BR112017012553B1 - Método de tratamento de um paciente que sofre de um câncer, método para o diagnóstico de um câncer, método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, método para determinar se um paciente com um câncer e método para otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM PACIENTE QUE SOFRE DE UM CÂNCER, MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO DE UM CÂNCER, MÉTODO PARA O PROGNÓSTICO DE UM PACIENTE QUE SOFRE DE CÂNCER, MÉTODO PARA DETERMINAR SE UM PACIENTE COM UM CÂNCER E MÉTODO PARA OTIMIZAR A EFICÁCIA TERAPÊUTICA DE UMA TERAPIA ANTICÂNCER. A invenção fornece métodos e composições para detectar a expressão de um ou mais biomarcadores, incluindo FGFR3, TP53, e/ou EGFR, para tratar, diagnosticar e proporcionar um prognóstico para o câncer, por exemplo, câncer de bexiga. A invenção também fornece kits e artigos de fabricação para uso nos métodos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a métodos para tratar, diagnosticar e proporcionar prognósticos para o câncer, por exemplo, o câncer de bexiga.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer continua sendo uma das ameaças mais mortais para a saúde humana. Nos Estados Unidos, o câncer afeta cerca de 1,3 milhão de novos pacientes a cada ano, e é a segunda principal causa de morte após uma doença cardíaca, representando aproximadamente 1 em cada 4 mortes. Tumores sólidos são responsáveis pela maioria dessas mortes. Tumores malignos sofrem metástase e crescem rapidamente de forma descontrolada, tornando a detecção e o tratamento oportunos extremamente difíceis.

[003] O câncer de bexiga é a quinta malignidade mais comum em todo o mundo, com cerca de 400.000 casos recentemente diagnosticados e aproximadamente 150.000 mortes associadas relatadas por ano. Aproximadamente 75-80% dos pacientes com câncer de bexiga apresentam câncer de bexiga não invasivo aos músculos (NMIBC) no momento do diagnóstico inicial. Embora confinados à lâmina própria e normalmente sem ameaça de vida, aproximadamente 50-80% dos NMIBCs recorrem, frequentemente requerendo dispendiosa intervenção clínica. NMIBCs podem progredir em cerca de 20-30% dos casos para o câncer de bexiga invasivo aos músculos mais sério (MIBC). Os MIBCs (T2 e T3) constituem apenas ~ 10 a 15% dos novos casos, mas conferem maior risco de desenvolver câncer de bexiga metastático (pT4). O câncer metastático de bexiga é associado uma triste probabilidade de sobrevivência de 5 anos e representa uma grande necessidade médica não satisfeita com poucas terapias eficazes até à data.

[004] Portanto, ainda há uma necessidade de meios eficazes para tratar, diagnosticar e proporcionar prognósticos para o câncer, por exemplo, o câncer de bexiga.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção refere-se a métodos para tratar, diagnosticar e proporcionar prognósticos para o câncer, por exemplo, o câncer de bexiga.

[006] Em um aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um paciente que sofre de um cancro de bexiga, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer, em que o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e EGFR, em uma amostra obtida do paciente foi determinada como sendo aumentada em relação a um nível de referência do pelo menos um gene.

[007] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para diagnosticar um câncer bexiga em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53 e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente tendo um câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (c) informar ao paciente que ele tem um câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (d) selecionar uma terapia anticâncer para o tratamento do referido paciente quando um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência é detectado. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (e) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente.

[008] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer de bexiga, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene; e (c) determinar um prognóstico ao paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que é aumentado em relação ao nível de referência. Em algumas modalidades, o prognóstico é um prognóstico de sobrevivência. Em algumas modalidades, o método é realizado antes da administração de uma terapia anticâncer ao paciente. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (d) identificar o paciente como suscetível a beneficiar da administração de uma terapia anticâncer quando o paciente é determinado como tendo um prognóstico ruim de sobrevivência. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (e) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente, se o paciente é determinado como tendo um prognóstico ruim de sobrevivência. Em algumas modalidades, a sobrevivência é a sobrevivência livre de doença ou sobrevivência global.

[009] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para determinar se um paciente com um câncer de bexiga é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53 e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene a um nível de referência do pelo menos um gene, em que um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento que compreende uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (c) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente.

[010] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer a um paciente que tem um câncer de bexiga, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53 e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene a um nível de referência do pelo menos um gene, em que um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento que compreende uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, o método compreende ainda (c) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente.

[011] Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método de tratamento de um paciente que sofre de um câncer de bexiga, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer diferente da vacina Bacillus Calmette-Guérin (BCG), em que o nível de expressão de TP53 em uma amostra obtida do paciente foi determinada como sendo aumentada em relação a um nível de referência de TP53.

[012] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima referidos, a terapia anticâncer inclui um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 e/ou um antagonista de EGFR. Em algumas modalidades, a terapia anticâncer inclui um antagonista de FGFR3 e um antagonista de EGFR. Em algumas modalidades, o antagonista de FGFR3, o antagonista de EGFR ou o antagonista de TP53 é um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de FGFR3 é um anticorpo anti-FGFR3, ou um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de EGFR é um anticorpo anti-EGFR, ou um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de TP53 é um anticorpo anti-TP53, ou um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o antagonista de FGFR3, o antagonista de TP53 ou antagonista de EGFR é um antagonista de molécula pequena. Em algumas modalidades, o antagonista de FGFR3 ou o antagonista de EGFR é um inibidor de tirosina cinase. Em algumas modalidades, o antagonista de EGFR é erlotinibe (TARCEVA™). Em algumas modalidades, a terapia anticâncer compreende ainda (i) um agente selecionado do grupo que consiste em um agente antineoplásico, um agente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento e um agente citotóxico, (ii) radioterapia ou (iii) uma combinação dos mesmos.

[013] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o nível de expressão do pelo menos um gene na amostra obtida do paciente é determinado medindo o mRNA. Em algumas modalidades, o nível de expressão do pelo menos um gene na amostra obtida do paciente é determinado por um ensaio de reação em cadeia com polimerase (PCR). Em algumas modalidades, o ensaio PCR é um ensaio PCR quantitativo.

[014] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o nível de expressão do pelo menos um gene na amostra obtida do paciente é determinado medindo a proteína. Em algumas modalidades, o nível de expressão do pelo menos um gene na amostra obtida do paciente é determinado por um método imuno-histoquímico (IHC).

[015] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, a amostra obtida do paciente é uma amostra de tumor. Em algumas modalidades, a amostra de tumor é uma amostra de tumor fixada em formalina embebida em parafina (FFPE).

[016] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o método compreende ainda a determinação do nível de expressão de pelo menos dois dos genes. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a determinação do nível de expressão de todos os três dos genes.

[017] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o nível de expressão de FGFR3 foi determinado para ser aumentado pelo menos 2 vezes em relação a um nível de referência. Em algumas modalidades, o nível de expressão de FGFR3 foi determinado para ser aumentado pelo menos 4 vezes em relação a um nível de referência.

[018] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o nível de expressão de EGFR foi determinado para ser aumentado pelo menos 4 vezes em relação a um nível de referência. Em algumas modalidades, o nível de expressão de EGFR foi determinado para ser aumentado pelo menos 8 vezes em relação a um nível de referência.

[019] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o método compreende ainda determinar o nível de expressão de pelo menos um gene adicional selecionado do grupo que consiste em: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9 e FGF2, em uma amostra obtida do paciente, em que o nível de expressão do pelo menos um gene adicional é alterado em relação a um nível de referência do pelo menos um gene adicional.

[020] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o câncer de bexiga é câncer de bexiga não invasivo aos músculos, câncer de bexiga invasivo aos músculos ou câncer de bexiga metastático. Em algumas modalidades, o câncer de bexiga não invasivo ao músculo é um câncer de bexiga não invasivo ao músculo recorrente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[021] A FIGURA 1 é uma tabela que mostra informações sobre os pacientes e recursos clinicopatológico das amostras de tumor de câncer de bexiga que foram analisadas na seção Exemplos (por exemplo, Exemplos 1-6).

[022] As FIGURAS 2A e 2B são gráficos que mostram a análise de componentes de princípio (PCA) na expressão de 18.000 genes de Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012 (Figura 2A) e utilizando apenas 82 genes que se sobrepõem com o painel de expressão do gene Fluidigm do câncer de bexiga personalizado descrito na seção de Exemplos (ver, por exemplo, Tabela 1) (Figura 2B). Ambas as análises mostram uma distribuição similar de amostras pertencentes aos subtipos de câncer de bexiga descritos por Sjodahl et al. (supra).

[023] As FIGURAS 2C e 2D são gráficos que mostram que a validação cruzada com um classificador baseado no centroide resulta em precisão semelhante de classificação dos subtipos de câncer de bexiga de Sjodahl et al. (supra) baseado em 1.000 genes (Figura 2C) e com base em 82 genes que se sobrepõem com o painel de expressão do gene Fluidigm de câncer de bexiga personalizado (Figura 2D). Os dados apresentados nas Figuras 2A- 2D mostram que o painel de expressão do gene Fluidigm do câncer de bexiga personalizado pode classificar com precisão o câncer de bexiga em subtipos molecularmente definidos. Os marcadores de linha são para maior clareza e não indicam pontos de dados.

[024] As FIGURAS 3A e 3B são gráficos que mostram que o desempenho do ensaio de Fluidigm não foi afetado pela quantidade de entrada de RNA, como mostrado por FGFR3 (Figura 3A) e para PIK3CA (Figura 3B) com quantidades decrescentes de entradas de controles universais de RNA (uRNA).

[025] As FIGURAS 3C e 3D são gráficos que mostram que a reprodutibilidade de dados de execução para execução do painel de expressão de gene Fluidigm de câncer de bexiga era alta para tecidos clínicos. A Figura 3C (HP-52719) e a Figura 3D (HP-50331) duas amostras representativas de RNA derivadas de fixada em formalina embebida em parafina (FFPE) que cada um mostra valores de R2de > 0,98 entre execuções de dias diferentes.

[026] A FIGURA 3E é um gráfico que mostra a elevada reprodutibilidade dos dados de chip a chip do painel de expressão do gene Fluidigm de câncer de bexiga personalizado.

[027] A FIGURA 4A é um mapa de calor de aglomerações de tecido transcricionalmente definidas da análise de Fluidigm (Tecidos) e grupos de genes corregulados (Genes). Os grupos de tecidos Verde, Amarelo e Vermelho continham a maioria das amostras.

[028] A FIGURA 4B é um gráfico que mostra que as aglomerações de tecidos Verde, Amarelo e Vermelho (ver, por exemplo, Figura 4A) estão associadas a probabilidades distintas de sobrevivência livre de doença (DFS). As amostras do grupo Vermelho apresentaram o melhor perfil de DFS (Vermelho vs. Amarelo: HR = 0,54, P = 0,03), e as amostras do grupo Verde foram associadas com as piores probabilidades de DFS (Vermelho vs. Verde: HR = 0,29, P = 0,004).

[029] A FIGURA 4C é um gráfico mostrando chamadas histológicas não invasivas e invasivas/metástases indicando que os grupos Verde e Vermelho incluíram uma frequência significativamente mais elevada de amostras não invasivas do que o grupo Amarelo, que incluía principalmente tecidos invasivos e todas as metástases (Verde vs. Vermelho: P = 0,1029, não significativo (NS); Verde vs. Amarelo e Vermelho vs. Amarelo: P <0,0001 para ambas as comparações).

[030] A FIGURA 4D é um gráfico que mostra a frequência de tumores com histologia micropapilar nas três aglomerações de tecido principais. Observou-se maior frequência de histologia micropapilar no grupo Amarelo (Verde vs. Vermelho: P = 0,2351, NS; Verde vs. Amarelo: P = 0,1167, NS; Vermelho vs. Amarelo: P = 0,0063).

[031] A FIGURA 4E é um gráfico que não mostra diferenças significativas entre os grupos Verde, Vermelho e Amarelo em relação à prevalência de amostras positivas de infiltração imune (Verde vs. Vermelho: P = 0,3332, NS; Verde vs. Amarelo: P = 0,5197, NS; Vermelho vs. Amarelo: P = 1, NS).

[032] A FIGURA 4F é um gráfico que mostra a distribuição de frequência de tratamento para os três grupos. O grupo Verde foi tratado com maior intensidade do que os grupos Vermelho e Amarelo (P <0,0001 para ambas as comparações), e os grupos Vermelho e Amarelo foram tratados a uma taxa comparável (P = 0,8836, NS). Os tratamentos incluíram vacina Bacillus Calmette-Guérin (BCG), quimioterapia, radiação ou combinações dos mesmos.

[033] A FIGURA 5A é um mapa de calor que mostra que a análise de expressão pelo painel de expressão do gene Fluidigm do câncer de bexiga personalizado descrito no Exemplo 2 identificou 3 subconjuntos principais de tecidos representados pelos grupos Verde, Amarelo e Vermelho e 2 subtipos menores representados pelos grupos Azul e Roxo.

[034] A FIGURA 5B é um mapa de calor mostrando que a análise de expressão pelo painel de expressão do gene Fluidigm do câncer de bexiga personalizado, tal como descrito no Exemplo 2 identificou 4 aglomerações de expressão de genes principais associados com diferentes biologias. As setas apontam genes representativos para cada aglomeração, incluindo TP53 e FGFR3 (aglomeração rosa I); genes de transição epitelial para mesenquimais como (EMT) ZEB1/2 e fosfoinosítido 3-cinase (PI3K), tais como PIK3CA e PIK3R1 (aglomeração azul claro II); outros genes PI3K, tais como PTEN e AKT 1 (aglomeração magenta III); e ligandos e receptores do fator de crescimento de fibroblasto (FGF) (aglomeração marrom claro IV).

[035] A FIGURA 5C é um gráfico que mostra que os subtipos de tecido descritos na Figura 5A foram associados com probabilidades de sobrevivência livre de doença (DFS) distintas. Os marcadores de linha são para maior clareza e não indicam pontos de dados.

[036] As FIGURAS 6A-6D são seções manchadas representativas de hematoxilina & eosina (H & E) apresentando características histológicas do câncer de bexiga não invasivo ao músculo (Figura 6A); (Figura 6B) câncer de bexiga invasivo ao músculo; (Figura 6C) tecido infiltrado linfoide positivo; e (Figura 6D) tumor de bexiga com histologia micropapilar. A barra de escala indica 100 μm.

[037] A FIGURA 7A é um estado de mutação do FGFR3 apresentando mapa de cores, imuno-histoquímica de FGFR3 (IHC), e chamadas de histopatologia para as amostras dos grupos, Verde, Vermelho e Amarelo.

[038] A FIGURA 7B é um gráfico que mostra que os níveis de transcrição de FGFR3 eram superiores em mutante (MT), em comparação com amostras de tipo selvagem (WT) (P < 0,0001) conforme determinado pela análise de expressão de gene Fluidigm.

[039] A FIGURA 7C é um gráfico que mostra que as amostras de mutante de FGFR3 expressaram níveis mais elevados da proteína do que os tecidos de tipo selvagem, como medido por IHC (P <0,0001).

[040] A FIGURA 7D é um gráfico que mostra que a taxa de mutação de FGFR3 foi significativamente maior no grupo Verde, em comparação com os grupos Vermelho e Amarelo invasivo/metastático (P < 0,0001 para ambas as comparações).

[041] A FIGURA 7E é um gráfico que mostra que as amostras no grupo verde expressaram níveis de transcrição de FGFR3 significativamente mais elevados do que as amostras dos grupos vermelho e amarelo (P < 0,0001 para ambas as comparações).

[042] A FIGURA 7F é um gráfico que mostra que os níveis de proteína FGFR3 por IHC foram maiores no grupo Verde do que no grupo Vermelho e foram os mais baixos no grupo Amarelo (Verde vs. Vermelho: P = 0. 0343; Vermelhos vs. Amarelo: P < 0,0001).

[043] A FIGURA 7G é uma série de gráficos de pizza que mostra que a expressão de FGFR3 em metástases de câncer de bexiga, não invasivas e invasivas. Níveis elevados de FGFR3 (IHC 2 +/3+) foram observados em 66%, 32% e 33% dos casos, respectivamente.

[044] A FIGURA 7H é uma série de gráficos que mostram as taxas de DFS de 3 ou 5 anos para pacientes com tumores invasivos FGFR3 elevado e baixo e metástases do câncer de bexiga, demonstrando taxas mais baixas de DFS em tumores de alta expressão em ambos os contextos (corte de expressão = 50 percentil).

[045] A FIGURA 7I é uma série de gráficos que mostram que as taxas de sobrevivência global (OS) aos 3 e 5 anos são mais baixas para os casos de FGFR3-alto versus baixo-expressando (corte de expressão = 25o percentil, FGFR3 alto, N = 15, FGFR3 baixo, N = 24).

[046] A FIGURA 7J figura mostra uma análise de um conjunto de dados publicamente disponíveis de Kim et al. Mol. Cancer 9: 3, 2010, indicando um perfil significativamente mais grave de OS para pacientes com câncer avançado de bexiga que expressam níveis elevados ("hi") versus níveis baixos ("lo") de FGFR3 por ambos os gráficos de Kaplan-Meier (painel esquerdo) e pela taxa de OS de 3 e 5 anos (painel direito) (corte de expressão = percentil 75o, FGFR3 elevado, N = 10, FGFR3 baixo, N = 52).

[047] A FIGURA 8 é um gráfico que mostra que a análise do software INGENUITY® (Qiagen, Redwood City, CA) identificou as vias p53, PI3K-AKT, EMT e ERBB e FGFR3 como expressas diferencialmente entre o grupo Verde não invasivo de rápida recuperação e o Grupo vermelho menos agressivo. Os genes de 45/96, que foram significativamente diferencialmente expressos entre os grupos Verde e Vermelho (P < 0,05, com múltiplos testes corretos) foram usados como entradas para a análise.

[048] A FIGURA 9A é um mapa de cores dos resultados da sequenciação de nova geração (NGS) e do estado de mutação como determinado por análise de Fluidigm (MutMap, ver Schleifman et al. PloS One 9: e90761, 2014) em amostras dos grupos Verde, Amarelo e Vermelho. As mutações validadas foram aquelas identificadas por NGS e MutMap.

[049] A FIGURA 9B é um diagrama esquemático (diagrama de pirulito) do gene TP53 que mostra as mutações de TP53 identificadas por NGS em amostras para os grupos Verde, Vermelho e Amarelo. Caixas coloridas indicam atribuição de grupos de tecido. Caixas com números semelhantes apontam para mutações codetectadas nas mesmas amostras. A maioria das mutações se aglomera no domínio de ligação ao DNA e não se sobrepõem.

[050] A FIGURA 9C é um gráfico que mostra que havia uma taxa significativamente maior de mutação TP53 no grupo Verde de rápida recorrência em relação ao grupo Vermelho mais benigno (P = 0,03). As frequências de mutação de TP53 não foram significativamente diferentes entre os grupos Vermelho e Amarelo ou Verde e Amarelo (P = 0,1227, NS e P = 0,3605, NS).

[051] A FIGURA. 9D é um gráfico que mostra que os níveis de expressão de TP53 foram maiores no grupo Verde em relação aos grupos Vermelho e Amarelo, conforme determinado pela análise de expressão do gene Fluidigm (P = 0,0187 e P = 0,0020, respectivamente).

[052] A FIGURA 9E é um gráfico que mostra que os níveis de expressão do alvo de transcrição TP53 p21 foram significativamente mais elevados no grupo Verde comparado com os grupos Vermelho e Amarelo (P <0,0001 para ambas as comparações), como determinado pela análise de expressão do gene Fluidigm.

[053] A FIGURA 9F é um gráfico que mostra que as amostras do mutante de TP53 expressaram níveis mais elevados de proteína TP53 do que os casos de tipo selvagem (P = 0,0201), conforme determinado por IHC.

[054] A FIGURA 9G é um gráfico de Kaplan-Meier que mostra perfis de DFS semelhantes para casos de TP53 elevado e baixo da coorte global de câncer da bexiga descrito no Exemplo 1 (todos os estágios de tumores, P = 0,4218; TP53 elevado N = 53; TP53 baixo N = 73). Hi, elevado; Lo, baixo.

[055] A FIGURA 9H é um gráfico de Kaplan-Meier que mostra que em tumores não invasivos, a expressão de TP53 elevado está associada a uma tendência para uma probabilidade de DFS mais grave (HR = 1,99; P = 0,1292).

[056] A FIGURA 9I é um gráfico de Kaplan-Meier que mostra que no ajuste do tumor não invasivo, a expressão de TP53 elevado está ligada à probabilidades de DFS significativamente mais grave em pacientes tratados com BCG (HR = 4,2; P = 0,0405).

[057] A FIGURA 9J é um gráfico de Kaplan-Meier que mostra que a expressão de TP53 elevado em tumores não invasivos não está associada a probabilidades de DFS mais grave para pacientes que não receberam tratamento (HR = 0,57; P = 0,5749).

[058] A FIGURA 10 é um mapa de cores da análise de Fluidigm de ligandos de via de ERBB e expressão de receptor em um subconjunto de amostras de câncer de bexiga e alterações de mutação e número de cópias sobrepostas em vias-chave nas mesmas amostras. A análise de expressão de receptores ERBB e ligando, a análise mutacional e a análise de número de cópias foi realizada em painéis Fluidigm personalizados (Schleifman et al. PloS One 9: e90761, 2014). Para análise da mutação de Fluidigm: barra cinza escuro, mutante; barra cinza médio; nenhuma chamada devido a razões técnicas; barra branca, não aplicável; barra cinza claro, tipo selvagem. Para a análise do número de cópias do DNA de Fluidigm: barra cinza escuro, ganho do número da cópia de DNA; barra cinza médio, nenhuma chamada devido a razões técnicas; barra cinza claro, nenhuma mudança do número da cópia do DNA; barra branca, não aplicável.

[059] A FIGURA 11A é um gráfico que mostra que EGFR foi expresso em níveis significativamente mais elevados no grupo Verde, em comparação com os grupos Vermelho e Amarelo, conforme determinado por Fluidigm (P = 0,012 e P = 0,0012, respectivamente).

[060] A FIGURA 11B é um gráfico que mostra que nos tumores de câncer de bexiga não invasivos, níveis de expressão de EGFR elevado foram associados com taxas de DFS de 3 e 5 anos reduzidas (expressão de corte = 25o percentil, EGFR elevado, N = 22, EGFR baixo, N = 66).

[061] A FIGURA 11C é um gráfico que mostra que níveis de expressão de EGFR elevado foram associados com uma taxa de DFS reduzida para pacientes com metástases de câncer de bexiga (corte de expressão = 25o percentil, EGFR elevado, N = 6, EGFR baixo, N = 4).

[062] A FIGURA 11D é um gráfico que mostra que em pacientes com metástases de câncer de bexiga, níveis de expressão de EGFR elevado foram associados com taxas de OS de 3 e 5 anos mais baixas (corte de expressão = 50o percentil, EGFR elevado, N = 3, EGFR baixo, N = 7).

[063] A FIGURA 11E é um gráfico que mostra uma análise de um conjunto de dados independentes de Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012. O gráfico mostra que a expressão de EGFR elevado foi associada a piores frequências de OS de 3 e 5 anos (corte de expressão = 50o percentil, EGFR elevado, N = 23, EGFR baixo, N = 28).

[064] A FIGURA 11F é um gráfico que mostra uma análise de um conjunto de dados independentes de Kim et al. Mol. Cancer 9: 3, 2010. O gráfico mostra que a expressão de EGFR elevado está associada a uma taxa mais baixa de OS de 3 e 5 anos (expressão de corte = 25o percentil, EGFR elevado N = 48, EGFR baixo N = 14).

[065] A FIGURA 11G é um gráfico que mostra que o tratamento de linhagens celulares de câncer de bexiga com o inibidor de EGFR erlotinibe (TARCEVA™) identificou três linhagens celulares sensíveis que exibem >25% de inibição de crescimento (GI) (UMUC5, UMUC10 e UMUC17) e quatro linhagens celulares que exibem <25% de GI em resposta ao tratamento (RT112, UMUC3, SW780 e BFTC905).

[066] A FIGURA 11H é um gráfico que mostra que o EGFR é expresso em níveis significativamente mais elevados nas linhagens celulares de câncer de bexiga que são sensíveis ao erlotinibe (TARCEVA™) (> 25% GI) do que nas linhagens celulares que exibem GI mínimo em resposta ao tratamento (P = 0,0106) .

[067] A FIGURA 12A é um diagrama de Venn que mostra genes compreendendo o painel de expressão do gene Fluidigm de câncer da bexiga personalizado descrito no Exemplo 1 (por exemplo, Tabela 1) ilustrando genes sobrepostos e únicos pertencentes a três grupos de vias principais com base na análise INGENUITY®: (1) vias FGFR, RTK, MAPK e PI3K; (2) desenvolvimento e eixos de transição epitelial para mesenquimal (EMT); e (3) TP53, estabilidade do genoma e redes de regulação do ciclo celular. Os números correspondem ao número de genes únicos em cada porção do diagrama de Venn.

[068] A FIGURA 12B é um gráfico que mostra os resultados de aglomeração hierárquica não supervisionada de amostras de um grande conjunto de dados públicos e grau de tumor, fase e classe molecular correspondente, tal como definido por Sjodahl et al. supra.

[069] A FIGURA 12C é uma série de gráficos que mostram curvas de erros de classificação errada validadas de forma cruzada para tumores de Sjodahl et al. (supra) com base no número decrescente de sondas Illumina em comparação com as sondas correspondentes ao painel personalizado de expressão do gene Fluidigm. Cada gráfico mostra a quantidade de erro de classificação cometida ao tentar predizer o grau de tumor, o estágio de TNM ou a classe molecular usando um classificador de centroide encolhido mais próximo com um subconjunto dos genes totais. O número de genes é mostrado ao longo do eixo x superior com o correspondente "fator de contração" mostrado no eixo x inferior.

[070] A FIGURA 12D é uma série de gráficos que mostram aglomeração hierárquica não supervisionada de amostras de quatro conjuntos de dados públicos baseados nos sinais de sondas correspondentes a genes do painel de expressão de gene Fluidigm de câncer de bexiga personalizado e estado basal/luminal publicado correspondente (Damrauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 111: 3110-3115, 2014).

[071] A FIGURA 13A é uma série de gráficos que mostram o desempenho linear de seis ensaios representativos e os seus valores de CT brutos em relação ao aumento de quantidades de entrada de controles de RNA universal (uRNA).

[072] A FIGURA 13B é uma série de gráficos que mostram a reprodutibilidade dos dados de execução para execução para tecidos de FFPE arquivadores, tal como observado para duas amostras de RNA representativas derivadas de FFPE executadas em dias diferentes.

[073] A FIGURA 14A é um mapa de calor que mostra os resultados de aglomeração não supervisionada de genes e amostras de conjuntos de dados públicos, bem como NMIBCs, MIBCs e metastases (METs) da coorte de tecido FFPE de câncer de bexiga descrito no Exemplo 1 e na Figura 1. Os blocos brancos representam genes que não são encontrados nos respectivos conjuntos de dados.

[074] A FIGURA 14B é um gráfico que mostra o perfil basal (barras vermelhas) e o perfil luminal (barras azuis) para os genes de painel de câncer de bexiga calculados a partir das amostras de descoberta de Damrauer et al. (supra). A centralização média e a normalização da variância unitária foram aplicadas aos valores de expressão transformados em log e os níveis de expressão normalizados de log foram calculados independentemente para os grupos de amostra basal e luminal para formar os perfis finais.

[075] A FIGURA 14C é um diagrama que mostra a metodologia utilizada para computar assinaturas basais/luminais a partir de dados públicos e depois aplicando estas assinaturas a dados de painel de bexiga para medir a semelhança basal/luminal de amostras.

[076] A FIGURA 15A mostra os resultados de aglomeração hierárquica não supervisionada (média de ligação, 1 - métrica de distância de correlação de Pearson) de 204 amostras de FFPE (ver Exemplo 1 e Figura 1) com base na expressão genética do painel de câncer de bexiga e nas correspondentes pontuações B/L, histologia e estado de mutação de genes relevantes para o câncer. Consulte o Exemplo 6 para obter detalhes adicionais.

[077] As FIGURAS 15B-15E são gráficos que mostram a análise estatística das pontuações B/L (Figura 15B), a distribuição de NMIBCs, MIBCs e METs (Figura 15C), a prevalência de mutações FGFR3 (Figura 15D) e FGFR3 IHC (Figura 15E) em amostras das aglomerações luminal e basal definidas transcricionalmente na Figura 15A.

[078] A FIGURA 15F mostra os índices de ativação da via INGENUITY® com base na expressão de genes que foram significativamente expressos diferencialmente entre as amostras luminal e basal na Figura 15A.

[079] A FIGURA 16A é um gráfico que mostra um gráfico de correlação entre as pontuações B/L em tumores primários (eixo X) e pontuações B/L correspondentes em metástases correspondentes (eixo Y) dos mesmos pacientes. A cor do ponto reflete a significância das amostras que estão sendo combinadas ao mesmo paciente com base na genotipagem SNP. Log10 (valor p) = -4 (P = 0,0001), Log10 (valor p) = -3 (P = 0,001) e Log10 (valor p) de -2 (P = 0,01). As linhas pontilhadas representam o intervalo de confiança de 95% para além do qual as metástases e as pontuações B/L da amostra primária são diferentes para um valor de p de 0,05.

[080] A FIGURA 16B é uma tabela que mostra a pontuação B/L de tumores primários ("pri"), metástases correspondentes ("met") e valores p correspondentes para divergência no estado B/L nos pares correspondentes.

[081] As FIGURAS 17A e 17B são diagramas que representam os resultados da análise de INGENUITY® mostrando a ativação preditiva do receptor de estrogênio em amostras luminais em comparação com amostras basais com base em genes expressos de forma significativamente diferencial entre os dois grupos em tecidos de FFPE.

[082] A FIGURA 18 é uma matriz de correlação de Pearson utilizando dados de AMPLISEQ™ de sequenciação de nova geração (NGS) comparando a frequência de alelos em todos os locais variantes com pelo menos 100x de cobertura de leitura e frequência > 10% (em média, 120 locais foram comparados entre quaisquer duas amostras).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO I. INTRODUÇÃO

[083] A presente invenção proporciona métodos terapêuticos, de diagnóstico e prognósticos e composições para o câncer, por exemplo, câncer de bexiga. A invenção baseia-se na descoberta de que a determinação dos níveis de expressão (por exemplo, um nível de expressão alterado em relação a uma amostra de referência) de pelo menos um dos genes apresentados na Tabela 1, incluindo FGFR3, TP53, e/ou EGFR, é útil para tratar um paciente que sofre de câncer, para diagnosticar um paciente que sofra de câncer, para determinar um prognóstico de um paciente que sofre de um câncer, para determinar se um paciente tendo câncer é provável de responder ao tratamento com uma terapia anticâncer e/ou para otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer para um paciente com câncer. Em algumas modalidades, uma terapia anticâncer pode então ser selecionada para o paciente e, adicionalmente, uma terapia anticâncer pode opcionalmente ser administrada ao paciente.

II. DEFINIÇÕES

[084] Os termos "nível de expressão" ou "nível" são usados permutavelmente e referem-se geralmente à quantidade de um polinucleotídeo (por exemplo, um RNA mensageiro (mRNA)) ou um produto ou proteína de aminoácido em uma amostra biológica. "Expressão" geralmente refere-se ao processo pelo qual a informação codificada do gene é convertida nas estruturas presentes e que operam na célula. Portanto, de acordo com a invenção, a "expressão" de um gene pode referir-se à transcrição em um polinucleotídeo (por exemplo, um mRNA), tradução em um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína) ou mesmo modificação pós-tradução do polipeptídeo. Os fragmentos do polinucleotídeo transcrito, do polipeptídeo traduzido ou do polipeptídeo modificado pós-tradução também devem ser considerados expressos quer sejam originados de uma transcrição gerada por junção alternativa ou por uma transcrição degradada, quer a partir de um processamento pós-tradução da proteína, por exemplo, por proteólise. Os "genes expressos" incluem aqueles que são transcritos em um polinucleotídeo como mRNA e depois traduzidos em uma proteína, e também aqueles que são transcritos em RNA, mas não traduzidos em uma proteína (por exemplo, RNAs de transferência e ribossômicos).

[085] Os termos "marcador" e "biomarcador" são aqui utilizados permutavelmente para se referirem a um marcador molecular baseado em DNA, RNA, proteína, carboidrato ou glicolipídeo, cuja expressão ou presença na amostra de um indivíduo ou do paciente pode ser detectada por métodos convencionais (ou métodos aqui divulgados) e é útil, por exemplo, para diagnosticar um câncer de bexiga em um paciente, para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer de bexiga, determinar se um paciente com um câncer de bexiga é suscetível de responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, otimizando a eficácia terapêutica de um paciente com câncer com um câncer de bexiga, e/ou em métodos terapêuticos que envolvem a determinação do nível de expressão de um tal marcador. Tais biomarcadores incluem, mas não estão limitados a, os genes apresentados na Tabela 1. Em algumas modalidades, o gene pode ser um ou mais de FGFR3, TP53, e EGFR. Em algumas modalidades, o gene é FGFR3. Em algumas modalidades, o gene é TP53. Em algumas modalidades, o gene é EGFR. Em outras modalidades, o(s) gene(s) pode(m) ser selecionado de DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9 ou FGF2. A expressão de um tal biomarcador pode ser determinada como sendo mais elevada ou mais baixa em uma amostra obtida de um paciente do que um nível de referência. Os indivíduos com um nível de expressão que é superior ou inferior ao nível de expressão de referência de pelo menos um gene podem ser identificados como sujeitos/pacientes que sofrem de câncer de bexiga, como pacientes com um prognóstico particular (por exemplo, prognóstico ruim), ou como alguém que é suscetível de responder ao tratamento com uma terapia anticâncer.

[086] Em certas modalidades, o termo "nível de referência" refere- se aqui a um valor predeterminado. Como o versado na técnica irá apreciar, o nível de referência é predeterminado e ajustado para satisfazer os requisitos em termos de, por exemplo, especificidade e/ou sensibilidade. Estes requisitos podem variar, por exemplo, de corpo regulador a corpo regulador. Pode ser, por exemplo, que a sensibilidade ou especificidade de ensaio, respectivamente, tenha que ser ajustada para certos limites, por exemplo, 80%, 90%, 95% ou 99%. Estes requisitos também podem ser definidos em termos de valores preditivos positivos ou negativos. No entanto, com base nos ensinamentos apresentados na presente invenção, será sempre possível chegar ao nível de referência que satisfaça esses requisitos. Em uma modalidade, o nível de referência é determinado em indivíduos saudáveis. O nível de referência em uma modalidade foi predeterminado na entidade patológica a qual o paciente pertence (por exemplo, um tipo de câncer, tal como câncer de bexiga, ou um subtipo de um câncer de bexiga). Em certas modalidades, o nível de referência pode ser ajustado para qualquer percentil entre o 20o e 95o percentil (por exemplo, o 20o, 25o, 30o, 35o, 40o, 45o, 50o, 55o, 60o, 65o, 70o, 75o, 80o, 85o, 90o, ou 95o percentil) da distribuição global dos valores em uma entidade patológica investigada. Em modalidades particulares, o nível de referência é definido como o 25o percentil da distribuição total dos valores em uma entidade patológica investigada. Em outras modalidades particulares, o nível de referência é ajustado para o 50o percentil da distribuição global dos valores em uma entidade patológica investigada. Em outras modalidades, o nível de referência pode ser ajustado para, por exemplo, a mediana, tertis, quartis ou quintis como determinado a partir da distribuição global dos valores em uma entidade patológica investigada ou em uma dada população. Em outras modalidades, o nível de referência pode ser ajustado para, por exemplo, a média, tal como determinado a partir da distribuição global dos valores em uma entidade patológica investigada ou em uma dada população.

[087] Em certas modalidades, o termo "aumento" ou "acima" refere-se a um nível no nível de referência ou a um aumento global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes ou mais, no nível de um marcador (por exemplo, FGFR3, TP53, ou EGFR) detectado pelos métodos aqui descritos, em comparação com o nível de uma amostra de referência.

[088] Em certas modalidades, o termo "diminuição" ou "abaixo" refere-se a um nível abaixo do nível de referência ou a uma redução global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60% %, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, no nível de um marcador (por exemplo, FGFR3, TP53, ou EGFR) detectado pelos métodos aqui descritos, em comparação com o nível de uma amostra de referência.

[089] Em certas modalidades, o termo "a um nível de referência" refere-se a um nível de um marcador (por exemplo, FGFR3, TP53, e/ou EGFR) que é o mesmo que o nível, detectado pelos métodos aqui descritos, a partir de uma amostra de referência.

[090] O termo "diagnóstico" é aqui utilizado para se referir à identificação e classificação de um estado molecular ou patológico, doença ou condição (por exemplo, câncer, incluindo câncer de bexiga). Por exemplo, "diagnóstico" pode referir-se à identificação de um tipo particular de câncer. "Diagnóstico" também pode referir-se à classificação de um subtipo particular de câncer, por exemplo, por critérios histopatológicos, ou por características moleculares (por exemplo, um subtipo caracterizado pela expressão de um ou uma combinação dos biomarcadores (por exemplo, genes específicos ou proteínas codificadas pelos referidos genes)). Em algumas modalidades, um subtipo de câncer pode ser um câncer de bexiga não invasivo ao músculo (NMIBC, T0, T1), um câncer de bexiga invasivo ao músculo (MIBC, T2, T3) ou um câncer de bexiga metastático.

[091] Uma "resposta" de um paciente ou "responsividade" de um paciente ao tratamento ou terapia, por exemplo, tratamento compreendendo uma quantidade eficaz de uma terapia anticâncer (por exemplo, uma terapia anticâncer compreendendo um antagonista de FGFR3 um antagonista de TP53, e/ou um antagonista de EGFR), refere-se ao benefício clínico ou terapêutico conferido a um paciente em risco ou tendo um câncer (por exemplo, um câncer de bexiga) a partir ou como resultado do tratamento. Tal benefício pode incluir respostas celulares ou biológicas, uma resposta completa, uma resposta parcial, uma doença estável (sem progressão ou recaída) ou uma resposta com uma recaída posterior do paciente ou como resultado do tratamento com o antagonista. Um versado na técnica estará prontamente em posição para determinar se um paciente é responsivo. Por exemplo, no que diz respeito ao câncer de bexiga, uma resposta pode ser refletida por diminuição do sofrimento do câncer de bexiga, tal como um crescimento tumoral diminuído e/ou interrompido, redução do tamanho de um tumor e/ou melhoria de um ou mais sintomas de câncer de bexiga, por exemplo, sangue na urina (hematúria), alterações na micção, outros sintomas urinários, dor nas costas ou dor pélvica. Em algumas modalidades, a resposta pode ser refletida por índices diminuídos ou reduzidos da conversão metastática do câncer ou índices do câncer, por exemplo, a prevenção da formação de metástases ou uma redução do número ou tamanho de metástases. Por exemplo, uma resposta pode reduzir o tamanho do tumor, a sobrevivência livre de doença, a sobrevivência livre de progressão ou a sobrevivência global em um paciente diagnosticado como expressando níveis aumentados ou diminuídos de um ou mais dos biomarcadores apresentados na Tabela 1 (por exemplo, FGFR3, TP53, e EGFR) em relação a um nível de referência.

[092] Os termos "amostra" e "amostra biológica" são utilizados permutavelmente para referir-se a qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo incluindo fluidos corporais, tecido corporal (por exemplo, tecido tumoral), células ou outras fontes. Os fluidos corporais são, por exemplo, linfa, soro, sangue fresco total, células mononucleares de sangue periférico, sangue total congelado, plasma (incluindo fresco ou congelado), urina, saliva, sêmen, líquido sinovial e fluido espinal. As amostras também incluem tecido mamário, tecido renal, tecido colônico, tecido cerebral, tecido muscular, tecido sinovial, pele, folículo piloso, medula óssea e tecido tumoral. Métodos para obtenção de biópsias de tecidos e fluidos corporais de mamíferos são bem conhecidos na técnica.

[093] Uma “amostra de tumor” aqui é uma amostra derivada de, ou compreendendo células tumorais a partir de, um tumor de um paciente. Exemplos de amostras biológicas aqui incluem, mas não estão limitados a, biópsias tumorais, células tumorais, soro ou plasma circulantes, proteínas plasmáticas circulantes, líquido ascítico, culturas de células primárias ou linhagens celulares derivadas de tumores ou apresentando propriedades semelhantes a tumores, bem como amostras de tumor conservadas, tal como, amostras de tumores fixadas com formalina embebidas em parafina ou amostras de tumor congeladas.

[094] Um "antagonista" (permutavelmente denominado "inibidor") de um polipeptídeo de interesse é um agente que interfere na ativação ou na função do polipeptídeo de interesse, por exemplo, bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma atividade biológica mediada por um polipeptídeo de interesse. Por exemplo, um antagonista do polipeptídeo X refere-se a qualquer molécula que bloqueia, inibe ou neutraliza parcial ou totalmente uma atividade biológica mediada pelo polipeptídeo X. Exemplos de inibidores incluem anticorpos; anticorpos de ligando; antagonistas de pequenas moléculas; moléculas antissentido e inibidoras de RNA (por exemplo, shRNA). De preferência, o inibidor é um anticorpo ou molécula pequena que se liga ao polipeptídeo de interesse. Em uma modalidade particular, um inibidor tem uma afinidade de ligação (constante de dissociação) ao polipeptídeo de interesse de cerca de 1000 nM ou menos. Em uma outra modalidade, um inibidor tem uma afinidade de ligação ao polipeptídeo de interesse de cerca de 100 nM ou menos. Em uma outra modalidade, um inibidor tem uma afinidade de ligação ao polipeptídeo de interesse de cerca de 50 nM ou menos. Em uma modalidade particular, um inibidor está covalentemente ligado ao polipeptídeo de interesse. Em uma modalidade particular, um inibidor inibe a sinalização do polipeptídeo de interesse com metade da concentração inibidora máxima (IC50) de 1. 000 nM ou menos. Em uma outra modalidade, um inibidor inibe a sinalização do polipeptídeo de interesse com uma IC50 de 500 nM ou menos. Em uma outra modalidade, um inibidor inibe a sinalização do polipeptídeo de interesse com uma IC50 de 50 nM ou menos. Em certas modalidades, o antagonista reduz ou inibe, em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais, o nível de expressão ou a atividade biológica do polipeptídeo de interesse. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de interesse é FGFR3 ou um ligando de FGFR3. Em algumas modalidades, o polipéptido de interesse é EGFR ou um ligando de FGFR3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de interesse é TP53.

[095] O termo "polipeptídeo", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer polipeptídeo nativo (por exemplo, proteína) de interesse de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplos, seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). O termo engloba polipeptídeo não processado de "comprimento completo", bem como qualquer forma do polipeptídeo que resulte do processamento na célula. O termo engloba também variantes de ocorrência natural do polipeptídeo, por exemplo, variantes de junção ou variantes alélicas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é FGFR3. Em outras modalidades, o polipeptídeo é TP53. Em outras modalidades, o polipeptídeo é EGFR.

[096] "Polinucleotídeo", ou "ácido nucleico", tal como aqui utilizados permutavelmente, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos ou qualquer substrato que pode ser incorporado a um polímero por DNA ou RNA polimerase ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se estiver presente, a modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado após a síntese, tal como por conjugação com um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídicas, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas que contêm porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina etc. (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas que contêm alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, alfa-anomérico ácidos nucleicos, etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxil geralmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados com suportes sólidos ou semissólidos. O OH terminal 3'e 5' pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou grupos orgânicos de grupo de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono. Outros hidroxis também podem ser derivatizados em grupos protetores padrão. Os polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carboxílico, açúcares α- anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos, e análogos de nucleosídeo abásico tal como ribosídeo de metil. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquil (1-20 C) substituído ou não substitituído opcionalmente contendo uma ligação de éter (O-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior aplica-se a todos os polinucleotídos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.

[097] O termo "molécula pequena" refere-se a qualquer molécula com um peso molecular de cerca de 2000 daltons ou menos, preferencialmente de cerca de 500 daltons ou menos.

[098] O termo "anticorpo" é usado aqui no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo incluindo, mas não limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, contanto que eles exibam a atividade desejada da ligação do antígeno.

[099] Os termos "anticorpo antipolipeptídeo de interesse" e "um anticorpo que se liga a" um polipeptideo de interesse referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a um polipeptídeo de interesse com afinidade suficiente de tal modo que o anticorpo seja útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico em direcionar um polipeptídeo de interesse. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo antipolipeptídeo de interesse a uma proteína não relacionada com o polipeptídeo de interesse é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a um polipeptídeo de interesse medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um polipeptídeo tem uma constante de dissociação (Kd) de < 1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0. 01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas modalidades, um anticorpo antipolipeptídeo de interesse liga-se a um epítopo de um polipeptídeo de interesse que é conservado entre polipepídeo de interesse de espécies diferentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de interesse é FGFR3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de interesse é EGFR. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de interesse é TP53.

[0100] Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que liga. Os anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancial ou completamente a atividade biológica do antígeno.

[0101] "Afinidade" refere-se à força do total da soma de interações não-covalentes entre um sítio de ligação único de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e de seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos aqui.

[0102] Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma parte de um anticorpo intacto e que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Um "fragmento funcional" é um fragmento de anticorpo que mantém uma função do anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos.

[0103] O termo anticorpo "quimérico" refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[0104] Os termos “anticorpo de comprimento completo”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são usados aqui permutavelmente para se referir a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc, conforme definido aqui.

[0105] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou originados durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como a exigência da produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fago, e métodos que utilizam animais transgênicos que contêm todos ou parte dos loci da imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplificativos para produzir anticorpos monoclonais sendo descritos aqui.

[0106] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde a de um anticorpo produzido por um humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpo humano ou outras sequências de codificação de anticorpo humano. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação a antígeno não humanos.

[0107] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de regiões hipervariáveis não humanas (HVRs) e resíduos de aminoácidos de regiões estruturais humanas (FRs). Em determinadas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, regiões de determinação de complementaridade (CDRs)) correspondem àquelas de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, se refere a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[0108] Um "imunoconjugado" é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas, incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.

[0109] Os termos "receptor de fator de crescimento de fibroblasto 3" e "FGFR3", tal como aqui utilizados, referem-se a qualquer FGFR3 nativo de qualquer fonte vertebrada, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). O termo engloba FGFR3 não processado de "comprimento completo", bem como qualquer forma de FGFR3 que resulte do processamento na célula. O termo engloba também variantes de ocorrência natural do FGFR3, por exemplo, variantes de junção ou variantes alélicas. Uma sequência exemplificativa de tipo selvagem de polipeptídeo FGFR3 humano compreende a sequência de aminoácidos da base de dados UniProt de P22607-1 ou P22607-2.

[0110] Tal como aqui utilizado, o termo "antagonista de FGFR3" e "inibidor de FGFR3" refere-se a qualquer antagonista de FGFR3 que é atualmente conhecido na técnica ou que será identificado no futuro e inclui qualquer entidade química que, após administração a um paciente, resulte na inibição de uma atividade biológica associada com a ativação de FGFR3 no paciente, incluindo qualquer dos efeitos biológicos a jusante que de outro modo resultantes da ligação a FGFR3 do seu ligando natural. Tais antagonistas de FGFR3 incluem qualquer agente que possa bloquear a ativação de FGFR3 ou qualquer dos efeitos biológicos a jusante da ativação de FGFR3 que são relevantes para o tratamento de câncer em um paciente. Tal antagonista pode agir ligando diretamente ao domínio intracelular do receptor e inibindo a atividade da cinase. Alternativamente, tal antagonista pode agir, ocupando o sítio de ligação do ligante ou uma porção o mesmo do receptor FGFR3, tornando assim o receptor inacessível ao seu ligado natural para que a sua atividade biológica normal seja evitada ou reduzida. Alternativamente, tal antagonista pode agir modulando a dimerização de polipeptídeos FGFR3, ou a interação do polipeptídeo FGFR3 com outras proteínas ou potencializar a ubiquitinação e a degradação endocitótica do FGFR3. Os antagonistas de FGFR3 incluem, mas não estão limitados a, inibidores de moléculas pequenas, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, construtos antissentido, RNAs inibidores pequenos (isto é, interferência e RNA por dsRNA; RNAi), e ribozimas. Em uma modalidade preferida, o antagonista de FGFR3 é uma molécula pequena ou um anticorpo que se liga especificamente a FGFR3 humano. Anticorpos antagonistas de FGFR3 exemplificativos são descritos, por exemplo, naPatente US8. 410. 250, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Por exemplo, aPatente US8. 410. 250 descreve os clones de anticorpo antagonista de FGFR3 184,6, 184,6,1 e 184,6,1N54S (estes clones são também referidos como "R3 Mab").

[0111] Os termos "receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)", "ErbB1", "HER1" e "EGFR cinase" são aqui utilizados permutavelmente e referem-se a EGFR como descrito, por exemplo, em Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), incluindo as suas formas mutantes de ocorrência natural (por exemplo, um EGFR mutante de deleção como em Humphrey et al. PNAS (EUA) 87: 4207-4211 (1990)). EGFR ou ERBB1 refere-se ao gene que codifica o produto proteico de EGFR. A sequência de aminoácidos de uma proteína EGFR humana exemplificativa pode ser encontrada, por exemplo, sob o número de acesso UniProt P00533.

[0112] Tal como aqui utilizado, o termo "antagonista de EGFR" e "inibidor de EGFR" refere-se a qualquer antagonista de EGFR que é atualmente conhecido na técnica ou que será identificado no futuro e inclui qualquer entidade química que, após administração a um paciente, resulte na inibição de uma atividade biológica associada com a ativação de EGF no paciente, incluindo qualquer dos efeitos biológicos a jusante que de outro modo resultantes da ligação a EGFR do seu ligando natural. Tais antagonistas de EGFR incluem qualquer agente que possa bloquear a ativação de EGFR ou qualquer dos efeitos biológicos a jusante da ativação de EGFR que são relevantes para o tratamento de câncer em um paciente. Tal antagonista pode agir ligando diretamente ao domínio intracelular do receptor e inibindo a atividade da cinase. Alternativamente, tal antagonista pode agir, ocupando o sítio de ligação do ligante ou uma porção o mesmo do receptor EGF, tornando assim o receptor inacessível ao seu ligado natural para que a sua atividade biológica normal seja evitada ou reduzida. Alternativamente, tal antagonista pode agir modulando a dimerização de polipeptídeos EGFR, ou a interação do polipeptídeo EGFR com outras proteínas ou potencializar a ubiquitinação e a degradação endocitótica do EGFR. Os antagonistas de EGFR incluem, mas não estão limitados a, inibidores de moléculas pequenas, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, construtos antissentido, RNAs inibidores pequenos (isto é,interferência e RNA por dsRNA; RNAi), e ribozimas. Em uma modalidade preferida, o antagonista de EGFR é uma molécula pequena ou um anticorpo que se liga especificamente a EGFR humano.

[0113] Antagonistas de EGFR exemplificativos adequados para uso na invenção incluem, por exemplo, antagonistas de EGFR de molécula pequena, incluindo inibidores da cinase EGFR quinazolina, inibidores de pirido- pirimidina EGFR cinase, inibidores de pirrol-pirimidina EGFR cinase, inibidores de pirrol-pirimidina EGFR cinase, inibidores de pirazol-piridimina EGFR cinase, inibidores de fenilamino-pirimidina EGFR cinase, inibidores de oxidol EGFR cinase, inibidores de indolocarbazol EGFR cinase, inibidores de ftalazina EGFR cinase, inibidores de isoflavona EGFR cinase, inibidores de quinaloa EGFR cinase e inibidores de tirfostina EGFR cinase, como os descritos as seguintes publicações de patentes e todos os sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos dos inibidores de EGFR: Publicação de patente internacional WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701, e WO 92/20642; Pedido de Publicação Europeia EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063, e EP 682027; Patente US 5.747.498, 5.789.427, 5.650.415 e 5.656.643; e Pedido de Patente Alemã DE 19629652. Exemplos adicionais não limitativos de antagonistas de EGFR de molécula pequena incluem qualquer um dos inibidores de EGFR cinase descritos em Traxler, Exp. Opin. Ther. Patents 8 (12): 1599-1625 (1998).

[0114] Exemplos específicos preferidos de antagonistas de EGFR de molécula pequena que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem [6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]- (3-etinilfenil) amina (também conhecida como OSI -774, erlotinibe ou TARCEVA™ (erlotinibe HCl), OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche) (Patente US 5.747.498; Publicação de Patente Internacional WO 01/34574, e Moyer et al. Cancer Res. 57: 4838-4848 (1997)); CI-1033 (anteriormente conhecido como PD183805, Pfizer) (Sherwood et al.,Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 40: 723 (1999)); PD-158780 (Pfizer); AG- 1478 (Universidade da Califórnia); CGP-59326 (Novartis); PKI-166 (Novartis); EKB-569 (Wyeth); GW-2016 (também conhecido como GW-572016 ou ditosilato de lapatinibe, GSK); e gefitinibe (também conhecido como ZD1839 ou IRESSA™, Astrazeneca) (Woodburn et al.,Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38: 633 (1997)). Um inibidor de EGFR cinase de moléculapequena particularmente preferido que pode ser utilizado de acordo com a presente invenção é [6,7-bis(2- metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]-(3-etinilfenil) amina (isto é, erlotinibe), seu sal cloridrato (isto é, erlotinibe HCl, TARCEVA™) ou outras formas salinas (por exemplo, mesilato de erlotinibe).

[0115] Exemplos de anticorpos antagonistas de EGFR incluem os descritos em Modjtahedi, et al., Br. J. Cancer 67: 247-253 (1993); Teramoto et al.,Cancer 77: 639-645 (1996); Goldstein et al., Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318 (1995); Huang, et al., Cancer Res. 15: 59(8): 1935-40 (1999); e Yang et al., Cancer Res. 59: 1236-1243 (1999). Assim, em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de EGFR pode ser o anticorpo monoclonal Mab E7.6.3 (Yang et al. Cancer Res. 59: 1236-43 (1999)), ou Mab C225 (N.° de Acessão ATCCHB-8508), ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a especificidade de ligação do mesmo. Anticorpos antagonistas de EGFR monoclonais adequados incluem, mas não estão limitados a, IMC-C225 (também conhecido como cetuximabe ou ERBITUX™, Imclone Systems), ABX- EGF (Abgenix), EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt), RH3 (York Medical Bioscience Inc.) e MDX-447 (Medarex/Merck KgaA).

[0116] Os termos "TP53,", "antígeno de tumor celular p53" e "p53", utilizado permutavelmente aqui, referem-se a uma proteína supressora de tumor potente codificando uma fosfoproteína de 393 aminoácidos. O TP53 é negativamente regulado ou transformado em muitos tipos de câncer. A ausência ou inativação de TP53 pode contribuir para o câncer. Existe uma grande variedade de mutações TP53. Em alguns casos, um câncer pode sobre- expressar TP53, em particular, versões mutantes de TP53. Um TP53 de "tipo selvagem" é TP53 encontrado em células normais (isto é, não cancerígenas) ou TP53 que não tem uma mutação correlacionada com um câncer. O estado de TP53 de uma amostra (por exemplo, se a amostra inclui TP53 de tipo selvagem ou mutante) pode ser avaliado como, por exemplo, descrito na Patente US 6.090.566 concedida a Vogelstein et al., ou utilizando técnicas padrão, tais como as aqui descritas ou conhecidas na técnica. uma molécula de TP53 pode incluir, sem limitação, polipeptídeos contendo sequências substancialmente idênticas às apresentadas, por exemplo, no N.° de Acessão UniProtP04637 e moléculas de ácido nucleico codificadas por essas sequências.

[0117] Um "inibidor de tirosina cinase" é uma molécula antagonista que inibe em alguma extensão a atividade de tirosina cinase de uma tirosina cinase, tal como um receptor EGFR ou um receptor FGFR3.

[0118] "Vacina Bacillus Calmette-Guérin (BCG)" refere-se a uma vacina utilizada para prevenir a tuberculose (TB) em pessoas com alto risco de TB ou onde a TB é comum. É feito a partir de uma forma enfraquecida de uma bactéria chamada Mycobacterium bovis (Bacilo Calmette-Guérin), que é semelhante às bactérias que causam TB. A vacina pode ajudar o sistema imunológico do organismo a produzir anticorpos para destruir as bactérias da tuberculose. Também pode ajudar o sistema imunológico a exterminar as células cancerígenas, e é usado, por exemplo, como tratamento no câncer de bexiga.

[0119] Os termos "câncer" e "cancerígeno" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é normalmente caracterizada pelo crescimento celular não regulado. Incluídos nesta definição estão cânceres benignos e malignos. Por "câncer de fase inicial" ou "tumor de fase inicial" entende-se um câncer que não é invasivo ou metastático ou é classificado como um câncer de Estágio 0, I ou II. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluindo meduloblastoma e retinoblastoma), sarcoma (incluindo lipossarcoma e sarcoma de células sinoviais), tumores neuroendócrinos (incluindo tumores carcinoides, gastrinoma e câncer das ilhotas), mesotelioma, schwannoma (incluindo neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer de bexiga, câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células epiteliais escamosas), câncer de pulmão incluindo câncer de pequenas células do pulmão (SCLC), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, hepatoma, câncer de mama, (incluindo câncer de mama metastático), câncer de cólon, câncer do reto, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândulas salivares, câncer de rins ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, câncer testicular, câncer esofágico, tumores do trato biliar, bem como câncer de cabeça e pescoço e mieloma múltiplo.

[0120] O termo "pré-cancerígeno" refere-se a uma condição ou a um crescimento que tipicamente precede ou se desenvolve em um câncer. Um crescimento "pré-cancerígeno" terá células que são caracterizadas por regulação anormal do ciclo celular, proliferação ou diferenciação, que pode ser determinada por marcadores da regulação do ciclo celular, proliferação celular ou diferenciação.

[0121] "Tumor", como aqui utilizado, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e a todas as células e tecidos pré-cancerígenos e cancerígenos. Os termos "câncer", "cancerígeno", "distúrbio proliferativo de células" e "tumor" não são mutuamente exclusivos, como aqui referidos.

[0122] Tal como aqui utilizado, "metástase" significa a propagação do câncer a partir do seu local primário para outros locais no corpo. Células cancerígenas podem romper longe de um tumor primário, penetrar em vasos linfáticos e sanguíneos, circular através da corrente sanguínea e crescer em um foco distante (metástase) em tecidos normais em qualquer parte do corpo. A metástase pode ser local ou distante. A metástase é um processo sequencial, dependente de células tumorais rompendo o tumor primário, se deslocando através da corrente sanguínea e parando em um local distante. No novo local, as células estabelecem um suprimento de sangue e podem crescer para formar uma massa potencialmente fatal. Ambas as vias moleculares estimuladoras e inibidoras no interior da célula tumoral regulam este comportamento, e as interações entre a célula tumoral e as células hospedeiras no local distante são também significativas.

[0123] Por "não metastático" entende-se um câncer benigno ou que permanece no local primário e não penetrou no sistema linfático ou dos vasos sanguíneos ou em tecidos que não o local primário. Geralmente, um câncer não metastático é qualquer câncer que é um câncer do Estágio 0, I ou II e, ocasionalmente, um câncer do Estágio III.

[0124] O termo "terapia anticâncer" refere-se a uma terapia útil no tratamento do câncer. Exemplos de agentes terapêuticos anticâncer incluem, mas não estão limitados a, antagonistas, agentes quimioterapêuticos, agentes inibidores de crescimento, agentes citotóxicos, agentes utilizados em terapia de radiação, agentes antiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulina e outros agentes para tratar o câncer, anticorpos anti-CD20, inibidores do fator de crescimento derivado de plaquetas (por exemplo, GLEEVEC™ (Imatinib Mesylate), um inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxibe), interferons, citocinas, antagonistas (por exemplo, anticorpos neutralizantes) que se ligam a um ou mais dos seguintes alvos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptor(es) de VEGF ou BCMA, TRAIL/Apo2 e outros agentes químicos bioativos e orgânicos, etc. Em modalidades particulares, um antagonista é um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 ou um antagonista de EGFR. Combinações dos mesmos são também incluídas na invenção.

[0125] Por "radioterapia" entende-se o uso de raios gama ou raios beta dirigidos para induzir dano suficiente a uma célula, de modo a limitar a sua capacidade de funcionar normalmente ou destruir a célula completamente. Será apreciado que haverá muitas maneiras conhecidas na técnica para determinar a dosagem e a duração do tratamento. Os tratamentos típicos são administrados como uma administração única e as dosagens típicas variam de 10 a 200 unidades (Grays) por dia.

[0126] Tal como aqui utilizado, "tratamento", "tratar" ou outras variações gramaticais refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula a ser tratada e pode ser realizada quer para profilaxia quer durante o curso de patologia clínica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem prevenir a ocorrência ou recorrência de doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenindo a metástase, diminuindo a taxa da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas modalidades, é utilizada uma terapia anticâncer (por exemplo, uma terapia anticâncer incluindo um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 e/ou um antagonista de EGFR) para retardar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio.

[0127] Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático ou terapêutico desejado.

[0128] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância/molécula da invenção, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores, tais como o estado patológico, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista para induzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula, agonista ou antagonista são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um anticorpo, polipeptídeo ou antagonista desta invenção eficaz para "tratar" uma doença ou distúrbio em um mamífero (por exemplo, um paciente). No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, abrandar até certo ponto e preferencialmente interromper) a infiltração da célula cancerígena dentro de órgãos periféricos (isto é, abrandar até certo ponto e preferencialmente interromper) a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais sintomas associados com o câncer. À medida que a droga pode impedir o crescimento e/ou exterminar as células de câncer já existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade inibidora de crescimento. Para a terapia de câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida avaliando a duração de sobrevivência, o tempo da progressão da doença (TTP), a duração de sobrevivência livre de doença (DFS), a duração de sobrevivência livre de progressão (PFS), as taxas de resposta (RR), a duração da resposta e/ou a qualidade de vida.

[0129] O termo "sobrevivência" refere-se ao paciente permanecer vivo, e inclui a sobrevivência global, bem como a sobrevivência livre de doença.

[0130] O termo “sobrevivência global” refere-se ao paciente permanecer vivo por um período definido de tempo, como 1 ano, 5 anos, etc. a partir do momento do diagnóstico ou tratamento.

[0131] A frase “sobrevivência livre de progressão” no contexto da presente invenção refere-se ao período de tempo durante e após o tratamento, durante o qual, de acordo com a avaliação do médico ou investigador do tratamento, uma doença de um paciente não se torna pior, isto é, não progride. Como o versado na técnica irá apreciar, a sobrevivência livre de progressão de um paciente é melhorada ou aumentada, se o paciente apresentar uma duração mais longa de tempo durante o qual a doença não progredir, em comparação com o tempo médio ou mediano de sobrevivência livre de progressão de um grupo de controle de pacientes situados de forma semelhante.

[0132] A expressão "sobrevivência livre de doença (DFS)" refere- se ao período de tempo após o tratamento primário para um câncer terminar que o paciente sobrevive sem quaisquer sinais ou sintomas desse câncer.

[0133] Por "sobrevivência prolongada" entende-se aumentar a sobrevivência, por exemplo, a sobrevivência global ou livre de doença, em um paciente tratado em relação a um paciente não tratado (isto é, em relação a um paciente não tratado com uma terapia anticâncer (por exemplo, incluindo um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 e/ou um antagonista de EGFR), ou relativamente a um paciente que não expressa FGFR3, TP53, e/ou EGFR a um nível de referência designado.

[0134] O termo "agente citotóxico" como utilizado aqui refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, Em At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposido),doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes de intercalação, enzimas e fragmentos dos mesmos, tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas de pequenas moléculas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, e os vários agentes antitumorais ou anticâncer descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Um agente tumoricida provoca a destruição das células tumorais.

[0135] Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquil, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o topotecan análogo sintético (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopoletina, e 9- aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1- TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas nitrogenadas, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama1I e caliqueamicina ômega1I (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl.,33: 183186 (1994)); dinemicina, incluindo a dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos de antibióticos de enedina de cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil-hidrazida; procarbazina;complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazoico; triaziquona; 2,2', 2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM, formulação de nanopartículas de paclitaxel sem Cremophor engenheirada por albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e docetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima tal como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinada com 5-FU e leucovorina. Os agentes quimioterapêuticos incluem agentes citotóxicos úteis como conjugados de medicamento anticorpo, tais como os maitansinoides (DM1, por exemplo) e auristatinas MMAE e MMAF, por exemplo.

[0136] "Os agentes quimioterapêuticos" incluem também "agentes anti-hormonais" ou que atuam para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos dos hormônios que podem promover o crescimento do câncer e estão muitas vezes sob a forma de tratamento sistêmico ou por todo o corpo. Eles podem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem antiestrógeno e moduladores do receptor de estrógeno seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno FARESTON®; antiprogesteronas; receptor de estrógeno para infrarreguladores (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ou desligar os ovários, por exemplo, agonistas do hormônio liberador do hormônio luteinizante (LHRH), tais como LUPRON® ELIGARD® e acetato de leuprolida, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas suprarrenais, tais como, por exemplo, 4 (5)-imidazois, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®. Além disso, tal definição de agentes quimioterapêuticos inclui bisfosfonatos, tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina (um 1,3-dioxolano nucleosídeo análogo de citosina); oligonucleotídeos antissentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicados na proliferação celular aberrante, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator do crescimento epidérmico (EGFR); vacinas, tais como vacinas THERATOPE® e vacinas de terapia de genes, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor 1 de topoisomerase LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinibe (um inibidor de ErbB-2 e EGFR de tirosina- cinase dupla de molécula pequena, também conhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

[0137] Um "agente inibidor de crescimento", quando aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento e/ou proliferação de uma célula (por exemplo, uma célula de câncer de bexiga) quer in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduz significativamente a percentagem de células em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a paragem de G1 e a paragem de fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como o antibiótico antraciclina doxorrubicina ((8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6- tridesoxi-a-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetra-hidro-6,8,11-tri-hidroxi-8- (hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenediona), epirubicina, daunorrubicina, etoposídeo e bleomicina. Os agentes que param G1 também extravasam para paragem da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5- fluorouracil, e ara-C. Mais informações podem ser encontradas em “The Molecular Basis of Cancer,” Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são medicamentos anticâncer ambos derivados da árvore de teixo. O docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético do paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). O paclitaxel e o docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos por prevenção da despolimerização, o que resulta na inibição da mitose em células.

[0138] Tal como aqui utilizados, os termos "paciente" ou "sujeito" são utilizados permutavelmente e referem-se a um único animal, mais preferivelmente um mamífero (incluindo os animais não humanos como, por exemplo, cães, gatos, cavalos, coelhos, animais de jardim zoológico, vacas, porcos, ovelhas e primatas não humanos) para os quais é desejado um tratamento. Preferencialmente, o paciente aqui é um ser humano.

[0139] Tal como aqui utilizado, "administração" significa um método para dar uma dosagem de um composto (por exemplo, um antagonista) ou uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo um antagonista) a um indivíduo (por exemplo, um paciente). A administração pode ser por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem, por exemplo, administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer rota apropriada, por exemplo, injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte da administração ser breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, mas não se limitando a administrações únicas ou múltiplas sobre vários pontos de tempo, a administração em bolus e infusão de pulso, são aqui contemplados.

[0140] O termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade de um medicamento que é eficaz para tratar um distúrbio, por exemplo, para tratar um câncer.

[0141] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação de tal forma que permite que a atividade biológica do medicamento seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos em um sujeito ao qual a formulação seria administrada.

[0142] Uma formulação "estéril" é asséptica ou isenta de todos os micro-organismos vivos e dos seus esporos.

[0143] Utiliza-se uma "bula" para se referir a instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos ou medicamentos que contêm informação sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicações, outros produtos terapêuticos a combinar com o produto embalado e/ou avisos relativos à utilização de tais produtos ou medicamentos terapêuticos, etc.

[0144] Um "kit" é qualquer fabricação (por exemplo, uma embalagem ou recipiente) compreendendo pelo menos um reagente, por exemplo, um medicamento para tratamento de um câncer (por exemplo, um câncer de bexiga) ou uma sonda para detectar especificamente um gene biomarcador ou proteína da invenção. A fabricação é de preferência promovida, distribuída ou vendida como uma unidade para a realização dos métodos da presente invenção.

[0145] A palavra "marcador", quando aqui utilizado refere-se a um composto ou composição que esteja conjugado ou fundido direta ou indiretamente a um reagente, tal como uma sonda de polinucleotídeo ou um anticorpo e facilita a detecção do reagente ao qual é conjugado ou fundido. O marcador pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de uma marcação enzimática, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. O termo destina-se a englobar a marcação direta de uma sonda ou anticorpo pelo acoplamento (ou seja, vinculando fisicamente) uma substância detectável para a sonda ou o anticorpo, bem como a marcação indireta da sonda ou do anticorpo pela reatividade com outro reagente que é diretamente marcado. Os exemplos de marcações indiretas incluem detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário com marcado fluorescentemente e marcação na extremidade de uma sonda de DNA com biotina tal que ela possa ser detectada com estreptavidina marcada fluorescentemente.

III. MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[0146] A presente invenção proporciona métodos para o tratamento de um paciente que sofre de câncer. O termo câncer engloba uma coleção de distúrbios proliferativos, incluindo mas não limitado a crescimentos não cancerígenos, tumores benignos e tumores malignos. Tumores benignos permanecem localizados no local de origem e não têm a capacidade de se infiltrar, invadir ou sofrer metástase para locais distantes. Tumores malignos irão invadir e danificar outros tecidos ao seu redor. Eles também podem ganhar a capacidade de romper do local original e se espalhar para outras partes do corpo (metástase), geralmente através da corrente sanguínea ou através do sistema linfático, onde os gânglios linfáticos estão localizados. Os tumores primários são classificados pelo tipo de tecido do qual se originam; os tumores metastáticos são classificados pelo tipo de tecido a partir do qual as células de câncer são derivadas. Ao longo do tempo, as células de um tumor maligno tornam-se mais anormais e parecem menos como células normais. Esta alteração no aparecimento de células cancerígenas é denominada grau tumoral, e as células cancerígenas são descritas como sendo bem diferenciadas (baixo grau), moderadamente diferenciadas, mal diferenciadas ou indiferenciadas (alto grau). Células bem diferenciadas parecem bastante normais e se assemelham às células normais de onde se originaram. Células indiferenciadas são células que se tornaram tão anormais que não é mais possível determinar a origem das células. Em modalidades particulares, a invenção proporciona métodos de tratamento de câncer de bexiga.

[0147] Os sistemas de estadiamento de câncer descrevem até que ponto o câncer se espalhou anatomicamente e tentam colocar pacientes com prognóstico e tratamento semelhantes no mesmo grupo de estadiamento. Vários testes podem ser realizados para ajudar no estágio do câncer, incluindo biópsia e certos exames de imagem, como raios-x, mamografia, tomografia óssea, tomografia computadorizada e ressonância magnética. Exames de sangue e uma avaliação clínica também são usados para avaliar a saúde geral de um paciente e detectar se o câncer se espalhou para determinados órgãos.

[0148] Para estadiar o câncer, o American Joint Committee on Cancer coloca o câncer, particularmente tumores sólidos, em uma categoria de carta usando o sistema de classificação TNM. Os cânceres são designados pela letra T (tamanho do tumor), N (nós palpáveis) e/ou M (metástases). T1, T2, T3 e T4 descrevem o aumento de tamanho da lesão primária; N0, N1, N2, N3 indica envolvimento de nó progressivamente avançando; e M0 e M1 refletem a ausência ou presença de metástases distantes.

[0149] No segundo método de estadiamento, também conhecido como Agrupamento Geral de Estágios ou Escalonamento Numérico Romano, os cânceres são divididos em estágios de 0 a IV, incorporando o tamanho das lesões primárias, bem como a presença de propagação nodal e de metástases à distância. Neste caso, os casos são agrupados em quatro estágios, indicados pelos números romanos I a IV, ou são classificados como "recorrentes". Para alguns tipos de câncer, o estágio 0 é referido como "in situ" ou "Tis", como carcinoma ductal in situ ou carcinoma lobular in situ para câncer de mama. Adenomas de alto grau também podem ser classificados como estágio 0. Em geral, os cânceres de estágio I são pequenos cânceres localizados que são geralmente curáveis, enquanto que o estágio IV representa habitualmente câncer inoperável ou metastático. Cânceres de estágio II ou III são geralmente localmente avançados e/ou apresentam envolvimento de linfonodos locais. Em geral, números mais altos de estágio indicam doença mais extensa, incluindo maior tamanho do tumor e/ou disseminação do câncer para os linfonodos vizinhos e/ou órgãos adjacentes ao tumor primário. Estes estágios são definidos precisamente, mas a definição é diferente para cada tipo de câncer e é conhecida para o especialista versado.

[0150] Muitos registros de câncer, como os do Programa de Vigilância de NCI, Epidemiologia, e Resultados Finais (SEER), usam estadiamento sumário. Este sistema é utilizado para todos os tipos de câncer. Ele agrupa os casos de câncer em cinco categorias principais: In situ é o câncer inicial que está presente apenas na camada de células na qual começou. Localizado é o câncer que se limita ao órgão no qual começou, sem evidência de disseminação. Regional é um câncer que se espalhou além do local original (primário) para os gânglios linfáticos ou órgãos e tecidos nas proximidades. Distante é um câncer que se espalhou do local principal para órgãos distantes ou distante dos gânglios linfáticos. Desconhecido é usado para descrever os casos para os quais não há informações suficientes para indicar um estágio. Além disso, é comum para o câncer retornar meses ou anos depois que o tumor primário foi removido. O câncer que se repete depois de que todo o tumor visível foi erradicado, é chamado de doença recorrente. A doença que reaparece na área do tumor primário é localmente recorrente, e a doença que se repete como metástase é referida como uma recorrência distante. O tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor de tecido não sólido ou macio. Leucemia (por exemplo, leucemia mieloide crônica, leucemia mieloide aguda, adulta leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda madura de células B, leucemia linfocítica crônica, leucemia polimfocítica ou leucemia de células pilosas) ou linfoma (por exemplo, não Hodgkin Linfoma, linfoma de célula T cutâneo ou doença de Hodgkin) são exemplos de tumores de tecidos moles. Um tumor sólido inclui qualquer tipo de câncer dos tecidos do corpo diferente de sangue, medula óssea ou o sistema linfático. Tumores sólidos podem ser divididos em aqueles de origem de células epiteliais e os de origem de células não epiteliais. Exemplos de tumores sólidos de células epiteliais incluem tumores da bexiga, trato gastrointestinal, cólon, mama, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovário, cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, vesícula biliar, lábio, nasofaringe, pele, útero, órgão genital masculino, órgãos urinários e pele. Os tumores sólidos de origem não epitelial incluem sarcomas, tumores cerebrais e tumores ósseos. Outros exemplos de tumores são descritos na seção Definições.

[0151] Em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer, em que o nível de expressão pelo menos um dos biomarcadores da invenção (por exemplo, um biomarcador listado na Tabela 1) em uma amostra obtida a partir do paciente foi determinado para ser alterado em relação a um nível de referência do biomarcador da invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de tratamento de um câncer (por exemplo, câncer de bexiga) que envolve a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer, em que o nível de expressão de pelo menos um gene listado na Tabela 1 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ou 96 genes listados na Tabela 1) foi determinado para ser alterado em relação a um nível de referência de pelo menos um gene.

[0152] Em outro exemplo, em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de tratamento de um câncer (por exemplo, câncer de bexiga) que envolve a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer, no qual o nível de expressão de pelo menos um gene listado na Tabela 4 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 ou 48 listados na Tabela 4) foi determinado como sendo alterado em relação a um nível de referência do pelo menos um gene. Em algumas modalidades, a alteração é um aumento. Em outras modalidades, a mudança é uma diminuição.

[0153] Em modalidades, os métodos da invenção incluem administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer, em que o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e/ou EGFR em uma amostra obtida do paciente foi determinada como sendo aumentada em relação a um nível de referência do pelo menos um gene. O nível de expressão dos biomarcadores da invenção (por exemplo, um gene listado na Tabela 1, por exemplo, FGFR3, TP53 e/ou EGFR) pode ser determinado usando qualquer um dos métodos ou ensaios descritos aqui (por exemplo, métodos ou ensaios descritos na seção IV da Descrição Detalhada da invenção ou nos Exemplos). Em algumas modalidades, o câncer de bexiga é NMIBC. Em outras modalidades, o câncer de bexiga é MIBC. Em ainda outras modalidades, o câncer de bexiga é câncer de bexiga metastático. O paciente pode opcionalmente ter uma forma avançada, refratária, recorrente e/ou resistente à quimioterapia do câncer. Por exemplo, em algumas modalidades, um paciente pode ter um câncer de bexiga recorrente, por exemplo, um NMIBC recorrente.

[0154] Em qualquer dos métodos anteriores da invenção, o nível de expressão de um biomarcador da invenção (por exemplo, um gene listado na Tabela 1, por exemplo, FGFR3, TP53, e/ou EGFR) em uma amostra obtida do paciente pode ser alterado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de biomarcador. Por exemplo, em algumas modalidades, o nível de expressão de um biomarcador da invenção em uma amostra obtida do paciente pode ser aumentado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de biomarcador. Em outras modalidades, o nível de expressão de um biomarcador da invenção em uma amostra obtida a partir do paciente pode ser diminuído pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de biomarcador.

[0155] Em modalidades particulares, o nível de expressão de pelo menos um (por exemplo, 1, 2 ou 3) do seguinte: FGFR3, TP53, e/ou EGFR em uma amostra obtida do paciente pode ser aumentada pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência do pelo menos um gene. Por exemplo, o nível de expressão de FGFR3 pode ser aumentado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de FGFR3. Em outro exemplo, o nível de expressão de TP53 pode ser aumentada pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de TP53. Em ainda outro exemplo, o nível de expressão de EGFR pode ser aumentado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de EGFR.

[0156] Em algumas modalidades, o nível de referência pode ser ajustado para qualquer percentil entre, por exemplo, o 20o percentil e o 99o percentil (por exemplo, o 20o, 25o, 30o, 35o, 40o, 45o, 50o, 55o, 60o, 65o, 70o, 75o, 80o, 85o, 90o, 95o, ou 99o percentil) da distribuição global do nível de expressão de um biomarcador (por exemplo, FGFR3, TP53, ou EGFR) em um determinado tipo de câncer (por exemplo, câncer de bexiga). Em modalidades particulares, o nível de referência pode ser ajustado para o 25o percentil da distribuição global dos valores em um câncer de bexiga. Em outras modalidades particulares, o nível de referência pode ser ajustado para o valor 50o percentil da distribuição global dos valores em um câncer de bexiga. Em outras modalidades, o nível de referência pode ser a mediana da distribuição global dos valores em um câncer de bexiga.

[0157] Em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem administrar ao paciente uma terapia anticâncer que inclui um ou mais (por exemplo, 1, 2 ou 3) do seguinte: um antagonista FGFR3, um TP53 e/ou um antagonista do EGFR. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem administrar uma terapia anticâncer, compreendendo um antagonista FGFR3, um antagonista de TP53 ou um antagonista de EGFR. Em outros casos, o método pode envolver a administrar uma terapia anticâncer, compreendendo um antagonista FGFR3 e um antagonista de EGFR. Em outros casos, o método pode envolver a administração de uma terapia anticâncer compreendendo um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 e um antagonista de EGFR.

[0158] Em qualquer dos métodos anteriores, o antagonista de FGFR3 pode ser um anticorpo antagonista de FGFR3 ou um antagonista de FGFR3 de molécula pequena. Exemplos de anticorpos antagonistas de FGFR3, tais como 184.6, 184.6.1 e 184.6.1N54S, são descritos, por exemplo, na Patente US 8.410.250, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o antagonista de FGFR3 de molécula pequena é um inibidor de tirosina cinase.

[0159] Em qualquer dos métodos anteriores, o antagonista de TP53 pode ser um anticorpo antagonista TP53 ou um antagonista de TP53 de molécula pequena.

[0160] Em qualquer dos métodos anteriores, o antagonista de EGFR pode ser um anticorpo antagonista de EGFR ou um antagonista de EGFR de molécula pequena. Em algumas modalidades, o antagonista de FGFR3 de molécula pequena é um inibidor de tirosina cinase. Em modalidades particulares, o antagonista de FGFR3 de molécula pequena é erlotinibe (TARCEVA™).

[0161] Antagonistas de EGFR exemplificativos que podem ser usados no método da invenção incluem, por exemplo, antagonistas de EGFR de molécula pequena, incluindo inibidores da cinase EGFR quinazolina, inibidores de pirido-pirimidina EGRF cinase, inibidores de pirrol-pirimidina EGFR cinase, inibidores de pirrol-pirimidina EGFR cinase, inibidores de pirazol-piridimina EGFR cinase, inibidores de fenilamino-pirimidina EGFR cinase, inibidores de oxidol EGFR cinase, inibidores de indolocarbazol EGFR cinase, inibidores de ftalazina EGFR cinase, inibidores de isoflavona EGFR cinase, inibidores de quinaloa EGFR cinase e inibidores de tirfostina EGFR cinase, como os descritos as seguintes publicações de patentes e todos os sais farmaceuticamente aceitáveis e solvatos dos inibidores de EGFR: Publicação de patente internacional WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701, e WO 92/20642; Pedido de Publicação Europeia EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063, e EP 682027; PatenteUS5. 747. 498, 5. 789. 427, 5. 650. 415 e 5. 656. 643; e Pedido de Patente Alemã DE 19629652. Exemplos adicionais não limitativos de antagonistas de EGFR de molécula pequena incluem qualquer um dos inibidores de EGFR cinase descritos em Traxler, Exp. Opin. Ther. Patentes 8 (12): 1599-1625 (1998).

[0162] Exemplos específicos preferidos de antagonistas de EGFR de molécula pequena que podem ser utilizados nos métodos da invenção incluem [6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]- (3-etinilfenil) amina (também conhecida como OSI -774, erlotinibe ou TARCEVA™ (erlotinibe HCl), OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche) (Patente US 5.747 498; Publicação de Patente InternacionalWO 01/34574, e Moyer et al. Cancer Res. 57: 4838-4848 (1997)); CI-1033 (anteriormente conhecido como PD183805, Pfizer) (Sherwood et al.,1999, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 40: 723); PD-158780 (Pfizer); AG- 1478 (Universidade da Califórnia); CGP-59326 (Novartis); PKI-166 (Novartis); EKB-569 (Wyeth); GW-2016 (também conhecido como GW-572016 ou ditosilato de lapatinibe, GSK); e gefitinibe (também conhecido como ZD1839 ou IRESSA™, Astrazeneca) (Woodburn et al.,1997, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38: 633).

[0163] Exemplos de anticorpos antagonistas de EGFR que podem ser utilizados nos métodos da invenção incluem os descritos em Modjtahedi, et al.,Br. J. Cancer 67: 247-253 (1993); Teramoto et al.,Cancer 77: 639-645 (1996); Goldstein et al., Clin. Cancer Res. 1: 1311-1318 (1995); Huang, et al.,Cancer Res. 15: 59(8): 1935-40 (1999); e Yang et al., Cancer Res. 59: 1236-1243 (1999). Assim, em algumas modalidades, o anticorpo antagonista de EGFR pode ser o anticorpo monoclonal Mab E7.6.3 (Yang et al. Cancer Res. 59: 1236-43 (1999)), ou Mab C225 (N.° de Acessão ATCCHB-8508), ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a especificidade de ligação do mesmo. Anticorpos antagonistas de EGFR monoclonais adequados incluem, mas não estão limitados a, IMC-C225 (também conhecido como cetuximabe ou ERBITUX™, Imclone Systems), ABX-EGF (Abgenix), EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt), RH3 (York Medical Bioscience Inc.) e MDX-447 (Medarex/Merck KgaA).

[0164] Em certas modalidades, o câncer expressa FGFR3, FGFR3 amplificado, FGFR3 translocado e/ou FGFR3 mutado. Em certas modalidades, o câncer expressa FGFR3 ativado. Em certas modalidades, o câncer expressa FGFR3 translocado (por exemplo, uma translocação t(4;14)). Em certas modalidades, o câncer expressa FGFR3 constitutivo. Em algumas modalidades, o FGFR3 constitutivo compreende uma mutação no domínio da tirosina cinase e/ou o domínio juxtamembrana e/ou um domínio de ligação ao ligando. Em certas modalidades, o câncer expressa FGFR3 independente de ligando. Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3 dependente de ligando.

[0165] Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3 compreendendo uma mutação correspondente a FGFR3-IIIbS248C. Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3-IIIb S248C e/ou FGFR3-IIIcS248C.

[0166] Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3 compreendendo uma mutação correspondente a FGFR3-IIIbK652E. Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3-IIIb K652E e/ou FGFR3-IIIc K650E.

[0167] FGFR3 compreendendo uma mutação correspondente a FGFR3-IIIbS249C. Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3-IIIbS249C e/ou FGFR3-IIIc S249C.

[0168] Em um aspecto, o câncer expressa FGFR3 compreendendo uma mutação correspondente a FGFR3-IIIbG372C. Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3-IIIbG372C e/ou FGFR3-IIIc G370C.

[0169] Em um aspecto, o câncer expressa FGFR3 compreendendo uma mutação correspondente a FGFR3-IIIbY375C. Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3-IIIbY375C e/ou FGFR3-IIIcY373C.

[0170] Em algumas modalidades, o câncer expressa (a) FGFR3- IIIbK652E e (b) um ou mais de FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, e FGFR3IIIb G372C.

[0171] Em algumas modalidades, o câncer expressa (a) FGFR3- IIIbR248C e (b) um ou mais de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, e FGFR3-IIIbG372C.

[0172] Em algumas modalidades, o câncer expressa (a) FGFR3- IIIbG372C e (b) um ou mais de FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, e FGFR3-IIIbR248C.

[0173] Em algumas modalidades, o câncer expressa FGFR3- IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIb S249C, e FGFR3-IIIb G372C.

[0174] Em certas modalidades, o câncer expressa níveis aumentados de fosfo-FGFR3, fosfo-FRS2 e/ou fosfo-MAPK em relação a uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra de tecido normal) ou nível.

[0175] A composição compreendendo uma terapia anticâncer, por exemplo, uma terapia anticâncer compreende um antagonista (por exemplo, um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 e/ou um antagonista de EGFR) será formulada, doseada e administrada de uma forma consistente com a boa prática médica. Fatores para a consideração neste contexto incluem o tipo particular de câncer sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, o quadro clínico do paciente individual, a causa do câncer, o local de distribuição do agente, possíveis efeitos colaterais, o tipo de antagonista, o método de administração, a programação da administração, e outros fatores conhecidos de médicos praticantes. A quantidade eficaz do antagonista a ser administrado será regida por tais considerações.

[0176] Os agentes terapêuticos da invenção são administrados a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por rota intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal oual, tópica ou por inalação. Uma estratégia ex vivo também pode ser utilizada para aplicações terapêuticas. Estratégias ex vivo envolvem a transfecção ou a transdução de células obtidas a partir do indivíduo com um polinucleotídeo que codifica um antagonista. As células transfectadas ou transduzidas são então devolvidas ao sujeito. As células podem ser qualquer uma de uma ampla variedade de tipos incluindo, sem limitação, células hematopoiéticas (por exemplos, células de medula óssea, macrófagos, monócitos, células dendríticas, células T ou células B), fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, ou células musculares.

[0177] Por exemplo, se a terapia anticâncer incluir um anticorpo antagonista (por exemplo, um anticorpo antagonista de FGFR3, um anticorpo antagonista de TP53 ou um anticorpo antagonista de EGFR), o anticorpo é administrado por quaisquer meios adequados, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento imunossupressor local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Adicionalmente, o anticorpo é adequadamente administrado por infusão de impulsos, particularmente com doses decrescentes do anticorpo. Preferencialmente, a dosagem é dada por injeções, mais preferencialmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica.

[0178] Em um outro exemplo, o composto antagonista é administrado localmente, por exemplo, por injeções diretas, quando o distúrbio ou localização do tumor o permite, e as injeções podem ser repetidas periodicamente. O antagonista pode também ser administrado sistemicamente ao sujeito ou diretamente às células tumorais, por exemplo, a um tumor ou a um leito tumoral após a excisão cirúrgica do tumor, de modo a prevenir ou reduzir a recorrência local ou a metástase.

[0179] Uma terapia anticâncer pode ser combinada em uma formulação de combinação farmacêutica, ou em um regime de dosagem como terapia de combinação, com pelo menos um composto adicional possuindo propriedades anticâncer. O pelo menos um composto adicional da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem preferencialmente tem atividades complementares à composição antagonista de tal modo que não se afetem adversamente umas às outras.

[0180] A terapia anticâncer pode incluir um agente quimioterapêutico, um agente citotóxico, uma citocina, um agente inibidor de crescimento, um agente anti-hormonal e combinações dos mesmos. Tais moléculas estão devidamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Por exemplo, uma composição farmacêutica contendo um antagonista (por exemplo, um antagonista de FGFR3, um antagonista de TP53 e/ou um antagonista de EGFR) também pode compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente antineoplásico, um agente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento, um agente citotóxico, ou combinações dos mesmos.

[0181] A administração de agentes terapêuticos em combinação tipicamente é realizada durante um período de tempo definido (normalmente minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada). A terapia de combinação destina-se a englobar a administração desses agentes terapêuticos de uma maneira sequencial, isto é, em que cada agente terapêutico é administrado em um momento diferente, bem como a administração desses agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea.

[0182] Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma rota ou por rotas diferentes. Por exemplo, um anticorpo antagonista na combinação pode ser administrado por injeção intravenosa enquanto um agente quimioterapêutico na combinação pode ser administrado oralmente. Alternativamente, por exemplo, ambos os agentes terapêuticos podem ser administrados oralmente, ou ambos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção intravenosa, dependendo dos agentes terapêuticos específicos. A sequência na qual os agentes terapêuticos são administrados também varia dependendo dos agentes específicos.

[0183] Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg de cada agente terapêutico é uma dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, por exemplo, ou por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dose diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até o câncer ser tratado, conforme medido pelos métodos descritos acima. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Esquemas de preparação e dosagem para constituintes de uma terapia anticâncer, por exemplo, uma terapia anticâncer compreendendo um ou mais antagonistas (por exemplo, Antagonistas de FGFR3, antagonistas de TP53 e/ou antagonistas de EGFR), agentes quimioterapêuticos, etc. podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante ou como determinados empiricamente pelo praticante versado. Os esquemas de preparação e dosagem para tal quimioterapia são também descritos em "Chemotherapy Service", Ed. M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md (1992).

[0184] A terapia de combinação pode proporcionar "sinergia" e provar ser "sinérgica", isto é, o efeito obtido quando os ingredientes ativos utilizados em conjunto é maior que a soma dos efeitos que resulta da utilização dos compostos separadamente. Um efeito sinérgico pode ser alcançado quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou distribuídos simultaneamente em uma formulação combinada, de dose unitária; (2) distribuídos por alternância ou em paralelo como formulações distintas; ou (3) por outro regime. Quando proporcionado em terapia de alternância, um efeito sinérgico pode ser alcançado quando os compostos são administrados ou distribuídos sequencialmente, por exemplo, por injeções diferentes em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternância, uma dosagem efetiva de cada ingrediente ativo é administrada em sequência, ou seja, em série, enquanto na terapia combinada, as doses eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administradas juntos.

[0185] Além da administração de uma terapia anticâncer por vias tradicionais como se referiu acima, a presente invenção inclui a administração por terapia genética. Tal administração de ácidos nucleicos codificando o antagonista é englobada pela expressão "administrar uma quantidade eficaz de uma terapia anticâncer". Ver, por exemplo, WO 1996/07321 relativo ao uso da terapia genética para gerar anticorpos intracelulares. Um tal método pode ser útil, por exemplo, para direcionar proteínas intracelulares, tais como TP53.

[0186] Existem duas abordagens principais para obter o ácido nucleico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para a distribuição in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente no paciente, geralmente no local onde é necessário o antagonista. Para o tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (ver, por exemplo, Patente US 4.892.538 e 5.283.187). Há uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vetor vulgarmente utilizado para distribuição ex vivo do gene é um retrovírus.

[0187] As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo atualmente preferidas incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus Herpes simplex I ou vírus adeno-associados) e sistemas baseados em lipídeos (lipídeos úteis para a transferência do gene mediada por lipídeos são DOTMA, DOPEe DC-Chol, por exemplo). Em algumas situações, é desejável proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente específico para células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície celular na célula alvo, um ligando para um receptor na célula alvo, etc. Quando os lipossomas são empregados, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celular associada com endocitose podem ser utilizadas para direcionamento e/ou para facilitar a captação, por exemplo, de proteínas de cápside ou fragmentos trópicos das mesmas para um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclos e proteínas que visam a localização intracelular e aumentam a meia-vida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner et al., PNAS EUA 87: 3410-3414 (1990). Os protocolos de marcação genética e de terapia genética são descritos, por exemplo, em Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992) e WO 1993/25673.

IV. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS E PROGNÓSTICOS

[0188] A presente invenção proporciona métodos para diagnosticar um paciente que sofre de um câncer, para determinar um prognóstico de um paciente que sofre de câncer, para determinar se um paciente que tem um câncer é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer e para otimizar a eficácia da terapêutica de uma terapia anticâncer para um paciente com câncer. Os métodos são úteis, inter alia, para o diagnóstico de subtipos de câncer, para prever os resultados do tratamento e para aumentar a probabilidade de que a administração de uma terapia anticâncer a um paciente seja eficaz. Em várias modalidades, os métodos incluem determinar um nível de expressão pelo menos um dos biomarcadores da invenção (por exemplo, um biomarcador listado na Tabela 1) em uma amostra obtida do paciente e comparar o nível de expressão com um nível de referência do biomarcador da invenção. Em modalidades particulares, os métodos incluem determinar um nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e/ou EGFR em uma amostra obtida do paciente e comparar o nível de expressão com um nível de referência de pelo menos um gene. O nível de expressão dos biomarcadores da invenção (por exemplo, FGFR3, TP53, e/ou EGFR) pode ser determinado utilizando qualquer dos métodos ou ensaios descritos abaixo ou por qualquer método ou ensaio conhecido na técnica. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga. Em algumas modalidades, o câncer de bexiga é NMIBC. Em outras modalidades, o câncer de bexiga é MIBC. Em ainda outras modalidades, o câncer de bexiga é câncer de bexiga metastático. O paciente pode opcionalmente ter uma forma avançada, refratária, recorrente e/ou resistente à quimioterapia do câncer. Por exemplo, em algumas modalidades, um paciente pode ter um câncer de bexiga recorrente, por exemplo, um NMIBC recorrente.

[0189] Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para diagnosticar um câncer em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 1 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ou 96 genes listados na Tabela 1) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que uma alteração no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente com câncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga. Por exemplo, em modalidades particulares, a invenção proporciona um método para diagnosticar um câncer em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um (por exemplo, 1, 2 ou 3) dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente tendo um câncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0190] Em alguns casos, a invenção proporciona um método para diagnosticar um câncer em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de FGFR3 em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de FGFR3 com um nível de referência de FGFR3, em que um aumento no nível de expressão de FGFR3 na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente com câncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0191] Em alguns casos, a invenção proporciona um método para diagnosticar um câncer em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de TP53 em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de TP53 com um nível de referência de TP53, em que um aumento no nível de expressão de TP53 na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente com câncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0192] Em alguns casos, a invenção proporciona um método para diagnosticar um câncer em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de EGFR em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de EGFR com um nível de referência de EGFR, em que um aumento no nível de expressão de EGFR na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente com câncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0193] Em um outro exemplo, em algumas modalidades, a invenção proporciona um método para diagnosticar um câncer em um paciente, o método compreendendo as etapas de: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 4 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, ou 48 genes listados na Tabela 4) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que uma alteração no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente com câncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0194] Em qualquer dos métodos anteriores, o método pode ainda incluir (c) informar ao paciente que ele têm um câncer. Em qualquer dos métodos anteriores, o método pode ainda incluir (d) selecionar uma terapia anticâncer para tratamento do paciente, quando um aumento no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação à amostra é detectada. Em qualquer das modalidades anteriores, o método pode ainda incluir administrar a uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente, por exemplo, como descrito na Seção III da Descrição Detalhada da Invenção.

[0195] Em outros casos, a invenção proporciona um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 1 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ou 96 genes listados na Tabela 1) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, e (c) determinar um prognóstico para o paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que está alterada em relação ao nível de referência. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0196] Por exemplo, em alguns casos, a invenção proporciona um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene; e (c) determinar um prognóstico ao paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que é aumentado em relação ao nível de referência.

[0197] Em alguns casos, a invenção proporciona um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de FGFR3 em uma amostra obtida do paciente; (b) comparar o nível de expressão de FGFR3 com um nível de referência de FGFR3; e (c) determinar um prognóstico para o paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que é aumentado em relação ao nível de referência. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0198] Em outros casos, a invenção proporciona um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de TP53 em uma amostra obtida do paciente; (b) comparar o nível de expressão de TP53 com um nível de referência de TP53; e (c) determinar um prognóstico para o paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que é aumentado em relação ao nível de referência. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0199] Por exemplo, em alguns casos, a invenção proporciona um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de EGFR em uma amostra obtida do paciente; (b) comparar o nível de expressão de EGFR com um nível de referência de EGFR; e (c) determinar um prognóstico para o paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que é aumentado em relação ao nível de referência. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0200] Em outros casos, a invenção proporciona um método para o prognóstico de um paciente que sofre de câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 4 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, ou 48 genes listados na Tabela 4) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, e (c) determinar um prognóstico para o paciente, em que um prognóstico ruim é indicado por um nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente que é alterado em relação ao nível de referência. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0201] Em qualquer dos métodos anteriores, o prognóstico pode ser um prognóstico de sobrevivência. Em alguns casos, o método é realizado antes da administração de uma terapia anticâncer ao paciente. Em outras modalidades, o método é realizado durante a administração de uma terapia anticâncer ao paciente. Em outras modalidades, o método é realizado após a administração de uma terapia anticâncer ao paciente.

[0202] Em qualquer dos métodos anteriores, o método pode ainda incluir a identificação do paciente como suscetível a beneficiar da administração de uma terapia anticâncer quando o paciente é determinado como tendo um prognóstico ruim de sobrevivência. Em outros casos, o método pode incluir ainda identificar o paciente como menos suscetível a beneficiar da administração de uma terapia anticâncer quando o paciente é determinado como tendo um prognóstico ruim de sobrevivência.

[0203] Em qualquer dos métodos anteriores, o método pode incluir ainda administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente, se o paciente for determinado como tendo um prognóstico ruim de sobrevivência, como descrito, por exemplo, na Seção III da Descrição Detalhada da Invenção.

[0204] Em qualquer dos métodos anteriores, a sobrevivência pode ser sobrevivência livre de doença, sobrevivência livre de progressão ou sobrevivência global.

[0205] Em outros casos, a invenção apresenta um método para determinar se um paciente com um câncer de bexiga é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 1 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ou 96 genes listados na Tabela 1) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que uma alteração no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível de responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0206] Por exemplo, em alguns casos, a invenção proporciona um método para determinar se um paciente com um câncer é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos seguintes genes: FGFR3, TP53 e EGFR, em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene a um nível de referência do pelo menos um gene, em que um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento que compreende uma terapia anticâncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0207] Por exemplo, em alguns casos, a invenção proporciona um método para determinar se um paciente com um câncer é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de FGFR3 em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de FGFR3 com um nível de referência de FGFR3, em que um aumento no nível de expressão de FGFR3 na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0208] Em outros casos, a invenção apresenta um método para determinar se um paciente com um câncer de bexiga é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de TP53 em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de TP53 com um nível de referência de TP53, em que um aumento no nível de expressão de TP53 na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0209] Em ainda outros casos, a invenção apresenta um método para determinar se um paciente com um câncer de bexiga é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de EGFR em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de EGFR com um nível de referência de EGFR, em que um aumento no nível de expressão de EGFR na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0210] Em outros casos, a invenção apresenta um método para determinar se um paciente com um câncer de bexiga é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 4 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, ou 48 genes listados na Tabela 4) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que uma alteração no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0211] Em alguns casos, a invenção proporciona um método de otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer para um paciente com um câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Tabela 1 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ou 96 genes listados na Tabela 1) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que uma alteração no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível de responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0212] Por exemplo, em alguns casos, a invenção proporciona um método de otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer para um paciente com um câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um (por exemplo, 1, 2 ou 3) dos seguintes genes: FGFR3, TP53, e EGFR em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene a um nível de referência do pelo menos um gene, em que um aumento do nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é provável de responder ao tratamento que compreende uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0213] Em alguns casos, a invenção proporciona um método de otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer para um paciente com um câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de FGFR3 em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão de FGFR3 com um nível de referência de FGFR3, em que um aumento no nível de expressão de FGFR3 na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0214] Em alguns casos, a invenção proporciona um método de otimizar a eficácia terapêutica de uma terapia anticâncer para um paciente com um câncer, o método compreendendo: (a) determinar o nível de expressão de pelo menos um dos genes listados na Table 4 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, ou 48 genes listados na Tabela 4) em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do pelo menos um gene com um nível de referência do pelo menos um gene, em que uma alteração no nível de expressão do pelo menos um gene na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que é suscetível a responder ao tratamento compreendendo uma terapia anticâncer. Em algumas modalidades, a alteração pode ser um aumento. Em outras modalidades, a alteração pode ser uma diminuição. Em modalidades particulares, o câncer é câncer de bexiga.

[0215] Em qualquer dos métodos anteriores, o método pode compreender ainda a determinação do nível de expressão de pelo menos um gene adicional selecionado do grupo que consiste em: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9 e FGF2, em uma amostra obtida do paciente, em que o nível de expressão do pelo menos um gene adicional é alterado em relação a um nível de referência do pelo menos um gene adicional.

[0216] Em alguns casos, a invenção proporciona um método de tratamento de um paciente que sofre de um câncer de bexiga, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer diferente da vacina Bacillus Calmette-Guérin (BCG), em que o nível de expressão de TP53 em uma amostra obtida do paciente foi determinada como sendo aumentada em relação a um nível de referência de TP53.

[0217] Em qualquer um dos métodos anteriores, o método pode ainda incluir administrar a uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma terapia anticâncer ao paciente, por exemplo, como descrito na Seção III da Descrição Detalhada da Invenção.

[0218] Em qualquer um dos métodos anteriores, o nível de expressão de um biomarcador da invenção, por exemplo, um gene listado na Tabela 1, por exemplo, FGFR3, TP53, ou EGFR, pode ser determinado medindo o RNA mensageiro (mRNA), conforme descrito, por exemplo abaixo ou por métodos conhecidos na técnica. Em alguns casos, o nível de expressão de um biomarcador da invenção em uma amostra obtida do paciente é determinado por um ensaio de reação em cadeia (PCR) de polimerase. Em alguns casos, o ensaio PCR é um ensaio PCR quantitativo. Em algumas modalidades, o ensaio PCR quantitativo é um ensaio de TAQMAN®. Em algumas modalidades, o ensaio é realizado usando um ensaio de Fluidigm.

[0219] Em qualquer um dos métodos anteriores, o nível de expressão de um biomarcador da invenção, por exemplo, um gene listado na Tabela 1, por exemplo, FGFR3, TP53, ou EGFR, pode ser determinado medindo a proteína, conforme descrito, por exemplo abaixo ou por métodos conhecidos na técnica. Em alguns casos, o nível de expressão de um biomarcador da invenção em uma amostra obtida do paciente é determinado por um método de imuno-histoquímica.

[0220] Um método exemplificativo para determinar o nível de expressão para FGFR3 por imuno-histoquímica é fornecido abaixo. Ensaios similares poderiam ser utilizados para outros biomarcadores da invenção.

[0221] Em uma modalidade, a sobre-expressão de FGFR3 pode ser analisada por IHC. As seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia de tumor podem ser submetidas ao ensaio de IHC e concedidas um critério de intensidade de coloração da proteína FGFR3 como se segue:

[0222] Pontuação 0: nenhuma coloração é observada ou a coloração de membrana observada é menor que 10% das células tumorais.

[0223] Pontuação 1+: coloração de membrana fraca/quase imperceptível é detectada em mais de 10% das células de tumor. As células são apenas manchadas em parte de sua membrana.

[0224] Pontuação 2+: uma coloração de membrana completa moderada é observada em mais de 10% das células de tumor.

[0225] Pontuação 3+: observa-se uma coloração de membrana completa moderada a forte em mais de 10% das células de tumor.

[0226] Em algumas modalidades, os tumores com pontuações de 0 ou 1+ para a avaliação da sobre-expressão de FGFR3 podem ser caracterizados como não sobre-expressando FGFR3, enquanto que os tumores com pontuações 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobre-expressando FGFR3.

[0227] Em algumas modalidades, os tumores que sobre- expressam FGFR3 podem ser classificados por pontuações imuno- histoquímicas correspondentes ao número de cópias de moléculas de FGFR3 expressas por célula e podem ser determinadas bioquimicamente: 0 = 0-90 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de 100 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 1000 cópias/célula, 3+ = pelo menos cerca de 10. 000 cópias/célula.

[0228] Em alguns casos, a amostra obtida do paciente é uma amostra de tumor.

[0229] Em qualquer dos métodos anteriores da invenção, o nível de expressão de um biomarcador da invenção (por exemplo, um gene listado na Tabela 1) em uma amostra obtida do paciente pode ser alterado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de biomarcador. Por exemplo, em algumas modalidades, o nível de expressão de um biomarcador da invenção em uma amostra obtida do paciente pode ser aumentado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de biomarcador. Em outras modalidades, o nível de expressão de um biomarcador da invenção em uma amostra obtida a partir do paciente pode ser diminuído pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de biomarcador.

[0230] Em modalidades particulares, o nível de expressão de pelo menos um (por exemplo, 1, 2 ou 3) do seguinte: FGFR3, TP53, e/ou EGFR em uma amostra obtida do paciente pode ser aumentada pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência do pelo menos um gene. Por exemplo, o nível de expressão de FGFR3 pode ser aumentado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de FGFR3. Em outro exemplo, o nível de expressão de TP53 pode ser aumentada pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de TP53. Em ainda outro exemplo, o nível de expressão de EGFR pode ser aumentado pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes ou mais em relação a um nível de referência de EGFR.

[0231] Em algumas modalidades, o nível de referência pode ser ajustado para qualquer percentil entre, por exemplo, o 20o percentil e o 99o percentil (por exemplo, o 20o, 25o, 30o, 35o, 40o, 45o, 50o, 55o, 60o, 65o, 70o, 75o, 80o, 85o, 90o, 95o, ou 99o percentil) da distribuição global do nível de expressão de um biomarcador (por exemplo, FGFR3, TP53, ou EGFR) em um determinado tipo de câncer (por exemplo, câncer de bexiga). Em modalidades particulares, o nível de referência pode ser ajustado para o 25o percentil da distribuição global dos valores em um câncer de bexiga. Em outras modalidades particulares, o nível de referência pode ser ajustado para o valor 50o percentil da distribuição global dos valores em um câncer de bexiga. Em outras modalidades, o nível de referência pode ser a mediana da distribuição global dos valores em um câncer de bexiga.

[0232] Os métodos divulgados e ensaios proporcionam meios potencialmente rentáveis, eficientes e convenientes para obter dados e informações úteis na avaliação de terapias adequadas ou eficazes para o tratamento de pacientes. Por exemplo, um paciente poderia fornecer uma amostra (por exemplo, uma biópsia do tumor ou uma amostra de sangue) para o diagnóstico de um câncer em particular, ou subtipo de câncer. Em alguns casos, o diagnóstico poderia ser para câncer de bexiga. Em outros casos, o diagnóstico poderia ser para um subtipo de câncer de bexiga, por exemplo, NMIBC, MIBC ou câncer metastático de bexiga. Em outros casos, um paciente poderia proporcionar uma amostra (por exemplo, uma biópsia do tumor ou uma amostra de sangue) antes do tratamento com uma terapia anticâncer e a amostra poderia ser examinada por meio de vários ensaios in vitro para determinar se as células do paciente seriam sensíveis a uma terapia anticâncer, por exemplo, uma terapia anticâncer, incluindo um antagonista FGFR3, um antagonista de TP53, e/ou um antagonista de EGFR.

[0233] Uma das habilidades nas técnicas médicas, particularmente relativa à aplicação de testes de diagnóstico e tratamento com terapêuticos, reconhecerá que sistemas biológicos são um pouco variáveis e nem sempre totalmente previsíveis, e assim testes muito bons de diagnóstico ou terapêuticos são ocasionalmente ineficazes. Assim, dependendo somente do julgamento do médico assistente determinar o curso de tratamento mais adequado para um paciente individual, com base nos resultados do teste, na condição do paciente e no histórico, e na sua própria experiência. Podem até haver ocasiões, por exemplo, quando um médico vai escolher tratar um paciente com uma terapia anticâncer, por exemplo, uma terapia anticâncer, incluindo um antagonista (por exemplo, um antagonista FGFR3, um antagonista de TP53 e/ou um antagonista de EGFR), mesmo quando não se prevê que um paciente seja particularmente sensível aos antagonistas de VEGF, com base em dados de testes de diagnóstico ou de outros critérios, particularmente se todas ou a maioria das outras opções de tratamento óbvias falharem ou se alguma sinergia for antecipada quando administrada com outro tratamento.

[0234] A amostra pode ser retirada de um paciente que é suspeito de ter, ou é diagnosticado como tendo um câncer (por exemplo, câncer de bexiga) e, portanto, é provável que necessite de tratamento, ou de um indivíduo normal que não é suspeito de ter qualquer distúrbio. Para avaliação da expressão do marcador, as amostras dos pacientes, tais como aquelas que contêm células, ou proteínas ou ácidos nucleicos produzidos por essas células, podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção. Nos métodos desta invenção, o nível de um biomarcador pode ser determinado avaliando a quantidade (por exemplo, o valor absoluto ou a concentração) dos marcadores em uma amostra, de preferência uma amostra de tecido (por exemplo, uma tumor amostra de tecido, tal como uma biópsia). Além disso, o nível de um biomarcador pode ser avaliado em fluidos ou excreções contendo níveis detectáveis de biomarcadores. Fluidos corporais ou secreções úteis como amostras na presente invenção incluem, por exemplo, sangue, urina, saliva, fezes, líquido pleural, líquido linfático, escarro, ascite, fluido prostático, líquido cerebrospinal (CSF), ou qualquer outra secreção corporal ou derivados dos mesmos. A palavra sangue deve incluir qualquer derivado de sangue, plasma, soro ou sangue total. A avaliação de um biomarcador em tais fluidos ou excreções às vezes pode ser preferida em circunstâncias onde um método de amostragem invasiva é impróprio ou inconveniente. No entanto, no caso de amostras que são fluidos corporais, a amostra a ser testada aqui é de preferência tecido sinovial, sangue ou líquido sinovial, mais de preferência de sangue.

[0235] A amostra pode ser congelada, fresca, fixa (por exemplo, fixada em formalina), centrifugada e/ou incorporada (por exemplo, embebida em parafina), etc. A amostra de células pode, naturalmente, ser submetida a uma variedade de técnicas de preparação e armazenamento pós-coleta (por exemplo, extração de ácido nucleico e/ou proteína, fixação, armazenamento, congelamento, ultrafiltração, concentração, evaporação, centrifugação, etc.) antes de avaliar a quantidade do marcador na amostra. Do mesmo modo, as biópsias podem também ser submetidas a técnicas de preparação e armazenamento pós-coleta, por exemplo, fixação.

[0236] Como mencionado acima, qualquer um dos métodos anteriores pode, opcionalmente, incluir ainda a seleção de uma terapia anticâncer para administração ao paciente e incluir ainda, opcionalmente, a administração de uma terapia anticâncer ao paciente.

A. DETECÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE

[0237] Os biomarcadores genéticos aqui descritos podem ser detectados usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, amostras de tecidos ou células de mamíferos podem ser convenientemente analisadas para, por exemplo, mRNAs ou DNAs de um biomarcador genético de interesse utilizando Northern, dot-blot ou análise de reação em cadeia de polimerase (PCR), hibridação em matriz, ensaio de proteção RNase ou utilizando microarranjos de DNA SNP chip, que estão comercialmente disponíveis, incluindo microarranjos de DNA instantâneos. Por exemplo, ensaios de PCR em tempo real (RT-PCR), tais como ensaios de PCR quantitativos são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade ilustrativa da invenção, um método para detectar mRNA de um biomarcador genético de interesse em uma amostra biológica compreende produzir cDNA da amostra por transcrição reversa usando pelo menos um iniciador; amplificação do cDNA então produzida; e detectar a presença do cDNA amplificado. Além disso, tais métodos podem incluir uma ou mais etapas que permitem determinar os níveis do mRNA em uma amostra biológica (por exemplo, examinando simultaneamente os níveis de uma sequência de mRNA de controle comparativo de um gene de "arrumação" como um membro da família actina). Opcionalmente, pode ser determinada a sequência do cDNA amplificado. Métodos exemplificativos para detectar o nível de expressão de FGFR3 são proporcionados, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US2014/0030259 e na Patente US 8.410.250, ambos os quais são incorporados aqui por referência na sua totalidade.

1. DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

[0238] Em uma modalidade específica, a expressão dos genes estabelecidos na Tabela 1 pode ser executada pela tecnologia de RT-PCR. As sondas usadas para PCR podem ser marcadas com um marcador detectável, tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelante de metal ou enzima. Tais sondas e iniciadores podem ser usados para detectar a presença de genes expressos, estabelecidos na Tabela 1, em uma amostra. Como será entendido pelo versado na técnica, podem preparar-se um grande número de iniciadores e sondas diferentes com base nas sequências aqui proporcionadas e utilizados eficazmente para amplificar, clonar e/ou determinar a presença e/ou níveis de genes expressos apresentados na Tabela 1 e/ou Tabela 4. Em algumas modalidades, o RT-PCR pode ser RT-PCR quantitativo. Em alguns casos, o RT- PCR quantitativo pode ser executado em um dispositivo microfluídico, por exemplo, uma plataforma de Fluidigm BIOMARK™ BMK-M-96. 96.

[0239] Outros métodos incluem protocolos que examinam ou detectam mRNAs de pelo menos um dos genes estabelecidos na Tabela 1 (por exemplo, FGFR3, TP53 e EGFR mRNAs), em uma amostra de tecido ou célula por tecnologias de microarranjo. Utilizando microarranjos de ácido nucleico, as amostras de mRNA de teste e controle de amostras de tecido de teste e de controle são transcritas inversamente e marcadas para gerar sondas de cDNA. As sondas são então cruzadas para uma matriz de ácidos nucleicos imobilizada em um suporte sólido. A matriz é configurada tal que a sequência e a posição de cada membro da matriz são conhecidas. Por exemplo, uma seleção de genes que têm potencial para ser expresso em certos estágios da doença pode ser disposta em um suporte sólido. A hibridização de uma sonda marcada com um membro de matriz específico indica que a amostra da qual a sonda foi derivada expressa esse gene. A análise da expressão diferencial do gene do tecido da doença pode fornecer informações valiosas. A tecnologia de microarranjo utiliza técnicas de hibridação de ácido nucleico e tecnologia de computação para avaliar o perfil de expressão de mRNA de milhares de genes dentro de uma única experiência (ver, por exemplo, WO 2001/75166). Ver, por exemplo, Patente US 5.700.637, Patente US 5.445.934 e Patente US 5.807.522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); e Cheung et al., Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999) para uma discussão de fabricação de arranjo.

[0240] Além disso, o método de perfilação e detecção de DNA utilizando microarranjos descritos em EP 1753878 pode ser empregado. Esse método rapidamente identifica e distingue entre diferentes sequências de DNA utilizando microarranjos de DNA e breve análise de repetição em tandem (STR). Em uma modalidade, uma sequência alvo marcada STR é hibridizada a um microarranjo de DNA transportando sondas complementares. Estas sondas variam em comprimento para cobrir a faixa de possíveis STRs. As regiões de cadeia única marcadas dos híbridos de DNA são seletivamente removidas da superfície de microarranjo utilizando uma digestão enzimática pós-hibridação. ão. O número de repetições no alvo desconhecido é deduzido com base no padrão de DNA alvo que permanece hibridizado com o microarranjo.

[0241] Um exemplo de um processador de microarranjo é o sistema de Affymetrix GENECHIP®, que está disponível comercialmente e é composto por matrizes fabricadas por síntese direta dos oligonucleotídeos sobre uma superfície de vidro. Outros sistemas podem ser usados como conhecido de um versado na técnica.

[0242] Outros métodos para determinação do nível do biomarcador além de RT-PCR ou outro método à base de PCR incluem técnicas de proteômica, bem como perfis genéticos individualizados que são necessários para tratar um câncer com base na resposta do paciente a um nível molecular. Os microarranjos especializados aqui, por exemplo, microarranjos de oligonucleotídeos ou microarranjos de cDNA, podem compreender um ou mais biomarcadores com perfis de expressão que se correlacionam quer com a sensibilidade quer com a resistência a uma ou mais terapias anticâncer. Outros métodos que podem ser usados para detectar ácidos nucleicos, para uso na invenção, envolvem análise de expressão de sequências de RNA de alta vazão, incluindo análise genômica à base de RNA, tal como, por exemplo, RNASeq.

[0243] Muitas referências estão disponíveis para fornecer orientação na aplicação das técnicas acima (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982); e Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-1 58 (CRC Press, Inc.,1987)). A análise de Northern blot é uma técnica convencional bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edição, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Protocolos típicos para avaliar o status de genes e produtos de genes são encontrados, por exemplo em Ausubel et al. eds.,1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) e 18 (PCR Analysis).

2. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS

[0244] Quanto à detecção de biomarcadores de proteína, como aqueles listados na Tabela 1 (por exemplo, FGFR3, TP53 e/ou EGFR), vários ensaios de proteína estão disponíveis incluindo, por exemplo, métodos baseados em anticorpos, bem como espectroscopia de massa e outros meios semelhantes, conhecidos na técnica. No caso de métodos baseados em anticorpos, por exemplo, a amostra pode ser contactada com um anticorpo específico para o referido biomarcador em condições suficientes para um complexo anticorpo-biomarcador se formar, e então detectar o referido complexo. A detecção da presença de biomarcador de proteína pode ser realizada em uma série de maneiras, tais como por Western blotting (com ou sem imunoprecipitação), SDS-PAGE 2-dimensional, imunoprecipitação, triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), citometria de fluxo e procedimentos de ELISA para análise de uma grande variedade de tecidos e amostras, incluindo o plasma ou soro. Está disponível uma ampla variedade de técnicas de imunoensaio utilizando um tal formato de ensaio, ver, por exemplo, Patente US 4.016.043, 4.424.279 e 4.018.653. Estes incluem ensaios de sítio único e de dois sítios ou "sanduíche" dos tipos não competitivos, bem como nos ensaios de ligação competitiva tradicionais. Estes ensaios incluem também a ligação direta de um anticorpo marcado para um biomarcador alvo.

[0245] Ensaios de sanduíche estão entre os ensaios mais úteis e comumente usados. Existe um número de variações da técnica do ensaio de sanduíche, e todos se destinam a ser abrangidos pela presente invenção. Resumidamente, em um ensaio para frente típico, um anticorpo não marcado é imobilizado em um substrato sólido, e a amostra a ser testada é posta em contato com a molécula ligada. Após um período adequado de incubação, por um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo antígeno- anticorpo, um segundo anticorpo específico para o antígeno, marcado com uma molécula de repórter, capaz de produzir um sinal detectável é então adicionado e incubado, permitindo tempo suficiente para a formação de um outro complexo de anticorpo anticorpo-antígeno marcado. Qualquer material que não tenha reagido é lavado, e a presença do antígeno é determinada pela observação do sinal produzido pela molécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, pela simples observação do sinal visível, ou podem ser quantificados através da comparação com uma amostra de controle contendo quantidades conhecidas de biomarcador.

[0246] Variações sobre o ensaio para frente incluem um ensaio simultâneo, na qual tanto a amostra quanto o anticorpo marcado são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado. Estas técnicas são bem conhecidas para aqueles versados na técnica, incluindo quaisquer variações menores, como será prontamente aparente. Em um ensaio de sanduíche para frente típico, um primeiro anticorpo tendo especificidade para o biomarcador é covalentemente ou passivamente ligado a uma superfície sólida. A superfície sólida é geralmente vidro ou um polímero, os polímeros mais comumente usados, sendo a celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinil ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser em forma de tubos, grânulos, discos de microplacas, ou qualquer outra superfície adequada para a realização de um imunoensaio. Os processos de ligação são conhecidos na técnica e geralmente consistem em ligar em reticulação ligando covalentemente ou adsorvendo fisicamente, o complexo polímero-anticorpo é lavado em preparação para a amostra de teste. Uma alíquota da amostra a ser testada é então adicionada ao complexo de fase sólida e incubada por um período de tempo suficiente (por exemplo, 2-40 minutos ou durante a noite, se mais conveniente) e sob condições adequadas (por exemplo, de temperatura de 40°C, tal como entre 25°C e 32°C inclusiva) para permitir a ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo. Após o período de incubação, a fase sólida de subunidade de anticorpo é lavada e secada e incubada com um segundo anticorpo específico para uma porção do biomarcador. O segundo anticorpo é ligado a uma molécula repórter que é usada para indicar a ligação de um segundo anticorpo para o marcador molecular.

[0247] Um método alternativo envolve a imobilização dos biomarcadores alvo na amostra e depois a exposição do alvo imobilizado a um anticorpo específico que pode ou não ser marcado com uma molécula repórter. Dependendo da quantidade de alvo e da intensidade do sinal da molécula repórter, um alvo ligado pode ser detectável por marcação direta com o anticorpo. Alternativamente, um segundo anticorpo marcado, específico para o primeiro anticorpo é exposto ao complexo do primeiro anticorpo alvo para formar um complexo terciário dede primeiro anticorpo e segundo anticorpo alvo. O complexo é detectado pelo sinal emitido pela molécula repórter. Por "molécula repórter", tal como é utilizado no presente relatório descritivo, entende-se uma molécula que, pela sua natureza química, proporciona um sinal analiticamente identificável que permite a detecção de anticorpo ligado ao antígeno. As moléculas repórter mais utilizadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclídeos (isto é, radioisótopos) e moléculas quimioluminescentes.

[0248] No caso de um imunoensaio enzimático, uma enzima é conjugada com o segundo anticorpo, geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Como será facilmente reconhecido, contudo, existe uma grande variedade de diferentes técnicas de conjugação, que estão prontamente disponíveis para o versado na técnica. As enzimas comummente utilizadas incluem peroxidase de rábano, glucose oxidase, beta-galactosidase e fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos a serem utilizados com as enzimas específicas são geralmente escolhidos para a produção, por hidrólise pela enzima correspondente, de uma alteração de cor detectável. Exemplos de enzimas adequadas incluem fosfatase alcalina e peroxidase. É também possível empregar substratos fluorogênicos, que produzem um produto fluorescente em vez dos substratos cromogênicos mencionados acima. Em todos os casos, o anticorpo marcado com enzima é adicionado ao primeiro complexo de marcador anticorpo-molecular, deixado ligar, e depois o excesso de reagente é lavado. Uma solução contendo o substrato apropriado é então adicionada ao complexo de anticorpo-antígeno-anticorpo. O substrato irá reagir com a enzima ligada ao segundo anticorpo, dando um sinal visual qualitativo, que pode ser adicionalmente quantificado, usualmente espectrofotometricamente, para dar uma indicação da quantidade de biomarcador que estava presente na amostra. Alternativamente, os compostos fluorescentes, tais como a fluoresceína e a rodamina, podem ser quimicamente acoplados a anticorpos sem alterar a sua capacidade de ligação. Quando ativado por iluminação com luz de um determinado comprimento de onda, o anticorpo marcado com fluorocromo adsorve a energia luminosa, induzindo um estado à excitabilidade na molécula, seguido pela emissão da luz em uma cor característica visualmente detectável com um microscópio óptico. Como o EIA, o anticorpo marcado fluorescente é permitido ligar ao primeiro complexo de marcador anticorpo-molecular complexo. Após lavagem do reagente não ligado, o restante complexo terciário é então exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a fluorescência observada indica a presença do marcador molecular de interesse. Técnicas de imunofluorescência e EIA são ambas muito bem estabelecidas na técnica. No entanto, podem também ser utilizadas outras moléculas repórter, tais como radioisótopo, moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes.

B. KITS

[0249] Para utilização na detecção dos biomarcadores, kits ou artigos de fabricação são também proporcionados pela invenção. Tais kits podem ser utilizados, por exemplo, para diagnosticar um paciente que sofra de, ou suspeita de sofrer, de um câncer (por exemplo, câncer de bexiga), para proporcionar um prognóstico para um paciente que sofra de câncer, por exemplo, câncer de bexiga e/ou para determinar se um paciente com câncer (por exemplo, câncer de bexiga) responderá, de forma eficaz, a uma terapia anticâncer. Estes kits podem compreender um meio de suporte que está compartimentado para receber em confinamento próximo um ou mais meios de recipiente tais como frascos, tubos e semelhantes, compreendendo cada um dos meios de recipiente um dos elementos separados a utilizar no método. Por exemplo, um dos meios de recipiente pode compreender uma sonda que é ou pode ser marcada de forma detectável. Tal sonda pode ser um anticorpo ou polinucleotídeo específico para uma proteína ou mensagem, respectivamente. Quando o kit utiliza hibridação de ácido nucleico para detectar o ácido nucleico alvo, o kit também pode ter recipientes contendo nucleotídeo(s) para amplificação da sequência de ácido nucleico alvo e/ou um recipiente compreendendo um meio repórter, tal como uma proteína de ligação de biotina, por exemplo, avidina ou estreptavidina, ligada a uma molécula repórter, tal como um marcador enzimático, fluorescente ou radioisótopo.

[0250] Tal kit compreenderá tipicamente o recipiente descrito acima e um ou mais outros recipientes compreendendo materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de utilização. Um marcador pode estar presente no recipiente para indicar que a composição é utilizada para uma aplicação específica e também pode indicar direções para uso in vivo ou in vitro, como os descritos acima.

[0251] Os kits da invenção têm uma série de modalidades. Uma modalidade típica é um kit compreendendo um recipiente, um marcador no referido recipiente e uma composição contida no referido recipiente, em que a composição inclui um anticorpo primário que se liga a um biomarcador de proteína ou autoanticorpo e o marcador no referido recipiente indica que a composição pode ser utilizada para avaliar a presença de tais proteínas ou anticorpos em uma amostra, e em que o kit inclui instruções para utilizar o anticorpo para avaliar a presença de proteínas biomarcadoras em um determinado tipo de amostra. O kit pode ainda compreender um conjunto de instruções e materiais para preparar uma amostra e aplicar anticorpo à amostra. O kit pode incluir um anticorpo primário e secundário, em que o anticorpo secundário é conjugado com um marcador, por exemplo, um marcador enzimático.

[0252] Outra modalidade é um kit compreendendo um recipiente, um marcador no referido recipiente e uma composição contida no referido recipiente, em que a composição inclui um ou mais polinucleotídeos que hibridam com um complemento de um biomarcador apresentado na Tabela 1 sob condições rigorosas e o marcador no referido recipiente indica que a composição pode ser utilizada para avaliar a presença de um biomarcador apresentado na Tabela 1 em uma amostra, e em que o kit inclui instruções para utilizar os polinucleotídeo(s) para avaliar a presença do RNA ou DNA biomarcador em um determinado tipo de amostra.

[0253] Outros componentes opcionais do kit incluem um ou mais tampões (por exemplo, tampão de bloco, tampão de lavagem, tampão de substrato, etc), outros reagentes, tais como o substrato (por exemplo, cromógeno) que é alterado quimicamente por um marcador enzimático, solução de recuperação de epítopo, amostras de controle (controles positivos e/ou negativos), lâminas de controle, etc. Kits também podem incluir instruções para interpretar os resultados obtidos usando o kit.

[0254] Em ainda modalidades específicas, para kits baseados em anticorpos, o kit pode compreender, por exemplo: (1) um primeiro anticorpo (por exemplo, ligado a um suporte sólido) que se liga a uma proteína biomarcadora; e, opcionalmente, (2) um segundo anticorpo diferente que se liga à proteína ou ao primeiro anticorpo e é conjugado com um marcador detectável.

[0255] Para kits baseados em oligonucleotídeos, o kit pode compreender, por exemplo: (1) um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotídeo marcado de forma detectável, que hibrida com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína biomarcadora ou (2) um par de iniciadores úteis para amplificar uma molécula de ácido nucleico biomarcadora. O kit também pode compreender, por exemplo, um agente tampão, um conservante ou um agente estabilizante de proteínas. O kit pode ainda compreender componentes necessários para detectar o marcador detectável (por exemplo, uma enzima ou um substrato). O kit também pode conter uma amostra de controle ou uma série de amostras de controle que podem ser ensaiadas e comparadas com a amostra de teste. Cada componente do kit pode ser incluído dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de uma única embalagem, juntamente com instruções para interpretar os resultados dos ensaios realizados utilizando o kit.

[0256] Em algumas modalidades, um kit compreende qualquer uma das sequências de nucleotídeos aqui descritas, por exemplo, uma ou mais das SEQ ID NOs: 1-51,

V. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[0257] As formulações terapêuticas do(s) agente(s) terapêutico(s) das terapias anticâncer aqui descritas (por exemplo, terapias anticâncer incluindo antagonistas, tais como antagonistas de FGFR3, antagonistas de TP53 e/ou antagonistas de EGFR) preparadas para a presente invenção são preparadas para armazenamento, misturando o(s) agente(s) terapêutico(s) com o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Para obter informações gerais sobre formulações, ver, por exemplo, Gilman et al., (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania; Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; e Lieberman et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.)(2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker.

[0258] Carreadores, excipientes e estabilizantes aceitáveis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como o cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como a glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como o EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tais como o sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[0259] As formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea são descritas, por exemplo, na Patente US 6.267.958 (Andya et al.). Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado para uma concentração de proteína elevada e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao mamífero a ser tratado aqui.

[0260] As formas cristalizadas do(s) agente(s) terapêutico(s) também estão contempladas. Ver, por exemplo, US 2002/0136719A1.

[0261] A formulação aqui contida também pode conter mais do que um composto ativo (um segundo medicamento tal como referido acima), de preferência aqueles com atividades complementares que não se afetam mutuamente. O tipo e as quantidades eficazes de tais medicamentos dependem, por exemplo, da quantidade e do tipo de agente(s) terapêutico(s) presente(s) na formulação e dos parâmetros clínicos dos sujeitos. Tais segundos medicamentos preferidos são indicados acima.

[0262] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em umas microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas da albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

[0263] Podem preparar-se preparações de liberação prolongada. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo nas quais as matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e de etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis, tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático- ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[0264] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

EXEMPLOS

[0265] Os exemplos a seguir são proporcionados para ilustrar, mas não limitar, a invenção presentemente reivindicada.

EXEMPLO 1. MATERIAIS E MÉTODOS AMOSTRAS DE TUMOR

[0266] Uma coleção de 204 amostras de tumores de câncer de bexiga fixadas com formalina embebidas em parafina (FFPE) foram obtidas da Cureline, Inc. (South San Francisco, CA), após a aprovação do Comitê de Ética do Hospital de Oncologia Clínica de São Petersburgo e a confirmação apropriada do consentimento informado por escrito, ou do Grupo MT (Van Nuys, CA), após a aprovação pelo Conselho de Revisão Institucional (Sterling Institutional Review Board). As amostras clínicas recapitularam fielmente a razão esperada ~ 80%/20% para sexo masculino/feminino que é tipicamente observada no câncer de bexiga, e as razões de cânceres de bexiga não invasivos ao músculo (NMIBCs, T0, T1) MIBCs, T2, T3) e metástases foram ~ 75% e ~ 25%, respectivamente (Figura 1), consistente com a incidência clínica destes estágios na população de câncer de bexiga (Jemal et al. CA Cancer J. Clin. 61(2): 69-90, 2011; Heney, Urol. Clin. North Am. 19(3): 429-433, 1992; Hall et al. Urology 52(4): 594-601, 1998). Um subconjunto de casos apresentava informações de tratamento de acompanhamento, sobrevivência livre de doença (DFS) e anotação de sobrevivência global (OS) semelhantes aos parâmetros clínicos esperados para os respectivos grupos (Figura 1, Tabela 3).

[0267] As seções coradas com hematoxilina e eosina (H&E) foram avaliadas por dois patologistas independentes e as áreas tumorais para casos com menos de 70% de celularidade neoplásica foram marcadas por um patologista para macrodissecção. Em geral, o teor tumoral variou de 70-90%. O RNA e o DNA foram extraídos de amostras macrodissecadas como anteriormente descrito (Schleifman et al. PLoS One 9(3): e90761; Schleifman et al. PLoS One 9(2): e88401).

ANÁLISE DE EXPRESSÃO

[0268] A análise de expressão genética foi realizada em RNA extraído de amostras tumorais de FFPE macrodissecadas utilizando o Micro Kit de RNA da FFPE High Pure (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) após desparafinização com ENVIRENE™, como descrito anteriormente (Schleifman et al. PLoS One 9(2): e88401). A análise de expressão genética de 96 transcritos de mRNA únicos de genes relevantes para o câncer de bexiga (ver Tabela 1) foi realizada em amostras de paciente a partir de 100 ng de RNA total que foi transcrito inversamente para cDNA e pré-amplificado em uma única reação utilizando SUPERSCRIPT® III/PLATINUM® Taq e mistura de reação de pré- amplificação (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todos os 96 conjuntos de iniciador/sonda TAQMAN® foram incluídos na reação de pré-amplificação em uma diluição final de 0,05x de concentração de ensaio TAQMAN® original (Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições de termociclagem foram as seguintes: 1 ciclo de 50°C durante 15 min, 1 ciclo de 70°C durante 2 min, 14 ciclos de 95°C durante 15 s e 1 ciclo de 60°C durante 4 min. O cDNA pré- amplificado foi diluído 2 vezes e depois amplificado utilizando TAQMAN® Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA) na plataforma BIOMARK™ BMK-M-96. 96 (Fluidigm, South San Francisco, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado. Os valores de limiar de ciclo (Ct) foram convertidos para expressão relativa utilizando o método 2-ΔCt (Livak et al. Methods 25(4):402-408, 2001), em que ΔCt é a média do gene alvo menos a média dos 96 valores de Ct calculados para a respectiva amostra de paciente. A Tabela 2 mostra as sequências nucleotídicas de sondas e oligonucleotídeos TAQMAN® personalizados que foram utilizados para os genes indicados. TABELA 1. PAINEL DE MICROFLUÍDICA DE CÂNCER DE BEXIGA PERSONALIZADO E ENSAIOS CORRESPONDENTES HGNC = Comitê de Nomenclatura de Gene HUGO. TABELA 2: SEQUÊNCIAS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA SONDAS E INICIADORES TAQMAN® PERSONALIZADOS

ANÁLISES DE MUTAÇÕES E SEQUENCIAMENTO DE PRÓXIMA GERAÇÃO

[0269] As análises de mutação foram realizadas em DNA genético extração de tecidos FFPE macrodissecados utilizando o kit QIAAMP© FFPE (Qiagen, Valencia, CA) após deparafinização com ENVIRENE™ (Schleifman et al. PLoS One 9(3): e90761). Mutações em PIK3CA, EGFR, KRAS, NRAS, HRAS, FGFR3, MET, BRAF, KIT, AKT1, e FLT3 foram detectadas usando qPCR específico da mutação como descrito anteriormente (Schleifman et al. PLoS One 9(3): e90761). O sequenciamento de próxima geração (NGS) foi realizado utilizando a sequenciação de próxima geração ION TORRENT™ utilizando o ION AMPLISEQTM Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com as diretrizes do fabricante (ver, por exemplo, Tsongalis et al. Clin. Chem. Lab. Med. 52(5): 707-714, 2014). A Tabela 3 apresenta um resumo dos resultados da análise da mutação NGS das amostras de câncer de bexiga (WT, tipo selvagem, MUT, mutante). TABELA 3: ANÁLISE DE MUTAÇÃO NGS DE AMOSTRAS DE CÂNCER DE BEXIGA

IMUNO-HISTOQUÍMICA DE FGFR3

[0270] A imuno-histoquímica (IHC) foi realizada em uma seção de tecido FFPE de 4 μm de espessura utilizando a plataforma Ventana DISCOVERY® XT Autostainer (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ). Para a detecção de FGFR3, as lâminas foram submetidas a pré-tratamento utilizando a recuperação de antígeno prolongada CC1 seguida de coloração com anticorpo primário anti-FGFR3, clone 15C3 (Genentech) diluído a 1 μg/mL e incubadas durante 60 minutos à temperatura ambiente. Para amplificação do sinal de FGFR3, um anticorpo de ligação de camudongo anticamundongo não conjugado (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) foi aplicado a 1 μg/mL e incubado durante 32 minutos à temperatura ambiente. Este foi seguido por um kit anti- coelho-OMNIMAP™ peroxidase de rábano (HRP) (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ).

[0271] As seções foram contra-coradas com hematoxilina, desidratadas, desobstruídas e cobertas-deslizadas para visualização.

ESTUDOS DE VIABILIDADE DE LINHAGENS CELULARES

[0272] As linhagens celulares de câncer de bexiga foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ou da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). As linhagens celulares foram arquivadas em uma passagem precoce no banco de células de Genentech e autenticadas quer por um ensaio de repetição em tandem curto de multiplex ou como anteriormente descrito (O'Brien et al. Clin. Cancer Res. 16(14): 3670-3683, 2010). Todas as linhagens celulares foram mantidas em RPMI 1640 ou DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (Sigma, St. Louis, MO), aminoácidos não essenciais, e L-glutamina 2 mmol/L.

[0273] O Erlotinibe (TARCEVA™) é um inibidor seletivo e potente de EGFR. Detalhes de sua estrutura, seletividade e propriedades biológicas foram previamente descritos (Stamos et al. J. Biol. Chem. 277(48): 46265-46272, 2002). Os estudos de viabilidade celular foram realizados como previamente descrito (O'Brien et al. Clin. Cancer Res. 16(14): 3670-3683, 2010). As células foram plaqueadas em quadruplicado a uma densidade de 2500 células por poço em placas de 384 poços em meio de crescimento normal e deixadas a aderir durante a noite. A resposta à dose de erlotinibe foi determinada por tratamento com 10 concentrações com base em uma série de diluição de 3 vezes começando com uma dose de 5 uM. A viabilidade celular foi medida 72 horas depois utilizando o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CELLTITER-GLO® (Promega, Madison, WI). A viabilidade percentual a cada concentração foi calculada em comparação com o controle tratado apenas com DMSO.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0274] Para identificar as aglomerações de amostras de tecido (subgrupos), a aglomeração hierárquica não supervisionada foi realizada utilizando distância euclidiana e ligação completa. Testes não paramétricos de Mann-Whitney (ver, por exemplo, Mann and Whitney, Annals of Mathematical Statistics 18(1): 50-60, 1947) e correções de Bonferroni (ver, por exemplo, Bonferroni, Pubblicazioni del R Instituto Superiore di Scienze Economiche e Commerciali di Firenze 8: 3-62, 1936 and Miller, Simultaneous Statistical Inference, 2a Ed., Springer Verlag, páginas 6-8, 1981) foram aplicadas para identificar ainda mais genes expressos diferencialmente entre as aglomerações de amostras da bexiga. DFS foi definido como o tempo desde a data da cirurgia até a data de recorrência ou morte. OS foi similarmente definido como o tempo desde a data da cirurgia até a data da morte. Os resultados de sobrevivência foram censurados no último momento observado quando o paciente era conhecido por estar livre de recorrência (para DFS) ou vivo (para OS). As estimativas de Kaplan-Meier (ver, por exemplo, Kaplan and Meier, Journal of the American Statistical Association 53(282): 457-481, 1958) foram utilizadas para estimar a probabilidade de DFS e a probabilidade de sobrevivência ao longo do tempo. A taxa de DFS de 3 e 5 anos e a taxa de sobrevivência também foram calculadas a partir das estimativas da curva de DFS/OS de Kaplan-Meier. Para a significância da frequência de mutação diferencial entre as aglomerações, o teste exato de Fisher foi realizado. O teste exato de Fisher (ver, por exemplo, Fisher, Journal of the Royal Statistical Society 85(1): 87-94, 1922) e testes T de duas caudas (ver, por exemplo, Student, Biometrika 6(1): 1-25, 1908) como indicado para comparações estatísticas.

EXEMPLO 2: DESENVOLVIMENTO DE UM PAINEL DE EXPRESSÃO DE GENES DE CÂNCER DE BEXIGA PERSONALIZADO BASEADO EM MICROFLUÍDICOS E SUA APLICAÇÃO NA ESTRATIFICAÇÃO DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE CÂNCER DE BEXIGA ARQUIVADAS

[0275] Embora as análises genômicas tenham fornecido informações valiosas sobre os fundamentos moleculares do câncer de bexiga, a maioria dos estudos anteriores baseia-se no uso de tecidos congelados que produzem ácidos nucleicos de alta qualidade e geralmente não são adequados para a caracterização de amostras de arquivo de ensaios clínicos. No entanto, as amostras de arquivo de ensaios clínicos são frequentemente associadas com informações sobre o tratamento, informações sobre sobrevivência livre de doença (DFS) e sobrevivência global (OS) e outras informações que os tornam uma excelente plataforma para a análise genômica do câncer. Aqui desenvolvemos um painel de expressão de genes de câncer de bexiga baseado em microfluídicos que é otimizado para a análise de tecidos embebidos em parafina fixados em formolina. O painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado é constituído por 96 genes que foram selecionados para capturar os atributos-chave da biologia do câncer de bexiga (ver Tabela 1). O painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado descrito na Tabela 1 inclui dois genes de manutenção para controle de qualidade de dados e normalização, juntamente com 91 genes únicos de câncer de bexiga (ver Figura 12A).

[0276] Avaliamos a capacidade do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado de identificar com sucesso os subtipos de câncer de bexiga em um grande conjunto de dados publicamente disponível (Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12):3377-3386, 2012). A comparação de gráficos de Análise de Componentes Principais (PCA) com base na expressão de 18. 000 genes de Sjodahl et al. (Supra) com gráficos de PCA utilizando 82 genes sobrepostos a partir do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado mostrou padrões comparáveis de segregação da amostra (Figuras 2A-2B). Em seguida, realizou- se a análise de Análise Diagonal Linear Discriminante (DLDA) (Diaz-Uriarte et al. BMC Bioinformatics 7: 3, 2006) para avaliar a exatidão de nosso painel em classificar corretamente o câncer de bexiga do estudo de Sjodahl. Descobrimos que aproximadamente 200 dos 18. 000 genes de Sjodahl et al. (Supra) foram necessários para classificar corretamente a maioria dos subtipos relatados em seu estudo com uma precisão >80% (Figura 2C). Em comparação, apenas 20 genes do câncer de bexiga, o painel de Fluidigm classificou corretamente o conjunto de dados de Sjodahl com uma precisão >80% (Figura 2D). Isto indicou que os genes cuidadosamente selecionados no painel capturam as principais classes de transcrição da doença com um elevado grau de exatidão.

[0277] Para confirmar a robustez e a reprodutibilidade do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado na medição da expressão genética em amostras de FFPE, realizou-se uma série de experiências de controle de qualidade (Figuras 3A-3E). Primeiro, realizamos diluições em série para avaliar o desempenho de cada um dos 96 ensaios, redesenhando os ensaios quando necessário, para obter curvas de diluição padrão linear para todos os testes (Figuras 3A e 3B). Em segundo lugar, realizamos conjuntos de amostras de RNA derivadas de FFPE e observamos uma alta concordância nos resultados para amostras de repetição executadas em dias diferentes (Figuras 3C e 3D; R2 > 0,98). Em terceiro lugar, observou-se um alto grau de reprodutibilidade de dados de chip para chip para amostras de RNA de controle que incluímos em cada sete execuções independentes (Figura 3E; R2 > 0,92). No total, os resultados de nossas avaliações qualitativas e quantitativas indicam que o painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado fornece uma plataforma robusta e biologicamente relevante para estratificar transcricionalmente cânceres de bexiga.

[0278] Utilizou-se o painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado na análise de um conjunto de tecidos de câncer de bexiga 204 FFPE (ver Exemplo 1 e Figura 1). A análise hierárquica não supervisionada dos dados de expressão do gene de Fluidigm revelou cinco grupos de tecido de câncer bexiga definidos transcricionalmente que estavam associados com probabilidades de DFS distintas (Figuras 4A-4F, Figuras 5A e 5C). A condução do agrupamento de tecidos foram cinco grupos principais de genes corregulados que incluíram genes de sinalização de receptor de tirosina cinase (RTK), tais como membros de via de Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGFR) e Fator de Crescimento Epidérmico (EGF), genes de apoptose que incluíam o gene supressor de tumor TP53, assim como genes de transição epitelial para mesenquimal (EMT) (Figura 5B).

[0279] Concentramos nossa atenção em três grupos de tecidos principais, pois incluíam a maioria das amostras de pacientes e referem-se a eles a partir deste ponto como os grupos Verde, Amarelo e Vermelho (Figura 4A). A análise de Kaplan-Meier revelou que o grupo Vermelho foi associado com melhores probabilidades de DFS do que o grupo Amarelo (Figura 4B, HR = 0,54, P = 0,03) e que o grupo Amarelo apresentou perfis de DFS significativamente melhores do que o grupo Verde (Figura 4B HR = 0,29, P = 0,004). Dada a associação bem estabelecida entre a histologia do câncer de bexiga e os resultados dos pacientes (Nargund et al. Semin. Oncol. 39(5): 559-572, 2012; Resnick et al. Curr. Opin. Oncol. 25(3): 281-288, 2013), examinamos em seguida os atributos histofatológicos dos grupos de tecidos verde, vermelho e amarelo. Não surpreendentemente, observamos que a maioria das amostras no grupo vermelho, que foi associado com o melhor perfil de DFS, eram da histologia NMIBC (Figura 4B e 4C, Figuras 6A-D). O grupo Amarelo foi composto por uma proporção significativamente maior de casos de MIBC do que o grupo Vermelho, e os casos metastáticos aglomeraram-se exclusivamente neste grupo sem qualquer necessidade de análise supervisionada (Figura 4C).

[0280] Surpreendentemente, o grupo Verde, que estava associado com as piores probabilidades de DFS, era quase inteiramente composto por amostras da histologia NMIBC tipicamente não agressiva (Figura 4B e 4C, Figuras 6A-D). Esta foi uma observação surpreendente que sugeriu que o painel de Fluidigm personalizado pode identificar um grupo de pacientes com NMIBCs de rápida recorrência quem pode se beneficiar de acompanhamento clínico atento e intervenção terapêutica. Para excluir a possibilidade de que o grupo Verde possa representar uma variante histológica agressiva, realizamos um exame abrangente de tecidos do grupo Verde, Vermelho e Amarelo (ver, por exemplo, Figuras 4D e 4E). Como esperado, houve uma incidência significativamente maior da histologia micropapilar pré-invasiva no grupo MIBC e Metastático Amarelo em comparação com o grupo NMIBC Red (Figura 4D, P = 0,0063, Figuras 6A-6D). Entretanto, não observamos diferença estatisticamente significante na incidência de histologia micropapilar no grupo verde NMIBC agressivo em relação ao grupo Vermelho (Figura 4D, P = 0,2351, Figuras 6A-6D). Também examinamos o infiltrado imunológico que foi relatado estar associado com os resultados clínicos do paciente com câncer de bexiga (Otto et al. World J. Urol. 30(6): 875-877, 2012) nos três grupos de tecidos e não se observou diferença significativa entre eles (Figura 4E). Não houve diferenças significativas no estágio do tumor e no grau de amostras pertencentes aos grupos Verde e Vermelho. Portanto, o grupo Verde definido transcricionalmente não parece representar um subtipo de doença que seja histologicamente diferente do grupo vermelho de resultado favorável.

[0281] Em seguida, determinou-se se que a recorrência rápida da doença observada no grupo Verde poderia ser devida ao tratamento inadequado dessa população de pacientes. Examinamos a frequência de tratamento com vacina Bacillus Calmette-Guérin (BCG), quimioterapia ou radioterapia, bem como suas combinações, nos três grupos definidos transcricionalmente (Figura 4F). Frações comparáveis de pacientes (> 60%) dos grupos NMIBC Vermelho e invasivo / metastático Amarelo receberam tratamento (Figura 4F, P = 0,8836). Pacientes do grupo de crescimento rápido NMIBC Verde foram tratados a uma taxa significativamente maior do que os grupos Vermelho e Amarelo (Figura 4F, P <0,0001 para ambas as comparações). Estes resultados indicaram que a recorrência rápida de casos do grupo Verde não era devida ao tratamento adjuvante inadequado e que poderia haver impulsionadores moleculares de tumores agressivos a partir deste subtipo de NMIBC.

[0282] Portanto, o painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado fornece uma plataforma robusta para estratificar tecidos de câncer de bexiga arquivados. A análise do conjunto anotado clinicamente de amostras de câncer de bexiga neste painel revelou três subtipos transcricionalmente distintos de câncer de bexiga, incluindo um grupo Verde de NMIBC que estava associado com probabilidades de DFS ruim.

EXEMPLO 3: O FGFR3 É HIPERMUTADO E SOBRE-EXPRESSO EM NMIBCS DE RECORRÊNCIA RÁPIDA, E A EXPRESSÃO ELEVADA EM UM SUBCONJUNTO DE TUMORES INVASIVOS E METASTÁTICOS ESTÁ ASSOCIADA A RESULTADOS CLÍNICOS DESFAVORÁVEIS

[0283] Uma das características dos NMIBCs é que eles carregam mutações de ativação somáticas ativando em Receptor de Fator de Crescimento de Fibroblasto 3 (FGFR3) em aproximadamente 60-70% dos casos (van Rhijn et al. J. Pathol. 198(2): 245-251; Tomlinson et al. J. Pathol. 213(1): 91-98, 2007; Martinez-Torrecuadrada et al. Clin. Cancer Res. 11(17): 6280-6290, 2005; Kompier et al. PLoS One 5(11): e13821, 2010; Juanpere et al. Hum. Pathol. 43(10): 1573-1582, 2012; Gust et al. Mol. Cancer Ther. 12(7): 1245-1254, 2013; Cappellen et al. Nat. Genet. 23(1): 18-20, 1999; Ah-Ahmadie et al. J. Pathol. 224(2): 270-279, 2011). A maioria das mutações de FGFR3 são substituições missense nos domínios extracelular ou juxtamembrana que conduzem à dimerização do receptor independente do ligando e subsequente ativação (Tomlinson et al. supra; Cappellen et al. supra). O fato de que a frequência de mutação em FGFR3 cai para 11-16% em doença invasiva e metastática tem levado a incerteza em torno de se FGFR3 continua a conduzir tumorigênese em doença avançada, ou se o seu papel tumorigênico é principalmente confinado a estágios iniciais de desenvolvimento de câncer de bexiga (Tomlinson et al. supra; Al-Ahmadie et al. supra, Qing et al. J. Clin. Invest. 119(5): 1216-1229, 2009; Liu et al. Genet. Mol. Res. 13(1): 1109-1120, 2014).

[0284] Avaliamos o estado de mutação do FGFR3 utilizando um painel de PCR multiplex personalizado que capturou a grande maioria das mutações conhecidas de FGFR3 (Schleifman et al. PLoS One 9(3): e90761). A análise de amostras de NMIBC do grupo Vermelho revelou uma frequência de mutação esperada de FGFR3 de aproximadamente 60% e, tal como antecipado, as amostras do grupo MIBC e amarelo metastático exibiram uma frequência de mutação de FGFR significativamente inferior de aproximadamente 15% (Figura 7A). Mutações no FGFR3 têm sido relatadas para níveis mais elevados de expressão unidade de FGFR3 (Tomlinson et al. supra). Consistente com estes relatórios, detectamos níveis significativamente mais elevados de expressão de FGFR3 em mutantes em comparação com amostras de tipo selvagem tanto nos níveis de transcrição como de proteína (Figura 7B e 7C, P <0,0001 para ambas as comparações). Raciocinamos que a presença de uma alta frequência de mutações de FGFR3 no grupo Verde poderia ser uma confirmação adicional de que pertence ao subtipo NMIBC. De fato, observamos mutações frequentes de FGFR3 no grupo verde NMIBC de recorrência rápida (Figura 7A). Surpreendentemente, porém, a grande maioria das amostras do grupo Verde apresentou mutações no FGFR3, mesmo com uma frequência significativamente maior do que aquela observada no grupo NMIBC Vermelho (Figuras 7A e 7D, P <0,0001). A mutação de Hyper-FGFR3 no grupo Verde foi associada a uma expressão de FGFR significativamente mais alta do que nos grupos Vermelho e Invasivo/Metastático Amarelo de NMIBC, tanto nos níveis de transcrição (Figura 7E, P <0,0001 para ambas as comparações) 0,0343 para Verde vs. Vermelho e P <0,0001 para Vermelho vs. Amarelo).

[0285] Os dados acima descritos indicam que a hipermutação e a sobre-expressão concomitante da expressão de FGFR3 estão correlacionadas com NMIBCs de recorrência rápida. Se o FGFR3 continuar a atuar como um condutor de câncer em fases posteriores da doença, então a expressão elevada de FGFR3 deve ser mantida durante o desenvolvimento do câncer de bexiga, pelo menos em um subconjunto de casos. Para determinar se este era o caso, examinamos os níveis de expressão de FGFR3 nos níveis de RNA e proteína e verificamos que 66% dos NMIBCs expressaram níveis elevados de FGFR3 como determinado por imuno-histoquímica (IHC) (Figura 7G). Embora a incidência de casos elevados de expressão de FGFR3 tenha sido reduzida em MIBCs e metástases de câncer de bexiga, mais de 30% dos tumores destes estágios mais avançados mantiveram altos níveis de expressão de FGFR3 (Figura 7G, pontuações IHC 2+/3+), para FGFR3 em doença avançada.

[0286] Na coorte global de câncer de bexiga de nosso estudo, observamos probabilidades favoráveis de sobrevivência de DFS e OS para casos de alta expressão de FGFR3, o que está de acordo com relatos previamente publicados (Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012; Dyrskjot et al. Nat. Genet. 33(1): 90-96, 2003; Kim et al. Mol. Cancer 9: 3, 2010). Contudo, inesperadamente, a expressão elevada de FGFR3 tanto nos MIBCs como nos contextos metastáticos esteve associada com probabilidades de DFS de 3 e 5 anos diminuídas (Figura 7H). Além disso, a expressão elevada de FGFR3 na doença avançada (MIBC e câncer de bexiga metastático) em nossa série de amostras foi associada a probabilidade de OS de 3 e 5 anos reduzida (Figura 7I). Para validar estas observações, foram examinados vários conjuntos de dados públicos que forneceram tanto expressão de FGFR3 quanto dados de OS (Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012; Kim et al. Mol. Cancer 9: 3, 2010). Embora altos níveis de FGFR3 conferiram um bom prognóstico na população geral nesses dois estudos, semelhante às observações em nosso conjunto de dados, observou-se probabilidades de OS significativamente piores em FGFR3 elevado comparado com FGFR3 baixo expressando cânceres de bexiga invasivos/metastático do estudo por Kim et al. supra, proporcionando assim a confirmação independente de nossos achados (Figura 7J). Observou-se também uma tendência para OS pior em FGFR3 elevado versus - baixos de tumores do estágio avançado do estudo por Sjodahl et al. (supra).

[0287] Tomados em conjunto, estes dados suportam um papel para o FGFR3 como um condutor de NMIBCs de recorrência rápida, bem como um promotor de doença agressiva nos cenários invasivos (MIBC) e metastáticos. Vários estudos demonstraram que a inibição de FGFR3 suprime o crescimento de tumores de bexiga expressando FGFR3 elevado in vitro e in vivo (Martinez- Torrecuadrada et al. Clin. Cancer Res. 11(17): 6280-6290, 2005; Gust et al. Mol. Cancer Ther. 12(7): 1245-1254, 2013; Qing et al. J. Clin. Invest. 119(5): 12161229, 2009; Gomez-Roman et al. Clin. Cancer Res. 11(2 Pt 1): 459-465, 2005; Lamont et al. Br. J. Cancer 104(1) 75-82, 2011; Tomlinson et al. Oncogene 26(40): 5889-5899, 2007). Portanto, os pacientes com câncer de bexiga de alto risco (por exemplo, pacientes com NMIBC de recorrência rápida, MIBC ou câncer de bexiga metastático) cujos cânceres expressam FGFR3 elevado representam bons candidatos para o tratamento com antagonistas de FGFR3.

EXEMPLO 4: O SUPRESSOR DE TUMOR TP53 É MUTADO E SOBRE-EXPRESSO EM NMIBCS DE RECORRÊNCIA RÁPIDA

[0288] O painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado identificou um subconjunto agressivo definido por transcrição de NMIBCs. A análise de expressão comparativa mostrou que 45/96 genes (47%) foram significativamente diferencialmente expressos entre o NMIBC de recorrência rápida Verde e os grupos mais benignos Vermelhos (P <0,05, com correção de testes múltiplos). Os genes expressos diferencialmente pertenciam à via FGFR3, como descrito acima, e também o supressor de tumor TP53, o Erythroblastosis Oncogene B (ERBB), a Transmissão Epitelial-Mesenquimal (EMT), a Fosfatidilinositol-3-Quinasee a Proteína Quinase B (PI3K- AKT) (Figura 8).

[0289] Para caracterizar ainda mais nossas amostras em um nível mutacional, conduzimos análise NGS (Tsongalis et al. Clin. Chem. Lab. Med. 52(5): 707-714, 2014). Como esperado, os dados NGS confirmaram a presença de mutações de FGFR3 descritas acima e apresentadas na Figura 7A (Figura 9A, Tabela 3). Além disso, a análise NGS revelou mutações em vários outros genes, incluindo TP53, PIK3CA, KRAS, VHL, EGFR, PTEN, e IDH2, entre outros (Figura 9A, Tabela 3). Mutações em TP53 têm sido relatadas em cânceres de bexiga invasivos e metastáticos e, em menor grau, na doença superficial (George et al. J. Clin. Oncol. 25(34): 5352-5358, 2007). Observamos a presença de mutações de TP53 no grupo invasivo/metastático Amarelo, e em alguns casos do grupo NMIBC Vermelho (Figura 9A). Surpreendentemente, no entanto, observamos uma alta frequência de mutações de TP53 no grupo NMIBC de recorrência rápida Verde (Figura 9A). Em todos os casos, com exceção de três, as mutações mapeadas para o domínio de ligação a DNA de TP53 e os sítios de mutação de TP53 em cada um dos grupos Amarelo, Vermelho e Verde eram na maior parte não sobrepostos (Figura 9B).

[0290] A hipótese de que as mutações de TP53 poderiam estar contribuindo para as probabilidades de DFS ruins observadas no grupo Verde. Consistente com isso, observamos uma frequência significativamente mais elevada de mutações de TP53 em NMIBCs de recorrência rápida do grupo Green comparado ao grupo Vermelho, mas não estatisticamente diferente do observado no grupo amarelo invasivo/metastático (Figura 9C, P = 0,03 e P = 0,3605, respectivamente). Os níveis de expressão de TP53 foram também significativamente maiores nos grupos Verdes do que nos Grupos Vermelho e Amarelo (Figura 9D, P = 0,0187 e P = 0,002, respectivamente). Os níveis de expressão do alvo de transcrição TP53 p21 também foram significativamente mais elevados no Verde em comparação com os outros dois grupos, confirmando ainda o aumento dos níveis de expressão de TP53 (Figura 9E; P<0,0001 para ambas as comparações). Observamos níveis de proteína TP53 significativamente mais elevados em mutantes comparados com amostras de tipo selvagem da coorte de estudo (Figura 9F, P = 0,0201). Estes resultados indicam que o gene TP53 é mutado e preferencialmente sobre-expresso em NMIBCs de recorrência rápida do grupo Verde.

[0291] Em seguida, determinamos o impacto clínico da sobre- expressão de TP53 em nossa coorte de pacientes. Verificou-se que, na nossa população global de câncer de bexiga, os tumores com níveis elevados de expressão de TP53 tendiam a ter um perfil de DFS mais favorável do que os tumores de expressão baixa (Figura 9G, P = 0,4218). Curiosamente, esta relação entre a elevada expressão de TP53 e melhores probabilidades de DFS foi invertida quando analisamos a expressão de TP53 no grupo NMIBC separadamente dos outros grupos (Figura 9H). No grupo NMIBC, verificou-se que níveis elevados do supressor tumoral conferem uma probabilidade de DFS pior, embora não estatisticamente significativa, em comparação com casos de baixa expressão (Figura 9H, HR = 1,99, P = 0,1292). Foi demonstrado que uma assinatura de TP53 está associada com a resistência à quimioterapia no contexto de câncer invasivo da bexiga (Choi et al. Cancer Cell 25(2): 152-165, 2014). No subgrupo NMIBC da nossa coorte de estudo, a expressão elevada de TP53 foi associada a uma DFS significativamente pior em pacientes tratados com BCG, um tratamento comumente administrado a pacientes com câncer de bexiga (Figura 9I, HR = 4,2, P = 0,0405). Esta associação entre a expressão elevada de TP53 e DFS ruim em NMIBCs, no entanto, não foi observada em pacientes não tratados (isto é, pacientes sem tratamento prévio) (Figura 9J, HR = 0,57, P = 0,5749). Nossos dados sugerem que uma alta frequência de mutação de TP53 pode contribuir para o comportamento agressivo do tumor em pacientes com NMIBCs, e que isso poderia ser devido, em parte, a um efeito contraproducente do tratamento BCG nesta população de pacientes.

EXEMPLO 5: A ELEVADA EXPRESSÃO DE EGFR ESTÁ ASSOCIADA A RESULTADOS CLÍNICOS DEFICIENTES E CONFERE SENSIBILIDADE AO ERLOTINIBE EM LINHAGENS CELULARES DE CÂNCER DE BEXIGA

[0292] Mutações em ERBB2 têm sido relatadas em tumores da histologia micropapilar agressiva (Ross et al. Clin Cancer Res. 20(1): 68-75, 2014). Em nossa coorte de pacientes, não detectamos mutações de ERBB2; entretanto, identificamos mutações de EGFR em tumores do grupo NMIBC de recorrência rápida Verde, mas não em tumores do grupo mais benigno Vermelho ou do grupo invasivo/metastático Amarelo (Figura 3A). Realizou-se uma análise genômica mais aprofundada dos ligandos e receptores da família ERBB para investigar um papel potencial para esta via como condutor do câncer de bexiga (Figura 10). Observamos ganhos de número de cópias de EGFR em 2/39 (~ 5%) e ERBB2 em 4/39 (~ 10%) de amostras do grupo Amarelo, bem como ganhos de número de cópias de ERBB2 em amostras de 1/30 (~ 3%) do grupo Vermelho (Figura 10). Estes resultados são consistentes com relatórios anteriores (Weinstein et al. Nature 507(7492): 315-322, 2014; Capellen et al. Nat. Genet. 23(1):18-20, 1999), e indicam que a via poderia desempenhar um papel na carcinogênese da bexiga.

[0293] Embora não detectemos alterações no número de cópias de DNA nos membros da família ERBB nos NMIBCs de recorrência rápida, a análise de dados de Fluidigm revelou que os níveis de expressão de EGFR foram significativamente mais elevados no grupo NMIBC de recorrência rápida Verde comparado com o grupo NMIBC mais benigno Vermelho bem amostras do grupo Invasivo/metastático Amarelo (Figura 11A, P = 0,012 e P = 0,0012, respectivamente). Para investigar a possibilidade de EGFR estar contribuindo, pelo menos em parte, para o comportamento agressivo do câncer de bexiga nos NMIBCs, examinamos as probabilidades de DFS de pacientes cujos tumores expressaram níveis altos versus baixos de EGFR. No cenário não invasivo, os pacientes com NMIBCs que expressaram altos níveis de EGFR tiveram probabilidades de DFS de 3 e 5 anos reduzidas em comparação com pacientes com malignidades de baixa expressão (Figura 11B). No ajuste metastático avançado, níveis elevados de expressão de EGFR também foram associados com probabilidades de DFS de 3 e 5 anos diminuídas (Figura 11C). Além disso, a expressão elevada de EGFR em pacientes de nossa coorte com doença metastática estava associada a probabilidades desfavoráveis de OS de 3 e 5 anos em comparação com casos de baixa expressão (Figura 11D).

[0294] Para validar estes achados, avaliamos o valor prognóstico dos níveis de expressão de EGFR em dois conjuntos de dados independentes (Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012; Kim et al. Mol. Cancer 9: 3, 2010). Nos casos invasivos/metastáticos desses dois estudos, observamos que a expressão elevada de EGFR foi acompanhada por probabilidades reduzidas de OS, tanto em períodos de 3 e 5 anos de acompanhamento (Figuras 11E e 11F). Assim, os dados de nossa coorte, bem como o de dois estudos independentes sugerem que a expressão elevada de EGFR poderia estar contribuindo, pelo menos em parte, para o comportamento agressivo dos cânceres de bexiga.

[0295] Para avaliar os níveis de expressão de EGFR como um biomarcador preditivo para resposta a terapias anti-EGFR em câncer de bexiga, selecionamos um painel de linhagens celulares de câncer de bexiga para a sensibilidade ao erlotinibe inibidor de molécula pequena EGFR (Stamos et al. J. Biol. Chem. 277(48): 46265-46272, 2002). As linhagens celulares UMUC-5, UMUC-10 e UMUC-17 apresentaram diferentes graus de sensibilidade ao erlotinibe, variando de> 75% de inibição de crescimento (GI) a UMUC-5 a aproximadamente 40% de GI para UMUC-17 (Figura 11G). Por outro lado, quatro linhagens celulares (RT-112, UMUC-3, SW780 e BFTC905) apresentaram GI mínimo em resposta ao tratamento com erlotinibe (Figura 11G). Em seguida, examinamos os níveis de expressão de EGFR em nossas linhagens celulares. As linhagens celulares que eram sensíveis (> 25% GI) expressaram níveis significativamente mais elevados de EGFR em comparação com linhagens celulares de câncer de bexiga insensível (GI mínima de < 25%) (Figura 11H; P = 0,0106). Estes resultados indicam que o nível de expressão de EGFR em um câncer de bexiga prediz sua sensibilidade aos inibidores de via de EGFR (por exemplo, o erlotinibe).

EXEMPLO 6: O PAINEL DE FLUIDIGM DE CÂNCER DE BEXIGA PERSONALIZADO CLASSIFICA COM PRECISÃO AMOSTRAS DE CÂNCER DE BEXIGA EM SUBTIPOS LUMINAIS E BASAIS

[0296] Este exemplo descreve a validação adicional de desenvolvimento ein silico do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado para análise transcricional de câncer de bexiga, incluindo amostras clínicas de câncer de bexiga FFPE arquivadas. Conforme descrito nos exemplos 1 e 2, os genes do painel incluem componentes das vias de tirosina cinase (RTK) do receptor como FGFR, ERBB, MET, PI3K/AKT e eixos MAPK; ciclo celular e genes de genoma de estabilidade como TP53; bem como genes envolvidos na regulação da diferenciação celular e no desenvolvimento e transição epitelial-mesenquimal (EMT) (Figura 12A).

[0297] In silico, avaliamos a capacidade do the painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado (verTabela 1) para capturar os principais atributos moleculares e histológicos de amostras de um grande conjunto de dados público (Sjodahl et al. Clin. Cancer Res. 18(12): 3377-3386, 2012). A aglomeração hierárquica não supervisionada de amostras com base na expressão de 125 sondas que correspondem aos genes nopainel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado revelou duas ramificações principais (Figura 12B). A ramificação esquerda era enriquecida para tumores de grau baixo (G1/G2), cânceres de estágio T1 e classe molecular MS1, conforme definido por Sjodahl et al. (supra) (Figura 12B). Sob a ramificação direita, observou-se uma preponderância de tumores G3/G4 e enriquecimento para neoplasias malignas T3/T4, coaglomeração da classe MS2a de cânceres de bexiga e cossegregação de tumores MS2b do subtipo molecular definido por Sjodahl (Figura 12B) .

[0298] A seguir, calculamos a taxa de erro de classificação errada para o grau de tumor, o estágio TNM e as classes de transcrição, conforme definido por Sjodahl et al. (supra), usando todos os 24. 394 conjuntos de sondas Illumina ou usando os 125 conjuntos de sondas que estão sobrepostos com o conteúdo do painel de Fluidigm de câncer de bexiga, e determinamos a capacidade preditiva de diminuir subconjuntos de genes quando utilizado em um centroide classificador e avaliado através de validação cruzada (Tibshirani et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 99: 6567-6572, 2002) (Figura 12C). Foram encontradas taxas de erro de erro de classificação errada de aproximadamente 40% para o grau de tumor e o estágio TNM, e uma frequência de erro de erro de classificação errada de aproximadamente 20% para as classes MS1, MS2a e MS2b (Figura 12C). Observou-se um aumento semelhante nas taxas de erros de classificação errada em ambos os casos, uma vez que o número de sondas foi reduzido (Figura 12C). Estes resultados sugerem que os genes do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado capturam classes moleculares com um alto grau de precisão, bem como grau de tumor e estágio TNM com eficácia semelhante como utilizando todo o conteúdo do microarranjo Illumina utilizado em Sjodahl et al. (supra).

[0299] Dada a relevância biológica e clínica dos subtipos basais e luminais recentemente descritos de câncer de bexiga (Damrauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 111: 3110-3115, 2014; Choi et al. PLoS One 7: e30206, 2012), examinamos a capacidade do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado para distinguir entre estes dois subgrupos moleculares em vários conjuntos de dados públicos. Utilizando as atribuições basal/luminal determinadas por Damrauer et al. (supra) e Choi et al. (Cancer Cell 25: 152-165, 2014) em suas coortes de descoberta e validação, utilizamos uma abordagem não supervisionada para aglomerar hierarquicamente amostras com base na expressão de sondas correspondentes a genes no painel de Fluidigm de câncer de bexiga (Figura 12D). Essa abordagem classificou corretamente 39/44 (80%) das amostras luminais e 42/47 (89%) das amostras basais Sjodahl et al. (supra) e 10/12 (83%) dos tumores luminais e 17/18 (94%) dos tumores basais da coorte Kim (Kim et al. Molecular Cancer 9: 3, 2010) (Figura 12D). Além disso, esta abordagem classificou com precisão as amostras do conjunto de descobertas Damrauer (Damrauer et al., Supra) Em subtipos luminais e basais em 33/33 (100%) e 23/28 (82%) dos casos, respectivamente (Figura 12D). Finalmente, os genes no painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado foram capazes de classificar corretamente amostras com base no estado luminal e basal a partir do conjunto de dados de descoberta de Choi (Choi et al. 2012, supra) em 23/24 (96%) e 23/23 (100%) casos, respectivamente. Em resumo, os resultados desta análise in silico demonstram que os genes cuidadosamente selecionados no painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado detectam com precisão o estado basal/luminal em quatro conjuntos de dados públicos.

[0300] Para avaliar a robustez do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado e a reprodutibilidade na medição de expressão gênica em amostras de FFPE, realizamos uma série de experimentos de controle de qualidade. Primeiro, realizamos diluições em série para avaliar o desempenho de cada um dos ensaios, redesenhando os ensaios quando necessário, para obter curvas de diluição padrão lineares para todos os testes (Figura 13A). Também realizamos conjuntos de amostras de RNA derivadas de FFPE e observamos uma alta concordância na expressão normalizada de cada gene no painel a partir de amostras de repetição executadas em dias diferentes (Figura 13B, R2 variação = 0,98-0,99). Finalmente, observamos um alto grau de reprodutibilidade de dados de chip para chip para um controle de RNA humano universal que foi incluído em cada um de sete execuções independentes (Figura 3E, faixa de R2 = 0,91-0,98).

[0301] No total, os resultados de nossa avaliação qualitativa e quantitativa indicam que o painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado é tecnicamente robusto e pode ser usado para estratificar transcricionalmente tecidos de câncer de bexiga de FFPE. Para demonstrar ainda mais a utilidade do painel e Fluidigm de câncer de bexiga personalizado para caracterização transcripcional de tecidos FFPE, analisamos o conjunto de 204 amostras constituídas por NIMBCs primários, MIBCs, bem como os METs linfonodais e distais, descritos acima no Exemplo 1 e na Tabela 1. Examinamos como essas amostras se compararam com aquelas de vários conjuntos de dados públicos com relação às características de transcrição basal/luminal. Conforme esperado, a aglomeração hierárquica não supervisionada de amostras de quatro conjuntos de dados públicos (Damrauer et al. 2014, supra; Kim et al. 2010, supra; Sjodahl et al. 2012, supra; e Choi et al. 2014, supra) usando expressão mediana centrada de sondas correspondentes aos genes em nosso painel revelou uma clara separação de amostras basais e luminais (Figura 14A). As amostras luminais de Kim aglomeraram-se com as amostras basais dos outros três conjuntos de dados e, portanto, foram valores atípicos nesta análise (Figura 14A).. Observou-se que os NMIBCs na coorte de câncer de bexiga descritos no Exemplo 1 e na Figura 1 aglomeraram-se com amostras luminais, enquanto os MIBCs e METs pareciam ser mais basais e aglomerados ao lado de amostras basais dos conjuntos de dados públicos (Figura 14A).

[0302] Para avaliar ainda mais as assinaturas de transcrição basal/luminal (B/L) das amostras de 204 FFPE descritas no Exemplo 1 e na Figura 1, estabelecemos em seguida um método para calcular os valores de similaridade B/L para cada um destes tumores. Em primeiro lugar, centralizamos em mediana a expressão de todas as sondas correspondentes aos genes dopainel de Fluidigm de câncer de bexiga em conjuntos de dados públicos e calculamos um valor médio de expressão gênica em grupos basais e luminais, conforme atribuído por Damrauer et al. (supra) e Choi et al. (supra) (Figura 14B). Isto permitiu-nos obter uma vista média da expressão de cada um destes genes nos grupos luminal e basal de conjuntos de dados públicos (Figuras 14B e 14C). Por exemplo, FGFR3 tinha o maior valor de expressão média nas amostras luminais do que qualquer outro gene no nosso painel, e o nível de expressão de FGFR3 médio foi um das amostras basais mais baixas em conjuntos de dados públicos (Figura 14B). Obteve-se então uma pontuação de similaridade B/L para cada amostra de FFPE calculando a correlação com os perfis basal e luminal públicos (Figura 14C).

[0303] A aglomeração hierárquica não supervisionada das 204 amostras de FFPE descritas no Exemplo 1 e na Figura 1 mostrou duas ramificações principais com padrões distintos de expressão gênica: (1) uma ramificação direita sob a qual as amostras com baixas pontuações de similaridade B/L (tipo luminal) foram coaglomeradas; e (2) uma ramificação esquerda que era composta de amostras com pontuações B/L elevadas (tipo basal) (Figura 15A). A análise estatística confirmou uma pontuação B/L significativamente menor na ramificação esquerda, indicativa do estado luminal, e uma pontuação B/L significativamente maior consistente com o estado basal sob o braço direito da árvore hierárquica (Figura 15B, parte superior esquerda). Observamos uma fração significativamente mais elevada de NMIBCs no grupo luminal em comparação com o grupo basal (Figura 15B, canto superior direito). MIBCs foram representados em grupos basais e luminais; no entanto, observou- se uma proporção significativamente maior de MIBCs, no grupo basal (Figura 15B). Curiosamente, quase todos os METs aglomerados sob o braço basal da árvore hierárquica, sugerindo que a maioria dos METs na coorte de câncer de bexiga descrita no Exemplo 1 e Figura 1 exibiu um perfil de transcrição basal (Figuras 15A e 15C).

[0304] Conforme descrito acima, uma das suas características de NMIBCs é que eles carregam mutações de ativação somática em FGFR3 em aproximadamente 60-80% dos casos, e uma menor frequência de aproximadamente 15% tem sido relatada em MIBCs e METs. Avaliamos o estado mutacional de FGFR3 e outros genes relevantes para câncer em amostras de coorte usando um painel de PCR alelo-específico personalizado (Schleifman et al supra; Tomlinson et al, supra; van Rhijn et al, supra; Martinez-Torrecuadrada et al, supra; Kapellen et al supra, 1999; e Al-Ahmadie et al supra). Como esperado, descobrimos que aproximadamente 75% dos tumores de coaglomeraram sob a marcação luminal, uma fração significativamente maior do que a de aproximadamente 20% observada em amostras do grupo basal (Figuras 15A e 15D). Mutações no FGFR3 têm sido relatadas como acionadores de níveis mais elevados de expressão de proteína FGFR3. Consistente com estes relatórios, observou-se níveis significativamente mais elevados de proteína FGFR3, medida por IHC, em amostras do grupo luminal comparadas com as do grupo basal (Figuras 15A e 15D). O FGFR3 mutacional e os dados de expressão fornecem confirmação molecular do estado luminal e basal das nossas amostras.

[0305] Além das características transcricionais B/L, avaliamos a utilidade do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado na medição da expressão de genes pertencentes a vias conhecidas por estarem envolvidas na carcinogênese da bexiga, tais como a via TP53, a via PI3K/AKT, a via ERK/MAPK e componentes do eixo de sinalização do ciclo celular. Utilizamos valores p ajustados para permutação para controlar o teste de múltiplas hipóteses, identificamos 49/91 genes únicos como sendo expressos significativamente diferencialmente entre os grupos basal e luminal (Tabela 4) e mapeamos estes genes para vias usando o software INGENUITY® (Figura 15F). TABELA 4: GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS ENTRE GRUPOS BASAIS E LUMINAIS

[0306] As vias que exibiram uma pontuação de ativação significativa nos tumores luminais incluíram as vias de sinalização NF-kB, TP53, ERK/MAP, G1/S do ciclo celular, HGF e VEGF (Figura 15F). Por outro lado, as vias que foram significativamente ativadas no grupo basal incluíram as vias de sinalização de PTEN, PI3K/AKT, ceramida e de regulação do ciclo celular (Figura 15F). A análise de ativação de via de entrada usando o software INGENUITY® também revelou que as amostras pertencentes ao grupo luminal tinham um perfil de expressão consistente com a ativação de receptor de estrogênio (RE), incluindo níveis elevados de FGFR3, GATA3, CCND1 e ERBB3, níveis baixos de AXL1, CXCL1, FGFR1 e BCL2, bem como níveis baixos de expressão de genes EMT, tais como SNAI1 e ZEB1 (Figura 17A). Em contraste, as amostras pertencentes ao grupo basal exibiram os perfis de expressão oposta para estes genes (Figura 17B). Estes resultados demonstram que o nosso painel é informativo para medir o estado transcricional de via relevantes para câncer de bexiga em tecidos FFPE.

[0307] Características histopatológicas de câncer de bexiga primário historicamente têm impulsionado decisões de gestão clínica para pacientes de câncer de bexiga. Com o aumento da compreensão dos acionadores genéticos de câncer de bexiga, novas vias estão sendo pavimentadas para a intervenção terapêutica baseada nos atributos moleculares da doença. No entanto, características moleculares de tumores primários frequentemente são utilizadas para orientar as decisões clínicas com agentes alvo, mesmo para drogas que estão sendo desenvolvidas no cenário metastático. Para começar a tratar-se as principais características moleculares de tumores primários que são representativos daqueles em metástases de câncer de bexiga em um nível transcricional, comparamos as pontuações de B/L de 9 pares combinados de tumor primário/MET dos mesmos pacientes. Examinamos primeiro os dados da sequenciação de próxima geração (NGS) e verificamos que as variantes de todos os 9 pares de primário/metástase estavam altamente correlacionadas, estabelecendo assim que os tumores correspondentes eram de fato dos mesmos pacientes (Figuras 16A e 18). A análise de correlação entre as pontuações B/L de tumores primários e os MET correspondentes indicou que 5/9 pares tinham pontuações B/L quase idênticos e 2/9 exibiam diferenças insignificantes no seu estado B/L (Figuras 17A e 17B). Curiosamente, observamos uma mudança significativa nas pontuações B/L em 2/9 casos, ambos os quais foram caracterizados como tendo tumores primários luminais e METs basais (Figuras 17A e 17B). Estas descobertas sugerem que o estado B/L do tumor primário nem sempre reflete o observado em lesões metastáticas e indica que a caracterização molecular de metástases de câncer de bexiga pode ser justificada para orientar com mais precisão as decisões de tratamento na clínica.

MATERIAIS ADICIONAIS E MÉTODOS PARA O EXEMPLO 6 ANÁLISE DE CONJUNTOS DE DADOS PÚBLICOS

[0308] Vários conjuntos de dados públicos foram usados para determinar a capacidade preditiva dos genes do o painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado para capturar o estágio do tumor, o grau e as principais características transcricional da doença, como o estado basal/luminal. Sjodahl Illumina Human HT-12 V3. 0 gene expression data (Sjodahl et al. 2012, supra) foi baixado do site do Gene Expression Omnibus (GEO) (ncbi. nlm. nih. gov/geo/GSE32894). Os dados de expressão foram normalizados usando polimento mediano (Tukey et al. Exploratory Data Analysis, Addison-Wesley, editores, 1977). A análise de aglomeração hierárquica não supervisionada foi aplicada utilizando uma métrica de distância de correlação média, 1 - Pearson para encontrar aglomerações de amostras, e foi utilizado o grau de tumor da amostra relatado, o estágio TMN e a classe molecular (Sjodahl et al. 2012, supra). A capacidade dos 91 genes únicos do painel de Fluidigm de câncer de bexiga foi avaliada para identificar corretamente o grau de tumor, o estágio de TNM e a classe molecular foi determinada utilizando uma abordagem de classificador centroide. As curvas de erros de classificação errada com validação cruzada foram criadas utilizando a biblioteca PAMR R (Tibshirani et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 99: 6567-6572, 2002) usando a matriz completa ou o subconjunto de 125 sondas correspondente do conjunto de dados de expressão Sjodahl et al. (supra) . A capacidade dos genes do painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado para identificar amostras semelhantes a basal e semelhantes a luminal, como através da criação de perfil transcricional foi avaliada em quatro conjuntos de dados de literatura (GSE32894, GSE5287, GSE13507, GSE48075).

[0309] As classificações basais ou luminais feitas nestes dados públicos foram como descrito por Damrauer et al. (supra). Brevemente, as amostras de descoberta de Damrauer et al. (supra) (N = 30, matriz de U133A do genoma humano Affymetrix) foram baixadas de NCBI Gene Expression Omnibus (GSE5287). Foram utilizados conjuntos de sondas Affymetrix correspondentes a genes no painel personalizado de Fluidigm de câncer de bexiga. O subconjunto restante de expressão transformada de log de dados foi então centralizado em média e normalizado para a variância de unidade. Os valores médios de expressão gênica foram então calculados para os 91 genes únicos das 12 amostras classificadas como semelhantes a luminal e 18 amostras classificadas como semelhantes a basal (classificações obtidas por correspondência de autor) para produzir perfis de expressão basal e luminal. Este processo foi repetido por três outros conjuntos de dados públicos (GSE32894, GSE13507, GSE48075).

TUMORES

[0310] A coleta de 204 amostras de tumor de bexiga embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) como descrito no Exemplo 1 foi utilizada nas experiências descritas neste Exemplo. O RNA e o DNA foram extraídos de amostras macrodissecadas como descrito no Exemplo 1.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE FLUIDIGM DE TUMORES FFPE

[0311] A análise de expressão genética foi realizada em RNA extraído de FFPE macrodissecado utilizando o Micro Kit de RNA de FFPE de Alta Pureza (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) após desparafinização com ENVIRENE®, como descrito previamente (O’Brien et al. Clin. Cancer Res. 16: 3670-3683, 2010). A análise de expressão genética de 96 transcritos de mRNA únicos de genes relevantes para o câncer de bexiga foi realizada em amostras de paciente a partir de 100 ng de RNA total que foi transcrito inversamente para cDNA e pré-amplificado em uma única reação utilizando Superscript III/Platinum Taq e mistura de reação de pré-amplificação (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todos os 96 conjuntos de iniciador/sonda foram incluídos na reação de pré- amplificação em uma diluição final de 0,05x de concentração de ensaio TAQMAN® original (Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições de termociclagem foram as seguintes: 1 ciclo de 50°C durante 15 min, 1 ciclo de 70°C durante 2 min, 14 ciclos de 95°C durante 15 s e 60°C durante 4 min. O cDNA pré-amplificado foi diluído 2 vezes e depois amplificado utilizando TAQMAN® Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA) na plataforma BIOMARK™ BMK-M-96. 96 (Fluidigm, South San Francisco, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado. Os valores de limiar de ciclo (Ct) foram convertidos para expressão relativa utilizando o método ΔCt (O’Brien et al. supra), onde ΔCt foi a média do gene alvo menos a média geométrica dos genes de referência calculados para a respectiva amostra de paciente. Para genes avaliados no painel de Fluidigm de câncer de bexiga personalizado, os limiares de ciclo (Ct) foram normalizados usando polimento de mediana (Tukey et al supra). A aglomeração hierárquica de genes diferencialmente expressos foi realizada em dados normalizados com o método de ligação média usando a correlação de 1 - Pearson como uma métrica de distância e subsequentemente visualizados usando R.

ANÁLISE DE MUTAÇÃO

[0312] As análises de mutação foram realizadas em DNA genômico extraído de tecidos FFPE macrodissecados utilizando o kit QIAamp FFPE (Qiagen, Valencia, CA) após deparafinização com ENVIRENE® (Lindgren et al. PLoS One 7: e38863, 2012). Mutações em PIK3CA, EGFR, KRAS, NRAS, HRAS, FGFR3, MET, BRAF, KIT, AKT1, e FLT3 foram detectadas usando qPCR específico da mutação como descrito anteriormente (Schleifman et al. PLoS One 9: e88401, 2014).

IMUNO-HISTOQUÍMICA

[0313] A imuno-histoquímica foi realizada conforme descrito no Exemplo 1.

CÁLCULO DAS PONTUAÇÕES DE SIMILARIDADE BASAL/LUMINAL, ANÁLISE DE TUMORES PRIMÁRIOS E METÁSTASES CORRESPONDENTES E ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0314] As pontuações de similaridade basal/luminal para amostras das 204 amostras de FFPE de coorte de câncer de bexiga descritas no Exemplo 1 foram determinadas primeiro derivando perfis de expressão basal/luminal do conjunto de dados públicos de descoberta de Damrauer, conforme descrito anteriormente (Damrauer et al. supra). Em seguida, foram determinadas as correlações basais e luminais de Pearson entre cada perfil e cada amostra de FFPE normalizada com média de variância média. Estas duas pontuações de correlação foram combinadas para produzir uma pontuação de similaridade B/L global: Pontuação B/L = (correlação do perfil basal - correlação do perfil luminal) /2. 0. A pontuação B/L tinha um intervalo de +1,0 a -1,0, com pontuações acima de zero indicando uma amostra de tipo basal e pontuações abaixo de zero indicando uma amostra tipo luminal. De forma semelhante, os valores de similaridade de B/L de 9 amostras primárias e de metástases correspondentes foram calculados de uma maneira semelhante. Para confirmar que as amostras correspondentes eram dos mesmos pacientes, a sequenciação de próxima geração (NGS) foi realizada utilizando o ION AMPLISEQ™ Cancer Hotspot Panel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante (Tsongalis et al. CCLM/FESCC 52: 707-714, 2014), e a correlação de Pearson foi calculada comparando a frequência do alelo em todos os sítios variantes onde ambas as amostras tinham pelo menos 100x de cobertura de leitura e pelo menos uma amostra tinha uma frequência de alelos >10% (em média, 120 locais foram comparados entre quaisquer duas amostras). A probabilidade de que as amostras de metástases-primárias não foram correspondidas foi encontrada através da comparação das suas pontuações de correlação com as 3.500 correlações de pares de amostras aleatórias. As diferenças na pontuação de B/L entre os primários e as metástases correspondentes foram comparadas com as diferenças esperadas devido ao erro sistêmico típico. Estimativa do erro sistemático foram alcançados por genes do painel de Fluidigm câncer de bexiga personalizada com substituição para amostras selecionadas aleatoriamente e pontuações re-cálculo de B/L em 100.000 permutações de amostragem. Para a significância da frequência de mutação diferencial entre as aglomerações, o teste exato de Fisher foi realizado. O teste exato de Fisher e os teste de t de duas caudas foram usados para todas as outras comparações estatísticas.

Claims (18)

1. USO DE UMA TERAPIA ANTICÂNCER compreendendo erlotinibe HCl, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente que sofre de um câncer de bexiga não invasivo aos músculos (NMIBC), em que o nível de expressão de EGFR em uma amostra obtida do paciente foi determinada como sendo aumentada em relação a um nível de referência de EGFR, e em que um aumento no nível de expressão de EGFR na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica o paciente como aquele que tem uma baixa probabilidade de sobrevivência livre de doença (DFS) e é suscetível a responder ao tratamento com uma terapia anticâncer compreendendo erlotinibe HCl.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela terapia anticâncer compreender ainda (i) um agente selecionado do grupo que consiste em um agente antineoplásico, um agente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento e um agente citotóxico, (ii) radioterapia ou (iii) uma combinação dos mesmos.

3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato do NMIBC ser uma NMIBC recorrente.

4. MÉTODO PARA DETERMINAR SE UM PACIENTE COM NMIBC É SUSCETÍVEL A RESPONDER AO TRATAMENTO COM UMA TERAPIA ANTICÂNCER compreendendo erlotinibe HCl, o método caracterizado por compreender: (a) determinar o nível de expressão de EGFR em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do EGFR com um nível de referência do EGFR, em que um aumento no nível de expressão do EGFR na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que possui uma baixa probabilidade de sobrevivência livre de doença (DFS) e é suscetível a responder ao tratamento que compreende erlotinib HCl.

5. MÉTODO PARA OTIMIZAR A EFICÁCIA TERAPÊUTICA DE UMA TERAPIA ANTICÂNCER compreendendo erlotinibe HCl a um paciente que tem um NMIBC, o método caracterizado por compreender: (a) determinar o nível de expressão de EGFR, em uma amostra obtida do paciente; e (b) comparar o nível de expressão do EGFR com um nível de referência do EGFR, em que um aumento no nível de expressão do EGFR na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica um paciente que possui uma baixa probabilidade de sobrevivência livre de doença (DFS) e é suscetível a responder ao tratamento que compreende erlotinib HCl.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pela terapia anticâncer compreender ainda (i) um agente selecionado do grupo que consiste em um agente antineoplásico, um agente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento e um agente citotóxico, (ii) radioterapia ou (iii) uma combinação dos mesmos.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado peloo nível de expressão do EGFR na amostra obtida do paciente ser determinado pela medição do mRNA.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do nível de expressão do EGFR na amostra obtida do paciente ser determinado por um ensaio de reação em cadeia com polimerase (PCR), opcionalmente em que o ensaio PCR é um ensaio PCR quantitativo.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato do nível de expressão do EGFR na amostra obtida do paciente ser determinado por medição da proteína

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato do nível de expressão de pelo menos um gene na amostra obtida do paciente ser determinado por um método de imuno histoquímica (IHC).

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado pela amostra obtida do paciente ser uma amostra de tumor.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela amostra obtida do paciente ser uma amostra de tumor embebido em parafina fixada em formalina (FFPE).

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado por compreender ainda a determinação do nível de FGFR3 e TP53.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo nível de expressão de FGFR3 ter sido determinado a ser aumentado pelo menos 2 vezes em relação a um nível de referência, opcionalmente em que o nível de expressão de FGFR3 foi determinado a ser aumentado pelo menos 4 vezes em relação a um nível de referência.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 14, caracterizado pelo nível de expressão de EGFR ter sido determinado a ser aumentado pelo menos 4 vezes em relação a um nível de referência, opcionalmente em que o nível de expressão de EGFR foi determinado a ser aumentado pelo menos 8 vezes em relação a um nível de referência.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 15, caracterizado pelo método compreender ainda a determinação do nível de expressão de pelo menos um gene adicional selecionado do grupo que consiste em: DUSB3, FRS2, TSC1, ERBB3, CDKN1A, CCND1, TP63, MMP2, ZEB2, PIK3CB, PIK3R1, MDM2, SNAI2, AXL, ZEB1, BCL2B, TSC2, RB1, FGFR32, PIK3IP1, MTOR, PIK3CA, PTEN, AKT1, BCL2A, FRS3, ERBB2, FGFR31, FGF1, SNAI1, FGFR34, FGF9 e FGF2, em uma amostra obtida do paciente, em que o nível de expressão do pelo menos um gene adicional é alterado em relação a um nível de referência do pelo menos um gene adicional.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 16, caracterizado pelo NMIBC ser NMIBC recorrente.

18. KIT PARA O PROGNÓSTICO DE UM PACIENTE QUE SOFRE DE NMIBC, caracterizado por compreender meios para determinar o nível de expressão de EGFR, em uma amostra obtida do paciente, em que o nível de expressão de EGFR é comparado com um nível de referência de EGFR, e em que um aumento do nível de expressão do EGFR na amostra do paciente em relação ao nível de referência identifica que o paciente possui uma baixa probabilidade de DFS e é suscetível a responder ao tratamento compreendendo erlotinibe HCl, opcionalmente em que o NMIBC é um NMIBC recorrente.