ES2398568T3 - Procedimientos de pronóstio de cáncer - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para el pronóstico de cáncer en un sujeto humano diagnosticado con cáncer colorrectal, comprendiendo el procedimiento: (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra de tejido o célula colorrectal del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control; y (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a una muestra de control es pronóstica de duración elevada de la supervivencia o duración elevada de la supervivencia sin reaparición en el sujeto.

Description

Procedimientos de pronóstico de cáncer.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere a la detección de polipéptido y/o polinucleótido EphB2 para procedimientos de pronóstico de cáncer colorrectal, y a procedimientos para seleccionar tratamiento contra el cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El cáncer sigue siendo una de las amenazas más mortíferas para la salud humana. En los EE.UU., el cáncer afecta a casi 1,3 millones de nuevos pacientes cada año, y es la segunda causa principal de muerte después de enfermedad cardíaca, representando aproximadamente 1 de cada 4 muertes. También se predice que el cáncer puede superar a las enfermedades cardiovasculares como la causa número uno de muerte en el plazo de 5 años. Los tumores sólidos son responsables de la mayoría de aquellas muertes. Aunque ha habido avances significativos en el tratamiento médico de ciertos cánceres, la tasa de supervivencia global a 5 años para todos los cánceres sólo ha mejorado aproximadamente el 10% en los últimos 20 años. Los cánceres, o tumores malignos, metastatizan y crecen rápidamente de una forma incontrolada, haciendo extremadamente difícil la detección temprana y el tratamiento. El cáncer colorrectal es la tercera causa más común de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos. Se estimó que se diagnosticarían aproximadamente 129.000 nuevos casos de cáncer colorrectal y se producirían

56.000 muertes debido al cáncer colorrectal en los Estados Unidos en 1999 (Landis y col., Cancer J Clin. 49:8-31 (1999)).

[0003] El tratamiento contra el cáncer, tal como quimioterapia, radiación y/o cirugía, tiene riesgos asociados y sería útil poder seleccionar óptimamente los pacientes más probables a beneficiar. La prueba de pronóstico es útil, por ejemplo, para identificar pacientes con males pronósticos de forma que se identificara un enfoque de tratamiento de mayor riesgo más agresivo, y para identificar pacientes con buenos pronósticos para los cuales una terapia arriesgada no proporcionaría suficiente beneficio para garantizar los riesgos. Hay una necesidad urgente de nuevos factores pronósticos en el cáncer.

[0004] Los receptores de Eph constituyen la mayor familia de tirosina cinasas receptoras en el genoma humano e interactúan con ligandos llamados efrinas (revisado en Kullander y col., Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3:47586.). La familia se divide por identidad de secuencias en dos clases, EphA y EphB, con familias de ligando transmembrana correspondientes, denominadas efrinas de tipo A y tipo B. El receptor de EphB2 (“EphB2” o “EphB2R”) tiene una región extracelular con un motivo rico en cisteína que se extiende sobre su mitad del extremo amino, seguido de dos motivos de tipo II de fibronectina. Hay un dominio intracelular que caracteriza una región de cinasa conservada y un dominio transmembrana. La expresión de EphB2 se ha descrito en cáncer. Véase, por ejemplo, Cairns y col., WO2003/000113; Mao y col., Cancer Res. 64, 781-788 (2004).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0005] En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el pronóstico de cáncer en un sujeto humano diagnosticado con cáncer colorrectal, como se define en las reivindicaciones, comprendiendo el procedimiento: (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra de tejido o célula colorrectal del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control (valor de referencia de control); y (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a una muestra de control es pronóstica de cáncer en el sujeto. El aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a la muestra de control es pronóstica de cáncer en el sujeto.

[0006] Según las reivindicaciones, el pronóstico de cáncer comprende proporcionar la estimación o predicción de (pronóstico de) la duración de la supervivencia de un paciente diagnosticado con un cáncer, o duración de la supervivencia sin reaparición.

[0007] El aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a la muestra de control es pronóstica de duración de la supervivencia prolongada o supervivencia sin reaparición prolongada.

[0008] En otro aspecto, como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona procedimientos para la selección del tratamiento para cáncer colorrectal para un paciente humano, comprendiendo los procedimientos (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra de tejido o célula colorrectal del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control; (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que la expresión de EphB2 en la muestra elevada del paciente con respecto a una muestra de control es pronóstica de duración elevada de la supervivencia o duración elevada de la supervivencia sin reaparición en el sujeto y (c) posterior a las etapas (a) y (b), seleccionar el tratamiento contra el cáncer para el paciente, en el que la selección del tratamiento se basa en el pronóstico del paciente determinado en la etapa (b). En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a la muestra de control es pronóstico de cáncer en el sujeto. En algunas realizaciones, la disminución de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a la muestra de control es pronóstica de cáncer en el sujeto.

[0009] También se desvela un procedimiento para la detección de polinucleótido o polipéptido EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, comprendiendo el procedimiento comparar la expresión del polinucleótido o polipéptido EphB2 en la muestra biológica con la expresión de EphB2 en una muestra de control. En algunas realizaciones, la muestra biológica comprende células y/o tejido de adenoma de colon.

[0010] También se desvela un procedimiento para diagnosticar un trastorno de adenoma de colon, comprendiendo el procedimiento detectar la expresión del polinucleótido o polipéptido EphB2 en la muestra biológica

[0011] procedimiento: para tratar un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-EphB2 (tal como un antagonista de anticuerpo anti-EphB2) al paciente.

[0012] También se desvela un procedimiento: para tratar un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon administrando una cantidad eficaz de un inmunoconjugado anti-EphB2 al paciente.

[0013] También se desvela un procedimiento para tratar un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon administrando una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-EphB2, o una cantidad eficaz de un inmunoconjugado anti-EphB2 al paciente, adicionalmente en el que la expresión de EphB2 se detecta en células y/o tejido de adenoma de colon del paciente humano antes, durante o después de la administración de un anticuerpo anti-EphB2 o un inmunoconjugado anti-EphB2. En algunas realizaciones, la expresión en exceso de EphB2 se detecta antes, durante y/o después de la administración de un anticuerpo anti-EphB2 o un inmunoconjugado anti-EphB2. La expresión puede detectarse antes; durante; después; antes y durante; antes y después; durante y después; o antes, durante y después de la administración de un anticuerpo anti-EphB2 o un inmunoconjugado anti-EphB2.

[0014] En algunas realizaciones, el trastorno de adenoma de colon puede seleccionarse del grupo que consiste en poliposis adenomatosa familiar, síndrome de Peutz-Jegher, síndrome de poliposis juvenil, síndrome de poliposis mixta hereditaria, enfermedad de Cowden y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley.

[0015] En realizaciones que implican la selección del tratamiento contra el cáncer o selección del tratamiento contra el trastorno de adenoma de colon, el tratamiento contra el cáncer o tratamiento contra el trastorno de adenoma de colon puede comprender administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-EphB2, o una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-EphB2. En otras realizaciones más, el tratamiento comprende una cualquiera o más de quimioterapia, radiación y cirugía.

[0016] En algunas realizaciones que implican la administración de anticuerpos, el anticuerpo anti-EphB2 está seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA-6606 (depositado el 24 de febrero de 2005). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo que comprende dominio(s) variable(s) de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA-6606, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 comprende al menos una (al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 y/o 6) secuencia(s) hipervariable(s) (HVR(s)) que comprende(n) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y/o HVR-H3 del anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA6606, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo que se une al mismo epítope sobre EphB2 humano como el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA6606. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo que compite con el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA-6606 por unirse a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 comprende: al menos una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de regiones hipervariables (HVR) seleccionada(s) del grupo que consiste en: (a) HVR-L1 que comprende la secuencia KSSQSLLNSGNQENYLA (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia GASTRES (SEQ ID NO:2); (c) HVR-L3 que comprende la secuencia QNDHSYPFT (SEQ ID NO:3); (d) HVR-H1 que comprende la secuencia SYWMH (SEQ ID NO:4); (e) HVR-H2 que comprende la secuencia FINPSTGYTDYNQKFKD (SEQ ID NO:5); y (f) HVR-H3 que comprende la secuencia RLKLLRYAMDY (SEQ ID NO:6). En una realización, el anticuerpo anti-EphB2 comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia:

DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQENYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRF TGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO:7). En una realización, el anticuerpo anti-EphB2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia:

QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGFINPSTGYTDYNQKFKD KATLTVKSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCTRRLKLLRYAMDYWGQGTTLTVSA (SEQ ID NO:8). En una realización, el anticuerpo anti-EphB2 comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia: DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQENYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRF TGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO:7); y comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia:

[0017] En algunas realizaciones, el inmunoconjugado anti-EphB2 comprende además una toxina, un agente para quimioterapia, un agente inhibidor del crecimiento o material radiactivo. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un maitansinoide. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende MMAE.

[0018] En realizaciones que implican la detección de la expresión de EphB2 puede detectarse la expresión del polinucleótido EphB2 y/o la expresión del polipéptido EphB2. En realizaciones que implican la detección de la expresión de EphB2 se detecta la expresión de ARNm de EphB2. En otras realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando un agente anti-EphB2. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando un anticuerpo. Cualquier anticuerpo adecuado puede usarse para la detección, que incluye anticuerpos monoclonales y/o policlonales, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humanizado y/o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando inmunohistoquímica (IHC). En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 se puntúa en 2 o superior usando IHC. En algunas realizaciones se detecta una variante de EphB2 y/o fragmento. En algunas realizaciones, el polipéptido de variante tiene al menos aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencias de aminoácidos con un polipéptido de secuencia nativa, en algunas realizaciones, el polipéptido mostrado en las Figuras 1, 3 y/o 5. En otras realizaciones, el polipéptido de variante está codificado por una secuencia de polinucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótidos EphB2, en algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos mostradas en las Figuras 2, 4 y/o 6. En algunas realizaciones, el polinucleótido de variante tiene al menos aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencias de polinucleótidos con un polinucleótido de secuencia nativa, en algunas realizaciones, el polinucleótido mostrado en las Figuras 2, 4 y/o 6. En otras realizaciones, el polinucleótido de variante comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótidos EphB2, en algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos mostradas en las Figuras 1, 3 y/o 5. En algunas realizaciones, las variantes de EphB2 son biológicamente activas. Las actividades biológicas de EphB2 son muy conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, una cualquiera o más de las siguientes: (a) se unen a ligando(s) de EphB2 (tales como efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y/o efrina-A4); (b) se unen a ligando de EphB2 y activan la actividad biológica de ligandos de EphB2 o rutas en la dirección 3' mediadas por ligando de EphB2; (c) señalizan en respuesta a la unión a ligando de EphB2.

[0019] En algunas realizaciones que implican la detección de la expresión de EphB2, la presencia y/o ausencia y/o nivel de expresión de EphB2 puede detectarse. La expresión de EphB2 puede aumentarse. Se entiende que la ausencia de expresión de EphB2 incluye niveles insignificantes o de mínimos. En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 en la muestra biológica de prueba es superior a la observada para una muestra de control biológica (o nivel de expresión de control). En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces superior o superior en la muestra biológica de prueba que en la muestra de control biológica. En algunas

realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se determina en un ensayo de inmunohistoquímica (“IHC”) para

puntuar al menos 2 o superior para intensidad de tinción. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se determina en un ensayo de IHC para puntuar al menos 1 o superior, o al menos 3 o superior para intensidad de tinción. En algunas realizaciones, en la muestra biológica de prueba es inferior a la observada para una muestra de control biológica (o nivel de expresión de control). En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces inferior o inferior en la muestra biológica de prueba que en la muestra de control biológica.

[0020] En algunas realizaciones que implican detección, los procedimientos comprenden además la detección de la expresión de uno o más ligandos de EphB2.

[0021] También se desvelan kits, composiciones y artículos de fabricación que comprenden polinucleótido(s) y/o polipéptido(s) EphB2 y/o inmunoconjugados anti-EphB2. En algunas realizaciones, los kits y artículos de fabricación comprenden además instrucciones para cualquier procedimiento desvelado en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0022]

FIGURA 1: representa la secuencia de aminoácidos predicha de la variante de transcrito de EphB2 1 (nº de acceso de GenBank NM_017449) (SEQ ID NO:9).

FIGURAS 2A y 2B: representan la secuencia de ADNc de la variante de transcrito de EphB2 1 (nº de acceso de GenBank NM_017449) (SEQ ID NO: 10).

FIGURA 3: representa la secuencia de aminoácidos predicha de la variante de transcrito de EphB2 2 (nº de acceso de GenBank NM_004442) (SEQ ID NO: 11).

FIGURAS 4A y 4B: representan la secuencia de ADNc de la variante de transcrito de EphB2 2 (nº de acceso de GenBank NM_004442) (SEQ ID NO: 12).

FIGURA 5: representa la secuencia de aminoácidos predicha de EphB2 desvelada en la Figura 101 del documento WO03/000113 (SEQ ID NO: 13).

FIGURA 6: representa la secuencia de ADNc de EphB2 desvelada en la Figura 23 del documento WO03/000113 (SEQ ID NO:14).

FIGURA 7: representa la expresión de ARNm de EphB2 (indistintamente llamado “EphB2”) en tejidos completos que representan desarrollo de tumor colorrectal (A), epitelio microdiseccionado de colon normal y cánceres primarios (B) (obtenidos de Gene Logic), y líneas celulares de tumor colorrectal (C). La expresión de EphB2 se representa como la intensidad de señal media (intervalos de confianza de +/- 95%) del conjunto de sondas 209588_at en la matriz de sondas Affymetrix HG-U133 de GeneChip. Las líneas celulares se agrupan según su puntuación de intensidad de inmunohistoquímica (IHC) de EphB2.

FIGURA 8: EphB2 se expresa en la base de criptas colónicas normales (A) y en todos los estados de tumorigénesis colorrectal, que incluyen criptas adenomatosas (B izquierda superior, criptas normales adyacentes derecha inferior), cánceres primarios (C), metástasis de ganglios linfáticos (D), metástasis mesentéricas (E) y metástasis hepáticas (F). La localización de EphB2 membranoso y citoplásmico se muestra por deposición del cromógeno DAB (marrón) contra una contratinción con hematoxilina (azul).

FIGURA 9: muestra la expresión de EphB2 por inmunohistoquímica (IHC) e hibridación in situ (HIS) en colon normal y cánceres colorrectales. Se muestran cánceres primarios representativos con puntuaciones inmunohistoquímicas de cero, uno y dos. La deposición del cromógeno DAB (marrón) membranoso y citoplásmico, que ilustra la expresión de EphB2, se observa sobre células de colon normal y neoplásicas contra una contratinción con hematoxilina (azul). Imágenes de campo brillante (teñidas con hematoxilina y eosina) y de HIS de campo oscuro correspondientes demuestran un patrón idéntico de expresión de EphB2 limitada a epitelio, mostrada por la deposición de granos de plata en el campo de oscuridad. Barra = 100 µm.

FIGURA 10: representa la frecuencia de expresión de EphB2 en adenomas colorrectales (MMT, n = 148) y una serie de cánceres primarios (sección completa, n = 28) y metástasis (sección completa, n = 39).

FIGURA 11: representa representaciones de Kaplan-Meier que demuestran la supervivencia global (A) y la supervivencia sin reaparición (B) para subgrupos de pacientes con CCR con alta expresión de EphB2 (puntuación 2)

o baja expresión de EphB2 (puntuación 0 ó 1). Las razones de riesgo para la alta expresión de EphB2 fueron 0,45, intervalos de confianza del 95% (IC) 0,18-0,95, para supervivencia global, y 0,60, IC 0,30-1,10, para la supervivencia sin reaparición. La línea discontinua en (A) y (B) representa la puntuación de EphB2 0, 1; y la línea continua en (A) y

(B)

representa la puntuación de EphB2 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0023] En el presente documento se desvelan procedimientos para detectar un polipéptido(s) (por ejemplo, EphB2) en una muestra biológica de un sujeto, tal como un sujeto humano. Según la invención, los solicitantes encontraron sorprendentemente que la expresión de EphB2 era predictiva de cáncer pronóstico. Por tanto, los procedimientos desvelados pueden proporcionar medios convenientes, eficientes y posiblemente rentables para obtener datos e información útil en la evaluación de la futura evolución del trastorno, que incluye selección de terapias apropiadas para tratar pacientes.

[0024] En otro aspecto, la invención también proporciona procedimientos para la selección del tratamiento contra el cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo), o una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-EphB2 conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina activa de origen sintético, bacteriano, fúngico, vegetal o animal,

o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

[0025] También se desvelan procedimientos para detectar la expresión de EphB2 en paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, procedimientos para diagnosticar un trastorno de adenoma de colon y procedimientos para tratar trastornos de cáncer de colon.

[0026] También se desvelan kits, composiciones y artículos de fabricación.

TÉCNICAS GENERALES

[0027] Las técnicas y procedimientos descritos o citados en el presente documento son generalmente muy entendidas y comúnmente empleadas usando metodología convencional por aquellos expertos en la materia tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, y col. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G.

R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds., 1993-8)

J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis y col., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach

(P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita y col., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

DEFINICIONES

[0028] Como se usa en el presente documento, “EphB2” (indistintamente llamado “EphB2R”) se define como todas las especies de mamífero del receptor de Eph B2 de secuencia nativa, incluyendo el receptor de Eph B2

humano. El término “secuencia nativa” a propósito de EphB2 o cualquier otro polipéptido se refiere a un polipéptido

que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido correspondiente derivado de la naturaleza, independientemente de su modo de preparación. Tal polipéptido de la secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes y/o sintéticos o cualquier combinación de los mismos. El

término “secuencia nativa” engloba específicamente formas truncadas o secretadas que se producen naturalmente

(por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas de variante que se producen naturalmente (por ejemplo, formas alternativamente cortadas y empalmadas) y variantes alélicas que se producen naturalmente. Como

se usa en el presente documento, “EphB2” se refiere a la expresión de proteínas y/o polipéptidos. Generalmente, el

término se refiere a la expresión de tanto polipéptido como polinucleótido. Sin embargo, el contexto puede indicar que la referencia está prevista para o bien polipéptido o bien polinucleótido.

[0029] El término “dominio extracelular de EphB2” o “ECD de EphB2” se refiere a una forma de EphB2 que está esencialmente libre de dominios transmembrana y citoplásmicos. Generalmente, el ECD tendrá menos del 1% de tales dominios transmembrana y citoplásmicos, y preferentemente tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Se entenderá que cualquier dominio transmembrana identificado para los polipéptidos de la presente invención se identifica conforme a criterios rutinariamente empleados en la materia para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar, pero lo más probablemente no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio que se ha identificado inicialmente. En realizaciones preferidas, el ECD consistirá en una secuencia del dominio extracelular soluble del polipéptido que está libre de los dominios transmembrana y citoplásmicos o intracelulares (y no está unido a la membrana).

[0030] Como se usa en el presente documento, el término “ligando de EphB2” incluye todas las especies de

mamífero del ligando de EphB2 de secuencia nativa, que incluye todas las especies de mamífero de efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y efrina-A4 de secuencia nativa. Como se usa en el presente documento, “ligando de EphB2” se refiere a la expresión de proteína y/o polipéptido. Generalmente, el término se refiere a la expresión de tanto polipéptido como polinucleótido. Sin embargo, el contexto puede indicar que la referencia está prevista para o bien polipéptido o bien polinucleótido.

[0031] “Pronóstico de cáncer” se refiere generalmente a una estimación o predicción de la probable evolución o desenlace del cáncer. Como se usa en el presente documento, el pronóstico de cáncer incluye la estimación o predicción de una cualquiera o más de las siguientes: duración de la supervivencia de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la supervivencia sin reaparición, duración de la supervivencia libre de progresión de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, tasa de respuesta en un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la respuesta en un paciente o un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer y/o probabilidad de metástasis en un paciente susceptible a o

diagnosticado con un cáncer. Como se usa en el presente documento, “pronóstico de cáncer” significa proporcionar una estimación o predicción de la probable evolución o desenlace del cáncer. En algunas realizaciones, “pronóstico para cáncer” comprende proporcionar la estimación o predicción de (pronóstico de) una cualquiera o más de las siguientes: duración de la supervivencia de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la supervivencia sin reaparición, duración de la supervivencia libre de progresión de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, tasa de respuesta en un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la respuesta en un paciente o un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer y/o probabilidad de metástasis en un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer.

[0032] Por “sujeto” o “paciente” se indica cualquier sujeto individual para el que se desea terapia, que incluye

seres humanos, ganado vacuno, perros, cobayas, conejos, pollos, etc. También está previsto incluir como sujeto cualquier sujeto que participe en ensayos de investigación clínica que no muestren ningún signo clínico de enfermedad, o sujetos que participan en estudios epidemiológicos, o sujetos usados como controles.

[0033] El término “mamífero” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos.

[0034] Una “muestra biológica” (indistintamente llamada “muestra” o “muestra de tejido o célula”) engloba una

variedad de tipos de muestra obtenidos de un individuo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o monitorización. La definición engloba sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras sólidas de tejido tal como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier modo después de su obtención tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes tales como proteínas o polinucleótidos, o incorporación en una matriz semisólida o sólida para fines de

seccionamiento. El término “muestra biológica” engloba una muestra clínica, y también incluye células en cultivo,

sobrenadantes de células, lisados celulares, suero, plasma, líquido biológico y muestras de tejido. La fuente de la muestra biológica puede ser tejido sólido como de un órgano fresco, congelado y/o preservado o muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente de la sangre; fluidos corporales tales como líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido peritoneal o líquido intersticial; células de cualquier momento en la gestación o desarrollo del sujeto. En algunas realizaciones, la muestra biológica se obtiene de un tumor primario o metastásico. La muestra biológica puede contener compuestos que no se entremezclan naturalmente con el tejido en la naturaleza tales como conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes, antibióticos o similares.

[0035] Para los fines en el presente documento, una “sección” de una muestra de tejido indica una única parte

o trozo de una muestra de tejido, por ejemplo, una delgada rebanada de tejido o células cortadas de una muestra de tejido. Se entiende que pueden tomarse múltiples secciones de muestras de tejido y someterse a análisis según la presente invención. En algunas realizaciones, la misma sección de muestra de tejido se analiza a niveles tanto morfológicos como moleculares, o se analiza con respecto a tanto proteína como ácido nucleico.

[0036] “Polinucleótido” o “ácido nucleico,” como se usan indistintamente en el presente documento, se refieren

a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura del nucleótido puede conferirse antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes de no nucleótido. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente de marcado. Otros tipos de modificaciones incluyen,

por ejemplo, “tapas”, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo,

modificaciones entre nucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, cabamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos laterales tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleases, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), además de formas sin modificar del (de los) polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo generalmente presentes en los azúcares puede sustituirse, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerse por grupos protectores convencionales o activarse para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse con soportes sólidos. Los OH del extremo 5' y 3' pueden fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos de remate orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que generalmente son conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, 2'O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como metilrribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden reemplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, realizaciones en las que el fosfato está sustituido por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (“formacetal”) en las que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o sin sustituir (1-20 C) que opcionalmente contiene un enlace éter (--O--), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos citados en el presente documento, que incluyen ARN y ADN.

[0037] Por “gen” se indica cualquier secuencia de polinucleótidos o porción de la misma con una función funcional en codificar o transcribir una proteína o regular otra expresión génica. El gen puede consistir en todos los ácidos nucleicos responsables de codificar una proteína funcional o sólo una parte de los ácidos nucleicos responsables de codificar o expresar una proteína. La secuencia de polinucleótidos puede contener una anomalía genética dentro de exones, intrones, regiones de iniciación o terminación, secuencias promotoras, otras secuencias reguladoras o regiones adyacentes únicas al gen.

[0038] La palabra “marca” cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición

que está conjugado o fusionado directamente o indirectamente con un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo con el que está conjugado o fusionado. La marca puede ser por sí misma detectable (por ejemplo, marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

[0039] El término “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido más amplio y específicamente

cubre anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos.

[0040] El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables se

diferencien ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usen en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente distribuida por todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman la región estructural (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR,

que adoptan ampliamente una configuración de hoja β, conectados por tres CDR que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja β. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras tales como participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

[0041] “Fragmentos de anticuerpos” comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, que incluye

generalmente un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y, por tanto, que retiene la capacidad para unirse a antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos englobados por la presente definición incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene los dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab', que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd que tiene los dominios VH y CH1; (iv) el fragmento Fd' que tiene los dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteína en el extremo C del dominio CH1;

(v)

el fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb (Ward y col., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab' ligados por un puente disulfuro en la región bisagra;

(ix)

moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, Fv monocatenario; scFv) (Bird y col., Science 242:423426 (1988); y Huston y col., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) “diacuerpos” con dos sitios de unión a antígeno, que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) “anticuerpos lineales” que comprenden un par

de fragmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata y col. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); y patente de EE.UU. nº 5.641.870).

[0042] El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo

obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante sobre el antígeno. El modificador

“monoclonal” no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por cualquier procedimiento

particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de

EE.UU. nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de

fago usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y col., Nature 352:624-628 (1991) o Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

[0043] Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos

“quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a secuencias

correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, además de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

[0044] Formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región hipervariable del receptor están sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[0045] El término “región hipervariable”, “HVR” o “HV”, cuando se usan en el presente documento, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpos que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (H1, H2, H3) y tres en VL (L1, L2, L3). Están en uso varias delineaciones de regiones hipervariables y están englobadas en el presente documento. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencias y son las más comúnmente usadas (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immulogical Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refiere en su lugar a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables del AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son usadas por el software de modelado de anticuerpos Oxford Molecular's AbM. Las regiones hipervariables de

“contacto” se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles.

[0046] Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano está seleccionado de una biblioteca de fagos, en el que esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets y col. PNAS (USA) 95:61576162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos también pueden prepararse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido parcialmente o completamente inactivados. Tras la exposición se observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece mucho a la observada en seres humanos en todos los respectos, que incluye transposición de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse mediante inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B pueden recuperarse de un individuo o pueden haberse inmunizado in vitro). Véase, por ejemplo, Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); y patente de EE.UU. nº 5.750.373.

[0047] Un anticuerpo “madurado por afinidad” es uno con una o más alteraciones en una o más CDR del

mismo que resultan de una mejora en la afinidad del anticuerpo por antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee aquella(s) alteración (alteraciones). Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks y col. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por barajado de dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de CDR y/o residuos de la región estructural se describe por: Barbas y col. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier y col. Gene 169:147-155 (1995); Yelton y col. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins y col., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0048] Un anticuerpo “que se une” a antígeno de interés es uno que puede unirse a ese antígeno con

suficiente afinidad y/o avidez de forma que el anticuerpo sea útil como pronóstico y/o detección (tal como diagnóstico) y/o agente terapéutico para el antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo “que se une” a antígeno de interés se une específicamente o preferencialmente al antígeno de interés. En algunas realizaciones, el anticuerpo “que se une” a antígeno de interés se une exclusivamente al antígeno de interés.

[0049] Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de

su entorno natural. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el antagonista o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso de anticuerpo como se ha determinado por el procedimiento de Lowry, y lo más preferentemente a más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo N o secuencia de aminoácidos interna por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

[0050] Una “variante” de polipéptido significa un polipéptido que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que el uno o más residuos de aminoácidos se añaden, o delecionan, en el extremo N o C del polipéptido. Generalmente, una variante tendrá al menos aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de aminoácidos con el polipéptido de secuencia nativa.

[0051] Una “variante” de polinucleótido significa un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias de polinucleótidos con el polinucleótido de secuencia nativa. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polinucleótidos en los que el uno o más nucleótidos se añaden, o delecionan, en el extremo 5'

o 3' del polinucleótido. Generalmente, una variante tendrá al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencias, más preferentemente al menos aproximadamente el 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencias con el polinucleótido de secuencia nativa.

[0052] Un “fragmento” de polipéptido (también llamado una “región”) es un polipéptido que comprende una

secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950 o más aminoácidos contiguos de una secuencia de polipéptidos.

[0053] Un “fragmento” de polinucleótido (también llamado una “región”) es un polinucleótido que comprende

una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 3400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500 o más nucleótidos contiguos de una secuencia de polinucleótidos.

[0054] Los términos “cáncer”, “canceroso” o “maligno” se refieren a o describen la condición fisiológica en

mamíferos que se caracteriza normalmente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma. Más ejemplos particulares de tales cánceres incluyen cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, melanoma y cáncer de mama.

[0055] El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar

una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar a cierto grado y preferentemente parar) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar a cierto grado y preferentemente parar) metástasis tumorales; inhibir, a cierto grado, crecimiento tumoral; y/o aliviar a cierto grado uno o más de los síntomas asociados al trastorno. Hasta el punto de que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para terapia contra el cáncer, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, medirse evaluando la duración de la supervivencia, tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las tasas de respuesta (RR), duración de la respuesta y/o calidad de vida. En el caso de adenoma de colon, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir, por ejemplo, el número de células de adenoma; reducir el tamaño del adenoma; reducir el número de adenomas; inhibir, a cierto grado, el crecimiento de adenomas; y/o aliviar a cierto grado uno o más de los síntomas asociados al trastorno.

[0056] Como se usa en el presente documento, “tratamiento” es un enfoque para obtener resultados clínicos

beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar a cierto grado y/o parar) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar a cierto grado y/o parar) metástasis tumorales; inhibir, a cierto grado, crecimiento tumoral; y/o aliviar a cierto grado uno o más de los síntomas asociados al trastorno, encoger el tamaño del tumor, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de pacientes.

[0057] “Aislado,” cuando se usa para describir los diversos polipéptidos o proteínas desvelados en el presente

documento, significa polipéptido o proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su natural entorno. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que normalmente interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido o proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido o proteína se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo N o secuencia de aminoácidos interna usando un secuenciador de taza giratoria, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata, o (3) a homogeneidad en técnicas espectroscópicas de masa o de mapeo de péptidos. El material aislado incluye polipéptido o proteína in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente de su entorno natural no estará presente. Generalmente, sin embargo, el polipéptido o proteína aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

[0058] Los términos “polipéptido”, “oligopéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente

documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación tal como conjugación con un componente de marcado. También están incluidos dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), además de otras modificaciones conocidas en la técnica.

[0059] El “porcentaje (%) de identidad de secuencias de aminoácidos” con respecto a las secuencias

identificadas en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencias. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse de diversas formas que están dentro de la habilidad en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento que incluye asignar algoritmos necesarios para lograr el máximo alineamiento con respecto a las secuencias de longitud completa que se comparan. Para los fines en el presente documento, los valores de porcentaje de identidad de aminoácidos pueden obtenerse usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, que fue escrito por Genentech, Inc. y cuyo código fuente ha sido presentado con documentación de usuario en la Oficina de derechos de autor estadounidense, Washington, DC, 20559, registrado bajo el nº de registro de derechos de autor estadounidense TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencias están fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

[0060] “Porcentaje (%) de identidad de secuencias de ácidos nucleicos” se define como el porcentaje de

nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos de referencia de interés, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencias. El alineamiento para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de ácidos nucleicos puede lograrse de diversas formas que están dentro de la habilidad en la materia, por ejemplo, usando software informático públicamente disponible tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Para los fines en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN

2. Todos los parámetros de comparación de secuencias están fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

[0061] La “rigurosidad” de reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un experto en la materia,

y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para la hibridación apropiada, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a hibridarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor sea el grado de identidad deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, de esto resulta que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas menores menos rigurosas. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (2003).

[0062] “Condiciones de alta rigurosidad”, como se define en el presente documento, se identifican por aquellas

que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado; cloruro sódico 0,015 M / citrato de sodio 0,0015 M / dodecilsulfato de sodio 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante; 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

[0063] “Condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse como se describe por Sambrook y col.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y similares.

[0064] La “detección” incluye cualquier medio de detección, que incluye detección directa e indirecta. Por ejemplo, productos “detectablemente menores” pueden observarse directamente o indirectamente, y el término indica cualquier reducción (incluyendo sin productos). Similarmente, producto “detectablemente más” significa cualquier aumento, si se observa directamente o indirectamente.

“Que comprende” significa que incluye.

[0065] Como se usa en el presente documento, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen

referentes plurales, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, referencia a “una alteración genética” incluye una pluralidad de tales alteraciones y referencia a “una sonda” incluye referencia a una o más sondas.

[0066] El término “agente citotóxico” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que

inhibe o previene la función de células y/o produce la destrucción de células. El término está previsto que incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metrotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, mefalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de las mismas, y los diversos agentes antitumorales o contra el cáncer desvelados más adelante. Otros agentes citotóxicos se describen más adelante. Un agente tumoricida produce la destrucción de células tumorales.

[0067] Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de

agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y la ciclofosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapacol; colcicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calmentestatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 11 y caliqueamicina omega 11 (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinemicina A; una esperamicina; además de cromóforo de neocarzinostatina y la cromoproteína relacionada cromóforos antibióticos de enediína), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolinodoxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metrotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; recuperador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanopartículas manipuladas con albúmina de paclitaxel sin Cremophor ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metrotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; además de combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina.

[0068] En esta definición también se incluyen agentes antihormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer, y están frecuentemente en forma de tratamiento sistémico, o de cuerpo completo. Pueden ser las propias hormonas. Ejemplos incluyen antiestrógenos y moduladores de receptores de estrógenos selectivos (SERM) que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo el tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; reguladores por disminución de receptores de estrógenos (ERD); agentes que funcionan para suprimir o cerrar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de hormona leutinizante (LHRH) tales como acetato de leuprolida LUPRON® y ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®. Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® o risedronato ACTONEL®; además de troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido de 1,3dioxolano); oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular anómala tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna VAXID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de moléculas pequeñas de tirosina cinasa dual ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016); y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

[0069] Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en el presente documento se refiere a un

compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (tal como una célula que expresa EphB2) bien in vitro o bien in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células (tal como una célula que expresa EphB2) en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un sitio distinto de la fase S), tal como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Bloqueantes de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse más información en The Molecular Basis of

Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado “Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs”

de Murakami y col. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente la pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticancerígenos derivados ambos del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos de dímeros de tubulina y estabilizan microtúbulos previniendo la despolimerización, que produce la inhibición de la mitosis en células.

[0070] “Doxorubicina” es un antibiótico de antraciclina. El nombre químico completo de la doxorubicina es (8Scis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1metoxi-5,12-naftacenodiona.

PROCEDIMIENTOS DE LA INVENCIÓN

Procedimientos que comprenden detección de EphB2

[0071] En un aspecto, la invención proporciona procedimientos que comprenden la detección de polipéptido(s) y/o polinucleótido(s) EphB2 en una muestra de tejido o célula colorrectal de un paciente que tiene cáncer colorrectal, en el que la detección es predictiva o indicativa de pronóstico de cáncer en el paciente. Los solicitantes encontraron sorprendentemente que la expresión de EphB2 es predictiva de pronóstico de cáncer. Por tanto, los procedimientos desvelados pueden proporcionar medios convenientes, eficientes y posiblemente rentables para obtener datos e información útil en la evaluación de la futura evolución del trastorno, que incluye selección de terapias apropiadas para tratar pacientes.

[0072] Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona procedimientos para la evaluación del pronóstico de un paciente que tiene cáncer colorrectal, comprendiendo los procedimientos: (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra biológica derivada de cáncer del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control (o valor de referencia de control); y (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que la expresión de EphB2 es pronóstica de cáncer colorrectal en el paciente. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control (o valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto. En algunas realizaciones, la disminución de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control (o valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto.

[0073] En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para la evaluación del pronóstico de un paciente que tiene cáncer colorrectal, comprendiendo los procedimientos: (a) obtener una muestra de tejido o célula colorrectal del paciente; y (b) detectar la expresión de EphB2 en la muestra, en el que la expresión de EphB2 es pronóstica de cáncer colorrectal en el paciente. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a una muestra de control (o un valor de referencia de control) es pronóstico de cáncer en el sujeto. En algunas realizaciones, la disminución de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control (o valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto.

[0074] El cáncer es cáncer colorrectal. En otras realizaciones, el cáncer es cáncer de colon posiblemente curable por cirugía. En otras realizaciones, el cáncer es cáncer de colon inoperable. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de colon metastásico.

[0075] Generalmente, como se usa en el presente documento, el pronóstico de cáncer engloba la estimación o predicción de una cualquiera o más de las siguientes: duración de la supervivencia de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la supervivencia sin reaparición, duración de la supervivencia libre de progresión de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, tasa de respuesta en un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la respuesta en un paciente o un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer y/o probabilidad de metástasis en un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer. La duración de la supervivencia se define como el tiempo desde la primera administración del tratamiento hasta la muerte. La duración de la supervivencia también puede medirse por la razón de riesgo estratificada (HR) del grupo de tratamiento frente al grupo de control, que representa el riesgo de muerte para un paciente durante el tratamiento. La duración de la supervivencia sin reaparición se define como el tiempo desde el tratamiento hasta la reaparición del cáncer. El tiempo hasta la progresión de la enfermedad se define como el tiempo desde la administración del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad. La tasa de respuesta se define como el porcentaje de pacientes tratados que respondieron al tratamiento. La duración de la respuesta se define como el tiempo desde la respuesta inicial a tratamiento hasta la progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, la duración de la supervivencia y la duración de la supervivencia libre de progresión se predicen. En algunas realizaciones, el pronóstico define el desenlace en ausencia de terapia adyuvante.

[0076] En alguna realización, el pronóstico para cáncer comprende proporcionar la estimación o predicción de una cualquiera o más de las siguientes: duración de la supervivencia de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la supervivencia sin reaparición, duración de la supervivencia libre de progresión de un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer, tasa de respuesta en un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer, duración de la respuesta en un paciente o un grupo de pacientes susceptible a o diagnosticado con un cáncer y/o probabilidad de metástasis en un paciente susceptible a o diagnosticado con un cáncer. En algunas realizaciones, la duración de la supervivencia se pronostica o se predice que aumenta. En alguna realización, la duración de la supervivencia se pronostica o se predice que disminuye. En algunas realizaciones, la duración de la supervivencia sin reaparición se pronostica o se predice que aumenta. En alguna realización, la duración de la supervivencia sin reaparición se pronostica o se predice que disminuye. En algunas realizaciones, la tasa de respuesta se pronostica o se predice que aumenta. En algunas realizaciones, la tasa de respuesta se pronostica o se predice que disminuye. En algunas realizaciones, la duración de la respuesta es predicha o se predice que aumenta. En algunas realizaciones, la duración de la respuesta es predicha o se predice que disminuye. En algunas realizaciones, la probabilidad de metástasis se predice o se pronostica que aumenta. En algunas realizaciones, la probabilidad de metástasis se predice o se pronostica que disminuye. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a la muestra de control es pronóstica de duración de la supervivencia prolongada. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a la muestra de control es pronóstica de supervivencia sin reaparición prolongada.

[0077] Se entiende que otros factores de pronóstico y/o diagnóstico pueden considerarse además de y/o en combinación (conjunción) con la expresión de EphB2. Factores de pronóstico y/o diagnóstico a modo de ejemplo incluyen edad y/o sexo del paciente, estadio de TNM (TNM Classification of Malignant Tumours, sexta ed.), grado de tumor, presencia o ausencia de invasión linfática, presencia o ausencia de invasión de vasos sanguíneos y sitio. Para cáncer colorrectal, el sitio puede ser uno o más del ciego, colon ascendente y transverso, colon descendente y sigmoide, o recto. Véanse también Nicum y col., Acta Oncol 42:263-275 (2003); Kinzler, KW, y Vogelstein, B. Colorectal Tumors, en Kinzeler KW, Vogelstein B, eds. The Genetic Basis of Human Cancer: McGraw-Hill 1999, pág. 565-87. La participación maligna del margen de resección circunferencial quirúrgica es un factor de pronóstico fuerte para la supervivencia del paciente en cáncer rectal. Véase ídem; Birbeck y col. Annals Surg 235:449-457 (2002). Factores adicionales que pueden considerarse generalmente se conocen en la técnica e incluyen evolución previa del tratamiento del paciente que incluye cirugía, tratamiento con radiación, quimioterapia y tratamiento con otros fármacos.

[0078] EphB2 es muy conocido en la técnica. Secuencias de polinucleótidos y aminoácidos de EphB2 a modo de ejemplo se representan en las Figuras 1-6. Las secuencias de EphB2 a modo de ejemplo se desvelan adicionalmente en, por ejemplo, Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); documentos WO2003042661; WO200053216; WO2004065576; WO2004020583; WO2003004529 (página 128132); y WO200053216. Como se usa en el presente documento, EphB2 engloba formas truncadas o secretadas que se producen naturalmente (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas de variante que se producen naturalmente (por ejemplo, formas alternativamente cortadas y empalmadas) y variantes alélicas que se producen naturalmente de los polipéptidos de longitud completa.

[0079] Los procedimientos de la invención también pueden detectar polipéptido(s) y/o polinucleótidos de variante EphB2. En algunas realizaciones, el polipéptido de variante tiene al menos aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de identidad de secuencias de aminoácidos con un polipéptido de secuencia nativa, en algunas realizaciones, el polipéptido mostrado en las Figuras 1, 3 y/o 5. En otras realizaciones, el polipéptido de variante está codificada por una secuencia de polinucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótidos de EphB2, en algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos mostradas en las Figuras 2, 4 y/o 6. En algunas realizaciones, la polinucleótido de variante tiene al menos aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% identidad de secuencias de polinucleótidos con un polinucleótido de secuencia nativa, en algunas realizaciones, el polinucleótido mostrado en las Figuras 2, 4 y/o 6. En otras realizaciones, la polinucleótido de variante comprende una secuencia de polinucleótidos que se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de polinucleótidos de EphB2, en algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos mostradas en las Figuras 1, 3 y/o 5. En algunas realizaciones, las variantes de EphB2 son biológicamente activas. Las actividades biológicas de EphB2 son muy conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, una cualquiera o más de las siguientes: (a) se unen a ligando(s) de EphB2 (tales como efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y/o efrina-A4); (b) se unen a ligando de EphB2 y activan la actividad biológica de ligandos de EphB2 o rutas en la dirección 3' mediadas por ligando de EphB2; (c) señalizan en respuesta a la unión a ligando de EphB2. Los procedimientos de la invención también pueden detectar fragmentos de EphB2.

[0080] La detección de la expresión puede ser cuantitativa o cualitativa. La presencia y/o ausencia y/o nivel (cantidad) de expresión de EphB2 puede detectarse. Se entiende que la ausencia de expresión de EphB2 incluye niveles insignificantes, o de mínimos. La expresión del polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en la muestra biológica de prueba puede ser superior a la observada para una muestra de control biológica (o valor de referencia de control)

(llamado “expresión en exceso). En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 es al menos aproximadamente 2

veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces superior o superior en la muestra biológica de prueba. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se

determina en un ensayo de inmunohistoquímica (“IHC”) para puntuar al menos 2 o superior para intensidad de

tinción. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se determina en un ensayo IHC para puntuar al menos 1 o superior o al menos 3 o superior para intensidad de tinción. La expresión de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en la muestra biológica de prueba puede ser inferior a la observada para una muestra de control biológica

(llamada “expresión por defecto”). En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 es al menos aproximadamente 2

veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces inferior o inferior en la muestra biológica de prueba.

[0081] La expresión de EphB2 en la muestra biológica de prueba (es decir, la muestra biológica del paciente que tiene cáncer o del que se sospecha que tiene cáncer) puede compararse con una muestra de control adecuada, como es muy conocido en la técnica. Controles a modo de ejemplo incluyen muestras normales comparables (por ejemplo, tejido no canceroso normal o células del mismo tipo que las presentes en la muestra biológica de prueba), muestras normales de correspondencia del mismo paciente, muestras de control universales o un valor de referencia normal (también llamado un valor de referencia de control). Como se usa en el presente documento, el término “control” o “muestra de control” engloba un valor de referencia normal. Los procedimientos para la comparación de niveles de expresión (tal como presencia o ausencia de o cantidad de expresión) se conocen en la técnica, y algunos se describen y ejemplifican en el presente documento.

[0082] Como se trata en el presente documento, EphB2 en una muestra biológica puede detectarse por varios procedimientos que son muy conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, análisis inmunohistoquímicos y/o Western, ensayos de actividad enzimática bioquímica, hibridación in situ, análisis Northern y/o análisis por PCR de ARNm y análisis Southern genómicos (para examinar, por ejemplo, deleción o amplificación de genes), además de una cualquiera de la amplia variedad de ensayos que pueden realizarse por análisis de matrices de genes, proteínas y/o tejidos. Protocolos típicos para evaluar el estado de polinucleótidos y polipéptidos se encuentran, por ejemplo en Ausubel y col. eds., 2003, y algunos se describen y ejemplifican en el presente documento.

Detección del polipéptido EphB2

[0083] En el presente documento se desvelan procedimientos para detectar (por ejemplo, presencia o ausencia de o cantidad de) un polipéptido(s) (por ejemplo, EphB2) en una muestra biológica de un sujeto, tal como un sujeto humano. Puede emplearse una variedad de procedimientos para detectar polipéptidos e incluyen, por ejemplo, análisis inmunohistoquímico, inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western, ensayos de unión molecular, ELISA, ELIFA, citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS), espectroscopía de masas, micromatriz de proteínas y similares.

[0084] En algunas realizaciones, EphB2 en una muestra biológica se detecta (a) poniendo en contacto la muestra con un agente de unión de EphB2 tal como un anticuerpo, un fragmento del mismo o una proteína (tal como una proteína recombinante) que contiene una región de unión a EphB2; y (b) detectando el complejo agente de unión de EphB2-polipéptido EphB2 en la muestra.

[0085] En la técnica se conocen anticuerpos anti-EphB2 (por ejemplo, número de catálogo AF467, R&D Systems, Mineápolis, MN) y pueden generarse usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Un anticuerpo anti-EphB2 debe presentar una cualquiera o más de las siguientes características (ensayos para los que son muy conocidos en la técnica): (a) se unen a EphB2; (b) bloquean o disminuyen la activación de EphB2; (c) bloquean o disminuyen la activación y/o unión a ligando de EphB2 (tal como efrinas-B1, efrinas-B2, efrinas-B3 y/o efrinas-A4)). Un ensayo para la activación de EphB2 se describe en Mao y col. Cancer Res. 64: 781-788, 2004. Anticuerpos anti-EphB2 a modo de ejemplo adicionales se describen en el presente documento.

[0086] El anticuerpo anti-EphB2 puede unirse, preferencialmente se une a o exclusivamente se une, a EphB2. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a EphB2 y no reacciona significativamente de forma cruzada con EphB 1R y/o EphB3R. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 se une a EphB2 y no reacciona significativamente de forma cruzada con EphB1R, EphB3R, EphB4R, EphB5R y/o EphB6R. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 se une a un fragmento del polipéptido EphB2 que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940 o más aminoácidos contiguos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 se une a un fragmento del polipéptido EphB2 que comprende al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110,120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940 o más aminoácidos contiguos mostrados en las Figuras 2, 4 ó 6. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 puede unirse a EphB2 humano, EphB2 murino, EphB2 de roedor y/o EphB2 de mono. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 se une a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a ECD de EphB2. ECD de EphB2 se conocen en la técnica. Se entiende que un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo anti-EphB2) puede reconocer uno o más polipéptidos EphB2 de secuencia nativa. Es rutina en la materia seleccionar agentes (tales anticuerpos) que se unen a uno o más de tales polipéptidos y adicionalmente para determinar si un agente reconoce uno o más de tales polipéptidos.

[0087] Proteínas anti-EphB2 que comprenden una región de unión a EphB2 incluyen, por ejemplo, inmunoadhesinas de efrina-B1, inmunoadhesina de efrina-B2, inmunoadhesina de efrina-B3 e inmunoadhesina de efrinas-A4. Por comodidad, la detección usando anticuerpos anti-EphB2 se trata generalmente en el presente documento. Se entiende que los agentes anti-EphB2 pueden usarse generalmente en lugar de (o además de) un anticuerpo en los procedimientos descritos en el presente documento.

[0088] La expresión de proteínas en una muestra puede examinarse usando protocolos de inmunohistoquímica y de tinción. Se ha mostrado que la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido es un procedimiento fidedigno de evaluación o detección de la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica (“IHC”) utilizan un anticuerpo para sondar y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente por procedimientos cromogénicos o fluorescentes. Para la preparación de muestras puede usarse una muestra de tejido o célula de un mamífero (normalmente un paciente humano). Ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas tales como células de cáncer de colon, mama, próstata, ovario, pulmón, estómago, páncreas, linfoma y leucemia. La muestra puede obtenerse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, escisión quirúrgica, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una realización, la muestra se fija e incorpora en parafina o similares. La muestra de tejido puede fijarse (es decir, preservarse) por metodología convencional (véase, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, 3ª edición (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston

Division McGraw-Hill Book Company, Nueva York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Un experto en la materia apreciará que la elección de un fijador se determina con el fin de que la muestra sea histológicamente teñida o analizada de otro modo. Un experto en la materia también apreciará que la longitud de fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y el fijador usado. A modo de ejemplo, formalina tamponada neutra, Bouin o paraformaldehído pueden usarse para fijar una muestra. Generalmente, la muestra se fija primero y luego se deshidrata mediante una serie ascendente de alcoholes, se infiltra y se incorpora en parafina u otros medios de seccionamiento de manera que la muestra de tejido pueda seccionarse. Alternativamente, el tejido puede seccionarse y fijarse las secciones obtenidas. A modo de ejemplo, la muestra de tejido puede incorporarse y procesarse en parafina por metodología convencional (véase, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). Ejemplos de parafina que pueden usarse incluyen, pero no se limita a, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez se ha incorporado la

muestra de tejido, la muestra puede seccionarse por un microtomo o similares (véase, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). A modo de ejemplo para este procedimiento, las secciones pueden oscilar de aproximadamente tres micrómetros a aproximadamente cinco micrómetros de espesor. Una vez se han seccionado, las secciones pueden unirse a portaobjetos por varios procedimientos convencionales. Ejemplos de adhesivos a portaobjetos incluyen, pero no se limitan a, silano, gelatina, poli-L-lisina y similares. A modo de ejemplo, las secciones incorporadas en parafina pueden unirse a portaobjetos positivamente cargados y/o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina. Si se ha usado parafina como material de incorporación, las secciones de tejido se desparafinan generalmente y se rehidratan en agua. Las secciones de tejido pueden desparafinarse por varias metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, pueden usarse xilenos y una serie gradualmente descendente de alcoholes (véase, por ejemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”, arriba). Alternativamente pueden usarse agentes no orgánicos desparafinantes comercialmente disponibles tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas).

[0089] Opcionalmente, posterior a la preparación de muestras, una sección de tejido puede analizarse usando IHC. La IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridación por fluorescencia in situ. Están disponibles dos procedimientos generales de IHC; ensayos directos e indirectos. Según el primer ensayo, la unión de anticuerpo al antígeno diana (por ejemplo, EphB2) se determina directamente. Este ensayo directo usa un reactivo marcado tal como una marca fluorescente o un anticuerpo primario marcado con enzima, que puede visualizarse sin más interacción con el anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario sin conjugar se une al antígeno y luego un anticuerpo secundario marcado se une al anticuerpo primario. Si el anticuerpo secundario está conjugado con una marca enzimática, un sustrato cromogénico o fluorogénico se añade para proporcionar visualización del antígeno. La amplificación de señales se produce debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopes sobre el anticuerpo primario.

[0090] El anticuerpo primario y/o secundario usado para inmunohistoquímica normalmente se marcará con un resto detectable. Están disponibles numerosas marcas que pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías:

(a)

Radioisótopos tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volúmenes 1 y 2, Coligen y col., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse usando recuento por centelleo.

(b)

Partículas de oro coloidal.

(c)

Marcas fluorescentes que incluyen, pero no se limitan a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio), Texas Red, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficoeriterina, ficocianina, o fluoróforos comercialmente disponibles tales SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de uno cualquiera o más de los anteriores. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo usando las técnicas desveladas en Current Protocols in Immunology, arriba, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro.

(d)

Están disponibles diversas marcas enzima-sustrato y la patente de EE.UU. nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electrónicamente por una reacción química y luego puede emitir luz que puede medirse (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente de EE.UU. nº 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981).

[0091] Ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:

(i)

Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en la que la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'tetrametilbencidina (TMB));

(ii)

fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y

(iii) β-D-galactosidasa (β-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidasa).

[0092] Están disponibles numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato para aquellos expertos en la materia. Para una revisión general de éstas véanse las patentes de EE.UU. nº 4.275.149 y 4.318.980. Algunas veces, la marca está indirectamente conjugada con el anticuerpo. El experto conocerá muy bien diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de marcas mencionadas anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a avidina y, por tanto, la marca puede conjugarse con el anticuerpo en este modo indirecto. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un

5 hapteno pequeño y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno. Por tanto, puede lograrse la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo.

[0093] Aparte de los procedimientos de preparación de muestras tratados anteriormente, puede desearse tratamiento adicional de la sección de tejido antes de, durante o tras la IHC, Por ejemplo, pueden llevarse a cabo procedimientos de recuperación de epítopes tales como calentamiento de la muestra de tejido en tampón citrato (véase, por ejemplo, Leong y col. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).

[0094] Tras una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone a anticuerpo primario durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas de forma que el anticuerpo primario se una al antígeno

15 de proteína diana en la muestra de tejido. Condiciones apropiadas para alcanzar esto pueden determinarse por experimentación rutinaria. El grado de unión del anticuerpo a la muestra se determina usando una cualquiera de las marcas detectables tratadas anteriormente. Preferentemente, la marca es una marca enzimática (por ejemplo HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico tal como el cromógeno 3,3'-diaminobencidina. Preferentemente, la marca enzimática está conjugada con anticuerpo que se une específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo de cabra anti-conejo).

[0095] Los especímenes así preparados pueden montarse y cubrirse con cubreobjetos. Entonces, la evaluación de portaobjetos se determina, por ejemplo, usando un microscopio, y pueden emplearse criterios de

25 intensidad de tinción, usados rutinariamente en la materia. Los criterios de intensidad de tinción pueden evaluarse del siguiente modo: TABLA 1

Patrón de tinción

Puntuación

No se observa tinción en células.

0

Se detecta tinción débil/escasamente perceptible en más del 10% de las células.

1+

Se observa tinción de débil a moderada en más del 10% de las células.

2+

Se observa tinción de moderada a fuerte en más del 10% de las células.

3+

[0096] Se entiende que cuando las células y/o tejido de un tumor o adenoma de colon se examinan usando IHC, la tinción se determina o evalúa generalmente en célula y/o tejido de tumor (a diferencia de tejido de estroma o de alrededor que puede estar presente en la muestra). Normalmente, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 2+ o superior en un ensayo de IHC es pronóstica. En algunas realizaciones, una puntuación del patrón de tinción de aproximadamente 1+ o superior es pronóstica. En otras realizaciones, una puntuación del patrón

35 de tinción de aproximadamente 3 o superior es pronóstica.

[0097] En algunas realizaciones, la muestra biológica puede ponerse en contacto con un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo que se une a EphB2) en condiciones suficientes para que se forme un complejo agente anti-EphB2--EphB2, y luego detectar dicho complejo. La detección puede llevarse a cabo de varias formas conocidas en la técnica tales como por transferencia Western y procedimientos de ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, que incluyen plasma o suero. Está disponible un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo usando un formato de ensayo tal, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.016.043, 4.424.279 y 4.018.653.Éstos incluyen tanto ensayos de “sándwich” de un único sitio como de dos sitios de los tipos no competitivos, además de en los ensayos competitivos de unión tradicional. Estos ensayos también incluyen la unión directa de un

45 anticuerpo marcado con EphB2.

[0098] Los ensayos de sándwich están entre los ensayos más útiles y comúnmente usados. Existen varias variaciones de la técnica de ensayos de sándwich, y todas pretenden estar englobadas por la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo típico, un anticuerpo sin marcar se inmoviliza sobre un sustrato sólido, y la muestra a probarse se pone en contacto con la molécula unida. Después de un periodo de incubación adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo específico para el antígeno, marcado con una molécula indicadora que puede producir una señal detectable, se añade luego y se incuba, dejando tiempo suficiente para la formación de otro complejo anticuerpoantígeno-anticuerpo marcado. Cualquier material sin reaccionar se lava, y la presencia del antígeno se determina

55 por observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados puede ser o bien cualitativos, por simple observación de la señal visible, o bien pueden ser cuantificados comparando con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de biomarcador.

[0099] Variaciones en el ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo en el que tanto muestra como anticuerpo marcado se añaden simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son muy conocidas para aquellos expertos en la materia, que incluyen cualquier variación menor como será rápidamente evidente. En un ensayo de sándwich directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad por el biomarcador se une o bien covalentemente o bien pasivamente a una superficie sólida. La superficie sólida es normalmente vidrio o un polímero, siendo los polímeros más comúnmente usados los polímeros celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos de microplacas o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo. Los procedimientos de unión son muy conocidos en la técnica y generalmente consisten en reticular, unir covalentemente o adsorber físicamente, el complejo polímero-anticuerpo se lava en la preparación para la muestra de prueba. Entonces, una alícuota de la muestra a probar se añade al complejo de fase sólida y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40ºC tal como entre 25ºC y 32ºC, ambos incluidos) para permitir la unión de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Tras el periodo de incubación, la fase sólida de la subunidad de anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una parte del biomarcador. El segundo anticuerpo se liga a una molécula indicadora que se usa para indicar la unión del segundo anticuerpo al marcador molecular.

[0100] Procedimientos alternativos implican inmovilizar los biomarcadores diana en la muestra y luego exponer la diana inmovilizada al anticuerpo específico que puede o puede no marcarse con una molécula indicadora. Dependiendo de la cantidad de diana y la concentración de la molécula señal indicadora, una diana unida puede ser detectable por marcado directo con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico para el primer anticuerpo, se expone al complejo diana-primer anticuerpo para formar un complejo terciario diana-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la

molécula indicadora. Por “molécula indicadora”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se indica una

molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de anticuerpo unido a antígeno. Las moléculas indicadoras más comúnmente usadas en este tipo de ensayo son moléculas que contienen o bien enzimas, fluoróforos o bien radionúclidos (es decir, radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes.

[0101] En el caso de un enzimoinmunoensayo, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Como será fácilmente reconocido, sin embargo, existe una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes, que están fácilmente disponibles para el experto. Las enzimas comúnmente usadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, -galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que van a usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente para la producción, tras la hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos que dan un producto fluorescente en vez de los sustratos cromogénicos anotados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo marcado con enzima se añade al complejo primer anticuerpo-marcador molecular, se deja que se una y luego se lava el reactivo en exceso. Luego se añade una disolución que contiene el sustrato apropiado al complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo. El sustrato reaccionará con la enzima ligada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa que puede cuantificarse adicionalmente, normalmente espectrofotométricamente, dando una indicación de la cantidad de biomarcador que estaba presente en la muestra. Alternativamente, compuestos fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, induciendo un estado para la excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio óptico. Como en EIA, se deja que el anticuerpo marcado fluorescente se una al complejo primer anticuerpo-marcador molecular. Después de lavar el reactivo sin unir, el complejo terciario restante se expone luego a luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. La inmunofluorescencia y las técnicas de EIA están ambas muy bien establecidas en la materia. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadoras tales como moléculas de radioisótopo, quimioluminiscentes o bioluminiscentes.

[0102] En algunas realizaciones se detecta la expresión de ligandos de EphB2 tales como efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y/o efrina-A4 (sola o conjuntamente con la expresión de EphB2) como se describe adicionalmente en el presente documento. En otras realizaciones más, la expresión de APC, p53, DCC, DPC4, JV18-1/MADR2 y/o ras (tal como c-Ki-ras o N-ras) se detecta conjuntamente con la expresión de EphB2.

[0103] La expresión de EphB2 en una muestra biológica también puede detectarse usando ensayos funcionales o basados en actividad. Los procedimientos para ensayar la función de EphB2 se conocen en la técnica e incluyen el ensayo descrito en Mao y col. Cancer Res. 64: 781-788, 2004.

Detección de polinucleótidos EphB2

[0104] En el presente documento se desvelan procedimientos para detectar (por ejemplo, presencia o ausencia de o cantidad) un polinucleótido(s) (por ejemplo, polinucleótidos EphB2) en una muestra biológica de un sujeto, tal como un sujeto humano. Pueden emplearse una variedad de procedimientos para detectar polinucleótidos e incluyen, por ejemplo, RT-PCR, TaqMan, procedimientos de amplificación, micromatriz de polinucleótidos y similares.

[0105] Los procedimientos para la detección de polinucleótidos (tales como ARNm) son muy conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridación usando sondas de ADN complementario (tal como hibridación in situ usando ribosondas de EphB2 marcadas), transferencia Northern y técnicas relacionadas, y diversos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos (tales como RT-PCR usando cebadores complementarios específicos para EphB2, y otros procedimientos de detección de tipo amplificación tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SPIA, Ribo-SPIA, SISBA, MMT y similares).

[0106] En algunas realizaciones, el (los) polinucleótido(s) (tal como un cebador y/o sonda) adecuado(s) para hibridación con el polinucleótido EphB2 se hibrida(n) con el polinucleótido EphB2 y no reacciona(n) significativamente de forma cruzada con polinucleótido EphB1R y/o polinucleótido EphB3R. En algunas realizaciones, el polinucleótido se hibrida con el polinucleótido EphB2 y no reacciona significativamente de forma cruzada con el polinucleótido EphB1R, polinucleótido EphB3R, polinucleótido EphB4R, polinucleótido EphB5R y/o polinucleótido EphB6R. En algunas realizaciones, el polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido EphB2 comprende al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 3400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500 o más nucleótidos contiguos. En algunas realizaciones, el polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido EphB2 comprende al menos aproximadamente 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 3400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500 o más nucleótidos contiguos mostrados en la Figura 2, 4 y/o 6. En algunas realizaciones, el polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido EphB2 es EphB2 humano, EphB2 murino, EphB2 de roedor y/o EphB2 de mono. En algunas realizaciones, el polinucleótido que se hibrida con el polinucleótido EphB2 es EphB2 humano. Se entiende que un polinucleótido que se hibrida con EphB2 puede hibridarse con uno o más polinucleótidos EphB2 de secuencia nativa. Es rutina en la materia seleccionar polinucleótidos que se unen a uno o más polinucleótidos EphB2 de secuencia nativa y adicionalmente determinar si un polinucleótido reconoce uno o más polinucleótidos EphB2 de secuencia nativa.

[0107] Muestras biológicas de mamíferos pueden ensayarse convenientemente para, por ejemplo, ARNm de EphB2 usando transferencia Northern, puntual o análisis por PCR. Por ejemplo, ensayos de RT-PCR tales como ensayos de PCR cuantitativa son muy conocidos en la técnica. En una realización ilustrativa de la invención, un procedimiento para detectar ARNm de EphB2 en una muestra biológica comprende producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido usando un polinucleótido EphB2 como cebadores de sentido directo y de sentido contrario para amplificar ADNc de EphB2 en su interior; y detectar la presencia o ausencia del ADNc de EphB2 amplificado. Además, tales procedimientos pueden incluir una

o más etapas que permiten determinar la cantidad (niveles) de ARNm de EphB2 en una muestra biológica (por ejemplo, examinando simultáneamente los niveles de una secuencia de ARNm de control comparativo de un gen de mantenimiento tal como un miembro de la familia de actina). Opcionalmente puede determinarse la secuencia del ADNc de EphB2 amplificado.

[0108] Sondas y/o cebadores pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico o enzima. Tales sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de polinucleótidos EphB2 en una muestra y como un medio para detectar una célula que expresa proteínas EphB2. Como será entendido por el experto, pueden prepararse muchos cebadores y sondas diferentes (por ejemplo, basándose en las secuencias proporcionadas en el presente documento) y usarse eficazmente para amplificar, clonar y/o determinar la presencia

o ausencia de y/o cantidad de ARNm de EphB2.

[0109] Procedimientos opcionales de la invención incluyen protocolos que comprenden detección de polinucleótidos tales como polinucleótido EphB2 en una muestra de tejido o célula usando tecnologías de micromatriz. Por ejemplo, usando micromatrices de ácidos nucleicos, muestras de ARNm de prueba y de control y muestras de de tejido de prueba y control se transcriben de forma inversa y se marcan para generar sondas de ADNc. Entonces, las sondas se hibridan con una matriz de ácidos nucleicos inmovilizada sobre un soporte sólido. La matriz está configurada de forma que la secuencia y posición de cada miembro de la matriz sea conocida. Por ejemplo, una selección de genes que tienen potencial para expresarse en ciertos estados de enfermedad puede matrizarse sobre un soporte sólido. La hibridación de una sonda marcada con un miembro de matriz particular indica que la muestra de la que se derivó la sonda expresa ese gen. Los análisis de expresión génica diferencial de tejido de enfermedad pueden proporcionar información valiosa. La tecnología de micromatrices utiliza técnicas de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de cálculo para evaluar el perfil de expresión de ARNm de miles de genes dentro de un único experimento (véase, por ejemplo, el documento WO 01/75166 publicado el 11 de octubre de 2001; (véanse, por ejemplo, el documento U.S. 5.700.637, la patente de EE.UU. 5.445.934 y la patente de EE.UU. 5.807.522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. y col., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999) para una discusión de la fabricación de matrices). Las micromatrices de ADN son matrices en miniatura que contienen fragmentos de genes que o bien se sintetizan directamente sobre o bien se aplican en puntos sobre vidrio u otros sustratos. Miles de genes están normalmente representados en una única matriz. Un experimento de micromatrices típico implica las siguientes etapas: 1. preparación de diana fluorescentemente marcada de ARN aislado de la muestra, 2. hibridación de la diana marcada con la micromatriz, 3. lavado, tinción y barrido de la matriz, 4. análisis de la imagen barrida y 5. generación de perfiles de expresión génica. Actualmente están usándose dos tipos principales de micromatrices de ADN: matrices de oligonucleótidos (normalmente 25 a 70meros) y matrices de expresión génica que contienen productos de PCR preparados a partir de ADNc. En la formación de una matriz, los oligonucleótidos pueden o bien prefabricarse y aplicarse en puntos a la superficie o bien sintetizarse directamente sobre la superficie (in situ).

[0110] El sistema GeneChip® de Affymetrix es un sistema de micromatrices comercialmente disponible que comprende matrices fabricadas mediante síntesis directa de oligonucleótidos sobre una superficie de vidrio. Matrices de sondas/genes: los oligonucleótidos, normalmente 25 meros, se sintetizan directamente sobre una oblea de vidrio mediante una combinación de fotolitografía basada en semiconductores y tecnologías químicas de síntesis en fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400.000 oligonucleótidos diferentes y cada oligonucleótido está presente en millones de copias. Como las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en localizaciones conocidas sobre la matriz, los patrones de hibridación y las intensidades de señal pueden interpretarse en términos de identidad génica y niveles relativos de expresión por el software Affymetrix Microarray Suite. Cada gen está representado sobre la matriz por una serie de sondas de oligonucleótidos diferentes. Cada par de sondas consiste en un oligonucleótido de apareamiento perfecto y un oligonucleótido de desapareamiento. La sonda de apareamiento perfecto tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y, por tanto, mide la expresión del gen. La sonda de desapareamiento se diferencia de la sonda de apareamiento perfecto por una única sustitución de bases en la posición de bases central, perturbando la unión del transcrito del gen diana. Esto ayuda a determinar la hibridación de fondo y no específica que contribuye a la señal medida para el oligonucleótido de apareamiento perfecto. El software Microarray Suite resta las intensidades de hibridación de las sondas de desapareamiento de aquellas de las sondas de apareamiento perfecto para determinar el valor de intensidad absoluto o específico para cada conjunto de sondas. Las sondas se eligen basándose en la actual información de Genbank y otros repositorios de nucleótidos. Se cree que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Se usa un horno de

hibridación de GeneChip (horno “asador”) para llevar a cabo la hibridación de hasta 64 matrices a la vez. La estación

hidráulica realiza el lavado y la tinción de las matrices de sondas. Está completamente automatizada y contiene cuatro módulos, conteniendo cada módulo una matriz de sondas. Cada módulo está controlado independientemente por el software Microarray Suite usando protocolos hidráulicos previamente programados. El escáner es un escáner de fluorescencia láser confocal que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a las matrices de sondas. El terminal de trabajo informático con el software Microarray Suite controla la estación hidráulica y el escáner. El software Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones hidráulicas usando protocolos de hibridación previamente programados, de lavado y de tinción para la matriz de sondas. El software adquiere y convierte los datos de intensidad de hibridación en una llamada de presencia/ausencia para cada gen usando algoritmos apropiados. Finalmente, el software detecta cambios en la expresión génica entre experimentos por análisis de comparación y formatea las salidas en archivos .txt que pueden usarse con otros programas informáticos para el análisis de datos adicional.

[0111] En algunas realizaciones se detecta la deleción del gen, mutación del gen o amplificación del gen EphB2. La deleción del gen, mutación del gen o amplificación puede medirse por uno cualquiera de una amplia variedad de protocolos conocidos en la técnica, por ejemplo, por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN) o hibridación in situ (por ejemplo, FISH) usando una sonda apropiadamente marcada, procedimientos citogenéticos o hibridación genómica comparativa (CGH) usando una sonda apropiadamente marcada. Además, estos procedimientos pueden emplearse para detectar deleción del gen del

ligando de EphB2, mutación del ligando o amplificación del gen. Como se usa en el presente documento, “detectar la expresión de EphB2” engloba la detección de la deleción del gen, mutación del gen o amplificación del gen EphB2.

[0112] Adicionalmente puede examinarse el estado de metilación del gen EphB2 en una muestra de tejido o de células. La desmetilación y/o hipermetilación aberrante de islas CpG en las regiones reguladoras de 5' del gen producida frecuentemente en células inmortalizadas y transformadas puede producir expresión alterada de diversos genes. Son muy conocidos en la técnica una variedad de ensayos para examinar el estado de metilación de un gen. Por ejemplo, pueden utilizarse, en soluciones de hibridación Southern, enzimas de restricción sensibles a la metilación que no pueden escindir secuencias que contienen sitios CpG metilados para evaluar el estado de metilación de islas CpG. Además, MSP (PCR específica de metilación) puede perfilar rápidamente el estado de metilación de todos los sitios CpG presentes en una isla CpG de un gen dado. Este procedimiento implica la modificación inicial de ADN por bisulfito de sodio (que convertirá todas las citosinas sin metilar en uracilo), seguido de amplificación usando cebadores específicos para ADN metilado frente a sin metilar. Los protocolos que implican la interferencia de metilación también pueden encontrarse, por ejemplo, en Current Protocols In Molecular Biology, unidad 12, Frederick M. Ausubel y col. eds., 1995; De Marzo y col., Am. J. Patol. 155(6): 1985-1992 (1999); Brooks y col., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536); y Lethe y col., Int. J. Cancer 76 (6): 903-908 (1998).

Como se usa en el presente documento, “detectar la expresión de EphB2” engloba la detección de la metilación del

gen EphB2.

[0113] En algunas realizaciones, la expresión de ligandos de EphB2 tales como efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y/o efrina-A4 se detecta (sola o conjuntamente (simultáneamente y/o secuencialmente)) con la expresión de EphB2) como se describe adicionalmente en el presente documento. En otras realizaciones más, la expresión de APC, p53, DCC, DPC4, JV18-1/MADR2 y/o ras (tal como c-Ki-ras o N-ras) se detecta conjuntamente con la expresión de EphB2.

Detección del ligando de EphB2

[0114] En los procedimientos de la presente invención, la muestra biológica también puede examinarse (tanto conjuntamente con la expresión de EphB2 como independientemente) para la expresión de ligando(s) de EphB2 (tal como polipéptido y/o polinucleótido del ligando de EphB2). Como se ha descrito anteriormente y en la materia, actualmente se cree que EphB2 se une a al menos cuatro ligandos diferentes: efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y efrina-A4. Usando procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en el presente documento, puede detectarse la expresión del polinucleótido y/o polipéptido de efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3 y/o efrina-A4. A modo de ejemplo, las técnicas de IHC descritas anteriormente pueden emplearse para detectar la

presencia de una o más de tales moléculas en la muestra. Como se usa en el presente documento, “conjuntamente”

pretende englobar cualquier detección simultánea y/o secuencial. Por tanto, se contempla que en realizaciones en las que una muestra biológica esté siendo examinada no sólo para la presencia de EphB2, sino también para la presencia de, por ejemplo, efrina-B1, efrina-B2, efrina-B3, y/o efrina-A4, puedan prepararse portaobjetos separados a partir del mismo tejido o muestra, y probar cada portaobjetos con un reactivo que se une a EphB2 y/o ligando, respectivamente. Alternativamente puede prepararse un único portaobjetos a partir de la muestra de tejido o célula, y pueden usarse anticuerpos dirigidos a EphB2 y ligando a propósito de un protocolo de tinción de múltiples colores para permitir la visualización y detección de EphB2 y ligando.

Análisis y comparación de datos

[0115] Los datos generados por la detección pueden analizarse usando cualquier medio adecuado (por ejemplo, visualmente, por ordenador, etc.). En una realización, los datos se analizan usando un ordenador digital programable. El análisis de datos puede incluir las etapas de determinar la intensidad de la señal. La intensidad puede normalizarse, por lo que la intensidad se calibra con respecto a algún valor de referencia. Por ejemplo, una referencia puede ser ruido de fondo de la unión. Alternativamente, una referencia puede ser la intensidad de unión a proteína de un anticuerpo de control. La comparación de la expresión de EphB2 (por ejemplo, comparación del nivel de expresión en una muestra biológica de prueba y una muestra de control biológica o nivel de referencia de control) puede realizarse mediante procedimientos convencionales, que incluyen procedimientos estadísticos convencionales como prueba de la chi al cuadrado, prueba de la t de Student o correlación del orden de Spearman según convenga. Procedimientos estadísticos adicionales se tratan en Wohlgemuth y col., documento US2004/0009479 A1; Birbeck y col. Annals Surg 235:449-457 (2002) y se ejemplifican en el presente documento. Están ampliamente disponibles paquetes de software para realizar el análisis estadístico.

Procedimientos que comprenden la selección del tratamiento contra el cáncer

[0116] En el presente documento se desvelan procedimientos para la selección del tratamiento contra el cáncer. Como se observa anteriormente, el tratamiento contra el cáncer, tal como quimioterapia, radiación y/o cirugía, tiene riesgos asociados y sería útil poder seleccionar óptimamente los pacientes más probables a beneficiar. La prueba de pronóstico es útil, por ejemplo, para identificar pacientes con males pronósticos de forma que se identifique un enfoque de tratamiento de mayor riesgo más agresivo, y para identificar pacientes con buenos pronósticos para los cuales una terapia arriesgada no proporcionaría suficiente beneficio para garantizar los riesgos. Por consiguiente, se desvelan procedimientos para la selección del tratamiento contra el cáncer para un paciente, comprendiendo los procedimientos (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra biológica del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control (o valor de referencia de control); (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que la expresión de EphB2 es pronóstica de cáncer en el paciente; y (c) posterior a las etapas (a) y (b), seleccionar el tratamiento contra el cáncer para el paciente, en el que la selección del tratamiento se basa en el pronóstico del paciente determinado en la etapa (b). En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra (de prueba) del paciente es pronóstico de cáncer en el paciente.

[0117] En el presente documento se desvelan procedimientos para seleccionar tratamiento contra el cáncer para paciente, comprendiendo los procedimientos: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) detectar la expresión de EphB2 en la muestra biológica, en el que la expresión de EphB2 es pronóstica de cáncer en el paciente; y (c) posterior a las etapas (a) y (b), seleccionar el tratamiento contra el cáncer para el paciente, en el que la selección del tratamiento se basa en el pronóstico del paciente determinado en la etapa (b). En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente es pronóstico de cáncer en el paciente. En algunas realizaciones, el tratamiento engloba mejorar, reducir la incidencia de, paliar, retrasar el desarrollo de y/o retrasar la progresión de cáncer.

[0118] En el presente documento se describen cánceres a modo de ejemplo. Los tratamientos para el cáncer son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita y col., eds., Williams & Wilkins Co., 2001); Manual of Clinical Oncology (Casciato, DA, ed., Lippincott, Williams & Wilkins Co., 2000); Bacquiran, DC ed., Lippincott's Cancer Chemotherapy Handbook, Lippincott Co., 2001); Armitage, JO, ed., High-Dose Cancer Therapy, Lippincott, Williams & Wilkins Co., 1999). En algunas realizaciones, el tratamiento comprende la administración de una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-EphB2 conjugado con agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina activa de origen sintético, bacteriano, fúngico, vegetal o animal,

o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los inmunoconjugados se conocen en la técnica e inmunoconjugados a modo de ejemplo se describen en el presente documento. Véase también Pennell, CA. Immunol. Res. 25,177-191 (2002; Kreitman, RJ, Curr. Pharm. Biotechnol. 2: 313-325 (2001).

[0119] Adicionalmente se desvela el uso de agentes anti-EphB2 (tal como un anticuerpo antagonista). Puede usarse una proteína anti-EphB2 que comprende una región de unión a EphB2, por ejemplo, una inmunoadhesina de efrina-B1, inmunoadhesina de efrina-B2, inmunoadhesina de efrina-B3 e inmunoadhesina de efrinas-A4. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA-6606 (depositado el 24 de febrero de 2005). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo que comprende dominio(s) variable(s) de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA-6606, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 comprende al menos uno (al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 y/o 6) secuencia(s) hipervariable(s) (HVR(s)) que comprende(n) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y/o HVR-H3 del anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA6606, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo que se une al mismo epítope sobre EphB2 humano que el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA6606. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 es un anticuerpo que compite con el anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma 2H9.11.14 que tiene el nº de la Colección americana de cultivos de tejido tipo (ATCC) PTA-6606 por unirse a EphB2 humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-EphB2 comprende: al menos una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis secuencias de regiones hipervariables (HVR) seleccionadas del grupo que consiste en: (a) HVR-L1 que comprende la secuencia KSSQSLLNSGNQENYLA (SEQ ID NO:1); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia GASTRES (SEQ ID NO:2); (c) HVR-L3 que comprende la secuencia QNDHSYPFT (SEQ ID NO:3); (d) HVR-H1 que comprende la secuencia SYWMH (SEQ ID NO:4); (e) HVR-H2 que comprende la secuencia FINPSTGYTDYNQKFKD (SEQ ID NO:5); y (f) HVR-H3 que comprende la secuencia RLKLLRYAMDY (SEQ ID NO:6). En una realización, el anticuerpo anti-EphB2 comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia:

DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQENYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRF TGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO:7). En una realización, el anticuerpo anti-EphB2 comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia:

QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGFINPSTGYTDYNQKFKD KATLTVKSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCTRRLKLLRYAMDYWGQGTTLTVSA (SEQ ID NO:8). En una realización, el anticuerpo anti-EphB2 comprende un dominio variable de la cadena ligera que tiene la secuencia:

DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQENYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRF TGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGAGTKVEIKR (SEQ ID NO:7); y comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene la secuencia:

Anticuerpos anti-EphB2 a modo de ejemplo adicionales se describen en el presente documento.

[0120] En el presente documento se desvela el uso de inmunoconjugados (llamados indistintamente “conjugados anticuerpo-fármaco” o “ADC”) que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-EphB2 descritos en el presente documento conjugados con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).

[0121] El uso de conjugados anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151172; patente de EE.UU. 4.975.278) permite la administración elegida como diana del resto de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular en su interior, en el que la administración sistémica de estos agentes de fármaco sin conjugar puede producir niveles inaceptables de toxicidad a células normales, además de las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin y col., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A.

Pinchera y col. (eds), pp. 475-506). Así se busca la máxima eficacia con toxicidad mínima. Se ha informado de tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales como útiles en estas estrategias (Rowland y col., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Los fármacos usados en estos procedimientos incluyen daunomicina, doxorubicina, metrotrexato y vindesina (Rowland y col., (1986) arriba). Las toxinas usadas en los conjugados anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler y col. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler y col. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler y col. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu y col., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) y caliqueamicina (Lode y col. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman y col. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión a ADN o inhibición de topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.

[0122] ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos y radioisótopo 111In o 90Y unido por un quelante de ligador de tiourea (Wiseman y col. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman y col. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig y col. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig y col. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra linfoma no Hodgkin (LNH) de linfocitos B, la administración produce citopenias graves y prolongadas en la

mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado

anticuerpo-fármaco compuesto por un anticuerpo huCD33 ligado a caliqueamicina, fue aprobado en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; patentes de EE.UU. nº 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 ligado por el ligador de disulfuro SPP al resto de fármacos maitansinoides, DM1, está avanzando en ensayos de fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tal como colon, pancreático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado anticuerpo-fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal anti-antígeno prostático específico de membrana (PSMA) ligado al resto de fármacos maitansinoides, DM1, está en desarrollo para el posible tratamiento de tumores de próstata. Los péptidos auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específico para CD30 en tumores malignos hematológicos) (Doronina y col. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) y están en desarrollo terapéutico.

[0123] Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de inmunoconjugados se describen en el presente documento (por ejemplo, arriba). Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcinas, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Está disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Se preparan conjugados del anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento a proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de Nsuccinimidilo (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y col., Science, 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3metildietilentriaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026.

[0124] Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una caliqueamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en el presente documento.

i. Maitansina y maitansinoides

[0125] En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (longitud completa o fragmentos) de la invención conjugado con una o más moléculas de maitansinoide.

[0126] Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto del África oriental Maytenus serrata (patente de EE.UU. nº 3.896.111). Posteriormente se descubrió que ciertos microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres de maitansinol C-3 (patente de EE.UU. nº 4.151.042). El maitansinol sintético y los derivados y análogos del mismo se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

[0127] Los restos de fármacos maitansinoides son restos de fármaco en conjugados anticuerpo-fármaco debido a que son: (i) relativamente accesibles para preparar por fermentación o modificación química, derivatización de productos de fermentación, (ii) favorecen la derivatización con grupos funcionales adecuados para la conjugación mediante ligadores de no disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) eficaces contra una variedad de líneas celulares tumorales.

[0128] Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides, procedimientos de preparación de los mismos y su uso terapéutico se desvelan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1. Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DM1 ligado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari y col., Cancer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que un maitansinoide se conjugó mediante un ligador de disulfuro con el anticuerpo A7 murino que se une a un antígeno en líneas de células de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría aumentarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones.

[0129] Los conjugados anticuerpo-maitansinoide se preparan ligando químicamente un anticuerpo con una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de tanto el anticuerpo como la molécula de maitansinoide. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.208.020. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia en potenciar la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso se esperaría que una molécula de toxina/anticuerpo potenciara la citotoxicidad con respecto al uso de anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se desvelan, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.208.020 y en las otras patentes y publicaciones de no patente citadas anteriormente en el presente documento. Maitansinoides preferidos son maitansinol y análogos de maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, tal como diversos ésteres de maitansinol.

[0130] Hay muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para preparar conjugados anticuerpomaitansinoide que incluyen, por ejemplo, los desvelados en las patentes de EE.UU. nº 5.208.020 o la patente EP 0 425 235 B1, Chari y col., Cancer Research 52:127-131 (1992). Los conjugados anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente de ligador SMCC pueden prepararse como se desvela en la solicitud de patente de EE.UU. nº 2005/1699331. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa o lábiles de esterasa, como se desvela en las patentes anteriormente identificadas, prefiriéndose grupos disulfuro y tioéter. Grupos de enlace adicionales se describen y ejemplifican en el presente documento.

[0131] Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide pueden prepararse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6diisocianato) y compuestos de flúor bis-activo (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Carlsson y col., Biochem.

J. 173:723-737 (1978)) y 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

[0132] El ligador puede unirse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace éster mediante la reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede producirse en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en posición la C-3 del maitansinol o un análogo de maitansinol.

ii. Auristatinas y dolostatinas

[0133] En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (patentes de EE.UU. nº 5635483; 5780588). Se ha mostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con la dinámica de microtúbulos, hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke y col. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticancerígena (documento US 5663149) y antifúngica (Pettit y col. (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42:2961-2965). El resto del fármaco dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo mediante el extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) del resto de fármaco peptídico (documento WO 02/088172).

[0134] Realizaciones de auristatina a modo de ejemplo incluyen el extremo N ligado a restos del fármaco

monometilauristatina DE y DF, desvelado en “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,

solicitud de EE.UU. 2005/238649 publicada el .

[0135] Normalmente, los restos de fármaco basados en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Tales enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, según el procedimiento de síntesis en fase líquida (véase E. Schröder y K. Lübke, “The Peptides”, volumen 1, pág. 76-136, 1965, Academic Press) que es muy conocido en el campo de la química de los péptidos. Los restos del fármaco auristatina/dolastatina pueden prepararse según los procedimientos de: documentos US 5635483; US 5780588; Pettit y col. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit y col. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243277; Pettit, G.R., y col. Synthesis, 1996, 719-725; y Pettit y col. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784. “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, solicitud de EE.UU. 2005/238649 (que desvela, por ejemplo, ligadores y procedimientos de preparación de compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados con ligadores).

iii. Caliqueamicina

[0136] En otras realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina puede producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones inferiores a picomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina véanse las patentes de 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas a American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, 1, , 1, N-acetil-11, PSAG y 1 (Hinman y col., Cancer Research

53:3336-3342 (1993), Lode y col., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas a American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelular y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por tanto, la captación celular de estos agentes por la internalización mediada por anticuerpos potencia enormemente sus efectos citotóxicos.

iv. Otros agentes citotóxicos

[0137] Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida conjuntamente el complejo LL-E33288 descrito en las patentes de EE.UU. 5.053.394, 5.770.710, además de esperamicinas (patente de EE.UU. 5.877.296).

[0138] Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos de no unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.

[0139] La presente divulgación contempla adicionalmente un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; ADNsa).

[0140] Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Están disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212,P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Si el conjugado se usa para la detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo, Ttc99m o I123, o una marca de espín para la obtención de imágenes de resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes de resonancia magnética, irm), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

[0141] Las radiomarcas u otras marcas pueden incorporarse en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Marcas tales como Tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse por un residuo de cisteína en el péptido. Itrio-90 puede unirse por un residuo de lisina. El procedimiento IODOGEN (Fraker y col. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 4957 puede usarse para incorporar yodo-123. “Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy” (Chatal, CCR Press 1989) describe otros procedimientos en detalle.

[0142] Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico pueden prepararse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 4-(Nmaleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y col., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El ligador puede ser un “ligador escindible” que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede usarse un ligador lábil de ácido, ligador sensible a peptidasa, ligador fotolábil, ligador de dimetilo o ligador que contiene disulfuro (Chari y col., Cancer Research 52:127-131 (1992); patente de EE.UU. nº 5.208.020).

[0143] Los compuestos de la invención contemplan expresamente, pero no se limitan a, ADC preparado con reactivos de ligador cruzado: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU.). Véanse las páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

v. Preparación de conjugados anticuerpo-fármaco

[0144] En los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención, un anticuerpo (Ab) está conjugado con uno o más restos de fármaco (D), por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos de fármaco por anticuerpo, mediante un ligador (L). El ADC de fórmula I puede prepararse por varias rutas empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos para aquellos expertos en la materia que incluyen: (1) reacción de un grupo nucleófilo de un anticuerpo con un reactivo de ligador bivalente para formar Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con un resto de fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleófilo de un resto de fármaco con un reactivo de ligador bivalente, para formar D-L, mediante un enlace covalente, seguido de reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. Procedimientos adicionales para preparar ADC se describen en el presente documento.

Ab-(L-D)p I

[0145] El ligador puede estar compuesto por uno o más componentes de ligador. Componentes de ligador a modo de ejemplo incluyen 6-maleimidocaproílo (“MC”), maleimidopropanoílo (“MP”), valina-citrulina (“val-cit”), alanina-fenilalanina (“ala-phe”), p-aminobenciloxicarbonilo (“PAB”), 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo (“SPP”), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo (“SMCC”) y (4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo (“SIAB”). Componentes de ligador adicionales se conocen en la técnica y algunos se describen en el presente documento. Véase también “Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”, solicitud

de EE.UU. 2005/238649

[0146] En algunas realizaciones, el ligador puede comprender residuos de aminoácidos. Componentes de ligador de aminoácidos a modo de ejemplo incluyen un dipéptido, un tripéptido, un tetrapéptido o un pentapéptido. Dipéptidos a modo de ejemplo incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Tripéptidos a modo de ejemplo incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Residuos de aminoácidos que comprenden un componente de ligador de aminoácidos incluyen aquellos que se producen naturalmente, además de aminoácidos menores y análogos de aminoácidos que se producen no naturalmente, tales como citrulina. Los componentes de ligador de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse en su selectividad para escisión enzimática por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.

[0147] Los grupos nucleófilos en anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) grupos amina del extremo N, (ii) grupos amina de la cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos hidroxilo o amino de azúcar en los que el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de ligador y reactivos de ligador que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros entre cadenas reducibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos de ligador mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Por tanto, cada puente de cisteína formará teóricamente dos nucleófilos de tiol reactivos. Grupos nucleófilos adicionales pueden introducirse en anticuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) produciendo la conversión de una amina en un tiol. Pueden introducirse grupos tiol reactivos en el anticuerpo (o fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no nativos).

[0148] Los conjugados anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse por modificación del anticuerpo para introducir restos electrófilos que pueden reaccionar con sustituyentes nucleófilos en el reactivo de ligador o fármaco. Los azúcares de anticuerpos glucosilados pueden oxidarse, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato para formar grupos aldehído o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos de ligador o restos de fármaco. Los grupos de base de Schiff de iminas resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realización, la reacción de la porción de hidrato de carbono de un anticuerpo glucosilado con tanto galactosa oxidasa como meta-peryodato de sodio pueden dar grupos carbonilo (aldehído y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina del extremo N pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, produciendo la producción de un aldehído en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; documento US 5362852). Tal aldehído puede hacerse reaccionar con un resto de fármaco o nucleófilo ligador.

[0149] Asimismo, los grupos nucleófilos en un resto de fármaco incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida que pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos de ligador y reactivos de ligador que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) aldehídos, cetonas, grupos carboxilo y maleimida.

[0150] Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico puede prepararse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado tanto adyacentes entre sí como separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

[0151] En otra realización más, el anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (como estreptavidina) para

la utilización en la elección previa como diana de tumores en el que el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado sin unir de la circulación usando un agente de limpieza y luego

administración de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un

radionucleótido).

[0152] Las formulaciones terapéuticas de anticuerpo anti-EphB2 se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª edición (2000)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; tonificantes tales como trehalosa y cloruro sódico; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; tensioactivo tal como polisorbato; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG). La formulación comprende preferentemente el anticuerpo a una concentración de entre 5-200 mg/ml, preferentemente entre 10-100 mg/ml.

[0153] Los principios activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª edición (2000).

[0154] Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de -etilo, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[0155] Las formulaciones que van a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0156] Los anticuerpos (tal como composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo) pueden administrarse a un paciente, según procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolo

o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Se prefiere administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.

En una realización, el tratamiento de la presente invención implica la administración combinada de un anticuerpo anti-EphB2 y uno o más agentes quimioterapéuticos. La presente invención contempla la administración de mezclas de diferentes agentes quimioterapéuticos. La administración combinada incluye co-administración, usando formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en la que preferentemente hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

[0157] Los programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden usarse según instrucciones del fabricante o según se determine empíricamente por el médico experto. Los programas de preparación y dosificación para quimioterapia también se describen en, por ejemplo, Chemotherapy Service Ed.,

M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) y Lippincott's Cancer Chemotherapy Handbook, Baquiran y col., eds. Lippincott, Williams y Wilkins (2002). El agente quimioterapéutico puede preceder, o seguir la administración del anticuerpo o puede administrarse simultáneamente con el mismo.

[0158] Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, como se define anteriormente, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico adjunto. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. En una pauta de terapia de combinación, las composiciones de la presente invención se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz o sinérgica. Como se usa en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz es de forma que la co-administración de anticuerpo anti-EphB2 y uno o varios de otros agentes terapéuticos, o la administración de una composición de la presente invención, produzca la reducción o inhibición de la enfermedad o afección que elige diana. Una cantidad terapéuticamente sinérgica es la cantidad de anticuerpo anti-EphB2 y uno o varios de otros agentes terapéuticos necesarios para reducir o eliminar sinérgica o significativamente las afecciones o síntomas asociados a una enfermedad particular.

[0159] Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, tanto si es, por ejemplo, por una o más administraciones separadas como por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría oscilar de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o prolongadas, dependiendo de la afección, el tratamiento es sostenido hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. En un aspecto preferido, el anticuerpo de la invención se administra cada dos a tres semanas, a una dosis que oscila de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. El progreso de la terapia de la invención se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. La eficacia del tratamiento de la invención puede medirse por diversos criterios de valoración comúnmente usados en la evaluación de los tratamientos contra el cáncer que incluyen, pero no se limitan a, regresión del tumor, encogimiento del peso o tamaño del tumor, tiempo hasta la progresión, la duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, la duración de la respuesta y calidad de vida.

Procedimientos de tratamiento de trastornos que comprenden adenomas de colon

[0160] En el presente documento se desvelan adicionalmente procedimientos para detectar la expresión de EphB2 en adenomas de colon, y procedimientos para tratar trastornos caracterizados por adenomas de colon

(indistintamente llamados “trastornos de adenoma de colon”). Los solicitantes encontraron sorprendentemente que

EphB2 se expresa en exceso en adenomas de colon. Por consiguiente, EphB2 es una diana atractiva para terapia con inmunoconjugados para trastornos que caracterizan adenomas de colon, por ejemplo, poliposis adenomatosa familiar (PAF), en la que pacientes desarrollan grandes números de pólipos adenomatosos colónicos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno caracterizado por adenoma(s) de colon administrando una cantidad eficaz de un inmunoconjugado anti-EphB2 al paciente. Adicionalmente se desvelan procedimientos para mejorar, reducir la incidencia de, paliar, retrasar el desarrollo de, retrasar la progresión de o prevenir un trastorno caracterizado por adenoma(s) de colon administrando una cantidad eficaz de un inmunoconjugado anti-EphB2 a un paciente que tiene

o del que se sospecha que tiene un trastorno caracterizado por adenoma(s) de colon. En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para tratar un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno caracterizado por adenoma(s) de colon administrando una cantidad eficaz de un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo) al paciente. Adicionalmente se desvelan procedimientos para mejorar, reducir la incidencia de, paliar, retrasar el desarrollo de, retrasar la progresión de o prevenir un trastorno caracterizado por adenoma(s) de colon administrando una cantidad eficaz de un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo) a un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno caracterizado por adenoma(s) de colon.

[0161] Los procedimientos de la divulgación son particularmente adecuados para trastornos caracterizados por una pluralidad de adenomas de colon (tal como más de 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más adenomas de colon), que incluyen al menos los siguientes: trastorno de poliposis adenomatosa familiar (PAF) dominante autosómica producida por mutación en el gen APC (Tomlinson y col., J Med Genet 1996;33:268-73); síndrome de Peutz-Jegher (PJS), síndrome de poliposis juvenil (JPS), PAF atenuada producida por mutaciones en el gen MYH (Sieber y col. N Eng J Med 348:791-9 (2003)), síndrome de poliposis mixta hereditaria (SPMH), enfermedad de Cowden y síndrome de Bannayan-Ruvalcaba-Riley. Véanse también Crawford JM, Gastrointestinal tract, en: Cotran RS y col. Robbin's Pathological Basis of Disease, 6ª ed. London: Saunders (1999) pp775-844; Nicum y col., Acta Oncol 42:263-275 (2003); Kinzler, KW y Vogelstein, B. Colorectal Tumors, en Kinzeler KW, Vogelstein B, eds. The Genetic Basis of Human Cancer: McGraw-Hill 1999, pág. 565-87.

[0162] Agentes anti-EphB2 a modo de ejemplo (tal como anticuerpos e inmunoconjugados) se describen en el presente documento. En el presente documento se describen formulaciones y dosificaciones a modo de ejemplo. El progreso de la terapia de la invención se monitoriza fácilmente por técnicas y ensayos convencionales como se conocen en la técnica y se desvelan en el presente documento. La eficacia del tratamiento de la invención puede medirse por diversos criterios de valoración comúnmente usados en la evaluación de los tratamientos que incluyen, pero no se limitan a, regresión de adenomas, encogimiento de peso o tamaño de adenomas, tiempo hasta la progresión, la duración de la supervivencia, supervivencia libre de progresión, tasa de respuesta global, la duración de la respuesta y calidad de vida.

Procedimientos para la detección de la expresión de EphB2 en adenoma de colon

[0163] En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos que comprenden la detección de polipéptido(s) y/o polinucleótido(s) EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon. Como se observa en el presente documento, los solicitantes encontraron sorprendentemente que EphB2 se expresa en exceso en adenomas de colon tales como adenomas planos, tubulares, tubulovellosos y vellosos. La detección de la expresión de EphB2 en adenomas de colon es útil, por ejemplo, para determinar la idoneidad para el tratamiento con un agente anti-EphB2 (tal como un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-EphB2), monitorizar el tratamiento con inmunoconjugados anti-EphB2 u otros agentes o intervenciones (por ejemplo, cirugía, radiación), determinar la reaparición de adenomas, monitorizar la progresión de adenomas, y similares. En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 se detecta antes; durante; después; antes y durante; antes y después; durante y después; antes, durante y después del tratamiento (por ejemplo, tratamiento con un agente anti-EphB2).

[0164] Por consiguiente, en un aspecto se proporcionan procedimientos para la detección de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, comprendiendo el procedimiento detectar la expresión de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en la muestra biológica. En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para la detección de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, comprendiendo los procedimientos comparar la expresión de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en la muestra biológica con expresión de EphB2 en una muestra de control (o valor de referencia de control). En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control (o valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto. En algunas realizaciones, la disminución de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control (o valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto.

[0165] Adicionalmente se proporcionan procedimientos para detectar la expresión de polinucleótidos y/o polipéptidos EphB2 en células y/o tejido de adenoma de colon de un paciente, comprendiendo los procedimientos:

(a) obtener las células y/o tejido de adenoma de colon; y (b) detectar la expresión de EphB2 en las células y/o tejido de adenoma de colon. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a una muestra de control (o un valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto. En algunas realizaciones, la disminución de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control (o valor de referencia de control) es pronóstica de cáncer en el sujeto.

[0166] Los procedimientos de la divulgación también pueden detectar polipéptido(s) y/o polinucleótido(s) de variante de EphB2 y/o fragmentos de EphB2. La detección de variantes y fragmentos de EphB2 se describe en el presente documento.

[0167] La detección de la expresión puede ser cuantitativa o cualitativa. La presencia y/o ausencia y/o nivel de expresión de EphB2 puede detectarse. Se entiende que la ausencia de expresión de EphB2 incluye niveles insignificantes, o de mínimos. La expresión de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en la muestra biológica de

prueba puede ser superior a la observada para una muestra de control biológica (llamada “expresión en exceso). En

algunas realizaciones, la expresión de EphB2 es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces superior o superior en la muestra biológica de prueba. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se determina en un ensayo de inmunohistoquímica (“IHC”) para puntuar al menos 2 o superior para intensidad de tinción. En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido EphB2 se determina en un ensayo de IHC para puntuar al menos 1 o superior, o al menos 3 o superior para intensidad de tinción. La expresión de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en la muestra

biológica de prueba puede ser inferior a la observada para una muestra de control biológica (llamada “expresión por

defecto). En algunas realizaciones, la expresión de EphB2 es al menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 150 veces inferior o inferior en la muestra biológica de prueba. Procedimientos para la detección de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 se conocen en la técnica y se desvelan y ejemplifican en el presente documento.

[0168] En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para diagnosticar trastornos caracterizados por adenomas de colon, comprendiendo dichos procedimientos detección de polinucleótido y/o polipéptido EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon. En algunas realizaciones, el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra biológica del paciente con respecto a una muestra de control (o un valor de referencia de control) es diagnóstico de un trastorno de adenoma de colon en el sujeto.

Kit, composiciones y artículos de fabricación

[0169] Para su uso en las aplicaciones descritas o sugeridas anteriormente también se proporcionan kits, composiciones y artículos de fabricación. En algunas realizaciones, los kits comprenden uno o más recipientes que comprenden un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo), un inmunoconjugado anti-EphB2, un polinucleótido EphB2 y/o un polipéptido EphB2, y en algunas realizaciones comprenden además instrucciones para su uso según cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento (tal como procedimientos para evaluación (tal como evaluación de pronóstico) de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene cáncer, procedimiento para la selección del tratamiento contra el cáncer para un paciente, procedimientos para tratar un paciente que tiene

o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, procedimientos para detectar polinucleótido o polipéptido EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, procedimientos para detectar polinucleótido o polipéptido de la expresión de EphB2 en células de adenoma de colon o tejido de un paciente y/o procedimientos que comprenden detectar la expresión del polinucleótido o polipéptido EphB2 en la muestra biológica). Los kits puede comprender además un control adecuado (valor de referencia de control).

[0170] Tales kits pueden comprender un medio de vehículo que está compartimentalizado para recibir en estrecho confinamiento uno o más medios de recipiente tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada medio de recipiente uno de los elementos separados que va a usarse en el procedimiento. Por ejemplo, uno de los medios del recipiente puede comprender un polinucleótido (tal como una sonda o cebador) que está o puede estar detectablemente marcado. Tal polinucleótido puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína EphB2 o un polinucleótido EphB2, respectivamente. Si el kit utiliza hibridación de ácidos nucleicos para detectar el ácido nucleico diana, el kit también puede tener, por ejemplo, recipientes que contienen nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos diana y/o un recipiente que comprende un medio indicador tal como una proteína de unión a biotina tal como avidina o estreptavidina, unida a una molécula indicadora, tal como una marca enzimática, fluorescente o de radioisótopo.

[0171] El kit comprenderá normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o varios de otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial o de usuario, que incluyen tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas y prospectos con instrucciones para su uso. Una etiqueta puede estar presente sobre el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar indicaciones para uso bien in vivo o bien in vitro, tal como aquellos descritos anteriormente.

[0172] Los kits tienen varias realizaciones. Una realización típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; en el que la composición incluye un anticuerpo primario que se une a una secuencia de polipéptidos de EphB2, la etiqueta sobre dicho recipiente indica que la composición puede usarse para evaluar la presencia de proteínas EphB2 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones para usar el anticuerpo para EphB2 que comprende la detección de la presencia o ausencia de proteína EphB2 en al menos un tipo de célula de mamífero. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar el anticuerpo y sonda a la misma sección de una muestra de tejido. El kit puede incluir tanto un anticuerpo primario como secundario, estando el anticuerpo secundario conjugado con una marca, por ejemplo, una marca enzimática.

[0173] Otra realización es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre dicho recipiente y una composición contenida dentro de dicho recipiente; en el que la composición incluye un polinucleótido que se hibrida con un complemento del polinucleótido EphB2 bajo condiciones rigurosas, la etiqueta sobre dicho recipiente indica que la composición puede usarse para evaluar la presencia de EphB2 en al menos un tipo de célula de mamífero, e instrucciones que comprenden el uso del polinucleótido EphB2 para evaluar la presencia de ARN o ADN de EphB2 en al menos un tipo de célula de mamífero.

[0174] Otros componentes opcionales en el kit incluyen uno o más tampones (por ejemplo, tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que es químicamente alterado por una marca enzimática, disolución de recuperación de epítopes, muestras de control (controles positivos y/o negativos), portaobjetos de control, etc.

[0175] Las composiciones (tales como composiciones farmacéuticas) comprenden un agente anti-EphB2 (tal como un anticuerpo) e inmunoconjugado anti-EphB2, un polinucleótido EphB2 y/o un polipéptido EphB2, y en algunas realizaciones comprenden además instrucciones para su uso según cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento (tal como procedimientos para evaluación (tal como evaluación de pronóstico) de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene cáncer, procedimiento para la selección del tratamiento contra el cáncer para un paciente, procedimientos para tratar un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, procedimientos para detectar polinucleótido o polipéptido EphB2 en una muestra biológica de un paciente que tiene o del que se sospecha que tiene un trastorno de adenoma de colon, procedimientos para detectar la expresión de polinucleótidos o polipéptidos EphB2 en células de adenoma de colon

o tejido de un paciente, y/o procedimientos que comprenden detectar la expresión del polinucleótido o polipéptido EphB2 en la muestra biológica).

[0176] Los artículos de fabricación pueden comprender componentes y/o composiciones de kit descritas en el presente documento.

[0177] Diversos aspectos de la invención se describen e ilustran adicionalmente a modo de los ejemplos que siguen, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.

EJEMPLOS

PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES

Base de datos Gene Logic

[0178] La expresión de EphB2 se examinó en la base de datos Gene Logic (Gaithersburg, MD) de los datos de la matriz de sondas HG-U133 de Affymetrix (conjunto de sondas 209588_at) para tejidos colorrectales que incluyen colon normal (n = 288), adenomas (n = 30), cánceres primarios (n = 122), metástasis distantes (n = 55), epitelio normal microdiseccionado por láser (n = 16) y epitelio microdiseccionado por láser de cánceres primarios (n = 9). Brevemente, el análisis de la base de datos GeneExpress® (Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD), una base de datos patentada que contiene información de expresión génica, se realizó usando tanto software disponible mediante Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD, para su uso con la base de datos GeneExpress®, como con software patentado escrito y desarrollado en Genentech, Inc. para su uso con la base de datos GeneExpress®. Véase Jubb y col., J Clin Pathol 2004 57:514-512 para descripción adicional del sistema GeneLogic. La clasificación de acontecimientos positivos en el análisis se basa en varios criterios que incluyen, por ejemplo, especificidad por tejido, especificidad por tumor y nivel de expresión en tejidos esenciales normales y/o proliferantes normales.

Muestras de tejido y construcción de micromatrices de tejido (MMT)

Líneas celulares

[0179] Se obtuvieron Colo206 y CX-1 de DSMZ (Braunschweig, Alemania), KM12 se obtuvo del Instituto nacional del cáncer (Bethesda, MD), y todas las otras líneas celulares de CCR se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA). Las células se cultivaron en 50/50 de medio Ham's F12 y de Eagle modificado por Dulbecco, complementado con L-glutamina 2 mM y 10% de suero bovino fetal. El ARN total se recogió y se hibridó con matrices de sonda HG-U133 GeneChip de Affymetrix como se ha descrito previamente (Yang y col., Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:1797-803). Los sedimentos de células también se fijaron en formalina, se incorporaron en parafina y se representaron en MMT como se ha descrito previamente (Kononen y col. Nat Med 1998;4:844-7).

Tejidos humanos

[0180] Un comité de revisión ético (Universidad de Leeds, RU) aprobó el uso de todos los tejidos e información clínica. El archivo de histopatología del Hospital general de Leeds (Leeds, RU) se cribó para identificar 148 adenomas colorrectales anonimizados, que incluyeron 84 adenomas tubulares, 27 adenomas tubulovellosos, 5 adenomas vellosos y 32 adenomas planos. Los tejidos incorporados en parafina fijados a formalina se biopsizaron para representar cada adenoma en MMT, como se ha descrito previamente (Kononen y col. Nat Med 1998;4:844-7).

[0181] Los tejidos incorporados en parafina fijados en formalina de cánceres primarios de correspondencia y metástasis de múltiples fuentes se recuperaron de los archivos de Genentech. La serie comprendía 28 CCR primarios y 30 metástasis (seis mesentéricas, 21 de los ganglios linfáticos y 3 hepáticas), representando 27 pacientes. También se incluyeron nuevas metástasis hepáticas sin corresponder adicionales. Se cortaron secciones completas y se usaron para ensayos aguas abajo.

[0182] Este estudio también investigó 342 CCR del archivo de tejidos de la Universidad de Leeds, representando 330 pacientes que se sometieron a resección en el Departamento de Cirugía en el Hospital Marien (Duesseldorf, Alemania) entre enero de 1990 y diciembre de 1995. Los datos de mucosa normal y supervivencia de correspondencia estuvieron disponibles para todos los pacientes, que incluyen información sobre la reaparición de enfermedad. La mediana del tiempo de seguimiento fue 4,2 años (intervalo: 5 meses a 11,4 años). Posoperatoriamente, catorce pacientes recibieron quimioterapia, doce pacientes recibieron radioterapia y siete pacientes ambos. Ciento diez tumores (32%) fueron proximales a la flexión esplénica, la edad media en el diagnóstico fue 69 años (intervalo: 28-88 años) y 150 pacientes (45%) fueron hombres. Al final del periodo de seguimiento, la reaparición de enfermedad local se observó en 25 pacientes, metástasis distantes en 49 pacientes y 8 pacientes mostraron ambos (Grabsch y col. Am J Clin Pathol 2004;122:511-6). Se construyeron MMT como se ha descrito previamente (Kononen y col. Nat Med 1998;4:844-7).

Hibridación in situ (HIS)

[0183] Se emplearon ribosondas marcadas con 33P para evaluar la expresión de ARNm de EphB2. Se amplificaron moldes de ADNc por reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADNc listo para la maratón de cerebro humano completo (BD Clontech, Palo Alto, CA). Cebadores directos e inversos contuvieron sitios de iniciación de 5' T7 y T3 ARN polimerasa, respectivamente. Se diseñaron ribosondas para complementar los nucleótidos 3043-3500 de la secuencia de ARNm de la variante de transcrito 2 (acceso de GenBank NM_004442) y los nucleótidos 2972-3404 de la secuencia de ARNm de la variante de transcrito 1 (acceso de GenBank NM_017449): directo 5'-T7-GCCCTCCTGGTGCTCTATCC-3' (SEQ ID NO:15), inverso 5'-T3-TCTGTCCATCTGTCCCGTCCT-3' (SEQ ID NO:16). La transcripción in vitro de sondas sentido y antisentido, hibridación y revelado de secciones se llevaron a cabo como se describe en Jubb y col. J Pathol 2003;200:577-88. Las secciones de tejido hibridadas se revisaron por microscopía de campo brillante y oscuro en una escala de 0-3 para la intensidad máxima de expresión de EphB2 en >10% del epitelio.

Inmunohistoquímica (IHC)

[0184] La IHC se realizó como se describe en Jubb y col. J Pathol 2003;200:577-88. En resumen, la recuperación de antígeno mediada por calor se realizó sobre secciones desparafinadas (disolución de recuperación diana, DAKOCytomation, Carpinteria, EE.UU.), antes del bloqueo de la biotina endógena (kit de bloqueo de avidinabiotina, Vector Labs, Burlingame, CA) e inmunoglobulinas no específicas con 10% de suero de caballo normal, según las instrucciones del fabricante. El inmunomarcado se realizó con un anticuerpo policlonal anti-EphB2 (número de catálogo AF467, R&D Systems, Mineápolis, MN) o inmunoglobulinas de cabra sin tratamiento previo (R&D Systems) a 1 µg/ml. Los inmunocomplejos se marcaron con un anticuerpo secundario anti-cabra biotinilado (Vector Labs) y un complejo de avidina-biotina-peroxidasa de rábano picante (Vectastain Elite, Burlingame, CA). Los tejidos se puntuaron en una escala de 0-3 para la intensidad máxima de expresión de EphB2 en >10% del epitelio.

Las MMT de sedimentos de células se incluyeron en cada ejecución de tinción para controlar la variabilidad en la intensidad de tinción.

Análisis estadístico

5 [0185] El mismo anatomopatólogo puntuó todos los casos, cegado al desenlace clínico. La puntuación se realizó según los criterios enumerados en la Tabla 1. En todos las MMT, la puntuación del mayor núcleo de expresión (n = 1-3 /muestra) se usó para representar cada paciente. Los tiempos de supervivencia medios dentro de cada subgrupo se estimaron a partir de curvas de Kaplan-Meier y las razones de riesgo correspondientes para

10 supervivencia global y sin reaparición se estimaron por modelado de ajuste de riesgos proporcionales usando el software JMP versión 5.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Las asociaciones estadísticas se evaluaron usando la prueba de la chi al cuadrado, prueba de la t de Student, correlación por rangos de Spearman según conviniera. La significancia estadística se asumió si el valor de P fue < 0,05.

15 RESULTADOS EXPERIMENTALES

[0186] La expresión de EphB2 se analizó en mucosa normal, adenomas, cánceres primarios de correspondencia y metástasis, y una serie de cánceres primarios con seguimiento clínico detallado. Los objetivos de este estudio fueron investigar el impacto del pronóstico de EphB2 en cáncer colorrectal (“CCR”) y examinar los

20 niveles relativos de expresión de EphB2 a través de la secuencia de adenoma a adenocarcinoma. Los experimentos se realizaron usando los procedimientos y materiales descritos anteriormente. Los resultados de estos experimentos se ilustran en las Figuras 7-11, como se trata más adelante.

Datos de micromatrices de oligonucleótidos

25 [0187] Un análisis de la base de datos Gene Logic demostró que el colon normal tenía un nivel de expresión de EphB2 medio significativamente inferior al de los adenomas colorrectal, cánceres primarios y metástasis distantes, P < 0,0001 (Figura 7A). Esta tendencia se preservó en muestras microdiseccionadas por láser, P = 0,01 (Figura 7B). Los cánceres primarios no tuvieron una expresión media significativamente mayor que los adenomas (P

30 = 0,06) o metástasis (P = 0,48) (Figura 7A). El perfilado de la expresión reveló que EphB2 era menos frecuente en líneas celulares de CCR, con la mayor expresión a niveles de acuerdo con colon normal (Figura 7C). Los niveles de transcrito de EphB2 y proteína EphB2 guardaron significativamente la misma relación en líneas celulares de CCR (P < 0,0001).

35 Localización

[0188] En intestino grueso tanto normal como neoplásico, la expresión de ARNm y proteína de EphB2 se localizó en el epitelio (Figuras 8, 9). La expresión de proteínas EphB2 fue predominantemente membranosa, con expresión citoplásmica más débil. En todas las muestras de colon normal, tanto la expresión de ARNm (n = 47)

40 como de proteína (n = 342) fue más intensa en la base de la cripta (puntuación = 2), disminuyendo la expresión al epitelio luminal (puntuación = 0). La intensidad de expresión máxima en poblaciones de células neoplásicas fue equivalente a la expresión en la base de la cripta colónica (Figuras 8, 9). Todos los subtipos de adenomas colorrectales presentaron evidencias de expresión homogénea de EphB2, con niveles relativamente mayores en lesiones planas en comparación con polipoides (Tabla 2). La falta de una correlación con el tamaño del tumor o la

45 gravedad de la displasia sugiere que la expresión está presente desde un estadio muy temprano en la tumorigénesis (datos no mostrados). Aunque el 82% de los CCR primarios y el 64% de las metástasis mostraron algún nivel de expresión de EphB2 en secciones completas (Figura 8), EphB2 no se expresó homogéneamente o uniformemente en todos los tumores malignos. Esto es a diferencia de lesiones adenomatosas que, cuando estuvieron presentes, expresaron EphB2 homogéneamente en toda la población de células neoplásicas. El veintitrés por ciento de todos

50 los adenomas no expresó EphB2. La hibridación de sondas HIS sentido y la tinción de inmunoglobulinas que no recibieron tratamiento previo no superó el ruido (datos no mostrados). Estroma benigno, tejido de ganglio linfático normal y tejido hepático normal fueron uniformemente negativos para la expresión de EphB2.

Tabla 2. Intensidad de la expresión de EphB2 en diferentes subtipos histológicos de adenoma 55

Histología Puntuación de intensidad IHC de EphB2, n (%) P (prueba de la t frente a 0 1 2 3 adenomas vellosos)

Adenomas planos (n = 32)* 2 (6) 13 (41) 11 (34)

6 (19) 0,81

Adenomas tubulares (n = 84) 22 (26) 35 (42) 25 (30)

2 (2) 0,10

Adenomas tubulovellosos (n = 27) 9(33) 10 (37) 8 (30)

0,05

Adenomas vellosos (n = 5) 3 (60) 1 (20)

1 (20)

*Prueba de la t para adenomas planos frente a polipoides, P = 0,001

Adenomas colorrectales, cánceres primarios y metástasis

[0189] Ciento quince (77%) de los 148 adenomas fueron positivos (puntuación ≥1) para la expresión de EphB2. Esto no fue estadísticamente diferente de la intensidad de expresión observada en CCR primarios, P = 0,37 (Figura 10). La expresión de EphB2 se demostró en todos los estados de tumorigénesis colorrectal, que incluyen todas las criptas normales, 77% de adenomas, 82% de cánceres primarios y 64% de metástasis. Cuando estuvo 5 presente, EphB2 se expresó homogéneamente en todos los adenomas. Subtipos histológicos diferentes de adenomas polipoides no mostraron diferencia estadísticamente significativa en la intensidad de expresión de EphB2 (Tabla 2), aunque la expresión fue significativamente mayor en adenomas planos (P = 0,001). No hubo asociaciones significativas con sitio, gravedad de displasia, frecuencia de pólipos, tamaño de pólipos o sexo del paciente (datos no mostrados). La expresión de EphB2 fue comparable en CCR primarios y metástasis, P = 0,17 (Figura 10). 10 Aunque se observó expresión homogénea en adenomas, el patrón de tinción fue focal en la mayoría de las lesiones malignas, con variación considerable en la intensidad de tinción en toda la población de células neoplásicas. Una media del 25% de las células tumorales que expresaron proteína EphB2 en tumores malignos primarios y secundarios puntuaron positivo para la expresión de EphB2. Todos los subtipos de adenomas colorrectales mostraron pruebas para la expresión homogénea de EphB2, con niveles relativamente mayores en lesiones planas

15 en comparación con polipoides (Tabla 2). La falta de una correlación con el tamaño del tumor o la gravedad de displasia sugiere que la expresión está presente desde un estadio muy temprano en la tumorigénesis.

Serie de pronóstico de CCR primarios

20 [0190] Trescientos veintisiete de los 330 pacientes fueron informativos de expresión de proteínas EphB2: 185 pacientes puntuaron cero, 101 pacientes puntuaron 1 y 41 pacientes puntuaron dos (ningún paciente puntuó tres en esta serie, y las puntuaciones estuvieron ausentes en tres pacientes). La HIS se realizó sobre una MMT que contenía 47 CCR: ocho pacientes puntuaron cero, 19 pacientes puntuaron uno, 18 pacientes puntuaron dos y dos pacientes puntuaron tres. Las criptas colónicas normales correspondientes fueron positivas en la base en todos los

25 casos. Se observó una asociación significativa entre IHC de EphB2 y puntuaciones de HIS en 46 cánceres informativos de ambos, P < 0,01.

[0191] Los efectos de la expresión de proteínas EphB2 se incluyeron en un ajuste de riesgos proporcional para supervivencia global. Altos niveles de expresión de EphB2 se asociaron a una duración de la supervivencia 30 media prolongada en cáncer colorrectal y una supervivencia sin reaparición media prolongada. Los pacientes cuyo tumor se tiñó 2+ para la expresión de EphB2 (frente a 0/1+) presentaron supervivencia global significativamente prolongada: la duración media de la supervivencia fue 2514 frente a 1044 días, la razón de riesgos 0,45, intervalos de confianza del 95%: 0,18-0,95 (Figura 11A). Se encontraron resultados similares en análisis de la supervivencia sin reaparición (supervivencia media 795 frente a 2233 días, HR 0,60, IC: 0,30-1,10) (Figura 11B). Las curvas de 35 supervivencia para pacientes que puntuaron 0 ó 1 fueron solapantes. Aunque la edad media fue significativamente inferior en pacientes con alta expresión de proteínas EphB2 (65 frente a 69,3 años, P < 0,02) (Tabla 3), la edad no fue un factor pronóstico en esta serie (datos no mostrados). No se observaron otras asociaciones estadísticamente significativas (Tabla 2), y no hubo diferencias en la frecuencia de terapia con adyuvante recibida por los dos grupos (datos no mostrados). El impacto de la supervivencia de las variables clinicopatológicas descritas en la Tabla 2 se ha

40 tratado previamente (Grabsch y col. Am J Clin Pathol 2004;122:511-6). En un análisis multifactorial, que incluye estadio, grado, invasión linfática e invasión de vasos sanguíneos, una puntuación de EphB2 de 2 fue un factor de pronóstico independiente significativo (HR 0,47, IC 0,18-0,99).

Tabla 3. Asociación de la expresión de EphB2 y variables clinicopatológicas en 327 pacientes con CCR 45

Variable n Puntuación de intensidad IHC de EphB2, n (%) P 2 0 ó 1

Edad Sexo Estadio de TNM

Media Masculino Femenino I II III IV 150 177 74 140 107 6 65 23 (56) 18(44) 14 (34) 14 (34) 12 (29) 1 (2) 69,3 127 (44) 159 (56) 60 (21) 126 (44) 95 (33) 5 (2) 0,02 0,22 0,28

Grado

1 2 3 4 4 247 74 2 31 (76) 10 (24) 4 (1) 216 (76) 64 (22) 2 (1) 0,82

Invasión linfática

Ausente Presente 238 89 28 (68) 13 (32) 210 (73) 76 (27) 0,62

Variable

n Puntuación d2 e intensidad IHC de EphB2, n (%) 0 ó 1 P

Invasión de vasos sanguíneos

Ausente

300 36 (88) 264 (92) 0,50

Presente

27 5 (12) 22 (8)

Sitio

Ciego, colon ascendente

109 16 (39) 93 (33) 0,16

y transverso

Colon descendente y

218 25 (61) 193 (67)

sigmoide, recto

[0192] Aunque la anterior invención se ha descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para los fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, que sólo está limitada por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

5 Listado de secuencias

[0193]

10 <110> Genentech, Inc.

<120> PROCEDIMIENTOS DE PRONÓSTICO, DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE CÁNCER

<130> P2201R1 15

<141> 05/01/2006

<150> US 60/642.164

<151> 06/01/2005 20

<160> 16

<210> 1

<211> 17 25 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT 35 <213> Mus musculus

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus 45

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<213> Mus musculus

<400> 8

<210> 9

<211>

1055 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211>

4641 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11 5 <211> 987

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211>

4737 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 986

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211>

3800 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 21

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 16

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para el pronóstico de cáncer en un sujeto humano diagnosticado con cáncer colorrectal, comprendiendo el procedimiento: (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra de tejido o célula colorrectal del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control; y (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a una muestra de control es pronóstica de duración elevada de la supervivencia o duración elevada de la supervivencia sin reaparición en el sujeto.

2. 2.

   Un procedimiento para la selección del tratamiento para cáncer colorrectal para un paciente humano, comprendiendo el procedimiento (a) comparar la expresión de EphB2 en una muestra de tejido o célula colorrectal del paciente con la expresión de EphB2 en una muestra de control; (b) predecir el pronóstico de cáncer del paciente basándose en la comparación en (a), en el que el aumento de la expresión de EphB2 en la muestra de paciente con respecto a la muestra de control es pronóstica de duración elevada de la supervivencia o duración elevada de la supervivencia sin reaparición en el sujeto; y (c) posterior a las etapas (a) y (b), seleccionar el tratamiento contra el cáncer para el paciente, en el que la selección del tratamiento se basa en el pronóstico del paciente determinado en la etapa (b).

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que se detecta la expresión del polinucleótido EphB2.

4. 4.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se detecta la expresión del polipéptido EphB2.

5. 5.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que se detecta la expresión de ARNm de EphB2.

6. 6.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando un agente anti-EphB2.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el agente anti-EphB2 es un anticuerpo.

8. 8.

   El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando inmunohistoquímica.

9. 9.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además detección de expresión de uno cualquiera o más ligandos de EphB2.

10. 10.

    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo anti-EphB2.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el inmunoconjugado comprende un maitansinoide.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el inmunoconjugado comprende MMAE.

13. 13.

    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende una cualquiera o más de quimioterapia, radiación y cirugía.

14. 14.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que se detecta la expresión del polinucleótido EphB2.

15. 15.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que se detecta la expresión del polipéptido EphB2.

16. 16.

    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que se detecta la expresión de ARNm de EphB2.

17. 17.

    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando un agente anti-EphB2.

18. 18.

    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el agente anti-EphB2 es un anticuerpo.

19. 19.

    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la expresión del polipéptido EphB2 se detecta usando inmunohistoquímica.

20. 20.

    Los procedimientos de cualquiera de las reivindicaciones 10-19, que comprenden además detección de la expresión de uno cualquiera o más ligandos de EphB2.

21. 21.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10-20, en el que el anticuerpo anti-EphB2 presente en el inmunoconjugado está seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento de anticuerpo.