키는 방법이 기재된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 진핵생물 PDI 및 박테리아 DsbC가 기능적으로 상호교환가능한 것을 제시한다.
도 2a는 실시예에 기재된 샤페론 연속 발현 스크린의 개략적 예시를 제시한다.
도 2b는 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에 박테리아 세포 비함유 시스템 발현된 단백질 샤페론을 첨가함으로써 IgG 역가가 개선될 수 있음을 제시한다.
도 3은 단백질 샤페론 Skp, SlyD 및 FkpA가 적절하게 어셈블리된 IgG의 용해도 및/또는 양을 개선시키는 것을 제시한다.
도 4는 단백질 샤페론 FkpA가 IgG 단백질의 용해도 및 폴딩을 개선시키는 것을 제시한다.
도 5는 DsbC를 함유하는 추출물로의 정제된 FkpA의 첨가가 IgG 폴딩을 촉진하는 것을 제시한다.
도 6은 FkpA를 함유하는 추출물로 첨가된 외인성 DsbC 단백질의 첨가가 IgG 역가를 증가시키는 것을 제시한다.
도 7은 샤페론 DsbC 또는 FkpA를 발현하는 표시된 박테리아 균주로부터의 추출물 중 CFPS에 의해 생성된 GMCSF 단백질의 양을 제시한다.
도 8은 항시성 프로모터의 조절하에서 1X 또는 2X 카피의 DsbC를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주의 성장 속도를 제시한다(상부 패널). 하부 패널은 원형질막 주위공간 용해질에 존재하는 DsbC 단백질의 양을 제시한다.
도 9는 1X 또는 2X 카피의 DsbC를 과발현하는 박테리아 균주에 의해 생성된 DsbC 단백질의 양을 제시한다. 상부 패널은 세포내 농도를 제시한다. 하부 패널은 추출물 농도를 제시한다.
도 10은 항시성 프로모터의 조절하에서 1X 또는 2X 카피의 FkpA를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주의 성장 속도를 제시한다(상부 패널). 하부 좌측 패널은 1X 및 2X 카피의 FkpA를 발현하는 박테리아로부터 제조된 전체 추출물에 존재하는 FkpA 단백질의 양을 제시한다. 하부 우측 패널은 박테리아 균주의 배가 시간을 제시한다.
도 11은 1X 및 2X 카피의 FkpA를 발현하는 박테리아로부터의 추출물 내의 FkpA 농도의 정량을 제시한다.
도 12는 FkpA로의 C-말단 His 태그의 첨가의 결과를 제시한다. (a)는 FkpA-His(2XFkpA-His (e49))를 과발현하는 박테리아로부터 제조된 FkpA의 추출물 수준이 30℃에서의 추출 활성화(예비-인큐베이션) 후의 원심분리 회전에 의해 증가된 것을 제시한다. (b)는 FkpA-His를 함유하는 추출물이 야생형 FkpA를 함유하는 추출물보다 더 많은 전체 IgG를 생성하였고(2XFkpA-His (e49)에 대해 2XFkpA (e44)를 비교함), 정확하게 어셈블리된 IgG의 전체량이 활성화 후에 추출물을 원심분리시킴으로써 증가(2XFkpA-His 최종 회전에 대해 2XFkpA 최종 회전을 비교함)된 것을 제시한다. Con 1 및 Con 2는 FkpA를 발현하지 않는 박테리아로부터 제조된 대조군 추출물이다.
도 13은 샤페론의 과발현이 개방 세포 비함유 합성 시스템에서 다수의 IgG의 생성을 개선시키는 것을 제시한다. (A) 트라스투주맙(Trastuzumab), CD30 항원 결합 브렌툭시맙(brentuximab), 및 점라인(germline) 경쇄 Vk3-20과 조합된 점라인 중쇄 VH3-7 및 VH3-23이 14C-류신의 존재하에서 SBJY001, 2xDsbC, 및 2xD + 2xF 추출물에서 발현되었고, SDS-PAGE 및 자가방사선촬영술에 의해 시각화되었다. (B) 다양한 추출물에서 발현된 어셈블리된 IgG가 실시예에 기재된 바와 같이 정량되었다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4th ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989); Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (Hoboken, NY 1995)]을 참조하라. 단수 용어는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. 단계 또는 구성요소의 언급에 선행하는 경우 용어 "-들을 포함하다" 및 이의 변형, 예를 들어, "-을 포함하다" 및 "포함하는"은 추가 단계 및 구성요소의 첨가가 임의적인 것으로, 배제되지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 하기 정의는 본원에서 빈번하게 사용되는 특정 용어의 이해를 촉진하기 위해 제공되며, 본 발명의 개시의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
용어 "활성 산화적 인산화 시스템"은 단백질 합성 동안 활성 산화적 인산화를 나타내는 박테리아 용해질을 나타낸다. 예를 들어, 박테리아 용해질은 ATP 신타제 효소 및 산소의 환원을 이용하여 ATP를 발생시킬 수 있다. 당 분야에 공지된 다른 번역 시스템이 또한 단백질 합성 동안 활성 산화적 인산화를 이용할 수 있음이 이해될 것이다. 산화적 인산화의 활성화는 특정 억제제, 예를 들어, 전자 전달 사슬 억제제를 이용한 경로의 억제에 의해 입증될 수 있다.
용어 "항체"는 결합 단백질로 기능적으로 정의되고, 동물 생성 항체의 면역글로불린 인코딩 유전자의 프레임워크 영역으로부터 유래되는 것으로 당업자에 의해 인지되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 구조적으로 정의되는 단백질을 나타낸다. 항체는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성될 수 있다. 인지된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 차례로 각각 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다.
통상적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사합체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 사합체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 상기 경쇄 및 중쇄를 각각 나타낸다.
항체는 온전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다제를 이용한 분해에 의해 생성된 널리 특성규명된 다수의 단편으로 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역 내의 이황화 결합 아래에서 항체를 분해하여, 자체가 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab의 이합체인 F(ab)'2를 생성시킨다. F(ab)'2가 힌지 영역 내의 이황화 결합을 파괴하기 위해 가벼운 조건하에서 환원됨으로써, (Fab')2 이합체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다(예를 들어, 다른 항체 단편의 더욱 상세한 설명을 위해 문헌[Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)] 참조). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해와 관련하여 정의되나, 당업자는 상기 Fab' 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 새로이 합성될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성되거나, 재조합 DNA 방법을 이용하여 새로이 합성된 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 단일쇄 항체(단일 폴리펩티드 사슬로 존재하는 항체), 및 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 함께 연결(직접적으로 또는 펩티드 링커를 통함)되어 연속적 폴리펩티드를 형성하는 단일쇄 Fv 항체(sFv 또는 scFv)를 포함한다. 단일쇄 Fv 항체는 직접적으로 연결되거나 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL-인코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유적으로 연결된 VH-VL 이종이합체이다. 문헌[Huston, et al. (1988) Proc . Nat. Acad . Sci . USA, 85: 5879-5883]. VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 사슬로서 서로 연결되나, VH 및 VL 도메인은 비공유적으로 회합한다. 섬유상 파지의 표면 상에서 발현되는 첫번째 기능성 항체 분자는 단일쇄 Fv's(scFv)였으나, 대안적 발현 전략이 또한 성공적이었다. 예를 들어, Fab 분자는 사슬 중 하나(중쇄 또는 경쇄)가 g3 캡시드 단백질에 융합되고, 상보적 사슬이 가용성 분자로서 원형질막 주위공간으로 유출되는 경우에 파지 상에서 전시될 수 있다. 2개의 사슬은 동일하거나 상이한 복제단위 상에서 인코딩될 수 있으며, 요점은 각각의 Fab 분자 내의 2개의 항체 사슬이 번역후 어셈블리되고, 이합체가 사슬 중 하나의 g3p로의 결합을 통해 파지 입자로 통합된다는 점이다(예를 들어, 미국 특허 번호 5733743호를 참조하라). scFv 항체 및 자연적으로 응집되나 화학적으로 분리된 항체 V 영역으로부터의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드 사슬을 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩되는 분자로 전환시키는 다수의 다른 구조가 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,091,513호, 5,132,405호, 및 4,956,778호를 참조하라). 항체는 또한 파지 상에 전시된 모든 항체를 포함한다(예를 들어, scFv, Fv, Fab 및 이황화 결합된 Fv(Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8: 1323-1331). 항체는 또한 디안티바디(diantibody), 미니안티바디(miniantibody) 및 scFv-Fc 융합체를 포함할 수 있다.
용어 "박테리아 유래 세포 비함유 추출물"은 DNA를 mRNA로 전사시키고/시키거나 mRNA를 폴리펩티드로 번역시킬 수 있는 시험관내 반응 혼합물의 제조물을 나타낸다. 혼합물은 리보솜, ATP, 아미노산, 및 tRNA를 포함한다. 이들은 용해된 박테리아, 정제된 성분, 또는 둘 모두의 조합으로부터 직접 유래될 수 있다.
용어 "박테리아 세포 비함유 합성 시스템"은 생물학적 추출물 및/또는 규정된 시약을 포함하는 반응 혼합물에서의 폴리펩티드의 시험관내 합성을 나타낸다. 반응 혼합물은 거대분자의 생성을 위한 주형, 예를 들어, DNA, mRNA 등; 합성되는 거대분자에 대한 단량체, 예를 들어, 아미노산, 뉴클레오티드 등; 및 보조인자, 효소 및 합성에 필요한 다른 시약, 예를 들어, 리보솜, 하전되지 않은 tRNA, 비자연 아미노산으로 하전된 tRNA, 중합효소, 전사 인자, tRNA 신세타제 등을 포함할 것이다.
용어 "생물학적 활성 단백질"은 관심 단백질의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하는 단백질을 나타낸다. 생물학적 활성은 본원에 기재된 방법에 의해 발현된 관심 단백질의 활성, 기능 및/또는 구조를 관심 참조 단백질의 활성과 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 관심 참조 단백질이 IgG인 경우, 생물학적 활성 단백질은 적절하게 폴딩되고 어셈블리된 IgG 분자를 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 참조 단백질은 외인성 단백질 샤페론을 함유하지 않는 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에 의해 발현된 단백질일 수 있다. 생물학적 활성은 또한 관심 단백질에 적절한 시험관내 또는 생체내 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 관심 단백질의 생물학적 활성은 세포-비함유 단백질 합성 반응 혼합물의 단위 부피 당 생물학적 활성으로 표현될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 단백질의 생물학적 활성은 참조 단백질의 활성의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%이다.
용어 "항시성 프로모터"는 적절한 조건하에서 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결되거나 결합된 핵산 서열 또는 유전자의 연속적 전사를 가능케 하는 핵산 서열을 나타낸다. 적절한 조건은 프로모터 서열에 결합하는 전사 인자, 예를 들어, RNA 중합효소, 및 전사되는 RNA로 통합되는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 항시성 프로모터는 통상적으로 이들이 정상 세포 조건하에서 연속적 전사를 촉진하는 상향조절된 프로모터이다.
용어 "이황화물 이소메라제" 또는 "단백질 이황화물 이소메라제"(PDI)는 각각이 통상적인 티오레독신(Trx) 폴드를 갖는 다수의 도메인을 포함하는 단백질 패밀리를 나타낸다. PDI 분자는 이소메라제 활성에 대한 부위인 CXXC 모티프를 포함하는 2개 이상의 활성 부위를 갖는다. 시험관 내에서, PDI는 환경의 산화환원 잠재성에 따라 이황화 결합의 산화적 형성, 환원, 또는 이성화를 촉매한다. PDI는 폴다제(foldase)로도 언급되는 폴딩 촉매의 한 부류의 일원이다. 폴딩 촉매는 단백질 폴딩 과정에서 특정한 속도-제한 단계를 촉진시킴으로써 응집된 단백질 폴딩 중간체의 농도를 감소시킴으로써 폴딩을 돕는다. 이황화 결합의 형성을 촉매하는 이소메라제 기능에 더하여, PDI는 또한 폴리펩티드의 이들의 자연 입체형태로의 폴딩을 촉진하며, 따라서 샤페론으로 작용한다. PDI의 C-말단 영역은 폴리펩티드 결합 영역을 포함하며, 이는 샤페론 활성을 담당하는 것으로 생각된다. PDI의 이소메라제 및 샤페론 활성은 별개의 독립적 활성이며, 둘 모두의 활성은 이황화 결합을 함유하는 환원되고 변성된 단백질의 재활성화에 필요한 것으로 보인다.
그람-음성 박테리아에서, 이황화 결합 형성, 환원 및 이성화는 DsbA, DsbB, DsbC, 및 DsbD를 포함하는 단백질의 Dsb (disulfide bond formation) 패밀리에 의해 촉매된다. DsbA는 이의 활성 부위 이황화물을 표적 단백질로 전달함으로써 이황화 결합의 산화적 형성을 촉매하며, 이는 환원된 형태의 DsbA를 남긴다. DsbB는 DsbA를 재산화시키고, 이의 전자를 호흡 사슬로 통과시켜 산화된 DsbB를 재생시킨다. DsbC는 이황화 결합의 재배열을 촉매하고, 이는 진핵생물 PDI의 대응물로 인지된다. DsbC는 DsbD에 의해 이의 환원된 형태로 유지된다. DsbC는 각각이 23 kDa 서브유닛 단량체인 활성 부위 내의 2개의 -Cys98-Gly-Tyr-Cys101(SEQ ID NO:29), 및 나머지 2개의 Cys141 및 Cys163의 4개의 티올기를 갖는 동종이합체이다. PDI와 유사하게, DsbC는 이의 이소메라제 활성과 독립적인 샤페론 활성을 갖는다(예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Biol . Chem . 274:19601-19605, 1999; 및 Kolag, O., et al., Microbial Cell Factories, 2009, 8:9] 참조). 각각의 단량체는 시스타틴(cystatin) 폴드를 갖는 N-말단 이합체화 도메인 및 티오레독신 폴드를 갖는 C-말단 촉매 도메인으로 구성된다(McCarthy A.A., et al., Nat. Struct. Biol. 7:196-199, 2000). 다른 Dsb 단백질은 DsbE 및 DsbG를 포함한다.
용어 "외인성 단백질 샤페론"은 일반적으로 박테리아 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아 균주에 의해 일반적으로 발현되지 않는 단백질 샤페론(예를 들어, 재조합 단백질 샤페론), 또는 자연 박테리아 균주에 존재하지 않는 핵산 작제물에 의해 발현되는 재조합 단백질 샤페론을 나타낸다. 예를 들어, 박테리아 추출물을 제조하기 위해 사용되는 자연 박테리아 균주가 자연적으로 내인성 단백질 샤페론의 낮은 수준(예를 들어, 관심 생물학적 활성 단백질의 발현 수준을 개선시키기에 충분하지 않은 수준)을 발현하는 경우, 외인성 단백질 샤페론을 인코딩하는 핵산 서열은 샤페론을 인코딩하는 내인성 서열과 상이한 조절 서열의 조절하에 있어, 외인성 단백질 샤페론은 비-자연 핵산 작제물로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 샤페론 DsbC 및 FkpA는 자연 발생 E. 콜리 단백질이나, 이들의 발현 수준은 박테리아 추출물 내의 단백질을 검출하기 위한 본원에 기재된 ELISA 검정을 이용하여 검출 한도 미만이다. 따라서, 용어 "외인성"은 박테리아 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아 균주에 의해 일반적으로 발현되지 않는 단백질 샤페론, 또는 자연 박테리아 균주에 존재하지 않는 단백질 샤페론을 인코딩하는 핵산을 나타내는 "이종성"과 동의어이다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 박테리아 세포 비함유 추출물에 첨가되고, 따라서 추출물이 제조되는 박테리아에 의해 발현되지 않는 재조합 단백질 샤페론을 나타낸다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 상황에서 용어 "동일한", "본질적으로 동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 문헌[Altschul et al. (J. Mol . Biol . 215:403-10, 1990), 및 Altschul et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997)]에 기재된 BLAST 및 PSI-BLAST 알고리즘을 각각 이용하여 측정시 비교 범위 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치를 위해 비교되고 정렬되는 경우 동일하거나 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율(예를 들어, 특정된 영역에 걸쳐 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성)을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(인터넷 주소 ncbi.nlm.nih.gov 참조)를 통해 공적으로 이용 가능하다. 이러한 알고리즘은 데이터베이스 서열 내의 동일 길이의 워드와 정렬되는 경우 일치되거나 일부 양성-값의 역치 스코어 T를 만족시키는 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 스코어링 서열쌍(HSP)을 먼저 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치로 언급된다(Altschul et al. 상기). 이들 최초 이웃 워드 적중(hit)은 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시시키기 위한 시드로 작용한다. 워드 적중은 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 이용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 스코어를 계산하기 위해 스코어링 매트릭스(scoring matrix)가 사용된다. 각 방향에서의 워드 적중의 연장은, 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성된 값으로부터 양 X에 의해 하락하는 경우, 누적 스코어가 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 또는 그 미만이 되는 경우, 또는 어느 하나의 서열의 끝에 도달되는 경우에 정지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 이용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이, 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스를 이용한다(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915-10919, 1992] 참조).
"서열 동일성의 백분율"은 비교 범위에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교 범위 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 둘 모두의 서열 내에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 생성시키고, 일치된 위치의 수를 비교 범위 내의 위치의 전체 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 발생시킴으로써 계산된다.
본원에서 사용되는 "비교 범위"는 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 서열이 동일 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교될 수 있는, 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 더욱 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 구성된 군으로부터 선택되는 연속 위치의 수 중 어느 하나의 세그먼트에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-87, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연이 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 통상적으로 약 0.01 미만, 더욱 통상적으로 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
서열 동일성의 백분율이 폴리펩티드에 관하여 이용되는 경우, 달리 동일하지 않은 하나 이상의 잔기 위치가 제 1 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성, 예를 들어, 유사한 전하 또는 소수성 또는 친수성 특징을 갖고, 따라서 폴리펩티드의 기능적 특성을 변화시키지 않는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 보존성 아미노산 치환에 의해 상이할 수 있음이 인지된다. 폴리펩티드 서열이 보존성 치환으로 상이한 경우, 치환의 보존성 특성을 교정하기 위해 서열 동일성 백분율이 상향 조정될 수 있다. 상기 조정은 널리 공지된 방법을 이용하여, 예를 들어, 전체 미스매치가 아닌 부분적 미스매치로서 보존성 치환을 스코어링하여 서열 동일성 백분율을 증가시킴으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산이 1의 스코어가 제공되고, 비-보존성 치환이 0의 스코어가 제공되는 경우, 보존성 치환은 0과 1 사이의 스코어가 제공된다. 보존성 치환의 스코어링은 문헌[Pearson et al. (Meth . Mol . Biol. 24:307-331, 1994)]에 기재된 알고리즘을 이용하여 계산될 수 있다. 정렬은 또한 간단한 시각적 검사 및 서열의 수작업 정렬에 의해 수행될 수 있다.
특정 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "보존적으로 변형된 변이"는 동일하거나 본질적으로 동일한(예를 들어, 특정 영역에 걸쳐 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성) 아미노산 서열을 인코딩하는 상이한 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 폴리뉴클레오티드가 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우 본질적으로 동일한 서열을 나타낸다. 유전 부호의 축퇴성으로 인해, 많은 수의 기능적으로 동일한 폴리뉴클레오티드가 임의의 제공된 폴리펩티드를 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, 및 AGG 모두는 아미노산 아르기닌을 인코딩한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열 변이는 "보존적으로 변형된 변이"의 한 종으로 간주될 수 있는 "침묵 변이"이다. 이와 같이, 단백질 변이체를 인코딩하는 것으로 본원에 개시된 각각의 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 모든 가능한 침묵 변이를 기재하는 것이 인지될 것이다. 보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 UUG를 제외하고는 폴리뉴클레오티드 내의 각각의 코돈은 표준 기술에 의해 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 발생시킬 수 있음이 또한 인지될 것이다. 따라서, 인코딩된 폴리펩티드의 서열을 변화시키지 않는 폴리뉴클레오티드의 각각의 침묵 변이는 본원에서 암암리에 기재된다.
또한, 인코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 아미노산의 적은 백분율(통상적으로 10% 미만, 일반적으로 1% 미만)을 변경시키거나, 첨가하거나, 결실시키는 개별적 치환, 결실 또는 첨가가 보존적으로 변형된 변이로 간주될 수 있으나, 단, 상기 변경이 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 치환을 발생시켜야 하는 것이 인지될 것이다. 하기 6개 그룹을 포함하는 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 아미노산 치환은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 상기 그룹 각각은 서로에 대해 보존성 치환으로 간주되는 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (Ala, A), 세린 (Ser, S), 트레오닌 (Thr, T);
2) 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산 (Glu, E);
3) 아스파라긴 (Asn, N), 글루타민 (Gln, Q);
4) 아르기닌 (Arg, R), 리신 (Lys, K);
5) 이소류신 (Ile, I), 류신 (Leu, L), 메티오닌 (Met, M), 발린 (Val, V); 및
6) 페닐알라닌 (Phe, F), 티로신 (Tyr, Y), 트립토판 (Trp, W).
2개 이상의 아미노산 서열 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열은, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열이 제공된 비교 범위에 걸쳐 서로 또는 참조 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유하는 경우 "실질적으로 유사한" 것으로 간주된다. 2개 이상의 단백질은 또한, 이들이 아미노산 서열에 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 아미노산 치환을 포함하는 경우 실질적으로 유사한 것으로 간주된다.
용어 "인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한"은 비교 목적상 대조군 또는 참조 추출물이 외인성 단백질 샤페론을 함유하지 않거나 발현하지 않는 것을 제외하고는 동일한 실험 조건을 나타낸다. 상기 용어는 또한 외인성 단백질 샤페론의 한 부류(예를 들어, PDI)를 발현하거나 함유하는 대조군 추출물과 외인성 단백질 샤페론의 2개의 상이한 부류(예를 들어, PDI 및 PPIase)를 발현하거나 함유하는 추출물 사이의 비교를 포함한다. 예를 들어, 추출물은 단백질 샤페론의 한 부류(예를 들어, PDI 또는 DsbC)를 발현하거나 과발현하는 박테리아 균주로부터 제조될 수 있고, 다른 부류의 단백질 샤페론으로부터의 정제된 단백질(예를 들어, 정제된 PPIase, 예를 들어, FkpA)이 추출물에 첨가될 수 있다. 상기 조건은 또한 박테리아 추출물 내의 외인성 단백질 샤페론의 전체 농도(예를 들어, 한 샤페론, 예를 들어, PDI의 전체 농도, 또는 2개의 상이한 샤페론, 예를 들어, PDI 및 PPI의 조합물의 전체 농도)가 동일하게 되도록 조정하는 것을 포함할 수 있다. 그 밖에는, 박테리아 추출물의 성분 및 관심 단백질을 인코딩하는 핵산은 동일하다. 관심 단백질의 발현 및 적절한 폴딩을 가능케 하는 예시적 조건이 실시예에 기재된다.
용어 "펩티딜 프롤릴 이소메라제," "펩티딜 프롤릴 시스-트랜스 이소메라제" 및 "프롤릴 이소메라제"(PPI 또는 PPIase)는 상호교환적으로 사용되며, 단백질 폴딩 촉매로 공지된 샤페론의 한 부류를 나타낸다. PPI는 자연 또는 기능성 단백질에서 아미노산 프롤린 내의 트랜스 펩티딜 프롤릴 결합의 시스 입체형태로의 전환을 촉매한다. PPI는 다양한 서브유닛 또는 다양한 기능을 갖는 모듈, 예를 들어, 촉매 활성을 갖는 모듈 및 샤페론 또는 단백질 결합 활성을 갖는 모듈을 가질 수 있다. PPI의 3개의 패밀리가 인지되어 있다: 사이클로필린(cyclophilin)(이의 이소메라제 활성은 사이클로스포린 A(cyclosporin A)에 의해 억제됨); FK506 및 라파마이신에 의해 억제되는 FKBP(FK506 결합 단백질); 및 파르불린(parvulin). 사이클로필린의 비제한적인 예는 PpiA(RotA)를 포함한다. FKBP의 비제한적인 예는 FkpA, SlyD, 및 트리거 인자(trigger factor)(TF 또는 tig)를 포함한다. 파르불린의 비제한적인 예는 SurA 및 PpiD를 포함한다. PPI의 추가 예는 CypA, PpiB, Cpr1, Cpr6, 및 Fpr1을 포함한다. FkpA, SlyD, 및 트리거 인자는 서열 정렬을 기초로 하여 관련된다. FkpA에 대해, 샤페론 및 촉매 활성은 N-말단 및 C-말단 도메인에 각각 존재한다(Saul F.A., J. Mol . Biol . 335:595-608, 2004).
용어 "데아그레가제(deaggregase)"는, 예를 들어, 박테리아 비함유 번역 시스템에서 생성되는 관심 단백질을 탈응집시키고/시키거나 용해시키는 것을 돕는 단백질 샤페론을 나타낸다. 이러한 샤페론은 이들의 작용 메커니즘이 촉매적이 아닌 화학량론적이므로 고농도에서 특히 도움이 되며, 단백질이 폴딩되는 동안 새로이 합성된 단백질의 소수성 패치를 안정화시킴으로써 작동하는 것으로 생각된다. 데아그레가제의 예는 IbpA, IbpB, 및 Skp를 포함한다.
용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용되는 상기 용어는 전장 단백질 및 트렁케이션된 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함하며, 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.
용어 "적절하게 폴딩된 단백질"은 생물학적으로 활성이거나 기능성인 단백질 또는 폴리펩티드의 자연 입체형태를 나타낸다. 따라서, 상기 용어는 폴딩된 상태에서 최소의 자유 에너지를 갖는 삼차 구조를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 박테리아에서 발현된 재조합 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 상기 용어는 일반적으로 세포질에서 과발현되는 경우 가용성인 단백질을 나타내며, 적절하게 폴딩된 재조합 단백질은 불용성 응집체를 형성하지 않고/않거나 변성되거나 언폴딩되지 않는다.
용어 "상승작용적" 또는 "상승작용"은 2개 이상의 작용제의 조합된 효과가 이들의 개별적 효과의 합보다 큰 2개 이상의 작용제의 상호작용을 나타낸다. 상승작용적 약물 상호작용은 중앙 효과 원칙(median effect principle)(예를 들어, 문헌[Chou and Talalay (1984) Adv Enzyme Regul 22:27 및 Synergism and Antagonism in Chemotherapy, Chou and Rideout, eds., 1996, Academic, pp. 61-102]을 참조하라)을 이용하여 결정될 수 있고, 컴퓨터 프로그램 Calcusyn을 이용한 조합 지수에 의해 정량적으로 결정될 수 있다(Chou and Hayball, 1996, Biosoft, Cambridge, MA). 예를 들어, 문헌[Reynolds and Maurer, Chapter 14 in Methods in Molecular in Medicine, vol. 110: Chemosensitivity, Vol. 1: In vitro Assays, Blumenthal, ed., 2005, Humana Press]을 참조하라. 조합 지수(CI)는 다음과 같이 상승작용, 합계 및 길항작용을 정량한다: CI<1 (상승작용); CI=1 (합계); CI>1 (길항작용). 0.7-0.9의 CI 값은 중간 내지 약간의 상승작용을 나타낸다. 0.3-0.7의 CI 값은 상승작용을 나타낸다. 0.1-0.3의 CI 값은 강한 상승작용을 나타낸다. <0.1의 CI 값은 매우 강한 상승작용을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
서론
본원에 기재된 방법 및 시스템은 세포 비함유 합성 시스템, 예를 들어, 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 생물학적 활성 단백질의 발현 수준을 개선시키고/시키거나 증가시키는데 유용하다. 관심 생물학적 활성 단백질의 증가된 발현 수준은 외인성 단백질 샤페론을 포함하는 활성 산화적 인산화 시스템을 갖는 박테리아 추출물을 이용함으로써 달성된다. 외인성 단백질 샤페론은 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아에 의해 발현될 수 있다. 본 발명자는 놀랍게도 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아에서 비교적 많은 양의 외인성 단백질 샤페론을 발현시킴으로써, 증가된 양의 관심 생물학적 활성 단백질이 세포 비함유 합성 시스템에 의해 발현되는 것을 발견하였다. 따라서, 많은 양의 단백질을 발현시키는 추출물의 능력은 놀랍게도 비교적 높은 농도 수준의 단백질 샤페론에 의해 불리하게 영향을 받지 않아, 세포 비함유 단백질 합성 반응에서 생성된 적절하게 폴딩되고 생물학적으로 활성인 단백질의 전체량은 외인성 단백질 샤페론을 함유하지 않는 세포 비함유 합성 시스템에 의해 발현된 적절하게 폴딩되고 생물학적으로 활성인 단백질의 양보다 실질적으로 높다. 따라서, 세포 비함유 단백질 합성 시스템에 의해 생성된 관심 단백질의 전체량은 외인성 샤페론을 발현하지 않는 세포 비함유 단백질 합성 시스템에 의해 생성된 단백질의 전체량과 실질적으로 유사한 한편, 추출물 내의 단백질 샤페론의 증가된 농도 수준은 적절하게 폴딩되고, 어셈블리되고, 생물학적으로 활성인 관심 단백질의 증가된 양을 발생시킨다. 본 발명자는 또한 놀랍게도 단백질 샤페론의 2개의 상이한 부류(예를 들어, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜 프롤릴 시스-트랜스 이소메라제)를 발현시킴으로써, 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질의 발현 수준에서의 상승작용적 개선이 수득되는 것을 발견하였다. 상기 방법 및 시스템이 이제 기재될 것이다.
관심 생물학적 활성 단백질을 생성시키기 위해, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 활성 산화적 인산화 시스템, 및 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 다른 성분, 예를 들어, 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 갖는 박테리아 추출물을 이용한다. 박테리아 추출물의 성분은 하기에 더욱 상세히 기재된다. 한 양태에서, 박테리아 추출물은 외인성 단백질 샤페론을 발현하는 재조합 박테리아로부터 제조된다. 일부 구체예에서, 추출물이 제조되는 박테리아는 추출물 리터(L) 당 적어도 약 1 그램(g)의 농도로 외인성 단백질 샤페론을 발현한다. 예를 들어, 추출물이 제조되는 박테리아는 적어도 추출물 리터 당 약 1 g, 추출물 리터 당 2 g, 추출물 리터 당 3 g, 추출물 리터 당 4 g, 추출물 리터 당 5 g, 추출물 리터 당 6 g, 추출물 리터 당 7 g, 추출물 리터 당 8 g, 추출물 리터 당 9 g, 추출물 리터 당 10 g 또는 그 초과의 농도로 외인성 단백질 샤페론을 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 단백질 샤페론의 전체 농도는 추출물 리터 당 약 1 g 내지 20 g, 추출물 리터 당 약 1 g 내지 15 g, 추출물 리터 당 약 1 g 내지 10 g, 또는 추출물 리터 당 약 1 g 내지 5 g이다. 일부 구체예에서, 박테리아는 적어도 1 mg/ml, 적어도 2 mg/ml, 적어도 3 mg/ml, 적어도 4 mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/ml, 적어도 20 mg/ml, 적어도 30 mg/ml, 또는 적어도 40 mg/ml의 세포내 농도로 외인성 단백질 샤페론을 발현한다. 일부 구체예에서, 박테리아는 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 범위의 세포내 농도로 외인성 단백질 샤페론을 발현한다.
외인성 단백질 샤페론은 적절하게 폴딩되고/되거나 생물학적으로 기능성인 관심 단백질의 증가된 생성을 발생시키는 임의의 단백질 샤페론일 수 있다. 본원에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 단백질 샤페론은 적절한 폴딩을 돕고/돕거나 비-기능성 응집체로의 관심 단백질의 응집을 방지하기 위해 관심 표적 단백질과 상호작용하는 단백질일 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 분자 샤페론은 폴딩되지 않거나, 부분적으로 폴딩되거나, 미스폴딩된 폴리펩티드 내의 노출된 소수성 모이어티에 결합함으로써 응집을 방지하는 것으로 생각된다. 따라서, 노출된 소수성 모이어티에 결합하고, 관심 단백질의 응집을 방지하는 임의의 단백질 샤페론이 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
외인성 단백질 샤페론은 또한 관심 단백질의 자연 및 기능성 입체형태의 형성에 중요한 공유적 변화를 촉매하는 효소일 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 외인성 단백질 샤페론은 단백질 이황화물 이소메라제(PDI) 또는 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제(PPI)이다. PDI의 예는 포유동물 PDI, 효모 PDI, 또는 박테리아 PDI를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, PDI는 E. 콜리의 Dsb(이황화 결합 형성) 패밀리의 일원, 예를 들어, DsbA 또는 DsbC이다. 한 구체예에서, 외인성 단백질 샤페론은 티오레독신(Trx)이다. PPI의 예는 사이클로필린(이의 이소메라제 활성은 사이클로스포린 A에 의해 억제됨); FK506 및 라파마이신에 의해 억제되는 FKBP(FK506 결합 단백질); 및 파르불린을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. E. 콜리에서의 PPIase의 3개의 패밀리는 제한된 서열 및 구조적 유사성을 나타내나, 구조화되지 않은 펩티드에 대한 비교적 낮은 친화성 및 높은 촉매 활성을 공유한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, PDI 및 PPI 샤페론은 샤페론(단백질 결합) 및 촉매 도메인 둘 모두를 포함하는 모듈 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kolag, O., et al., Microbial Cell Factories, 2009, 8:9; Wang, C-C., Methods in Enzymology, 2002, 348:66-75]을 참조하라. 본원에 기재된 방법 및 시스템에서 유용한 다른 단백질 샤페론은, 예를 들어, Skp를 포함하는 데아그레가제로 언급된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 또한 PDI 및 PPIase를 포함하는 박테리아 추출물을 이용하여 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 상기 방법은 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 성분, 예를 들어, 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산, 리보솜을 포함하는 박테리아 추출물을 제조하는 것을 포함한다. 박테리아 추출물은 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 추가로 포함하며, 상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제는 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질의 발현을 개선(예를 들어, 증가)시키기에 충분한 농도로 존재한다. 이러한 구체예에서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 발현은 적절하게 폴딩된 생물학적 활성의 관심 단백질의 발현에서 상승작용적 개선을 제공한다. 예를 들어, 관심 단백질의 발현은 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제 중 둘 모두가 아닌 하나가 존재하는 경우 그 농도 초과의 농도로 개선되며, 인큐베이션 조건은 그 밖에는 동일하다. 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 발현이 단백질 발현에서 상승작용적 개선을 제공하는 구체예에서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도는 추출물 리터 당 적어도 약 1 gm(g/L)이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도는 추출물 리터 당 적어도 약 1 g, 추출물 리터 당 2 g, 추출물 리터 당 3 g, 추출물 리터 당 4 g, 추출물 리터 당 5 g, 추출물 리터 당 6 g, 추출물 리터 당 7 g, 추출물 리터 당 8 g, 추출물 리터 당 9 g, 추출물 리터 당 10　g, 추출물 리터 당 11 g, 추출물 리터 당 12 g, 추출물 리터 당 13 g, 추출물 리터 당 14 g, 추출물 리터 당 15 g 또는 그 초과이다. 일부 구체예에서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도는 추출물 리터 당 약 1 g 내지 20 g, 추출물 리터 당 약 1 g 내지 15 g, 추출물 리터 당 약 1 g 내지 14 g, 추출물 리터 당 약 1 g 내지 10 g, 또는 추출물 리터 당 약 1 g 내지 5 g이다. 일부 구체예에서, PDI는 Dsb 패밀리 단백질, 예를 들어, DsbA, DsbC, 및 DsbG로 구성된 군으로부터 선택되고, PPI는 FkpA, SlyD, tig, SurA, 및 Cpr6로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 박테리아 추출물은 이황화물 이소메라제 및 프롤릴 이소메라제를 인코딩하는 유전자로 공동-형질전환된 박테리아로부터 제조될 수 있다. 추출물이 제조되는 박테리아(예를 들어, E. 콜리)는 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 외인성 단백질 샤페론을 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 외인성 단백질 샤페론은 DsbA, DsbC, FkpA, SlyD, 및/또는 Skp, 또는 이들의 조합물이다. 일부 구체예에서, 박테리아 추출물은 E. 콜리로부터의 S30 추출물이다.
본원에 기재된 박테리아 세포 비함유 합성 시스템은 약 20 마이크로리터 내지 500 리터의 부피를 가질 수 있고, 인큐베이션 시간은 약 1시간 내지 약 36시간 지속되는 기간이다. 예를 들어, 인큐베이션 시간은 약 1 내지 36시간, 약 1 내지 24시간, 약 1 내지 18시간, 또는 약 1 내지 12시간일 수 있다.
관심 단백질을 생성시키기 위해, 박테리아 추출물은 관심 단백질을 인코딩하는 핵산과 조합되어 박테리아 세포 비함유 합성 시스템을 생성시킨다. 관심 단백질을 인코딩하는 핵산은 통상적으로 DNA 또는 mRNA이다. 핵산으로부터 관심 단백질을 발현시키기 위한 방법은 하기에 더욱 상세히 기재된다. 박테리아 세포 비함유 합성 시스템은 관심 단백질의 발현 및/또는 적절한 폴딩을 가능케 하는 조건하에서 인큐베이션된다. 일부 구체예에서, 관심 단백질은 적어도 약 100 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L, 700 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, 또는 L 당 1000 mg 또는 그 초과의 농도로 발현된다. 관심 단백질의 발현을 위한 조건은 하기에 더욱 상세히 기재된다.
일부 구체예에서, 관심 단백질은 이의 생물학적 활성 입체형태에서 적어도 하나의 이황화 결합을 갖는다. 한 구체예에서, 관심 단백질은 적어도 2개의 프롤린 잔기를 갖는다. 관심 단백질은 또한 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 관심 단백질은 본원에 기재된 샤페론 단백질을 갖는 융합 단백질로 발현된다.
또 다른 양태에서, 상기 개시는 E. 콜리 세포 배양물의 생활력 및/또는 성장 속도를 개선시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 Dsb 단백질로 E. 콜리 세포를 형질전환시키고, Dsb 단백질의 과발현을 가능케 하는 조건하에서 형질전환된 E. 콜리 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, Dsb 단백질은 적어도 약 1 mg/ml의 세포내 농도로 발현된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Dsb 단백질은 약 1 mg/ml 내지 약 40 mg/ml의 세포내 농도로 발현된다.
일부 구체예에서, 단백질 샤페론은 N-말단 또는 C-말단에서 폴리-아미노산 태그, 예를 들어, 폴리히스티딘(예를 들어, His6; SEQ ID NO:24) 태그 또는 폴리(Ser-Arg) 태그를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 하전된 아미노산은 양성으로 하전된다. 일부 구체예에서, 하전된 아미노산은 음성으로 하전된다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 극성 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 교대로 존재하는 하전된 아미노산 및 극성 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 Ser-Arg-Ser-Arg-Ser-Arg-Ser-Arg(SEQ ID NO:25)를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys(SEQ ID NO:26)를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO:27)를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그는 Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu(SEQ ID NO:28)를 포함한다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, C-말단 태그는 샤페론의 용해도를 증가시키고, 이는 태깅된 샤페론을 발현하는 박테리아로부터 제조된 추출물 내의 샤페론의 양을 증가시키는 것으로 생각된다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태그의 존재는 생성된 관심 단백질의 전체량을 증가시킨다. 일부 구체예에서, 폴리-아미노산 태깅된 샤페론을 함유하는 활성화된 추출물을 원심분리시키는 것은 적절하게 어셈블리된 관심 단백질의 양을 증가시킨다.
일반 방법
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 의료인은 당 분야의 정의 및 용어에 대해 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Green, M.R. and Sambrook, J., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), 및 Ausubel, F. M., et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, New York (2012)]을 특히 참조한다. 표준 방법은 또한 RNA 조작 및 분석을 위한 상세한 방법을 기재하고, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bindereif, Schon, & Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Germany]에 기재되어 있다. 재조합 핵산을 생성시키기에 적절한 분자 기술, 및 많은 클로닝 수행을 통해 당업자를 지도하기에 충분한 설명서의 예는 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Green, M.R., and Sambrook, J., (Id.); Ausubel, F. M., et al. (Id.); Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1987); 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, San Diego, Calif. 1990)]에서 발견된다.
단백질 정제, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 위한 방법은 문헌[Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]에 기재되어 있다. 세포-비함유 합성을 위한 방법은 문헌[Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Germany]에 기재되어 있다. 세포-비함유 합성을 이용한 단백질로의 비-자연 아미노산의 통합을 위한 방법은 문헌[Shimizu et al. (2006) FEBS Journal, 273, 4133-4140]에 기재되어 있다.
PCR 증폭 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, Calif., 1990]에 기재되어 있다. 증폭 반응은 통상적으로 증폭되어야 하는 DNA, 열안정성 DNA 중합효소, 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP), 반응 완충액 및 마그네슘을 포함한다. 통상적으로, 열 주기의 바람직한 수는 1 내지 25이다. 프라이머 설계 및 PCR 조건의 최적화를 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 문헌[Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 5th Edition, Wiley, 2002, 및 Innis et al. PCR Protocols, Academic Press, 1990]와 같은 표준 분자생물학 교과서에서 발견될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 필요한 특이성 및 최적 증폭 특성을 갖는 프라이머의 설계에서 유용하다(예를 들어, Oligo Version 5.0 (National Biosciences)). 일부 구체예에서, PCR 프라이머는 벡터 내의 특정 제한 효소 부위로의 증폭된 DNA 단편의 삽입을 촉진하기 위해 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인지 부위를 추가로 함유할 수 있다. 제한 부위가 PCR 프라이머의 5' 말단에 첨가되어야 하는 경우, 효소에 의한 더욱 효과적인 분해를 가능케 하기 위해 소수(예를 들어, 2개 또는 3개)의 여분의 5' 염기를 포함하는 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, PCR 프라이머는 또한 이후의 시험관내 전사를 가능케 하기 위해 RNA 중합효소 프로모터 부위, 예를 들어, T7 또는 SP6을 함유할 수 있다. 시험관내 전사를 위한 방법은 당 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Van Gelder et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 87:1663-1667, 1990; Eberwine et al. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 89:3010-3014, 1992]을 참조하라).
본원에 기재된 단백질이 명칭에 의해 언급되는 경우, 이는 유사한 기능 및 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 것이 이해된다. 따라서, 본원에 기재된 단백질은 야생형 프로토타입 단백질 뿐만 아니라 동족체, 다형태 변이체 및 재조합적으로 생성된 뮤테인을 포함한다. 예를 들어, 명칭 "DsbC 단백질"은 E. 콜리로부터의 야생형 프로토타입 단백질(예를 들어, SEQ ID NO:1), 뿐만 아니라 다른 종으로부터의 동족체, 다형태 변이체 및 재조합적으로 생성된 뮤테인을 포함한다. DsbC 및 FkpA와 같은 단백질은, 이들이 야생형 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 기능적 능력(예를 들어, 생물학적 활성 또는 기능적 능력의 적어도 80%)을 갖는 경우 유사한 기능을 갖는 것으로 정의된다. DsbC 및 FkpA와 같은 단백질은, 이들이 프로토타입 단백질과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 경우 유사한 아미노산 서열을 갖는 것으로 정의된다. 단백질의 서열 동일성은 3의 워드길이, 10의 기대값(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스의 디폴트와 함께 BLASTP 프로그램을 이용하여 결정된다(문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992]을 참조하라).
단백질 동족체, 다형태 변이체 또는 재조합 뮤테인이 본원에 기재된 단백질 샤페론을 포함하는지 결정하기 위한 용이하게 통상적인 시험은 프로토타입 단백질에 대해 발생된 폴리클로날 항체에 대한 특정 결합에 의한 시험이다. 예를 들어, DsbC 단백질은 SEQ ID NO:1의 프로토타입 단백질에 대해 발생된 폴리클로날 항체에 결합하는 단백질을 포함하며, FkpA 단백질은 SEQ ID NO:6의 프로토타입 단백질에 대해 발생된 폴리클로날 항체에 결합하는 단백질을 포함한다.
폴리클로날 항체에 대한 본원에 기재된 단백질 샤페론의 반응과 관련하여, 시험 단백질은 지정된 면역검정 조건하에서 백그라운드의 적어도 2배로 특정 항체에 결합할 것이며, 특정 항체는 샘플에 존재하는 다른 단백질에 유의한 양으로 실질적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, SEQ ID NO:1로 인코딩되는 DsbC에 대해 발생된 폴리클로날 항체, 스플라이스 변이체, 또는 이들의 일부는 DsbC와 특이적으로 면역반응성이고, DsbC의 다형태 변이체를 제외하고는 다른 단백질과 면역반응성이 아닌 폴리클로날 항체만 수득하기 위해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 Dsb 패밀리의 다른 일원과 교차-반응하는 항체를 제외함으로써 달성될 수 있다. 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 다양한 면역검정 포맷이 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 고상 ELISA 면역검정이 통상적으로 사용된다(예를 들어, 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건의 기재에 대해 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)]을 참조하라). 통상적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 백그라운드 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 더욱 통상적으로 백그라운드의 10 내지 100배 초과일 것이다.
본원에 기재된 샤페론 단백질 중 적어도 일부는 유사한 기능 및 다양한 정도의 서열 상동성을 갖는 관련 단백질의 큰 패밀리의 일원인 것이 이해될 것이다. 따라서, 본원에 기재된 단백질 샤페론은 유사한 기능을 갖는 패밀리 일원의 동족체, 예를 들어, PDI 및 PPIase의 동족체, Dsb 단백질의 동족체, FkpA 단백질의 동족체 등을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 샤페론은 본원에 기재된 샤페론과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 추가로, 실시예에 제공된 데이터는 진핵생물 PDI 및 박테리아 DsbC가 적절하게 어셈블리된 IgG를 생성시키는 이들의 능력에 관하여 기능적으로 상호교환적인 것을 나타내며, 이는 본원에 기재된 샤페론의 동족체가 본원에 기재된 방법 및 시스템에서 사용될 수 있다는 증거를 제공한다.
세포 비함유 단백질 합성(CFPS) 기술
본원에 기재된 관심 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위해, 세포 비함유 단백질 합성 시스템이 이용될 수 있다. 정제된 mRNA 전사물 또는 시험관내 합성 반응 동안 DNA로부터 전사된 mRNA로부터 시험관내에서의 단백질의 합성을 뒷받침하는 세포 추출물이 개발되었다.
반응 혼합물 내의 폴리펩티드의 CFPS는 박테리아 추출물 및/또는 규정된 시약을 포함한다. 반응 혼합물은 적어도 ATP 또는 에너지원; 거대분자의 생성을 위한 주형, 예를 들어, DNA, mRNA 등; 아미노산, 및 상기 보조인자, 효소 및 폴리펩티드 합성에 필요한 다른 시약, 예를 들어, 리보솜, tRNA, 중합효소, 전사 인자, 아미노아실 신세타제, 연장 인자, 개시 인자 등을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 에너지원은 항상성 에너지원이다. 고에너지 포스페이트 결합으로부터 ATP의 재생을 촉매하는 효소(들), 예를 들어, 아세테이트 키나제, 크레아틴 키나제 등이 또한 포함될 수 있다. 이러한 효소는 번역에 사용되는 추출물에 존재할 수 있거나, 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 이러한 합성 반응 시스템은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 문헌에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "반응 혼합물"은 핵산 주형으로부터의 폴리펩티드의 합성을 촉매할 수 있는 반응 혼합물을 나타낸다. 반응 혼합물은 박테리아 세포로부터의 추출물, 예를 들어, E. 콜리 S30 추출물을 포함한다. S30 추출물은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Lesley, S.A., et al. (1991), J. Biol . Chem. 266, 2632-8]에 기재되어 있다. 합성은 산소성 또는 무산소성 조건 하에서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 박테리아 추출물은 건조된다. 건조된 박테리아 추출물은 시작 물질의 고체 백분율을 측정함으로써 결정된 바와 같은 본래 고체의 110%로 milli-Q 물(예를 들어, 역삼투 물) 중에서 재구성될 수 있다. 한 구체예에서, 10 mL의 추출물의 본래의 고체의 110%인 정확하게 칭량된 분취량의 건조된 추출물이 자기 교반기 상에서 교반 막대를 갖는 유리 비커 중의 10 mL의 Milli-Q 물에 첨가된다. 생성된 혼합물은 분말이 용해될 때까지 교반된다. 용해시, 물질이 15 mL Falcon 튜브로 전달되고, 즉시 사용되지 않는 한 -80C에서 저장된다.
반응 혼합물 내의 추출물의 부피 백분율은 다양할 것이며, 상기 추출물은 일반적으로 전체 부피의 적어도 약 10%, 더욱 일반적으로 적어도 약 20%이고, 일부 예에서, 전체 부피의 적어도 약 50%; 또는 적어도 약 60%; 더욱 일반적으로 약 75% 이하로 제공되는 경우 추가 이익을 제공할 수 있다.
일반 시스템은 관심 단백질을 인코딩하는 핵산 주형을 포함한다. 핵산 주형은 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 또는 mRNA를 인코딩하는 핵산(예를 들어, RNA, DNA)이며, 이는 임의의 형태(예를 들어, 선형, 원형, 초나선, 단일 가닥, 이중 가닥 등)이다. 핵산 주형은 요망되는 단백질의 생성을 유도한다.
주형을 유지시키기 위해, 추출물을 생성시키기 위해 사용되는 세포는 유해 효소의 활성의 감소, 실질적 감소 또는 제거 또는 변형된 활성을 갖는 효소에 대해 선택될 수 있다. 변형된 뉴클레아제 또는 포스파타제 활성을 갖는(예를 들어, 적어도 하나의 돌연변이된 포스파타제 또는 뉴클레아제 유전자 또는 이들의 조합을 갖는) 박테리아 세포가 합성 효율을 증가시키기 위해 세포 추출물의 합성에 사용될 수 있다. 예를 들어, CFPS에 대한 S30 추출물을 제조하기 위해 사용되는 E. 콜리 균주는 RNase E 또는 RNase A 결핍성(예를 들어, 돌연변이에 의함)일 수 있다.
CFPS 시스템은 또한 요망되는 단백질로의 검출 가능하게 표지된 아미노산, 또는 통상적이지 않은 아미노산 또는 비자연 아미노산의 통합을 유도하기 위해 조작될 수 있다. 아미노산은 합성이거나 또 다른 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있다. 검출가능하게 표지된 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 종류의 비자연 아미노산이 CFPS 반응물에 첨가될 수 있고, 특정 목적을 위해 단백질로 효과적으로 통합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Albayrak, C. and Swartz, JR., Biochem. Biophys Res. Commun., 431(2):291-5; Yang WC et al. Biotechnol. Prog. (2012), 28(2):413-20; Kuechenreuther et al.. PLoS One, (2012), 7(9):e45850; 및 Swartz JR., AIChE Journal, 58(1):5-13]을 참조하라.
일반 CFPS 반응에서, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자는 전사 완충액에서 발현되어, CFPS 추출물 및 번역 완충액 중에서 관심 단백질로 번역되는 mRNA를 발생시킨다. 전사 완충액, 세포-비함유 추출물 및 번역 완충액은 개별적으로 첨가될 수 있거나, 이들 용액 중 2개 이상은 이들의 첨가 전에 조합될 수 있거나, 동시에 첨가될 수 있다.
시험관내에서 관심 단백질을 합성하기 위해, 일부 지점에서의 CFPS 추출물은 관심 단백질을 인코딩하는 mRNA 분자를 포함한다. 일부 CFPS 시스템에서, mRNA는 자연원으로부터 정제되거나, RNA 중합효소, 예를 들어, RNA 중합효소 II, SP6 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소, T7 RNA 중합효소, RNA 중합효소 III 및/또는 파지 유래 RNA 중합효소를 이용하여 클로닝된 DNA로부터 시험관 내에서 합성적으로 제조된 후에 외인성으로 첨가된다. 다른 시스템에서, mRNA는 주형 DNA로부터 시험관 내에서 생성되고, 상기 유형의 CFPS 반응에서 전사 및 번역 둘 모두가 발생한다. 일부 구체예에서, 전사 및 번역 시스템은 동일 반응에서 RNA 및 단백질 둘 모두의 합성을 수행하는 상보적 전사 및 번역 시스템에 커플링되거나 이들을 포함한다. 이러한 시험관내 전사 및 번역 시스템에서, CFPS 추출물은 단일 시스템에서 전사(mRNA를 생성시키기 위함) 및 번역(단백질을 합성하기 위함) 둘 모두에 필요한 모든 성분(외인성 또는 내인성)을 함유한다. 본원에 기재된 커플링된 전사 및 번역 시스템은 때때로 개방-세포 비함유 합성(OCFS) 시스템으로 언급되며, 높은 역가의 적절하게 폴딩된 관심 단백질, 예를 들어, 높은 역가의 항체 발현을 달성할 수 있다.
세포 비함유 단백질 합성 반응 혼합물은 다음과 같은 성분을 포함한다: 적어도 하나의 프로모터 및, 임의로, 하나 이상의 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 관심 유전자를 포함하는 주형 핵산, 예를 들어, DNA(예를 들어, 관심 유전자를 함유하는 클로닝 또는 발현 벡터) 또는 PCR 단편; 관심 유전자가 작동 가능하게 연결된 프로모터(들)을 인지하는 RNA 중합효소(예를 들어, T7 RNA 중합효소) 및, 임의로, 주형 핵산이 작동 가능하게 연결된 임의의 조절 서열에 특이적인 하나 이상의 전사 인자; 리보뉴클레오티드 트리포스페이트(rNTP); 임의로, 다른 전사 인자 및 이에 대한 보조-인자; 리보솜; 전달 RNA(tRNA); 다른 또는 임의의 번역 인자(예를 들어, 번역 개시, 연장 및 종료 인자) 및 이에 대한 보조-인자; 하나 이상의 에너지원(예를 들어, ATP, GTP); 임의로, 하나 이상의 에너지 재생 성분(예를 들어, PEP/피루베이트 키나제, AP/아세테이트 키나제 또는 크레아틴 포스페이트/크레아틴 키나제); 임의로 수율 및/또는 효율을 향상시키는 인자(예를 들어, 뉴클레아제, 뉴클레아제 억제제, 단백질 안정제, 샤페론) 및 이에 대한 보조-인자; 및 임의로, 가용화제. 반응 혼합물은 단백질 합성에 특별히 필요한 아미노산 및 다른 물질, 예를 들어, 염(예를 들어, 아세트산, 글루탐산, 또는 황산의 포타슘, 마그네슘, 암모늄, 및 망간 염), 중합체 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 디에틸 아미노에틸 덱스트란, 4차 아미노에틸 및 아미노에틸 덱스트란 등), 사이클릭 AMP, 단백질 또는 핵산 분해 효소의 억제제, 단백질 합성의 억제제 또는 조절제, 산화/환원 조절자(예를 들어, DTT, 아스코르브산, 글루타티온, 및/또는 이들의 옥사이드), 비-변성 계면활성제(예를 들어, Triton X-100), 완충액 성분, 스퍼민, 스퍼미딘, 푸트레신 등을 추가로 포함한다. CFPS 반응의 성분은 미국 특허 번호 7,338,789호 및 7,351,563호, 및 미국 출원 공개 번호 2010/0184135호 및 US 2010/0093024호에 더욱 상세히 논의되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 모든 목적상 전체내용이 참조로서 포함된다.
추출물 내에 존재하는 특정 효소에 따라, 예를 들어, 많은 공지된 뉴클레아제, 중합효소 또는 포스파타제 억제제 중 하나 이상이 합성 효율을 개선시키기 위해 선택될 수 있고, 유리하게 이용될 수 있다.
단백질 및 핵산 합성은 통상적으로 에너지원을 필요로 한다. mRNA를 생성시키기 위한 전사 개시에 에너지가 필요하다(예를 들어, DNA 주형이 사용되는 경우, 번역의 개시를 위해, 예를 들어, GTP 형태의 고에너지 포스페이트가 사용된다). 리보솜에 의한 하나의 코돈(3개의 뉴클레오티드; 하나의 아미노산)의 각각의 이후의 단계는 추가 GTP의 GDP로의 가수분해를 필요로 한다. ATP가 또한 통상적으로 필요하다. 단백질 합성 동안 중합되는 아미노산에 대해, 이는 먼저 활성화되어야 한다. 따라서, 고에너지 포스페이트 결합으로부터 유의한 양의 에너지가 단백질 및/또는 핵산 합성이 진행되는데 필요하다.
에너지원은 요망되는 화학적 반응을 달성하기 위한 에너지를 제공하기 위해 효소적으로 가공될 수 있는 화학적 기질이다. 고-에너지 포스페이트 결합의 분해에 의해 합성을 위한 에너지의 방출을 가능케 하는 에너지원, 예를 들어, 뉴클레오시드 트리포스페이트에서 발견되는 에너지원, 예를 들어, ATP가 일반적으로 사용된다. 고에너지 포스페이트 결합으로 전환가능한 임의의 공급원이 특히 적합하다. ATP, GTP, 및 다른 트리포스페이트가 단백질 합성을 뒷받침하기 위한 동등한 에너지원으로서 일반적으로 간주될 수 있다.
합성 반응을 위한 에너지를 제공하기 위해, 시스템은 고-에너지 트리포스페이트 화합물, 예를 들어, ATP, GTP, 다른 NTP 등을 생성시키거나 재생시킬 수 있는 첨가된 에너지원, 예를 들어, 글루코스, 피루베이트, 포스포에놀피루베이트(PEP), 카르바모일 포스페이트, 아세틸 포스페이트, 크레아틴 포스페이트, 포스포피루베이트, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, 3-포스포글리세레이트 및 글루코스-6-포스페이트를 포함할 수 있다.
충분한 에너지가 합성 시스템에 처음에 존재하지 않는 경우, 바람직하게는 추가 에너지원이 보충된다. 에너지원은 또한 시험관내 합성 반응 동안 첨가되거나 보충될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포-비함유 단백질 합성 반응은 NTPs, E. 콜리 tRNA, 아미노산, Mg2 + 아세테이트, Mg2 + 글루타메이트, K+ 아세테이트, K+ 글루타메이트, 폴린산, Tris pH 8.2, DTT, 피루베이트 키나제, T7 RNA 중합효소, 이황화물 이소메라제, 포스포에놀 피루베이트(PEP), NAD, CoA, Na+ 옥살레이트, 푸트레신, 스퍼미딘, 및 S30 추출물을 포함하는 PANOx-SP 시스템을 이용하여 수행된다.
일부 구체예에서, 비-자연 아미노산(nnAA)을 함유하는 단백질이 합성될 수 있다. 이러한 구체예에서, 반응 혼합물은 비-자연 아미노산, 20개의 자연 발생 아미노산에 오르쏘고날(orthogonal)인 tRNA, 및 nnAA와 오르쏘고날 tRNA를 연결시킬 수 있는 tRNA 신세타제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010/0093024호를 참조하라. 대안적으로, 반응 혼합물은 자연 발생 tRNA 신세타제가 고갈된 tRNA에 컨쥬게이션된 nnAA를 포함할 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2010/081111호를 참조하라.
일부 예에서, 세포-비함유 합성 반응은 일반적으로 이차 에너지원의 첨가를 필요로 하지 않으나, 산화적 인산화 및 단백질 합성의 공동-활성화를 이용한다. 일부 예에서, Cytomim(세포질 모방체) 시스템과 같은 CFPS가 반응에서 수행된다. Cytomim 시스템은 폴리에틸렌 글리콜의 부재하에서 최적화된 마그네슘 농도와 함께 수행되는 반응 조건으로 정의된다. 이러한 시스템은 단백질 합성을 억제하는 것으로 공지된 포스페이트를 축적하지 않는다.
활성 산화적 인산화 경로의 존재는 경로 내의 단계를 특이적으로 억제하는 억제제, 예를 들어, 전자 전달 사슬 억제제를 이용하여 시험될 수 있다. 산화적 인산화 경로의 억제제의 예는 독소, 예를 들어, 시아니드, 일산화탄소, 아지드, 카르보닐 시아니드 m-클로로페닐 하이드라존(CCCP), 및 2,4-디니트로페놀, 항생제, 예를 들어, 올리고마이신, 살충제, 예를 들어, 로테논, 및 숙시네이트 데히드로게나제의 경쟁 억제제, 예를 들어, 말로네이트 및 옥살로아세테이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 세포-비함유 단백질 합성 반응은 NTPs, E. 콜리 tRNA, 아미노산, Mg2 + 아세테이트, Mg2 + 글루타메이트, K+ 아세테이트, K+ 글루타메이트, 폴린산, Tris pH 8.2, DTT, 피루베이트 키나제, T7 RNA 중합효소, 이황화물 이소메라제, 소듐 피루베이트, NAD, CoA, Na+ 옥살레이트, 푸트레신, 스퍼미딘, 및 S30 추출물을 포함하는 Cytomim 시스템을 이용하여 수행된다. 일부 구체예에서, Cytomim 시스템에 대한 에너지 기질은 피루베이트, 글루탐산, 및/또는 글루코스이다. 시스템의 일부 구체예에서, 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP)는 뉴클레오시드 모노포스페이트(NMP)로 대체된다.
세포 추출물은 이황화 결합을 감소시키고, 적절한 단백질 폴딩을 손상시킬 수 있는 효소를 비활성화시키기 위해 아이오도아세트아미드로 처리될 수 있다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 세포 추출물은 또한 원핵생물 이황화 결합 이소메라제, 비제한적인 예로, E. 콜리 DsbC 및 PDI로 처리될 수 있다. 세포 추출물은 DsbC, FkpA 및 펩티딜 페올릴 이소메라제로 처리될 수 있다. 글루타티온 이황화물(GSSG) 및 글루타티온(GSH)이 또한 적절한 단백질 폴딩을 촉진하고, 이상 단백질 이황화물의 형성을 방지하는 비율로 추출물에 첨가될 수 있다.
일부 구체예에서, CFPS 반응물은 산화적 인산화를 수행하기 위해 역위된 막 소포를 포함한다. 이들 소포는 본원에 기재된 바와 같은 세포 추출 과정의 제조물의 고압 균질화 단계 동안 형성될 수 있고, 반응 혼합물에서 사용되는 추출물 중에 남아 있을 수 있다.
세포-비함유 추출물은 CFPS 반응에서 사용하기 전에 실온으로 해동될 수 있다. 추출물은 이황화 결합을 갖는 단백질을 합성하는 경우 30분 동안 50 μM 아이오도아세트아미드와 인큐베이션될 수 있다. 일부 구체예에서, CFPS 반응물은 약 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 약 10 mM 암모늄 글루타메이트, 약 130 mM 포타슘 글루타메이트, 약 35 mM 소듐 피루베이트, 약 1.2 mM AMP, 각각 약 0.86 mM의 GMP, UMP, 및 CMP, 약 2 mM 아미노산(티로신에 대해 약 1 mM), 약 4 mM 소듐 옥살레이트, 약 0.5 mM 푸트레신, 약 1.5 mM 스퍼미딘, 약 16.7 mM 포타슘 포스페이트, 약 100 mM T7 RNA 중합효소, 약 2-10 ㎍/mL 플라스미드 DNA 주형, 약 1-10 μM E. 콜리 DsbC, 및 약 2 mM 산화된 (GSSG) 글루타티온의 전체 농도를 갖는 약 30%(v/v) 아이오도아세트아미드-처리 추출물을 포함한다. 임의로, 세포 비함유 추출물은 1 mM의 환원된 (GSH)를 포함할 수 있다.
세포 비함유 합성 반응 조건은 당 분야에 공지된 바와 같이 회분식, 연속 유동, 또는 반-연속 유동으로 수행될 수 있다. 반응 조건은 선형으로 상승가능하며, 예를 들어, 0.5 L 교반 탱크 반응기에서 0.3 L 규모, 10 L 발효기에서 4 L 규모, 및 200 L 발효기에서 100 L 규모로 선형으로 상승가능하다.
문헌[Spirin et al. (1988) Science 242:1162-1164]에 의한 연속 유동 시험관내 단백질 합성 시스템의 개발은 반응이 수시간까지 연장될 수 있는 것을 입증하였다. 그 이후로, 다수의 그룹이 상기 시스템을 재현하고 개선시켰다(예를 들어, 문헌[Kigawa et al. (1991) J. Biochem . 110:166-168; Endo et al. (1992) J. Biotechnol. 25:221-230]을 참조하라). 문헌[Kim and Choi (Biotechnol. Prog. 12: 645-649, 1996)]에는 간단한 투석 막 반응기를 이용한 "반연속 작업"을 채택함으로써 회분식 및 연속 유동 시스템의 장점이 조합될 수 있는 것이 보고되어 있다. 이들은 통상적인 회분식 시스템의 최초 속도를 유지하면서 연속 유동 시스템의 연장된 반응 기간을 재현시킬 수 있었다. 그러나, 연속 및 반-연속 접근법 둘 모두는 생성물 수율에서의 증가보다 유의하게 더 큰 요인에 의해 증가되어야 하는 다량의 고비용의 시약을 필요로 한다.
통상적인 회분식 시스템에서 여러 개선이 이루어졌다(Kim et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239: 881-886; Kuldlicki et al. (1992) Anal. Biochem. 206:389-393; Kawarasaki et al. (1995) Anal. Biochem. 226: 320-324). 반연속 시스템은 연장된 기간에 걸쳐 단백질 합성의 최초 속도를 유지하나, 통상적인 회분식 시스템은 여러 장점, 예를 들어, 작업의 편리함, 용이한 규모 확장, 낮은 시약 비용 및 우수한 재현성을 여전히 제공한다. 또한, 회분식 시스템은 다양한 유전 물질을 동시에 발현하는 다중 포맷으로 용이하게 수행될 수 있다.
문헌[Patnaik and Swartz (Biotechniques 24:862-868, 1998)]에는 단백질 합성의 최초 특정 속도가 반응 조건의 광범위한 최적화를 통해 시험관내 발현의 수준과 유사한 수준으로 향상될 수 있는 것이 보고되어 있다. 이들이 임의의 응축 단계 없이 제조된 통상적인 세포 추출물을 이용하여 단백질 합성의 상기 높은 속도를 달성한 것이 주목할만 하다(Nakano et al. (1996) J. Biotechnol . 46:275-282; Kim et al. (1996) Eur . J. Biochem . 239:881-886). 문헌[Kigawa et al. (1999) FEBS Lett 442:15-19]에는 응축 추출물 및 에너지원으로서 크레아틴 포스페이트를 이용한 높은 수준의 단백질 합성이 보고되어 있다. 이들 결과는 특히 단백질 합성 반응의 수명과 관련하여 회분식 시스템의 추가 개선이 회분식 시험관내 단백질 합성에 대한 생산성을 실질적으로 증가시키는 것을 의미한다. 그러나, 통상적인 회분식 시스템에서의 단백질 합성의 초기 중지에 대한 이유는 불명확한 채로 남아있다.
본원에 기재된 단백질 합성 반응은 대규모 반응기, 소규모 반응기를 이용할 수 있거나, 복수의 동시 합성을 수행하기 위해 다중화될 수 있다. 연속 반응은 시약의 유동을 도입시키기 위해 공급 메커니즘을 이용할 수 있고, 공정의 일부로서 최종-생성물을 분리할 수 있다. 활성 합성을 위한 기간을 연장시키기 위해 추가 시약이 도입될 수 있는 회분식 시스템이 또한 관련된다. 반응기는 임의의 방식, 예를 들어, 회분식, 연장된 회분식, 반-회분식, 반-연속, 유가식 및 연속으로 작동될 수 있고, 이는 적용 목적에 따라 선택될 것이다.
용해질 생성
본원에 기재된 방법 및 시스템은 관심 표적 단백질의 시험관내 번역을 위해 세포 용해질을 이용한다. 편의를 위해, 용해질에 대한 공급원으로서 사용되는 유기체가 공급원 유기체 또는 숙주 세포로 언급될 수 있다. 숙주 세포는 박테리아, 효모, 포유동물 또는 식물 세포, 또는 단백질을 합성할 수 있는 임의의 다른 유형의 세포일 수 있다. 용해질은 요망되는 단백질을 인코딩하는 메신저 리보핵산(mRNA)을 번역시킬 수 있는 성분을 포함하고, 요망되는 단백질을 인코딩하는 DNA를 전사시킬 수 있는 성분을 임의로 포함한다. 상기 성분은, 예를 들어, DNA-특이적 RNA 중합효소(RNA 중합효소), 요망되는 단백질을 인코딩하는 DNA의 전사 개시에 필요한 임의의 전사 활성제, 전달 리보핵산(tRNA), 아미노아실-tRNA 신세타제, 70S 리보솜, N10-포르밀테트라하이드로폴레이트, 포르밀메티오닌-tRNAfMet 신세타제, 펩티딜 트랜스페라제, 개시 인자, 예를 들어, IF-1, IF-2, 및 IF-3, 연장 인자, 예를 들어, EF-Tu, EF-Ts, 및 EF-G, 방출 인자, 예를 들어, RF-1, RF-2, 및 RF-3 등을 포함한다.
한 구체예는 용해질이 유래되는 박테리아 세포를 이용한다. 임의의 박테리아 균주로부터 유래된 박테리아 용해질이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 박테리아 용해질이 하기와 같이 수득될 수 있다. 선택 박테리아는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 특정 박테리아의 성장을 위해 의료인에 의해 용이하게 최적화되는 성장 조건하에서 다수의 성장 배지 중 임의의 성장 배지에서 대수증식기로 성장된다. 예를 들어, 합성을 위한 자연 환경은 글루코스 및 포스페이트를 함유하는 배지에서 성장된 박테리아 세포로부터 유래된 세포 용해질을 이용하며, 상기 글루코스는 적어도 약 0.25%(중량/부피), 더욱 일반적으로 적어도 약 1%; 일반적으로 약 4% 이하, 더욱 일반적으로 약 2% 이하의 농도로 존재한다. 상기 배지의 한 예는 2YTPG 배지이나, 당업자는 많은 배양 배지가 상기 목적을 위해 적합화될 수 있는 것을 인지할 것인데, 이는 규정된 영양소원 및 규정되지 않은 영양소원 둘 모두를 이용하여 E. 콜리와 같은 박테리아의 성장에 적합한 많은 공개된 배지가 존재하기 때문이다. 밤새 수거된 세포는 적합한 세포 현탁 완충액에 세포 펠렛을 현탁시키고, 현탁된 세포를 음파처리, 프렌치 가압기(French press)에서의 현탁된 세포의 파괴, 연속 유동 고압 균질화, 또는 효과적인 세포 용해에 유용한 당 분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 파괴시킴으로써 용해될 수 있다. 이후, 세포 용해질은 많은 DNA 단편 및 세포 조직파편을 제거하기 위해 원심분리되거나 여과된다.
세포 용해질을 제조하기 위해 사용되는 박테리아 균주는 일반적으로 세포 비함유 합성 효율을 증가시키기 위해 감소된 뉴클레아제 및/또는 포스파타제 활성을 갖는다. 예를 들어, 세포 비함유 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아 균주는 뉴클레아제 RNase E 및 RNase A를 인코딩하는 유전자 내에 돌연변이를 가질 수 있다. 균주는 또한 세포-비함유 합성 반응에서 아미노산 트립토판, 아르기닌, 세린 및 시스테인의 분해를 각각 방지하는 tnaA , speA , sdaA 또는 gshA와 같은 유전자 내의 결실과 같은 세포 합성 반응의 성분을 안정화시키는 돌연변이를 가질 수 있다. 또한, 균주는 프로테아제 ompT 또는 lonP 내의 넉아웃(knockout)과 같은 세포-비함유 합성의 단백질 생성을 안정화시키는 돌연변이를 가질 수 있다.
관심 단백질
본원에 기재된 방법 및 시스템은 적절하게 폴딩된 생물학적 활성의 관심 단백질의 발현을 증가시키는데 유용하다. 관심 단백질은 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 발현될 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 비제한적인 예는 이황화 결합을 갖는 단백질 및 적어도 2개의 프롤린 잔기를 갖는 단백질을 포함한다. 관심 단백질은, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편, 치료 단백질, 성장 인자, 수용체, 사이토카인, 효소, 리간드 등일 수 있다. 관심 단백질의 추가 예는 하기에 기재된다.
이황화 결합을 갖는 단백질
본원에 제공된 방법은 생물학적 활성 입체형태에서 적어도 하나의 이황화 결합을 갖는 임의의 단백질에 대해 사용될 수 있다. 이황화 결합은 공유적 방식으로 잔기들을 연결시킴으로써 폴딩 단위를 안정적 입체형태로 잠금으로써 3차 단백질 구조를 안정화시킬 수 있다.
원핵생물 세포에서, DsbA 단백질이 자연 구조에서 이황화 결합을 포함하는 새로이 합성된 폴리펩티드로 이의 이황화 결합을 제공하는 경우에 이황화 결합이 형성된다. 온전한 막 단백질 DsbB는 자체 내에서 이황화 결합을 발생시키고, 이는 이후에 DsbA에 전달된다. 일부 진핵생물 세포에서, 주요 이황화물 경로는 막-결합 플라보단백질 EroI 및 가용성 티오레독신-유사 단백질 PDI로 구성된다. 산소에 의한 시스테인 쌍의 재산화를 매개하는 플라빈 보조인자를 이용하는 EroI은 자체 내에 이황화 결합을 발생시키고, 이후에 상기 결합을 PDI로 전달한다. 차례로, PDI는 이의 자연 구조를 채택하지 않는 새로이 합성된 폴리펩티드에 직접 이황화 결합을 전달한다.
이황화 결합은 분비된 단백질, 면역 단백질, 세포외 기질 단백질, 당단백질, 리소좀 단백질 및 막 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 단백질에 존재한다. 이황화 결합 및 이황화 결합을 갖는 단백질의 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌[Fass, D. Annu . Rev. Biophys ., 2012, 41:63-79, Sevier, C.S. and Kaiser, C.A. Antioxidants & Redox Signaling, 2006, 8(5):797-811 및 de Marco, A., Microbial Cell Factories, 2009, 8:26]에서 발견될 수 있다.
프롤린을 갖는 단백질
본원에 제공된 방법은 적어도 2개의 프롤린 잔기를 갖는 임의의 단백질에 대해 사용될 수 있다. 프롤린 함유 단백질은 통상적으로 이차 구조 요소, 예를 들어, 턴(turn) 및 폴리프롤린 헬릭스에 유리하다. 폴리프롤린 헬릭스는 펩티드 백본의 비틀림각 Φ = -78° 및 Ψ = +146°를 갖는 연장된 좌측으로 감기는 헬릭스일 수 있다. 막횡단 헬릭스의 중심 근처의 단백질에서 비교적 높은 비율의 프롤린이 발견될 수 있다. 프롤린 잔기는 또한, 예를 들어, α-헬릭스의 말단에서 β-턴 및 α-헬리칼 캡핑 모티프(α-helical capping motif) 또는 상기 말단으로부터의 심지어 1개 또는 2개의 잔기에서 발견될 수 있다. 프롤린은 또한 적절한 단백질 폴딩에 중요한 시스-트랜스 이성화를 겪을 수 있다.
프롤린-풍부 단백질은 반복성의 짧은 프롤린-풍부 서열을 갖는 단백질, 일렬 반복 프롤린-풍부 서열을 갖는 단백질, 비-반복성 프롤린-풍부 영역을 갖는 단백질, 및 하이드록시프롤린-풍부 단백질을 갖는 단백질을 포함한다. 프롤린 잔기는 온전한 막 단백질, 예를 들어, 전달체, 채널, 및 수용체, 구상 단백질, 호르몬, 신경펩티드, 뮤신, 면역글로불린, 및 세포외 기질 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 단백질에서 발견될 수 있다.
프롤린-풍부 펩티드는 세포에서 산화질소 생성을 향상시키고/시키거나 지속시킬 수 있고, 세포에서 아르기니노숙시네이트 신세타제 활성을 강화시킬 수 있고, 칼슘 이온의 세포내 농도를 증가시킬 수 있고, SH3, WW, EVH1 또는 BHB 도메인 함유 단백질에 대한 리간드로 작용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 프롤린-함유 단백질의 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌[Williamson, M. Biochem . J. 1994, 297:249-260 및 Kay et al. FASEB J., 14:231-241]에서 발견될 수 있다.
샤페론
관심 생물학적 활성 단백질의 발현을 개선시키기 위해, 본 발명의 방법 및 시스템은 외인성 단백질 샤페론을 포함하는 박테리아 추출물을 이용한다. 분자 샤페론은 비-공유 폴딩 또는 언폴딩 및 다른 거대분자 구조의 어셈블리 또는 분해를 돕는 단백질이다. 샤페론의 한 주요 기능은 새로이 합성된 폴리펩티드 사슬 및 어셈블리된 서브유닛 둘 모두의 비기능성 구조로의 응집을 방지하는 것이다. 첫번째로 확인된 단백질 샤페론인 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)은 DNA 및 적절하게 폴딩된 히스톤으로부터의 뉴클레오솜 어셈블리를 돕는다. 상기 어셈블리 샤페론은 폴딩된 서브유닛의 올리고머 구조로의 어셈블리를 돕는다. 샤페론은 최초 단백질 폴딩과 관련되는데, 이는 이들이 리보솜, 단백질의 세포내 수송, 뿐만 아니라 미스폴딩된 단백질 또는 변성된 단백질의 단백질 분해로부터 배출되기 때문이다. 대부분의 새로이 합성된 단백질은 샤페론의 부재하에서 폴딩될 수 있으나, 소수는 이들을 엄격히 필요로 한다. 통상적으로, 샤페론의 내부 부분은 소수성인 반면, 표면 구조는 친수성이다. 샤페론이 기질 단백질의 폴딩을 촉진하는 정확한 메커니즘은 공지되어 있지 않으나, 부분적으로 폴딩된 구조와 자연 형태 사이의 활성화 장벽을 낮춤으로써, 샤페론이 적절한 폴딩을 보장하기 위해 요망되는 폴딩 단계를 촉진하는 것으로 생각된다. 추가로, 특정 샤페론은 미스폴딩되거나 응집된 단백질을 언폴딩시키고, 연속적인 언폴딩 및 다시 자연 및 생물학적 활성 형태로의 재폴딩에 의해 단백질을 구제한다.
폴딩 기질을 캡슐화시키는 샤페론의 서브셋이 샤페로닌(chaperonin)(예를 들어, 그룹 I 샤페로닌 GroEL/GroES 복합체)으로 공지되어 있다. 그룹 II 샤페로닌, 예를 들어, TRiC(TCP-1 고리 복합체, TCP-1을 함유하는 샤페로닌에 대해 CCT로도 언급됨)는 다른 기질 중에서 세포골격 단백질 액틴 및 튜불린을 폴딩시키는 것으로 생각된다. 샤페로닌은 적층된 이중-고리 구조를 특징으로 하고, 원핵생물, 진핵생물의 세포질, 및 미토콘드리아에서 발견된다.
다른 유형의 샤페론이 진핵생물에서의 미토콘드리아 및 소포체(ER) 내의 막 수송과 관련된다. 박테리아 전위-특이적 샤페론은 전위-적격(일반적으로, 언폴딩된) 상태로 새로이 합성된 전구체 폴리펩티드 사슬을 유지시키고, 이들을 전위자 또는 전위 채널로 일반적으로 공지된 트랜스로콘(translocon)으로 유도한다. 원핵생물 및 진핵생물에서의 단백질의 유사한 복합체는 가장 일반적으로 세포질로부터의 소포체(ER)의 내부(수조 또는 내강) 공간으로의 표적화 신호 서열을 갖는 신생 폴리펩티드를 운반하나, 또한 막 자체로 신생 단백질(막 단백질)을 통합시키기 위해 사용되는 복합체를 나타낸다. 소포체(ER)에서, 단백질을 폴딩시키는 것을 돕는 일반 샤페론(BiP, GRP94, GRP170), 렉틴(칼넥신(calnexin) 및 칼레티큘린(calreticulin)) 및 비-고전적 분자 샤페론(HSP47 및 ERp29)이 존재한다. 폴딩 샤페론 단백질은 단백질 이황화물 이소메라제(PDI, DsbA, DsbC) 및 펩티딜 프롤릴 시스-트랜스 이소메라제(PPI, FkpA, SlyD, TF)를 포함한다.
많은 샤페론은 또한 열충격 단백질(Hsp)로 분류되는데, 이는 이들이 열충격과 같은 세포 스트레스 동안 고도로 상향조절되고, 단백질이 상승된 온도 또는 다른 세포 스트레스에 의해 변성됨에 따라 응집하는 경향이 증가하기 때문이다. 단백질을 분해에 대해 특징지우는 유비퀴틴이 또한 열충격 단백질의 특징을 갖는다. 일부 고도로 특이적인 '입체구조적 샤페론'은 자발적으로 폴딩될 수 없는 단백질로 독특한 구조적 입체형태(입체구조적) 정보를 전달한다. 샤페론에 대한 다른 기능은 단백질 분해, 박테리아 부착소 활성, 및 단백질 응집과 관련된 프리온 질병에 대한 반응에서의 도움을 포함한다.
폴다제로 공지된 효소는 합성된 단백질의 자연 및 기능적 입체형태의 형성에 필요한 공유적 변화를 촉매한다. 폴다제의 예는 자연 이황화 결합의 형성을 촉매하는 작용을 하는 단백질 이황화물 이소메라제(PDI), 및 안정적인 트랜스 펩티딜 프롤릴 결합의 단백질의 기능성 폴드에 필요한 시스 입체형태로의 이성화를 촉매하는 작용을 하는 펩티딜 프롤릴 시스-트랜스 이소메라제(PPI)를 포함한다. 자연 이황화물의 형성 및 프롤릴 이미드 결합의 시스-트랜스 이성화 둘 모두는 공유 반응이며, 이는 단백질 폴딩 과정에서 종종 속도-제한 단계이다. 화학량론적 농도에서 샤페론 단백질인 것으로 최근에 제안된 폴다제는 일부 변성된 단백질의 재활성화 수율을 증가시킨다. 샤페론 단백질의 다른 예는 데아그레가제, 예를 들어, Skp, 및 산화환원 단백질 Trr1 및 Glr1을 포함한다.
일부 구체예에서, 단백질 샤페론은 요망되는 단백질 샤페론의 활성을 증가시키는 기능을 하는 또 다른 단백질(들)과 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, Dsb 단백질 DsbA 및 DsbC는 DsbA 및 DsbC를 각각 산화시키고 환원시키는 DsbB 및 DsbD와 공동발현될 수 있다.
샤페론을 인코딩하는 유전자를 이용한 박테리아 형질전환
본원에 기재된 방법 및 시스템에서 사용되는 박테리아 추출물은 외인성 단백질 샤페론을 함유한다. 본원에 기재된 외인성 단백질 샤페론은 추출물에 첨가될 수 있거나, 세포 비함유 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아에 의해 발현될 수 있다. 후자의 구체예에서, 외인성 단백질 샤페론은 유전자의 전사를 개시시키는 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 외인성 단백질 샤페론을 인코딩하는 유전자로부터 발현될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터는 항시성 프로모터 및 조절된(유도성) 프로모터 둘 모두를 포함한다. 프로모터는 숙주에 따라 원핵생물성 또는 진핵생물성일 수 있다. 원핵생물성(박테리오파지를 포함함) 중에서, 본 발명의 실시에 유용한 프로모터는 lac, T3, T7, 람다 Pr'P1' 및 trp 프로모터이다. 진핵생물성(바이러스를 포함함) 중에서, 본 발명의 실시에 유용한 프로모터는 편재성 프로모터(예를 들어, HPRT, 비멘틴(vimentin), 액틴, 튜불린), 중간체 미세섬유 프로모터(예를 들어, 데스민(desmin), 신경미세섬유, 케라틴, GFAP), 치료 유전자 프로모터(예를 들어, MDR 타입, CFTR, 인자 VIII), 조직-특이적 프로모터(예를 들어, 평활근 세포에서의 액틴 프로모터), 자극(예를 들어, 스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체)에 반응하는 프로모터, 테트라사이클린-조절되는 전사 조정자, 사이토메갈로바이러스 즉시-초기, 레트로바이러스 LTR, 메탈로티오네인, SV-40, E1a, 및 MLP 프로모터이다. 테트라사이클린-조절되는 전사 조정자 및 CMV 프로모터는 WO 96/01313호, 미국 특허 번호 5,168,062호 및 5,385,839호에 기재되어 있으며, 이들의 전체 개시내용은 참조로서 본원에 포함된다.
일부 구체예에서, 프로모터는 항시성 프로모터이다. 박테리아에서의 항시성 프로모터의 예는 spc 리보솜 단백질 오페론 프로모터 Pspc, 플라스미드 pBR322의 β-락타마제 유전자 프로모터 Pbla, 파지 λ의 PL 프로모터, 플라스미드 pBR322의 복제 조절 프로모터 PRNAI 및 PRNAII, rrnB 리보솜 RNA 오페론의 P1 및 P2 프로모터, tet 프로모터, 및 pACYC 프로모터를 포함한다.
관심 단백질 및 샤페론의 정량적 측정
본원에 기재된 방법 및 시스템에 의해 생성된 관심 단백질의 양은 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 발현된 관심 단백질은 젤 전기영동(예를 들어, PAGE), 웨스턴 분석 또는 모세관 전기영동(예를 들어, Caliper LabChip)을 이용하여 정제되고 정량될 수 있다. 세포-비함유 번역 반응에서의 단백질 합성은 방사선 표지된 아미노산, 통상적으로 35S-표지된 메티오닌 또는 14C-표지된 류신의 통합에 의해 모니터될 수 있다. 방사선 표지된 단백질은 분자 크기에 대해 시각화될 수 있고, 전기영동 후의 자가방사선촬영술에 의해 정량되거나, 면역침전에 의해 분리될 수 있다. 재조합 His 태그의 통합은 Ni2 + 친화성 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제의 또 다른 수단을 제공한다. 발현 시스템으로부터의 단백질 생성은 가용성 단백질 수율로 측정될 수 있거나, 효소 또는 결합 활성의 검정을 이용함으로써 측정될 수 있다.
세포 비함유 합성 시스템에 첨가되는 샤페론 단백질의 양은 박테리아 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아 세포 배양물 내에 방사성 아미노산, 예를 들어, 14C-류신을 포함시키고, 예를 들어, 트리클로로아세트산(TCA)을 이용하여 방사성 단백질을 침전시키고, 회수된 방사능의 전체량을 측정함으로써 발현된 단백질 샤페론의 양을 정량함으로써 정량될 수 있다. 샤페론의 양은 또한, 예를 들어, 플레이트 내 또는 웨스턴 블롯 상에 고정된 샤페론 단백질을 검출하고 정량하기 위해 샤페론에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 사용되는 ELISA에 의해 면역학적으로 측정될 수 있다.
발현된 단백질의 생물학적 활성 및 적절한 폴딩의 정량적 측정
본원에 기재된 방법에 의해 생성된 관심 단백질의 생물학적 활성은 관심 단백질에 특이적인 시험관내 또는 생체내 검정을 이용하여 정량될 수 있다. 관심 단백질의 생물학적 활성은 세포-비함유 단백질 합성 반응 혼합물의 단위 부피 당 생물학적 활성으로 표현될 수 있다. 발현된 관심 단백질의 적절한 폴딩은 생성된 전체 단백질의 양을 가용성 단백질의 양과 비교함으로써 정량될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 전체량 및 생성된 상기 단백질의 가용성 분획은 방사선 표지된 아미노산, 예를 들어, 14C-류신으로 관심 단백질을 방사성 표지시키고, TCA로 표지된 단백질을 침전시킴으로써 결정될 수 있다. 폴딩되고 어셈블리된 단백질의 양은 정확한 분자량에서 이동하는 가용성 단백질의 분획을 측정하기 위한 환원 및 비-환원 조건하에서의 젤 전기영동(PAGE)에 의해 결정될 수 있다. 비-환원 조건하에서, 단백질 응집물은 젤 매트릭스 상에서 트랩핑(trapping)될 수 있거나, 별개의 존재물로 특성규명하기에 어려운 고분자량 도말표본으로서 이동할 수 있는 반면, 환원 조건 하 및 샘플의 가열시, 이황화 결합을 함유하는 단백질은 변성되고, 응집물은 분리되고, 발현된 단백질은 단일 밴드로서 이동한다. 적절하게 폴딩되고 어셈블리된 항체 단백질의 양을 결정하기 위한 방법은 실시예에 기재된다. 항체 분자의 기능적 활성은 면역검정, 예를 들어, ELISA를 이용하여 결정될 수 있다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 박테리아 세포 비함유 단백질 합성 시스템에 의해 발현된 샤페론 단백질이 세포 비함유 단백질 합성 시스템에 의해 발현된 적절하게 어셈블리된 IgG의 양을 증가시키고, 박테리아 PDI 및 PPI의 조합이 적절히 어셈블리된 IgG의 양을 상승작용적으로 증가시키는 작용을 하는 것을 입증한다.
면역글로불린 단백질의 신속한 발현을 위한 박테리아 소포체의 조작.
재료 및 방법:
소규모 세포-비함유 발현. 100 ㎕ 세포-비함유 단백질 합성 반응을 10 ㎍/mL DNA의 존재(발현 벡터 pYD317 중 2.5 ㎍/mL 트라스투주맙 경쇄 DNA, 7.5 ㎍/mL 트라스투주맙 중쇄 DNA)하에서 VWR Thermomixer에서 650 rpm에서 96-웰 미세역가 플레이트 중에서 12시간 동안 30℃에서 수행하였다. 세포-비함유 추출물에 RT(20℃)에서 30분 동안 50 μM 아이오도아세트아미드를 처리하고, 성분의 사전혼합물(premix)에 첨가하였다. 단백질 합성 반응에서의 최종 농도는 달리 표시하지 않는 한 30% 세포 추출물(v/v), 2 mM GSSG, 8 mM 마그네슘 글루타메이트, 10 mM 암모늄 글루타메이트, 130 mM 포타슘 글루타메이트, 35 mM 소듐 피루베이트, 1.2 mM AMP, 각각 0.86 mM의 GMP, UMP, 및 CMP, 2 mM 아미노산(예외적으로, 티로신 및 페닐알라닌에 대해 1 mM), 4 mM 소듐 옥살레이트, 1 mM 푸트레신, 1.5 mM 스퍼미딘, 15 mM 포타슘 포스페이트, 20 ㎍/mL T7 RNAP였다.
PDI 및 DsbC의 상호교환성. IgG 폴딩 및 어셈블리에 대한 이황화 결합 이소메라제에 대한 필요조건을 이해하기 위해 세포-비함유 단백질 합성 반응을 다양한 농도의 PDI 및 DsbC에서 수행하였다. 0-13 uM 재조합 DsbC와 조합된 0-5 uM 재조합 PDI를 세포-비함유 반응에 첨가하였다. 100 ㎕ 세포-비함유 반응을 8 ㎍/mL HC-HIS6 DNA 및 2 ㎍/mL LC DNA의 존재하에서 VWR Thermomixer에서 650 rpm에서 96-웰 미세역가 플레이트 중에서 30℃에서 12시간 동안 30% 대조군 추출물을 이용하여 수행하였다. 반응물을 이후 10분 동안 5000xg에서 원심분리시키고, 상층액을 PBS로 2배 희석시키고, Biomek 로봇 시스템을 이용하여 IMAC Phytips(200 ㎕ 첨단, 5 ㎕ 수지 베드)에서 정제하였다. 샘플을 20 mM Tris pH8, 300 mM NaCl, 500 mM 이미다졸 중에서 용리시키고, 용리된 IgG를 Caliper LapChip GXII 상에서의 모세관 전기영동을 이용하여 정량하였다.
샤페론 연속 발현 스크린. 후보 샤페론을 세포-비함유 발현 플라스미드 pYD317로 클로닝하였다. 이들 플라스미드로부터, T7 프로모터와 종료자 서열 사이에 삽입된 샤페론 유전자를 함유한 PCR 단편을 생성시켰다. 샤페론을 이후 30℃에서 16시간 동안 표준 미세역가 플레이트 조건하에서 세포-비함유 단백질 합성에 의해 상기 PCR 단편으로부터 발현시켰다. DNA 분해에 대해 PCR 단편을 안정화시키기 위해, 40 ㎍/mL GamS 단백질을 반응물에 첨가하였다. 샤페론-발현 추출물을 이후 10분 동안 5000xg에서 원심분리시키고, 샤페론-함유 상층액을 14C-류신의 존재하에서 IgG(8 ㎍/mL 트라스투주맙 중쇄 DNA 및 2 ㎍/mL 트라스투주맙 경쇄 DNA)의 발현을 위해 20%(v/v)로 새로운 세포-비함유 반응물에 첨가하였다. IgG 역가를 이전에 기재된 바와 같이 IgG 분자로의 14C-류신의 통합 속도를 기초로 하여 계산하였다(MAbs. 2012 Mar 1;4(2)). IgG 역가에서의 샤페론-관련 개선을 GFP-발현 추출물의 첨가에 비한 개선 배수로서 표현하였다. IgG 발현 반응물에 첨가되는 샤페론의 양을 측정하기 위해, 샤페론 세포-비함유 반응을 또한 14C-류신의 존재하에서 수행하였고, 발현된 단백질을 정량하였다.
2xDsbC 및 2xFkpA 추출물. 항시성 프로모터(pACYC) 뒤에 박테리아 유전자 DsbC(2xDsbC) 및 FkpA(2xFkpA)의 이중시스트론 플라스미드를 생성시키고, 박테리아로 형질전환시켰다. 이들 균주를 문헌[Yang W.C. et al. Biotechnol. Prog. (2012), 28(2):413-20]에 기재된 바와 같이 대수증식기로 성장시키고, 세포-비함유 추출물의 생성을 위해 용해시켰다. FkpA가 IgG 폴딩 및 어셈블리를 추가로 개선시키는지 시험하기 위해 FkpA 단백질을 2xDsbC 추출물을 이용한 IgG 세포-비함유 반응물에 첨가하였다. 2xFkpA 추출물을 갖는 세포-비함유 반응물로의 13 μM DsbC 단백질의 첨가에 의해 역 실험을 수행하였다.
결과:
PDI 및 DsbC의 상호교환성. 진핵생물 및 박테리아 이황화 결합 이소메라제에 대한 IgG 폴딩 및 어셈블리의 의존성을 더 잘 이해하기 위해, IgG 세포-비함유 단백질 합성 반응을 다양한 농도의 PDI 및 DsbC에서 수행하였다. IgG를 0-13 μM DsbC와 조합된 0-5 μM PDI의 존재하에서 세포-비함유 반응에서 발현시켰다. 발현된 IgG-His를 Ni++ 수지에 의해 정제하고, 모세관 전기영동에 의해 정량하였다(도 1). DsbC의 부재하에서, 폴딩에 대해 IgG는 PDI에 매우 의존적이었다(도 1, 속이 채워진 원). 그러나, 반응물 내의 DsbC의 농도가 증가함에 따라, PDI에 대한 의존성은 감소하여, 6.4 μM DsbC에서, 반응에서 PDI에 기인가능한 추가 이점이 없었다(도 1, 속이 빈 삼각형). 또한, 반응물 내의 DsbC의 농도를 증가시킴으로써, 본 발명자는 본 발명자가 이전에 관찰한 것을 넘어서는 IgG 역가에서의 현저한 개선을 관찰하였다(도 1, 속이 빈 원). 사실상, 본 발명자는 진핵생물 단백질의 폴딩에서 진핵생물 이황화 결합 이소메라제의 유사한 기능의 박테리아 샤페론에 의한 효과적인 치환을 관찰하였다.
샤페론 연속 발현 스크린. 생체내에서, 진핵생물 샤페론은 IgG의 폴딩 및 어셈블리에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 상기 생리학적 폴다제가 결핍된 박테리아 시스템에서의 IgG 분자의 발현이 시도되어 왔다(REFS). 이와 같이, 본 발명자는 IgG 폴딩 및/또는 어셈블리의 양성 효과인자인 샤페론 단백질을 확인하기 위해 스크리닝 접근법을 수행하였다. 후보 샤페론을 본 발명의 세포-비함유 시스템에서 발현시키고, 이후 발현된 샤페론을 IgG의 발현을 위해 새로운 세포-비함유 반응물에 첨가하였다. IgG 폴딩에서의 임의의 개선을 IgG와 상호작용하지 않을 것 같은 단백질인 GFP-발현 대조군 추출물의 첨가에 비한 역가에서의 개선으로 표현하였다. 스크린의 처리량을 개선시키기 위해, IgG 반응물에 첨가되기 전에 샤페론을 추출물로부터 정제하지 않았다. 이 때문에, 본 발명자는 샤페론 DNA가 전사되지 않고, 이후의 IgG 반응에서 발현되는 것을 보장하는 것을 원하였다. 이와 같이, 샤페론 단백질을 플라스미드 DNA보다 유의하게 더 불안정한 PCR 주형으로부터 발현시켰다. GamS 단백질의 첨가는 PCR 주형을 보존시키는 것을 도왔으며, 충분한 수준의 샤페론 단백질이 합성될 수 있었다.
여러 패밀리의 샤페론이 생체내에서 IgG 폴딩에서의 이들의 소정의 역할에 있어서 특히 흥미로웠다. 박테리아, 효모, 및 인간 종으로부터의 PPIase, 폴다제, 데아그레가제, 및 산화환원 단백질을 시험하였다. 산화환원 샤페론 중에서, 본 발명자는 PDI(효모 동족체) 및 DsbC가 IgG 형성을 유의하게 도운 것을 발견하였고, 이는 본 발명자의 이전의 발견과 일치한다(도 2b). 흥미롭게도, 인간 PDI(hPDI)는 IgG 폴딩에 유의하게 영향을 미치지 않았는데, 이는 IgG 폴딩을 돕기에 충분한 양으로 첨가되는 것을 가능케 하지 않은 이의 세포 추출물에서의 불량한 발현으로 인한 것일 수 있다. 대조적으로, 박테리아 단백질 DsbC는 추출물 내에서 매우 잘 발현되었고, 이는 IgG 반응물로의 ~5 uM DsbC의 첨가를 가능케 하였다(DsbC는 ~25 uM로 발현되었고, 이는 IgG 반응물에 20%로 첨가되었다). 시험된 PPIase 중에서, 여러 PPIase가 IgG 발현에 이로운 것으로 입증되었다(도 2b). 이들로부터, 본 발명자는 Skp, SlyD, 및 FkpA에 대한 추적 검사를 결정하였다.
정제된 Skp, SlyD, 및 FkpA는 IgG 역가를 개선시킬 수 있다. 샤페론 스크린으로부터의 본 발명의 적중(hit)을 확인하기 위해, 본 발명자는 Skp, SlyD, 및 FkpA를 발현시키고, 정제하고, 이들을 다시 IgG 세포-비함유 단백질 합성 반응물에 첨가하였다(도 3). 샤페론 Skp에 대해, 본 발명자는 Skp가 HC 및 LC의 가용성을 도우나, 어셈블리된 IgG의 양을 유의하게 증가시키지 않은 것을 관찰하였다. 그러나, 프롤릴 이소메라제, SlyD 및 FkpA에 대해, 본 발명자는 본 발명자가 첨가한 상기 샤페론이 많을수록, 가용성 단백질 및 어셈블리된 IgG의 양이 비례적으로 증가한 것을 관찰하였다. 본 발명자는 프롤릴 이성화가 본 발명의 세포-비함유 단백질 합성 시스템에서 IgG 형성에 대해 이전에 제한하는 기능을 하는 것으로 추론하였고, 이들 외인성 단백질의 첨가는 IgG 폴딩 및 어셈블리를 극적으로 개선시켰다. DsbC 및 FkpA로 관찰된 광범위한 개선으로 인해, 본 발명자는 IgG 폴딩에서의 이들의 역할을 추가로 특성규명하기로 결정하였다.
FkpA 및 DsbC는 IgG를 폴딩시키고 어셈블리시키기 위해 상승작용적으로 작용한다. FkpA 및 DsbC가 IgG 형성에서 작용하는 역할을 더 잘 이해하기 위해, 본 발명자는 IgG 폴딩에 대한 이들의 기여를 독립적으로 평가하였다(도 4). 흥미롭게도, FkpA의 첨가는 HC 및 LC 합성 동안 형성된 고분자량 응집물의 정도를 유의하게 감소시켰다. 증가하는 양의 FkpA를 이용하여, 본 발명자는 또한 IgG의 형성 뿐만 아니라 다수의 부분적으로 어셈블리된 생성물을 관찰하였다. 이들은 희미한 밴드로 이동하였고, 이는 이들이 교차-이황화 결합된 단백질의 혼합된 집단일 수 있음을 암시한다. 또 다른 한편으로, DsbC의 첨가는 IgG의 명백한 날카로운 밴드를 발생시켰다. 그러나, FkpA 없이, 발현된 단백질의 유의한 비율은 SDS-PAGE 젤에 완전히 진입할 수 없는 더 고등한 종의 응집물을 형성하였다.
2개의 샤페론이 동일한 IgG 반응으로 조합되는 경우, 이들은 IgG를 폴딩시키기 위해 상승작용적으로 작용한다(도 5). HC 및 LC가 DsbC-함유 추출물(2xDsbC)에서 발현되었고, 다양한 양의 외인성 FkpA 단백질을 첨가하였다. 50 uM FkpA에서, 약 900 ㎍/mL의 어셈블리된 IgG가 발현될 수 있었다. 이에 대해 추적 검사하기 위해, FkpA를 과발현하는 박테리아 균주를 조작하였고, 이로부터 세포 추출물을 생성시켰다. 외인성 DsbC 단백질의 첨가로 FkpA 추출물로부터 IgG를 합성하였다(도 6). 30% 추출물(v/v)의 본 발명의 표준 조건하에서 감소된 응집과 함께 IgG가 ~600 ㎍/mL로 생성되었다. 각각의 반응에서 FkpA의 농도를 추가로 증가시키기 위해, 본 발명자는 반응물 내의 FkpA-함유 추출물을 상향 적정하였고, 이는 > 900 ㎍/mL의 IgG 역가를 발생시켰다(도 6).
상기 실시예는 2개의 상이한 부류의 단백질 샤페론인 PDI 및 PPI의 조합이 세포 비함유 발현 시스템에서 적절한 단백질 폴딩 및 어셈블리에 대해 상승작용적 효과를 제공하는 것을 입증한다.
실시예 2
본 실시예는 세포 추출물을 제조하기 위해 사용되는 박테리아 균주에서 외인성 단백질 샤페론의 과발현이 GMCSF와 같은 관심 단백질의 생성을 억제하지 않는 것을 입증한다.
균주 설명:
SBDG028: SBJY001 + pACYC 2x DsbC + ΔRF1
SBDG031: SBJY001 + pACYC 2x DsbC
SBDG044: SBJY001 + pACYC 2x FkpA
SBDG049: SBJY001 + pACYC 2x FkpA-6xHis
세포 추출물 제조:
E. 콜리 균주 SBDG028, SBDG031, SBDG044 및 SBDG049로부터의 추출물을 본질적으로 문헌[Zawada et al., Biotechnology and Bioengineering Vol. 108, No. 7, July 2011]에 기재된 바와 같이 제조하였다.
GMCSF CFPS 반응
GMCSF 단백질 생성을 위한 세포-비함유 반응 절차를 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Zawada et al. Biotechnology and Bioengineering Vol. 108, No. 7, July 2011]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 7은 DsbC 또는 FkpA를 과발현하는 지정된 균주로부터의 추출물에서 CFPS에 의해 생성된 GMCSF 단백질의 양을 제시한다. 외인성 DsbC 또는 FkpA를 발현하지 않는 박테리아로부터 제조된 대조군 추출물에서, 매우 적은 GMCSF가 생성된다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 3
본 실시예는 단백질 샤페론을 과발현하는 박테리아 세포가 단백질 샤페론을 과발현하지 않는 박테리아와 유사한 성장 속도를 갖는 것을 입증한다.
방법: 박테리아 균주를 실시예 1에 기재된 바와 같이 1개(1X) 또는 2개(2X) 카피의 DsbC 및 FkpA를 발현하는 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다. 이들 균주를 대수증식기로 성장시키고, 세포-비함유 추출물의 생성을 위해 용해시켰다. 균주에 대한 성장 속도(배가 시간)을 결정하고, 박테리아 균주에 의해 생성된 단백질 샤페론의 양을 웨스턴 분석 및/또는 ELISA를 이용하여 정량하였다.
발현된 단백질 샤페론의 세포내 농도를 결정하기 위해, 진탕 플라스크 성장된 세포의 원형질막 주위공간을 삼투압 충격을 이용하여 용해시켰다. 원형질막 주위공간 용해질을 공지된 DsbC 농도의 표준을 이용한 젤 전기영동에 의해 분리시켰다. 원형질막 주위공간 용해질 내의 밴드의 강도에 대해 표준 DsbC 밴드의 강도를 비교하기 위해 농도측정을 이용하였다. 용해질 내의 DsbC 농도를 결정하기 위해 밴드의 강도를 이용하였고, 이를 세포 내의 DsbC의 농도를 역 계산하기 위해 이용하였다.
세포-비함유 추출물 내의 샤페론 단백질의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. 세포-비함유 추출물 내의 DsbC 및 FkpA 역가를 결정하기 위한 ELISA는 직접 ELISA 포맷이다. 상기 검정은 표준 및 샘플로 검정 플레이트를 코팅한 후, DsbC 또는 FkpA를 인지하는 항체를 결합시키고, 과량의 DsbC 및 FkpA 항체를 세척하고, 토끼 IgG에 HRP 컨쥬게이션된 이차 항체를 도입시키고(DsbC 및 FkpA 항체가 토끼에서 생성됨), 과량의 컨쥬게이션된 이차 항체를 세척한 후, 컨쥬게이션된 이차 항체 상에 존재하는 HRP를 검출하기 위해 ABTS 기질을 이용하는 것으로 구성된다. 공지된 농도를 갖는 정제된 DsbC 및 FkpA를 샘플 농도의 결정에서 이용하기 위한 7 포인트 표준 곡선을 생성시키는데 사용하였다.
DsbC: MSD(최소 샘플 희석): 1/120,000; MSD에서의 LLOQ(정량 하한): 187.5 ㎍/ml.
FkpA: MSD(최소 샘플 희석): 1/75,000; MSD에서의 LLOQ(정량 하한): 390 ㎍/ml
결과:
도 8은 항시성 프로모터의 조절하에서 1X 또는 2X 카피의 DsbC를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주의 성장 속도를 제시한다. 1X 및 2X 카피의 DsbC를 발현하는 균주의 성장 속도는 발현 플라스미드로 형질전환되지 않은 대조군 균주와 유사하였다. 도 8의 하부 패널은 상기 기재된 바와 같은 원형질막 주위공간 용해질에 존재하는 DsbC 단백질의 양을 제시한다.
도 9는 1X 또는 2X 카피의 DsbC를 과발현하는 박테리아 균주에 의해 생성된 DsbC 단백질의 양을 제시한다. 상부 패널은 상기 기재된 바와 같이 결정된 세포내 농도를 제시한다. 하부 패널은 ELISA에 의해 결정된 추출물 농도를 제시한다.
도 10은 항시성 프로모터의 조절하에서 1X 또는 2X 카피의 FkpA를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주의 성장 속도를 제시한다. 1X 및 2X 카피의 FkpA를 발현하는 균주의 성장 속도는 발현 플라스미드로 형질전환되지 않은 대조군 균주와 유사하였다. 도 10의 하부 좌측 패널은 1X 및 2X 카피의 FkpA를 발현하는 박테리아로부터 제조된 전체 추출물에 존재하는 FkpA 단백질의 양을 제시한다. 도 11은 1X 및 2X 카피의 FkpA를 발현하는 박테리아로부터의 추출물 내의 FkpA 농도의 정량을 제시한다.
대표적 ELISA 실험의 결과가 하기 표에 제시된다. FkpA에 대한 ELISA 데이터는 도 9에 제시된 것과 상이한 추출물 제조물로부터의 ELSIA 데이터이며, 이는 다양한 DsbC 농도를 설명한다.
표 1. ELSIA에 의해 추출물에서 결정된 DsbC 농도.
Figure 112015110475312-pct00001
표 2. ELSIA에 의해 추출물에서 결정된 FkpA 농도.
Figure 112015110475312-pct00002
본 실시예는 샤페론 단백질을 과발현시키는 재조합 박테리아 균주가 신속히 성장할 수 있고, 세포 비함유 단백질 합성을 위한 고품질 추출물을 제조하는데 유용한 것을 입증한다.
실시예 4
본 실시예는 샤페론 FkpA의 C-말단 상에 다중-하전된 아미노산 태그를 포함시키는 것이 추출물 내의 FkpA의 양을 증가시키고, 세포 비함유 단백질 합성 시스템에 의해 생성되는 전체 단백질의 양을 증가시키는 것을 제시한다.
FkpA를 인코딩하는 유전자를 벡터 pACYC-Pc의 C-말단 상에 His6(SEQ ID NO:24) 또는 (Ser-Arg)4(SEQ ID NO:25) 태그와 함께 클로닝하였다. 이들 벡터를 균주 SBJY001로 형질전환시키고, 추출물을 상기 기재된 바와 같이 생성시켰다. FkpA ELISA는 His-태깅된 FkpA 변이체의 추출 수준이 활성화 후 추출물의 최종 원심분리 회전에 의해 증가된 것을 제시하였다(도　12a). wt FkpA를 함유하는 추출물과 비교하여, 상기 가용성-태깅된 FkpA 단백질을 함유하는 추출물은 더 많은 전체 단백질을 생성시켰다. 또한, 어셈블리된 IgG 수준은 활성화 후의 추출물의 최종 회전에 의해 향상되었다(도 12b).
본 실시예는 FkpA의 C-말단 상에 다중-하전된 아미노산 태그를 첨가하는 것이 추출물을 제조하기 위해 사용된 박테리아에 의해 발현된 FkpA의 양을 증가시키고, 생성된 전체 단백질의 양을 증가시키는 것을 입증한다. 추가로, C-말단 His-티깅된 FkpA를 함유하는 추출물에 대해, 활성화 후에 추출물을 회전시키는 것은 정확하게 어셈블리된 IgG의 양을 증가시켰다.
실시예 5
본 실시예는 2개의 독립적 박테리아 균주에서의 샤페론 dsbC 및 FkpA의 유전체 통합이 높은 샤페론 수준을 발생시킨 높은 성장 속도를 갖는 세포를 발생시키고, 이들 균주로부터 유래된 세포-비함유 추출물이 높은 수준의 둘 모두의 샤페론을 함유하고, 높은 수준의 재조합 IgG 및 GMC-SF의 세포-비함유 합성을 뒷받침한 것을 입증한다.
균주 108
균주 SBDG108은 SBMT095의 유도체이다. 이러한 균주는 상동성 재조합을 이용하여 제조된 중간 강도의 항시성 프로모터 뒤의 galK 유전자좌로 염색체 상에 통합된 2 카피의 dsbC를 갖는다. SBMT095는 적격이 된 후, 항시성 프로모터 뒤에 2 카피의 FkpA를 갖는 중간 카피 플라스미드인 pACYC-Pc0-2xFkpA로 형질전환되었다. 둘 모두의 카피는 야생형 E. 콜리 FkpA를 코딩하였으나, 하나의 유전자는 WT 유전자에 대한 뉴클레오티드 상동성을 감소시키도록 합성되어, 각각이 동일한 플라스미드 내에서 안정적으로 증식되도록 하였다.
회분식 방식의 DM80-80을 이용한 표준 추출 발효에서, 균주 SBDG108은 매우 높은 샤페론 수준을 여전히 생성시키면서 높은 성장 속도를 달성할 수 있었다(표 3 참조).
표 3. 추출 발효에서의 108의 특성.
Figure 112015110475312-pct00003
균주 108로부터 제조된 추출물은 높은 수준의 둘 모두의 샤페론을 함유하였고, 재조합 IgG 및 다른 단백질의 매우 높은 수준의 세포-비함유 합성을 뒷받침하였다(표 4 참조).
표 4. 세포-비함유 단백질 역가.
Figure 112015110475312-pct00004
균주 150
균주 SBMT150은 SBHS016의 유도체, ompT 민감성 RF1을 갖는 KGK10 유도체이다. SBMT150을 생성시키기 위해, 2 카피의 DsbC를 xylA 유전자좌로 염색체 상에 통합시켰다. 2 카피의 FkpA를 galK 유전자좌에 통합시켰다. 둘 모두의 염색체 통합을 상동성 재조합으로 도입시켰다.
회분식 방식의 DM80-80을 이용한 표준 추출 발효에서, 균주 SBMT150은 높은 샤페론 수준을 여전히 발생시키면서 높은 성장 속도를 달성할 수 있었다(표 5 참조). 샤페론은 유전체로부터 과발현되므로, 상기 균주의 발효 동안 항생체가 필요하지 않다.
표 5. 추출 발효에서의 150의 특성.
Figure 112015110475312-pct00005
균주 108로부터 제조된 추출물은 높은 수준의 둘 모두의 샤페론을 함유하였고, 하기 표 6에 제시된 바와 같이 높은 수준의 재조합 IgG 및 다른 단백질의 세포-비함유 합성을 뒷받침하였다.
표 6. 세포 비함유 단백질 역가.
Figure 112015110475312-pct00006
요컨대, 본 실시예는 박테리아 균주가 성장 속도를 손상시키지 않고 높은 수준의 샤페론 단백질을 발현하는 샤페론 발현 카세트를 안정적으로 통합하도록 조작될 수 있고, 이들 균주로부터 유래된 세포 비함유 추출물이 높은 수준의 관심 재조합 단백질을 생성시키는 것을 입증한다.
실시예 6
본 실시예는 DsbC 및 FkpA 샤페론을 과발현하는 박테리아 세포로부터 유래된 추출물이 다수의 다양한 IgG의 발현 및 어셈블리를 개선시킬 수 있음을 제시한다.
방법:
2xDsbC 및 2xFkpA 추출물 . E. 콜리 균주 SBJY001(Yin G, et al., Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system. mAbs 2012; 4)을 pACYC-기반 샤페론 과발현 플라스미드로 형질전환시키고, 대수증식기에서 수거하여 세포 추출물을 제조하였다. E. 콜리 프로모터 Mt-cons-10 뒤에 1 카피(1xDsbC) 또는 2개의 일렬 카피(2xDsbC)의 dsbC를 갖는 플라스미드(Thouvenot B. et al. The strong efficiency of the Escherichia coli gapA P1 promoter depends on a complex combination of functional determinants. Biochem J 2004; 383:371-82)를 생성시키고, 1 카피(1xFkpA) 또는 2 카피(2xFkpA)의 fkpA가 존재하도록 박테리아에 형질전환시켰다. 이들 균주를 대수증식기로 성장시키고, 문헌[Zawada J.F. et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnol Bioeng 2011; 108:1570-8]에 기재된 바와 같이 세포-비함유 추출물의 생성을 위해 용해시켰다. 상기 추출물 각각의 IgG-생성 활성을 단독으로 또는 외인적으로 첨가된 정제된 단백질과 조합하여 시험하였다. OCFS 추출에 최적화된 박테리아 균주 SBHS016(박테리아 균주 SBJY001으로부터 유래됨)을 DsbC 단백질의 생성을 향상시키기 위해 추가로 변형시켰다. 상기 균주는 변형된 MT-cons-10 프로모터를 이용하여 항시적으로 발현되는 박테리아 galK　유전자좌로 통합된 이중 일렬 카피의 dsbC를 갖는다(Thouvenot B. et al. Biochem J 2004; 383:371-82). 이는 정상 dsbC 유전자좌에서 야생형 유전자에 더한 것이다. 이중 일렬 유전자 카세트는 1 카피의 모(parental) dsbC 유전자, 및 1 카피의 야생형 단백질을 인코딩하도록 설계되었으나, 유전체 내의 다른 곳에서 dsbC 유전자의 다른 형태와의 원치 않는 서열 재조합을 억제하기 위해 변경된 코돈을 갖는 dsbC 유전자의 합성 형태를 함유한다. 이러한 DsbC 과발현 균주를 2xFkpA 플라스미드로 형질전환시켜, 균주 '2xD + 2xF'를 생성시켰다.
결과:
다양한 IgG의 패널을 본원에 기재된 박테리아 시험관내 전사/번역 시스템에서 번역시켰다. IgG를 대조군 추출물(SBJY001), DsbC 추출물(2xDsbC 추출물), 및 DsbC + FkpA 추출물(2xD + 2xF)에서 번역시켰다. 상기 패널은 경쇄 Vk3-20과 조합된 2개의 점라인 중쇄 VH3-7 및 VH3-23에 더하여 치료 항체 트라스투주맙(항-Her2 IgG1) 및 브렌툭시맙(항-CD30 IgG1)을 포함하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 2xDsbC 추출물에서의 IgG의 발현은 4개 모두의 IgG의 수율을 극적으로 개선시켰다. DsbC + FkpA 추출물에서 추가 개선이 관찰되었고, 트라스투주맙 및 브렌툭시맙 둘 모두에 대해 1 g/L의 발현 수준 및 점라인 IgG에 대해 거의 1.5 g/L의 발현 수준을 발생시켰다.
본 실시예는 샤페론 DsbC 및 FkpA를 과발현하는 조작된 박테리아로부터의 추출물이 OCFS 커플링된 전사-번역 시스템에서 광범위한 면역글로불린 단백질의 발현을 증가시킬 수 있음을 입증한다.
본원에 기재된 실시예 및 구체예는 단지 예시 목적을 위한 것으로, 상기 실시예 및 구체예에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이며, 첨부된 청구항의 상기 적용 및 범위의 사상 및 범위 내에 포함되어야 하는 것이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 서열 등록 번호, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
약식 서열 목록:
Figure 112015110475312-pct00007
Figure 112015110475312-pct00008
Figure 112015110475312-pct00009
Figure 112015110475312-pct00010
Figure 112015110475312-pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Yam, Alice Groff, Dan Rivers, Patrick Thanos, Christopher D. Sutro Biopharma, Inc. <120> Expression of Biologically Active Proteins in a Bacterial Cell-Free Synthesis System Using Bacterial Cells Transformed to Exhibit Elevated Levels of Chaperone Expression <130> 91200-905971 <140> WO Not yet assigned <141> Not yet assigned <150> US 61/813,914 <151> 2013-04-19 <150> US 61/937,069 <151> 2014-02-07 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 protein disulfide isomerase II, thiol:disulfide interchange protein DsbC, locus b2893, JW2861, xprA <400> 1 Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15 Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met 20 25 30 Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys 35 40 45 Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys 50 55 60 His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val 65 70 75 80 Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys 85 90 95 Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val 100 105 110 Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met 115 120 125 Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro 130 135 140 Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp 145 150 155 160 Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys 165 170 175 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys 225 230 235 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 periplasmic protein disulfide isomerase I, thiol:disulfide interchange protein DsbA, locus b3860, JW3832, dsf, ppfA <400> 2 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu 20 25 30 Lys Pro Val Ala Gly Ala Pro Gln Val Leu Glu Phe Phe Ser Phe Phe 35 40 45 Cys Pro His Cys Tyr Gln Phe Glu Glu Val Leu His Ile Ser Asp Asn 50 55 60 Val Lys Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met Thr Lys Tyr His Val 65 70 75 80 Asn Phe Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Ala 85 90 95 Val Ala Met Ala Leu Gly Val Glu Asp Lys Val Thr Val Pro Leu Phe 100 105 110 Glu Gly Val Gln Lys Thr Gln Thr Ile Arg Ser Ala Ser Asp Ile Arg 115 120 125 Asp Val Phe Ile Asn Ala Gly Ile Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Ala 130 135 140 Trp Asn Ser Phe Val Val Lys Ser Leu Val Ala Gln Gln Glu Lys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Asp Val Gln Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly 165 170 175 Lys Tyr Gln Leu Asn Pro Gln Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Asp Val 180 185 190 Phe Val Gln Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys 195 200 205 <210> 3 <211> 176 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 oxidoreductase that catalyzes reoxidation of DsbA protein disulfide isomerase I, disulfide bond formation protein B (DsbB), locus b1185, JW5182, roxB, ycgA <400> 3 Met Leu Arg Phe Leu Asn Gln Cys Ser Gln Gly Arg Gly Ala Trp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ala Phe Thr Ala Leu Ala Leu Glu Leu Thr Ala Leu Trp Phe 20 25 30 Gln His Val Met Leu Leu Lys Pro Cys Val Leu Cys Ile Tyr Glu Arg 35 40 45 Cys Ala Leu Phe Gly Val Leu Gly Ala Ala Leu Ile Gly Ala Ile Ala 50 55 60 Pro Lys Thr Pro Leu Arg Tyr Val Ala Met Val Ile Trp Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Ala Phe Arg Gly Val Gln Leu Thr Tyr Glu His Thr Met Leu Gln Leu 85 90 95 Tyr Pro Ser Pro Phe Ala Thr Cys Asp Phe Met Val Arg Phe Pro Glu 100 105 110 Trp Leu Pro Leu Asp Lys Trp Val Pro Gln Val Phe Val Ala Ser Gly 115 120 125 Asp Cys Ala Glu Arg Gln Trp Asp Phe Leu Gly Leu Glu Met Pro Gln 130 135 140 Trp Leu Leu Gly Ile Phe Ile Ala Tyr Leu Ile Val Ala Val Leu Val 145 150 155 160 Val Ile Ser Gln Pro Phe Lys Ala Lys Lys Arg Asp Leu Phe Gly Arg 165 170 175 <210> 4 <211> 565 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 fused thiol:disulfide interchange protein DsbD, activator of DsbC/conserved protein, C-type cytochrome biogenesis protein CycZ, copper tolerance protein, protein-disulfide reductase, locus b4136, JW5734, cutA2 <400> 4 Met Ala Gln Arg Ile Phe Thr Leu Ile Leu Leu Leu Cys Ser Thr Ser 1 5 10 15 Val Phe Ala Gly Leu Phe Asp Ala Pro Gly Arg Ser Gln Phe Val Pro 20 25 30 Ala Asp Gln Ala Phe Ala Phe Asp Phe Gln Gln Asn Gln His Asp Leu 35 40 45 Asn Leu Thr Trp Gln Ile Lys Asp Gly Tyr Tyr Leu Tyr Arg Lys Gln 50 55 60 Ile Arg Ile Thr Pro Glu His Ala Lys Ile Ala Asp Val Gln Leu Pro 65 70 75 80 Gln Gly Val Trp His Glu Asp Glu Phe Tyr Gly Lys Ser Glu Ile Tyr 85 90 95 Arg Asp Arg Leu Thr Leu Pro Val Thr Ile Asn Gln Ala Ser Ala Gly 100 105 110 Ala Thr Leu Thr Val Thr Tyr Gln Gly Cys Ala Asp Ala Gly Phe Cys 115 120 125 Tyr Pro Pro Glu Thr Lys Thr Val Pro Leu Ser Glu Val Val Ala Asn 130 135 140 Asn Ala Ala Pro Gln Pro Val Ser Val Pro Gln Gln Glu Gln Pro Thr 145 150 155 160 Ala Gln Leu Pro Phe Ser Ala Leu Trp Ala Leu Leu Ile Gly Ile Gly 165 170 175 Ile Ala Phe Thr Pro Cys Val Leu Pro Met Tyr Pro Leu Ile Ser Gly 180 185 190 Ile Val Leu Gly Gly Lys Gln Arg Leu Ser Thr Ala Arg Ala Leu Leu 195 200 205 Leu Thr Phe Ile Tyr Val Gln Gly Met Ala Leu Thr Tyr Thr Ala Leu 210 215 220 Gly Leu Val Val Ala Ala Ala Gly Leu Gln Phe Gln Ala Ala Leu Gln 225 230 235 240 His Pro Tyr Val Leu Ile Gly Leu Ala Ile Val Phe Thr Leu Leu Ala 245 250 255 Met Ser Met Phe Gly Leu Phe Thr Leu Gln Leu Pro Ser Ser Leu Gln 260 265 270 Thr Arg Leu Thr Leu Met Ser Asn Arg Gln Gln Gly Gly Ser Pro Gly 275 280 285 Gly Val Phe Val Met Gly Ala Ile Ala Gly Leu Ile Cys Ser Pro Cys 290 295 300 Thr Thr Ala Pro Leu Ser Ala Ile Leu Leu Tyr Ile Ala Gln Ser Gly 305 310 315 320 Asn Met Trp Leu Gly Gly Gly Thr Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Gly Met 325 330 335 Gly Leu Pro Leu Met Leu Ile Thr Val Phe Gly Asn Arg Leu Leu Pro 340 345 350 Lys Ser Gly Pro Trp Met Glu Gln Val Lys Thr Ala Phe Gly Phe Val 355 360 365 Ile Leu Ala Leu Pro Val Phe Leu Leu Glu Arg Val Ile Gly Asp Val 370 375 380 Trp Gly Leu Arg Leu Trp Ser Ala Leu Gly Val Ala Phe Phe Gly Trp 385 390 395 400 Ala Phe Ile Thr Ser Leu Gln Ala Lys Arg Gly Trp Met Arg Ile Val 405 410 415 Gln Ile Ile Leu Leu Ala Ala Ala Leu Val Ser Val Arg Pro Leu Gln 420 425 430 Asp Trp Ala Phe Gly Ala Thr His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Leu 435 440 445 Asn Phe Thr Gln Ile Lys Thr Val Asp Glu Leu Asn Gln Ala Leu Val 450 455 460 Glu Ala Lys Gly Lys Pro Val Met Leu Asp Leu Tyr Ala Asp Trp Cys 465 470 475 480 Val Ala Cys Lys Glu Phe Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Asp Pro Gln Val 485 490 495 Gln Lys Ala Leu Ala Asp Thr Val Leu Leu Gln Ala Asn Val Thr Ala 500 505 510 Asn Asp Ala Gln Asp Val Ala Leu Leu Lys His Leu Asn Val Leu Gly 515 520 525 Leu Pro Thr Ile Leu Phe Phe Asp Gly Gln Gly Gln Glu His Pro Gln 530 535 540 Ala Arg Val Thr Gly Phe Met Asp Ala Glu Thr Phe Ser Ala His Leu 545 550 555 560 Arg Asp Arg Gln Pro 565 <210> 5 <211> 248 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 periplasmic thiol:disulfide interchange protein DsbG, locus b0604, JW00597, ybdP <400> 5 Met Leu Lys Lys Ile Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ile Ala Phe 1 5 10 15 Ala Glu Glu Leu Pro Ala Pro Val Lys Ala Ile Glu Lys Gln Gly Ile 20 25 30 Thr Ile Ile Lys Thr Phe Asp Ala Pro Gly Gly Met Lys Gly Tyr Leu 35 40 45 Gly Lys Tyr Gln Asp Met Gly Val Thr Ile Tyr Leu Thr Pro Asp Gly 50 55 60 Lys His Ala Ile Ser Gly Tyr Met Tyr Asn Glu Lys Gly Glu Asn Leu 65 70 75 80 Ser Asn Thr Leu Ile Glu Lys Glu Ile Tyr Ala Pro Ala Gly Arg Glu 85 90 95 Met Trp Gln Arg Met Glu Gln Ser His Trp Leu Leu Asp Gly Lys Lys 100 105 110 Asp Ala Pro Val Ile Val Tyr Val Phe Ala Asp Pro Phe Cys Pro Tyr 115 120 125 Cys Lys Gln Phe Trp Gln Gln Ala Arg Pro Trp Val Asp Ser Gly Lys 130 135 140 Val Gln Leu Arg Thr Leu Leu Val Gly Val Ile Lys Pro Glu Ser Pro 145 150 155 160 Ala Thr Ala Ala Ala Ile Leu Ala Ser Lys Asp Pro Ala Lys Thr Trp 165 170 175 Gln Gln Tyr Glu Ala Ser Gly Gly Lys Leu Lys Leu Asn Val Pro Ala 180 185 190 Asn Val Ser Thr Glu Gln Met Lys Val Leu Ser Asp Asn Glu Lys Leu 195 200 205 Met Asp Asp Leu Gly Ala Asn Val Thr Pro Ala Ile Tyr Tyr Met Ser 210 215 220 Lys Glu Asn Thr Leu Gln Gln Ala Val Gly Leu Pro Asp Gln Lys Thr 225 230 235 240 Leu Asn Ile Ile Met Gly Asn Lys 245 <210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 FKBP (FK506 binding protein)-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) (rotamase) FkpA, locus b3347, JW3309, yzzS <400> 6 Met Lys Ser Leu Phe Lys Val Thr Leu Leu Ala Thr Thr Met Ala Val 1 5 10 15 Ala Leu His Ala Pro Ile Thr Phe Ala Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala 20 25 30 Thr Ala Ala Asp Ser Lys Ala Ala Phe Lys Asn Asp Asp Gln Lys Ser 35 40 45 Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Gly Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu 50 55 60 Lys Glu Gln Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Asp Lys Asp Gln Leu Ile 65 70 75 80 Ala Gly Val Gln Asp Ala Phe Ala Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gln 85 90 95 Glu Ile Glu Gln Thr Leu Gln Ala Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser 100 105 110 Ala Gln Ala Lys Met Glu Lys Asp Ala Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly 115 120 125 Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser 130 135 140 Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gln Val Val Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu Ile 165 170 175 Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser 180 185 190 Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn 195 200 205 Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys Leu Val Ile Pro Pro Glu Leu Ala 210 215 220 Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val 225 230 235 240 Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala 245 250 255 Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala Asp Ser Ala Lys Lys 260 265 270 <210> 7 <211> 196 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 FKBP (FK506 binding protein)-type peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) (rotamase), histidine-rich protein, sensitivity to lysis protein D (SlyD), metallochaperone SlyD, locus b3349, JW3311 <400> 7 Met Lys Val Ala Lys Asp Leu Val Val Ser Leu Ala Tyr Gln Val Arg 1 5 10 15 Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu 20 25 30 Asp Tyr Leu His Gly His Gly Ser Leu Ile Ser Gly Leu Glu Thr Ala 35 40 45 Leu Glu Gly His Glu Val Gly Asp Lys Phe Asp Val Ala Val Gly Ala 50 55 60 Asn Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Asp Glu Asn Leu Val Gln Arg Val Pro 65 70 75 80 Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe 85 90 95 Leu Ala Glu Thr Asp Gln Gly Pro Val Pro Val Glu Ile Thr Ala Val 100 105 110 Glu Asp Asp His Val Val Val Asp Gly Asn His Met Leu Ala Gly Gln 115 120 125 Asn Leu Lys Phe Asn Val Glu Val Val Ala Ile Arg Glu Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Glu Leu Ala His Gly His Val His Gly Ala His Asp His His His 145 150 155 160 Asp His Asp His Asp Gly Cys Cys Gly Gly His Gly His Asp His Gly 165 170 175 His Glu His Gly Gly Glu Gly Cys Cys Gly Gly Lys Gly Asn Gly Gly 180 185 190 Cys Gly Cys His 195 <210> 8 <211> 428 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) (rotamase), survival protein A (SurA), chaperone SurA, locus b0053, JW0052 <400> 8 Met Lys Asn Trp Lys Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Met Ile Ala Asn 1 5 10 15 Thr Ser Phe Ala Ala Pro Gln Val Val Asp Lys Val Ala Ala Val Val 20 25 30 Asn Asn Gly Val Val Leu Glu Ser Asp Val Asp Gly Leu Met Gln Ser 35 40 45 Val Lys Leu Asn Ala Ala Gln Ala Arg Gln Gln Leu Pro Asp Asp Ala 50 55 60 Thr Leu Arg His Gln Ile Met Glu Arg Leu Ile Met Asp Gln Ile Ile 65 70 75 80 Leu Gln Met Gly Gln Lys Met Gly Val Lys Ile Ser Asp Glu Gln Leu 85 90 95 Asp Gln Ala Ile Ala Asn Ile Ala Lys Gln Asn Asn Met Thr Leu Asp 100 105 110 Gln Met Arg Ser Arg Leu Ala Tyr Asp Gly Leu Asn Tyr Asn Thr Tyr 115 120 125 Arg Asn Gln Ile Arg Lys Glu Met Ile Ile Ser Glu Val Arg Asn Asn 130 135 140 Glu Val Arg Arg Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Glu Val Glu Ser Leu 145 150 155 160 Ala Gln Gln Val Gly Asn Gln Asn Asp Ala Ser Thr Glu Leu Asn Leu 165 170 175 Ser His Ile Leu Ile Pro Leu Pro Glu Asn Pro Thr Ser Asp Gln Val 180 185 190 Asn Glu Ala Glu Ser Gln Ala Arg Ala Ile Val Asp Gln Ala Arg Asn 195 200 205 Gly Ala Asp Phe Gly Lys Leu Ala Ile Ala His Ser Ala Asp Gln Gln 210 215 220 Ala Leu Asn Gly Gly Gln Met Gly Trp Gly Arg Ile Gln Glu Leu Pro 225 230 235 240 Gly Ile Phe Ala Gln Ala Leu Ser Thr Ala Lys Lys Gly Asp Ile Val 245 250 255 Gly Pro Ile Arg Ser Gly Val Gly Phe His Ile Leu Lys Val Asn Asp 260 265 270 Leu Arg Gly Glu Ser Lys Asn Ile Ser Val Thr Glu Val His Ala Arg 275 280 285 His Ile Leu Leu Lys Pro Ser Pro Ile Met Thr Asp Glu Gln Ala Arg 290 295 300 Val Lys Leu Glu Gln Ile Ala Ala Asp Ile Lys Ser Gly Lys Thr Thr 305 310 315 320 Phe Ala Ala Ala Ala Lys Glu Phe Ser Gln Asp Pro Gly Ser Ala Asn 325 330 335 Gln Gly Gly Asp Leu Gly Trp Ala Thr Pro Asp Ile Phe Asp Pro Ala 340 345 350 Phe Arg Asp Ala Leu Thr Arg Leu Asn Lys Gly Gln Met Ser Ala Pro 355 360 365 Val His Ser Ser Phe Gly Trp His Leu Ile Glu Leu Leu Asp Thr Arg 370 375 380 Asn Val Asp Lys Thr Asp Ala Ala Gln Lys Asp Arg Ala Tyr Arg Met 385 390 395 400 Leu Met Asn Arg Lys Phe Ser Glu Glu Ala Ala Ser Trp Met Gln Glu 405 410 415 Gln Arg Ala Ser Ala Tyr Val Lys Ile Leu Ser Asn 420 425 <210> 9 <211> 161 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 periplasmic molecular chaperone for outer membrane proteins Skp, DNA-binding 17 kDa protein, histone-like protein HLP-1 (hlpA), locus b0178, JW0173, ompH <400> 9 Met Lys Lys Trp Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Ala Thr 1 5 10 15 Ser Ala Gln Ala Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Gln Val Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn 35 40 45 Glu Phe Lys Gly Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu 50 55 60 Gln Ala Lys Met Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg 65 70 75 80 Thr Lys Leu Glu Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln 85 90 95 Lys Ala Gln Ala Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala 115 120 125 Asn Ser Gln Asp Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr 130 135 140 Asn Ser Ser Asp Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val 145 150 155 160 Lys <210> 10 <211> 522 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c protein disulfide isomerase PDI1 (yPDI), thioredoxin-related glycoprotein 1 (TRG1), locus YCL043C <400> 10 Met Lys Phe Ser Ala Gly Ala Val Leu Ser Trp Ser Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ser Ser Val Phe Ala Gln Gln Glu Ala Val Ala Pro Glu Asp Ser 20 25 30 Ala Val Val Lys Leu Ala Thr Asp Ser Phe Asn Glu Tyr Ile Gln Ser 35 40 45 His Asp Leu Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys 50 55 60 Lys Asn Met Ala Pro Glu Tyr Val Lys Ala Ala Glu Thr Leu Val Glu 65 70 75 80 Lys Asn Ile Thr Leu Ala Gln Ile Asp Cys Thr Glu Asn Gln Asp Leu 85 90 95 Cys Met Glu His Asn Ile Pro Gly Phe Pro Ser Leu Lys Ile Phe Lys 100 105 110 Asn Ser Asp Val Asn Asn Ser Ile Asp Tyr Glu Gly Pro Arg Thr Ala 115 120 125 Glu Ala Ile Val Gln Phe Met Ile Lys Gln Ser Gln Pro Ala Val Ala 130 135 140 Val Val Ala Asp Leu Pro Ala Tyr Leu Ala Asn Glu Thr Phe Val Thr 145 150 155 160 Pro Val Ile Val Gln Ser Gly Lys Ile Asp Ala Asp Phe Asn Ala Thr 165 170 175 Phe Tyr Ser Met Ala Asn Lys His Phe Asn Asp Tyr Asp Phe Val Ser 180 185 190 Ala Glu Asn Ala Asp Asp Asp Phe Lys Leu Ser Ile Tyr Leu Pro Ser 195 200 205 Ala Met Asp Glu Pro Val Val Tyr Asn Gly Lys Lys Ala Asp Ile Ala 210 215 220 Asp Ala Asp Val Phe Glu Lys Trp Leu Gln Val Glu Ala Leu Pro Tyr 225 230 235 240 Phe Gly Glu Ile Asp Gly Ser Val Phe Ala Gln Tyr Val Glu Ser Gly 245 250 255 Leu Pro Leu Gly Tyr Leu Phe Tyr Asn Asp Glu Glu Glu Leu Glu Glu 260 265 270 Tyr Lys Pro Leu Phe Thr Glu Leu Ala Lys Lys Asn Arg Gly Leu Met 275 280 285 Asn Phe Val Ser Ile Asp Ala Arg Lys Phe Gly Arg His Ala Gly Asn 290 295 300 Leu Asn Met Lys Glu Gln Phe Pro Leu Phe Ala Ile His Asp Met Thr 305 310 315 320 Glu Asp Leu Lys Tyr Gly Leu Pro Gln Leu Ser Glu Glu Ala Phe Asp 325 330 335 Glu Leu Ser Asp Lys Ile Val Leu Glu Ser Lys Ala Ile Glu Ser Leu 340 345 350 Val Lys Asp Phe Leu Lys Gly Asp Ala Ser Pro Ile Val Lys Ser Gln 355 360 365 Glu Ile Phe Glu Asn Gln Asp Ser Ser Val Phe Gln Leu Val Gly Lys 370 375 380 Asn His Asp Glu Ile Val Asn Asp Pro Lys Lys Asp Val Leu Val Leu 385 390 395 400 Tyr Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Arg Leu Ala Pro Thr Tyr 405 410 415 Gln Glu Leu Ala Asp Thr Tyr Ala Asn Ala Thr Ser Asp Val Leu Ile 420 425 430 Ala Lys Leu Asp His Thr Glu Asn Asp Val Arg Gly Val Val Ile Glu 435 440 445 Gly Tyr Pro Thr Ile Val Leu Tyr Pro Gly Gly Lys Lys Ser Glu Ser 450 455 460 Val Val Tyr Gln Gly Ser Arg Ser Leu Asp Ser Leu Phe Asp Phe Ile 465 470 475 480 Lys Glu Asn Gly His Phe Asp Val Asp Gly Lys Ala Leu Tyr Glu Glu 485 490 495 Ala Gln Glu Lys Ala Ala Glu Glu Ala Asp Ala Asp Ala Glu Leu Ala 500 505 510 Asp Glu Glu Asp Ala Ile His Asp Glu Leu 515 520 <210> 11 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> protein disulfide isomerase family A member 1 (PDIA1, PDI) precursor. collagen prolyl 4-hydroxylase subunit beta (P4HB, P4Hbeta), procollagen-proline 2-oxoglutarate 4-dioxygenase beta, thyroid hormone-binding protein p55, GIT, ERBA2L, DSI <400> 11 Met Leu Arg Arg Ala Leu Leu Cys Leu Ala Val Ala Ala Leu Val Arg 1 5 10 15 Ala Asp Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser 20 25 30 Asn Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe 35 40 45 Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala 50 55 60 Lys Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala 65 70 75 80 Lys Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val 85 90 95 Arg Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser 100 105 110 Pro Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp 115 120 125 Leu Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala 130 135 140 Ala Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe 145 150 155 160 Phe Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala 165 170 175 Glu Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val 180 185 190 Phe Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys 195 200 205 Phe Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn 210 215 220 Leu Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe 225 230 235 240 Thr Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His 245 250 255 Ile Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu 260 265 270 Ser Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe 275 280 285 Ile Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe 290 295 300 Phe Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu 305 310 315 320 Glu Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala 325 330 335 Glu Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys 340 345 350 Pro His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro 355 360 365 Val Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu 370 375 380 Lys Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys 385 390 395 400 Lys Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp 405 410 415 His Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val 420 425 430 Glu Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala 435 440 445 Ser Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp 450 455 460 Gly Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp 465 470 475 480 Asp Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu 485 490 495 Glu Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu 500 505 <210> 12 <211> 319 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c thioredoxin-disulfide reductase TRR1 (yTrr1)cytoplasmic thioredoxin reductase 1, locus YDR353W <400> 12 Met Val His Asn Lys Val Thr Ile Ile Gly Ser Gly Pro Ala Ala His 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ile Tyr Leu Ala Arg Ala Glu Ile Lys Pro Ile Leu Tyr 20 25 30 Glu Gly Met Met Ala Asn Gly Ile Ala Ala Gly Gly Gln Leu Thr Thr 35 40 45 Thr Thr Glu Ile Glu Asn Phe Pro Gly Phe Pro Asp Gly Leu Thr Gly 50 55 60 Ser Glu Leu Met Asp Arg Met Arg Glu Gln Ser Thr Lys Phe Gly Thr 65 70 75 80 Glu Ile Ile Thr Glu Thr Val Ser Lys Val Asp Leu Ser Ser Lys Pro 85 90 95 Phe Lys Leu Trp Thr Glu Phe Asn Glu Asp Ala Glu Pro Val Thr Thr 100 105 110 Asp Ala Ile Ile Leu Ala Thr Gly Ala Ser Ala Lys Arg Met His Leu 115 120 125 Pro Gly Glu Glu Thr Tyr Trp Gln Lys Gly Ile Ser Ala Cys Ala Val 130 135 140 Cys Asp Gly Ala Val Pro Ile Phe Arg Asn Lys Pro Leu Ala Val Ile 145 150 155 160 Gly Gly Gly Asp Ser Ala Cys Glu Glu Ala Gln Phe Leu Thr Lys Tyr 165 170 175 Gly Ser Lys Val Phe Met Leu Val Arg Lys Asp His Leu Arg Ala Ser 180 185 190 Thr Ile Met Gln Lys Arg Ala Glu Lys Asn Glu Lys Ile Glu Ile Leu 195 200 205 Tyr Asn Thr Val Ala Leu Glu Ala Lys Gly Asp Gly Lys Leu Leu Asn 210 215 220 Ala Leu Arg Ile Lys Asn Thr Lys Lys Asn Glu Glu Thr Asp Leu Pro 225 230 235 240 Val Ser Gly Leu Phe Tyr Ala Ile Gly His Thr Pro Ala Thr Lys Ile 245 250 255 Val Ala Gly Gln Val Asp Thr Asp Glu Ala Gly Tyr Ile Lys Thr Val 260 265 270 Pro Gly Ser Ser Leu Thr Ser Val Pro Gly Phe Phe Ala Ala Gly Asp 275 280 285 Val Gln Asp Ser Lys Tyr Arg Gln Ala Ile Thr Ser Ala Gly Ser Gly 290 295 300 Cys Met Ala Ala Leu Asp Ala Glu Lys Tyr Leu Thr Ser Leu Glu 305 310 315 <210> 13 <211> 483 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c glutathione-disulfide reductase GLR1 (yGl1, GR, GRase), cytosolic and mitochondrial glutathione oxidoreductase, cytosolic Glr1p, locus YPL091W, LPG17 <400> 13 Met Leu Ser Ala Thr Lys Gln Thr Phe Arg Ser Leu Gln Ile Arg Thr 1 5 10 15 Met Ser Thr Asn Thr Lys His Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Val Ala Ser Ala Arg Arg Ala Ala Ser Tyr Gly Ala Lys 35 40 45 Thr Leu Leu Val Glu Ala Lys Ala Leu Gly Gly Thr Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Cys Val Pro Lys Lys Val Met Trp Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Thr 65 70 75 80 Arg Val Ser His Ala Asn Glu Tyr Gly Leu Tyr Gln Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Asp Lys Glu His Leu Thr Phe Asn Trp Pro Glu Phe Lys Gln Lys Arg 100 105 110 Asp Ala Tyr Val His Arg Leu Asn Gly Ile Tyr Gln Lys Asn Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Lys Val Asp Val Val Phe Gly Trp Ala Arg Phe Asn Lys Asp 130 135 140 Gly Asn Val Glu Val Gln Lys Arg Asp Asn Thr Thr Glu Val Tyr Ser 145 150 155 160 Ala Asn His Ile Leu Val Ala Thr Gly Gly Lys Ala Ile Phe Pro Glu 165 170 175 Asn Ile Pro Gly Phe Glu Leu Gly Thr Asp Ser Asp Gly Phe Phe Arg 180 185 190 Leu Glu Glu Gln Pro Lys Lys Val Val Val Val Gly Ala Gly Tyr Ile 195 200 205 Gly Ile Glu Leu Ala Gly Val Phe His Gly Leu Gly Ser Glu Thr His 210 215 220 Leu Val Ile Arg Gly Glu Thr Val Leu Arg Lys Phe Asp Glu Cys Ile 225 230 235 240 Gln Asn Thr Ile Thr Asp His Tyr Val Lys Glu Gly Ile Asn Val His 245 250 255 Lys Leu Ser Lys Ile Val Lys Val Glu Lys Asn Val Glu Thr Asp Lys 260 265 270 Leu Lys Ile His Met Asn Asp Ser Lys Ser Ile Asp Asp Val Asp Glu 275 280 285 Leu Ile Trp Thr Ile Gly Arg Lys Ser His Leu Gly Met Gly Ser Glu 290 295 300 Asn Val Gly Ile Lys Leu Asn Ser His Asp Gln Ile Ile Ala Asp Glu 305 310 315 320 Tyr Gln Asn Thr Asn Val Pro Asn Ile Tyr Ser Leu Gly Asp Val Val 325 330 335 Gly Lys Val Glu Leu Thr Pro Val Ala Ile Ala Ala Gly Arg Lys Leu 340 345 350 Ser Asn Arg Leu Phe Gly Pro Glu Lys Phe Arg Asn Asp Lys Leu Asp 355 360 365 Tyr Glu Asn Val Pro Ser Val Ile Phe Ser His Pro Glu Ala Gly Ser 370 375 380 Ile Gly Ile Ser Glu Lys Glu Ala Ile Glu Lys Tyr Gly Lys Glu Asn 385 390 395 400 Ile Lys Val Tyr Asn Ser Lys Phe Thr Ala Met Tyr Tyr Ala Met Leu 405 410 415 Ser Glu Lys Ser Pro Thr Arg Tyr Lys Ile Val Cys Ala Gly Pro Asn 420 425 430 Glu Lys Val Val Gly Leu His Ile Val Gly Asp Ser Ser Ala Glu Ile 435 440 445 Leu Gln Gly Phe Gly Val Ala Ile Lys Met Gly Ala Thr Lys Ala Asp 450 455 460 Phe Asp Asn Cys Val Ala Ile His Pro Thr Ser Ala Glu Glu Leu Val 465 470 475 480 Thr Met Arg <210> 14 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase), trigger factor (tig, TF), locus b0436, JW0426, ECK0430 <400> 14 Met Gln Val Ser Val Glu Thr Thr Gln Gly Leu Gly Arg Arg Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Ile Ala Ala Asp Ser Ile Glu Thr Ala Val Lys Ser Glu Leu 20 25 30 Val Asn Val Ala Lys Lys Val Arg Ile Asp Gly Phe Arg Lys Gly Lys 35 40 45 Val Pro Met Asn Ile Val Ala Gln Arg Tyr Gly Ala Ser Val Arg Gln 50 55 60 Asp Val Leu Gly Asp Leu Met Ser Arg Asn Phe Ile Asp Ala Ile Ile 65 70 75 80 Lys Glu Lys Ile Asn Pro Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Val Pro Gly Glu 85 90 95 Tyr Lys Leu Gly Glu Asp Phe Thr Tyr Ser Val Glu Phe Glu Val Tyr 100 105 110 Pro Glu Val Glu Leu Gln Gly Leu Glu Ala Ile Glu Val Glu Lys Pro 115 120 125 Ile Val Glu Val Thr Asp Ala Asp Val Asp Gly Met Leu Asp Thr Leu 130 135 140 Arg Lys Gln Gln Ala Thr Trp Lys Glu Lys Asp Gly Ala Val Glu Ala 145 150 155 160 Glu Asp Arg Val Thr Ile Asp Phe Thr Gly Ser Val Asp Gly Glu Glu 165 170 175 Phe Glu Gly Gly Lys Ala Ser Asp Phe Val Leu Ala Met Gly Gln Gly 180 185 190 Arg Met Ile Pro Gly Phe Glu Asp Gly Ile Lys Gly His Lys Ala Gly 195 200 205 Glu Glu Phe Thr Ile Asp Val Thr Phe Pro Glu Glu Tyr His Ala Glu 210 215 220 Asn Leu Lys Gly Lys Ala Ala Lys Phe Ala Ile Asn Leu Lys Lys Val 225 230 235 240 Glu Glu Arg Glu Leu Pro Glu Leu Thr Ala Glu Phe Ile Lys Arg Phe 245 250 255 Gly Val Glu Asp Gly Ser Val Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val Arg Lys 260 265 270 Asn Met Glu Arg Glu Leu Lys Ser Ala Ile Arg Asn Arg Val Lys Ser 275 280 285 Gln Ala Ile Glu Gly Leu Val Lys Ala Asn Asp Ile Asp Val Pro Ala 290 295 300 Ala Leu Ile Asp Ser Glu Ile Asp Val Leu Arg Arg Gln Ala Ala Gln 305 310 315 320 Arg Phe Gly Gly Asn Glu Lys Gln Ala Leu Glu Leu Pro Arg Glu Leu 325 330 335 Phe Glu Glu Gln Ala Lys Arg Arg Val Val Val Gly Leu Leu Leu Gly 340 345 350 Glu Val Ile Arg Thr Asn Glu Leu Lys Ala Asp Glu Glu Arg Val Lys 355 360 365 Gly Leu Ile Glu Glu Met Ala Ser Ala Tyr Glu Asp Pro Lys Glu Val 370 375 380 Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Asn Lys Glu Leu Met Asp Asn Met Arg Asn 385 390 395 400 Val Ala Leu Glu Glu Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Ala Lys Ala Lys 405 410 415 Val Thr Glu Lys Glu Thr Thr Phe Asn Glu Leu Met Asn Gln Gln Ala 420 425 430 <210> 15 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B precursor (PPIase B, PPIB), rotamase B, cyclophilin B, cyclophilin-like protein, S-cyclophilin, epididymis secretory protein Li 39 (HEL-S-39), SCYLP, CYP-S1, CYPB, OI9 <400> 15 Met Leu Arg Leu Ser Glu Arg Asn Met Lys Val Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ile Ala Gly Ser Val Phe Phe Leu Leu Leu Pro Gly Pro Ser Ala 20 25 30 Ala Asp Glu Lys Lys Lys Gly Pro Lys Val Thr Val Lys Val Tyr Phe 35 40 45 Asp Leu Arg Ile Gly Asp Glu Asp Val Gly Arg Val Ile Phe Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Lys Thr Val Pro Lys Thr Val Asp Asn Phe Val Ala Leu Ala 65 70 75 80 Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr Lys Asn Ser Lys Phe His Arg Val 85 90 95 Ile Lys Asp Phe Met Ile Gln Gly Gly Asp Phe Thr Arg Gly Asp Gly 100 105 110 Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Glu Arg Phe Pro Asp Glu Asn Phe 115 120 125 Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val Ser Met Ala Asn Ala Gly 130 135 140 Lys Asp Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Thr Thr Val Lys Thr Ala 145 150 155 160 Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe Gly Lys Val Leu Glu Gly Met 165 170 175 Glu Val Val Arg Lys Val Glu Ser Thr Lys Thr Asp Ser Arg Asp Lys 180 185 190 Pro Leu Lys Asp Val Ile Ile Ala Asp Cys Gly Lys Ile Glu Val Glu 195 200 205 Lys Pro Phe Ala Ile Ala Lys Glu 210 215 <210> 16 <211> 162 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) CPR1 (Cpr1), rotamase, cyclophilin (CPH, CPH1, CYP1), cyclosporin A-binding protein, locusYDR155C, PPI-II, SCC1 <400> 16 Met Ser Gln Val Tyr Phe Asp Val Glu Ala Asp Gly Gln Pro Ile Gly 1 5 10 15 Arg Val Val Phe Lys Leu Tyr Asn Asp Ile Val Pro Lys Thr Ala Glu 20 25 30 Asn Phe Arg Ala Leu Cys Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr Ala Gly 35 40 45 Ser Pro Phe His Arg Val Ile Pro Asp Phe Met Leu Gln Gly Gly Asp 50 55 60 Phe Thr Ala Gly Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Gly Lys 65 70 75 80 Phe Pro Asp Glu Asn Phe Lys Lys His His Asp Arg Pro Gly Leu Leu 85 90 95 Ser Met Ala Asn Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile 100 105 110 Thr Thr Val Pro Cys Pro Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe Gly 115 120 125 Glu Val Val Asp Gly Tyr Asp Ile Val Lys Lys Val Glu Ser Leu Gly 130 135 140 Ser Pro Ser Gly Ala Thr Lys Ala Arg Ile Val Val Ala Lys Ser Gly 145 150 155 160 Glu Leu <210> 17 <211> 371 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c peptidyl-prolyl isomerase (PPIase) CPR6 (Cpr6), rotamase, cyclophilin, locusYLR216C, CYP40 <400> 17 Met Thr Arg Pro Lys Thr Phe Phe Asp Ile Ser Ile Gly Gly Lys Pro 1 5 10 15 Gln Gly Arg Ile Val Phe Glu Leu Tyr Asn Asp Ile Val Pro Lys Thr 20 25 30 Ala Glu Asn Phe Leu Lys Leu Cys Glu Gly Asn Ala Gly Met Ala Lys 35 40 45 Thr Lys Pro Asp Val Pro Leu Ser Tyr Lys Gly Ser Ile Phe His Arg 50 55 60 Val Ile Lys Asp Phe Met Cys Gln Phe Gly Asp Phe Thr Asn Phe Asn 65 70 75 80 Gly Thr Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Asp Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn 85 90 95 Phe Thr Val Lys His Asp Lys Pro Phe Leu Leu Ser Met Ala Asn Ala 100 105 110 Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Ala Phe Ile Thr Cys Val Pro Thr 115 120 125 Pro His Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe Gly Glu Val Ile Gln Gly 130 135 140 Lys Arg Ile Val Arg Leu Ile Glu Asn Gln Gln Cys Asp Gln Glu Asn 145 150 155 160 Asn Lys Pro Leu Arg Asp Val Lys Ile Asp Asp Cys Gly Val Leu Pro 165 170 175 Asp Asp Tyr Gln Val Pro Glu Asn Ala Glu Ala Thr Pro Thr Asp Glu 180 185 190 Tyr Gly Asp Asn Tyr Glu Asp Val Leu Lys Gln Asp Glu Lys Val Asp 195 200 205 Leu Lys Asn Phe Asp Thr Val Leu Lys Ala Ile Glu Thr Val Lys Asn 210 215 220 Ile Gly Thr Glu Gln Phe Lys Lys Gln Asn Tyr Ser Val Ala Leu Glu 225 230 235 240 Lys Tyr Val Lys Cys Asp Lys Phe Leu Lys Glu Tyr Phe Pro Glu Asp 245 250 255 Leu Glu Lys Glu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Gln Leu Lys Val Ser Ile 260 265 270 Pro Leu Asn Ile Ala Ile Cys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Tyr Lys Gln 275 280 285 Val Leu Val Ala Ser Ser Glu Val Leu Tyr Ala Glu Ala Ala Asp Glu 290 295 300 Lys Ala Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Arg Gly Leu Ala Tyr Tyr His 305 310 315 320 Val Asn Asp Thr Asp Met Ala Leu Asn Asp Leu Glu Met Ala Thr Thr 325 330 335 Phe Gln Pro Asn Asp Ala Ala Ile Leu Lys Ala Ile His Asn Thr Lys 340 345 350 Leu Lys Arg Lys Gln Gln Asn Glu Lys Ala Lys Lys Ser Leu Ser Lys 355 360 365 Met Phe Ser 370 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c peptidyl-prolyl isomerase (PPIase) FPR1 (Fpr1), FK506-binding protein 1 (FKBP, FKB1), nonhistone chromatin binding protein Hmo1p binding protein, rapamycin-binding protein (RBP1), locus YNL135C <400> 18 Met Ser Glu Val Ile Glu Gly Asn Val Lys Ile Asp Arg Ile Ser Pro 1 5 10 15 Gly Asp Gly Ala Thr Phe Pro Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Ile His 20 25 30 Tyr Thr Gly Thr Leu Glu Asn Gly Gln Lys Phe Asp Ser Ser Val Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Pro Phe Gln Cys Asn Ile Gly Val Gly Gln Val Ile Lys 50 55 60 Gly Trp Asp Val Gly Ile Pro Lys Leu Ser Val Gly Glu Lys Ala Arg 65 70 75 80 Leu Thr Ile Pro Gly Pro Tyr Ala Tyr Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly 85 90 95 Leu Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys 100 105 110 Val Asn <210> 19 <211> 358 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> DnaJ (Hsp40) homolog subfamily B member 11 (DNAJB11) precursor, ER-associated dnaJ protein 3 (ERdj3, ERj3p, EDJ, ERJ3, ERj3, HEDJ), human DnaJ protein 9 (9HDJ9, DJ9, Dj-9), APOBEC1-binding protein 2 (ABBP-2), locus PSEC0121, PRO1080 <400> 19 Met Ala Pro Gln Asn Leu Ser Thr Phe Cys Leu Leu Leu Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Arg Asp Phe Tyr Lys Ile Leu Gly Val 20 25 30 Pro Arg Ser Ala Ser Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu 35 40 45 Ala Leu Gln Leu His Pro Asp Arg Asn Pro Asp Asp Pro Gln Ala Gln 50 55 60 Glu Lys Phe Gln Asp Leu Gly Ala Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Arg Lys Gln Tyr Asp Thr Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Lys Asp 85 90 95 Gly His Gln Ser Ser His Gly Asp Ile Phe Ser His Phe Phe Gly Asp 100 105 110 Phe Gly Phe Met Phe Gly Gly Thr Pro Arg Gln Gln Asp Arg Asn Ile 115 120 125 Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ile Val Asp Leu Glu Val Thr Leu Glu Glu 130 135 140 Val Tyr Ala Gly Asn Phe Val Glu Val Val Arg Asn Lys Pro Val Ala 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Lys Cys Asn Cys Arg Gln Glu Met Arg 165 170 175 Thr Thr Gln Leu Gly Pro Gly Arg Phe Gln Met Thr Gln Glu Val Val 180 185 190 Cys Asp Glu Cys Pro Asn Val Lys Leu Val Asn Glu Glu Arg Thr Leu 195 200 205 Glu Val Glu Ile Glu Pro Gly Val Arg Asp Gly Met Glu Tyr Pro Phe 210 215 220 Ile Gly Glu Gly Glu Pro His Val Asp Gly Glu Pro Gly Asp Leu Arg 225 230 235 240 Phe Arg Ile Lys Val Val Lys His Pro Ile Phe Glu Arg Arg Gly Asp 245 250 255 Asp Leu Tyr Thr Asn Val Thr Ile Ser Leu Val Glu Ser Leu Val Gly 260 265 270 Phe Glu Met Asp Ile Thr His Leu Asp Gly His Lys Val His Ile Ser 275 280 285 Arg Asp Lys Ile Thr Arg Pro Gly Ala Lys Leu Trp Lys Lys Gly Glu 290 295 300 Gly Leu Pro Asn Phe Asp Asn Asn Asn Ile Lys Gly Ser Leu Ile Ile 305 310 315 320 Thr Phe Asp Val Asp Phe Pro Lys Glu Gln Leu Thr Glu Glu Ala Arg 325 330 335 Glu Gly Ile Lys Gln Leu Leu Lys Gln Gly Ser Val Gln Lys Val Tyr 340 345 350 Asn Gly Leu Gln Gly Tyr 355 <210> 20 <211> 654 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 78 kDa glucose-regulated protein (BiP, BIP) precursor, ER lumenal Ca(2+)-bindintg protein grp78 (GRP-78), heat shock 70 kDa protein 5 (HSPA5), immunoglobulin heavy chain-binding protein, epididymis secretory sperm binding protein Li 89n <400> 20 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly 20 25 30 Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly 35 40 45 Arg Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser 50 55 60 Tyr Val Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys 85 90 95 Arg Leu Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile 100 105 110 Lys Phe Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile 115 120 125 Gln Val Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu 130 135 140 Ile Ser Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Gly Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe 165 170 175 Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly 180 185 190 Leu Asn Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala 195 200 205 Tyr Gly Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp 210 215 220 Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly 225 230 235 240 Val Phe Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu 245 250 255 Asp Phe Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys 260 265 270 Lys Thr Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu 275 280 285 Arg Arg Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln 290 295 300 Ala Arg Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu 305 310 315 320 Thr Leu Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg 325 330 335 Ser Thr Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys 340 345 350 Lys Ser Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile 355 360 365 Pro Lys Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro 370 375 380 Ser Arg Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val 385 390 395 400 Gln Ala Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu 405 410 415 Leu Asp Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val 420 425 430 Met Thr Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser 435 440 445 Gln Ile Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys 450 455 460 Val Tyr Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly 465 470 475 480 Thr Phe Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln 485 490 495 Ile Glu Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr 500 505 510 Ala Glu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn 515 520 525 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp 530 535 540 Ala Glu Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp 545 550 555 560 Thr Arg Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile 565 570 575 Gly Asp Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu 580 585 590 Thr Met Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His 595 600 605 Gln Asp Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu 610 615 620 Glu Ile Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro 625 630 635 640 Pro Pro Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Lys Asp Glu Leu 645 650 <210> 21 <211> 705 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> S. cerevisiae strain S288c 82 kDa heat shock cognate protein, heat shock protein Hsp90 constitutive isoform (HSP90), Hsp90 family chaperone HSC82, ATP-dependent molecular chaperone HSC82, cytoplasmic chaperone of the Hsp90 family, locus YMR186W <400> 21 Met Ala Gly Glu Thr Phe Glu Phe Gln Ala Glu Ile Thr Gln Leu Met 1 5 10 15 Ser Leu Ile Ile Asn Thr Val Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe Leu Arg 20 25 30 Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg Tyr Gln 35 40 45 Ala Leu Ser Asp Pro Lys Gln Leu Glu Thr Glu Pro Asp Leu Phe Ile 50 55 60 Arg Ile Thr Pro Lys Pro Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Arg Asp Ser 65 70 75 80 Gly Ile Gly Met Thr Lys Ala Glu Leu Ile Asn Asn Leu Gly Thr Ile 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu Ala Leu Ser Ala Gly Ala 100 105 110 Asp Val Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Leu Phe 115 120 125 Leu Val Ala Asp Arg Val Gln Val Ile Ser Lys Asn Asn Glu Asp Glu 130 135 140 Gln Tyr Ile Trp Glu Ser Asn Ala Gly Gly Ser Phe Thr Val Thr Leu 145 150 155 160 Asp Glu Val Asn Glu Arg Ile Gly Arg Gly Thr Val Leu Arg Leu Phe 165 170 175 Leu Lys Asp Asp Gln Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Arg Ile Lys Glu 180 185 190 Val Ile Lys Arg His Ser Glu Phe Val Ala Tyr Pro Ile Gln Leu Leu 195 200 205 Val Thr Lys Glu Val Glu Lys Glu Val Pro Ile Pro Glu Glu Glu Lys 210 215 220 Lys Asp Glu Glu Lys Lys Asp Glu Asp Asp Lys Lys Pro Lys Leu Glu 225 230 235 240 Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys Lys Val 245 250 255 Lys Glu Glu Val Gln Glu Leu Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Leu 260 265 270 Trp Thr Arg Asn Pro Ser Asp Ile Thr Gln Glu Glu Tyr Asn Ala Phe 275 280 285 Tyr Lys Ser Ile Ser Asn Asp Trp Glu Asp Pro Leu Tyr Val Lys His 290 295 300 Phe Ser Val Glu Gly Gln Leu Glu Phe Arg Ala Ile Leu Phe Ile Pro 305 310 315 320 Lys Arg Ala Pro Phe Asp Leu Phe Glu Ser Lys Lys Lys Lys Asn Asn 325 330 335 Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Thr Asp Glu Ala Glu Asp 340 345 350 Leu Ile Pro Glu Trp Leu Ser Phe Val Lys Gly Val Val Asp Ser Glu 355 360 365 Asp Leu Pro Leu Asn Leu Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Asn Lys Ile 370 375 380 Met Lys Val Ile Arg Lys Asn Ile Val Lys Lys Leu Ile Glu Ala Phe 385 390 395 400 Asn Glu Ile Ala Glu Asp Ser Glu Gln Phe Asp Lys Phe Tyr Ser Ala 405 410 415 Phe Ala Lys Asn Ile Lys Leu Gly Val His Glu Asp Thr Gln Asn Arg 420 425 430 Ala Ala Leu Ala Lys Leu Leu Arg Tyr Asn Ser Thr Lys Ser Val Asp 435 440 445 Glu Leu Thr Ser Leu Thr Asp Tyr Val Thr Arg Met Pro Glu His Gln 450 455 460 Lys Asn Ile Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Leu Lys Ala Val Glu Lys 465 470 475 480 Ser Pro Phe Leu Asp Ala Leu Lys Ala Lys Asn Phe Glu Val Leu Phe 485 490 495 Leu Thr Asp Pro Ile Asp Glu Tyr Ala Phe Thr Gln Leu Lys Glu Phe 500 505 510 Glu Gly Lys Thr Leu Val Asp Ile Thr Lys Asp Phe Glu Leu Glu Glu 515 520 525 Thr Asp Glu Glu Lys Ala Glu Arg Glu Lys Glu Ile Lys Glu Tyr Glu 530 535 540 Pro Leu Thr Lys Ala Leu Lys Asp Ile Leu Gly Asp Gln Val Glu Lys 545 550 555 560 Val Val Val Ser Tyr Lys Leu Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ile Arg Thr 565 570 575 Gly Gln Phe Gly Trp Ser Ala Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln 580 585 590 Ala Leu Arg Asp Ser Ser Met Ser Ser Tyr Met Ser Ser Lys Lys Thr 595 600 605 Phe Glu Ile Ser Pro Lys Ser Pro Ile Ile Lys Glu Leu Lys Lys Arg 610 615 620 Val Asp Glu Gly Gly Ala Gln Asp Lys Thr Val Lys Asp Leu Thr Asn 625 630 635 640 Leu Leu Phe Glu Thr Ala Leu Leu Thr Ser Gly Phe Ser Leu Glu Glu 645 650 655 Pro Thr Ser Phe Ala Ser Arg Ile Asn Arg Leu Ile Ser Leu Gly Leu 660 665 670 Asn Ile Asp Glu Asp Glu Glu Thr Glu Thr Ala Pro Glu Ala Ser Thr 675 680 685 Glu Ala Pro Val Glu Glu Val Pro Ala Asp Thr Glu Met Glu Glu Val 690 695 700 Asp 705 <210> 22 <211> 137 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 heat shock chaperone, small heat shock protein IbpA, 16 kDa heat shock protein A, locus b3687, JW3664, hsIT, htpN, ECK3679 <400> 22 Met Arg Asn Phe Asp Leu Ser Pro Leu Tyr Arg Ser Ala Ile Gly Phe 1 5 10 15 Asp Arg Leu Phe Asn His Leu Glu Asn Asn Gln Ser Gln Ser Asn Gly 20 25 30 Gly Tyr Pro Pro Tyr Asn Val Glu Leu Val Asp Glu Asn His Tyr Arg 35 40 45 Ile Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ala Glu Ser Glu Leu Glu Ile Thr 50 55 60 Ala Gln Asp Asn Leu Leu Val Val Lys Gly Ala His Ala Asp Glu Gln 65 70 75 80 Lys Glu Arg Thr Tyr Leu Tyr Gln Gly Ile Ala Glu Arg Asn Phe Glu 85 90 95 Arg Lys Phe Gln Leu Ala Glu Asn Ile His Val Arg Gly Ala Asn Leu 100 105 110 Val Asn Gly Leu Leu Tyr Ile Asp Leu Glu Arg Val Ile Pro Glu Ala 115 120 125 Lys Lys Pro Arg Arg Ile Glu Ile Asn 130 135 <210> 23 <211> 142 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> E. coli strain K-12 substrain MG1655 heat shock chaperone, small heat shock protein IbpB, 16 kDa heat shock protein B, locus b3686, JW3663, hsIS, htpE, ECK3678 <400> 23 Met Arg Asn Phe Asp Leu Ser Pro Leu Met Arg Gln Trp Ile Gly Phe 1 5 10 15 Asp Lys Leu Ala Asn Ala Leu Gln Asn Ala Gly Glu Ser Gln Ser Phe 20 25 30 Pro Pro Tyr Asn Ile Glu Lys Ser Asp Asp Asn His Tyr Arg Ile Thr 35 40 45 Leu Ala Leu Ala Gly Phe Arg Gln Glu Asp Leu Glu Ile Gln Leu Glu 50 55 60 Gly Thr Arg Leu Ser Val Lys Gly Thr Pro Glu Gln Pro Lys Glu Glu 65 70 75 80 Lys Lys Trp Leu His Gln Gly Leu Met Asn Gln Pro Phe Ser Leu Ser 85 90 95 Phe Thr Leu Ala Glu Asn Met Glu Val Ser Gly Ala Thr Phe Val Asn 100 105 110 Gly Leu Leu His Ile Asp Leu Ile Arg Asn Glu Pro Glu Pro Ile Ala 115 120 125 Ala Gln Arg Ile Ala Ile Ser Glu Arg Pro Ala Leu Asn Ser 130 135 140 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polyhistidine, His-6, 6xHis tag, poly-amino acid tag <400> 24 His His His His His His 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic poly-amino acid tag <400> 25 Ser Arg Ser Arg Ser Arg Ser Arg 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic poly-amino acid tag <400> 26 Ser Lys Ser Lys Ser Lys Ser Lys 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic poly-amino acid tag <400> 27 Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic poly-amino acid tag <400> 28 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DsbC active site <400> 29 Cys Gly Tyr Cys 1

Claims (59)

  1. i) 박테리아 추출물과 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 조합시켜 박테리아 세포 비함유 합성 시스템을 생성시키는 단계; 및
    ii) 적어도 100 mg/L의 농도로 관심 단백질의 발현을 가능케 하는 조건하에서 박테리아 세포 비함유 합성 시스템을 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 생물학적 활성 단백질의 발현 수준을 개선시키는 방법으로서,
    상기 박테리아 추출물이 활성 산화적 인산화 시스템을 갖고, 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 포함하고, 상기 추출물이 추출물 리터 당 적어도 1 g의 전체 농도로 외인성 이황화물 이소메라제(isomerase) 및 외인성 프롤릴 이소메라제를 발현하는 박테리아로부터 제조되며, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜리인, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 추출물이 외인성 데아그레가제(deaggregase)를 추가로 발현하는 박테리아로부터 제조되는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 추출물이 제조되는 박테리아가 이황화물 이소메라제, 프롤릴 이소메라제, 또는 데아그레가제를 인코딩하는 유전자로 공동-형질전환된 것인 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 외인성 이황화물 이소메라제가 DsbA, DsbB, DsbC, 또는 효모 PDI이고, 외인성 프롤릴 이소메라제가 FkpA, SlyD, 또는 트리거 인자 (tig)이고, 외인성 데아그레가제가 Skp인 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 추출물이 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)의 S30 추출물인 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 추출물이 제조되는 박테리아가 항시성 프로모터(constitutive promotor)에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 외인성 이황화물 이소메라제, 프롤릴 이소메라제, 또는 데아그레가제를 발현하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 관심 단백질이 이의 생물학적 활성 입체형태에서 적어도 하나의 이황화 결합을 갖는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 관심 단백질이 적어도 2개의 프롤린 잔기를 갖는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 관심 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 박테리아 세포 비함유 합성 시스템이 0.5 리터 내지 500 리터의 부피를 갖고, 인큐베이션이 1-36시간 지속되는 기간의 인큐베이션인 방법.
  11. i) 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 함유하는 활성 산화적 인산화 시스템을 갖는 박테리아의 세포 비함유 추출물로서, 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제가 추출물 리터 당 적어도 1 g의 수준으로 박테리아에서 발현되는, 박테리아의 세포 비함유 추출물; 및
    ii) 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템으로서,
    상기 박테리아 세포 비함유 합성 시스템이 적어도 100 mg/L의 농도로 관심 단백질을 발현하며, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜리인, 박테리아 세포 비함유 합성 시스템.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서, 추출물이 제조되는 박테리아가 이황화물 이소메라제 및 프롤릴 이소메라제를 인코딩하는 유전자로 공동-형질전환된 것인 시스템.
  14. 제 11항 또는 제 13항에 있어서, 외인성 이황화물 이소메라제가 DsbA, DsbB, DsbC, 또는 효모 PDI이고, 외인성 프롤릴 이소메라제가 FkpA, SlyD, 또는 트리거 인자 (tig)인 시스템.
  15. 삭제
  16. 제 11항 또는 제 13항에 있어서, 추출물이 제조되는 박테리아가 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제를 발현하는 시스템.
  17. 제 11항 또는 제 13항에 있어서, 추출물이 E. 콜리의 S30 추출물인 시스템.
  18. i) 박테리아 추출물과 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 조합시키는 단계; 및
    ii) 관심 단백질의 발현 및 적절한 폴딩을 가능케 하는 조건하에서 박테리아 추출물과 핵산을 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질을 발현시키는 방법으로서,
    상기 박테리아 추출물이 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 포함하고, 상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도가 추출물 리터 당 적어도 1 g이며, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜리인, 방법.
  19. 삭제
  20. 제 18항에 있어서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도가 추출물 리터 당 1 g 내지 14 g인 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 관심 단백질의 발현이, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제 둘 모두가 아닌 하나가 존재하는 경우 그 농도 초과의 농도로 개선되고, 인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 단백질 이황화물 이소메라제가 DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, 및 효모 PDI로 구성된 군으로부터 선택되고, 펩티딜-프롤릴 시스/트랜스 이소메라제가 FkpA, SlyD, 및 트리거 인자 (tig)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  23. 제 18항에 있어서, 추출물이 제조되는 박테리아가 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제 중 적어도 하나를 발현하는 방법.
  24. 제 18항에 있어서, 추출물이 에스케리키아 콜리의 S30 추출물인 방법.
  25. 제 18항에 있어서, 관심 단백질이 이의 생물학적 활성 입체형태에서 적어도 하나의 이황화 결합을 갖는 방법.
  26. 제 18항에 있어서, 관심 단백질이 적어도 2개의 프롤린 잔기를 갖는 방법.
  27. 제 18항에 있어서, 관심 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  28. i) 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 함유하고, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 추가로 포함하는 활성 산화적 인산화 시스템을 갖는 박테리아의 세포 비함유 추출물로서, 상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스/트랜스 이소메라제가 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질의 발현을 개선시키기에 충분한 농도로 존재하는, 박테리아의 세포 비함유 추출물; 및
    ii) 관심 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템으로서,
    상기 박테리아 세포 비함유 합성 시스템이 적어도 100 mg/L의 농도로 관심 단백질을 발현하며, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜리인, 박테리아 세포 비함유 합성 시스템.
  29. 제 28항에 있어서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도가 추출물 리터 당 적어도 1 g인 시스템.
  30. 제 28항에 있어서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도가 추출물 리터 당 1 g 내지 14 g인 시스템.
  31. 제 28항에 있어서, 관심 단백질의 발현이, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제 둘 모두가 아닌 하나가 존재하는 경우 그 농도 초과의 농도로 개선되고, 인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한 시스템.
  32. 제 28항에 있어서, 단백질 이황화물 이소메라제가 DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, 및 효모 PDI로 구성된 군으로부터 선택되고, 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제가 FkpA, SlyD, 및 트리거 인자 (tig)로 구성된 군으로부터 선택되는 시스템.
  33. 제 28항에 있어서, 추출물이 제조되는 박테리아가 항시성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제 중 적어도 하나를 발현하는 시스템.
  34. 제 28항에 있어서, 추출물이 에스케리키아 콜리의 S30 추출물인 시스템.
  35. 제 28항에 있어서, 관심 단백질이 이의 생물학적 활성 입체형태에서 적어도 하나의 이황화 결합을 갖는 시스템.
  36. 제 28항에 있어서, 관심 단백질이 적어도 2개의 프롤린 잔기를 갖는 시스템.
  37. 제 28항에 있어서, 관심 단백질이 항체 또는 항체 단편인 시스템.
  38. i) 외인성 단백질 이황화물 이소메라제 및 외인성 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 발현하는 박테리아를 배양하는 단계, 및
    ii) 활성 산화적 인산화 시스템을 갖고, 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 포함하는 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 박테리아 추출물을 제조하기 위한 방법으로서,
    상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제가 추출물 리터 당 적어도 1 g의 전체 농도로 존재하며, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜리인, 방법.
  39. 세포 비함유 단백질 합성에 필요한 생물학적 기능성 tRNA, 아미노산 및 리보솜을 함유하고, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제를 추가로 포함하는, 활성 산화적 인산화 시스템을 포함하는 생물학적 활성 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 세포 비함유 추출물로서,
    상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제가 추출물 리터 당 적어도 1 g의 전체 농도로 존재하며, 상기 박테리아가 에스케리키아 콜리인, 박테리아 세포 비함유 추출물.
  40. 제 1항에 있어서, 외인성 단백질 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제의 전체 농도가 추출물 리터 당 1 g 내지 14 g인 방법.
  41. 제 38항에 있어서, 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제의 전체 농도가 추출물 리터 당 1 g 내지 14 g인 방법.
  42. 제 1항에 있어서, 이황화물 이소메라제는 산화환원 샤페론이고, 프롤릴 이소메라제 또는 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제는 FK506 결합 단백질 (FKBP) 또는 파르불린(parvulin)인 방법.
  43. 제 4항에 있어서, 이황화물 이소메라제는 DsbC이고, 프롤릴 이소메라제 또는 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제는 FkpA인 방법.
  44. 제 1항에 있어서, 상기 관심 단백질은 100 mg/L 내지 1000 mg/L의 농도로 발현되는 방법.
  45. 제 1항에 있어서, 상기 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제는 추출물 리터 당 1 g 내지 20 g의 농도로 박테리아에서 발현되는 방법.
  46. 제 1항에 있어서, 상기 외인성 이황화물 이소메라제는 추출물 리터 당 2.5 g 내지 4.1 g의 수준으로 박테리아에서 발현되고, 상기 외인성 프롤릴 이소메라제는 추출물 리터 당 3.4 g 내지 13.9 g의 수준으로 박테리아에서 발현되는 방법.
  47. 제 1항에 있어서, 상기 관심 단백질은 600 mg/L 초과의 농도로 발현되는 방법.
  48. 제 11항에 있어서, 상기 관심 단백질은 100 mg/L 내지 1000 mg/L의 농도로 발현되는 것인 시스템.
  49. 제 11항에 있어서, 상기 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제는 추출물 리터 당 1 g 내지 20 g의 농도로 박테리아에서 발현되는 시스템.
  50. 제 11항에 있어서, 상기 외인성 이황화물 이소메라제는 추출물 리터 당 2.5 g 내지 4.1 g의 수준으로 박테리아에서 발현되고, 상기 외인성 프롤릴 이소메라제는 추출물 리터 당 3.4 g 내지 13.9 g의 농도로 박테리아에서 발현되는 시스템.
  51. 제 11항에 있어서, 상기 관심 단백질은 600 mg/L 초과의 농도로 발현되는 시스템.
  52. 제 18항 및 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 100 mg/L 내지 1000 mg/L의 농도로 발현되는 것인 방법.
  53. 제 18항 및 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 이황화물 이소메라제 및 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제는 추출물 리터 당 1 g 내지 20 g의 농도로 박테리아에서 발현되는 방법.
  54. 제 18항 및 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 이황화물 이소메라제는 추출물 리터 당 2.5 g 내지 4.1 g의 수준으로 박테리아에서 발현되고, 상기 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스 이소메라제는 추출물 리터 당 3.4 g 내지 13.9 g의 수준으로 박테리아에서 발현되는 방법.
  55. 제 18항 및 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 600 mg/L 초과의 농도로 발현되는 방법.
  56. 제 1항에 있어서, 상기 관심 단백질의 농도가, 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제를 별개로 발현하는 박테리아에 의해 발현된 농도의 합보다 크고, 인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한 방법.
  57. 제 11항에 있어서, 상기 관심 단백질의 농도가, 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제를 별개로 발현하는 박테리아에 의해 발현된 농도의 합보다 크고, 인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한 시스템.
  58. 제 18항 및 제 20항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적절하게 폴딩된 생물학적 활성 단백질의 농도가, 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제를 별개로 발현하는 박테리아에 의해 발현된 농도의 합보다 크고, 인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한 방법.
  59. 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질의 농도가, 외인성 이황화물 이소메라제 및 외인성 프롤릴 이소메라제를 별개로 발현하는 박테리아에 의해 발현된 농도의 합보다 크고, 인큐베이션 조건이 그 밖에는 동일한 시스템.
KR1020157032515A 2013-04-19 2014-04-18 상승된 수준의 외인성 샤페론을 갖는 세포 추출물을 이용한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서의 생물학적 활성 단백질의 발현 KR102289258B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361813914P 2013-04-19 2013-04-19
US61/813,914 2013-04-19
US201461937069P 2014-02-07 2014-02-07
US61/937,069 2014-02-07
PCT/US2014/034643 WO2014172631A2 (en) 2013-04-19 2014-04-18 Expression of biologically active proteins in a bacterial cell-free synthesis system using bacterial cells transformed to exhibit elevated levels of chaperone expression

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160002913A KR20160002913A (ko) 2016-01-08
KR102289258B1 true KR102289258B1 (ko) 2021-08-11

Family

ID=50733442

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157032515A KR102289258B1 (ko) 2013-04-19 2014-04-18 상승된 수준의 외인성 샤페론을 갖는 세포 추출물을 이용한 박테리아 세포 비함유 합성 시스템에서의 생물학적 활성 단백질의 발현

Country Status (14)

Country Link
US (3) US10190145B2 (ko)
EP (1) EP2986731B1 (ko)
JP (2) JP6463732B2 (ko)
KR (1) KR102289258B1 (ko)
CN (1) CN105283556B (ko)
AU (1) AU2014253785B2 (ko)
CA (1) CA2909516C (ko)
DK (1) DK2986731T3 (ko)
ES (1) ES2922358T3 (ko)
HK (1) HK1220993A1 (ko)
HU (1) HUE059565T2 (ko)
IL (1) IL242148B (ko)
SG (2) SG11201508642WA (ko)
WO (1) WO2014172631A2 (ko)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE059565T2 (hu) 2013-04-19 2022-11-28 Sutro Biopharma Inc Biológiailag aktív fehérjék expressziója bakteriális sejtmentes szintézisrendszerben, emelkedett exogén chaperonszintû sejtextraktumok segítségével
US10316322B2 (en) 2014-07-02 2019-06-11 Sutro Biopharma, Inc. High growth capacity auxotrophic Escherichia coli and methods of use
US10112994B2 (en) 2014-11-05 2018-10-30 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in bacteria
JP6770966B2 (ja) 2014-11-05 2020-10-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細菌における２鎖タンパク質の生成方法
WO2016100889A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Sutro Biopharma, Inc. Codon optimization for titer and fidelity improvement
CA2972604C (en) * 2014-12-30 2023-07-04 Celgene Corporation Anti-cd47 antibodies and uses thereof
EP3636749B1 (en) * 2015-03-06 2022-04-27 F. Hoffmann-La Roche AG Ultrapurified dsbc and methods of making and using the same
US20170029798A1 (en) * 2015-07-27 2017-02-02 Cellivery Therapeutics, Inc. Development of Improved Cell-Permeable (iCP) Parkin Recombinant Protein as a Protein-Based Anti-Neurodegenerative Agent for the Treatment of Parkinson's Disease-Associated Phenotypes by Utilizing BBB-Penetrating Protein Delivery System MITT, Enabled by Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD)
WO2017031476A2 (en) * 2015-08-20 2017-02-23 Genentech, Inc. Purification of fkpa and uses thereof for producing recombinant polypeptides
CN105198983B (zh) * 2015-09-11 2018-11-06 中国石油大学(华东) 一种利于七次跨膜蛋白ccr5功能性表达的方法
CN106190940B (zh) * 2016-07-19 2019-06-14 北京三元基因药业股份有限公司 表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌
CN106399352B (zh) * 2016-11-09 2020-04-17 华东理工大学 调节目标蛋白表达的折叠因子及其应用
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
EP3562940B1 (en) * 2016-12-30 2022-06-15 Nature's Toolbox, Inc. Cell-free expression system having novel inorganic polyphosphate-based energy regeneration
US20200131555A1 (en) 2017-07-11 2020-04-30 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
EP3661955A4 (en) 2017-08-03 2021-05-26 Synthorx, Inc. CYTOKINE CONJUGATES FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
EP3665188A4 (en) * 2017-08-11 2021-07-21 Synvitrobio, Inc. IMPROVED IN VITRO TRANSLATION / TRANSLATION SYSTEM (TXTL) AND ITS USES
WO2019127469A1 (zh) * 2017-12-29 2019-07-04 康码（上海）生物科技有限公司 一种高效的能源再生体系(bes)、试剂盒及其制备方法
CA3176812A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
KR20210090645A (ko) * 2018-11-05 2021-07-20 제넨테크, 인크. 원핵 숙주 세포에서 2개의 사슬 단백질을 생산하는 방법
KR20210089699A (ko) * 2018-11-08 2021-07-16 서트로 바이오파마, 인크. 산화성 세포질을 갖는 대장균 균주
CN109371049A (zh) * 2018-11-14 2019-02-22 天津大学 分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用
MA54952A (fr) 2019-02-06 2022-05-11 Synthorx Inc Conjugués d'il-2 et méthodes d'utilisation de ceux-ci
WO2021178001A1 (en) * 2020-03-05 2021-09-10 Curie Co. Inc. Methods for cell free protein expression of mature polypeptides derived from zymogens and proproteins
KR20220047598A (ko) 2019-08-15 2022-04-18 신톡스, 인크. Il-2 콘쥬게이트를 사용한 면역 종양학 병용 요법
AU2020347154A1 (en) 2019-09-10 2022-03-03 Synthorx, Inc. IL-2 conjugates and methods of use to treat autoimmune diseases
BR112022006703A2 (pt) 2019-11-04 2022-07-12 Synthorx Inc Conjugados de interleucina 10 e usos dos mesmos
EP4142711A1 (en) * 2020-04-29 2023-03-08 Willow Biosciences Inc. Compositions and methods for enhancing recombinant biosynthesis of cannabinoids
JP2023531509A (ja) 2020-06-25 2023-07-24 シンソークス， インコーポレイテッド Ｉｌ－２コンジュゲートおよび抗ｅｇｆｒ抗体を用いる免疫腫瘍学併用療法
KR20220000028U (ko) 2020-06-29 2022-01-05 채인자 농작물용 농약 간편 분무장치
IL301292A (en) 2020-09-14 2023-05-01 Sutro Biopharma Inc A method for the large-scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system
JP2023546010A (ja) 2020-10-09 2023-11-01 シンソークス， インコーポレイテッド Ｉｌ－２コンジュゲートを用いた免疫腫瘍療法
AU2021356693A1 (en) 2020-10-09 2023-06-15 Synthorx, Inc. Immuno oncology combination therapy with il-2 conjugates and pembrolizumab
WO2022174102A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Synthorx, Inc. Lung cancer combination therapy with il-2 conjugates and an anti-pd-1 antibody or antigen-binding fragment thereof
TW202245843A (zh) 2021-02-12 2022-12-01 美商欣爍克斯公司 Ｉｌ－２接合物及西米普利單抗（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）之皮膚癌組合療法
EP4346903A1 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Synthorx, Inc. Head and neck cancer combination therapy comprising an il-2 conjugate and pembrolizumab
WO2023122573A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Synthorx, Inc. Head and neck cancer combination therapy comprising an il-2 conjugate and pembrolizumab
WO2023122750A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Synthorx, Inc. Cancer combination therapy with il-2 conjugates and cetuximab
CN115028691A (zh) * 2022-06-29 2022-09-09 青岛硕景生物科技有限公司 一种检测试纸用的独立质控系统、杂交瘤细胞株、质控线用包被单克隆抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081033A2 (en) 2003-03-11 2004-09-23 National Institutes Of Health Synthesis of proteins by cell-free protein expression
JP2005253432A (ja) 2004-03-15 2005-09-22 Sekisui Chem Co Ltd タンパク質の生産方法、並びにそれに使用するための組成物、試薬及びキット
JP2006061080A (ja) 2004-08-27 2006-03-09 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 無細胞タンパク質合成系のための媒体

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10145694A1 (de) 2001-09-17 2003-04-03 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Erhöhung der Löslichkeit, der Expressionsrate und der Aktivität von Proteinen während der rekombinanten Herstellung
CA2657811C (en) * 2006-06-29 2014-10-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-free synthesis of proteins containing unnatural amino acids
WO2008088884A2 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced cell-free synthesis of active proteins containing disulfide bonds
CN102348807B (zh) 2009-01-12 2015-04-15 苏特罗生物制药公司 利用体外蛋白合成体系将非天然氨基酸引入蛋白的单装载体系
CN102732548A (zh) 2012-05-16 2012-10-17 中国农业大学 一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立及应用
HUE059565T2 (hu) * 2013-04-19 2022-11-28 Sutro Biopharma Inc Biológiailag aktív fehérjék expressziója bakteriális sejtmentes szintézisrendszerben, emelkedett exogén chaperonszintû sejtextraktumok segítségével

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081033A2 (en) 2003-03-11 2004-09-23 National Institutes Of Health Synthesis of proteins by cell-free protein expression
JP2005253432A (ja) 2004-03-15 2005-09-22 Sekisui Chem Co Ltd タンパク質の生産方法、並びにそれに使用するための組成物、試薬及びキット
JP2006061080A (ja) 2004-08-27 2006-03-09 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 無細胞タンパク質合成系のための媒体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioprocess Biosyst., Vol. 33, pp. 127-132 (2010.)

Also Published As

Publication number Publication date
ES2922358T3 (es) 2022-09-13
CA2909516C (en) 2023-03-07
CN105283556B (zh) 2020-07-14
JP2018157837A (ja) 2018-10-11
EP2986731A2 (en) 2016-02-24
US20190161781A1 (en) 2019-05-30
WO2014172631A2 (en) 2014-10-23
CN105283556A (zh) 2016-01-27
US20210054429A1 (en) 2021-02-25
JP6463732B2 (ja) 2019-02-06
HUE059565T2 (hu) 2022-11-28
HK1220993A1 (zh) 2017-05-19
CA2909516A1 (en) 2014-10-23
WO2014172631A4 (en) 2015-02-19
AU2014253785A1 (en) 2015-11-05
AU2014253785B2 (en) 2018-07-19
US20140315245A1 (en) 2014-10-23
SG10202108497TA (en) 2021-09-29
US10190145B2 (en) 2019-01-29
JP2016518833A (ja) 2016-06-30
US10774354B2 (en) 2020-09-15
SG11201508642WA (en) 2015-11-27
DK2986731T3 (da) 2022-08-01
EP2986731B1 (en) 2022-05-18
WO2014172631A3 (en) 2014-12-18
KR20160002913A (ko) 2016-01-08
IL242148B (en) 2019-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10774354B2 (en) Expression of biologically active proteins in a bacterial cell-free synthesis system using bacterial cells transformed to exhibit elevated levels of chaperone expression
US11261219B2 (en) Proteolytic inactivation of select proteins in bacterial extracts for improved expression
US10487133B2 (en) Codon optimization for titer and fidelity improvement
US20200332280A1 (en) Use of lambda-gam protein in ribosomal display technology
US20220089690A1 (en) Method for large scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant