KR20210090645A - 원핵 숙주 세포에서 2개의 사슬 단백질을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

항체, 절반-항체, 항체 단편, 또는 한팔(one-armed) 항체와 같은 2개의 사슬을 함유하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및 숙주 세포가 본원에 제공된다. 상기 방법 및 숙주 세포는 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)로부터의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현, 및 샤페론 단백질을 인코딩하는 프로모터와 번역 단위의 비-천연 조합(들)을 사용하여 숙주 세포 염색체로부터의 하나 이상의 샤페론 단백질(들) (예를 들어, 펩티딜-프롤릴 이소머라제 및/또는 단백질 이황화물 산화환원효소)의 발현을 사용하는 2-사슬 폴리펩타이드 생산을 가능하게 한다.

Description

원핵 숙주 세포에서 2개의 사슬 단백질을 생산하는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2018년 11월 5일 자 출원된 미국 가출원 번호 62/755,915에 우선권을 주장하고, 이것은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.

ASCII 텍스트 파일로 서열 목록의 제출

ASCII 텍스트 파일로 아래와 같이 제출한 내용은 전체가 참조로서 본원에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태(CRF)(파일 명칭: 146392044040SEQLIST.TXT, 기록된 날자: 2019년 10월 28일, 크기: 6 KB).

분야

이 개시내용은 상기 방법에 사용될 수 있는 재조합 폴리펩타이드, 예컨대 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 절반-항체, 한팔 항체, 항체 단편, 등), 뿐만 아니라 원핵 숙주 세포를 생산하는 방법에 관련된다.

원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질 생산은 1978년 E. 콜리에서 인간 인슐린의 생산이래 많은 중요한 치료제의 공급원이 되어 왔다. 분자 생물학 도구 및 지식이 진전됨에 따라, 재조합 치료제의 복잡성 또한 증가되었다. 이들 재조합 단백질의 생산은 생성물이 특성 예컨대 적절한 번역, 폴딩, 어셈블리, 이황화물 결합, 및 주변세포질로 이송을 나타내는 것을 필요로 한다. 많은 재조합 단백질, 특히 이황화물 결합을 갖는 것 (예를 들어, 비제한적으로 항체 및 항체 단편을 포함한, 두 사슬 단백질)의 발현은 원핵 숙주 세포에서 봉입체의 형성을 초래한다 것으로 알려져 있다(Spadiut 등, Trends in Biotechnology, 32:54, 2014). 따라서, 산업적 규모로 원핵 숙주 세포에서 적절하게 폴딩되고 조립된 두 사슬 단백질의 재조합 생산을 위한 발현 시스템 및 공정에 대한 요구가 있다.

단클론성 항체는 다양한 질환의 치료에 대해 이미 승인되었거나 검토 하에 있는 다수의 단클론성 항체로, 가장 빠르게 성장하고 있는 유형의 재조합 치료제 중 하나를 나타낸다(Nelson 등, Nature Review Drug Discovery, 9:767, 2010). 전통적인 단클론성 항체는 단일 표적 항원에 결합한다. 많은 질환에 대해, 하나 초과의 표적 항원에 결합하는 항체, 즉, 다중특이적 항체를 이용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 항체는 다수의 치료 표적를 겨냥하는 조합 접근법에 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Bostrom 등, Science, 323:1610, 2009; 및 Wu 등, Nature Biotechnology, 25:1290, 2007). 예를 들어, 암 세포의 표면 상에 발현된 에피토프와 종양 세포의 T 세포-매개된 사멸을 도입하기 위해 T 세포 상에 발현된 에피토프에 동시에 결합하는 이중특이적 항체가 생산될 수 있다(Shalaby 등, Clinical Immunology, 74:185, 1995). 다른 단클론성 항체 포맷, 예컨대 항체 단편 및 한팔 항체가 또한 사용되었다(참조, 예를 들어, Merchant 등, Proc . Natl . Acad . Sci . 110:E2987-E2996, 2013).

병상에서 항체의 사용은 산업으로 관련된 양으로 두 사슬 단백질을 생산하는 능력을 필요로 한다. 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질 생산을 개선하는 벡터 구성요소가 기재되었고 (참조, 예를 들어, Schlapschy 등, Protein Engineering, Design and Selection, 19:385, 2006; 및 Simmons 등, Journal of Immunological Methods, 263: 133, 2002), 특히 샤페론 단백질(들)의 발현이 항체 역가를 증가하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이들 샤페론 단백질(들)은 전형적으로 숙주 세포에서 플라스미드로부터 발현되었다. 이는 발현되는 모든 새로운 재조합 단백질에 대해, 재조합 생성물 및 샤페론(들) 둘 모두를 인코딩하는 고유한 발현 플라스미드를 구축하고 그것의 발현을 조정하는데 (예를 들어, 상이한 프로모터 및/또는 번역 개시 영역을 시험함에 의함) 상당한 시간 및 비용이 반드시 소비되어야 한다는 것을 의미한다. 이는 또한 샤페론 단백질(들)에 대한 코딩 서열(들) 및 회합된 조절 인자를 수용하기 위해 더 큰 플라스미드 크기의 사용을 필요로 한다. 플라스미드 발현은 또한 전형적으로 샤페론 단백질(들)에 대한 더 높은 발현 수준을 초래하고 (플라스미드가 세포당 적어도 10-15 카피로 존재할 수 있기 때문임), 일부 경우에 이는 재조합 생성물 역가로부터 샤페론 단백질을 제거하기 위해 추가의 정제 단계(들)를 필요로 한다.

특허 출원, 특허 공보, 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호를 포함한, 본원에 인용된 모든 참조문헌은, 각 개별 참조문헌이 참조로서 포함될 수 있도록 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.

발명의 내용

분취 규모로 재조합 두 사슬 단백질을 효율적으로 생산하는 최적의 방법에 대한 요구가 남아 있다. 특히, 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위(들)의 원핵 숙주 세포 염색체 안으로 통합, 및/또는 천연 샤페론 단백질의 발현을 구동하기 위한 비-천연 프로모터의 통합은 다양한 재조합 단백질 제품을 발현하고 생산에 필요한 플라스미드 엔지니어링 및 단백질 정제 프로토콜을 단순화하기 위해 사용될 수 있는 단일 숙주 세포를 허용한다.

이들 및 다른 요구를 충족하기 위해, 2-사슬 폴리펩타이드를 생산하기 위한 원핵 숙주 세포 및 이를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 유익하게는, 이들 숙주 세포 및 방법은, 예를 들어, 샤페론 발현 플라스미드 또는 샤페론 단백질을 제거하기 위한 다운스트림 정제 단계들을 최적화하기 위한 상승하는 시간과 비용을 요함이 없는 2-사슬 폴리펩타이드의 보다 효율적인 생산을 허용한다.

일 양태에서, 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포에 두 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 폴리펩타이드의 두 사슬의 발현으로 적합한 조건하에서 배양 배지에서 폴리펩타이드의 두 사슬을 발현하며, 이에 의해 발현시 두 사슬이 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합하도록 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 다음을 포함하는 단계: (1) 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부임; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 및 단백질 이황화물 산화환원효소로 구성된 군으로부터 선택된 샤페론 단백질을 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하고, 상기 제3 번역 단위 및 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 제거하는 단계.

일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 배양 배지에서 포스페이트가 고갈될 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 배양 배지에 IPTG가 존재할 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 CP25 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 대해 타고난다. 일부 구현예에, 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 대해 비-천연이다. 일부 구현예에서, 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이성화효소이다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이다. 일부 구현예에서, FkpA는 E. 콜리 FkpA이다. 일부 구현예에서, 샤페론 단백질은 단백질 이황화물 산화환원효소이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA이다.

또 다른 양태에서, 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포에 두 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 폴리펩타이드의 두 사슬의 발현으로 적합한 조건하에서 배양 배지에서 폴리펩타이드의 두 사슬을 발현하며, 이에 의해 발현시 두 사슬이 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합하도록 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 다음을 포함하는 단계: (1) 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부임; (3) 를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드 a 단백질 이황화물 산화환원효소, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제1 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하고, 상기 제3 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임; 및 (4) 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 제4 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제4 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제2 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제4 번역 단위의 전사를 유도하고, 상기 제4 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 제거하는 단계.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터 둘 모두는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터 둘 모두는 배양 배지에서 포스페이트가 고갈될 때 제3 및 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 프로모터 중 하나는 유도성 프로모터이고, 다른 제1 및 제2 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 배양 배지에서 포스페이트가 고갈될 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이고, 제2 프로모터는 CP25 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이고, 제1 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 제4 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두 숙주 세포 염색체에 타고난다. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 제4 번역 단위 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 천연이다. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 제4 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이다. 일부 구현예에서, FkpA는 E. 콜리 FkpA이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이고, 상기 제1 프로모터는 배양 배지에서 포스페이트가 고갈될 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이고, 상기 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 E. 콜리 FkpA이고, 상기 제2 프로모터는 CP25 프로모터이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이고, 상기 제1 프로모터는 배양 배지에서 포스페이트가 고갈될 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이고, 상기 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 E. 콜리 FkpA이고, 상기 제2 프로모터는 배양 배지에서 포스페이트가 고갈될 때 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 추가로 다음을 포함한다: (5) 제2 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제5 번역 단위를 포함하는 제5 폴리뉴클레오타이드, 상기 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제3 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제5 번역 단위의 전사를 유도하고, 상기 제5 번역 단위 및 제3 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임. 일부 구현예에서, 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA이다. 일부 구현예에서, 제3 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제3 프로모터는 배양 배지에 IPTG가 존재할 때 제5 번역 단위의 전사를 유도하는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 타고난다. 일부 구현예에서, 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 제1 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이며, 상기 제1 프로모터는 배양 배지에 IPTG가 존재할 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이고, 상기 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 E. 콜리 FkpA이며, 상기 제2 프로모터는 CP25 프로모터이고, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA이며, 상기 제3 프로모터는 배양 배지에 IPTG가 존재할 때 제5 번역 단위의 전사를 유도하는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 추가로 다음을 포함한다: (6) 폴리펩타이드의 제3 사슬을 인코딩하는 제6 번역 단위를 포함하는 제6 폴리뉴클레오타이드, 상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부이고; 이에 의해 발현시 세 사슬은 숙주 세포에 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합됨. 일부 구현예에서, 제1 번역 단위는 면역글로불린 중쇄를 인코딩하고, 여기서 제2 번역 단위는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하며, 여기서 제6 번역 단위는 면역글로불린 Fc 단편을 인코딩하고, 세 사슬은 생물학적 활성 1가 항체를 형성하도록 접히고 조합된다. 일부 구현예에서, 1가 항체는 특이적으로 항원을 결합할 수 있다.

임의의 상기 구현예 중 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 모두는 단일 염색체외 발현 벡터 중 일부이다. 일부 구현예에서, 염색체외 발현 벡터는 선택 제제에 대한 내성을 촉진하는 선택가능한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하며, 여기서 숙주 세포는 선택가능한 마커의 발현에 대해 적합한 조건하에서 배양되고 배양 배지는 선택 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 염색체외 발현 벡터는 원핵 숙주 세포에서 염색체외 발현 벡터를 복제하기에 적합한 복제 기원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 두 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 서로에 대해서 연결된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 이종이량체의 단량체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 제1 사슬 및 제2 사슬이 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 절반 항체다. 일부 구현예에서, 절반 항체는 특이적으로 항원을 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 분비 단백질이다. 일부 구현예에서, 분비 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 제거된다. 일부 구현예에서, 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리움이다. 일부 구현예에서, 그람-음성 박테리움은 E. 콜리이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 향상된 LacI 생산 또는 활성을 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 lacI ^Q 돌연변이를 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 균주 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (IlvG+; Valr) Δprc spr43H1 ΔmanA lacI ^Q ΔompT ΔmenE742 degPS210A의 것이다.

또 다른 양태에서, 제1 항원을 결합할 수 있는 제1 절반 항체 및 제2 항원을 결합할 수 있는 제2 절반 항체를 포함하는 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은: 임의의 하나의 상기 구현예의 방법에 따른 제1 절반 항체를 생산하는 단계로서, 상기 제1 번역 단위는 제1 절반 항체의 중쇄를 인코딩하고 제2 번역 단위는 제1 절반 항체의 경쇄를 인코딩하고, 상기 제1 절반 항체는 적어도 하나의 놉-형성 돌연변이를 포함하는, 단계; 임의의 하나의 상기 구현예의 방법에 따른 제2 절반 항체를 생산하는 단계로서, 상기 제1 번역 단위는 제2 절반 항체의 중쇄를 인코딩하고 제2 번역 단위는 제2 절반 항체의 경쇄를 인코딩하고, 상기 제2 절반 항체는 적어도 하나의 홀-형성 돌연변이를 포함하는, 단계; 및 이중특이적 항체를 생성하도록 제1 절반 항체를 제2 절반 항체와, 환원 조건하에서, 조합시키는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이한 항원이다. 일부 구현예에서, 방법은 환원 조건을 달성하기 위해 환원제를 부가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 환원제는 글루타티온이다.

또 다른 양태에서, 숙주 세포 염색체를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 원핵 숙주 세포)가 본원에 제공되며, 여기서 원핵 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제1 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제1 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제1 번역 단위의 전사를 유도하고, 제1 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임; 및 (2) 단백질 이황화물 산화환원효소를 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제2 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제2 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제2 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제2 번역 단위의 전사를 유도하고, 제2 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임.

일부 구현예에서, 제1 번역 단위 및 제2 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 원핵 숙주 세포 염색체에 타고난다. 일부 구현예에서, 제1 번역 단위 및 제2 번역 단위 둘 모두는 원핵 숙주 세포 염색체에 타고난다. 일부 구현예에서, 제1 번역 단위 및 제2 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 원핵 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 제1 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 유도성 프로모터는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 프로모터는 제1 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제1 구성적 프로모터는 CP25 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 제2 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 유도성 프로모터는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 프로모터는 제2 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 구성적 프로모터는 CP25 프로모터이다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이다. 일부 구현예에서, FkpA는 E. 콜리 FkpA이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이며, 상기 제1 프로모터는 CP25 프로모터이고, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이고, 상기 제2 프로모터는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이며, 상기 제1 프로모터는 Pho 프로모터이고, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이고, 상기 제2 프로모터는 Pho 프로모터이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 추가로 다음을 포함한다: (3) 제2 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제3 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하고, 제3 번역 단위 및 제3 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임. 일부 구현예에서, 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA이다. 일부 구현예에서, 제3 프로모터는 제3 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제3 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이고, 상기 제1 프로모터는 CP25 프로모터이고, 상기 제1 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이고, 상기 제2 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이고, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질이고, 그리고 상기 제3 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리움이다. 일부 구현예에서, 그람-음성 박테리움은 E. 콜리이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 내인성 프로테아제 활성이 결여된 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 향상된 LacI 생산 또는 활성을 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 lacI ^Q 돌연변이를 갖는 균주이다. 일부 구현예에서, E. 콜리 는 균주 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (IlvG+; Valr) Δprc spr43H1 ΔmanA lacI ^Q ΔompT ΔmenE742 degPS210A이다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함하는 염색체외 발현 벡터를 추가로 포함한다: (a) 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 염색체외 번역 단위를 포함하는 제1 염색체외 폴리뉴클레오타이드; 및 (b) 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 염색체외 번역 단위를 포함하는 제2 염색체외 폴리뉴클레오타이드; 이에 의해 발현시 두 사슬은 숙주 세포에 생물학적 활성 2-사슬 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합됨. 일부 구현예에서, 염색체외 발현 벡터는 원핵 숙주 세포에 염색체외 발현 벡터를 복제하기에 적합한 복제 기원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 염색체외 발현 벡터는 선택 제제에 대한 내성을 촉진하는 선택가능한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2-사슬 폴리펩타이드의 두 사슬은 서로에 대해서 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 2-사슬 폴리펩타이드는 이종이량체의 단량체이다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 제1 사슬 및 제2 사슬이 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 절반 항체이다. 일부 구현예에서, 절반 항체는 특이적으로 항원을 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 2-사슬 폴리펩타이드는 분비 단백질이다. 일부 구현예에서, 분비 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. 일부 구현예에서, 염색체외 발현 벡터는 2-사슬 폴리펩타이드의 제3 사슬을 인코딩하는 제3 염색체외 번역 단위를 포함하는 제3 염색체외 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 이에 의해 발현시 세 사슬은 숙주 세포에 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합된다. 일부 구현예에서, 제1 염색체외 번역 단위는 면역글로불린 중쇄를 인코딩하고, 상기 제2 염색체외 번역 단위 면역글로불린 경쇄를 인코딩하고, 상기 제3 염색체외 번역 단위는 면역글로불린 Fc 단편을 인코딩하고, 그리고 여기서 세 사슬은 생물학적 활성 1가 항체를 형성하도록 접히고 조합된다. 일부 구현예에서, 1가 항체는 특이적으로 항원을 결합할 수 있다.

본원에 기재된 다양한 구현예의 특성들 중 하나, 일부 또는 모든 특성이 조합되어 본 개시내용의 다른 구현예들을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용의 이들 및 다른 측면은 당해 분야의 숙련가에게 분명해질 것이다. 본 개시내용의 이들 및 다른 구현예는 다음에 이어지는 상세한 설명에 의해 더욱 설명된다.

도 1은 동일한 샤페론 단백질의 염색체 과발현을 갖는 숙주 세포에서 2-사슬 단백질 제품의 발현을 위한 발현 벡터 (CS392; 우측)에 비하여, 샤페론 단백질 및 2-사슬 단백질 제품을 과발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 (MD156; 우측) (이 경우에, 항체 또는 항체 단편 중쇄 및 경쇄; 각각 "HC" 및 "LC")의 플라스미드 맵을 도시한다. 벡터 크기는 염기쌍, bp로 제공된다.
도 2는 FkpA의 플라스미드-기반 발현을 갖는 균주에 비하여, 표시된 프로모터-fkpA 짝짓기를 갖는 균주의 역가 (블랙) 및 FkpA 발현 수준 (회색)을 도시한다.
도 3a-3c는 진탕 플라스크에 표시된 균주에서 DsbA (도 3a), DsbC (도 3b), 또는 FkpA (도 3c)의 상대적인 샤페론 발현 수준 (천연 발현 수준에 비한 배수)을 도시한다. Sh.Fl.은 진탕 플라스크 배양을 나타내고, +는 양성 대조군 (플라스미드 샤페론 발현)을 나타내고, -는 음성 대조군 (무 샤페론 발현)을 나타내고, 그리고 Sh. Fl. (-)는 천연 발현 수준을 지칭한다.
도 4a-4c는 10L 발효로부터 표시된 균주에서 DsbA (도 4a), DsbC (도 4b), 또는 FkpA (도 4c)의 상대적인 샤페론 발현 수준 (천연 발현 수준에 비한 배수)을 도시한다. +는 양성 대조군 (플라스미드 샤페론 발현)을 나타내고, -는 음성 대조군 (무 샤페론 발현)을 나타내고, 그리고 Ambr (-)는 천연 발현 수준을 지칭한다.
도 5는 플라스미드 및 천연 샤페론 유전자좌의 표시된 염색체로 조작된 쌍을 갖는 균주에 의해 생산된 xIL13 역가 (g/L)를 도시한다. 67A6/MD157은 표시된 프로모터 하에서 표시된 샤페론을 발현하는 MD157 플라스미드를 가지고 염색체 엔지니어링을 갖니 않는 균주를 지칭한다(MD157 플라스미드의 다이어그램에 대해 도 1 참고).
도 6a & 6b는 xIL13을 생산하는 표시된 균주/플라스미드 조합의 배양 시간이 지남에 따른 광학 밀도 (OD; 도 6a) 및 삼투질농도 (도 6b)를 도시한다.
도 7a-7c는 시간이 지남에 따라 표시된 균주에 의해 생산된 xIL13 역가 (g/L; 도 7a), DsbC 농도 (도 7b), 및 FkpA 농도 (도 7c)를 도시한다.
도 8a & 8b는 AF2를 생산하는 표시된 균주/플라스미드 조합의 배양 시간이 지남에 따른 광학 밀도 (OD; 도 8a) 및 삼투질농도 (도 8b)를 도시한다.
도 9는 시간이 지남에 따라 표시된 균주에 의해 생산된 AF2 역가 (g/L)를 도시한다.
도 10a & 10b는 MetMAb를 생산하는 표시된 균주/플라스미드 조합의 배양 시간이 지남에 따른 광학 밀도 (OD; 도 10a) 및 삼투질농도 (도 10b)를 도시한다.
도 11은 시간이 지남에 따라 표시된 균주에 의해 생산된 MetMAb 역가 (g/L)를 도시한다.
도 12a & 12b는 항-VEGF 항체 단편을 생산하는 표시된 균주/플라스미드 조합의 배양 시간이 지남에 따른 광학 밀도 (OD; 도 12a) 및 삼투질농도 (도 12b)를 도시한다.
도 13은 시간이 지남에 따라 표시된 균주에 의해 생산된 항-VEGF 항체 단편 역가 (g/L)를 도시한다.

상세한 설명

본 개시내용은 재조합 2-사슬 단백질 제품의 대규모 생산에 적합한 통합된 비-천연 프로모터:샤페론 단백질 조합(들)을 갖는 숙주 세포 (예를 들어, 원핵 숙주 세포), 뿐만 아니라 이에 관련된 방법을 제공한다. 본원에 제공된 실시예들은 숙주 세포 염색체로부터 샤페론 단백질을 발현하는 원핵 숙주 세포가 플라스미드-기반 샤페론 발현에 견줄만한 역가를 생성한다는 것을 입증한다. 이들 결과는 다수의 항체 포맷, 예컨대 절반-항체, 한팔 항체, 및 항체 단편에 걸쳐 일관되었고, 추가의 공정 개발이 거의 요구되지 않았다. 중요하게는, 본원에 제시된 데이터는 플라스미드보다는 숙주 세포 염색체로부터 샤페론 발현이 동등하거나 더 높은 생성물 역가이지만 (잠재적으로 생성물로부터 샤페론 단백질을 제거하기 위해 추가의 다운스트림 정제에 대한 필요성을 제거하는) 더 낮은 샤페론 발현 수준을 초래한다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 샤페론 발현 플라스미드와 샤페론 단백질을 제거하기 위해 다운스트림 정제 단계들을 최적화하기 위한 상향하는 시간 및 비용을 요함이 없이, 플라스미드로부터 샤페론 단백질(들)을 발현하는 숙주 세포를 사용하는 것에 비하여 본 개시내용의 숙주 세포 및/또는 방법을 사용하여 적어도 효율적으로 산업적 규모로 생성물이 생산될 수 있다는 것을 입증한다.

일 양태에서, 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포에 두 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 폴리펩타이드의 두 사슬의 발현에 적합한 조건하에서 배양 배지에서 폴리펩타이드의 두 사슬을 발현하고, 이에 의해 발현시 두 사슬 숙주 세포에 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합되도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 제거하는 단계를 포함하며; 상기 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부임; 및 (3) 펩티딜-프롤릴 이성화효소 및 단백질 이황화물 산화환원효소로 구성된 군으로부터 선택된 샤페론 단백질을 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하고, 여기서 제3 번역 단위 및 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임.

또 다른 양태에서, 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포에 두 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 폴리펩타이드의 두 사슬의 발현에 적합한 조건하에서 배양 배지에서 폴리펩타이드의 두 사슬을 발현하고, 이에 의해 발현시 두 사슬 숙주 세포에 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합되도록 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 제거하는 단계를 포함하며; 상기 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부임; (3) 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하고, 여기서 제3 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임; 및 (4) 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드, 상기 제4 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제4 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제2 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제4 번역 단위의 전사를 유도하고, 여기서 제4 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임.

또 다른 양태에서, 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공되며, 상기 원핵 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 상기 제1 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제1 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제1 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제1 번역 단위의 전사를 유도하고, 여기서 제1 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임; 및 (2) 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 상기 제2 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고, 상기 제2 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 통합된 제2 프로모터와 작동 가능한 조합으로 되고 제2 번역 단위의 전사를 유도하고, 여기서 제2 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연임.

I. 정의

본 개시내용을 상세히 설명하기 전에, 본 개시내용은 당연히 달라질 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않는다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예들을 설명하기 위한 목적이며, 한정하려는 것은 아님을 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 별도로 다르게 지시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "분자"에 대한 언급은 2개 이상의 상기 분자들의 조합 등을 선택적으로 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에게 용이하게 공지된 개별 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터 지칭은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 구현예를 포함한다(그리고 기재한다). 최대로, 값과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 그 값의 90% 내지 110%를 포괄한다(예를 들어, 약 1.0 내지 약 3.0의 제1 및 제2 TIR의 상대적인 번역 강도는 0.9 내지 3.3의 범위인 상대적인 번역 강도를 지칭한다).

본원에서 설명된 발명의 양상과 구현예는 "포함하는," "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는" 양상과 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "두 사슬을 포함하는 폴리펩타이드" (용어들 "두 사슬 단백질" 및 "두 사슬 폴리펩타이드"는 또한 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있음)는 하나 초과의 별개의 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 임의의 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 두 사슬 단백질은 비제한적으로 이황화물 결합을 포함한, 하나 이상의 분자간 연결기를 통해 함께 연결된 둘 이상의 폴리펩타이드의 거대분자 복합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 두 사슬 단백질은 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 두 별개의 폴리펩타이드 사슬 (예를 들어, 항체 중쇄 및 항체 경쇄)에 속하는 아미노산 서열을 갖는 단일 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이 경우에, 두 사슬 단백질은 물리적으로 단일 사슬을 나타낼 수 있으나, 단일 사슬의 둘 이상의 부분은 그들이 2개의 별도의 단백질 사슬인 것처럼 기능적으로 거동할 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 항체는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결되지만, 그럼에도 불구하고 그들이 분자간 연결기 (예를 들어, 하나 이상의 이황화물 결합)에 의해서만 회합된 별도의 폴리펩타이드인 것처럼 접히고 조합되는 기능적 중쇄 및 기능적 경쇄를 포함할 수 있다.

하나 이상의 유전 인자 (예를 들어, 프로모터, 번역 단위, 또는 이들의 조합)와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "천연" 및 "비-천연"은 자연에서 발생할 때 숙주 세포 염색체에서 유전 인자의 게놈 문맥을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 번역 단위가 숙주 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하는 때 번역 단위는 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 관하여 "천연"이고, 번역 단위가 숙주 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하지 않을 때 "비-천연"이다. 프로모터는 프로모터가 숙주 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하는 때 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 관하여 "천연"이고, 프로모터가 숙주 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하지 않을 때 "비-천연"이다. 번역 단위와 프로모터의 작동 가능한 조합은 프로모터가 번역 단위와 동일한 작동 가능한 연결에서 숙주 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하지 않을 때 "비-천연"이거나, 또는 그 반대이다. 예를 들어, 프로모터:번역 단위 조합은 프로모터 및 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두가 숙주 세포 게놈에 천연적으로 존재하지 않는 때, 프로모터가 (동일한 프로모터 서열이 숙주 세포 게놈에 다른 곳에 천연적으로 존재하더라도) 천연 발생 숙주 세포 게놈에서 작동 가능하게 조합되지 않은 번역 단위와 작동 가능한 연결로 숙주 세포 게놈에 존재할 때, 또는 번역 단위가 (동일한 번역 단위 서열이 숙주 세포 게놈에 다른 곳에 천연적으로 존재하더라도) 천연 발생 숙주 세포 게놈에서 작동 가능하게 조합되지 않은 프로모터와 작동 가능한 연결로 숙주 세포 게놈에 존재할 때, 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 관하여 "비-천연"이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이것이 결합되는 또다른 핵산을 이송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 파아지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내에 결찰될 수 있다. 특정 벡터 (예를 들면, 박테리아 복제 기원 및 에피솜 포유류 벡터를 갖는 박테리아 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적 복제를 할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 그리고 그에 따라 호스트 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히, "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 된다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용된 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시스트론"은 폴리펩타이드 사슬 및 인접한 조절 영역에 대해 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 번역 단위에 광범위하게 동등한 유전 인자를 지칭하는 것으로 의도된다. "시스트론"은, 예를 들어, 하나 이상의 오픈-리딩 프레임, 번역 개시 영역 (TIR; 아래 본원에서 정의된 바와 같음), 신호 서열 및 종료 영역을 포함할 수 있다.

"폴리시트론성" 발현 벡터는 하나의 단일 프로모터의 조절성 제어하에서 다수의 시스트론을 함유하고 발현하는 단일 벡터를 지칭한다. 폴리시트론성 벡터의 공통적인 예는 하나의 프로모터의 제어하에서 2개의 상이한 폴리펩타이드를 함유하고 발현하는 "디시스트론성" 벡터이다. 디시스트론성 또는 폴리시트론성 벡터의 발현시, 다중 유전자는 먼저 단일 전사 단위로 전사되고, 그 다음 별도로 번역된다.

"전사 단위"는 단일 RNA 전사체로서 전사된 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. "번역 단위"는 인코딩하고, 번역될 때, 폴리펩타이드를 생산하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기에 기재된 바와 같이, 폴리시트론성 폴리뉴클레오타이드는 다수의 번역 단위를 갖는 단일 전사 단위를 함유할 수 있다.

본 개시내용에 따른 "별도 시스트론" 발현 벡터는 적어도 2개의 별도 프로모터-시스트론 쌍을 포함하는 단일 벡터를 지칭하며, 여기서 각 시스트론은 그것의 자체 프로모터의 제어 하에 있다. 별도 시스트론 발현 벡터의 발현시, 상이한 유전자의 전사 및 번역 과정 둘 모두는 별도이고 독립적이다.

본원에서 사용된 바와 같이 "샤페론 단백질"은 비제한적으로 두 사슬 단백질을 포함하는 다른 거대분자의 폴딩 또는 어셈블리를 돕는 임의의 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 샤페론 단백질은 많은 상이한 메커니즘에 의해 작용하여 단백질 폴딩 또는 어셈블리를 증진할 수 있다. 예를 들어, 샤페론 단백질은 단백질 폴딩 및/또는 어셈블리를 증진하고, 사슬내 이황화물 결합의 형성을 촉매하고, 단백질 비-폴딩 및/또는 비어셈블리 (예를 들어, 응집된 또는 미스폴딩된 단백질 또는 다중단백질 복합체의 것)를 증진하고, 응집을 방지하고, 단백질 분해, 등에 도움이 될 수 있다.

"분비 신호 서열" 또는 "신호 서열"은 세포 멤브레인, 일반적으로 원핵생물의 내막 또는 내부 및 외부 멤브레인 둘 모두를 통해 관심 있는 새로 합성된 단백질에 지향하기 위해 사용될 수 있는 짧은 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 이와 같이, 관심 있는 단백질 예컨대 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 폴리펩타이드는 원핵 숙주 세포의 주변세포질 안으로 또는 배양 배지 안으로 분비된다. 분비 신호 서열에 의해 인코딩된 신호 펩타이드는 숙주 세포에 내인성일 수 있거나, 이들은 발현되는 폴리펩타이드에 고유한 신호 펩타이드를 포함하여, 비-내인성일 수 있다. 분비 신호 서열은 전형적으로 발현되는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하고, 전형적으로 세포질로부터 폴리펩타이드의 생합성과 분비 사이에서 효소적으로 제거된다. 따라서, 신호 펩타이드는 일반적으로 성숙한 단백질 제품에는 존재하지 않는다.

"작동 가능하게 연결된"은 둘 이상의 구성요소의 병치를 지칭하며, 여기서 그렇게 기재된 구성요소는 이들을 그것의 의도된 방식으로 기능하게 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터는 연결된 서열의 전사를 제어 또는 조절하기 위해 시스에서 작용한다면 코딩 서열 또는 번역 단위에 작동 가능하게 연결된다. 그러나 반드시 그런 것은 아니지만, 일반적으로, "작동 가능하게 연결된" DNA 서열은 인접하고, 두 단백질 코딩 영역을 결합하는 것이 필요하거나 분비성 리더의 경우에는, 인접하고 해독틀에 있다. 그러나, 작동 가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 코딩 서열 또는 번역 단위의 업스트림에 위치되더라도, 그것과 반드시 인접하지는 않는다. 작동 가능하게 연결된 증진제는 코딩 서열/번역 단위의 업스트림, 그 안 또는 다운스트림 및 프로모터로부터 상당한 거리에 위치될 수 있다. 연결은 재조합 당해 분야에서 알려진 방법에 의하여, 예를 들어, 편리한 제한 부위에서 어닐링, 또는 결찰에 의한 PCR 방법론을 사용하여 달성된다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 종래의 실시에 따라 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이 "조절 인자"는 이종성 폴리펩타이드를 폴리펩타이드로 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역에 필요한, 시스에 존재하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 전사 조절 인자는 정상적으로 발현되는 유전자 서열의 프로모터 5', 전사 개시 및 말단 부위, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 포함한다. 용어 "전사 시작 부위"는 1차 전사체, 즉, mRNA 전구체 안으로 혼입된 제1 핵산에 상응하는 작제물에서 핵산을 지칭하고; 전사 시작 부위는 프로모터 서열과 중첩할 수 있다.

"프로모터"는 그것이 작동 가능하게 연결된 유전자 또는 서열의 전사를 제어하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 프로모터는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시에 대한 신호를 포함한다. 사용된 프로모터는 선택된 서열의 발현이 고려되는 숙주 세포의 세포 유형에서 기능성일 것이다. 다양한 상이한 공급원으로부터 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함한 다수의 프로모터가 당해 분야에서 잘 알려져 있고 (그리고 데이터베이스 예컨대 유전자은행에서 확인되고) 클로닝된 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 보관소 예컨대 ATCC 뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개별 공급원에서 나옴)로 또는 그 안에서 이용가능하다. 유도성 프로모터로는, 프로모터의 활성이 신호, 예를 들어, IPTG의 존재 또는 포스페이트 고갈에 반응하여 증가 또는 감소한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포" (또는 "재조합 숙주 세포")는 외인성 또는 비-천연 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 재조합 플라스미드 또는 벡터의 도입에 의해 유전적으로 변경되었거나, 유전적으로 변경될 수 있는 세포를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러한 용어들은 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향에 기인하여 계속되는 생성에서 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실상 모 세포에 동일하지 않을 수 있지만 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.

용어 "약학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태이고, 상기 제형이 투여될 대상체에 허용 불가능하게 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 상기 제형은 무균성이다. "약학적으로 허용가능한" 부형제(비히클, 첨가제)는 유효량의 활성 성분을 제공하기 위해 대상체 포유동물에 합리적으로 투여될 수 있는 부형제이다.

치료의 목적을 위한 "대상체" 또는 "개체"는, 인간, 가축 및 경작용 동물, 동물원, 스포츠, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 등을 포함한 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.

본원의 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로 단클론 항체(전장 단클론 항체를 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 항체 단편을 포함한다.

"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 식별되고, 분리되고/거나 복구된 항체이다. 이의 천연 환경의 오염물질 성분들은 상기 항체에 대한 연구, 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 (1) 예를 들어, Lowry법으로 결정시 항체의 95 중량% 초과까지, 일부 구체예에서, 99 중량% 초과까지; (2) 예를 들어, 회전 컵 시퀀싱 장치를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성에 도달하도록 정제된다. 단리된 항체는 상기 항체의 천연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에 자체적으로 항체를 포함한다. 통상적으로, 그러나, 단리된 항체는 적어도 1종의 정제 단계에 의해 제조된다.

"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경(L) 쇄 및 2개의 동일한 중(H) 쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 다이설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 다이설파이드 연결부의 수는 상이한 면역글로불린 아이소형의 중쇄에 따라 다르다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적 간격의 사슬내 다이설파이드 브릿지를 가진다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인을(VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 상기 경쇄의 불변 도메인은 상기 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 상기 경쇄 가변 도메인은 상기 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인들 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "불변 도메인"은, 항원 결합 부위를 함유하는, 면역글로불린의 다른 부분, 즉 가변 도메인에 비하여 상대적으로 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 상기 불변 도메인은 상기 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (총괄하여, CH) 및 상기 경쇄의 CHL(또는 CL) 도메인을 함유한다.

항체의 상기 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 지칭한다. 상기 중쇄의 상기 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 상기 경쇄의 상기 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원-결합 부위를 포함한다.

용어 "가변"은 상기 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 중에 서열에 있어서 광범위하게 상이하고 특정한 항원에 대한 각각의 특정한 항체의 결합 및 특이성에 있어서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 고르게 분포되지 않는다. 상기 가변성은 상기 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변성 영역(HVR)으로 불리는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인들 중 보다 많이 보존되는 부분들을 프레임워크 영역 (FR)이라 한다. 고유의 중쇄 및 경쇄의 각 가변 도메인은 3개의 HVR에 의해 연결된, 대체로 베타-쉬트 배위를 취하는 4개의 FR 영역들을 포함하며, 그리고 이는 루프 연결을 만들고, 일부 경우에는 베타-쉬트 구조의 일부가 된다. 각 사슬에서 HVR은 FR 영역들에 의해 근접하게, 그리고 다른 사슬의 HVR과 함께 유지되며, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(참고 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). 불변 도메인은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체 의존성 세포 독성에서의 항체의 참여와 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.

임의의 포유동물 종으로부터의 항체들(면역글로불린)의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여, 카파("κ") 및 람다("λ")로 불리는 2개의 명확히 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 IgG "이소형" 또는 "하위부류"는 이의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 하위부류를 의미한다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체들 (면역글로불린)은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류인: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 중 몇 가지는 하위부류(이소형), 예컨대, IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및IgA2로 추가로 세분화될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, γ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 하부단위 구조 및 3차원 입체 배위는 잘 알려져 있고 일반적으로, 예를 들어, Abbas 등 Cellular and Mol . Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)에 기재되어 있다. 항체는 상기 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티이드와의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성된 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.

본원에서 사용된 용어들 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 상호교환적으로 아래에서 정의된 바와 같이 항체 단편이 아닌 이의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭한다. 상기 용어들은 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.

본원의 목적을 위해 "네이키드 항체(기존의 항체)"는 세포독성 모이어티 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체이다.

"항체 단편"은 바람직하게는 이의 항원-결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 단편은 항원-결합 단편이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체(선형 항체); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

항체의 파파인 분해는, "Fab" 단편이라 불리는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 그 명칭이 쉽게 결정화하하는 능력을 반영한 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.

"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 일 구현예에서, 2-쇄 Fv 종은 밀접한 비-공유 결합으로 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일 사슬 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩티드 연결기에 의해 공유 연결되어, 이러한 경쇄와 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 결합될 수 있다. 이러한 구성에서 각 가변 도메인의 3개 HVR이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면 상의 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로 6개의 HVR은 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 HVRs를 포함하는 Fv의 절반)은 비록 전체 결합 부위보다 친화력이 더 낮기는 하지만, 여전히 항원을 인지하고, 이에 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 상기 경쇄의 불변 도메인 및 상기 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편들은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인들의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편들은 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 상기 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편들은 항체의 VH 및 VL 도메인들을 포함하며, 상기 도메인들은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 상기 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 연결기를 더 포함하는데, 이 연결기는 상기 scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 한다. sFv에 대한 검토를 위해서는, 예컨대, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315를 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 상기 단편들은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없는 연결기를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, Nat. Med . 9:129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993)에서 더욱 충분히 설명된다. 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson 등, Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체군으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 예컨대, 상기 군을 포함하는 개별 항체들은 가능한 돌연변이, 예컨대, 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단클론"은 별개 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 상기 단클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 상기 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적-결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선택 과정은 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 복수의 클론으로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선하고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양에서 이의 생산을 개선하고, 생체내 그것의 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체 등을 생성하기 위해 추가로 변경될 수 있으며, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체는 또한 본 개시내용의 단클론성 항체임을 이해하여야 한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 단클론성 항체 제제의 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 이외에도, 단클론 항체 제제는 통상적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.

수식어 "단클론성"은 항체의 특징을 실질적으로 균일한 항체군으로부터 수득되는 것으로 나타내고 임의의 특정 방법에 의한 상기 항체의 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용될 단클론성 항체는, 예를 들어 원핵 숙주 세포에서 발현, 하이브리도마 방법을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo 등, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 등, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(예컨대, 미국 특허 제 4,816,567호를 참조), 파지-디스플레이 기술(예컨대, Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Sidhu 등, J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)를 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 부호화하는 유전자 또는 인간 면역글로불린 좌위의 일부 또는 전체를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하기 위한 기술(예컨대, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits 등, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann 등, Year in Immunol . 7:33 (1993); 미국 특허 제 5,545,807호; 5,545,806호; 5,569,825호; 5,625,126호; 5,633,425호; 및 5,661,016; Marks 등, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg 등, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild 등, Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995))에 의해 제조될 수 있다.

본원에서 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 상동하는 반면, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 대응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 상동하는 "키메라" 항체뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 상기 항체의 단편들 역시도 포함한다(예컨대, 미국 특허 제 4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984)를 참조한다). 키메라 항체는 상기 항체의 항원-결합 영역이, 예컨대, 짧은꼬리 원숭이를 관심 항원으로 면역화시킴으로써 생성된 항체로부터 유래된 PRIMATTZED^® 항체를 포함한다.

비인간(예컨대, 쥣과) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및/또는 수용력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우들에서, 상기 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 대응하는 비-인간 잔기들에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형들은 항체 성능을 추가로 정련하기 위해 제조될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 이뮤노글로불린의 것에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 상기 인간화 항체는 또한 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함하게 된다. 추가적인 세부 사항에 대해서는, 예컨대, Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992)을 참조한다. 또한, 예컨대 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc . Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr . Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 제 6,982,321호 및 7,087,409호를 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 대응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 기술들 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리(phage-display library)를 포함하여, 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol ., 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol ., 222:581 (1991). 인간 단일클론 항체의 제조를 위해, Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner 등, J. Immunol ., 147(1):86-95 (1991)에서 설명된 방법이 또한 입수 가능하다. 또한, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol ., 5: 368-74 (2001)를 참조한다. 인간 항체는 항원 유발에 반응하여 상기 항체를 생성하도록 변형되어 있으나, 이의 내인성 좌위는 비활성화(disabled)되어 있는 유전자도입 동물, 예컨대, 면역화된 제노마우스에 상기 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예컨대, XENOMOUSE?? 기술에 관한 미국 특허 제 6,075,181호 및 6,150,584호를 참조). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 생성된 인간 항체에 관하여, 예를 들어, Li 등, Proc. Natl. Acad. Sc i . USA , 103:3557-3562 (2006)를 참조한다.

"종-의존성 항체"는 제2 포유동물 종 유래의 항원의 상동체에 대해서보다 제1 포유동물 종 유래의 항원에 대해 보다 강한 결합 친화성을 갖는 항체이다. 일반적으로, 상기 종-의존성 항체는 인간 항원(예컨대, 약 1 x 1x10^-7 M 이하, 바람직하게는, 약 1 x 1x10^-8 M 이하, 및 가장 바람직하게는 약 1 x 1x10^-9 M 이하의 결합 친화성(Kd) 값을 갖는)에 "특이적으로 결합"하지만 상기 인간 항원에 대한 결합 친화성 보다 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1000배 약한 제2 비인간 포유동물 종 유래의 항원의 상동체에 대해 결합 친화성을 갖는다. 상기 종-의존성 항체는 상기 정의된 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있지만, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.

본원에서 사용될 때, 용어 "초가변 영역", "HVR," 또는 "HV"는 서열에서 초가변성이고/거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 자연 항체에서, H3 및 L3은 6 개 HVR의 가장 큰 다양성을 나타내며, H3은 특히 항체에 대해 미세한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 예컨대, Xu 등, Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)을 참조한다. 실제로 중쇄로만 구성된 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄가 없을 때 기능적이고 안정적이다. 예컨대, Hamers-Casterman 등, Nature 363:446-448 (1993); Sheriff 등, Nature Struct . Biol . 3:733-736 (1996)를 참조한다.

많은 HVR 설명이 사용되고 있이며, 본원에 포함된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역(CDRs)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 흔히 사용된다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 코티아(Chothia)는 대신에 구조적 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 카바트 HVR 및 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내며, 옥스포드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체-모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기들을 하기에 나타낸다.

HVR은 아래와 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2) 및 89-97 또는 89-96(L3) 및 VH에서 26-35(H1), 50-65 또는 49-65(H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102(H3). 가변 도메인 잔기들은 이들 정의 각각에 대해 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.

용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 이의 변형은 상기 Kabat 등에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이것 내로 삽입에 상응하는 더욱 적은 또는 추가 아미노산을 내포할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예컨대, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. Kabat의 잔기 넘버링은 "표준" Kabat 넘버링 서열과 항체의 서열의 상동성 영역을 정렬하여 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.

상기 카밧 넘버링 시스템은 가변 도메인 내 잔기(대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)에 대하여 지칭할 때 일반적으로 사용된다(예를 들어, Kabat 등, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다(예컨대, 상기 Kabat 등에서 보고된 EU 지수). "Kabat에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 나타낸다.

표현 "선형 항체"는 Zapata 등 (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게, 상기 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께, 항원-결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fd 분절(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

II. 숙주 세포

프로모터 및 번역 단위의 조합이 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 비-천연이 되도록, 번역 단위의 전사를 유도하는 프로모터 (또한 숙주 세포 염색체의 일부)와 작동 가능한 조합 또는 연결에서 적어도 하나의 샤페론 단백질 (예를 들어, 펩티딜-프롤릴 이성화효소 또는 단백질 이황화물 산화환원효소)을 인코딩하는 번역 단위를 포함하는 숙주 세포 염색체를 갖는 숙주 세포 (예를 들어, 원핵 숙주 세포)가 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 숙주 세포 염색체는 다음을 포함한다: (1) 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및 (2) 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드; 상기 제1 및 제2 번역 단위는 숙주 세포 염색체 중 일부이고 각각 제1 및 제2 번역 단위의 전사를 구동하는 제1 및 제2 (각각) 프로모터 (또한 숙주 세포 염색체의 일부)와 작동 가능한 조합 또는 연결로 됨. 일부 구현예에서, 제1 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합 및/또는 제2 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 예를 들어, 프로모터 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 비-천연일 수 있고, 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 비-천연일 수 있고, 또는 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 천연일 수 있으나 숙주 세포 염색체에 비-천연인 조합으로 프로모터와 작동 가능하게 조합된다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 둘 이상의 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드; 및 (3) 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 프로모터와 작동 가능한 조합으로 샤페론 단백질 (예를 들어, a 펩티딜-프롤릴 이성화효소 또는 단백질 이황화물 산화환원효소)을 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 (즉, 제1 및 제2 번역 단위를 각각 인코딩함)는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들) (예를 들어, 플라스미드(들)) 중 일부이고, 제3 폴리뉴클레오타이드 (및 회합된 프로모터)는 숙주 세포 염색체 중 일부이다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드; (3) 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 프로모터와 작동 가능한 조합으로 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드; 및 (4) 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 프로모터와 작동 가능한 조합으로 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 그것의 회합된 프로모터의 조합 및/또는 제4 번역 단위 및 그것의 회합된 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 (즉, 제1 및 제2 번역 단위를 각각 인코딩함)는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들) (예를 들어, 플라스미드(들))의 일부이고, 제3 및 제4 폴리뉴클레오타이드 (및 회합된 프로모터)는 숙주 세포 염색체의 일부이다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드; (3) 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 제1 프로모터와 작동 가능한 조합으로 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드; 및 (4) 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 제2 프로모터와 작동 가능한 조합으로 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합 및/또는 제4 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 (즉, 제1 및 제2 번역 단위를 각각 인코딩함)는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들) (예를 들어, 플라스미드(들)) 중 일부이고, 제3 및 제4 폴리뉴클레오타이드 (및 회합된 프로모터)는 숙주 세포 염색체 중 일부이다.

일부 구현예에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다: (1) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; (2) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드; (3) 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 제 1 프로모터와 작동 가능한 조합으로 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드; (4) 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 제2 프로모터와 작동 가능한 조합으로 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드; 및 (5) 제5 번역 단위의 전사를 유도하는 제3 프로모터와 작동 가능한 조합으로 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제5 번역 단위를 포함하는 제5 폴리뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 제3 번역 단위 및 제1 프로모터의 조합, 제4 번역 단위 및 제2 프로모터의 조합, 및/또는 제5 번역 단위 및 제3 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 비-천연이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 (즉, 제1 및 제2 번역 단위를 각각 인코딩함)는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들) (예를 들어, 플라스미드(들)) 중 일부이고, 제3, 제4, 및 제5 폴리뉴클레오타이드 (및 회합된 프로모터)는 숙주 세포 염색체 중 일부이다.

일부 구현예에서, 샤페론 단백질 (예를 들어, 펩티딜-프롤릴 이성화효소 또는 단백질 이황화물 산화환원효소)을 인코딩하는 본 개시내용의 번역 단위의 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포 염색체에 타고난다. 예를 들어, 샤페론 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 번역 단위는 천연 샤페론 단백질 유전자 또는 유전자좌일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 숙주 세포 염색체에 비-천연인 프로모터:번역 단위 조합을 생성하는, 천연 샤페론 단백질 유전자 또는 유전자좌와 작동 가능한 조합으로 되도록 숙주 세포 게놈 안으로 (예를 들어, 하나 이상의 천연 조절성 서열 또는 유전 인자 안으로 삽입 또는 대체에 의해) 삽입되었다.

다른 구현예에서, 샤페론 단백질 (예를 들어, 펩티딜-프롤릴 이성화효소 또는 단백질 이황화물 산화환원효소)을 인코딩하는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 번역 단위는 숙주 세포에 비-천연이다(예를 들어, 숙주 세포 안으로 염색체로 통합된다).

일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 천연 번역 단위(들) 및 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 비-천연 번역 단위(들)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 다수의 비-천연 번역 단위(들)를 포함할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 많은 숙주 세포는 다수의 샤페론 단백질을 인코딩하는 숙주 세포 염색체 (예를 들어, E. 콜리의FkpA, DsbA, 및 DsbC)를 함유하는 것으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 천연 번역 단위(들) 중 하나 이상은 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 비-천연인 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능하게 조합된다.

숙주 세포 (예를 들어, 원핵 숙주 세포) 안으로 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 번역 단위를 도입하는 방법은 당해 기술에 알려져 있다. 예시적인 방법, 대립유전자 교환이 아래에 더 상세히 기재되어 있다. 유익하게는, 대립유전자 교환 방법은 숙주 세포 게놈 상에 "반흔"을 남기지 않는다. 다른 방법은, 비제한적으로, 하기에 기재된 방법을 포함한다: Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. (2000) Proc . Natl. Acad. Sci. 97:6640-6645.

임의의 상기 구현예 중 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제3 사슬을 인코딩하는 번역 단위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 번역 단위는 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 및/또는 제2 사슬을 인코딩하는 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 2-사슬 폴리펩타이드는 생물학적 활성 1가 항체 (예를 들어, 특이적으로 항원을 결합할 수 있는 1가 항체)를 형성하도록 조합하는, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 및 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 한팔 항체이다.

샤페론 단백질

본 개시내용의 특정 측면은 샤페론 단백질에 관한 것이다. 샤페론 단백질은 비제한적으로 두 사슬 단백질을 포함한, 다른 거대분자의 폴딩 또는 어셈블리를 돕는 임의의 단백질을 지칭할 수 있다. 샤페론 단백질의 예는 비제한적으로 펩티딜-프롤릴 이성화효소, 단백질 이황화물 산화환원효소, 및 열충격 단백질 (예컨대 Hsp60, Hsp70, Hsp90, 및 Hsp100 단백질)을 포함할 수 있다. 샤페론 단백질은 또한 멤브레인에 걸친 단백질 이송 예를 들어, 원형질막 또는 내형질 망 멤브레인에 걸쳐서 폴리펩타이드 사슬의 전좌에 도움이 될 수 있다.

일부 구현예에서, 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이성화효소일 수 있다. 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (용어들 "프롤릴 이성화효소", "로타마제" 및 "PPiase"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있음)는 프롤린 또는 프롤릴-이미노펩타이드 결합의 시스 및 트랜스 이성질체의 상호전환을 촉매하는 임의의 효소를 지칭할 수 있다. 이 반응에 대한 EC 번호는 EC 5.2.1.8이다. 이 EC 번호에 의해 기재된 반응을 촉매하는 것으로 알려진 또는 예측된 임의의 단백질은 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소일 수 있다. 펩티딜-프롤릴 이성화효소 활성은 또한 GO 용어 ID GO:0003755에 의해 기재될 수 있다. 이 GO 용어 ID에 의해 기재된 분자 기능을 보유하는 것으로 알려진 또는 예측된 임의의 단백질은 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소일 수 있다.

펩티딜-프롤릴 이성화효소 활성은 단백질 폴딩 및 어셈블리를 증진하는 것으로 당업계에서 알려져 있다. 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 그것의 적절하게 폴딩된 구조가 시스 프롤릴 결합을 포함하는 단백질에 대한 트랜스 프롤릴 결합을 시스 프롤릴 결합으로 전환함에 의해 단백질 폴딩 및 어셈블리에 도움이 될 수 있다. 일부 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 또한 시스 프롤릴 결합을 결여하는 단백질의 폴딩 및 어셈블리를 향상시키는 것으로 알려져 있다(Bothmann H and Pluckthun A 2000 J. Biol. Chem. 275:17100). 일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 시스 프롤릴 결합이 결여된 단백질의 단백질 폴딩 및 어셈블리에 도움이 될 수 있다. 따라서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소 활성이 본원에서 기재된 방법에 유용한 샤페론 단백질을 동정하는데 특징적인 기능성으로 쓰일 수 있는 반면, 펩티딜-프롤릴 이성화효소의 유용성은 반드시 그것의 촉매 활성 그 자체로 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 펩티딜-프롤릴 이성화효소는 FkpA 단백질이다. 일부 구현예에서, FkpA 단백질은 E. 콜리 FkpA이다. E. 콜리 FkpA는 종 E. 콜리에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주에서 fkpA 유전자에 의해 인코딩된 임의의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, E. 콜리 FkpA는 EcoGene 수탁 번호 EG12900에 의해 기재된 fkpA 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, E. 콜리 FkpA는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_417806에 의해 기재된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.

다른 FkpA 단백질은 당해 기술에 알려져 있다. FkpA 단백질의 예는, 비제한적으로, S. 보이디 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000838252), C. 영가에 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_006687366), K. 옥시토카 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_004125943), S. 엔테리카 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000838233), K. 뉴모니아에 펩티딜-프롤릴 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_019704642), S. 세레비지아에 FPR3p (NCBI RefSeq No. NP_013637), M. 머스큘러스 Fkpb1a (NCBI RefSeq No. NP_032045), M. 머스큘러스 Fkpb2 (NCBI RefSeq No. NP_032046), H. 사피엔스 FKBP2 (NCBI RefSeq No. NP_001128680), 및 D. 멜라노가스테르 CG14715 (NCBI RefSeq No. NP_650101)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 FkpA 단백질은 E. 콜리 FkpA에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는다.

일부 구현예에서, 샤페론 단백질은 단백질 이황화물 산화환원효소일 수 있다. 단백질 이황화물 산화환원효소 (용어들 "단백질 이황화물 이성화효소" 및 "티올-이황화물 이성화효소"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있음)는 단백질에서 이황화물 결합의 재배열을 촉매하는 임의의 효소를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 단백질 이황화물 산화환원효소는 시스테인의 산화를 촉매하여 이황화물 결합을 단백질에 형성할 수 있다. 단백질 이황화물 산화환원효소는 또한 단백질에서 잘못 짝지어진 이황화물 결합의 이성질체화를 촉매할 수 있다. 이 반응에 대한 EC 번호는 EC 5.3.4.1이다. 이 EC 번호에 의해 기재된 반응을 촉매하는 것으로 알려진 또는 예측된 임의의 단백질은 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소일 수 있다. 단백질 이황화물 산화환원효소 활성은 또한 GO 용어 ID GO:0015035에 의해 기재될 수 있다. 이 GO 용어 ID에 의해 기재된 분자 기능을 보유하는 것으로 알려진 또는 예측된 임의의 단백질은 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소일 수 있다.

단백질 이황화물 산화환원효소 활성은 단백질 폴딩 및 어셈블리를 증진하는 것으로 당업계에서 알려져 있다. 예를 들어, 단백질 이황화물 산화환원효소 활성은 단백질 폴딩 및 어셈블리 동안 적절한 분자내 및 분자간 이황화물 결합의 형성을 촉진한다. 특히, 단백질 이황화물 산화환원효소 활성은 원핵 세포의 주변세포질에서 발현된 이황화물 결합을 갖는 단백질에 중요하다.

일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질이다. 일부 구현예에서, DsbA 단백질은 E. 콜리 DsbA이다. E. 콜리 DsbA는 종 E. 콜리에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주에서 dsbA 유전자에 의해 인코딩된 임의의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, E. 콜리 DsbA는 EcoGene 수탁 번호 EG11297에 의해 기재된 dsbA 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, E. 콜리 DsbA는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_418297에 의해 기재된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.

다른 DsbA 단백질은 당해 기술에 알려져 있다. DsbA 단백질의 예는, 비제한적으로, S. 플렉스네리 티올-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000725335), S. 다이센테리아에 티올-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000725348), C. 영가에 티올-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_006686108), 및 S. 엔테리카 티올-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_023240584)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 DsbA 단백질은 E. 콜리 DsbA에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는다.

일부 구현예에서, 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이다. 일부 구현예에서, DsbC 단백질은 E. 콜리 DsbC이다. E. 콜리 DsbC는 종 E. 콜리에 속하는 박테리아의 단리물 또는 임의의 균주에서 dsbC 유전자에 의해 인코딩된 임의의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, E. 콜리 DsbC는 EcoGene 수탁 번호 EG11070에 의해 기재된 dsbC 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, E. 콜리 DsbC는 NCBI RefSeq 수탁 번호 NP_417369에 의해 기재된 서열을 갖는 단백질을 지칭한다.

다른 DsbC 단백질은 당해 기술에 알려져 있다. DsbC 단백질의 예는, 비제한적으로, S. 손네이 단백질-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000715206), S. 다이센테리아에 단백질-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000715209), E. 페르구소니 단백질-이황화물 이성화효소 (NCBI RefSeq No. WP_000715225), S. 본고리 티올:이황화물 상호교환 단백질 DsbC (NCBI RefSeq No. WP_020845161), 및 S. 엔테리카 단백질 이황화물 이성화효소 DsbC (NCBI RefSeq No. WP_023183515)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 DsbC 단백질은 E. 콜리 DsbC에 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는다.

두 아미노산 서열, 또는 두 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭이 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 중 하나 또는 둘 모두 또는 핵산 서열에 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 일 구현예에서, 비교 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 50%, 전형적으로 적어도 75%, 및 더욱더 전형적으로 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 그 다음 비교된다. 제1 서열에서 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 그러면 분자는 그 위치에서 동일하다(본원에서 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다).

두 서열 간의 퍼센트 동일성은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어 질 필요가 있는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 테스트 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 테스트 및 참조 서열은 컴퓨터 안으로 도입되고, 하위서열 좌표가 지정되고, 필요하면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 그 다음 프로그램 파라미터에 기반하여, 참조 서열에 비교한 테스트 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 동일성에 대해 두 서열을 비교할 때, 임의의 갭이 아닌 인접되는 서열이 전반적으로 퍼센트 동일성을 감소시킬 수 있는 페널티를 수반할 필요는 없다. Blastn 경우, 디폴트 파라미터는 갭 개방 페널티=5 및 갭 연장 패널티=2이다. Blastp 경우, 디폴트 파라미터는 갭 개방 페널티=11 및 갭 연장 패널티=1이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"는 두 서열이 최적으로 정렬된 후 서열이 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열에 비교될 수 있는 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 더 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 구성된 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 세그먼트에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에서 잘-알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 알려진 알고리즘 (예를 들어, Smith and Waterman, Adv Appl Math, 2:482, 1981의 국소 상동성 알고리즘; Needleman and Wunsch, J Mol Biol, 48:443, 1970의 상동성 정렬 알고리즘; Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988의 유사성 방법에 대한 검색; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)에서 이들 알고리즘 FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA의 컴퓨터화된 실행, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의한 것을 사용하여 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 FASTA 알고리즘이다(Pearson and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA, 85:2444, 1988; 및 Pearson, Methods Enzymol, 266:227-258, 1996). 퍼센트 동일성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTA 정렬에 사용된 바람직한 파라미터는, BL50 매트릭스 15:-5, k-터플 (tuple)=2; 결합 패널티=40, 최적화=28; 갭 페널티-12, 갭 길이 페널티=-2; 및 폭=16으로 최적화된다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 또 다른 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다(각각 Altschul 등, Nuc Acids Res, 25:3389-3402, 1977; 및 Altschul 등, J Mol Biol, 215:403-410, 1990). BLAST 및 BLAST 2.0은 본원에 기재된 파라미터로, 본 개시내용의 핵산 및 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해 사용된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 웹사이트 센터를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 정렬될 때 일부 양성-평가된 역치 점수 T에 매칭되거나 만족하는 쿼리 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 동정함에 의해 먼저 높은 평점 서열 쌍 (HSP)을 동정하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다. 이들 초기 이웃 워드 히트는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위해 씨드로 역할을 한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열에 대해 파라미터 M (한 쌍의 매칭하는 잔기에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N (매칭하는 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 평점 매트릭스는 누적 점수를 계산하기 위해 사용된다. 각 방향에서 워드 히트의 연장은: 누적 정렬 점수가 그것의 최대 달성된 값에서 양 X만큼 떨어질때; 누적 점수가 하나 이상의 음성-평점 잔기 정렬의 축적에 기인하여 제로 또는 그 아래로 갈때; 또는 어느 하나의 서열의 말단이 도달될 때 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오타이드 서열 경우)은 디폴트로 워드 길이 (W) 11, 기대 (E) 10, M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 3, 및 기대 (E) 10, 및 BLOSUM62 평점 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915, 1989) 정렬 (B) 50, 기대 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간 유사성의 통계적 분석을 수행한다(참고, 예를 들어, Karlin and Altschul, Proc Natl Acad Sci USA, 90:5873-5787, 1993). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성 중 하나의 척도는 최소 합계 확률 (P(N))이며, 이는 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간 매칭이 우연히 발생할 수 있는 개연성의 적응증을 제공한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.

유용한 알고리즘의 또 다른 예는 PILEUP이다. PILEUP는 관계 및 퍼센트 서열 동일성을 나타내는 점진적인, 쌍별 정렬을 사용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다수의 서열 정렬을 만든다. 그것은 또한 정렬을 만들기 위해 사용되는 클러스터링 관계를 보여주는 트리 또는 덴도그램 (dendogram)을 플롯팅한다. PILEUP는 공개된 방법 (Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989)에 유사한 방법을 이용한, 점진적 정렬 방법 (Feng and Doolittle, J Mol Evol, 35:351-360, 1987)의 단순화를 사용한다. 프로그램은 각각 최대 길이 5,000 뉴클레오타이드 또는 아미노산인, 최대 300개 서열을 정렬할 수 있다. 다수의 정렬 절차는 2개 정렬된 서열의 클러스터를 생성하는, 2개의 가장 유사한 서열의 쌍별 정렬로 시작한다. 이 클러스터는 그 다음 정렬된 서열의 다음 가장 관련된 서열 또는 클러스터에 정렬된다. 서열의 두 클러스터는 두 개별 서열의 쌍별 정렬의 단순한 연장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 점진적인, 쌍별 정렬에 의해 달성된다. 프로그램은 서열 비교의 영역에 대한 특정 서열 및 그것의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 좌표를 지정하고 프로그램 파라미터를 지정함에 의해 수행된다. PILEUP를 사용하여, 참조 서열은 다른 테스트 서열에 비교되어 다음의 파라미터를 사용하여 퍼센트 서열 동일성 관계를 결정한다: 디폴트 갭 중량 (3.00), 디폴트 갭 길이 중량 (0.10), 및 가중된 말단 갭. PILEUP는 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어, 버전 7.0으로부터 수득될 수 있다(Devereaux 등, Nuc Acids Res, 12:387-395, 1984).

다수의 DNA 및 아미노산 서열 정렬에 적합한 알고리즘의 또 다른 바람직한 예 CLUSTALW 프로그램이다(Thompson 등, Nuc Acids. Res, 22:4673-4680, 1994). ClustalW는 서열의 그룹 간에 다수의 쌍별 비교를 수행하고 이들을 상동성에 기반한 다수의 정렬로 조합한다. Gap 개방 및 Gap 연장 페널티는 각각 10 및 0.05였다. 아미노산 정렬을 위해, BLOSUM 알고리즘이 단백질 중량 매트릭스로서 사용될 수 있다(Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA, 89:10915-10919, 1992).

프로모터

발현과 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 생명체에 의해 인식되고 항체를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 내포한다. 원핵 숙주에서 이용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 인산분해효소 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 그리고 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 하지만, 다른 공지된 세균 프로모터가 적합하다. 세균 시스템에서 이용을 위한 프로모터는 또한, 항체를 인코딩하는 DNA에 작동 가능하게 연결된 샤인 달가노 (S.D.) 서열을 내포할 것이다. 상기에 논의된 바와 같이, 프로모터는 번역 단위 (예를 들어, 천연 번역 단위, 예컨대 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 것)와 작동 가능한 조합에서 숙주 세포 염색체 안으로 삽입되어 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 비-천연인 프로모터:번역 단위 조합을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 프로모터는 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 활성은 신호에 반응하여 증가하거나 감소한다. 예를 들어, 유도성 프로모터는 신호, 예컨대 IPTG의 존재에 반응하여 전사를 촉진할 수 있다. 유도성 프로모터는 신호, 예컨대 포스페이트의 부재에 반응하여 전사를 촉진할 수 있다. 어느 하나의 이들 시나리오에서, 전사의 양은 신호의 양, 또는 이의 결핍에 비례하거나 하지 않을 수 있다. 원핵 숙주 세포에 적합한 유도성 프로모터의 다수의 예가 당해 기술에 알려져 있다. 이들은, 비제한적으로, lac, tac, trc, trp, pho, recA, tetA, nar, 파아지 P_L, cspA, T7, 및 P_BAD 프로모터를 포함할 수 있다(보다 상세한 설명에 대한 참고: Terpe K. 2006 Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:211). 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 다수의 카피가 별개 번역 단위의 별현, 예를 들어, 배위된 방식으로 샤페론 단백질 예컨대 DsbC 및 FkpA를 인코딩하기 위해 사용된다.

일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 IPTG-유도성 프로모터이다. IPTG-유도성 프로모터는 lac 오페론 (예를 들어, 알로락토스)으로부터 전사를 촉진할 수 있는 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 또는 임의의 다른 락토스 유도체에 반응하는 방식으로 전사를 촉진하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭할 수 있다. IPTG-유도성 프로모터의 많은 예가 당해 기술에 알려져 있고, 비제한적으로 tac (예를 들어, tacI, tacII, 등) 프로모터, lac 프로모터, 및 이의 유도체 (예를 들어, lacUV5, taclac, 등)를 포함한다.

일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 배양 배지에 포스페이트가 고갈될 때 번역 단위의 전사를 유도하는 pho 프로모터이다. pho 프로모터는 세포외 포스페이트 (예를 들어, 무기 포스페이트)에 반응하는 방식으로 전사를 촉진하는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, E. 콜리에서 포스페이트 (Pho) 레귤론 (regulon)은 세포외 포스페이트를 감지하고 포스페이트 수준에 반응하여 Pho 프로모터를 통해 다수의 다운스트림 유전자의 발현을 조절하는 단백질 구성요소를 포함한다(보다 상세한 설명에 대한 참고: Hsieh YJ and Wanner BL 2010 Curr. Opin. Microbiol. 13(2):198). 박테리아가 배양 배지에서 성장될 때, 이 Pho 레귤론의 발현은 포스페이트 (예를 들어, 무기 포스페이트, Pi)가 배지에서 이용가능할 때 억제되고 포스페이트가 고갈될 때 유도되는 것으로 알려져 있다. 본원에서 기재된 방법에 사용된 pho 프로모터의 하나의 비-제한적인 예는 E. 콜리 phoA 프로모터이다. 이 프로모터는 널리 알려져 있고, 세포 배양 배지에서 포스페이트의 농도에 의존적 방식으로 원핵 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 조절하기 위해 당업계에서 사용된다(보다 상세한 설명에 대한 참고: Lubke C 등 1995 Enzyme Microb. Technol. 17(10):923).

일부 구현예에서, 본 개시내용의 프로모터는 구성적 프로모터이다. 구성적 프로모터의 활성은 숙주 세포가 성장되는 조건 (예를 들어, 영양소 조건, 세포 밀도, 등)에서 변동에 무관하게 일정한 수준의 유전자 발현을 유지하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 구성적 프로모터의 활성은 하나 이상의 전사 인자의 활성 또는 발현보다는 RNA 중합효소 이용가능성에 의존적일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 합성 또는 비-천연 발생 프로모터이다. 원핵 숙주 세포의 범위에 적합한 예시적인 구성적 프로모터는, 예를 들어, Jensen PR, Hammer K. Appl Environ Microbiol 1998; 64: 82-87에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 CP25 프로모터이다.

본원에서 기재된 바와 같이, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 또는 조합된 프로모터 다수의 비-천연 조합을 포함할 수 있다. 프로모터의 상이한 유형이 임의의 수 또는 조합으로 숙주 세포 염색체 안으로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 유도성 프로모터 (예를 들어, 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 조합된 것) 및 구성적 프로모터 (예를 들어, 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 상이한 번역 단위와 작동 가능하게 조합된 것)를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 조합된 본 개시내용의 유도성 프로모터 및 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 상이한 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 구성적 프로모터를 포함하며, 여기서 프로모터:번역 단위의 조합 둘 모두는 숙주 세포 또는 숙주 세포 염색체에 비-천연이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 상이한 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 DsbC를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 FkpA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 E. 콜리 DsbC를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 E. 콜리 FkpA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이고, DsbC 및 FkpA를 인코딩하는 번역 단위는 천연이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 둘 이상의 번역 단위를 포함하는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 상이한 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 DsbC를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 FkpA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 E. 콜리 DsbC를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터 및 E. 콜리 FkpA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Pho 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이고 DsbC 및 FkpA를 인코딩하는 번역 단위는 천연이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 둘 이상의 번역 단위를 포함하는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 제2 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, 및 본 개시내용의 샤페론 단백질을 인코딩하는 제3 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제2 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, 및 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하는 제3 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 DsbC를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, DsbA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, 및 FkpA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포 염색체는 E. 콜리 DsbC를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, E. 콜리 DsbA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 tac 프로모터, 및 E. 콜리 FkpA를 인코딩하는 번역 단위와 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 CP25 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 E. 콜리이고 DsbC, DsbA, 및 FkpA를 인코딩하는 번역 단위는 천연이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 둘 이상의 번역 단위를 포함하는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.

염색체외 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터

일부 구현예에서, 숙주 세포는 (1) 본 개시내용의 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및 (2) 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 동일한 염색체외 폴리뉴클레오타이드 중 일부이다. 일부 구현예에서, 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)는 2-사슬 폴리펩타이드의 제3 사슬을 인코딩하는 제3 번역 단위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)는 하나 이상의 발현 벡터 또는 플라스미드를 포함한다.

일부 구현예에서, 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위 및 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위는 단일 염색체외 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 플라스미드 또는 기타 발현 벡터) 중 일부이다. 일부 구현예에서, 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위 및 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위는 별개 염색체외 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 플라스미드 또는 기타 발현 벡터)로부터 발현된다.

일부 구현예에서, 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)는 선택가능한 마커 (예를 들어, 선택가능한 마커 단백질을 인코딩하는 번역 단위)를 추가로 함유한다. 선택가능한 마커는 세포가 선택, 즉, 선택가능한 마커가 결여된 세포(들)의 존재도에 비해 선택가능한 마커를 담지하는 세포(들)의 존재도를 우선적으로 증가시키기 위해 사용되는 임의의 조건 하에 있을 때 숙주 세포의 생존을 촉진하는 단백질을 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있다. 전형적인 선택 마커는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지, 예를 들어, 바실러스에 대해 D-알라닌 라세마제를 인코딩하는 유전자로부터 이용불가능한 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 단일 항생제를 갖는 다수의 선택가능한 마커 및 상응하는 선택 제제가 당해 기술에 알려져 있다. 예를 들어 그리고 비제한적으로, 많은 선택가능한 마커 및 상응하는 항생제가 Jang CW and Magnuson T 2013 PLoS ONE 8(2):e57075에 기재되고 인용된다. 일부 구현예에서, 선택가능한 마커는 숙주 세포의 게놈 내에 존재하는 유전자 결실을 보완하는 유전자 (예를 들어, 플라스미드로부터 발현된 유전자)를 지칭할 수 있다. 이들 예에서, 세포가 선택 (즉, 호스트 게놈으로부터 결실된 유전자의 활성을 필요로 하는 조건 하에서 성장) 하에 있을 때, 플라스미드에 의해 공급된 유전자 카피는 호스트 게놈의 결핍을 보완하고, 그에 따라 외인성 보완 유전자를 담지하는 세포(들)를 선택한다. 이러한 유전자는, 그것의 예가 본원에 추가로 기재된, 세포 배지에 결여된 특이적 영양소를 생성하기 위해 요구된 영양요구성 마커 또는 유전자를 포함할 수 있다. 몇 개의 예시적인 선택가능한 마커 및 항생제가 본원에 추가로 기재된다.

일부 구현예에서, 선택가능한 마커는 선택 제제에 대한 내성을 촉진하고, 배양 배지는 숙주 세포가 폴리뉴클레오타이드를 보유하도록 하는 선택 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 항생제이다. 선택 반응식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지하기 위해 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포들은 약물 내성을 부여한 단백질을 생산하고, 따라서 선택 요법을 견디고 살아 남는다. 상기 우성 선택의 예로는 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신 약물을 사용한다.

또 다른 선택 체계는 그 유전자 산물이 특정 배양 배지에서 성장에 필수적인 유전자를 제거하는 염색체 결실을 갖는 원핵 숙주 세포를 사용한다. 이들 예에서, 숙주 세포의 염색체 결실을 보완하는 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 특정 배양 배지에서 성장될 때 생존할 것이다. 이 체계에서 유용한 유전자의 예는 숙주 세포가 특정 배양 배지에서 성장될 때 필수 영양소를 생성하도록 요구된 영양요구성 마커 유전자 또는 기타 유전자를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)는 원핵 숙주 세포에서 염색체외 발현 벡터를 복제하기에 적합한 복제 기원을 추가로 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 상기 백터를 숙주 염색체 DNA와 별개로 복제하게 할 수 있고, 복제의 기점 또는 자율적으로 복제하는 서열들을 포함하는 것이다. 이러한 서열은 다양한 원핵 숙주 세포에 대해 잘 알려져 있다. 예를 들어, 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 최대 그람-음성 박테리아로 적합하다.

원핵 숙주 세포에 사용된 발현 벡터는 또한 전사의 종료 및 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 수 있다. 원핵 세포에서, 종결자는 Rho-의존적 또는 Rho-독립적인 종결자를 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 유용한 종결자의 일 예는 비제한적으로 λt0 종결자를 포함한다(Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185, 1987).

본 개시의 항체는 직접적으로뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드와 함께 융합 폴리펩타이드로서 재조합으로 생성될 수 있으며, 이는 바람직하게는 신호 서열 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드이다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는(예컨대, 신호 펩티다아제에 의해 절단되는) 것이다. 천연 항체 신호 서열을 인식하고 처리하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 상기 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다.

재조합 폴리펩타이드

본 개시내용의 특정 측면은 2-사슬 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 유익하게는, 본원에서 기재된 방법은 많은 상이한 유형의 단백질, 특히 상기에 기재된 바와 같이 이황화물 결합, 예컨대 두 사슬 단백질을 갖는 것의 발현, 폴딩 및 어셈블리를 촉진하는데 유용할 수 있다. 특정 두 사슬 단백질은 아래에 기재되어 있으나, 본원에서 기재된 방법은 이들 특정 구현예에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 두 사슬 단백질은 하나 초과의 별개의 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 많은 구현예가 두 폴리펩타이드 사슬을 갖는 두 사슬 단백질을 포함하지만, 2개 초과 폴리펩타이드 사슬 (예를 들어, 3개 이상 폴리펩타이드)을 갖는 두 사슬 단백질이 고려되고 본원에서 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다. 상기에 기재된 바와 같이, 달리는 2개 별개의 폴리펩타이드 사슬인 경우와 같이 회합하는 단일 폴리펩타이드 사슬 (예를 들어, 단일 사슬 항체, 단일 사슬 가변 단편, 등)로 이루어진 두 사슬 단백질이 또한 고려되고 본원에서 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 두 사슬 폴리펩타이드의 두 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 서로에 대해서 연결된다. 이황화물 결합은 두 티올 기를 연결하는 임의의 공유결합을 지칭할 수 있다. 폴리펩타이드에서 이황화물 결합은 전형적으로 시스테인 잔기의 티올 기 사이에 형성된다. 폴리펩타이드 이황화물 결합은 많은 폴리펩타이드, 예컨대 본 개시내용의 두 사슬 단백질의 폴딩 및 어셈블리에 중요한 것으로 당해 기술에 알려져 있다. 폴리펩타이드 이황화물 결합은 단일 폴리펩타이드 사슬에서 시스테인 잔기 간의 이황화물 결합 (즉, 분자내 또는 사슬내 이황화물 결합)을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 이황화물 결합은 또한 별개의 폴리펩타이드 사슬에서 발견된 시스테인 잔기 간의 이황화물 결합 (즉, 분자간 또는 사슬간 이황화물 결합)을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 두 사슬 폴리펩타이드의 두 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 서로에 대해서 연결된다.

이황화물 결합은 항체 및 항체 단편의 폴딩 및 어셈블리에 중요한 것으로 당해 기술에 알려져 있다. 상이한 항체 동위원소, 및 동위원소 내의 상이한 서브클래스는 상이한 패턴의 이황화물 결합을 보유하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, IgG 항체는 특정 IgG 서브클래스에 의존하여, 12개 사슬내 이황화물 결합, 각 경쇄와 그것의 상응하는 중쇄 사이 하나의 사슬간 이황화물 결합, 및 중쇄 사이의 2 내지 11개 사슬간 이황화물 결합을 함유할 수 있다(보다 상세한 설명에 대한 참고: Liu H and May K 2012 MAbs. 4(1):17). IgM (참고, 예를 들어, Wiersma EJ and Shulman MJ 1995 J. Immunol. 154(10):5265), IgE (참고, 예를 들어, Helm BA 등 1991 Eur. J. Immunol. 21(6):1543), IgA (참고, 예를 들어, Chintalacharuvu KR 등 2002 J. Immunol. 169(9):5072), 및 IgD (참고, 예를 들어, Shin SU 등 1992 Hum. Antibodies Hybridomas 3(2):65)가 또한 폴딩 및 어셈블리 동안 이황화물 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 두 사슬 폴리펩타이드는 숙주 세포에 이종성이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 숙주 세포와 관련하여 사용될 때 이종성 폴리펩타이드는즉 , 숙주 세포가 자연으로부터 단리될 때, 숙주 세포에서 천연적으로 발현되지 않는 임의의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 이종성 폴리펩타이드는 또한 숙주 세포에 의해 천연적으로 발현되지 않지만, 숙주 세포가 자연으로부터 단리될 때보다 상이한 조절 하에서 발현되는 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 상이한 조절의 예는 비제한적으로 상이한 양의 발현, 상이한 자극, 또는 임의의 다른 변경된 맥락, 예컨대 이종성 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터의 사용에 의한 발현에 반응한 발현을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 두 사슬 폴리펩타이드는 이종이량체의 단량체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이종이량체는 2개의 별개의 폴리펩타이드 또는 작동 가능한 연결로 폴리펩타이드 복합체를 함유하는 임의의 폴리펩타이드 복합체를 지칭할 수 있다. 이종이량체의 비-제한적인 예는 2개의 별개의 항체 단량체 (즉, 작동 가능한 연결로 된 경쇄-중쇄 쌍)로 구성된 이중특이적 또는 2가 항체이다. 이 실시예에서, 제1 항원을 인식하는 제1 중쇄-경쇄 쌍의 폴딩 및 어셈블리는 제1 항체 단량체를 생성한다. 제2 항원을 인식하는 제2 중쇄-경쇄 쌍의 폴딩 및 어셈블리는 제2 항체 단량체를 생성한다. 이들 단량체는 이종이량체를 형성하기 위해 당업계에서 알려진 임의의 수단 (이중특이적 항체 에 관하여 아래에 더 상세히 기재됨)에 의해 조립될 수 있다. 이종이량체성 항체 형성의 예시적인 예에 대한 더 많은 세부사항에 대해, Ridgway JBB 등 1996 Protein Eng. 9(7):617 참고.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 두 사슬 폴리펩타이드는 제1 사슬 및 제2 사슬이 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 나타내는 1가 항체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 1가 항체는 중쇄-경쇄 쌍이 제2 중쇄-경쇄 쌍에 작동 가능하게 연결되지 않은 중쇄-경쇄을 형성하기 위해 함께 작동 가능하게 연결된 항체 중쇄 및 항체 경쇄로부터 이루어진 임의의 폴리펩타이드 복합체를 지칭할 수 있다. 용어 "절반-항체 (hAb)"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 1가 항체는 특이적으로 항원을 결합할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합한다", "특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적인"은, 표적 (즉, 및 항체 간의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭하며, 이는 생물학적 분자를 포함한 분자의 이질성 집단의 존재에서 표적의 존재를 결정한다. 예를 들면, 표적 (에피토프일 수 있음)에 결합 또는 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더욱 쉽게, 및/또는 더 긴 지속시간으로 상기 표적에 결합하는 항체이다. 일 구현예에서, 관련없는 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역검정 (RIA)으로 측정시, 표적에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예들에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 특정 구체예에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에서 보존되는 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 특이적 결합은 배타적인 결합을 포함할 수 있지만, 배타적 결합을 필요로 하는 것은 아니다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 두 사슬 폴리펩타이드는 분비 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분비 단백질은 숙주 세포 주변세포질 또는 세포외 환경으로 숙주 세포에 의해 분비된 임의의 단백질을 지칭할 수 있다. 분비 단백질은 숙주 세포에 의해 천연적으로 분비된 단백질일 수 있거나, 또는 분비 단백질은 숙주 세포에 의해 천연적으로 분비되지 않으나 그것의 분비를 촉진하도록 그와 같은 방식으로 변형된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 폴리펩타이드의 N-말단에서 발견된 신호 서열의 존재는 폴리펩타이드를 분비를 위해 분비 경로로 향하게 할 수 있다. 다수의 신호 서열이 당해 기술에 알려져 있고 분비 단백질의 분비를 촉진하거나 숙주 세포에 의해 자연적으로 분비되지 않는 단백질의 분비를 허용하는데 유용할 수 있다; 참조, 예를 들어, Picken 등, Infect. Immun. 42:269-275 (1983); Simmons and Yansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996); 및 Humphreys DP 등 2000 Protein Expr. Purif. 20(2):252. 신호 서열의 하나의 비-제한적인 예는 열 안정한 장독소 II (STII) 신호 서열이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 분비 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. 주변세포질은 그람-음성 박테리아 세포의 내부 또는 세포질 멤브레인과 외막 사이의 공간을 지칭하는 것으로 당업계에서 알려져 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 주변세포질은 이황화물 결합의 형성에 유리하게 작동하는 산성화 환경이라고 생각된다. 따라서, 주변세포질로 그것의 적절하게 폴딩되고 조립된 구조 (예를 들어, 본 개시내용의 두 사슬 단백질)의 일부로 이황화물 결합을 갖는 폴리펩타이드를 국지화하는 것이 유리할 수 있다(보다 상세한 설명에 대한 참고: Schlapschy M 등 2006 Protein Eng. Des. Sel. 19(8):385).

주변세포질의 단백질을 회수하기 위한 다수의 방법이 당해 기술에 알려져 있다. 주변세포질의 단백질의 대규모 정제의 하나의 비-제한적인 예가 유럽 특허 번호 EP1356052 B1 (참고, 예를 들어, 실시예 4)에 기재되어 있다. 주변세포질의 단백질은 스페로블라스트 제제로부터 주변세포질의 분획을 추출함에 의해 회수될 수 있다(참고, 예를 들어, Schlapschy M 등 2006 Protein Eng. Des. Sel. 19(8):385). 주변세포질의 추출물이 생성되면, 주변세포질의 단백질은 당업계에서 알려진 임의의 표준 단백질 정제 기술, 예컨대 친화성 정제, 크로마토그래피, 등에 의해 정제될 수 있다.

숙주 세포

본 개시내용의 특정 측면은 원핵 숙주 세포에 관한 것이다. 본원에서 벡터에 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에 예컨대 에스케리치아, 예를 들어E. 콜리엔테로박터, 어위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들어, 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아, 예를 들어, 세라티아 마르체칸스, 및 시겔라, 뿐만 아니라 바실러스 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스 (예를 들어, B. 리케니포르미스 41P로 1989년 4월 12일 자 공개된 DD 266,710에서 개시된 것), 슈도모나스 예컨대 P. 에어루기노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 한 가지 바람직한 E. 콜리클로닝 숙주는 E. 콜리 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주들 예컨대 E. 콜리 B, E. 콜리X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜리 W3110 (ATCC 27,325)이 적합하다. 상기 실시예들은 제한적이기보다 예시적이다.

일부 구현예에서, 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리움이다. 그람-음성 박테리움는 그람 염색에 의해 검출된 펩티도글리칸 층을 둘러싸는 외막을 함유하는 임의의 박테리움을 지칭한다. 많은 그람-음성 박테리아 숙주 세포가 당해 기술에 알려져 있다. 예를 들어, 그람-음성 박테리아는 비제한적으로 프로테오박테리아, 예컨대 알파프로테오박테리아, 베타프로테오박테리아 , 감마프로테오박테리아 , 제타프로테오박테리아 , 엡실론프로테오박테리아 , 델타프로테오박테리아 , 및 에시도박테리아 ; 시아노박테리아; 및 스피로차에테스를 포함하는 것으로 알려져 있다. 잘 알려진 그람-음성 박테리아는 속으로부터의 종 예컨대 에쉐리키아, 살모넬라, 시겔라 , 슈도모나스, 헬리로박터, 레지오넬라, 나이세리아, 및 클렙시엘라를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 그람-음성 박테리움은 E. 콜리이다. 본원에서 사용된 바와 같이, E. 콜리는 종 E. 콜리에 속하는 박테리아의 임의의 균주 또는 단리물을 지칭할 수 있다. E. 콜리는 천연 발생 균주 또는, 예컨대 본원에서 기재된 바와 같이 플라스미드로 돌연변이 또는 형질전환에 의해, 유전적으로 변형된 균주를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 E. 콜리는 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주의 것이다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주는 일부 내인성 프로테아제가 재조합으로 발현된 기질에 대해 활성을 갖기 때문에 본 개시내용의 재조합 단백질, 예컨대 주변세포질의 단백질의 향상된 생산을 허용할 수 있다고 생각된다(하나의 그와 같은 예에 대한 참고: Baneyx F and Georgiu G 1990 J. Bacteriol. 172(1):491). 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주는 내인성 프로테아제를 인코딩하는 유전자가 돌연변이되거나, 결실되거나 달리는 불활성화된 균주를 포함할 수 있다. 이러한 유전자의 예는, 비제한적으로, degP, prc , 및 ompT를 포함할 수 있다. 다양한 원핵 숙주 세포에 돌연변이를 도입하는 방법 (예를 들어, 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주를 조작하기 위함)은 당해 분야에서 잘 알려져 있다; 참조, 예를 들어, Snyder L 등 2013 Molecular Genetics of Bacteria 4^th ed. ASM Press). 특정 구현예에서, 본 개시내용의 E. 콜리는 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주의 것이다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 E. 콜리는 향상된 LacI 생산 또는 활성을 갖는 균주의 것이다. 예시적인 LacI 단백질의 서열은 UniProt KB 수탁 번호 P03023에 의해 제시된다. 특정 구현예에서, E. 콜리 는 lacI ^Q 돌연변이를 갖는 균주이다(참조, 예를 들어, Muller-Hill, B. 등 (1968) Proc . Natl . Acad . Sci . 59:1259-1264). 이 돌연변이는 lac 오페론의 LacI 억제자의 과잉생산을 초래하는 것으로 알려져 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 E. 콜리는 균주 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (IlvG+; Valr) Δprc spr43H1 ΔmanA lacI ^Q ΔompT ΔmenE742 degPS210A의 것이다.

항체 및 항체 단편

본원에 기재된 두 사슬 단백질은 당업계에서 알려진 임의의 적합한 기술에 의해 제조될 수 있다. 두 사슬 단백질의 하나의 예시적인 부류는 항체이다. 아래에 기재된 바와 같이, 항체는 항체 생성을 위한 당업계에서 이용가능한 기술을 사용하여 제조되고, 이의 예시적인 방법은 하기 섹션에서 더욱 상세히 기재되어 있다. 당해 분야의 숙련가는 아래에 기재된 많은 방법이 항체이외의 두 사슬 단백질에 적용될 수 있음을 인식할 것이다.

항체는 관심 있는 항원 (예를 들어, 비제한적으로, PD-L1 (예컨대 인간 PD-L1), HER2, 또는 CD3 (예컨대 인간 CD3), IL13, IL4, VEGFC, VEGFA, 및 VEGF)에 대해 지향된다. 바람직하게는, 상기 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고 장애를 앓는 포유동물에게 상기 항체를 투여하는 것은 상기 포유동물에서 치료적 이점을 가져올 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 인터류킨-13 (본원에서 IL-13 또는 IL13 지칭함)에 대해 지향된다. 예를 들어, 항체는 IL13에 대해 지향된 1가 항체 또는 "절반-항체", IL13에 대해 지향된 2개 1가 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 완전 항체 (예를 들어, 2개 동일한 1가 중쇄-경쇄 쌍; 2개 1가 중쇄-경쇄 쌍, 각각은 IL13의 동일한 에피토프를 인식하는 상이한 HVR 또는 CDR을 포함함; 또는 2개 1가 중쇄-경쇄 쌍, 각각은 IL13의 비-중첩 또는 부분적으로 중첩 에피토프를 인식하는 상이한 HVR 또는 CDR을 포함함), 또는 IL13에 대해 지향된 중쇄-경쇄 쌍 및 상이한 항원에 대해 지향된 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다.

IL13 폴리펩타이드의 예는 당해 기술에 알려져 있다. 일부 구현예에서, IL13 폴리펩타이드는 인간 IL13 폴리펩타이드. 일부 구현예에서, IL13 폴리펩타이드는 IL13의 전구체 형태이다. IL13 폴리펩타이드의 전구체 형태의 비-제한적인 예는 Swiss-Prot 수탁 번호 P35225.2에 제시된 바와 같은 인간 IL13 전구체이다. 일부 구현예에서, IL13 폴리펩타이드는 다음 서열을 포함한다:

MALLLTTVIA LTCLGGFASP GPVPPSTALRELIEEL VNITQNQKAP LCNGSMVWSI NLTAGMYCAA LESLINVSGC SAIEKTQRML SGFCPHKVSA GQFSSLHVRD TKIEVAQFVK DLLLHLKKLF REGRFN (서열번호:1).

다른 구현예에서, IL13은 성숙한 형태의 IL13 (예를 들어, 신호 서열을 결함)이다. 일부 구현예에서, IL13 폴리펩타이드는 다음 서열을 포함한다:

SPGPVPPSTALR ELIEELVNIT QNQKAPLCNG SMVWSINLTA GMYCAALESL INVSGCSAIE KTQRMLSGFC PHKVSAGQFS SLHVRDTKIE VAQFVKDLLL HLKKLFREGR FN (서열번호:2).

일부 구현예에서, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항-IL13 항체가 본원에 제공되며, 여기서:

중쇄 가변 도메인은 각각 AYSVN(서열번호:5), MIWGDGKIVYNSALKS (서열번호:6) 및 DGYYPYAMDN (서열번호:7)에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3 서열을 포함하고/하거나

경쇄 가변 도메인은 각각 RASKSVDSYGNSFMH (서열번호:8), LASNLES (서열번호:9) 및 QQNNEDPRT (서열번호:10)에 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3 서열을 포함한다.

구체적인 양태에서, 서열 동일성은 참조 서열에 비하여 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

일부 구현예에서, 항-IL13 항체는 서열번호:3의 중쇄 가변 도메인 서열 및/또는 서열번호:4의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 또 추가의 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항-IL13 항체가 제공되며, 여기서:

중쇄 가변 도메인 서열은 다음의 참조 중쇄 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가지고:

EVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSS (서열번호:3), 및/또는

경쇄 가변 도메인 서열은 다음의 참조 경쇄 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다:

DIVLTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKR (서열번호:4).

일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 인터류킨-33 (본원에서 IL-33 또는 IL33으로 지칭함)에 대해 지향된다. 예를 들어, 항체는 IL33에 대해 지향된 1가 항체 또는 "절반-항체", IL33에 대해 지향된 2개 1가 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 완전 항체 (예를 들어, 2개 동일한 1가 중쇄-경쇄 쌍; 2개 1가 중쇄-경쇄 쌍, 각각은 IL33의 동일한 에피토프를 인식하는 상이한 HVR 또는 CDR을 포함함; 또는 2개 1가 중쇄-경쇄 쌍, 각각은 IL33의 비-중첩 또는 부분적으로 중첩 에피토프를 인식하는 상이한 HVR 또는 CDR을 포함함), 또는 IL33에 대해 지향된 중쇄-경쇄 쌍 및 상이한 항원에 대해 지향된 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다.

IL33의 다양한 동형체가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 IL33 동형체는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, NCBI RefSeq 수탁 번호 AOZ26495, ADR77828, AAH47085, NP_254274, NP_001186569, NP_001300977, NP_001340731, NP_001300975, NP_001300976, 및 XP_06870774에 의해 제시된 것들을 포함한다.

일 양태에서, 다중특이적 항체가 제공되며, 상기 항체는 제1 1가 또는 절반 항체 및 제2 1가 또는 절반 항체를 포함하고, 상기 제1 절반-항체는 IL-33을 결합하는 제1 VH/VL 단위를 포함하고 제2 절반 항체는 IL-13을 결합하는 제2 VH/VL 단위를 포함한다.

예시적인 항-IL33 항체 (항-IL33/항-IL13 이중특이적 항체를 포함)에 대한 HVR 및 가변 도메인 서열은, 예를 들어, WO2016077381에서 찾아볼 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체의 CH3 및/또는 CH2 도메인은 IgG (예를 들어, IgG1 아형, IgG2 아형, IgG2A 아형, IgG2B 아형, IgG3, 아형, 또는 IgG4 아형)로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체의 CH3 및/또는 CH2 도메인은 하나 이상의 놉- 또는 홀-형성 돌연변이, 예컨대 하기 표 2 기재된 것들을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용의 항체의 CH3 및/또는 CH2 도메인은 IgG4 아형으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체의 IgG4 CH3 및/또는 CH2 도메인은, 비제한적으로 S228P 돌연변이 (EU 넘버링)를 포함하여, 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 아래에 더 상세히 논의된 바와 같은 항체 단편이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 단편은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 한팔 항체이다. 일부 구현예에서, 한팔 항체는 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 및 면역글로불린 Fc 단편을 포함하며, 여기서 세 사슬은 생물학적 활성 1가 항체를 형성하도록 접히고 조합된다. 예시적이고 비제한적인 한팔 항체의 설명의 경우 오나투주맙 (예를 들어, MetMAb), 참조, 예를 들어, Merchant, M. 등 (2013) Proc . Natl . Acad . Sci . 110:E2987-E2996.

항체 특성

특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 해리 상수 (Kd) ≤　1μM, ≤　150 nM, ≤　100 nM, ≤　50 nM, ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM (예를 들어, 10-8M 또는 그 미만, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)를 갖는다.

일 구현예에서, Kd는 하기의 검정에 의해 설명된 바와 같은 관심 항체의 Fab 버전 및 이의 항원과 병용으로 실시된 방사능표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용해 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재에서 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형시키고, 그 다음 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다(참고, 예를 들어, Chen 등, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER^® 다중웰 평판 (Thermo Scientific)이 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 코팅되고, 그리고 차후에, 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비-흡착제 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 관심 있는 해당 Fab의 연속 희석액과 혼합된다. 관심 있는 Fab는 그 다음 밤새 인큐베이션되고; 그러나, 평형에 확실하게 도달될 수 있도록 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 인큐베이션이 지속될 수 있다. 그 후에, 혼합물은 실온에서 인큐베이션 동안 (예를 들어, 1시간 동안) 포획 플레이트로 이동된다. 용액은 그 다음 제거되고 플레이트는 PBS 내 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척된다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광기 (MICROSCINT-20 TM; Packard)가 첨가되고, 플레이트는 TOPCOUNT TM 감마 계수기 (Packard) 상에서 10분 동안 계수된다. 경쟁적 결합 분석에 사용하기 위하여 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab 농도가 선택된다.

다른 구현예에 따르면, Kd는 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 a BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., 뉴저지주, 피츠카타웨이 소재)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N' - (3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원을 약 10 반응 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해, 5 μl/분의 유속으로 주입 전에 10 mM 아세트산 나트륨을 이용해, pH 4.8, 5 μg/ml(약 0.2 μM)까지 희석시킨다. 항원 주사 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 비-반응 그룹을 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석액(0.78 nM 내지 500 nM)을 약 25 μl/분의 유속으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20(트윈-20??) 계면활성제(PBST)를 포함하는 PBS 내에 주입한다. 결합 속도((kon)) 및 해리 속도(koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어^® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)는 비율 koff/kon으로서 계산한다. 예컨대, Chen 등, J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999)를 참조한다. 만약 화합률(on-rate)이 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐벳을 갖춘 8000-시리즈 SLM- SLM-AMINCO ^TM 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 농도가 증가하는 항원의 존재 하에 25℃에서 pH 7.2, PBS 내 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용함으로써 결합 속도를 측정할 수 있다.

항원 준비

선택적으로 다른 분자들에 접합된 가용성 항원들 또는 이의 단편들은 항체들을 생성하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 막관통 분자들, 예컨대 수용체들에 대하여, 이들의 단편들(예컨대, 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 막관통 분자를 발현하는 세포들을 면역원으로서 사용할 수 있다. 상기 세포들은 천연 공급원(예컨대, 암 세포주)으로부터 유도될 수 있거나, 막관통 분자를 발현시키기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환되는 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원들 및 이의 형태들은 당업자들에게 명백할 것이다.

(ii) 특정 항체-기반 방법

다클론 항체들은 바람직하게는 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강 내(ip) 주사에 의해 동물에서 발생한다. 그것은 이중작용성 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 콘주게이션), N-하이드록시석신이미드 (라이신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR, 상기 식에서 R 및 R¹은 상이한 알킬 기인 것을 사용하여, 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 관련된 항원을 접합하는 데 유용할 수 있다.

예컨대, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 접합체(각각 토끼 또는 마우스의 경우)를 3 부피의 프로인트 완전 보조제와 혼합하고 상기 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써, 동물은 상기 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 맞서 면역성을 갖게 된다. 1개월 후 상기 동물들은 다수의 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 내 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 강화(boost)된다. 7 내지 14일 후 상기 동물들을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대하여 검정한다. 동물들은 역가가 정체 상태를 유지할 때까지 강화된다. 바람직하게는, 상기 동물은 동일한 항원의 접합체로 강화되지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된다. 접합체들은 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반은 면역 반응을 증진시키기 위해 적합하게 사용된다.

본 개시내용의 단클론성 항체는 Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)에 처음 기재되고, 그리고 예를 들어, Hongo 등, Hybridoma , 14 (3): 253-260 (1995), Harlow 등에 추가로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al ., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)에서 추가로 설명된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 추가적인 방법들은, 예를 들어, 하이브리도마 세포주로부터의 단클론 인간 천연 IgM 항체의 생성에 관한 미국 특허 제 7,189,826호에 기재된 방법들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)에서 설명된다. 일단 원하는 단클론성 항체가 하이브리도마로부터 단리되면, 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 원핵 발현 벡터 안으로 서브클로닝될 수 있고, 항체는 본원에서 기재된 임의의 방법에 의해 원핵 숙주 세포에서 발현에 의해 생산될 수 있다.

(iii) 라이브러리-유래된 항체

본 개시내용의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지-디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특징을 보유한 항체들에 대해 상기 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 벙법, 예컨대 실시예 3에 기재된 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 추가적인 방법들이, 예컨대, Hoogenboom 등 in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 검토되고, 예컨대, McCafferty 등, Nature 348:552-554; Clackson 등, Nature 352: 624-628 (1991); Marks 등, J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu 등, J. Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee 등, J. Mol. Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee 등, J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004)에서 추가로 설명된다.

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클론되고, 그 다음 파지 라이브러리에 무작위로 재조합된 다음, Winter 외, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이, 항원-결합 파지에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편의 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 제작할 필요없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734(1993)에 기재된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 자가 항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝(예컨대, 인간으로부터)할 수 있다. 끝으로, 나이브 라이브러리는 줄기 세포로부터 재배치되지 않은 V-유전자 단편을 클로닝하고, 매우 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험관내에서 재배열을 수행하기 위하여 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 이용해 합성하여 만들어 질 수 있다(Hoogenboom and Winter J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)). 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는, 예를 들어: 미국 특허 제 5,750,373호, 및 미국 특허 공보 제 2005/0079574호, 2005/0119455호, 2005/0266000호, 2007/0117126호, 2007/0160598호, 2007/0237764호, 2007/0292936호, 및 2009/0002360호를 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들 또는 항체 단편들은 본 명세서의 인간 항체 또는 인간 항체 단편들로 간주된다.

(iv) 키메라, 인간화된 및 인간 항체

특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체들은, 예컨대, 미국 특허 제 4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 일 예시에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 한 추가 예에서, 키메라 항체는 분류 또는 하위분류가 모 항체의 분류로부터 변화되어 있는 "분류 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성이 감소되지만, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화도는 유지된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어, CDR, (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기들은 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체 (예를 들어,HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 예를 들어, Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); Queen 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 등, Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그라프팅을 기술함); Padlan, Mol. Immunol . 28:489-498 (1991) ("재표면화"를 기술함); Dall'Acqua 등, Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 기술함); 및 Osbourn 등, Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka 등, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도된 선택" 접근법을 기술함)에 추가로 기재되어 있다.

인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 비제한적으로 포함한다: "최적화" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Sims 등 J. Immunol . 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Carter 등 Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 및 Presta 등 J. Immunol ., 151:2623 (1993)); 인간 성숙한 (체세포적으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참고, 예를 들어, Baca 등, J. Biol . Chem . 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 등, J. Biol . Chem . 271:22611-22618 (1996)).

특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk 및 van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol . 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr . Opin. Immunol . 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다. 인간 항체는, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 본원에서 기재된 임의의 방법에 의해 원핵 발현 벡터로부터 원핵 숙주 세포에서 발현에 의해 제조될 수 있다.

인간 항체는 또한 인간-유도된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 분리시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변 도메인 서열은 그 다음 원하는 인간 불변 도메인에 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술은 하기에서 설명된다.

(v) 항체 단편

항체 단편들은 효소 분해와 같은 전통적인 수단에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성할 수 있다. 특정 상황들에서, 완전 항체보다는 항체 단편을 이용하는 것이 이점이 있다. 단편의 크기가 작을 수록 빠른 청소능이 가능하고, 고형 종양에 대한 접근을 개선할 수 있다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, Hudson 등 (2003) Nat. Med. 9:129-134를 참고한다.

항체 단편의 생성을 위하여 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래되었다(참고, 예를 들어, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan 등, Science, 229:81 (1985)). 하지만, 상기 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. Fab, Fv, 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균 내에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있으며, 따라서 많은 양의 상기 단편을 손쉽게 생성할 수 있다. 항체 단편은 위에서 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜리로부터 직접적으로 회수될 수 있고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성한다(Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab') ₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 재생(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기들을 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab') 2 단편이 미국 특허 제 5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기술들은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예들에서, 항체는 단일 쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제 5,571,894호; 및 5,587,458호를 참조한다. Fv 및 scFv는 불변 영역들이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 생체내 사용 중에 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 수득하도록 구성될 수 있다. 상기 Antibody Engineering, ed. Borrebaeck를 참조한다. 상기 항체 단편은 또한, 예컨대 미국 특허 제 5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

(vi) 다중특이적 항체

다중특이적 항체들은 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합 특이성을 갖고, 상기 에피토프들은 보통 상이한 항원으로부터 유래된다. 상기 분자들은 보통 2개의 상이한 에피토프(즉, 이중특이적 항체, BsAbs)를 단지 결합하는 반면, 추가적인 특이성을 갖는 항체들, 예컨대 삼중특이적 항체들은 본원에서 사용될 때 상기 발현에 포함된다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기반하며, 상기 두 사슬은 상이한 특이성을 갖는다(Millstein 등, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열 때문에, 상기 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이들 중 오직 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의하여 실시되는, 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829, 및 Traunecker 등, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)에 개시되어 있다.

이중특이적 항체 제조를 위한 당업계에서 공지된 하나의 접근법은 "놉-인투-홀" 또는 "돌출부-인투-공동" 접근법이다(참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168). 이 접근법에서, 두 면역글로불린 폴리펩타이드 (예를 들어, 중쇄 폴리펩타이드) 각각은 계면을 포함한다. 일 면역글로불린 폴리펩티드의 계면은 타 면역글로불린 폴리펩티드 상에서 대응하는 계면과 상호작용함으로써, 2개의 면역글로불린 폴리펩티드를 결합시킨다. 상기 계면들은 일 면역글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "손잡이" 또는 "돌기"(상기 용어들은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있음)가 타 면역글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "구멍" 또는 "공동"(상기 용어들은 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있음)과 대응하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 구멍은 상기 손잡이와 동일한 또는 유사한 크기이고, 상기 2개의 계면이 상호작용할 때, 일 계면의 손잡이가 타 계면의 대응하는 구멍 내에 위치할 수 있도록 적합하게 배치된다. 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 이종다량체를 안정화시키고 다른 종, 예를 들어 동종다량체보다 이종다량체의 형성을 선호한다고 생각된다. 일부 구현예들에서, 상기 접근법은 2개의 상이한 면역글로불린 폴리펩티드의 이종다량체화를 촉진하여 상이한 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한 이중특이적 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예들에서, 손잡이는 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄로 대체함으로써 구성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 구멍은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄로 대체함으로써 구성될 수 있다. 손잡이들 또는 구멍들은 본래 계면에 존재할 수 있거나 합성으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 손잡이들 또는 구멍들은 적어도 하나의 "본래" 아미노산 잔기를 적어도 하나의 "유입" 아미노산 잔기로 대체하기 위해 상기 계면을 부호화한 핵산 서열을 변경함으로써 합성으로 도입될 수 있다. 핵산 서열들을 변경하는 방법들은 당해 분야에서 잘 알려진 표준 분자 생물학 기술을 포함할 수 있다. 다양한 아미노산 잔기의 측쇄 부피는 하기 표에 나타낸다. 일부 구현예들에서, 본래 잔기들은 작은 측쇄 용적(예컨대, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌, 또는 발린)을 갖고, 손잡이를 형성하기 위한 유입 잔기들은 자연 발생 아미노산들이고 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본래 잔기들은 큰 측쇄 용적(예컨대, 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판)을 가질 수 있고, 구멍을 형성하기 위한 유입 잔기들은 자연 발생 아미노산이고 알라닌, 세린, 트레오닌, 및 발린을 포함할 수 있다.

일부 구현예들에서, 손잡이 또는 구멍을 형성하기 위한 본래 잔기들은 이종다량체의 3차원 구조에 기초로 하여 확인된다. 3차원 구조를 수득하기 위하여 당해 분야에 공지된 기술들은 X-선 결정학 및 NMR을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 계면은 면역글로불린 불변 도메인의 CH3 도메인이다. 상기 구현예들에서, 인간 IgG₁ 의 CH3/CH3 계면은 4개의 역-평행 β-가닥 상에 위치한 각 도메인 상에 16개의 잔기를 포함한다. 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 돌연변이된 잔기들은 2개의 중심 역-평행 β-가닥 상에 바람직하게는 위치하여 손잡이들이 상대 CH3 도메인에서 보상성 구멍들보다는 주위의 용매에 의해 수용될 수 있는 위험을 최소화시킨다. 일부 구현예에서, 두 면역글로불린 폴리펩타이드에서 상응하는 놉 및 홀을 형성하는 돌연변이는 다음의 표에 제공된 하나 이상의 쌍에 해당한다.

일부 구현예에서, 면역글로불린 폴리펩타이드는 상기 표 2에 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 표 2의 왼쪽 열에 열거된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한 제1 면역글로불린 폴리펩타이드, 및 표 2의 오른쪽 열에 열거된 하나 이상의 상응하는 아미노산 치환을 포함한 CH3 도메인을 포함한 제2 면역글로불린 폴리펩타이드를 포함한다. 놉-및-홀-형성 쌍의 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 T366W 돌연변이를 포함하는 CH3 도메인을 포함하는 제1 면역글로불린 폴리펩타이드, 및 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 CH3 도메인을 포함하는 제2 면역글로불린 폴리펩타이드를 포함한다.

각 절반-항체는 미국 특허 번호 7,642,228에 기재된 바와 같이 중쇄 안으로 조작된 놉 (돌출부) 또는 홀 (공동) 중 어느 하나를 가질 수 있다. 간략하게, CH3 놉 돌연변이체가 먼저 생성될 수 있다. CH3 홀 돌연변이체의 라이브러리는 그 다음 파트너 CH3 도메인 상의 놉에 근접한 잔기 366, 368 및 407을 랜덤화함에 의해 창작될 수 있다. 특정 구현예에서, 놉 돌연변이는 T366W를 포함하고, 홀 돌연변이는 T366S, L368A 및 Y407V를 IgG1또는 IgG4 골격에 포함한다. 다른 면역글로불린 아이소타입에서 동등한 돌연변이가 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 당업자는 이중특이적 항체에 대해 사용된 2개의 절반-항체가 동일한 아이소타입인 것이 바람직하다는 것을 쉽게 인정할 것이다.

다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 생산하는 예시적이고 비제한적인 기술이 섹션 III에 제공되어 있다.

2개를 초과하는 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft 등 J. Immunol. 147: 60 (1991).

일부 구현예에서, 두 사슬 단백질은 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체의 일부이다. 다중특이적 항체 또는 이중특이적 항체는 본 개시내용의 둘 이상의 1가 항체를 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 제1 항원 결합 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 하나 이상의 중쇄 불변 도메인은 제1 CH1 (CH1 ₁ ) 도메인, 제1 CH2 (CH2 ₁ ) 도메인, 제1 CH3 (CH3 ₁ ) 도메인으로부터 선택되고; 이중특이적 항체의 제2 항원 결합 도메인은 하나 이상의 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 하나 이상의 중쇄 불변 도메인은 제2 CH1 (CH1 ₂ ) 도메인, 제2 CH2 (CH2 ₂ ) 도메인, 및 a 제2 CH3 (CH3 ₂ ) 도메인으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 도메인의 하나 이상의 중쇄 불변 도메인 중 적어도 하나는 제2 항원 결합 도메인의 또 다른 중쇄 불변 도메인과 쌍을 이룬다. 일부 구현예에서, CH3₁ 및 CH3₂ 도메인 각각은 돌출부 또는 공동을 포함하고, 여기서 CH3₁ 도메인에서 돌출부 또는 공동은 각각 CH3₂ 도메인에서 공동 또는 돌출부에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, CH3₁ 및 CH3₂ 도메인은 상기 돌출부와 공동 사이 계면에서 만난다. CH3₁ 및 CH3₂ 도메인에서 아미노산 치환의 예시적인 세트는 본원에서 표 2에 나타나 있다. 일부 구현예에서, CH2₁ 및 CH2₂ 도메인 각각은 돌출부 또는 공동을 포함하고, 여기서 CH2₁ 도메인에서 돌출부 또는 공동은 각각 CH2₂ 도메인에서 공동 또는 돌출부에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, CH2₁ 및 CH2₂ 도메인은 상기 돌출부와 공동 사이 계면에서 만난다. 일부 구현예에서, IgG의 CH3₁ 및/또는 CH3₂ 도메인은 미국 특허 번호 8,216,805의 도 5에서 나타낸 바와 같이 아미노산 넘버링에 따른 347, 349, 350, 351, 366, 368, 370, 392, 394, 395, 398, 399, 405, 407, 및 409로 구성된 군으로부터 선택된 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, 돌출부는 아르기닌 (R) 잔기, 페닐알라닌 (F) 잔기, 티로신 (Y) 잔기, 및 트립토판 (W) 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도입된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 공동은 알라닌 (A) 잔기, 세린 (S) 잔기, 트레오닌 (T) 잔기, 및 발린 (V) 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도입된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, CH3 및/또는 CH2 도메인은 IgG (예를 들어, IgG1 아형, IgG2 아형, IgG2A 아형, IgG2B 아형, IgG3, 아형, 또는 IgG4 아형)로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체의 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366Y를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 Y407T를 포함한다. 일부 구현예에서, 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366W를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 Y407A를 포함한다. 일부 구현예에서, 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 F405A를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394W를 포함한다. 일부 구현예에서, 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366Y 및 F405A를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394W 및 Y407T를 포함한다. 일부 구현예에서, 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366W 및 F405W를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394S 및 Y407A를 포함한다. 일부 구현예에서, 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 F405W 및 Y407A를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T366W 및 T394S를 포함한다. 일부 구현예에서, 일 CH3 도메인은 아미노산 치환 F405W를 포함하고, 다른 CH3 도메인은 아미노산 치환 T394S를 포함한다. 돌연변이는 최초 잔기, 이어서 카밧 넘버링 시스템을 사용한 위치, 및 그 다음 도입 잔기에 의해 지정된다. 또한 미국 특허 번호 8,216,805의 도 5에서의 넘버링을 참고한다.

(vii) 단일-도메인 항체

일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 단일-도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 구현예들에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(매사추세츠 주 월섬의 도만티스 사( Domantis, Inc.); 예컨대, 미국 특허 제 6,248,516 B1을 참조한다). 일 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부로 구성된다.

(viii) 항체 변이체

일부 구현예들에서, 본원에 기재된 항체들의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들면, 항체의 상기 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 부호화하는 뉴클레오타이드 서열 내에 적절할 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기 결실, 및/또는 상기 아미노산 서열 내부로의 잔기 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 제작물이 원하는 특징을 갖는 한, 최종 제작물에 도달하기 위해 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이뤄질 수 있다. 상기 아미노산 변경은 서열이 만들어지는 시간에 대상체 항체 아미노산 서열 내에 도입될 수 있다.

(ix) 치환, 삽입, 및 결실 변이체

특정 구현예들에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 HVR들 및 FRs가 포함된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 제목 하에 표 1에 나타나 있다. 더 많은 실질적인 변화가 표 1의 "예시적 치환"이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 분류를 참조하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환은 관심 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예컨대, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별검사될 수 있다.

아미노산은 다음과 같이 공통적인 측쇄 성질들에 따라 그룹화될 수 있다:

a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

c. 산성: Asp, Glu;

d. 염기성: His, Lys, Arg;

e. 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;

f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존성 치환들은 이들 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 분류로 교환하게 할 것이다.

치환형 변이체의 한 유형은 모체 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환 (예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 생성된 변이체(들)은 모 항체에 대하여 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환형 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 이는 예를 들어, 파아지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기술 예컨대 본원에서 기재된 것을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게는, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이화되고, 파지 상에서 변이체 항체가 표시되며, 특정한 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)을 위해 선별검사된다.

변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어, 항체 친화성을 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 고주파수에서 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (참고, 예를 들어, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어 질 수 있고, 결과로 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리를 구축하고, 이로부터 재선택함에 의한 친화성 성숙은 예를 들어, Hoogenboom 등 in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 등, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)에 기재되어 있다.) 친화성 성숙의 일부 구현예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지향된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 안으로 도입된다. 이어서 제 2 라이브러리가 생성된다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 동정한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 포함하는데, 이때 몇 개의 HVR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 동정될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적이 된다.

특정 구현예들에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 상기 변경이 항원에 결합하는 상기 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에서 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 이루어질 수 있다. 상기 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열에 관한 특정 구현예들에서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 함유한다.

돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하기 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)은 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해 확인되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 상기 아미노산 위치에 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점을 동정한다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로서 표적되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 보유하는지를 판단하기 위하여 이 변이체들이 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예컨대, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.

(x) Fc 영역 변이체

특정 구현예들에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입됨으로써, Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어. 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 개시내용은 모든 효과기 기능은 아니지만 일부 효과기 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려하며, 이는 생체내 항체 반감기가 중요하지만 특정 효과기 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 대해 항체 변이체를 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체가 FcgR 결합은 부족하지만(따라서 유사하게 ADCC 활성의 부족), FcRn 결합 능력을 보유하도록 Fc 수용체(FcR) 결합 검정을 실시할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 단지 Fc(RIII를 발현하는 반면, 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII를 발현한다. 조혈 세포 상에 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비-제한적인 예는 미국 특허 제 5,500,362호 (참고, 예를 들어 Hellstrom, I. 등 Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)) 및 Hellstrom, I 등, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (참고 Bruggemann, M. 등, J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987))에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다(참고, 예를 들어, 유동 세포측정에 대해 ACTI?? 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96^® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI). 이러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 Clynes 등 Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같이 생체내, 예를 들어, 동물 모델에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 참조, 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(참고, 예를 들어, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 등, Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정이 또한 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(참고, 예를 들어, Petkova, S.B. 등, Int'l . Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).

감소된 효과기 기능를 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 가진 항체들을 포함한다(미국 특허 제 6,737,056호). 상기 Fc 돌연변이체들은 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 가진 Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 제 7,332,581을 참조).

FcR에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체가 기재된다. (참고, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 등, J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001).)

특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예시적인 구현예에서, 그것의 Fc 영역에 다음의 아미노산 치환을 포함하는 항체: S298A, E333A, 및 K334A.

일부 구현예에서, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 등 J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)에 기재된 바와 같은 변경된 (즉, 개선된 또는 줄어든) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 Fc 영역에서 변경이 이루어진다.

태아로 모계 IgG의 이동을 담당하는, 증가된 반감기와 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer 등, J. Immunol . 117:587 (1976) 및 Kim 등, J. Immunol . 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1 (Hinton 등))에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 가진 Fc 영역을 내부에 포함한다. 상기 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기들: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환, 예컨대, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제 7,371,826호)을 갖는 것을 포함한다. Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관련된 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제 5,648,260; 미국 특허 제 5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참조.

(xi) 항체 유도체

본 개시내용의 항체는 당해 기술에 알려져 있고 쉽게 이용가능한 추가적인 비단백질성 모이어티를 함유하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글라이콜 프로피온알데하이드는 물에서의 그것의 안정성으로 인하여 제조에 있어 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있고, 만약 하나를 초과한 중합체가 부착된 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.

III. 생산 방법

본 개시내용의 원핵 숙주 세포에 두 사슬을 포함하는 폴리펩타이드 (예를 들어, 2-사슬 폴리펩타이드)를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 방법은 다음 단계를 포함한다: 본 개시내용의 숙주 세포를 폴리펩타이드의 두 사슬의 발현에 적합한 조건 하에서 배양 배지에 폴리펩타이드의 두 사슬을 발현하고, 이에 의해 발현시 두 사슬이 숙주 세포에 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합되도록 배양하는 단계; 및 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 제거하는 단계.

본 개시내용의 임의의 숙주 세포 (예를 들어, 섹션 II에 기재된 바와 같은 것)가 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 개시내용의 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들) 및 본 개시내용의 하나 이상의 번역 단위 (예를 들어, 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 비-천연 조합으로 숙주 세포 염색체 상에 존재함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드 (염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부); 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드 (염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부); 및 샤페론 단백질 (예를 들어, 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소 또는 단백질 이황화물 산화환원효소)을 인코딩하고 비-천연 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능한 조합인 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드 (숙주 세포 염색체의 일부)를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드 (염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부); 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드 (염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부); 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하고 비-천연 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능한 조합인 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드 (숙주 세포 염색체의 일부); 및 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하고 비-천연 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능한 조합인 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드 (숙주 세포 염색체의 일부)를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드 (염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부); 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드 (염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부); 본 개시내용의 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하고 비-천연 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능한 조합인 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드 (숙주 세포 염색체의 일부); 본 개시내용의 펩티딜-프롤릴 이성화효소를 인코딩하고 비-천연 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능한 조합인 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드 (숙주 세포 염색체의 일부); 및 본 개시내용의 제2 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하고 비-천연 조합에서 본 개시내용의 프로모터와 작동 가능한 조합인 제5 번역 단위 (숙주 세포 염색체의 일부)를 포함한다. 임의의 상기 구현예의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 추가로 2-사슬 단백질의 제3 사슬을 인코딩하는 번역 단위를 포함한다(염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부).

일부 구현예에서, 숙주 세포는 폴리펩타이드의 두 사슬을 발현하도록 배양되고, 여기서 발현시 두 사슬은 숙주 세포에 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하도록 접히고 조합된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 두 사슬 폴딩 및 어셈블리는 적절한 3차원 두 사슬 단백질 형태, 두 사슬 단백질 어셈블리, 또는 둘 모두의 궁극적인 채택을 촉진하는 임의의 또는 모든 단계들을 지칭할 수 있다. 폴딩 및 어셈블리는 그것의 적절한 형태 및 폴딩 안으로 각 사슬의 폴딩 및 어셈블리를 지칭할 수 있거나 두 단백질 사슬의 분자간 연결에 의해 생성된 복합체의 폴딩 및 어셈블리를 지칭할 수 있다. 유사하게, 각 사슬은 접히고 조합되어 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성할 수 있거나, 또는 두 단백질 사슬의 분자간 연결에 의해 생성된 복합체는 접히고 조합되어, 전체적으로, 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성할 수 있다.

생물학적 활성 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에 간주된 기능을 수행할 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 생물학적 활성 폴리펩타이드의 기능은, 비제한적으로, 적절한 폴딩 또는 어셈블리, 또 다른 거대분자와 결합 또는 기타 상호작용, 및 효소적 활성을 포함할 수 있다. 예시로서, 생물학적 활성 항체는, 비제한적으로 본원에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 에피토프에 대한 결합 또는 항체 Fc 영역의 특성을 보유하는 것을 포함한, 항체에 간주된 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있는 항체를 지칭할 수 있다.

항체는 재조합 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생성을 위해, 상기 항체를 부호화하는 핵산을 분리하고 추가적인 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 인코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 구체적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함에 의해) 종래의 절차를 사용하여 시퀀싱될 수 있다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 구성요소는 일반적으로, 비제한적으로, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은, 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 증진제 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

다중특이적 ( 예를 들어, 이중특이적) 항체 생산

본 개시내용의 특정 측면은 (예를 들어, 제1 항원을 결합할 수 있는 제1 절반 항체 및 제2 항원을 결합할 수 있는 제2 절반 항체를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 항원은 선택적으로 상이한) 이중특이적 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에서 기재된 바와 같은 제1 절반 항체를 생산하는 단계로, 상기 제1 절반 항체는 본 개시내용의 번역 단위에 의해 인코딩된 중쇄 및 경쇄 (예를 들어, 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)의 일부)를 포함하는, 단계; 및 본원에서 기재된 바와 같은 제2 절반 항체를 생산하는 단계로, 상기 제2 절반 항체는 본 개시내용의 번역 단위에 의해 인코딩된 중쇄 및 경쇄 (예를 들어, 하나 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드(들)의 일부)를 포함하는, 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 절반-항체 중 하나는 본 개시내용의 적어도 하나의 놉-형성 돌연변이를 포함하고, 제1 및 제2 절반-항체 중 다른 것은 본 개시내용의 적어도 하나의 홀-형성 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 이중특이적 항체를 생성하도록, 환원 조건에서, 제1 절반 항체를 제2 절반 항체와 조합시키는 단계를 추가로 포함한다. 절반 항체 생산 및 이중특이적 항체 어셈블리에 대한 예시적인 방법이 아래에제공된다.

하나 이상의 상응하는 놉- 또는 홀-형성 돌연변이를 갖는 변형된 면역글로불린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 당업계에서 알려진 표준 재조합 기술 및 세포 시스템을 사용하여 발현되고 정제될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 5,731,168호; 5,807,706호; 5,821,333호; 7,642,228호; 7,695,936호; 8,216,805호; 미국 특허 제 2013/0089553호; 및 Spiess 등, Nature Biotechnology 31: 753-758, 2013을 참조한다. 변형된 면역글로불린 폴리펩타이드는 원핵 숙주 세포, 예컨대 E. 콜리를 사용하여 생산될 수 있다. 대응하는 손잡이- 및 구멍-보유 면역글로불린 폴리펩티드는 공-배양물 내 숙주 세포에서 발현될 수 있고 이종다량체로서 함께 정제될 수 있거나, 단일 배양물에서 발현되고, 별도로 정제되며, 시험관내 조립될 수 있다. 일부 구현예들에서, 박테리아성 숙주 세포의 2개 균주(하나는 손잡이를 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현하고, 다른 하나는 구멍을 갖는 면역글로불린 폴리펩티드를 발현함)는 당해 분야에 공지된 표준 박테리아성 배양 기술을 이용하여 공-배양된다. 일부 구현예들에서, 상기 2개의 균주는, 예컨대, 배양물에서 동등한 발현 수준을 달성하기 위해 특이적 비로 혼합될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 2개의 균주는 50:50, 60:40, 또는 70:30 비로 혼합될 수 있다. 폴리펩티드 발현 이후, 상기 세포들은 함께 용해될 수 있고, 단백질은 추출될 수 있다. 동종-다량체 대 이종-다량체 종의 존재비를 측정하는 당해 분야에 공지된 표준 기술들은 크기 배제 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각 변형된 면역글로불린 폴리펩타이드는 표준 재조합 기술을 사용하여 별도로 발현되고, 회수되고 시험관내에서 함께 조립될 수 있다. 아래에 더 상세히 기재된 바와 같이, 어셈블리는, 예를 들어, 각 변형된 면역글로불린 폴리펩타이드를 정제하고, 이들을 동등한 질량으로 함께 혼합 및 인큐베이팅하고, (예를 들어, 디티오트레이톨로 처리함에 의해) 이황화물을 환원하고, 농축하고, 및 폴리펩타이드를 재산화시킴에 의해 달성될 수 있다. 형성된 이중특이적 항체들은 양이온-교환 크로마토그래피를 포함한 표준 기술들을 이용하여 정제할 수 있고, 크기 배제 크로마토그래피를 포함한 표준 기술들을 이용하여 측정할 수 있다. 상기 방법에 관한 좀 더 자세한 설명은, Speiss 등, Nat Biotechnol 31:753-8, 2013을 참조한다.

놉 또는 홀 돌연변이 중 어느 하나를 함유하는 절반-항체는 박테리아 숙주 세포 (예를 들어, E. 콜리 )에서 중쇄 및 경쇄 작제물을 발현함에 의해 별개 배양에서 생성된다. 각각의 절반-항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 별도로 정제될 수 있다. 놉 및 홀 절반-항체로부터 정화된 세포 추출물은 HiTrap MabSelect SuRe?? 칼럼에 의해 정제될 수 있다. 상이한 특이성을 갖는 단백질 A 정제된 절반 항체는 환원제의 존재에서 시험관내 산화환원 반응에서 이중특이적 항체를 형성하도록 조립될 수 있다.

임의의 적합한 방법이 원하는 환원 조건을 준비하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 환원 조건은 반응 (예컨대 본 발명의 어셈블리 혼합물)에 환원제/환원제를 부가함에 의해 제조될 수 있다. 적합한 환원제는 비제한적으로 디티오트레이톨 (DTT), 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP), 티오글라이콜 산, 아스코르브산, 티올 아세트산, 글루타티온 (GSH), 베타-머캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, GSH/글루타티온 이황화물 (GSSG), 시스테아민/시스타민, 글라이실시스테인, 및 베타-머캅토에탄올, 바람직하게는 GSH를 포함한다. 특정 특정 구현예에서, 환원제는 비제한적으로 GSH, 베타-머캅토에틸아민, 시스테인/시스틴, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글라이실시스테인, 및 베타-머캅토에탄올, 바람직하게는 GSH를 포함한 약한 환원제이다. 특정 바람직한 구현예에서, 환원제는 GSH이다. 특정 구현예에서, 환원제는 DTT가 아니다. 반응에서 원하는 환원 조건을 달성하기 위해 적합한 농도에서 그리고 적합한 실험 조건 하에서 적합한 환원제를 선택하는 것은 당업자의 능력 이내이다. 예를 들어, 20^oC에서 10g/L의 이중특이적 항체 단백질 농도를 갖는 용액에 10 mM L-환원된 글루타티온은 약 - 400Mv의 개시 산화환원 전위를 초래할 것이다. 예를 들어, 어셈블리 혼합물에 첨가된 글루타티온은 놉-인투-홀 이중특이적 어셈블리에 유리한 약한 환원 조건을 만든다. 유사한 부류에서의 다른 환원제 예컨대 BMEA (베타-머캅토에틸아민)가 유사한 효과를 가질 것이다. 본원에 전체적으로 인용되어 포함된 WO2013/055958을 참고한다. 반응의 환원 조건은 당해 분야에서 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 추정되고 측정될 수 있다. 예를 들어, 환원 조건은 레사주린 인디케이터 (환원 조건에서 블루에서 무색으로 탈색화)를 사용하여 측정될 수 있다. 보다 정확한 측정을 위해, 산화환원-전위계 (예컨대 BROADLEY JAMES®에 의해 제작된 ORP 전극)가 사용될 수 있다.

특정 특정 구현예에서, 환원 조건은 약한 환원 조건이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "약한 환원제" 또는 "약한 환원 조건"은 25℃에서 음성 산화 전위를 갖는 환원제에 의해 제조된 환원제 또는 환원 조건을 지칭한다. 환원제의 산화 전위는 pH가 7 내지 9이고, 온도가 15℃ 내지 39℃일 때, 바람직하게는 -50 내지 -600 mV, -100 내지 -600 mV, -200 내지 -600 mV, -100 내지 -500 mV, -150 내지 -300 mV, 더 바람직하게는 약 -300 내지 -500 mV, 가장 바람직하게는 약 -400mV이다. 당업자는 원하는 환원 조건을 만들기에 적합한 환원제를 선택할 수 있을 것이다. 숙련된 연구자는 강한 환원제, 즉, 동일한 농도, pH 및 온도에 대해 상기 언급된 환원제보다 더 음성 산화 전위를 갖는 것이 더 낮은 농도에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 구현예에서, 단백질은 상기-언급된 조건 하에서 인큐베이션될 때 환원제의 존재에서 이황화물 결합을 형성할 수 있을 것이다. 약한 환원제의 예는 비제한적으로 글루타티온, 베타-머캅토에틸아민, 시스틴/시스테인, GSH/GSSG, 시스테아민/시스타민, 글라이실시스테인, 및 베타-머캅토에탄올을 포함한다. 특정 구현예에서, GSH:항체의 200X 몰비의 것에 유사한 산화 전위는 다른 환원제를 사용한 효율적인 어셈블리가 예상될 수 있는 약한 환원 조건에 대한 참조점으로서 사용될 수 있다.

글루타티온 농도는 어셈블리 혼합물에 존재하는 절반-항체의 양에 관하여 몰농도 관점에서 또는 몰비 또는 몰 과잉 관점에서 표현될 수 있다. 환원제의 표적 몰비를 사용하는 것은 어셈블리 혼합물에서 단백질 농도를 조절하며; 이는 가변 단백질 농도의 결과로 과잉 환원 또는 과소 환원을 방지한다. 특정 다른 구현예에서, 환원제는 절반 항체의 총량에 관하여 2-600X, 2-200X, 2-300X, 2-400X, 2-500X, 2-20X, 2-8X, 20-50X, 50-600X, 50-200X, 또는 100-300X 몰 과잉, 바람직하게는 50-400X, 더 바람직하게는 100-300X, 및 가장 바람직하게는 200X 몰 과잉으로 어셈블리 혼합물에 첨가된다. 특정 구현예에서, 어셈블리 혼합물은 7 내지 9, 바람직하게는 pH 8.5의 pH를 갖는다.

특정 구현예에서, 제1 절반 항체 및 제2 절반 항체의 배양물은 조합되고 후속으로 조합된 배양물에 용해될 수 있다. 조합으로 방출된 제1 절반 항체 및 제2 절반 항체는 환원 조건에서 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 전체적으로 본원에 인용되어 표함된 WO 2011/133886을 참고한다.

상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인들(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열들에 융합된다. 상기 융합은 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖고, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 상기 융합들 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 상기 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원하는 경우, 상기 면역글로불린 경쇄를 부호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 공동 형질감염된다. 이는 구성에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예들에서 상기 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정함에 있어 큰 가요성을 제공한다. 하지만, 균등 비에서 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 산출하는 경우, 또는 상기 비가 특별한 유의성이 없는 경우, 한 발현 벡터에서 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 부호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

상기 접근법의 일 구현예에서, 이중특이적 항체들은 하나의 팔에 제1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항제의 생성에 관한 추가적인 세부사항은, 예를 들어 Suresh 등, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)을 참고한다.

WO96/27011에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수된 이종이량체의 비율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 일 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄들(예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄들을 작은 측쇄들(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하여 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동들"이 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비하여 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.

이중특이적 항체들은 가교 결합된 또는 "이종 접합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종 접합체 내 항체들 중 하나가 아비딘에 커플링되고, 다른 항체가 비오틴에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체들은 원치 않는 세포들에 대하여 면역계 세포들을 표적하기 위해(미국 특허 제 4,676,980호), 그리고 HIV 감염을 치료하기 위해(WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되었다. 이종 접합체 항체들은 임의의 편리한 가교결합 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교 결합제들은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제 4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편들로부터 이중특이적 항체들을 생성하기 위한 기술들은 또한 하기 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체들은 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. Brennan 등, Science, 229: 81 (1985)은 온전한 항체가 F(ab')₂ 단편을 생성하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단되는 절차를 기술한다. 상기 단편들은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재 하에서 환원된다. 그런 다음, 생성된 Fab' 단편들은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그런 다음, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 메르캅토에틸아민과의 환원에 의하여 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 상기 생성된 이중특이적 항체들은 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.

최근의 발전은 대장균으로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 회수하는 것을 수월하게 하며, 이들은 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby 등, J. Exp . Med ., 175: 217-225 (1992)는 완전 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생성을 기재한다. 각 Fab' 단편은 대장균으로부터 별도로 분비되고, 시험관 내에서 지시된 화학적 커플링이 이루어져 이중특이적 항체를 형성하였다.

재조합 세포 배양물로부터 직접 유래한 이중특이적 항체 단편들을 제조하고 분리하는 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체들은 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다. Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체들은 힌지 영역에서 환원되어 단량체들을 형성한 후, 재-산화되어 항체 이종이량체들을 형성하였다. 상기 방법은 또한 항체 동종이량체들의 생성을 위하여 이용될 수 있다. Hollinger 등, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편들을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 상기 단편들은 동일한 쇄 상의 두 도메인 간 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_H)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_L)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인이 또 다른 단편의 상보적 V_L and V_H 도메인과 쌍을 형성하도록 유도되어 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되었다. Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994)를 참조한다.

이중특이적 항체 단편을 만들기 위한 또 다른 기술은 "이중특이적 T 세포 연관체" 또는 BiTE® 접근법이다(참고, 예를 들어, WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261, 및 WO2008/119567). 이 접근법은 단일 폴리펩타이드 상에 배열된 2개 항체 가변 도메인을 이용한다. 예를 들어, 단일 폴리펩타이드 사슬은 2개 도메인 사이에서 분자내 회합을 허용하기에 충분한 길이의 폴리펩타이드 링커에 의해 분리된 가변 중쇄 (V_H) 및 가변 경쇄 (V_L) 도메인을 각각 갖는 두 단일 사슬 Fv (scFv) 단편을 포함한다. 이 단일 폴리펩타이드는 추가로 2개 scFv 단편 사이에 폴리펩타이드 스페이서 서열을 포함한다. 각 scFv는 상이한 에피토프를 인식하고, 이들 에피토프는 상이한 세포 유형에 특이적일 수 있어서, 이로써 각 scFv가 그것의 동족 에피토프와 계합되는 경우 2개의 상이한 세포 유형의 세포가 근접해서 접촉되거나 또는 결박된다. 이 접근법의 하나의 특정 구현예는 표적 세포, 예컨대 악성 또는 종양 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원을 인식하는 또 다른 scFv에 연결된, 면역 세포에 의해 발현된 세포-표면 항원, 예를 들어, T 세포 상의 CD3 폴리펩타이드를 인식한 scFv를 포함한다.

그것이 단일 폴리펩타이드이므로, 이중특이적 T 세포 연관체는 당업계에서 알려진 임의의 원핵 세포 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있다. 그러나, 특이적 정제 기술 (참고, 예를 들어, EP1691833)은 단량체의 의도된 활성 이외의 생물학적 활성을 가질 수 있는, 다른 다량체 종으로부터 단량체성 이중특이적 T 세포 연관체를 분리하는데 필요할 수 있다. 하나의 예시적인 정제 반응식에서, 분비된 폴리펩타이드를 함유한 용액은 먼저 금속 친화성 크로마토그래피 처리되고, 폴리펩타이드는 이미다졸 농도의 구배로 용리된다. 이 용출물은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제되고, 폴리펩타이드는 염화나트륨 농도의 구배로 사용하여 용리된다. 마침내, 이 용출물은 크기 배제 크로마토그래피 처리되어 다량체 종으로부터 단량체를 분리한다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

두 사슬 단백질 예컨대 전장 항체 또는 절반 항체, 항체 융합 단백질, 한팔 항체, 및 항체 단편은, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요없는 경우, 예컨대 치료적 항체가 종양 세포 파괴에서 그 자체로 유효성을 보이는 세포독성 약물 (예를 들면, 독소)에 접합된 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 전장 항체들은 순환 중에 더 큰 반감기를 갖는다. 대장균 내 생성은 더 빠르고 더욱 비용 효율적이다. 박테리아 내에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제 5,648,237호(Carter 등), 미국 특허 제 5,789,199호(Joly 등), 미국 특허 제 5,840,523호(Simmons 등)를 참조하며, 이는 발현 및 분비를 최적화하기 위한 번역 개시 영역(TIR) 및 신호 서열을 기재한다. E. 콜리 내에서의 항체 단편의 발현을 기술하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254를 또한 참고한다. 발현 후, 상기 항체는 대장균 세포 덩어리 페이스트로부터 분리될 수 있고, 예컨대, 이소형에 의존한 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는, 예컨대, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하는 공정과 유사하게 실시될 수 있다.

숙주 세포는 두 사슬 단백질 생산을 위한 본 개시내용의 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 그리고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양소에서 배양된다.

숙주 세포 배양

본 개시내용의 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "배양 배지"는 본 개시내용의 박테리아의 성장을 뒷받침하는 임의의 조성물 또는 액체 배지를 지칭한다. 적합한 배양 배지는 액체 또는 고체일 수 있고 세포의 성장 및 생존력을 뒷받침하는 임의의 영양소, 염, 완충액, 요소, 및 다른 화합물을 함유한다. 배양 배지의 공통 영양소는 질소, 탄소, 아미노산, 탄수화물, 미량 원소, 비타민, 및 미네랄의 공급원을 포함할 수 있다. 이들 영양소는 개별 구성요소 (한정된 배양 배지 경우) 또는 복합체 추출물의 구성성분 (예를 들어, 효모 추출물)으로 첨가될 수 있다. 배양 배지는 급속 성장을 뒷받침하기 위해 영양소-풍부하거나 또는 느린 성장을 뒷받침하기 위해 최소일 수 있다. 배양 배지는 또한 성장을 억제하거나 오염 유기체를 사멸시키기 위해 사용되는 임의의 제제 (예를 들어, 항생제)를 함유할 수 있다. 배양 배지는 또한 유도성 프로모터 또는 효소의 활성을 조절하기 위해 사용되는 임의의 화합물을 함유할 수 있다(일 예로서, IPTG는 lac 오페론 또는 기능적으로 유사한 프로모터에 의해 제어된 임의의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하기 위해 포함될 수 있다). 적합한 배양 배지의 많은 예가 당해 분야에서 잘 알려져 있고 비제한적으로 M9 배지, Lysogeny 액체배지 (LB), Terrific 액체배지 (TB), NZY 액체배지, SOB 배지, 및 YT 액체배지를 포함한다.

임의의 이들 배지에는 필요에 따라 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액 (예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제, 항진균제, 미량 원소 (마이크로몰 범위인 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의된 것), 글루코스, 및/또는 적절한 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 원핵 세포 배양 배지에서 발견되는 전형적인 성분은 효모 추출물, 염 (예를 들어, NaCl), 트립톤, 완충액 (예를 들어, 인산염 버퍼), 글리세롤, 등을 포함한다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 당업자들에게 공지될 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 등은 발현을 위해 선택된 원핵 숙주 세포에서 이전에 함께 사용된 것들이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다.

생물학적 활성 폴리펩타이드의 정제

본 개시내용의 특정 측면은 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 회수하는 것에 관한 것이다. 전형적으로 본 개시내용의 생물학적 활성 폴리펩타이드를 회수하는 것 (용어들 "정제하는 것" 또는 "정제"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있음)은 숙주 세포 (또는 폴리펩타이드가 배지 안으로 배출된 경우 세포 배양 배지)로부터 폴리펩타이드를 단리하는 것과 다른 회합된 거대분자, 예를 들어, 세포 잔해 및 다른 폴리펩타이드로부터 폴리펩타이드를 정제하는 것을 수반한다. 다양한 숙주 세포 구획으로부터 다양한 단백질을 정제하는 다수의 기술이 당해 기술에 알려져 있다(참고, 예를 들어, Evans, Jr., TC and Xu MQ (eds.) Heterologous Gene Expression in E. coli (2011) Methods in Molecular Biology Vol 705, Humana Press). 예시적인 기술은 아래에 기재되어 있으나, 이들은 당업자의 이해를 보충하기 위해 단지 예시적인 목적을 위해 포함되고 결코 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

재조합 기술을 사용하는 경우, 두 사슬 단백질 예컨대 분비 단백질은 세포내에서 생성되거나, 주변세포질의 공간에서 생성되거나, 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 분비 단백질이 세포내에서 생성된 경우, 제1 단계로서, 미립자 잔해, 숙주 세포 또는 용해된 단편은, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다.

일부 구현예에서, 분비 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수된다. Carter 등, Bio/기술 10:163-167 (1992)은 E. 콜리의 주변세포질의 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 기술한다. 간략하게는, 세포 덩어리를 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐서 해동시킨다. 세포 파편은 원심 분리로 제거할 수 있다. 분비 단백질이 배지 내로 분비되는 경우, 이런 발현 시스템으로부터 상청액은 일반적으로 먼저, 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 사용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 억제하기 위한 전술한 단계들 중 임의의 것에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 분비 단백질 조성물은, 예를 들어, 하이드록실인회석 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중에서 한 가지이다. 항체에 관하여, 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반하여 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다(Lindmark 등, J. Immunol . Meth . 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입에 대해 그리고 인간 γ3에 대해 권고된다(Guss 등, EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 많은 경우에 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 입수 가능하다. 기계적으로 안정된 매트릭스, 예컨대 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABX^TM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)이 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온 교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE^TM에서 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼)에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전 역시 회수되는 항체에 따라서 가용하다. 당해 분야의 숙련가는 항체 회수에 유용한 많은 이들 기술이 다른 두 사슬 단백질, 예컨대 분비 단백질을 회수하는데 쉽게 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

실시예

본 개시내용은 하기 실시예를 참조하면 더욱 완전히 이해될 것이다. 그러나, 그것은 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이들의 견지에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.

실시예 1: 샤페론 DsbA , DsbC , 및 FkpA의 발현을 조절하는 염색체로 통합된 프로모터로 E. 콜리 균주 조작

플라스미드로부터 샤페론 DsbA, DsbC, 및 FkpA의 과발현은 박테리아 배양에서 항체-기반 생성물 생산을 개선할 수 있다. 그러나, 플라스미드로부터 이들 샤페론의 발현은 몇 개의 약점을 가진다. 예를 들어, 이러한 접근법은 각각의 신규한 생성물에 대해 발현 플라스미드의 개발 및 조정을 필요로 한다. 큰 플라스미드 크기는 또한 일부 경우에 낮은 생성물 역가를 초래한다. 또한, 플라스미드는 전형적으로 세포당 10-15 카피로 존재하여, 생성물로부터 샤페론 단백질 (예를 들어, FkpA)을 제거하기 위해 다운스트림 정제 단계(들)를 요할 수 있는 높은 수준의 과발현을 초래한다. 일부 경우에, 동일한 생성물 역가는 하나 이상의 샤페론의 더 낮은 발현 수준으로 달성될 수 있다.

여기서, 샤페론을 염색체로 과발현하는 조작된 균주를 생성하기 위해 E. 콜리 게놈 내의 dsbA, dsbC, 및 fkpA의 천연 프로모터가 비-천연 조합에서의 프로모터 phoA, tac, 및 CP25와 교환되었다. 이들 균주는 2개 절반-항체 (본원에서 "xIL13"으로 지칭된, 항-IL13 절반-항체, 및 AF2), 한팔 항체 (MetMAb), 및 항체 Fab 단편 (항-VEGF 항체 단편)을 생산하는데 사용하기 위해 조사되었다.

방법

벡터 구축

xIL13 (MD157) 또는 AF2 (MD341) 및 샤페론을 발현하는 벡터는 WO2016073791 (참조, 예를 들어, 단락 278 및 279, 281-284, 285-288)에 기재된 바와 같은 구축되었다.

균주 조작

phoA (참고 Wanner B.L. (1990) Colloqium Mosbach , Mol . Basis Bact . Metab . P.41), tac ( 참고 de Boer H.A. 등 (1983) PNAS 80, P.21-5), 및 CP25 (참고 Jensen P.R. and Hammer K. (1998) Appl . Environ. Microbiol . 64, P.82-87) 프로모터는 E. 콜리 게놈 안으로 통합되어 천연 프로모터 dsbA, dsbC, 및 fkpA를 대체한다. 이들 프로모터 변형은 대립유전자 교환을 통해 수행되었다(참조, 예를 들어, Bass, S. 등 (1996) J. Bacteriol . 178:1154-1161 및 Innes, D. 등 (2001) Microbiology 147:1887-1896.).

간략하게, pS1080-기반 자살 벡터는 NEBuilder® HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스 (Gibson Assembly)로 구축되어 E. 콜리 게놈에 원하는 삽입 영역에 매칭하는 상동성 서열의 500 염기쌍에 의해 각 측면 상에 측접된, 관심 있는 프로모터를 포함했다. 확인을 위한 서열분석 후, 박테리오파아지 M13 및 P1이 균주 48C8을 플라스미드 서열로 감염시키고 도입된 서열을 관심 있는 균주에 형질도입하기 위해 사용되었다(참조, 예를 들어, Nakashima, N. and Miyazaki, K. (2014) Int . J. Mol . Sci. 15:2773-2793). 공급원 플라스미드로부터 취해진 프로모터를 샤페론의 유전자간 영역 업스트림에 대체했다. 이것은 E. 콜리 게놈 내의 dsbA, dsbC, 및 fkpA 의 천연 프로모터를 pS1080 자살 벡터로부터의 phoA, tac, 및/또는 CP25 프로모터로의 대체를 초래했다. tac 프로모터로부터 발현을 더욱 증강시키기 위해 lacI 유전자에 대한 변형이 또한 이루어졌다. 생성된 균주의 바이알 로트가 생산되고 -80℃에서 저장되었다.

진탕 플라스크 배양 및 발효 공정

조작된 균주 (참고 표 B)는 다음에서 배양되었다: 표준 진탕 플라스크 배양 (Sh. Fl.) 및 10 리터 발효 (10 L). 10 리터 발효는 WO2016073791 (참조, 예를 들어, 단락 289-292)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 그것의 천연 프로모터로부터 발현된 샤페론 만을 함유하는 균주 67A6 및 64B4는 음성 대조군으로 사용되었다(즉, Sh.Fl. (-) 및 Ambr (-)). 양성 대조군 경우, 이들 균주는 DsbA, DsbC, 및 FkpA를 발현하는 플라스미드로 형질전환되었다(참고 표 A) (즉, Sh.Fl. (+), Ambr (+), 및 10 L (+)).

전기영동, 웨스턴 블랏, 및 HPLC 분석

DsbA, DsbC, 및 FkpA 상대 농도는 웨스턴 블랏에 의해 측정도었다. xIL13, AF2, MetMAb, 및 항-VEGF 항체 단편 농도는 역상 HPLC에 의해 측정되었다. 전기영동, 웨스턴 블랏, 및 HPLC 분석 방법은 WO2016073791 (참조, 예를 들어, 단락 293-299)에 기재된 바와 같이 수행되었다.

결과

벡터는 E. 콜리.에서 항체-기반 생성물 xIL13, AF2, MetMAb, 및 항-VEGF 항체 단편의 과발현을 위해 구축되었다. xIL13을 발현하는 벡터에 대한 대표적인 플라스미드 맵은 도 1에 도시되어 있다. 각 벡터는 하기 표 A에 상세히 기술된 바와 같이, xIL13, AF2, MetMAb, 또는 항-VEGF 항체 단편 및 (1) 무 샤페론 유전자 (예를 들어, 도 1, 우측), 또는 (2) dsbA, dsbC, 및 fkpA 의 조합 (예를 들어, 도 1, 좌측)을 인코딩하는 유전자를 함유한다. 이들 벡터를 함유하는 균주는 조작된 균주에서 단백질 발현을 평가할 때 양성 대조군로서 사용될 수 있다.

또한, E. 콜리 게놈에서 이들 샤페론의 천연 프로모터를 tac, phoA, 및 CP25 프로모터와 교환함에 의해 주변세포질의 샤페론 DsbC, DsbA, 및 FkpA 중 하나 이상의 과발현을 위해 17개 균주가 구축되었다. 균주의 lacI 배경은 또한 lacI (ΔlacI 및 Δ lacI:kan)을 결실, lacI (lacI ⁺ 또는 lacI WT)의 야생형 카피 삽입, 또는 온전한 모 균주의 원래의 lacI ^Q 돌연변이 제거에 의해 tac 프로모터로부터 발현을 추가로 증강시키기 위해 조작되었다. lacI 유전자 산물은 tac 프로모터로부터의 발현을 억제하고, 따라서 lacI의 결실은 tac 프로모터로부터 더 높은 발현을 초래한다. lacI ^Q 돌연변이는 lacI의 증가된 수준의 전사를 초래하여, tac 프로모터의 강력한 억제를 유도한다(참고 Calos (1978) Nature 274, P.762-765). 추가로, tac 프로모터는 IPTG로 유도될 수 있다. 표 B는 lacI 유전자 변형에 부가하여 조작된 프로모터 변형을 나타내는 조작된 균주를 열거한다.

실시예 2: 염색체로 통합된 프로모터의 제어 하에 FkpA의 과발현

FkpA의 과발현은 FkpA를 발현하는 플라스미드를 잠복시키는 균주와 비교될 때, 천연 FkpA를 과발현하는 통합된 프로모터로 실시예 1에 기재된 바와 같이 조작된 균주 중에서 비교되었다.

염색체로 과발현되는 FkpA의 능력을 평가하기 위해, FkpA의 천연 프로모터는 실시예 1의 방법에 따라 tac, phoA, 또는 CP25 프로모터와 교환되었다. tac 프로모터의 강도를 더욱 증강시키기 위해 lacI 프로모터에 대한 변형이 또한 이루어졌다. 균주는 10 리터 발효에서 성장되었고 FkpA 생산에 대해 웨스턴 블랏에 의해 평가되었다.

CP25 프로모터에 의해 유도된 염색체 발현은 최고 수준의 FkpA 발현과, 이어서 phoA 프로모터 (도 2)에 의해 유도된 발현을 나타내었다. tac 프로모터는, 예상된 바와 같이, lacI WT 배경에서보다 ΔlacI 배경에서 더 높은 FkpA 발현으로, 최저 수준의 FkpA 발현을 나타내었다.

이와 같이, FkpA 발현의 범위는 플라스미드-발현된 fkpA 유전자좌의 사용을 통한 높은 발현의 단일 수준과 비교하여, 염색체 조작을 통해 생산되었다. 이들 결과는 FkpA의 발현이 염색체 과발현을 통해 제어되고 증강될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 3: 진탕기 플라스크 배양에서 tac , phoA , 및 CP25 프로모터의 제어 하에 샤페론의 염색체 발현

DsbA, DsbC, 및 FkpA의 프로모터 변형을 갖는 균주에서 샤페론 발현을 평가하기 위해, 배양물은 진탕 플라스크에서 성장되었고, 이들 샤페론의 발현은 웨스턴 블랏을 사용하여 측정되었다.

발현 수준의 범위가 관찰되었다(도 3a-3c). DsbA 경우, CP25 프로모터로부터의 발현은 가장 강력하여, 양성 대조군에서 나타난 발현의 수준을 초과하였다(Sh. Fl. (+) 및 10 L (+); 플라스미드로부터 DsbA 발현) (도 3a). 다음 최고 DsbA 수준은 예상된 바와 같이 phoA 그 다음 tac, 그리고 DsbA의 tac 프로모터 상승된 발현 수준의 IPTG 유도에 의해 생산되었다. tac 프로모터 단독으로부터의 발현은 음성 대조군보다 낮았으며 (Sh. Fl. (-), 무 외인성 샤페론 발현) 이는 이 균주의 억제성 lacI ^Q 배경에 기인하기 쉽다. 유사하게, DsbC 발현은 증가된 DsbC 발현으로 이어지는 tac 프로모터의 IPTG 유도로, tac 프로모터에 비하여 phoA 프로모터로 더 높았다(도 3b). tac 프로모터 단독으로부터 DsbC 발현은 또한 음성 대조군보다 낮았다(Sh. Fl. (-)).

흥미롭게도, FkpA 발현은 DsbA 및 DsbC 발현 결과에 비교할 때 조작된 균주 중에서 약간 상이하였다(도 3c). phoA 프로모터는 FkpA의 최고 발현과, 이어서 CP25 프로모터로부터의 발현을 유도했다. DsbA 및 DsbC와 마찬가지로, tac 프로모터는 최저 수준의 발현을 유도했다. 일반적으로, FkpA의 발현 수준은 천연 수준에 비하여 훨씬 높아 (Sh. Fl. (-)), 천연 FkpA 프로모터는 천연 DsbA 및 DsbC 프로모터에 비하여 더 약한 프로모터이다는 것을 함축한다.

함께, 이들 결과는 3개 샤페론 DsbA, DsbC, 및 FkpA의 발현은 염색체 과발현을 통해 모두 유사하게 제어되고 증강될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 4: ambr250 발효 배양에서 tac , phoA , 및 CP25 프로모터의 제어 하에 샤페론의 염색체 발현

샤페론의 염색체 과발현이 진탕 플라스크 배양으로부터 더 큰 발효 배양으로 번역될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 조작된 균주는 실시예 1에서의 방법에 따라 ambr250 높은 세포 밀도 발효에서 성장되었고 샤페론 발현이 웨스턴 블랏에 의해 측정되었다.

진탕 플라스크 배양과 마찬가지로, 발현 수준의 범위가 관찰되었다(도 4a-4c). DsbA 및 DsbC 경우, 상이한 lacI 배경을 갖는 단지 tac 프로모터만이 시험되었다. DsbA 및 DsbC 양자의 경우, lacI ^Q 배경을 갖는 tac 프로모터가 최저 수준의 발현을 생성한 반면, 진탕기 플라스크 배양에서 나타낸 바와 같이 lacI WT 배경을 갖는 IPTG-유도된 tac 프로모터는 최고 발현을 가졌다(도 4a & 4b). 진탕 플라스크에서 FkpA 발현과 달리, CP25 프로모터는 phoA 및 tac 프로모터에 비교할 때 ambR250 생물반응기에서 최고 FkpA 발현을 가졌다(도 4c).

함께, 이들 데이터는 염색체로 발현된 샤페론의 발현 패턴은 진탕기 플라스크로부터 10L 높은 세포 밀도 발효 공정으로 성공적으로 확장될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 5: 조작된 균주에서 xIL13절반-항체의 발현

절반-항체 xIL13의 생산에 대한 숙주 균주 (참고 표 B)에서 샤페론 과발현의 효과가 시험되었다.

숙주 균주는 xIL13을 발현하는 플라스미드 CS392로 형질전환되었다. 염색체로 과발현된 샤페론을 함유하지 않는 숙주 균주 67A6은 플라스미드 MD157로 형질전환되었으며, 이는 DsbA, DsbC, 및 FkpA와 함께 xIL13을 발현한다(도 1). 67A6/MD157은 양성 대조군으로 사용되었다. 모든 균주는 실시예 1에 기재된 바와 같은 10 L 발효에서 성장되었고, xIL13 생산은 역상 HPLC 역가 검정에 의해 평가되었다.

최상부 3개 xIL13 생산 균주 (69E1, 69F8, 및 69F4)는 양성 대조군에 비하여 더 크거나 동등한 역가의 xIL13을 생산하였으며, 여기서 xIL13은 플라스미드로부터 발현되었다(도 5). 균주 69E1로부터 최고 발현은 각각 phoA 및 CP25 프로모터에 의해 유도된 DsbC 및 FkpA를 함유했다. 이들 결과는 또한 xIL13 역가는 DsbA의 발현에 의해 상당히 영향을 받지 않았다는 것을 표시했다.

따라서, 3개 조작된 균주 69E1, 69F8, 및 69F4에서와 같이 염색체 조작은 xIL13과 함께 플라스미드 상에 샤페론을 공-발현하는 대안으로서 사용될 수 있어, 동등한 xIL13 역가를 초래한다.

실시예 6: 조작된 균주 69E1 , 69F4, 및 69F8에서 샤페론 및 xIL13 절반-항체의 발현

항체-기반 생성물 생산에서 균주 69E1, 69F4, 및 69F8의 사용을 추가로 조사하기 위해, 이들 균주는 72시간의 과정에 걸쳐서 xIL13 및 샤페론의 발현에 대해 보다 밀접하게 평가되었다. 실시예 5에 기재된 3개 조작된 균주는 실시예 1 및 5에 기재된 바와 같이, xIL13을 발현하도록 플라스미드 CS392로 형질전환되었다. 균주 67A6은 실시예 1에 기재된 바와 같이, xIL13 및 샤페론을 발현하도록 양성 대조군과 같은 플라스미드 MD157로 형질전환되었다. 모든 균주는 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 L 발효에서 성장되었고 xIL13 농도는 역상 HPLC 역가 검정에 의해 평가되었다.

발효 동안, 광학 밀도 (도 6a) 및 삼투질농도 (도 6b)가 측정되었다. 실험 균주와 플라스미드 대조군 균주 사이에 유의차는 관찰되지 않았다.

모든 3개 실험 균주 경우, xIL13 발현은 양성 대조군에 유사하거나 또는 그보다 약간 더 높아서, 균주 69E1 및 69F8은 72시간에서 최고 발현 수준을 가졌다(도 7a). 조작된 균주 발효의 DsbC 수준은 대다수의 발효 제어 과정에 비해 더 낮았다(도 7b). 이것은 플라스미드 기반 공정이 샤페론이 염색체로부터 발현되는 공정보다 훨씬 높은 카피수를 가지기 때문에 예상되었다. 69E1과 69F8 균주 발효 사이의 DsbC 수준은 유사하였으며, 이것은 둘 모두 발현을 위해 phoA 프로모터를 사용하기 때문에 예상되었다. 흥미롭게도, 수준은 발효의 종단을 향한 플라스미드 발현 수준에 유사하였다. DsbC는 69E1 및 69F8 균주에서 phoA 프로모터로부터 발현되고, 그래서 프로모터가 포스페이트의 존재에 기인하여 발효 안으로 18시간까지 유도되지 않았기 때문에 수준은 발효의 초기 부분 동안 더 낮았다. 포스페이트는 ~18시간까지 완전히 소비되었고 그 후 프로모터는 완전히 유도되어 보다 많은 DsbC 발현을 초래한다. 69F4 발효에서 DsbC 수준은 69E1 및 69F8 균주 발효에 비하여 초기에 더 높았는데 이는 69F4가 약한 tac 프로모터를 사용하고 배지에서의 포스페이트 수준에 독립적이기 때문이다. 이들 결과는 또한 phoA 프로모터가 진탕 플라스크 배양에서 수득된 발현 결과에 유사한 tac 프로모터에 비하여 더 강한 프로모터이다는 것을 나타낸다.

균주 69E1 및 69F4는 CP25 프로모터 하에서 FkpA를 발현하고 반면에 69F8은 phoA 프로모터 하에서 FkpA를 발현한다. 강한 구성적 CP25 프로모터는 플라스미드 수준 (여기서 FkpA는 phoA 프로모터 하에 있음; 도 7c)에 상당하는 높은 수준의 FkpA를 초래했다. 69F8 균주는 플라스미드-기반 공정에 비하여 낮은 수준에서 FkpA를 축적하였으며, 이는 양 경우가 FkpA 발현을 유도하기 위해 phoA 프로모터를 사용하더라도 카피수 차이 (플라스미드 경우 ~15 및 염색체 경우 1)에 기인할 수 있다. 그러나, 페이스 I 플라스미드 기초 공정과 69F8 균주 공정 사이의 역가 (도 7a)는 유사하여, 추가의 FkpA가 필요하지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 최종 풀에서 FkpA 수준을 감소시키기 위한 정제 전개에 부과된 부담에 기인하여, 고역가를 달성하는 능력을 갖는 감소된 FkpA 수준은 xIL13 공정에 대한 균주 69F8의 이점인 것으로 간주될 수 있다.

이들 데이터는 xIL13의 발현이 플라스미드 대조군에 비하여 높은 수준의 DsbC 및 FkpA를 반드시 필요로 하지는 않는다는 것을 시사한다. 비록 균주가 일반적으로 낮은 수준의 샤페론을 발현했지만 (비록 이 특징이 FkpA를 제거하기 위한 추가의 정제에 대한 필요성을 배제한다는 점에서 유리하지만), xIL13의 동등한 또는 더 높은 역가가 3가지 균주 모두로부터 생산될 수 있다.

실시예 7: 조작된 균주 69E1, 69F4, 및 69F8에서 절반-항체 AF2의 발현

절반-항체 AF2를 생산하는 균주 69E1, 69F4, 및 69F8의 능력이 평가되었다. 69E1, 69F4, 및 69F8 균주는 AF2를 발현하도록 플라스미드 ERD046으로 형질전환되었고, 균주 67A6은 실시예 1에 기재된 바와 같이 AF2 및 샤페론을 발현하도록 양성 대조군으로 플라스미드 MD341로 형질전환되었다. 균주는 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 L 발효에서 성장되었고 AF2 농도는 72시간의 과정에 걸쳐서 다양한 시점으로 평가되었다.

발효 동안, 광학 밀도 (도 8a) 및 삼투질농도 (도 8b)가 측정되었다. 실험 균주와 플라스미드 대조군 균주 사이에 유의차는 관찰되지 않았다. AF2의 발현은 균주 69E1에서 최고였으며, 이는 플라스미드 대조군에서 관찰된 역가를 능가하였다(도 9). 균주 69F4 및 69F8은 대조군에 비하여 AF2의 약간 낮지만 견줄만한 역가를 가졌다.

이들 데이터는 3가지 균주 모두, 특히 균주 69E1은 AF2를 생산할 때 플라스미드 상에 샤페론을 발현하는 대안으로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 8: 조작된 균주 69E1, 69F4, 및 69F8에서 MetMAb 한팔 항체의 발현

한팔 항체 MetMAb를 생산하는 균주 69E1, 69F4, 및 69F8의 능력이 평가되었다. 이들 3개 균주는 MetMAb를 발현하도록 플라스미드 p186으로 형질전환되었고, 균주 64B4는 실시예 1에 기재된 바와 같이 MetMAb 및 샤페론을 발현하도록 양성 대조군으로 플라스미드 pOA5D5.3630으로 형질전환되었다. 균주는 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 L 발효에서 성장되었고 MetMAb 농도는 72시간의 과정에 걸쳐서 다양한 시점으로 평가되었다.

발효 동안, 광학 밀도 (도 10a) 및 삼투질농도 (도 10b)가 측정되었다. 실험 균주와 플라스미드 대조군 균주 사이에 유의차는 관찰되지 않았다.

대조군 공정에서, DsbA 및 DsbC는 플라스미드로부터 발현되지 않았고 FkpA는 사용되지 않았다. 3개 균주 모두를 사용한 발효는 대조군 공정에 비교할 때 견줄만한 또는 더 높은 역가를 가졌다(도 11). 69E1 균주를 사용한 발효는 대조군 공정에 비하여 역가에서 대략 2-배수 증가를 가졌다. 놀랍게도 69F4 균주를 사용한 발효는 69E1 균주에 유사한 역가를 축적하지 않았다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 이것은 69E1 균주에서 phoA 프로모터 (강한 프로모터) 에 비하여 이 균주에서 tac 프로모터 하에서 발현된 준최적 수준의 DsbC에 기인할 수 있다. 69E8 균주를 사용한 발효는 대조군 공정과 유사한 역가를 가졌다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 이것은 준최적 수준의 FkpA에 기인할 수 있다.

실시예 9: 조작된 균주 69E1에서 항-VEGF 항체 단편의 발현

항-VEGF Fab 단편을 생산하는 균주 69E1의 능력이 평가되었다. 균주 69E1 및 대조군 균주 67A6은 실시예 1에 기재된 바와 같이 항-VEGF 항체 단편을 발현하도록 플라스미드 HSK117로 형질전환되었다. 균주는 실시예 1에 기재된 바와 같이 10 L 발효에서 성장되었고 항-VEGF 항체 단편 농도는 72시간의 과정에 걸쳐서 다양한 시점으로 평가되었다.

발효 동안, 광학 밀도 (도 12a) 및 삼투질농도 (도 12b)가 측정되었다. 균주 69E1은 대조군보다 72시간에서 약간 더 높은 광학 밀도를 나타내었다(도 12a). 균주 69E1에서 항-VEGF 항체 단편의 발현은 또한 시험된 모든 시점에서 플라스미드 대조군의 것을 초과했다(도 13).

이들 데이터는 염색체 샤페론 과발현을 갖는 균주는 플라스미드-기반 샤페론 과발현을 사용한 균주와 비교하여 항-VEGF 항체 단편의 더 높은 역가를 생성하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

종합해 보면, 실시예 5-9의 결과는 샤페론의 염색체 과발현은 플라스미드 기반 샤페론 발현에 견줄만한 역가를 생성할 가능성을 갖는다는 것을 입증한다. 이중특이적 절반-항체 xIL13 및 AF2, 한팔 항체 MetMAb, 및 항-VEGF Fab 단편을 포함한 몇 개의 분자 포맷이 시험되었다. 3개의 조작된 균주 69E1, 68F8, 및 69F4를 사용한 발효는 거의 내지 전혀 추가의 공정 개발을 갖지 않는 대조군 공정에 비하여 견줄만한 또는 더 높은 역가를 가졌다. 또한, 일 경우 (69F8 숙주를 갖는 AF2 경우 )에서 대조군을 넘은 경우 연구에서 추가의 전개가 수행되지 않았기 때문에, 여기서 관찰된 수준을 넘어서 추가로 역가를 유도하기 위해 분자-대-분자 기반에서 추가의 공정 개발 노력이 수행될 수 있다는 것이 가능하다. 고역가를 달성하는 것이 더하여, 이들 균주는 추가의 플라스미드 클로닝 작업을 요함이 없이 샤페론 발현이 평가되는 빠르고 용이한 방법을 제공한다. 일부 경우에 (예를 들어, xIL13 공정에서 69F8 균주), 유사한 역가가 낮은 수준의 FkpA로 수득되었으며, 이는 FkpA의 청소능을 위해 추가의 칼럼 정제가 필요하지 않기 때문에 다운스트림 정제에 바람직하다.

SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH INC. <120> METHODS OF PRODUCING TWO CHAIN PROTEINS IN PROKARYOTIC HOST CELLS <130> 14639-20440.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/755,915 <151> 2018-11-05 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Arg Phe Asn 130 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu 1 5 10 15 Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly 20 25 30 Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala 35 40 45 Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr 50 55 60 Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln 65 70 75 80 Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe 85 90 95 Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg 100 105 110 Phe Asn <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 65 70 75 80 Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln Gly Ser 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Ala Tyr Ser Val Asn 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Met Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Val Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Arg Thr 1 5

Claims (112)

1. 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포에서 2개의 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이며,
   (a) 폴리펩타이드의 2개의 사슬의 발현에 적합한 조건 하에 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드의 2개의 사슬을 발현시킴으로써, 이에 의해 발현 시 2개의 사슬이 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하는 단계이며,
   상기 숙주 세포는
   (1) 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드;
   (2) 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드; 및
   (3) 펩티딜-프롤릴 이소머라제 및 단백질 이황화물 산화환원효소로 이루어진 군으로부터 선택된 샤페론 단백질을 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드
   를 포함하고,
   상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 1종 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부이고,
   상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
   상기 제3 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
   상기 제3 번역 단위와 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은(non-native) 것인 단계; 및
   (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 회수하는 단계
   를 포함하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 배양 배지 중의 인산염이 고갈되었을 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터인 방법.
4. 청구항 2에 있어서, 상기 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)가 배양 배지 중에 존재할 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 IPTG-유도성 프로모터인 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 프로모터는 구성적(constitutive) 프로모터인 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 CP25 프로모터인 방법.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 대해 고유한(native) 것인 방법.
8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은 것인 방법.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샤페론 단백질은 펩티딜-프롤릴 이소머라제인 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 FkpA 단백질인 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 FkpA는 E. 콜리(E. coli) FkpA인 방법.
12. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샤페론 단백질은 단백질 이황화물 산화환원효소인 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질인 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC인 방법.
15. 청구항 12에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질인 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA인 방법.
17. 숙주 세포 염색체를 포함하는 원핵 숙주 세포에서 2개의 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법이며,
    (a) 폴리펩타이드의 2개의 사슬의 발현에 적합한 조건 하에 배양 배지에서 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드의 2개의 사슬을 발현시킴으로써, 이에 의해 발현 시 2개의 사슬이 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하는 단계이며,
    상기 숙주 세포는
    (1) 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드;
    (2) 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드;
    (3) 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드; 및
    (4) 펩티딜-프롤릴 이소머라제를 인코딩하는 제4 번역 단위를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하고,
    상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 1종 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부이고,
    상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
    상기 제3 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 제1 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
    상기 제3 번역 단위와 제1 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 고유하지 않고,
    상기 제4 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
    상기 제4 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 제2 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
    상기 제4 번역 단위와 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은 것인 단계; 및
    (b) 숙주 세포로부터 생물학적 활성 폴리펩타이드를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로모터 둘 모두는 유도성 프로모터인 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 제1 및 제2 프로모터 둘 모두는 배양 배지 중의 인산염이 고갈되었을 때 각각 제3 및 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터인 방법.
20. 청구항 17에 있어서,
    제1 및 제2 프로모터 중 하나는 유도성 프로모터이고,
    제1 및 제2 프로모터 중 다른 하나는 구성적 프로모터인 방법.
21. 청구항 20에 있어서,
    상기 제1 프로모터는 유도성 프로모터이고,
    상기 제2 프로모터는 구성적 프로모터인 방법.
22. 청구항 21에 있어서,
    상기 제1 프로모터는 배양 배지 중의 인산염이 고갈되었을 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이고,
    상기 제2 프로모터는 CP25 프로모터인 방법.
23. 청구항 20에 있어서,
    상기 제2 프로모터는 유도성 프로모터이고,
    상기 제1 프로모터는 구성적 프로모터인 방법.
24. 청구항 17 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 번역 단위 및 제4 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 대해 고유한 것인 방법.
25. 청구항 24에 있어서, 상기 제3 번역 단위 및 제4 번역 단위 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 대해 고유한 것인 방법.
26. 청구항 17 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 번역 단위 및 제4 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은 것인 방법.
27. 청구항 17 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질인 방법.
28. 청구항 27에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC인 방법.
29. 청구항 17 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 FkpA 단백질인 방법.
30. 청구항 29에 있어서, 상기 FkpA는 E. 콜리 FkpA인 방법.
31. 청구항 17에 있어서,
    상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이고,
    상기 제1 프로모터는 배양 배지 중의 인산염이 고갈되었을 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이고,
    상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 E. 콜리 FkpA이고,
    상기 제2 프로모터는 CP25 프로모터인 방법.
32. 청구항 17에 있어서,
    상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이고,
    상기 제1 프로모터는 배양 배지 중의 인산염이 고갈되었을 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터이고,
    상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 E. 콜리 FkpA이고,
    상기 제2 프로모터는 배양 배지 중의 인산염이 고갈되었을 때 제4 번역 단위의 전사를 유도하는 Pho 프로모터인 방법.
33. 청구항 17에 있어서, 상기 숙주 세포는,
    (5) 제2 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제5 번역 단위를 포함하는 제5 폴리뉴클레오타이드
    를 추가로 포함하고,
    상기 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
    상기 제5 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제5 번역 단위의 전사를 유도하는 제3 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
    상기 제5 번역 단위와 제3 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은 것인 방법.
34. 청구항 33에 있어서, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질인 방법.
35. 청구항 34에 있어서, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA인 방법.
36. 청구항 33 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 프로모터는 유도성 프로모터인 방법.
37. 청구항 36에 있어서, 상기 제3 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)가 배양 배지 중에 존재할 때 제5 번역 단위의 전사를 유도하는 IPTG-유도성 프로모터인 방법.
38. 청구항 33 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 대해 고유한 것인 방법.
39. 청구항 33 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제5 번역 단위는 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은 것인 방법.
40. 청구항 33에 있어서,
    상기 제1 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC이고,
    상기 제1 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)가 배양 배지 중에 존재할 때 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 IPTG-유도성 프로모터이고,
    상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 E. 콜리 FkpA이고,
    상기 제2 프로모터는 CP25 프로모터이고,
    상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA이고,
    상기 제3 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)가 배양 배지 중에 존재할 때 제5 번역 단위의 전사를 유도하는 IPTG-유도성 프로모터인 방법.
41. 청구항 17 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는,
    (6) 폴리펩타이드의 제3 사슬을 인코딩하는 제6 번역 단위를 포함하는 제6 폴리뉴클레오타이드
    를 추가로 포함하고,
    상기 제6 폴리뉴클레오타이드는 1종 이상의 염색체외 폴리뉴클레오타이드의 일부이며,
    이로써 발현 시 3개의 사슬이 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하는 것인 방법.
42. 청구항 41에 있어서,
    상기 제1 번역 단위는 면역글로불린 중쇄를 인코딩하고,
    상기 제2 번역 단위는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하고,
    상기 제6 번역 단위는 면역글로불린 Fc 단편을 인코딩하고,
    상기 3개의 사슬은 접히고 조립되어 생물학적 활성 1가 항체를 형성하는 것인 방법.
43. 청구항 42에 있어서, 상기 1가 항체는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 방법.
44. 청구항 1 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드 둘 모두는 단일 염색체외 발현 벡터의 일부인 방법.
45. 청구항 44에 있어서,
    상기 염색체외 발현 벡터는 선택 제제에 대한 내성을 촉진하는 선택가능한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고,
    상기 숙주 세포는 선택가능한 마커의 발현에 적합한 조건 하에 배양되고,
    상기 배양 배지는 선택 제제를 추가로 포함하는 것인 방법.
46. 청구항 44 또는 청구항 45에 있어서, 상기 염색체외 발현 벡터는 원핵 숙주 세포에서 염색체외 발현 벡터를 복제하는데 적합한 복제 기원을 추가로 포함하는 것인 방법.
47. 청구항 1 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 2개의 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 서로 연결된 것인 방법.
48. 청구항 1 내지 41 및 43 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 이종이량체의 단량체인 방법.
49. 청구항 1 내지 41 및 43 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 절반 항체이며, 여기서의 상기 제1 사슬 및 제2 사슬은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 방법.
50. 청구항 49에 있어서, 상기 절반 항체는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 방법.
51. 청구항 1 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 분비 단백질인 방법.
52. 청구항 51에 있어서, 상기 분비 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수되는 것인 방법.
53. 청구항 1 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리아인 방법.
54. 청구항 53에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아는 E. 콜리인 방법.
55. 청구항 54에 있어서, 상기 E. 콜리는 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주의 것인 방법.
56. 청구항 55에 있어서, 상기 E. 콜리는 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주인 방법.
57. 청구항 54 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E. 콜리는 향상된 LacI 생산 또는 활성을 갖는 균주의 것인 방법.
58. 청구항 57에 있어서, 상기 E. 콜리는 lacI ^Q 돌연변이를 갖는 균주인 방법.
59. 청구항 54에 있어서, 상기 E. 콜리는 균주 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (IlvG+; Valr) Δprc spr43H1 ΔmanA lacI ^Q ΔompT ΔmenE742 degPS210A의 것인 방법.
60. 제1 항원에 결합할 수 있는 제1 절반 항체 및
    제2 항원에 결합할 수 있는 제2 절반 항체
    를 포함하는 이중특이적 항체를 생산하는 방법이며,
    청구항 1 내지 40 및 44 내지 59 중 어느 한 항의 방법에 따라 제1 절반 항체를 생산하는 단계이며,
    제1 번역 단위는 제1 절반 항체의 중쇄를 인코딩하고
    제2 번역 단위는 제1 절반 항체의 경쇄를 인코딩하고,
    상기 제1 절반 항체는 적어도 하나의 놉(knob)-형성 돌연변이를 포함하는 것인 단계;
    청구항 1 내지 40 및 44 내지 59 중 어느 한 항의 방법에 따라 제2 절반 항체를 생산하는 단계이며,
    제1 번역 단위는 제2 절반 항체의 중쇄를 인코딩하고
    제2 번역 단위는 제2 절반 항체의 경쇄를 인코딩하고,
    상기 제2 절반 항체는 적어도 하나의 홀(hole)-형성 돌연변이를 포함하는 것인 단계; 및
    환원 조건에서 상기 제1 절반 항체를 상기 제2 절반 항체와 조합하여 이중특이적 항체를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
61. 청구항 60에 있어서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 상이한 항원인 방법.
62. 청구항 60 또는 청구항 61에 있어서,
    환원제를 첨가하여 환원 조건을 달성하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
63. 청구항 62에 있어서, 상기 환원제는 글루타티온인 방법.
64. 숙주 세포 염색체를 포함하고,
    (1) 펩티딜-프롤릴 이소머라제를 인코딩하는 제1 번역 단위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및
    (2) 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제2 번역 단위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하며,
    상기 제1 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
    상기 제1 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제1 번역 단위의 전사를 유도하는 제1 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
    상기 제1 번역 단위와 제1 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 고유하지 않고,
    상기 제2 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
    상기 제2 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제2 번역 단위의 전사를 유도하는 제2 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
    상기 제2 번역 단위와 제2 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 대해 고유하지 않은 것인 원핵 숙주 세포.
65. 청구항 64에 있어서, 상기 제1 번역 단위 및 제2 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 대해 고유한 것인 원핵 숙주 세포.
66. 청구항 65에 있어서, 상기 제1 번역 단위 및 제2 번역 단위 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 대해 고유한 것인 원핵 숙주 세포.
67. 청구항 64에 있어서, 상기 제1 번역 단위 및 제2 번역 단위 중 하나 또는 둘 모두는 숙주 세포 염색체에 대해 고유하지 않은 것인 원핵 숙주 세포.
68. 청구항 64 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 제1 유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
69. 청구항 68에 있어서, 상기 제1 유도성 프로모터는 Pho 프로모터인 원핵 숙주 세포.
70. 청구항 68에 있어서, 상기 제1 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
71. 청구항 64 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 제1 구성적 프로모터인 원핵 숙주 세포.
72. 청구항 71에 있어서, 상기 제1 구성적 프로모터는 CP25 프로모터인 원핵 숙주 세포.
73. 청구항 64 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 프로모터는 제2 유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
74. 청구항 73에 있어서, 상기 제2 유도성 프로모터는 Pho 프로모터인 원핵 숙주 세포.
75. 청구항 73에 있어서, 상기 제2 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
76. 청구항 64 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 프로모터는 제2 구성적 프로모터인 원핵 숙주 세포.
77. 청구항 76에 있어서, 상기 제2 구성적 프로모터는 CP25 프로모터인 원핵 숙주 세포.
78. 청구항 64 내지 77 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 FkpA 단백질인 원핵 숙주 세포.
79. 청구항 78에 있어서, 상기 FkpA는 E. 콜리 FkpA인 원핵 숙주 세포.
80. 청구항 64 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질인 원핵 숙주 세포.
81. 청구항 80에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC인 원핵 숙주 세포.
82. 청구항 64 내지 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질인 원핵 숙주 세포.
83. 청구항 82에 있어서, 상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA인 원핵 숙주 세포.
84. 청구항 64에 있어서,
    상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 FkpA 단백질이고,
    상기 제1 프로모터는 CP25 프로모터이고,
    상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이고,
    상기 제2 프로모터는 Pho 프로모터인 원핵 숙주 세포.
85. 청구항 64에 있어서,
    상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 FkpA 단백질이고,
    상기 제1 프로모터는 Pho 프로모터이고,
    상기 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이고,
    상기 제2 프로모터는 Pho 프로모터인 원핵 숙주 세포.
86. 청구항 64 내지 83 중 어느 한 항에 있어서,
    (3) 제2 단백질 이황화물 산화환원효소를 인코딩하는 제3 번역 단위를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드
    를 추가로 포함하며,
    상기 제3 번역 단위는 숙주 세포 염색체의 일부이고,
    상기 제3 번역 단위는, 숙주 세포 염색체에 통합되고 제3 번역 단위의 전사를 유도하는 제3 프로모터와 작동 가능하게 조합되고,
    상기 제3 번역 단위와 제3 프로모터의 조합은 숙주 세포 염색체에 고유하지 않은 것인 원핵 숙주 세포.
87. 청구항 86에 있어서, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질인 원핵 숙주 세포.
88. 청구항 87에 있어서, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbA인 원핵 숙주 세포.
89. 청구항 86에 있어서, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질인 원핵 숙주 세포.
90. 청구항 89에 있어서, 상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 E. 콜리 DsbC인 원핵 숙주 세포.
91. 청구항 86 내지 90 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 프로모터는 제3 유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
92. 청구항 91에 있어서, 상기 제3 유도성 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
93. 청구항 86에 있어서,
    상기 펩티딜-프롤릴 이소머라제는 FkpA 단백질이고,
    상기 제1 프로모터는 CP25 프로모터이고,
    상기 제1 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbC 단백질이고,
    상기 제2 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터이고,
    상기 제2 단백질 이황화물 산화환원효소는 DsbA 단백질이고,
    상기 제3 프로모터는 이소프로필 베타-D-티오갈락토시드 (IPTG)-유도성 프로모터인 원핵 숙주 세포.
94. 청구항 64 내지 93 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원핵 숙주 세포는 그람-음성 박테리아인 원핵 숙주 세포.
95. 청구항 94에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아는 E. 콜리인 원핵 숙주 세포.
96. 청구항 95에 있어서, 상기 E. 콜리는 내인성 프로테아제 활성이 결핍된 균주의 것인 원핵 숙주 세포.
97. 청구항 96에 있어서, 상기 E. 콜리는 degpS210A 돌연변이를 갖는 균주인 원핵 숙주 세포.
98. 청구항 95 내지 97 중 어느 한 항에 있어서, 상기 E. 콜리는 향상된 LacI 생산 또는 활성을 갖는 균주의 것인 원핵 숙주 세포.
99. 청구항 98에 있어서, 상기 E. 콜리는 lacI ^Q 돌연변이를 갖는 균주인 원핵 숙주 세포.
100. 청구항 95에 있어서, 상기 E. 콜리는 균주 ΔfhuA ΔphoA ilvG2096 (IlvG+; Valr) Δprc spr43H1 ΔmanA lacI ^Q ΔompT ΔmenE742 degPS210A의 것인 원핵 숙주 세포.
101. 청구항 64 내지 100 중 어느 한 항에 있어서,
     (a) 2-사슬 폴리펩타이드의 제1 사슬을 인코딩하는 제1 염색체외 번역 단위를 포함하는 제1 염색체외 폴리뉴클레오타이드; 및
     (b) 2-사슬 폴리펩타이드의 제2 사슬을 인코딩하는 제2 염색체외 번역 단위를 포함하는 제2 염색체외 폴리뉴클레오타이드
     를 포함하는 염색체외 발현 벡터
     를 추가로 포함하고, 이로써 발현 시 2개의 사슬이 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 2-사슬 폴리펩타이드를 형성하는 것인 원핵 숙주 세포.
102. 청구항 101에 있어서, 상기 염색체외 발현 벡터는
     원핵 숙주 세포에서 염색체외 발현 벡터를 복제하는데 적합한 복제 기원
     을 추가로 포함하는 것인 원핵 숙주 세포.
103. 청구항 101 또는 청구항 102에 있어서, 상기 염색체외 발현 벡터는
     선택 제제에 대한 내성을 촉진하는 선택가능한 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
     를 추가로 포함하는 것인 원핵 숙주 세포.
104. 청구항 101 내지 103 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-사슬 폴리펩타이드의 2개의 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 서로 연결된 것인 원핵 숙주 세포.
105. 청구항 101 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-사슬 폴리펩타이드는 이종이량체의 단량체인 원핵 숙주 세포.
106. 청구항 101 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 절반 항체이며, 여기서의 상기 제1 사슬 및 제2 사슬은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 원핵 숙주 세포.
107. 청구항 106에 있어서, 상기 절반 항체는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 원핵 숙주 세포.
108. 청구항 101 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-사슬 폴리펩타이드는 분비 단백질인 원핵 숙주 세포.
109. 청구항 108에 있어서, 상기 분비 단백질은 숙주 세포의 주변세포질로부터 회수되는 것인 원핵 숙주 세포.
110. 청구항 101 내지 104 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염색체외 발현 벡터는
     2-사슬 폴리펩타이드의 제3 사슬을 인코딩하는 제3 염색체외 번역 단위를 포함하는 제3 염색체외 폴리뉴클레오타이드
     를 추가로 포함하고, 이로써 발현 시 3개의 사슬이 접히고 조립되어 숙주 세포에서 생물학적 활성 폴리펩타이드를 형성하는 것인 원핵 숙주 세포.
111. 청구항 110에 있어서,
     상기 제1 염색체외 번역 단위는 면역글로불린 중쇄를 인코딩하고,
     상기 제2 염색체외 번역 단위는 면역글로불린 경쇄를 인코딩하고,
     상기 제3 염색체외 번역 단위는 면역글로불린 Fc 단편을 인코딩하고,
     상기 3개의 사슬은 접히고 조립되어 생물학적 활성 1가 항체를 형성하는 것인 원핵 숙주 세포.
112. 청구항 111에 있어서, 상기 1가 항체는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 원핵 숙주 세포.

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