PT2000545E - Composições e métodos para o diagnóstico e tratamento do tumor pulmonar - Google Patents

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Thomas D Wu
Victoria Smith
Zemin Zhang
Belinda Cairns
Ruihuan Chen
Gretchen Frantz
Hartmut Koeppen
Heidi S Phillips
Paul Polakis
Susan D Spenser
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Description

ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Composições e métodos para o diagnóstico e tratamento do tumor pulmonar"
CAMPO DO INVENTO A presente descrição refere-se a composições de matéria úteis para o diagnóstico e tratamento de um tumor em mamíferos e a métodos de utilização dessas composições de matéria para esse efeito.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Os tumores malignos (cancros) são a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos depois da doença cardíaca (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). O cancro é caracterizado pelo aumento do número de células anómalas, ou neoplásicas, derivadas de um tecido normal que proliferam para formar uma massa tumoral, pela invasão dos tecidos adjacentes por estas células tumorais neoplásicas e pela geração de células malignas que eventualmente se disseminam, através do sangue ou do sistema linfático, para os gânglios linfáticos regionais e para locais distantes através de um processo denominado metástase. Num estado canceroso, uma célula prolifera em condições em que as células normais não cresceriam. O cancro manifesta-se sob uma grande variedade de formas, caracterizadas por diferentes graus de carácter invasivo e de agressividade.
Nas tentativas efectuadas para encontrar alvos celulares eficazes para o diagnóstico e terapia do cancro, os investigadores têm procurado identificar polipéptidos transmembranares ou de outra forma associados à membrana que são especif icamente expressos na superfície de um ou mais tipo(s) particular(es) de célula cancerosa em comparação com uma ou mais célula(s) não cancerosa(s) normal(is). Muitas vezes, estes polipéptidos associados à membrana são expressos mais abundantemente na superfície das células cancerosas comparativamente à superfície das células não cancerosas. A identificação de tais polipéptidos antigénicos de superfície celular associados a tumores deu origem à possibilidade de 2 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ visar especificamente as células cancerosas para destruição através de terapias à base de anticorpos. A este respeito, salienta-se que a terapia à base de anticorpos se tem revelado muito eficaz no tratamento de determinados cancros. Por exemplo, o HERCEPTIN® e o RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia) são anticorpos que têm sido utilizados com êxito para tratar o cancro da mama e o linfoma não-Hodgkin, respectivamente. Mais especificamente, o HERCEPTIN® é um anticorpo monoclonal humanizado derivado via ADN recombinante que se liga selectivamente ao domínio extracelular do proto-oncogene do receptor 2 do factor de crescimento epidérmico humano (HER2). Observa-se uma sobreexpressão da proteína HER2 em 25-30% dos cancros da mama primários. O RITUXAN® é um anticorpo monoclonal quimérico murino/humano geneticamente manipulado dirigido contra o antigénio CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos. Ambos os anticorpos são produzidos de modo recombinante em células CHO.
Em outras tentativas para encontrar alvos celulares eficazes para o diagnóstico e terapia do cancro, os investigadores procuraram identificar (1) polipéptidos não associados à membrana que são especificamente produzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) cancerosa(s) em comparação com um ou mais tipo(s) particular (es) de célula(s) normal(is) não cancerosa (s), (2) polipéptidos que são produzidos por células cancerosas com um nível de expressão que é significativamente superior ao de uma ou mais célula(s) não cancerosa(s) normal(is) ou (3) polipéptidos cuja expressão está especificamente limitada a apenas um único (ou um número muito limitado de diferentes) tipo(s) de tecido(s) em ambos os estados canceroso e não canceroso (por exemplo, tecido normal da próstata e tecido tumoral da próstata). Estes polipéptidos poderão permanecer localizados intracelularmente ou poderão ser segregados pela célula cancerosa. Além disso, estes polipéptidos poderão ser expressos não pela própria célula cancerosa, mas antes por células que produzem e/ou segregam polipéptidos que possuem um efeito potenciador ou de reforço do crescimento nas células cancerosas. Tais polipéptidos segregados são muitas vezes proteínas que conferem às células cancerosas uma vantagem de crescimento sobre as células normais e incluem 3 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ espécies como, por exemplo, factores angiogénicos, factores de adesão celular, factores de crescimento e espécies similares. Seria de esperar que a identificação de antagonistas destes polipéptidos não associados à membrana proporcionasse agentes terapêuticos eficazes para o tratamento de tais cancros. Adicionalmente, a identificação do padrão de expressão destes polipéptidos seria útil para o diagnóstico de cancros particulares nos mamíferos.
Apesar dos avanços na terapia do cancro em mamíferos identificados acima, há uma grande necessidade de agentes de diagnóstico e terapêuticos adicionais capazes de detectar a presença do tumor num mamífero e de inibir eficazmente o crescimento das células neoplásicas, respectivamente. Por conseguinte, um objectivo do presente invento consiste em identificar: (1) polipéptidos associados à membrana celular que são expressos mais abundantemente em um ou mais tipo(s) de célula(s) cancerosa(s) em comparação com as células normais ou outras células cancerosas diferentes, (2) polipéptidos não associados à membrana que são produzidos especificamente por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) cancerosa(s) (ou por outras células que produzem polipéptidos com um efeito potenciador sobre o crescimento de células cancerosas) em comparação com um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) normal(is) não cancerosa(s) , (3) polipéptidos não associados à membrana que são produzidos por células cancerosas com um nível de expressão que é significativamente superior ao de uma ou mais célula(s) não cancerosa(s) normal(is) ou (4) polipéptidos cuja expressão está especificamente limitada a apenas um único (ou um número muito limitado de diferentes) tipo(s) de tecido(s) em ambos os estados canceroso e não canceroso (por exemplo, tecido normal da próstata e tecido tumoral da próstata); e utilizar aqueles polipéptidos, e os seus ácidos nucleicos codificantes, para produzir composições de matéria úteis no tratamento terapêutico e na detecção de diagnóstico do cancro em mamíferos. Um objectivo do presente invento é também a identificação de polipéptidos associados à membrana celular, segregados ou intracelulares cuja expressão está limitada a um único ou a um número muito limitado de tecidos e a utilização daqueles polipéptidos, e dos seus ácidos nucleicos codificantes, para produzir composições de matéria úteis no 4 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ tratamento terapêutico e na detecção de diagnóstico do cancro em mamíferos.
Yin et al. (Câncer Immunity (2008) 8, 1-9) e WO 96/40295 descrevem o anticorpo MX35, que se liga a TAT211 aqui descrito. Ο MX35 foi desenvolvido como um anticorpo contra o cancro do ovário. A marcação de células tumorais do ovário utilizando MX35 marcado radioactivamente está descrita em Rubin et al (Gynecologic Oncology (1993) 51, 61-66).
Concretizações
No presente fascículo, os requerentes descrevem a identificação de vários polipéptidos celulares (e dos respectivos ácidos nucleicos codificantes ou seus fragmentos) que são expressos em maior extensão na superfície de ou por um ou mais tipos de célula(s) cancerosa(s) em comparação com na superfície de ou por um ou mais tipos de células não cancerosas normais. Em alternativa, estes polipéptidos são expressos por células que produzem e/ou segregam polipéptidos que possuem um efeito potenciador ou de reforço do crescimento nas células cancerosas. Novamente em alternativa, estes polipéptidos poderão não ser expressos por ambas as células tumorais e células normais de apenas um único ou um número muito limitado de tipos de tecidos (preferencialmente, tecidos que não são essenciais para a vida; por exemplo, a próstata, etc.).
Todos os polipéptidos acima são aqui designados por polipéptidos-alvo antigénicos associados a um tumor (polipéptidos "TAT" de "Tumor-associated Antigenic Target") e espera-se que actuem como alvos eficazes para a terapia e o diagnóstico do cancro em mamíferos. É aqui também descrita uma molécula de ácido nucleico isolada possuindo uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido-alvo antigénico associado a um tumor ou um seu fragmento (um polipéptido "TAT"). em A molécula de ácido nucleico isolada poderá compreender uma sequência nucleotídica que possui uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 80%, 5 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ alternativa uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, com (a) uma molécula de ADN que codifica um polipéptido TAT completo possuindo uma sequência de aminoácidos como aqui descrito, uma sequência de aminoácidos do polipéptido TAT que não possui o péptido de sinal como aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT transmembranar, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito ou qualquer outro fraqmento especificamente definido da sequência de aminoácidos do polipéptido TAT completo como aqui descrito, ou (b) o complemento da molécula de ADN de (a). A molécula de ácido nucleico isolada poderá compreender uma sequência nucleotídica que possui uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 80%, em alternativa uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, com (a) uma molécula de ADN que compreende a sequência codificante de um ADNc do polipéptido TAT completo como aqui descrito, a sequência codificante de um polipéptido TAT que não possui o péptido de sinal como aqui descrito, a sequência codificante de um domínio extracelular de um polipéptido TAT transmembranar, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito ou a sequência codificante de qualquer outro fragmento especificamente definido da sequência de aminoácidos do polipéptido TAT completo como aqui descrito, ou (b) o complemento da molécula de ADN de (a). É aqui adicionalmente descrita uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotídica que possui uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 80%, em alternativa uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 10 0%, com (a) uma molécula de ADN que codifica o mesmo polipéptido maduro codificado pela região codificante completa de qualquer um dos ADNc de proteínas humanas depositados junto da ATCC como aqui descrito, ou (b) o complemento da molécula de ADN de (a). 6 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ É também descrita uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido TAT cujo domínio transmembranar foi eliminado ou inactivado, ou que é complementar de tal sequência nucleotidica codificante, em que o(s) domínio(s) transmembranar(es) deste(s) polipéptido(s) são aqui descritos; os domínios extracelulares solúveis dos polipéptidos TAT aqui descritos; moléculas de ácido nucleico isoladas que hibridam com (a) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido TAT possuindo uma sequência de aminoácidos completa como aqui descrito, uma sequência de aminoácidos de um polipéptido TAT que não possui o péptido de sinal como aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT transmembranar, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito ou qualquer outro fragmento especificamente definido da sequência de aminoácidos de um polipéptido TAT completo como aqui descrito, ou (b) o complemento da sequência nucleotidica de (a); e fragmentos de uma sequência codificante do polipéptido TAT completo, ou do seu complemento, como aqui descrito, que poderão ter aplicação como, por exemplo, sondas de hibridação úteis como, por exemplo, sondas de diagnóstico ou sondas oligonucleotídicas anti-senso, ou para codificar fragmentos de um polipéptido TAT completo que poderão opcionalmente codificar um polipéptido que compreende um local de ligação para um anticorpo anti-polipéptido TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou outra molécula orgânica pequena que se liga a um polipéptido TAT. Tais fragmentos de ácido nucleico têm normalmente pelo menos cerca de 5 nucleótidos de comprimento, em alternativa pelo menos cerca de 6, 7 «·. 00 9, 10 , 11/ 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 23 , 26, 27, 28, 29, 30, 35 , 40, 5, 50, 55 , 60, 65, 70, 75, 80 , 85, 90, LO σ> 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 210, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 990, 990 ou 1000 nucleótidos de comprimento, 7 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ em que, neste contexto, o termo "cerca de" significa o comprimento da sequência nucleotidica referenciado mais ou menos 10% desse comprimento referenciado. Salienta-se que novos fragmentos de uma sequência nucleotidica que codifica o polipéptido TAT poderão ser determinados de uma forma rotineira, através de alinhamento da sequência nucleotidica que codifica o polipéptido TAT com outras sequências nucleotidicas conhecidas utilizando qualquer um de vários programas de alinhamento de sequências bem conhecidos e determinando que fragmento(s) da sequência nucleotidica que codifica o polipéptido TAT são novos. Todos estes novos fragmentos de sequências nucleotidicas que codificam o polipéptido TAT estão aqui contemplados. Estão igualmente contemplados os fragmentos do polipéptido TAT codificados por estes fragmentos moleculares nucleotidicos, preferencialmente aqueles fragmentos do polipéptido TAT que compreendem um local de ligação para um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou outra molécula orgânica pequena que se liga a um polipéptido TAT. São também aqui descritos polipéptidos TAT isolados codificados por qualquer uma das sequências de ácido nucleico isoladas identificadas acima; um polipéptido TAT isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, em alternativa uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%, com um polipéptido TAT que possui uma sequência de aminoácidos completa como aqui descrito, uma sequência de aminoácidos de um polipéptido TAT que não possui o péptido de sinal como aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT transmembranar, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito, uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma das sequências de ácido nucleico aqui descritas, ou qualquer outro fragmento especificamente definido da sequência de aminoácidos de um polipéptido TAT completo; um polipéptido TAT isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui uma identidade de sequência de 8 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, em alternativa uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, com uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer um dos ADNc de proteínas humanas depositados junto da ATCC como aqui descrito; um polipéptido TAT isolado sem a sequência de sinal N-terminal e/ou sem a metionina de iniciação e que é codificado por uma sequência nucleotídica que codifica uma tal sequência de aminoácidos como aqui descrita acima; processos para produzir o mesmo, em que esses processos compreendem a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vector que compreende a molécula de ácido nucleico codificante apropriada em condições adequadas para a expressão do polipéptido TAT e a recuperação do polipéptido TAT a partir da cultura celular; e um polipéptido TAT isolado cujo domínio transmembranar foi eliminado ou inactivado; e processos para produzir o mesmo, em que esses processos compreendem a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vector que compreende a molécula de ácido nucleico codificante apropriada em condições adequadas para a expressão do polipéptido TAT e a recuperação do polipéptido TAT a partir da cultura celular. São adicionalmente descritos vectores compreendendo o ADN que codifica qualquer um dos polipéptidos aqui descritos. Células hospedeiras compreendendo qualquer um destes vectores são também descritas. A título exemplificativo, as células hospedeiras poderão ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura. Um processo para produzir qualquer um dos polipéptidos aqui descritos é adicionalmente descrito e inclui a cultura das células hospedeiras em condições adequadas para a expressão do polipéptido desejado e a recuperação do polipéptido desejado a partir da cultura celular. São também descritos polipéptidos quiméricos isolados compreendendo qualquer um dos polipéptidos TAT aqui descritos fundido com um polipéptido heterólogo (não TAT) . Um exemplo de tais moléculas quiméricas inclui qualquer um dos 9 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ polipéptidos ΤΑΤ aqui descritos fundido com um polipéptido heterólogo tal como, por exemplo, uma sequência de marca epitópica ou uma região Fc de uma imunoglobulina. O invento disponibiliza um anticorpo que se liga, de preferência especificamente, a qualquer um dos polipéptidos descritos acima ou abaixo para utilização conforme descrito nas reivindicações. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia única ou um anticorpo que inibe competitivamente a ligação de um anticorpo anti-polipéptido TAT ao respectivo epitopo antigénico. Os anticorpos do presente invento estão conjugados com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. Os anticorpos do presente invento poderão ser opcionalmente produzidos em células CHO ou em células bacterianas e, de preferência, induzem a morte de uma célula à qual se ligam. Para fins de diagnóstico, os anticorpos do presente invento poderão ser marcados de modo detectável, ligados a um suporte sólido ou sujeitos a procedimentos similares. São aqui descritos vectores compreendendo o ADN que codifica qualquer um dos anticorpos aqui descritos. Células hospedeiras compreendendo qualquer um destes vectores são também descritas. A titulo exemplificativo, as células hospedeiras poderão ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura. Um processo para produzir qualquer um dos anticorpos aqui descritos é adicionalmente descrito e inclui a cultura das células hospedeiras em condições adequadas para a expressão do anticorpo desejado e a recuperação do anticorpo desejado a partir da cultura celular. São também descritos oligopéptidos ("oligopéptidos de ligação a TAT") que se ligam, de preferência especificamente, a qualquer um dos polipéptidos TAT descritos acima ou abaixo. Opcionalmente, os oligopéptidos de ligação a TAT poderão estar conjugados com um agente inibidor do crescimento ou com 10 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. Os oligopéptidos de ligação a TAT poderão ser opcionalmente produzidos em células CHO ou em células bacterianas e, de preferência, induzem a morte de uma célula à qual se ligam. Para fins de diagnóstico, os oligopéptidos de ligação a TAT poderão ser marcados de modo detectável, ligados a um suporte sólido ou sujeitos a procedimentos similares. São também descritos vectores compreendendo o ADN que codifica qualquer um dos oligopéptidos de ligação a TAT aqui descritos; células hospedeiras compreendendo qualquer um destes vectores; a titulo exemplificativo, as células hospedeiras poderão ser células CHO, células de E. coli ou células de levedura; um processo para produzir qualquer um dos oligopéptidos de ligação a TAT aqui descritos que inclui a cultura das células hospedeiras em condições adequadas para a expressão do oligopéptido desejado e a recuperação do oligopéptido desejado a partir da cultura celular; e moléculas orgânicas pequenas ("moléculas orgânicas de ligação a TAT") que se ligam, de preferência especificamente, a qualquer um dos polipéptidos TAT descritos acima ou abaixo. Opcionalmente, as moléculas orgânicas de ligação a TAT poderão estar conjugadas com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. As moléculas orgânicas de ligação a TAT induzem, de preferência, a morte de uma célula à qual se ligam. Para fins de diagnóstico, as moléculas orgânicas de ligação a TAT poderão ser marcadas de modo detectável, ligadas a um suporte sólido ou sujeitas a procedimentos similares.
Ainda em outra concretização, o invento refere-se a uma composição de matéria compreendendo um anticorpo anti-TAT como aqui descrito, para utilização conforme definido nas reivindicações em combinação com um veiculo. Opcionalmente, o veiculo é um veiculo farmaceuticamente aceitável. 11 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Outra concretização do presente invento refere-se à utilização de um anticorpo anti-polipéptido TAT como aqui descrito, para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que responde ao anticorpo anti-polipéptido TAT. B. Concretizações adicionais
Outra concretização do presente invento refere-se a um método de inibição do crescimento de uma célula que expressa um polipéptido TAT, em que o método compreende o contacto da célula com um anticorpo que se liga ao polipéptido TAT e em que a ligação do anticorpo ao polipéptido TAT provoca a inibição do crescimento da célula que expressa o polipéptido TAT. Em concretizações preferidas, a célula é uma célula cancerosa e a ligação do anticorpo ao polipéptido TAT provoca a morte da célula que expressa o polipéptido TAT. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo de cadeia única. Os anticorpos empregues nos métodos do presente invento estão conjugados com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. Os anticorpos utilizados nos métodos do presente invento poderão ser opcionalmente produzidos em células CHO ou em células bacterianas.
Ainda outra concretização do presente invento refere-se a um método de tratamento terapêutico de um mamífero que possui um tumor canceroso compreendendo células que expressam um polipéptido TAT, em que o método compreende a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao polipéptido TAT, resultando assim no tratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo de cadeia única. Os anticorpos empregues nos métodos do presente invento estão conjugados com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um 12 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. Os anticorpos utilizados nos métodos do presente invento poderão ser opcionalmente produzidos em células CHO ou em células bacterianas. É aqui descrito um método de determinação da presença de um polipéptido TAT numa amostra suspeita de conter o polipéptido TAT, em que o método compreende a exposição da amostra a um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica pequena que se liga ao polipéptido TAT e a determinação da ligação do anticorpo, do oligopéptido ou da molécula orgânica ao polipéptido TAT na amostra, em que a presença desta ligação é indicativa da presença do polipéptido TAT na amostra. Opcionalmente, a amostra poderá conter células (que poderão ser células cancerosas) suspeitas de expressarem o polipéptido TAT. O anticorpo, o oligopéptido de ligação a TAT ou a molécula orgânica de ligação a TAT empregue no método poderá ser opcionalmente marcado de modo detectável, ligado a um suporte sólido ou sujeito a procedimentos similares.
Uma concretização adicional do presente invento refere-se a um método de diagnóstico da presença de um tumor num mamífero, em que o método compreende a detecção do nível de expressão de um gene que codifica um polipéptido TAT (a) numa amostra de teste de células de um tecido obtidas a partir do referido mamífero e (b) numa amostra de controlo de células não cancerosas normais conhecidas da mesma origem ou tipo tecidual, em que um nível mais elevado de expressão do polipéptido TAT na amostra de teste, em comparação com a amostra de controlo, é indicativo da presença de um tumor no mamífero a partir do qual a amostra de teste foi obtida.
Outra concretização do presente invento refere-se a um método de diagnóstico da presença de um tumor num mamífero, em que o método compreende (a) o contacto de uma amostra de teste compreendendo células de um tecido obtidas a partir do mamífero com um que se liga a um polipéptido TAT e (b) a detecção da formação de um complexo entre o anticorpo e o polipéptido TAT na amostra de teste, em que a formação de um complexo é indicativa da presença de um tumor no mamífero. 13 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Opcionalmente, ο anticorpo empregue é marcado de modo detectável, ligado a um suporte sólido ou sujeito a procedimentos similares e/ou a amostra de teste de células do tecido é obtida a partir de um indivíduo suspeito de ter um tumor canceroso.
Outra concretização ainda do presente invento refere-se a um método de tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular associada a uma expressão ou actividade alterada, de preferência aumentada, de um polipéptido TAT, em que o método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antagonista de um polipéptido TAT a um sujeito necessitado de tal tratamento. Preferencialmente, a perturbação proliferativa celular é um cancro, e o antagonista do polipéptido TAT é um anticorpo anti-polipéptido TAT. O tratamento ou prevenção eficaz da perturbação proliferativa celular poderá ser um resultado de morte directa ou inibição do crescimento das células que expressam um polipéptido TAT ou de antagonizar a actividade potenciadora do crescimento celular de um polipéptido TAT. É aqui descrito um método de ligação de um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica pequena a uma célula que expressa um polipéptido TAT, em que o método compreende contactar uma célula que expressa um polipéptido TAT com o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica pequena em condições que são adequadas para a ligação do anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica pequena ao referido polipéptido TAT, e permitir a ligação entre eles.
Outras concretizações do presente invento referem-se à utilização de um anticorpo anti-polipéptido TAT na preparação de um medicamento útil para (i) o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro ou tumor (ii) a prevenção ou o tratamento terapêutico de uma perturbação proliferativa celular.
Outra concretização do presente invento refere-se a um método de inibição do crescimento de uma célula cancerosa, em que o crescimento da referida célula cancerosa está, pelo menos em parte, dependente do(s) efeito(s) de potenciação do crescimento de um polipéptido TAT (em que o polipéptido TAT 14 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ poderá ser expresso quer pela própria célula cancerosa quer por uma célula que produz polipéptido(s) que têm um efeito de potenciação do crescimento sobre as células cancerosas), em que o método compreende o contacto do polipéptido TAT com um anticorpo que se liga ao polipéptido TAT, antagonizando assim a actividade de potenciação do crescimento do polipéptido TAT e, como consequência, inibindo o crescimento da célula cancerosa. Preferencialmente, o crescimento da célula cancerosa é totalmente inibido. Ainda mais preferencialmente, a ligação do anticorpo, do oligopéptido ou da molécula orgânica pequena ao polipéptido TAT induz a morte da célula cancerosa. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo de cadeia única. Os anticorpos empregues nos métodos do presente invento estão conjugados com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. Os anticorpos utilizados nos métodos do presente invento poderão ser opcionalmente produzidos em células CHO ou em células bacterianas.
Outra concretização ainda do presente invento refere-se a um método de tratamento terapêutico de um tumor num mamifero, em que o crescimento do referido tumor está, pelo menos em parte, dependente do(s) efeito (s) de potenciação do crescimento de um polipéptido TAT, em que o método compreende a administração ao mamifero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao polipéptido TAT, antagonizando assim a actividade de potenciação do crescimento do referido polipéptido TAT e resultando no tratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo de cadeia única. Os anticorpos empregues nos métodos do presente invento estão conjugados com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou a caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioactivo, uma enzima nucleolitica ou uma espécie idêntica. 15 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Os anticorpos utilizados nos métodos do presente invento poderão ser opcionalmente produzidos em células CHO ou em células bacterianas. C.
Estão aqui também descritos: 1. Ácido nucleico isolado possuindo uma sequência nucleotidica que tem uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos 80% com: (a) uma molécula de ADN que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO: 107); (b) uma molécula de ADN que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) uma molécula de ADN que codifica um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) uma molécula de ADN que codifica um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) a sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO. 2 9); (f) a região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO. 29); ou (g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f). 2. Ácido nucleico isolado possuindo: (a) uma sequência nucleotidica que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) uma sequência nucleotidica que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência nucleotidica que codifica um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com o seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência nucleotidica que codifica um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; 16 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
(e) a sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 2 9); (f) a região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f). 3. Ácido nucleico isolado que híbrida com: (a) um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um ácido nucleico que codifica um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um ácido nucleico que codifica um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) a sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 2 9); (f) a região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f). 4. Ácido nucleico da reivindicação 3, em que a hibridação ocorre sob condições estringentes. 5. Ácido nucleico da reivindicação 3 que tem pelo menos cerca de 5 nucleótidos de comprimento. 6. Vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 1, 2 ou 3. 7. Vector de expressão da reivindicação 6, em que o referido ácido nucleico está ligado de forma funcional a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector. 8. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão da reivindicação 7. 17 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 9. Célula hospedeira da reivindicação 8 que é uma célula CHO, uma célula de E. coli ou uma célula de levedura. 10. Processo de produção de um polipéptido que compreende a cultura da célula hospedeira da reivindicação 8 em condições adequadas para a expressão do referido polipéptido e a recuperação do referido polipéptido a partir da cultura celular. 11. Polipéptido isolado que possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO:107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NOS: 29). 12. Polipéptido isolado possuindo: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou 18 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 13. Polipéptido quimérico compreendendo o polipéptido da reivindicação 11 ou 12 fundido com um polipéptido heterólogo. 14. Polipéptido quimérico da reivindicação 13, em que o referido polipéptido heterólogo é uma sequência de marca epitópica ou uma região Fc de uma imunoglobulina. 15. Anticorpo isolado que se liga a um polipéptido possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 16. Anticorpo isolado que se liga a um polipéptido possuindo: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; 19 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 17. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que é um anticorpo monoclonal. 18. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que é um fragmento de anticorpo. 19. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que é um anticorpo quimérico ou humanizado. 20. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 21. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que está conjugado com um agente citotóxico. 22. Anticorpo da reivindicação 21, em que o agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleolítica. 23. Anticorpo da reivindicação 21, em que o agente citotóxico é uma toxina. 24. Anticorpo da reivindicação 23, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 25. Anticorpo da reivindicação 23, em que a toxina é um maitansinóide. 26. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que é produzido em bactérias. 20 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 27. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que é produzido em células CHO. 28. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que induz a morte de uma célula à qual se liga. 29. Anticorpo da reivindicação 15 ou 16 que está marcado de forma detectável. 30. Ácido nucleico isolado possuindo uma sequência nucleotidica que codifica o anticorpo da reivindicação 15 ou 16. 31. Vector de expressão compreendendo o ácido nucleico da reivindicação 30 ligado de forma funcional a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector. 32. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão da reivindicação 31. 33. Célula hospedeira da reivindicação 32 que é uma célula CHO, uma célula de E. coli ou uma célula de levedura. 34. Processo de produção de um anticorpo que compreende a cultura da célula hospedeira da reivindicação 32 sob condições adequadas para a expressão do referido anticorpo e a recuperação do referido anticorpo a partir da cultura celular. 35. Oligopéptido isolado que se liga a um polipéptido possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com o seu péptido de sinal associado; 21 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 36. Oligopéptido isolado que se liga a um polipéptido possuindo: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 37. Oligopéptido da reivindicação 35 ou 36 que está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 38. Oligopéptido da reivindicação 35 ou 36 que está conjugado com um agente citotóxico. 39. Oligopéptido da reivindicação 38, em que o agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleolítica. 40. Oligopéptido da reivindicação 38, em que o agente citotóxico é uma toxina. 22 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 41. Oligopéptido da reivindicação 40, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 42. Oligopéptido da reivindicação 40, em que a toxina é um maitansinóide. 43. Oligopéptido da reivindicação 35 ou 36 que induz a morte de uma célula à qual se liga. 44. Oligopéptido da reivindicação 35 ou 36 que está marcado de forma detectável. 45. Molécula orgânica de ligação a TAT que se liga a um polipéptido possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 46. Molécula orgânica da reivindicação 45 que se liga a um polipéptido possuindo: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; 23 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 47. Molécula orgânica da reivindicação 45 ou 46 que está conjugada com um agente inibidor do crescimento. 48. Molécula orgânica da reivindicação 45 ou 46 que está conjugada com um agente citotóxico. 49. Molécula orgânica da reivindicação 48, em que o agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleolíticas. 50. Molécula orgânica da agente citotóxico é uma toxina. 51. Molécula orgânica da toxina é seleccionada entre maitansinóide e caliqueamicina. 52. Molécula orgânica da toxina é um maitansinóide. reivindicação 48, em que o reivindicação 50, em que a o grupo que consiste em reivindicação 50, em que a 53. Molécula orgânica da reivindicação 45 ou 46 que induz a morte de uma célula à qual se liga. 54. Molécula orgânica da reivindicação 45 ou 46 que está marcada de forma detectável. 55. Composição de matéria compreendendo: (a) o polipéptido da reivindicação 11; 24 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (b) ο polipéptido da reivindicação 12/ (c) o polipéptido quimérico da reivindicação 13/ (d) o anticorpo da reivindicação 15/ (e) o anticorpo da reivindicação 16/ (f) o oligopéptido da reivindicação 35/ (g) o oligopéptido da reivindicação 36/ (h) a molécula orgânica de ligação a TAT da reivindicação 45/ ou (i) a molécula orgânica de ligação a TAT da reivindicação 46/ em combinação com um veiculo. 56. Composição de matéria da reivindicação 55, em que o referido veiculo é um veiculo farmaceuticamente aceitável. 57. Artigo de manufactura compreendendo: (a) um recipiente/ e (b) a composição de matéria da reivindicação 55 contida no referido recipiente, 58. Artigo de manufactura da reivindicação 57, compreendendo adicionalmente uma etiqueta afixada no referido recipiente, ou um folheto incluído com o referido recipiente, referindo-se à utilização da referida composição de matéria para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 59. Método de inibição do crescimento de uma célula que expressa uma proteína possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107)/ (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado/ (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado/ (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado/ (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29)/ ou 25 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende o contacto da referida célula com um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica que se liga à referida proteína, e a ligação do referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida proteína provoca assim uma inibição do crescimento da referida célula. 60. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. 61. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo é um fragmento de anticorpo. 62. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado. 63. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 64. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente citotóxico. 65. Método da reivindicação 64, em que o referido agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleolíticas. 66. Método da reivindicação 64, em que o agente citotóxico é uma toxina. 67. Método da reivindicação 66, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 68. Método da reivindicação 66, em que a toxina é um maitansinóide. 26 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 69. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo é produzido em bactérias. 70. Método da reivindicação 59, em que o referido anticorpo é produzido em células CHO. 71. Método da reivindicação 59, em que a referida célula é uma célula cancerosa. 72. Método da reivindicação 71, em que a referida célula cancerosa é adicionalmente exposta a um tratamento com radiação ou a um agente quimioterapêutico. 73. Método da reivindicação 71, em que a referida célula cancerosa é seleccionada entre o grupo que consiste numa célula cancerosa do pulmão e numa célula de cancro do ovário. 74 . Método da reivindicação 71, em que a referida proteína é expressa mais abundantemente pela referida célula cancerosa em comparação com uma célula normal originária do mesmo tecido. 75. Método da reivindicação 59 que causa a morte da referida célula. 76. Método da reivindicação 59, em que a referida proteina possui: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou 27 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 77. Método de tratamento terapêutico de um mamífero que possui um tumor canceroso compreendendo células que expressam uma proteína possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID N0:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO:107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende a administração ao referido mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica que se liga à referida proteína, tratando assim eficazmente o referido mamífero. 78. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. 79. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo é um fragmento de anticorpo. 80. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado. 81. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 28 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 82. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente citotóxico. 83. Método da reivindicação 82, em que o referido agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleoliticas. 84. Método da reivindicação 82, em que o agente citotóxico é uma toxina. 85. Método da reivindicação 84, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 86. Método da reivindicação 84, em que a toxina é um maitansinóide. 87. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo é produzido em bactérias. 88. Método da reivindicação 77, em que o referido anticorpo é produzido em células CHO. 89. Método da reivindicação 77, em que o referido tumor é adicionalmente exposto a um tratamento com radiação ou a um agente quimioterapêutico. 90. Método da reivindicação 77, em que o referido tumor é um tumor pulmonar ou um tumor do ovário. 91. Método da reivindicação 77, em que a referida proteína é expressa mais abundantemente pelas células cancerosas do referido tumor em comparação com uma célula normal originária do mesmo tecido. 92. Método da reivindicação 77, em que a referida proteína possui: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); 29 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 93. Método de determinação da presença de uma proteína numa amostra suspeita de conter a referida proteína, em que a referida proteína possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende a exposição da referida amostra a um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica que se liga à referida proteína e a determinação da ligação do referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida proteína na referida amostra, em que a ligação do anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à 30 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ referida proteína é indicativa da presença da referida proteína na referida amostra. 94. Método da reivindicação 93, em que a referida amostra compreende uma célula suspeita de expressar a referida proteína. 95. Método da reivindicação 94, em que a referida célula é uma célula cancerosa. 96. Método da reivindicação 93, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está marcado de forma detectável. 97. Método da reivindicação 93, em que a referida proteína possui: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 98. Método de diagnóstico da presença de um tumor num mamífero, em que o referido método compreende a determinação do nível de expressão de um gene que codifica uma proteína possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); 31 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (b) ο polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), numa amostra de teste de células de um tecido obtidas a partir do referido mamífero e numa amostra de controlo de células normais conhecidas originárias do mesmo tecido, em que um nível mais elevado de expressão da referida proteína na amostra de teste, em comparação com a amostra de controlo, é indicativo da presença de um tumor no mamífero a partir do qual a amostra de teste foi obtida. 99. Método da reivindicação 98, em que a etapa de determinação do nível de expressão de um gene que codifica a referida proteína compreende a utilização de um oligonucleótido numa hibridação in situ ou numa análise de RT-PCR. 100. Método da reivindicação 98, em que a etapa de determinação do nível de expressão de um gene que codifica a referida proteína compreende a utilização de um anticorpo numa análise de imuno-histoquímica ou de transferência de Western. 101. Método da reivindicação 98, em que a referida proteína possui: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; 32 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 102. Método de diagnóstico da presença de um tumor num mamífero, em que o referido método compreende o contacto de uma amostra de teste de células de um tecido obtidas a partir do referido mamífero com um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica que se liga a uma proteína possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), e a detecção da formação de um complexo entre o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica e a referida proteína na amostra de teste, em que a formação de um complexo é indicativa da presença de um tumor no referido mamífero. 33 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 103. Método da reivindicação 102, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está marcado de forma detectável. 104. Método da reivindicação 102, em que a referida amostra de teste de células de um tecido é obtida a partir de um indivíduo suspeito de ter um tumor canceroso. 105. Método da reivindicação 102, em que a referida proteína tem: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107);
(b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 106. Método de tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular associada a uma expressão ou actividade incrementada de uma proteína que possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; 34 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende a administração a um sujeito necessitado de tal tratamento de uma quantidade eficaz de um antagonista da referida proteína, tratando ou prevenindo assim eficazmente a referida perturbação proliferativa celular. 107. Método da reivindicação 106, em que a referida perturbação proliferativa celular é um cancro. 108. Método da reivindicação 106, em que o referido antagonista é um anticorpo anti-polipéptido TAT, um oligopéptido de ligação a TAT, uma molécula orgânica de ligação a TAT ou um oligonucleótido anti-senso. 109. Método de ligação de um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica a uma célula que expressa uma proteína possuindo uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende contactar a referida célula com um anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica 35 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ que se liga à referida proteína e permitir que a ligação do anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida proteína tenha lugar, ligando assim o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida célula. 110. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. 111. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo é um fragmento de anticorpo. 112. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. 113. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 114. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente citotóxico. 115. Método da reivindicação 114, em que o referido agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleoliticas. 116. Método da reivindicação 114, em que o agente citotóxico é uma toxina. 117. Método da reivindicação 116, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 118. Método da reivindicação 116, em que a toxina é um maitansinóide. 119. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo é produzido em bactérias. 36 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 120. Método da reivindicação 109, em que o referido anticorpo é produzido em células CHO. 121. Método da reivindicação 109, em que a referida célula é uma célula cancerosa. 122. Método da reivindicação 121, em que a referida célula cancerosa é adicionalmente exposta a um tratamento com radiação ou a um agente quimioterapêutico. 123. Método da reivindicação 121, em que a referida célula cancerosa é uma célula cancerosa do pulmão e uma célula de cancro do ovário. 124. Método da reivindicação 123, em que a referida proteína é expressa mais abundantemente pela referida célula cancerosa em comparação com uma célula normal originária do mesmo tecido. 125. Método da reivindicação 109 que causa a morte da referida célula. 126. Utilização de um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 30, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 127. Utilização de um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 30, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 128. Utilização de um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 30, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 129. Utilização de um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 31, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 37 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 130. Utilização de um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 31, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 131. Utilização de um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 31, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 132. Utilização de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 32 ou 33, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 133. Utilização de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 32 ou 33, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 134. Utilização de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 32 ou 33, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 135. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 136. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 137. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 138. Utilização de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 38 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 139. Utilização de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 140. Utilização de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 29, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 141. Utilização de um oligopéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 44, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 142. Utilização de um oligopéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 44, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 143. Utilização de um oligopéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 44, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 144. Utilização de uma molécula orgânica de ligação a TAT de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 54, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 145. Utilização de uma molécula orgânica de ligação a TAT de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 54, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 146. Utilização de uma molécula orgânica de ligação a TAT de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 54, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 147. Utilização de uma composição de matéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 ou 56, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 39 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 148. Utilização de uma composição de matéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 ou 56, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 149. Utilização de uma composição de matéria de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 ou 56, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 150. Utilização de um artigo de manufactura de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 ou 58, na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico ou a detecção de diagnóstico de um cancro. 151. Utilização de um artigo de manufactura de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 ou 58, na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor. 152. Utilização de um artigo de manufactura de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 ou 58, na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma perturbação proliferativa celular. 153. Método de inibição do crescimento de uma célula, em que o crescimento da referida célula está, pelo menos em parte, dependente de um efeito de potenciação do crescimento de uma proteína que possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou 40 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotidica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende o contacto da referida proteína com um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica que se liga à referida proteína, inibindo assim o crescimento da referida célula. 154. Método da reivindicação 153, em que a referida célula é uma célula cancerosa. 155. Método da reivindicação 153, em que a referida proteína é expressa pela referida célula. 156. Método da reivindicação 153, em que a ligação do referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida proteína antagoniza uma actividade de potenciação do crescimento celular da referida proteína. 157. Método da reivindicação 153, em que a ligação do referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida proteína induz a morte da referida célula. 158. Método da reivindicação 153, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. 159. Método da reivindicação 153, em que o referido anticorpo é um fragmento de anticorpo. em que o referido ou um anticorpo 160. Método da reivindicação 153, anticorpo é um anticorpo quimérico humanizado. 161. Método da reivindicação 153, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 162. Método da reivindicação 153, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente citotóxico. 41 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 163. Método da reivindicação 162, em que o referido agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleoliticas. 164. Método da reivindicação 162, em que o agente citotóxico é uma toxina. 165. Método da reivindicação 164, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 166. Método da reivindicação 164, em que a toxina é um maitansinóide. 167 . Método da reivindicação 153, em que o referido anticorpo é produzido em bactérias. 168 . Método da reivindicação 153, em que o referido anticorpo é produzido em células CHO. 169. Método da reivindicação 153, em que a referida proteína ; possui: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107 ); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29). 42 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 170. Método de tratamento terapêutico de um tumor num mamífero, em que o crescimento do referido tumor está, pelo menos em parte, dependente de um efeito de potenciação do crescimento de uma proteína que possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% com: (a) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) o polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem o seu péptido de sinal associado; (c) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO: 107), com o seu péptido de sinal associado; (d) um domínio extracelular do polipéptido apresentado na
Figura 107 (SEQ ID NO: 107), sem o seu péptido de sinal associado; (e) um polipéptido codificado pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO:29); ou (f) um polipéptido codificado pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29), em que o referido método compreende o contacto da referida proteína com um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica que se liga à referida proteína, tratando assim eficazmente o referido tumor. 171. Método da reivindicação 170, em que a referida proteína é expressa por células do referido tumor. 172. Método da reivindicação 170, em que a ligação do referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica à referida proteína antagoniza uma actividade de potenciação do crescimento celular da referida proteína. 173. Método da reivindicação 170, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal. em que o referido 174. Método da reivindicação 170, anticorpo é um fragmento de anticorpo. 43 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 175. Método da reivindicação 170, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. 176. Método da reivindicação 170, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente inibidor do crescimento. 177. Método da reivindicação 170, em que o referido anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica está conjugado com um agente citotóxico. 178. Método da reivindicação 177, em que o referido agente citotóxico é seleccionado entre o grupo que consiste em toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos e enzimas nucleolíticas. 179. Método da reivindicação 177, em que o agente citotóxico é uma toxina. 180. Método da reivindicação 179, em que a toxina é seleccionada entre o grupo que consiste em maitansinóide e caliqueamicina. 181. Método da reivindicação 179, em que a toxina é um maitansinóide. 182. Método da anticorpo é produzido reivindicação em bactérias. 170, em que o referido 183. Método da anticorpo é produzido reivindicação em células CHO 170, em que o referido 184. Método da reivindicação 170, em que a referida proteína possui: (a) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107); (b) a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; 44 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ (c) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), com a sequência do seu péptido de sinal associado; (d) uma sequência de aminoácidos de um domínio extracelular do polipéptido apresentado na Figura 107 (SEQ ID NO:107), sem a sequência do seu péptido de sinal associado; (e) uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29); ou (f) uma sequência de aminoácidos codificada pela região codificante completa da sequência nucleotídica apresentada na Figura 29 (SEQ ID NO: 29).
Outras concretizações adicionais do presente invento serão evidentes para um perito na técnica após a leitura do presente fascículo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 29 representa uma sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 29) de um ADNc de TAT211, em que a SEQ ID NO: 29 é um clone aqui designado por "DNA219894". A Figura 107 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:107) derivada da sequência codificante da SEQ ID NO: 29 apresentada na Figura 29.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições
Os termos "polipéptido TAT" e "TAT", tal como aqui utilizados e quando seguidos imediatamente por uma designação numérica, referem-se a vários polipéptidos, em que a designação completa (isto é, TAT/número) refere-se a sequências de polipéptidos específicos como aqui descritos. Os termos "polipéptido TAT/número" e "TAT/número", em que o termo "número" é fornecido como uma designação numérica efectiva tal como aqui utilizada, por exemplo, TAT211, abrangem polipéptidos de sequência nativa, variantes dos polipéptidos e fragmentos de polipéptidos de sequência nativa e de variantes dos polipéptidos (que estão aqui adicionalmente definidos). Os polipéptidos TAT aqui descritos 45 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ poderão ser isolados a partir de uma variedade de fontes, por exemplo tipos de tecidos humanos ou outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. O termo "polipéptido TAT" refere-se a cada polipéptido TAT/número individual aqui descrito. Todas as descrições neste fascículo que se referem ao "polipéptido TAT" referem-se a cada um dos polipéptidos individualmente, bem como conjuntamente. Por exemplo, as descrições da preparação de, purificação de, derivação de, formação de anticorpos para ou contra, formação de oligopéptidos de ligação a TAT para ou contra, formação de moléculas orgânicas de ligação a TAT para ou contra, administração de, composição contendo, tratamento de uma doença com, etc. dizem respeito a cada polipéptido do invento individualmente. O termo "polipéptido TAT" também inclui variantes dos polipéptidos TAT/número aqui descritos.
Um "polipéptido TAT de sequência nativa" compreende um polipéptido que possui a mesma sequência de aminoácidos que o polipéptido TAT correspondente derivado da natureza. Estes polipéptidos TAT de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipéptido TAT de sequência nativa" abrange especificamente formas segregadas ou truncadas de ocorrência natural do polipéptido TAT específico (por exemplo, uma sequência do domínio extracelular), formas de variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas provenientes de excisão-reparação alternativa) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipéptido. Em determinadas concretizações do invento, os polipéptidos TAT de sequência nativa aqui descritos são polipéptidos de sequência nativa maduros ou completos compreendendo as sequências de aminoácidos completas apresentadas nas figuras anexas. Os codões de iniciação e de terminação (caso estejam indicados) estão representados em negrito e sublinhados nas figuras. Os resíduos de ácidos nucleicos indicados por "N" nas figuras anexas representam qualquer resíduo de ácido nucleico. Embora os polipéptidos TAT descritos nas figuras anexas comecem com resíduos de metionina designados por posição de aminoácido 1 nas figuras, é contudo concebível e possível que outros resíduos de metionina localizados quer a montante quer a jusante da posição de aminoácido 1 nas 46 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ figuras possam ser utilizados como o resíduo de aminoácido inicial para os polipéptidos TAT. O "dominio extracelular" ou "DEC" do polipéptido TAT refere-se a uma forma do polipéptido TAT que é essencialmente desprovida de domínios transmembranares e citoplasmáticos. Normalmente, um DEC do polipéptido TAT terá menos de 1% destes domínios transmembranares e/ou citoplasmáticos e, preferencialmente, terá menos de 0,5% destes domínios. Entende-se que quaisquer domínios transmembranares identificados para os polipéptidos TAT do presente invento são identificados de acordo com os critérios normalmente empregues na técnica para identificar esse tipo de domínio hidrofóbico. As fronteiras exactas de um domínio transmembranar poderão variar, embora muito provavelmente em não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer uma das extremidades do domínio conforme aqui inicialmente identificado. Por conseguinte, opcionalmente, um domínio extracelular de um polipéptido TAT poderá conter desde cerca de 5 ou menos aminoácidos em qualquer um dos lados da fronteira domínio transmembranar/domínio extracelular tal como identificada nos Exemplos ou no fascículo, e tais polipéptidos, com ou sem o péptido de sinal associado, e o ácido nucleico que os codifica, estão contemplados pelo presente invento. A localização aproximada dos "péptidos de sinal" dos vários polipéptidos TAT aqui descritos poderá estar representada no presente fascículo e/ou nas figuras anexas. Salienta-se, contudo, que a fronteira C-terminal de um péptido de sinal poderá variar, embora muito provavelmente em não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer um dos lados da fronteira C-terminal do péptido de sinal tal como aqui inicialmente identificada, em que a fronteira C-terminal do péptido de sinal poderá ser identificada de acordo com os critérios habitualmente empregues na técnica para identificar esse tipo de elemento das sequências de aminoácidos (por exemplo, Nielsen et al., Prot, Eng., 10:1-6 (1997) e von
Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Além disso, reconhece-se também que, em alguns casos, a clivagem de uma sequência de sinal de um polipéptido segregado não é inteiramente uniforme, resultando em mais de uma espécie 47 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ segregada. Estes polipéptidos maduros, em que o péptido de sinal é clivado dentro da região constituída por não mais de cerca de 5 aminoácidos em qualquer um dos lados da fronteira C-terminal do péptido de sinal tal como aqui identificada, e os polinucleótidos que os codificam, estão contemplados pelo presente invento. O termo "variante de um polipéptido TAT" designa um polipéptido TAT, de preferência um polipéptido TAT activo, tal como aqui definido que possui uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 8 0% com uma sequência de um polipéptido TAT de sequência nativa completo como aqui descrito, uma sequência de um polipéptido TAT sem o péptido de sinal conforme aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito, ou qualquer outro fragmento de uma sequência de um polipéptido TAT completo conforme aqui descrito (como aqueles codificados por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência codificante completa de um polipéptido TAT completo). Estas variantes de polipéptidos TAT incluem, por exemplo, polipéptidos TAT em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou eliminados, nas extremidades N-terminal ou C-terminal da sequência de aminoácidos nativa completa. Normalmente, uma variante de um polipéptido TAT terá uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, em alternativa uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 98% ou 99 %, com sequência nativa %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, uma sequência de um polipéptido TAT de completo conforme aqui descrito, uma sequência de um polipéptido TAT sem o péptido de sinal como aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito, ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de um polipéptido TAT completo como aqui descrito. Normalmente, os polipéptidos das variantes de TAT têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, em alternativa pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 , 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 48 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 600 aminoácidos de comprimento ou mais. Opcionalmente, os polipéptidos das variantes de TAT terão não mais de uma substituição conservativa de aminoácidos em comparação com a sequência do polipéptido TAT nativo, em alternativa não mais de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições conservativas de aminoácidos em comparação com a sequência do polipéptido TAT nativo. "A percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências dos polipéptidos TAT aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência do polipéptido TAT específico, após alinhamento das sequências e introdução das lacunas ("gaps"), se necessário, para obter a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para efeitos de
determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, utilizando software computacional disponível publicamente como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na técnica conseguem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter um alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências que estão a ser comparadas. Para efeitos desta descrição, contudo, os valores da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código fonte completo do programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc., e o código fonte apresentado na Tabela 1 abaixo foi depositado, juntamente com documentação do utilizador, junto do U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registado sob o n.° TXU510087 de registo de Copyright dos EUA. O
programa ALIGN-2 está disponível publicamente através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte disponibilizado na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de preferência UNIX 49 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação das sequências são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações em que o programa ALIGN-2 é utilizado para comparações de sequências de aminoácidos, a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A perante, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (o que pode, em alternativa, ser enunciado como uma dada sequência de aminoácidos A que possui ou compreende uma determinada percentagem de identidade de sequência de aminoácidos perante, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:
100 vezes a fracção X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B efectuado por esse programa e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Entender-se-á que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a percentagem de identidade da sequência de aminoácidos de A perante B não será igual à
percentagem de identidade da sequência de aminoácidos de B perante A. Como exemplos de cálculos da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos utilizando este método, as Tabelas 2 e 3 demonstram a forma de calcular a percentagem de identidade de sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos designada por "Proteína de comparação" com a sequência de aminoácidos designada por "TAT", em que "TAT" representa a sequência de aminoácidos de um polipéptido TAT hipotético de interesse, a "Proteína de comparação" representa a sequência de aminoácidos de um polipéptido contra o qual o polipéptido "TAT" de interesse está a ser comparado, e "X", "Y" e "Z" representam, cada um, diferentes resíduos de aminoácidos hipotéticos. Excepto indicação específica em contrário, todos os valores da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos aqui utilizados são obtidos da forma descrita no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2. 50 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Um "polinucleótido de uma variante de TAT" ou uma "sequência de ácido nucleico de uma variante de TAT" designa uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido TAT, preferencialmente um polipéptido TAT activo, como aqui definido, e que possui uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 80% com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de um polipéptido TAT de sequência nativa completo como aqui descrito, uma sequência de um polipéptido TAT de sequência nativa completo sem o péptido de sinal como aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT, com ou sem o péptido de sinal, como aqui descrito, ou qualquer outro fragmento de uma sequência de um polipéptido TAT completo como aqui descrito (como aqueles codificadas por um ácido nucleico que representa apenas uma porção da sequência codificante completa de um polipéptido TAT completo). Normalmente, um polinucleótido de uma variante de TAT terá uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 80%, em alternativa uma identidade de sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de um polipéptido TAT de sequência nativa completo como aqui descrito, uma sequência de um polipéptido TAT de sequência nativa completo sem o péptido de sinal como aqui descrito, um domínio extracelular de um polipéptido TAT, com ou sem a sequência de sinal, como aqui descrito, ou qualquer outro fragmento de uma sequência de um polipéptido TAT completo como aqui descrito. As variantes não englobam a sequência nucleotídica nativa.
Habitualmente, os polinucleótidos das variantes de TAT têm pelo menos cerca de 5 nucleótidos de comprimento, em alternativa pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 / 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 35 , 40, 45, 50, 55, 60 , 65, 70, 75, 80, 85 , 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 51 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 720, 730, 740, 750, 760 , 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 830, 860, 870, 880 , 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleótidos de comprimento, em que, neste contexto, o termo "cerca de " significa o comprimento da sequência de nucleótidos referenciado mais ou menos 10% desse comprimento referenciado. "A percentagem (%) de identidade de sequência de ácido nucleico" em relação às sequências de ácido nucleico que codificam TAT aqui identificadas é definida como a percentagem de nucleótidos numa sequência candidata que são idênticos aos nucleótidos na sequência de ácido nucleico de TAT de interesse, após alinhamento das sequências e introdução das lacunas ("gaps"), se necessário, para obter a máxima percentagem de identidade de sequência. O alinhamento para efeitos de determinação da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico pode ser obtido de várias formas que estão dentro da perícia na técnica, por exemplo, utilizando software computacional disponível publicamente como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para efeitos desta descrição, contudo, os valores da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico são gerados utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2, em que o código fonte completo do programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc., e o código fonte apresentado na Tabela 1 abaixo foi depositado, juntamente com documentação do utilizador, junto do U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registado sob o n.° TXU510087 de registo de Copyright dos EUA. 0 programa ALIGN-2 está disponível publicamente através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte disponibilizado na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, de preferência UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação das sequências são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações em que o programa ALIGN-2 é utilizado para comparações de sequências de ácido nucleico, a percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico de uma dada 52 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ sequência de ácido nucleico C perante, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D (o que pode, em alternativa, ser enunciado como uma dada sequência de ácido nucleico C que possui ou compreende uma determinada percentaqem de identidade de sequência de ácido nucleico perante, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D) é calculada da seguinte forma:
100 vezes a fracção W/Z em que W é o número de nucleótidos classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de C e D efectuado por esse programa e em que Z é o número total de nucleótidos em D. Entender-se-á que quando o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a percentagem de identidade da sequência de ácido nucleico de C perante D não será igual à percentagem de identidade da sequência de ácido nucleico de D perante C.
Como exemplos de cálculos da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico, as Tabelas 4 e 5 demonstram a forma de calcular a percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico da sequência de ácido nucleico designada por "ADN de comparação" com a sequência de ácido nucleico designada por "ADN-TAT", em que "ADN-TAT" representa uma sequência de ácido nucleico hipotética que codifica um TAT de interesse, o "ADN de comparação" representa a sequência nucleotidica de uma molécula de ácido nucleico contra a qual a molécula de ácido nucleico "ADN-TAT" de interesse está a ser comparada, e "N", "L" e "V" representam, cada um, diferentes nucleótidos hipotéticos. Excepto indicação especifica em contrário, todos os valores da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico aqui utilizados são obtidos da forma descrita no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2.
Em outras concretizações, os polinucleótidos das variantes de TAT são moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido TAT e que são capazes de hibridar, preferencialmente sob condições de hibridação e de lavagem estringentes, com sequências nucleotidicas que codificam um polipéptido TAT completo como aqui descrito. Os polipéptidos 53 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ das variantes de TAT poderão ser aqueles que são codificados por um polinucleótido de uma variante de TAT. 0 termo "região codificante completa", quando utilizado em referência a um ácido nucleico que codifica um polipéptido TAT, refere-se à sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido TAT completo do invento (a qual é frequentemente representada entre os codões de iniciação e de terminação, inclusive, nas figuras anexas). O termo "região codificante completa", quando utilizado em referência a um ácido nucleico depositado junto da ATCC, refere-se à porção do ADNc, que está inserido no vector depositado junto da ATCC, que codifica o polipéptido TAT (a qual é frequentemente representada entre os codões de iniciação e de terminação, inclusive, nas figuras anexas). O termo "isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos TAT aqui descritos, designa um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que normalmente interfeririam com as utilizações terapêuticas ou de diagnóstico do polipéptido e poderão incluir enzimas, hormonas e outros solutos de natureza proteica ou não proteica. Numa concretização preferida, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para fornecer pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal através de utilização de um sequenciador de copo giratório ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE, em condições redutoras ou não redutoras, utilizando o corante azul de Coomassie ou, de preferência, prata. O polipéptido isolado inclui um polipéptido in situ nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipéptido TAT não estará presente. Normalmente, contudo, o polipéptido isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação.
Um ácido nucleico que codifica um polipéptido TAT ou um ácido nucleico que codifica um outro polipéptido "isolado" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está habitualmente associada na fonte natural do ácido 54 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ nucleico que codifica o polipéptido. Uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipéptido não se encontra sob a forma, ou no ambiente, em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam um polipéptido são, por consequinte, diferentes da molécula de ácido nucleico especifica que codifica um polipéptido tal como existe nas células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipéptido inclui as moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido contidas em células que habitualmente expressam o polipéptido onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente daquela das células naturais. 0 termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência codificante ligada de forma funcional num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para os procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora e um local de ligação do ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e amplificadores.
Um ácido nucleico está "ligado de forma funcional" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN de uma pré-sequência ou sequência "leader" secretora está ligado de forma funcional ao ADN de um polipéptido caso seja expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou amplificador está ligado de forma funcional a uma sequência codificante caso afecte a transcrição da sequência; ou um local de ligação do ribossoma está ligado de forma funcional a uma sequência codificante caso esteja posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado de forma funcional" significa que as sequências de ADN que estão a ser ligadas são contíguas e, no caso de uma sequência "leader" secretora, contíguas e em fase de leitura. Os amplificadores, contudo, não precisam de ser contíguos. A união é obtida mediante ligação ao nível de locais de restrição convenientes. Se estes locais não 55 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ existirem, utilizam-se adaptadores oligonucleotidicos sintéticos de acordo com as práticas convencionais. A "estringência" das reacções de hibridação é facilmente determinável por um perito na técnica e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, da temperatura de lavagem e da concentração de sal. Em geral, as sondas mais compridas requerem temperaturas mais elevadas para um emparelhamento correcto, ao passo que as sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação geralmente depende da capacidade do ADN desnaturado para reemparelhar quando estão presentes cadeias complementares num determinado ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto mais elevado for o grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, mais elevada é a temperatura relativa que pode ser utilizada. Assim, resulta daqui que temperaturas relativas mais elevadas teriam tendência para tornar as condições da reacção mais estringentes, ao passo que temperaturas mais baixas as tornariam menos estringentes. Para obter detalhes adicionais e uma explicação da estringência das reacções de hibridação, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
As "condições estringentes" ou as "condições de estringência elevada", como aqui definidas, poderão ser identificadas como aquelas que: (1) utilizam uma força iónica baixa e uma temperatura elevada para a lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecilsulfato de sódio a 0,1% a 50°C; (2) utilizam um agente desnaturante, como a formamida, durante a hibridação, por exemplo, formamida a 50% (v/v) contendo albumina sérica de bovino a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0, 1%/tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) hibridação durante a noite numa solução que utiliza formamida a 50%, SSC 5x (NaCl 0,75 M; citrato de sódio 0, 075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%; solução de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml) , SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com uma lavagem durante 10 minutos a 42°C em SSC 0,2x (cloreto de sódio/citrato de sódio) , seguida de uma lavagem durante 10 56 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ minutos em condições de estringência elevada consistindo em SSC 0,lx contendo EDTA a 55°C.
As "condições moderadamente estringentes" poderão ser identificadas como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de condições de hibridação e da solução de lavagem (por exemplo, temperatura, força iónica e %SDS) menos estringentes que aquelas descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é a incubação durante a noite a 37°C, numa solução compreendendo: formamida a 20%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão cisalhado e desnaturado 20 mg/ml, seguida de lavagem dos filtros em SSC lx a cerca de 37-50°C. O perito reconhecerá como ajustar a temperatura, a força iónica, etc. conforme necessário para acomodar factores como o comprimento da sonda e factores similares. 0 termo "com uma marca epitópica", quando aqui utilizado, refere-se a um polipéptido quimérico que compreende um polipéptido TAT ou um anticorpo anti-TAT fundido com uma "marca polipeptidica". A marca polipeptidica possui resíduos suficientes para fornecer um epitopo contra o qual é possível produzir um anticorpo, mas é suficientemente curta de modo a não interferir com a actividade do polipéptido com o qual está fundida. A marca polipeptidica é também de preferência bastante singular, para que o anticorpo não reaja substancialmente de forma cruzada com outros epitopos. As marcas polipeptídicas adequadas possuem geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e, normalmente, entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácidos (preferencialmente, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos). "Activo" ou "actividade", para efeitos desta descrição, refere-se a forma(s) de um polipéptido TAT que retêm uma actividade biológica e/ou uma actividade imunológica do polipéptido TAT nativo ou de ocorrência natural, em que uma actividade "biológica" refere-se a uma função biológica (inibidora ou estimuladora) causada por um TAT nativo ou de 57 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ocorrência natural diferente da capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigénico detido por um TAT nativo ou de ocorrência natural, e uma actividade "imunológica" refere-se à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigénico detido por um TAT nativo ou de ocorrência natural. O termo "antagonista" é utilizado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza, parcial ou totalmente, uma actividade biológica de um polipéptido TAT nativo aqui descrito. De modo idêntico, o termo "agonista" é utilizado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que mimetiza uma actividade biológica de um polipéptido TAT nativo aqui descrito. As moléculas agonistas ou antagonistas adequadas incluem especificamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes da sequência de aminoácidos de polipéptidos TAT nativos, péptidos, oligonucleótidos anti-senso, moléculas orgânicas pequenas, etc. agonistas ou antagonistas. Os métodos para identificar agonistas ou antagonistas de um polipéptido TAT poderão compreender o contacto de um polipéptido TAT com uma molécula agonista ou antagonistas candidata e a medição de uma alteração detectável em uma ou mais actividades biológicas normalmente associadas ao polipéptido TAT. "Tratar" ou "tratamento" ou "alivio" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profilácticas ou preventivas, em que o objectivo consiste em prevenir ou retardar (atenuar) a condição ou perturbação patológica visada. Os indivíduos necessitados de tratamento incluem aqueles já com a perturbação, assim como aqueles propensos a ter a perturbação ou aqueles nos quais se pretende evitar a perturbação. Um sujeito ou mamífero é "tratado" com êxito relativamente a um cancro que expressa o polipéptido TAT se, após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo anti-TAT, de um oligopéptido de ligação a TAT ou de uma molécula orgânica de ligação a TAT de acordo com os métodos do presente invento, o doente mostrar uma redução observável e/ou mensurável nas seguintes condições ou a ausência de uma ou mais das seguintes condições: redução do número de células cancerosas ou ausência das células cancerosas; redução do tamanho do tumor; inibição (isto é, diminuição nalguma 58 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ extensão e preferencialmente paragem) da infiltração de células cancerosas nos órgãos periféricos, incluindo a disseminação do cancro para o tecido mole e o osso; inibição (isto é, diminuição nalguma extensão e preferencialmente paragem) da metástase do tumor; inibição, nalguma extensão, do crescimento do tumor; e/ou alivio, nalguma extensão, de um ou mais dos sintomas associados ao cancro especifico; morbidade e mortalidade reduzidas e melhoria em questões de qualidade de vida. Na medida em que poderá impedir o crescimento e/ou matar as células cancerosas existentes, o anticorpo anti-TAT ou o oligopéptido de ligação a TAT poderá ser citostático e/ou citotóxico. A redução destes sinais ou sintomas também poderá ser sentida pelo doente.
Os parâmetros referidos acima para avaliar o sucesso do tratamento e a melhoria da doença são facilmente mensuráveis através de procedimentos de rotina familiares para o médico. No caso da terapia do cancro, a eficácia pode ser medida, por exemplo, avaliando o tempo de progressão da doença (TPD) e/ou determinando a velocidade de resposta (VR). A metástase pode ser determinada através de testes de determinação do estágio, scan ósseo e testes do nivel de cálcio e de outras enzimas para determinar a disseminação para o osso. Também é possível efectuar exames de TC para pesquisar uma disseminação para a pélvis e para os gânglios linfáticos na área. As radiografias do peito e a medição dos níveis das enzimas hepáticas por métodos conhecidos são utilizadas para pesquisar a existência de metástase para os pulmões e para o fígado, respectivamente. Outros métodos de rotina para monitorizar a doença incluem a ultra-sonografia transrectal (CTRUS) e a biopsia transrectal com agulha.
No caso do cancro da bexiga, que é um cancro mais localizado, os métodos para determinar o progresso da doença incluem a avaliação citológica urinária por citoscopia, a monitorização da presença de sangue na urina, a visualização do trato do urotélio por sonografia ou um pielograma intravenoso, a tomografia computorizada (TC) e a ressonância magnética (RM) . A presença de metástases distantes pode ser avaliada por TC do abdómen, radiografias ao peito ou imagiologia do esqueleto utilizando radionuclidos. 59 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Administração "crónica" refere-se à administração do(s) agente(s) de um modo continuo em oposição a um modo agudo, de forma a manter o efeito terapêutico inicial (actividade) durante um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é efectuado consecutivamente sem interrupção, tendo antes uma natureza cíclica. "Mamífero" para efeitos do tratamento, alívio dos sintomas ou diagnóstico de um cancro refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo os seres humanos, os animais domésticos e de quinta e os animais de zoo, desportivos ou de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. Preferencialmente, o mamífero é um ser humano.
Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concomitante) e consecutiva por qualquer ordem.
Os "veículos", tal como o termo é aqui utilizado, incluem veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou mamífero exposto a eles, nas doses e concentração empregues. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa tamponada em termos de pH. Os exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas como a albumina sérica, a gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como a polivinilpirrolidona; aminoácidos como a glicina, a glutamina, a asparagina, a arginina ou a lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono, incluindo a glucose, a manose ou as dextrinas; agentes quelantes como o EDTA; açúcares-álcoois como o manitol ou o sorbitol; contra-iões que formam sais como o sódio; e/ou tensioactivos não iónicos como TWEEN®, o polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS®.
Por "fase sólida" ou "suporte sólido" pretende designar-se uma matriz não aquosa à qual um anticorpo, um oligopéptido 60 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT do presente invento pode aderir ou ligar-se. Os exemplos de fases sólidas aqui englobadas incluem aquelas constituídas, parcial ou integralmente, por vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polissacáridos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em determinadas concretizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; em outras, é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia de afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, como sejam aquelas descritas na Patente U.S. n.° 4,275,149.
Um "lipossoma" é uma pequena vesícula constituída por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivo que é útil para a entrega de um fármaco (como um polipéptido TAT, um anticorpo para ele ou um oligopéptido de ligação a TAT) a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão normalmente dispostos numa formação de bicamada, semelhante à disposição dos lípidos das membranas biológicas.
Uma molécula "pequena" ou molécula orgânica "pequena" é aqui definida como tendo um peso molecular inferior a cerca de 500 Daltons.
Uma "quantidade eficaz" de um polipéptido, anticorpo, oligopéptido de ligação a TAT, molécula orgânica de ligação a TAT ou de um agonista ou antagonista destes, como aqui descrito, é uma quantidade suficiente para realizar um objectivo especificamente expresso. Uma "quantidade eficaz" poderá ser determinada empiricamente e de uma forma rotineira em relação ao objectivo expresso. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo, polipéptido, oligopéptido de ligação a TAT, molécula orgânica de ligação a TAT ou outro fármaco eficaz para "tratar" uma doença ou perturbação num sujeito ou mamífero. No caso do cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco poderá reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, retardar nalguma extensão e preferencialmente parar) a 61 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ infiltração das células cancerosas nos órgãos periféricos; inibir (isto é, retardar nalguma extensão e preferencialmente parar) a metástase do tumor; inibir, nalguma extensão, o crescimento do tumor; e/ou aliviar nalguma extensão um ou mais dos sintomas associados ao cancro. Ver a definição aqui apresentada de "tratar". Na medida em que poderá impedir o crescimento e/ou matar as células cancerosas existentes, o fármaco poderá ser citostático e/ou citotóxico.
Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um anticorpo anti-TAT, um polipéptido TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente um tumor, por exemplo, uma célula cancerosa, quer in vitro quer in vivo. Uma "quantidade inibidora do crescimento" de um anticorpo anti-TAT, um polipéptido TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT para efeitos de inibição do crescimento das células neoplásicas poderá ser determinada empiricamente e de forma rotineira.
Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-TAT, um polipéptido TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente um tumor, por exemplo, uma célula cancerosa, quer in vitro quer in vivo. Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo anti-TAT, um polipéptido TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT para efeitos de inibição do crescimento das células neoplásicas poderá ser determinada empiricamente e de forma rotineira. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e abrange especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-TAT individuais (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes), composições de anticorpos anti-TAT com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos anti-TAT de cadeia única e fragmentos de anticorpos anti-TAT (ver abaixo) desde que apresentem a actividade biológica ou imunológica desejada. 0 termo "imunoglobulina" (Ig) é aqui utilizado indistintamente de anticorpo. 62 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações terapêuticas ou de diagnóstico do anticorpo e poderão incluir enzimas, hormonas e outros solutos de natureza proteica ou não proteica. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) para um nível superior a 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry e, mais preferencialmente, mais de 99% em peso, (2) até um qrau suficiente para fornecer pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal através de utilização de um sequenciador de copo qiratório ou (3) até à homoqeneidade por SDS-PAGE, em condições redutoras ou não redutoras, utilizando o corante azul de Coomassie ou, de preferência, prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. A unidade básica de 4 cadeias do anticorpo é uma glicoproteína heterotetramérica constituída por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 unidades heterotetraméricas básicas juntamente com um polipéptido adicional denominado cadeia J e, por conseguinte, contém 10 locais de ligação do antigénio, ao passo que os anticorpos IgA segregados podem polimerizar-se para formar conjuntos polivalentes compreendendo 2-5 unidades básicas de 4 cadeias juntamente com a cadeia J) . No caso das IgG, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H através de uma ligação dissulfureto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas uma à outra por meio de uma ou mais ligações dissulfureto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada uma das cadeias H e L possui também pontes de dissulfureto intracadeia a intervalos regulares. Cada cadeia H tem, ao nível da extremidade N-terminal, um domínio variável (VH), seguido de três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e de quatro domínios CH para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L possui, ao 63 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ nível da extremidade N-terminal, um domínio variável (VL) seguido de um domínio constante (CL) na sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH, e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Crê-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O emparelhamento de um VH com um VL forma um único local de ligação do antigénio. Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Ten e Tristram G. Parslow.(eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 & Chapter 6. A cadeia L de qualquer espécie vertebrada pode ser atribuída a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas (CH) , as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, possuindo cadeias pesadas designadas por α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As classes γ e α são adicionalmente divididas em subclasses com base em diferenças relativamente secundárias na sequência e função de CH; por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. O termo "variável" refere-se ao facto de determinados segmentos dos domínios variáveis diferirem consideravelmente em termos de sequência entre os anticorpos. 0 domínio V medeia a ligação do antigénio e define a especificidade de um anticorpo particular para o seu antigénio particular. Contudo, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo da extensão de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes denominados regiões de estrutura (FR de "framework region") com 15-30 aminoácidos, separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade designadas por "regiões hipervariáveis" que têm, cada uma, 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas compreendem, cada um, quatro FR, que adoptam essencialmente uma configuração de folha β, ligadas 64 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ por três regiões hipervariáveis, que formam voltas ligando, e em alguns casos fazendo parte da, estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas e próximas pelas FR e, juntamente com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação do antigénio dos anticorpos (consultar Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão directamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tal como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). O termo "região hipervariável", quando aqui utilizado, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antigénio. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (de "Complementarity Determining Region") (por exemplo, à volta aproximadamente dos resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) em VL e à volta aproximadamente dos resíduos 1-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) em VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "volta hipervariável" (por exemplo, os resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) em VL e os resíduos 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) em VH;
Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987). O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos exceptuando possíveis mutações naturais que poderão estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos 65 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ monoclonais são vantajosos na medida em que poderão ser sintetizados sem contaminação por outros anticorpos. O modificador "monoclonal" não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis no presente invento poderão ser preparados através da metodologia do hibridoma inicialmente descrita por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou poderão ser preparados utilizando métodos de ADN recombinante em células bacterianas, animais ou vegetais eucarióticas (ver, por exemplo, Patente U.S. n.° 4,816,567). Os "anticorpos monoclonais" também poderão ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos, utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e
Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais neste fascículo incluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a, ou homóloga de, sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, ao passo que o resto da(s) cadeia(s) é idêntico a, ou homólogo de, sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos destes anticorpos, desde que apresentem a actividade biológica desejada (ver Patente U.S. n.° 4, 816, 567; e Morrison et al. , Proc. Netl Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesse aqui incluem os anticorpos "primatizados", que compreendem sequências de ligação do antigénio do domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, o macaco do Velho Mundo, o simióide, etc.) e sequências da região constante humanas.
Um anticorpo "intacto" é um anticorpo que compreende um local de ligação do antigénio, bem como uma CL e pelo menos os domínios constantes da cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes poderão ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou uma sua variante ao nível da 66 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ sequência de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções efectoras.
Os "fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente a região variável ou de ligação do antigénio do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; "diabodies"; anticorpos lineares (ver Patente U.S. n.° 5, 641, 870, Exemplo 2; Zapataet al., Protein.Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão com papaina dos anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação do antigénio, denominados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflecte a capacidade de cristalizar facilmente. O fragmento Fab consiste numa cadeia L completa, juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH) e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1) . Cada fragmento Fab é monovalente no que diz respeito à ligação do antigénio, isto é, possui um único local de ligação do antigénio. O tratamento com pepsina de um anticorpo origina um único fragmento F(ab')2 grande, que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab unidos por ligações dissulfureto, com uma actividade de ligação do antigénio divalente e que ainda é capaz de reticular o antigénio. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pelo facto de terem alguns resíduos adicionais na extremidade carboxi do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui utilizada para um Fab' no qual o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes transportam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas da dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos. O fragmento Fc compreende as porções carboxi-terminais de ambas as cadeias H, mantidas juntas por meio de ligações dissulfureto. As funções efectoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, região esta que é 67 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ também a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos de células. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento e de ligação do antigénio. Este fragmento consiste num dímero do domínio da região variável de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve em associação firme e não covalente. A partir do enrolamento destes dois domínios emanam seis voltas hipervariáveis (3 voltas de cada uma das cadeias H e L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para a ligação do antigénio e conferem a especificidade de ligação do antigénio ao anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antigénio, embora com uma afinidade mais baixa que o local de ligação completo.
Os fragmentos "Fv de cadeia única", também abreviados como "sFv" ou "scFv", são fragmento de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL do anticorpo ligados numa única cadeia polipeptídica. Preferencialmente, o polipéptido sFv compreende adicionalmente um adaptador polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o fragmento sFv forme a estrutura desejada para a ligação do antigénio. Para consultar uma revisão sobre sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, abaixo. 0 termo "diabodies" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo preparados através da construção de fragmentos sFv (ver o parágrafo anterior) com adaptadores curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL, de modo a obter um emparelhamento intercadeia, mas não intracadeia dos domínios V, o que resulta num fragmento bivalente, isto é, um fragmento que possui dois locais de ligação do antigénio. Os "diabodies" biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv "entrecruzados", em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias polipeptídicas. Os "diabodies" estão descritos mais integralmente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e 68 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Na maioria dos casos, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador), como seja o ratinho, o rato, o coelho ou um primata não humano, com a capacidade, a afinidade e a especificidade do anticorpo desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados poderão compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo receptor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá praticamente a totalidade de pelo menos um e, normalmente, dois domínios variáveis, em que todas ou praticamente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana, e todas ou praticamente todas as FR são as da sequência de uma imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma porção da região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana. Para obter pormenores adicionais, consultar Jones et al., Nature 321:622-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323- 329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) .
Um "anticorpo dependente da espécie", por exemplo, um anticorpo de mamífero anti-IgE humana, é um anticorpo que possui uma afinidade de ligação mais forte para um antigénio de uma primeira espécie de mamífero do que para um homólogo desse antigénio de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie "liga-se especificamente" a um antigénio humano (isto é, possui um valor de afinidade de ligação (Kd) não superior a cerca de 1 x IO-7 M, preferencialmente não superior a cerca de 1 x 1CT8 69 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ e, mais preferencialmente, não superior a cerca de 1 x 10“9 M) , mas possui uma afinidade de ligação para um homólogo do antigénio de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de 50x, ou pelo menos cerca de 500x, ou pelo menos cerca de lOOOx, mais fraca que a sua afinidade de ligação para o antigénio humano. O anticorpo dependente da espécie pode ser qualquer um dos vários tipos de anticorpos conforme definidos acima, mas preferencialmente é um anticorpo humanizado ou humano.
Um "oligopéptido de ligação a TAT" é um oligopéptido que se liga, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito. Os oligopéptidos de ligação a TAT poderão ser sintetizados quimicamente utilizando uma metodologia de síntese de oligopéptidos conhecida, ou poderão ser preparados e purificados utilizando a tecnologia recombinante. Os oligopéptidos de ligação a TAT têm geralmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos de comprimento, em alternativa pelo menos cerca de 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 3, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 94, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimento ou mais, em que estes oligopéptidos são capazes de se ; ligar, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito. Os oligopéptidos de ligação a TAT poderão ser identificados sem necessidade de uma experimentação excessiva, utilizando técnicas bem conhecidas. Neste sentido, salienta-se que as técnicas para rastrear bibliotecas de oligopéptidos quanto a oligopéptidos que são capazes de se ligar especificamente a um polipéptido-alvo são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. n.° 5, 556, 762, 5, 750, 373, 4,708,871, 4, 833, 092, 5, 223, 409,
5,403,484, 5,571,1589, 5,663,143; Publicação PCT n.° WO 84/03506 e WO84/03564; Geysen et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad.
Sei. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schools et al., J.
Immunol., 140:611-616 (1988); Cwirla, S. E. et al. (1990) 70 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al.(1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991)
Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363; e Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
Uma "molécula orgânica de ligação a TAT" é uma molécula orgânica diferente de um oligopéptido ou de um anticorpo como aqui definidos que se liga, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito. As moléculas orgânicas de ligação a TAT poderão ser identificadas e sintetizadas quimicamente utilizando uma metodologia conhecida (ver, por exemplo, as Publicações PCT n.os WO00/00823 e WOOO/39585). As moléculas orgânicas de ligação a TAT têm geralmente um tamanho inferior a cerca de 2.000 daltons, em alternativa inferior a cerca de 1.500, 750, 500, 250 ou 200 daltons, em que estas moléculas orgânicas que são capazes de se ligar, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito poderão ser identificadas sem necessidade de uma experimentação excessiva, utilizando técnicas bem conhecidas. Neste sentido, salienta-se que as técnicas para rastrear bibliotecas de moléculas orgânicas quanto a moléculas que são capazes de se ligar a um polipéptido-alvo são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, as Publicações PCT n.os WO00/00823 e WO00/3958S).
Um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica "que se liga" a um antigénio de interesse, por exemplo, um alvo antigénico polipeptidico associado a um tumor, é uma espécie que se liga ao antigénio com uma afinidade suficiente para que o anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica seja útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico para visar a célula ou tecido que expressa o antigénio, e não reage significativamente de modo cruzado com outras proteínas. Nestas concretizações, a extensão da ligação do anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica a uma proteína "não alvo" será inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica à sua proteína-alvo particular, conforme determinado por análise de separação de células activadas por fluorescência (FACS) ou por radioimunoprecipitação (RIA) . No que diz respeito à 71 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ligação de um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica a uma molécula-alvo, o termo "ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um polipéptido particular ou um epitopo num alvo polipeptídico particular designa uma ligação que é mensuravelmente diferente de uma interacção não específica. Uma ligação específica pode ser medida, por exemplo, por determinação da ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula de controlo, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não possui actividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada através de competição com uma molécula de controlo que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso do alvo não marcado. Neste caso, a existência de ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida de forma competitiva pelo excesso de alvo não marcado. O termo "ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um polipéptido particular ou um epitopo num alvo polipeptídico particular, como aqui utilizado, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula possuindo um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 1CT4 M, em alternativa pelo menos cerca de 1CT5 M, em alternativa pelo menos cerca de IO”6 M, em alternativa pelo menos cerca de 10”7 M, em alternativa pelo menos cerca de IO”8 M, em alternativa pelo menos cerca de 10”9 M, em alternativa pelo menos cerca de IO”10 M, em alternativa pelo menos cerca de 10”11 M, em alternativa pelo menos cerca de 10”12 M ou superior. Numa concretização, o termo "ligação específica" refere-se a uma ligação em que uma molécula liga-se a um polipéptido particular ou um epitopo num polipéptido particular, sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipéptido ou epitopo num polipéptido.
Um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica que "inibe o crescimento de células tumorais que expressam um polipéptido TAT" ou um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica "inibidor do crescimento" é uma espécie que resulta numa inibição mensurável do crescimento de células cancerosas que expressam ou sobreexpressam o polipéptido TAT apropriado. 0 polipéptido TAT poderá ser um polipéptido transmembranar expresso na superfície de uma célula cancerosa ou poderá ser um polipéptido que é produzido e segregado por uma célula cancerosa. Os anticorpos anti-TAT, oligopéptidos 72 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ou moléculas orgânicas inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células tumorais que expressam TAT em mais de 20%, preferencialmente entre cerca de 20% e cerca de 50%, e ainda mais preferencialmente em mais de 50% (por exemplo, entre cerca de 50% e cerca de 100%) em comparação com o controlo apropriado, em que o controlo são normalmente células tumorais não tratadas com o anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica que está a ser testado. Numa concretização, a inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 pg/ml ou de cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, em que a inibição do crescimento é determinada 1-10 dias após a exposição das células tumorais ao anticorpo. A inibição do crescimento das células tumorais in vivo pode ser determinada de várias formas, tal como descrito na secção de exemplos experimentais abaixo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo se a administração do anticorpo anti-TAT, numa quantidade de cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, resultar em redução do tamanho do tumor ou da proliferação das células tumorais no espaço de cerca de 5 dias a 3 meses desde a primeira administração do anticorpo, preferencialmente no espaço de cerca de 5 a 30 dias.
Um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica que "induz a apoptose" é uma espécie que induz a morte celular programada, tal como determinada por ligação de anexina V, fragmentação do ADN, contracção das células, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação das células e/ou formação de vesículas membranares (denominadas corpos apoptóticos) . A célula é geralmente uma célula que sobreexpressa um polipéptido TAT. Preferencialmente, a célula é uma célula tumoral, por exemplo, uma célula da próstata, mama, ovário, estômago, endométrio, pulmão, rim, cólon e bexiga. Estão disponíveis vários métodos para avaliar os eventos celulares associados à apoptose. Por exemplo, a translocação da fosfatidilserina (PS) pode ser medida por meio da ligação de anexina; a fragmentação do ADN pode ser avaliada através de "DNA laddering"; e a condensação nuclear/cromatina juntamente com a fragmentação do ADN podem ser avaliadas por meio de qualquer aumento das células hipodiplóides. De preferência, o anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica que induz a apoptose é uma espécie 73 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ que resulta numa indução de cerca de 2 a 50x, preferencialmente cerca de 5 a 50x, mais preferencialmente cerca de 10 a 50x, da ligação de anexina em relação a uma célula não tratada, num ensaio de ligação de anexina.
As "funções efectoras" dos anticorpos referem-se aquelas actividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc de uma variante da sequência de aminoácidos) de um anticorpo e variam com o isotipo do anticorpo. Os exemplos de funções efectoras dos anticorpos incluem: a ligação de Clq e a citotoxicidade dependente do complemento; a ligação ao receptor Fc; a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC); a fagocitose; a regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor das células B) ; e a activação das células B. A "citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que a Ig segregada e ligada a receptores Fc (FcR) presentes em determinadas células citotóxicas (por exemplo, as células assassinas naturais (NK), os neutrófilos e os macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula-alvo portadora de um antigénio e subsequentemente matem a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para esta morte. As células primárias para mediar a ADCC, as células NK, expressam apenas o receptor FcyRIII, ao passo que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3, página 464, de Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse, é possível realizar um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente US n.° 5,500,362 ou 5,821,337. As células efectoras úteis para estes ensaios incluem as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e as células assassinas naturais (NK) . Em alternativa, ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse poderá ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal como aquele descrito em Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998). 74 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ Ο termo "receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um receptor que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo as variantes alélicas e as formas resultantes de excisão-reparação alternativa destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de activação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), os quais têm sequências de aminoácidos similares que diferem essencialmente nos seus domínios citoplasmáticos. 0 receptor de activação FcyRIIA contém um motivo de activação dos imunorreceptores baseado em tirosina (ITAM de "Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif") no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição dos imunorreceptores baseado em tirosina (ITIM de "Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif") no seu domínio citoplasmático (ver revisão em M. Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcR estão revistos em Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med, 126:330-41 (1995). Outros FcR, incluindo aqueles que serão identificados no futuro, estão abrangidos pelo termo "FcR" aqui utilizado. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
As "células efectoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcR e desempenham uma função efectora. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham a função efectora ADCC. Os exemplos de leucócitos humanos que medeiam a ADCC incluem as células mononucleares do sangue periférico (PBMC), as células assassinas naturais (NK), os monócitos, as células T citotóxicas e os neutrófilos, em que as células PBMC e as células NK são preferidas. As células efectoras poderão ser isoladas a partir de uma fonte nativa, por exemplo, a partir do sangue. A "citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula-alvo na presença de complemento. A activação da via do complemento clássica é 75 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada) que estão ligados ao seu antigénio cognato. Para avaliar a activação do complemento, poderá realizar-se um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por um crescimento celular desregulado. Os exemplos de cancro incluem, embora não estejam limitados a estes, o carcinoma, o linfoma, o blastoma, o sarcoma e a leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares destes cancros incluem o cancro das células escamosas (por exemplo, o cancro das células epiteliais escamosas), o cancro do pulmão, incluindo o cancro do pulmão de pequenas células, o cancro do pulmão de não pequenas células, o adenocarcinoma do pulmão e o carcinoma escamoso do pulmão, o cancro do peritoneu, o carcinoma hepatocelular, o cancro gástrico ou do estômago, incluindo o cancro gastrintestinal e o cancro do pâncreas, o glioblastoma, o cancro cervical, o cancro do ovário, o cancro do fígado, o cancro da bexiga, o cancro do trato urinário, o hepatoma, o cancro da mama, o cancro do cólon, o cancro do recto, o cancro colo-rectal, o carcinoma do endométrio ou uterino, o carcinoma das glândulas salivares, o cancro dos rins ou renal, o cancro da próstata, o cancro da vulva, o cancro da tiróide, o carcinoma hepático, o carcinoma anal, o carcinoma do pénis, o melanoma, o mieloma múltiplo e o linfoma das células B, o cancro do cérebro, assim como o cancro da cabeça e pescoço e metástases associadas.
Os termos "perturbação proliferativa celular" e "perturbação proliferativa" referem-se a perturbações que estão associadas a algum grau de proliferação celular anómala. Numa concretização, a perturbação proliferativa celular é um cancro. O termo "tumor", como aqui utilizado, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, seja ele maligno ou benigno, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. 76 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica que "induz a morte celular" é uma espécie que faz com que uma célula viável passe a ser não viável. A célula é uma célula que expressa um polipéptido TAT, preferencialmente uma célula que sobreexpressa um polipéptido TAT em comparação com uma célula normal do mesmo tipo de tecido. 0 polipéptido TAT poderá ser um polipéptido transmembranar expresso na superfície de uma célula cancerosa ou poderá ser um polipéptido que é produzido e segregado por uma célula cancerosa. Preferencialmente, a célula é uma célula cancerosa, por exemplo, uma célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas ou bexiga. A morte celular in vitro poderá ser determinada na ausência de complemento e de células efectoras imunológicas para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) ou por citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Assim, o ensaio de morte celular poderá ser realizado utilizando soro inactivado termicamente (isto é, na ausência de complemento) e na ausência de células efectoras imunológicas. Para determinar se o anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica é capaz de induzir morte celular, a perda de integridade da membrana, tal como avaliada por captação de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) ou 7AAD, pode ser avaliada em relação a células não tratadas. Os anticorpos, oligopéptidos ou outras moléculas orgânicas indutores de morte celular preferidos são aqueles que induzem a captação de PI no ensaio de captação de PI em células BT474.
Uma "célula que expressa TAT" é uma célula que expressa um polipéptido TAT endógeno ou transfectado, seja na superfície da célula ou numa forma segregada. Um "cancro que expressa TAT" é um cancro compreendendo células que têm um polipéptido TAT presente na superfície da célula ou que produzem e segregam um polipéptido TAT. Um "cancro que expressa TAT" produz opcionalmente níveis suficientes de polipéptido TAT na superfície das suas células, de modo que um anticorpo anti-TAT, oligopéptido ou outra molécula orgânica pode ligar-se a ele e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro. Em outra concretização, um "cancro que expressa TAT" produz e segrega opcionalmente níveis 77 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ suficientes de polipéptido TAT, de modo que um anticorpo anti-TAT, oligopéptido ou outra molécula orgânica antagonista pode ligar-se a ele e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro. No que diz respeito a este último, o antagonista poderá ser um oligonucleótidos anti-senso que reduz, inibe ou previne a produção e secreção do polipéptido TAT segregado pelas células tumorais. Um cancro que "sobreexpressa" um polipéptido TAT é um cancro que apresenta níveis significativamente mais elevados do polipéptido TAT na sua superfície celular, ou produz e segrega, em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Esta sobreexpressão poderá ser causada por uma amplificação do gene ou por um aumento da transcrição ou da tradução. A sobreexpressão do polipéptido TAT poderá ser determinada num ensaio de diagnóstico ou de prognóstico, avaliando os níveis acrescidos da proteína TAT presente na superfície de uma célula ou segregada pela célula (por exemplo, através de um ensaio de imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-TAT preparados contra um polipéptido TAT isolado, que poderá ser preparado com recurso a tecnologia de ADN recombinante a partir de um ácido nucleico isolado que codifica o polipéptido TAT; análise FACS, etc.). Em alternativa, ou adicionalmente, é possível medir os níveis do ácido nucleico que codifica o polipéptido TAT ou ARNm na célula, por exemplo, através de hibridação in situ fluorescente utilizando uma sonda à base de ácido nucleico correspondente a um ácido nucleico que codifica TAT ou ao seu complemento (FISH; ver W098/45479 publicada em Outubro de 1998), análise de transferência de Southern, análise de transferência de Northern ou técnicas de reacção em cadeia da polimerase (PCR), como a reacção de PCR quantitativa em tempo real. A sobreexpressão do polipéptido TAT também poderá ser estudada através de medição do antigénio solto num fluido biológico, como o soro, por exemplo, utilizando ensaios à base de anticorpos (ver também, por exemplo, Patente U.S. n.° 4,933,294 concedida em 12 de Junho de 1990; WO 91/05264 publicada em 18 de Abril de 1991; Patente U.S. 5,401,638 concedida em 28 de Março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Além dos ensaios referidos acima, estão disponíveis vários ensaios in vivo para os peritos. Por exemplo, células no corpo do doente poderão ser expostas a um anticorpo que está opcionalmente marcado com um marcador 78 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ detectável, por exemplo, um isótopo radioactivo, e a ligação do anticorpo a células presentes no doente pode ser avaliada, por exemplo, através de tomografia externa para detecção de radioactividade ou de análise de uma biopsia recolhida a partir de um doente previamente exposto ao anticorpo.
Tal como aqui utilizado, o termo "imunoadesina" designa moléculas idênticas a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras dos domínios constantes de uma imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada, que é diferente do local de reconhecimento e ligação do antigénio de um anticorpo (isto é, é "heterólogo"), com uma sequência do domínio constante de uma imunoglobulina. A porção de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou ligando. A sequência do domínio constante de uma imunoglobulina na imunoadesina poderá ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 ou IgG-4, IgA (incluindo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD ou IgM. O termo "marcador", quando aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição detectável que está conjugado, directa ou indirectamente, com o anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica, de modo a gerar um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica "marcado". O marcador poderá ser ele próprio detectável (por exemplo, marcadores radioisotópicos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, poderá catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. O termo "agente citotóxico", como aqui utilizado, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou provoca a destruição das células. O termo pretende incluir isótopos radioactivos (por exemplo, Ar211, τ 131 τ 125 v90 π 186 ·~ 188 Ctv,153 π212 π32 Λ ι , ι , ι , Re , Re , Sm , Βι , Ρ e isotopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapêuticos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, 79 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ vimblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleoliticas, antibióticos, toxinas como as toxinas constituídas por pequenas moléculas ou as toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destas, e os vários agentes antitumorais ou anticancerosos descritos abaixo. Um agente tumoricida provoca a destruição das células tumorais.
Um "agente inibidor do crescimento", quando aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente de uma célula cancerosa que expressa TAT, quer ín vitro quer in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento poderá ser um agente que reduz significativamente a percentagem de células que expressam TAT na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em local diferente da fase S) , tais como os agentes que induzem bloqueio da fase G1 e bloqueio da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vimblastina), os taxanos e inibidores da topoisomerase II como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Aqueles agentes que bloqueiam a fase G1 também extravasam para bloqueio da fase S, por exemplo, agentes de alquilação do ADN como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Informação adicional pode ser encontrada em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente na página 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são ambos fármacos anticancerosos derivados da árvore teixo. O docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). O paclitaxel e o docetaxel promovem a reunião de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos ao impedir a despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células. 80 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ Α "doxorrubicina" é um antibiótico de antraciclina. O nome químico completo da doxorrubicina é (8S-cis)-10-[ (3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetra-hidro-6,8,ll-tri-hidroxi-8-(hidroxiacetil)-l-metoxi-5, 12-naftacenodiona. O termo "citocina" é um termo genérico para as proteínas libertadas por uma população de células que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos destas citocinas são as linfocinas, as monocinas e as hormonas polipeptídicas tradicionais. Incluídas entre as citocinas estão a hormona de crescimento, como a hormona de crescimento humano, a N-metionil-hormona de crescimento humano e a hormona de crescimento bovino; a hormona paratiroideia; a tiroxina; a insulina; a proinsulina; a relaxina; a prorrelaxina; as hormonas glicoproteicas como a hormona folículo-estimulante (FSH), a hormona estimulante da tiróide (TSH) e a hormona luteinizante (LH); o factor de crescimento hepático; o factor de crescimento fibroblástico; a prolactina; o lactogénio placentário; o factor de necrose tumoral α e β; a substância inibidora Mulleriana; o péptido associado à gonadotrofina de ratinho; a inibina; a activina; o factor de crescimento endotelial vascular; a integrina; a trombopoietina (TPO); factores de crescimento nervoso como o NGF-β; factor de crescimento plaquetário; factores de crescimento transformantes (TGF) como TGF-α e TGF-β; factor de crescimento do tipo insulina I e II; eritropoietina (EPO); factores osteoindutivos; interferões como o interferão α, β e γ; factores de estimulação de colónias (CSF) como o CSF de macrófagos (M-CSF), o CSF de granulócitos-macrófagos (G;-CSF) e o CSF de granulócitos (G-CSF) ; as interleucinas (IL) como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; um factor de necrose tumoral como TNF-α ou TNF-β; e outros factores polipeptídicos incluindo LIF e o ligando Kit (KL) . Tal como aqui utilizado, o termo citocina inclui proteínas provenientes de fontes naturais ou da cultura de células recombinantes, bem como equivalentes biologicamente activos das citocinas de sequência nativa. 81 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ Ο termo "folheto incluído na embalagem" é utilizado para designar as instruções habitualmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, posologia, administração, contra-indicações e/ou avisos referentes à utilização destes produtos terapêuticos.
Tabela 1 /*
* C-C increased firam 12 (o 15 ZisaverageofEQ
* B * averoge of ND * nntcb with stap is M; sltpmp = 0; J (jota·) nutCb · O */
McRdc _M ^ /* vahie of a matcb witli α stop V inl dayPe][2í] = { /· ABCDEFGK1JKLMNOPQRSTUVWXYZV /· A */ { 2.0.-2,0. 0.-4.1.-1.-1.0.-1,-2.-1. 0._M. I, 0.-2, 1.1,0.0.-6.0.-3.0). /•BV { 0.3.-4,3.2,-S, 0.1.-2.0.0.-3.-2. 2._M.-I.1.0.0, 0. 0. 2.-5.0.-3, l}. /* C V {-2.-4,15,-5.-5.-4,-3.-3.-2.0,-S.-6.-5,-4,_M.-3,.S,-4.0.-2.0.-2.·*. 0.0.-3}. /* D V { 0. 3,-5,4. 3,-6.1. 1.-2. 0.0.-4.-3.2._M.-1.2.-1.0.0. 0.-2,-7.0,-4,2), /· E */ { 0.2.-5. 3.4.-5. 0. 1.-2,0.0.-3.-2. IJM.-1.2,-1.0.0, 0.-2.-7.0.-4,3>. /» F ·/ {-4.-5.-4.-6.-5, 9.-3.-2. 1,0.-5.2. 0.-4,_M.-S,-5,-4,-3,-3,0,-1.0.0.7.-5}. /* G V { 1.0.-3,1.0.-5.3.-2,-3,0.-2M.-3.0._M.-l.-l.-3.1.0.0.-1.-7.0.-3.0}. /* H *V {-I. 1.-3. 1. 1,-2,-2.6.-2,0.0.-2,-2,2,_M. 0. 3.2.-1,-1.0.-2.-3.0.0,2>. /* I ·/ {-I .-2.-2,-2.-2, 1.-3,-2.5.0,-2.2. Z.-2._M.-2,-2,-2.-l. 0.0,4.-5.0.-I.-2). ri’i { o. o. o. o, o. o. o, o. o. o. o. o. o. o,_m. o. o, o, o. o. o. o. o. o. o, o}. /· K ·/ {-1, 0,-S, 0. 0.-5,-2,0.-2.0.5.-3.0.1._M.-l. 1. 3.0.0.0.-2,-3.0.-4,0). /· L V {-2,-3.-6,-4,-3,2.-4.-2.2.0.-3. 6. 4.-3, M.-3.-2.-3.-3.-1.0.2,-2.0.-1.-2). /· M */ {-1.-2.-S.-3.-2. 0.-3,-2, 2.0.0,4,6,-2._M,-2.-l. 0.-2.·!. 0.2,-4.0,-2.-1}. /· N ·/ { 0. 2.-4. 2,1.-4. 0.2.-2, 0. 1.-3,-2,2,_M,-1, 1.0.1,0.0.-2.-4.0.-2.1}. /* 0 */ {_M, M,_M, Μ. Μ, Μ. Μ, Μ. Μ. Μ. Μ. Μ. Μ. M. 0, M._M. M._M._M. M,_M. M,_M,_M._M}. f P */ { 1.-T.-3.-1.-1 .-57-1 ,Õ.-270.-Ί ,-3T-2,-l.^M, 6, 0,0, l, 0, 0,-1,-6, 0,-5.0}. I*Q { 0. 1,-5, 2,2,-5,-1, 3,-2, 0, 1.-2,-1, 1,_M. 0.4. l.-l.-l, 0,-2,-5. 0,-4, 3}. t· R ·/ {-2. 0.-4,-1,-1.-4,-3, 2.-2,0, 3,-3. 0, 0, M, 0. 1.6,0,-1,0.-2. 2.0.-4.0}. l*S*t { 1.0, 0,0.0.-3. l.-l.-l. 0.0.-3,-2. l._M. l.-l, 0.2. 1.0.-1.-2, 0,-3.0}. /* T */ { 1.0,-2, 0.0.-3.0,-1.0.0. Ο,-Ι,-1.0,_M, O.-l.-l, 1, 3. 0,0,-5, 0,-3, 0), /· U ·/ { 0.0. 0, 0.0, 0, 0.0.0.0, 0,0, 0. 0. M. 0. 0.0.0.0.0,0.0, 0. 0,0). Ι·ν·1 { 0.-2.-2.-2,-2,-1,-1.-2, 4. 0.-2, 2. 2.-27 M,-1,-2,-2,-1.0, 0.4.-6.0.-2,-2}, /* »·' {-6,-5.-8.-7,-7.0.-7,-3.-5,0.-3.-2.-4.-4. M.-6.-5.2,-2.-5.0,-6.17, 0, 0.-6}, /· X ·/ { 0.0. 0.0. O. 0. 0, 0.0.0. O, O, 0. 0, M, 0.0,0,0,0. 0, 0,0.0.0.0}. /· Y *y {-3.-3.0,-4,-4. 7,-S, 0,-1, 0,-4,-1,-2.-2. M.-S,-4,-4.-3,-3,0.-2. 0,0.10.-4}. /· Z */ { 0.1,-5. 2, 3,-3,0.2.-2,0,0.-2,-1, 1,_M. 0. 3. 0.0,0,0,-2.-6. 0,-4.4} »: 82 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.)
y1 •y «inctude <sidio.b> «indode <ctype.h> «define MAXJMP 1« y1 max jurnps in a diag ·/ «define MAXGAP 24 /1 don't conómie to penalize gaps largcr than Ihis ·/ «define JMPS 1024 y1 max jmps in an path 1/ «define MX 4 y1 save if tbere's at least MX-1 bases since last jmp 1/ #define DMAT 3 /1 value of matcliing bases 1/ «define D MIS 0 y1 peralty for mismatchcd bases m! «define DINSO 8 /1 pemlty for a gap 1t «define DINS1 1 11 penalty per base 1/ «define PINSO 8 y1 petnlly for a gap V «define PINSl 4 /1 penalty per residue 1/ struet jrop { short njMAXIMPJ: /1 size of Jmp (neg for dely) 1/ unsipied short x(MAXJMP]; y1 hase no. of Jmp in seqx 1! }: /· limita seq to 2116 -1 ·/ stroct diag { int score; /1 score at last jmp ·/ long offset; /1 offset of pnv bloct V' short ymp: /1 canent jmp índex 1y stmct jmp jp; y» lia of jmps V stmct path { inl spc; /· mimtjir of leadisg spaees 1/
short nIJMPS]:/1sÍMof jmptgap) V inl xIIMPSJ;/· loc of jmp(laa elembefoie gap) ·/ }: ctuir •ofile; chftf *mmex{2]; cbar *pr°8; dnr int í<ib»| int dninO; íní dna; int eadgaps; Int gapy; inl lenD, leoi; Int Dfispj, ngapy; Int sana; int •jibm; fa»e offeet; stntct díag •dx; stmct path PPPl: t1 outpct fila name ·/
Ia seq munes: getseqsO 1/ /1 prog nimr for err msgs ·/ y· seqs: geceqsO 1/ y· besr ding: nwO 1/ / pwii dúg 1y /1 set if doa: tnxinO 1/ I1 set tf ppmlmng cnd gaps »/ /1 total gaps in seqs ·/ /1 scq tens 1/
/1 total sõe of gaps 11 y1 mnx score: nwO 1/ y· bitmap for miorhing 1/ y1 cuiTent offset in jmp file ·/ y1 bolds diagonais 1/ y1 boldl path for teqs V dier chsr 1 callocO, 1mallocO. 1mdexO. 1sbtjjyO: *getseqO, 1B_ealloeO: 83 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) /* Nccdkinan-Wunscti alignment program *
* usigc: progs filei SIeZ * where filei and fde2 are two dna or two protelo sequentes. * The sequences can be Ln upper- or lower-case ao niay condiu amfciguity * Aojr lines beginning with ’ or '<' are ignorai * Mai file length is 6SJ35 (limited by umigned shnrt a ia ibe jmp enact)
* A sequente with 1/3 ot more cf Its eleroents ACtTTU is assumcd to be DNA * Output u in tfae file 'aliganout' * * Tbe program may creaie a tmp Ble ia /tmp to bold inío about tracebaek. * Original version developed undtr SSD 4.3 on a vai 8&50 *1 tftndude *nw,h* fiadnde "day.h* stalfc _dbval[26] «= { 1.14.2.13,0,0.4,11,0.0.12.0.3.15.0,0,0,5,6,8,8.7,9.0.10.0 }: sinltc _pbval(26) ·* { I. 2{<1< <(‘D'-'A'»|(I < <('Ν^-·Α’)), 4.8. 16, 32, 64. 128,256, OiFFFFFFF, 1<<10. 1 < < 11,1< < 12,1 < <13.1<<14. 1<<1S, 1 < < 16, 1<<17. I < < 18. 1<<19. 1<<20, l<<21, 1<<22, 1 < <23, 1< <24. 1< <251(1 < «(Έ’-Ά’ΜΚΚ <('Q'-"A')) Ϊ: nnin(£C, av)
Int ac; cbar *bvQ: { prog = svfOl: ΙΓ (1C I = 3) { fjprirtftstdert/uioge: %s filei 61t2\o\ ptog); fpriíirflsulen,*wbere filei and filc2 are two doa or two protein sequentes. \n*); fprintí(stden,’The sequences can be in upper- or lawtr-case\n')-. fprimf(stden,'Any Unes beginmng wilb or ’ <' are ignoiedtn*); fprintfísiden. 'Output is io tbe file \"align.oui\'\o*); esitfl): > namexfO) = avflj; natneatllj = avJ2j; seqx|DJ «» getseqfnameifO], AíecO); seqx(l] = getseqtoameill]. Atenl); xbõi *= (dna)7 .dbval: _pbval; endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile = 'align.oul'; /* output file */ nwQ; / fili in tbe matriz, get tbe possible jmps ·/ resdjmpsO; /* get tbe actual jmps V printO; V* print staia, aUgtuneot */ Ϊ cleanupQ»; /* onliiik any tmp files */ 84 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) /* do the alignment, return besl scoic: mainO * dna: vaJues in Filch and Smiih. PNAS, 80. 1382-1386.1983 * pio: PAM 230 values * Wben scores aic equal, we prefer iniamatcbea to any gap, prefer * a oew gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. V nwO < riwT *px. *py: int •ndely. “dely; Int ndelx, delx; int *tmp; int mis; ínl insO.insl; regfater id; reglster register •colO. *0011; ngiEttr «.yy; dx = (slrvct diag •)g_ealloc(*to { !· seqs and pm ·/ /•teeptnckof dely ·/ /* kccp tnck of delx V /* for swapping rowO. rowl */ /* seote fot eaeh type *1 /· insertioD penalties *t /* diagonal índex *f /* jmp indcx */ /* scoie for enrr. last row ·/
/* índex imo seqs V diags*, leo0+lenl+l, sbeoQiitiiKd diag)); ncfely = (int *)g_eafloe(*to get nitely*. leal + 1. streorflnt)); dely ° (Int *)g_cailoc("n> get dely*, leni +1, eêaeof(frit)); colO -· (Int *)g_caHoc(*lo get colO*. leal + 1, Acoitai)); coll = (int *}g calloe(*to geteoll*. lenl + 1, sfxeofflnt)): insO - (dna)? DÍNSO : PINSO. imi «, (dag)? nntisi prNSi · qna» =. -10000: if(endgaps) { for (col0(0] - dely[0] - -insO, yy = I; yy < = leni; yy++) { coIOIyy] = delylyy) = col0(yy-lj - insl; ndely(yy] = yy; > colOfO] ^ O; /· Watenrum Buli Math Biol 84 */ } elce for (yy = l; yy < = leni; yy++) d£ly(yyl β -insO; /* fill in mau* matxix v for(px · seqx(O). a* - 1: xx < = lenO: ρχ+Ί-, xx++) { f* fim entzy in col
V íf (endgaps) {
«f <« == D ooll(0J — delx — -(msO+insl); cise ¢011(0] = delx = «10(01 · insl; ndeU = xx; } elsÊ { coll(0] = O, ddx = -insO; ndeU b O; > 85 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) for (py = scqx[l], yy « 1; yy < = leni;py+ + , yy++) í mis «= colOÍyy-1]; IT(dna) mis + = (*bmí*px->A']&Jibm[*p3'',A'])? DMAT: DM15; tlst mis + = _day(*px-,A']l*py-'A']; /* update penalty for dei in x seq; * favor new dei over ongong del * ignore MAXGAF if weigbling cndgsps ·/ if (endgaps 11 Ddelytyyl < MAXGAP) {
If (oolO[yyl - insO > — delyfyyj) l delytyy] = coíOfyyJ - (insO+insl); ndelytyy] ” I; ) *lse{ delyryy] -= iwl; «*iyln]++! } >ebe{ if (colQlyy] - (insO+insl) > - deiytyyD { driytyy] = oolDlyy] - (insO+insl); ndely[yy) - 1:
| dSS nddy[yy]++; > /* update petully for del in y seq; * fevor new del over ongong del ·/
If (endgaps 11 nílrlx < MAXGAP) { if {coll(yy-11 - insO > = deh) { delx — coll(yy-l] -(inSO+insl); ndelx *» 1; }*be{ delx -=5 inst; ndebr-t- +; ) >*U®Í ir<cdltyy-l] - (insO+insl) > = delx) ( delx = eoll[yy-l) - (insO+insl); odeU β I; ndelx++; >
/* (dck lhe maxímmn score; we'rt fivoring • mis over any del and delx over ddy V 86 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) id = xx - yy + leni - 1; if (mis > — delx &Jk mis > = dely[yy]> colHyy] — rofc: cise if (delx > = delyfyy]) { colltyy] “ delx; (j = dxlid].(jmp; if (di[id].jp.nIO] Sí& (fdna 11 (ndelx > <= MAXIMP && xx > dx[id].jp.x(ij]+MX) 11 mis > dx[íd].score+DINSO)) { dxiid].ijnip+-t-; ít(++jj > = MAJCJMP){ writejmpsGd); ij = dx[id].ijmp «* 0; dxj7d].oQ»t o offiet; offsa * — sneoí(stnirt jmp) + siueRotlwt); } } dx(id).jp.n{ij] » ndelx; dx(id].jp.xnfl - xx; dx[id].Bcere — delx; > cbe { colibri = ddytyyl; ij = 4t[id].ijmp;
if (dx(id).jp.D[0] && (IdM 11 (ndelytyy] > = MAXIMP &íl xx > dxpdl.jp.xlíjl-t-MX) 11 mis > dx(id]-scoie+DINSO)) { dxf[d).ijnip+ +; if(++ij >= MAXIMP) { writejopsfíd); ij dxlidl.ijmp — 0; dx(td].ofiset o offset; offsei + = £ixíof(rtruc< jmp) + sizeaQofftef);
J ) dx[id] jp.n[ij] 3-- -nddytyy}: dx(ilí].jp .xfrj] = xx; dx(idJ.ccom = dety(yy]; } if (xx ·* » leoO && yy < leni) {
/· last col *V if (endgapx) colllyy] -= ins0+insl*0eal-yy); ÍT(coII(yy) > smu){ smex — eoll[yy]; dmax = id; } Ϊ > if (endgaps && xx < laO) coll[yy-l] -«= insO+inslOenO-xx); lf(colHyy-l) > smax) { smax *3 coll[yy-l]; dmax — íd; } tmp 33 coIO; ooIO == coll; coll = rmp; > (vold) frec((cb*r *)ndely); (roid) fmc((diar *)ddy); (void) &ee((<ijar *)colO); (void) free((diar *)t»ll); } 87 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) /· * prinlO - ocJy routine 'visitfle outside Uiis module * sradc:
r getmatO - trace back besr pedi, eotait matches: priníO
* pr_aligt0 - ptint aligiunenl of dtsciibed in array pQ: priníO
* dumpblockO *' durop b block of liões with numbers. stais: pralignQ
* numsQ - pui out a nutnber line: dumpblockO
* putlmeO — puf out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblockO
* stareO - -put a line of etare: dumpblockO * stripoameO " strip eny palb and prefii frofli a teqiMiae ·/ finclude *ow.h*
PdeGneSPC fdefine P_LtNE f define F~SPC 3 256 3 /* masimiim output line */ /· cpace between name or num nnd seq */ extern _day[2é][26]; ínt olen; FUJB *fe; /* set output line length */ /* output file */ printO ( mt lx, ly, firstgap. lastgap; f” ovcrUp */ *m = fbpenlofile, "w")) -- 0) { fpritttfísttlen.·*»: can‘t wiice *J\n", prog, ofile); cleanuptl); fpiimftfx, *<first seqnance: *s (lengúi - *d)\B*·, ramex[|)], Iσΰ): fprintfifit, "<secood scqucace: Ksflengtb ’ Kd)\n', namexfl], leni); oleo b 60;
Ix — leoO; ly = lcol; firstgap = laatgap = a,
ir (dmix < leal - 1) { /* leadmg gap in x V pp(D].«pc - firstgap — leni · dmsx -1; ly ppPJspc; } ebe if (Ana* > leni -1){ /· leadinggipiny V pp[l].spc — firstgap — dmax - (leni - I); 1* — pp[l].epe; > if (dmaxO < lenO - l) { I* tralllng gap m x ·/
Lagtgsp e IpttP · ήρρι^ι -1; lx — lastgsp; } elre if (dmaiO > Ιού -!){/* trailing gap iny */ lastgap <= dmaxO - (lenO - \y, ly — laagap; } gennat(lx, ly, firagap, lastgap); pijalignO; > 88 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
/· * trace back tbc bcsl path, count malches ·/ £U*tÍC
Tabela 1 (cont.) gctmat()*, ly, fustgap, lestgip) Int 1*. ly; /* *core* (miaus endgaps) V íot firstgap, lastgap; /· leading uailípg overtap */ getmat
Int thar double registar reglster daar m, iO, 11, tbO, cizl;oue(32]; oD, nl; “pO, «pl; /* get total mntrhiw. score V 10 = 11= sirO «= ήζΐ * 0; pO = seqx(0) + pp[l).spc; pl - teqalU + PP[0).spc; nO = pp[l].ipc + 1; nl = pp[0],ipc + 1; nm = 0; whOe ( *p0 && *pl ) { If (sufi) {pl ++; nl ++; 6ÊO-;} else tf (sizl) {p0++; n0+4; »1-; >if (χΙ>αιΙ·ρΟ>>Α,νωιοι[*ρ1-,Α'1) am 4·+; ir (οο++ -*= pp{0],*noDàiD = pptO].a[iO+ +1;iT(nl + + =- pp[)).x]ilD*hl = ppll).n{il++); p0++;pl + +;} Ϊ /* pct boraokjgy; * if penalizing endgnps, base is the sboiter seq * cise, knock off ovatungs and tate shnrtcr core V If (endgaps) U ·= OenD < leni)? lenO r leni; dse bt - (la < ly)? U : ly; pct = 100.*fdonble)nm((double)U;IprinrfCfit, «Vq·); ipiintftfi, < Hd matchfts in an owertap of %d: %.11 perccnt slmilafityln*, nm, (nm == 1)? " : ’es*, lx, pct); 89 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) ...getmat ίρι ir.tf(fx. " < £8ps in first sequence: Bd’, gapx): tf(gapx) { (void) sprimÇcutx, ' (%d KsSs)", ogapx, {dna)1 "base*:*iesidue*. (ngapx ·— 1)1 *:*!*); fprinrf(fii,"Xí·, ontx); fprintf(fic, *, gaps in sccond scqucnoc: %d\ gapy); tf (gapy) { (void) sprintfiCouta, * (Bd *í*i)“, ngapy, (dm)? "bascVresidue*. (ngapy = = l)T fprinrUEx/Ba*, outx); Ϊ if(doa) tprinrftbt. "Λη< score: %á (matth = %d, mismaccb = Bd, gap pcmlry <=> Bd + Bd per base)Vn* smax, DMAT. D MIS. DINSO. DINS1); cise fgsilltfltt, '\o<scorc: %d (Dayhoff PAM 250 matrix. gap pcnahy Bd + %d per reaiduego*. ffluut. PINSO. PINS1): if (endgaps) fprintfffit, *<cndgaps peoalized. Icft endgap: Bd BsBj, righl endgap: %d XaBsta*, flrslgap, (dna)? 'base* : 'reskbie’, (fiístgap == 1)1 " : "fi". lastgap, (dna)? 'base* : "reddne’, (laagsp <= = 1)1" : 's'); ike fprimf(fk, ' < endgBpj oot penalizedUi*); > ftatic Win; /* mai^tmc íncore — for cbecldiig V statíc Ima*; /· leogths of itripped Glc cama */ static UP); /+ Jmp índex (br a path */ statíc dcP); /* mimber at (tait of currení linr ·/ statíc mpi; /* curou ciem mtmher — for gapping */ statíc «Pl; statíc d»r •psPl: /· ptt to curtem danem */ statíc char *po{2); /* ptr to next omput cbar Slot */ statíc dsar out[2](P_UNS); /* output Une V stBtícdiar saifPJJNE]; /* jtt by staraQ */ /* * piínt alignmeot of described íd stmct patb ppQ ·/ statíc pr alignO {" Int om f* ehar ccami */ int more; register ii for(i = 0, Imax · 0; i < I; i+ +) { m = stnpiiame(oamex[il); tf (nn > Imax) Imax α mu “PI = 1; oili] = 1: sizli] <= y[i] - 0; píÕ] - seqxfl); po[i| omp]; } pralign 90 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) ...pr_align for (m = am 0, mote “ 1; more; ) { for (i = mote - 0; i < 8; i+4) { /» * do we have moic of thi) sequeoee?
tf(t*ps[iP continue; more++: if (ppR.tpe) { /· leading spice ·/ •po[i]++ -· ΡΡΓΟ-Spc—; ) cise tf (sizfiD { /* in a gap *1 *poB]+ + " } tdse { f * we'te pumcg a seq elemeitl ·/ •poK = *ps(i]; U (ufa>wett*p$Ç])) •pkfl = touppo<*ps[iD; poti|++: psin++; /*
• ate we at esxt gap for ihís teqT V aom ==ρρ10.*Γ«Ι®)1 í* * we need to merge all gaps
• al UÚ9 locaiioo V
snp] = ρρΠ1·ηίϋΗ!++]; nbik foifi] = = pp[i].x[ij[iID ώ(Π += ppli].nltt(i] + +l; ) OÍRJ4 4; Ϊ Ϊ lf(++nn= = oko 11 Ímoie&&. nn) { duaipblockO· for(i = 0;i < I; i++) P°[íl - oattfl; OD = ft } ) } /· * dump a block of lises» indudiog numbers, çtaft: pr aligoQ ·/ sutíc dumpblock
tfumpblockO ( repto i; for (i a 0; i < 2; i4 4) •poli)- = «*; 91 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) ...dumpblock <void) putcCXn', fx); for (1 = 0:1 < { if (*omliJ *A <*outW 1“ " 11 '(poíiD != ‘ í íf(i-==0)
If (l = = O&A starsQ; puUioe(i): |f(i = - 0 && ‘outUD fprimf(É». stai):
If 0 == 1) nunu(i); } Ϊ } /* * put out a Qumber line: dumpblockO */ static nums putline nums(ix) |nt i»; i* iedex in otnQ tmldin; seq line */ í dor oliúe[P_LINE): nsbtcr i, j; regbter dmr *pn, *px, *py; for (ρη = nline, i = O: i < Unax+P_SFC: i+ + . pn++) •pn = ’; for (i = ηφχ], py = ouílix]; *py; py+ +, pn+ +) { ir{*py " || *m == '') •pn = * esc { if (i%10 ==. 0 11 (i —» 1 && cc[ix] <- I)) { j*=(i <0)7-i:i; for (px " p«u j: j / = 10, px-) •p* =j*lO + '0·; tt(i < Q) •px = Ϊ cise •pn i+ + ; > } •pn — '\0' ·, οφχ] => i; for (pn = aiioe; *ps; pn+ +) (void) pute(*pn. b); <τοΜ) paàc\n’, tx); Ϊ I·
• put out a line (oame, [num], seq, [mim]): duznpblockO ·/ í etatic putline(ix) inl U; 92 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) ...putllne tnt l; register ehar *pi: for (px = ι = 0; ·ρχ && *p* 1= px++. 1++) (void) putc(*px, 60; for(;i < lmax4P_SPC; i++) (void) pstcC ’, fu); /· ttcsccouai Asm 1; * lãQ is curtcnt demem (fiam 1) * ncQ is mitnbei M start of cuirent line ·/ for (px = oulfix); *px: px+ +) (void) puieC*pi*ai7F. fr); (void) puttCVn', fe); Ϊ /* * put a line of sars (sep. alwayi in outfD), ootll]): dumpblockO ·/ statie sqjsO stars tat i; rcgistcr dar *p0. *pl. cx, *pi; ΙΓ (1'outtOÍ 11 (*onlI0] — ' 1 *& *(polOD ™ ‘ ·) 11 !*0«41) 11 (*ooiín =>-** *(poHD — ·» muni; ps = «ar; for (i lmax+P_SPC; i; i—) *px++ = ' for(p0 = out(0). pl = outfl); *p0&&*pl:p0++,pl++){ if (isalphfl(*pO) && isaIpS»(*pl)) { if (*bmt*pO-'A')axbin[*pl-'A,D { cx = *·*; mn++; 1 dse If (Idos && jJay[*pO-'A'l[*pl-’An > 0) , cx = «be cx > ' Ϊ ebe cs “ *px+ + · cx; } *px++ * ^n'; > *px α ·\0'; 93 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) /·
• slrip paih or prefu from pn. retum Icq: prjilignO V strlpname static scripnamc(pn) char *jth: t* file nxme (may be palh) */ { regirter char *px, *py: ΡΪ -0; for (px = pn; *px; ja+ 4-) íf (*px - = T) py «px + l; ií(py) (void) strcpy(pn. py); ictum(strlea(pD)); ) 94 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) t* * cleamipO — cleanup any tmp file * gciseqO - read in seq, sei dm, lco, multo * g_calloc0 — callocO widi erroí rtnvlrin * rêãdjrapsO - get tbe good jmps, from tmp lile if necessaty * wiiicjmpsO - write a filled array of jmps to a tmp file: swO ·/ //bidude 'nw.b' tfiadode <cys/file.b> cbar 'jnenie = Vtmp/homgXXXXxX"; /· tmp file for jmps *1 FILE »fj: int cleanupO: /* cleanup tmp file V kmg lseekO: l* * remove auy tmp file if wo blow *I cleaimpfi) int i; { if® (Toid) unlinkfjmme); ejdtTi);} cleanup t* * read, retino ptr to seq, sei doa, ien. maxlen sldp lises stamng wifli or '>' * seq in upper or tower case ·/ ehflp »
geiseqlfile, Ien) ctmr *file; int *len; { ctiar regtster cbar int FILE getseq I* file nime ·/ /· seq len */ lise(IOZ41, *pseq;*f*. *py: oatgc, Oen; *fr: if ((¾ - fopen(file,*r·)) = = Q) { fprintf{slden,*Xs.' cas't read Bs\n", prog, file); exitfl);} tÍCO e nafgf. e O" wbfle <fgets(line. 1024, fp)) { if (*Une - ·= ·;· || *Iine -- '< || *Une '>) continue; for (p* = Une; ·ρχ 1= Λη'; ρχ++) W (isiipper(*pi) 11 islowerfV*)) if ((pseq = maUoc((iiiisigDedXUea+6))) == 0) { QjrósfistdeiT,' Bs: maBocO feiled to gel Bd byíts for %e\n*. prog, tleo+6, file); emiti);) pseq(O) = pseqjl] = pseqP] = pteq[3] = ·\0'; 95 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) ...getseq Ρϊ = pseq + 4; •len = tlee; «vnod(fp); wtiflt (f£ets(llní. 1024, fp)) { if (*Jine == |] *line == || «line == '>’) conlimit; for (px = line: *px != 'W: px+-l·) { if (isoppeK*p*)) •py++ - *px: else if (islowei<*pi)) *py+ + »touppei<*px): if (itsdu('ATGCU* ,*(py-l») o*tge++;}I •py + + >= ·\0·; *py - ’\0’: (votd) fclose(fp); dna = natgc > (denft); retom(pseq+4); d#r * g_cal!oc(msg. nx, sz) char *msg: I* progniB, calling rDutinr ·/ d! nx, sz; i* munber and aize of dementa ·/{ i*ap *ρχΒ *callocO; g.caHoc ) if ((pz " caUoc((uarigir«l)ni. (nnsigiiíd)»)) e=0){ lf(*nu*){ fprintUstdext, ’%s: gjcallooO feiled %s(n=%d, jz~*d)\n*, prog, exiKl); }} retorDfpx): msg. dx, se); !· • gei final jmps from d»D or tmp fUe, set ppo. i»et dmax: mainO ·/ leidjmpsO < inl fá - -l; int ãz, iO, 11; rggister i,j, xx;»<S>{ (Toid) fc!ose(Ç): if ((fd » ppenQnans, 0_RD0NLY, O» < 0) { fprinttUtdeiT, can‘| openO %s\n*, prog, jname); cteacnipO); readjmps fax (i = iO = i 1 =0. dmaxO = dmax, π t, teaO; ;++){ whâe (1) ( for (í - dxldmaxj.ijmp; j > = 0 ΛΑ dxtdnaxl.jp.xC) > ·> xx; j—) 96 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 1 (cont.) ...readjmps if (j < 0 && dx[£taiax].offeei &.& Ç) { (void) lscek(fd, dx[ttaax].of&et, 0); (vd(íí) read(fd, (citar sneof(stntci jmp)): (void) rcaC(fd, (char *)ítdxidmax).offset, siz£of(dx[dmax].ofiseQ}; dxldmax).ijmp = MAXJMP-1; } ctse break; } iro > = ímps) { fpjintflstderr, *%s: too many gapg io alignmcctXn", piog); cleamípCl); ) if (j >= 0) { siz = ds[dmax]-jpn]j); xx ~ <ttldmaxl.jp. x(j}; dmax + = six; if (5iz <0){ /* gap in second seq */ pptlj.D[U) = -six; «4» siz;
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Tabela 2 TAT XXXXXXXXXXXXXXX (Comprimento = 15 aminoácidos)
Proteína de XXXXXYYYYYYY (Comprimento = 12 aminoácidos) comparação % de identidade de sequência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácidos identicamente correspondentes entre as duas sequências polipeptídicas conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de resíduos de aminoácidos do polipéptido TAT) = 5 dividido por 15 = 33,3 % 98 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 3 TAT XXXXXXXXXX (Comprimento = 10 aminoácidos) Proteína de comparação XXXXXYYYYYYZZYZ (Comprimento = 15 aminoácidos) % de identidade de sequência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácidos identicamente correspondentes entre as duas sequências polipeptídicas conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de resíduos de aminoácidos do polipéptido TAT) = 5 dividido por 10 = 50%
Tabela 4 ADN-TAT NNNNNNNNNNNNNN (Comprimento = 14 nucleótidos) ADN de comparação NNNNNNLLLLLLLLLL (Comprimento = 16 nucleótidos) % de identidade de sequência de ácido nucleico = (o número de nucleótidos identicamente correspondentes entre as duas sequências de ácido nucleico conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de nucleótidos da sequência de ácido nucleico ADN-TAT) = 6 dividido por 14 = 42,9% 99 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tabela 5 ADN-TAT ΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝΝ (Comprimento = 12 nucleótidos) ADN de comparação NNNNLLLW (Comprimento = 9 nucleótidos) % de identidade de sequência de ácido nucleico = (o número de nucleótidos identicamente correspondentes entre as duas sequências de ácido nucleico conforme determinado por ALIGN-2) dividido por (o número total de nucleótidos da sequência de ácido nucleico ADN-TAT) = 4 dividido por 12 = 33,3 % II. Composições e métodos do invento
A. Anticorpos anti-TAT
Numa concretização, o presente invento disponibiliza anticorpos anti-TAT que poderão encontrar utilização aqui como agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico. Os anticorpos exemplificativos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecificos e heteroconjugados. 1. Anticorpos policlonais
Os anticorpos policlonais são preferencialmente produzidos em animais por meio de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e de um adjuvante. Poderá ser útil conjugar o antigénio relevante (especialmente quando se utilizam péptidos sintéticos) com uma proteína que é imunogénica na espécie que se pretende imunizar. Por exemplo, o antigénio pode ser conjugado com hemocianina de lapa (KLH), albumina sérica, tiroglobulina de bovino ou inibidor da tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster de maleimidobenzoí1-sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), 100 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Os animais são imunizados contra o antigénio, os conjugados imunogénicos ou os derivados por combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 pg da proteína ou do conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injecção intradérmica da solução em múltiplos locais. Um mês mais tarde, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou de conjugado em adjuvante completo de Freund, por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a catorze dias mais tarde, os animais são drenados e o soro é analisado quanto ao titulo de anticorpos. Os animais são reforçados até o titulo estabilizar. Os conjugados também podem ser preparados em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, utilizam-se agentes de agregação como o alúmen para reforçar a resposta imune. 2. Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais poderão ser preparados utilizando o método do hibridoma inicialmente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) ou poderão ser preparados através de métodos de ADN recombinante (Patente U.S. n.0 4,816,567).
No método do hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, como um hamster, é imunizado da forma descrita acima para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para a imunização. Em alternativa, os linfócitos poderão ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e depois são fundidos com uma linha de células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como o polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e crescidas num meio de cultura adequado, meio este que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que 101 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ inibem ο crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas (também designadas por parceiro de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuírem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selectivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), que são substâncias que impedem o crescimento das células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma que constituem um parceiro de fusão preferido são células que fundem eficazmente, sustentam uma produção elevada e estável do anticorpo pelas células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio selectivo que efectua uma selecção contra as células parentais não fundidas. As linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma murino, como aquelas derivadas dos tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 e disponíveis através de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA; e SP-2 e derivados, por exemplo, as células X63-Ag8-653 disponíveis através da American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia, EUA. Linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma murino-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão a crescer é analisado quanto à produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Preferencialmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) . A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, pela análise de Scatchard descrita em Munson et al.. Anal. Biochem., 107:220 (1980). 102 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Uma vez identificadas as células de hibridoma que produzem os anticorpos com a especificidade, a afinidade e/ou a actividade desejadas, os clones poderão ser subclonados através de procedimentos de diluição limite e crescidos por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, o meio D-MEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma poderão ser crescidas in vivo como tumores asciticos num animal, por exemplo, por injecção i.p. das células em ratinhos.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são separados do meio de cultura, do liquido ascitico ou do soro por meio de procedimentos convencionais de purificação de anticorpos como, por exemplo, a cromatografia de afinidade (por exemplo, utilizando proteína A ou proteína G-Sepharose) ou a cromatografia de permuta iónica, a cromatografia em hidroxiapatite, a electroforese em gel, a diálise, etc. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias leves e pesadas dos anticorpos murinos). As células de hibridoma actuam como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN poderá ser colocado em vectores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem anticorpo de outro modo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias do ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pliickthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).
Numa concretização adicional, os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos, geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., 103 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de afinidade elevada (gama nM) por baralhação de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10; 779-783 (1992)), assim como a infecção combinatória e a recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas fágicas muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). Por conseguinte, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpos monoclonais para o isolamento de anticorpos monoclonais. O ADN que codifica o anticorpo poderá ser modificado para produzir polipéptidos de anticorpos quiméricos ou de anticorpos de fusão, por exemplo, utilizando as sequências de domínios constantes de cadeias leves e pesadas humanas (CH and CL) em substituição das sequências murinas homólogas (Patente U.S. n.° 4,816, 567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei, USA, 81:6851 (1984)), ou fundindo a sequência codificante da imunoglobulina com a totalidade ou parte da sequência codificante de um polipéptido diferente de imunoglobulina (polipéptido heterólogo). As sequências do polipéptido diferente de imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo, ou ser substituídas pelos domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo, para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio e outro local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio diferente. 3. Anticorpos humanos e humanizados
Os anticorpos anti-TAT do invento poderão compreender adicionalmente anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos quiméricos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio dos anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de uma 104 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinante da complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador), como o ratinho, o rato ou o coelho, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também poderão compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências CDR ou de estrutura importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá praticamente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que a totalidade ou praticamente a totalidade das regiões CDR corresponde às de uma imunoglobulina não humana, e a totalidade ou praticamente a totalidade das regiões FR corresponde às de uma sequência consenso de uma imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado em condições óptimas também compreenderá pelo menos uma porção da região constante de uma imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Os métodos para humanizar os anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos provenientes de uma fonte não humana introduzidos nele. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes designados por resíduos de "importação", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada de acordo com o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], utilizando as CDR ou sequências das CDR de roedor em substituição das sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. n.° 4,816,567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie 105 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são normalmente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR estão substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a utilizar na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e a resposta HAMA (anticorpos humanos anti-ratinho) quando o anticorpo se destina a uma utilização terapêutica humana. Segundo o método denominado de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de sequências conhecidas de domínios variáveis humanos. A sequência do domínio V humano que é mais próxima da do roedor é identificada, e a região de estrutura humana (FR) no seu interior é aceite para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma região de estrutura poderá ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993) ) . É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção da afinidade de ligação elevada para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados conceptuais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão normalmente disponíveis e são familiares dos peritos. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e representam as estruturas conformacionais 3D prováveis das sequências de imunoglobulinas candidatas seleccionadas. A inspecção destas representações permite uma análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a 106 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Desta forma, os resíduos FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências do receptor e de importação, de modo que a característica desejada do anticorpo, como seja uma maior afinidade para o(s) antigénio(s)-alvo, seja obtida. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão directa e muito substancialmente envolvidos na determinação da ligação do antigénio
Estão contempladas várias formas de um anticorpo anti-TAT humanizado. Por exemplo, o anticorpo humanizado poderá ser um fragmento de anticorpo, como seja um fragmento Fab, que está opcionalmente conjugado com um ou mais agente (s) citotóxico(s) para gerar um imunoconjugado. Em alternativa, o anticorpo humanizado poderá ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGl intacto.
Como alternativa à humanização, é possível gerar anticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a eliminação homozigótica do gene da região de junção (JH) da cadeia pesada do anticorpo em ratinhos mutantes da linha germinal e em ratinhos quiméricos resulta numa inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulinas da linha germinal humana para estes ratinhos mutantes da linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após provocação com o antigénio. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad, Sei, USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno, 7:33 (1993); Patente U.S. n.° 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas da GenPharm); 5,545,807; e WO 97/17852.
Em alternativa, a tecnologia de apresentação em fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes do domínio variável (V) de imunoglobulinas provenientes de dadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes 107 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ do domínio V dos anticorpos são clonados "in-frame" no gene de uma proteína de capa principal ou secundária de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, e apresentados como fragmentos de anticorpos funcionais na superfície da partícula fágica. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma fágico, as selecções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam em selecção do gene que codifica o anticorpo apresentando aquelas propriedades. Assim, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula B. A apresentação em fagos pode ser realizada numa variedade de formatos, que estão revistos, por exemplo, em Johnson, Kevin S. & Chiswell. David J., Current Opinions Structural Biology 3:564-571 (1993). É possível utilizar várias fontes de segmentos de genes V para a apresentação em fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes V provenientes de dadores humanos não imunizados poderá ser construído, e os anticorpos para um conjunto diverso de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993).
Ver, também, Patente U.S. n.° 5,565,332 e 5,573,905.
Tal como discutido acima, os anticorpos humanos também poderão ser gerados por células B activadas ín vitro (ver Patentes U.S. 5,567,610 e 5,229,275). 4. Fragmentos de anticorpos
Em determinadas circunstâncias, há vantagens em utilizar fragmentos de anticorpos em vez de anticorpos completos. O tamanho mais pequeno dos fragmentos permite uma eliminação rápida e poderá conduzir a um acesso melhorado aos tumores sólidos Têm sido desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados por digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., 108 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem agora ser produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem ser todos expressos e segregados a partir de E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de anticorpos em fagos discutidas acima. Em alternativa, os fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir de uma cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com uma semivida acrescida in vivo, compreendendo resíduos do epitopo de ligação a um receptor de resgate ("salvage receptor"), estão descritos na Patente U.S. n.° 5,869,046.
Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para um perito. Em outras concretizações, o anticorpo de eleição é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver WO 93/16185; Patente U.S. n.° 5,571,894; e Patente U.S. n.° 5, 587,458. Fv e sFv são as únicas espécies com locais de combinação intactos que são desprovidas de regiões constantes; assim, elas são adequadas para ligação não especifica reduzida durante a utilização in vivo. É possível construir proteínas de fusão de sFv para obter a fusão de uma proteína efectora na extremidade amino ou na extremidade carboxi de um fragmento sFv. Consultar Antibody Enqineering, ed. Borrebaeck, acima. O fragmento de anticorpo também poderá ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na Patente U.S. 5,641,870. Estes fragmentos de anticorpos lineares poderão ser monoespecíficos ou biespecíficos. 5. Anticorpos biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes. Os anticorpos biespecíficos exemplificativos poderão ligar-se a dois epitopos diferentes de uma proteína TAT como aqui descrita. Outros anticorpos deste tipo poderão 109 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ combinar um local de ligação de TAT com um local de ligação para outra proteína. Em alternativa, um braço anti-TAT poderá estar combinado com um braço que se liga a uma molécula accionadora num leucócito, tal como uma molécula de receptor de células T (por exemplo, CD3) ou receptores Fc para IgG (FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de modo a focar e localizar o mecanismo de defesa celular para a célula que expressa TAT. Os anticorpos biespecificos também poderão ser utilizados para direccionar agentes citotóxicos para as células que expressam TAT. Estes anticorpos possuem um braço de ligação de TAT e um braço que liga o agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferão a, alcaloide da vinca, cadeia A da ricina, metotrexato ou hapteno com um isótopo radioactivo). Os anticorpos biespecificos podem ser preparados como anticorpos completos ou como fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecificos F(ab')2). WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/anti-FcYRIII, e a Patente U.S. n.° 5,837,234 descreve um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/anti-FcYRI. Um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/Fca está apresentado em WO98/02463. A Patente U.S. n.° 5,821,337 descreve um anticorpo biespecifico anti-ErbB2/anti-CD3
Os métodos para preparar anticorpos biespecificos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecificos completos baseia-se na co-expressão de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Devido à variedade aleatória das cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecifica correcta. A purificação da molécula correcta, que é normalmente efectuada por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante incómoda, e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos idênticos estão descritos em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991). 110 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulinas. Preferencialmente, a fusão é com um domínio constante da cadeia pesada de Ig, que compreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferido que a primeira região constante da cadeia pesada (CH1) contenha o local necessário para a ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões das cadeias pesadas de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são introduzidos em vectores de expressão separados e são co-transfectados numa célula hospedeira adequada. Isto proporciona uma maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em concretizações em que razões desiguais das três cadeias polipeptídicas utilizadas na construção proporcionam o rendimento óptimo do anticorpo biespecífico desejado. É, contudo, possível inserir as sequências codificantes de duas ou da totalidade das três cadeias polipeptídicas num único vector de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm qualquer efeito significativo sobre o rendimento da combinação de cadeias desejada.
Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são constituídos por uma cadeia pesada de uma imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e por um par cadeia pesada-cadeia leve de uma imunoglobulina híbrida (que proporciona uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma forma fácil de separação. Esta abordagem está descrita em WO 94/04690. Para obter detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). 111 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. No. 5, 731, 168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodimeros que são recuperados a partir de uma cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades "compensatórias" de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(ais) grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais grandes de aminoácidos por cadeias mais pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Este procedimento proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento dos heterodimeros sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.
Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode estar acoplado a avidina e o outro a biotina. Estes anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. n.° 4,676,980) e para o tratamento da infecção pelo VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados poderão ser preparados utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e estão descritos na Patente U.S. n.° 4,676,980, juntamente com algumas técnicas de reticulação.
As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando a ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditióis, arsenito de sódio, para estabilizar os ditióis vicinais e impedir a formação de ligações dissulfureto intermoleculares. Os fragmentos Fab' gerados são depois convertidos em derivados de 112 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ tionitrobenzoato (ΤΝΒ). Um dos derivados Fab'-TNB é, em seguida, reconvertido para o fragmento Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.
Progressos recentes facilitaram a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, os quais podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecifico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi segregado separadamente a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobreexpressam o receptor ErbB2 e a células T humanas normais, bem como de desencadear a actividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos do tumor da mama humano. Várias técnicas de preparação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecificos directamente a partir de uma cultura de células recombinantes foram também descritas. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecificos utilizando fechos ("zipper") de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5) :1547-1553 (1992) . Os péptidos com fechos de leucinas provenientes das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos ao nível da região de dobradiça para formar monómeros e depois foram reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diabodies" descrita por
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um VH ligado a um VL por um adaptador que é demasiado curto para permitir um emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Por conseguinte, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios 113
ΕΡ 2 000 545/PT VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação de antigénio. Outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpos biespecificos mediante a utilização de dimeros de Fv de cadeia única (sFv) foi também referida. Ver Gruber et ai., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Anticorpos com mais de duas valências estão contemplados. Por exemplo, é possível preparar anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). 6. Anticorpos heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados estão também no âmbito do presente invento. Os anticorpos heteroconjugados são constituídos por dois anticorpos unidos covalentemente. Este tipo de anticorpos tem, por exemplo, sido proposto para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. n.° 4,676,980) e para o tratamento da infecção pelo VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Está contemplado que os anticorpos poderão ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos de química sintética de proteínas, incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, é possível construir imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou mediante a formação de uma ligação tioéter. Os exemplos de reagentes adequados para este fim incluem o iminotiolato, o 4-mercaptobutirimidato de metilo e aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. n.° 4,676,980. 7. Anticorpos multivalentes
Um anticorpo multivalente poderá ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antigénio ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos do presente invento podem ser anticorpos multivalentes (que não são da classe IgM) com três ou mais locais de ligação do antigénio (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante do ácido nucleico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais locais de ligação do antigénio. O domínio de dimerização 114 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais locais de ligação do antigénio em posição amino-terminal à região Fc. 0 anticorpo multivalente preferido compreende (ou consiste em) três a cerca de oito, mas preferencialmente quatro locais de ligação do antigénio. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptidica (e preferencialmente duas cadeias polipeptidicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptidica(s) compreendem dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptidica(s) poderão compreender VDl-(XI)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptidica de uma região Fc, XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptidica (s) poderão compreender: VH-CH1- adaptador flexível-VH-CHl-cadeia da região Fc ou VH-CH1-VH-CHl-cadeia da região Fc. 0 anticorpo multivalente compreende ainda preferencialmente pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipéptidos do domínio variável de cadeias leves. 0 anticorpo multivalente poderá, por exemplo, compreender entre cerca de dois e cerca de oito polipéptidos do domínio variável de cadeias leves. Os polipéptidos do domínio variável de cadeias leves aqui contemplados compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreendem ainda um domínio CL. 8. Manipulação da função efectora
Poderá ser desejável modificar o anticorpo do invento em relação à função efectora, por exemplo, de modo a reforçar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e/ou a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto poderá ser obtido por introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos numa região Fc do anticorpo. Em alternativa ou adicionalmente, é possível introduzir resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfureto intercadeia nesta região. 0 anticorpo homodimérico assim gerado poderá ter uma capacidade de internalização melhorada e/ou uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e uma capacidade de morte celular mediada por complemento 115 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ melhoradas. Ver Caron et al., J. Exp Med. 17 6:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral reforçada também poderão ser preparados utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Em alternativa, é possível gerar um anticorpo com regiões Fc duplas, passando assim a ter capacidades de ADCC e de lise via complemento melhoradas. Consultar Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a semivida sérica do anticorpo, é possível incorporar um epitopo de ligação ao receptor de resgate ("salvage receptor") no anticorpo (especialmente num fragmento de anticorpo) como descrito na Patente U.S. 5,739,277, por exemplo. Tal como aqui utilizado, o termo "epitopo de ligação ao receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida sérica in vivo da molécula IgG. 9. Imunoconj ugados 0 invento também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado com um agente citotóxico, tal como um agente quimioterapêutico, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioactivo (por exemplo, um radioconjugado).
Os agentes quimioterapêuticos úteis para a geração destes imunoconjugados foram descritos acima. As toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizadas incluem a cadeia A da toxina diftérica, fragmentos activos de não ligação da toxina diftérica, a cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aerugínosa), a cadeia A da ricina, a cadeia A da abrina, a cadeia A da modecina, a alfa-sarcina, proteínas de Aleurítes fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), o inibidor de melão-de-são-caetano, a curcina, a crotina, o inibidor de Sapaonaria officinalis, a gelonina, a mitogilina, a restrictocina, a fenomicina, a enomicina e os tricotecenos. Encontra-se disponível uma variedade de radionuclidos para a 116 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y, e 186Re. Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP),
iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis(p-azidobenzoí1)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (como bis(p-diazóniobenzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de bis-flúor activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, uma imunotoxina com ricina pode ser preparada da forma descrita em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triamino- pentacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de um radionucleótido com o anticorpo. Ver WO94/11026.
Conjugados de um anticorpo com uma ou mais toxinas constituídas por moléculas pequenas, como a caliqueamicina, os maitansinóides, um tricoteno e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem actividade de toxina, estão aqui também contemplados.
Maitansina e maitansinóides
Numa concretização preferida, um anticorpo anti-TAT (completo ou fragmentos) do invento está conjugado com uma ou mais moléculas de maitansinóides.
Os maitansinóides são inibidores mitóticos que actuam inibindo a polimerização da tubulina. A maitansina foi inicialmente isolada a partir do arbusto da África oriental Maytenus serrata (Patente U.S. n.° 3,896,111). Subsequentemente, constatou-se que determinados microrganismos também produzem maitansinóides, como o maitansinol e os ésteres de maitansinol em C-3 (Patente U.S. n.° 4,151,042). 0 maitansinol sintético e seus derivados e análogos estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n.os 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 117 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 4,294,757; 4,313, 946; 4,361,650; 4,371,533, 4,307, 016; 4,315, 929; 4,364,866; 4,308,268; 4,317,821; 4,424,219; 4 4,308,269; 4,322,348; ,450,254; 4,309, 428; 4,331,598; ,362,663; e
Conjugados anticorpo-maitansinóide
Numa tentativa de melhorar o seu índice terapêutico, a maitansina e os maitansinóides foram conjugados com anticorpos que se ligam especificamente a antigénios de células tumorais. Imunoconjugados contendo maitansinóides e a sua utilização terapêutica estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n.os 5,208,020; 5,416,064 e na Patente Europeia EP 0 425 235 BI. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designado por DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra o cancro colo-rectal humano. Verificou-se que o conjugado foi altamente citotóxico para células do cancro do cólon em cultura e apresentou actividade antitumoral num ensaio de crescimento do tumor in vivo. Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado, por meio de um adaptador de dissulfureto, com o anticorpo murino A7 que se liga a um antigénio presente em linhas celulares de cancro do cólon humano, ou com outro anticorpo monoclonal murino, TA.l, que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinóide foi testada in vitro na linha celular de cancro da mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antigénios de superfície HER-2 por célula. O conjugado com o fármaco obteve um grau de citotoxicidade similar ao fármaco maitansinóide livre, o qual poderia ser aumentado através de um aumento do número de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinóide mostrou uma citotoxicidade sistémica baixa em ratinhos.
Conjugados anticorpo anti-polipéptido TAT-maitansinóide (imunoconjugados)
Os conjugados anticorpo anti-TAT-maitansinóide são preparados através da união química de um anticorpo anti-TAT a uma molécula de maitansinóide, sem diminuir 118 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ significativamente a actividade biológica quer do anticorpo quer da molécula de maitansinóide. A conjugação de uma média de 3-4 moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo revelou eficácia no reforço da citotoxicidade das células-alvo sem afectar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora fosse de esperar que mesmo uma molécula de toxina/anticorpo melhorasse a citotoxicidade em relação à utilização do anticorpo nu. Os maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinóides adequados estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. n.° 5,208,020 e nas outras patentes e publicações distintas de patentes referidas acima. Os maitansinóides preferidos são o maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como vários ésteres de maitansinol. Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para preparar os conjugados anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, aqueles descritos na Patente U.S. n.° 5,208,030 ou na Patente EP 0 425 235 BI e em Chari et al., Câncer
Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos dissulfureto, grupos tioéter, grupos lábeis de ácidos, grupos fotolábeis, grupos lábeis de peptidases ou grupos lábeis de esterases, conforme descrito nas patentes acima identificadas, em que os grupos dissulfureto e tioéter são preferidos.
Os conjugados do anticorpo e do maitansinóide poderão ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HC1), ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis(p-azidobenzoí1)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (como bis(p-diazóniobenzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de bis-flúor activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Os agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem 119 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem, J, 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para fornecer uma ligação dissulfureto. O adaptador poderá estar ligado à molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação éster poderá ser formada por reacção com um grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamento convencionais. A reacção poderá ocorrer na posição C-3 que possui um grupo hidroxilo, na posição C-14 modificada com hidroximetilo, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo e na posição C-20 possuindo um grupo hidroxilo. Numa concretização preferida, a ligação é formada ao nivel da posição C-3 do maitansinol ou de um análogo do maitansinol.
Caliqueamicina
Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo anti-TAT conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos da caliqueamicina é capaz de produzir quebras no ADN de cadeia dupla presente em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família da caliqueamicina, consultar as Patentes U.S. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas concedidas a American Cyanamid Company). Os análogos estruturais da caliqueamicina que poderão ser utilizados incluem, embora não estejam limitados a estes, γχ1, α2Ι, α.3τ, N-acetil-γχ1, PSAG e Θ1! (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as Patentes U.S. concedidas a American Cyanamid acima referidas). Outro fármaco antitumoral com o qual o anticorpo pode ser conjugado é o QFA que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como o QFA têm locais de acção intracelulares e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Assim, a captação celular destes agentes através de uma internalização mediada por anticorpo aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos. 120 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Outros agentes citotóxicos
Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados com os anticorpos anti-TAT do invento incluem BCNU, estreptozocina, vincristina e 5-fluorouracilo, a família de agentes conhecidos colectivamente como complexo LL-E33288 descrita nas Patentes U.S. 5,053,394 e 5,770,710, assim como as esperamicinas (Patente U.S. 5,877,296).
As toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A da toxina diftérica, fragmentos activos de não ligação da toxina diftérica, a cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , a cadeia A da ricina, a cadeia A da abrina, a cadeia A da modecina, a alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), o inibidor de melão-de-são-caetano, a curcina, a crotina, o inibidor de Sapaonaria officinalis, a gelonina, a mitogilina, a restrictocina, a fenomicina, a enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, WO 93/21232 publicada em 28 de Outubro de 1993. O presente invento contempla ainda um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com actividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de ADN como uma desoxirribonuclease; ADNase).
Para a destruição selectiva do tumor, o anticorpo poderá compreender um átomo extremamente radioactivo. Está disponível uma variedade de isótopos radioactivos para a produção de anticorpos anti-TAT radioconjugados. Os exemplos 711-211 T131 T125 v90 π 186 π 188 0 153 ,-,-212 π32 ,-,,212 incluem At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi , P , Pb e isótopos radioactivos de Lu. Quando é utilizado para diagnóstico, o conjugado poderá compreender um átomo radioactivo para estudos de cintigrafia, por exemplo Tc99m ou I , ou um marcador de spin para ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imagens de ressonância magnética), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganês ou ferro. 121 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Os radiomarcadores ou outros marcadores poderão ser incorporados no conjugado de formas conhecidas. Por exemplo, o péptido poderá ser biossintetizado ou poderá ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados que envolvem, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Marcadores como Tc99m ou I , Re , Re e In podem ser ligados via um resíduo de cisteína no péptido. O ítrio-90 pode ser ligado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser utilizado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) descreve outros métodos em pormenor.
Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico poderão ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos
(como suberato de disuccinimidilo), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis(p-azidobenzoí1)hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (como bis(p-diazóniobenzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de bis-flúor activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina com ricina pode ser preparada da forma descrita em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triamino- pentacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de um radionucleótido com o anticorpo. Ver WO94/11026. O adaptador poderá ser um ''adaptador clivável" que facilita a libertação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, é possível utilizar um adaptador lábil ácido, um adaptador sensível a peptidases, um adaptador fotolábil, um adaptador dimetilo ou um adaptador contendo dissulfureto (Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992); Patente U.S. n.° 5,208,020).
Em alternativa, poderá preparar-se uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo anti-TAT e o agente citotóxico, por 122 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ exemplo, através de técnicas recombinantes ou de síntese de péptidos. O comprimento do ADN poderá compreender as respectivas regiões que codificam as duas porções do conjugado, quer adjacentes uma à outra quer separadas por uma região que codifica um péptido adaptador que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.
Ainda em outra concretização, o anticorpo poderá ser conjugado com um "receptor" (como a estreptavidina) para utilização em pré-direccionamento para o tumor, em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao doente, seguido de remoção do conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de eliminação e depois da administração de um "ligando" (por exemplo, a avidina) que está conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleótido). 10. Imunolipossomas
Os anticorpos anti-TAT aqui descritos também poderão ser formulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula constituída por vários tipos de lipidos, fosfolípidos e/ou tensioactivo que é útil para a entrega de um fármaco a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão normalmente dispostos numa formação em bicamada, similar à disposição dos lipidos das membranas biológicas. Os lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, como descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); Patentes U.S. n.os 4,485,045 e 4,544,545; e W097/38731 publicada em 23 de Outubro 1997. Lipossomas com um tempo de circulação melhorado estão descritos na Patente U.S. n.° 5,013,556. É possível gerar lipossomas particularmente úteis pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipidos que compreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extruídos através de filtros de tamanho de poro definido para originar lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento podem ser conjugados com os lipossomas da forma descrita em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982), via uma 123 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ reacção de permuta de dissulfureto. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido no lipossoma. Ver Gabizon et al., J.National Câncer Inst. 81(19):1484 (1989).
B. Oligopéptidos de ligação a TAT
Os oligopéptidos de ligação a TAT do presente invento são oligopéptidos que se ligam, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito. Os oligopéptidos de ligação a TAT poderão ser sintetizados quimicamente utilizando uma metodologia de síntese de oligopéptidos conhecida, ou poderão ser preparados e purificados utilizando tecnologia recombinante. Os oligopéptidos de ligação a TAT têm geralmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos de comprimento, em alternativa pelo menos cerca de 6, 7 , 8, 9, O \—1 11, 12, 13, \—1 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, OO 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61. 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimento ou mais, em que estes oligopéptidos são capazes de se : ligar, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito. Os oligopéptidos de ligação a TAT poderão ser identificados sem necessidade de uma experimentação excessiva, utilizando técnicas bem conhecidas. Neste sentido, salienta-se que as técnicas para rastrear bibliotecas de oligopéptidos relativamente a oligopéptidos que são capazes de se ligar especif icamente a um alvo polipeptidico são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Patentes U.S. n.os 5, 556, 762, 5, 750,373, 4,708, 871, 4, 833, 092, 5, 223, 409,
5, 403,484, 5, 571, 689, 5, 663, 143; Publicações PCT n.os WO 84/03506 e WO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82:178-182 (1985): Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J.
Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) 124 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363; e Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).
Neste sentido, a apresentação em bacteriófagos (fagos) é uma técnica bem conhecida que permite rastrear bibliotecas grandes de oligopéptidos para identificar membro(s) dessas bibliotecas que são capazes de se ligar especificamente a um alvo polipeptidico. A apresentação em fagos é uma técnica mediante a qual os polipéptidos de variantes são apresentados como proteínas de fusão com a proteína de capa na superfície das partículas de bacteriófago. (Scott, J.K. and Smith, G.P. (1990) Science 249: 386) . A utilidade da apresentação em fagos assenta no facto de grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorizadas de forma selectiva (ou de ADNc clonados de forma aleatória) poderem ser rápida e eficientemente tríadas quanto a sequências que se ligam a uma molécula-alvo com afinidade elevada. A apresentação de bibliotecas de péptidos (Cwirla, S. B. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378) ou de proteínas (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363) em fagos tem sido utilizada para rastrear milhões de polipéptidos ou de oligopéptidos e identificar aqueles que possuem propriedades de ligação específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). A triagem de bibliotecas de mutantes aleatórios em fagos requer uma estratégia para construir e propagar um número elevado de variantes, um procedimento de purificação por afinidade utilizando o receptor-alvo e um meio de avaliação dos resultados dos enriquecimentos da ligação. Patentes U.S. n.os 5, 223, 409, 5, 403, 484, 5,571, 689 e 5, 663, 143.
Embora a maioria dos métodos de apresentação em fagos tenha utilizado fagos filamentosos, também são conhecidos sistemas de apresentação em fagos lambda (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de apresentação em fagos T4 (Ren, Z-J. et al. (1998) Gene 215:439; Zhu, Z. (1997) CAN 33:534; Jiang, J. et al. (1997) CAN 128:44380; Ren, Z-J. et al. (1997) CAN 127:215644; Ren, Z.J. (1996) Protein Sei. 5:1833; Efimov, V. 125 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ Ρ. et al. (1995) Vírus Genes 10:173) e sistemas de apresentação em fagos T7 (Smith, G. P. and Scott, J.K. (1993) Methods in Enzymoloqy, 217, 228-257; U.S. 5,766,905).
Muitas outras melhorias e variações do conceito básico de apresentação em fagos foram agora desenvolvidas. Estes aperfeiçoamentos melhoram a capacidade dos sistemas de apresentação para rastrear as bibliotecas de péptidos quanto a ligação às moléculas-alvo seleccionadas, e para apresentar proteínas funcionais com o potencial de rastrear estas proteínas quanto às propriedades desejadas. Desenvolveram-se dispositivos de reacção combinatórios para as reacções de apresentação em fagos (WO 98/14277), e as bibliotecas de apresentação em fagos têm sido utilizadas para analisar e controlar as interacções bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) e as propriedades dos péptidos helicoidais constrangidos (WO 98/20036). WO 97/35196 descreve um método de isolamento de um ligando de afinidade, em que uma biblioteca de apresentação em fago é colocada em contacto com uma solução em que o ligando se ligará a uma molécula-alvo e com uma segunda solução em que o ligando de afinidade não se ligará à molécula-alvo, para isolar selectivamente ligandos de ligação. WO 97/46251 descreve um método de "biopanning" de uma biblioteca aleatória de apresentação em fago com um anticorpo purificado por afinidade e isolamento do fago que se liga, seguido de um processo de "micropanning" utilizando poços de microplacas para isolar o fago que se liga com uma afinidade elevada. A utilização da proteína A de Staphlylococcus aureus como marca de afinidade também foi referida (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 descreve a utilização de bibliotecas de subtracção de substratos para diferenciar as especificidades de enzimas, utilizando uma biblioteca combinatória que poderá ser uma biblioteca de apresentação em fago. Um método de selecção de enzimas adequadas para uso em detergentes utilizando a apresentação em fagos está descrita em WO 97/09446. Métodos adicionais para seleccionar proteínas de ligação específicas estão descritos nas Patentes U.S. n.os 5,498,538, 5,432,018 e em WO 98/15833. Métodos para gerar bibliotecas de péptidos e rastrear estas bibliotecas estão também descritos nas Patentes U.S. 126 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ η.03 5 , 7 2 3,2 8 6 , 5 , 4 3 2,0 1 8 , 5 , 5 8 0,7 1 7 , 5 , 4 2 7,9 0 8 , 5 , 4 9 8,5 3 0, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 e 5,723,323.
C. Moléculas orgânicas de ligação a TAT
As moléculas orgânicas de ligação a TAT são moléculas orgânicas diferentes de oligopéptidos ou de anticorpos como aqui definidos que se ligam, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito. As moléculas orgânicas de ligação a TAT poderão ser identificadas e sintetizadas quimicamente utilizando metodologia conhecida (ver, por exemplo, Publicação PCT n.° WO 00/00823 e WO 00/39585). As moléculas orgânicas de ligação a TAT têm geralmente um tamanho inferior a cerca de 2.000 daltons, em alternativa um tamanho inferior a cerca de 1.500, 750, 500, 250 ou 200 daltons, em que estas moléculas orgânicas que são capazes de se ligar, de preferência especificamente, a um polipéptido TAT como aqui descrito poderão ser identificadas sem necessidade de uma experimentação excessiva, utilizando técnicas bem conhecidas. Neste sentido, salienta-se que as técnicas para rastrear bibliotecas de moléculas orgânicas quanto a moléculas que são capazes de se ligar a um alvo polipeptidico são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Publicações PCT n.os WO 00/00823 e WO 00/39585). As moléculas orgânicas de ligação a TAT poderão ser, por exemplo, aldeídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias, hidrazinas N-substituídas, hidrazidas, álcoois, éteres, tióis, tioéteres, dissulfuretos, ácidos carboxilicos, ésteres, amidas, ureias, carbamatos, carbonatos, cetais, tiocetais, acetais, tioacetais, halogenetos de arilo, sulfonatos de arilo, halogenetos de alquilo, sulfonatos de alquilo, compostos aromáticos, compostos heterociclicos, anilinas, alcenos, alcinos, dióis, amino-álcoois, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloretos de sulfonilo, compostos diazo, cloretos de ácidos ou compostos idênticos. 127 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ D. Rastreio de anticorpos anti-TAT, oligopéptidos de ligação a TAT e moléculas orgânicas de ligação a TAT com as propriedades desejadas
As técnicas para gerar anticorpos, oligopéptidos e moléculas orgânicas que se ligam a polipéptidos TAT têm sido descritas acima. É possível seleccionar adicionalmente anticorpos, oligopéptidos ou outras moléculas orgânicas com determinadas características biológicas, conforme desejado.
Os efeitos inibidores do crescimento de um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou outra molécula orgânica do invento poderão ser avaliados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando células que expressam um polipéptido TAT quer endogenamente quer após transfecção com o gene TAT. Por exemplo, linhas de células tumorais e células transfectadas com TAT apropriadas poderão ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-TAT, um oligopéptido ou outra molécula orgânica do invento em várias concentrações durante alguns dias (por exemplo, 2-7 dias) e coradas com violeta de cristal ou MTT ou analisadas por meio de algum outro ensaio colorimétrico. Outro método de medição da proliferação seria através da comparação da captação de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência de um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT do invento. Após tratamento, as células são colhidas, e a quantidade de radioactividade incorporada no ADN é quantificada num contador de cintilações. Os controlos positivos apropriados incluem o tratamento de uma linha celular seleccionada com um anticorpo inibidor do crescimento que se sabe inibir o crescimento dessa linha celular. A inibição do crescimento de células tumorais in vivo pode ser determinada de várias formas conhecidas na técnica. Preferencialmente, a célula tumoral é uma célula que sobreexpressa um polipéptido TAT. De preferência, o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido de ligação a TAT ou a molécula orgânica de ligação a TAT inibirão a proliferação celular de uma célula tumoral que expressa TAT, in vitro ou in vivo, em cerca de 25-100% em comparação com a célula tumoral não tratada, mais preferencialmente em cerca de 30-100%, e ainda mais preferencialmente em cerca de 50-100% ou 70-100%, numa concretização, a uma concentração do 128 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ anticorpo de cerca de 0,5 a 30 μΐ/ml. A inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração do anticorpo de cerca de 0,5 a 30 pg/ml ou de cerca de 0,5 nM a 200 nM em cultura celular, em que a inibição do crescimento é determinada 1-10 dias após a exposição das células tumorais ao anticorpo. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo se a administração do anticorpo anti-TAT, numa quantidade compreendida entre cerca de 1 pg/kg e cerca de 100 mg/kg de peso corporal, resultar em redução do tamanho do tumor ou redução da proliferação das células tumorais no período de cerca de 5 dias a 3 meses desde a primeira administração do anticorpo, preferencialmente no período de cerca de 5 a 30 dias.
Para seleccionar um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido de ligação a TAT ou uma molécula orgânica de ligação a TAT que induz morte celular, a perda de integridade da membrana conforme indicada, por exemplo, pela captação de iodeto de propídio (PI), azul de tripano ou 7AAD poderá ser avaliada em relação ao controlo. Um ensaio de captação de PI pode ser efectuado na ausência de complemento e de células efectoras imunes. As células tumorais que expressam o polipéptido TAT são incubadas apenas com meio ou com meio contendo o anticorpo anti-TAT (por exemplo, a cerca de 10 pg/ml), o oligopéptido de ligação a TAT ou a molécula orgânica de ligação a TAT apropriados. As células são incubadas durante um período de 3 dias. Após cada tratamento, as células são lavadas e aliquotadas para tubos de 12 x 75 munidos de tampas com filtros de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para a remoção de tufos de células. Os tubos recebem depois PI (10 pg/ml). As amostras poderão ser analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCAN® e o software FACSCONVERT® CellQuest (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos anti-TAT, oligopéptidos de ligação a TAT ou moléculas orgânicas de ligação a TAT que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular, tal como determinada pela captação de PI, poderão ser seleccionados como anticorpos anti-TAT, oligopéptidos de ligação a TAT ou moléculas orgânicas de ligação a TAT indutores de morte celular. 129 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Para pesquisar anticorpos, oligopéptidos ou outras moléculas orgânicas que se ligam a um epitopo num polipéptido TAT ligado por um anticorpo de interesse, é possível efectuar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Este ensaio pode ser utilizado para determinar se um anticorpo, oligopéptido ou outra molécula orgânica de teste se liga ao mesmo local ou epitopo que um anticorpo anti-TAT conhecido. Em alternativa, ou adicionalmente, é possível fazer um mapeamento de epitopos por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a sequência do anticorpo pode sofrer mutagénese, tal como por varrimento de alanina, para identificar os resíduos de contacto. 0 anticorpo mutante é inicialmente testado quanto a capacidade de ligação com um anticorpo policlonal para garantir a existência de um enrolamento correcto. Num método diferente, os péptidos correspondentes a diferentes regiões de um polipéptido TAT podem ser utilizados em ensaios de competição com os anticorpos de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epitopo caracterizado ou conhecido E. Terapia com profármacos mediada por enzimas dependente de anticorpo (ADEPT)
Os anticorpos do presente invento também poderão ser utilizados em ADEPT ("Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy") através da conjugação do anticorpo com uma enzima de activação do profármaco, que converte um profármaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidilo, ver WO81/01145) num fármaco anticanceroso activo. Ver, por exemplo, WO88/07378 e Patente U.S. 4,975,278. 0 componente enzimático do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de actuar sobre um profármaco de forma a convertê-lo na sua forma citotóxica mais activa.
As enzimas que são úteis no método deste invento incluem, embora não estejam limitadas a estas, a fosfatase alcalina útil para converter profármacos contendo fosfato em fármacos livres; a arilsulfatase útil para converter profármacos contendo sulfato em fármacos livres; a citosina- 130 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ desaminase útil para converter a 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticanceroso 5-fluorouracilo; proteases como a protease de Serratia, a termolisina, a subtilisina, as carboxipeptidases e as catepsinas (como as catepsinas B e L), que são úteis para converter profármacos contendo péptidos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases úteis para converter profármacos que contêm substituintes D-aminoácido; enzimas que clivam hidratos de carbono, como a β- galactosidase e a neuraminidase, úteis para converter profármacos glicosilados em fármacos livre; a β-lactamase útil para converter fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e as penicilina amidases, como a penicilina V amidase ou a penicilina G amidase, úteis para converter fármacos derivatizados ao nível dos azotos das suas aminas com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Em alternativa, os anticorpos com actividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas", podem ser utilizados para converter os profármacos do invento em fármacos activos livres (ver, por exemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Os conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados da forma aqui descrita para entrega da abzima a uma população de células tumorais.
As enzimas deste invento podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos anti-TAT por métodos bem conhecidos na técnica, tal como a utilização dos reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Em alternativa, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação do antigénio de um anticorpo do invento ligada a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima do invento podem ser construídas utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)). F. Polipéptidos TAT completos 0 presente invento também disponibiliza sequências nucleotídicas recentemente identificadas e isoladas que codificam polipéptidos designados no presente pedido por polipéptidos TAT. Em particular, identificaram-se e isolaram-se ADNc (parciais e completos) que codificam vários 131 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ polipéptidos ΤΑΤ, conforme descrito em maior pormenor nos Exemplos abaixo.
Como descrito nos Exemplos abaixo, vários clones de ADNc foram depositados junto da ATCC. As sequências nucleotidicas efectivas desses clones podem ser facilmente determinadas pelo perito, mediante sequenciação do clone depositado utilizando métodos de rotina na técnica. A sequência de aminoácidos prevista pode ser determinada a partir da sequência nucleotidica utilizando perícia de rotina. Para os polipéptidos TAT e ácidos nucleicos codificantes aqui descritos, em alguns casos, os requerentes identificaram o que se crê ser a grelha de leitura melhor identificável com a informação sobre a sequência disponível no momento.
G. Variantes de anticorpos anti-TAT e polipéptidos TAT
Além dos anticorpos anti-TAT e dos polipéptidos TAT de sequência nativa completos aqui descritos, está contemplada a possibilidade de preparar variantes dos anticorpos anti-TAT e dos polipéptidos TAT. As variantes dos anticorpos anti-TAT e dos polipéptidos TAT podem ser preparadas através da introdução de alterações nucleotidicas apropriadas no ADN codificante e/ou por síntese do anticorpo ou polipéptido desejado. Os peritos na técnica entenderão que as alterações de aminoácidos poderão alterar os processos pós-traducionais do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT, como seja a modificação do número ou posição dos locais de glicosilação ou a alteração das características de ancoragem à membrana.
As variações nos anticorpos anti-TAT e nos polipéptidos TAT aqui descritos podem ser realizadas, por exemplo, utilizando qualquer uma das técnicas e directrizes para mutações conservativas e não conservativas expostas, por exemplo, na Patente U.S. n.° 5,364,934. As variações poderão ser uma substituição, uma deleção ou uma inserção de um ou mais codões que codificam o anticorpo ou o polipéptido, que resulta numa modificação da sequência de aminoácidos em comparação com o anticorpo ou o polipéptido de sequência nativa. Opcionalmente, a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido num ou mais dos domínios do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT. Uma orientação para determinar que resíduo de aminoácido poderá 132 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ser introduzido, substituído ou eliminado sem afectar negativamente a actividade desejada poderá ser encontrada através de uma comparação da sequência do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT com a sequência de proteínas homólogas conhecidas e minimização do número de modificações da sequência de aminoácidos efectuadas em regiões de homologia elevada. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido por outro aminoácido possuindo propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, como seja a substituição de uma leucina por uma serina, isto é, substituições de aminoácidos conservativas. As inserções ou deleções poderão estar opcionalmente situadas no intervalo de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida poderá ser determinada efectuando sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes quanto à actividade apresentada pela sequência nativa completa ou madura.
Fragmentos dos anticorpos anti-TAT e dos polipéptidos TAT são aqui disponibilizados. Tais fragmentos poderão estar truncados ao nível da extremidade N-terminal ou C-terminal ou poderão carecer de resíduos internos, por exemplo, quando comparados com um anticorpo ou uma proteína nativa completos. Determinados fragmentos carecem de resíduos de aminoácidos que não são essenciais para uma actividade biológica desejada do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT.
Os fragmentos dos anticorpos anti-TAT e dos polipéptidos TAT poderão ser preparados por qualquer uma de várias técnicas convencionais. Os fragmentos de péptidos desejados poderão ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve gerar fragmentos do anticorpo ou do polipéptido por digestão enzimática, por exemplo, tratando a proteína com uma enzima conhecida por clivar as proteínas em locais definidos por resíduos de aminoácidos particulares, ou digerindo o ADN com enzimas de restrição adequadas, e isolando o fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um fragmento de ADN que codifica um fragmento desejado do anticorpo ou do polipéptido por reacção em cadeia da polimerase (PCR). Oligonucleótidos que definem os extremos desejados do fragmento de ADN são empregues nos iniciadores 5' e 3' na reacção de PCR. De preferência, os fragmentos do anticorpo anti-TAT e do polipéptido TAT partilham pelo menos uma actividade biológica e/ou imunológica com o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT nativo aqui descritos. 133 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Em concretizações particulares, as substituições conservativas de interesse estão apresentadas na Tabela 6 sob o titulo de substituições preferidas. Caso tais substituições resultem numa modificação da actividade biológica, então introduzem-se modificações mais substanciais, designadas por substituições exemplificativas na Tabela 6, ou adicionalmente descritas abaixo em referência às classes de aminoácidos, e os produtos são rastreados.
Tabela 6
Substituições preferidas
Resíduo Substituições original exemplificativas
Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro ; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; ala; phe ; leu norl eucina Leu (L) norl eucina; il e; vai ; met; ile ala; phe Lys (K) arg; gin asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; leu norl eucina 134 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Obtêm-se modificações substanciais na função ou na identidade imunológica do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT através da selecção de substituições que diferem significativamente quanto ao seu efeito de manutenção (а) da estrutura do esqueleto polipeptidico na área da substituição, por exemplo, uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local-alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos que existem naturalmente estão divididos em grupos com base em propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofilicos neutros: cys, ser, thr; (3) acidicos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (б) aromáticos: trp, tyr, phe.
As substituições não conservativas implicarão trocar um membro de uma destas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também poderão ser introduzidos nos locais de substituições conservativas ou, mais preferencialmente, nos restantes locais (não conservados).
As variações podem ser efectuadas utilizando métodos conhecidos na técnica como a mutagénese (dirigida) mediada por oligonucleótidos, o varrimento de alanina e a mutagénese por PCR. A mutagénese dirigida [Cárter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], a mutagénese via cassete [Wells et al.,
Gene, 34:315 (1985)], a mutagénese por restrição-selecção [Wells et al., Philos, Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser aplicadas ao ADN clonado para produzir o ADN da variante do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT. A análise de varrimento de aminoácidos também pode ser empregue para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos de varrimento 135 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ preferidos estão os aminoácidos relativamente pequenos e neutros. Estes aminoácidos incluem a alanina, a glicina, a serina e a cisteina. A alanina é tipicamente um aminoácido de varrimento preferido entre este grupo, pois elimina a cadeia lateral além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. A alanina também é tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Além disso, encontra-se frequentemente em posições tanto internas como expostas [Creighton. The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição de alanina não proporcionar quantidades adequadas da variante, é possível utilizar um aminoácido isotérico.
Qualquer resíduo de cisteina não envolvido na manutenção da conformação correcta do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT também poderá ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar uma reticulação aberrante. Reciprocamente, é possível adicionar ligação(ões) de cisteina ao anticorpo anti-TAT ou ao polipéptido TAT para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo como seja um fragmento Fv).
Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para desenvolvimento adicional possuirão propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo parental a partir do qual são gerados. Uma forma conveniente de gerar estas variantes de substituição envolve a maturação por afinidade utilizando a apresentação em fagos. Resumidamente, vários locais da região hipervariável (por exemplo, 6-7 locais) são mutados para gerar todas as substituições amino possíveis em cada local. As variantes do anticorpo assim geradas são apresentadas de uma forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso, como fusões com o produto do gene III de M13 empacotadas em cada partícula. As variantes apresentadas em fago são depois rastreadas quanto à sua actividade 136 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como aqui descrito. De modo a identificar locais da região hipervariável candidatos a modificação, a mutagénese de varrimento de alanina pode ser efectuada para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação do antigénio. Em alternativa, ou adicionalmente, poderá ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o polipéptido TAT humano. Estes resíduos de contacto e os resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez geradas estas variantes, o painel de variantes é sujeito a rastreio como aqui descrito, e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes poderão ser seleccionados para desenvolvimento subsequente.
As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo anti-TAT são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na arte. Estes métodos incluem, embora não estejam limitados a estes, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou a preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida), mutagénese por PCR e mutagénese via cassete de uma variante preparada anteriormente ou de uma versão não variante do anticorpo anti-TAT. H. Modificações dos anticorpos anti-TAT e polipéptidos
TAT
As modificações covalentes dos anticorpos anti-TAT e dos polipéptidos TAT estão incluídas no âmbito deste invento. Um tipo de modificação covalente inclui a reacção de resíduos de aminoácidos visados de um anticorpo anti-TAT ou polipéptido TAT com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N-terminais ou C-terminais do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticular o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT com uma superfície ou uma matriz de suporte insolúvel em água destinada a utilização no método de 137 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ purificação de anticorpos anti-TAT e vice-versa. Os agentes de reticulação habitualmente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidilo como 3,3'-ditiobis(propionato de succinimidilo), maleimidas bifuncionais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes como 3-[(p-azidofenil)ditio]-propioimidato de metilo.
Outras modificações incluem a desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo para os correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo, respectivamente, a hidroxilação de prolina e lisina, a fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, a metilação dos grupos a-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], a acetilação da amina N-terminal e a amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT incluída no âmbito deste invento compreende a alteração do padrão de glicosilação nativo do anticorpo ou do polipéptido. O termo "alteração do padrão de glicosilação nativo", para os objectivos deste invento, pretende significar a deleção de um ou mais grupos funcionais hidrato de carbono encontrados no anticorpo anti-TAT ou no polipéptido TAT de sequência nativa (quer removendo o local de glicosilação subjacente quer eliminando a glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos) e/ou a adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo anti-TAT ou no polipéptido TAT nativo. Adicionalmente, a frase inclui modificações qualitativas da glicosilação das proteínas nativas, envolvendo uma alteração da natureza e das proporções dos vários grupos funcionais hidrato de carbono presentes. A glicosilação dos anticorpos e outros polipéptidos é tipicamente N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à ligação do grupo funcional hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências 138 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido com excepção de prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática do grupo funcional hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. A glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais habitualmente a serina ou a treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou a 5-hidroxilisina também possam ser utilizadas. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo anti-TAT ou ao polipéptido TAT é convenientemente obtida através de alteração da sequência de aminoácidos de modo a conter uma ou mais das sequências tripeptídicas descritas acima (para os locais de glicosilação N-ligada). A alteração também poderá ser feita mediante a adição de, ou a substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT original (para os locais de glicosilação O-ligada). A sequência de aminoácidos do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT poderá ser opcionalmente modificada através de alterações ao nível do ADN, particularmente por mutação do ADN que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT ao nível de bases pré-seleccionadas, de modo a gerar codões que serão traduzidos nos aminoácidos desejados.
Outro meio de aumentar o número de grupos funcionais hidrato de carbono no anticorpo anti-TAT ou no polipéptido TAT é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Estes métodos estão descritos na técnica, por exemplo, em WO 87/05330, publicada em 11 de Setembro de 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306 (1981). A remoção de grupos funcionais hidrato de carbono presentes no anticorpo anti-TAT ou no polipéptido TAT poderá ser obtida química ou enzimaticamente, ou por meio da substituição mutacional de codões que codificam resíduos de aminoácidos que servem de alvos para a glicosilação. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas na técnica 139 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ e são descritas, por exemplo, por Hakimuddin et al., Arch Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal.
Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática dos grupos funcionais hidrato de carbono no polipéptido pode ser alcançada mediante a utilização de uma variedade de endo- e exoglicosidases conforme descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT compreende a ligação do anticorpo ou do polipéptido a um de vários polímeros de carácter não proteico, por exemplo, o polietilenoglicol (PEG), o polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da forma apresentada nas Patentes U.S. n.os 4, 640, 835; 4, 496, 689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ou 4.179.337. O anticorpo ou polipéptido também poderá ser encapsulado em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente) em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980). 0 anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT do presente invento também poderá ser modificado de modo a formar moléculas quiméricas que compreendem um anticorpo anti-TAT ou um polipéptido TAT fundido com outro polipéptido ou sequência de aminoácidos heterólogo.
Numa concretização, uma molécula quimérica deste tipo compreende uma fusão do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT com uma marca polipeptídica que fornece um epitopo ao qual um anticorpo anti-marca se pode ligar selectivamente. A marca epitópica é geralmente colocada na extremidade amino-terminal ou carboxi-terminal do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT. A presença destas formas do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT contendo marcas epitópicas pode ser detectada utilizando um anticorpo contra a marca polipeptídica. Adicionalmente, a disponibilização da marca 140 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ epitópica permite que o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT seja facilmente purificado através de purificação por afinidade, utilizando um anticorpo anti-marca ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga à marca epitópica. Várias marcas polipeptídicas e os seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os exemplos incluem as marcas poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); a marca polipeptidica HA da gripe e o respectivo anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; a marca c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para ela [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e a marca constituída pela glicoproteína D (gD) do vírus Herpes simplex e o seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6);547-553 (1990)]. Outras marcas polipeptídicas incluem o péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; o péptido epitópico KT3 [Martin et al. , Science, 255:192-194 (1992)]; um péptido epitópico α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e a marca peptídica correspondente à proteína do gene 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)].
Numa concretização alternativa, a molécula quimérica poderá compreender uma fusão do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também designada por "imunoadesina"), esta fusão poderia ser com a região Fc de uma molécula IgG. As fusões Ig incluem preferencialmente a inclusão de uma forma solúvel (domínio transmembranar eliminado ou inactivado) de um anticorpo anti-TAT ou um polipéptido TAT em substituição de pelo menos uma região variável numa molécula Ig. Numa concretização particularmente preferida, a fusão com a imunoglobulina inclui as regiões de dobradiça, 0¾ e CH3 ou as regiões de dobradiça, CHi, CH2 e CH3 de uma molécula IgGl. Para a produção de fusões com imunoglobulinas, ver também a Patente U.S. n.° 5,428,130, concedida em 27 de Junho de 1995.
I. Preparação de anticorpos anti-TAT e polipéptidos TAT A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de anticorpos anti-TAT e de polipéptidos TAT por cultura de 141 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ células transformadas ou transfectadas com um vector contendo o ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT. Está, naturalmente, contemplada a utilização de métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, para preparar os anticorpos anti-TAT e os polipéptidos TAT. Por exemplo, a sequência de aminoácidos apropriada, ou porções desta, poderá ser produzida por síntese directa de péptidos utilizando técnicas em fase sólida [ver, por exemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A síntese de proteínas in vitro poderá ser efectuada utilizando técnicas manuais ou através de automação. A síntese automatizada poderá ser obtida, por exemplo, utilizando um sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, Califórnia), de acordo com as instruções do fabricante. Várias porções do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT poderão ser quimicamente sintetizadas em separado e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos, para produzir o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT desejado.
1. Isolamento do ADN que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT O ADN que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT poderá ser obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de um tecido que se crê possuir o ARNm do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT e expressá-lo num nível detectável. Por conseguinte, o ADN do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT humano pode ser obtido convenientemente a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano. O gene que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT também poderá ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese automatizada de ácidos nucleicos).
As bibliotecas podem ser rastreadas com sondas (tais como oligonucleótidos com pelo menos cerca de 20-80 bases) concebidas para identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. O rastreio da biblioteca genómica ou de ADNc com a sonda seleccionada poderá ser efectuado utilizando 142 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para
isolar o gene que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT consiste em utilizar a metodologia de PCR
[Sambrook et al., acima; Dieffenbach et al., PCR Primer: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
As técnicas para rastrear uma biblioteca de ADNc são bem conhecidas na técnica. As sequências oligonucleotidicas seleccionadas como sondas devem possuir um comprimento suficiente e ser suficientemente inequívocas para minimizar os falsos positivos. O oligonucleótido é preferencialmente marcado de modo a poder ser detectado quando a hibridação com o ADN da biblioteca estiver a ser rastreada. Os métodos de marcação são bem conhecidos na técnica e incluem a utilização de radiomarcadores como ATP marcado com 32P, a biotinilação ou a marcação enzimática. As condições de hibridação, incluindo uma estringência moderada e uma estringência elevada, são fornecidas em Sambrook et al., acima.
As sequências identificadas nestes métodos de rastreio de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas, como o GenBank, ou outras bases de dados de sequências privadas. A identidade de sequência (seja ao nível de aminoácidos ou de nucleótidos) em regiões definidas da molécula ou ao longo da sequência completa pode ser determinada utilizando métodos conhecidos na técnica e da forma aqui descrita. 0 ácido nucleico possuindo uma sequência codificante de proteína poderá ser obtido através do rastreio de bibliotecas genómicas ou de ADNc seleccionadas, utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui descrita pela primeira vez e, se necessário, utilizando procedimentos convencionais de extensão de iniciadores, como descrito em Sambrook et al., acima, para detectar precursores e intermediários de processamento do ARNm que poderão não ter sido retrotranscritos para ADNc. 143 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 2. Selecção e transformação de células hospedeiras
As células hospedeiras são transfectadas ou
transformadas com vectores de expressão ou de clonagem aqui descritos para a produção do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT e cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. As condições de cultura, como os meios, a temperatura, o pH e factores similares, podem ser seleccionados pelo perito sem uma experimentação excessiva. Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas de células podem ser encontrados em Maromalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL
Press, 1991) e Sambrook et al., acima.
Os métodos de transfecção de células eucarióticas e de transformação de células procarióticas são conhecidos dos peritos, por exemplo, CaCl2, CaP04, mediada por lipossomas e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é efectuada utilizando técnicas padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., acima, ou a electroporação são geralmente utilizados para procariotas. A infecção com Agrobacterium tumefadens é utilizada para a transformação de determinadas células vegetais, como descrito por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e em WO 89/05859, publicada em 29 de Junho de 1989. Para as células de mamíferos sem estas paredes celulares, é possível utilizar o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham & van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspectos gerais das transfecções de sistemas hospedeiros baseados em células de mamíferos foram descritos na Patente U.S. n.° 4,399,216. As transformações em levedura são tipicamente efectuadas de acordo com o método de Van Solingen et al.. J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei, (USA), 76:3829 (1979). Contudo, outros métodos de introdução do ADN em células, como a microinj ecção nuclear, a electroporação, a fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou os policatiões, por exemplo, polibreno ou poliornitina, também poderão ser usados. Para várias técnicas 144 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ de transformação de células de mamíferos, consultar Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o ADN contido nos vectores do invento incluem células de procariotas, levedura ou eucariotas superiores. Os procariotas apropriados incluem, mas não estão limitados a, Eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como E. coli. Estão disponíveis publicamente várias estirpes de E. coli, tais como a estirpe de E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X177 6 (ATCC 31,537); a estirpe de E. coli W3110 (ATCC 27,325) e K5 772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacteriaceae como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, assim como Bacilli como B. subtilis e B.
licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrito em DD 266, 710, publicada em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitativos. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido, uma vez que é uma estirpe hospedeira comum para as fermentações de produtos utilizando ADN recombinante. Preferencialmente, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a estirpe W3110 poderá ser modificada para efectuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas ao hospedeiro, em que os exemplos destes hospedeiros incluem a estirpe de E. coli W3110 1A2, que possui o genótipo completo tonA; a estirpe de E. coli W3110 9E4, que possui o genótipo completo tonA ptr3; a estirpe de E. coli W3110 27C7 (ATCC 55, 244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; a estirpe de E. coli W3110 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; a estirpe de E. coli W3110 40B4, que é uma estirpe 37D6 com uma mutação de deleção degP não resistente a canamicina; e uma estirpe de E. coli contendo uma protease periplasmática mutante descrita na Patente U.S. n.° 4,946,783, concedida em 7 de Agosto de 1990. 145 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Em alternativa, os métodos de clonagem ín vitro, por exemplo, PCR ou outras reacções de polimerases de ácidos nucleicos, são adequados. O anticorpo completo, os fragmentos de anticorpo e as proteínas de fusão do anticorpo podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efectora Fc não são necessárias, tal como acontece quando o anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado por si só mostra eficácia na destruição das células tumorais. Os anticorpos completos possuem uma semivida maior em circulação. A produção em E. coli é mais rápida e mais eficiente em termos de custos. Para a expressão de polipéptidos e de fragmentos de anticorpo em bactérias, ver, por exemplo, U.S. 5,648,237 (Cárter et. al.); U.S. 5,789,199 (Joly et al.) e U.S. 5,840,523 (Simmons et al.) que descrevem as sequências da região de iniciação da tradução (TIR) e de sinal para optimizar a expressão e a secreção. Após a expressão, o anticorpo é isolado a partir da pasta de células de E. coli numa fracção solúvel e pode ser purificado através, por exemplo, de uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser efectuada de modo similar ao processo utilizado para purificar o anticorpo expresso, por exemplo, em células CHO.
Além dos procariotas, os microrganismos eucarióticos como os fungos filamentosos ou a levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vectores que codificam o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT.
Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior normalmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicada em 2 de Maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente U.S. n.° 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por
exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683. CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12, 424), K. bulgaricus (ATCC 16, 045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36, 906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); 146 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Pichia pastoris (ΕΡ 183, 070; Sreekrishma et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Tríchoderma reesia (EP 244, 234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como
Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada em 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada em 10 de Janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus como A. nidulans (Ballance et al., Biochem, Biophys, Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983];
Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984] ) e A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. , 4:475-479 [1985] ). As leveduras metilotrópicas são adequadas e incluem, embora não estejam limitadas a estas, leveduras capazes de crescer em metanol seleccionadas entre os géneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies especificas que são exemplificativas desta classe de leveduras poderá ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo anti-TAT ou de polipéptido TAT glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem células de insectos como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais, tais como as culturas de células de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco. Foram identificadas numerosas estirpes e variantes de baculovirus e as correspondentes células hospedeiras permissivas de insectos a partir de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Várias estirpes virais para transfecção estão disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-l de Autographa calífornica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e estes vírus poderão ser utilizados como os vírus de acordo com o presente invento, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
Contudo, o maior interesse tem incidido nas células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados em 147 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Os exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de células de rim embrionário humano (células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); as células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); as células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); as células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); as células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); as células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); as células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); as células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); as células de fígado de rato Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); as células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75) ; as células de fígado humano (Hep G2, HB 8065) ; o tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); as células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); as células MRC 5; as células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT e cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. 3. Selecção e utilização de um vector replicável O ácido nucleico (por exemplo, ADNc ou ADN genómico) que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT poderá ser inserido num vector replicável para clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Estão disponíveis publicamente vários vectores. O vector poderá, por exemplo, encontrar-se sob a forma de um plasmídeo, um cosmídeo, uma partícula virai ou um fago. A sequência de ácido nucleico apropriada poderá ser inserida no vector por uma variedade de procedimentos. Em geral, o ADN é inserido no(s) local(ais) de uma endonuclease de restrição apropriada, utilizando técnicas conhecidas na 148 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ técnica. Os componentes dos vectores geralmente incluem, embora não estejam limitados a estes, uma ou mais sequências de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais destes componentes utiliza técnicas de ligação comuns, que são conhecidas pelos peritos. O TAT poderá ser produzido de modo recombinante não só directamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que poderá ser uma sequência de sinal ou outro polipéptido que possui um local de clivagem especifico na extremidade N-terminal da proteína ou polipéptido maduro. Em geral, a sequência de sinal poderá ser um componente do vector ou poderá ser uma parte do ADN que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT que está inserido no vector. A sequência de sinal poderá ser uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, entre o grupo das sequências "leader" da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II termicamente estável. Para a secreção em levedura, a sequência de sinal poderá ser, por exemplo, a sequência "leader" da invertase de levedura, a sequência "leader" do factor alfa (incluindo as sequências "leader" do factor α de Saccharomyces e de Kluyveromyces, em que a última está descrita na Patente U.S. n.° 5,010,182), a sequência "leader" da fosfatase ácida, a sequência "leader" da glucoamilase de C. albícans (EP 362,179 publicada em 4 de Abril de 1990) ou a sequência de sinal descrita em WO 90/13646, publicada em 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamíferos, é possível utilizar sequências de sinal de mamíferos para dirigir a secreção da proteína, como sejam as sequências de sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, bem como sequências "leader" secretoras virais.
Ambos os vectores de expressão e de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique em uma ou mais células hospedeiras seleccionadas. Estas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias 149 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Gram-negativas, a origem do plasmideo 2μ é apropriada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para clonar os vectores em células de mamíferos.
Os vectores de expressão e de clonagem conterão normalmente um gene de selecção, também designado por marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos que não estão disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina-racemase para Bacíllí.
Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para as células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para aceitar o ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT, tal como a DHFR ou a timidina-cinase. Uma célula hospedeira apropriada quando se utiliza DHFR de tipo selvagem é a linha de células CHO deficientes em termos de actividade de DHFR, preparada e propagada conforme descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Um gene de selecção apropriado para utilização em levedura é o gene trp 1 presente no plasmideo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al. , Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al. , Gene, 10:157 (1980)]. O gene trpl fornece uma marca de selecção para uma estirpe mutante de levedura que não tem capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Os vectores de expressão e de clonagem geralmente contêm um promotor ligado de forma funcional à sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT para dirigir a síntese do ARNm. Os promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos. Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da β-lactamase e da lactose [Chang et al., Nature, 150 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 275:615 (1978); Goeddel et al. , Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] e promotores híbridos como o promotor tac [deBoer et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)]. Os promotores destinados a utilização em sistemas bacterianos também compreenderão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada de forma funcional ao ADN que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT.
Os exemplos de sequências promotoras adequadas para uso com hospedeiros do tipo levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato-cinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], como a enolase, a gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, a hexoeinase, a piruvato-descarboxilase, a fosfofrutocinase, a glucose-6-fosfato-isomerase, a 3-fosfoglicerato-mutase, a piruvato-cinase, a triose-fosfato-isomerase, a fosfoglucose-isomerase e a glucocinase.
Outros promotores para levedura, que são promotores indutiveis possuindo a vantagem adicional de uma transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, o isocitocromo C, a fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, a metalotioneína, a gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e de galactose. Os vectores e promotores apropriados para utilização na expressão em levedura estão adicionalmente descritos em EP 73,657. A transcrição do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT a partir de vectores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus como o poliomavírus, o vírus da varíola aviária (UK 2,211,504, publicada em 5 de Julho de 1989), o adenovírus (como o adenovírus 2), o vírus do papiloma bovino, o vírus do sarcoma aviário, o citomegalovírus, um retrovírus, o vírus da hepatite B e o vírus símio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde 151 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. A transcrição de um ADN que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT por eucariotas superiores poderá ser aumentada através da inserção de uma sequência amplificadora no vector. Os amplificadores são elementos de ADN de actuação em cis, geralmente com cerca de 10 a 300 pb, que actuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas sequências amplificadoras de genes de mamíferos são agora conhecidas (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, usar-se-á um amplificador de um vírus de células eucarióticas. Os exemplos incluem o amplificador SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o amplificador do promotor precoce de citomegalovírus, o amplificador de polioma no lado tardio da origem de replicação e amplificadores de adenovírus. O amplificador poderá ser introduzido no vector numa posição 5' ou 3' em relação à sequência que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT, mas está preferencialmente localizado num local em 5' do promotor.
Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de leveduras, fungos, insectos, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também compreenderão as sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do ARNm. Estas sequências estão normalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3' de ADNc ou ADN eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT.
Ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT em cultura de células de vertebrados recombinantes estão descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al. , Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; e EP 117,058. 152 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 4. Cultura de células hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo anti-TAT ou o polipéptido TAT deste invento poderão ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios disponíveis comercialmente, como o meio Ham FIO (Sigma) , o meio mínimo essencial ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma) e o meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz, 58:44 (1979) , Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980).
Patentes U.S. n.os 4,767,704; 4, 657,866; 4,927,762; 4,560,655; ou 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente U.S. Re. 30, 985 poderá ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios poderá ser suplementado, conforme necessário, com hormonas e/ou outros factores de crescimento (como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (como HEPES), nucleótidos (como adenosina e timidina), antibióticos (como o fármaco GENTAMYCIN™) , elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também poderão ser incluídos em concentrações apropriadas que são conhecidas dos peritos na técnica. As condições de cultura, como a temperatura, o pH e factores idênticos, são aqueles previamente utilizados com a célula hospedeira seleccionada para a expressão e serão evidentes para o perito. 5. Detecção da amplificação/expressão génica A amplificação e/ou expressão génica poderá ser medida numa amostra directamente, por exemplo, por análise de transferência de Southern convencional, análise de transferência de Northern para quantificar a transcrição do ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 77:5201-5205 (1980) ], "dot blotting" (análise de ADN) ou hibridação in situ, utilizando uma sonda marcada convenientemente, com base nas sequências aqui disponibilizadas. Em alternativa, é possível empregar anticorpos que conseguem reconhecer dúplexes específicos, incluindo dúplexes de ADN, dúplexes de 153 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ARN, dúplexes híbridos de ADN-ARN ou dúplexes de ADN-proteína. Os anticorpos, pelo seu lado, poderão estar marcados, e o ensaio poderá ser realizado com o dúplex preso a uma superfície, de modo que ao ocorrer a formação do dúplex na superfície, a presença do anticorpo preso ao dúplex pode ser detectada. A expressão génica, em alternativa, poderá ser medida através de métodos imunológicos, tais como a coloração imuno-histoquímica de células ou de secções de tecido e a análise da cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto génico. Os anticorpos úteis para a coloração imuno-histoquímica e/ou a análise de fluidos da amostra poderão ser monoclonais ou policlonais e poderão ser preparados em qualquer mamífero. De modo conveniente, os anticorpos poderão ser preparados contra um polipéptido TAT de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui disponibilizadas ou contra uma sequência exógena fundida com o ADN de TAT e que codifica um epitopo para um anticorpo específico. 6. Purificação do anticorpo anti-TAT e do polipéptido
TAT
As formas do anticorpo anti-TAT e do polipéptido TAT poderão ser recuperadas a partir do meio de cultura ou a partir de lisados das células hospedeiras. Caso estejam presas à membrana, elas poderão ser libertadas da membrana utilizando uma solução de detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou através de clivagem enzimática. As células empregues na expressão do anticorpo anti-TAT e do polipéptido TAT podem ser quebradas por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, sonicação, disrupção mecânica ou agentes de lise celular.
Poderá ser desejável purificar o anticorpo anti-TAT e o polipéptido TAT a partir de proteínas ou polipéptidos das células recombinantes. Os procedimentos seguintes são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica como DEAE; cromatofocagem; SDS- 154 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-sepharose para remover contaminantes como IgG; e colunas de metais quelantes para ligar as formas do anticorpo anti-TAT e do polipéptido TAT que contêm marcas epitópicas. É possível utilizar vários métodos de purificação de proteínas, e estes métodos são conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice,
Springer-Verlag, New York (1982). 0(s) passo (s) de purificação seleccionado(s) dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do anticorpo anti-TAT ou do polipéptido TAT particular produzido.
Ao utilizar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico ou ser directamente segregado para o meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como primeira etapa, os resíduos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30 min. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes destes sistemas de expressão normalmente são primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases, como o PMSF, poderá ser incluído em qualquer um dos passos anteriores para inibir a proteólise, e antibióticos poderão ser incluídos para impedir o crescimento de contaminantes acidentais. A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxiapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, em que a cromatografia de afinidade é a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como 155 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ligando de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol, Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz a que o ligando de afinidade é unido é mais geralmente a agarose, embora estejam disponíveis outras matrizes. As matrizes mecanicamente estáveis, como seja o vidro de poro controlado ou o poli(estireno/divinilbenzeno) , permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos do que os obtidos com a agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, Nova Jérsia) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas, como o fraccionamento numa coluna de permuta iónica, a precipitação com etanol, a HPLC de fase reversa, a cromatograf ia em sílica, a cromatografia em heparina-SEPHAROSE™, a cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), a cromatofocagem, a SDS-PAGE e a precipitação com sulfato de amónio, também estão disponíveis dependendo do anticorpo que se pretende recuperar.
Após quaisquer passo(s) de purificação preliminar(es), a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes poderá ser submetida a uma cromatografia de interacção hidrofóbica a baixo pH, utilizando um tampão de eluição com um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferencialmente realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, uma concentração de sal de cerca de 0-0,25 M). J. Formulações farmacêuticas
As formulações terapêuticas dos anticorpos anti-TAT, dos oligopéptidos de ligação a TAT, das moléculas orgânicas de ligação a TAT e/ou dos polipéptidos TAT utilizadas de acordo com o presente invento são preparadas para armazenamento através de mistura do anticorpo, polipéptido, oligopéptido ou molécula orgânica possuindo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente 156 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os receptores nas doses e concentrações empregues e incluem tampões como acetato, Tris, fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetil-benzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono, incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; tonificantes como a trealose e cloreto de sódio; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; tensioactivos como polissorbato; contra-iões que formam sais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG). O anticorpo compreende preferencialmente o anticorpo numa concentração entre 5-200 mg/ml, de preferência entre 10-100 mg/ml.
As formulações também poderão conter mais de um composto activo conforme necessário para a indicação particular em tratamento, preferencialmente aqueles com actividades complementares que não interferem negativamente uns com os outros. Por exemplo, além do anticorpo anti-TAT, do oligopéptido de ligação a TAT ou da molécula orgânica de ligação a TAT, poderá ser desejável incluir um anticorpo adicional na formulação, por exemplo, um segundo anticorpo anti-TAT que se liga a um epitopo diferente no polipéptido TAT ou um anticorpo para outro alvo, tal como um factor de crescimento que afecta o crescimento do cancro particular. Em alternativa, ou adicionalmente, a composição poderá ainda compreender um agente quimioterapêutico, um agente citotóxico, uma citocina, um agente inibidor do crescimento, 157 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ um agente anti-hormonal e/ou um cardioprotector. Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o objectivo pretendido.
Os ingredientes activos também poderão ser encapsulados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).
Poderão preparar-se preparações de libertação controlada. Exemplos adequados de preparações de libertação controlada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que se encontram sob a forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação controlada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Patente U.S. n.° 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, acetato de etilenovinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis como LUPRON DEPOT® (microesferas injectáveis constituídas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações destinadas a administração in vivo têm de ser estéreis. Tal é facilmente obtido por filtração através de membranas de filtração estéreis. K. Diagnóstico e tratamento com anticorpos anti-TAT, oligopéptidos de ligação a TAT e moléculas orgânicas de
ligação a TAT
Estão disponíveis vários ensaios de diagnóstico para determinar a expressão de TAT no cancro. Numa concretização, a sobreexpressão do polipéptido TAT poderá ser analisada por 158 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ imuno-histoquímica (IHQ). Secções de tecido incrustadas em parafina provenientes da biopsia de um tumor poderão ser submetidas ao ensaio de IHQ, sendo-lhes atribuído um critério de intensidade de coloração da proteína TAT como se segue:
Classificação 0 - não se observa coloração ou observa-se coloração da membrana em menos de 10% das células tumorais. Classificação 1+ - detecta-se uma coloração fraca/ escassamente perceptível da membrana em mais de 10% das células tumorais. As células estão coradas apenas em parte da sua membrana.
Classificação 2+ - observa-se uma coloração fraca a moderada da membrana completa em mais de 10% das células tumorais. Classificação 3+ - observa-se uma coloração moderada a forte da membrana completa em mais de 10% das células tumorais.
Aqueles tumores com classificações de 0 ou 1+ para a expressão do polipéptido TAT poderão ser caracterizados como tumores que não sobreexpressam TAT, enquanto aqueles tumores com classificações de 2+ ou 3+ poderão ser caracterizados como tumores que sobreexpressam TAT.
Em alternativa, ou adicionalmente, ensaios FISH, como o ensaio INFORM® (comercializado por Ventana, Arizona) ou o ensaio PATHVISION® (Vysis, Ilinóis), poderão ser realizados em tecido tumoral incrustado em parafina e fixado em formalina para determinar a extensão (caso exista) da sobreexpressão de TAT no tumor. A sobreexpressão ou a amplificação de TAT poderão ser avaliadas utilizando um ensaio de diagnóstico in vivo, por exemplo, através da administração de uma molécula (como um anticorpo, um oligopéptido ou uma molécula orgânica) que liga a molécula que se pretende detectar e que está marcada com uma marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioactivo ou um marcador fluorescente) e analisando externamente o doente para detectar a localização do marcador.
Como descrito acima, os anticorpos anti-TAT, os oligopéptidos e as moléculas orgânicas do invento possuem várias aplicações não terapêuticas. Os anticorpos anti-TAT, os oligopéptidos e as moléculas orgânicas do presente invento 159 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ podem ser úteis para o diagnóstico e a determinação do estágio dos cancros que expressam o polipéptido TAT (por exemplo, em radioimagiologia). Os anticorpos, os oligopéptidos e as moléculas orgânicas também são úteis para a purificação ou a imunoprecipitação do polipéptido TAT a partir de células, para a detecção e quantificação do polipéptido TAT in vitro, por exemplo, num ensaio ELISA ou numa análise de transferência de Western, ou para matar e eliminar as células que expressam TAT de uma população de células mistas como um passo na purificação de outras células.
Actualmente, dependendo do estágio do cancro, o tratamento do cancro envolve uma ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia para remover o tecido canceroso, radioterapia e quimioterapia. A terapia com o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a molécula orgânica poderá ser especialmente desejável em doentes idosos que não toleram bem a toxicidade e os efeitos secundários da quimioterapia e na doença metastática em que a radioterapia tem uma utilidade limitada. Os anticorpos anti-TAT, os oligopéptidos e as moléculas orgânicas do invento que visam o tumor são úteis para aliviar os cancros que expressam TAT aquando do diagnóstico inicial da doença ou durante uma recaída. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a molécula orgânica pode ser utilizado isoladamente, em terapia de combinação com, por exemplo, hormonas, antiangiogénicos ou compostos radiomarcados, ou juntamente com cirurgia, crioterapia e/ou radioterapia. O tratamento com o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a molécula orgânica pode ser administrado em conjunção com outras formas de terapia convencional, consecutivamente com, antes ou após a terapia convencional. Os fármacos quimioterapêuticos como o TAXOTERE® (docetaxel), o TAXOL® (palictaxel), a estramustina e a mitoxantrona são utilizados no tratamento do cancro, em particular, em doentes de risco promissor. No presente método do invento para tratar ou aliviar o cancro, o doente com cancro pode receber o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a molécula orgânica em conjunção com o tratamento com um ou mais dos agentes quimioterapêuticos anteriores. Em particular, está contemplada a terapia de combinação com palictaxel e derivados modificados (ver, por exemplo, 160 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ΕΡ0600517). Ο anticorpo anti-TAT, ο oligopéptido ou a molécula orgânica será administrado com uma dose terapeuticamente eficaz do agente quimioterapêutico. Em outra concretização, o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a molécula orgânica é administrado é conjunção com a quimioterapia para reforçar a actividade e a eficácia do agente quimioterapêutico, por exemplo, o paclitaxel. O Physicians' Desk Reference (PDR) refere as doses destes agentes que têm sido utilizadas no tratamento de vários cancros. O regime posológico e as doses destes fármacos quimioterapêuticos mencionados acima, que são terapeuticamente eficazes, dependerão do cancro particular que está em tratamento, da extensão da doença e de outros factores que são familiares para o médico com perícia na técnica e que podem ser determinados pelo médico.
Numa concretização particular, é administrado ao doente um conjugado compreendendo um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica conjugado com um agente citotóxico. De preferência, o imunoconjugado ligado à proteína TAT é internalizado pela célula, o que resulta numa maior eficácia terapêutica do imunoconjugado para matar a célula cancerosa à qual se liga. Numa concretização preferida, o agente citotóxico visa ou interfere com o ácido nucleico na célula cancerosa. Os exemplos de agentes citotóxicos deste tipo estão descritos acima e incluem os maitansinóides, as caliqueamicinas, as ribonucleases e as endonucleases de ADN.
Os anticorpos anti-TAT, os oligopéptidos, as moléculas orgânicas ou os seus conjugados com uma toxina são administrados a um doente humano de acordo com métodos conhecidos, tal como a administração intravenosa, por exemplo, como um bolus ou por infusão contínua ao longo de um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-
sinovial, intratecal, oral, tópica ou de inalação. A administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica é preferida.
Outros regimes terapêuticos poderão ser combinados com a administração do anticorpo anti-TAT, do oligopéptido ou da 161 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ molécula orgânica. A administração combinada inclui a co-administração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferencialmente existe um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exercem simultaneamente as suas actividades biológicas. Preferencialmente, esta terapia combinada resulta num efeito terapêutico sinérgico.
Também poderá ser desejável combinar a administração do anticorpo ou anticorpos anti-TAT, oligopéptidos ou moléculas orgânicas com a administração de um anticorpo dirigido contra outro antigénio tumoral associado ao cancro particular.
Em outra concretização, os métodos de tratamento terapêutico do presente invento envolvem a administração combinada de um anticorpo (ou anticorpos) anti-TAT, oligopéptido ou molécula orgânica e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, incluindo a co-administração de cocktails de diferentes agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos incluem fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluorouracilo, melfalano, ciclofosfamida, hidroxiureia e hidroxiureia-taxanos (como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. A preparação e os regimes posológicos para estes agentes quimioterapêuticos poderão ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado pelo perito. A preparação e os regimes posológicos para esta quimioterapia estão também descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica poderá ser combinado com um composto anti-hormonal/ por exemplo, um composto antiestrogénico como tamoxifeno; um composto antiprogesterona como a onapristona (ver EP 616 812) ; ou um composto antiandrogénico como a flutamida, em doses conhecidas para estas moléculas. Quando o cancro que se pretende tratar é um cancro independente de androgénios, o doente poderá ter sido previamente submetido a terapia antiandrogénica e, depois de o cancro se tornar independente de androgénios, o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a 162 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ molécula orgânica (e opcionalmente outros agentes conforme aqui descrito) poderá ser administrado ao doente.
Por vezes, poderá ser benéfico co-administrar também um cardioprotector (para evitar ou reduzir a disfunção miocárdica associada à terapia) ou uma ou mais citocinas ao doente. Além dos regimes terapêuticos indicados acima, o doente poderá ser submetido a remoção cirúrgica das células cancerosas e/ou a radioterapia, antes, simultaneamente com ou após a terapia com o anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica. As doses adequadas para qualquer um dos agentes co-administrados mencionados acima são aquelas presentemente utilizadas e poderão ser reduzidas devido à acção combinada (sinergia) do agente com o anticorpo anti-TAT, o oligopéptido ou a molécula orgânica.
Para a prevenção ou tratamento da doença, a dose e o modo de administração serão seleccionados pelo médico de acordo com critérios conhecidos. A dose apropriada do anticorpo, do oligopéptido ou da molécula orgânica dependerá do tipo de doença que se pretende tratar, como definida acima, da gravidade e curso da doença, do facto de o anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica ser administrado para fins preventivos ou para fins terapêuticos, da terapia prévia, do historial clinico do doente, da resposta do doente ao anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica e do critério do médico assistente. O anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica é adequadamente administrado ao doente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Preferencialmente, o anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica é administrado por infusão intravenosa ou por injecções subcutâneas. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal (por exemplo, cerca de 0,1-15 mg/kg/dose) pode ser uma dose candidata inicial para administração ao doente, por exemplo, numa ou mais administrações separadas ou por infusão continua. Um regime posológico pode compreender a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida de uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo anti-TAT. Contudo, outros regimes posológicos poderão ser úteis. Uma dose diária típica poderia variar entre cerca de 1 pg/kg e 100 mg/kg ou mais, dependendo 163 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ dos factores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. O progresso desta terapia pode ser prontamente monitorizado através de métodos e ensaios convencionais e com base nos critérios conhecidos pelo médico ou outros peritos na técnica. À parte a administração da proteína anticorpo ao doente, o presente pedido contempla a administração do anticorpo por terapia génica. Esta administração de um ácido nucleico que codifica o anticorpo está abrangida pela expressão "administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo". Ver, por exemplo, WO96/07321, publicada em 14 de Março de 1996, relativamente à utilização de terapia génica para gerar anticorpos intracelulares. Há duas abordagens principais para fazer entrar o ácido nucleico (opcionalmente compreendido num vector) nas células do doente: in vivo e ex vivo. Para a entrega in vivo, o ácido nucleico é injectado directamente no doente, habitualmente no local onde o anticorpo é necessário. No caso do tratamento ex vivo, as células do doente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao doente, quer directamente quer, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no doente (ver, por exemplo, Patentes U.S. n.os 4,892,538 e 5,283,187). Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de o ácido nucleico ser transferido para células cultivadas in vitro ou ser transferido in vivo nas células do hospedeiro pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, a electroporação, a microinjecção, a fusão celular, o DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vector habitualmente utilizado para a entrega ex vivo do gene é um vector retroviral.
As técnicas de transferência de ácidos nucleicos in vivo actualmente preferidas incluem a transfecção com vectores virais (como adenovírus, o vírus Herpes simplex I ou vírus 164 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ adeno-associados) e sistemas à base de lípidos (os lipidos úteis para a transferência mediada por lipidos do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo) . Para um artigo de revisão dos protocolos de marcação de genes e de terapia génica actualmente conhecidos, ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Ver também WO 93/25673 e as referências ai citadas.
Os anticorpos anti-TAT do invento podem encontrar-se sob as diferentes formas englobadas pela definição de "anticorpo" aqui apresentada. Assim, os anticorpos incluem anticorpo completo ou intacto, fragmentos de anticorpo, anticorpo de sequência nativa ou variantes da sequência de aminoácidos, anticorpos humanizados, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados e seus fragmentos funcionais. Nos anticorpos de fusão, uma sequência do anticorpo é fundida com uma sequência polipeptidica heteróloga. Os anticorpos podem ser modificados na região Fc para fornecer as funções efectoras desejadas. Tal como discutido em maior detalhe em secções deste pedido, com as regiões Fc apropriadas, o anticorpo nu preso à superfície da célula pode induzir citotoxicidade, por exemplo, via citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) , por recrutamento do complemento na citotoxicidade dependente de complemento ou por algum outro mecanismo. Em alternativa, quando é desejável eliminar ou reduzir a função efectora de modo a minimizar os efeitos secundários ou as complicações terapêuticas, determinadas regiões Fc distintas poderão ser usadas.
Numa concretização, o anticorpo compete pela ligação, ou liga-se substancialmente, ao mesmo epitopo que os anticorpos do invento. Anticorpos que possuem as características biológicas dos presentes anticorpos anti-TAT do invento também estão contemplados, especificamente incluindo a função de visar o tumor in vivo e quaisquer características citotóxicas ou de inibição da proliferação celular.
Os métodos de produção dos anticorpos acima estão aqui descritos em pormenor.
Os presentes anticorpos anti-TAT, oligopéptidos e moléculas orgânicas são úteis para tratar um cancro que 165 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ expressa ΤΑΤ ou aliviar um ou mais sintomas do cancro num mamífero. Um cancro deste tipo inclui o cancro da próstata, o cancro do tracto urinário, o cancro do pulmão, o cancro da mama, o cancro do cólon e o cancro dos ovários, mais especificamente o adenocarcinoma da próstata, os carcinomas de células renais, os adenocarcinomas colo-rectais, os adenocarcinomas do pulmão, os carcinomas de células escamosas do pulmão e o mesotelioma pleural. Os cancros englobam os cancros metastáticos de qualquer um dos anteriores. O anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica é capaz de se ligar a pelo menos uma porção das células cancerosas que expressam o polipéptido TAT no mamífero. Numa concretização preferida, o anticorpo, o oligopéptido ou a molécula orgânica é eficaz para destruir ou matar as células tumorais que expressam TAT ou inibir o crescimento destas células tumorais, in vitro ou in vivo, ao ocorrer a ligação ao polipéptido TAT na célula. Um anticorpo destes inclui um anticorpo anti-TAT nu (não conjugado com nenhum agente). Os anticorpos nus que possuem propriedades citotóxicas ou de inibição do crescimento celular podem ser adicionalmente presos a um agente citotóxico para os tornar ainda mais potentes na destruição das células tumorais. As propriedades citotóxicas podem ser conferidas a um anticorpo anti-TAT através, por exemplo, de conjugação do anticorpo com um agente citotóxico, para formar um imunoconjugado como aqui descrito. O agente citotóxico ou um agente inibidor do crescimento é preferencialmente uma molécula pequena. Toxinas como a caliqueamicina ou um maitansinóide e seus análogos ou derivados são preferidas. O invento disponibiliza uma composição compreendendo um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica do invento e um veículo. Para fins de tratamento do cancro, as composições podem ser administradas ao doente necessitado desse tratamento, em que a composição pode compreender um ou mais anticorpos anti-TAT presentes como um imunoconjugado ou como o anticorpo nu. Numa concretização adicional, as composições podem compreender estes anticorpos, oligopéptidos ou moléculas orgânicas em combinação com outros agentes terapêuticos, tais como agentes citotóxicos ou inibidores do crescimento, incluindo agentes quimioterapêuticos. O invento também disponibiliza formulações que compreendem um anticorpo 166 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica do invento e um veículo. Numa concretização, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável.
Outro aspecto do invento consiste nos ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos anti-TAT. Os ácidos nucleicos que codificam ambas as cadeias H e L e, especialmente, os resíduos da região hipervariável, as cadeias que codificam o anticorpo de sequência nativa, bem como as variantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo estão englobados. 0 invento também proporciona métodos úteis para tratar um cancro que expressa o polipéptido TAT ou aliviar um ou mais sintomas do cancro num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica ao mamífero. As composições terapêuticas do anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica podem ser administradas a curto prazo (modo agudo) ou de modo crónico ou intermitente conforme indicado pelo médico. Métodos para inibir o crescimento e matar uma célula que expressa o polipéptido TAT são também disponibilizados. O invento disponibiliza igualmente kits e artigos de manufactura compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica. Os kits contendo anticorpos anti-TAT, oligopéptidos ou moléculas orgânicas encontram utilização, por exemplo, em ensaios de morte de células TAT, para purificação ou para imunoprecipitação do polipéptido TAT a partir de células. Por exemplo, para o isolamento e purificação de TAT, o kit pode conter um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica acoplado a esferas (por exemplo, esferas de sepharose). É possível disponibilizar kits que contêm os anticorpos, oligopéptidos ou moléculas orgânicas para detecção e quantificação de TAT in vitro, por exemplo, num ensaio ELISA ou numa análise de transferência de Western. Este anticorpo, oligopéptido ou molécula orgânica útil para a detecção poderá ser fornecido com um marcador, tal como um marcador fluorescente ou um marcador radioactivo. 167 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ L. Artigos de manufactura e kits
Outra concretização do invento é um artigo de manufactura contendo materiais úteis para o tratamento de um cancro que expressa TAT. O artigo de manufactura compreende um recipiente e uma etiqueta ou folheto no recipiente ou associado a ele. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos, frasquinhos, seringas, etc. Os recipientes poderão ser constituídos por uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condição cancerosa e poderá ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente poderá ser um saco de solução intravenosa ou um frasquinho com uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica do invento. A etiqueta ou folheto indica que a composição é utilizada para tratamento do cancro. A etiqueta ou folheto compreenderá adicionalmente instruções para administrar a composição do anticorpo, do oligopéptido ou da molécula orgânica ao doente com cancro. Adicionalmente, o artigo de manufactura poderá incluir ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção, soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Poderá incluir ainda outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
Disponibilizam-se também kits que são úteis para vários fins, por exemplo, em ensaios de morte de células que expressam TAT, para purificação ou para imunoprecipitação do polipéptido TAT a partir de células. Para o isolamento e purificação do polipéptido TAT, o kit pode conter um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica acoplado a esferas (por exemplo, esferas de sepharose). É possível disponibilizar kits que contêm os anticorpos, os oligopéptidos ou as moléculas orgânicas para detecção e quantificação do polipéptido TAT in vitro, por exemplo, num ensaio ELISA ou numa análise de transferência de Western. Tal como acontece com o artigo de manufactura, o kit compreende 168 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ um recipiente e uma etiqueta ou folheto no recipiente ou associado a ele. 0 recipiente contém uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TAT, um oligopéptido ou uma molécula orgânica do invento. Poderão estar incluídos recipientes adicionais que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, anticorpos de controlo. A etiqueta ou folheto poderá fornecer uma descrição da composição, bem como instruções para a utilização in vitro ou de diagnóstico pretendida.
M. Utilizações para os polipéptidos TAT e os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos TAT
As sequências nucleotídicas (ou o seu complemento) que codificam polipéptidos TAT têm várias aplicações na técnica da biologia molecular, incluindo utilizações como sondas de hibridação, no mapeamento de cromossomas e genes e na geração de sondas de ADN e ARN anti-senso. 0 ácido nucleico que codifica TAT também será útil para a preparação de polipéptidos TAT pelas técnicas recombinantes aqui descritas, em que aqueles polipéptidos TAT poderão encontrar utilização, por exemplo, na preparação dos anticorpos anti-TAT conforme aqui descritos. 0 gene TAT de sequência nativa completa, ou suas porções, poderá ser utilizado como sondas de hibridação para uma biblioteca de ADNc, para isolar o ADNc de TAT completo ou para isolar ainda outros ADNc (por exemplo, aqueles que codificam variantes de ocorrência natural de TAT ou TAT de outras espécies) que possuem uma identidade de sequência desejada com a sequência de TAT nativo aqui descrita. Opcionalmente, o comprimento das sondas será de cerca de 20 a 50 bases. As sondas de hibridação poderão ser derivadas de regiões pelo menos parcialmente novas da sequência nucleotídica nativa completa, em que essas regiões poderão ser determinadas sem necessidade de uma experimentação excessiva ou a partir de sequências genómicas que incluem promotores, elementos amplificadores e intrões de TAT de sequência nativa. A titulo exemplificativo, um método de rastreio compreenderá o isolamento da região codificante do gene TAT utilizando a sequência de ADN conhecida para seleccionar uma sonda seleccionada com cerca de 40 bases. As 169 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ sondas de hibridação poderão ser marcadas com uma variedade de marcadores, incluindo radionucleótidos como 32P ou 35S ou marcadores enzimáticos como a fosfatase alcalina acoplada à sonda através de sistemas de acoplamento avidina/biotina. As sondas marcadas que possuem uma sequência complementar da sequência do gene TAT do presente invento podem ser utilizadas para rastrear bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico ou ARNm, de modo a determinar quais os membros dessas bibliotecas com que a sonda híbrida. As técnicas de hibridação estão descritas em maior detalhe nos Exemplos abaixo. Quaisquer sequências EST descritas no presente pedido poderão ser identicamente empregues como sondas, utilizando os métodos aqui descritos.
Outros fragmentos úteis dos ácidos nucleicos que codificam TAT incluem oligonucleótidos anti-senso ou senso compreendendo uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (quer ARN quer ADN) capaz de se ligar a sequências-alvo de ARNm de TAT (senso) ou ADN de TAT (anti-senso) . Os oligonucleótidos anti-senso ou senso, de acordo com o presente invento, compreendem um fragmento da região codificante do ADN de TAT. Este fragmento geralmente compreende pelo menos cerca de 14 nucleótidos, preferencialmente cerca de 14 a 30 nucleótidos. A capacidade de derivar um oligonucleótido anti-senso ou senso, com base numa sequência de ADNc que codifica uma dada proteína, está descrita, por exemplo, em Stein e Cohen (Câncer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988) . A ligação de oligonucleótidos senso ou anti-senso a sequências-alvo de ácido nucleico resulta na formação de dúplexes que bloqueiam a transcrição ou a tradução da sequência-alvo através de um de vários meios, incluindo a degradação reforçada dos dúplexes, a terminação prematura da transcrição ou da tradução ou outros meios. Estes métodos estão abrangidos pelo presente invento. Os oligonucleótidos anti-senso poderão, assim, ser utilizados para bloquear a expressão de proteínas TAT, em que essas proteínas TAT poderão desempenhar um papel na indução do cancro em mamíferos. Os oligonucleótidos anti-senso ou senso compreendem ainda oligonucleótidos que possuem esqueletos de açúcar-fosfodiéster modificados (ou outras ligações no 170 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ açúcar, como sejam aqueles descritas em WO 91/06629) e em que estas ligações no açúcar são resistentes a nucleases endógenas. Os oligonucleótidos deste tipo com ligações resistentes no açúcar são estáveis in vivo (isto é, são capazes de resistir à degradação enzimática), mas conservam a especificidade de sequência para serem capazes de se ligar às sequências nucleotidicas-alvo.
Os locais intragénicos preferidos para a ligação anti-senso incluem a região que incorpora o codão de iniciação/ start da tradução (5'-AUG / 5'-ATG) ou o codão de terminação/ stop da tradução (5'-UAA, 5' -UAG e 5-UGA / 5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA) da grelha de leitura aberta (ORF de "Open Reading Frame") do gene. Estas regiões referem-se a uma porção do ARNm ou gene que engloba cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer uma das direcções (isto é, 5' ou 3') a partir de um codão de iniciação ou terminação da tradução. Outras regiões preferidas para a ligação anti-senso incluem: intrões, exões, junções intrão-exão, a grelha de leitura aberta (ORF) ou "região codificante", que é a região entre o codão de iniciação da tradução e o codão de terminação da tradução; a estrutura cap 5' de um ARNm que compreende um resíduo de guanosina metilado em N7 unido ao resíduo mais 5' do ARNm via uma ligação trifosfato 5'-5' e inclui a estrutura cap 5' em si, bem como os primeiros 50 nucleótidos adjacentes à estrutura cap; a região não traduzida 5' (5'UTR), a porção de um ARNm na direcção 5' desde o codão de iniciação da tradução e incluindo, deste modo, os nucleótidos entre o local cap 5' e o codão de iniciação da tradução de um ARNm ou os nucleótidos correspondentes no gene; e a região não traduzida 3' (3'UTR), a porção de um ARNm na direcção 3' desde o codão de terminação da tradução e incluindo, deste modo, os nucleótidos entre o codão de terminação da tradução e a extremidade 3' de um ARNm ou os nucleótidos correspondentes no gene.
Os exemplos específicos de compostos anti-senso preferidos úteis para inibir a expressão de proteínas TAT incluem oligonucleótidos contendo esqueletos modificados ou ligações internucleósido não naturais. Os oligonucleótidos que possuem esqueletos modificados incluem aqueles que 171 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ conservam um átomo de fósforo no esqueleto e aqueles que não têm um átomo de fósforo no esqueleto. Para fins deste fascículo, e como por vezes referenciado na técnica, os oliqonucleótidos modificados que não têm um átomo de fósforo no seu esqueleto internucleósido também podem ser considerados oligonucleósidos. Os esqueletos de oligonucleótido modificados preferidos incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilfosfonatos e outros alquilfosfonatos, incluindo 3'-alquilenofosfonatos, 5'-alquilenofosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforoamidatos incluindo 3'-aminofosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e boranofosfatos com ligações 3'-5' normais, análogos destes com ligações 2'-5' e aqueles que possuem uma polaridade invertida em que uma ou mais ligações internucleótido consiste numa ligação 3' para 3', 5' para 5' ou 2' para 2'. Os oligonucleótidos preferidos possuindo uma polaridade invertida compreendem uma única ligação 3' para 3' ao nível da ligação internucleótido mais 3', isto é, um único resíduo de nucleósido invertido que poderá ser abásico (a nucleobase está ausente ou possui um grupo hidroxilo no seu lugar). Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre também estão incluídos. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar ligações contendo fósforo incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n, 4,476,301; 5, 276, 019; 5,405,939; 5,519,126; 5,571,799; 5,721,218; 5,023,243; 5,278,302; 5,453,496; 5,536,821; 5,587,361; 5,177,196; 5,286,717; 5,455,233; 5,541,306; 5,194,599; 3,687,808; 5,188,897; 5,321,131; 5,466,677; 5,550,111; 5,565,555; 4,469, 863; 5,264,423; 5,399,676; 5,476,925; 5,563,253; 5,527,899; 5,672,697 e 5,625,050.
Os esqueletos de oligonucleótido modificados preferidos que não incluem um átomo de fósforo apresentam esqueletos que são formados por ligações internucleósido de alquilo ou cicloalquilo de cadeia curta, ligações internucleósido mistas de heteroátomo e alquilo ou cicloalquilo, ou uma ou mais ligações internucleósido heterociclicas ou heteroatómicas de cadeia curta. Estes incluem aqueles que possuem ligações morfolino (formados em parte a partir da porção açúcar de um 172 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ nucleósido); esqueletos de siloxano; esqueletos de sulfureto, sulfóxido e sulfona; esqueletos de formacetilo e tioformacetilo; esqueletos de metilenoformacetilo e metilenotioformacetilo; esqueletos de riboacetilo; esqueletos que contêm alceno; esqueletos de sulfamato; esqueletos de metilenimino e metileno-hidrazino; esqueletos de sulfonato e sulfonamida; esqueletos de amida; e outros que apresentam componentes mistos de N, O, S e CH2. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar estes oligonucleósidos incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n.° 5,034,506; 5,235,033; 5,466,677; 5,596,086; 5,610,289; 5,166,315; 5, 264,562; 5,470,967; 5,602,240; 5,618,704; 5,185,444; 5,264,564; 5,489,677; 5,610,289, 5,623,070; 5,214,134; 5,405.938; 5.541.307; 5,602,240; 5,663,312; 5,216,141; 5,434,257; 5,561,225; 5,608,046; 5,633,360; 5,677,437; 5,792,608; 5,646,269 e 5,677,439.
Em outros oligonucleótidos anti-senso preferidos, tanto o açúcar como a ligação internucleósido, isto é, o esqueleto, das unidades nucleotidicas estão substituídos por grupos novos. As bases são mantidas para hibridação com um composto-alvo de ácido nucleico apropriado. Um destes compostos oligoméricos, um oligonucleótido mimético que se demonstrou possuir propriedades de hibridação excelentes, é designado por ácido nucleico peptidico (PNA de "Peptide Nucleic Acid"). Nos compostos PNA, o esqueleto de açúcar de um oligonucleótido é substituído por um esqueleto que contém amida, em particular um esqueleto de aminoetilglicina. As nucleobases são conservadas e estão ligadas directa ou indirectamente a átomos de azoto aza da porção amida dos esqueletos. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar compostos PNA incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n.° 5,539,082; 5,714,331; e 5,719,262. Explicações adicionais sobre compostos PNA podem ser encontradas em Nielsen et al.. Science, 1991, 254, 1497-1500.
Os oligonucleótidos anti-senso preferidos incorporam esqueletos de fosforotioato e/ou esqueletos heteroatómicos e, em particular, -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3)-0-CH2- [conhecido como um esqueleto de metileno(metilimino) ou MMI], -CH2-0-N (CH3) -CH2-, -CH2-N (CH3) -N (CH3) -CH2- e -O-N (CH3) -CH2-CH2- [ em que o esqueleto fosfodiéster nativo é representado por -O-P- 173 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ O-CH2-] descritos na Patente U.S. n.° 5,489,677 acima referenciada e os esqueletos de amida da Patente U.S. n.° 5,602,240 acima referenciada. Os oligonucleótidos anti-senso possuindo esqueletos morfolino da Patente U.S. n.° 5,034,506 acima referenciada são também preferidos.
Os oligonucleótidos modificados também poderão conter um ou mais resíduos de açúcar substituídos. Os oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes grupos na posição 2': OH; F; O-alquilo, S-alquilo ou N-alquilo; O-alcenilo, S-alcenilo ou N-alcenilo; O-alcinilo, S-alcinilo ou N-alcinilo; ou O-alquilo-O-alquilo, em que os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo poderão ser alquilo em Ci a Cio ou alcenilo e alcinilo em C2 a Cio substituídos ou não substituídos. Os grupos particularmente preferidos são O [ (0¾) nO] mCH3, 0(CH2)n0CH3, 0(CH2)nNH2, o(CH2)nCH3, 0(CH2)n0NH2 e 0 (CH2) nON [ (CH2) nCH3) ] , em que nem estão compreendidos entre 1 e cerca de 10. Outros oligonucleótidos anti-senso preferidos compreendem um dos seguintes grupos na posição 2': alquilo inferior em Ci a Cio, alquilo inferior substituído, alcenilo, alcinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo ou 0-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, 0CF3, S0CH3, S02 CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo substituído, um grupo de clivagem do ARN, um grupo repórter, um grupo de intercalação, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleótido ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleótido e outros substituintes que possuem propriedades similares. Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietoxi (2'-0-CH2CH20CH3, também conhecido como 2'-0-(2-metoxietilo) ou 2'-M0E) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), isto é, um grupo alcoxialcoxi. Uma modificação preferida adicional inclui 2'- dimetilaminooxietoxi, isto é, um grupo 0 (CH) 2ON (CH3) 2, também conhecido como 2'-DMAOE, tal como descrito nos exemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo ou 2'-DMAEOE), ou seja, 2 '-0-CH2-0-CH2-N (CH2) .
Uma modificação preferida adicional inclui ácidos nucleicos bloqueados (LNA de "Locked Nucleic Acids"), em que 174 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ο grupo 2'-hidroxilo está ligado ao átomo de carbono 3' ou 4' do anel do açúcar, formando, deste modo, um resíduo de açúcar bicíclico. A ligação é preferencialmente um grupo metileno (-CH2-)n fazendo a ponte entre o átomo de oxigénio 2' e o átomo de carbono 4', em que n é 1 ou 2. Os LNA e a sua preparação estão descritos em WO 98/39352 e WO 99/14226.
Outras modificações preferidas incluem 2'-metoxi (2'-0-CH3) , 2 '-aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2NH2) , 2'-alilo (2'-CH2- CH=CH2), 2 ' -O-alilo (21-0-CH2-CH=CH2) e 2'-fluoro (2'-F). A modificação em 2' poderá ser na posição arabino (ascendente) ou na posição ribo (descendente). Uma modificação 2'-arabino preferida é 2'-F. Modificações similares também poderão ser efectuadas em outras posições do oligonucleótido, 5,519,134; 5,610,300; 5,670,633; particularmente na posição 3' do açúcar no nucleótido terminal 3' ou em oligonucleótidos ligados 2'-5' e na posição 5' do nucleótido terminal 5'. Os oligonucleótidos também poderão ter grupos miméticos de açúcares, tais como grupos ciclobutilo, em lugar do açúcar pentofuranosilo. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar estas estruturas de açucares modificadas incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n.° 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5, 627,053; 5, 639, 873; 5, 646, 265; 5, 658,873; 5,792,747; e 5,700,920.
Os oligonucleótidos também poderão incluir modificações ou substituições das nucleobases (muitas vezes designadas na técnica simplesmente por "base"). Tal como aqui utilizadas, as nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases purínicas adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidínicas timina (T) , citosina (C) e uracilo (U) . As nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-propilo e outros derivados alquilo de adenina e guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracilo e citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3 ou -CH2-C=CH) uracilo e citosina e outros derivados alcinilo de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 175 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxi e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo e outros uracilos e citosinas 5-substituídos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desaza-adenina e 3-desazaguanina e 3-desaza-adenina. Outras nucleobases modificadas incluem pirimidinas triciclicas como fenoxazina-citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina-citidina (lH-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), grampos ("G-clamps) como uma fenoxazina-citidina substituída (por exemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4] benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol-citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol-citidina (H-pirido[3',2':4,5] pirrol[2,3-d]pirimidin-2-ona). As nucleobases modificadas também poderão incluir aquelas em que uma base purínica ou pirimidínica é substituída por outros heterociclos, por exemplo, 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Nucleobases adicionais incluem aquelas descritas na Patente U.S. n.° 3,687,808, aquelas descritas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, e aquelas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613. Algumas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos do invento. Estas incluem as pirimidinas 5-substituídas, as 6-azapirimidinas e as purinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina. Foi demonstrado que substituições com 5-metilcitosina aumentam a estabilidade do dúplex de ácido nucleico em 0,6-l,2°C (Sanghvi et al, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993. pp. 276-278) e constituem substituições de bases preferidas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações 2'-0-metoxietilo do açúcar. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n.° 3, 687, 808, bem como Patentes U.S. n.os: 4,845, 205; 5, 130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 176 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 5, 594,121, 5, 596, 091/ 5, 614, 617/ 5, 645, 985/ 5, 830, 653/ 5, 763, 588/ 6, 005, 096/ 5, 681,941 e 5, 750, 692.
Outra modificação dos oligonucleótidos anti-senso consiste em ligar quimicamente ao oligonucleótido um ou mais resíduos ou conjugados que reforçam a actividade, a distribuição celular ou a captação celular do oligonucleótido. Os compostos do invento podem incluir grupos conjugados ligados covalentemente a grupos funcionais, por exemplo, grupos hidroxilo primários ou secundários. Os grupos conjugados do invento incluem compostos de intercalação, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicóis, poliéteres, grupos que reforçam as propriedades farmacodinâmicas dos oligómeros e grupos que reforçam as propriedades farmacocinéticas dos oligómeros. Os grupos conjugados típicos incluem colesteróis, lípidos, lípidos catiónicos, fosfolípidos, fosfolípidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Os grupos que intensificam as propriedades farmacodinâmicas, no contexto deste invento, incluem grupos que melhoram a captação dos oligómeros, reforçam a resistência dos oligómeros à degradação e/ou intensificam a hibridação específica ao nível da sequência com o ARN. Os grupos que reforçam as propriedades farmacocinéticas, no contexto deste invento, incluem grupos que melhoram a captação, a distribuição, o metabolismo ou a excreção dos oligómeros. Os grupos conjugados incluem, embora não estejam limitados a estes, grupos lipídicos como um grupo de colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido eólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sei., 1992, 660, 306-309/ Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem.
Let., 1993, 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecanodiol ou undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118/
Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330/ Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamónio (Manoharan et al., 177 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654/ Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), uma cadeia de poliamina ou polietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) o ácido adamantanoacético (Manoharan et al. , Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), um resíduo de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) ou um resíduo de octadecilamina ou hexilaminocarboniloxicolesterol. Os oligonucleótidos do invento também poderão ser conjugados com substâncias farmacológicas activas, por exemplo, aspirina, varfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácido flufenâmico, ácido folínico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina, indometicina, um barbiturato, uma cefalosporina, um fármaco sulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico. Os conjugados oligonucleótido-fármaco e a sua preparação estão descritos nas Patentes U.S. n.os: 4,828,979; 4,948,882; 5,218, 105; 5, 525, 4 65; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578, 717, 5, 580, 731; 5,580,731; 5,591,584/ 5,109,124; 5,118, 8 02; 5, 138, 045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578, 718; LO 608, 04 6; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762, 779; 4, 789, 737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904, 582; 4, 958, 013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082, 830; 5, 112, 963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258, 50 6; 5, 262, 53 6; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371, 241, 5, 391, 723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512, 667; 5, 514, 785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585, 481; 5, 587, 371; 5,595,726/ 5, 597, 696/ 5,599,923; 5, 599, 928 e 5, 688,941. Não é necessário que todas as posições num dado composto estejam modificadas uniformemente e, na verdade, mais de uma das modificações previamente referidas poderá estar incorporada num único composto ou mesmo num único nucleósido presente num oligonucleótido. O presente invento também inclui compostos anti-senso que são compostos quiméricos. Os compostos anti-senso "quiméricos" ou "quimeras", no contexto deste invento, são compostos anti-senso, particularmente oligonucleótidos, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma delas constituída por pelo menos uma unidade monomérica, isto é, um nucleótido no caso 178 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ de um composto oligonucleotídico. Estes oligonucleótidos contêm tipicamente pelo menos uma região em que o oligonucleótido está modificado, de modo a conferir ao oligonucleótido uma resistência acrescida à degradação por nucleases, uma maior captação celular e/ou uma maior afinidade de ligação para o ácido nucleico visado. Uma região adicional do oligonucleótido poderá servir de substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de ARN:ADN ou ARN:ARN. A título exemplificativo, a ARNase H é uma endonuclease celular que cliva a cadeia de ARN de um dúplex de ARN:ADN. Deste modo, a activação da ARNase H resulta em clivagem do alvo de ARN, aumentando, assim, grandemente a eficácia da inibição da expressão génica por parte do oligonucleótido. Consequentemente, quando se utilizam oligonucleótidos quiméricos, é muitas vezes possível obter resultados comparáveis com oligonucleótidos mais curtos, em comparação com desoxi-oligonucleótidos de fosforotioato que hibridam com a mesma região-alvo. Os compostos anti-senso quiméricos do invento poderão ser formados como estruturas compósitas de dois ou mais oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos e/ou compostos miméticos de oligonucleótidos como descrito acima. Os oligonucleótidos anti-senso quiméricos preferidos incorporam pelo menos um açúcar modificado na posição 2' (preferencialmente 2'-O-(CH2) 2-O-CH3) na extremidade 3' para conferir resistência às nucleases e uma região com pelo menos 4 2'-H-açúcares contíguos para conferir actividade de ARNase H. Estes compostos também têm sido referidos na técnica como híbridos ou "gapmers". Os "gapmers" preferidos possuem uma região de açúcares modificados na posição 2' (preferencialmente 2'-0-(CH2) 2-0-CH3) na extremidade 3' e na extremidade 5' separada por pelo menos uma região que possui pelo menos 4 2'-H-açúcares contíguos e preferencialmente incorporam ligações fosforotioato no esqueleto. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar estas estruturas híbridas incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n.° 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5, 565, 350; 5, 623, 065; 5, 652,355; 5, 652,356; e 5, 700, 922.
Os compostos anti-senso utilizados de acordo com este invento poderão ser conveniente e rotineiramente preparados através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O 179 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ equipamento para esta síntese é vendido por vários vendedores, incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Califórnia). Quaisquer outros meios conhecidos na técnica para efectuar esta síntese poderão ser adicional ou alternativamente empregues. A utilização de técnicas similares para preparar oligonucleótidos como os 5,521,291; 4,426,330; 5,227,170; 5,417,978; 5,534,259; 5,459,127; 5,591,721; 5,213,804; 5,416,016; 5,527,528; fosforotioatos e os derivados alquilados é bem conhecida. Os compostos do invento também poderão ser misturados, encapsulados, conjugados ou associados de outra forma com outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos como, por exemplo, lipossomas, moléculas visadas por receptores ou formulações orais, rectais, tópicas ou outras, para ajudar na captação, distribuição e/ou absorção. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparar estas formulações de auxilio à captação, distribuição e/ou absorção incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. n.° 5, 108,921; 5, 354, 844; 5,416,016; 5,543,158; 4,534,899; 5,264,221; 5,462,854; 5,547,932; 5, 013, 556; 5,356,633; 5,469,854; 5,583,020; 5,108,921; 5,395,619; 5,512,295; 5, 543, 152; 5, 556, 948; 5,580, 575; e 5, 595, 756.
Outros exemplos de oligonucleótidos senso ou anti-senso incluem aqueles oligonucleótidos que estão ligados covalentemente a grupos orgânicos, tais como aqueles descritos em WO 90/10048, e outros grupos que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência-alvo de ácido nucleico, tal como poli-(L-lisina). Ainda adicionalmente, é possível ligar agentes de intercalação, como a elipticina, e agentes de alquilação ou complexos metálicos a oligonucleótidos senso ou anti-senso, para modificar as especificidades de ligação do oligonucleótido senso ou anti-senso para a sequência nucleotídica visada.
Os oligonucleótidos anti-senso ou senso poderão ser introduzidos numa célula que contém a sequência-alvo de ácido nucleico por qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, a transfecção de ADN mediada por CaP04, a electroporação ou utilizando vectores para transferência de genes como o vírus de Epstein-Barr. Num procedimento preferido, um oligonucleótido anti-senso ou 180 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ senso é introduzido num vector retroviral adequado. Uma célula contendo a sequência-alvo de ácido nucleico é colocada em contacto com o vector retroviral recombinante, in vivo ou ex vivo. Os vectores retrovirais adequados incluem, embora não estejam limitados a estes, aqueles derivados do retrovirus murino M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M-MuLV) ou os vectores de dupla cópia designados por DCT5A, DCT5B e DCT5C (ver WO 90/13641).
Os oligonucleótidos senso ou anti-senso também poderão ser introduzidos numa célula que contém a sequência nucleotidica-alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação ao ligando, como descrito em WO 91/04753. As moléculas de ligação ao ligando adequadas incluem, embora não estejam limitadas a estas, receptores de superfície celular, factores de crescimento, outras citocinas ou outros ligandos que se ligam a receptores de superfície celular. Preferencialmente, a conjugação da molécula de ligação ao ligando não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação ao ligando para se ligar à sua molécula ou receptor correspondente ou para bloquear a entrada do oligonucleótido senso ou anti-senso, ou da sua versão conjugada, na célula.
Em alternativa, um oligonucleótido senso ou anti-senso poderá ser introduzido numa célula que contém a sequência-alvo de ácido nucleico por formação de um complexo oligonucleótido-lípido, conforme descrito em WO 90/10448. O complexo lípido-oligonucleótido senso ou anti-senso é preferencialmente dissociado no interior da célula por uma lipase endógena.
As moléculas de ARN ou ADN senso ou anti-senso possuem geralmente pelo menos cerca de 5 nucleótidos de comprimento, em alternativa pelo meno s cerca de 6, 7 00 9, 10 / 11/ 12 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27 28, 29, 30, 35 , 40, 45, 50, 55 , 60, 65, 70, 75, 80 / 85, 90 95, 100, 105, 110, 115, 120, : 125, 130, 135, 140, 145, 150 155 , 160 , 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220 230 , 240 , 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 350 , 360 , 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460 470 , 480 , 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580 181 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 ou 1000 nucleótidos de comprimento, em que, neste contexto, o termo "cerca de" significa o comprimento referenciado da sequência nucleotidica mais ou menos 10% desse comprimento referenciado.
As sondas também poderão ser utilizadas em técnicas de PCR para gerar uma "pool" de sequências para a identificação de sequências codificantes de TAT bastante relacionadas.
As sequências nucleotidicas que codificam um TAT também podem ser utilizadas para construir sondas de hibridação destinadas ao mapeamento do gene que codifica esse TAT e destinadas à análise genética de indivíduos com perturbações genéticas. As sequências nucleotidicas aqui disponibilizadas poderão ser mapeadas num cromossoma e em regiões específicas de um cromossoma utilizando técnicas conhecidas, tais como a hibridação in situ, a análise de ligação contra marcadores cromossómicos conhecidos e o rastreio por hibridação com bibliotecas.
Quando as sequências codificantes de TAT codificam uma proteína que se liga a outra proteína (por exemplo, quando o TAT é um receptor), o TAT pode ser utilizado em ensaios para identificar as outras proteínas ou moléculas envolvidas na interacção de ligação. Por meio destes métodos, inibidores da interacção de ligação receptor/ligando podem ser identificados. As proteínas envolvidas nestas interacções de ligação também podem ser utilizadas para rastrear inibidores ou agonistas da interacção de ligação do tipo péptido ou pequena molécula. Além disso, o receptor TAT pode ser utilizado para isolar ligando(s) correlativo(s). Os ensaios de rastreio podem ser concebidos para encontrar compostos principais que mimetizam a actividade biológica de um TAT nativo ou de um receptor para TAT. Estes ensaios de rastreio incluirão ensaios compatíveis com um rastreio de elevado rendimento de bibliotecas químicas, tornando-os particularmente adequados para identificar candidatos a fármacos do tipo pequenas moléculas. As pequenas moléculas contempladas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos 182 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ sintéticos. Os ensaios podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de rastreio bioquímico, imunoensaios e ensaios à base de células, que estão bem caracterizados na técnica.
Os ácidos nucleicos que codificam TAT ou as suas formas modificadas também podem ser utilizados para gerar quer animais transgénicos quer animais "knockout" que, pelo seu lado, são úteis no desenvolvimento e rastreio de reagentes terapeuticamente úteis. Um animal transgénico (por exemplo, um ratinho ou um rato) é um animal possuindo células que contêm um transgene, em que este transgene foi introduzido no animal ou num antecessor do animal numa fase pré-natal, isto é, embrionária. Um transgene é um ADN que é integrado no
genoma de uma célula a partir da qual se desenvolve um animal transgénico. Em uma concretização, o ADNc que codifica TAT pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica TAT de acordo com técnicas estabelecidas, e as sequências genómicas utilizadas para gerar animais transgénicos que contêm células expressando o ADN que codifica TAT. Os métodos para gerar animais transgénicos, particularmente animais como ratinhos ou ratos, tornaram-se convencionais na técnica e estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. n.os 4,736,866 e 4,870,009. Tipicamente, células particulares seriam visadas para a incorporação do transgene de TAT utilizando amplificadores específicos dos tecidos. Os animais transgénicos que incluem uma cópia de um transgene que codifica TAT introduzida na linha germinal do animal numa fase embrionária podem ser utilizados para analisar o efeito de uma expressão aumentada do ADN que codifica TAT. Tais animais podem ser utilizados como animais de teste para reagentes que se pensa conferirem protecção contra, por exemplo, condições patológicas associadas à sua sobreexpressão. De acordo com este aspecto do invento, um animal é tratado com o reagente e uma incidência reduzida da condição patológica, em comparação com animais não tratados que transportam o transgene, indicaria uma potencial intervenção terapêutica para a condição patológica.
Em alternativa, é possível utilizar homólogos não humanos de TAT para construir um animal "knockout" em termos de TAT, o qual possui um gene que codifica TAT defeituoso ou 183 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ alterado em resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno que codifica TAT e o ADN genómico alterado que codifica TAT introduzido numa célula-tronco embrionária do animal. Por exemplo, o ADNc que codifica TAT pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica TAT de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do ADN genómico que codifica TAT pode ser eliminada ou substituída por outro gene, tal como um gene que codifica um marcador seleccionável que pode ser utilizado para monitorizar a integração. Normalmente, várias quilobases de ADN de flanco inalterado (em ambas as extremidades 5' e 3') são incluídas no vector [ver, por exemplo, Thomas & Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para obter uma descrição de vectores de recombinação homólogos]. O vector é introduzido numa linha de células-tronco embrionárias (por exemplo, por electroporação), e as células em que o ADN introduzido sofreu recombinação homóloga com o ADN endógeno são seleccionadas (ver, por exemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. As células seleccionadas são depois injectadas num blastocisto de um animal (por exemplo, um ratinho ou um rato) para formar quimeras de agregação [ver, por exemplo, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode depois ser implantado num animal de acolhimento fêmea pseudográvido adequado, e o embrião desenvolvido até ao final da gestação para criar um animal "knockout". A descendência que alberga o ADN recombinado homologamente nas suas células germinais pode ser identificada através de técnicas padrão e utilizada para criar animais nos quais todas as células do animal contêm o ADN recombinado homologamente. Os animais "knockout" podem ser caracterizados, por exemplo, pela sua capacidade de defesa contra determinadas condições patológicas e pelo seu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência do polipéptido TAT. O ácido nucleico que codifica os polipéptidos TAT também poderá ser utilizado em terapia génica. Em aplicações de terapia génica, os genes são introduzidos em células de modo a obter a síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente eficaz, por exemplo, para substituição de um gene defeituoso. A "terapia génica" inclui tanto a terapia génica convencional em que se obtém um efeito duradouro 184 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ através de um único tratamento, como a administração de agentes terapêuticos génicos, que envolve a administração única ou repetida de um ADN ou ARNm terapeuticamente eficaz. Os ARN e ADN anti-senso podem ser utilizados como agentes terapêuticos para bloquear a expressão de determinados genes in vivo. Já foi demonstrado que é possível importar oligonucleótidos anti-senso curtos para o interior das células onde estes actuam como inibidores, apesar das suas concentrações intracelulares baixas provocadas pela sua captação limitada pela membrana celular (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4143-4146 [1986]). Os oligonucleótidos podem ser modificados para reforçar a sua captação, por exemplo, substituindo os seus grupo fosfodiéster carregados negativamente por grupos não carregados.
Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de o ácido nucleico ser transferido para células cultivadas in vitro ou ser transferido in vivo nas células do hospedeiro pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, a electroporação, a microinjecção, a fusão celular, o DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vector habitualmente utilizado para a entrega ex vivo do gene é um vector retroviral. As técnicas de transferência de genes in vivo actualmente preferidas incluem a transfecção com vectores virais (tipicamente retrovirais) e a transfecção mediada por lipossoma-proteína do envelope virai (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]). Em algumas situações, é desejável fornecer a fonte de ácido nucleico juntamente com um agente que visa as células-alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana da superfície celular ou para a célula-alvo, um ligando para um receptor presente na célula-alvo, etc. Quando se utilizam lipossomas, é possível utilizar proteínas que se ligam a uma proteína de membrana da superfície celular associada à endocitose para visar e/ou facilitar a captação, por exemplo, proteínas da cápside ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização no ciclo, proteínas que visam uma localização 185 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ intracelular e aumentam a semivida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414 (1990). Para um artigo de revisão sobre marcação de genes e protocolos de terapia génica, ver Andersen et al., Science 256, 808-813 (1992).
As moléculas de ácido nucleico que codificam os polipéptidos TAT ou seus fragmentos aqui descritos são úteis para a identificação de cromossomas. A este respeito, continua a existir a necessidade de identificar novos marcadores cromossómicos, uma vez que estão actualmente disponíveis relativamente poucos reagentes de marcação de cromossomas baseados em dados de sequências efectivas. Cada molécula de ácido nucleico de TAT do presente invento pode ser utilizada como um marcador cromossómico.
Os polipéptidos e as moléculas de ácido nucleico de TAT do presente invento também poderão ser utilizados diagnosticamente para a tipagem de tecidos, em que os polipéptidos TAT do presente invento poderão ser expressos de modo diferencial num tecido em comparação com outro, preferencialmente num tecido doente em comparação com um tecido normal do mesmo tipo de tecido. As moléculas de ácido nucleico de TAT encontrarão utilização para gerar sondas para PCR, análise de Northern, análise de Southern e análise de Western.
Este invento compreende métodos de rastreio de compostos para identificar aqueles que mimetizam o polipéptido TAT (agonistas) ou que impedem o efeito do polipéptido TAT (antagonistas). Os ensaios de rastreio de candidatos a fármacos antagonistas são concebidos para identificar compostos que se ligam ou complexam com os polipéptidos TAT codificados pelos genes aqui identificados, ou que interferem de outro modo com a interaeção dos polipéptidos codificados com outras proteínas celulares, incluindo, por exemplo, inibindo a expressão do polipéptido TAT a partir das células. Estes ensaios de rastreio incluirão ensaios compatíveis com um rastreio de elevado rendimento de bibliotecas químicas, 186 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ tornando-os particularmente adequados para identificar candidatos a fármacos do tipo pequenas moléculas.
Os ensaios podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteina-proteina, ensaios de rastreio bioquímico, imunoensaios e ensaios à base de células, que estão bem caracterizados na técnica.
Todos os ensaios para a identificação de antagonistas têm em comum o facto de necessitarem de um contacto entre o candidato a fármaco e o polipéptido TAT codificado por um ácido nucleico aqui identificado, em condições e durante um período de tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.
Em ensaios de ligação, a interacção é a ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura reaccional. Numa concretização particular, o polipéptido TAT codificado pelo gene aqui identificado ou o candidato a fármaco é imobilizado numa fase sólida, por exemplo, numa placa de microtitulação, através de ligações covalentes ou não covalentes. A ligação não covalente é geralmente obtida por revestimento da superfície sólida com uma solução do polipéptido TAT e secagem. Em alternativa, é possível utilizar um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticorpo monoclonal, específico para o polipéptido TAT que se pretende imobilizar para ancorá-lo a uma superfície sólida. O ensaio é efectuado mediante a adição do componente não imobilizado, que poderá estar marcado com um marcador detectável, ao componente imobilizado, por exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reacção estiver completa, os componentes que não reagiram são removidos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados à superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado transporta um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizado na superfície indica que ocorreu complexação. Quando o componente originalmente não imobilizado não transporta um marcador, a complexação pode ser detectada, por exemplo, por utilização de um anticorpo marcado que se liga especificamente ao complexo imobilizado. 187 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Se ο composto candidato interagir, mas não se ligar a um polipéptido TAT particular codificado por um gene aqui identificado, a sua interacção com esse polipéptido pode ser analisada através de métodos bem conhecidos de detecção de interacções proteína-proteína. Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, como, por exemplo, a reticulação, a co-imunoprecipitação e a co-purificação através de gradientes ou de colunas cromatográficas. Adicionalmente, as interacções proteína-proteína podem ser monitorizadas por utilização de um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colegas (Fields & Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:9578-9582 (1991)) como descrito por Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muitos activadores da transcrição, como GAL4 de levedura, consistem em dois domínios modulares fisicamente discretos, em que um actua como o domínio de ligação ao ADN e o outro funciona como o domínio de activação da transcrição. O sistema de expressão em levedura descrito nas publicações anteriores (geralmente designado por "sistema de dois híbridos") tira partido desta propriedade e emprega duas proteínas híbridas, uma em que a proteína-alvo está fundida com o domínio de ligação ao ADN de GAL e a outra em que as proteínas de activação candidatas estão fundidas com o domínio de activação. A expressão de um gene repórter GALl-IacZ sob o controlo de um promotor activado por GAL4 depende da reconstituição da actividade de GAL4 via a interacção proteína-proteína. As colónias contendo polipéptidos que interagem são detectadas com um substrato cromogénico para a β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER™) para identificar interacções proteína-proteína entre duas proteínas específicas, utilizando a técnica de dois híbridos, está disponível comercialmente através de Clontech. Este sistema também pode ser estendido para mapear domínios de proteínas envolvidos em interacções proteicas específicas, bem como para identificar os resíduos de aminoácidos que são cruciais para estas interacções.
Os compostos que interferem com a interacção de um gene que codifica um polipéptido TAT aqui identificado com outros componentes intra- ou extracelulares podem ser testados da seguinte forma: geralmente prepara-se uma mistura reaccional contendo o produto do gene e o componente intra- ou 188 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ extracelular, sob condições e durante um período de tempo que permitem a interacção e a ligação dos dois produtos. De modo a testar a capacidade de um composto candidato para inibir a ligação, a reacção é efectuada na ausência e na presença do composto de teste. Além disso, um placebo poderá ser adicionado a uma terceira mistura de reacção para servir de controlo positivo. A ligação (formação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente na mistura é monitorizada como aqui descrito acima. A formação de um complexo na(s) reacções de controlo, mas não na mistura reaccional que contém o composto de teste indica que o composto de teste interfere com a interacção do composto de teste e do seu parceiro de reacção.
Para ensaiar os antagonistas, o polipéptido TAT poderá ser adicionado a uma célula juntamente com o composto que se pretende rastrear quanto a uma actividade particular, e a capacidade do composto para inibir a actividade de interesse na presença do polipéptido TAT indica que o composto é um antagonista do polipéptido TAT. Em alternativa, os antagonistas poderão ser detectados por combinação do polipéptido TAT e de um potencial antagonista com receptores do polipéptido TAT ligados à membrana ou com receptores recombinantes, em condições apropriadas para um ensaio de inibição competitiva. 0 polipéptido TAT pode estar marcado, por exemplo via radioactividade, de modo que o número de moléculas de polipéptido TAT ligadas ao receptor possa ser usado para determinar a eficácia do potencial antagonista. 0 gene que codifica o receptor pode ser identificado por numerosos métodos conhecidos pelos peritos, por exemplo, "panning" de ligandos e separação por FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991).
Preferencialmente, utiliza-se a clonagem de expressão em que ARN poliadenilado é preparado a partir de uma célula responsiva ao polipéptido TAT, e uma biblioteca de ADNc criada a partir desta ARN é dividida em "pools" e utilizada para transfectar células COS ou outras células que não são responsivas ao polipéptido TAT. As células transfectadas que são crescidas em lâminas de vidro são expostas ao polipéptido TAT marcado. 0 polipéptido TAT pode ser marcado através de uma variedade de meios, incluindo a iodação ou a inclusão de um local de reconhecimento para uma proteína cinase 189 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ especifica de local. Após fixação e incubação, as lâminas são sujeitas a análise auto-radiográfica. Identificam-se as "pools" positivas e preparam-se "subpools" que são re-transfectadas utilizando um processo interactivo de "subpooling" e novo rastreio, fornecendo eventualmente um clone único que codifica o receptor putativo.
Como abordagem alternativa para a identificação do receptor, o polipéptido TAT marcado pode ser ligado por fotoafinidade à membrana celular ou a preparações do extracto que expressam a molécula receptora. O material reticulado é resolvido por PAGE e exposto a filme de raios X. O complexo marcado contendo o receptor pode ser excisado, resolvido em fragmentos peptidicos e submetido a microssequenciação de proteínas. A sequência de aminoácidos obtida a partir da microssequenciação seria utilizada para conceber um conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para rastrear uma biblioteca de ADNc e identificar o gene que codifica o receptor putativo.
Em outro ensaio dirigido para antagonistas, células de mamífero ou uma preparação membranar expressando o receptor seriam incubadas com polipéptido TAT marcado na presença do composto candidato. A capacidade do composto para reforçar ou bloquear esta interacção poderia então ser medida.
Exemplos mais específicos de potenciais antagonistas incluem um oligonucleótido que se liga às fusões de imunoglobulina com o polipéptido TAT e, em particular, anticorpos que incluem, sem limitação, anticorpos policlonais e monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos anti-idiotípicos e versões quiméricas ou humanizadas destes anticorpos ou fragmentos, bem como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos. Em alternativa, um potencial antagonista poderá ser uma proteína muito relacionada, por exemplo, uma forma mutada do polipéptido TAT que reconhece o receptor, mas que não confere qualquer efeito, inibindo, assim, competitivamente a acção do polipéptido TAT.
Outro antagonista potencial do polipéptido TAT é uma construção de ARN ou ADN anti-senso preparada utilizando tecnologia anti-senso, em que, por exemplo, uma molécula de 190 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ARN ou ADN anti-senso actua para bloquear directamente a tradução do ARNm, hibridando com o ARNm visado e impedindo a tradução em proteína. A tecnologia anti-senso pode ser utilizada para controlar a expressão génica através da formação de hélices triplas ou de ADN ou ARN anti-senso, em que ambos os métodos se baseiam na ligação de um polinucleótido a ADN ou ARN. Por exemplo, a porção codificante 5' da sequência polinucleotídica, que codifica os polipéptidos TAT maduros do invento, é utilizada para conceber um oligonucleótido de ARN anti-senso com um comprimento de cerca de 10 a 40 pares de bases. Um oligonucleótido de ADN é concebido para ser complementar de uma região do gene envolvida na transcrição (hélice tripla -ver Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), impedindo assim a transcrição e a produção do polipéptido TAT. O oligonucleótido de ARN anti-senso híbrida com o ARNm in vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm no polipéptido TAT (anti-senso: Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Os oligonucleótidos descritos acima também podem ser entregues a células de modo que o ARN ou ADN anti-senso possa ser expresso in vivo para inibir a produção do polipéptido TAT. Quando se utiliza ADN anti-senso, oligodesoxirribonucleótidos derivados do local de iniciação da tradução, por exemplo, entre as posições aproximadamente -10 e +10 da sequência nucleotídica do gene-alvo, são preferidos.
Os potenciais antagonistas incluem pequenas moléculas que se ligam ao local activo, ao local de ligação do receptor, ao local de ligação do factor de crescimento ou a outro local de ligação relevante do polipéptido TAT, bloqueando desse modo a actividade biológica normal do polipéptido TAT. Os exemplos de pequenas moléculas incluem, embora não estejam limitados a estas, pequenos péptidos ou moléculas idênticas a péptidos, preferencialmente péptidos solúveis, e compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos não peptidilo.
As ribozimas são moléculas de ARN enzimáticas capazes de catalisar a clivagem específica do ARN. As ribozimas actuam 191 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ através de hibridação específica de sequência com o ARN-alvo complementar, seguida de clivagem endonucleolítica. Os locais de clivagem específicos das ribozimas num potencial ARN-alvo podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para obter pormenores adicionais, ver, por exemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) e Publicação PCT n.° WO 97/33551 (publicada em 18 de Setembro de 1997).
As moléculas de ácido nucleico em formação de tripla hélice utilizadas para inibir a transcrição deverão ser de cadeia simples e constituídas por desoxinucleótidos. A composição de bases destes oligonucleótidos é concebida de modo a promover a formação de hélices triplas através das regras de emparelhamento de bases de Hoogsteen, que geralmente exigem extensões consideráveis de purinas ou pirimidinas numa cadeia de um dúplex. Para obter pormenores adicionais, ver Publicação PCT n.° WO 97/33551, acima.
Estas pequenas moléculas podem ser identificadas por qualquer um ou mais de um dos ensaios de rastreio aqui discutidos acima e/ou por meio de quaisquer outras técnicas de rastreio bem conhecidas pelos peritos. O ácido nucleico que codifica o polipéptido TAT isolado pode ser aqui utilizado para produzir polipéptido TAT por via recombinante, utilizando técnicas bem conhecidas na técnica e conforme aqui descritas. Pelo seu lado, os polipéptidos TAT produzidos podem ser empregues para gerar anticorpos anti-TAT, utilizando técnicas bem conhecidas na técnica e conforme aqui descritas.
Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido TAT aqui identificado, assim como outras moléculas identificadas pelos ensaios de rastreio aqui descritos acima, podem ser administrados para o tratamento de várias perturbações, incluindo o cancro, sob a forma de composições farmacêuticas.
Caso o polipéptido TAT seja intracelular e se utilizem anticorpos inteiros como inibidores, os anticorpos internalizantes são preferidos. Contudo, as lipofecções ou os lipossomas também podem ser utilizados para entregar o 192 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ anticorpo, ou um fragmento do anticorpo, às células. Quando se utilizam fragmentos de anticorpos, o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína-alvo é preferido. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, é possível conceber moléculas peptídicas que conservam a capacidade de ligação à sequência proteica-alvo. Tais péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de ADN recombinante. Ver, por exemplo, Marasco et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893 (1993). A formulação do invento também poderá conter mais de um composto activo consoante necessário para a indicação particular em tratamento, preferencialmente aqueles com actividades complementares que não se afectam negativamente um ao outro. Em alternativa, ou adicionalmente, a composição poderá compreender um agente que intensifica a sua função tal como, por exemplo, um agente citotóxico, uma citocina, um agente quimioterapêutico ou um agente inibidor do crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação e em quantidades que são eficazes para o objectivo pretendido.
Os exemplos seguintes são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito do presente invento de nenhuma forma.
EXEMPLOS
Os reagentes disponíveis comercialmente referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante salvo indicação em contrário. A origem daquelas células identificadas nos exemplos seguintes e ao longo do fascículo pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. EXEMPLO 1: Perfil de expressão em tecidos utilizando GeneExpress®
Uma base de dados registada contendo informação sobre expressão génica (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) foi analisada numa tentativa de identificar 193 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ polipéptidos (e os respectivos ácidos nucleicos codificantes) cuja expressão é significativamente regulada de forma positiva ("upregulated") em tecido(s) tumorais particulares de interesse em comparação com outro(s) tumor(es) e/ou tecidos normais. Especificamente, a análise da base de dados GeneExpress® foi realizada utilizando quer software disponível através de Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD para utilização com a base de dados GeneExpress®, quer software registado escrito e desenvolvido na Genentech, Inc. para utilização com a base de dados GeneExpress®. A classificação de correspondências positivas na análise baseia-se em vários critérios que incluem, por exemplo, a especificidade do tecido, a especificidade do tumor e o nível de expressão em tecidos essenciais normais e/ou proliferantes normais.
As moléculas cujo perfil de expressão nos tecidos, conforme determinado a partir de uma análise da base de dados GeneExpress , evidencia uma expressão elevada nos tecidos e uma regulação positiva significativa da expressão num tumor ou tumores específicos em comparação com outro(s) tumor(es) e/ou tecidos normais e, opcionalmente, uma expressão relativamente baixa em tecidos essenciais normais e/ou proliferantes normais são alvos polipeptídicos excelentes para o diagnóstico e terapia do cancro nos mamíferos. EXEMPLO 2: Análise de "microarrays" para detectar a regulação positiva de polipéptidos TAT em tumores cancerosos
Os "microarrays" de ácidos nucleicos, muitas vezes contendo milhares de sequências génicas, são úteis para identificar genes expressos de modo diferencial em tecidos doentes em comparação com os seus homólogos normais. Utilizando "microarrays" de ácidos nucleicos, as amostras de ARNm de teste e de controlo provenientes de amostras de tecidos de teste e de controlo são retrotranscritas (transcrição reversa) e marcadas para gerar sondas de ADNc. As sondas de ADNc são depois hibridadas com um "array" de ácidos nucleicos imobilizados num suporte sólido. O "array" é configurado de modo que a sequência e a posição de cada membro do "array" seja conhecida. Por exemplo, uma selecção de genes que se sabe serem expressos em determinados estados de doença pode ser disposta num suporte sólido. A hibridação 194 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ de uma sonda marcada com um membro particular do "array" indica que a amostra da qual a sonda foi derivada expressa esse gene. Caso o sinal de hibridação de uma sonda proveniente de uma amostra de teste (tecido doente) seja superior ao sinal de hibridação de uma sonda proveniente de uma amostra de controlo (tecido normal), o gene ou genes sobreexpressos no tecido doente são identificados. A implicação deste resultado é o facto de uma proteína sobreexpressa num tecido doente ser útil não só como um marcador de diagnóstico para a presença da condição de doença, mas também como um alvo terapêutico para o tratamento da condição de doença. A metodologia da hibridação de ácidos nucleicos e a tecnologia de "microarrays" é bem conhecida na técnica. Num exemplo, a preparação específica dos ácidos nucleicos para hibridação e as sondas, as lâminas e as condições de hibridação estão todas detalhadas no Pedido de Patente PCT com o n.° de série PCT/US01/10482, apresentado em 30 de Março de 2001, e que está aqui incorporado pode meio de referência.
No presente exemplo, tumores cancerosos derivados de vários tecidos humanos foram estudados quanto a uma expressão génica regulada positivamente em relação a tumores cancerosos provenientes de diferentes tipos de tecidos e/ou de tecidos humanos agora cancerosos, numa tentativa de identificar aqueles polipéptidos que são sobreexpressos em tumor(es) canceroso (s) particular(es) . Em determinadas experiências, obteve-se tecido de tumor humano canceroso e tecido de tumor humano não canceroso do mesmo tipo de tecido (muitas vezes do mesmo doente) e analisou-se relativamente à expressão do polipéptido TAT. Adicionalmente, obteve-se tecido de tumor humano canceroso de uma variedade de diferentes tumores humanos e comparou-se com uma amostra de controlo epitelial "universal" que foi preparada por combinação de tecidos humanos não cancerosos de origem epitelial, incluindo fígado, rim e pulmão. O ARNm isolado a partir dos tecidos combinados representa uma mistura dos produtos génicos expressos destes diferentes tecidos. As experiências de hibridação com o "microarray" utilizando as amostras de controlo combinadas geraram uma representação linear numa análise a duas cores. O declive da linha gerada numa análise a duas cores foi depois 195 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ utilizado para normalizar as razões de (detecção teste:controlo) em cada experiência. As razões normalizadas provenientes de várias experiências foram depois comparadas e utilizadas para identificar uma aglomeração de expressão génica. Assim, a amostra de "controlo universal" combinada não só permitiu determinações eficazes da expressão génica relativa numa comparação simples de duas amostras, como também permitiu comparações multiamostra através de várias experiências.
Nestas experiências, utilizaram-se sondas de ácido nucleico derivadas das sequências de ácido nucleico que codificam polipéptidos TAT aqui descritas na criação do "microarray", e o ARN proveniente de vários tecidos tumorais foi utilizado para a hibridação com o "microarray". Os resultados destas experiências estão apresentados em baixo, demonstrando que vários polipéptidos TAT do presente invento são significativamente sobreexpressos em vários tecidos tumorais humanos em comparação com os tecido(s) homólogo(s) normais. Além disso, todas as moléculas apresentadas em baixo são significativamente sobreexpressas no(s) seu(s) tecido(s) tumorais específicos em comparação com o controlo epitelial "universal". Como descrito acima, estes resultados demonstram que os polipéptidos TAT do presente invento são úteis não só como marcadores de diagnóstico para a presença de um ou mais tumores cancerosos, mas também actuam como alvos terapêuticos para o tratamento daqueles tumores.
Molécula regulação positiva em comparação com; da expressão em: DNA219894(TAT211) tumor do ovário tecido normal do ovário DNA219894(TAT211) tumor do pulmão tecido normal do pulmão EXEMPLO 3: Análise quantitativa da expressão do ARNm de
TAT
Nesta análise, utilizou-se um ensaio com uma nuclease 5' (por exemplo, TaqMan®) e um PCR quantitativo em tempo real (por exemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, 196 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Califórnia)) para encontrar genes que são significativamente sobreexpressos num tumor ou tumores cancerosos em comparação com outros tumores cancerosos ou com tecido não canceroso normal. A reacção do ensaio com a nuclease 5' é uma técnica fluorescente baseada na reacção de PCR, que faz uso da actividade de exonuclease 5' da enzima ADN Taq polimerase para monitorizar a expressão génica em tempo real. Dois iniciadores oligonucleotidicos (cujas sequências são baseadas no gene ou na sequência EST de interesse) são utilizados para gerar um amplicão típico de uma reacção de PCR. Um terceiro oligonucleótido, ou sonda, é concebido para detectar a sequência nucleotídica localizada entre os dois iniciadores de PCR. A sonda não é extensível pela enzima ADN TAq polimerase e está marcada com um corante fluorescente repórter e um corante fluorescente desactivador. Qualquer emissão induzida por laser do corante repórter é desactivada pelo corante desactivador quando os dois corantes estão localizados próximos um do outro como acontece na sonda. Durante a reacção de amplificação de PCR, a enzima ADN Taq polimerase cliva a sonda de uma forma dependente do modelo. Os fragmentos de sonda resultantes dissociam-se em solução, e o sinal do corante repórter libertado fica livre do efeito desactivador do segundo fluoróforo. Uma molécula de corante repórter é libertada por cada nova molécula sintetizada, e a detecção do corante repórter não desactivado fornece a base para uma interpretação quantitativa dos resultados. O processo da nuclease 5' é efectuado num dispositivo de PCR quantitativo em tempo real, tal como o ABI Prism 7700TM Sequence Detection. O sistema consiste num termociclador, laser, uma câmara com dispositivo de carga acoplada (CCD) e um computador. 0 sistema amplifica as amostras num formato de 96 poços, num termociclador. Durante a amplificação, o sinal fluorescente induzido por laser é recolhido em tempo real, através de cabos de fibra óptica, para a totalidade dos 96 poços e detectado na CCD. 0 sistema inclui software para operar o instrumento e para analisar os resultados. 0 material de partida para o rastreio foi ARNm isolado a partir de uma variedade de diferentes tecidos cancerosos. O ARNm é quantificado de forma precisa, por exemplo,
fluorimetricamente. Como controlo negativo, isolou-se o ARN 197 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ de vários tecidos normais do mesmo tipo de tecido que os tecidos cancerosos em teste.
Os resultados do ensaio com a nuclease 5' são inicialmente expressos como Cl, ou ciclo de limiar. Este é definido como o ciclo no qual o sinal do repórter acumula acima do nível de fundo da fluorescência. Os valores ACl são utilizados como uma medição quantitativa do número relativo de cópias iniciais de uma sequência-alvo particular numa amostra de ácido nucleico, quando se comparam resultados de ARNm de cancro com resultados de ARNm humano normal. Como uma unidade Cl corresponde a 1 ciclo de PCR ou a um aumento relativo de aproximadamente 2x em relação ao normal, duas unidades correspondem a um aumento relativo de 4x, 3 unidades correspondem a um aumento relativo de 8x etc., é possível medir quantitativamente em vezes o aumento relativo da expressão de ARNm entre dois ou mais tecidos diferentes. Utilizando esta técnica, as moléculas indicadas em baixo foram identificadas como sendo siqnificativamente sobreexpressas em tumor(es) particular(es) em comparação com o(s) respectivo(s) tecido(s) homóloqo(s) não canceroso(s) normal(ais) (tanto do mesmo como de diferentes dadores de tecido) e, deste modo, constituem excelentes alvos polipeptídicos para o diaqnóstico e terapia do cancro em mamíferos. em comparação com: tecido normal do pulmão
Molécula regulação positiva da expressão em: DNA219894 (TAT211) tumor do pulmão EXEMPLO 4: Hibridação in situ A hibridação in situ é uma técnica versátil e poderosa para a detecção e localização de sequências de ácido nucleico em preparações de células ou de tecido. Ela poderá ser útil, por exemplo, para identificar locais de expressão génica, analisar a distribuição da transcrição no tecido, identificar e localizar uma infecção virai, seguir alterações na síntese de um ARNm específico e ajudar no mapeamento cromossómico. 198 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ A hibridação in situ foi realizada de acordo com uma versão optimizada do protocolo de Lu & Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando ribossondas marcadas com 33P e geradas por PCR. Resumidamente, tecidos humanos incrustados em parafina e fixados em formalina foram seccionados, desparafinados, desproteinizados com proteinase K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37°C e adicionalmente processados para hibridação in situ como descrito por Lu e Gillett, acima. Gerou-se uma ribossonda anti-senso marcada com [33P]-UTP a partir de um produto de PCR e hibridou-se a 55°C durante a noite. As lâminas foram imersas em emulsão fotográfica Kodak NTB2 e expostas durante 4 semanas. Síntese da 33P-ribossonda 6,0 μΐ (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BP 1002, SA < 2000 Ci/mmol) foram secos num speedvac. A cada tubo contendo 33P-UTP seco, adicionaram-se os seguintes ingredientes: 2.0 μΐ de tampão de transcrição 5x 1, 0 μΐ de DTT (100 mM) 2.0 μΐ de mistura de NTP (2,5 mM; 10 μ; de cada um de GTP, CTP & ATP 10 mM + 10 μΐ de H20) 1.0 μΐ de UTP (50 μΜ) 1.0 μΐ de RNasin 1.0 μΐ de modelo de ADN (1 pg) 1.0 μΐ de H20 1.0 μΐ de ARN-polimerase (para produtos de PCR T3 = AS, T7 = S, geralmente)
Os tubos foram incubados a 37°C durante uma hora. Adicionou-se 1,0 μΐ de ADNase RQ1, seguido de incubação a 37°C durante 15 minutos. Adicionaram-se 90 μΐ de TE (Tris 10 mM pH 7,6/EDTA 1 mM pH 8,0), e a mistura foi pipetada sobre papel DE81. A restante solução foi carregada numa unidade de ultrafiltração Microcon-50 e girada utilizando o programa 10 (6 minutos). A unidade de filtração foi invertida sobre um segundo tubo e girada utilizando o programa 2 (3 minutos).
Após a rotação de recuperação final, adicionaram-se 100 μΐ de TE. Pipetou-se 1 μΐ do produto final sobre papel DE81 e contou-se em 6 ml de Biofluor II. 199 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ A sonda foi corrida num gel de TBE/ureia. Adicionaram-se 1-3 μΐ da sonda ou 5 μΐ de RNA Mrk III a 3 μΐ de tampão de trabalho. Após aquecimento num bloco de aquecimento a 95°C durante três minutos, a sonda foi imediatamente colocada em gelo. Os poços do gel foram irrigados, e a amostra foi carregada e corrida a 180-230 volts durante 45 minutos. O gel foi embrulhado em invólucro de saran e exposto a filme XAR com um ecrã intensificador num congelador a -70°C, uma hora até durante a noite. 33P-Hibri dação A. Pré-tratamento das secções congeladas
As lâminas foram removidas do congelador, colocadas em tabuleiros de alumínio e descongeladas à temperatura ambiente durante 5 minutos. Os tabuleiros foram colocados num incubador a 55°C durante cinco minutos para reduzir a condensação. As lâminas foram fixadas durante 10 minutos em paraformaldeído a 4% em gelo, na hotte, e lavadas com SSC 0,5x durante 5 minutos à temperatura ambiente (25 ml de SSC 20x + 975 ml de SQ H20). Após desproteinização com proteinase K a uma concentração de 0,5 pg/ml durante 10 minutos a 37°C (12,5 μΐ de solução-stock 10 mg/ml em 250 ml de tampão de ARNase isento de ARNase pré-aquecido), as secções foram lavadas com SSC 0,5x durante 10 minutos à temperatura ambiente. As secções foram desidratadas em etanol a 70%, 95% e 100%, 2 minutos em cada uma delas. B. Pré-tratamento das secções incrustadas em parafina
As lâminas foram desparafinadas, colocadas em SQ H20 e enxaguadas duas vezes com SSC 2x à temperatura ambiente, durante 5 minutos de cada uma das vezes. As secções foram desproteinizadas com proteinase K a uma concentração de 20 pg/ml (500 μΐ de solução 10 mg/ml em 250 ml de tampão de ARNase isento de ARNase; 37°C, 15 minutos) - embrião humano ou com proteinase K 8x (100 μΐ em 250 ml de tampão de ARNase, 37°C, 30 minutos) - tecidos em formalina. O enxaguamento com SSC 0,5x e a desidratação subsequentes foram efectuados da forma descrita acima. 200 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ C. Pré-hibridação
As lâminas foram dispostas numa caixa de plástico coberta com tampão Box (SSC 4x, formamida a 50%) - papel de filtro saturado. D. Hibridação 1,0 x 106 c.p.m. de sonda e 1,0 μΐ de ARNt (solução-stock 50 mg/ml) por lâmina foram aquecidos a 95°C durante 3 minutos. As lâminas foram arrefecidas em gelo e adicionaram-se 48 μΐ de tampão de hibridação por lâmina. Após colocação no Vortex, adicionaram-se 50 μΐ de mistura 33P a 50 μΐ da pré-hibridação na lâmina. As lâminas foram incubadas durante a noite a 55°C. E. Lavagens A lavagem foi efectuada 2 x 10 minutos com SSC 2x, EDTA à temperatura ambiente (400 ml de SSC 20x + 16 ml de EDTA 0,25 M, Vf=41) , seguida de tratamento com ARNase A a 37°C durante 30 minutos (500 μΐ de solução 10 mg/ml em 250 ml de tampão de ARNase = 20 pg/ml). As lâminas foram lavadas 2 x 10 minutos com SSC 2x, EDTA à temperatura ambiente. As condições de estringência da lavagem foram as seguintes: 2 horas a 55°C, SSC 0, lx; EDTA (20 ml de SSC 20x + 16 ml de EDTA, Vf=41) . F. 01igonucleótidos A análise in situ foi efectuada numa variedade de sequências de ADN aqui descritas. Os oligonucleótidos empregues para estas análises foram obtidos de modo a serem complementares dos ácidos nucleicos (ou dos seus complementos) tal como ilustrados nas figuras anexas. G. Resultados A análise in situ foi efectuada numa variedade de sequências de ADN aqui descritas. Os resultados destas análises são como se segue. 201 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ DNA219894 (ΤΑΤ211)
Numa análise, 12/14 adenocarcinomas do ovário são positivos e 8/9 adenocarcinomas do endométrio são positivos. O estroma do ovário normal é negativo, tal como o miométrio uterino. Outros tecidos uterinos e dos ovários normais são negativos.
Numa análise independente, 16/27 carcinomas pulmonares de não pequenas células são positivos, em que o sinal é moderado ou forte. EXEMPLO 5: Análise imuno-histoquímica
Prepararam-se anticorpos contra determinados polipéptidos TAT aqui descritos e a análise imuno-histoquímica foi realizada como se segue. As secções de tecido foram inicialmente fixadas durante 5 minutos em acetona/etanol (congeladas ou incrustadas em parafina). As secções foram depois lavadas com PBS e bloqueadas com avidina e biotina (kit Vector) durante 10 minutos cada, seguido de lavagem com PBS. Em seguida, as secções foram bloqueadas com soro a 10% durante 20 minutos e secas com absorvente para remover o excesso. Adicionou-se um anticorpo primário às secções a uma concentração de 10 pg/ml durante 1 hora e, em seguida, as secções foram lavadas com PBS. Adicionou-se depois um anticorpo secundário biotinilado (anti-anticorpo primário) às secções durante 30 minutos, e as secções foram lavadas com PBS. As secções foram expostas aos reagentes do kit Vector ABC durante 30 minutos e depois foram lavadas com PBS. Seguidamente, as secções foram expostas a diaminobenzidina (Pierce) durante 5 minutos e lavadas com PBS. As secções foram depois sujeitas a coloração de contraste com hematoxilina de Mayers, cobertas com uma lamela e visualizadas. A análise de imuno-histoquímica também pode ser efectuada da forma descrita em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 e Ausubel et al., Current Protocols of Molecular
Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). 202 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ EXEMPLO 6: Verificação e análise da expressão
diferencial do polipéptido TAT por GEPIS
Os polipéptidos TAT que poderão ter sido identificados como um antigénio tumoral da forma descrita em um ou mais dos exemplos acima foram analisados e verificados como se segue. Pesquisou-se uma base de dados de ADN de marcas de sequência expressa (EST de "Expressed Sequence Tag") (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, Califórnia) e identificaram-se sequências EST interessantes por GEPIS. O perfil de expressão génica in silíco (GEPIS de "Gene Expression Profiling In Silico") é uma ferramenta bioinformática desenvolvida na Genentech, Inc. que caracteriza genes de interesse para novos alvos terapêuticos no cancro. A GEPIS tira partido de grandes quantidades de informação de sequências EST e bibliotecas para determinar os perfis de expressão génica. A GEPIS é capaz de determinar o perfil de expressão de um gene com base na correlação proporcional com o número das suas ocorrências em bases de dados de EST, e a ferramenta funciona integrando a base de dados relacional de EST LIFESEQ® e informações registadas da Genentech de uma forma rigorosa e estatisticamente significativa. Neste exemplo, a GEPIS é utilizada para identificar e contravalidar novos antigénios tumorais, embora a ferramenta possa ser configurada para realizar quer análises muito especificas quer tarefas de rastreio amplas. Para o rastreio inicial, a GEPIS é utilizada para identificar sequências EST da base de dados LIFESEQ® que estão correlacionadas com a expressão num tecido ou tecidos particulares de interesse (frequentemente um tecido tumoral de interesse). As sequências EST identificadas neste rastreio inicial (ou as sequências de consenso obtidas do alinhamento de múltiplas sequências EST relacionadas e sobreponiveis obtidas a partir do rastreio inicial) foram depois submetidas a um rastreio destinado a identificar a presença de pelo menos um domínio transmembranar na proteína codificada. Finalmente, a GEPIS foi empregue para gerar um perfil completo de expressão nos tecidos para as várias sequências de interesse. Utilizando este tipo de bioinformática de rastreio, identificaram-se vários polipéptidos TAT (e as respectivas moléculas de ácido nucleico codificante) que são significativamente sobreexpressos num tipo particular de cancro ou em determinados cancros em comparação com outros 203 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ cancros e/ou tecidos não cancerosos normais. A classificação das correspondências GEPIS baseia-se em vários critérios incluindo, por exemplo, a especificidade do tecido, a especificidade do tumor e o nível de expressão em tecidos essenciais normais e/ou proliferantes normais. As moléculas cujo perfil de expressão nos tecidos, conforme determinado por GEPIS, evidencia uma expressão elevada nos tecidos e uma regulação positiva significativa da expressão num tumor ou tumores específicos em comparação com outro(s) tumor(es) e/ou tecidos normais e, opcionalmente, uma expressão relativamente baixa em tecidos essenciais normais e/ou proliferantes normais são alvos polipeptídicos excelentes para o diagnóstico e terapia do cancro nos mamíferos. EXEMPLO 7: Utilização de TAT como uma sonda de hibridação 0 método seguinte descreve a utilização de uma sequência nucleotídica que codifica TAT como uma sonda de hibridação para, por exemplo, diagnosticar a presença de um tumor num mamífero.
Um ADN compreendendo a sequência codificante de TAT completo ou maduro, como aqui descrito, também pode ser utilizado como uma sonda para pesquisar ADN homólogos (como sejam aqueles que codificam variantes de TAT de ocorrência natural) em bibliotecas de ADNc de tecidos humanos ou em bibliotecas genómicas de tecidos humanos. A hibridação e a lavagem dos filtros que contêm os ADN de qualquer uma das bibliotecas são efectuadas sob as seguintes condições de estringência elevada. A hibridação da sonda derivada de TAT radiomarcada com os filtros é efectuada numa solução de formamida a 50%, SSC 5x, SDS a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8; solução de Denhardt 2x e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, durante 20 horas. A lavagem dos filtros é realizada numa solução aquosa de SSC 0,lx e SDS a 0,1% a 42°C.
Os ADN que possuem uma identidade de sequência desejada com o ADN que codifica TAT de sequência nativa completo podem 204 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ depois ser identificados utilizando técnicas padrão conhecidas na técnica. EXEMPLO 8: Expressão de TAT em E. coli
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma não glicosilada de TAT por expressão recombinante em E. coli. A sequência de ADN que codifica TAT é inicialmente amplificada utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores deverão conter locais de enzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado. É possível utilizar uma variedade de vectores de expressão. Um exemplo de um vector adequado é pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contém genes de resistência à ampicilina e à tetraciclina. O vector é digerido com uma enzima de restrição e desfosforilado. As sequências amplificadas por PCR são depois ligadas no vector. O vector incluirá, de preferência, sequências que codificam um gene de resistência a um antibiótico, um promotor trp, uma sequência "leader" poli-his (incluindo os primeiros seis codões STII, a sequência poli-his e o local de clivagem da enterocinase), a região codificante de TAT, uma sequência de terminação da transcrição de lambda e um gene argU. A mistura de ligação é depois utilizada para transformar uma estirpe de E. coli seleccionada, usando os métodos descritos em Sambrook et al., acima. Os transformantes são identificados por meio da sua capacidade para crescer em placas LB, e as colónias resistentes ao antibiótico são depois seleccionadas. 0 ADN plasmídico pode ser isolado e confirmado por análise de restrição e sequenciação de ADN.
Os clones seleccionados podem ser crescidos durante a noite em meio de cultura líquido, por exemplo, meio LB suplementado com antibióticos. A cultura realizada durante a noite pode ser subsequentemente usada para inocular uma cultura em maior escala. As células são depois crescidas até uma densidade óptica desejada, período durante o qual o promotor de expressão é activado. 205 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Após cultura das células durante várias horas adicionais, as células podem ser colhidas por centrifugação. 0 depósito celular obtido por centrifugação pode ser solubilizado utilizando vários agentes conhecidos na técnica, e a proteína TAT solubilizada pode depois ser purificada usando uma coluna de metal quelante, em condições que permitem uma ligação firme da proteína. TAT poderá ser expresso em E. coli numa forma dotada de uma marca poli-His, utilizando o procedimento seguinte. O ADN que codifica TAT é primeiro amplificado utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores conterão locais de enzimas de restrição que correspondem aos locais de enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado, e outras sequências úteis que permitem uma iniciação eficaz e fiável da tradução, uma purificação rápida numa coluna de metal quelante e uma remoção proteolítica com enterocinase. As sequências amplificadas por PCR e dotadas de uma marca poli-His são depois ligadas num vector de expressão, que é utilizado para transformar um hospedeiro E. coli baseado na estirpe 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Os transformantes são primeiro crescidos em meio LB contendo carbenicilina numa concentração de 50 mg/ml, a 30°C e com agitação, até à obtenção de uma D.O.õoo de 3-5. As culturas são depois diluídas 50-100x em meio CRAP (preparado por mistura de 3,57 g de (NH4)2S04,· 0,71 g de citrato de sódio·2Η2θ; 1,07 g de KC1; 5,36 g de extracto de levedura de Difco; 5,36 g de Hycase SF de Sheffield em 500 ml de água, bem como MPOS 110 mM, pH 7,3; glucose a 0,55% (p/v) e MgS04 7 mM) e crescidas durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C com agitação. Retiram-se amostras para verificar a existência de expressão por análise de SDS-PAGE, e a cultura em volume é centrifugada para depositar as células. Os depósitos celulares são congelados até à purificação e reenrolamento. A pasta de E. coli proveniente de fermentações de 0,5 a 11 (depósitos de 6-10 g) é ressuspensa em 10 volumes (p/v) de tampão de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Adiciona-se sulfito de sódio e tetrationato de sódio para perfazer concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e a solução é agitada durante a noite a 4°C. Esta etapa resulta 206 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ numa proteína desnaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados por sulfitolização. A solução é centrifugada a 40.000 rpm numa ultracentrifuga de Beckman durante 30 minutos. O sobrenadante é diluído com 3-5 volumes de tampão para a coluna de metal quelante (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) e filtrado através de filtros de 0,22 mícrones para clarificar. O extracto clarificado é carregado numa coluna de quelato metálico Ni-NTA de Qiagen de 5 ml equilibrada com o tampão para a coluna de metal quelante. A coluna é lavada com tampão adicional contendo imidazol 50 mM (Calbiochem, qualidade Utrol), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo imidazol 250 mM. As fracções contendo a proteína desejada são combinadas e armazenadas a 4°C. A concentração de proteína é estimada pela sua absorvância a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na sua sequência de aminoácidos.
As proteínas são reenroladas por diluição lenta da amostra em tampão de reenrolamento acabado de preparar, que consiste em: Tris 20 mM, pH 8,6/ NaCl 0,3 M; ureia 2,5 M; cisteína 5 mM; glicina 20 mM e EDTA 1 mM. Os volumes de reenrolamento são seleccionados de modo que a concentração final de proteína esteja compreendida entre 50 e 100 microgramas/ml. A solução de reenrolamento é agitada suavemente a 4°C durante 12-36 horas. A reacção de reenrolamento é parada através da adição de TFA até uma concentração final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de uma purificação adicional da proteína, a solução é filtrada através de um filtro de 0,22 mícrones e adiciona-se acetonitrilo para uma concentração final de 2-10%. A proteína reenrolada é sujeita a cromatografia numa coluna de fase reversa Poros Rl/H, utilizando um tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição com um gradiente de acetonitrilo entre 10 e 80%. Alíquotas das fracções com absorvância A2so são analisadas em géis de SDS-poliacrilamida, e as fracções contendo a proteína reenrolada homogénea são combinadas. Geralmente, as espécies correctamente reenroladas da maioria das proteínas são eluídas às menores concentrações de acetonitrilo, uma vez que essas espécies são as mais compactas com os seus interiores hidrofóbicos protegidos da interacção com a resina de fase reversa. As espécies agregadas são geralmente eluídas a concentrações mais elevadas de acetonitrilo. Além de resolver 207 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ as formas incorrectamente enroladas das proteínas da forma desejada, a etapa de fase reversa também remove endotoxinas das amostras.
As fracções que contêm o polipéptido TAT enrolado desejado são combinadas, e o acetonitrilo é removido utilizando uma corrente suave de azoto dirigida para a solução. As proteínas são formuladas em Hepes 20 mM, pH 6,8 contendo cloreto de sódio 0,14 M e manitol a 4% por diálise ou por filtração em gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas no tampão de formulação e filtradas em condições estéreis.
Alguns dos polipéptidos TAT aqui descritos foram expressos e purificados com êxito utilizando esta(s) técnica(s). EXEMPLO 9: Expressão de TAT em células de mamífero
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma potencialmente glicosilada de TAT por expressão recombinante em células de mamífero. O vector pRK5 (ver EP 307,247, publicada em 15 de Março de 1989) é utilizado como vector de expressão. Opcionalmente, o ADN TAT é ligado em pRK5 com enzimas de restrição seleccionadas para permitir a inserção do ADN TAT usando métodos de ligação como descritos em Sambrook et al., acima. O vector resultante é denominado pRK5-TAT.
Numa concretização, as células hospedeiras seleccionadas poderão ser células 293. As células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são crescidas até à confluência em placas de cultura de tecidos em meio como, por exemplo, DMEM suplementado com soro fetal de vitelo e, opcionalmente componentes nutrientes e/ou antibióticos. Misturam-se cerca de 10 pg de ADN pRK5-TAT com cerca de 1 pg de ADN que codifica o gene VA RNA [Thimmappaya et al., Cell. 31:543 (1982)] e dissolve-se em 500 pl de Tris-HC1 1 mM; EDTA 0,1 mM; CaC2 0,227 Μ. A esta mistura adicionam-se, gota a gota, 500 pl de HEPES 50 mM (pH 7,35); NaCl 280 mM; NaPCp 1,5 mM; e permite-se a formação de um precipitado durante 10 minutos a 25°C. O precipitado é 208 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ suspenso, adicionado às células 293 e deixado depositar durante cerca de quatro horas a 37°C. Aspira-se o meio de cultura e adicionam-se 2 ml de glicerol a 20% em PBS durante 30 segundos. As células 293 são depois lavadas com meio isento de soro, adiciona-se meio fresco e as células são incubadas durante cerca de 5 dias.
Aproximadamente 24 horas após as transfecções, o meio de cultura é removido e substituído por meio de cultura (só) ou por meio de cultura contendo 35S-cisteína 200 pCi/ml e 35S-metionina 200 pCi/ml. Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado num filtro rotativo e carregado num gel de SDS a 15%. O gel processado poderá ser seco e exposto a filme durante um período de tempo seleccionado para revelar a presença do polipéptido TAT. As culturas que contêm células transfectadas poderão sofrer uma incubação adicional (em meio isento de soro) , e o meio é testado em bioensaios seleccionados.
Numa técnica alternativa, TAT poderá ser introduzido em células 293 de modo transiente, utilizando o método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 12:7575 (1981). As células 293 são crescidas até à densidade máxima num frasco "spinner" e adicionam-se 700 pg de ADN pRK5-TAT. As células são primeiro concentradas por centrifugação a partir do frasco "spinner" e depois lavadas com PBS. O precipitado de ADN-dextrano é incubado no depósito de células durante quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% durante 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos e reintroduzidas no frasco "spinner" contendo meio de cultura de tecidos, insulina bovina numa concentração de 5 pg/ml e transferrina bovina numa concentração de 0,1 pg/ml. Após cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifugado e filtrado para remover as células e os resíduos. A amostra contendo TAT expresso pode depois ser concentrada e purificada através de qualquer método seleccionado, como seja a diálise e/ou a cromatografia em coluna.
Em outra concretização, TAT pode ser expresso em células CHO. O vector pRK5-TAT pode ser transfectado em células CHO utilizando reagentes conhecidos, como CaP04 ou DEAE-dextrano. 209 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Como descrito acima, as culturas celulares podem ser incubadas, e o meio substituído por meio de cultura (só) ou por meio de cultura contendo um radiomarcador como 35S-metionina. Após determinação da presença do polipéptido TAT, o meio de cultura poderá ser substituído por meio isento de soro. De preferência, as culturas são incubadas durante cerca de 6 dias e, em seguida, recolhe-se o meio condicionado. O meio contendo o TAT expresso pode depois ser concentrado e purificado por qualquer método seleccionado. O polipéptido TAT dotado de uma marca epitópica também poderá ser expresso em células hospedeiras CHO. O TAT poderá ser subclonado desde o vector pRK5. A inserção do subclone pode ser sujeita a PCR para fundir "in frame" com uma marca epitópica seleccionada, tal como uma marca poli-his num vector de expressão baseado em baculovírus. A inserção de TAT com uma marca poli-his pode depois ser subclonada num vector controlado por SV40 que contém um marcador de selecção, como DHFR, para a selecção dos clones estáveis. Finalmente, as células CHO podem ser transfectadas (como descrito acima) com o vector controlado por SV40. Poderá efectuar-se uma marcação, como descrito acima, para verificar a existência de expressão. 0 meio de cultura contendo o polipéptido TAT com uma marca poli-his expresso pode depois ser concentrado e purificado através de qualquer método seleccionado, como seja a cromatografia de afinidade em Ni2+-quelato. TAT também poderá ser expresso em células CHO e/ou COS através de um procedimento de expressão transiente ou em células CHO por outro procedimento de expressão estável. A expressão estável em células CHO é obtida utilizando o seguinte procedimento. As proteínas são expressas como uma construção com IgG (imunoadesina) , em que as sequências codificantes das formas solúveis (por exemplo, domínios extracelulares) das respectivas proteínas estão fundidas com uma sequência da região constante de IgGl contendo a dobradiça e os domínios CH2 e CH2 e/ou é uma forma dotada de uma marca poli-His.
Após a amplificação por PCR, os respectivos ADN são subclonados num vector de expressão para células CHO 210 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ utilizando técnicas padrão como descrito em Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Os vectores de expressão para CHO são construídos de modo a terem locais de restrição compatíveis em 5' e 3' do ADN de interesse para permitir o vaivém conveniente dos ADNc. O vector utilizado para a expressão em células CHO é como descrito em Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 1774-1779 (1996) e utiliza o amplificador/promotor precoce de SV40 para controlar a expressão do ADNc de interesse e a di-hidrofolato-redutase (DHFR). A expressão de DHFR permite efectuar a selecção com base numa manutenção estável do plasmídeo após a transfecção.
Doze microgramas do ADN plasmídico desejado são introduzidos em aproximadamente 10 milhões de células CHO, utilizando os reagentes de transfecção comercialmente disponíveis Superfect® (Quiagen), Dbspc® ou Fugene® (Boehringer Mannheim). As células são crescidas como descrito em Lucas et al. . acima. Aproximadamente 3 x 107 células são congeladas numa ampola para crescimento e produção subsequentes como descrito abaixo.
As ampolas contendo o ADN plasmídico são descongeladas por colocação num banho de água e misturadas no Vortex. O conteúdo é pipetado para um tubo de centrifugação contendo 10 ml de meio e centrifugado a 1.000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante é aspirado, e as células são ressuspensas em 10 ml de meio selectivo (PS20 filtrado através de filtro de 0,2 pm contendo soro fetal de bovino a 5% duplamente filtrado através de filtro de 0,2 pm) . As células são depois aliquotadas para um "spinner" de 100 ml contendo 90 ml de meio selectivo. Após 1-2 dias, as células são transferidas para um "spinner" de 250 ml cheio com 150 ml de meio de crescimento selectivo e incubadas a 37°C. Após outros 2-3 dias, semeiam-se "spinners" de 250 ml, 500 ml e 2000 ml com 3 x 105 células/ml. O meio celular é trocado por meio fresco através de centrifugação e ressuspensão em meio de produção. Embora possa ser utilizado qualquer meio adequado para células CHO, um meio de produção descrito na Patente U.S. n.° 5,122,469, concedida em 16 de Junho de 1992, poderá ser factualmente utilizado. Um "spinner" de 3 1 para produção é semeado com 1,2 x 106 células/ml. No dia 0, determina-se o pH 211 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ das células. No dia 1, o "spinner" é amostrado e tem inicio a aspersão com ar filtrado. No dia 2, o "spinner" é amostrado, a temperatura é deslocada para 33°C e 30 ml de glucose 500 g/1 e 0,6 ml de antiespuma a 10% (por exemplo, emulsão de polidimetilsiloxano a 33%, Dow Corning 365, emulsão de categoria médica) tirados. Ao longo da produção, o pH é ajustado conforme necessário para mantê-lo à volta de 7,2. Após 10 dias, ou até a viabilidade ter caído abaixo de 70%, a cultura celular é colhida por centrifugação e filtrada através de um filtro de 0,22 pm. O filtrado foi armazenado a 4°C ou imediatamente carregado em colunas para purificação.
No caso das construções com uma marca poli-His, as proteínas são purificadas utilizando uma coluna de Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adiciona-se imidazol ao meio condicionado para uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Ni-NTA de 6 ml, equilibrada com tampão Hepes 20 mM, pH 7,4; contendo NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM, utilizando um caudal de 4-5 ml/min a 4°C. Após a carga, a coluna é lavada com tampão de equilíbrio adicional, e a proteína é eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazol 0,25 Μ. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8; com uma coluna de G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml, e armazenada a -80°C.
As construções de imunoadesinas (contendo Fc) são purificadas a partir dos meios condicionados da seguinte forma. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) , que havia sido equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 6,8. Após a carga, a coluna é extensamente lavada com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada através da recolha de fracções de 1 ml em tubos contendo 275 μΐ de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada é subsequentemente dessalinizada em tampão de armazenamento como descrito acima para as proteínas com uma marca poli-His. A homogeneidade é avaliada através de géis de SDS-poliacrilamida e por sequenciação dos aminoácidos N-terminais via degradação de Edman. 212 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Alguns dos polipéptidos TAT aqui descritos foram expressos e purificados com êxito utilizando esta(s) técnica(s). EXEMPLO 10: Expressão de TAT em levedura O método seguinte descreve a expressão recombinante de TAT em levedura.
Primeiro, constroem-se vectores de expressão em levedura para a produção intracelular ou a secreção de TAT a partir do promotor ADH2/GAPDH. 0 ADN que codifica TAT e o promotor é introduzido em locais de enzimas de restrição adequados, no plasmideo seleccionado, para dirigir a expressão intracelular de TAT. No caso da secreção, o ADN que codifica TAT pode ser clonado no plasmideo seleccionado, juntamente com o ADN que codifica o promotor ADH2/GAPDH, um péptido de sinal de TAT nativo ou outro péptido de sinal de mamífero ou, por exemplo, uma sequência "leader"/sinal do factor alfa ou da invertase de levedura, e sequências adaptadoras (se necessário) para a expressão de TAT.
As células de levedura, como a estirpe de levedura AB110, podem depois ser transformadas com os plasmídeos de expressão descritos acima e cultivadas em meios de fermentação seleccionados. Os sobrenadantes da levedura transformada podem ser analisados por precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação por SDS-PAGE, seguida de coloração dos géis com corante azul de Coomassie. 0 TAT recombinante pode ser subsequentemente isolado e purificado através de remoção das células de levedura do meio de fermentação por centrifugação, seguida de concentração do meio utilizando cartuchos de filtração seleccionados. O concentrado contendo TAT poderá ser adicionalmente purificado utilizando resinas seleccionadas de cromatografia em coluna.
Alguns dos polipéptidos TAT aqui descritos foram expressos e purificados com êxito utilizando esta(s) técnica(s). 213 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ EXEMPLO 11: Expressão de TAT em células de insecto infectadas por baculovírus 0 método seguinte descreve a expressão recombinante de TAT em células de insecto infectadas por baculovírus. A sequência que codifica TAT é fundida a montante de uma marca epitópica contida num vector de expressão baseado em baculovírus. Tais marcas epitópicas incluem as marcas poli-His e as marcas de imunoglobulina (como as regiões Fc de IgG). É possível utilizar uma variedade de plasmídeos, incluindo plasmídeos derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis como pVL1393 (Novagen). Resumidamente, a sequência que codifica TAT ou a porção desejada da sequência codificante de TAT, por exemplo, a sequência que codifica um domínio extracelular de uma proteína transmembranar ou a sequência que codifica a proteína madura caso a proteína seja extracelular, é amplificada por PCR com iniciadores complementares das regiões 5' e 3. O iniciador 5' poderá incorporar locais de enzimas de restrição de flanco (seleccionadas). O produto é depois digerido com aquelas enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. O baculovírus recombinante é gerado por co-transfecção do plasmídeo acima e do ADN do vírus BaculoGold™ (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), utilizando Lipofectin (disponível comercialmente de GIBCO-BRL). Após 4-5 dias de incubação a 28°C, os vírus libertados são colhidos e utilizados para amplificações adicionais. A infecção virai e a expressão da proteína são efectuadas da forma descrita por 0'Reilley et al., Baculovírus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994). O TAT com uma marca poli-His expresso pode depois ser purificado, por exemplo, por cromatografia de afinidade em Ni2+-quelato da forma que se segue. Os extractos são preparados a partir de células Sf9 infectadas pelo vírus recombinante como descrito por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Resumidamente, as células Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão de sonicação (25 ml Hepes, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol a 10%; NP-40 a 214 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 0,1%; KC1 0,4 Μ) e sonicadas duas vezes durante 20 segundos em gelo. Os extractos sonicados são clarificados por centrifugação, e o sobrenadante é diluído 50x em tampão de trabalho (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 pm. Prepara-se uma coluna de agarose com Ni2+-NTA (disponível comercialmente de Qiagen) com um volume de leito de 5 ml, que é lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão de trabalho. O extracto celular filtrado é carregado na coluna a 0,5 ml por minuto. A coluna é lavada até à A28o de linha de base com tampão de trabalho, altura em que tem inicio a recolha de fracções. Em seguida, a coluna é lavada com um tampão de lavagem secundário (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol a 10%, pH 6,0), que elui a proteína não ligada especificamente. Após atingir novamente a A2so da linha de base, a coluna é desenvolvida com um gradiente de imidazol entre 0 e 500 mM no tampão de lavagem secundário. Recolhem-se fracções de um ml, que são analisadas por SDS-PAGE e coloração com prata ou transferência de Western com Ni2+-NTA conjugado com fosfatase alcalina (Qiagen) . As fracções contendo o TAT com a marca Hisio eluído são combinadas e dialisadas contra o tampão de trabalho.
Em alternativa, a purificação do TAT com uma marca IgG (ou uma marca Fc) pode ser efectuada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo, por exemplo, a cromatografia em coluna de Proteína A ou Proteína G.
Alguns dos polipéptidos TAT aqui descritos foram expressos e purificados com êxito utilizando esta(s) técnica(s).
EXEMPLO 12: Preparação de anticorpos que ligam TAT
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que se podem ligar especificamente a TAT.
As técnicas para produzir os anticorpos monoclonais são conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, em Goding, acima. Os imunogénios que poderão ser utilizados incluem TAT purificado, proteínas de fusão contendo TAT e células que expressam TAT recombinante na superfície celular. 215 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ A selecção do imunogénio pode ser efectuada pelo perito sem necessidade de uma experimentação excessiva.
Os ratinhos, por exemplo, ratinhos Balb/c, são imunizados com o imunogénio TAT emulsionado em adjuvante completo de Freund e injectado, subcutânea ou intraperitonealmente, numa quantidade entre 1-100 microgramas. Em alternativa, o imunogénio é emulsionado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injectado nas almofadas das patas traseiras do animal. Os ratinhos imunizados são depois reforçados 10 a 12 dias mais tarde com imunogénio suplementar emulsionado no adjuvante seleccionado. Subsequentemente, durante várias semanas, os ratinhos poderão também ser reforçados com injecções adicionais de imunização. Amostras de soro poderão ser periodicamente obtidas dos ratinhos por drenagem retroorbital, para teste em ensaios ELISA destinados a detectar anticorpos anti-TAT.
Após a detecção de um título de anticorpos adequado, os animais "positivos" para os anticorpos podem ser injectados com uma injecção intravenosa final de TAT. Três a quatro dias mais tarde, os ratinhos são sacrificados, e as células do baço são colhidas. As células do baço são depois fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) com uma linha de células de mieloma murino seleccionada, tal como P3X63AgU.l, disponível através de ATCC, N.° CRL 1597. As fusões geram células de hibridoma, que podem depois ser plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos do mieloma e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma serão rastreadas num ensaio ELISA para detecção de reactividade contra TAT. A determinação de células de hibridoma "positivas" que segregam os anticorpos monoclonais desejados contra TAT encontra-se dentro da perícia da técnica.
As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singénicos para produzir ascite contendo os anticorpos monoclonais anti-TAT. 216 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Em alternativa, as células de hibridoma podem ser crescidas em frascos de cultura de tecidos ou frascos rotativos. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos na ascite pode ser obtida utilizando precipitação com sulfato de amónio, seguida de cromatografia de exclusão em gel. Em alternativa, é possível utilizar a cromatografia de afinidade baseada na ligação do anticorpo à proteína A ou à proteína G.
Anticorpos dirigidos contra alguns dos polipéptidos TAT aqui descritos foram produzidos com êxito utilizando esta(s) técnica(s). Mais especificamente, anticorpos monoclonais funcionais que são capazes de reconhecer e ligar-se à proteína TAT (conforme medido por ensaio ELISA padrão, análise de separação por FACS e/ou análise de imuno-histoquímica) foram gerados com êxito contra as seguintes proteínas TAT: TATUO (DNA95930) , TAT210 (DNA95930-1) , TAT113 (DNA215609), TAT126 (DNA226539), TAT151 (DNA236511), TAT111 (DNA18 8221) , TAT146 (DNA233876), TAT112 (DNA96930) , TAT145 (DNA98565), TAT152 (DNA246435), TAT141 (DNA236493), TAT114 (DNA108809), TAT104 (DNA236343), TAT100 (DNA231542), TAT284 (DNA2 31542-1), TAT285 (DNA231542-2), TAT285-1 (DNA297393), TAT 14 4 (DNA226456), TAT188 (DNA237637), TAT123 (DNA210499), TAT211 (DNA219894), TAT102 (DNA236534), TAT127 (DNA228199) e TAT 12 8 (DNA220432) . De modo interessante, os requerentes identificaram que os anticorpos monoclonais preparados contra TAT111(DNA188221) e TAT146(DNA233876) são capazes de bloquear a activação do receptor EpbB2R, codificado pelas moléculas DNA188221 e DNA233876, pelo seu polipéptido ligando associado. Como tal, os anticorpos e os métodos de utilização desses anticorpos para bloquear a activação do receptor EphB2R (isto é, os polipéptidos TATlll e TAT146) pelo seu ligando associado estão abrangidos no invento presentemente descrito. Além disso, os requerentes identificaram que os anticorpos monoclonais dirigidos contra os polipéptidos TATUO (DNA95930) e TAT210 (DNA95930-1) (isto é, os polipéptidos receptor IL-20 alfa) são capazes de inibir a activação do receptor IL-20 alfa pela proteína IL-19. Como tal, os anticorpos e os métodos de utilização desses anticorpos para inibir a activação do receptor IL-20 alfa (isto é, os polipéptidos TATUO e TAT210) por IL-19 estão abrangidos no invento presentemente descrito. 217 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Além da preparação com êxito de anticorpos monoclonais dirigidos contra os polipéptidos TAT como aqui descritos, muitos desses anticorpos monoclonais foram conjugados com sucesso com uma toxina celular, para utilização no direccionamento da toxina celular para uma célula (ou tecido) que expressa um polipéptido TAT de interesse (tanto in vitro como in vivo) . Por exemplo, anticorpos monoclonais derivatizados com uma toxina (por exemplo, DM1) foram gerados com êxito para os seguintes polipéptidos TAT aqui descritos: TATUO (DNA9593 0) , TAT210 (DNA95930-1) , TAT112 (DNA96930), TAT113 (DNA215609), TAT111 (DNAISR21) e TAT146 (DNA233876). EXEMPLO 13: Purificação de polipéptidos TAT utilizando anticorpos específicos
Os polipéptidos TAT nativos ou recombinantes poderão ser purificados por uma variedade de técnicas comuns na técnica de purificação de proteínas. Por exemplo, o pro-polipéptido TAT, o polipéptido TAT maduro ou o pré-polipéptido TAT são purificados por cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipéptido TAT de interesse. Geralmente, constrói-se uma coluna de imunoafinidade por acoplamento covalente do anticorpo anti-polipéptido TAT a uma resina cromatográfica activada.
As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros imunes por precipitação com sulfato de amónio ou por purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, Nova Jérsia). De modo idêntico, os anticorpos monoclonais são preparados a partir do fluido ascítico de ratinhos por precipitação com sulfato de amónio ou cromatografia em Proteína A imobilizada. A imunoglobulina parcialmente purificada é ligada covalentemente a uma resina cromatográfica tal como SEPHAROSE™ activada com CNBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é acoplado à resina, a resina é bloqueada, e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.
Tal coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação do polipéptido TAT por preparação de uma fracção a partir de células que contêm o polipéptido TAT sob uma forma solúvel. Esta preparação é derivada por solubilização da célula total 218 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ou de uma fracção subcelular obtida via centrifugação diferencial pela adição de detergente, ou por outros métodos bem conhecidos na técnica. Em alternativa, o polipéptido TAT solúvel contendo uma sequência de sinal poderá ser segregado em quantidade útil para o meio no qual as células são crescidas.
Uma preparação contendo o polipéptido TAT solúvel é passada pela coluna de imunoafinidade, e a coluna é lavada em condições que permitem a absorvância preferencial do polipéptido TAT (por exemplo, tampões de força iónica elevada na presença de detergente). Em seguida, a coluna é eluida em condições que perturbam a ligação anticorpo/polipéptido TAT (por exemplo, um tampão de baixo pH, por exemplo aproximadamente pH 2-3, ou uma concentração elevada de um agente caotrópico como a ureia ou o ião tiocianato) e o polipéptido TAT é recolhido. EXEMPLO 14: Ensaio de morte de células tumorais in vitro É possível obter células de mamífero que expressam o polipéptido TAT de interesse utilizando técnicas de clonagem e vectores de expressão comuns. Em alternativa, muitas linhas de células tumorais que expressam polipéptidos TAT de interesse estão disponíveis publicamente, por exemplo, através da ATCC e podem ser rotineiramente identificadas utilizando análises ELISA ou de FACS padrão. Anticorpos monoclonais anti-polipéptido TAT (e seus derivados conjugados com toxinas) poderão depois ser utilizados em ensaios destinados a determinar a capacidade do anticorpo para matar as células que expressam o polipéptido TAT in vitro.
Por exemplo, obtêm-se células expressando o polipéptido TAT de interesse da forma descrita acima e plaqueiam-se em placas de 96 poços. Numa análise, o conjugado anticorpo/toxina (ou o anticorpo nu) é incluído ao longo da incubação das células durante um período de 4 dias. Numa segunda análise independente, as células são incubadas durante 1 hora com o conjugado anticorpo/toxina (ou o anticorpo nu) e depois são lavadas e incubadas na ausência do conjugado anticorpo/toxina durante um período de 4 dias. A viabilidade celular é, em seguida, medida utilizando o ensaio 219 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo de Promega (n.° catálogo G7571) . As células não tratadas servem de controlo negativo.
Numa análise especifica, analisaram-se anticorpos monoclonais dirigidos contra TAT112 (DNA96930) quanto à sua capacidade de matar células que expressam esse polipéptido. Numa análise, preparou-se um vector de expressão denominado gD.NCA. As sequências que codificam o polipéptido TAT112 inseridas nesse vector são controladas por um promotor SV40 e o vector também contém o sinal poliA de SV40 precoce. 0 vector gD.NCA foi co-transfectado em células PC3 juntamente com um vector SV40 que expressa resistência a Neo em células PC3, e os transformantes positivos foram seleccionados em 800 pg/ml de G418. Os clones positivos foram isolados em placas de 96 poços e analisados por citometria de fluxo, utilizando um anticorpo monoclonal anti-TAT112 preparado da forma descrita acima e denominado 3E6. O clone 3 foi seleccionado para a análise, pois verificou-se que expressa um nível elevado do polipéptido TAT112 na sua superfície. Numa segunda análise independente, a linha celular de cancro pancreático Hpaf II foi obtida junto da ATCC e utilizada no ensaio.
Os resultados do ensaio descrito acima demonstraram que os anticorpos monoclonais anti-TAT112 conjugados com DM1 foram altamente eficazes a matar tanto a linha de células PC3 expressando TAT112 como a linha de células de cancro pancreático Hpaf II, em comparação com os controlos negativos não tratados. EXEMPLO 15: Ensaio de morte de células tumorais in vivo
Para testar a eficácia de anticorpos monoclonais anti-TAT112 não conjugados, injectou-se anticorpo anti-TAT112 intraperitonealmente em ratinhos nude (atímicos), 24 horas antes de estes receberem células PC3.gD.NCA do clone 3 (obtidas da forma descrita no Exemplo 14 acima) subcutaneamente no flanco. As injecções de anticorpo continuaram duas vezes por semana pela restante duração do estudo. O volume do tumor foi medido duas vezes por semana. 220 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Para testar a eficácia do anticorpo anti-TAT112 conjugado com DM1, inocularam-se células PC3.gD.NCA do clone 3 (obtidas da forma descrita no Exemplo 14 acima) no flanco de ratinhos nude. Quando os tumores atingiram um volume médio de aproximadamente 100 mm3, os ratinhos foram tratados intravenosamente com anticorpo anti-TAT112 conjugado com DM1, uma ou duas vezes por semana.
Os resultados das análises acima demonstraram que tanto o anticorpo anti-TAT112 não conjugado como o anticorpo anti-TAT112 conjugado com DM1 foram altamente eficazes na redução do volume do tumor neste modelo in vivo. Estas análises demonstram que os anticorpos monoclonais anti-polipéptido TAT são eficazes para matar células tumorais que expressam um polipéptido TAT de interesse. EXEMPLO 16: Análise de transferência de Northern A análise de transferência de Northern foi realizada essencialmente da forma descrita por Sambrook et al., acima. A análise de transferência de Northern utilizando sondas derivadas de DNA231542, DNA231542-1, DNA231542-2 e DNA297393 evidencia uma regulação positiva significativa da expressão em tecido de glioma humano em comparação com tecido de cérebro humano normal. O fascículo escrito anterior é considerado suficiente para permitir a prática do invento por um perito. O âmbito do presento invento não deverá ser limitado pela idealização depositada, uma vez que a concretização depositada se pretende como uma simples ilustração de determinados aspectos do invento, e quaisquer construções que sejam funcionalmente equivalentes encontram-se no âmbito deste invento. O depósito de material não constitui uma admissão de que a descrição escrita aqui contida seja inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto do invento, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser entendido como limitando o âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. 221 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Listagem de sequências <110> Genentech, Inc. <120> Composições e métodos para o diagnóstico e tratamento de tumor <130> CPS/FP6559090 <140> Ainda desconhecido <141> 19-06-2002 <150> EP 02747926.0 <151> 19-06-2002 <150> PCT/US2002/019592 <151> 19-06-2002 <150> US 60/299,500 <151> 20-06-2001 <150> US 60/300,880 <151> 25-06-2001 <150> US 60/301,880 <151> 29-06-2001 <150> US 60/304,813 <151> 11-07-2001 <150> US 60/312,312 <151> 13-08-2001 <150> US 60/314,280 <151> 22-08-2001 <150> US 60/339,227 <151> 19-10-2001 <150> US 60/323,268 <151> 18-09-2001 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 222 <150> US 60/336,827 <151> 07-11-2001 <150> US 60/378,885 <151> 08-05-2002 <150> US 60/366,869 <151> 20-03-2002 <1 60> 2 <210> 29 <211> 2366 <212> ADN <213> Homo Sapien <4 0 0> 29 223 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ cagcccagca cctgcggagg gagcgctgac catggctccc tggcctgaat 50 tgggagatgc ccagcccaac cccgataagt acctcgaagg ggocgcaggt 100 cagcagccca ctgcccctga taaaagcaaa gagaccaaca aaacagataa 150 cactgaggca cctgtaacca agattgaaet tctgccgtcc tactccacgg 200 ctacactgat agatgagccc actgaggtgg atgacccctg gaacctaccc 250 actcttcagg actcggggat caagtggtca gagagagaca ccaaagggaa 300 gattctctgt ttcttccaag ggattgggag attgatttta cttctcggat 350 ttctctactt tttcgtgtgc tccctggata tt-cttagtag cgccttccag 400 ctggttggag çaaaaatggc aggacagttc ttcagcaaca gctctattat 450 gtccaaccct ttgttggggc tggtgatcgg ggtgctggtg accgtcttgg 500 tgcagagctc cagcacctca acgtccatcg ttgtcagcat ggtgtcctct 550 tcattgctca ctgttcgggc tgccatcccc attatcatgg gggccaacat 600 tggaacgtca atcaccaaca ctattgttgc gctcatgcag gtgggagatc 650 ggagtgagtt cagaagagct tttgcaggag ccactgtcca tgacttcttc 700 aactggctgt ccgtgttggt gctcttgccc gtggaggtgg ccacccatta 750 cctcgagatc ataacccagc ttatagtgga gagcttccac ttcaagaatg 800 gagaagatgc cccagatctt ctgaaagtca tcactaagcc cttcacaaag 850 ctcattgtcc agctggataa aaaagttatc agccaaattg caatgaacga 900 tgaaaaagcg aaaaacaaga gtcttgtcaa gatttggtgc aaaactttta 950 ccaacaagac ccagattaac gtcactgttc cctcgactgc taactgcacc 1000 tccccttccc tctgttggac ggatggcatc caaaactgga ccatgaagaa 1050 tgtgacctac aaggagaaca tcgccaaatg ccagcatatc tttgtgaatt 1100 tccacctccc ggatcttgct gtgggcacca tcttgctcat actctccctg 1150 ctggtcctct gtggttgcct gatcatgatt gtcaagatcc tgggctctgt 1200 gctcaagggg caggtcgcca ctgtcatcaa gaagaccatc aacactgatt 1250 tcccctttcc ctttgcatgg ttgactggct acctggccat cctcgt-cggg 1300 gcaggcatga ccttcatcgt acagagcagc tctgtgttca cgtcggcctt 1350 gacccccctg attggaatcg gcgtgataac cattgagagg gcttatccac 1400 tcacgctggg ctccaacatc ggcaccacca ccacogccat cctggccgcc 1450 ttagccagcc ctggcaatgc attgaggagt fccactccaga tcgccctgtg 1500 224 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ ccactttttc ttcaacatct ccggcatctt gctgtggtac ccgatcocgt 1550 tcactcgcct gcccatccgc atggccaagg ggctgggcaa catctctgcc 1600 aagtatcgct ggttcgccgt cttctacctg atcatcttct tcttcctgat 1650 cccgctgacg gtgtttggcc tctcgctggc cggctggcgg gtgctggttg 1700 gtgtcggggt tcccgtcgtc ttcatcatca tcctggtact gtgcctccga 1750 ctcctgcagt ctcgctgccc acgcgtcctg ccgaagaaac tccagaactg 1800 gaacttcctg ccgctgtgga tgcgctcgct gaagccctgg gatgccgtcg 1850 tctccaagtt caccggctgc ttccagatgc gctgctgctg ctgctgccgc 1900 gtgtgctgcc gcgcgtgotg cttgctgtgt ggctgcccca agtgctgocg 1950 ctgcagcaag tgctgcgagg acttggagga ggcgcaggag gggcaggatg 2000 tccctgtcaa ggctcctgag acctttgata acataaccat tagcagagag 2050 gctcagggtg aggtccctgc ctcggactca aagaccgaat gcacggcctt 2100 gtaggggacg ccccagattg tcagggatgg ggggatggtc cttgagtttt 2150 gcatgctctc ctccctccca cttctgcacc ctttcaccac ctcgaggaga 2200 tttgctcccc attagcgaat gaaattgatg cagtcctacc taactcgatt 2250 ccctttggct tggtgggtag gcctgcaggg cacttttatt ccaacccatg 2300 gcctccatga ctttttcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2350 aaaaaaaaaa aaaaaa 2366 <210> 107 <211> 690 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 107
Met Ala Pro Trp Pro Glu Leu Gly Asp Ala Gin Pro Asn Pro Asp 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Glu Gly Ala Ala Gly Gin Gin Pro Thr Ala Pro Asp 20 25 30 Lys Ser Lys Glu Thr Asn Lys Thr Asp Asn Thr Glu Ala Pro Vai 35 40 45 Thr Lys Ile Glu Leu Leu Pro Ser Tyr Ser Thr Ala Thr Leu Ile 50 55 60 Asp Glu Pro Thr Glu Vai Asp Asp Pro Trp Asn Leu Pro Thr Leu 65 70 75 225 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Gin Asp Ser Gly Ile Lys Trp Ser Glu Arg Asp Thr Lys Gly Lys 80 85 90 Ile Leu Cys Phe Phe Gin Gly Ile Gly Arg Leu Ile Leu Leu Leu 95 100 105 Gly Phe Leu Tyr Phe Phe Vai Cys Ser Leu Asp Ile Leu Ser Ser 110 115 120 Ala Phe Gin Leu Vai Gly Gly Lys Met Ala Gly Gin Phe Phe Ser 125 130 135 Asn Ser Ser Ile Met Ser Asn Pro Leu Leu Gly Leu Val Ile Gly 140 145 150 Vai Leu Vai Thr Vai Leu Vai Gin Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser 155 160 165 Ile Vai Vai Ser Met Vai Ser Ser Ser Leu Leu Thr Val Arg Ala 170 175 180 Ala Ile Pro Ile Ile Met Gly Ala Asn Ile Gly Thr Ser Ile Thr 185 190 195 Asn Thr Ile Vai Ala Leu Met Gin Vai Gly Asp Arg Ser Glu Phe 200 205 210 Arg Arg Ala Phe Ala Gly Ala Thr Vai His Asp Phe Phe Asn Trp 215 220 225 Leu Ser Vai Leu Vai Leu Leu Pro Vai Glu Vai Ala Thr His Tyr 230 235 240 Leu Glu Ile Ile Thr Gin Leu Ile Vai Glu Ser Phe His Phe Lys 245 250 255 Asn Gly Glu Asp Ala Pro Asp Leu Leu Lys Vai Ile Thr Lys Pro 260 265 270 Phe Thr Lys Leu Ile Vai Gin Leu Asp Lys Lys Val lie Ser Gin 275 280 285 Ile Ala Met Asn Asp Glu Lys Ala Lys Asn Lys Ser Leu Val Lys 290 295 300 Ile Trp Cys Lys Thr Phe Thr Asn Lys Thr Gin Ile Asn Val Thr 305 310 315 Vai Pro Ser Thr Ala Asn cys Thr Ser Pro Ser Leu Cys Trp Thr 320 325 330 Asp Gly ile Gin Asn Trp Thr Met Lys Asn Val Thr Tyr Lys Glu 335 340 345 Asn Ile Ala Lys Cys Gin His Ile Phe Vai Asn Phe His Leu Pro 350 355 360 Asp Leu Ala Vai Gly Thr Ile Leu Leu Ile Leu Ser Leu Leu Val 365 370 375 226 ΕΡ 2 000 545/ΡΤ
Leu Cys Gly Cys Leu Ile Met Ile Vai Lys Ile Leu Gly Ser Vai 380 385 390 Leu Lys Gly Gin Vai Ala Thr Vai Ile Lys Lys Thr Ile Asn Thr 395 400 405 Asp Phe Pro Phe Pro Phe Ala Trp Leu Thr Gly Tyr Leu Ala Ile 410 415 420 Leu Vai Gly Ala Gly Met Thr Phe Ile Vai Gin Ser Ser Ser Vai 425 430 435 Phe Thr Ser Ala Leu Thr Pro Leu Ile Gly ile Gly Vai Ile Thr 440 445 450 Ile Glu Arg Ala Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Ser Asn Ile Gly Thr 45S 460 465 Thr Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Ser Pro Gly Asn Ala 470 475 480 Leu Arg Ser Ser Leu Gin Ile Ala Leu Cys His Phe Phe Phe Asn 485 490 495 Ile Ser Gly Ile Leu Leu Trp Tyr Pro Ile Pro Phe Thr Arg Leu 500 505 510 Pro Ile Arg Met Ala Lys Gly Leu Gly Asn Ile Ser Ala Lys Tyr 515 520 525 Arg Trp Phe Ala Vai Phe Tyr Leu Ile Ile Phe Phe Phe Leu Ile 530 535 540 Pro Leu Thr Vai Phe Gly Leu Ser Leu Ala Gly Trp Arg Vai Leu 545 550 555 Vai Gly Vai Gly Vai Pro Vai Vai Phe Ile Ile Ile Leu Vai Leu 560 565 570 Cys Leu Arg Leu Leu Gin Ser Arg Cys Pro Arg Vai Leu Pro Lys 575 580 585 Lys Leu Gin Asn Trp Asn Phe Leu Pro Leu Trp Met Arg Ser Leu 590 595 600 Lys Pro Trp Asp Ala Vai Vai Ser Lys Phe Thr Gly -Cys Phe Gin 605 610 615 Met Arg Cys Cys Cys Cys Cys Arg Vai Cys Cys Arg Ala Cys Cys 620 625 630 Leu Leu Cys Gly Cys Pro Lys Cys Cys Arg Cys ser Lys Cys Cys 635 640 645 Glu Asp Leu Glu Glu Ala Gin Glu Gly Gin Asp Vai Pro Vai Lys 650 655 660 Ala Pro Glu Thr Phe Asp Asn Ile Thr Ile Ser Arg Glu Ala Gin 665 670 675 -Gly Glu Vai Pro Ala Ser Asp Ser Lys Thr Glu Cys Thr Ala Leu 680 685 690
Lisboa, 2011-11-28

Claims (14)

  1. ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo que se liga a um polipéptido-alvo antigénico associado a um tumor 211 (TAT211) de SEQ ID N.° 107, para utilização num método de indução da morte de uma célula cancerosa do pulmão que expressa o referido polipéptido, em que o referido anticorpo está conjugado com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico.
  2. 2. Anticorpo que se liga a um polipéptido-alvo antigénico associado a um tumor 211 (TAT211) de SEQ ID N.° 107, para utilização num método de prevenção ou de tratamento de um tumor pulmonar num mamífero, em que o tumor compreende células expressando o referido polipéptido-alvo antigénico associado a um tumor (TAT) de SEQ ID N.° 107, e em que o referido anticorpo está conjugado com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico.
  3. 3. Anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o referido tratamento induz a retracção do tumor pulmonar.
  4. 4. Anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o referido tratamento induz a morte de células tumorais do pulmão.
  5. 5. Anticorpo que se liga a um polipéptido-alvo antigénico associado a um tumor 211 (TAT211) de SEQ ID N.° 107, para utilização num método de prevenção ou de tratamento de uma perturbação proliferativa pulmonar, em que o referido anticorpo está conjugado com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico.
  6. 6. Anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida perturbação proliferativa pulmonar é o cancro do pulmão.
  7. 7. Anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido agente citotóxico é uma toxina. ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 2/3
  8. 8. Método de diagnóstico da presença de um tumor pulmonar num mamífero, em que o referido método compreende o contacto de uma amostra de teste de células de tecido pulmonar obtidas a partir do referido mamífero com um anticorpo que se liga a uma proteína TAT211 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N.° 107, e a detecção da formação de um complexo entre o referido anticorpo e a referida proteína na amostra de teste, em que a formação de um complexo é indicativa da presença de um tumor pulmonar no referido mamífero.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido anticorpo está marcado de forma detectável.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a referida amostra de teste de células de um tecido é obtida a partir de um indivíduo suspeito de ter um tumor pulmonar canceroso.
  11. 11. Método de diagnóstico da presença de um tumor num mamífero, em que o referido método compreende a determinação do nível de expressão de um gene que codifica uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N.° 107, numa amostra de teste de células de um tecido obtidas a partir do referido mamífero e numa amostra de controlo de células normais conhecidas da mesma origem tecidual, em que um nível de expressão mais elevado da referida proteína na amostra de teste, em comparação com a amostra de controlo, é indicativo da presença de um tumor no mamífero a partir do qual a amostra de teste foi obtida.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa de determinação do nível de expressão de um gene que codifica a referida proteína compreende: a) a utilização de um oligonucleótido numa hibridação in situ ou numa análise de RT-PCR; ou b) a utilização de um anticorpo numa análise de imuno-histoquímica ou numa análise de transferência de Western. ΕΡ 2 000 545/ΡΤ 3/3
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou a reivindicação 12, em que o tumor é um tumor pulmonar ou um tumor do ovário.
  14. 14. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, anticorpo este que está conjugado com um agente inibidor do crescimento ou com um agente citotóxico, em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 2011-11-28
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