JPH08500017A - 二特異的免疫アドヘジン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、二特異的免疫アドヘジンを調製および均一に精製することに関する。二特異的化合物は、ヘテロ３量体免疫グロブリン様構造によって特徴づけられ、第１の機能性をもつ免疫グロブリン重鎖および第２の機能性をもつ免疫グロブリン重鎖−軽鎖ぺアーからなる。

Description

【発明の詳細な説明】二特異的免疫アドヘジン 発明の分野 本発明は、二特異的免疫アドヘジンの分野に由来する。さらに詳細には、本発 明は、２つの特異性を有する免疫アドヘジンを生産する組み換え技術の使用、お よびそれらを均質に精製する技術に関する。本発明はまた、二特異的免疫アドヘ ジンを治療的または診断的に使用することにも関する。発明の背景 免疫アドヘジン（immunoadhesins）は、細胞表面レセプター、細胞接着分子ま たはリガンド（“アドヘジン”）のようなタンパク質の結合特異性と、免疫グロ ブリンの定常ドメインのエフェクター機能とが組み合わされた抗体様分子である 。免疫アドヘジンは、ヒト抗体の価値ある化学的および生物学的性質の多くを有 する。免疫アドヘジンは、適切なヒト免疫グロブリンのヒンジおよび定常ドメイ ン（Ｆｃ）の配列に結合する望ましい特異性を有するヒトタンパク質の配列から 構築することができるので、ヒトの成分を全て用いて、関心のある結合特異性を 達成することができる。このような免疫アドヘジンは、患者に対する免疫原性が 最小であり、慢性的なまたは反復した使用に対して安全である。抗体様免疫アド へジンの両腕構造が２つの異なる特異性を有するなら、免疫アドヘジンは、二特 異的抗体の分類上、二特異的であると呼ばれる。 文献に報告されている免疫アドヘジンには、Ｔ細胞レセプター＊［ガスコイン Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４ ，２９３６−２９４０（１９８７）］；ＣＤ４＊［カポンＣａｐｏｎら，Ｎａｔ ｕｒｅ ３３７，５２５−５３１（１９８９）；トラウネッカーＴｒａｕｎｅｃ ｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３３９，６８−７０（１９８９）；ツェットマイセル Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９，３４７− ３ ５３（１９９０）；ビルンＢｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，６６７−６７０ （１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）［ワトソンＷａｔｓ ｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０，２２２１−２２２９（１９９０）； ワトソンＷａｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４９，１６４−１６７（１９９１） ］；ＣＤ４４＊［アルフォＡｒｕｆｆｏら，Ｃｅｌｌ ６１，１３０３−１３１ ３（１９９０）］；ＣＤ２８＊およびＢ７＊［リンスレーＬｉｎｓｌｅｙら，Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３ ，７２１−７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４＊［ リンスレーＬら．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１−５６９（１９９１）］ ；ＣＤ２２＊［スタメンコビィックＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら，Ｃｅｌｌ ６６ ，１１３３−１１４４（１９９１）］；ＴＮＦレセプター［アシケナジＡｓｈｋ ｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，１０５ ３５−１０５３９（１９９１）；レスラウアーＬｅｓｓｌａｕｅｒら，Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７ ，２８８３−２８８６（１９９１）；ペペルＰｅｐｐ ｅｌら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，１４８３−１４８９（１９９１）］；Ｎ Ｐレセプター［ベネットＢｅｎｎｅｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６， ２３０６０−２３０６７（１９９１）］；ＩｇＥレセプターα鎖＊［リッジウェ イとゴーマンＲｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ ．１１５ ，ａｂｓｔｒ．１４４８（１９９１）］；ＨＧＦレセプター［マーク， Ｍ．Ｒ．マーク，Ｍ．Ｒ．ら，１９９２，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ］の融合物があり 、星印＊は、そのレセプターが免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である ことを示す。 レセプター一免疫グロブリン免疫アドヘジンの原型はＣＤ４−ＩｇＧキメラで あるが、これはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染を予防または治療する能 力を調べるために臨床実験において詳細に研究されている。 ＨＩＶは未だ論争中の機構によってＣＤ４⁺リンパ球を涸渇させ、またＨＩＶ 抗原に対する抗体および細胞性免疫に応答するものが存在するにもかかわらず、 免疫系の監視機能を破壊する［グループマンＧｒｏｏｐｍａｎら，ＡＩＤＳ Ｒ ｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ３，７１−８５（１９８７ ） ；ウォーカーＷａｌｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３２８，３４５−３４８（１９８ ６）］。 細胞傷害性細胞は、３つの主要な分類；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の仲 介細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細 胞と活性化マクロフファージを含む雑多なキラー細胞に分けられる［へンカート Ｐ．Ａ．Ｈｅｎｋａｒｔ，Ｐ．Ａ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３： ３１−５８（１９８５）］。Ｔ細胞が仲介する溶解では、腫瘍または感染細胞表 面に存在してこれらの細胞を正常な自己の細胞と区別するためのクラスII主要組 織適合抗原系（ＭＨＣ）分子と共働して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）が変異ま たは外来マーカーに結合する。ＡＤＣＣでは、この機能はＦｃγレセプター（Ｆ ｃγＲ）によって実行され、抗体に覆われた標的細胞が破壊される［ロブチク， Ｊ．Ｃ．およびホン，Ｒ．Ｌｏｖｃｈｉｋ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｈｏｎ，Ｒ．Ｐｒ ｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２２，１−４４（１９７７）；ズカーマン，Ｓ．Ｈ．お よびダグラス，Ｓ．Ｄ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ Ｄｏｕｇｌａｓ ，Ｓ．Ｄ．ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１−２６（１ ９７８）；およびアンケレス，Ｊ．Ｃ．Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｃ．ら，Ａｄｖ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１ ：２４７−２６８（１９８１）］。外来抗原に対する正 常な免疫応答は、マクロフファージ、単球および樹状細胞による抗原のプロセシ ングと抗原提示、Ｔヘルパーと記憶細胞の調節、およびこれらのエフェクター細 胞の活性化からなる。ＣＤ４⁺Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞を刺激するリンホカイ ンを生産してＡＤＣＣへ至る体液性免疫応答を誘起することによって、および細 胞傷害性Ｔリンパ球の活性化を刺激して外来の病原体に対する細胞性免疫応答を 補充することによって、正常な免疫系応答カスケードで中心的な役割を果たす。 後者は、ウイルス感染に対する主要な宿主側の防御であると考えられている［ヤ ップ，Ｋ．Ｌ．Ｙａｐ，Ｋ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８−２３９（ １９７８）；カンナギ，Ｍ．Ｋｎｎｎａｇｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ３０ ：２９４２−２９４６（１９８３）；フライヤー，Ｄ．Ｃ．Ｆｌｙｅｒ，Ｄ ．Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：８１５−８１８（１９８３）；ホルト，Ｃ． Ａ． Ｈｏｌｔ，Ｃ．Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：２１１−２２６（１９８ ６）］。この流れはＨＩＶ感染によって破壊される：抗原提示細胞は感染を受け 、その機能は減少する。ＣＤ４⁺Ｔヘルパー細胞が進行性に失われ、その活性は 、細胞性系と体液性系の両者に対する“ヘルプ”の喪失およびウイルス感染を制 御するための結果として生じる免疫系不全と付随して減少する。 １９８４年には、細胞表面タンパク質ＣＤ４は、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ に対するレセプターであることが示された［カポンおよびワードＣａｐｏｎ ａ ｎｄ Ｗａｒｄ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，６４９−６７８（１ ９９１）に概説］。ＨＩＶ感染の顕著な特徴はＣＤ４⁺Ｔ細胞の特異的破壊であ り、ＡＩＤＳに感染した個人の進行はＣＤ４⁺Ｔ細胞数の減少と密接に平行する ので［レーン，Ｈ．およびフォーシ，Ａ．Ｌａｎｅ，Ｈ ａｎｄ Ｆａｕｃｉ， Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，４７７−５００（１９８５）］ 、ＨＩＶがＣＤ４⁺細胞に直接感染するかまたは他の方法かのどちらかによって 、ＣＤ４レセプターとＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０ との相互作用が、ＣＤ４⁺細胞の死の根底にあると提案された。 トランスメンブランおよび細胞質ドメインをコードする配列を除去するために 天然のＣＤ４遺伝子を断頭すると、組み換え可溶性分泌タンパク質を生産するこ とができる。組み換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）はウイルス−レセプター相互 作用をブロックすることによってＨＩＶの感染を防ぐということがいくつかのグ ループによって示唆された。しかし、ＣＤ４抗原の可溶性分泌型の半減期は、そ の大きさが小さいために、この大きさ（約５０ｋＤａ）の分子が腎臓で迅速に除 去されるので、短いことがまもなく明らかになった。ＣＤ４の一部は、その構造 が類似することから、そのキメラ分子のどの部分にも不都合な効果をもたらすこ となしに、免疫グロブリンの可変域と置換できることが可能であるように見え、 この分子は、より長い半減期およびより遅いクリアランスを有する有意に変化し た薬物動態をもち、等量の投与に対してより高い定常状態濃度を生み出すことが 示唆された。その構造は免疫グロブリンのＦｃドメインを含有しているので、抗 体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を仲介する能力、溶解性補体カスケードの活性化 、 およびＦｃレセプターが仲介するクリアランスによるウイルスの向上した除去の ような抗体分子の防御的特性を、それらが獲得することもまた予言された。 免疫グロブリンの種々の部分とＣＤ４の種々の部分とが結合している免疫アド ヘジンは、ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月３日公開）に開示されている。 ウサギにおける薬物動態学的研究により、ＣＤ４₂Ｆｃｌと名付けた免疫アドへ ジンのクリアランス速度が、組み換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）と比較して、 約３０倍減少することが示唆された。サルおよびヒトにおいても、同様のクリア ランス速度の違いが観察された［モーデンティＭｏｒｄｅｎｔｉら，Ｐｈａｒｍ ａｃｕｅｔ．Ｒｅｓ．８ ，１３５１−１３５９（１９９１）］。他の研究者達［ ツァイテマイセルＺｅｉｔｔｅｍｅｉｓｓｌら，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （ＵＳ） ９，３４７−３５３（１９９０）］もまた、マウスおよびサルにおい て、同様のＣＤ４−Ｉｇ免疫アドヘジンのクリアランスが劇的に遅いことを観察 した。 ビルンＢｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，６６７−６７０（１９９０）は、 ＣＤ４−ＩｇＧがポリクローナル抗ＨＩＶ血清と同程度にＨＩＶ感染細胞のＡＤ ＣＣを仲介できることを示した。しかし、抗ＨＩＶ抗血清は可溶性ｇｐ１２０を 存在させることによって感作した“傍観”細胞に対してもＡＤＣＣを仲介できる が、このことは、可溶性ｇｐ１２０が唯一のＣＤ４結合部位しかもたないことか ら、ＣＤ４−ＩｇＧには当てはまらないことは重要である。ビルンＢｙｒｎら，前掲 はまた、ＣＤ４−ＩｇＧが８時間に１％の割合で霊長類動物の胎盤を通過し 、これがヒト検体でヒトＩｇＧに関して観察される結果に匹敵することを示した 。このことは、ｌｍｇ／ｋｇのＣＤ４−ＩｇＧを陣痛の開始時点または出産の１ 週間前および陣痛の開始時点でＨＩＶ血清陽性の妊婦に静脈内ボーラス投与した フェイズＩ臨床試験において今や確証されている。ＣＤ４−ＩｇＧはＩｇＧの投 与と同程度にヒト胎盤を通過した。母子ともに毒性の徴候は全く示さなかった。 追跡調査の際にも、ＰＣＲで決定されるようなＨＩＶ感染、血漿のウイルス培養 およびリンパ球の増殖の証拠は、どの幼児でも示されなかった。 ＡＩＤＳ患者はＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を失うが、残っているＣＤ８陽 性Ｔリンパ球が細胞傷害機能を維持することが知られている。無関係な特異性を 有する細胞傷害性Ｔ細胞に焦点が当てられ、二特異的抗体を用いて標的細胞を殺 すための刺激を受けることができることもまた示された［スターツ，Ｕ．Ｄ．お よびビーバン，Ｍ．Ｊ．Ｓｔａｅｒｚ，Ｕ．Ｄ． ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｊ .,Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ７，２４１−２４５（１９８６）およびそこに 引用された参考文献］。細胞傷害性Ｔリンパ球は、活性化されてもいないし、ウ イルスを標的としてもいないが、その機能は残っており［ウォーカー，Ｂ．Ｄ． Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３４５−３４８（１９８６） ］、ＨＩＶ感染による免疫系の悲惨な不全の最後の生存者かもしれない。それゆ え、免疫系を補充するための合理的な取り組みは、ウイルスとの戦いにおいて新 しい標的に向けることにより、この残った細胞性免疫機能を開発することである かもしれない。 ＣＤ４−免疫グロブリンキメラの抗レトロウイルスの性質を保持しながら、Ａ ＩＤＳ患者における免疫系活性化経路の抑制を防止するという試みにおいて、ウ イルス感染細胞に対してエフェクター細胞を新しい標的に向けさせることが可能 な二特異的抗体を作成した。それらは必要なウイルスタンパク質を表面に発現す るので、レトロウイルスに感染した細胞は二特異的抗体の接近に特に適している ことが提案された。そのような抗体様分子は、標的細胞の表面の外来抗原を認識 する片方の腕および細胞傷害性細胞の表面の活性化分子を認識するもう片方の腕 を用いて、そのシグナル伝達系を通してエフェクター細胞を活性化でき、またＭ ＨＣ系の関与がなくても標的細胞に致死的な打撃を与えるよう助ける［セーガル ，Ｄ．およびウンダーリッヒ，Ｊ．Ｓｅｇａｌ，Ｄ． ａｎｄ Ｗｕｎｄｅｒｌ ｉｃｈ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．６，８３−９２（１９８８）；ユ ングハンス，Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｒ．Ｐ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅ ｄ．１１６ ，１４６−１６０（１９９２）］。 文献中にてしばしば二機能的抗体と呼ばれる抗体様分子がこのように新たに生 み出されたことで、抗原を提示するための機能的欠陥を防ぐことが可能であり、 免疫制御を担う細胞はＨＩＶ感染に直接応答するエフェクター細胞を活性化する ことができる。これは、これらの人工的な抗体が感染細胞の表面上の外来抗原お よびＡＤＣＣを仲介する細胞上のＦｃレセプターまたはＣＴＬ上の抗原レセプタ ーに結合することによって仲介される。 ＡＩＤＳに対して向上した免疫治療を提供するための研究において、バーグＢ ｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，４７２３（ １９９１）は、２番目の軽鎖に加えて、可変域がＣＤ４配列と置換しているヒト ＩｇＧ重鎖を結合したヒトＣＤ３に対するマウス抗体由来の重鎖／軽鎖ぺアーか らなる二特異的抗体様分子（本明細書で用いられている用語では二特異的免疫ア ドヘジン）を構築した。ＣＤ３はＴ細胞上の抗原レセプターの一部であり、シグ ナル伝達に関係がある。二特異的分子は、どのＨＩＶ株のｇｐ１２０にも結合す るＣＤ４の能力とＣＤ３に対する抗体のＴ細胞を活性化する性質を結び付けるた めに設計された。 現在では、二特異的抗体および免疫アドヘジンの組み換え生産は、通常、２つ の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ぺアーの同時発現に基づいており、２つの重鎖は異 なる特異性を有する［ミルステインおよびキュロＭｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃ ｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５，５３７−５３９（１９８３）］。軽鎖に結 合していない免疫グロブリンの重鎖は、小胞体中の免疫グロブリン重鎖結合タン パク質（ＢｉＰ）によって引き止められてしまうので、軽鎖の存在は一般に、効 率的な分泌にとって必須であると考えれれている［ハース，Ｉ．Ｇ．ワール，Ｍ ．Ｒ．Ｈａａｓ，Ｉ．Ｇ．Ｗａｂｌ，Ｍ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０６，３８７ −３８９（１９８３）；ボール，Ｄ．Ｇ．Ｂｏｌｅ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｌｏｌ．１０２ ，１５５８−１５６６（１９８６）］。免疫クロフリン重鎖お よび軽鎖がランダムに１組を形成するため、これらの雑種細胞（４種類雑種細胞 ）は１０種類の異なる抗体分子の混合物を生産する可能性があり、そのうちたっ た１つが正確な二特異的構造を有している。それゆえ、正確な分子の精製は非常 に厄介である。このように、１０種類の可能な構造のうちたった１つが目的物で あり、その分子の精製が難しいために目的産物の収量はかなり減少する。 バーグＢｅｒｇらのマウス二特異的免疫アドヘジンは、マウス細胞で発現が可 能なベクター中でキメラタンパク質ＣＤ４₂γ１（カポンＣａｐｏｎら，前掲） をコードする遺伝子をクローニングし、得られたベクターを抗ヒトＣＤ３抗体で あるγ１を分泌する雑種細胞にトランスフェクションすることによって、二特異 的抗体を類推して作成された。ＣＤ４₂γ１は免疫グロブリンのＣＨ１ドメイン を保持しているので、抗体の軽鎖に結合する能力を有している。したがって、ト ランスフェクションされた雑種細胞は異種産物の混合物を生産し、抗ＣＤ３抗体 の重鎖−軽鎖ぺアーに結合した抗ＣＤ３抗体の軽鎖にジスルフィド結合で結合し たＣＤ４₂γ１からなる４量体である目的の産物を含有した（バーグＢｒｅｇら の図１）。トランスフェクションされた雑種細胞に存在する３つのポリペプチド 鎖の他の組み合わせは、それぞれジスルフィド結合で結合した２つのＣＤ４₂γ １−抗ＣＤ３抗体の軽鎖のぺアー（２価の単一特異的な免疫アドヘジン）および ジスルフィド結合で結合した２つの抗ＣＤ３抗体重鎖−軽鎖のぺアー（２価の抗 ＣＤ３抗体）からなる２つの２価の単一特異的な４量体を含有した。産物を含有 するＣＤ４領域は、溶出に未確定の抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いた抗ＣＤ ４アフィニティクロマトグラフィーによって、２価の抗ＣＤ３抗体から分離した 。バーグＢｅｒｇらの図２Ｅの電気泳動像で証明したように、目的の二特異的免 疫アドヘジンの大体等しい部分、および２価の単一機能的なジスルフィド結合で 結合した２つのＣＤ４₂γ１抗ＣＤ３抗体の軽鎖のぺアーの４量体を得た。これ らの２つの成分は分離せず、インビトロでＨＩＶ感染細胞の傷害を促進する効力 を試験した二特異的免疫アドヘジン調製物は、４量体である単一特異的な２価の ＣＤ４₂γ１（細胞傷害を促進しない）および目的の、活性のある二特異的免疫 アドヘジンを等量ずつ含有した。量が少なく、２つの成分が両者とも２つのジス ルフィド結合で結合した重鎖−軽鎖のペアーからなる抗体様の４量体であり、構 造的に類似していることが、精製が難しい原因である。これらの２つの構造的に 非常に類似した産物の分離はＣＤ３結合部位に基づかなければならず、調製量と しては簡単に手に入らない精製ＣＤ３リガンドやＣＤ３結合部位に対する抗イデ ィオタイプモノクローナル抗体などの試薬を必要としただろう。 トラウネッカ−Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ １０，３６５５−３６５ ９（１９９１）は、２種類の二特異的ＣＤ４−抗ＣＤ３分子を生み出した。最初 の構造は、Ｆａｂ域が抗ＣＤ３の１本鎖結合部位（ＦｖＣＤ３）およびＣＤ４の 最初の２つのＮ末ドメインで置換しているヒトＩｇＧ３に基づいていた。最初に 、抗ＣＤ３雑種細胞ＴＲ６６（Ｖ_HおよびＶ_L）由来の可変ドメインの配列をクロ ーニングし、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインの間の１８アミノ酸の結合ペプチドをコード する合成ＤＮＡ断片と融合し、ＦｖＣＤ３と呼ばれる構造を生み出した。それか ら、ＦｖＣＤ３はヒトＩｇＧ３分子中の可変ドメインを置換するために用い、得 られた免疫アドヘジン（ＦｖＣＤ３−Ｈγ３）は哺乳動物の細胞でＣＤ４−Ｈγ ３とともに共発現した。３つの主要な産物（ＣＤ４−Ｈγ３、ＦｖＣＤ３−Ｈγ ３およびＣＤ４−Ｈγ３／ＦｖＣＤ３−Ｈγ３）が得られ、そのうち最後に挙げ た二特異的免疫アドheヘジンは精製されていない少量の成分であった。 トラウネッカーＴｒａｕｎｅｃｋｅｒらは、二特異的免疫アドヘジンの構造の 関して経験した困難を克服するために、ヤヌシン（ＣＤ４−ＦｖＣＤ３−Ｃカッ パ）と命名したＦｖＣＤ３、ＣＤ４およびＣ−カッパの２つのＮ末ドメインから なる１本鎖ポリペプチドをデザインした。この二特異的直線状分子は抗カッパア フィニティカラムを用いて精製した。この分子は免疫グロブリンの定常ドメイン の配列を含有していないので、その血漿半減期は可溶性ＣＤ４よりも有意に長い ことは期待されない。 要するに、ＣＤ４の形態中のｇｐ１２０と相互作用するドメイン［バーグ，Ｊ ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．ら，前掲；トラウネッカー，Ａ．Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ． ら，前掲］またはＨＩＶ抗原に結合する抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体［ザー リング，Ｊ．Ｍ．Ｚａｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら，前掲；オカダ，Ｈ．Ｏｋａｄａ ，Ｈ．ら，前掲］を細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するＣＤ３と相互作用するドメ インと結合することで、免疫グロブリン様分子［バーグ，Ｊ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．ら ，前掲；ザーリング，Ｊ．Ｍ．Ｚａｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．１ ４０，２６０９−２６１３（１９８８）；オカダ，Ｈ．Ｏｋａｄａ，Ｈ． ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５，３１．２４７−５２（１９９２）］また は１本鎖ペプチド［トラウネッカー，Ａ．Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら，前掲 ］をこれまで生じてきた。そのような二特異的構築物を含有する調製物は、細胞 傷害性 Ｔリンパ球でＨＩＶ感染の溶解を誘導するのに効果的だった。他の研究［ザーリ ング，Ｊ．Ｍ．Ｚａｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら，前掲］はまた、核をなす標的細胞 に対するインビボでのＡＤＣＣの主要な仲介者である大顆粒リンパ球（ＬＧＬ） による細胞傷害を特異的に補充する抗ＣＤＩ６（３Ｇ８）を開発した［オータル ド，Ｊ．Ｒ．Ｏｒｔａｌｄｏ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３５ ６６−３５７２（１９８７）］。これは、同一の系においてＣＴＬの細胞傷害を 補充する抗ＣＤ３二特異的構築物で観察されるものと等しい細胞傷害能力を示し ていた。 この分野が最近進歩したにもかかわらず、現在でも、二特異的免疫アドヘジン の効率的な生産、分離および精製に関して当業者に既知の一般に応用可能な方法 は存在していない。可能なペプチド鎖の組み合わせの数が多いときは特に、目的 産物の収量は通常少なく、目的以外の鎖の組み合わせをもつ副産物から双免疫ア ドヘジン分子を分離するために、各々の機能性に合わせて特異的に結合する試薬 などの特異的な分離方法が手近に必要である。生産物の混合物から２つの特異性 に基づいて成分を分離するのに容易な方法が存在しないときには、分離および精 製は、厄介で、極端に経費を食い、時間を浪費するものとなる。 いかなる特異性をも有する目的の二特異的免疫アドヘジンを高収量で生産する 方法を提供することが好ましいだろう。 目的の二特異的産物が実質的に均一な形態で分離ができるように、特異性の１ つを特異的に認識できるような簡便に入手できる試薬が存在しないときでも、目 的以外の免疫グロブリン鎖の組み合わせから生じる付随的な副産物から二特異的 免疫アドヘジンを分離することができる方法を提供することもまた好ましいだろ う。 ＨＩＶ感染細胞を殺す患者自身の細胞障害性リンパ球を新たな標的に向けるこ とによって、ＨＩＶにさらされた個人におけるＨＩＶ感染を予防または治療する 方法を提供することはさらに好ましいだろう。 したがって、実質的に均一な二特異的免疫アドヘジンを生産する方法を提供す ることが本発明の目的である。 付随する副産物から実質的に均一な形態で二特異的免疫アドヘジンを分離する 方法を提供することもまた目的である。 そのような方法によって得ることができる実質的に均一な二特異的免疫アドヘ ジンを提供することがさらなる目的である。 さらに、感染した妊婦から胎児へのＨＩＶ感染の伝播の予防を含めて、ＨＩＶ にさらされたかまたはさらされる危険のある個人において、ＨＩＶ感染の予防ま たは治療する方法を提供することもまた目的である。 ＨＩＶにさらされているかまたは感染している患者の細胞傷害性リンパ球また はリンパ節に対して抗ＨＩＶ物質を特異的に向かわせることのできる薬物伝達系 を提供することがさらなる目的である。 これらおよびさらなる目的は当業の熟練者にとっては自明であろう。本発明の概要 本発明は、二特異的免疫アドヘジンを作成および精製する新規な方法に関する 。 抗体に関する研究に基づいて、軽鎖の存在は免疫アドヘジンの効率的な分泌に 必須であると一般的に考えられている［バーグＢｅｒｇら，前掲を参照］。当業 者に既知のほとんどの二特異的免疫アドヘジンは、分子のそれぞれの腕に重鎖融 合タンパク質と結合した軽鎖をもつようにデザインされてきた。軽鎖を欠いてい る稀な場合には（１９９２年５月２６日発行の米国特許番号５，１１６，９６４ を参照）、二特異的免疫アドヘジンは雑種の免疫グロブリン鎖が適切に集合し折 りたたまれることを保証する対称的な構造を有する。 本発明は、片方の腕の雑種免疫グロブリン重鎖およびもう一方の腕の雑種免疫 グロブリン重鎖−軽鎖ペアーからなる二特異的免疫アドヘジンが、正確に集合し 、折りたたまれたヘテロ３量体の形態で効率的に分泌されうるという実験的な発 見を利用している。これは、片方の腕に軽鎖が存在せず、３量体分子という非対 称な構造をしていることとは関係ない。二特異的分子の片方だけに免疫グロブリ ン軽鎖が存在すると分離方法が簡単になるのと同じように、調製過程で有害では ない同様の非対称構造が、目的以外の免疫グロブリン鎖の組み合わせから目的の 二 特異的化合物を分離するのを容易にすることをさらに発見した。 本発明の二特異的免疫アドヘジンは、好ましくは、３量体分子を構成する３種 類の免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡ配列を適当な宿主細胞にそれぞれ導入 することによって生産する。その結果として、これらのＤＮＡ配列の割合は、自 由に変化することができる。この系を柔軟に利用することで、ヘテロ３量体二特 異的免疫アドヘジンの３種類の鎖をコードするＤＮＡ配列を組み換え宿主細胞に 導入する割合が、それらの発現によって得られる産物の混合物の組成に純粋な効 果をもつことが明らかになった。さらに明確に言えば、３種類の可能な免疫グロ ブリン鎖の組み合わせの相互の割合が、トランスフェクションに用いるプラスミ ドＤＮＡの割合の関数として有意に変化することを発見した。したがって、２種 類の個々の雑種免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列の割合を 適当に調整することによって、目的のいかなる二特異的免疫アドヘジン産物の収 量も最適化することができる。 ＣＤ４および抗ＣＤ３特異性を有する免疫アドヘジンに関して、ＣＤ４−免疫 グロブリン融合タンパク質をコードするＤＮＡを過量に用いることによって、目 的の二特異的免疫アドヘジン分子の収量が著しく増加することを見いだした。 バーグＢｅｒｇら，前掲のその構築物の精製計画と比較すると、習慣的な研究 にのっとった本発明の調製および精製過程の利点を最もよく説明している。バー グＢｅｒｇらの二特異的免疫アドヘジンは、マウス抗ヒトＣＤ３抗体重鎖−軽鎖 のペアーからなっており、ＣＤ４−ＩｇＧ−１重鎖定常ドメイン−マウス抗ヒト ＣＤ３抗体軽鎖のペアーにジスルフィド結合で結合している。このデザインでは 、二特異的抗体様分子の両腕は、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインにジスルフィ ド結合で結合した抗体の軽鎖を含有している。共発現は、３つの主要な産物：二 特異的免疫アドヘジン、ジスルフィド結合で結合した２つの抗ＣＤ３抗体重鎖− 軽鎖ペアーからなる２価の単一特異的４量体、およびジスルフィド結合で結合し た２つのＣＤ４−ＩｇＧ−１の重鎖−抗ＣＤ３軽鎖ペアーからなる第２の２価の 単一特異的４量体を生じる。ＣＤ４の配列を含有する産物は分子のＣＤ４部分に 基づいた精製技術によって抗ＣＤ３抗体分子から分離できるのに対して、二特異 的 免疫アドヘジン分子の抗ＣＤ３部分に選択的に結合することができる試薬の入手 が基本的に難しいために、それらの互いからの分離は成し遂げられていない。そ の結果、バーグＢｅｒｇらは、いかなる商業的な（治療用または診断用）応用に も適さない産物の混合物のままで終わっている。 それとは対照的に、本発明の二特異的免疫アドヘジンの構造は、その分子のこ ちら側の腕に軽鎖が結合するのを防ぐためにそのＣＨ１ドメインが除去されてい る１本のＣＤ４−ＩｇＧ−１重鎖定常ドメインの融合タンパク質がジスルフィド 結合で結合している擬人化抗ＣＤ３抗体重鎖−軽鎖のペアーから構成されている 。さらに、全長の二特異的免疫アドヘジンを調製するのに一般的に用いられてい るトランスフェクトーマ法の代わりに、この構造に存在する３つの鎖のコード配 列をそれそれ適当な宿主細胞に導入し、こうしてその相互の割合により大きな柔 軟性が与えられ、その結果、以前に達成されていたよりも著しく高い収量の産物 を得ることになった。この技術によって、３つの産物：ＣＤ３に対して２つの結 合部位を含有する２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖のペアーから構成されるヘ テロ４量体；軽鎖を結合していないｇｐ１２０に対する２つの結合部位を含有す る２つのＣＤ４−Ｉｇ免疫アドヘジンから構成されるホモ２量体；およびＣＤ３ に対する結合部位を１つとｇｐ１２０に対する結合部位を１つ含有する、１つの 免疫グロブリン軽鎖、１つの免疫グロブリン重鎖および１つのＣＤ４−Ｉｇ免疫 アドヘジンから構成されるヘテロ３量体（二特異的免疫アドヘジン）を生じた。 二特異的免疫アドヘジンは、二特異的分子に存在するＣＤ４部分および免疫グロ ブリン軽鎖に基づいた直線的な精製計画を用いて、その治療的使用を可能にする ような実質的に均一な形態で、目的以外の鎖の組み合わせから精製することがで きる。 したがって、本発明は以下の事項を含有する二特異的免疫アドヘジンを作成す る方法に関している。 ａ）軽鎖との結合部位を欠いた免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列に融合し た第１の結合ドメインを含有する第１の融合物；軽鎖との結合部位を保持してい る免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列に融合した第２の結合ドメインを含有す る第２の融合物；および免疫グロブリン軽鎖をそれぞれコードするＤＮＡ配列を 宿主細胞へ導入すること； ｂ）（ｉ）第２の融合物−免疫グロブリン軽鎖のペアーと共有結合で結合した 第１の融合物を含有するヘテロ３量体；（ii）共有結合で結合した２つの第二の 融合物−免疫グロブリン軽鎖のペアーを含有するヘテロ４量体；（iii）共有結 合で結合した２つの第一の分子を含有するホモ２量体の混合物を生成するＤＮＡ 配列を発現するために宿主細胞を培養すること； ｃ）（ｉ）、（ii）および（iii）の産物の混合物を細胞培養から取り出すこ と； ｄ）第１の結合ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖のそれぞれに基づいた分離 方法によって実質的に均一な形態の産物（ｉ）を単離すること。 好ましい具体例において、免疫グロブリンの鎖をコードするＤＮＡ配列の少な くとも２つをそれそれ宿主細胞に導入し、これらのＤＮＡ配列の割合を調整する ことによって目的のヘテロ３量体の収量を最適化する。 他の局面から言えば、本発明は、第１の結合ドメインおよび免疫グロブリン軽 鎖を含有する産物を特異的に認識し、任意の順序で分離する方法を用いることに よって、前出の産物の混合物から二特異的免疫アドヘジンを単離する方法に関す る。 単離のための好ましい方法はクロマトグラフィーであり、特に第１の結合ドメ イン（つまりＣＤ４部分）、および二特異的免疫アドヘジンの分子の免疫グロブ リンの軽鎖部分に基づいた免疫アフィニティクロマトグラフィーである。 さらなる局面から言えば、本発明は、、標的細胞上の外来抗原を特異的に認識 する片方の腕、および細胞傷害性細胞上の活性化分子を認識するもう片方の腕を 有する、実質的に均一な二特異的免疫アドヘジンを作成するための以下の事項か らなる方法に関する： ａ）第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が決して免疫グロブリ ンの軽鎖と結合することのできないように除去または変更してある免疫グロブリ ン重鎖の定常ドメインの配列と外来抗原結合ドメインとの融合物、軽鎖との結合 が可能なＣＨ１ドメインを保持している細胞傷害性細胞上の活性化部位に対する 抗体の重鎖および上記の抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ配列を宿主細胞に導入す ること； ｂ）（ｉ）ジスルフィド結合で結合した抗体の重鎖−軽鎖のペアーにジスルフ ィド結合で結合した外来抗原結合ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合物からなる へテロ３量体の二特異的免疫アドヘジン；（ii）２つの抗体重鎖−軽鎖のぺアー からなるジスルフィド結合で結合したヘテロ４量体；および（iii）ジスルフィ ド結合で結合した２つの外来抗原結合ドメイン−免疫グロブリン重鎖定常ドメイ ン融合物をからなるホモ２量体の混合物を生産する上記のＤＮＡ配列を発現する ための上記の宿主細胞を培養すること； ｃ）（ｉ）、（ii）および(iii）の産物の混合物を細胞培養から取り出すこと ； ｄ）二特異的免疫アドヘジン分子の外来抗原結合部分および軽鎖部分に基づい て、任意の順序で、アフィニティクロマトグラフィーによって産物（ii）および （iii）から二特異的免疫アドヘジン（ｉ）を分離すること；および ｅ）二特異的免疫アドヘジン（ｉ）を実質的に均一な形態で回収すること。 特異的結合がｇｐ１６０、ｇｐ１２０またはｇｐ４１ドメイン内の部位に対す るものであるときは、外来抗原は、例えば、ＨＩＶのようなレトロウイルスの必 須ウイルスタンパク質であるかもしれない。ｇｐ１２０に結合することが知られ ている分子は細胞表面糖タンパク質のＣＤ４である。活性化される細胞傷害性細 胞は、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞または大顆粒リンパ球であり、活性化分子は 好ましくはＣＤ３またはＣＤ１６である。 またさらなる局面から言えば、本発明は、共有結合で結合した、第一の機能性 を有する２つの免疫グロブリンの重鎖から構成されるホモ２量体および共有結合 で結合した、第二の機能性を有する２つの重鎖と軽鎖のペアーから構成されるへ テロ４量体を含んだ混合物から、第二の機能性を有する免疫グロブリン重鎖−軽 鎖のペアーと共有結合で結合した第一の機能性を有する免疫グロブリン重鎖から 構成される実質的に均一なヘテロ３量体二特異的免疫アドヘジンを単離するため の方法に関しており、第一の機能性および免疫グロブリン軽鎖のそれぞれに基づ いて、任意の順序で、２段階クロマトグラフィーによって付随するヘテロ４量体 およびホモ２量体からヘテロ３量体二特異的免疫アドヘジンを分離することを含 有している。もし望むのであれば、クロマトグラフィーによる精製段階のうち少 なくとも１回は繰り返してもよい。 さらに他の局面から言えば、本発明は、細胞傷害性細胞の表面上の活性化分子 に対する抗体の重鎖−軽鎖のペアーに共有結合で結合した、免疫グロブリン軽鎖 結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列と融合した、レトロウイル スの必須ウイルスタンパク質に対する結合ドメインを含有する実質的に均一な二 特異的免疫アドヘジンに関する。特定の具体例においては、二特異的免疫アドヘ ジンは、ＨＩＶ結合配列および細胞傷害性Ｔリンパ球または大顆粒リンパ球がＨ ＩＶ感染と戦うために新たな標的に向うのを助ける配列をもつようにデザインさ れている。 さらなる局面から言えば、本発明は、標的細胞上でＨＩＶを特異的に認識する 片方に腕、および細胞傷害性細胞上の活性化分子を認識するもう片方の腕を有す る３量体の二特異的ＩｇＧ免疫アドヘジンの有効量を妊婦に投与することによっ て、ＨＩＶ血清陽性の妊婦から胎児へＨＩＶ感染が伝播するのを防ぐ方法に関す る。 本発明の調製および精製方法の利点はＣＤ４−Ｉｇ−抗ＣＤ３抗体二特異的免 疫アドヘジン［（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジン］の例によって説 明されているが、同様の計画は、その特異性に関係なく３量体二特異的免疫アド ヘジンを均一に調製および精製するのに広く応用できる。類似の方法で作成およ び精製できる他の二特異的免疫アドヘジンは、例えば、ＣＤ４−ＩｇＧ×抗ＣＤ １６ｍＡｂ、ｔ−ＰＡ−ＩｇＧ×抗フィブリンｍＡｂ、腫瘍壊死因子レセプター （ＴＮＦＲ）−ＩｇＧ×抗エンドトキシンｍＡｂ、ＣＤ４−ＩｇＧｘＴＮＦＲ− ＩｇＧ、ＣＤ４−ＩｇＧＸＬ−セレクチン−ＩｇＧなどを含有する。最後に挙げ た分子は、リンパ球のホーミングレセプター（ＬＨＲ，Ｌ−セレクチン）のリン パ節結合機能とＣＤ４のＨＩＶ結合機能を結び付けており、ＨＩＶ感染の予防も しくは治療において、関係する条件において、または診断用として潜在的な応用 の道を見いだしている。 本発明のあらゆる二特異的免疫アドヘジンはリポソームに、好ましくは同様の 指示とともにそれによって組み合わせ治療を容易にするような他の治療物質と組 み合わせて取り込んでもよい。図面の簡単な説明 図１は、（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンの構造を描いている。 Ａ．二特異的免疫アドヘジンの構築において用いられた抗体重鎖および軽鎖およ びＣＤ４−ＩｇＧ１キメラタンパク質のサブユニット構造。Ｂ．（ＣＤ４×抗Ｃ Ｄ３）二特異的免疫アドヘジンヘテロ３量体の構造の略図。 図２は、各ＤＮＡを異なる比（パーセントで表されている）で用いた場合の（ ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンヘテロ３量体、抗ＣＤ３（αＣＤ３ ）ヘテロ４量体、およびＣＤ４−免疫グロブリンホモ２量体（ＣＤ４−ＩｇＧ） の生産を示している。プラスミドＤＮＡの全量はどの場合も２０μｇであった。 トランスフェクションした細胞は³⁵Ｓ−メチオニンで標識し、そしてプロテイン Ａを用いて血清の入っていない上清からタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＳＧＥ およびオートラジオグラフィーで分析した。 図３は、実施例１に記載したようなアフィニティークロマトグラフィーによる （ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンヘテロ３量体、抗ＣＤ３ヘテロ４ 量体、およびＣＤ４−免疫グロブリンホモ２量体の分離を示している。 図４。エフェクター細胞と抗体の共存による非感染細胞（ＣＥＭ）（ａ）およ びＨＩＶ感染細胞（ｂ）の溶解の特異性。標的細胞は一晩の間標識し、１ｍｇ／ ｍｌの異なる抗体とともに室温で１時間インキュベー卜し、それからＰＢＬ−Ｉ Ｌ−２（黒い棒）、ＰＢＬ−ＩＬ−２（白い棒）およびＣＴＬ（影つきの棒）の ３種類のエフェクター細胞とともに３７°Ｃで３時間インキュベートした。上清 を回収し、実施例に記載したように計数し、計算した。 図５。ヒト血清の非存在下（ａ）または８％（ｂ）または５０％（ｃ）ヒト血 清存在下におけるエフェクター細胞と抗体の共存によるＨＩＶ感染細胞（ＣＥＭ ／IIIＢ）の溶解。 図６。二特異的免疫アドヘジンが仲介するＣＴＬによるＣＥＭ／IIIＢ溶解の 用量依存性効果（垂直の棒は標準偏差を示す）。発明の詳細な説明 Ａ．定義 抗体（Ａｂｓ）および免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、同じ構造的特徴を有する 糖タンパク質である。抗体が特定の抗原に特異性を示すのに対し、免疫グロブリ ンは抗体および、抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を包含する。例えば、 後者の種類のポリペプチドは、リンパ系によって低レベルに、骨髄腫によって増 加したレベルで生産される。構造的な意味では、“抗体”という用語と“免疫グ ロブリン”という用語は本明細書を通じて相互交換的に使用されているが、抗原 特異性に関係する機能的性質を議論する場合には明確な区別を行っている。 天然の抗体および免疫グロブリンは通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つ の同一の重鎖（Ｈ）から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖 タンパク質である。重鎖の間のジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンの イディオタイプによって違うのに対し、各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド 結合によって重鎖に結合している。重鎖および軽鎖の各鎖はまた、規則正しい距 離を保った鎖間のジスルフィド橋を有している。各重鎖は、一方の端に可変ドメ イン（Ｖ_H）を有し、続いて多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端 に可変ドメイン（Ｖ_L）を有し、その反対側の端に定常ドメインを有する；軽鎖 の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと向かい合って整列しており、軽鎖 の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと向かい合って整列している。特定のアミ ノ酸残基が、軽鎖および重鎖の可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられて いる［クロシアＣｌｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６，６５１−６ ６３（１９８５）；ノボトニーおよびハーバーＮｏｖｏｔｎｙ ａｎｄ Ｈａｂ ｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，４５９２−４５ ９６（１９８５）］。 その多様性は、抗体の可変域を通じて均等に分配されない。それは、軽鎖およ び重鎖の可変域における相補性決定域（ＣＤＲ）または超可変域と呼ばれる３つ のセグメントに集中している。可変域中で比較的高度に保存されている部分はフ レームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは それぞれ、４つのＦＲを含有しており、これらは広くβシート構造をとっていて 、βシート構造を連結している、およびある場合にはβシート構造の一部を形成 するループを形作っている３つのＣＤＲによって連結されている。各鎖のＣＤＲ は、ＦＲ域によって近接した状態でまとまっており、他の鎖のＣＤＲとともに抗 体の抗原結合部位の形成に寄与している［カバト，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ ｔ Ｎａｔｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ，ＭＤ（１９８７）］。定常トメインは、抗体の抗原への結合に直接には関 与しないが、抗体依存性細胞傷害への抗体の関与のような、様々なエフェクター 機能を示す。 抗体をパパインで消化すると、それぞれが１個の抗原結合部位をもつＦａｂフ ラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および容易に結晶化 するという能力を反映した名前をもつ、残りの“Ｆｃ”フラグメントが生じる。 ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位をもち、未だに抗原をクロス連結で きるＦ（ａｂ’）₂フラグメントを生じる。 “Ｆｖ”は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体フラグメン トである。この領域は、しっかりと非共有結合的に結合した、１つの重鎖および １つの軽鎖の可変ドメインの２量体からなっている。各可変ドメインの３つのＣ ＤＲが相互作用してＶ_H−Ｖ_L２量体表面で抗原結合部位を規定するのは、この構 造においてである。結合して、６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性を与 える。しかし、全体の結合部位に比べるとアフィニティは低いが、たった１つの 可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＣＤＲしか含まないＦｖの半 分）であっても、抗原を認識して、結合する能力を有する。 いかなる脊椎動物の種由来の免疫グロブリンの軽鎖であっても、その定常ドメ インのアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明ら かに異なったタイプの１つに割り当てることができる。 免疫グロブリンは、その重鎖の定常域のアミノ酸配列によって、異なるクラス に割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、 ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、さらにこれらのうちのいくつか はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４のようなサブクラス（ イソタイプ）に分割することができる。免疫グロブリンの種々のクラスに対応す る重鎖の定常域は、それぞれα、デルタ、イプシロン、γおよびμと呼ばれてい る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元配置はよく 知られている。 本明細書で用いられている“モノクローナル抗体（ｍＡｂ）”という用語は、 実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指しており、すなわち、その集団 からなる抗体は、少量は存在するかもしれない天然に起こる可能性のある変異を 除いては同一である。このように、“モノクローナル”という語句は、別個の抗 体の混合物ではないものとして抗体の特徴を指し示している。モノクローナル抗 体は、抗体のフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂およひＦｖ）はもち ろんのこと、種の由来または免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスの指定に かかわらず、抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含めて）を定常ドメインと つなぐことによって（例えば“擬人化”抗体）、または軽鎖を重鎖とつなぐこと によって、またはある種由来の鎖を他の種由来の鎖とつなぐことによって、また は融合物を異種のタンパク質とつなぐことによって生産された雑種および組み換 え抗体を含有する。カビリーＣａｂｉｌｌｙら，米国特許番号４，８１６，５６ ７；メイジおよびラモイＭａｇｅ＆Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ 中，ｐｐ．７９−９７（マーセル デッカーＭａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，インコーポレイティッド．，ニューヨーク，１９８７）。このよ うに、“モノクローナル”という語句は、そのように実質的に均一な抗体の集団 から得られるものとして抗体の特徴を指し示しており、特定の方法によって抗体 を生産する必要のあるものと考えるべきでない。 非ヒト（例えば、ネズミ）の抗体の“擬人化”形態は、非ヒト免疫グロブリン 由来の最小配列を含有する免疫グロブリン、免疫グロブリンの鎖または（Ｆｖ、 Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂または抗体の他の抗原結合配列のような）免 疫グロブリンのフラグメントである。擬人化抗体は殆どの部分がヒト免疫グロブ リン（受容者の抗体）であり、この免疫グロブリンは受容者の相補性決定域（Ｃ ＤＲ）由来の残基が、目的の特異性、アフィニティおよび能力をもっているマウ ス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基と 置換している。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖのフレームワー ク残基か相当する非ヒト残基と置換している。さらに、擬人化抗体は、受容者の 抗体や持ち込んだＣＤＲもしくはフレームワーク配列には決して見いだされない 残基を含有してもよい。これらの変更は、さらに抗体の性能を精錬および最適化 するために行われる。“キメラ”および“擬人化”抗体に関しては、例えば、米 国特許番号４，８１６，５６７；ＷＯ９１／０９９６８；ＥＰ４５２，５０８； およびＷＯ９１／１６９２７を参照されたい。 本明細書で用いられているように、“免疫アドヘジン”という用語は、異種タ ンパク質（“アドヘジン”）の結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフ ェクタ機能と結び付けた抗体様分子を意味している。免疫アドヘジンは構造的に は、抗体（すなわち“異種”）の抗原認識および結合部位（抗原結合部位(antig en combining site)）以外の所望の結合特異性を有するアミノ酸配列、および免 疫グロブリンの定常ドメイン配列の融合物を含有する。免疫アドヘジン分子のア ドヘジン部分は一般に、少なくともレセプター（細胞接着分子など）またはリガ ンドの結合ドメインを含有する隣接したアミノ酸配列である。免疫アドヘジンに おける免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ −３またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのよう ないかなる免疫グロブリンから得てもよい。 異種の結合ドメインのＣ末端は普通、免疫グロブリンの可変域の代わりに、定 常域の配列のＮ末端と融合しているが、Ｎ末端での融合もまた可能である。 そのような融合物は一般に、少なくとも機能的に活性のあるヒンジ、免疫グロ ブリンの重鎖の定常域のＣＨ２およびＣＨ３を保持している。融合はまた定常域 のＦｃ部のＣ末端、または重鎖もしくはそれに相当する軽鎖のＣＨ１間近のＮ末 端に対して行われる。これは本来、適当なＤＮＡ配列を構築し、それを組み換え 細胞培養で発現することによって達成する。または、免疫アドヘジンは既知の方 法にしたがって合成してもよい。 融合を行う正確な部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、免疫 アドヘジンの生物学的な活性、分泌または結合の特徴を最適化するために選択し てもよい。 好ましい具体例において、レセプターまたはリガンドに対する結合部位を含有 するアミノ酸配列のＣ末端は、例えば免疫グロブリンＧ₁（ＩｇＧ−１）などの 免疫グロブリンのエフェクター機能を有する抗体のＣ末端部分（特にＦｃドメイ ン）にＮ末端で融合する。重鎖定常域の全体を結合部位を含有する配列と融合す ることは可能である。しかし、さらに好ましくは、パパイン分解部位（ＩｇＧの Ｆｃを化学的に規定する；重鎖の最初の残基を１１４番目とみなしたときの２１ ６番目の残基［コベットＫｏｂｅｔら，前掲］、または他の免疫グロブリンの類 似の部位を規定する）のすぐ上流のヒンジ領域から始まる配列を融合に用いる。 特に好ましい具体例において、リガンドまたはレセプター結合部位を含有するア ミノ酸配列をＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４重鎖のヒン ジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３；またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメ インと融合する。 本明細書で用いられているように“二特異的免疫アドヘジン”という熟語は、 少なくとも２つの結合特異性を有し、そのうちの１つが抗体の抗原結合部位であ ってもよい（しかしそうである必要はない）免疫アドヘジン（本明細書中上記で 定義している）を意味している。二特異的免疫アドヘジンは一般に、ＷＯ８９／ ０２９２２（１９８９年４月６日発行）、ＥＰ３１４，３１７（１９８９年５月 ３日公開）、および１９９２年５月２日発行の米国特許番号５，１１６，９６４ に開示されているように、ヘテロ多量体として、および特にヘテロ２量体、ヘテ ロ３量体またはヘテロ４量体としてとして集合することができる。 “３量体二特異的免疫アドヘジン”という表現は、Ｙ字型の免疫グロブリンの 片方の腕において、最初の重鎖定常ドメイン（ＣＨＩ）が除去または改変されて 免疫グロブリン軽鎖と共有結合する能力が排除されており（つまり、軽鎖結合部 位が除去されている）、一方で、もう片方の腕において、ＣＨ１ドメイン中の軽 鎖結合部位が保持され、そして免疫グロブリン軽鎖に共有結合している、という 構造を意味している。 各腕では、重鎖定常ドメイン配列は互いに異なる（重鎖の可変ドメインに取っ て代わる）“結合ドメイン”と融合している。結合ドメインの１つは異種であり （つまり抗体の抗原結合部位ではない）、それに対して、他方の結合ドメインは 異なる異種の結合ドメインまたは抗体の抗原結合部位を含有する配列でもよい。 結果として生じる構造は、第１の結合ドメインと融合した免疫グロブリン重鎖定 常ドメイン配列および異なる結合ドメインと融合し、免疫グロブリン軽鎖と共有 結合で結合した第２の免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列から構成される２つ の異なる結合特異性を有する３量体（ヘテロ３量体）である。異種の結合ドメイ ンは、好ましくは、天然のリガンドまたはレセプターに特異的に結合することが できるペプチドまたはポリペプチド（リガンドまたはレセプター結合ドメイン） である。本明細書においてそのヘテロ３量体構造を作成するという究極的な目的 は、様々な免疫グロブリン鎖の組み合わせ混合物からの二特異的免疫アドヘジン の単離および精製を容易にするということであるので、軽鎖結合部位は、好まし くは、簡便な分離方法（例えば、選択的な結合試薬）が存在しない結合ドメイン を含む重鎖内に保持する。その結果、二特異的免疫アドヘジン分子のこちら側の 腕の重鎖は、例えば市販の軽鎖特異的抗体によって特異的に認識および分離する ことができる免疫グロブリン軽鎖に共有結合で結合するだろう。もっとも好まし くは、実質的に無傷のＣＨ１ドメインは二特異的免疫アドヘジン分子のこちら側 の腕に保持する。 ２つまたはそれ以上のヘテロ３量体は、互いに共有結合で結合して多量体構造 を生じる。一般に、これらの集合体二特異的免疫アドヘジンは既知の単位構造を 有するだろう。ジスルフィド結合によって結合した基本的な４本鎖単位の５量体 として一般に存在するＩｇＭのような、または血清中で多量体の形態で存在する ＩｇＡグロブリン、およびしばしばＩｇＧグロブリンのようなより大きい分子量 の免疫グロブリンと同様に、３本鎖単位が繰り返すかもしれない。多量体の場合 には、各３本鎖単位は、同一かまたは異なっているかもしれない。 “（免疫グロブリンの）軽鎖結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常ドメイン 配列”という用語は、軽鎖が普通に結合している配列要素が除去または十分に変 更されて（変異して）、そのような結合がもはや不可能になっている免疫グロブ リン重鎖定常ドメイン配列を意味するために用いている。好ましい具体例として 、軽鎖が普通にジスルフィド結合で結合しているかまたは非共有結合的に相互作 用している部分が取り除かれていることを条件に、ＣＨ１ドメイン全体は欠失し ているが、免疫グロブリン定常ドメインのより短い短縮型がまた適している。ま たは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの軽鎖結合領域は、免疫グロブリン軽鎖 に共有結合も非共有結合ももはやできないように、変異（置換または挿入によっ て）してもよい。 本明細書で用いられるように、“リガンド結合ドメイン”という用語は、少な くとも定性的なリガンド結合力、および好ましくは対応する天然のレセプターの 生物学的活性を保持しているいかなる天然の細胞表面レセプターまたはいかなる 領域またはその誘導体をも指している。特定の具体例では、そのレセプターは、 免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと相同な細胞外ドメインを有する 細胞表面ポリペプチドに由来する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバ ーであっても、そうでなくてもよいが、それにもかかわらず、この定義に特に包 含される他の一般的なレセプターは、サイトカインに対するレセプター、そして 特にチロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ） 、ヘマトポイエチンおよび神経成長因子レセプタースーパーファミリーのメンバ ー、および例えば（Ｅ−、Ｌ−およびＰ−）セレクチンなどの細胞接着分子であ る。 “レセプター結合ドメイン”という用語は、少なくとも定性的なレセプター結 合力、および、好ましくは対応する天然のリガンドの生物学的活性を保持してい る細胞接着分子などのレセプターに対するいかなる天然のリガンド、またはいか なる領域またはそのような天然のリガンドの誘導体をも意味するために用いられ ている。この定義は、数あるなかでも特に、上で挙げたレセプターに対するリガ ンド由来の結合配列を含有する。 多遺伝子ファミリーは、同様な機能を有する相同な遺伝子の集団である。“ス ーパー遺伝子ファミリー”“遺伝子スーパーファミリー”および“スーパーファ ミリー”という名称は、配列の相同性によって関係づけているが、必ずしも機能 では関係ない多遺伝子および単一コピーの遺伝子の集合を指している。免疫グロ ブリンスーパー遺伝子ファミリー（免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーま たは免疫グロブリンスーパーファミリーとも言われる）のメンバーによってコー ドされるポリペプチドは、免疫グロブリン定常ドメインに相同なドメインを含有 し、およびクラスＩおよびクラスII主要組織適合性抗原、免疫グロブリンおよび 例えばＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８などのＴ細胞レセプターα、 β、γおよびデルタ鎖、ＣＤ３、ＯＸ−２、Ｔｈｙ−１のγ、デルタおよびカッ パ鎖、細胞内または神経細胞接着分子（Ｉ−ＣＡＭ、Ｎ−ＣＡＭ）、リンパ球機 能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）、神経細胞質タンパク質（ＮＰＣ−３）、ポリＩ ｇレセプター、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、高アフィニティＩｇＥレ セプター、末梢性ミエリンの主要糖タンパク質（Ｐｏ）、血小板由来成長因子レ セプター（ＰＤＧＦ−Ａ、 ＰＤＧＦ−Ｂ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１ ）、マクロファージＦｃレセプター、ＦＣガンマレセプターおよびがん胎児性抗 原［フッド，Ｌ．Ｍ．Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ ４０，２２５−２２９ （１９８５）］を含有している。相同とは、本明細書で定義されているように、 免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーの配列を有していること、 または上で免疫グロブリン可変または定常ドメインに与えた特定の実施例のよう に、スーパーファミリーの既知のメンバーと実質的に同一の（またはかなりの程 度まで）アミノ酸配列の相同性をもつ内部配列を有していることを意味する。 “ＣＤ４”という用語は、天然の供給源から単離してこようと、化学的に合成 しようと、または組み換えＤＮＡ技術の方法によって生産しようと、少なくとも 定性的なＨＩＶ結合能力を保持している、天然の配列のＣＤ４分子［マダンＭａ ｄｄｏｎら，Ｃｅｌｌ ４２，９３（１９８５）；１９８８年２月２５日発行の ＷＯ８８／０１３０４］またはそのいかなるフラグメントもしくは誘導体を意味 するために用いられている。 “リンパ球ホーミングレセプター”および“Ｌ−セレクチン”という用語は相 互交換的に用いられ、天然の供給源から単離してこようと、化学的に合成しよう と、または組み換えＤＮＡ技術の方法によって生産しようと、少なくともＬ−セ レクチンのリガンドに結合する定性的な能力、および好ましくはＬ−セレクチン の生物学的活性を保持している、１９９２年３月２４日発行の米国特許番号５， ９８，８３３に開示されているような天然の配列のホーミングレセプター分子、 またはいかなるフラグメントもしくはその誘導体を意味している。 “誘導体”という用語は、本発明の二特異的免疫アドヘジンを構築する際に使 用することができるレセプター、リガンドまたは免疫グロブリンの配列などのア ミノ酸配列およびグリコシル化変異体、および天然の配列のタンパク質の共有結 合の変更を定義するために用いられている。 “アミノ酸”および“種々のアミノ酸”という用語は、天然に存在するＬ−α −アミノ酸をすべて指している。アミノ酸は、１文字表記または３文字表記の名 称のどちらかによって確定する： これらのアミノ酸は、化学的組成およびその側鎖によって分類してもよい。そ れらは電荷のあるものと電荷のないものの２つのグループに大きく分類される。 これらのグループはそれぞれ、アミノ酸をさらに正確に分類するためのサブグル ープに分けられる： Ｉ．電荷のあるアミノ酸 酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸 塩基性残基：リジン、アルギニン、ヒスチジン II．電荷のないアミノ酸 親水性残基：セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン 疎水性残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン 非極性残基：システイン、メチオニン、プロリン 芳香性残基：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン “アミノ酸配列変異体”という用語は、天然のアミノ酸配列と比較して、その アミノ酸配列中にいくつかの相違がある分子を指している。そのようなアミノ酸 配列変異体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、厳密な条件下において、天 然のレセプター配列のリガンド結合ドメイン、天然のリガンド配列のレセプター 結合ドメイン、相当する天然の免疫グロブリンの鎖または天然の抗体の抗原結合 部位をコードするＤＮＡ配列の相補鎖とハイブリダイズすることができる。アミ ノ酸配列変異体は本来、天然のリガンド配列のレセプター結合ドメイン、天然の レセプター配列のリガンド結合ドメイン、天然の免疫グロブリン配列、または（ 二特異的免疫アドヘジンに存在する結合ドメインの１つが抗体の抗原結合部位で あるときには）天然の抗体の抗原結合部位と少なくとも約７０％の相同性を有す るだろう。その相同性は、好ましくは、少なくとも約８０％、さらに好ましくは 少なくとも約９０％である。アミノ酸配列変異体は、相当する天然のアミノ酸配 列内のある場所での置換、欠失、および／または挿入を有する。 “相同性”は、もし必要であるならば、最大のパーセントの相同性を達成する ために、その配列を直線状に並べ、ギャップを導入した後に、その天然の対応物 のアミノ酸配列中の残基と同一であるような該アミノ酸配列中の残基のパーセン トとして定義されている。直線状に並べるための方法およびコンピューターのプ ログラムは当業者によく知られている。 “厳密な条件”とは、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣ ｌ、１５ｍＭ クエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７ ．６）、５×デンハーツ溶液、１０％ 硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍ ｌの変性し、破砕したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２゜Ｃで一晩インキ ュベートすることである。 置換変異体は、天然の配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されていて 、同じ位置のその場所に異なるアミノ酸が挿入されている変異体である。置換は 分子中のたった１つのアミノ酸が置換されている単一の場合であってもよく、ま たは２つまたはそれ以上のアミノ酸が同一分子内で置換されている多重の場合で もよい。 挿入変異体は、天然の配列の特定の部位のアミノ酸にすぐ隣接して１つまたは それ以上アミノ酸が挿入されている変異体である。アミノ酸にすぐ隣接するとは 、アミノ酸のα−カルボキシルまたはα−アミノ官能基のどちらかに結合してい ることを意味する。 欠失変異体は、天然のアミノ酸配列中の１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去 されている変異体である。欠失変異体は本来、分子の特定の領域で１つまたは２ つのアミノ酸が欠失しているだろう。 “グリコシル化変異体”という用語は、天然の対応物とは異なったグリコシル 化プロフィルをもつ糖タンパク質を指すために用いられている。ポリペプチドの グリコシル化は一般に、Ｎ−結合型かまたはＯ−結合型のどちらかである。Ｎ− 結合型とは、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物の一部が結合することを指して いる。Ｘがプロリン以外のどのアミノ酸でもよいアスパラギン−Ｘ−セリン、ア スパラギン−Ｘ−スレオニンのトリペプチド配列は、酵素がアスパラギン側鎖に 炭水化物の一部を結合するための認識配列である。Ｏ−結合型グリコシル化は、 Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースまたはキシロースなどの糖の１つがヒ ドロキシアミノ酸、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシセリンもまた Ｏ−結合型グリコシル化に含有されるが、もっとも一般にはセリンまたはスレオ ニンに結合することを指している。その天然の対応物と比較して、リガンド中に 存在する炭水化物の一部の位置および／または性質のいかなる相違も、本明細書 の範囲に含まれる。 天然の糖タンパク質のグリコシル化パターンは、ＨＰＡＥクロマトグラフィー ［ハーディ，Ｍ．Ｒ．Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１ ７０ ，５４−６２（１９８８）］、グルコシル結合の組成を決定するためのメチ ル化分析［リンドバーグ，Ｂ．Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｍａｔｈ．Ｅｎｚｙｍ ｏｌ．２８ ．１７８−１９５（１９７２）；ウィージェ，Ｔ．Ｊ．Ｗａｅｇｈｅ ，Ｔ．Ｊ．ら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１２３，２８１−３０４（１９８ ３）］，ＮＭＲ分光測定法、ｍａｓｓ分光測定法などの分析化学のよく知られて いる技術によって決定することができる。 相互交換的に用いられている“結合ドメイン変異体”および“変異体結合ドメ イン”という用語は、天然の結合ドメイン配列のアミノ酸配列変異体およびグル コシル化変異体の両方を含有している。 “共有結合性変異体”は、有機性のタンパク質または非タンパク質誘導剤を用 いる天然のアミノ酸配列の変更、および翻訳後変更（修飾）を含有している。共 有結合性の変更は慣習的には、選択した側鎖または末端残基と反応することがで きる有機的な誘導剤を用いて、変更されるべきポリペプチドの標的アミノ酸残基 を反応させることによって、または選択した組み換え宿主細胞で機能する翻訳後 変更のメカニズムを利用することによって導入する。結果として生じる共有結合 性誘導体は、生物学的活性、イムノアッセイ、または組み換え糖タンパク質をイ ムノアフィニティによって精製するための抗体調製にとって重要な残基を確定す ることを目的とした計画に有用である。ある種の翻訳後変更は、組み換え宿主細 胞が発現ポリペプチドにもたらした活動の結果である。グルタミンおよびアスパ ラギン残基はしばしば、翻訳後に脱アミド化して相当するグルタミルおよびアス パラチル残基になることがある。または、これらの残基は緩やかなアルカリ条件 下で脱アミド化する。これらの残基の形態のどちらかは、本発明にしたがって用 いられるポリペプチドに存在してもよい。他の翻訳後変更は、プロリンおよびリ ジンのヒドロキシ化、セリンまたはスレオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン 、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．クレイ 卜ンＴ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａ ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ，Ｗ．Ｈ．フリーマンＷ．Ｈ ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ.,サンフランシスコ，ｐｐ．７９−８６（１９８３ ）］を含有する。 共有結合性誘導体は特に、天然または変異体のアミノ酸配列が非タンパク質ポ リマーに共有結合で結合している融合分子を含有する。非タンパク質ポリマーは 本来、親水性合成ポリマー、つまりそうでなければ天然には見いだされないポリ マーである。しかし、天然に存在し、組み換えまたはインビトロの方法によって 生産されるポリマーは、天然から単離されるポリマーと同様に有用である。例え ばポリビニルアルコールおよびポリビニルプロピレンなどの親水性ポリビニルポ リマーは、本発明の範囲に入る。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ コールなどのポリビニルアルキレンエーテルは特に有用である。 その結合ドメインは、米国特許番号４，６４０，８３５；４，３０１，１４４ ；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２または４，１７９，３３７中の上記 の方法で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキ シアルキレンのような様々な非タンパク質ポリマーに結合してもよい。 本発明の二特異的免疫アドヘジンは実質的に均一に精製される。“実質的に均 一”“実質的に均一な形態”および“実質的な均一性”という語句は、その産物 が、望んでいない免疫グロブリン鎖の組み合わせに由来する副産物を実質的に欠 いているということを指すために用いられている。純粋、実質的な均一性という 用語で表現されているのは、副産物を含有する免疫グロブリン配列の量が重量パ ーセントで５％を越えず、好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．５％以下 、 最も好ましくは０．１％以下であることを意味している。 １９８３年に、レトロウイルスは、細胞性免疫機能の深刻な不全および日和見 感染および悪性化の発生によって特徴づけられる症候群との関係において確定さ れた［バーレーシノアシ，Ｆ．Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ，Ｆ．ら，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２２０，８６８−８７１（１９８３）］。引き続き、異なる地理学的 な地域の患者から関係するレトロウイルスが多数単離され、このレトロウイルス の疫学的な役割が明らかに確立された。最初は、これらの単離物はリンパアデノ パチー関連ウイルス（ＬＡＶ）、ヒトＴリンパ球性ウイルス（ＨＴＬＶ−III） またはＡＩＤＳ関連ウイルスのように様々な呼ばれ方をしていたが、今日一般に 認められている用語はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、さらにＨＩＶタ イプ−１（ＨＩＶ−１）およびＨＩＶ−タイプ２（ＨＩＶ−２）のようなサブタ イプ、およびＨＩＶ−１のIIIＢ株ようにサブタイプ内に数種の株が存在する。 “ＨＩＶ”という用語は、本明細書では、前出のレトロウイルスすべて、および 特にヒト免疫不全ウイルスのすべてのタイプおよび株を包含するために用いられ ている。 ＨＩＶは、構造タンパク質をコードする３つの領域を包含するレトロウイルス である。ｇａｇ領域はビリオンのコアータンパク質をコードし、ｐｏｌ領域はビ リオンの逆転写酵素をコードし、およびｅｎｖ（エンベロープ）領域はＨＩＶウ イルスに感染した細胞の膜に見いだされる主要な糖タンパク質である。ウイルス の病原において基本的な役割を果たすと考えられている構造エレメントは、前駆 体であるｅｎｖポリペプチドｇｐ１６０をコードするｅｎｖ領域である。この前 駆体は分解されて、ｇｐ１２０（約４８１アミノ酸の多数グリコシル化された細 胞外の膜タンパク質）およびｇｐ４１（約３４５アミノ酸の膜貫通タンパク質） を生じる。ＨＩＶ−１の構造および完全なヌクレオチド配列についてのさらなる 詳細に関しては、例えばラトナーＲａｔｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，２７ ７−２８５（１９８５）を参照されたい。 本発明にしたがって、結合の標的となるＨＩＶの主要なエンベロープの糖タン パク質内の特異的部位は、好ましくは、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１領域 内またはｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体上にある。 本発明の文脈において“細胞”、“細胞株”および“細胞培養”という表現は 相互交換的に用いられ、そのような名称はすべてその後代も含有する。すべての 後代は、意図的または偶然の変異のために、ＤＮＡの内容において正確には同一 ではないかも知れないということもまた理解される。もともとの形質転換細胞に おいてスクリーニングされるのと同じ機能または生物学的性質を有する変異した 後代は包含される。 “形質転換”は、染色体外エレメントとしてかまたは染色体との融合によって 、ＤＮＡが複製できるような生物体にＤＮＡを導入することを意味している。 “トランスフェクション”は、コードしている配列が実際に発現するしないに かかわらず、発現ベクターを宿主細胞が取り込むことを指している。 “形質転換した宿主細胞”および“形質転換した”という用語は、ＤＮＡを細 胞に導入することを指している。細胞は“宿主細胞”と呼ばれ、原核細胞でも真 核細胞でもよい。一般的な原核宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉの様々な株を含有する 。一般的な真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胎児腎 臓２９３細胞のような噛乳類である。導入されるＤＮＡは通常、ＤＮＡの挿入断 片を含有するベクターの形態をとっている。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞 と同じ種由来のものでも、宿主細胞と異なる種由来ものもでもよく、いくつかの 外来ＤＮＡおよびいくつかの同種ＤＮＡを含有する２本鎖ＤＮＡ配列でもよい。 “複製可能な発現べクター”および“発現ベクター”という用語は、そのベク ターに外来ＤＮＡ断片が挿入されている、通常は２本鎖のＤＮＡ断片を指してい る。外来ＤＮＡは、宿主細胞に天然には見いだされないＤＮＡである異種ＤＮＡ として定義されている。ベクターは外来または異種ＤＮＡを適当な宿主細胞に輸 送するために用いられる。ベクターはいったん宿主細胞に入ると、宿主の染色体 ＤＮＡに依存せずに複製することができ、ベクターのいくつかのコピーと挿入さ れた（外来）ＤＮＡが生成するかもしれない。さらに、べクターは外来ＤＮＡを ポリペプチドに翻訳するのを可能にする必要なエレメントを含有する。外来ＤＮ Ａによってコードされる多くのポリペプチド分子は、このように迅速に合成する ことができる。 “オリゴヌクレオチド”は、既知の方法によって［１９８８年５月４日公開の ＥＰ２６６，０３２に記載されているような固相技術を用いた、またはフローラ ーＦｒｏｅｈｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４，５３９９（１９ ８６）によって記載されているようなデオキシヌクレオチド Ｈ−ホスファネー ト中間体を介した、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホラミダイト 化学など］化学的に合成される長さの短い１本鎖または２本鎖ポリデオキシヌク レオチドである。それらはそれからポリアクリルアミドゲル上で精製する。 Ｂ．開始材料 免疫グロブリンおよびある種のその変異体が知られており、多くは組み換え細 胞培養で調製されている。例えば、米国特許番号４，７４５，０５５；ＥＰ２５ ６，６５４；フォールクナーＦａｕｌｋｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ２９８：２８ ６（１９８２）；ＥＰ１２０，６９４；ＥＰ１２５，０２３；モリソンＭｏｒｒ ｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｏｎ．１２３：７９３（１９７９）；ケーラーＫｏｈｌｅ ｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１ ９８０）；ラソＲａｓｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４１：２０７３（１９８１ ）；モリソンＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５ ）；モリソンＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１ ：６８５１（１９８４）；ＥＰ２５５，６９４，ＥＰ２６６，６６ ３；およびＷＯ８８／０３５５９を参照されたい。再集合した免疫グロブリンの 鎖もまたタンパク質工学によって生産した合成抗体結合部位（Ｆｖ類似体）［例 えば、ハストン，Ｊ．Ｓ．Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，５８７９−５８８３（１９８８）および１９９ ２年２月２５日発行のＵＳ５，０９１，５１３を参照）と同様に、知られている （例えば、米国特許番号４，４４４，８７８；ＷＯ８８／０３５６５：およびＥ Ｐ６８，７６３および本明細書に引用した参考文献を参照）。 レセプター−（リガンドー）免疫グロブリンキメラまたは抗体中に重鎖の定常 ドメイン配列を提供する免疫グロブリンの選択は、本明細書における特定の二特 異的免疫アドヘジンを構築する動機に大きく依存している。胎盤細胞の特定のレ セプターは、ＩｇＧ（そしてＩｇＧのみ）分子の定常域を認識し、それによって 、それらをエンドサイトーシスによって取り込み、細胞を横切って輸送し、細胞 の反対側の胎児の血中に放出することができる。ＩｇＧは、妊娠中、母体から胎 児へ移動するために胎盤を横切ることができる唯一の免疫グロブリンであるので 、ＩｇＧの定常ドメインは、母体から胎児への感染の伝播を防ぐためにデザイン されている免疫アドヘジンに用いられなければならない。もしレセプターまたは リガンドの血漿半減期を延長することが懸案であるならば、ＩｇＧ−３のインビ ボの半減期が７日であるのに対し、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２およびＩｇＧ−４イ ソタイプはすべてインビボの半減期が２１日であるので、よい候補である。ある 種の状況において利点または害となりそうなさらなる相違は、例えば、補体の活 性化においてである。ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２およびＩｇＧ−３はすべて補体を 活性化するが、ＩｇＧ−２は補体の活性化がＩｇＧ−１より有意に弱く、単球や 好中球上のＦｃレセプターに結合せず、一方でＩｇＧ−３はＩｇＧ−１よりも強 い補体の活性化を示す。ＩｇＧ−１は血清学的に定義されたアロタイプ部位を４ つだけもち、そのうちの２つ（Ｇ１ｍ１および２）はＦｃ部分に存在する；これ らの部位の２つ（Ｇ１ｍ１および１７）のうち１つのアロタイプは非免疫原性で ある。それとは対照的に、ＩｇＧ−３の中には１２の血清学的に定義されたアロ タイプが存在し、それらすべてがＦｃ部分に存在し、そのうち３つ（Ｇ３ｍ５、 １１および２１）だけが非免疫原性のアロタイプを有している。このように、反 復的および長期的な治療に応用するためには、ＩｇＧ−１由来の定常ドメイン配 列を有する免疫アドヘジンが好ましい。二特異的免疫アドヘジン分子の２つの腕 に、異なるクラスやイソタイプ由来の免疫グロブリンを用いることは可能である 。その分子の同一の腕に、様々な免疫グロブリンのクラスやイソタイプ由来の配 列を結合することもさらに可能である。例えば、ＩｇＧ−１のヒンジがＩｇＧ− ３のものと置換している構築物は、十分に機能的である。 本発明の二特異的免疫アドヘジンを調製するための、結合ドメインを生じるか もしれない天然のタンパク質をコードするＤＮＡは、目的のタンパク質に対する ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる臓器から調製 されたいかなるｃＤＮＡライブラリーからも得られるかもしれない。ライブラリ ーは、関心のある遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質の遺伝子を 同定するためにデザインされたプローブを用いてスクリーニングされる。ｃＤＮ Ａ発現ライブラリーでは、適当なプローブは通常、目的のタンパク質を認識し、 特異的に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含有する；同一ま たは異なる種由来のリガンドｃＤＮＡの既知のまたは推測される部分をコードす る、長さにして約２０−８０塩基のヌクレオチド；および／または同一または同 様の遺伝子をコードする相補的または同種のｃＤＮＡまたはその断片。 目的の天然のタンパク質をコードする遺伝子を単離するための他の方法は、１ ９８７年７月２８日発行の米国特許番号４，６８３，１９５、サンブルークＳａ ｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス ．ニューヨーク，１９８９のセクション１４中、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，オースベルＡｕｓ ｕｂｅｌら，編．，グリーンパブリッシングアソシエイツおよびワイリー−イン ターサイエンス１９９１の１５章中に記載されているポリメラーゼチェーン反応 （ＰＣＲ）を用いることである。 他の選択肢は、エンジェルズＥｎｇｅｌｓら，Ａｑｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２８ ，７１６（１９８９）に記載されている方法の１つを用 いて、結合ドメインを含有する目的の（天然のまたは変異した）タンパク質をコ ードする遺伝子を化学的に合成することである。これらの方法は、トリエステル 、ホスファイト、ホスホラミダイトおよびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび他 のオートプライマー法、および固体の支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を含 有する。もしその遺伝子の核酸の配列全体が既知であるか、コードしている鎖に 相補的な核酸の配列が利用可能であるならば、または、もし標的のアミノ酸配列 が既知であって、各アミノ酸残基に対する既知で好ましいコード残基を用いて可 能 な核酸の配列を推測してもよいならば、これらの方法を利用してもよい。 本発明の二特異的免疫アドヘジンのアミノ酸配列変異体は、好ましくは、その 構築に用いられる天然のタンパク質の配列をコードするＤＮＡ配列を変異するこ とによって、またはもっと早い時期に作成した変異配列から開始することによっ て構築する。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作成するのに適当な一般的方 法は、本明細書中の以降で詳細を説明するだろう。 天然の糖タンパク質のグリコシル化パターンにおける変化は通常、操作を簡単 にするために、アミノ酸配列変異体に関して本明細書中の以降で議論する技術を 必ず用いて、ＤＮＡレベルで作成する。 本発明の二特異的免疫アドヘジンを構築するのに用いられるアミノ酸配列への 糖の化学的または酵素的なカップリングはまた、炭水化物の置換の数またはプロ フィルを変更または増加するために用いられる。これらの手順は、それらがＯ− 結合型（またはＮ−結合型）グリコシル化が可能なポリペプチドの生産を必要と しないという点で有利である。用いられるカップリングの様式によって、糖は（ ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システ インにあるような遊離の硫化水素基、（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロ キシプロリンにあるような水酸基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくは トリプトファンにあるような芳香性残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に 結合するかもしれない。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９ 月１１日発行）、およびエイプリンとリストンＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔ ｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６中 に記載されている。 天然の糖タンパク質の配列上に存在する炭水化物部分はまた、化学的または酵 素的に除去されるかもしれない。化学的な脱グリコシル化はトリフルオロメタン 硫酸または同等な化合物にさらすことが必要である。これらの処置の結果として 、ポリペプチドは無傷のままであるが、結合している糖を除いてほとんどまたは すべての糖が分解される。化学的な脱グリコシル化は、ハキムディンＨａｋｉｍ ｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９，５２（１ ９ ８７）およびエッジＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，１３１（ １９８１）によって記載されている。炭水化物部分は、ソタクラＴｈｏｔａｋｕ ｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８，３５０（１９８７）によって記載 されているような様々なエンドおよびエキソヌクレアーゼによって除去すること ができる。グリコシル化は、ダスキンＤｕｓｋｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２５７，３１０５（１９８２）によって記載されているツニカマイシンによっ て抑制される。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を妨 害する。 本明細書における二特異的免疫アドヘジンを構築するのに用いられるアミノ酸 配列のグリコシル化変異体はまた、選択する適当な宿主細胞によって生産するこ とができる。例えば、酵母は哺乳類とは有意に異なるグリコシル化を導入する。 同様に、天然のアミノ酸配列の供給源よりも、異なる種（例えばハムスター、ネ ズミ、昆虫、ブタ、ウシおよびヒツジ）または由来する臓器（例えば肺、肝臓、 リンパ、間葉または上皮）を有する哺乳類細胞は日常的に、変異したグリコシル 化を導入する能力をスクリ−ニングされる。 Ｂ．一般的な技術 次に、本発明の二特異的免疫アドヘジンを作成するために用いることができる 組み換えＤＮＡ技術のある種の一般に用いられる技術について簡単な説明を行う 。 これらおよび同様の技術のさらなる詳細は、例えば、サンブルークＳａｍｂｒ ｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，第２版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス．ニュ ーヨーク，１９８９；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，オースベルＡｕｓｕｂｅｌら，編．，グリー ンパブリッシングアソシエイツおよびワイリー−インターサイエンス１９９１の ような一般的な教科書に見いだされる。部位特異的突然変異誘発 本発明の二特異的免疫アドヘジンの変異体の調製は、その構造物中に用いられ ている配列を含めて、好ましくは、より早い段階で調製した変異体または標的の 変異タンパク質の変異していないものをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異 誘発によって達成する。部位特異的突然変異誘発は、横切っている連結部の両端 で安定な２量体を形成するのに十分な大きさと配列の複雑さをもつプライマー配 列を提供する十分な数の隣接するヌクレオチドはもちろんのこと、目的の変異の ＤＮＡ配列をコードする特定のヌクレオチド配列を使用することによって変異体 の生産を可能にする。一般に、長さにして約２０から２５ヌクレオチトのプライ マーが好ましく、その配列の連結部の両端の約５から１０残基が変異している。 一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は、アデルマンＡｄｅｌｍａｎら，ＤＮ Ａ ，２：１８３（１９８３）のような出版物によって例示されているように、当 業者によく知られている。 理解されているだろうが。部位特異的突然変異誘発は一般に、１本鎖および２ 本鎖の両方の形態で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘 発で有用な一般的なべクターは、例えば、メシングＭｅｓｓｉｎｇら，Ｔｈｉｒ ｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ，編集者Ａ．ワルトンＡ．Ｗ ａｌｔｏｎ，エルスビアー，アムステルダム（１９８１）によって開示されてい るように、Ｍ１３ファージのようなベクターを含有している。これらのファージ は、市販のものを容易に入手することができ、一般に、当業の熟練者にはよく知 られている。または、１本鎖ファージの複製起点を有するプラスミドベクター（ ベイラＶｅｉｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３（１９８７））は 、１本鎖ＤＮＡを得るのに用いてもよい。 部位特異的突然変異誘発は一般に、例えば、その配列内に、関係する非変異ア ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有する、最初に得られる１本鎖ベクター によって行われるかもしれない。目的の変異した配列を有するオリゴヌクレオチ ドプライマーは一般に、例えばクレアＣｒｅａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ），７５：５７６５（１９７８）の方法によって、合成的 に調製する。それから、このプライマーは１本鎖の非変異配列を包含するベクタ ーとアニーリングし、変異を包含する鎖の合成を完了するために、Ｅ．Ｃｏｌｉ ポリメラーゼＩクレノーフラグメントのようなＤＮＡをポリマー化する酵素を処 置する。このように、ヘテロ２本鎖が形成され、その内部では１つの鎖はもとも との非変異配列をコードし、２番目の鎖は目的の変異を包含している。それから 、このヘテロ２本鎖ベクターはＪＭ１０１のような適当な細胞を形質転換するた めに用い、変異配列を包含する組み換えベクターを含有するクローンは、³²−Ｐ でラベルした突然変異プライマーから構成される放射活性のあるプローブとハイ ブリダイゼーションすることによって選択する。 そのようなクローンを選択した後に変異した領域を除去し、一般には適当な真 核性宿主を形質転換するために一般に用いられる型の発現ベクターなどの、目的 の変異体を生産するための適当なベクターに導入するかもしれない。本発明の文 脈において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または２９３［グラハ ムＧｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）に記載 されているようなヒト胎児細胞］が長期にわたる安定なペプチド生産者の調製に 好ましい。しかし、試験目的で一過性の酵素生産のみを望むの場合には特に、多 数の他の細胞の種類を用いるのが適当であるように、本発明はＣＨＯ生産に限る ものではない。 二特異的免疫アドヘジンまたはそのうちの部分をコードするＤＮＡ配列に変異 を加えるための他の方法は、制限酵素で消化することによって適当な位置でＤＮ Ａを切断し、適切に切断したＤＮＡを回収し、目的のアミノ酸をコードするオリ ゴヌクレオチドおよび平滑末端のポリリンカー（ポリリンカーを用いる代わりに 、リガンドをコードするＤＮＡを分解するためにも用いられる制限酵素で合成オ リゴヌクレオチドを消化し、それによって粘着末端を作り出す）のような突出し た領域を合成し、および二特異的免疫アドヘジンまたはそのうちの目的の部分を コードする構造遺伝子の残りにその合成ＤＮＡを連結する。ＰＣＲ突然変異誘発 ＰＣＲ突然変異誘発はまた、本発明を実行するためのポリペプチドを作成する のに適している。次の議論はＤＮＡに関するものであるが、その技術はＲＮＡに 応用できることもまた理解される。ＰＣＲ技術は一般に次の手順に従っている。 少量の鋳型ＤＮＡがＰＣＲの開始材料として用いられるときには、プライマーが 鋳型と異なっている位置でだけ鋳型の配列と異なっている相対的に大量の特定の ＤＮＡ断片を生み出すために、鋳型ＤＮＡの相当する領域とは配列上少し異なる プライマーを用いることができる。プライマーの１つは、変異をプラスミドＤＮ Ａに導入するために、変異の位置をまたぎ、変異を含有するようにデザインする ；もう一方のプライマーはの配列はプラスミドの反対側の配列の範囲と同一でな ければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡのどこに位置することもできる 。しかし、第二のプライマーの配列は、結局のところプライマーに結合したＤＮ Ａの増幅された領域全体が容易に塩基配列の決定を行うことができるように、第 一のプライマーの配列から２００ヌクレオチド以内に位置することが好ましい。 今記載したばかりの増幅のようなプライマーのペアーを用いるＰＣＲ増幅は、結 果としてプライマーによって指定される変異の位置で、および鋳型のコピーはや や誤りが起こりがちであるので可能性としては他の位置で異なるＤＮＡ断片の集 合を生じる。 もし産物に対する鋳型の比が極端に低いならば、産物のＤＮＡ断片の大部分は 目的の変異を組み込んでいる。この産物は、標準的なＤＮＡ技術を用いて、ＰＣ Ｒの鋳型として働くプラスミド中の相当する領域と置換するために用いられる。 異なる位置の変異は、変異した第二のプライマーを用いるか、または異なる変異 プライマーで２回目のＰＣＲを行い、３カ所（またはそれ以上）の連結で２つの 生成したＰＣＲ断片を同時にベクター断片に連結するかどちらかによって同時に 導入することできる。宿主細胞の培養およびベクター チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓細胞株２９３ ［ウルロープおよびチャシンＵｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０）；グラハム Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６，５９（１９７７）］におけ る発現が結局のところ好ましいが、本明細書に開示されているベクターおよび方 法は、真核生物の広い範囲にわたる宿主細胞での使用に適している。 一般に、本発明における初期のＤＮＡ配列のクローニングおよび有用なベクタ ーの構築には、原核生物が好ましい。例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２株２９４（ ＡＴＣＣ番号３１，４４６）およびＥ．ｃｏｌｉ株 Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号 ２７，３２５）は特に有用である。他の適当な微生物株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂお よびＥ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５１７）のようなＥ．ｃｏ ｌｉ 株を含有する。これらの例は、当然のことながら、制限するということでは なく例示的なものであることを意図している。 原核生物はまた、発現にも有用である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ のようなバチルス菌、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｎまた はＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓのような腸内細菌、およびさまざまなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 種はもちろんのこと、上で挙げた株は発現に有用な宿主 の例である。 一般に、宿主細胞と和合性のある種由来のレプリコンおよび対照の配列を含有 するプラスミドが、これらの宿主とともに用いられる。ベクターは本来、形質転 換細胞で表現型の選択を提供することができるマーキング配列と同様に、複製部 位をもっている。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは一般に、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラス ミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する（例えば、ボリバーＢｏｌｉｖａ ｒら，Ｇｅｎｅ，２：９５（１９７７））。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよび テトラサイクリン耐性の遺伝子を含有しており、このように形質転換した細胞を 確定するのに容易な手段を提供している。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微 生物プラスミドもしくはファージはまた、それ自身のタンパク質を発現するため に微生物によって用いることができるプロモーターを含有するか、または含有す るように変更しなければならない。 組み換えＤＮＡ構築物においてもっとも一般に用いられるプロモーターは、β −ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャンＣ ｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３７５：６１５（１９７８）；イタクラＩｔａｋｕ ｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：１０５６（１９７７）；ゴーデルＧｏｅｄｄ ｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））およびトリプトファン（ ｔｒｐ）プロモーター系（ゴーデルＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ，８：４０５７（１９８０）；ＥＰＯ Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．３ ６，７７６）およびアルカリホスファターゼ系を含有する。これらはもっとも一 般に用いられる一方で、他の微生物プロモーターが発見されて利用されており、 そのヌクレオチド配列に関する詳細は発行されていて、熟練した人がそれらをプ ラスミドベクターと連結するのを可能にしている（シーベンリストＳｉｅｂｅｎ ｌｉｓｔら，Ｃｅｌｌ，２０：２９６（１９８０）参照）。 原核生物に加えて、酵母のような真核性微生物もまた本発明で用いるのに適し ている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的な パン酵母は、たくさんの他の株が一般に入手可能であるが、真核性微生物の中で は最も一般に用いられている。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発 現には、プラスミドＹＲｐ７（スティンクコームＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａ ｔｕｒｅ ，２８２：３９（１９７９）；キングスマンＫｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅ ｎｅ ，７：１４１（１９７９）；シェンパーＴｓｃｈｅｍｐｅｒら，Ｇｅｎｅ，１０ ：１５７（１９８０））が一般に用いられる。このプラスミドはすでに、例 えば、ＡＴＣＣ番号４４，０７６またはＰＥＰ４−１（ジョーンズＪｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，８５：１２（１９７７）などのトリプトファン中で生育する 能力を欠いている酵母の変異株に対する選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子 を含有する。宿主細胞のゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、それから 、トリプトファン非存在下において、生育によって形質転換を検出するための効 果的な環境を提供することになる。 酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列は、３−ホスホグリセリン酸キ ナーゼ（ヒッツェマンＨｉｔｚｅｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.,２５５： ２０７３（１９８０））、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸 脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ 、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピ ルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ ーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖系の酵素（ヘスＨｅｓｓら，Ｊ．Ａ ｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ，７：１４９（１９６８）；ホーランドＨｏｌｌ ａｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，１７：４９００（１９７８））を含有する 。適当な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に関係する終結配列は また、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結をもたらすために発現を目的とする 配列の発現ベクターの３’末端に連結されている。生育条件によって制御される という転写の利点を追加的に有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲ ナーゼ２、イソチトクロームＣＮ酸ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵 素、および上で挙げたグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびマル トースおよびガラクトース利用に働く酵素に対するプロモーターである。酵母と 和合的なプロモーター、複製起点および終結配列を含有するいかなるプラスミド ベクターも適している。 微生物に加えて、多細胞生物由来の培養もまた宿主として用いてもよい。原則 として、そのような細胞培養はどれでも、脊椎動物由来であろうが無脊椎動物由 来であろうが機能できる。しかし、脊椎動物への関心はもっとも大きかったし、 培養（組織培養）における脊椎動物細胞の普及が、近年、決まりきった手順とな ってきた［Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，アカデミックプレス，クルースおよ びパターソンＫｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，編（１９７３）］。そ のような有用な宿主細胞系列の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞 系列、およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１） 、２９３、およびＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）細胞系列である。そのよ うな細胞の発現ベクターは本来、複製起点、必要なリボゾーム結合部位とともに 、発現されるべき遺伝子の前に位置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、 ポリアデニル化部位、および転写終結配列を（必要であれば）含有する。 発現ベクター上の制御機能はしばしば、哺乳類細胞で使用するために、ウイル スの材料を提供されていることがある。例えば、一般に用いられるプロモーター はポリオーマ、アデノウイルス２由来であり、もっとも頻繁にシミアンウイルス ４０（ＳＶ４０）由来のものが用いられている。ＳＶ４０の初期および後期プロ モーターは、両者がＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含有する断片としてウイル スから容易に得られるという理由で特に有用である（フィアースＦｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２７３ ：１１３（１９７８））。より小さいまたはより大きいＳ Ｖ４０断片もまた、もしウイルスの複製起点に位置しているＨｉｎｄIII部位か らＢｇｌＩ部位にいたる約２５０−ｂｐの配列を含有しているのなら使用に適し ている。さらに、目的の遺伝子の配列に普通は関係するプロモーターまたは制御 配列を利用することは、もしそのような制御配列が宿主細胞系と和合的であるの なら可能でもあるし、しばしば望ましい。 複製起点は一般に、ＳＶ４０や他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、 ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源の由来であるような外因性の起点を含むべクターの構築 によって、または宿主細胞の染色体複製機構によって提供される。もしそのベク ターが宿主細胞の染色体に導入されるなら、後者でも十分なことがある。 十分な量の二特異的免疫アドヘジンは細胞培養によって生産される；しかし、 第二のコード配列を用いて純化するとさらに生産レベルを高めることができる。 第二のコード配列は、メトトレキセート（ＭＴＸ）のような内部で制御されるパ ラメーターによって影響を受けるデヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含有し、 このようにＭＴＸ濃度を制御することによって発現の制御を可能にする。 標的のポリペプチドおよびＤＨＦＲタンパク質の両者をコードＤＮＡ配列を含 有する本発明のベクターをトランスフェクションするための好ましい宿主細胞を 選択する場合に、用いるＤＨＦＲタンパク質の型を考慮することが適当である。 もし野生型ＤＨＦＲを用いるならばＤＨＦＲに欠陥がある宿主細胞を選択するこ とが好ましく、このように、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠いた 選択培地中で首尾よいトランスフェクションマーカーとしてＤＨＦＲコード配列 を利用することが可能になる。この場合の適当な宿主細胞はウルロープおよびチ ャシンＵｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓ ｃｉ． （ＵＳＡ）７７：４２１６（１９８０）によって記載されているように調 製され、普及した、ＤＨＦＲ活性を欠いたＣＨＯ細胞系列である。 一方で、もしＭＴＸに対する結合親和性が低いＤＨＦＲタンパク質が制御配列 として用いられるならばＤＨＦＲ欠陥細胞を用いる必要はない。その変異ＤＨＦ ＲがＭＴＸに耐性であるので、もしその宿主細胞自体がＭＴＸ感受性であるなら 、ＭＴＸを含有する培地を選択の手段として用いることができる。ＭＴＸを吸収 することができるほとんどの真核細胞はＭＴＸに感受性であると考えられる。そ のような有用な細胞系列はＣＨＯ系列のＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１ ）である。利用できる一般的なクローニングおよび発現方法 もし哺乳類細胞を宿主細胞として用いるならば、トランスフェクションは一般 に、グラハムおよびファンデルエプＧｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅ ｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６（１９７８）によって記載されているよう なリン酸カルシウム沈殿法によって実行される。しかし、核注入、エレクトロポ レーションまたはプロトプラスト融合のようなＤＮＡを細胞内に導入するための 他の方法もまた、使用するのに適している。 もし酵母を宿主として用いるならば、トランスフェクションは一般に、ヒネン Ｈｉｎｎｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５： １９２９−１９３３ （１９７８）が示しているように、ポリエチレングリコー ルを用いて達成される。 もし原核細胞または実質的な細胞壁構造を有する細胞を用いるならば、好まし いトランスフェクションの方法はコーエンＣｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）６９：２１１０（１９７２）によって記載されて いるようなカルシウムを用いるカルシウム処理、またはもっと最近ではエレクト ロポレーションである。 目的のコード配列および制御配列を有する適当なべクターの構築には標準的な 連結技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片は分解して、形状を整 え、および必要とするプラスミドを形成するための目的の形態に再連結する。 分解は、適当な緩衝液において制限酵素（または複数の酵素）で処理すること によって行われる。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片は約２０μ ｌの緩衝液中で約１ユニットの酵素を用いて処理され、特定の制限酵素に対する 基質量は、生産者によって明記されている。３７°Ｃで約１時間というインキュ ベーション時間が効果的である。インキュベーション後に、タンパク質はフェノ ールおよびクロロホルムでの抽出によって除去され、核酸がエタノールでの沈殿 によって水相から回収される。 もし平滑末端が必要であるなら、その調製物は１０ユニットのＤＮＡポリメラ ーゼＩ（クレノウ）のクレノウ断片で１５°Ｃで１５分処理し、フェノールーク ロロホルム抽出し、およびエタノールで沈殿してもよい。 分解した断片の大きさによる分離はゴーデルＧｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ，８：４０５７（１９８０）によって記載されている ６パーセントのポリアクリルアミドゲルを用いて行う。 連結するためには、正確な適合を与えるように適当な末端の形状に整えた大体 等モル量の目的の成分は、ＤＮＡ０．５μｇにつき約１０ユニットのＴ４ＤＮＡ リガーゼで処理する。（分解したベクターが成分として用いられるときには、細 菌にアルカリホスファターゼで前処理することによって、分解したべクターの連 結を防ぐことが有用かもしれない。） 構築されたプラスミド中の配列が正確であることを確証するための分析では、 連結した混合物は一般に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＡＴＣＣ ３１，４４６）ま たは他の適当なＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換するために用い、アンピシリンおよび テトラサイクリン耐性によって首尾よく選択された形質転換体が適している。形 質転換体由来のプラスミドは、制限マッピングおよび／またはメシングＭｅｓｓ ｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１）ま たはマキサムＭａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ６５ ：４９９ （１９８０）の方法によるＤＮＡ塩基配列決定によって調製およ び分析する。 ＤＮＡを哺乳類細胞に導入し、安定な形質転換体を得るための培地で選択した 後、ＤＨＦＲ活性の競合阻害剤であるＭＴＸが約２０，０００−５００，０００ ｎＭの濃度で存在する条件下で宿主細胞培養を生育することによって、ＤＨＦＲ タンパク質をコードする配列の増幅が行われる。当然のことながら、効果的な濃 度範囲はＤＨＦＲ遺伝子およびタンパク質の性質および宿主の特徴にかなり左右 される。明らかに、一般的に定義された上限および下限は明確にはできない。他 の葉酸の類似体またはＤＨＦＲを阻害する他の成分の適当な濃度も使用すること ができる。しかし、ＭＴＸ自体が簡便で、容易に入手でき、効果的である。 Ｃ．二特異的免疫アドヘジンの使用 本出願に開示されている調製および精製計画を利用することで、二特異的免疫 アドヘジンは治療的に応用するのに適当な程度にまで精製することができる。実 際の治療的な使用は、どの特定の二特異的免疫アドヘジンでも、その機能性に依 存するだろう。 （ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンの治療的な可能性はすでに議論 されており、およびさらなる詳細は本明細書中の以降で提供されるだろう。（Ｃ Ｄ４×抗ＣＤ１６）二特異的免疫アドヘジンは、同様の治療的用途を有すること が期待される。 ＴＮＦＲ−ＩｇＧ×抗エンドトキシン抗体（ＴＮＦＲ×抗エンドトキシン）免 疫アドヘジンは、例えば、エンドトキシンショックの予防または治療のために用 いることができる。 ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼまたはｔ−ＰＡのよう なプラスミノーゲンアクチベーターの活性部分を含有するタンパク質に結合した フィブリンに対して特異的な抗原結合部位を有する二特異的免疫アドヘジンは、 免疫治療剤として有用である。そのような分子は、そのフィブリン特異的結合部 位によって血栓の部位に局在化することができ、その血栓はその雑種分子のプラ スミノーゲン活性化因子部分の酵素活性によって溶解される（１９８８年５月１ ９日発行のＷＯ８８／０３５５９参照）。 （ＣＤ４×Ｌ−セレクチン）二特異的免疫アドヘジンは、Ｌ−セレクチンのリ ンパ節結合機能とＣＤ４のＨＩＶ結合機能を組み合わせている。この二特異的分 子は、リンパ節だけでなく、ぺイヤーズパッチのような２次的なリンパ性の器官 および脳の上皮組織に結合するので、ＨＩＶ関連の痴呆の治療のために血液−脳 関門を越えてＣＤ４−ＩｇＧを運ぶのに用いられるかもしれない。 二特異的免疫アドヘジンは、治療的な応用のために製薬的に許容できる担体と 組み合わせる。そのような担体は当業者によく知られており、例えば、Ｒｅｍｉ ｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版 ，１９８０，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ中に開示されてい る。いかなる目的の二特異的免疫アドヘジンにとっても治療的に有効な濃度を決 定することは、もっともなことに、普通の熟練者の技術の範囲内である。好まし い製薬的な製剤化の選択および治療的に有効な投与量の管理の決定は、治療剤と して、または単一特異的免疫アドヘジンの形態として用いられるときの２つの機 能性に役立つ情報によって容易になる。一般的原則として、二特異的免疫アドヘ ジンは、その結合ドメインが由来する個々のタンパク質よりも低い濃度で効果を 発揮することが期待される。 本発明の二特異的免疫アドヘジンは、例えば、必要な補助因子とともに滅菌し た等張の製剤中に保持してもよい。その製剤は液体であることが好ましく、凍結 乾燥した粉体でもよい。（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンは、例え ば、５．０ｍｇ／ｍｌクエン酸１水和物、２．７ｍｇ／ｍｌクエン酸３ナトリウ ム、４１ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌグリシンおよび１ｍｇ／ｍｌポ リソルベート２０を含有する製剤化緩衝液で希釈することができる。この溶液は 、凍結乾燥し、冷凍下で保存し、および滅菌した注射用水（ＵＳＰ）で投与前に 再構築することができる。 二特異的免疫アドヘジンはまた、マイクロスフェア、リポソーム、他の微小粒 子伝達系または血液を包含するある種の組織に保持される持続性放出製剤を介し て投与してもよい。持続性放出担体の適当な例は、サポジトリーまたはマイクロ カプセルのような形成物の形態の半透性のポリマー支持体を含有する。体内に植 え付け可能なまたはマイクロカプセルの持続性放出支持体は、ポリラクチド（米 国特許番号３，７７３，９１９；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸および ガンマエチル−Ｌ−グルタミンのコポリマー［シドマンＳｉｄｍａｎら，Ｂｉｐ ｏｌｙｍｅｒｓ ２２（１），５４７−５５６（１９８５）］、ポリ（２−ヒド ロキシエチルーメタクリル酸）またはエチレンビニル酢酸［ランガーＬａｎｇｅ ｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５，１６７−２７７（１９８ １）；ランガーＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２，９８−１０５（１９ ８２）］を含有する。 二特異的免疫アドヘジンを含有するリポソームはよく知られた方法によって調 製することができる：ＤＥ３，２１８，１２１；イプステインＥｐｓｔｅｉｎら ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，３６８８−３６９２ （１９８５）；ワンＨｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ７７，４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２３２２；ＥＰ３６６７ ６；ＥＰ８８０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，５４１；米国特許番号 ４，４８５，０４５および４，５４４，５４５。リポソームは本来、油脂含量が 約３０ｍｏｌより大きい、小さい（約２００−８００オングストローム）単層型 をしている。選択される比率である％コレステロールはポリペプチドが漏出する 最適な比に調整される。 本発明の二特異的免疫アドヘジンを毒素やさまざまな治療薬を含有するリポソ ームを結合することは有利であるかもしれない。例えば、（ＣＤ４×抗ＣＤ３） 二特異的免疫アドヘジンは、ＨＩＶ感染を阻害することができる毒素や薬剤を含 有するリポソームと共有結合で結合することができる［マツクラＭａｔｓｕｋｕ ｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，４２４４−４ ２４８（１９８９）］。二特異的免疫アドヘジンは、そのＣＤ４の腕を介してＣ Ｄ４レセプターをもつＨＩＶの相互作用を阻害し、ＨＩＶ感染細胞に対する毒素 や抗ＨＩＶ剤を標的に向けさせる一方で、その抗ＣＤ３の腕は細胞障害性Ｔリン パ球を活性化し、それによってＨＩＶ感染と戦うための細胞性免疫応答を補充す る際の手段となる。二特異的免疫アドヘジンのリポソームへの結合は、毒素や化 学療法剤を標的化した伝達を行うための抗体とカップリングする際の領域特異性 のために広く用いられているへテロ２面機能性クロスリンク剤のような、いかな る既知のクロスリンク剤によっても実行されている。ＣＤ４の結合はその遊離の アミノ基よりもその炭水化物部分を介することが好ましい、というのも、そのよ うな結合はそのｇｐ１２０結合親和性を損なわずにＣＤ４と他の化合物との結合 を可能にすることが示されているからである（アミノ基指向性の試薬で起こる効 果）。可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）は、新規の炭水化物指向性のクロスリンク剤： ４−（４−マレイミドフェニル）ブタン酸ヒドラジン（ＭＰＢＨ）を用いて、そ の炭水化物部分を介してリポソームと首尾よく結合した［ダズグーンス，Ｎ．Ｄ ｕｚｇｕｎｅｓ，Ｎ．，フラッシャー，Ｄ．Ｆｌａｓｙｅｒ，Ｄ．，シャモー， Ｓ．Ｃｈａｍｏｗ，Ｓ．，アシュケナジ，Ａ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．，ダジ ン，Ｐ．Ｄａｚｉｎ，Ｐ．，およびコノプカ，Ｋ．Ｋｏｎｏｐｋａ，Ｋ．Ｊ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ ７７（１９９２）； シャモウＣｈａｍｏｗら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．］。他の二特異的免疫アド ヘジンをリポソームに結合するために同様の戦略を用いることができる。 二特異的免疫アドヘジンはまた、二特異的分子の１つの腕が標的をねらう腕で あり、もう１つの腕が（レポーター分子によって直接に検出される）情報を伝え る腕である場合には診断の手段として用いることができる。例えば、ＣＤ４分子 は（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンの標的をＨＩＶ感染細胞に向か わせることができるが、一方で、抗ＣＤ３部分は検出のために用いることができ る。同様に、プラスミノーゲンアクチベーターおよびフィブリン結合機能を組み 合わせた二特異的免疫アドヘジンは、放射核で二特異的分子を検出できるように ラベルすることによって、インビボでの免疫診断を含む免疫診断的応用に用いて もよい。 Ｄ．好ましい具体例 好ましい具体例において、２つの免疫グロブリン重鎖（例えば、免疫グロブリ ン重鎖定常ドメイン配列または目的の抗原結合部位を含有する天然またはキメラ の抗体の重鎖の配列とレセプターまたはリガンド結合ドメインとの異種の融合物 であろうと）および免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、別々のベク ターに挿入し、適当な宿主生物にコトランスフェクションする。構築物で用いら れている３つのポリペプチド鎖の割合を不平等にすると最適な収量が得られると きには、この方法は、具体例において３つのポリペプチド断片の相互の割合を調 整する場合における大きな柔軟性を提供している。しかし、等しい割合の少なく とも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらしたり、またはその割合が特 に意味をなさないときには、２つまたは３つのポリペプチド鎖すべてをコードす る配列を１つの発現ベクターに挿入することができる。 好ましい具体例において、本発明の二特異的免疫アドヘジンは、標的細胞の表 面の抗原に、および好ましくはＨＩＶなどのレトロウイルスの好ましくは必須ウ イルスタンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含有する。結合部位は、好 ましくは、ｇｐ１２０／ｇｐ４１複合体を含めた、ＨＩＶの主要なエンベロープ の糖タンパク質のｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１の内部である。 ＨＩＶ結合ドメインは、好ましくは、ＣＤ４アミノ酸配列である。天然のＣＤ ４分子のアミノ酸配列は既知である［マダンＭａｄｄｏｎら，Ｃｅｌｌ ４２， ９３（１９８５）；１９８８年２月２５日発行のＷＯ８８／０１３０４］。いく つかの研究方法が、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０が結合するＣＤ４のアミノ酸配 列のＶ１領域のアミノ酸を定義するために用いられてきた。この研究方法は、エ スケープ変異体の選択と共役したランダム飽和突然変異誘発［ペターソンおよび シードＰｅｔｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｅｅｄ，Ｃｅｌｌ ５４，６５（１９８８） および１９８９年１１月１５日公開のＥＰ３４１，４４４］、およひホモログ− スキャンニング突然変異誘発（ｇｐ１２０に結合するヒトＣＤ４由来配列をｇｐ １２０に結合しないマウスＣＤ４由来の非保存配列に置換）［ランド−Ｌａｎｄ ａｕら，Ｎａｔｕｒｅ ３３４，１５９（１９８８）；クレイトンＣｌａｙｔｏ ｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５，３６３（１９８８）；および１９８９年４月２０ か発行のＷＯ８９／０３２２］の技術を含有する。 膜貫通および細胞質領域はＣＤ４のｇｐ１２０への結合には必要なく、これら のドメインは可溶性ＣＤ４分子を提供するために欠失させてもよい。通常は、少 なくとも残基３６８から３９５（膜貫通ドメイン）、および時には残基３９６か ら４３３（細胞質ドメイン）を欠失させる。 ＣＤ４の挿入変異体はミズカミＭｉｚｕｋａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，９２７３（１９８８）によって発表された。ク レイトンＣｌａｙｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５，３６３（１９８８）は、ネ ズミＣＤ４分子の領域に相当する個々のおよび複数置換をもつＣＤ４変異体を発 表している。ＣＤ４の合成ぺプチド断片はリフソンＬｉｆｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２４１，７１２（１９８８）によって発表された。ペターソンおよびシー ドＰｅｔｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｅｅｄ，前掲は、ランダム突然変異誘発によって 、天然のＣＤ４の数種の置換および欠失変異体を作成した。さらなるＣＤ４アミ ノ酸配列変異体および共有結合性の誘導体は、例えは、１９８９年４月６日発行 のＷＯ８９／０２９２２に発表されている。明確に言えば、１つのアミノ酸は、 天然のＣＤ４アミノ酸配列の７、１５、１７、２１、２２、２３、２８、２９、 ３０、３２、３５、３６、３７、３９、４０、４４、４５、４６、４９、５１、 ５２、５３、５４、５７、５８、５９、６２、６３、６４、７５、７７、７８、 ７９、８０、８１、８２、８５、８７、８９、９１または９４番目の位置に相当 する位置のＣＤ４のアミノ酸に隣接して挿入、そこから欠失、またはそのかわり に置換することができる［アシュケナジＡｓｈｋｅｎａｚｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８７，１０５３５−１０５３９（１９９０） もまた参照］。 ＩｇＧまたはＩｇＭサブタイプの免疫グロブリン配列とＣＤ４の融合物を含有 する免疫アドヘジンは当業者に既知であり［ビルン，Ｒ．Ａ．Ｂｙｒｎ，Ｒ．Ａ ．ら，１９９０，前掲；カポン，Ｄ．Ｊ．Ｃａｐｏｎ，Ｄ．Ｊ.，１９８９，前 掲 ：トラウネッカー，Ａ．Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３９ ，６８−７０（１９８９）］、１９８９年４月６日発行のＷＯ８９／０２９２２ ；およびＥＰ３１４，３１７，前掲に発表されている。 その抗原認識および結合部位（Ｆｖ−ＣＤ３）を含有するマウス抗ヒトＣＤ３ 抗体を生産する細胞系列は当業者に既知であり、例えばバーグＢｅｒｇら，前掲 ；トラウネッカーＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，前掲およびハストンＨｕｓｔｏｎら ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，５８９７−５８９９ （１９８８）に発表されている。生合成抗体の抗原結合部位を作成する方法は、 例えば、１９９２年２月２５日出版の米国特許番号５，０９１，５１３に開示さ れている。 本発明の（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンは、ＷＯ８９／０２９ ２２（ＣＤ４−Ｉｇ免疫アドヘジンを開示）および１９９１年６月１３日発行の ＷＯ９１／０８２９８（免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーで はない接着を含有する免疫アドヘジンを開示）に開示されている一般的手順にし たがって作成することができる。 好ましい具体例において、本明細書中のＣＤ４−抗ＣＤ３二特異的免疫アドヘ ジンは、ヒトＣＤ４−ＩｇＧ（好ましくはＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３）、擬人 化マウス抗ＣＤ３γ１またはγ３の重鎖、および擬人化マウス抗ＣＤ３カッパγ １またはγ３の重鎖をそれぞれコードするプラスミドを哺乳類細胞にトランスフ ェクションすることによって構築する。この方法でトランスフェクションされた 細胞は、３つのオリゴマーの組み合わせのポリペプチド：（ｉ）ＣＤ３に対する ２つの結合部位を含有する２つのＩｇＧ重鎖および２つのＩｇＧ軽鎖のヘテロ４ 量体；（ii）ｇｐ１２０に対する２つの結合部位を含有する２つのＣＤ４−Ｉｇ Ｇ融合タンパク質のホモ２量体；および（iii）ＣＤ３に対する１つの結合部位 とｇｐ１２０に対する１つの結合部位を含有する１つのＩｇＧ軽鎖、１つのＩｇ Ｇ重鎖、および１つのＣＤ４−ＩｇＧのヘテロ３量体（二特異的免疫アドヘジン ）を生産し、集合する。 さまざまな割合のＣＤ４−ＩｇＧＮ擬人化マウス抗ＣＤ３γ１の重鎖、および 擬人化マウス抗ＣＤ３カッパ重鎖をそれそれコードするＤＮＡを含むベクターを 、標的の二特異的免疫アドヘジンの収量を増加するために試した。これらの３つ のベクターは、６０：２０：２０のパーセント比でトランスフェクションする細 胞に導入するなら、細胞によって分泌される二特異的免疫アドヘジンの量は、比 が ３３：３３：３３パーセントであったときに分泌された量より約２倍大きく、１ ０：４５：４５の比を用いたときに分泌された量より約２０倍大きいということ が見いだされた。したがって、ＣＤ４−免疫グロブリンキメラをコードするＤＮ Ａ配列を１つのベクターに、および抗ＣＤ３抗体重鎖および軽鎖をコードするＤ ＮＡ配列を他のベクターに挿入し、および目的の６０：２０：２０のパーセント 比で３つの鎖を生産するために２つのベクターの相互の比を変化することによっ て、等しくよい結果が期待される。この比は現在考えられるものとしては最良に 方法を表しているが、追加的に比を試験することによってさらなる改良が達成さ れるかもしれない。ＣＤ４−ＩｇＧ／抗ＣＤ３軽鎖／抗ＣＤ３重鎖の７０：２０ ：１０と６０：２０：２０の間、および６０：３０：１０と６０：２０：２０の 間のパーセント比は、目的の３量体二特異的免疫アドヘジンの最高の収量をもた らすことが期待される。 前出の３つの産物［産物（ｉ）−（iii）］は、好ましくは、そのＦｃ部分の 基づいたアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養の上清から単離す る。その単離は、好ましくは、Ｆｃをもつタンパク質を結合するプロテインＡセ ファロースクロマトグラフィーカラムで行う。溶出後に、ＣＤ４部分を含有する タンパク質が、固定化抗ＣＤ４モノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティー クロマトグラフィーによって抗ＣＤ３へテロ４量体から分離するかもしれない。 二特異的（ＣＤ４×抗ＣＤ３）分子は、ＣＤ４を含有する溶出液（二特異的３量 体行うＣＤ４−ＩｇＧ２量体からなる）から、固定化抗ヒトカッパＩｇＧポリク ローナル抗体を用いて、その軽鎖部分に基づいたアフィニティークロマトグラフ ィーによって取り出すことができる。もし望むのであれば、分離／単離のいかな る段階も繰り返してもよい。単離した二特異的免疫アドヘジンは、さらに、イオ ン交換クロマトグラフィーのような既知の技術によって精製してもよい。 ＣＤ４部分に基づいた、および免疫グロブリン軽鎖に基づいた分離段階は、最 初にＣＤ４−ＩｇＧホモ２量体から２つの免疫グロブリン軽鎖をもつ産物を分離 し、次にそのＣＤ４部分に基づいて抗ＣＤ３−Ｉｇホモ４量体（２つの重鎖−軽 鎖ぺアーから構成される）から（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンを 単離するというように順序を逆にして行ってもよい。 精製（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンは、薬理学的に許容可能な 賦形剤を用いる習慣的な製薬的な製剤へと製剤化される［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１６版．１９８０，Ｍ ａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ参照］。好ましい製剤化は、溶液 性の希釈液、好ましくは滅菌水でいかなる目的の保存用濃度にも希釈されるよう な凍結乾燥した粉末である。静脈内投与に適した希釈は、投与直前に、習慣的な 製剤化緩衝液および／または安定化剤を用いて行ってもよい。 本発明の（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンは、ＨＩＶ非感染細胞 ではなくＨＩＶ感染細胞に対するＣＴＬ応答を活性化することができる投与量で 、ＨＩＶ感染の危険が高い、またはＨＩＶ感染を有する患者に投与される。これ らの二特異的免疫アドヘジンは、ＨＩＶにさらされている、もしくはさらされる 危険がある非感染の個人における、またはＨＩＶ感染がまだ比較的少量の細胞に 限られている最近になって感染した個人におけるＨＩＶ感染の確立を予防するの に特に適している。ＩｇＧ重鎖で構築される二特異的（ＣＤ４×抗ＣＤ３）免疫 アドヘジンはＩｇＧ免疫グロブリンおよびＣＤ４−ＩｇＧ免疫アドヘジンと同様 にヒトの胎盤を通過することが期待されているので、ＨＩＶ感染の母体／胎児伝 播の予防に特に適している。この示唆のために、二特異的免疫アドヘジンは、好 ましくは陣痛の開始時に、さらに好ましくは陣痛の約１から２週間前および陣痛 の開始時にＨＩＶ血清陽性の婦人に投与する。または、（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二 特異的免疫アドヘジンはまた出生後の幼児に投与することもできる。好ましい投 与経路は注射または静脈内注入であり、本来の投与量は約ｌｍｇ／ｋｇから約６ ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラスである。この投与は出産前の母体におけるＨＩＶの 負担およびこれによって伝播の危険を減少することが期待される。さらに、胎児 への二特異的免疫アドヘジンの輸送、または幼児への出生後投与は、新生児に対 してＣＴＬを仲介する防御をもたらすことができる。 ＣＤ４−ＩｇＸＬ−セレクチン−Ｉｇ（ＣＤ４−Ｌ−セレクチン）二特異的免 疫アドヘジンは、ＨＩＶ感染の予防および処置に関して異なる戦略を示している 。 セレクチンは、構造的にはレクチン、ＥＧＦ様および補体結合様ドメインの包含 によって、機能的にはそのレクチンドメインと細胞表面の炭水化物リガンドの間 の相互作用によって細胞の結合を仲介する能力によって統一されている。これま でに、細胞接着分子のセレクチンファミリーにおいて、Ｌ−セレクチン（末梢リ ンパ節ホーミングレセプター（ｐｎＨＲ）、ＬＥＣ−ＣＡＭ−１、ＬＡＭ−１、 ｇｐ９０^MEL、ｇｐ１００^MEL、ｇｐ１１０^MEL、ＭＥＬ抗原、Ｌｅｕ−８抗原、 ＴＱ−１抗原、ＤＲＥＧ抗原としても知られている）；Ｅ−セレクチン（ＬＥＣ −ＣＡＭ−２、ＬＥＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１）およひＰ−セレクチン（ＬＥＣ −ＣＡＭ−３、ＬＥＣＡＭ−３、ＧＰＭ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ）の３種類のメ ンバーが確定されている。Ｌ−セレクチン（１９９２年３月２４日発行の米国特 許番号５，０９８，８３３参照）は白血球上に見いだされており、末梢リンパ組 織へのリンパ球の輸送［ギャラチンＧａｌｌａｔｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３０３ ，３０−３４（１９８３）］、および好中球が仲介する急性炎症応答［ワトソン Ｗａｔｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３４９，１６４−１６７（１９９１）］に関与し ている。（ＣＤ４−Ｌ−セレクチン）二特異的免疫アドヘジンはＨＩＶを結合す るＣＤ４の能力とＬ−セレクチンのリンパ節ホーミング能力を組み合わせている 。ＣＤ４分子の標的をリンパ節に向かわせることによって、これらの二特異的分 子はＨＩＶ感染がもっとも広範に広がっている部位でＣＤ４の局所濃度を高める ことができる。 （ＣＤ４−Ｌ−セレクチン）二特異的免疫アドヘジン分子のＬ−セレクチン部 分は、米国特許番号５，０９８，８３３，前掲に開示されているような天然の配 列のＬ−セレクチンまたは天然のＬ−セレクチンの定性的なリンパ節結合機能を 保持しているいかなるフラグメントもしくはその誘導体でもよい。そのような誘 導体は引用した米国特許に開示されており、および好ましくは、Ｌ−セレクチン のレクチンドメインと厳密な条件下でハイブリダイゼーションすることができる ＤＮＡ配列にコードされている。免疫グロブリンの定常ドメイン配列とＬ−セレ クチン配列との融合を含有する免疫アドヘジンは、１９９２年５月２６日発行の 米国特許番号５，１１６，９６４に開示されている。これらにおいては、リンパ 組織の上皮に対する結合部位を含有するＬ−セレクチン（ＬＨＲと呼ばれる）の Ｎ−末端部分は、免疫グロブリンのＣ−末端のＦｃ部分に融合する。特定の具体 例において、ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖定常域全体はＬ−セレクチンの一部に 融合する。他の具体例において、ＩｇＧのＦｃを化学的に定義するパパイン分解 部位（重鎖定常域の最初の残基を１１４番目と考えると、２１６番目の残基（カ バトＫａｂａｔら，前掲））、または他の免疫グロブリンの類似部位のすぐ上流 のヒンジ領域から始まる配列はＬＨＲの一部に融合する。Ｌ−セレクチンのレク チン、レクチン−ＥＧＦ、およびレクチン−ＥＧＦ−補体制御モチーフを含有す る特定のネズミのＬ−セレクチン（ＭＬＨＲ）−ＩｇＧキメラは実施例４に開示 されており、および米国特許番号５，１１６，９６４，前掲の図８に示されてい る。本特許はまた、ＣＨ１ドメインおよび最初のシステイン残基までのヒンジ領 域の一部が分子の各腕において除去されたヘテロ２量体ＣＤ４−ＩｇＧ−ＭＨＬ Ｒ−ＩｇＧキメラの構築も開示している。ヒト２９３細胞における発現は、結果 として３つの分子：ＣＤ４−ＩｇＧホモ２量体、ＬＨＲ−ＩｇＧホモ２量体、お よびＣＤ４−ＩｇＧ−ＬＨＲ−ＩｇＧヘテロ２量体をもたらした。 本発明にしたがって、（ＣＤ４×Ｌ−セレクチン）二特異的免疫アドヘジンは 、本明細書中上記に記載したようにヘテロ３量体構造を取るようにデザインする 。そのようなヘテロ３量体は、片方の腕のＣＤ４−免疫グロブリン重鎖定常ドメ イン融合タンパク質、およびもう片方の腕の免疫グロブリン軽鎖と結合したＬ− セレクチン−免疫グロブリン重鎖から構成される。このような非対称的な二特異 的分子は（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンに関して記載されたよう に調製および本質的に精製することができる。 本二特異的免疫アドヘジン治療はまた、ＨＩＶ感染および関係する条件の予防 および処置にとって、および特にＨＩＶ感染の発達の進行を遅くするのに有用な 他の治療と組み合わせることも可能である。組み合わせ治療は、例えば、リポソ ーム薬物伝達系を用いることによって行われるかもしれない。本明細書中上記に 記載したように、二特異的免疫アドヘジンは、いかなる毒素または薬物をも含有 するリポソームと共有結合で結合することができる。抗ＨＩＶ活性をもつ薬物を 含有するリポソームと抗ＨＩＶ治療に用いるためにデザインした二特異的免疫ア ドヘジンとの結合は、組み合わせ治療の新たな手段を提供している。ＣＤ４に関 しては、リポソームとその炭水化物部分を介した結合はＨＩＶに結合する能力を 阻害しないということがすでに示されている（ダズグーンス，Ｎ．Ｄｕｚｇｕｎ ｅｓ，Ｎ．ら，前掲を参照）。 本発明のさらなる詳細は、次の非制限的な実施例から明らかであろう。実施例１ プラスミドの構築 ＣＤ４−ＩｇＧキメラは、ビルンＢｙｒｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，６６７ （１９９０）に記載されているように構築した。簡潔には、本構築物は、重鎖− 軽鎖結合に関与するシステイン残基の後ろのＩｇＧ−１ヒンジの最初の残基であ るアスパラギン酸２１６（アミノ酸１１４を重鎖定常域の最初の残基と考える［ カバトＫａｂａｔら，前掲］）から始まり、残基４４１で終わるヒトＩｇＧ−１ 配列と融合した成熟ヒトＣＤ４タンパク質の残基１−１８０からなる。この分子 はヒトＩｇＧ−１のヒンジおよびＦｃ（ＣＨ１およびＣＨ２）ドメインに結合し たＣＤ４Ｖ１およびＶ２ドメインを含有し、ＣＤ４₂Ｆｃ１と名付けられている 。 擬人化抗ＣＤ３重鎖およびヒトに適応する抗ＣＤ３軽鎖の構築は、シャラビー Ｓｈａｌａｂｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５，２１７（１９９２）に記載さ れている。３つの構築物をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、哺乳類の発現ベ クターであるｐＲＫ５に挿入した（１９８９年３月１５日公開のＥＰ３０７，２ ４７）。トランスフェクション ＣＤ４−ＩｇＧ−１（ＣＤ４₂Ｆｃ１）、抗ＣＤ３重鎖および抗ＣＤ３軽鎖発 現ベクターは、リン酸カルシウム法の変法を用いる一過性のトランスフェクショ ンによってヒト胎児腎臓２９３Ｓ細胞に導入した［ゴーマン，ＣＧｏｒｍａｎ， Ｃ．ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｏｌ．III（グローバー，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅ ｒ， Ｄ．Ｍ．），ｐｐ．１４３−１９０，ＩＲＬ，オックスフォード，１９８５中］ 。トランスフェクションしたプラスミドＤＮＡの全量は２０μｇであり、それぞ れのプラスミドの量は３種類の可能なタンパク質産物の相対量にＤＮＡの相対量 が与える効果を評価するために変化した。 ＣＤ４−ＩｇＧおよび抗ＣＤ３重鎖および抗ＣＤ３軽鎖構築物をコードする３ 種類のプラスミドはさまざまな組み合わせ（ＤＮＡの全量は２０μｇ）でトラン スフェクションし、および代謝的にラベルし、トランスフェクションした細胞か ら得た血清の入っていない上清に存在する免疫グロブリンＦｃ部分を含有するタ ンパク質の量は、プロテインＡ（パンソブリン）を用いた放射免疫沈殿によって 評価した（図２）。 ３種類のプラスミドすべてが存在しない条件下では、Ｆｃを含有するタンパク 質は検出できなかった（最も右のレーン）。両方の抗ＣＤ３プラスミドの存在下 およびＣＤ４−ＩｇＧプラスミドの非存在下では、抗ＣＤ３ヘテロ４量体の抗体 を表す、ほとんどゲル中に移動していない１つの主要なバンドだけが観察された （右から２番目のレーン）。同様に、ＣＤ４−ＩｇＧプラスミドだけを添加する と、結果として、ＣＤ４−ＩｇＧ免疫アドヘジンを表す１本のバンドが見られた （最も左のレーン）。２種類の抗ＣＤ３プラスミド（それそれ４５％）とともに ＣＤ４−ＩｇＧプラスミド（１０％）を添加すると、結果として、目的の二特異 的免疫アドヘジンに相当する新しいバンドが見られた。ＣＤ４−ＩｇＧプラスミ ドの量を増加するほど、このタンパク質の量は増加した；この特定の実験で観察 した最高量は、ＣＤ４−ＩｇＧおよび２種類の抗ＣＤ３プラスミドが６０：２０ ：２０％比のときに生産された。これらの結果は、目的の産物の量はトランスフ ェクションするＤＮＡの量を変化することによって改めることができるというこ とを示している。目的の（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジン３量体は ６０：２０：２０％比で高濃度で生産されたが、トランスフェクションに用いる プラスミド比を変えることによって、さらなる改良が可能であるかもしれない。実施例２ （ＣＤ４×抗ＣＤ３） 二特異的抗体の回収および精製 ６０：２０：２０％のプラスミド比で得た産物の混合物は、次のように処置し た。Ｆｃ部分に基づいたアフィニティクロマトグラフィー 収穫した細胞培養上清（３．５Ｌ）は、１０ｍＭ トリス ｐＨ７．４、１５ ０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したプロテインＡセファロース（１０ｍＬ）にロード した。結合していない物質を除去するために同一の緩衝液で洗浄した後、結合し たＦｃをもつタンパク質（１７．５ｍｇ）を５０ｍＭ クエン酸 ｐＨ３．０、 ２０％（ｗ／ｖ）グリセリンで溶出した。このプールは３Ｍ トリス ｐＨ９． ０を添加することによって中性化した。ＣＤ４部分に基づいたアフィニティクロマトグラフィー ＣＤ４−ＩｇＧ×抗ＣＤ３重鎖−軽鎖のペアーのヘテロ３量体（目的の二特異 的免疫アドヘジン）および２つのＣＤ４−ＩｇＧ重鎖のホモ２量体からなる混合 物から抗ＣＤ３ヘテロ４量体を最初に除去するために、プロテインＡから溶出し たプールを抗ＣＤ４免疫アフィニティカラムにロードした。我々は既に、緩和な 条件下で効率的にＣＤ４−ＩｇＧに結合して溶出するモノクローナル抗体（ｍＡ ｂ７５４）を同定していた。Ｌｅｕ３Ａ（ベクトン ディッキンソン）のような 、他のＣＤ４−ＩｇＧ抗体が市販されており、この精製段階には等しく適してい る。ｍＡｂ７５４（５ｍｇ）は、制御された細孔ガラス（１ｍＬ）に固定化し、 ２０ｍＭ トリス ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍ テトラメチ ルアンモニウム（ＴＭＡＣ）で平衡化し、プロテインＡプール（１ｍｇ）をロー ドした。結合したタンパク質は、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．４、３．５Ｍ Ｍ ｇＣｌ₂で溶出した。ｍＡｂ７５４カラムは３量体の（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特 異的タンパク質４．８ｍｇの全量を得るために１１回サイクルした。カッパ軽鎖に基づいたアフィニティクロマトグラフィー ＣＤ４−ＩｇＧホモ２量体を含まない（ＣＤ４×抗ＣＤ３）ヘテロ３量体を回 収するために、ｍＡｂ７５４プールはヒトカッパ鎖に特異的な第二の免疫アフィ ニティカラムにロードした。ポリクローナル抗ヒトカッパＩｇＧ（３ｍｇ，シグ マ Ｋ−３５０２）は、制御された細孔ガラス（１ｍＬ）に固定化し、平衡化し 、ロード（０．５ｍｌ）し、およびｍＡｂ７５４に関して上に記載したように洗 浄した。この場合には、結合した精製二特異的免疫アドヘジンは、５０ｍＭ ク エン酸 ｐＨ３．０、２０％（ｗ／ｖ）グリセリンで溶出し、前出のように中性 化した。カラムは（ＣＤ４×抗ＣＤ３）ヘテロ３量体０．８３ｍｇの全量を得る ために６回サイクルした。結果 トランスフェクションに用いた３種類のプラスミドの比を変化することによっ て反応の平衡は目的の二特異的産物に有利なように移動し、その分離および回収 を容易にした。ＣＤ４−ＩｇＧ融合物、抗ＣＤ３抗体重鎖および抗ＣＤ３抗体軽 鎖をそれぞれコードするプラスミドのパーセント比が６０：２０：２０であった とき、大体の（ＣＤ４×抗ＣＤ３）ヘテロ３量体／ＣＤ４−ＩｇＧホモ２量体／ 抗ＣＤ３ヘテロ４量体の比は４０：４０：２０％（染色強度によって評価）であ り、（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンを約１４−２０％の収量で単 離した。考えるられるかぎりでは、産物の比および収量は付加的なプラスミド比 を試験することによって、およびＣＤ４に基づいたおよび免疫グロブリン軽鎖に 基づいた精製段階を順序を逆にして行うことによって改良することができる。実施例３ 擬人化抗体、ＣＤ４−抗ＣＤ３−ＩｇＧの新たな標的であるエフェクター細胞に よるＨＩＶ感染細胞の溶解 材料および方法 細胞系列：慢性的に感染した（ＣＥＭ／IIIＢ）または感染していない（ＣＥ Ｍ）ヒトＴ細胞系列ＣＥＭ、ＨＩＶ−１IIIＢは、熱で不活性化した１０％の胎 児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０（ＪＲＨバイオサイエンス，レネキサ ，ＫＳ） （増殖培地，ＧＭ）で培養した。細胞の約９５％が抗ＨＩＶ血清で免疫蛍光アッ セイによってＨＩＶ−１ｇｐ１２０を発現する。ＣＥＭは、ＣＤ３抗原の発現が 最小であるかまたは全く発現していないＣＤ４⁺の細胞系列であり［クーレ，Ｒ ．Ｋｕｒｒｌｅ，Ｒ．Ｃｌｕｓｔｅｒ ｒｅｐｏｒｔ：ナップ Ｗ．Ｋｎａｐｐ Ｗ．（編）Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ IV（オックスフォード：オック スフォードユニバーシティプレス），２９０−２９３（１９８９）中のＣＤ３］ 、ＨＩＶ感染後に新たに検出されることもない［ボーデュス，Ｍ．Ｂｏｄｅｕｓ ，Ｍ．ら，ナップ Ｗ．Ｋｎａｐｐ Ｗ．（編）Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉ ｎｇ IV（オックスフォード：オックスフォードユニバーシティプレス）３８２ −３８３（１９８９）中のＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＥＭ Ｓｕｒｆ ａｃｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｄｕｒｉｎｇ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ］。 抗体：二特異的免疫アドヘジンは、実施例１に記載したように、ヒト抗ＣＤ３ 抗体をＣＤ４−ＩｇＧ免疫アドヘジンを共発現することによって調製した［ビル ン，Ｒ．Ａ．Ｂｙｒｎ，Ｒ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：６６７−６７０（ １９９０）］。ヒトモノクローナル抗体であるＦ１０５は、マーシャル ポスナ ー博士，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌから 頂戴した［ポスナー，Ｍ．Ｒ．Ｐｏｓｎｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１４６ ：４３２５−４３３２（１９９１）］。このＩｇＧ１抗体はｇｐ１２０ と反応し、ＣＤ４に対するｇｐ１２０の結合を阻害する。 エフェクター細胞：末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は標準的なフィコルーハイパー ク勾配遠心によって正常な供給者から単離し、上記のようなＧＭ中で維持した［ ユングハンス，Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｒ．Ｐ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ，３１：２０７−２１２（１９９０）］。イン ターロイキン２（ＩＬ−２）で刺激したＰＢＬは、Ｉ０００Ｕ／ｍｌの親和性に よって精製したヒト組み換えＩＬ−２（ホフマン−ラロチェ，インコーポレイテ ィッド．）の存在下で１４−１６時間培養した。ヒト細胞傷害性リンパ球（ＣＴ Ｌ）は、ヨハン ヤネリ博士（ＮＩＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）から頂戴し、標準的 な手順にしたがって調製および活性化した［ヤネリ，Ｊ．Ｒ．Ｙａｎｎｅｌｌｉ ，Ｊ． Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３９：１−１６（１９９１） ］。 エフェクター細胞の新たな標的（ＥＣＲ）：ＥＣＲは、上記のように［ユング ハンス，Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｒ．Ｐ．，前掲］次の変法を用いて行った 。２×１０⁶のＣＥＭおよびＣＥＭ／IIIＢ細胞は、０．５ｍＣｉ／２ｍｌ ＧＭ の⁵¹Ｃｒで３７°Ｃで一晩ラベルし、ＧＭで４回洗浄し、１×１０⁵細胞数／ｍ ｌに懸濁した。その細胞は指示された濃度の抗体で室温で１時間インキュベート した。前日に調製したエフェクター細胞は遠心し、ＧＭに１．５×１０⁶細胞数 ／ｍｌに再懸濁した。５０μｌの⁵¹Ｃｒでラベルした標的細胞（細胞数５０００ ）は、３０：１のエフェクター：標的の比で、１００μｌのエフェクター細胞（ 細胞数１５００００）と混和した。混合物はすべて９６穴Ｕ底プレートにおいて ３重または４重に試験した。プレートは３７°Ｃで３時間インキュベートした。 上清はタンポンミニーハーベスター（スカトロン，リアー，ノルウェー）で収穫 し、ウイルスを不活性化するために６５゜Ｃで２時間熱し、ベックマン５５００ ガンマカウンターで計数した。 データの取り扱いおよび統計：ＩＢＭ ＡＴ−コンパーティブルコンピュータ ーを用いて、クワトロ４．０スプレッドシートプログラム（ボーランド，スコッ ツ バレー，カリフォルニア）で分析を行った。特異的溶解のパーセントはフラ クション［（実験による放出−バックグラウンドの放出）／トライトンによる放 出−バックグラウンドの放出）］×１００として計算した。バックグラウンドは 、自発的放出（１０−２０％）および天然の傷害（０−２０％）なとの特異的抗 体の非存在下における放出として定義し、標準的な公式によって計算した［ユン グハンス，Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｒ．Ｐ．，前掲］。標準偏差は一般に投 入計数の０−３％であった。結果 二特異的免疫アドヘジンが仲介する細胞溶解の特異性：（ＣＤ４×抗ＣＤ３） 二特異的免疫アドヘジンが仲介するＨＩＶ−１感染および非感染細胞の傷害を測 定するために、予備実験を行った。ＨＩＶ−１IIIＢ感染および非感染ＣＥＭお よ び単球細胞系列Ｕ９３７を標的として用いた。結果として、ＨＩＶ−１感染ＣＥ Ｍ細胞は二特異的免疫アドヘジンおよび対照の抗ｇｐ１２０抗体（Ｆ１０５）で 非常に大きな程度まで溶解し、一方で、非感染細胞は溶解を示さないということ が示された（図４）。同じ結果がＵ９３７でも観察された。Ｕ９３７細胞系列は ＮＫ傷害しさらに感受性が高く、バックグラウンドがより高くなるので、それに 関してはさらに研究はしなかった（不掲載）。しかし、これらの抗体の傷害パタ ーンは異なるエフェクター細胞によって異なっていた。ＰＢＬはＦ１０５または 二特異的免疫アドヘジンの存在下で標的細胞を殺すが、一方で、ＣＴＬは二特異 的免疫アドヘジンの存在下では標的細胞を殺し、Ｆ１０５では殺さなかった。図 ４の二特異的免疫アドヘジンの結果と対照的に、ＰＢＬが仲介する標的細胞の溶 解は一般に、ＰＢＬがＩＬ−２で刺激されたときに高められた。 インビボの条件を模倣するために、我々は、高濃度および低濃度のヒト血清中 で（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンおよびＦ１０５が仲介する標的 細胞の溶解を試験した。Ｆ１０５が仲介するＰＢＬ（＋ＩＬ−２または−ＩＬ− ２）による溶解は８％および５０％の正常なヒト血清で完全に阻害されたが、そ れに対し、二特異的免疫アドヘジンが仲介する＋ＩＬ−２または−ＩＬ−２のＰ ＢＬおよびＣＴＬによる溶解はかすかに影響を受けただけであった。 二特異的免疫アドヘジンの投与量依存的な標的細胞の溶解およびその濃度曲線 。（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特異的免疫アドヘジンのもっとも効果的な濃度を試験 するために、我々は、ＰＢＬおよびＣＴＬによる標的細胞の溶解を仲介するため の異なる濃度の効果を測定した。図６に示したように、標的細胞の溶解は１μｇ ／ｍｌまでは二特異的免疫アドヘジンの濃度が高くなるにつれて増加し、それよ り高い濃度では減少するかまたはプラトーに達した。（ＣＤ４×抗ＣＤ３）二特 異的免疫アドヘジンの濃度は、ＰＢＬまたはＣＴＬを用いて、５０％ヒト血清の 存在下で同一の最適条件を示した（不掲載）。Ｆ１０５による標的細胞の傷害は また、＋ＩＬ−２または−ＩＬ−２のＰＢＬでは１μｇ／ｍｌの範囲でプラトー を示し、最終濃度１０μｇ／ｍｌでさえ５０％ヒト血清中では活性がなくなった （不掲載）。これらの１μｇ／ｍｌの濃度は、図４および５の研究においても両 方の 抗体について用いた。考察 前出の結果は、細胞傷害性Ｔ細胞は二特異的免疫アドヘジンによって活性化さ れ、新たな標的に向けさせられ、短期（３時間）のインキュベーションでさえも 劇的な溶解を誘導するという以前の報告を確証し、拡大するものである。 我々のデータは、二特異的免疫アドヘジンによるＣＴＬ補充を介した傷害を確 立した。しかし、標的細胞の傷害がＡＤＣＣエフェクターの補充を介して仲介さ れることもまた可能であった。これは、二特異的分子いの半分を包含する親のＣ Ｄ４−ＩｇＧ−１（ビルン，Ｒ．Ａ．Ｂｙｒｎ，Ｒ．Ａ．，前掲）で起こるよう に、二特異的免疫アドヘジンがそのＣＤ４−ＩｇＧの腕を介して標的細胞表面の ＨＩＶ抗原に結合し、および二特異的免疫アドヘジンのＦｃドメインを介してＡ ＤＣＣエフェクターのＦｃγレセプターに結合することによって引き起こすこと ができた。ＰＢＬでの全活性に対するＡＤＣＣの寄与は小さいように見えるが、 しかし、純粋なＣＴＬ調製物（ＡＤＣＣは引き起こさない）に匹敵する細胞傷害 に血清が及ぼす影響は比較的緩和であるので、この小さな減少は非特異的である かまたはＡＤＣＣ非依存性であるかもしれない。 抗体をヒトに馴化させ、双機能的構築物を調製する技術の同時使用は、治療に おける抗体の問題点を克服するためにデザインした一連の応答における斬新さを 表している。ここで示したような宿主のエフェクター機構の補充が高まり、免疫 原性の減少が期待でき、インビボでの生存が増加するので、治療での抗体のさら に期待のもてる役割が、感染性、免疫性および悪性疾患の処置において賞賛を得 ている。 前出の事項は特定の好ましい具体例に関するものであるが、本発明はそれほど 限定的ではないことが理解されるだろう。当業に通常に熟練した人にとっては、 本発明の包括的な概念からそれることなく、開示した具体例に対してさまざまな 修正を加えるということも起こるだろう。そのような修正はすべて本発明の範囲 内であると意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/08 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．二特異的免疫アドヘジンを作成する方法であって、 ａ）軽鎖結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列と融合している 第１の結合ドメインからなる第１の融合物、軽鎖結合部位を保持する免疫グロブ リン重鎖定常ドメインと融合している第２の結合ドメインからなる第２の融合物 、および免疫グロブリン軽鎖をそれぞれコードするＤＮＡ配列を宿主細胞に導入 し、 ｂ）該宿主細胞を培養することにより該ＤＮＡ配列を発現させ、（ｉ）第２の 融合物−免疫グロブリン軽鎖ぺアーと共有結合している上記の第１の融合物から なるヘテロ３量体、（ii）共有結合している２つの第２の融合物−免疫グロブリ ン軽鎖ぺアーからなるヘテロ４量体、および（iii）上記の第１の融合物の共有 結合している２つ分子からなるホモ２量体の混合物を生産し、 ｃ）得られた細胞培養から産物（ｉ）、（ii）および（iii）の混合物を取り 出し、そして ｄ）産物（ii）および（iii）から産物（ｉ）を単離すること、からなる方法 。 ２．産物（ｉ）を第１の結合ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖のそれぞれに 基づいた分離方法によって、実質的に均一な形態で単離する請求項１に記載の方 法。 ３．第１の結合ドメインに特異的な免疫アフィニティカラムでのクロマトグラ フィーによって産物（ii）から産物（ｉ）および（iii）を分離し、免疫グロブ リン軽鎖に特異的な免疫アフィニティカラムでのクロマトグラフィーによって産 物（iii）から産物（ｉ）を分離する請求項２に記載の方法。 ４．免疫グロブリン軽鎖に特異的な免疫アフィニティカラムでのクロマトグラ フィーによって産物（iii）から産物（ｉ）および（ii）を分離し、第１の結合 ドメインに特異的な免疫アフィニティカラムでのクロマトグラフィーによって産 物（ii）から産物（ｉ）を分離する請求項２に記載の方法。 ５．第１の融合物が第１の免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を欠い ている請求項１に記載の方法。 ６．第２の融合物が無傷のＣＨ１ドメインを保持している請求項５に記載の方 法。 ７．第１および第２の結合ドメインが２つの異なるリガンドおよびレセプター 結合ドメインである請求項６に記載の方法。 ８．第１および第２の結合ドメインがＣＤ４およびＬ−セレクチンから選ばれ る請求項７に記載の方法。 ９．第１の結合ドメインがリガンドおよびレセプター結合ドメインであり、第 ２の結合ドメインが抗体の抗原結合部位である請求項６に記載の方法。 １０．第１の結合ドメインがｇｐ１２０に結合できるＣＤ４アミノ酸の配列を 含有する請求項９に記載の方法。 １１．第２の結合ドメインが抗ＣＤ３抗体の抗原結合部位を含有する請求項１ ０に記載の方法。 １２．第１の融合物をコードするＤＮＡ配列をその発現が可能なベクターの形 で個々の宿主細胞に導入する請求項１１に記載の方法。 １３．第２の融合物および免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ配列をそれ らの発現が可能な同一ベクターの一部として宿主細胞に導入する請求項１２に記 載の方法。 １４．第２の融合物および免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ配列をそれ らの発現が可能な２つの異なるベクターの形で個々の宿主細胞に導入する請求項 １２に記載の方法。 １５．第１の融合物、第２の融合物および免疫グロブリン軽鎖をコードするＤ ＮＡ配列の重量比が１：１：１以外である請求項１４に記載の方法。 １６．第１の融合物、第２の融合物および免疫グロブリン軽鎖をコードするＤ ＮＡ配列の重量パーセント比を約７０：２０：１０から６０：２０：２０に調整 する請求項１５に記載の方法。 １７．パーセント比が６０：２０：２０である請求項１６に記載の方法。 １８．第１の結合ドメインに特異的な免疫アフィニティカラムが固定化抗ＣＤ ４モノクローナル抗体を含有する請求項１７に記載の方法。 １９．免疫グロブリン軽鎖に特異的な免疫アフィニティカラムが抗免疫グロブ リン軽鎖ポリクローナル抗体を含有する請求項１８に記載の方法。 ２０．標的細胞上の外来抗原を特異的に認識する片方の腕および、細胞傷害性 細胞上の活性化分子を特異的に認識するもう一方の腕を有する実質的に均一な二 特異的免疫アドヘジンを作成するために記載の方法であって、 ａ）軽鎖結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常ドメインと外来抗原結合ドメ インとの融合物、軽鎖結合部位を保持している、細胞傷害性細胞上の活性化部位 に対する抗体の重鎖、および該抗体の軽鎖をそれぞれコードするＤＮＡ配列を宿 主細胞に導入し、 ｂ）該宿主細胞を培養して該ＤＮＡ配列を発現させ、（ｉ）ジスルフィド結合 で結合している抗体重鎖−軽鎖ぺアーにジスルフィド結合で連結した外来抗原結 合ドメイン−免疫グロブリン重鎖融合物からなるヘテロ３量体二特異的免疫アド ヘジン、（ii）２つの抗体重鎖−軽鎖ぺアーからなるジスルフィド連結したヘテ ロ４量体；および（iii）２つのジスルフィド連結した外来抗原結合ドメイン− 免疫グロブリン重鎖定常ドメイン融合物からなるホモ２量体の混合物を生産し、 ｃ）細胞培養から産物（ｉ）、（ii）および（iii）の混合物を取り出し、 ｄ）産物（ii）および（iii）から二特異的免疫アドヘジン（ｉ）を分離する こと、からなる方法。 ２１．二特異的免疫アドヘジン分子の外来抗原結合部分および軽鎖部分に基づ いたアフィニティクロマトグラフィーの任意の順序によって、二特異的免疫アド ヘジン（ｉ）を産物（ii）および（iii）から分離し、それを実質的に均一な形 態で回収する請求項２０に記載の方法。 ２２．外来抗原がレトロウイルスの全ウイルスタンパク質である請求項２０に 記載の方法。 ２３．レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である請求項２２に 記載の方法。 ２４．外来抗原結合ドメインがＨＩＶの主要なエンベロープ糖タンパク質内の 部位に特異的に結合できる請求項２３に記載の方法。 ２５．外来抗原結合ドメインがＨＩＶの主要なエンベロープ糖タンパク質であ るｇｐ１６０、ｇｐ１２０またはｇｐ４１に特異的に結合できる請求項２４に記 載の方法。 ２６．外来抗原結合ドメインがＣＤ４アミノ酸配列である請求項２５に記載の 方法。 ２７．細胞傷害性細胞がＴ細胞リンパ球または大顆粒リンパ球である請求項２ ６に記載の方法。 ２８．活性化分子がＣＤ３またはＣＤ１６である請求項２７に記載の方法。 ２９．抗体が抗ＣＤ３抗体である請求項２８に記載の方法。 ３０．抗体が擬人化マウス抗ヒトＣＤ３抗体である請求項２９に記載の方法。 ３１．免疫グロブリンがＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４ま たはＩｇＭである請求項３０に記載の方法。 ３２．免疫グロブリン配列がＩｇＧ−１免疫グロブリン由来である請求項３１ に記載の方法。 ３３．宿主細胞が哺乳類細胞である請求項３２に記載の方法。 ３４．ＣＨ１ドメインを欠くＣＤ４−ＩｇＧ−１免疫アドヘジン、ＣＨ１ドメ インを保持している擬人化マウス抗ヒトＣＤ３抗体重鎖および擬人化マウス抗ヒ トＣＤ３抗体軽鎖をそれそれコードし、発現することができるプラスミドを哺乳 類細胞に同時トランスフェクションする請求項３３に記載の方法。 ３５．ＣＨ１ドメインを欠くＣＤ４−ＩｇＧ−１免疫アドヘジン、ＣＨ１ドメ インを保持している擬人化マウス抗ヒトＣＤ３抗体重鎖および擬人化マウス抗ヒ トＣＤ３抗体軽鎖それぞれをコードするＤＮＡ配列をもつ３つのプラスミドの比 が６０：２０：２０％である請求項３４に記載の方法。 ３６．第２の機能性をもつ免疫グロブリン重鎖−軽鎖ぺアーと共有結合した第 １の機能性をもつ免疫グロブリン重鎖からなる実質的に均一なヘテロ３量体二特 異的免疫アドヘジンを、第１の機能性をもつ共有結合した２つの免疫グロブリン 重鎖からなるホモ２量体および第２の機能性をもつ共有結合した２つの重鎖−軽 鎖ぺアーからなるヘテロ４量体の混合物から単離する方法であって、第１の機能 性および免疫グロブリン軽鎖のそれぞれに基づいた２段階クロマトグラフィーの 任意の順序によって、付随するヘテロ４量体およびホモ２量体からヘテロ３量体 二特異的免疫アドヘジンを分離することからなる方法。 ３７．クロマトグラフィーによる精製段階のうち少なくとも１つの段階を繰り 返す請求項３６に記載の方法。 ３８．第２の結合ドメインと、免疫グロブリン軽鎖と結合した免疫グロブリン 軽鎖結合部位を保持している免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列との融合物に 共有結合している、免疫グロブリン軽鎖結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常 ドメイン配列と融合した第１の結合ドメインからなる実質的に均一な二特異的免 疫アドヘジン。 ３９．細胞傷害性細胞の表面上の活性化分子に対する抗体の重鎖−軽鎖ぺアー に共有結合した、免疫グロブリン軽鎖結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常ド メイン配列に融合したレトロウイルスの全ウイルスタンパク質に対する結合ドメ インを含有する請求項３８に記載の二特異的免疫アドヘジン。 ４０．全ウイルスタンパク質がＨＩＶの主要なエンベロープ糖タンパク質のｇ ｐ１２０ドメインである請求項３９に記載の二特異的免疫アドヘジン。 ４１．ｇｐ１２０結合ドメインがＣＤ４アミノ酸配列である請求項４０に記載 の二特異的免疫アドヘジン。 ４２．ＣＤ４アミノ酸配列の最初の２つの可変ドメインがＩｇＧ免疫グロブリ ン由来のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３アミノ酸配列と融合している請求項４１に 記載の二特異的免疫アドヘジン。 ４３．免疫グロブリンがＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３である請求項４２に記載 の二特異的免疫アドヘジン。 ４４．抗体が抗ＣＤ３抗体である請求項４３に記載の二特異的免疫アドヘジン 。 ４５．基本的に図１に示している請求項４４に記載の二特異的免疫アドヘジン 。 ４６．標的細胞上のＨＩＶを特異的に認識する片方の腕、および細胞傷害性細 胞上の活性化分子を特異的に認識するもう片方の腕を有する３量体二特異的免疫 アドヘジンの有効量を投与することによって、ＨＩＶにさらされたヒトにおける ＨＩＶ感染を予防および処置する方法。 ４７．標的細胞上のＨＩＶを特異的に認識する片方の腕、および細胞傷害性細 胞上の活性化分子を特異的に認識するもう片方の腕を有する３量体二特異的Ｉｇ Ｇ免疫アドヘジンの有効量を、ＨＩＶ血清陽性の妊婦に投与することによって、 該妊婦から胎児へＨＩＶ感染が伝播するのを予防するために記載の方法。