PT1725249E - Compostos de monometilvalina capazes de conjugação a ligandos - Google Patents

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PT1725249E
PT1725249E PT48214860T PT04821486T PT1725249E PT 1725249 E PT1725249 E PT 1725249E PT 48214860 T PT48214860 T PT 48214860T PT 04821486 T PT04821486 T PT 04821486T PT 1725249 E PT1725249 E PT 1725249E
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alkyl
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PT48214860T
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Peter D Senter
Mark X Sliwkowski
Svetlana O Doronina
Brian E Toki
Allen J Ebens
Toni Beth Kline
Paul Polakis
Susan D Spencer
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Seattle Genetics Inc
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Description

ΕΡ1725249Β1
DESCRIÇÃO
COMPOSTOS DE MONOMETILVALINA CAPAZES DE CONJUGAÇÃO A
LIGANDOS
1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um Composto de Fármaco e, mais especificamente, a Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando, Compostos de Fármaco-Ligante, e Conjugados de Fármaco-Ligando, e a composições incluindo os mesmos. Também se descreve no presente documento métodos para utilizar os mesmos para tratar cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa. A presente invenção também se refere a conjugados de anticorpo-fármaco, e a composições incluindo os mesmos, e a métodos para uso dos mesmos para tratar cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa. Também se descreve no presente documento métodos de utilização de compostos de conjugado de anticorpo-fármaco para o tratamento ou diagnóstico in vitro, in situ e in vivo de células de mamíferos, ou condições patológicas associadas.
2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Melhorar a administração de fármacos e outros agentes a células, tecidos e tumores alvos para atingir eficácia máxima e toxicidade mínima tem sido o objetivo central de pesquisas consideráveis durante muitos anos. Embora muitas tentativas tenham sido feitas para desenvolver métodos efetivos para importar moléculas biologicamente ativas para dentro das células, não foi provado, tanto in vivo quanto in vitro, que alguma delas seja inteiramente satisfatória. A otimização da associação do fármaco com seu alvo intracelular, ao mesmo tempo em que se minimiza a 1 ΕΡ1725249Β1 redistribuição intercelular do fármaco, por exemplo, para células vizinhas, é frequentemente difícil ou ineficiente. A maioria dos agentes atualmente administrados parentericamente a um paciente não são direcionadas, resultando em aplicação sistémica do agente a células e tecidos do corpo onde ele não é necessário, e frequentemente é indesejável. Isto pode resultar em efeitos secundários adversos do fármaco, e frequentemente limita a dose de um fármaco (por exemplo, agentes quimioterápicos (anti-cancro), citotóxicos, inibidores de enzima e fármacos antivirais ou antimicrobianos) que pode ser administrado. Em comparação, embora a administração oral de fármacos seja considerada um modo conveniente e económico de administração, apresenta os mesmos problemas de toxicidade não específica em células não afetadas após o fármaco ter sido absorvido na circulação sistémica. Complicações adicionais envolvem problemas com biodisponibilidade oral e residência do fármaco no intestino conduzindo à exposição adicional do intestino ao fármaco e, assim, ao risco de toxicidade no intestino. Consequentemente, um objetivo principal foi desenvolver métodos para direcionar agentes especificamente para células e tecidos. Os benefícios deste tratamento incluem evitar os efeitos fisiológicos gerais de aplicação inapropriada destes agentes a outras células e tecidos, tal como células não infetadas. 0 direcionamento intracelular pode ser obtido por métodos, compostos, e formulações que permitam o acúmulo ou retenção de agentes biologicamente ativos, isto é metabolitos ativos, dentro das células.
Terapêutica de anticorpo monoclonal foi estabelecida para o tratamento direcionado de pacientes com cancro, distúrbios imunológicos e angiogénicos. 2 ΕΡ1725249Β1 A utilização de conjugados de anticorpo-fármaco para a administração local de agentes citotóxicos ou citostáticos, por exemplo, fármacos para destruir ou inibir células de tumor no tratamento de cancro (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; Patente US N° 4975278) permite teoricamente a administração direcionada da fração de fármaco a tumores, e acúmulo intracelular nos mesmos, enquanto a administração sistémica destes agentes de fármaco não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade em células normais, assim como em células de tumor a serem eliminadas (Baldwin et al., 1986, Lancet pág. (15 de Mar. de 1986) : 603-05; Thorpe, 1985, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), páginas 475-506). Eficácia máxima com toxicidade mínima é buscada. Ambos os anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais foram considerados úteis nestas estratégias (Rowland et al.r 1986, Câncer Immunol. Immunother. 21:183-87). Fármacos usados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, e vindesina (Rowland et al., 1986, supra). Toxinas usadas em conjugados de anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina de difteria, toxinas de planta, tais como ricina, toxinas de molécula pequena tal como geldanamicina (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):781-784; Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Biogonjugate Chem. 13:786-791), maytansinoids (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Câncer Res. 53:3336-3342) . As toxinas podem afetar seus efeitos citotóxicos e 3 ΕΡ1725249Β1 citostáticos por mecanismos incluindo ligação de tubulina, ligação de ADN, ou inibição de topoisomerase (Meyer, D. L. e Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Câncer Therapy" no "Annual Reports in Medicinal Chemistry", Volume 38 (2003), Capitulo 23, 229- 237). Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativos ou menos ativos guando conjugados com ligandos de recetor de proteínas ou anticorpos grandes. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/ldec) é um conjugado de anticorpo-radioisótopo composto de um anticorpo monoclonal IgGl capa de murino direcionado contra o antigénio CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais ou malignos e radioisótopo inln ou 90Y ligados por um quelador-ligante de tioureia (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7) : 766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12) :4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15) :3262- 69) . Embora ZEVALIN tenha atividade contra Linfoma não Hodgkin (LNH) de célula B, a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado de fármaco e anticorpo composto de um anticorpo hu CD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mieloide aguda por injeção (Drugs of the Future (2000) 25(7) : 686; Patentes US N° 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado de anticorpo-fármaco composto do anticorpo huC242 ligado através do ligante de dissulfeto SPP à fração de fármaco maytansinoid, DM1, está a avançar a ensaios de Fase II para o tratamento de cancros que expressam CanAg, tal como do cólon, pancreático, gástrico, e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado de anticorpo- 4 ΕΡ1725249Β1 fármaco composto do anticorpo monoclonal do antigénio de membrana específico anti-prostático (PSMA) ligado à fração de fármaco maytansinoid, DM1, está a ser desenvolvido para o tratamento potencial de tumores prostáticos. A mesma fração de fármaco maytansinoid, DM1, foi ligada através de um ligante não dissulfeto, SMCC, a um anticorpo monoclonal de murino de ratinho, TA.l (Chari et al. (1992) Câncer Research 52:127-131). Este conjugado foi considerado 200 vezes menos potente que o conjugado de ligante de dissulfeto correspondente. O ligante SMCC foi considerado aqui como "não clivável". Vários compostos de péptido curtos foram isolados do molusco marinho Dolabella auricularia e descobriu-se que tinham atividade biológica (Pettit et al. (1993) Tetrahedron 49:9151; Nakamura et al. (1995) Tetrahedron Letters 36:5059-5062; Sone et al. (1995) Jour. Org Chem. 60:4474). Análogos destes compostos foram também preparados, e descobriu-se que alguns tinham atividade biológica (para uma análise, veja-se Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277). Por exemplo, auristatina E (Patente US N° 5635483) é um análogo sintético do produto natural marinho Dolastatina 10, um agente que inibe a polimerização de tubulina pela ligação ao mesmo domínio na tubulina que o fármaco anti-cancro vincristina (G.R. Pettit (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70:1-79). Dolastatina 10, auristatina PE, e auristatina E são péptidos lineares que têm quatro aminoácidos, três dos quais são únicos da classe dolastatina de compostos, e uma amida C-terminal.
Os péptidos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMEAE), análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados em: (i) anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em 5 ΕΡ1725249Β1 carcinomas); (ii) cAClO que é específico para CD30 em malignidades hematológicas (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15 (4) :765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102 (4) :1458-1465; Publicação US 2004/0018194; (iii) anticorpos anti-CD20 tais como RITUXAN® (documento WO 04/032828) para o tratamento de cancros que expressam CD20 e distúrbios imunológicos; (iv) anticorpos anti-EphB2 e anti-IL-8 para o tratamento de cancro colorretal (Mao, et al. (2004) Câncer Research 64(3) :781-788) ; (v) anticorpo de selectina E (Bhaskar et al. (2003) Câncer Res. 63:6387-6394); e (vi) outros anticorpos anti-CD30 (documento WO 03/043583).
Auristatina E conjugada com anticorpos monoclonais são apresentadas por Senter et al., Proceedings of the American Association for Câncer Research, Volume 45, Número de Resumo 623, apresentado em 28 de Março de 2004.
Apesar dos dados In vitro para compostos da classe de dolastatina e seus análogos, toxicidades gerais significativas nas doses requeridas para atingir um efeito terapêutico comprometem sua eficácia em estudos clínicos. Consequentemente, existe uma necessidade clara na técnica para derivados de dolastatina/auristatina que tenham toxicidade significativamente menor, e ainda eficiência terapêutica útil. Estas e outras limitações e problemas do passado são considerados pela presente invenção. A família de ErbB de cinases de tirosina de recetor são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência da célula. A família do recetor inclui quatro membros distintos incluindo recetor de fator de crescimento epidérmico (EGFR, ErbBl, HER1) , HER2 (ErbB2 ou pl85neu), 6 ΕΡ1725249Β1 HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2). Um painel de anticorpos anti-ErbB2 foi caracterizado usando a linha de célula de tumor de mama humano SKBR3 (Hudziak et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172. Inibição máxima foi obtida com o anticorpo denominado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56 %. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação celular numa extensão menor nesta análise. Descobriu-se ainda que o anticorpo 4D5 sensibiliza linhas de célula de tumor de mama que sobre-expressam ErbB2 aos efeitos citotóxicos de TGF-α (Patente US N° 5677171) . Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos por Hudziak et al. são ainda caracterizados em Fendly et al. (1990) Câncer
Research 40:1550-1558; Kotts et al. (1990) In vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Requlation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3):117-127;
Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11 (2):979-986; Lewis et al. (1993) Câncer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Câncer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661- 14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem.. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Câncer Research 56:1457-1465; e Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394.
Outros anticorpos anti-ErbB2 com várias propriedades foram descritos em Tagliabue et al. Int. J. Câncer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989);
Maier et al. Câncer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al.
Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. Proc. Nati Acad. Sei. USA 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Câncer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. int. J. Câncer 53:401-408 (1993); documento W094/00136; Kasprzyk et al. Câncer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. (1991) Câncer Res. 51:4575-4580; Shawver et al. (1994) 7 ΕΡ1725249Β1 Câncer Res. 54:1367-1373; Arteaga et al. (1994) Câncer Res. 54:3758-3765; Harwerth et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15160-15167; Patente US N° 5783186; e Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109. O rastreio de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família do recetor ErbB; ErbB3 (Patente US N° 5.183.884; Patente US N° 5.480.968; KraU.S. et al. (1989) Proc. Nati Acad. Sei. USA 86:9193-9197) e ErbB4 (documento EP 599274; Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei USA 90:174 6-1750; e Plowman et al. (1993)
Nature 366:473-475. Estes dois recetores apresentam expressão aumentada em pelo menos algumas linhas de célula de cancro de mama. HERCEPTIN® (Trastuzumab) é um anticorpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se liga seletivamente com alta afinidade numa análise baseada em célula (Kd = 5 nM) ao domínio extracelular da proteína de recetor2 de fator de crescimento epidérmico humano, HER2 (ErbB2) (Patente US N° 5821337; Patente US N° 6054297; Patente US N° 6407213; Patente US N° 6639055; Coussens L, et al. (1985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al. (1989)
Science 244:707-12). Trastuzumab é um anticorpo IgGl capa que contém regiões de estrutura humana com as regiões de determinação de complementação de um anticorpo de murino (4D5) que se liga a HER2. Trastuzumab liga-se ao antigénio HER2 e, assim, inibe o crescimento de células cancerígenas. Devido ao fato de Trastuzumab ser um anticorpo humanizado, ele minimiza qualquer resposta HAMA nos pacientes. O anticorpo humanizado contra HER2 é produzido por uma suspensão de cultura de célula de mamífero (Ovário de Hamster Chinês, CHO) . O protoncogene HER2 (ou c- erbB2) codifica uma proteína de recetor de transmembrana de 185 kDa, que é estruturalmente relacionada ao recetor de fator 8 ΕΡ1725249Β1 de crescimento epidérmico. A sobre-expressão da proteína HER2 é observada em 25 %-30 % de cancros de mama primários e pode ser determinada usando uma avaliação baseada em imunohistoquímica de blocos de tumor fixados (Press MF, et al. (1993) Câncer Res 53:4960-70. Trastuzumab demonstrou, em análises in vitro e em animais, inibir a proliferação de células de tumor humano que sobre-expressam HER2 (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9: 1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Câncer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga J, et al., (1998) Câncer Res. 58:2825-2831). Trastuzumab é um mediador de citotoxicidade celular dependente de anticorpo ADCC (Hotaling TE, et al. (1996) [resumo], Proc. Annual Meeting Am Assoe Câncer Res; 37:471; Pegram MD, et al. (1997) [resumo], Proc. Annual Meeting Am Assoe Câncer Res; 38:602). In vitro, ADCC mediado por Trastuzumab demonstrou ser preferencialmente atuante em células de cancro que sobre-expressam HER2 comparado com células de cancro que não sobre-expressam HER2. HERCEPTIN® como agente único é indicado para o tratamento de pacientes com cancro de mama metastático cujos tumores sobre-expressam a proteína HER2 e que receberam um ou mais regimes de quimioterapia para sua doença metastática. HERCEPTIN® em combinação com paclitaxel é indicado para o tratamento de pacientes com cancro de mama metastático cujos tumores sobre-expressam a proteína HER2 e que não receberam quimioterapia para sua doença metastática. HERCEPTIN® é clinicamente ativo em pacientes com cancros de mama metastático que sobre-expressam ErbB2 que receberam terapêutica anti-cancro anterior extensiva (Baselga et al., (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744). O anticorpo anti-HER2 monoclonal de murino inibe o crescimento de linhas de célula de cancro de mama que sobre-expressam HER2 no nível 2+ e 3+ (1-2 x 106 recetores HER2 por célula) , mas não tem atividade em células que expressam níveis mais baixos de HER2 (Lewis et al., (1993) 9 ΕΡ1725249Β1 Câncer Immunol. Immunother. 37:255-263). Com base nesta observação, anticorpo 4D5 foi humanizado (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Patente US N° 5821337; Cárter et al. (1992) Proc. Nat1. Acad. Sei. USA 89:4285-4289) e testado em pacientes com cancro de mama cujos tumores sobre-expressam HER2, mas que progrediram após quimioterapia convencional (Cobleigh et al., (1999) J. Clin. Oncol. 17:2639-2648).
Embora HERCEPTIN seja um marco no tratamento de pacientes com cancros de mama que sobre-expressam ErbB2 que receberam terapêutica anti-cancro anterior extensiva, alguns pacientes nesta população não responderam ou responderam apenas muito pouco ao tratamento com HERCEPTIN. 0 documento W001/18032 A2 descreve péptidos dolastatina de fórmula (I)
0 documento W02004/073656 A2 descreve anticorpos anti-CD70 e derivados dos mesmos conjugados a agentes citotóxicos, imunossupressores ou outros agentes terapêuticos, para o tratamento de cancros que expressam CD70 e distúrbios imunológicos. 0 documento W02004/010957 A2 descreve conjugados de fármaco-ligante-ligando em que um fármaco é ligado a um ligando via uma unidade de ligante à base de péptido. 0 ligando pode ser um anticorpo. Métodos para tratar cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa são descritos.
Portanto, existe uma necessidade clínica significativa para o desenvolvimento adicional de terapêuticas de cancro direcionadas para HER2 para aqueles pacientes com tumores 10 ΕΡ1725249Β1 que sobre-expressam HER2 ou outras doenças associadas com a expressão de HER2 que não respondem, ou respondem muito pouco, ao tratamento com HERCEPTIN. A menção a qualquer referência neste pedido não é uma admissão de que a referência seja técnica anterior a este pedido.
3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Num aspeto, a presente invenção proporciona Compostos de Fármaco que têm a fórmula Ib:
R n mesmos, em que independentemente em cada localização R2 é selecionado a partir de hidrogénio e -Ci-C8 alquilo; R3 é selecionado a partir de hidrogénio, -Ci-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, arilo, -Ci~C8 alquil-arilo, -Ci~C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo e -Ci-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); R4 é selecionado a partir de hidrogénio, -Ci-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, -arilo, -Ci-C8 alquil-arilo, -Ci-C8 alquil- (C3-C8 carbo-ciclo), -C3-C8 heterociclo e -Ci~C8 alquil- (C3—C8 heterociclo) em que R5 é selecionado a partir de -H e -metilo; ou R4 e R5 em conjunto formam um anel carbociclico e têm a fórmula - (CRaRb) n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de -H, - 11 ΕΡ1725249Β1
Ci-Cg alquilo e -C3-C8 carbociclo e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado a partir de H e -Ci-C8 alquilo; R7 é selecionado a partir de H, -Ci-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo, arilo, -Ci-C8 alquil-arilo, -Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), -C3-C8 heterociclo e -Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, -OH, -Ci-C8 alquilo, -C3-C8 carbociclo e -0-(Ci-C8 alquil); R9 é selecionado a partir de H e -Ci-C8 alquilo; R10 é selecionado a partir de arilo grupo ou -C3-C8 heterociclo; Z é -0-; e R11 é H.
Os compostos de Fórmula (Ib) são úteis para o tratamento de cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa num paciente, ou úteis como um intermediário para a síntese de um Conjugado de Fármaco-Ligante, Fármaco-Ligante-Ligando, e Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco que pode ser clivada.
Em outro aspeto, a presente invenção proporciona um conjugado como definido na reivindicação 2, que tem a seguinte fórmula:
L- (LU-DF)P ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: L- é uma unidade de Ligando, LU é uma unidade de Ligante que pode estar presente ou ausente, p varia de 1 a 20, e 12 ΕΡ1725249Β1
Df é um grupo da seguinte fórmula:
0 conjugado definido na reivindicação 2 pode ser um conjugado de anticorpo-fármaco que tem a Fórmula Ia':
Ab-(-A—W—Yy-Df )p la’ ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que:
Ab é um anticorpo, -Aa-Ww-Yy- é uma unidade de Ligante, A é uma unidade de Estirador, a é 0 ou 1, cada W é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, Y é uma unidade de Espaçador, y é 0, 1, ou 2, e p varia de 1 a 20.
Em outro aspeto, a presente invenção proporciona um conjugado como definido na reivindicação 3, que tem a seguinte fórmula: LU-Df ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: LU- é uma Unidade de Ligante que compreende um grupo funcional capaz de ligar-se a uma unidade de ligando, e DF é um grupo da seguinte fórmula: 13 ΕΡ1725249Β1
Em ainda um outro aspeto, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade efetiva de um conjugado de anticorpo-fármaco e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
Também se descrevem no presente documento composições que compreendem uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável a partir do Conjugado de Fármaco-Ligando, e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a multiplicação de células de tumor ou células cancerígenas incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma. 14 ΕΡ1725249Β1
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a replicação de uma célula que expresse um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a replicação de uma célula que expressa um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a replicação de uma célula que expressa um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma. 15 ΕΡ1725249Β1
Também se descrevem no presente documento métodos para o tratamento de uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para o tratamento de uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para o tratamento de uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para o tratamento de uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para o tratamento de uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para o tratamento de uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do 16 ΕΡ1725249Β1
Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco- Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma 17 ΕΡ1725249Β1 unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula que expressa um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula que expressa um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula que expressa um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença autoimune incluindo a administração de 18 ΕΡ1725249Β1 uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Composto de Fármaco-Ligante a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligando que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Num outro aspeto, é proporcionado um Composto de Fármaco que pode ser usado como um intermediário para a síntese de um Composto de Fármaco-Ligante que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando .
Num outro aspeto, é proporcionado um Composto de Fármaco- Ligante que pode ser usado como um intermediário para a síntese de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando.
Numa forma de realização dos compostos da Fórmula Ia', Ab não é um anticorpo que se liga a um recetor ErbB ou que se liga a um ou mais dos recetores (1) - (35) : 19 ΕΡ1725249Β1 (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203); (2) E16 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 034 8 6) ; (3) STEAP1 (seis antigénios transmembrana epitelial da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUCi6, N° de acesso do Genbank AF 3 614 8 6); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_0 05823) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio) , membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_006424) (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de tromboespondina (tipo 1 e similar ao tipo 1) , domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N° de acesso do Genbank AB040878); (8) PS CA hlg (gene 2700050Ci2Rik, C530008016Rik, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, N° de acesso do Genbank AY358628); (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, N° de acesso do Genbank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138); 20 ΕΡ1725249Β1 (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamilia M, membro 4, N° de acesso do Genbank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de virus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); (15) CD79b (IGb (beta imunoglobulina-associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626); (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la), SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); (17) HER2 (N° de acesso do Genbank M11730); (18) NCA (N° de acesso do Genbank M18728); (19) MDP (N° de acesso do Genbank BC0i7023) ; (20) IL20Ra (N° de acesso do Genbank AF184971); (21) Brevican (N° de acesso do Genbank AF229053); (22) Ephb2R (N° de acesso do Genbank NM_004442); (23) ASLG659 (N° de acesso do Genbank AX092328); (24) PSCA (N° de acesso do Genbank AJ297436); (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); (26) BAFF-R (N° de acesso do Genbank NP_443177.1); (27) CD22 (N° de acesso do Genbank NP_001762.1); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina-associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo na superfície com moléculas Ig M, faz a transdução um sinal envolvido na diferenciação de célula B, N° de acesso do Genbank NP_001774.1); (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela químocina CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no 21 ΕΡ1725249Β1 desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia, N° de acesso do Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio la) que se liga a péptidos e os apresenta aos linfócitos CD4+ T, N° de acesso do Genbank NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um ião de canal fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático, N° de acesso do Genbank NP_002552.2); (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2, N° de acesso do Genbank NP_001773.1); (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico, N° de acesso do Genbank NP_005573.1); (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo similar a lg e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B, N° de acesso do Genbank NP_4 4 317 0.1); ou (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamília imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B, N° de acesso do Genbank NP_112571.1).
Também se descrevem no presente documento composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo e um portador ou veículo farmaceuticamente aceitável. 22 ΕΡ1725249Β1
Também se descrevem no presente documento composições que compreendem uma quantidade eficaz de um conjugado Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável (fração) do Conjugado de Fármaco- Anticorpo e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco- Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a replicação de uma célula que expresse um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma 23 ΕΡ1725249Β1 quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para destruir ou inibir a replicação de uma célula que expresse um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para tratar uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma. 24 ΕΡ1725249Β1
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco- Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir cancro incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula que expresse um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir a multiplicação de uma célula que expressa um anticorpo autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de 25 ΕΡ1725249Β1 Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença autoimune incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
Também se descrevem no presente documento métodos para impedir uma doença infeciosa incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Fármaco-Anticorpo que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Anticorpo a um paciente que tenha necessidade da mesma.
No presente documento, é proporcionado um Composto de Fármaco que pode ser usado como um intermediário para a síntese de um Composto de Fármaco-Ligante que tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco- Anticorpo.
No presente documento, é proporcionado um Composto de Fármaco-Ligante que pode ser usado como um intermediário 26 ΕΡ1725249Β1 para a síntese de um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo.
Nos Conjugados de Fármaco-Ligante-Anticorpo (também referidos como conjugados de anticorpo-fármaco) descritos no presente documento, Ab pode ser um anticorpo que se liga a um ou mais dos antigénios (1) - (35) : (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203); (2) EI 6 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 034 8 6) ; (3) STEAP1 (seis antigénios transmembrana epitelial da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUCi6, N° de acesso do Genbank AF 3 614 8 6) ; (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_0 05 82 3) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio) , membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_00 6424) ; (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de tromboespondina (tipo 1 e similar a tipo 1) , domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N° de acesso do Genbank AB040878); (8) PSCA hlg (gene 2700050Ci2Rik, C530008016Rik, ADNc de RIKEN 2700050C12, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, N° de acesso do Genbank AY358628); (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, N° de acesso do Genbank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); 27 ΕΡ1725249Β1 (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamília M, membro 4, N° de acesso do Genbank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); (15) CD79b (IGb (beta imunoglobulina-associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626); (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la), SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); (17) HER2 (N° de acesso do Genbank M11730); (18) NCA (N° de acesso do Genbank M18728); (19) MDP (N° de acesso do Genbank BC0i7023) ; (20) IL2ORa (N° de acesso do Genbank AF184971); (21) Brevican (acesso Genbank n-AF229053); (22) Ephb2R (N° de acesso do Genbank NM_004442); (23) ASLG659 (N° de acesso do Genbank AX092328); (24) PSCA (N° de acesso do Genbank AJ297436); (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); (26) BAFF-R (N° de acesso do Genbank NP_443177.1); (27) CD22 (N° de acesso do Genbank NP_001762.1); (28) CD7 9a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina- associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com Ig beta (CD7 9B) e forma um complexo na superfície com molécula de Ig m, faz a transdução de um 28 ΕΡ1725249Β1 sinal envolvido na diferenciação de célula B, N° de acesso do Genbank NP_001774.1) ; (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na miqração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia, N° de acesso do Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio la) que se liga a péptidos e os apresenta aos linfócitos CD4+ T, N° de acesso do Genbank NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um ião de canal fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático, N° de acesso do Genbank NP_002552.2); (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2, N° de acesso do Genbank NP_001773.1); (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico, N° de acesso do Genbank NP_005573.1); (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo similar a lg e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B, N° de acesso do Genbank NP_4 4 317 0.1); ou (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamilia imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e iinfomagénese; desregulação do gene pela translocação 29 ΕΡ1725249Β1 ocorre em algumas malignidades de célula B, N° de acesso do Genbank NP_112571.1).
Num outro aspeto, o anticorpo do conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção liga-se especificamente a um recetor codificado por um gene ErbB2.
Num outro aspeto, o anticorpo do conjugado de anticorpo- fármaco é um anticorpo humanizado selecionado a partir de huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Trastuzumab).
Também se descreve no presente documento um artigo de fabrico que compreende um composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção; um recipiente; e uma inserção de embalagem ou rótulo indicando que o composto pode ser usado para tratar cancro caracterizado pela sobre-expressão de um recetor ErbB2.
Também se descreve no presente documento um método para o tratamento de cancro num mamífero, onde o cancro é caracterizado pela sobre-expressão de um recetor ErbB2 e não responde, ou responde muito pouco, ao tratamento com um anticorpo anti-ErbB2, que compreende a administração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção.
Em alguns casos, uma quantidade substancial da fração de fármaco não é clivada do anticorpo até o composto conjugado de anticorpo- fármaco entrar numa célula com um recetor de superfície de célula específico para o anticorpo do conjugado de anticorpo-fármaco, e a fração de fármaco é clivada do anticorpo quando o conjugado de anticorpo-fármaco entra na célula. 30 ΕΡ1725249Β1
Em alguns casos, a biodisponibilidade do composto conjugado de anticorpo-fármaco ou de um metabolito intracelular do composto num mamífero é melhorada quando comparada com um composto de fármaco que compreende a fração de fármaco do composto conjugado de anticorpo-fármaco, ou quando comparado com um análogo do composto que não possui a fração de fármaco. A fração de fármaco pode ser clivada intracelularmente num mamífero a partir do anticorpo do composto, ou um metabolito intracelular do composto.
Num outro aspeto, a invenção inclui uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um diluente, portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ainda compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de agente quimioterápico tal como um inibidor formador de tubulina, um inibidor de topoisomerase, e um aglutinante de ADN.
Também se descreve no presente documento um método para destruir ou inibir a proliferação de células de tumor ou células cancerígenas, o qual compreende o tratamento das células de tumor ou células cancerígenas com uma quantidade do composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção, ou com um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo efetivo para destruir ou inibir a proliferação das células de tumor ou células cancerígenas.
Também se descreve no presente documento um método para inibir proliferação celular que compreende expor células de mamífero num meio de cultura de célula a um composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção, onde o 31 ΕΡ1725249Β1 composto conjugado de anticorpo-fármaco entra nas células e o fármaco é clivado do restante do composto conjugado de anticorpo-fármaco; e portanto a proliferação das células é inibida.
Também se descreve no presente documento um método para o tratamento de cancro que compreende a administração a um paciente de uma formulação de um composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção, e um diluente, portador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
Também se descreve no presente documento um ensaio para detetar células de cancro que compreende: (a) expor células a um composto conjugado de anticorpo-fármaco da invenção; e (b) determinar a extensão de ligação do composto conjugado de anticorpo- fármaco às células. A invenção será melhor entendida por referência à descrição pormenorizada a seguir das formas de realização exemplares, consideradas em conjunto com os desenhos, figuras, e esquemas em anexo. A discussão a seguir é descritiva, ilustrativa e exemplar e não deve ser considerada como limitativa do âmbito definido por qualquer das reivindicações apensas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra uma análise de eficácia in vivo, de dose única subcutânea, de cAClO-mcMMAF em xenoenxertos de Karpas-299 ALCL. A Figura 2 mostra uma análise de eficácia in vivo, de dose única subcutânea, de cAClO-mcMMAF em L540cy. Para 32 ΕΡ1725249Β1 este estudo havia 4 ratinhos no grupo não tratado e 10 em cada um dos grupos de tratamento.
As Figuras 3a e 3b mostram uma análise de eficácia in vivo de cBR96-mcMMAF em L2987 subcutânea. Os triângulos preenchidos na Figura 3a e setas na Figura 3b indicam os dias de terapêutica. As Figuras 4a e 4b mostram atividade in vitro de conjugados de cAClO-anticorpo-fármaco contra linhas de célula CD30 + As Figuras 5a e 5b mostram atividade in vitro de conjugados de cBR96-anticorpo-fármaco contra linhas de célula Ley+. As Figuras 6a e 6b mostram atividade in vitro de conjugados de cl F6-anticorpo-fármaco contra linhas de célula de carcinoma de célula renal CD70+. A Figura 7 mostra um ensaio de proliferação de célula in vitro com células SK-BR-3 tratadas com conjugados de anticorpo-fármaco (ADC): -·- Trastuzumab-MC-vc-PAG-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, ~0~ Trastuzumab-MC- MMAF, 4,1 MMAF/Ab, e -Δ- Trastuzumab-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab, medidos em Unidades de Fluorescência Relativa (ULR) contra concentração pg/ml de ADC. H = Trastuzumab onde H está ligado através de uma cisteina [cys], A Figura 8 mostra um ensaio de proliferação de célula in vitro com células BT-474 tratadas com ADC: -·-Trastuzumab-MC-vc-PAG-MMAF, 3, 8 MMAF/Ab, -o-Trastuzumab-MC-MMAF, 4, 1 MMAF/Ab, e -Δ- Trastuzumab-MC -MMAF, 4,8 MMAF/Ab. 33 ΕΡ1725249Β1 A Figura 9 mostra um ensaio de proliferação de célula in vitro com células MCF-7 tratadas com ADC: -·-Trastuzumab-MC-vc-PAG-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o-Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab, e -Δ-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab A Figura 10 mostra um ensaio de proliferação de célula in vitro com células MDA-MB-468 tratadas com ADC: -·-Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE, 4,1 MMAE/Ab, -o-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab, e -Δ-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab. A Figura 11 mostra um estudo de depuração de concentração plasmática após administração de H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG e H-MC-vc-PAB- MMAF a ratos Sprague-Dawley: A dose administrada foi de 2 mg de ADC por kg de rato. As concentrações de anticorpo total e ADC foram medidas durante o decorrer do tempo. (H = Trastuzumab). A Figura 12 mostra um estudo de depuração de concentração plasmática após administração de H-MC-vc-MMAE a macacos Cynomolgus em doses diferentes: 0,5, 1,5, 2,5, e 3,0 mg/kg administradas no dia 1 e dia 21. As concentrações de anticorpo e ADC totais foram medidas durante o decorrer do tempo. (H = Trastuzumab). A Figura 13 mostra a mudança de volume médio do tumor durante o tempo em ratinhos nus atimicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no dia 0 com: veiculo, Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE (1250 pg/ml2) e Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF (555 yg/ml2) . (H = Trastuzumab). 34 ΕΡ1725249Β1 A Figura 14 mostra a mudança de volume médio do tumor durante o tempo em ratinhos nus atimicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com 10 mg/kg (660 pg/ml2) de Trastuzumab-MC-MMAE e 1250 pg/ml2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. A Figura 15 mostra a mudança no volume médio do tumor com o passar do tempo em ratinhos nus atimicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com Veículo e 650 pg/ml2 de trastuzumab-MC-MMAF. A Figura 16 mostra a mudança no volume médio de tumor com o tempo em ratinhos nus atimicos com aloenxertos de tumor de mama MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com veículo de 350 pg/ml2 de guatro conjugados de trastuzumab-MC-MMAF onde a proporção de MMAF/trastuzumab (H) é de 2, 4, 5,9 e 6. A Figura 17 mostra a mudança média no Grupo, com barras de erro, nos pesos corporais de animal (rato) (Média ± DP) após administração de Veículo, trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB- MMAF, trastuzumab-MC-MMAF e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF. A Figura 18 mostra a mudança média no Grupo nos pesos corporais de animal (rato) (Média ± DP) após administração de 9,94 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 24, 90 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 10,69 mg/kg de H-MC(Me)- vc-PAB-MMAF, 26,78 mg/kg de H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 10,17 mg/kg de H- MC-MMAF, 25,50 mg/kg de H-MC-MMAF, e 21,85 mg/kg de H-MC-vc-PAB- MMAF. H = trastuzumab. O ligante MC é unido através de uma cisteína de trastuzumab para cada conjugado. 35 ΕΡ1725249Β1
A Figura 19 mostra a mudança média no Grupo, com barras de erro, nos pesos corporais de rato Sprague-Dawley (Média ± DP) após administração de trastuzumab (H)-MC-MMAF em doses de 2105, 3158, e 4210 pg/ml2. O ligante MC é unido através de uma cisteina de trastuzumab para cada conjugado.
4. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLARES
4.1 DEFINIÇÕES E ABREVIAÇÕES A não ser gue mencionado de outro modo, os termos e frases a seguir, conforme usados no presente documento, visam ter os seguintes significados:
Quando nomes comerciais são usados no presente documento, os requerentes objetivam incluir independentemente a formulação do produto de nome comercial, o fármaco genérico, e o(s) ingrediente(s) farmaceuticamente ativo(s) do produto de nome comercial. O termo "anticorpo" é usado no presente documento em seu sentido mais amplo e abrange, especificamente, anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecificos (por exemplo, anticorpos biespecificos) formados de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imunológico que é capaz de reconhecer e ligar-se a um antigénio especifico. Descrito em termos de sua estrutura, um anticorpo tipicamente tem uma proteína de formato Y consistindo de quatro cadeias de aminoácidos, duas pesadas e duas leves. Cada anticorpo possui duas regiões primárias: uma região variável e uma 36 ΕΡ1725249Β1 região constante. A região variável está localizada nas extremidades dos braços do Y, ligam-se e interagem com o antigénio alvo. Esta região variável inclui uma região de terminação complementar (CDR) que reconhece e se liga a um local de ligação especifico num antigénio especifico. A região constante, localizada na cauda do Y, é reconhecida e interage com o sistema imunológico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5-. Ed., Garland Publishing, Nova York). Um antigénio alvo geralmente tem numerosos locais de ligação, também denominados epítopos, reconhecidos por CDRs em anticorpos múltiplos. Cada anticorpo que especificamente se liga a um epitopo diferente possui uma estrutura diferente. Dessa maneira, um antigénio pode ter mais que um anticorpo correspondente. 0 termo "anticorpo" conforme usado no presente documento, também se refere a uma molécula de imunoglobulina de comprimento total ou uma fração imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, isto é, uma molécula que contém um local de ligação de antigénio que se liga imunoespecificamente a um antigénio de um alvo de interesse ou parte do mesmo, tais alvos incluindo, mas não limitados a célula ou células de cancro que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune. A imunoglobulina revelada no presente documento pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) , classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e lgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie. Num aspeto, entretanto, a imunoglobulina é de origem humana, de murino, ou de coelho. Num outro aspeto, os anticorpos são policlonais, monoclonais, biespecificos, humanos, humanizados ou anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, Fv, fragmentos Fab, 37 ΕΡ1725249Β1 fragmentos F(ab')/ fragmentos F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, anticorpos anti-idióticos (anti-ld), CDR's, e fragmentos de ligação a epitopo de qualquer um dos acima que se liga imunoespecificamente a antigénios de célula de cancro, antigénios virais ou antigénios microbianos. 0 termo "anticorpo monoclonal" conforme usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades mínimas. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, estando direcionados contra um local antigénico único. Além do mais, em contraste com preparações de anticorpo policlonal que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um único determinante no antigénio. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos visto que podem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. 0 modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser considerada como requerendo produção de anticorpo por um método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou pode ser feito por métodos de ADN recombinante (veja-se, Patente US N° 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fagos usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 e 38 ΕΡ1725249Β1
Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, por exemplo.
Os anticorpos monoclonais no presente documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma fração da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloqa a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie especifica ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo especifica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos destes anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US N° 4816567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855). Vários métodos foram utilizados para produzir anticorpos monoclonais (MAbs). Tecnologia de hibridoma, a qual se refere a uma linha de célula clonada que produz um tipo único de anticorpo, usa as células de várias espécies, incluindo ratinhos (murino), hamsters, ratos, e humanos. Um outro método para preparar MAbs usa engenharia genética incluindo técnicas de ADN recombinante. Anticorpos monoclonais feitos a partir destas técnicas incluem, entre outros, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo quimérico combina regiões de codificação de ADN de mais que um tipo de espécie. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode derivar uma região variável de um ratinho e a região constante de um ser humano. Um anticorpo humanizado origina-se predominantemente de um ser humano, embora contenha porções não humanas. Como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado pode conter uma região constante completamente humana. Mas, diferente de um anticorpo quimérico, a região variável pode ser 39 ΕΡ1725249Β1 parcialmente derivada de um ser humano. As porções não humanas, sintéticas, de um anticorpo humanizado frequentemente advêm de CDRs em anticorpos de murino. Em qualquer caso, estas regiões são cruciais para permitir que o anticorpo reconheça e se ligue a um antigénio especifico.
Conforme observado, anticorpos de murino podem ser usados. Embora úteis para diagnósticos e terapêuticas de curta duração, anticorpos de murino não podem ser administrados a pessoas por um período longo sem aumentar o risco de uma resposta imunogénica prejudicial. Esta resposta, denominada Anticorpo Humano Anti-Ratinho (HAMA), ocorre quando o sistema imunológico humano reconhece o anticorpo murino como estrangeiro e o ataca. Uma resposta HAMA pode causar choque tóxico ou mesmo a morte.
Anticorpos quiméricos e humanizados reduzem a probabilidade de uma resposta HAMA pela minimização das porções não humanas de anticorpos administrados. Além do mais, anticorpos quiméricos e humanizados possuem o beneficio adicional de ativar respostas imunológicas humanas secundárias, tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma fração de um anticorpo intacto, preferivelmente que compreende a região de ligação de antigénio ou variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2f e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecificos formados de fragmento(s) de anticorpo.
Um anticorpo "intacto" é aquele que compreende uma região variável de ligação de antigénio, assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes 40 ΕΡ1725249Β1 de cadeia pesada, CHI, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácido dos mesmos. 0 anticorpo intacto pode ter uma ou mais "funções de efetor" que se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções de efetor de anticorpo incluem ligação Ciq; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de recetor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação para baixo de recetores de superfície de célula (por exemplo, recetor de célula B, BCR), etc.
Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser designados a diferentes "classes". Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominadas α, δ, □, γ, e μ respetivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. A expressão "ErbB2" e "HER2" são usadas de forma intercambiável no presente documento e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al., (1986) Nature 319:230-234 (Número de acesso do Genebank X03363) . O termo "erbB2" refere-se ao gene que codifica ErbB2 humano e "neu" refere-se ao gene 41 ΕΡ1725249Β1 que codifica pl85neu de rato. ErbB2 preferido é a sequência nativa humana ErbB2.
Anticorpos para recetores ErbB estão disponíveis comercialmente de uma série de fontes, incluindo, por exemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Califórnia, EUA.
Por "ligando de ErbB" entende-se um polipéptido que se liga e/ou ativa um recetor ErbB. 0 ligando de ErbB pode ser uma ligando de ErbB humano de sequência nativa tal como o fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al. (1972) J. Biol. Chem. 247:7612-7621); fator de crescimento de transformação alfa (TGF-α) (Marquardt et al. (1984) Science 223:1079-1082); anfirregulina, também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrino de ceratinócito (Shoyab et al. (1989) Science 243:1074-1076; Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990); e Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); uma herregulina (veja-se a seguir); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 94:9562- 9567 (1997)); neuregulin-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene, 18 :2681-89 (1999)) ou cripto (CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Ligandos ErbB que se ligam a EGFR incluem EGF, TGF-α, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Ligandos ErbB que se ligam a ErbB3 incluem herregulinas. Ligandos ErbB capazes de ligação a ErbB4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e herregulinas. O ligando de ErbB pode também ser um 42 ΕΡ1725249Β1 ligando de ErbB sintético. 0 ligando sintético pode ser específico para um recetor ErbB específico, ou pode reconhecer complexos específicos de recetor ErbB. Um exemplo de um ligando sintético é a herregulina/birregulina EGF quimera sintética (veja-se, por exemplo, Jones et al., (1999) FEBS Letters, 447:227-231, que é incorporado no presente documento por referência). "Herregulina" (HRG) refere-se a um polipéptido codificado pelo produto do gene herregulina conforme revelado na Patente US N° 5641869 ou Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Exemplos de herregulinas incluem herregulina-a, herregulina-βΐ, herregulina-p2 e herregulina-33 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) ; e Patente US N° 5641869); fator de diferenciação neu (NDF) (Peles et al., Cell 69:205-216 (1992)); atividade induzida por recetor de acetilcolina (ARIA) (Falis et al. (1993) Cell 72:801 -815); fatores de crescimento gliais (GGFs) (Marchionni et al. Nature, 362:312-318 (1993)); fator derivado de neurónio sensorial e motor (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); γ-regulina (Schaefer et al. Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). O termo inclui fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de sequência de aminoácido de um polipéptido HRG de sequência nativa, tal como um fragmento de domínio tipo EGF do mesmo (por exemplo, HRGpll77-244). "Hetero-oligómero ErbB" é um oligómero não covalentemente associado que compreende pelo menos dois recetores ErbB diferentes. Um "dímero ErbB" é um oligómero não covalentemente associado que compreende dois recetores ErbB diferentes. Estes complexos podem se formar quando uma célula que expressa dois ou mais recetores ErbB é exposta a um ligando de ErbB. Oligómeros ErbB, tais como dímeros ErbB, podem ser isolados por imunoprecipitação e analisado 43 ΕΡ1725249Β1 por SDS-PAGE conforme descrito em Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), por exemplo. Exemplos destes hetero-oligómeros ErbB incluem complexos EGFR-ErbB2 (também referidos como HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) e ErbB3- ErbB4 (HER3/HER4). Além do mais, o hetero-oligómero ErbB pode compreender dois ou mais recetores ErbB2 combinados com um recetor ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 ou EGFR (ErbBl) . Outras proteínas, tais como uma subunidade de recetor de citocina (por exemplo, gpl30) pode ser incluída no hetero-oligómero.
Um polipéptido de "sequência nativa" é aquele que tem a mesma sequência de aminoácido que um polipéptido, por exemplo, recetor de antigénio associado com tumor, derivado da natureza. Estes polipéptidos de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Dessa maneira, um polipéptido de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácido de polipéptido humano de ocorrência natural, polipéptido de murino, ou polipéptido de qualquer outra espécie de mamíferos. O termo "variante de sequência de aminoácido" refere-se a polipéptidos que tem sequências de aminoácido que diferem em alguma extensão de um polipéptido de sequência nativa. Ordinariamente, variantes de sequência de aminoácido possuirão pelo menos cerca de 70 % de homologia com pelo menos um domínio de ligação do recetor de um ligando nativo, ou com pelo menos um domínio de ligação a ligando de um recetor nativo, tal como um antigénio associado a tumor, e preferivelmente, eles serão pelo menos cerca de 80 %, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90 % homólogos a estes domínios de ligação de recetor ou ligando. As variantes de sequência de aminoácido possuem substituições, deleções, e/ou inserções em certas posições 44 ΕΡ1725249Β1 dentro da sequência de aminoácido da sequência de aminoácido nativa. "Identidade de sequência" é definida como a percentagem de resíduos na variante de sequência de aminoácido que são idênticos após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessários, para atingir o percentual máximo de identidade de sequência. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um destes programas de computador é o "Align 2", da Genentech, Inc., que foi depositado com documentação de usuário na United States Copyright Office, Washington, DC 20559, em 10 de dezembro de 1991. "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" refere-se a uma reação mediada pela célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam recetores Fc (FcRs) (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente causa lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e
FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas em é resumida no quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol., 9:457-92. Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, uma análise in vitro de ADCC, tal como aquela descrita na Patente US N° 5500362 ou 5821337 pode ser executada. Células efetoras úteis para estas análises incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como 45 ΕΡ1725249Β1 aquele revelado em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:652-656 (1998).
Os termos "recetor Fc" ou "FcR" são usados para descrever um recetor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além do mais, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um recetor gama) e inclui recetores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcYRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destes recetores. Recetores FeyRII incluem FcyRIIA (um "recetor ativador") e FcyRIIB (um "recetor inibidor"), que possuem sequências de aminoácido similares que diferem primariamente nos dominios citoplasmáticos dos mesmos. 0 recetor ativador FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado no imunorrecetor tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. 0 recetor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado no imunorrecetor tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (Veja-se análise M. no Daêron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcRs são analisados por Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. clin. Med., 126:330- 41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" no presente documento. O termo também inclui o recetor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto. (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se a capacidade de uma molécula para lisar um alvo na presença do complemento. O caminho de ativação do complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (Ciq) a uma molécula (por 46 ΕΡ1725249Β1 exemplo, um anticorpo) complexado com um antigénio cognato. Para avaliar a ativação de complemento, uma análise CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizada. 0 termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo especifico para seu antigénio específico. Entretanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente em todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto nos de cadeia pesada. As porções mais bem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas, cada um, compreendem quatro FRs, principalmente adotando uma forma de realização de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam alças conectando, e em alguns casos constituindo uma parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antigénio de anticorpos (veja-se Kabat et al. (1991) Sequences os Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções de efetor, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). O termo "região hipervariável" quando usado no presente documento se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antigénio. 47 ΕΡ1725249Β1 A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementação" ou "CDR" (por exemplo, resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al. supra) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no dominio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917). Resíduos de "Região de Estrutura" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definidos no presente documento.
Digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um local de ligação de antigénio único, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade para cristalizar prontamente. Tratamento com pepsina resulta num fragmento F(ab')2 que possui dois locais de ligação de antigénio e é ainda capaz de reticular o antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento de antigénio e ligação de antigénio. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação próxima, não covalente. É nesta forma de realização que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir o local de ligação de antigénio na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antigénio ao anticorpo. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três 48 ΕΡ1725249Β1 regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) possui a capacidade para reconhecer e ligar-se a antigénio, embora numa afinidade menor do que aquela do local de ligação inteiro. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos do terminal carboxi do dominio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab' na qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes suporta(m) pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de articulação entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.
As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser designadas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominado capa (k) e lambda (à), com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes.
Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, onde estes domínios estão presentes numa cadeia de polipéptido única. Preferivelmente, o polipéptido Fv compreende ainda um ligante de polipéptido entre os domínios VH e VL que permite ao scFv formar a estrutura desejada para ligação de antigénio. Para uma análise de scFv, veja-se Pluckthun na "The Pharmacology of Monoclonal antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994). 49 ΕΡ1725249Β1 0 termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação de antigénio, cujos fragmentos compreendem um domínio pesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipéptido (VH - VL) . Através da utilização de um ligante que é muito curto para permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a formar par com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois locais de ligação de antigénio. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, na EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448.
Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nos quais resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídas por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano, que tem a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além do mais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente tudo dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência 50 ΕΡ1725249Β1 de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma fração de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para pormenores adicionais, veja-se Jones et al. (1986) Nature, 321:522:525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596.
Anticorpos anti-ErbB2 humanizados incluem huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) conforme descrito no quadro 3 da Patente US N° 5821337, expressamente incorporada no presente documento por referência; anticorpos 520C9 humanizados (documento W093/21319) e anticorpos 2C4 humanizados são descritos no presente documento a seguir.
Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam com o diagnóstico ou usos terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteicos ou não proteicos. Nas formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais que 95 % em peso do anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais que 99 % em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 residuos de sequência de aminoácido N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não 51 ΕΡ1725249Β1 estará presente. Ordinariamente, entretanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.
Um anticorpo "que se liga" a um antigénio de interesse é aquele capaz de se ligar àquele antigénio com afinidade suficiente de modo que o anticorpo seja útil para ser direcionado a uma célula que expressa o antigénio.
Um anticorpo que "induz apoptose" é aquele que induz morte programada de célula conforme determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de ADN, encolhimento da célula, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação de célula, e/ou formação de vesículas de membrana (denominados corpos apoptóticos). A célula é uma célula de tumor, por exemplo, uma célula de mama, do ovário, estomacal, endométrica, da glândula salivar, pulmão, rins, cólon, tiroide, pancreática ou da bexiga. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida pela ligação de anexina; fragmentação de ADN pode ser avaliada através de escalonamento de ADN; e condensação nuclear/cromatina juntamente com fragmentação de ADN pode ser avaliada por qualquer aumento nas células hipodiploides.
Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria de tratamento da presente invenção. Isto inclui distúrbios crónicos e agudos ou doenças incluindo estas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitativos de distúrbios a serem tratados no presente documento incluem tumores benignos e malignos; leucemia e malignidades linfoides, em especial cancro de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rins, cólon, tiroide, pâncreas, próstata 52 ΕΡ1725249Β1 ou bexiga; distúrbios neuronais, gliais, astrócitos, hipotalâmicas e outros distúrbios glandulares, de macrófagos, epiteliais, estromais e blastocoélicas; e distúrbios inflamatórios, angiogénicas e imunológicas. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco efetiva para tratar uma doença ou distúrbio num mamífero. No caso de cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir em alguma extensão e preferivelmente cessar) a infiltração de célula cancerígena nos órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir em alguma extensão e preferivelmente cessar) metástase de tumor; inibir, em alguma extensão, o crescimento do tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados com o cancro. Na extensão em que o fármaco pode impedir o crescimento e/ou destruir as células cancerígenas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapêutica de cancro; a eficácia pode, por exemplo, ser medida pela avaliação do tempo para a progressão da doença (TTP) e/ou determinação da taxa de resposta (RR). 0 termo "quantidade substancial" refere-se a uma maioria, isto é, >50 % de uma população, de um conjunto ou uma amostra. O termo "metabolito intracelular" refere-se a um composto resultante de um processo ou reação metabólica dentro de uma célula num conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). 0 processo ou reação metabólica pode ser um processo enzimático tal como clivagem proteolítica de um ligante de péptido do ADC, ou hidrólise de um grupo funcional tal como hidrazona, éter, ou amida. Metabolitos intracelulares incluem, mas não se limitam a anticorpos e fármaco livre 53 ΕΡ1725249Β1 que sofreram clivagem intracelular após a entrada, difusão, absorção ou transporte para dentro de uma célula.
Os termos "intracelularmente clivado" e "clivagem intracelular" referem-se a um processo ou reação metabólica dentro de uma célula num Conjugado de Fármaco-Ligando, um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando, e um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) ou similar pelo qual a união covalente, por exemplo, o ligante, entre a fração de fármaco (D) e o anticorpo (Ab) é quebrada, resultando no fármaco livre dissociado do anticorpo dentro da célula. As porções clivadas do Conjugado de Fármaco-Ligando, um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando ou ADC são, dessa maneira, metabolitos intracelulares. 0 termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistémica (isto é, níveis sanguíneos/plasmáticos) de uma quantidade dada de fármaco administrado a um paciente. A biodisponibilidade é um termo absoluto que indica a medição do tempo (taxa) e a quantidade total (extensão) de fármaco que atinge a circulação geral de uma forma de dosagem administrada. 0 termo "atividade citotóxica" refere-se a um efeito de eliminação de célula, citostático ou anti-proliferação de um composto conjugado de anticorpo- fármaco ou um metabolito intracelular de um composto conjugado de anticorpo-fármaco. A atividade citotóxica pode ser expressa como o valor IC50 que é a concentração (molar ou massa) por volume unitário na qual metade das células sobrevive.
Os termos "cancro" e "cancerígeno" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento não regulado de células. Um "tumor" compreende uma ou mais células 54 ΕΡ1725249Β1 cancerígenas. Exemplos de cancro incluem, mas não se limitam a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos destes cancros incluem cancro de célula escamosa (por exemplo, cancro de célula escamosa epitelial) , cancro de pulmão incluindo cancro de pulmão de célula pequena, cancro de pulmão de célula não pequena ("NSCLC"), adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritónio, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou estomacal, incluindo cancro gastrintestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro retal, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma da glândula salivar, cancro dos rins ou renal, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, assim como cancro da cabeça e pescoço.
Um "cancro que expressa ErbB2" é aquele que produz níveis suficientes de ErbB2 na superfície de células do mesmo, de modo que um anticorpo anti-ErbB2 pode ligar-se às mesmas e ter um efeito terapêutico em relação ao cancro.
Um cancro "caracterizado por ativação excessiva" de um recetor ErbB2 é aquele em que a extensão de ativação de recetor ErbB2 nas células cancerígenas excede significativamente o nível de ativação daquele recetor em células não cancerígenas do mesmo tipo de tecido. Esta ativação excessiva pode resultar da sobre-expressão do recetor ErbB2 e/ou de niveis maiores que o normal de um ligando de ErbB2 disponível para ativar o recetor ErbB2 nas células cancerígenas. Esta ativação excessiva pode causar e/ou ser causada pelo estado maligno de uma célula cancerígena. Em algumas formas de realização, o cancro será 55 ΕΡ1725249Β1 submetido a uma análise diagnostica ou prognóstica para determinar se a amplificação e/ou sobre-expressão de um recetor ErbB2 está ocorrendo, gue resulte nesta ativação excessiva do recetor ErbB2. Alternativamente, ou adicionalmente, o cancro pode ser submetido a uma análise de diagnóstico ou prognóstico para determinar se a amplificação e/ou sobre-expressão de um ligando de ErbB2 está ocorrendo no cancro, o gue é atribuído à ativação excessiva do recetor. Num subconjunto destes cancros, ativação excessiva do recetor pode resultar numa via de estimulação autócrina.
Um cancro gue "sobre-expressa" um recetor ErbB2 é aquele que tem níveis significativamente mais elevados de um recetor ErbB2 na superfície da célula do mesmo, comparado com uma célula não cancerígena do mesmo tipo de tecido. Esta sobre-expressão pode ser causada por amplificação de gene ou por transcrição ou tradução aumentada. A sobre-expressão do recetor ErbB2 pode ser determinada numa análise de diagnóstico ou prognóstico através da avaliação dos níveis aumentados da proteína ErbB2 presentes na superfície de uma célula (por exemplo, através de uma análise de imuno-histoquímica; IHC) . Alternativamente, ou adicionalmente, os níveis de ácido nucleico que codifica ErbB2 na célula podem ser medidos, por exemplo, através de técnicas de hibridização fluorescente in situ (FISH; veja-se documento WO 98/45479), Southern blotting, ou reação em cadeia por polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa de tempo real (RT-PCR). A sobre-expressão do ligando de ErbB2 pode ser determinada por diagnóstico através da avaliação dos níveis do ligando (ou ácido nucleico que codifica o mesmo) no paciente, por exemplo, numa biopsia de tumor ou através de várias análises de diagnóstico, tal como IHC, FISH, Southern blotting, PCR ou análises in vivo descritas acima. A sobre- 56 ΕΡ1725249Β1 expressão do recetor ErbB2 pode também ser estudada através da medição do antigénio livre em circulação (por exemplo, dominio extracelular ErbB2) num fluido biológico tal como soro (veja-se, por exemplo, Patente US N° 4933294; documento WO 91/05264; Patente US N° 5401638; e Sias et al., (1990) J. Immunol. Methods, 132:73-80). Além das análises acima, várias outras análises in vivo estão disponíveis para o técnico especializado. Por exemplo, as células podem ser expostas dentro do corpo do paciente a um anticorpo que seja opcionalmente marcado com um rótulo detetável, por exemplo, um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, por rastreio externa quanto à radioatividade ou pela análise de uma biopsia retirada de um paciente previamente exposto ao anticorpo.
Os tumores que sobre-expressam HER2 são classificados por pontuações de imuno-histoquímica correspondendo ao número de cópias de moléculas de HER2 expressas por célula, e podem ser determinadas bioquímicamente: 0 = 0-10.000 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula, 3+ = cerca de 1-2 x 106 cópias/célula. A sobre-expressão de HER2 no nivel 3+, que conduz a ativação independente de ligando da cinase de tirosina (Hudziak et al., (1987; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7159-7163), ocorre em cerca de 30 % dos cancros de mama, e nestes pacientes, a sobrevivência isenta de recidiva e a sobrevivência geral são diminuídas (Slamon et al., (1989) Science, 244 :707-712; Slamon et al., (1987) Science, 235:177-182) .
Inversamente, um cancro que "não seja caracterizado por sobre-expressão do recetor ErbB2" é aquele que, numa análise de diagnóstico, não expressa níveis mais elevados 57 ΕΡ1725249Β1 que o normal de recetor ErbB2 se comparado a uma célula nao cancerígena do mesmo tipo de tecido. 0 termo "agente citotóxico" conforme usado no presente documento se refere a uma substância que inibe ou impede a função de células e/ou causa destruição de células. 0 termo objetiva incluir isótopos radioativos (por exemplo, 211At, 1311, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo análogos sintéticos e derivados dos mesmos. Num aspeto, o termo não se destina a incluir isótopos radioativos.
Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes de alquilação tais como tiotepa e CYTOXAN® ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tais como bussulfam, improssulfam e pipossulfam; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona) ; delta- 9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicina; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, e 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (especificamente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os 58 ΕΡ1725249Β1 análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostarda nitrogenada tal como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalana, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uracil mostarda; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimustina; bisfosfonatos, tal como clodronato; antibióticos tais como o antibiótico enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 11 e caliqueamicina ómega 11) (veja-se, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)) e antraciclinas tais como anamicina, AD 32, alcarrubicina, daunorrubicina, dexrazoxane, DX-52-1, epirrubicina, GPX-100, idarrubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluindo dinemicina A, uma esperamicina, cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediina de cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, ADRIAMYCIN® doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, doxorrubicina lipossomal, e desoxidoxorrubicina) , esorrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, e zorrubicina; análogos de ácido fólico tais como denopterina, pteropterina, e trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, e tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, β-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, e floxuridina; 59 ΕΡ1725249Β1 androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, e testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, e trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido folinico (leucovorina) ; aceglatona; agentes antifolato antineoplásticos tais como ALIMTA®, LY231514 pemetrexed, inibidores de redutase de diidrofolato tais como metotrexato, antimetabolitos tais como 5- fluorouracil (5-FU) e seus pró-fármacos tais como UFT, S-l e capecitabina, e inibidores de sintase de timidilato e inibidores de formiltransferase de glicinamida ribonucleótido tais como raltitrexed (TOMUDEX™, TDX); inibidores de desidrogenase de diidropirimidina tais como eniluracil; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulinico, amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maytansinoids tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK® complexo de polissacárido (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina a, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol, mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosideo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides e taxanos, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)/ ABRAXANE™ Cremophor-free, formulação de nanoparticula de albumina engenheirada de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , e TAXOTERE® doxetaxel (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucil; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; 60 ΕΡ1725249Β1 mercaptopurina; platina; análogos de platina ou análogos a base de platina tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vimblastina (VELBAN®), etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona, vincristina (ONCONVIN®); alcaloide vinca; vinorrelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato, daunomicina; aminopterina; xeloda, ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima tal como CHOP, uma abreviação para uma terapêutica combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada com 5-FU e leucovorina,
Também incluídos nesta definição estão agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormona em tumores tais como antiestrogénios e moduladores de recetor seletivo a estrogénio, incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX® tamoxifeno) , raloxifena, droloxifena, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON® toremifena; inibidores de aromatase que inibem aromatase de enzima, que regula a produção de estrogénio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® acetato de megestrol, AROMASIN® exemestano, formestano, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, e ARIMIDEX® anastrozol; e antiandrogénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserrelina; assim como troxacitabina, um análogo de 1,3-dioxolano nucleosideo citosina); oligonucleótidos antissense, especificamente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular aberrante, tal como, por exemplo, alfa PKC, Raf, H-Ras, e recetor de 61 ΕΡ1725249Β1 fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como vacinas de terapêutica de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
Conforme usado no presente documento, o termo "fármaco direcionado a EGFR" refere-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Exemplos destes agentes incluem anticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 57 9 (ATCC CRL HB 8506) , MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (veja-se Patente US N° 4943533, Mendelsohn et al.) e variantes dos mesmos, tais como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBITUX® e 225 reformatado humano (H225) (veja-se, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.) ; anticorpos que se ligam a EGFR mutante tipo II (Patente US N° 5.212.290); anticorpos humanizados e quiméricos que se ligam a EGFR conforme descrito na Patente US N° 5891996; e anticorpos humanos que se ligam a EGFR, tal como ABX-EGF (veja-se documento WO 98/50433, Abgenix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, dessa maneira gerando um imuno-conjugado (veja-se, por exemplo, documento EP 659.439A2, Merck Patent GmbH) . Exemplos de moléculas pequenas que se ligam a EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca); Erlotinib HC1 (CP-358774, TARCEVA™; Genentech/OSI) e AGI47 8, AG1571 (SU 5271; Sugen) .
Um "inibidor de tirosina-cinase" é uma molécula que inibe em alguma extensão a atividade de uma tirosina-cinase tal como um recetor ErbB. Exemplos destes inibidores incluem os fármacos direcionados para EGFR observados no 62 ΕΡ1725249Β1 parágrafo anterior, assim como quinazolinas tais como PD 153035,4 (3-cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706, e pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas contendo porções de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas antissense (por exemplo, aquelas que se ligam a ácido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (Patente US N° 5.804.396); trifostinas (Patente US N° 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK- 787 (Novartis/Schering AG); inibidores pan-ErbB tais como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); Imatinib mesilato (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis) ; GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em qualquer uma das publicações de patentes a seguir: Patente US N° 5804396; documento WO 99/09016 (American Cyanamid); documento WO 98/43960 (American Cyanamid); documento WO 97/38983 (Warner Lambert); documento WO 99/06378 (Warner Lambert); documento WO 99/06396 (Warner Lambert); documento WO 96/30347 (Pfizer, Inc.); documento WO 96/33978 (Zeneca); documento WO 96/3397 (Zeneca); e documento WO 96/33980 (Zeneca).
Um "agente antiangiogénico" refere-se a um composto que bloqueia, ou interfere em algum grau, com o desenvolvimento de vasos sanguíneos. O fator antiangiogénico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um fator de crescimento ou recetor de fator de crescimento envolvido na promoção de angiogénese. Numa forma de realização, o fator antiangiogénico é um anticorpo que se liga a Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). 63 ΕΡ1725249Β1 0 termo "citocina" é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população de célula que agem numa outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos destas citocinas são linfocinas, monocinas, e hormonas de polipéptido tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão hormona de crescimento tal como hormona de crescimento humano, hormona de crescimento humano N-metionilo, e hormona de crescimento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina, prorrelaxina; hormonas de glicoproteína tais como hormona estimulante de folículo (FSH), hormona estimulante da tiroide (TSH), e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogénio placentário; fator a e β de necrose de tumor; substância inibidora de mulleriano; péptido associado com gonadotropina de ratinho; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento neural tais como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento tipo insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferões tais como interferão-α, -β, e -γ; fatores de estimulação de colónia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM- CSF); e granulócito -CSF (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose de tumor tal como TGF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipéptidos incluindo LIF e conjunto de ligandos (KL). Conforme usado no presente documento, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de culturas de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa. 64 ΕΡ1725249Β1 0 termo "pró-fármaco" conforme usado neste pedido refere-se a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica a células de tumor se comparada com o fármaco parental e é capaz de ser enzimaticamente ou hidroliticamente ativada ou convertida na forma parental mais ativa. Veja-se, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et ai., (ed.), páginas 247-267, Humana Press (1985) . Os pró-fármacos desta invenção incluem, mas não se limitam a pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptido, pró-fármacos modificados por D-aminoácido, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo β-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-fármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, pró-fármacos 5-fluorocitosina e outros 5-fluorouridinas que podem ser convertidos no fármaco livre mais citotóxico. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados numa forma de pró-fármaco para utilização nesta invenção incluem, mas não se limitam àqueles agentes quimioterápicos descritos acima.
Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioativos que é útil para aplicação de um fármaco (tal como incluindo os anticorpos anti-CD30, CD40, CD70 ou Lewis Y e, opcionalmente, um agente quimioterápico) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comummente arranjados numa formação de bicamada, similar ao arranjo de lípido de membranas biológicas. 0 termo "inserção de embalagem" é usado no presente documento para referir-se a instruções 65 ΕΡ1725249Β1 comummente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contraindicação e/ou avisos relacionados com a utilização destes produtos terapêuticos.
Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela está ordinariamente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é diferente na forma ou forma de realização na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distintas da molécula de ácido nucleico da maneira como existe nas células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que ordinariamente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está num local cromossómico diferente daquele nas células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro específico. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação de ribossoma. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.
Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando ele é colocado num relacionamento funcional com uma outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou líder secretor está operativamente ligado ao 66 ΕΡ1725249Β1 ADN para um polipéptido se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou intensificador é operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um local de ligação de ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. De forma geral, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguo e na fase de leitura. Entretanto, intensificadores não necessitam ser contíguos. A ligação pode ser obtida pela ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existirem, os adaptadores ou ligantes sintéticos de oligonucleótido podem ser usados de acordo com a prática convencional.
Conforme usado no presente documento, a expressão "célula", "linha de célula", e "cultura de célula" são usadas de forma intercambiável e todas estas designações incluem progenitura. Dessa maneira, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula objeto primária e culturas derivadas das mesmas sem consideração com o número de transferências. É também entendido que toda a progenitura não precisa ser precisamente idêntica em teor de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progénie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme explorado na célula originalmente transformada são incluídas. Onde existir a intenção de designações distintas, isto ficará claro em consequência do contexto.
Uma "doença autoimune" no presente documento é uma doença ou distúrbio resultante e direcionada contra os tecidos do próprio indivíduo ou um co-segregado ou manifestação das mesmas ou condição resultante das mesmas. 67 ΕΡ1725249Β1
Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não se limitam a artrite (artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, e espondilite ancilosante), psoríase, dermatite, incluindo dermatite atópica; urticária idiopática crónica, incluindo urticária autoimune crónica, polimiosite/dermatomiosite, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia e esclerose sistémicas, respostas associadas com doença inflamatória do intestino (IBD) (doença de Crohn, colite ulcerativa), e IBD com co-secregado de piodermatite gangrenosa, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, e/ou episclerite), sindrome da angústia respiratória, incluindo sindrome da angústia respiratória do adulto (ARDS), meningite, doenças mediadas por IgE tais como anafilaxia e rinite alérgica, encefalite tal como encefalite de Rasmussen, uveite, colite tal como colite microscópica e colite colagenosa, glomerulonefrite (GN) tal como GN membranosa, GN membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, e GN rapidamente progressiva, condições alérgicas, eczema, asma, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas, aterosclerose, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus eritematoso sistémico (SLE) tal como SLE cutâneo, lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrica, não renal, discoide, alopecia), diabete de início na juventude, esclerose múltipla (MS) tal como MS espino-ótica, encefalomielite alérgica, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite dos Vasos Grandes (incluindo Polimialgia Reumática e Arterite de Célula Gigante (Takayasu)), vasculite dos Vasos Médios (incluindo Doença de Kawasaki e Poliarterite Nodosa), vasculite do CNS, e vasculite associada com ANCA, tal como 68 ΕΡ1725249Β1 vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS)), anemia aplástica, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolitica imune incluindo anemia hemolitica autoimune (AIHA), anemia perniciosa, aplasia de hemácias puras (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócito, distúrbios inflamatórias do CNS, síndrome de ferimento de múltiplos órgãos, miastenia grave, doenças mediadas por complexo de antigénio-anticorpo, doença de membrana de base antiglomerular, síndrome de anticorpo de antifosfolípido, neurite alérgica, doença de Bechet, síndrome de Castleman, Síndrome de Goodpasture, Síndrome Miasténica de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rejeição de transplante de órgão sólido (incluindo pré-tratamento para titulações de anticorpo reativo de alto painel, depósito IgA nos tecidos, e rejeição decorrente de transplante renal, transplante de fígado, transplante de intestino, transplante cardiaco, etc.), doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), penfigoide bolhosa, pênfigo (incluindo vulgar, foliáceo, e penfigoide da membrana mucosa do pênfigo, poliendocrinopatias autoimunes, doença de Reiter, síndrome do homem rígido, nefrite de complexo imune, polineuropatias de IgM ou neuropatia mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia (conforme desenvolvida por pacientes de enfarto do miocárdio, por exemplo), incluindo trombocitopenia autoimune, doença autoimune do testículo e ovário, incluindo orquite e ooforite autoimunes, hipotireoidismo primário; doenças endócrinas autoimunes incluindo tireoidite autoimune, tireoidite crónica (Tireoidite de Hashimoto), tireoidite sub-aguda, hipotireoidismo idiopático, doença de Addison, doença de Grave, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndrome da 69 ΕΡ1725249Β1 endocrinopatia poliglandular), diabete Tipo I também referida como diabete melito dependente de insulina (IDDM), incluindo IDDM pediátrica, e sindrome de Sheehan; hepatite autoimune, pneumonite intersticial Linfoide (VIH), bronquiolite obliterante (não transplante) vs NSIP, sindrome de Guillain- Barré, doença de Berger (nefropatia de igA), cirrose biliar primária, espru celíaca (enteropatia de glúten), espru refratário com dermatite herpetiforme co-segregada, crioglobulinemia, esclerose amilotrófica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), doença da artéria coronária, doença autoimune do ouvido interno (AIED), perda auditiva autoimune; sindrome de opsoclonus-mioclonus (OMS); policondrite tal como policondrite refratária, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, hepatite de célula gigante, esclerite, gamopatia monoclonal de significância incerta/desconhecida (MGUS) , neuropatia periférica, sindrome paraneoplástica, doenças de canal tais como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e doenças de canal do CNS; autismo, miopatia inflamatória, e glomerulosclerose focal segmentar (FSGS). "Alquilo" é hidrocarboneto Ci-Ci8 contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos. Exemplos são metilo (Me, -CH3) , etilo (Et, -CH2CH3) , 1- propil (n-Pr, n-propil, -CH2-CH2-CH3) , 2-propil (i-Pr, i-propil, -CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3) , 2-metil-l-propil (i- Bu, i-butil, - CH2CH (CH3) 2) , 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH (CH3) CH2CH3) , 2-metil-2- propil (t-Bu, t-butil, -C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2- pentil (-CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentil (-CH (CH2CH3) 2) , 2-metil-2-butil (- C (CH3) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butil (- CH (CH3) CH (CH3) 2) , 3-metil-l-butil (-CH2 CH2CH (CH3) 2) , 2- metϋ-1-butil (_CH2CH (CH3) CH2CH3) , 1-hexil (-CH2 CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-hexil (-CH (CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3-hexil (- 70 ΕΡ1725249Β1 CH (CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-metil-2-pentil (-C (CH3) 2CH2CH2CH3) , 3-metil-2- pentil (-CH (CH3) CH (CH3) CH2CH3) , 4-metil-2-pentil (-CH (CH3) CH2CH (CH3) 2) , 3- metil-3-pentil (-C (CH3) (CH2CH3) 2) , 2-metil-3-pentil (-CH (CH2CH3) CH (CH3) 2) , 2,3-dimetil-2-butil (-C (CH3) 2CH (CH3) 2) , 3,3-dimetil-2-butil (-CH (CH3) C (CH3) 3. "Alquenilo" é hidrocarboneto Ci-Ci8 contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, com pelo menos um local de insaturação, isto é, um carbono-carbono, ligação dupla sp2. Exemplos incluem, mas não se limitam a: etileno ou vinil (-CH=CH2) , alilo (-CH2CH=CH2) , ciclopentenil (-C5H7) , e 5-hexenil (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2) . "Alquinilo" é hidrocarboneto C2-Ci8 contendo átomos de carbono normais, secundários, terciários ou cíclicos, com pelo menos um local de insaturação, isto é, um carbono-carbono, ligação tripla sp. Exemplos incluem, mas não se limitam a: acetilénico (-CH^CH) e propargil (-CH2C=CH). "Alquileno" refere-se a um radical de hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico de 1-18 átomos de carbono, e que tem dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alcano parental. Radicais típicos de alquileno incluem, mas não se limitam a: metileno (-CH2-) , 1,2-etil (-CH2CH2-) , 1,3-propil (-CH2CH2CH2-) , 1,4-butil (- CH2CH2CH2CH2-) , e similares. "Alquenileno" se refere a um radical de hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e que tem dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes 71 ΕΡ1725249Β1 de um alqueno parental. Radicais típicos de alquenileno incluem, mas não se limitam a: 1,2- etileno (-CH=CH-). "Alquinileno" se refere a um radical de hidrocarboneto saturado, de cadeia ramificada ou linear ou cíclico de 2-18 átomos de carbono, e que tem dois centros de radical monovalente derivados pela remoção de dois átomos de hidrogénio dos mesmos ou dois átomos de carbono diferentes de um alcino parental. Radicais típicos de alquinileno incluem, mas não se limitam a: acetileno (-C^c-), propargil (-CH2C=C-) , e 4-pentinil (-CH2CH2CH2C=CH-) . "Arilo" significa um radical hidrocarboneto monovalente aromático de 6-20 átomos de carbono derivado pela remoção de um átomo de hidrogénio de um átomo de carbono único de um sistema de anel aromático parental. Alguns grupos arilo são representados nas estruturas exemplares como "Ar". Grupos arilo típicos incluem, mas não se limitam a radicais derivados de benzendo, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenilo, e similares. "Arilalquilo" refere-se a um radical alquilo acíclico no qual um dos átomos de hidrogénio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical arilo. Grupos arilalquilo típicos incluem, mas não se limitam a, benzilo, 2-feniletan-l-ilo, 2-fenileten-1- ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobenzilo, 2-naftofeniletan-l-ilo e similares. O grupo arilalquilo compreende 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo arilalquilo é 1 a 6 átomos de carbono e a fração arilo é de 5 a 14 átomos de carbono. O grupo arilalquilo compreende de 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou 72 ΕΡ1725249Β1 alquinilo, do grupo arilalquilo é de 1 a 6 átomos de carbono e a fração arilo é de 5 a 14 átomos de carbono. "Heteroarilalquilo" refere-se a um radical alquilo aciclica no qual um dos átomos de hidrogénio ligado a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroarilo. Grupos heteroarilalquilo típicos incluem, mas não se limitam a, 2-benzimidazolilmetilo, 2-furiletilo, e similares. 0 grupo heteroarilalquilo compreende de 6 a 20 átomos de carbono, por exemplo, a fração alquilo, incluindo grupos alcanilo, alquenilo ou alquinilo, do grupo heteroarilalquilo é de 1 a 6 átomos de carbono e a fração heteroarilo é de 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, 0, P, e S. A fração heteroarilo do grupo heteroarilalquilo pode ser um monociclo que tem de 3 a 7 membros do anel (2 a 6 átomos de carbono) ou um biciclo que tem de 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e de 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P, e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6] . "Alquilo substituído", "arilo substituído", e "arilalquilo substituído" significa alquilo, arilo, e arilalquilo, respetivamente, nas quais um ou mais átomos de hidrogénio são cada um, independentemente, substituídos por um substituinte. Substituintes típicos incluem, mas não se limitam a: -X, -R, -CT, - OR, -SR, -S“, -NR2, -NR3, =NR, - CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NCS, -NO, - N02, =N2, -N3, NC (=0) R, -C(=0)NR2, -S03, -S03H, -S (=0) 2R, -OS (=0) 20R, - S(=0)2NR, -S(=0)R, -0P(=0) (0R)2, -P (=0) (0R) 2, -P0~3, -po3h2, -C (=0) R, - C(=0)X, -C(=S)R, -C02R, -C02-, -C(=S)0R, - C (=0) SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, onde cada X é, independentemente um halogénio: F, Cl, Br, ou I; e cada R é, independentemente, -H, alquilo C2-Ci8, arilo Ce~ 73 ΕΡ1725249Β1 C2or heterociclo C3-C14, grupo protetor ou fração pró-fármaco. Grupos alquileno, alquenileno, e alquinileno conforme descritos acima podem também ser substituídos de maneira similar. "Heteroarilo" e "Heterociclo" se referem a um sistema de anel no qual um ou mais átomos do anel é um heteroátomo, por exemplo, nitrogénio, oxigénio, e enxofre. 0 radical heterociclo compreende de 1 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P, e S. Um heterociclo pode ser um monociclo que tem de 3 a 7 membros de anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P, e S) ou um biciclo que tem de 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de N, O, P, e S) , por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6] .
Heterociclos são descritos por Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, Nova York, 1968), especificamente Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, e 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nova York, 1950 até o presente), em especial os volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Exemplos de heterociclos incluem como exemplo e não como limitação, piridilo, diidropiridilo, tetraidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetraidrotiofenilo, tetraidrotiofenilo oxidada com enxofre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4- piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetraidrofuranilo, bis- 74 ΕΡ1725249Β1 tetraidrofuranilo, tetraidropiranilo, bis- tetraidropiranilo, tetraidroquinolinilo, tetraidroisoquinolinilo, decaidroquinolinilo, octaidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, lH-indazolilo, purinilo, 4H- quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, oxazolidinilo, oxindolilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, benzotriazolilo, benzissoxazolilo, benzoxazolinilo, e isatinoilo.
Como exemplo e não como limitação, heterociclos ligados a carbono são ligados na posição 2, 3, 4, 5, ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5, ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5, ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5, ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4, ou 5 de um furano, tetraidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetraidropirrol, posição 2, 4, ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4, ou 5 de um isoxazol, pirazol, ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3, ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por carbono incluem 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4- 75 ΕΡ1725249Β1 pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6- pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, ou 5-tiazolilo.
Como exemplo e não como limitação, heterociclos ligados por nitrogénio são ligados na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3- pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3- imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3- pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H- indazol, posição 2 de um isoindol, ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina, e posição 9 de um carbazol, ou β- carbolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados por nitrogénio incluem 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo, e 1-piperidinilo. "Carbociclo" significa um anel saturado ou insaturado que tem 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo. Carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos no anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos no anel. Carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos no anel, por exemplo, arranjados como um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos no anel arranjados como um sistema biciclo [5,6] ou [6,6]. Exemplos de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-l-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, cicloexilo, 1-cicloex-l-enilo, l-cicloex-2-enilo, l-cicloex-3-enilo, cicloeptilo, e ciclooctilo. "Ligante" "Unidade de Ligante", ou "ligação" significa uma fração química que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que covalentemente anexam um anticorpo a uma fração de fármaco. Em várias formas de realização, um ligante é especificado como LU, Ligantes incluem um radical 76 ΕΡ1725249Β1 bivalente tal como uma alquildiilo, uma arildiilo, uma heteroarildiilo, porções tais como: - (CR2) n0 (CR2) n-, unidades repetitivas de alquiloxi (por exemplo, polietilenoxi, PEG, "polimetilenoxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine™) ; e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato, e caproamida. 0 termo "quiral" refere-se a moléculas que têm a propriedade de não sobreposição do parceiro de imagem refletida, enquanto o termo "aquiral" refere-se a moléculas que são sobrepostas em seu parceiro de imagem refletida. 0 termo "estereoisómeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem com relação ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço. "Diasterómero" refere-se a um estereoisómero com dois ou mais centros de quiralidade e aquelas moléculas não são imagens refletidas uma da outra. Diasterómeros possuem propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espetrais, e reatividades. Misturas de diasterómeros podem ser separadas sob procedimentos analíticos de alta resolução, tais como eletroforese e cromatografia. "Enantiómeros" referem-se a dois estereoisómeros de um composto que não são imagens refletidas sobrepostas um do outro.
Definições e convenções de estereoquimica usadas no presente documento geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova York; e Eliel, E. e Wilen, s., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & 77 ΕΡ1725249Β1
Sons, Inc., Nova York. Muitos compostos orgânicos existem nas formas oticamente ativas, isto é, eles têm a capacidade para girar o plano de luz polarizada por plano. Na descrição de um composto oticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usados para denotar a forma de realização absoluta da molécula sobre seu(s) centro(s) guiral(is). Os prefixos d e 1 ou (+) e (-) são utilizados para designar o sinal de rotação de luz polarizada por plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levogiro. Um composto prefixado com ( + ) ou d é dextrogiro. Para uma estrutura química dada, estes estereoisómeros são idênticos, exceto pelo fato de que eles são imagens refletidas um do outro. Um estereoisómero específico pode também ser referido como um enantiómero, e uma mistura destes isómeros é frequentemente denominada de mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiómeros é referida como uma mistura racémica ou um racemato, que pode ocorrer onde não houver ocorrido estéreo seleção ou estéreo especificidade numa reação ou processo químico. Os termos "mistura racémica" e "racemato" referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, isentas de atividade ótica.
Exemplos de um "paciente" incluem, mas não se limitam a, um ser humano, rato, ratinho, cobaia, macaco, porco, vaca, cavalo, cão, gato, pássaro e aves. Numa forma de realização exemplar, o paciente é um ser humano. "Arilo" refere-se a um grupo carbocíclico aromático. Exemplos de grupos arilo incluem, mas não se limitam a fenilo, naftilo e antracenilo. Um grupo carbociclico aromático ou um grupo heterocíclico aromático pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos incluindo, mas não limitado a: alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , arilo, -C (0) R' , -0C(0)Rf, -C (0) 0Rf , - C(0)NH2, -C(0)NHR', - 78 ΕΡ1725249Β1 C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)Rf, -OH, - halogénio, —N3, -NH2, —NH (R' ) , —N (R' ) 2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-Cs, e arilo. 0 termo "alquilo Ci-Cs", conforme usado no presente documento, refere-se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada, saturado ou insaturado que tem de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos "alquilo Ci-C8" representativos incluem, mas não se limitam a -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n- heptilo, -n-octilo, -n-nonilo e -n-decilo; enquanto alquilos 02-08 ramificados incluem, mas não se limitam a -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butil, - isopentilo, 2-metilbutilo, alquilos Ci-C8 insaturadas incluem mas não se limitam a, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-l-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1 -butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, - 3-metil-l butinilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isoexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 2,2- dimetilpentilo, 2,3- dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 2.3.4- trimetilpentilo, 3-metilexilo, 2,2- dimetilexilo, 2.4- dimetilexilo, 2,5-dimetilexilo, 3,5-dimetilexilo, 2,4- dimetilpentilo, 2-metileptilo, 3-metileptilo, n-heptilo, isoeptilo, n-octilo, e isooctilo. Um grupo alquilo Ci-C8 pode ser não substituído ou substituído com um ou mais grupos incluindo, mas não limitado a -alquilo Ci-Cs, -0-(alquilo Ci—C8) , -arilo, -C(0)R', - 0C(0)R', -C(0)0R', C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2, -NHC(0)R', -S03R' - S(0)2R', -S(0)R', -OH, -halogénio, -N3, -NH2, -NH (R' ) , -N(R')2 e -CN; 79 ΕΡ1725249Β1 onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "carbociclo C3-C8" é um anel carbociclico saturado ou insaturado não aromático de 3-, 4-, 5-, 6-, 7- ou 8 membros. Carbociclos C3-C8 representativos incluem, mas não se limitam a -ciclopropilo, -ciclobutilo, ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -cicloexilo, -cicloexenilo, -1,3-cicloexadienilo, - 1,4-cicloexadienilo, cicloeptilo, -1,3-cicloeptadienilo, -1,3,5-cicloeptatrienilo, - ciclooctilo, e -ciclooctadienilo. Um grupo carbociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído por um ou mais grupos incluindo, mas não limitados a -alquilo Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , arilo, -C (0) R' , -0C(0)R', -C(0)0R', - C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S (0) R' , -OH, - halogénio, —N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "carbociclo C3-C8" refere-se a um grupo carbociclo C3—C8 definido acima onde um dos átomos de hidrogénio dos grupos carbociclos é substituído com uma ligação.
Um "alquileno Ci-Ci0" é um grupo hidrocarboneto de cadeia linear, saturado com a fórmula - (CH2) i-io_ · Exemplos de um alquileno Ci-Cio incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno e decaleno.
Um "arileno" é um grupo arilo que tem duas ligações covalentes e pode estar nas formas de realização orto, meta ou para, conforme mostrado nas estruturas a seguir: 80 ΕΡ1725249Β1
nas quais o grupo fenilo pode ser não substituído ou substituído com até quatro grupos incluindo, mas não limitado a -alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C (0) R ' , -0C (0) R ' , -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', C(0)N(R’)2, -NHC(0)R', - S(0)2R', -S(0)R' , -OH, -halogénio, —N3, —NH2, -NH (R1 ) , -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "heterociclo C3-C8 " refere-se a um carbociclo C3-C8 aromático ou não aromático no qual de um a quatro dos átomos de carbono do anel são independentemente substituídos com um heteroátomo do grupo consistindo de 0, S e N. Exemplos representativos de um heterociclo C3-C8 incluem, mas não se limitam a benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, e tetrazolilo. Um heterociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído com até sete grupos incluindo, mas não limitados a - alquilo Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(0)0R', C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', S (0) R' , -OH, - halogénio, -N3, -NH2, -NH (R') , -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alquilo Ci-C8, e arilo.
Um "heterociclo C3-C8" refere-se a um grupo heterociclo C3-C8 definido acima, onde um dos átomos de hidrogénio do grupo heterociclo é substituído por uma 81 ΕΡ1725249Β1 ligação. Um heterociclo C3-C8 pode ser não substituído ou substituído por até seis grupos incluindo, mas não limitados a -alguilo Ci-C8, - 0-(alguilo Ci-C8) , -arilo, -C (0) R' , -0C (0) R' , -C (0) OR' , -C(0)NH2, -C(0)NHR', C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -oh, -halogénio, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 e -CN; onde cada R' é independentemente selecionado a partir de H, alguilo Ci-C8, e arilo.
Um "Composto Exemplar" é um Composto de Fármaco ou um Composto de Fármaco-Ligante.
Um "Conjugado Exemplar" é um Conjugado de Fármaco-Ligando gue tem uma unidade de Fármaco clivável do Conjugado de Fármaco-Ligando ou um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando.
Em algumas formas de realização os Compostos
Exemplares e Conjugados Exemplares estão na forma isolada ou purificada. Conforme usado no presente documento, "isolado" significa separado de outros componentes de (a) uma fonte natural, tal como uma célula vegetal ou animal ou cultura de célula, ou (b) uma mistura de reação guímica orgânica sintética. Conforme usado no presente documento "purificado" significa gue, guando isolado, o isolado contém pelo menos 95 %, e num outro aspeto pelo menos 98 %, de Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar em peso do isolado.
Exemplos de um "grupo de proteção de hidroxilo" incluem, mas não se limitam a metoximetil éter, 2-metoxietoximetil éter, tetraidropiranil éter, benzil éter, p-metoxibenzil éter, trimetilsilil éter, trietilsilil éter, triisopropil silil éter, t-butildimetil silil éter, trifenilmetil silil éter, éster de acetato, ésteres de 82 ΕΡ1725249Β1 acetato substituídos, pivaloato, benzoato, metano sulfonato e p-tolueno sulfonato. "Grupo abandonante" refere-se a um grupo funcional que pode ser substituído por um outro grupo funcional. Estes grupos de partida são bem conhecidos na técnica, e exemplos incluem, mas não se limitam a haleto (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto), metano sulfonilo (mesilo), p-tolueno sulfonilo (tosilo), trifluorometil sulfonilo (triflato), e trifluorometil sulfonato. A frase "sal farmaceuticamente aceitável", conforme usada no presente documento, refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar. Os Compostos Exemplares e Conjugados Exemplares contêm pelo menos um grupo amino, e consequentemente sais de adição ácidos podem ser formados com este grupo amino. Sais exemplares incluem, mas não se limitam a sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metano sulfonato, etano sulfonato, benzeno sulfonato, p-tolueno sulfonato, e pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de uma outra molécula tal como um ião de acetato, um ião de succinato ou outros contra-iões. 0 contra-ião pode ser qualquer fração orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga do composto parental. Além do mais, um sal f armaceut icamente aceitável pode ter mais que um átomo carregado em sua estrutura. Casos onde átomos de carga múltipla são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem 83 ΕΡ1725249Β1 ter contra-iões múltiplos. Assim, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-iões. "Solvato farmaceuticamente aceitável" ou "solvato" refere-se a uma associação de uma ou mais moléculas de solvente e um composto da invenção, por exemplo, um Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar. Exemplos de solvente que formam solvatos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, e etanolamina.
As abreviações a seguir são usadas no presente documento e possuem as definições indicadas: AE é auristatina E, Boc é N-(t-butoxicarbonil), cit é citrulina, dap é dolaproina, DCC é 1,3-dicicloexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é diisopropilazodicarboxilato, DIEA é N,N-diisopropiletilamina, dil é dolaisoleuina (SIC), DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é éter dimetilico de etilenoglicol (ou 1,2-dimetoxietano) , DMF é N,N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfóxido, doe é dolafenina, dov é N,N-dimet ilvalina, DTNB é 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), DTPA é ácido dietilenotriaminapentaacético, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etoxi-l-etoxicarbonil-l,2-diidroquinolina, ES-MS é espetrometria de massa de eletropulverização, EtOAc é acetato de etilo, Fmoc é N- (9-fluorenilmetoxicarbonil), gly é glicina, HATU é 0-(7-azabenzotriazol-l- il)-N,N,N',N'~ tetrametilurónio hexafluorofosfato, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia liquida de alta pressão, ile é isoleucina, lys é lisina, MeCN (CH3CN) é 84 ΕΡ1725249Β1 acetonitrilo, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetilo (ou 4-metoxitritilo), nor é (IS, 2R)-(+)-norefedrina, PAB é p-aminobenzilo, PBS é fosfato-solução salina tamponada (pH 7,4), PEG é polietileno glicol, Ph é fenilo, Pnp é p-nitrofenilo, MC é 6-maleimidocaproilo, phe é L-fenilalanina, PyBrop é bromo tris-pirrolidino fosfónio hexafluorofosfato, SEC é cromatografia de exclusão de tamanho, Su é succinimida, TBTU é O-benzotriazol-l-il-Ν,Ν,Ν,Ν- tetrametilurónio tetrafluoroborato, TFA é ácido trifluoroacético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta, e vai é valina.
As abreviações de ligante a seguir são usadas no presente documento e têm as definições indicadas: Vai Cit é valina-citrulina, local do dipéptido no ligante clivável por protease; PAB é p-aminobenzilcarbamoilo; (Me)vc é N-metil-valina citrulina, onde a ligação de péptido do ligante foi modificada para impedir sua clivagem por catepsina B; MC(PEG)6-OH é maleimidocaproil- polietileno glicol; SPP é N-succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato; e SMCC é N-succinimidil 4-(N- maleimidometil) cicloexano-1 carboxilato.
Os termos "tratar" ou "tratamento", a não ser que indicado o contrário pelo contexto, referem-se a tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas, onde o objetivo é impedir ou tornar mais lento (diminuir) uma alteração fisiológica ou distúrbio indesejada, tal como o desenvolvimento ou disseminação de cancro. Para objetivos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a alivio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não agravamento) da doença, retardamento ou diminuição de progressão da doença, melhora ou mitigação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), quer detetável 85 ΕΡ1725249Β1 ou indetetável. "Tratamento" pode também significar prolongamento da sobrevivência se comparado com a sobrevivência esperada se não estivesse recebendo tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já apresentam a condição ou distúrbio, assim como aqueles propensos a desenvolver a condição ou distúrbio ou aqueles nos quais a condição ou distúrbio deve ser prevenida.
No contexto de cancro, o termo "tratamento" inclui qualquer ou todos dentre: impedir o crescimento de células de tumor, células cancerígenas, ou de um tumor; impedir a replicação de células de tumor ou células cancerígenas, diminuir a carga geral do tumor ou diminuir o número de células cancerígenas, e melhorar um ou mais sintomas associados com a doença.
No contexto de uma doença autoimune, o termo "tratamento" inclui qualquer um ou todos dentre: impedir a replicação de células associadas com um estado de doença autoimune incluindo, mas não limitado a células que produzem um anticorpo autoimune, diminuição da carga de anticorpo autoimune e melhoria de um ou mais sintomas de uma doença autoimune.
No contexto de uma doença infeciosa, o termo "tratamento" inclui qualquer um ou todos dentre: impedir o crescimento, multiplicação ou replicação do patógeno que causa a doença infeciosa e melhorar um ou mais sintomas de uma doença infeciosa.
As abreviações a seguir do fármaco citotóxico são usadas no presente documento e têm as definições indicadas: MMAE é monometil auristatina E (MW 718) ; MMAF é N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina 86 ΕΡ1725249Β1
(MW 731,5); MMAF-DMEA é MMAF com DMAEA (dimetilaminoetilamina) numa ligação de amida à fenilalanina do terminal C (MW 801,5); MMAF-TEG é MMAF com tetraetileno glicol esterificado à fenilalanina; MMAF-NtBu é N-t-butilo, unido como uma amida ao terminal C de MMAF; AEVB é auristatina E valeril benzilidrazona, ligante de ácido instável através do terminal C de AE (MW 732) ; e AFP é Monoamida de p-fenileno diamina com Fenilalanina de terminal C de Auristatina F (MW 732).
4.2 OS COMPOSTOS DA INVENÇÃO 4.2.1 OS COMPOSTOS DE FÓRMULA (Ia)
Num aspeto, a invenção proporciona Conjugados de Fármaco-Ligante-Liqando que tem a Fórmula Ia:
Ia ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que, L- é uma unidade de Ligando; -Aa-Ww-Yy- é uma unidade de Ligante (LU) , em que a unidade de Ligante inclui: -A- é uma unidade de Estirador, a é 0 ou 1, cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, -Y- é uma unidade de Espaçador, e y é 0, 1 ou 2; p varia de 1 a cerca de 20; e -D é uma unidade de Fármaco que tem a fórmula DF: 87 ΕΡ1725249Β1 ΕΡ1725249Β1
R10 Df como definido na reivindicação 2.
Em outra forma de realização, a presente invenção proporciona Compostos de Fármaco que têm a fórmula Ib:
Ib ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos dos mesmos, como definido na reivindicação 1.
Em ainda outra forma de realização, a invenção proporciona Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando que têm a fórmula Ia':
Ab (-Aa—Ww—Yy—d)p Fórmula Ia' ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos dos mesmos, como definido na reivindicação 4.
Ab é qualquer anticorpo covalentemente unido a uma ou mais unidades de fármaco. Ab inclui um anticorpo que se liga a CD30, CD40, CD70, antigénio Lewis Y. Numa outra forma de realização, Ab não inclui um anticorpo que se liga a um recetor ErbB ou a um ou mais dos recetores (D - (35) : 88 ΕΡ1725249Β1 (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203); (2) E16 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 034 8 6) ; (3) STEAP1 (seis antigénios transmembrana epitelial da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUCi6, N° de acesso do Genbank AF 3 614 8 6); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_0 05 82 3) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio) , membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_006424) (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de tromboespondina (tipo 1 e similar ao tipo 1) , domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N° de acesso do Genbank AB040878); (8) PS CA hlg (gene de 2700050Ci2Rik, C530008016Rik, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, ADNc de RIKEN 2700050C12, N° de acesso do Genbank AY358628); (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, N° de acesso do Genbank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138); 89 ΕΡ1725249Β1 (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamília M, membro 4, N° de acesso do Genbank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de virus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); (15) CD79b (IGb (beta imunoglobulina-associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626); (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la), SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); (17) HER2 (N° de acesso do Genbank M11730); (18) NCA (N° de acesso do Genbank M18728); (19) MDP (N° de acesso do Genbank BC0i7023) ; (20) IL20Ra (N° de acesso do Genbank AF184971); (21) Brevican (N° de acesso do Genbank AF229053); (22) Ephb2R (N° de acesso do Genbank NM_004442); (23) ASLG659 (N° de acesso do Genbank AX092328); (24) PSCA (N° de acesso do Genbank AJ297436); (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); (26) BAFF-R (N° de acesso do Genbank NP_443177.1); (27) CD22 (N° de acesso do Genbank NP_001762.1); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina-associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com Ig beta (CD7 9B) e forma um complexo na superfície com molécula de Ig M, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de célula B, N° de acesso do Genbank NP_001774.1); (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no 90 ΕΡ1725249Β1 desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia, N° de acesso do Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio la) que se liga a péptidos e os apresenta aos línfócitos ÇD4+ T, N° de acesso do Genbank NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de ião de ligando fechado P2X de
recetor purinérgico, um ião de canal fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático, N° de acesso do Genbank NP_002552.2);
(32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2, N° de acesso do Genbank NP_001773.1); (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico, N° de acesso do Genbank NP_005573.1); (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo similar a Ig e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B, N° de acesso do Genbank NP_4 4317 0.1); ou (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamília imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B, N° de acesso do Genbank NP_112571.1).
Numa forma de realização, -Ww- é —Val-Cit-
Numa outra forma de realização, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Numa 91 ΕΡ1725249Β1 forma de realização exemplar, R3 e R4 são cada um isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo. Em ainda uma outra forma de realização R2 e R6 são cada um metilo, e R9 é -H.
Em ainda outra forma de realização, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Numa forma de realização exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Numa forma de realização, R10 é arilo.
Numa forma de realização exemplar, R10 é -fenilo.
Num aspeto, Ab é cAClO, cBR96, cS2C6, clF6, c2F2, hAClO, hBR96, hS2C6, hlF6, e h2F2.
Exemplos de conjugados de fármaco-anticorpo revelados no presente documento incluem aqueles que têm as seguintes estruturas:
A
92 ΕΡ1725249Β1 ΕΡ1725249Β1 mAr-S b
P
L-MC-MMAF em que L é um anticorpo, Vai é valina, e Cit é citrulina. A carga do fármaco é representada por p, o número médio de moléculas de fármaco por anticorpo numa molécula (por exemplo, de Fórmula Ia, Ia' e Ic). A carga do fármaco pode variar de 1 a 20 fármacos (D) por Ligando (por exemplo Ab ou mAb). Composições de Fórmula Ia e Fórmula Ia' incluem coleções de anticorpos conjugados com uma variedade de fármacos, de 1 a 20. O número médio de fármacos por anticorpo na preparação de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espetroscopia de massa, análise ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de Conjugados de Ligando-Fármaco em termos de p pode também ser determinada. Em alguns casos, separação, purificação, e caracterização de conjugados de Ligando-Fármaco homogéneos onde p é certo valor de Conjugados de Ligando-Fármaco com outras cargas de fármaco podem ser atingidas por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese. 4.2.2 OS COMPOSTOS DE FÁRMACO DE FÓRMULA (Ib)
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona Compostos de Fármaco que têm a Fórmula (Ib): H
Ib 93 ΕΡ1725249Β1 ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, como definido na reivindicação 1.
Numa forma de realização, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Numa forma de realização exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo.
Em outra forma de realização, R2 e R6 são, cada um, metilo, e R9 é -H.
Em ainda outra forma de realização, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Numa forma de realização exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Numa forma de realização, R10 é arilo
Numa forma de realização exemplar, R10 é -fenilo.
Compostos ilustrativos revelados no presente documento, cada um dos quais pode ser usado como frações de fármaco (D) em ADC, incluem compostos que têm as seguintes estruturas:
94 ΕΡ1725249Β1
ΕΡ1725249Β1
e sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos dos mesmos. OS COMPOSTOS DE FÓRMULA (Ic)
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona compostos de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) que têm a Fórmula Ic:
Ab-fAa~Ww—Yy—D)p ^ que compreende um anticorpo covalentemente unido a uma ou mais unidades de fármaco (frações) . Os compostos de conjugado de anticorpo-fármaco incluem sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. 96 ΕΡ1725249Β1
Os compostos de Fórmula Ic sao definidos em que:
Ab é um anticorpo que se liga a um ou mais recetores de antigénios associados com tumor (1) - (35): (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203) ; (2) E16 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 034 8 6) ; (3) STEAP1 (seis antigénios transmembrana epitelial da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449); (4) 0772P (CA125, MUCi6, N° de acesso do Genbank AF 3614 8 6); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potencialização de megacariócito, mesotelina, N° de acesso do Genbank NM_0 0 5 82 3); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veiculo de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, portador de fosfato dependente de sódio do tipo II 3b, N° de acesso do Genbank NM_006424) (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de tromboespondina (tipo 1 e similar ao tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, N° de acesso do Genbank AB040878); (8) PS CA hlg (gene de 2700050C12Rik, C530 0 0 8 016Rik, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, N° de acesso do Genbank AY358628); (9) ETBR (recetor endotelina tipo B, N° de acesso do Genbank AY275463); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, N° de acesso do Genbank NM_017763); (11) STEAP2 (HGNC_8 63 9, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis 97 ΕΡ1725249Β1 proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamília M, membro 4, N° de acesso do Genbank NM_017636); (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212); (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de vírus Cad/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); (15) CD79b (IGb (beta imunoglobulina-associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626); (16) FcRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la), SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); (17) HER2 (N° de acesso do GenbankM11730); (18) NCA (N° de acesso do Genbank M18728); (19) MDP (N° de acesso do Genbank BC0i7023) ; (20) IL2ORa (N° de acesso do Genbank AF184971); (21) Brevican (N° de acesso do Genbank AF229053); (22) Ephb2R (N° de acesso do Genbank NM_004442); (23) ASLG659 (N° de acesso do Genbank AX092328); (24) PSCA (N° de acesso do Genbank AJ297436); (25) GEDA (N° de acesso do Genbank AY260763); (26) BAFF-R. (N° de acesso do Genbank NP_443177.1); (27) CD22 (N° de acesso do Genbank NP_001762.1); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina- associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com Ig beta (CD7 9B) e forma um complexo na superfície com molécula de Ig M, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de célula B, N° de acesso do Genbank NP_001774.1); (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina 98 ΕΡ1725249Β1 CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia, N° de acesso do Genbank NP_001707.1); (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio la) que se liga a péptidos e os apresenta aos linfócitos CD4+ T, N° de acesso do Genbank NP_002111.1); (31) P2X5 (canal de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um ião de canal fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático, N° de acesso do Genbank NP_002552.2) ; (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2, N° de acesso do Genbank NP_001773.1); (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico, N° de acesso do Genbank NP_005573.1) ; (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo similar a Ig e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B, N° de acesso do Genbank NP_4 4 317 0.1); ou (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamília imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B, N° de acesso do Genbank NP_112571.1). A é uma unidade de Estirador, a é 0 ou 1, 99 ΕΡ1725249Β1 cada W é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, Y é uma unidade de Espaçador, e y é 0, 1 ou 2, p varia de 1 a cerca de 8, e D é uma fração de Fármaco que tem a Fórmula DF:
.R11
Dp em que a linha ondulada de DE e DF indica o local de união covalente a A, W, ou Y.
Numa forma de realização -Ww- é -Val-Cit-.
Em outra forma de realização, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Numa forma de realização exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R5 é -H, e R7 é sec-butilo.
Em ainda outra forma de realizaçao, R2 e R6 sao, cada um, metilo, e R9 é -H.
Em ainda outra forma de realização, cada ocorrência de R8 é -OCH3.
Numa forma de realização exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H.
Numa forma de realização, R10 é arilo.
Numa forma de realização exemplar, R10 é -fenilo. 100 ΕΡ1725249Β1 Conjugados de anticorpo-fármaco ilustrativos descritos no presente documento incluem:
Ab-MC-MMAF em que Ab é um anticorpo que se liga a um ou mais recetores de antigénio associado a tumor (1) - (35); Vai é valina; e Cit é citrulina. A carga de fármaco é representada por p, o número médio de fármacos por anticorpo numa molécula de Fórmula I. A carga de fármaco varia de 1 a 20 fármacos (D) por anticorpo (Ab ou mAb) . Composições de ADC de Fórmula I incluem coleções de anticorpos conjugados com uma variedade de fármacos, de 1 a 20. O número médio de fármacos por anticorpo nas preparações de ADC de reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais tais como espetroscopia visivel/UV, espetrometria de massa, análise ELISA, e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p pode também ser determinada. Em alguns casos, 101 ΕΡ1725249Β1 separação, purificação, e caracterização de ADC homogéneo onde p é certo valor de ADC com outras cargas de fármaco, podem ser atingidas por meios tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese.
Para alguns conjugados de anticorpo-fármaco, p pode estar limitado pelo número de locais de anexação no anticorpo. Por exemplo, onde a anexação é uma cisteina tiol, como nas formas de realização exemplares acima, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos cisteina tiol, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligante pode ser unido.
Tipicamente, menos que o valor teórico máximo de frações de fármaco são conjugados a um anticorpo durante a reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de fármaco-ligante ou reagente de ligante. Apenas os grupos de lisina mais reativos podem reagir com um reagente de ligante reativo por amina. Geralmente, anticorpos não contêm muitos, se é que contêm algum, grupos cisteina tiol livres e reativos que podem ser ligados a uma fração de fármaco. A maioria dos resíduos de cisteina tiol nos anticorpos dos compostos da invenção existe como pontes de bissulfeto e deve ser reduzida com um agente de redução tal como ditiotreitol (DTT). Adicionalmente, o anticorpo deve ser submetido a condições de desnaturação para revelar os grupos nucleofílicos reativos tais como lisina ou cisteina. A carga (proporção fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de várias maneiras diferentes, incluindo: (i) limitação do excesso molar de intermediário de fármaco-ligante ou reagente de ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação 102 ΕΡ1725249Β1 de conjugação, e (iii) condiçoes redutivas parciais ou limitativos para modificação de cisteina tiol.
Deve ser entendido que onde mais de um grupo nucleofilico reage com um intermediário de fármaco-ligante, ou reagente de ligante seguido por reagente da fração de fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos ADC com uma distribuição de uma ou mais frações de fármaco unidas a um anticorpo. 0 número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por análise dupla de anticorpo ELISA, especifica para anticorpo e especifica para o fármaco. Moléculas de ADC individuais podem ser identificadas na mistura através de espetroscopia de massa, e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica ("Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate",
Hamblett, K.J., et ai., Resumo N° 624, American Association for Câncer Research; 2004 Annual Meeting, 27-31 de Março de 2004; Proceedings of the AACR, Volume 45, Março de 2004; "Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S.C., et al., Resumo N2 627,
American Association for Câncer Research; 2004 Annual Meeting, 27-31 de Março de 2004; Proceeding of the AACR, Volume 45, Março de 2004) . Assim, um ADC homogéneo com um valor de carga único pode ser isolado da mistura de conjugação por eletroforese ou cromatografia.
4.3 A UNIDADE DE LIGANTE
Uma ''unidade de Ligante" (LU) é um composto bifuncional que pode ser usado para unir uma unidade de Fármaco e uma unidade de Ligando para formar Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando, ou que é útil na formação de imunoconjugados direcionados contra antigénios associados 103 ΕΡ1725249Β1 com tumor. Estes imunoconjugados permitem a aplicação seletiva de fármacos tóxicos a células de tumor. Numa forma de realização, a unidade de Ligante do Composto de Fármaco-Ligante e Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a fórmula: -Aa-Ww-Yy- em que: -A- é uma unidade de Estirador; a é 0 ou 1; cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido; w é independentemente um número inteiro que varia de 0 a 12; -Y- é uma unidade de Espaçador; e y é 0, 1 ou 2.
No Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando, o Ligante é capaz de unir a fração de Fármaco e a unidade de Ligando.
4.3.1 A UNIDADE DE ESTIRADOR A unidade de Estirador (-A-), quando estiver presente, é capaz de unir uma unidade de Ligando a uma unidade de aminoácido (-W-). Com relação a isto, um Ligando (L) possui um grupo funcional que pode formar uma ligação com um grupo funcional de uma unidade de Estirador. Grupos funcionais úteis que podem estar presentes num ligando, tanto por ocorrência natural quanto via manipulação química, incluem, mas não se limitam a sulfidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, o grupo hidroxilo anomérico de um hidrato de carbono, e carboxilo. Num aspeto, os grupos funcionais de Ligando são sulfidrilo e amino. Grupos sulfidrilo podem ser gerados pela redução de uma ligação de bissulfeto intramolecular de um Ligando. Alternativamente, grupos sulfidrilo podem ser gerados pela reação de um grupo amino 104 ΕΡ1725249Β1 de uma fração lisina de um Ligando, usando 2- iminotiolano (reagente de Traut) ou um outro reagente gerador de sulfidrilo.
Numa forma de realização, a unidade de Estirador forma uma ligação com um átomo de enxofre da unidade de Ligando. 0 átomo de enxofre pode ser derivado de um grupo sulfidrilo de um Ligando. Unidades de Estirador representativas desta forma de realização são ilustradas dentro dos colchetes das Fórmulas Illa e Illb, onde L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima, e R17 é selecionado a partir de alquileno -C1-C10, carbociclo -C3-C8-, -0- (alquilo Ci-Cg) - , -arileno-, alquileno-arileno -Ci-Ci0-, -arileno-Ci-Cio alquileno-, alquileno -Ci-Ci0- (carbociclo C3-C8) -, (carbociclo C3-C8) -alquileno C1-C10-, heterociclo -C3- C8-, alquileno -C1-C10- (heterociclo C3-C8) -, - (heterociclo C3-C8) -alquileno -Cq-Cho-, - (CH2CH20) r-, e (CH2CH20) r-CH2-; e r é um inteiro que varia de 1-10. Deve ser entendido a partir das formas de realização exemplares de Fórmula Ia, tal como III-VI, que mesmo onde não denotado expressamente, de 1 a 20 frações de fármaco estão ligadas a um ligando (p = 1-20) .
O N-R17-C(0)—w, 'w
*Yy-D o
Illa
H-CH2-C0NH—R17~C(0)-f-Ww—Yy—D nib aquela de
Uma unidade de Estirador ilustrativa é Fórmula Illa em que R17 é -(CH2)5-: 105 ΕΡ1725249Β1
Uma outra unidade de Estirador ilustrativa é aquela de Fórmula Illa em que R17 é - (CH2CH20)r-CH2-; e r é 2:
Ainda uma outra unidade de Estirador ilustrativa é aquela de Fórmula Illb onde R17 é -(CH2)5_:
O
O
Numa outra forma de realização, a unidade de Estirador é ligada à unidade de Ligando através de uma ligação de bissulfeto entre um átomo de enxofre da unidade de Ligando e um átomo de enxofre da unidade de Estirador. Uma unidade de Estirador representativa desta forma de realização é ilustrada dentro dos colchetes de Fórmula IV, onde R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima. S-R17-C(0)·
-Ww-Yy-D
IV
Em ainda uma outra forma de realização, o grupo reativo da unidade de Estirador contém um local reativo que pode formar uma ligação com um grupo amino primário ou secundário de um Ligando. Exemplos destes locais reativos incluem, mas não se limitam a, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, 4-nitrofenil ésteres, pentafluorofenil ésteres, tetrafluorofenil ésteres, anidridos, cloretos ácidos, cloretos de sulfonilo, 106 ΕΡ1725249Β1 isocianatos e isotiocianatos. Unidades de Estirador representativas desta forma de realização são ilustradas dentro dos colchetes das Fórmulas Va e Vb, onde -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima.
Ww-Y„— D *C(0)NH-R17-C(0)-
Va s
C-NH-R17-C(OH-W,
Yy-D
Vb
Em ainda um outro aspeto, o grupo reativo da unidade de Estirador contém um local reativo que é reativo a um grupo de hidrato de carbono modificado (-CHO) que pode estar presente num Ligando. Por exemplo, um hidrato de carbono pode ser fracamente oxidado usando um reagente tal como periodato de sódio e a unidade resultante (-CHO) do hidrato de carbono oxidado pode ser condensada com uma unidade de Estirador que contém uma funcionalidade tal como uma hidrazida, uma oxima, uma amina primária ou secundária, uma hidrazina, uma tiossemicarbazona, uma hidrazina carboxilato e uma arilidrazida tal como aquelas descritas por Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem 2:133-41. Unidades de Estirador representativas desta forma de realização são ilustradas dentro dos colchetes de Fórmulas Via, Vlb, e Vlc, onde -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme definidos acima.
Yy—D :N-N H—R17-C(0)—Ww-
Via 107
ΕΡ1725249Β1 L :N-0—R17-C(0>
Ww-Yv-D VIb
O
:N-NH—ϋ—R17“C(0)*f-Ww—Yv-D VIc
4.3.2 A UNIDADE DE AMINOÁCIDO A unidade de Aminoácido (-W-), quando estiver presente, liga a unidade de Estirador à unidade de Espaçador se a unidade de Espaçador estiver presente, liga a unidade de Estirador à fração de Fármaco se a unidade de Espaçador estiver ausente, e liga a unidade de Ligando à unidade de Fármaco se a unidade de Estirador e unidade de Espaçador estiverem ausentes.
Ww— é uma unidade de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido ou dodecapéptido. Cada unidade -W- independentemente tem a fórmula denotada a seguir entre colchetes, e w é um número inteiro que varia de 0 a 12.
isobutilo, -CH (OH) CH3, em que R19 é hidrogénio, metilo, isopropilo, sec-butilo, benzilo, p-hidroxibenzilo, -CH2OH, 108 ΕΡ1725249Β1 -ch2ch2sch3, -ch2conh2, -ch2cooh, -ch2ch2conh2, -ch2ch2cooh, - (CH2) 3NHC (=NH)NH2, -(CH2)3NH2, - (CH2) 3NHCOCH3, - (CH2) 3NHCHO, -(CH2) 4NHC (=NH) nh2, - (CH2) 4nh2, - (CH2) 4nhcoch3, - (CH2) 4nhcho, -(CH2) 3nhconh2, - (ch2) 4nhconh2, -ch2ch2ch (oh) ch2nh2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo,
A unidade de Aminoácido pode ser clivada enzimaticamente por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumor, para libertar a unidade de Fármaco (-D), que numa forma de realização é protonada in vivo mediante libertação para proporcionar um Fármaco (D). Unidades Ww ilustrativas são representadas pelas fórmulas (VII)-(IX):
109 ΕΡ1725249Β1
Benzilo Metilo Isopropilo Isopropilo Benzilo Isobutilo sec-butilo
>-tD
N
H
Benzilo
Benzilo __ (CH2) 4nh2 (CH2) 4nh2 (CH2) 4nh2 (CH2) 3nhconh2 (CH2) 3nhconh2 (CH2) 3nhconh2 (CH2) 3nhconh2 (CH2) 3nhconh2 metilo; e (CH2) 3NHC (=NH) NH2;
Benzilo Benzilo Benzilo
Benzilo
Isopropilo H (CH2) 4nh2 (CH2) 4NH2; e (CH2) 4nh2
R em que R' 20
(IX) 21 22 20
R
R R' 23 H Metilo benzilo isobutilo
Isobutilo
Metilo H; e isobutilo,
Unidades de Aminoácido exemplares incluem, mas não se limitam a unidades de fórmula (VII) onde: R20 é benzilo e 110 ΕΡ1725249Β1 R21 é -(CH2; )4NH2; R20 é isopropilo e R21 é - (CH2 ) 4NH2; R20 é isopropilo e R21 é - (CH2) 3NHCONH2. Uma outra unidade de Aminoácido exemplar é uma unidade de fórmula (VIII) onde R20 é benzilo, R21 é benzilo, e R22 é -(CH2)4NH2.
Unidades úteis -Ww- podem ser designadas e otimizadas em suas seletividades para clivagem enzimática por enzimas especificas, por exemplo, uma protease associada com tumor. Numa forma de realização, uma unidade -Ww- é aquela cuja clivagem é catalisada por catepsina B, C e D, ou por uma protease plasmina.
Numa forma de realização, -Ww- é um dipéptido, tripéptido, tetrapéptido ou pentapéptido.
Quando R19, R20, R21, R22 ou R23 é diferente de hidrogénio, o átomo de carbono ao qual R19, R20, R21, R22 ou R23 está unido é quiral.
Cada átomo de carbono ao qual R19, R20, R21, R22 ou R23 é unido está independentemente na configuração (S) ou (R).
Num aspeto da unidade de Aminoácido, a unidade de
Aminoácido é valina-citrulina. Num outro aspeto, a unidade de Aminoácido é fenilalanina- lisina (isto é, fk) . Em ainda um outro aspeto da unidade de Aminoácido, a unidade de
Aminoácido é N-metilvalina-citrulina. Em ainda um outro aspeto, a unidade de Aminoácido é ácido 5-aminovalérico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato lisina, cicloexilalanina lisina, ácido isonopecótico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina e ácido isonopecótico.
Em certas formas de realização, a unidade de Aminoácido pode compreender aminoácidos naturais. Em outras m ΕΡ1725249Β1 formas de realizaçao, a unidade de Aminoácido pode compreender aminoácidos não naturais.
4.3.3 A UNIDADE DE ESPAÇADOR A unidade de Espaçador (-Y-), quando estiver presente, liga uma unidade de Aminoácido à fração de fármaco quando uma unidade de Aminoácido estiver presente. Alternativamente, a unidade de Espaçador liga a unidade de Estirador à fração de Fármaco quando a unidade de Aminoácido estiver ausente. A unidade de Espaçador também liga a fração de Fármaco à unidade de Ligando quando a unidade de Aminoácido e a unidade de Estirador estiverem ausentes.
Unidades de Espaçador são de dois tipos gerais: auto-sacrifical e não auto-sacrifical. Uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical é aquela na qual parte ou toda a unidade de Espaçador permanece ligada à fração de Fármaco após clivagem, especialmente enzimática, de uma unidade de Aminoácido do Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando ou Composto de Fármaco-Ligante. Exemplos de uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical incluem, mas não se limitam a uma unidade de Espaçador (glicina-glicina) e uma unidade de Espaçador glicina (ambas ilustradas no Esquema 1) (infra). Quando um Composto Exemplar contendo uma unidade de Espaçador glicina-glicina ou uma unidade de Espaçador glicina sofre clivagem enzimática através de protease associada à célula de tumor, protease associada a célula cancerígena ou uma protease associada a linfócito, uma fração glicina-glicina-Fármaco ou uma fração glicina-Fármaco é clivada de L-Aa- Ww-. Numa forma de realização, uma reação de hidrólise independente ocorre dentro da célula alvo, que cliva a fração de glicina-Fármaco ligada e que liberta o Fármaco. 112 ΕΡ1725249Β1
Numa outra forma de realização, -Yy- é uma unidade de álcool p-aminobenzílico (ΡΆΒ) (veja-se Esquemas 2 e 3) cuja fração fenileno é substituída por Qm onde Q é alquilo Ci-Cs, -0-(alquilo Ci-Cs) , -halogénio, -nitro ou -ciano; e m é um inteiro que varia de 0-4.
Esquema 1
Ab—Aa-Ww—Gly-D
Ab ~Aa-Ww—Gly—Glyj-D clivagem enzimática clivagem enzimática
Gly-D
Gly-Gly-D hidrólise Fármaco hidrólise Fármaco
Numa forma de realização, uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical (-Y-) é -Gly-Gly-. Numa outra forma de realização, uma unidade de Espaçador não auto-sacrifical (-Y-) é -Gly-.
Numa forma de realização, é proporcionado o Composto de Fármaco-Ligante ou um Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando em que a unidade de Espaçador está ausente (y=0), ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Alternativamente, um Composto Exemplar contendo uma unidade de Espaçador auto-sacrifical pode libertar -D sem a necessidade de uma etapa de hidrólise separada. Nesta forma de realização, -Y- é um grupo PAB que está ligado a -Ww-através do átomo de amino nitrogénio do grupo PAB, e conectado diretamente à -D através de um carbonato, carbamato ou grupo éter. Sem estar limitado por qualquer teoria ou mecanismo específico, o Esquema 2 ilustra um 113 ΕΡ1725249Β1 possível mecanismo de libertação de Fármaco de um grupo PAB que está unido diretamente a -D através de um grupo carbamato ou carbonato patrocinado porToki et al. (2002) J Org. Chem. 67:1866-1872. ΕΡ1725249Β1 Esquema 2
clivagem enzimática
O 1,6-eliminação Fármaco em que Q é alquilo -Ci-C8, -O- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; e p varia de 1 a cerca de 20.
Sem estar limitado por qualquer teoria ou mecanismo específico, o Esquema 3 ilustra um possível mecanismo de libertação de Fármaco de um grupo PAB que está unido diretamente a -D através de uma ligação de éter ou amina. 114 ΕΡ1725249Β1 Esquema 3
clivagem enzímátíca
Qm 1,6-eliminaçao
+ Fármaco em que Q é alquilo -Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; e p varia de 1 a cerca de 20.
Outros exemplos de espaçadores auto-sacrificais incluem, mas não se limitam a compostos aromáticos que são eletronicamente similares ao grupo PAB tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) e orto- ou para-aminobenzil acetais. Podem ser usados Espaçadores que sofrem ciclização mediante hidrólise de ligação de amida, tal como ácido 4-aminobutirico amidas substituídas ou não substituídas (Rodrigues, et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223), sistemas de anel biciclo[2.2.1 ] e biciclo[2.2.2] 115 ΕΡ1725249Β1 apropriadamente substituídos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 5867). A eliminação de fármacos contendo amina que são substituídas na posição a de glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) são também exemplos de espaçador auto-sacrifical úteis nos Compostos Exemplares.
Numa forma de realização, a unidade de Espaçador é uma unidade bis(hidroximetil)estireno ramificada (BHMS) conforme ilustrado no Esquema 4, que pode ser usada para incorporar e libertar diversos fármacos.
w,
Esquema 4 Qm ÇH2(0(C(0)))n-D 'CH2(0<C(0)))n-Dl W'
clivagem enzimática 2 fármacos em que Q é alquilo -Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs) , -halogénio, -nitro ou - ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4; n é 0 ou 1; e p varia de 1 a cerca de 20.
Numa forma de realização, as frações -D são iguais. Em ainda uma outra forma de realização, as frações -D são diferentes.
Num aspeto, unidades representadas pelas Fórmulas de Espaçador (X)-(XII): -Yy-) são 116 ΕΡ1725249Β1
em que Q é alquilo -Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou - ciano; e m é um número inteiro que varia de 0-4. xi —HN—CH2-CO-i e —NHCH2C(0)-NHCH2C(0)—i i XII.
Formas de realização de Fórmula Ia' e Ic de compostos conjugado de anticorpo-fármaco incluem:
de
117 ΕΡ1725249Β1
4.4 A UNIDADE DE FÁRMACO (FRAÇÃO) A fração de fármaco (D) dos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) são do tipo dolastatina/auristatina (Patente US N° 5635483; 5780588) que demonstraram interferir com a dinâmica de microtúbulo, hidrólise GTP, e divisão nuclear e celular (Woyke et ai. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584 e têm atividade anti-cancro 118 ΕΡ1725249Β1 (Patente US N° 5663149) e antifúngica (Pettit et al. (1998)
Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). D é uma unidade de Fármaco (fração) que tem um átomo de nitrogénio que pode formar uma ligação com a unidade de Espaçador quando y=l ou 2, com o grupo carboxilo C-terminal de uma unidade de Aminoácido quando y=0, com o grupo carboxilo de uma unidade de Estirador quando w e y = 0, e com o grupo carboxilo de uma unidade de Fármaco quando a, w, e y = 0. Deve ser entendido que os termos "unidade de fármaco" e "fração de fármaco" são sinónimos e usados de forma intercambiável no presente documento. A unidade de fármaco tem uma estrutura como definido nas reivindicações.
Também descrito no presente documento são unidades de fármaco que têm a fórmula DE:
R9 I R18
De em que, independentemente em cada localizaçao: R2 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R3 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquilarilo, Ci-C8 alquil- (C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e Ci-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); R4 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquilarilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); R5 é selecionado a partir de H e metilo; ou R4 e R5 em conjunto formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CRaRb)n- em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de H, Ci-C8 alquilo e C3-C8 119 ΕΡ1725249Β1 carbociclo e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R7 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil- (C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo e Ci-C8 alquil- (C3-C8 heterociclo); cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, OH, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo e 0-(Ci-C8 alquil); R9 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R18 é selecionado a partir de -C (R8) 2~C (R8) 2-arilo, C (R8) 2-C (R8) 2-(C3-C8 heterociclo), e -C (R8) 2_C (R8) 2_ (C3-C8 carbociclo); e n é um número inteiro que varia de 0 a 6.
Num caso, R3, R4 e R7 são independentemente isopropilo ou sec-butilo e R5 é -H. Num caso exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R5 é H, e R7 é sec-butilo.
Em outro caso, R2 e R6 são, cada um, metilo, e R9 é H.
Em ainda outro caso, cada ocorrência de R8 é -0CH3.
Num caso exemplar, R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -0CH3, e R9 é H.
Unidades de Fármaco (-D) ilustrativas incluem as unidades de fármaco que tem as seguintes estruturas:
MMAE
MMAF 120 ΕΡ1725249Β1
ΝΗ
121 ΕΡ1725249Β1
e sais farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos dos mesmos.
Como descrito no presente documento, grupos hidrofilicos, tais como trietileno glicol ésteres (TEG), mas não limitados aos mesmos, conforme mostrado acima, podem ser unidos à Unidade de Fármaco em R11. Sem estar 122 ΕΡ1725249Β1 limitado por teorias, os grupos hidrofílicos auxiliam na internalização e não aglomeração da Unidade de Fármaco.
4.5 A UNIDADE DE LIGANDO A unidade de Ligando (L-) inclui dentro de seu âmbito qualquer unidade de um Ligando (L) que se ligue ou reativamente se associe ou forme um complexo com um recetor, antigénio ou outra fração recetiva associada com uma população de célula alvo dada. Um Ligando é uma molécula que se liga, forma um complexo, ou reage com uma fração de uma população de células que se destinam a serem terapeuticamente ou, por outro lado, biologicamente modificadas. Num aspeto, a unidade de Ligando age para aplicar a unidade de Fármaco a uma população de célula alvo especifica com a qual a unidade de Ligando reage. Estes Ligandos incluem, mas não se limitam a, proteínas de grande peso molecular tais como, por exemplo, anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpo, proteínas de peso molecular menor, polipéptido ou péptidos, lectinas, glicoproteínas, não péptidos, vitaminas, moléculas de transporte de nutriente (tal como, mas não limitadas a transferina), ou qualquer outra molécula ou substância de ligação de célula.
Uma unidade de Ligando pode formar uma ligação com uma unidade de Estirador, uma unidade de Aminoácido, uma Unidade de Espaçador, ou uma Unidade de Fármaco. Uma unidade de Ligando pode formar uma ligação com uma unidade de Ligante através de um heteroátomo do Ligando.
Heteroátomos que podem estar presentes numa unidade de Ligando incluem enxofre (numa forma de realização, de um grupo sulfidrilo de um Ligando), oxigénio (numa forma de realização, de um grupo carbonilo, carboxilo ou hidroxilo de um Ligando) e nitrogénio (numa forma de realização, de 123 ΕΡ1725249Β1 um grupo amino primário ou secundário de um Ligando). Estes heteroátomos podem estar presentes no Ligando no estado natural do Ligando, por exemplo, um anticorpo de ocorrência natural, ou podem ser introduzidos no Ligando através de modificação quimica.
Numa forma de realização, um Ligando possui um grupo sulfidrilo e o Ligando se liga à unidade de Ligante através do átomo de enxofre do grupo sulfidrilo.
Em ainda um outro aspeto, o Ligando tem um ou mais residuos de lisina que podem ser modificados quimicamente para introduzir um ou mais grupos sulfidrilo. A unidade de Ligando se liga à unidade de Ligante através do átomo de enxofre do grupo sulfidrilo. Os reagentes que podem ser usados para modificar lisinas incluem, mas não se limitam a N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) e cloridrato de 2-iminotiolano (Reagente de Traut).
Numa outra forma de realização, o Ligando pode ter um ou mais grupos hidrato de carbono que podem ser modificados quimicamente para ter um ou mais grupos sulfidrilo. A unidade de Ligando se liga à unidade de Ligante, tal como a unidade de Estirador, através do átomo de enxofre do grupo sulfidrilo.
Em ainda uma outra forma de realização, o Ligando pode ter um ou mais grupos hidrato de carbono que podem ser oxidados para proporcionar um grupo aldeído (- CHO) (veja-se, por exemplo, Laguzza et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55). 0 aldeído correspondente pode formar uma ligação com um Local Reativo numa unidade de Estirador. Locais Reativos num Estirador que podem reagir com um grupo carbonilo num Ligando incluem, mas não se limitam a hidrazida e hidroxilamina. Outros protocolos para a 124 ΕΡ1725249Β1 modificação de proteínas para a anexação ou associação de Unidades de Fármaco são descritos por Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & sons (2002), incorporado no presente documento por referência.
Proteína não imunorreativa, polipéptido, ou Ligandos de péptido úteis incluem, mas não se limitam a transferrina, fatores de crescimento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido de libertação de gastrina, fator de crescimento derivado de plagueta, IL-2, IL-6, fatores de crescimento de transformação ("TGF"), tais como TGF-α e TGF-β, fator de crescimento de vacínia ("VGF"), insulina e fatores de crescimento tipo insulina I e II, lectinas e apoproteína de lipoproteína de baixa densidade.
Anticorpos policlonais úteis são populações heterogéneas de moléculas de anticorpo derivadas do soro de animais imunizados. Vários procedimentos bem conhecidos na técnica podem ser usados para a produção de anticorpos policlonais para um antigénio de interesse. Por exemplo, para a produção de anticorpos policlonais, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injeção com um antigénio de interesse ou derivado do mesmo, incluindo, mas não limitado a coelhos, ratinhos, ratos, e cobaias. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras, e incluindo, mas não limitados a adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substância tensioativas tais como lisolecitinas, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleo, hemocianinas do molusco "key-hole", dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) , e Corynebacterium parvum. Estes adjuvantes são também conhecidos na técnica. 125 ΕΡ1725249Β1
Anticorpos monoclonais úteis são populações homogéneas de anticorpos para um determinante antigénico especifico (por exemplo, um antigénio de célula cancerígena, um antigénio virai, um antigénio microbiano, uma proteína, um péptido, um hidrato de carbono, um produto químico, um ácido nucleico, ou fragmentos dos mesmos). Um anticorpo monoclonal (mAb) para um antigénio de interesse pode ser preparado através da utilização de qualquer técnica conhecida na técnica que proveja a produção de moléculas de anticorpo por linhas de células contínuas em cultura. Estas técnicas incluem, mas não se limitam à técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature 256, 495-497), a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), e a técnica do hibridoma EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancro Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Estes anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD e de qualquer subclasse das mesmas. 0 hibridoma que produz mAbs de utilização nesta invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo.
Anticorpos monoclonais úteis incluem, mas não se limitam a anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados, fragmentos de anticorpos, anticorpos monoclonais quiméricos humano- ratinho (ou outras espécies). Anticorpos monoclonais humanos podem ser feitos por qualquer uma dentre numerosas técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, Teng et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80, 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72-79; e Olsson et ai., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16). O anticorpo pode também ser um anticorpo biespecífico. Métodos para preparar anticorpos biespecíficos são 126 ΕΡ1725249Β1 conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada-cadeia leve, onde as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Devido à seleção aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. Procedimentos similares são apresentados são apresentados na Publicação Internacional N° WO 93/08829, e por Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
De acordo com uma abordagem diferente, dominios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão, preferivelmente, se dá com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter uma primeira região constante de cadeia pesada (CH1) , contendo o local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Ácidos nucleicos, com sequências que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, de cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos nos vetores de expressão separados, e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto possibilita grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido em formas de realização nas quais proporções desiguais das três cadeias de polipéptido usadas na construção proporcionam os resultados ideais. É possível, portanto, inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipéptido num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias 127 ΕΡ1725249Β1 de polipéptido em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não têm significância especifica.
Numa forma de realização desta abordagem, os anticorpos biespecificos possuem uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com a primeira especificidade de ligação num braço, e um par híbrido de cadeia pesada -cadeia leve de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações não desejadas de cadeia de imunoglobulina, visto que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma maneira fácil de separação (Publicação Internacional N° WO 94/04690) que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade.
Para pormenores adicionais para gerar anticorpos biespecificos veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210; Rodrigues et al. , 1993 , J. of Immunology 151:6954-6961; Cárter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Cárter et al., 1995, J. of Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16:677-681. Através da utilização destas técnicas, anticorpos biespecificos podem ser preparados para utilização no tratamento ou prevenção de doença conforme definido no presente documento.
Anticorpos bifuncionais são também descritos, na Publicação de Patente Europeia N° EPA 0 105 360. Conforme apresentado nesta referência, anticorpos híbridos ou bifuncionais podem ser derivados tanto biologicamente, isto é, por técnicas de fusão de célula, quanto quimicamente, especialmente com agentes de reticulação ou reagentes 128 ΕΡ1725249Β1 formadores de ponte de bissulfeto, e podem compreender anticorpos inteiros ou fragmentos dos mesmos. Métodos para obtenção destes anticorpos híbridos são apresentados, por exemplo, na Publicação Internacional WO 83/03679, e Publicação de Patente Europeia N° EPA 0 217 577, ambas incorporadas no presente documento por referência. O anticorpo pode ser um fragmento funcionalmente ativo, derivado ou análogo de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a antigénios de célula cancerígena, antigénios virais, ou antigénios microbianos ou outros anticorpos ligados a células de tumor ou matrizes. Com relação a isto, "funcionalmente ativo" significa que o fragmento, derivado ou análogo é capaz de extrair anticorpos anti-anti-idiotipos que reconhecem o mesmo antigénio que o anticorpo do qual o fragmento, derivado ou análogo é derivado reconhecido (SIC). Especificamente, numa forma de realização exemplar a antigenicidade do idiotipo da molécula de imunoglobulina pode ser aumentada pela deleção de estrutura e sequências CDR que sejam de terminal C para a sequência CDR que especificamente reconhece o antigénio. Para determinar quais sequências CDR se ligam ao antigénio, péptidos sintéticos contendo as sequências CDR podem ser usados nas análises de ligação com o antigénio através de quaisquer métodos de análise de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, a análise de núcleo BIA) (Veja-se, por exemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD; Kabat E. et al., 1980, J. of Immunology 125(3):961- 969).
Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos tais como, mas não limitados a, fragmentos F(ab')2/ que contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada e podem ser 129 ΕΡ1725249Β1 produzidos por digestão de pepsina da molécula de anticorpo, e fragmentos Fab, que podem ser gerados pela redução das pontes de bissulfeto dos fragmentos F(ab')2· Outros anticorpos são dímeros de cadeia leve de anticorpos, ou qualquer fragmento mínimo dos mesmos, tais como Fvs ou anticorpos de cadeia única (SCAs) (por exemplo, conforme descritos na Patente US N° 4946778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei USA 85:5879-5883; e Ward et al. 1989, Nature, 334:544-54), ou quaisquer outras moléculas com a mesma especificidade que o anticorpo.
Adicionalmente, anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos ou humanizados, que compreendem tanto porções humanas quanto não humanas, e que podem ser feitos usando técnicas de ADN recombinante padrão, são anticorpos úteis. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de diferentes espécies de animais, tais como aqueles que têm uma região variável derivada e regiões monoclonal de murino e constante de imunoglobulina humana. (Veja-se, por exemplo, Cabilly et al., Patente US N° 4816567; e Boss et al.r Patente US N° 4.816397, que são incorporadas no presente documento por referência em sua totalidade). Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas que têm uma ou mais regiões de determinação de complementação (CDRs) de espécies não humanas e uma região de estrutura de uma molécula de imunoglobulina. (Veja-se, por exemplo, Queen, Patente US N° 5.585.089, que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade). Estes anticorpos quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, usando métodos descritos na Publicação Internacional N° WO 87/02671; Publicação de Patente Europeia N° 184.187; 130 ΕΡ1725249Β1
Publicação de Patente Europeia N° 171496 Publicação de Patente Europeia N° 173494; Publicação Internacional N° WO 86/01533; Patente US N° 4816567; Publicação de Patente Europeia N° 12.023; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Câncer Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente US N° 5225539; Jones et al., 1986; Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060; cada uma das quais é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade.
Anticorpos completamente humanos são especificamente desejáveis e podem ser produzidos usando ratinhos transgénicos que sejam incapazes de expressar genes de cadeias leve e pesada de imunoglobulina endógena, mas que possam expressar genes humanos de cadeia leve e pesada. Os ratinhos transgénicos são imunizados da maneira normal com um antigénio selecionado, por exemplo, todo ou uma fração de um polipéptido da invenção. Anticorpos monoclonais direcionados contra o antigénio podem ser obtidos usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humanos ancorados de ratinhos transgénicos são rearranjados durante a diferenciação de célula B, e subsequentemente sofrem mudança de classe e mutação somática. Dessa maneira, usando esta técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma análise desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, veja-se Lonberg e Huszar (1995, Int. Ref. Immunol. 13:65- 93). Para uma discussão pormenorizada desta tecnologia para produção de anticorpos humanos e 131 ΕΡ1725249Β1 anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção destes anticorpos. Veja-se, por exemplo, as Patentes US N° 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; cada uma das quais é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade. Outros anticorpos humanos podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San Jose, CA).
Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epitopo selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "seleção guiada". Nesta abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de ratinho, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconheça o mesmo epitopo. (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903). Anticorpos humanos podem também ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de apresentação de fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Quan, Μ. P. e Cárter, P. 2002. The rise of monoclonal antibodies as therapeutics. No Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu, P. M. e Fick Jr., R. B., eds., Mareei Dekker, Nova York, NY, Capitulo 20, páginas 427-469) .
Em outras formas de realização, o anticorpo é uma proteína de fusão de um anticorpo, ou um fragmento funcionalmente ativo do mesmo, por exemplo, no qual o anticorpo é fundido através de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação de péptido), tanto no terminal N quanto no terminal C para uma sequência de aminoácido de uma outra proteína (ou porção da mesma, preferivelmente uma porção com pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos da proteína) que não seja o anticorpo. Preferivelmente, o anticorpo ou 132 ΕΡ1725249Β1 fragmento do mesmo é covalentemente ligado à outra proteína no terminal N do domínio constante.
Anticorpos incluem análogos e derivados que são modificados, isto é, pela anexação covalente de qualquer tipo de moléculas, contanto que esta anexação covalente permita que o anticorpo retenha sua imunoespecificidade de ligação ao antigénio. Por exemplo, mas não como uma limitação, os derivados e análogos dos anticorpos incluem aqueles foram adicionalmente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser executada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a clivagem química, acetilação, formulação, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não naturais.
Os anticorpos incluem anticorpos que têm modificações (por exemplo, substituições, deleções ou adições) nos resíduos de aminoácido que interagem com recetores Fc. Em especial, anticorpos incluem anticorpos que tenham modificações nos resíduos de aminoácido identificados como envolvidos na interação entre o domínio anti-Fc e o recetor FcRn (veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional N° WO 97/34631, que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade). Anticorpos imunoespecificos para antigénio de célula cancerígena podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Genentech (São Francisco, CA) ou produzidos por qualquer método conhecido por aqueles especializados na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou expressão recombinante. As sequências 133 ΕΡ1725249Β1 de nucleótido que codifica anticorpos imunoespecificos para um antigénio de célula cancerígena podem ser obtidas, por exemplo, do banco de dados GenBank ou de um banco de dados similar, de publicações da literatura, ou através de clonagem e sequenciamento de rotina.
Numa forma de realização específica, anticorpos conhecidos para o tratamento ou prevenção de cancro podem ser usados. Anticorpos imunoespecificos para um antigénio de célula cancerígena podem ser obtidos comercialmente ou produzido por qualquer método conhecido daqueles especializados na técnica, tal como, por exemplo, técnicas de expressão recombinante. A sequência de nucleótido que codifica anticorpos imunoespecificos para um antigénio de célula cancerígena pode ser obtida, por exemplo, do banco de dados GenBank ou de um banco de dados similar, de publicações da literatura, ou através de clonagem e sequenciamento de rotina. Exemplos de anticorpos disponíveis para o tratamento de cancro incluem, mas não se limitam a anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado, HERCEPTIN® (trastuzumab; Genentech) para o tratamento de pacientes com cancro de mama metastático; RITUXAN® (rituximab; Genentech) que é um anticorpo monoclonal antí-CD20 quimérico para o tratamento de pacientes com linfoma não de Hodgkin; OvaRex (AltaRex Corporation, MA) que é um anticorpo de murino para o tratamento de cancro do ovário; Panorex (Glaxo Wellcome, NC) que é um anticorpo IgG2a de murino para o tratamento de cancro colorretal; Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY) que é um anticorpo quimérico anti-EGFR IgG para o tratamento de cancros positivos para fator de crescimento epidérmico, tais como cancro da cabeça e pescoço; Vitaxin (Medlmmune, Inc., MD) que é um anticorpo humanizado para o tratamento de sarcoma; Campath I/H (Leukosite, MA) que é um anticorpo IgGi humanizado para o tratamento de leucemia linfocítica 134 ΕΡ1725249Β1 crónica (CLL); Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo IgG anti-CD33 humanizado para o tratamento de leucemia mieloide aguda (AML); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ) que é um anticorpo IgG anti-CD22 humanizado para o tratamento de linfoma não de Hodgkin; Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo anti-HLA-DR humanizado para o tratamento de linfoma não de Hodgkin; Oncolym (Techniclone, Inc., CA) que é um anticorpo anti-HLA-DrlO de murino rádio marcado para o tratamento de linfoma não de Hodgkin; Allomune (BioTransplant, CA) que um mAb anti-CD2 humanizado para o tratamento de Doença de Hodgkin ou linfoma não de Hodgkin; Avastin (Genentech, Inc., CA) que é um anticorpo humanizado anti-VEGF para o tratamento de cancros de pulmão e colorretal; Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA) que um anticorpo anti-CD22 para o tratamento de linfoma não de Hodgkin; e CEAcide (Immunomedics, NJ) que é um anticorpo anti-CEA humanizado para o tratamento de cancro colorretal.
Outros anticorpos úteis para o tratamento de cancro incluem, mas não se limitam a anticorpos contra os seguintes antigénios: CA125 (do ovário), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), alfa-fetoproteina (carcinomas), CA 242 (colorretal), fosfatase alcalina placentária (carcinomas), antigénio especifico da próstata (próstata), fosfatase prostática ácida (próstata), fator de crescimento epidérmico (carcinomas) , MAGE-1 (carcinomas) , MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), recetor de antitransferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUCi-KLH (cancro de mama), CEA (colorretal), gplOO (melanoma), MARTI (melanoma), PSA (próstata), recetor IL-2 (leucemia de célula T e linfomas); CD20 (linfoma não de Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 135 ΕΡ1725249Β1 (linfoma), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiplo), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma), e produto oncogene Neu (carcinomas). Alguns anticorpos específicos úteis incluem, mas não se limitam a BR96 mAb (Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S.J., Henderson, A. J., Hofstead, S.J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrõm, I., Hellstrõm, K. E., "Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates" Science 1993, 261, 212-215) , BR64 (Trail, PA, Willner, D., Knipe, J., Henderson, A.J., Lasch, S.J., Zoeckler, M.E., Trailsmith, M.D., Doyle, T.W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G.R., Brown, J. P., Hofstead, S.J., (Greenfield, R.S., Firestone, R.A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, Μ. B., Hellstrõm, K. E., e Hellstrõm, I. "Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma- reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates" Câncer Research 1997, 57 100-105, mAbs contra o antigénio CD-40, tal como S2C6 mAb (Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., e Wahl, A. F. "Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14" Câncer Res. 2000, 60, 3225-3231), mAbs contra o antigénio CD 70, tal como 1F6 mAb e 2F2 mAb, e mAbs contra o antigénio CD30, tal como ACi0 (Bowen, M.A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., e Podack, E. R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol. 151, 5896-5906, 1993: Wahl et al., 2002 Câncer Res. 62(13):3736-42). Muitos outros anticorpos de internalização que se ligam aos antigénios associados com tumores podem ser usados e foram analisados (Franke, A. E., Sievers, E. L., e Scheinberg, D. A., "Cell surface recetor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review" Câncer Biother Radiopharm. 2000, 15, 459-76; Murray, J. L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2000, 27, 64- 136 ΕΡ1725249Β1 70; Breitling, F., e Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley and Sons, Nova York, 1998) .
Em certas formas de realização, o anticorpo não é Trastuzumab (anti- HER2 de comprimento total, humanizado (PM 145167)), HerceptinF(ab')2 (derivado de anti-HER2 enzimaticamente (PM 100000)), 4D5 (anti-HER de comprimento total, murino, de hibridoma), rhu4D5 (anticorpo humanizado de comprimento total, expressado de forma transiente), rhuFab4D5 (Fab humanizado recombinante (PM 47738)), 4D5Fc8 (antiHER2 de comprimento total, murino, com domínio de ligação FcRn com mutação), ou Hg (4D5 humanizado de comprimento total "Sem articulação", com cisteínas de articulação de cadeia pesada que sofreu mutação para serinas. Expresso em E. coli (portanto não glicosilado)).
Numa outra forma de realização especifica, anticorpos conhecidos para o tratamento ou prevenção de uma doença autoimune são usados de acordo com as composições e métodos da invenção. Anticorpos imunoespecíficos para um antigénio de uma célula que é responsável pela produção de anticorpos autoimunes podem ser obtidos que qualquer organização (por exemplo, uma universidade científica ou uma companhia) ou produzidos por qualquer método conhecido daqueles com especialização na técnica tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou expressão recombinante. Numa outra forma de realização, anticorpos úteis são imunoespecíficos para o tratamento de doenças autoimunes, mas não se limitam a Anticorpo Antinuclear; Anti-ds ADN; Anti-ss ADN, Anticorpo Anticardiolipina IgM, IgG; Anticorpo Antifosfolípido IgM, IgG; Anticorpo Anti- SM; Anticorpo Antimitocondrial; Anticorpo de Tiroide; Anticorpo Microssómico; Anticorpo Tiroglobulina; Antí-SCL-70; Anti-Jo, Anti-UiRNP; Anti-La/SSB; Anti SSA, Anti-SSB, Anticorpo Anticélulas Peritais; Anti-Histonas; Anti-RNP; C- ANCA; P- 137 ΕΡ1725249Β1 ANCA; Anticentrómero; Antifibrilarina, e Anticorpo Anti-GBM.
Em certas formas de realização, anticorpos úteis podem se ligar a um recetor ou a um complexo de recetor expresso num linfócito ativado. 0 recetor ou complexo de recetor pode compreender um membro da superfamilia do gene imunoglobulina, um membro da superfamilia do recetor TNF, uma integrina, um recetor de citocina, um recetor de quimiocina, uma proteína de histocompatibilidade principal, uma lectina, ou uma proteína de controlo de complemento. Exemplos não limitativos de membros da superfamilia de imunoglobulina são CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CDl52/CTLA-4, PD-1, e ICOS. Exemplos não limitativos de membros da superfamilia de recetor TNF são CD27, CD4 0, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-IBB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, e APO-3. Exemplos não limitativos de integrinas adequadas são CDlla, CDllb, CDllc, CDl8, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 e CD104. Exemplos não limitativos de lectinas adequadas são lectina tipo C, tipo S, e tipo I.
Numa forma de realização, o Ligando liga-se a um linfócito ativado que está associado com uma doença autoimune.
Numa outra forma de realização específica, Ligandos imunoespecíficos úteis para um antigénio virai ou microbiano são anticorpos monoclonais. Os anticorpos podem ser quiméricos, humanizados ou anticorpos monoclonais humanos. Conforme usado no presente documento, o termo "antigénio virai" inclui, mas não está limitado a, qualquer péptido virai, proteína de polipéptido (por exemplo, VIH gpl20, VIH nef, RSV F glicoproteína, neuraminidase de 138 ΕΡ1725249Β1 influenza vírus, hemaglutinina de influenza vírus, HTLV tax, glicoproteína de vírus herpes simples (por exemplo, gB, gC, gD, e gE) e antigénio superficial de hepatite B) gue é capaz de obter uma resposta imunológica. Conforme usado no presente documento, o termo "antigénio microbiano" inclui, mas não se limita a, qualquer péptido microbiano, proteína, sacárido, polissacárido, ou molécula de lípido (por exemplo, uma molécula bacteriana, fúngica, protozoário patogénico, ou polipéptido de fermento incluindo, por exemplo, LPS e polissacárido capsular 5/8) que seja capaz de obter uma resposta imunológica.
Anticorpos imunoespecíficos para um antigénio virai ou microbiano podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da BD Biosciences (São Francisco, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), ou Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) ou produzidos por qualquer método conhecido por aqueles especializados na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou expressão recombinante. A sequência de nucleótido que codifica anticorpos que são imunoespecíficos para um antigénio virai ou microbiano pode ser obtida, por exemplo, do banco de dados GenBank ou de um banco de dados similar, de publicações da literatura, ou através de clonagem e sequenciamento de rotina.
Numa forma de realização específica, Ligandos úteis são aqueles que são úteis para o tratamento ou prevenção de infeção virai ou microbiana de acordo com os métodos apresentados no presente documento. Exemplos de anticorpos úteis disponíveis para o tratamento de infeção virai ou infeção microbiana incluem, mas não se limitam a, SYNAGIS (Medlmmune, Ind., MD) que é um anticorpo monoclonal de vírus sincicial anti-respiratório (RSV) humanizado útil para o tratamento de pacientes com infeção por RSV; PR0542 139 ΕΡ1725249Β1 (Progénies) que é um anticorpo de fusão CD4 útil para o tratamento de infeção por VIH; OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo humano útil para o tratamento de virus de hepatite B; PROTOVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que é um anticorpo IgGi humanizado útil para o tratamento de citomegalovirus (CMV); e anticorpos anti-LPS.
Outros anticorpos úteis no tratamento de doenças infeciosas incluem, mas não se limitam a anticorpos contra os antigénios de estirpes patogénicas de bactérias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphteriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hidrophilo, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.), fungos patogénicos (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum) ; protozoários (Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma 140 ΕΡ1725249Β1 rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania hraziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); ou helmintos (Enterohius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumhricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, e anciliostemas).
Outros anticorpos úteis nesta invenção para o tratamento de doença virai incluem, mas não se limitam a anticorpos contra antigénios de vírus patogénicos, incluindo como exemplos e não com intuito limitativo: Poxviridae, Herpesviridae, Herpes Simplex vírus 1, Herpes Simplex vírus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, vírus de influenza, vírus de parainfluenza, caxumba, sarampo, vírus sincicial respiratório, rubéola, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, vírus da Hepatite E, vírus da Hepatite não A/não B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, e Vírus da Imunodeficiência Humana.
Em tentativas para descobrir alvos celulares efetivos para diagnóstico de e terapêutica de cancro, pesquisadores buscaram identificar transmembrana ou, por outro lado, polipéptidos associados com tumor que fossem especificamente expressos na superfície de um ou mais tipos específicos de célula cancerígena, se comparado com uma ou mais células não cancerígenas normais. Frequentemente, estes polipéptidos associados com tumor são mais expressos de forma abundante na superfície das células cancerígenas se comparado com a superfície de células não cancerígenas. A identificação destes polipéptidos de antigénio de 141 ΕΡ1725249Β1 superfície celular associado com tumor fez surgir a capacidade para direcionar especificamente para células cancerígenas alvo para destruição através de terapêuticas baseadas em anticorpo.
Anticorpos gue compreendem Ab na Fórmula Ic de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) e gue podem ser úteis no tratamento de cancro incluem, mas não se limitam a anticorpos contra antigénios associados com tumor (TAA). Estes antigénios associados com tumor são conhecidos na técnica, e podem ser preparados para utilização na geração de anticorpos que usam métodos e informação que são bem conhecidos na técnica. Exemplos de TAA incluem (1) - (35), mas não se limitam a TAA (1) - (35) listados a seguir. Para conveniência, informação referente a estes antigénios, todos os quais são conhecidos na técnica, está listada a seguir e inclui nomes, nomes alternativos, números de acesso do Genbank e referências principais. Antigénios associados com tumor direcionados por anticorpos incluem todas as variantes de sequência de aminoácido e isoformas que possuam pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, ou 95 % de identidade de sequência em relação às sequências identificadas nas sequências correspondentes listadas (SEQ ID NOS: 1-35) ou nas sequências identificadas nas referências citadas. Em algumas formas de realização, TAA que têm variantes de sequência de aminoácido exibem substancialmente as mesmas propriedades biológicas ou características que um TAA que a sequência encontrada nas sequências correspondentes listadas (SEQ ID NOS: 1-35). Por exemplo, um TAA que tem uma sequência variante geralmente é capaz de se ligar especif icamente a um anticorpo que se ligue especificamente ao TAA com a sequência correspondente listada. As sequências e apresentações especificamente citadas no presente documento são expressamente incorporadas por referência. 142 ΕΡ1725249Β1
Antigénios Associados com Tumor (1) - (35): (1) BMPR1B (recetor de proteína morfogenética óssea do tipo IB, N° de acesso do Genbank NM_001203, ten Dijke, P., et al. Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); documento WO 2004063362 (Reivindicação 2) WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento US 2003134790-Al (Páginas 38-39); documento WO 2002102235 (Reivindicação 13; Página 296); documento WO 2003055443 (Páginas 91-92; documento WO 200299122 (Exemplo 2; Páginas 528-530); documento WO 2003029421 (Reivindicação 6) ; documento WO 2003024392 (Reivindicação 2, Figura 112); documento WO 200298358 (Reivindicação 1 γ- Página 183); documento WO 200254940 (Páginas 100- ΙΟΙ) ; documento WO 200259377 (Páginas 349-350); documento WO 200230268 (Reivindicação 27; Página 376); documento WO 200148204 (Exemplo; Figura 4) NP_001194 recetor de proteína morfogenética óssea, tipo IB/pid=NP_001194.1 - Referências Cruzadas: MIM:603248; NP_0 01194.1; NM_001203_1. 502 aa
XLLRSAGKtííVÍ3TICKJSDasSTAPTPR.FKVIíRCKCHHHCPBDSVl»JI CSÍDGVCFTÍÍIESD DSGLPV\rrSí3CI>GLBgSDFQC3UT?I PHQRRSI ECCTSÍ»JBC^TKDI,HPTf PPLKNSDPVD GPIKHRAL LISVTVt SI»tLVt 11 It FCXPRYKRQETR PRYSIGLEQDETYI PPQESLRtLI
Υ0Τνθ^ίΚΗΞΝΙΙ^Ρ1ίΛηΙϊΐί3Τ<38Η'Τ:0Ι,Υ1ι ITJ5YH BífíSS LYDYL kSTTUDAKS
imVDlPPHTRVGTkSYMPeSVtOaSLNÍlííBFQSYI^DMYSFGLXLWSVARHCVSGGtV SEYQLPYRaLVPSBPSYSDMkSXVÇ3:KkrJRPSm®Wa$DBCmgMGK»íll'BCWAaNPAS RUrAUR-ríCKTLAKMS SSQtXSCL (SBQ ID NO; 1} (2) EI 6 (LATI, SLC7A5, N° de acesso do Genbank NM_0 0 34 8 6) i ; Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2) , 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H. W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 11267-11273); documento WO 2004048938 (Exemplo 2) ; documento WO 2004032842 (Exemplo IV); documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento WO 2003016475 (Reivindicação 143 ΕΡ1725249Β1 1); documento WO 200278524 (Exemplo 2); documento WO 200299074 (Reivindicação 19); páginas 127-129); documento WO 200286443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); documento WO 2003003906 (Reivindicação 10; Página 293); documento WO 200264798 (Reivindicação 33; Páginas 93-95); documento WO 200014228 (Reivindicação 5; páginas 133-136); documento US 2003224454 (Figura 3); documento WO 2003025138 (Reivindicação 12; Página 150); NP_003477 família de portador de soluto 7 (portador de aminoácido catiónico,
Referências sistema y+) , membro 5/pid=NP_003477.3 cruzadas de Homo sapiens: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1 507 m GTfXGSGIFVTPTGVLKEíiGSPGLAIjWWAACGVFSIVGALCYáBLGTTtSKeeíítiyAYM L&VTGS£,PAF£KLS;í: EI&X IRPSSgyxVSÍ.YmTWiI^&FFPCPVSEHAAKliVAClíCVL ‘
LXiXAVHCY SVXAATRVQDAFARAKLIifUiAr I ILnGFVQieKSWSMiDPiíFSFBGTXUDV
2 IS fPXVTLVWX.SÍKAYrrTI. STEQMLSSHA.VAVUF-StryfíiiaVMSMIlPVFVGLSCFGSVNGSl.FTSSRi.FFVSGSREGHLP
RKFEIíERPIKVN£At.PVFFILACLFLrAVSF5^TPVECGÍGFXIIIiS<3IiPWFFaVWWiKH XFjKKM^QS I FSTTV^CQ^SQWPQET (SSQ 1D HO: 2} (3) STEAP1 (seis antigénios transmembrana epitelial da próstata, N° de acesso do Genbank NM_012449) ; Câncer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999)
Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96 (25) 14523-14528); documento WO 2004065577 (Reivindicação 6); documento WO 2004027049 (Figura 1L) ; EP 1394274 (Exemplo 11); documento WO
2004016225 (Reivindicação 2); documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento US 2003157089 (Exemplo 5); documento US 2003185830 (Exemplo 5) ; documento US 2003064397 (Figura 2); documento WO 200289747 (Exemplo 5; Páginas 618-619); documento WO 2003022995 (Exemplo 9; Figuras 13A, Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Figura 2A); 144 ΕΡ1725249Β1 NP_036581 seis antigénios epiteliais de transmembrana da próstata
Referências Cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1. 339 m
LQHTQEtFH3íííK,PXKIAAXIASXiT£fX.YTX^RBV3:Hf>tATSHQQyPYKlf>XliVIlíKVL£>M ν3ΪΧΙί1ΛΙίν¥ϊ1ΡδνΐΑΑΐν3ΙίΗΝΟΤΕΥΚΚΡΡΗΠ?Ι.ΟΙ®ΜΙ,Τ}ϊΚαΡαΧΙ>3ΡΡΡΑνϊ^ΑΙΥ3Ι.
8YPMRSSyRYKX*^A1f<XfVQQKKEmwIEHmWRMSIYVSLaiVeLArtALrAVTSlPS
VSDStTWREFHYXQSKIíGIVSliliíjíSPtHMtlFSLMlIKWIBIiOSFVMTr&PTFMXAVFIíPXV
Vr.IFKSILFLPÇtRKKItKlRBOÍÍS0VTK:XíííCTBICSQX. ÍSSQ XD NO 3) (4) 0772P (CA125, MUCi6, N° de acesso do Genbank AF 3614 8 6); J. Biol. Chem. 276 (2(:27371-27375 (2001)); documento WO 2004045553 (Reivindicação 14) ; documento WO 200292836 (Reivindicação 6; Figura 12); documento WO 200283866 (Reivindicação 15; Páginas 116-121); documento US 2003124140 (Exemplo 16); documento US 2003091580 (Reivindicação 6); documento WO 200206317 (Reivindicação 6; Páginas 400- 408); 145 ΕΡ1725249Β1
Referências Cruzadas: Gl:34501467; AAK74120.3; AF361486_1 6995 aa
Ε*νΤ5ηητΐ>ιίηνΐΤΤηΡΜΕ15ΗΞΡ!3Τ£εΤ3ΚΤ3ΞΤ8ΗΕΗί,Τ?η£ΟΤνϋΤΕΆΜΟΡ3ΤΗΤΑνΤ WRTSISGHESQeS^SOSETPKATSPMGTTYTOSETSVSISTSOPFKTSRIQIEPTSSL TSGLKETSSSlRISSATESgTVLSEVtSGATTEySRTSVISSSGTSMSGPDOFTISPDlS TSAITRLSTSPIfrrESAESAlTÍETGSPGA-pSEGTLTLDTSTTTFMSGTHSTftSPGFSKS BOTTIjMSSTmDVPWFSÍjPSVlEftgSVSSSLSS PAMTSTSFFSTLPES IS SSPHWMA TI^PVXTTDMÍ^TSSSPBTSSPHaSSTSAEIXATSI^KDREKXHPSSOTFWWGTVI YKHIiS PS Ξνϊ^ηνΐ^’ΚΡΓβΡ&1ΑΤΪ£ΤΙ,βϊΠ'3νεΤδ·ϊ,ΡΑΡΡΚΤ:'5ΚΤ0£,Τ3βϊ)ϊδ<3ΙίίΐΕΙ3 TSaBtSSA^BaâASIiSGMPTSATIíamSIBALSLGRTSÍPGPÃaS^lSPBISSETITEIS TPLTTTGSAEMTITPKIGHSGASSQQTFTlíDTSSPi^SWpGTBSAftTHRSPHSGí^TTííMSP ΟΡΕΪ3ν3·ΚΡβΚΡδνΒΛΚΤ3ΡΡ3ε^3ϊ1δΑνΤ8ϊί3ΡηΥ3ΤΡ3Ε5άΗ33ΡΙ,ΚνΤ3ΙίΡΤΡνΜΜΚΤ 'TDMIíDTSLBPVTTBPPSÍííEÍITSDESÍíATSKâTMSTKAIQLSSNTãVTQMGTXSAS.QSFYS SYPGLPBPSKVTSPWI^STIKOIVSTTIPASSSITRIEI^ESTSTXíTPTPRSTSTSQEIH SAOlíPSTVPYKMiTaATSSDÊMTaVMSSSRGPSPDQSTMSQDISTEVITRIíSTSPIíCTKS TSMTITTOTGSP^YSSGTtYHJTSTfFMaGTHSTASQaPSHSQKTALMSRTPSWPWI.S HPSVEEASS&SFSLSSPVMTSSSPVSSTLPDSIHSSarPVTSLLTSGlíVKTTELI.GTSSE PSTSSPPRMSTSAgXI^TTSVTlOTSKLmTím^SGYTHBSPSSVLADSVraCATSSM GJTYPTODTMVXtTSTPAYSDTSRXQTKSIÍÍíSLTPGIiMBTSX.yEETSSAXEKSWIíSSVPT GATTEVSRTgAISâSRTSIPGPAOSWíSSDTSMETITRXSTPI.TS.KESTDMAIXPKTGPS GATSÇGTPTLDS3STAS«Pl3rHSA.TrQRFPR3WrTPMSRGPKDVSííPSPLS¥EKKSPPS SLVSSSSVTSPSPLYSTPSGSSHPSPVPVTSIíPTSIMMKA-rDMLDASI.BPRTrSAPBMNI TSDESnAftSKATTSrTBAISVFEÍíTAASilVXrrTSATESLYSSSPGFSEPTKVISPWTSSS XRDMMVSTTMPGSSGITRIEIESMSSX.TPGXRETRTSQDITSSXETSITCYKMPSQATPÊ V3RXKVKS? SSRTSI PGPAQSl^SLDISBByvTíUjSTSPlMTESAB ITIXTQTGYSIATSQ WnPLGTSI-re-FLSQTHSYMSOGLSHSEMTRLMSRGPESI.SWrSPRFVBTTRSSSSLTSLP LTTSLSPVSSTLrDSSPSSPX.PVYSLIXíPGLVKTTEVLDTSSEPÍ^SSSPBIíSSTSVEíXP ATSEJOTDTEKIHPSSOTAVAíWRTSSSVHESHSSVLADSffmXIPSMGITSAVEDTTV 146 ΕΡ1725249Β1
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AFQLV^IO^^FSWSSIHãHPIiIiQ&VIíSVLVTVl.VOSSSTSTSIVV^nfSSSÍíBSVKA AI PI IQTS ITJJTIVAtWQVGBRSEFRRAEAGATVHBPPSníLSVLVLLíTTEVATHY LSI XTQAIVES FHFKKGEBAPDLLKVITKPFTKfl VQXíDICKVI SQIAM3MDKKAKUKSLVK IWCKTrri^l^IJrVTTOSTÍl^SPSIfCMlWlQÍBmíKNVTYKEHIAKCQHIFVNFHI^ DL&VGTILLI jLtSI/LVIíCKJCtlHl Vftl tgSVLKí3QVATVlKKTlSTÒFPPPFAM.TGYtkAI LVQASM^P IVQSSSVFTSAJjTPLIGI GVI TÍERAyPI/TIíGSMIGTTTTAI XAAEASPGKA ί^§Ι^ΙΜ,€ΗΡΡ^Ι3βΙΜ^ΡΙΡΡΤΑΒΡΙΙΒ®ΚΒΪίβϊΙΙΕ»Κϊ8ΗΚΑνΡΪΙ.ΙΙΡΡΡΙ1Ι PLTVFGLSIAaW^míVCVGVPWFI I ILV^LRI^SRCPRVI.PKKI^NWI^LPOÍMRSL· KPWDAWBKFTQCFWRCCíCCavCCRACCI.IiCGC&KCCaeôKCCBDLES&QSGQDVPVK APETFiDNITI SHÊAQSSVPASDSKTBCTAX. (SEQ IB MQí6f (7) Sema 5b (FLJ10372, ΚΙΑΆ1445, Mm.42015, SEMA5B,
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HIiíiYKGGGT PKHEKYTPÍÍEFICTLHKMÍÍLI PDDRMIFYFX^QTKVYTTTYYPSPl^KKSFR
PKASPOQHCFeiíS {$1¾ » ®>;7) (8) PS CA hlg (gene de 2700050Ci2Rik, C530008016Rik, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, ADNc de RIKEN 2700050Ci2, N° de acesso do Genbank AY358628); documento US 2003129192 (Reivindicação 2); documento US 2004044180 (Reivindicação 12); documento US 2004044179 (Reivindicação 11); documento US 2003096961 (Reivindicação 11); documento US 2003232056 (Exemplo 5) ; documento WO 2003105758 (Reivindicação 12) ; documento US 2003206918 (Exemplo 5); EP 1347046 (Reivindicação 1); documento WO 2003025148 (Reivindicação 20); Referências Cruzadas: Gl:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1 141 aa
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Referências Cruzadas: LocuslD:54894; NP_060233.2; NM_0177 63_1 783 aa
ERSABQKAIIWIPLKMUPTGK Lítt<1?X(EGWAaVAE2'rt>AS<3KLKa8HH-YfCHAíS|>E!0ÍÍI.SPGFISl¥KlIBSPRRaPSPCL SLASKHHMAGBRGASAVXiFDITEE?HAAAEQLQQPI,GI,TWPWI.XW^DABKÍíMBFV¥KNQ KAHVKlEUCB5>PAW&DVDVÍfS^n,WGTlFVtri*ASVI*RIRCHPR-HSR5>DPX.QQRTAWAI 3ΟίΛ'?ΚϊϊνθΑ3€ΕΟΑΙϊβΕΜΡΙ35ΐί38053ΆΡν0ΑΐαΧ»ΕΕΕ5Εβ0Κ^Β;νΐ5<:ϊίΗΕί’ΉΚΚ€νϋ PWLHQHRTCPI.CVFÍ3ITEQDS5'SQSlíGE:‘SESi'QEPGaRiKLIEQHPmiAKYKLPAaYXJLG PSRS&VMJPFRPGPFLPSQEPGMGPRHHRFPRA&HFRAPGEQQRttSJSA.QHPYAQGWGMSÍí LQSTSQRPAACPVPLRRARPPDgSQSGKSYCTBRSGyLAPSPASDSSSGPCHGSSSOSW MCTDISLQGVHGSSSTFCSSLSSDFDPLyYCSPKGOPQRVrJMQPSVTfiRPRgIíDSWPTG ETQVSSHVHYHP^íRRHKYKKRPQWHGP-KPGPRTGVPOSRPPJPRTQPQPSPPSPDQQVTG SítSAAPSGRLSKPQCPRALPKPAPGPVOASSICPStSSLFtí-LQKGSLSARHPQRKRReGP SSPrPaSRPODAWHPACQIPPH^TPSVAYPvíSPEjarPi.XCGPPGLEiKRltLPSTPGPCYS KSQPVMI.CE.TPRQPIíEPaPPGSGPSSKSSDYAEGRPCPYPHCQVI^.QPGgSEEl.HS^CS QAV {seq m soa o) (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAPl, STAMPl, STEAP2, STMP, gene 1 associado com cancro da próstata, proteína 1 associada com cancro da próstata, seis antigénios de transmembrana epitelial de próstata 2, seis proteínas de transmembrana da próstata, N° de acesso do Genbank AF455138; Lab. Invest. 82 (11):1573:1582 (2002)); documento WO 2003087306; documento US 2003064397 (Reivindicação 1; Figura 1); documento WO 200272596 (Reivindicação 13; Página 54-55) ; documente ) WO 200172962 (Reivindicação i; Figura 4B); documento WO 2003104270 (Reivindicação 11) ; documento WO 2003104270 (Reivindicação 16); documento US 2004005598 (Reivindicação 22) ; documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); : documento US 2003060612 (Reivindicação 12 ; Figura 10) ; documento WO 200226822 (Reivindicação 23 ; Figura 2); documento WO 200216429 (Reivindicação 12; Figura 10); 154 ΕΡ1725249Β1
Referências Cruzadas: Gl:22655488; AAN04080.1; AF455138_1 490 aa
MSSISÍ^OSPKSLSETVrPÍ-raiKGJKm.SOCVTVQVIGSGDFAKSLTXRIiJRCGyKVVieS l^PttFASEPPPHVVtíOTKHEDArTKlSÍ 1 S*miHS.B£OTiSL»DLRHLI.WKn,SDVSíJiW RI^YPESmEYI^eLFPD3LI\^GFHWSAlíM^LGPKDASaQVTXCSÍÍHIQAHQ0VlÈ LARQLNFIP3 DLGSf SSARB X^ÍLPLRfFTLMGFVWAISJATFFFL YS FVRDVXHPYA RIíQQSDFYKIPIK X VNKTLP XVATTLLSIiVYItkGIiXARAYQIjY Y GTKY RAFPPWÍiETWLO CRKQLQ^FFFMíVHVAYSX-cx.B«ES®RYXiPMfMaYi8QVH&N i emsmmeebvweiemy
1 SFaXMSiiGE.LSLLAVTS 1 PSVSNMJfl^gFS FXQSTI^WALLI STFKVt IYOMKRRFS EBYYF,PYTPFtIFVLALVXjPSIVIIiGKXILFLPCISQKIjKaiKXGWEKSQPIiKEGI<Sí3TIP HVSPERVTVK (SEQ ID MO:11) (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de catião potencial de recetor transiente, subfamilia M, membro 4, número de acesso do Genbank NM_017636); Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98 (19) : 10692-10697 (2001); Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); documento US 2003143557 (Reivindicação 4); documento WO 200040614 (Reivindicação 14; Página 100- 103); documento WO 200210382 (Reivindicação 1; Figura 9A) ; documento WO 2003042661 (Reivindicação 12); documento WO 200230268 (Reivindicação 27; Página 391) ; documento US 2003219806 (Reivindicação 4) ; documento WO 200162794 (Re ivindicação 14; Figuras IA- D) ; 155 ΕΡ1725249Β1
Referências Cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017 63 6_1 12X4 aa
VIíSSGSGGPVLQTWI.QDrrRRGLVPAà.ÇSTGAWIVT-SaLÍÍTCIGRHVGVAVROHQmSTQG
TKVVAMGVAPWGWH3SrR0fí1fHPKGSFPARYR14RGD»SDGVQFPIíDYWYSAFRLVDDGa,H GCI^GBWFRÍ^SSYXSQQKTc^GGTeiDIRVIttJ^IDGOEKMt1TJÍIE3WrGAQÍJPCLl. VAí^fRWiDCIAETtEraTtAeQSaGARQGKMmRrERFFPKGM.RVr^ftQVBRIMTJRKEL·
LTVTSSEDSSBEPEiriVMCM,VK&CGSSSftSA«X!Er5^VAmRVDlAQSBLFR<R>XQM
RSJmEASI^ALLNDR?B?,VRLLI3HCt^LGHPÍjTPMRIi?.QrySAAÍ1SÍJSLlRÍÍI<LDQA
SHSAGTKa.PArKGGAASLaPPDVaHVLRM3,LGÍ®CAE-RyPSG{m5íDPHFCQGFGBSMYLL S^KATSRLSL·DACrGO&P¾SDXΛL·WAliL·MϊAí^^AMyFWEMGSi>^AVSSAlGACM1LRVm
SnEPDi^EAARH^I^PKPEGMGTOrFGSCYRSSEVRAARLLLRRCPLlíGDATCIiOLflJíQ ήΒΑΚΑΡΡΑ0Οθνΰ3ηΓ,ΤαΚΜΐί0εΜΑ3ΤτΡΐΜΑΤνηΑΡ?ΟΡΡΠΥΤΚΠΤΙΗΚ3ΕΕΕΪ'ΤΗΒ
ELEm^VXNGEGP^/GTADFAEK^PLGWRQStmPGCCGGRCSGSRCÍ^RWPHFWGAPV
TlPMGS^WSXflPrLLRSRVLLVSPQPAPFGSLEIiliLYPWAPTtiIiCSSLROSíiSGGGGEL
VPTVIUUI¾IF1%¾KQW5PKIVlVSKt¢í!φ¥S,PFrPPL(3WXJV7^YGVATgGL·IiSPRr)SDPP S2LRRVF^PYI^IFaQIPa®OMDVM^asKCSSSP(3FI'JAHPPGAGA<5TCVSOX?»R-ri.V VLLiíUIFrLVANILL^/KdiLIAMFSYTPGKVQGHSDLYWKAQRYRLIRSFHSRPALAFPFI VI SHIiRIíLLKQLCRRPRSPQPSSPM.RRFlíVYrSKEABRKn.THaSVHKgííFtJiARASDK RSSDSERLKRTSQKVIJIjArKQIjQHiRSYEQRIíKVLERRVGQCSRVJjGWVAEALSRSai^P FGGPFPPDLPGSKO (SEQ £P MOtlRÍ (13) CRIPTO (CR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, N° de acesso do Genbank NP_003203 ou NM_003212); Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); documento US 2003224411 (Reivindicação
1) ; documento WO 2003083041 (Exemplo 1); documento WO 2003034984 (Reivindicação 12); documento WO 200288170 (Reivindicação 2; Páginas 52-53); documento WO 2003024392 (Reivindicação 2; Figura 58); documento WO 200216413 (Reivindicação 1; Páginas 94-95, 105); documento WO 200222808 (Reivindicação 2; Figura 1); documento US 5854399 (Exemplo 2; coluna 17- 18); documento US 5792616 (Figura 2) ; 156 ΕΡ1725249Β1
Referências Cruzadas: MIM: 187395; NP_003203.1; NM_003212_1 138 aa
PRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLílGCSTCMIjdSFCACPPSFYíSRNCEHÍJVRKÍSNCQSVFH ΟΤΜΙ*ΡΚΚα8^ΚΟΪίΗΟθηΕ€ΡΡΟΑΕΤΡ«ΟΕ«3Ι,νΜ»ΚΗΤνΑδΙΪΤΡ^ΡΡ8ΆΚΤΓΤΡΗΙινθΙ
CLBIQSYY CSSQ XD NO:13) (14) CD21 (CR2 (recetor de complemento 2) ou C3DR (recetor de vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, N° de acesso do Genbank M26004); Fujisaku et al. (1989) J. Biol. chem. 264 (4) : 2118-2125) ; Weis J.J. et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M, et al. Proc. Natl. Acad.
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MGÃAâLLGVrLAI.VAPíSVLeiâCeSPPPIUÍGSIS^STetAVGÍTVlRySCSQTFR.LlGE KSLI>CITKDKVi3GTWDK£>APK.CEYFHK¥SSCPEFIVPGOYKÍRGSTPYKHaOSV,rE,ACKT KFSMN^KSTOCQMíKMWGÇ^RLFÍ,CV3VFPI»SCPM,miHHGH£n,S®íríífJSIAÍi<3LSVT ¥SCSSa¥MA^KSIHCIjSSGKHS&WPTCE&&RC^StGRPPM3KVKEPPILRVcmAíJF FCOSGYHXQGPPSSRCVlAOQtSVAW^KW^yCSKIFCPSPFPILKGaKlOKSIAHVSYaSI VTYTCDPDRBBGVN?IX,I0SS,5Rj;|iC,rViPSQJKTfíT5ÍSGÍ?AFRCBI)8TSAVQCFHÍ’Q3:i<ReR MV^<K3KDRYTX®5DT\TI FACKFQFTIjKGSKíJIRCHAQOTWSPSAPVCEKSCQAFEÍíIIiKIGQ KEDRHMVRFDPGTSIKYSCHPerVÍ>V<3KESIQafSSGTOTBÍ>VPQCKyAACEATi3RQLt.T kpqhqfvrfovnsscqbgykiíSgwyqecqqtí: fwfmsi RtaoexTCPS ppviyugahtg
SSLKDFFYGTTVTYTCÍÍPGPERSVBFSLIGESTIRCTSHDQERGTWSGPAFLCKLSLIAV QCSHVHXSSQYKlSGKEAPYFYIÍDWTFKGySGPtLlCÍJSSOlRCXAIBrrWDPBXPVCEKS TC^mmQSIlQBLPAGSRVK£.Vm'SCQmYQÍ.TGÍÍAYQMCQDAÉ5:í<3ÍWFXl<tPIJCÍÍVlHCH FPPVIVÍÍGKHTQíMJi.EííFliYGHEVSYSCDQC3FYX)LGRKKXíCtCRSDSKGHGSMSGPS PQCL RgppOTRCPSFEimM^KiiRiaras&YSHNOiwvDc^papT^GSRVYsaíTiRmíTOGy PTClKKAPlQCF&PPKrPNeSKTGGKIARFSPGMSILYSCDQGYLLVGHAI^LE.CYKSGW SQVhmCl^V^CBBPmm^lQrj^EPJa^QYmS^rrhEC^OGYm.EQSBQSQaQSOm mιmlmrcm^L·Mm^Ih^hIL·mwhτγττL·τ^mmmBmτsmsQVMmmm RKVYSTOPYÈSPAS {SEQ ID ΪΪΟ; 14) (15) CD79b (CD79B, CD79(3, IGb (beta imunoglobulina- associada), B29, N° de acesso do Genbank NM_000626) ou 11038674, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (2003) 100 (7) :4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al. (1992)
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Referências Cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1 229 aa
U&HHC FMNSASGNV S64t>WK.OHMDENKJQ LKfBkGElMEBS QMS SIATLTIQG XR FEJSM&X Y FCÍJQKCNOTSEVYQGCGTEIjRVMGBSTLâQL^imi^KDtíX I MI QTLtIltPI XV?I FLL t-OKDDSK&C^íSS^HfYESLDIDQTATYSaiVTfftTGBVKWSVGSHPOQS ÍSEQ IP HOfISj (16) FCRH2, (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase la) , SPAP1B, SPAP1C, N° de acesso do Genbank NM_030764); Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002),
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MLIiKSIíIiVI FDAVTSQADSLTIiVAPSS VFBGDSI VLKOQf3BQHSÍÍCXQSCMRYHÍQa?KBIjSV fKKFSDFtϊQSAVl.SOSQÍ!ÍYgCSTKΘQLFLWDKTSNIVlα;lWQEL·FÔR&’i/L·tASSífQPIa aaFVSLKCETRLSPQRIiPVQLQFCFFRBSQVtasaWSSSPEDQISAVWSEDÍGSyKCKAE ?VTHRIRI^SIjQSQIHV(piPISWStBIIUVF^VTBGQK£lLI»CSVA^TiKi!VTFSMY S^TGTSMGK^QRSI^J^BIPAVK^SDAOKYÍCRADKGHVPIQSKVWXPVRIWSRÍ' VLTLRSPQaQM.VODtLSXHCEAiaQSSPILYQFYHEPVTtGKSSAPSCSOaaSFKLSLTA ^S^YSOgSSD^I43^CfimWtf$ISGPl^YRBPmTAGVLWi3im^F3S3VMíI^lCa LFBKISSES^'mKPRSASaE^I^BFTYSSFrPt^EBMJP1iirsrVKVGS,VPVDVVXSQyKSi» QQPESSísHIRTtltEKIKDSQVIYSSVKKS (SSQ IO Mj:IS} (17) Coussens L Yamamoto T, al. Proc. HER2 (ErbB2, N° de , et al. Science ( et al. Nature 319, Natl. Acad. Sei. acesso do Genbank M11730. 1985) 230(4730): 1132-1139; 230- 234, 1986; Semba K., et USA. 82, 6497-6501, 1985; 159 ΕΡ1725249Β1
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Referências Cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM__052945_1 184 m
WRRGPHSLEQHDAPAPTPCVPAECFDLLVKHCVAcarLRTPRPKPAQASSPAPiRTALQPQ g$VGAOAGEa^PDPGUíS'OAtftLIíGlALVnAI.VUVGLVSWRaRgKSJíRaASSAEAPD>E50 KBAPBPLDKVIII.SPeiSEiATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTBt.VrntTAa
PEQQ (SEG !D 110:26}
(27) CD22 (isoforma de de acesso do Genbank NP_0017 B., Nature 345 (6270), 2003157113; documento US
recetor de célula B CD22-B, N° 62.1); Stamenkovic, I., e Seed, 74-77 (1990); documento US
2003118592; documento WO 167 ΕΡ1725249Β1 2003062401 (Reivindicação 9); documento WO 2003072036 (Reivindicação 1, Figura 1) ; documento WO 200278524 (Exemplo 2);
Referências Cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1 847 aa NPBYHXm-SKPDGTI^Y^TKDGKVPSEQICRVQFtGDKSíaMOTtSIHF-VHLaDSGQLGIJi
iMESKTEKímBftlKnNVSEHFFPPHIQIíFPEIQESgSVTL-TCLLHFSCYGYFIdnQWLLaG νΐ?ΜΡ0ΑΑνΤ3Τ51ΤΧΚ3νΡΤΡ3®ηκ^3Ρ0Η«ί«αΜντθαηΰΠΑΙ3αχ^δΚ35Τν<ϊί^νΚΚ
TPKLSXí^TPSmiVKBOOSVrwrCWSSSNPEYrrVSWtKE!GTSLlaeQBTrfnNI.REVT ΪΦ08αΚΥϋσον3Μ)ν3ΡδΒ3ΕΕ¥Κ.όνφ£&ΡΒ®δΐνΏΙΙ1Η3ΡΑν®Ο30[«1?ΙΛ3ί8Χ*Μ3Ρί(
FríiyTWíKNGKEMQGSTEBiCVHIPKlIjEWHÍWSTYSCVAElJIliGTOQRQPGAM.DVQYPPIC
KSrrmí^P*^XRB®aTVTl^C^3SHP3VTRírS(^H^MSBPSLG^^QKVS»gKT
TmcaaCJffSWCSBASPVMWQYAPía^VRVlíKIÍ^I^BIHSGSS^SLQCDFSSSKPKEVQ ΡΡΒΕΚϊΐαΐίΙίΧ3ΧΒ30ΡϊΤη>3Ι3ΡΕΤ>Αα3Υ3€5ίνΝΝ3ΐααΤΑΒΚ?ίΜΤΒΚ,Μ,νΑΡβΚΒΒνΒΜ
SPGDQVMBGKSATtTCESDANPPVSHlíTOFnHiJNQSLPHHSQKlittLBPVKVQKSGA^fífCQ <^8νακα»3Ρ3^δ1Χ.τνΤίΎδΡΕΤΙΟΪξ^Αν3Ι^3ΟΒΑΧϊ,ΙΧΑΙθα^Κί^Β»»ΙίΒΤ08003
XQ^íSSGOSFFVESKKVRIiAPtSEaPHSI^CXKPMKEDGISTm-tRppE^XPRTCPASS
SEMQRPPETCDOTVTYSA^HBSQVtaJYEHWIPDFPECgeXHXSgtXQFGVGSRPQAQBBV
DYVILjKH (SBQ ID SO:27> (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa imunoglobulina- associada, uma proteína específica de célula B que interage covalentemente com lg beta (CD7 9B) e forma um complexo na superfície com moléculas lg M, faz a transdução de um sinal envolvido na diferenciação de célula B) SEQUÊNCIA DA PROTEÍNA completa mpggpgv...dvqlekp (1..226; 226 aa) , pl:4.84, PM:25028 TM:2 [P] Gene Chromosome: 19ql3.2, N° de acesso do Genbank NP_ 001774.1;
Documento WO 2003088808, US 20030228319; documento WO 2003062401 (reivindicação 9) ; documento US 2002150573 (reivindicação 4, páginas 13-14); documento WO 9958658 (reivindicação 13, figura 16); documento WO 9207574 (Figura 1) ; documento US 5644033; Ha et ai. (1992) J. Immunol. 148 (5) :1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 168 ΕΡ1725249Β1 40(4):287- 295; Preud'homme et al. (1992) Clin. Exp.
Immunol. 90(1) :141-146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7 (11) : 3457-3464; 226 aa
,N»nn^RVI,HCíHYT«?pSFmpGEDPHG^IIWMKSHGQXWCRVQB<3NESYQQSGG
SYEDEmYSGtNI^DCSMYKDISRGt.QGTÍQIJVaSJaiIGDVQI.EKP CSKQ XO HOj28í (29) CXCR5 (recetor 1 de linfoma de Burkitt, um recetor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócito e defesa humoral, possui um papel na infeção por VIH-2 e talvez no desenvolvimento de SIDA, linfoma, mieloma, e leucemia) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mnypltl ... atslttf (1..372; 372 aa), pl:8,54 MW:41959 TM: 7 [P] Gene Chromosome: llq23.3, N° de acesso do Genbank NP_001707.1);
Documento WO 2004040000; documento WO 2004015426; documento US 2003105292 (Exemplo 2); documento US 6555339 (Exemplo 2); documento WO 200261087 (Figura 1); documento WO 200157188 (Reivindicação 20, página 269); documento WO 200172830 (páginas 12-13); documento WO 200022129 (Exemplo 1, páginas 152-153, Exemplo 2, páginas 254-256); documento WO 9928468 (reivindicação 1, página 38); documento US 5440021 (Exemplo 2, col 49-52); documento WO 9428931 (páginas 56-58); documento WO 9217497 (reivindicação 7, Figura 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779); 169 ΕΡ1725249Β1 372 aa ΜΝΥΡ^Ί^^Ι.βϊ·ΪΙ^Ι^Ρ^^ΟΕ^Ο!^^ΐ:Β&νΒ5ίΗ£.α$>ΑΤΕα!>Ι1.1Α5ΐΚΛνΕινΡνΤίΥ£Ι.
I Υ)^νΐαϊ^ΥΙ.νΐϊ>Εϊ^ί^^«ίΒ$Ρ&™ϊΑνΑ01^νΡΪΙ,Ρ^Αν»®ι33Υΐϊ»Υϊί(5Τ? Ι^ΚΤΥΙΑ^ΗΚΜΥ¥ΰάδϊ.Ι^€ΙΑ^Κ.ΐη^ΑΐνΗ&νΐΛ¥ΗΚΗΪΕΪίΣ,3ΣΗ1Τα<3ΤΧΜΙίνδΡϊΛ ALPEIL^AJWSQGHKííSSljÇívCTFSClEííQíiBTHAWFTSP^FIiYtlVAGFLLPMLVMGWCYVG V^mHQAQRRPQROKAVRVAILVYSlFFI^SPYHI^/lFLDTIAPXJ^VDSTCKIj^SL PVAImCEFΪíαXΛRKCCr^P^1LYYFA<r^n^SO^RXL·mJ<SCT¾!eASI.CQlíFI>SVfRRS$L BRBEmXSUFSW iBMQ ID 1*0:29) (30) HLA-DOB (subunidade beta de molécula MHC classe II (antigénio la) que se liga a péptidos e os apresenta aos linfócitos CD4+ T) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mgsgwvp . . . vllpqsc (1..273; 273 aa, pl: 6.56 PM:30820 TM: 1 [P]
Gene Chromosome:6p21.3, número de acesso do Genbank NP_002111.1) ; Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839- 2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29 (6) :411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433- 441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 99:16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al. (2002)
Tissue Antigens 59:512-519; documento WO 9958658 (reivindicação 13, Figura 15) ; documento US 6153408 (Col 35-38); documento US 5976551 (coluna 168-170); documento US 6011146 (coluna 145-146); Kasahara et al. (1989)
Immunogenetics 30(l):66-68; Larhammar et al. (1985) J.
Biol. Chem. 260(26):14111-14119; 273 aa
MGSGWW5WWAM.Vl!a,TRIBSS}4TQG®3SPEDFVIQAKM}CyFOT3T2KyQFWRFIFHL
eEYVRFDSOVaMFV)UiTfa^PDAEQ^Sim5LI^SRÇAm>©VC8HKYRLGaPrrVGKK VQFEVTVYPESTFMjHQEQíliIiHCSVTGFYPgDXKIKWFLÍjGQEERAôVMSiraPIRÍíSDífr FQTVt^,EMTPSÍJí3H^Cl.VPHSStIíSPVsVEWkRQSBYSMRKKt,SOlAAFIIW3tIFLL·
VSIVI OLHAQKGYVRTÇ^SGSlEVSRRVl,LPOSC (31) P2X5 (canal 5 de ião de ligando fechado P2X de recetor purinérgico, um canal de ião fechado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogénese, deficiência pode contribuir para a fisiopatologia de instabilidade de detrusor idiopático) 170 ΕΡ1725249Β1 SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mgqagck.Jephrst (1..422; 422 aa) , pl:7,63, PM:47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome:17pl3.3, N° de acesso do Genbank NP_002552.2;
Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1-2): 195-199; documento WO 2004047749; documento WO 2003072035 (reivindicação 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165-173; documento WO 200222660 (Reivindicação 20); documento WO 2003093444 (Reivindicação 1); documento WO 2003087768 (Reivindicação l) ; documento WO 2003029277 (página 82); 422 aa MGÍ^GCKGLCLS t FDYKTEKYVlAJKNKKVGI^YRLLOAS I LAYtYVWFklKKGYQDVm·
NBGIPDGACSKDSDCmQEAVTAGÍTGVKTGRCLRIlSNIARGTCEIFAWCPLBTSSRPEEP
?LKKAEDFTIFlKmXSFPKFÍ-ÍFSKSKVM0V1KJaRS?l.KSC8PGPKÍíKYCPIFRLGSVtRW
M3Sr)PÔ£>2ATSGt3VIGISlPS<fííCDIJaKAASECRPHy3F3ftLr)K8XSKSVSSayjIFRPARY
YRDAAGVKFRTLMKJiYGIR.FDVMVNGIKjAFFCDLVLXYt.IKKRSnfRDKÍCirEBVRGXEDS SQSA®3BASGUGLSSQI,TSQPSIá»GMPEC!QSfcqBPPÊA}tft<3SSâQkGiiJGSVC&QLI.SPHft
ST <S2Q ID HGí3X> (32) CD72 (antigénio de diferenciação de célula B CD72, Lyb-2) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa) , pl: 8,66, PM: 40225 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 9pl3.3, N° de acesso do Genbank NP_0 017 7 3.1);
Documento WO 2004042346 (reivindicação 65); documento WO 2003026493 (páginas 51-52, 57-58); documento WO 200075655 (páginas 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144 (12) : 4870-4877; Strausberg (2002) Proc. Natl. Acad. Sei USA 99:16899-16903; 359 aa
0ΚΑΑνΈ^Ε«ΡΤΑ®ΜΚΑ^β&ΑνόΒΧΕΡ€^ΊΤΟΛΪΧ1Ιι(3Χ^Ταιΐα^νΤΑΐα«ι3νΚΥΕό VSQQX^®tíXRVLSVFÍ3SS3JtQQLM,iaTQLGQSAHDLQGSRRSXíAQSQEAI.QV8QÍ»HQA AEGCLQACQADRQKTX3,H,QS3EQQRRALEQKl1SHKENRI.-.íCPFFX'CGSAI5TCCPSG;‘?IMH QKSCRY ISLTSKi^RSaKiSCETXS SKJATFSai^PQSRSYYFLÍJSLt.PWGGSÔIÍS WXb líSSKKDWKIjTDSTqiltTRTV&QSSKCNIWHKrWSWíjfTIiESESCRSSIsPYICSMTAFRFPD (SEQ ID ííO:32) 171 ΕΡ1725249Β1 (33) LY64 (antigénio de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica de leucina (LRR), regula a ativação de célula B e apoptose, perda de função está associada com atividade aumentada de doença em pacientes com eritematose de lúpus sistémico) SEQUÊNCIA de PROTEÍNA completa mafdvsc...rwkyqhi (1 ..661; 661 aa) pl:6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 5ql2, N° de acesso do Genbank NP_005573.1; documento US 2002193567; documento WO 9707198 (reivindicação 11, páginas 39-42);
Miura et al. (1996) Genomics 38 (3) : 2 99-304; Miura et ai. (1998) Blood 92:2815- 2822; documento WO 2003083047; documento WO 9744452 (Reivindicação 8, páginas 57-61); documento WO 200012130 (páginas 24-26); 661 aa
fiAFSVSCFFWVrFSAGCKVlTâífOQÍíCIEiKEANKTÍSlCEitíLíjLSEIPÍJTL&MlrrEMiííF
I^PKSI,ÍÍ^PLigTGISKI1EFIPVHKXíBKI.SSI.YLGSÍ?HISSIKFPKDFPARÍÍ£lKV,H3F
aTJgHSTTQ31<WTJ3T?EDID£3EDiaSAMLÍ0St.CE«SVBSl,BrQEHaFSDlS3'CTFQCPTQL
QBLDLTATHLKGH^SG^KGLKLtKKkVX^WHFQQLCQXSWySIFPSLinirYIRGtlVKKLH pgD(3^TKTm,tQWGSLWLXLSí3COrLSIDQQAFHSLG>ttíSHVt3LSHÍÍ5tTCDSII3Sr 5ΗηΚ5ϊΥ1ίΚΥΜίί3ΙΝΙΙ3ΡΚΚίΡΙΙ,50Ο3ΤΙΗΙ)8ΗΗΡ^ΟΟΤΟ3ΪΙΧΗΡ£ιΤΤ4ΤΚΕ!ίηΗΚ1;Ε
GSESYTCÍ^PStRG^fKIíSD^/ja»SCSXmií3XF?tí2Vrri.rrAIÍ*rFPAVKYIY1RWKyQH Ϊ C3HQ XD KOs33) (34) FCRH1 (proteína 1 tipo recetor Fc, um recetor putativo para o domínio de imunoglobulina Fc que contém domínios C2 tipo similar a lg e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de linfócito B) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mlprlIL.vdyedam (1..429; 429 aa); pl:5,28, PM:46925 TM:1 [P] Gene Chromosome: Iq21-lq22, N° de acesso do Genbank NP_443170.1) ;
Documento WO 2003077836; documento WO 200138490 (reivindicação 6, Figuras 18E- 1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98 (17):9772-9777; 172 ΕΡ1725249Β1 documento WO 2003089624 (reivindicação 8); EP 1347046 (reivindicação 1); documento WO 2003089624 (reivindicação 7) ; 429 ââ ΜΧ»£1ΙΪ1,Χ,5,ϊ<Ι0Α:Ρΐί0ΒΪΆ8Ι.Ρ,ΤΙΑ3Ρ3ΒΡΤΚ<33ΡνΤΙ.Τ€ΚΜΡΡ«333ΟΑ0Ρβ^^£?ϋΕ>ΤΗΑ.
U3vma$ S PKi^IAÍWHSBD^SYWCKAQTMASKVIlasa«SQIímíRVt>VAOVSíiEtQPP
SGQV^geDRtVtlCSVftmSmítTPtWVÍOaAVGLHIíQSK^QRSLTASYEIPSVHaSDAEQ
VTCVj^SYGPSPSGI,V5ITraXPVSRPII^5^RAQARVBE^Bl>HCEAI.«GSPPII»Y
VíFYSSDXTI.mRSftP3GKXi^PHt»SIjTBEKe<^nrSCEAi«JGtGaORSEAVmiFTVP,i,QA
RSKlKiTSSVX£G2^1^P%T^^FC¥GLBSKXSRRSAEÍDPLRS£>PSPX.FQBF'm>l3SF
^PGQI.QPXVKÍíVKVVSGDEVy3LA¥YlíQPBQBSVAASTI.GTKMEOínrstDlVS$Ujl!jKftÍÍX
TDVDYEDM ÍSEQ XD ISO s 34) (35) IRTA2 (translocação de recetor da superfamília imunoglobulina associada 2, um imunorrecetor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento da célula B e linfomagénese; desregulação do gene pela translocação ocorre em algumas malignidades de célula B) SEQUÊNCIA DE PROTEÍNA completa mllwviL.assaphr (1.977; 977 aa) , pl:6.88 PM:106468 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1 q21, N° de acesso do Genbank NP_112571.1; documento WO 2003024392 (reivindicação 2, Figura 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 277(1 ):124-127; documento WO 2003077836; documento WO 200138490 (reivindicação 3, Figuras 18B-1-18B-2); 173 ΕΡ1725249Β1 977 m M&Mvi^im&i?vsGQmR?BR$ixFi®vpmrvF^mvTLTcmmF¥si^Kxstmm
Yl^KKILaKT^DmXKVOHSGKYÍtCQAQGSPI^âPVHMíFSSASI-ILaiiW.SVPSeDSVV UÍCRAKAEVTr,lÈ3?MT XYimíWIAFIJJKPTOPHI PHACT^NGAYRCTdYKSSCC PV3SSJT VKlQVQKPFTRPVI.RASSFQPlSSNPVTt.TCBT^iCíS&ETiSOVPLKFRFFRDDQTIiGX.GWS J^PKFQXTJS^ãirosíSFYwaaúmíFHSVXSOSPHSWIQroXPASHPV&TI^PSRftiaiFS STÍCVTLHCEX^EaSLRTr.VRFYHEGVPI.ÍUÍKSTOCE1ÍGASISFSLTTEI?SQiEíVYCTADlí(í liSAKPSmVSÍiSVT νΡ^ΗΡνΐ^33ΡΕ£!ί< ÍFEGAKVT£«HCEAQR13SIjP XL¥0£HHEOAA Ι.βΗΡ.3£Ηί^Ο^ΑΙΒΡ5^ΑΕΗ3£3ΪΓΤΪ€ΤΜΗ!ΐ&ΡαραΚ3ΚΑν3Ιι£ΙΤνρν£ϊϊΡν£.Τίί33Α EaiíTS^^TWTOJCEVSRQSSQIMQFXHEDÍÍPIjW^SSTPSVQRVSPSPSIíTEÊSaSOMVy CTAÍ^FSPQRSEWSLFWTVFVSR.PXI»TI1KVPRAQAVVGOLIJSI1HCmPR{5SPPlX,YWF YHEDVTLGSSSAPSGGEASFSÍLSLTAEHâGHYSCHAimGIiVAQHSDTISliSVIVpVSRPI S.TFRAPmQAWG^LI^LHCESIíRQSSPXLYWFYHEOVTIjGKXSAPSGQCSaSFmiSX.TTE HSaiYSCEÍU>K(3PEÍ^R3mVTJLKyAVPV3RFyXTLRAPGTMAAVGBI.ZIgI,HCEAtRGRP t.tIiYRPFMDVY&^^gpSaaa!SI^SÍ.13lEHSfiOTSCEADNSLea^RSeT!miYITaií t^í^GPPATf^&GGtRLSIM.X^GM^YCWl&R&AGRKPAStPAKSPPBaDSÇRPTYH íWPAÍffiEI^PVY^HANpSGl^íWYSBVRXXQSKKKaAVASDPRmMíKGSPÍXYSEVKm STPVSesiiPIASSAPiíR ÍSSÔ IB NO;35)
Veja-se também: documento W004/045516 (03 de Junho de 2004); documento W003/000113 (03 de Janeiro de 2003); documento W002/016429 (28 de Fevereiro de 2002); documento WO02/16581 (28 de Fevereiro de 2002); documento WO03/024392 (27 de Março de 2003); documento W004/016225 (26 de
Fevereiro de 2004); documento W001/40309 (07 de Junho de 2001); e Pedido de Patente Provisória US N° de Série 60/520842 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TUMOR OF HEMATOPOIETIC ORIGEN" depositada em 17 de Novembro de 2003; todos os quais são incorporados no presente documento por referência em sua totalidade.
Numa forma de realização, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a Fórmula Illa, onde o Ligando é um anticorpo Ab incluindo um que se liga a pelo menos um antigénio dentre CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w=0, y=0, e D
possui a Fórmula lb. Conjugados Exemplares de Fórmula Illa estão incluídos onde R17 for -(CH2)s-. Estão também incluídos estes Conjugados de Fórmula Illa nos quais D 174 ΕΡ1725249Β1 possui a estrutura do Composto 2 no Exemplo 3 e ésteres do mesmo. Também estão incluídos estes Conjugados de Fórmula Illa contendo cerca de 3 a cerca de 8, num aspeto, cerca de 3 a cerca de 5 frações de fármaco D, isto é, Conjugados de Fórmula Ia onde p é um valor no intervalo de cerca de 3- 8, por exemplo, cerca de 3-5. Conjugados contendo combinações das características estruturais observadas neste parágrafo são também consideradas como dentro do âmbito dos compostos da invenção.
Numa outra forma de realização, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a Fórmula Illa, onde Ligando é um Anticorpo Ab que se liga a um dentre os antigénios CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w=l, y=0, e D tem a Fórmula lb. Estão incluídos estes Conjugados de Fórmula Illa nos quais R17 é —(CH2)5-. Estão também incluídos estes Conjugados de Fórmula Illa nos quais W é -Vai- Cit-, e/ou onde D tem a estrutura do Composto 2 no Exemplo 3 e ésteres do mesmo. Estão também incluídos os Conjugados de Fórmula Illa contendo cerca de 3 a cerca de 8, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 5 frações de fármaco D, isto é, Conjugados de Fórmula Ia onde p é um valor no intervalo de cerca de 3-8, preferivelmente cerca de 3-5. Conjugados contendo combinações das características estruturais mencionadas neste parágrafo são também exemplares.
Numa forma de realização, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando possui a Fórmula Illa, onde o Ligando é um Anticorpo Ab que se liga a um dos antigénios CD30, CD40, CD70, Lewis Y, w=l, y=l, e D tem a Fórmula lb. Estão incluídos estes Conjugados de Fórmula Illa nos quais R17 for —(CH2) 5—. Estão também incluídos estes Conjugados de Fórmula Illa onde: W é -Val-Cit-, Y tem a Fórmula X; D tem a estrutura do Composto 2 no Exemplo 3 e ésteres do mesmo; p é cerca de 3 a cerca de 8, preferivelmente cerca de 3 a 175 ΕΡ1725249Β1 cerca de 5 frações de fármaco D. Conjugados contendo combinações de características estruturais mencionadas nestes parágrafos são também consideradas dentro do âmbito dos compostos da invenção.
Uma forma de realização adicional é um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC), ou um sal ou solvato f armaceut icamente aceitável do mesmo, onde Ab é um anticorpo que se liga a um dos antigénios associados com tumor (1) - (35) mencionados acima (o "Composto TAA").
Uma outra forma de realização é o Composto TAA ou sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo que está na forma isolada e purificada.
Uma outra forma de realização é um método para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena que compreende a administração a um paciente, por exemplo, um ser humano com uma distúrbio hiperproliferativa, de uma quantidade do Composto TAA ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, a referida quantidade sendo efetiva para destruir ou inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena.
Uma outra forma de realização é um método para o tratamento de cancro que compreende a administração a um paciente, por exemplo, um ser humano com uma distúrbio hiperproliferativa, de uma quantidade do Composto TAA ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, a referida quantidade sendo efetiva para tratar cancro, sozinha ou juntamente com uma quantidade eficaz de um agente anti-cancro adicional.
Uma outra forma de realização é um método para tratar uma doença autoimune que compreende a administração a um 176 ΕΡ1725249Β1 paciente, por exemplo, um ser humano com uma distúrbio hiperproliferativa, de uma quantidade do Composto TAA ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, a referida quantidade sendo efetiva para tratar uma doença autoimune.
Os anticorpos adequados para utilização na invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em especial, por síntese química ou por expressão recombinante, e são preferivelmente produzidos por técnicas de expressão recombinante.
4.5.1 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS RECOMBINANTES
Os anticorpos da invenção podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica que seja útil para a síntese de anticorpos, em especial, por síntese química ou por expressão recombinante. A expressão recombinante de anticorpos, ou fragmento, derivado ou análogo dos mesmos, requer a construção de um ácido nucleico que codifique o anticorpo. Se a sequência de nucleótido do anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (por exemplo, conforme descrito por Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que envolve a síntese de oligonucleótidos sobrepostos contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, associação e ligação daqueles oligonucleótidos, e então amplificação dos oligonucleótidos ligados, por exemplo, por PCR.
Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo pode ser gerada de uma fonte 177 ΕΡ1725249Β1 adequada. Se um clone contendo o ácido nucleico que codifica o anticorpo especifico não estiver disponível, mas a sequência do anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de ADNc do anticorpo, ou biblioteca de ADNc gerada de qualquer tecido ou células que expressam a imunoglobulina) , por exemplo, por meio de amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as extremidades 3' e 5' da sequência ou por meio de clonagem usando uma sonda de oligonucleótido específica a sequência de gene específica.
Se um anticorpo que especificamente reconheça um antigénio particular não estiver comercialmente disponível (ou uma fonte para uma biblioteca de ADNc para clonagem de um ácido nucleico que codifica esta imunoglobulina) , anticorpos específicos para um antigénio especifico podem ser gerados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por imunização de um paciente, ou modelo animal adequado tal como um coelho ou ratinho, para gerar anticorpos policlonais ou, mais preferivelmente, pela geração de anticorpos monoclonais, por exemplo, conforme descrito por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495-497) ou, conforme descrito por Kozbor et al. 91983, Immunology Today 4:72) ou por Cole et al. (1985 no Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96). Alternativamente, um clone que codifica pelo menos a fração Fab do anticorpo pode ser obtido por rastreio de bibliotecas de expressão de Fab (por exemplo, conforme descrito por Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se ligam ao antigénio específico ou por rastreio de bibliotecas de anticorpos (Veja-se, por exemplo, Clackson et al., 1991 Nature 352:624; Hane et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4937) . 178 ΕΡ1725249Β1
Após uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos o domínio variável do anticorpo ser obtida, ela pode ser introduzida num vetor contendo a sequência de nucleótido que codifica as regiões constantes do anticorpo (veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional N° WO 86/05807; documento WO 89/01036; e Patente US N° 5122464). Estão disponíveis vetores contendo a cadeia leve ou pesada completa, que permite a expressão de uma molécula de anticorpo completa. Então, o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser usado para introduzir as substituições de nucleótido ou deleção necessária para substituir (ou deletar) um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam de uma ligação de bissulfeto intracadeia com um resíduo de aminoácido que não contém um grupo sulfidilo. Estas modificações podem ser executadas por qualquer método conhecido na técnica para a introdução de mutações ou deleções especificas numa sequência de nucleótido, por exemplo, mas não limitadas a mutagénese química e mutagénese direcionada por local in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551).
Além disso, podem ser usadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) por junção de genes de uma molécula de anticorpo de ratinho de uma especificidade de antigénio apropriada, juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual porções diferentes são derivadas de espécies animais diferentes, tais como aquelas que tem uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal de murino e uma região constante de imunoglobulina humana, por exemplo, anticorpos humanizados. 179 ΕΡ1725249Β1
Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente US 4.694.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei USA 85:5879- 5883; e Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única. Anticorpos de cadeia única são formados pela ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácido, resultando num polipéptido de cadeia única. Técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli podem também ser usadas (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, estes fragmentos incluem, mas não se limitam aos fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão de pepsina da molécula do anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes de bissulfeto dos fragmentos F(ab')2·
Após uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo ter sido obtida, o vetor para a produção do anticorpo pode ser produzido por tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica. Métodos que são bem conhecidos por aqueles especializados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contenham as sequências que codificam o anticorpo e sinais de controlos de transcrição e tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Veja-se, por exemplo, as técnicas descritas por Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) e Ausubel et al. (eds, 180 ΕΡ1725249Β1 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
Um vetor de expressão que compreende a sequência de nucleótido de um anticorpo, ou a sequência de nucleótido de um anticorpo pode ser transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais (por exemplo, eletroporação, transfecção lipossómica, e precipitação de fosfato de cálcio), e as células transfectadas são, então, cultivadas por técnicas convencionais para produzir o anticorpo. Em formas de realização especificas, a expressão do anticorpo é regulada por um promotor especifico constitutivo, indutivel ou um tecido.
As células hospedeiras usadas para expressar o anticorpo recombinante podem ser tanto células bacterianas como Escherichia coli, como, preferivelmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de imunoglobulina recombinante integral. Em especial, células de mamíferos tais como células do ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o elemento promotor principal intermediário de gene inicial de citomegalovírus humano é um sistema de expressão efetivo para imunoglobulinas (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar os anticorpos de imunoglobulina. Estes sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos através dos quais as sequências de codificação do anticorpo podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleótido apropriadas, podem expressar uma molécula de imunoglobulina de anticorpo in 181 ΕΡ1725249Β1 situ. Estes incluem, mas não se limitam a micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de ADN de bacteriófagos recombinantes, ADN de plasmideo ou ADN de cosmidio contendo sequências de codificação de imunoglobulina; fermento (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformado com vetores de expressão de fermento recombinantes contendo sequências de codificação de imunoglobulina; sistemas de célula de inseto infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo as sequências de codificação de imunoglobulina; sistemas de células vegetais infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor (CaMV) e vírus mosaico de tabaco (TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmideo recombinantes (por exemplo, plasmideo Ti) contendo as sequências de codificação de imunoglobulina; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, células COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3) que ancoram construções de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor de vírus vacínia 7,5K).
Em sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionada dependendo da utilização destinado para o anticorpo que está a ser expresso. Por exemplo, quando uma grande quantidade desta proteína deve ser produzida, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são prontamente purificados devem ser desejáveis. Estes vetores incluem, mas não se limitam ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), nos quais a sequência de codificação do anticorpo pode ser 182 ΕΡ1725249Β1 ligada individualmente no vetor na estrutura com a região de codificação de lac Z, de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); e similares. Vetores pGEX podem também ser usados para expressar polipéptidos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). No geral, estas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas pela absorção e ligação a uma matriz de contas de glutationa-agarose seguidas por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são designados para incluir locais de clivagem de protease de trombina ou fator Xa, de modo que o produto de gene alvo clonado pode ser libertado da fração GST.
Num sistema de inseto, vírus poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) ou o virus análogo de Drosophila melanogaster é usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais do vírus (por exemplo, o gene poliedrina), e colocada sob controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliedrina).
Em células de hospedeiros de mamífero, uma série de sistemas de expressão baseados em vírus pode ser utilizada. Em casos onde um adenovirus é usado como um vetor de expressão, a sequência de codificação do anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovirus, por exemplo, o promotor tardio e sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode, então, ser inserido no genoma do adenovirus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virótico (por exemplo, região EI ou 183 ΕΡ1725249Β1 Ε3) resulta num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de imunoglobulina em hospedeiros infestados, (por exemplo, veja-se Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:355-359) . Sinais de iniciação específicos podem também ser requeridos para tradução eficiente de sequências de codificação de anticorpo. Estes sinais incluem o codão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Além do mais, o codão de iniciação deve estar em fase com a estrutura de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução da inserção inteira. Estes sinais de controlo de tradução exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência de expressão pode se aumentada pela inclusão de elementos intensificadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (veja-se Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Além disso, uma estirpe de célula hospedeira pode ser escolhida para modular a expressão das sequências inseridas, ou modificar e processar o produto de gene da maneira específica desejada. Estas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) dos produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos de gene. Linhas de célula apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a modificação correta e processamento da proteína estrangeira expressa. Com este fim, células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para processamento apropriado da transcrição, glicosilação, e fosforilação primárias do produto de gene podem ser usadas. Estas células hospedeiras de mamífero incluem, mas não se limitam 184 ΕΡ1725249Β1 a, CHO, VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, CRL7030 e Hs578Bst.
Para produção de longa duração e alto rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhas de célula que expressam de forma estável um anticorpo podem ser engenheiradas. Ao invés de usar vetores de expressão que contenham origens viróticas de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com ADN controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, locais de promotor, intensificador, sequências, transcrição, terminadores, poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Após a introdução do ADN estrangeiro, células engenheiradas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido, e então são mudadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que células integrem de forma estável o plasmídeo em seus cromossomas e cresçam para formar foci que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas de célula. Este método pode vantajosamente ser usado para engenheirar linhas de célula que expressam o anticorpo. Estas linhas de célula engenheiradas podem ser especificamente úteis no rastreio e avaliação de antigénios de tumor que interagem diretamente ou indiretamente com o anticorpo.
Uma série de sistemas de seleção pode ser usada, incluindo, mas não limitada a cinase de timidina de vírus de herpes simples (Wigler et ai., 1977, Cell 11:223), fosforibosil transferase de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202), e genes de fosforibosil transferase de adenina (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) podem ser utilizados em células tk-, hgprt- ou aprt-, respetivamente. Também, resistência 185 ΕΡ1725249Β1
antimetabolito pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: DHFR, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:357; 0'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu, 1991,
Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573- 596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann Rev. Biochem. 62:191-217; Maio, 1993, TIB TECH 11(5): 155-215) e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147) . Métodos comummente conhecidos na técnica de tecnologia de ADN recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al., (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics,
John Wiley & Sons, NY; Colberre-Gerapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1).
Os níveis de expressão de um anticorpo podem ser aumentados por amplificação de vetor (para uma análise, veja-se Bebbington e Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in ADN cloning, vol. 3. (Academic Press, Nova York, 1987)) . Quando um marcador no sistema de vetor que expressa um anticorpo é amplificável, um aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Visto que a região amplificada está associada com a sequência de nucleótido do anticorpo, a produção do anticorpo irá, 186 ΕΡ1725249Β1 também, aumentar (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257) . A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão, o primeiro vetor que codifica um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que permitem expressão igual de polipéptidos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um vetor único pode ser usado para codificar tanto polipéptidos de cadeia pesada quanto de cadeia leve. Nestas situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar excesso de cadeia pesada isenta de tóxico (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2197). As sequências de codificação para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.
Após o anticorpo ter sido expresso de forma recombinante, ele pode ser purificado usando qualquer método conhecido na técnica para purificação de um anticorpo, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iónica, afinidade, especificamente por afinidade para o antigénio especifico após Proteína A, e cromatografia de coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas.
Em ainda uma outra forma de realização exemplar, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
Em qualquer caso, os anticorpos híbridos têm uma especificidade dupla, preferivelmente com um ou mais locais de ligação específicos para o hapteno de escolha ou um ou mais locais de ligação específicos para um antigénio alvo, 187 ΕΡ1725249Β1 por exemplo, um antigénio associado com um tumor, uma doença autoimune, um organismo infecioso, ou outro estado de doença.
4.5.2_PRODUÇÃO DE ANTICORPOS A produção de anticorpos será ilustrada com referência a anticorpos anti-CD30, mas ficará aparente aos peritos na especialidade que anticorpos para outros membros da família do recetor TNF podem ser produzidos e modificados de maneira similar. A utilização de CD30 para a produção de anticorpos é apenas exemplar e não objetiva ser limitativo. 0 antigénio CD30 a ser usado para produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de CD30 ou uma fração do mesmo, contendo o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam CD30 em suas superfícies de célula (por exemplo, L540 (linha de célula derivada de linfoma de Hodgkin com um fenótipo de célula T) e L428 (linha de célula derivada de linfoma de Hodgkin com um fenótipo de célula B)) podem ser usadas para gerar anticorpos. Outras formas de CD30 úteis para gerar anticorpos ficarão aparentes aos peritos na especialidade.
Numa outra forma de realização exemplar, o antigénio ErbB2 a ser usado para produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de ErbB2 ou uma fração do mesmo, contendo o epítopo desejado. Alternativamente, células que expressam ErbB2 em suas superfícies de célula (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobre-expressar ErbB2; ou uma linha de célula de carcinoma tal como células SK-BR-3, veja-se Stancovski et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 : 8691-8695 (1991)) podem ser usadas para gerar anticorpos. Outras 188 ΕΡ1725249Β1 formas de ErbB2 úteis para gerar anticorpos ficarão aparentes aos peritos na especialidade. (i) Anticorpos Policlonais
Anticorpos policlonais são preferivelmente criados em animais através de múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante a uma proteina que seja imunogénica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina do molusco "keyhole", albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivador, por exemplo, maleimidobenzoil sulfossuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeido, anidrido succinico, SOCI2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos, ou derivados pela combinação, por exemplo, de 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respetivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e por injeção da solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês após os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em vários locais. Sete a 14 dias depois os animais são sangrados e o soro é analisado para titulação de anticorpo. Os animais são reforçados até o platô da titulação. Preferivelmente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugados com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Conjugados também podem ser feitos em cultura de célula recombinante como fusões de proteína. 189 ΕΡ1725249Β1
Também agentes de agregação tais como alume são adeguadamente usados para aumentar a resposta imunológica. (ii) Anticorpos Monoclonais
Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades mínimas. Dessa maneira, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feito pelos métodos de ADN recombinantes (Patente US N° 4816567) .
No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado como descrito no presente documento acima para preparar surgirem linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que irão, especificamente, se ligar à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são, então, fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59- 103 (Academic Press, 1986)).
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas num meio de cultura adequado, que 190 ΕΡ1725249Β1 preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Por exemplo, se células de mieloma precursoras não possuem a transferase de enzima hipoxantina guanina fosforibosil (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, amino proteína, e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimento de células deficientes de HGPRT. Células de mieloma preferidas são aquelas que fundem eficientemente, suportam alto nível de produção estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, e são sensíveis a um meio como o meio HAT. Entre estes, linhas de células de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, São Diego, Califórnia, EUA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis do American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Linhas de célula de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).
Meio de cultura no qual células de hibridoma estão a crescer é analisado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antigénio. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por uma análise de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser 191 ΕΡ1725249Β1 determinada pela análise "Scatchard" de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados pela limitação dos procedimentos de diluição e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para este objetivo incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI- 1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores ascíticos num animal.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite, ou soro por procedimentos convencionais de purificação de anticorpo tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese por gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. ADN, que codifica os anticorpos monoclonais, é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, através da utilização de sondas de oligonucleótidos que são capazes de ligação específica a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino) . As células de hibridoma servem como uma fonte preferida deste ADN.
Após ser isolado, o ADN pode ser colocado em vetores de expressão, que são, então, transfectados em células hospedeira tais como células de E. coli, células COS de símios, células do ovário de hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que, do contrário, não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos 192 ΕΡ1725249Β1 monoclonais nas células de hospedeiro recombinante. Artigos de análise em expressão recombinantes na bactéria de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256- 262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
Numa forma de realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpo usando as técnicas descritas por McCafferty et al., Nature, 348:552- 554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol.,222:581 -597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murino e humano, respetivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo de nM) por embaralhamento de cadeia (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infeção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Dessa maneira, estas técnicas são alternativas viáveis a técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monoclonal para isolamento de anticorpos monoclonais. 0 ADN também pode ser modificado, por exemplo, através de substituição da sequência de codificação para domínios constantes humanos de cadeia pesada e cadeia leve no lugar das sequências de murino homólogo (Patente US N° 4816567; e Morrison, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851), ou por união covalente com a sequência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina.
Tipicamente, estes polipéptidos não imunoglobulina são substituídos para os domínios constantes de um anticorpo, 193 ΕΡ1725249Β1 ou são substituídos para os domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo, de modo a criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antigénio que tem especificidade para um antigénio, e um outro local de combinação de antigénio que tem especificidade para um antigénio diferente. (iii) Anticorpos Humanizados
Um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humano são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente executada através do método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de sequências de região hipervariável para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US N° 4.816.567) onde substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de região hipervariável, e possivelmente alguns resíduos FR, são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, para serem usados na produção de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado de "mais adequado", a sequência do domínio variável de um anticorpo 194 ΕΡ1725249Β1 de roedor é explorada contra a biblioteca inteira de sequências conhecidas de domínio variável humano. A sequência humana que é mais próxima àquela do roedor é, então, aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et ai., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)). Um outro método usa uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Numa outra forma de realização, os anticorpos podem ser humanizados com retenção de alta afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Anticorpos humanizados podem ser preparados por um processo de análise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais, usando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comummente disponíveis e são familiares aos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador, que ilustram e mostram as estruturas prováveis de conformação tridimensional das sequências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção destas apresentações permite analisar o papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar a seu antigénio. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências recipientes e importadas, de modo que as características desejadas do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o antigénio(s) alvo(s), seja atingida. De forma geral, os 195 ΕΡ1725249Β1 resíduos da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação a antigénio. Várias formas do anticorpo humanizado são consideradas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo IgGl intacto.
Os Exemplos descrevem a produção de um anticorpo anti-ErbB2 humanizado exemplar. 0 anticorpo humanizado pode, por exemplo, compreender resíduos da região hipervariável não humana incorporados num domínio pesado variável humano e podem, ainda, compreender uma substituição de região de estrutura (FR) numa posição selecionada do grupo consistindo de 69H, 71H e 73H, utilizando o sistema de numeração do domínio variável definido por Kabat et al., Seguences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Numa forma de realização, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H. Um outro Exemplo descreve a preparação de anticorpo trastuzumab purificado da formulação HERCEPTIN®. (iv) Anticorpos Humanos
Como uma alternativa para humanização, anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, é possível, agora, produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união de cadeia 196 ΕΡ1725249Β1 pesada do anticorpo (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes da linha de germe resulta na inibição completa de produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo do gene de imunoglobulina da linha de germe nestes ratinhos mutantes de linha de germe resulta na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antigénio. Veja-se, por exemplo, Jakobovits et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255- 258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patentes US N° 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.
Alternativamente, tecnologia de apresentação de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, de repertórios de gene de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores imunizados. De acordo com esta técnica, genes de domínio V de anticorpo são clonados na estrutura dentro de um gene de proteína de revestimento principal ou mínima de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e apresentada como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície da partícula do fago. Devido ao fato da partícula filamentosa conter uma cópia de ADN de cadeia simples do genoma do fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Dessa maneira, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A apresentação do fago pode ser executada numa variedade de formatos; para sua análise veja-se, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David. J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadas para apresentação de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolou um arranjo diverso de anticorpos de antioxazolona de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V 197 ΕΡ1725249Β1 derivados de baços de ratinhos imunizados. Um repertório de genes V a partir de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um arranjo diverso de antigénios (incluindo auto-antigénios) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993) . Vejam também as Patentes US N° 5565332 e 5573905. Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (veja-se Patentes US N° 5567610 e 5229275). Anticorpos humanos anti-CD30 são descritos no pedido de Patente US N° de Série 10/338.366. (v) Fragmentos de Anticorpo
Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja-se, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem, agora, ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com uma outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para produção de fragmentos de anticorpo ficarão aparentes para os técnicos especializados. Em outras formas de realização, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja-se documento WO 198 ΕΡ1725249Β1 93/16185; Patente US N° 5.571.894; e Patente US N° 5.587.458. 0 fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na Patente US N° 5.641.870, por exemplo. Estes fragmentos de anticorpo lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. (vi) Anticorpos Biespecificos
Anticorpos biespecificos são anticorpos que têm especificidade de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epítopos diferentes da proteína CD30. Alternativamente, um braço anti-CD30 pode ser combinado com um braço que se liga a recetores Fc para IgG (FcyR) , tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de modo a direcionar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa CD30. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expressam CD30. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada- cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al. , Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à escolha aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é usualmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante incómoda, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são apresentados no documento WO 93/08829, e por Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) . De acordo com uma 199 ΕΡ1725249Β1 abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação de anticorpo-antigénio) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmente é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptido nas formas de realização quando proporções desiguais das três cadeias de polipéptido usadas na construção proporcionam os rendimentos ideais. É possível, portanto, inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipéptido num vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptido em proporções iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as proporções não são de significância específica.
Numa forma de realização desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par de cadeia leve- cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, visto que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma via fácil de separação. Esta 200 ΕΡ1725249Β1 abordagem é apresentada no documento WO 94/04690. Para pormenores adicionais sobre geração de anticorpos biespecificos, veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acordo com uma outra abordagem descrita na Patente US N° 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser engenheirada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados de cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar às cadeias laterais grandes são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição de cadeias laterais grandes de aminoácido por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros. Técnicas para gerar anticorpos biespecificos de fragmentos de anticorpo foram também descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecificos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descreve um procedimento onde anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação ditiol de arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e impedir a formação intermolecular de bissulfeto. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é, 201 ΕΡ1725249Β1 então, convertido novamente em Fab'-tiol pela redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser usados como aqentes para a imobilização seletiva de enzimas.
Um proqresso recente facilitou a recuperação direta dos fraqmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser quimicamente acoplados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et ai., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula F(ab'>2 de anticorpo biespecifico totalmente humanizado. Cada fraqmento Fab' foi separadamente seqreqado de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecifico. Várias técnicas para preparar e isolar fraqmentos de anticorpo biespecífico diretamente de cultura de célula recombinante foram também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecificos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al. , J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) . Os péptidos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os homodímeros do anticorpo foram reduzidos na região de articulação para formar monómeros e, então, reoxidados para formar heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) proveu um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpo biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio de cadeia pesada variável (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para 202 ΕΡ1725249Β1 permitir a formação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e Vh complementares de um outro fragmento, formando, portanto, dois locais de ligação de antigénio. Uma outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpo biespecífico pela utilização de dímeros de cadeia única Fv (sFv) foi também relatada. Veja-se Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) .
Anticorpos com mais que duas valências são considerados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et ai., J. Immunol. 147:60 (1991). (vii) Outras modificações em sequência de aminoácidos
Modificações de sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente documento são consideradas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequência de aminoácido dos anticorpos são preparadas pela introdução de alterações de nucleótido apropriadas no ácido nucleico do anticorpo, ou por síntese de péptido. Estas modificações incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para obter a construção final, contanto que a construção final possua as características desejadas. As alterações no aminoácido também podem alterar processos pós-tradução do anticorpo, tais como alteração do número ou posição de locais de glicosilação.
Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais favorecidos para 203 ΕΡ1725249Β1 mutagénese é denominado de "mutagénese de rastreio de alanina" conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). No presente documento, um residuo ou grupo de resíduos alvos é identificado (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antigénio. Aqueles locais de aminoácido que demonstram sensibilidade funcional em relação às substituições são, então, refinados pela introdução de variantes adicionais ou outras variantes, nos locais de substituição. Dessa maneira, embora o local para introdução de uma variação de sequência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação por si mesma não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num local dado, mutagénese aleatória ou por rastreio de ala é conduzida no codão ou região alvo e as variantes de anticorpo expressas são exploradas quanto à atividade desejada.
Inserções de sequência de aminoácido incluem fusões de terminal de amino e/ou carboxilo variando em comprimento de um resíduo para os polipéptidos contendo uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções de terminal incluem um anticorpo com um resíduo N-terminal metionilo ou o anticorpo fundido a um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão do terminal N- ou C-do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipéptido que aumente a meia-vida do soro do anticorpo.
Um outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo 204 ΕΡ1725249Β1 substituída por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações FR são também consideradas.
Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são obtidas pela seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção de (a) estrutura de suporte do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades de cadeia lateral comuns: (D (2) (3) (4) (5) gly, pro; (6) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; hidrofílica neutra: cys, ser, thr; ácida: asp, glu; básica: asn, gin, his, lys, arg; resíduos que influenciam a orientação da cadeia: e aromático: trp, tyr, phe.
Substituições não conservativas irão acarretar na troca de um membro de uma destas classes por uma outra classe.
Um tipo especialmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo precursor (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante (s) resultante (s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo precursor do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar estas 205 ΕΡ1725249Β1 variantes de substituição envolve a maturação de afinidade usando apresentação de fago. Resumidamente, vários locais de região hipervariável (por exemplo, 6-7 locais) sofrem mutações para gerar todas as substituições de amino possível em cada local. As variantes de anticorpo geradas desta maneira são apresentadas de uma maneira monovalente de partículas de fago filamentoso como fusões do produto do gene III de M13 embalados dentro de cada partícula. As variantes apresentadas de fago são, então, exploradas guanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) conforme apresentado no presente documento. De modo a identificar locais de região hipervariável candidata para modificação, mutagénese de rastreio de alanina pode ser executada para identificar resíduos de região hipervariável gue contribuem significativamente para ligação a antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antigénio. Estes resíduos de contato e resíduos adjacentes são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente documento. Após estas variantes serem geradas, o painel de variantes é submetido ao rastreio conforme descrito no presente documento e anticorpos com propriedades superiores numa ou mais análises relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com relação à função de efetor, por exemplo, de modo a aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de antigénio (ADCC) e/ou complementar a citotoxicidade dependente (CDC) do anticorpo. Isto pode ser obtido pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região 206 ΕΡ1725249Β1
Fc, permitindo, através disso, a formação de ligação de bissulfeto entre as cadeias nesta região. 0 anticorpo homodimérico gerado desta maneira pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou capacidade de eliminação de célula mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Veja-se Caron et al. J. Exp. Med. 17 6:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral aumentada podem também ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais conforme descrito por Wolff et al. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode-se engenheirar um anticorpo que tenha duas regiões Fc e que pode, portanto, ter lise de complemento e capacidade de ADCC aumentadas. Veja-se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Para aumentar a semivida do soro do anticorpo, pode ser incorporado um epítopo de ligação de recetor de salvamento no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) conforme descrito na Patente US N° 5739277, por exemplo. Conforme usado no presente documento, o termo "epítopo de ligação de recetor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG-i, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da semivida do soro in vivo da molécula de IgG. (viii) Variantes de Glicosilação
Anticorpos no ADC da invenção podem ser glicosilados nas posições conservadas em suas regiões constantes (Jefferis e Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128; Wright e Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32). As cadeias laterais de oligossacáridos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe e Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180), e a 207 ΕΡ1725249Β1 interação intramolecular entre porções da glicoproteína que podem afetar a conformação e apresentaram superfície tridimensional da glicoproteína (Hefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416) . Oligossacáridos podem também servir para direcionar uma glicoproteína dada para certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. Por exemplo, foi relatado que na IgG agalactosilada, a fração de oligossacárido "move-se" para fora do espaço inter-CH2 e resíduos terminais N-acetilglicosamina se tornam disponíveis para ligar proteína de ligação de manose (Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1:237- 243). A remoção por glicopeptidase dos oligossacáridos de CAMPATH-1H (um anticorpo IgGl monoclonal de murino humanizado recombinante que reconhece o antigénio CDw52 de linfócitos humanos) produzidos nas células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) resultou numa redução completa na lise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311- 1318), enquanto a remoção seletiva de resíduos de ácido siálico usando neuraminidase não resultou em perda de DMCL. Foi também relatado que glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em especial, foi relatado que células CHO com expressão regulada por tetraciclina de p(l,4)-N- acetilglicosaminil transferase III (GnTIII), uma formação de catalisação de glicosil transferase de bissecção de GlcNAc, tiveram atividade ADCC melhorada (Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17:176-180).
Glicosilação de anticorpos é tipicamente N-ligada ou O-ligada. N- ligada refere-se à anexação da fração de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripéptido asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para 208 ΕΡ1725249Β1 anexação enzimática da fração de hidrato de carbono para a cadeia lateral de asparagina. Dessa maneira, a presença de qualquer uma destas sequências de tripéptido num polipéptido cria um local de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidroxiamínico, mais comummente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.
Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes nas quais o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Por alteração entende-se a deleção de uma ou mais porções de hidrato de carbono encontradas no anticorpo, a adição de uma ou mais porções de hidrato de carbono ao anticorpo, a alteração da composição de glicosilação (padrão de glicosilação), a extensão da glicosilação, etc. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida através da alteração da sequência de aminoácido, de modo que ela contenha uma ou mais das sequências de tripéptido descritas acima (para locais de glicosilação N-ligada). A alteração pode também ser feita pela adição, ou substituição, de um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação O-ligada). De maneira similar, a remoção de locais de glicosilação pode ser obtida por alteração de aminoácido dentro dos locais de glicosilação nativos do anticorpo. A sequência de aminoácido é usualmente alterada pela alteração da sequência de aminoácido subjacente. Estes métodos incluem, mas não se limitam a isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por 209 ΕΡ1725249Β1 mutagénese mediada por oligonucleótido (ou direcionada ao local) , mutagénese de PCR, e mutagénese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou de uma versão não variante do anticorpo. A glicosilação (incluindo padrão de glicosilação) de anticorpos pode também ser alterada sem alterar a sequência de aminoácido ou a sequência de nucleótido subjacente. A glicosilação depende grandemente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Visto que o tipo de célula usado para expressão de glicoproteina recombinante, por exemplo, anticorpos, como potencial terapêutico está raramente na célula nativa, variações significativas no padrão de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas. Veja-se, por exemplo, Hse et al.f (1997) J. Biol. Chem. 272-9062-9070. Além da escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação do meio, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação atingido num organismo hospedeiro específico, incluindo a introdução ou sobre-expressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacáridos (Patentes US N° 5047335; 5510161; 5278299). Glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, podem ser enzimaticamente removidos da glicoproteina, por exemplo, usando endoglicosidase H (Endo H) . Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser engenheirada geneticamente, por exemplo, tornando-as defeituosas no processamento de certos tipos de polissacáridos. Estas e técnicas similares são bem conhecidas na técnica. A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser prontamente analisada por técnicas convencionais de análise de hidrato de carbono, incluindo cromatografia de lectina, 210 ΕΡ1725249Β1 RMN, espetrometria de massa, HPLC, GPC, análise de composição de monossacárido, digestão enzimática sequencial, e HPAEC- PAD, que usa cromatograf ia de troca aniónica de alto pH para separar oligossacáridos com base na carga. Métodos para libertar oligossacáridos para objetivos analíticos são também conhecidos, e incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comummente executado usando péptido-N-glicosidase F/endo^-galactosidase) , eliminação usando ambiente alcalino adstringente para libertar principalmente estruturas O-ligadas, e métodos químicos usando hidrazina anidra para libertar tanto oligossacáridos N- quanto O-ligados. 4.5.2a RASTREIO DE CONJUGADO DE ANTICORPO-FÁRMACO (ADC)
Animais transgénicos e linhas de célula são especialmente úteis no rastreio de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) que têm potencial como tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou distúrbios envolvendo a sobre-expressão de proteínas incluindo Lewis Y, CD30, CD40, e CD70. Animais transgénicos e linhas de célula são especialmente úteis no rastreio de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) que têm potencial como tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou distúrbios envolvendo a sobre-expressão de HER2 (documento US 6632979) . 0 rastreio de um ADC útil pode envolver a administração de ADC candidato numa variedade de doses para o animal transgénico, e a análise em vários pontos no tempo dos efeitos do ADC na doença ou distúrbio que está a ser avaliada. Alternativamente, ou adicionalmente, o fármaco pode ser administrado antes ou simultaneamente com a exposição a um indutor da doença, se aplicável. ADC candidato pode ser explorado serialmente e individualmente, ou em paralelo sob meio ou formato de rastreio de alto-resultado. A taxa na qual ADC pode ser explorado para 211 ΕΡ1725249Β1 utilidade em tratamentos profiláticos ou terapêuticos de doenças ou distúrbios é limitada apenas pela taxa de síntese ou metodologia de rastreio, incluindo a deteção/medição/análise de dados.
Uma forma de realização é um método de rastreio que compreende (a) transplantar células de uma linha de célula de cancro de célula renal estável num animal não humano, (b) administrar um fármaco ADC candidato ao animal não humano e (c) determinar a capacidade do candidato para inibir a formação de tumores da linha de célula transplantada.
Uma outra forma de realização é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contato células de uma linha de célula de doença de Hodgkin estável com um candidato a fármaco ADC e (b) avaliar a capacidade do candidato ADC para bloquear a ativação do ligando de CD40.
Uma outra forma de realização é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contato células de uma linha de célula de doença de Hodgkin com um fármaco ADC candidato e (b) avaliar a capacidade do candidato ADC para induzir a morte da célula. Numa forma de realização a capacidade do ADC candidato para induzir apoptose é avaliada.
Uma forma de realização é um método paro rastreio que compreende (a) transplantar células de uma linha de célula de cancro estável num animal não humano, (b) administrar um fármaco ADC candidato ao animal não humano e (c) determinar a capacidade do candidato para inibir a formação de tumores da linha de célula transplantada. A invenção também se refere a um método paro rastreio de candidato ADC para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizada pela sobre-expressão de HER2 que compreende (a) colocar em 212 ΕΡ1725249Β1 contato células de uma linha de célula cancerígena de mama estável com um fármaco candidato e (b) avaliar a capacidade do ADC candidato para inibir o crescimento da linha de célula estável.
Uma outra forma de realização é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contato células de uma linha de célula cancerígena estável com um fármaco ADC candidato e (b) avaliar a capacidade do ADC candidato para bloquear a ativação de HER2. Numa forma de realização, a capacidade do ADC candidato para bloquear a ligação de herregulina é avaliada. Numa outra forma de realização, a capacidade do ADC candidato para bloquear fosforilação de tirosina estimulada por ligando é avaliada.
Uma outra forma de realização é um método de rastreio que compreende (a) colocar em contato células de uma linha de célula cancerígena estável com um fármaco ADC candidato e (b) avaliar a capacidade do ADC candidato para induzir a morte da célula. Numa forma de realização, a capacidade do ADC candidato para induzir apoptose é avaliada.
Uma outra forma de realização é um método de rastreio que compreende (a) administrar um fármaco ADC candidato a um mamífero não humano transgénico que sobre-expressa em suas células de glândula mamária uma proteína HER2 humana ou um fragmento da mesma; onde este mamífero transgénico possui, integrada de forma estável em seu genoma, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína HER2 humana nativa ou um fragmento da mesma que tem a atividade biológica de HER2 humano nativo operativamente ligada a sequências reguladoras de transcrição que direcionam sua expressão para glândula mamária, e desenvolve um tumor de mama que não responde ou responde muito pouco a tratamento de anticorpo anti-HER2, ou a um mamífero não humano que 213 ΕΡ1725249Β1 possui um tumor transplantado do referido mamífero não humano transgénico; e (b) avaliar o efeito do ADC candidato na doença ou distúrbio alvo. Sem limitações, a doença ou distúrbio pode ser um cancro que sobre-expressam HER2, tal como cancro de mama, de ovário, estomacal, do endométrio, da glândula salivar, pulmonar, renal, do cólon, tiroide, pancreático e da bexiga. 0 cancro preferivelmente é cancro de mama que expressou HER2 em pelo menos cerca de 500.000 cópias por célula, mais preferivelmente pelo menos cerca de 2.000.000 cópias por célula. Fármaco ADC candidatos podem, por exemplo, ser avaliados quanto à sua capacidade para induzir morte e/ou apoptose de célula, usando métodos de análise bem conhecidos na técnica e descritos no presente documento posteriormente.
Numa forma de realização, ADC candidatos são explorados através de sua administração ao animal transgénico numa variedade de doses, e da avaliação da resposta fisiológica do animal aos compostos com o passar do tempo. A administração pode ser oral, ou por injeção adequada, dependendo da natureza química do composto que está a ser avaliado. Em alguns casos, pode ser apropriado administrar o composto em conjunto com co-fatores que intensificariam a eficácia do composto. Se linhas de célula derivadas dos animais transgénicos em questão são usadas para explorar compostos úteis no tratamento de várias distúrbios, os compostos de teste são adicionados ao meio de cultura de célula num momento apropriado, e a resposta celular ao composto é avaliada com o passar do tempo usando análises bioquímicas e/ou histológicas apropriadas. Em alguns casos, pode ser apropriado aplicar o composto de interesse ao meio de cultura em conjunto com co-fatores que intensificariam a eficácia do composto. 214 ΕΡ1725249Β1
Dessa maneira, são providas no presente documento análises para a identificação de ADC que especificamente se direcionam e se ligam à proteína alvo, cuja presença está correlacionada com função celular anormal, e na patogénese de proliferação celular e/ou diferenciação que está relacionada de forma causal com o desenvolvimento de tumores.
Para identificar um ADC que bloqueie ativação de ligando de um recetor de ErbB (por exemplo, ErbB2), a capacidade do composto para bloquear ligação de ligandos de ErbB a células que expressam o recetor ErbB (ErbB2) (por exemplo, em conjunto com um outro recetor ErbB com o qual o recetor ErbB de interesse forma um hetero-oligómero ErbB) pode ser determinada. Por exemplo, células isoladas do animal transgénico que sobre-expressam HER2 e transfectadas para expressar um outro recetor ErbB (com o qual HER2 forma hetero-oligómero) podem ser incubadas, isto é, cultivadas com ADC e então expostas a ligando de ErbB marcado. A capacidade do composto para bloquear ligação de ligando ao recetor ErbB no hetero- oligómero ErbB pode, então, ser avaliada.
Por exemplo, a inibição de ligação de herregulina (HRG) a linhas de célula de tumor de mama, que sobre-expressam HER2 e estabelecida dos mamíferos não humanos transgénicos (por exemplo, ratinho) no presente documento, pelo ADC candidato pode ser executada usando culturas de camada única em gelo num formato de placa de 24 poços. Anticorpos monoclonais anti-ErbB2 podem ser adicionados a cada poço e incubados durante 30 minutos. ΓΗΡΟβ1ΐ77-224 marcado com 125I (25.000 cpm) pode, então, ser adicionado, e a incubação pode ser continuada durante 4 a 16 horas. Curvas de resposta de dose podem ser preparadas e um valor 215 ΕΡ1725249Β1 IC5o (atividade citotóxica) pode ser calculada para o composto de interesse.
Alternativamente, ou adicionalmente, a capacidade de um ADC para bloquear fosforilação de tirosina estimulada por ligando de ErbB de um recetor ErbB presente num hetero-oligómero ErbB pode ser avaliada. Por exemplo, linhas de célula estabelecidas a partir dos animais transgénicos no presente documento, podem ser incubadas com um ADC de teste e então avaliadas quanto à atividade de fosforilação de tirosina dependente de ligando de ErbB usando um anticorpo monoclonal antifosfotirosina (que é opcionalmente conjugado com um rótulo detetável). A análise de ativação do recetor de cinase descrita na Patente US N° 5766863 está também disponível para determinar ativação de recetor ErbB e bloqueio daquela atividade pelo composto.
Numa forma de realização, é possível explorar ADC que inibe a estimulação de HRG de fosforilação de tirosina pl80 em células MCF7 essencialmente conforme descrito a seguir. Por exemplo, uma linha de célula estabelecida de um animal transgénico HER2 pode ser colocada em placas de 24 poços e o composto pode ser adicionado a cada poço e incubado durante 30 minutos na temperatura ambiente; então rHRG3n77-224 pode ser adicionado a cada poço até uma concentração final de 0,2 nM, e a incubação pode ser continuada durante cerca de 8 minutos. O meio pode ser aspirado de cada poço, e reações podem ser paradas pela adição de 100 μΐ de tampão de amostra SDS (5 % de SDS, 25 mM DTT, e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8). Cada amostra (25 μΐ) pode passar por eletroforese num gel gradiente de 4-12 % (Novex) e então transferidos eletroforeticamente para membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunoblots de antifosfotirosina (a 1 pg/ml) podem ser desenvolvidas, e a intensidade da banda reativa predominante a Mr-180.000 pode ser quantificada por 216 ΕΡ1725249Β1 densitometria de refletância. Um método alternativo para avaliar inibição de fosforilação de recetor é a análise Kl RA (ativação de recetor de cinase) de Sadick et ai. (1998) Jour. of Pharm. and Biomed. Anal. Alguns dos anticorpos monoclonais bem estabelecidos contra HER2 que são conhecidos por inibir a estimulação de HRG de fosforilação de tirosina pl80 podem ser usados como controlo positivo nesta análise. Uma curva de resposta da dose para inibição de estimulação de HRG da fosforilação de tirosina pl80, conforme determinado por densitometria de refletância, pode ser preparada e um IC50 para o composto de interesse pode ser calculado.
Os efeitos inibidores de crescimento de um teste ADC em linhas de célula derivadas de um animal transgénico HER2, por exemplo, essencialmente conforme descrito em Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394, podem também ser avaliados. De acordo com esta análise, as células podem ser tratadas com um composto de teste em várias concentrações durante 4 dias e coradas com violeta cristal ou corante de redox "Alamar Blue". A incubação com o composto pode mostrar um efeito inibidor no crescimento nesta linha de célula similar àquele apresentado por anticorpo monoclonal 2C4 em células MDA-MB-175 (Schaefer et al., supra). Numa forma de realização adicional, HRG exógeno não inverterá significativamente esta inibição.
Para identificar compostos inibidores de crescimento, os quais especificamente se direcionam para um antigénio de interesse, pode ser efetuado rastreio para compostos que inibam o crescimento de células cancerígenas que sobre-expressam um antigénio de interesse derivado de animais transgénicos, e a análise descrita na Patente US N° 5677171 pode ser executada. De acordo com está análise, células de cancro que sobre-expressam o antigénio de interesse são 217 ΕΡ1725249Β1 cultivadas numa mistura 1:1 de meio F12 e DMEM suplementado com 10 % de soro bovino, glutamina e penicilina estreptomicina. As células são laminadas a 20.000 células num placa de cultura de célula de 35 mm (placa 2 ml/35 mm) e o composto de teste é adicionado em várias concentrações. Após seis dias, o número de células, comparado com células não tratadas, é contado usando um contador de célula COULTER™ eletrónico. Os compostos que inibem o crescimento de célula em cerca de 20-100 % ou cerca de 50-100 % podem ser selecionados como compostos inibidores de crescimento.
Para selecionar compostos que induzam morte de célula, perda de integridade de membrana conforme indicado por, por exemplo, PI, absorção de azul tripano ou 7AAD pode ser avaliada em relação ao controlo. A análise de absorção de PI usa células isoladas do tecido de tumor de interesse de um animal transgénico. De acordo com esta análise, as células são cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado com 10 % de FBS desativado por calor (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. Dessa maneira, a análise é executada na ausência de complemente e células de efetor imunes. As células são semeadas numa densidade de 3 x 106 por placa em placas de 100 x 2 0 mm e deixadas anexar durante a noite. O meio é, então, removido e substituído com meio fresco sozinho ou meio contendo as várias concentrações do composto. As células são incubadas durante um período de 3 dias. Após cada tratamento, monocamadas são lavadas com PBS e separadas por tripsinização. Células são, então, centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C, a conta suspensa novamente em 3 ml de tampão de ligação frio Ca2+ (10 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) e divididos em tubos de 12 x 75 mm tampados de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupos de tratamento) para remoção de aglomerados de célula. Os tubos, então, recebem PI (10 218 ΕΡ1725249Β1 pg/ml). Amostras podem ser analisadas usando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software CellQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Aqueles compostos que induzem níveis estatisticamente significativos de morte de célula conforme determinado por absorção de PI podem ser selecionados como compostos indutores de morte de célula.
Para selecionar compostos que induzam apoptose, é executada uma análise de ligação de anexina usando células estabelecidas de tecido de tumor de interesse do animal transgénico. As células são cultivadas e semeadas em placas conforme discutido no parágrafo anterior. 0 meio é, então, removido e substituído com meio fresco sozinho ou meio contendo 10 pg/ml do conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). Após um período de incubação de três dias, monocamadas são lavadas com PBS e separadas por tripsinização. Células são, então, centrifugadas, suspensas novamente em tampão de ligação Ca2+ e divididas em tubos conforme discutido acima para a análise de morte de célula. Tubos, então, recebem anexina marcada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 pg/ml). Amostras podem ser analisadas usando um citómetro de fluxo FACSCAN™ e software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Os compostos que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina em relação ao controlo são selecionados como compostos indutores de apoptose.
4.5.3_ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA IN VITRO
De forma geral, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) é medida por: exposição de células de mamífero, que possuem proteínas do recetor para o anticorpo do ADC, num meio de cultura de célula; cultivo das células durante um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medida da viabilidade da 219 ΕΡ1725249Β1 célula. Os ensaios in vitro à base de células foram usados para medir a viabilidade (proliferação) , citotoxicidade, e indução de apoptose (ativação de caspase) do ADC da invenção. A potência in vitro de conjugados de anticorpo-fármaco foi medida por um ensaio de proliferação de célula (Exemplo 19, Figuras 7-10). O Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo® está comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, Wl), método de análise homogénea com base na expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (Patente US N° 5583024; 5674713 e 5700670) . Este ensaio de proliferação de célula determina o número de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, Patente US N° 6602677). O Ensaio de CellTiter-Glo® foi conduzido no formato de 96 poços, tornando-a recetível paro rastreio automatizada de alto resultado (HTS) (Cree et al. (1995) Anti Câncer Drugs 6:398-404). O procedimento de análise homogénea envolve a adição do reagente único (Reagente Celltiter-Glo®) diretamente nas células cultivadas no meio suplementado com soro. As etapas de lavagem de célula, remoção do meio e pipetagens múltiplas não são requeridas. O sistema deteta uma quantidade tão pequena quanto 15 células/poço num formato de 384 poços em 10 minutos após adição de reagente e mistura. As células podem ser tratadas continuamente com ADC, ou elas podem ser tratadas e separadas de ADC. De forma geral, células tratadas brevemente, isto é, 3 horas, mostraram os mesmos efeitos de potência que as células tratadas de forma continua. O formato "adição-mistura-medição" homogéneo resulta em lise de célula e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de 220 ΕΡ1725249Β1 ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. 0 Ensaio CellTiter-Glo® gera um sinal luminescente "tipo brilho", produzido pela reação de luciferase, que possui uma semivida geralmente maior que cinco horas, dependendo do tipo de célula e meio usados. Células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativas (ULR). 0 substrato, Beetle Luciferin, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume com conversão concomitante de ATP para AMP e geração de fotões. A semivida estendida elimina a necessidade de usar injetores de reagente e proporciona flexibilidade para processamento de modo continuo ou de lote de múltiplas lâminas. Este ensaio de proliferação de célula pode ser usado com vários formatos de poços múltiplos, por exemplo, formato de 96 ou 384 poços. Dados podem ser registados pelo luminómetro ou dispositivo de imagem de câmara CCD. A saida de luminescência é apresentada como unidades relativas de luz (ULR), medidas com o decorrer do tempo.
Oxiluciferina + AMP + PPi + C02 + luz
Luciferase ATP + Luciferina + O2 —--
Mg+2 .
Os efeitos anti-proliferativos de conjugados de anticorpo-fármaco foram medidos pela proliferação de célula, análise de morte de célula in vitro acima contra quatro linhas de célula de tumor de mama diferentes (Figuras 7-10). Valores de IC5o foram estabelecidos para SK-BR-3 e BT-474 que são conhecidos por sobre-expressar a proteina do recetor HER2. O quadro 2b mostra as medições de potência (IC50) de conjugados de anticorpo-fármaco exemplares no ensaio de proliferação de célula contra células BT-474.
Conjugados PAB- MMAF, 3,8 de anticorpo-fármaco: Trastuzumab-MC-vc-MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 221 ΕΡ1725249Β1 3,9 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab; e Trastuzumab- MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab não inibiram a proliferação de células MCF-7 (Figura 9).
Conjugados de anticorpo-fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAE, 4,1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab; e Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab não inibiram a proliferação de células MDA-MB-468 (Figura 10). Células MCF-7 e MDA-MB-468 não sobre-expressam a proteína de recetor HER2. Os conjugados de anticorpo-fármaco anti-HER2 da invenção, portanto, mostram seletividade para inibição de células que expressam HER2.
Quadro 2a. - Células SK-BR-3
Conjugado de Anticorpo-Fármaco H = Trastuzumab ligado através de cisteína [cys] exceto onde indicado IC50 (mg ADC/ml) H-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab 0, 008 H-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab 0,002 H-MC-vc-PAB-MMAE, 0, 007 (Exemplo de referência) H-MC-vc-PAB-MMAE 0, 015 (Exemplo de referência) H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab 0,0035 - 0,01 H-MC-vc-PAB-MMAF, 4,4 MMAF/Ab 0,006 - 0,007 H-MC-vc-PAB-MMAF, 4,8 MMAF/Ab 0, 006 H-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab 0,0035 H-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab 0,0035 H-MC-vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab 0, 010 (Exemplo de referência) 222 ΕΡ1725249Β1 H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab 0, 007 H-MC-vc-PAB-MMAE 4,1 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 015 H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab. 0, 010 H-MC-vc-PAB-MMAE, 7,5 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0,0025 H-MC-MMAE, 8,8 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 018 H-MC- MMAE, 4,6 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 05 H-MC-(L)vai-(L)cit-PAB-MMAE, 8,7 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0,0003 H-MC-(D)vai-(D)cit-PAB-MMAE, 8,2 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 02 H-MC-(D)vai-(L)cit-PAB-MMAE, 8,4 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0,0015 H-MC-(D)vai-(L)cit-PAB-MMAE, 3,2 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 003 H-Trastuzumab 0, 083 H-vc-MMAE, ligado via uma lisina [lys] (Exemplo de referência) 0, 002 H-phe-lys-MMAE, ligado via uma lisina [lys] (Exemplo de referência) 0,0015 4D5-Fc8-MC-vc-PAB-MMAF, 4,4 MMAF/Ab 0, 004 Hg-MC-vc-PAB-MMAF, 4,1 MMAF/Ab 0, 01 7C2-MC-vc-PAB-MMAF, 4,0 MMAF/Ab 0, 01 4D5 Fab-MC-vc-PAB-MMAF, 1,5 MMAF/Ab 0, 02 Anti-TF Fab-MC-vc-PAB-MMAE* (Exemplo de referência) -
Quadro 2b células BT474
Conjugado de Anticorpo-Fármaco H = trastuzumab ligado via uma cisteína [ cys ] IC50 (mg ADC/ml) H-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab 0,008 223 ΕΡ1725249Β1 H-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab 0.002 H-MC-vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0,015 H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab 0.02 - 0,05 H-MC-vc-PAB-MMAF, 4,4 MMAF/Ab 0.01 H-MC-vc-PAB-MMAF, 4,8 MMAF/Ab 0.01 H-MC-vc-PAB-MMAE 3,3 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 02 H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab. 0.02 H-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab 0. 015 H-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab 0.010 H-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab 0.00015 H-MC-vc-PAB-MMAE, 7,5 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0,0025 H-MC-MMAE, 8,8 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0, 04 H-MC- MMAE, 4,6 MMAE/Ab (Exemplo de referência) 0,07 4D5-Fc8-MC-vc-PAB-MMAF, 4,4 MMAF/Ab 0.008 Hg-MC-vc-PAB-MMAF, 4,1 MMAF/Ab 0.01 7C2-MC-vc-PAB-MMAF, 4,0 MMAF/Ab 0.015 4D5 Fab-MC-vc-PAB-MMAF, 1,5 MMAF/Ab 0.04 Anti-TF Fab-MC-vc-PAB-MMAE* (Exemplo de referência) - H = trastuzumab 7C2 = anticorpo de murino anti-HER2 que se liga a um epitopo diferente de trastuzumab. Fc8 = mutante que não se liga a FcRn Hg = 4D5 humanizado de comprimento total "Sem Articulação", com cisteínas de cadeia pesada articuladas que sofreram mutação em serinas. Expressa em E. coli (portanto, não glicosilada). Anti-TF Fab = fragmento de anticorpo de fator anti-tecido * atividade contra células MDA-MB-468 224 ΕΡ1725249Β1
Numa descoberta surpreendente e inesperada, os resultados de atividade de proliferação de célula in vitro do ADC nos Quadros 2a e 2b mostram, de forma geral, que ADC com um número médio baixo de frações de fármaco por anticorpo mostrou eficácia, por exemplo, IC50 < 0,1 pg ADC/ml. Os resultados sugerem que pelo menos para ADC trastuzumab, a proporção ideal de frações de fármaco por anticorpo pode ser menor que 8, e pode ser de cerca de 2 a cerca de 5.
4.5.4_DEPURAÇÃO E ESTABILIDADE PLASMÁTICA IN VIVO
Depuração e estabilidade plasmática farmacocinética de ADC foram investigadas em ratos e macacos cynomolgus. A concentração plasmática foi medida com periodicamente. O quadro 2c mostra dados de farmacocinética de conjugados de anticorpo-fármaco e outras amostras dosadas em ratos. Ratos são um modelo não especifico para anticorpo de recetor ErbB, visto que não se tem conhecimento de que o rato expresse proteínas do recetor HER2
Quadro 2c - Farmacocinética em Ratos H = trastuzumab ligado via uma cisteína [cys] exceto onde indicado 2 mg/kg dose exceto onde indicado Dose de amostra AUCinf dia* CL Cmax Termo Th. % de mg/kg pg/ml ml/dia/kg mg/ml dias Con j . H-MC-vc-PAB-MMAE 78,6 26, 3 39, 5 5, 80 40,6 (Total Ab H-MC-vc-PAB-MMAE 31,1 64,4 33,2 3, 00 (Conj.) (Exemplo de referência) H-MC-vc-PAB-MMAF 170 12,0 47,9 8,4 50,0 (Total Ab) 83, 9 24,0 44,7 4,01 H-MC-vc-PAB-MMAF (Conj.) 225 ΕΡ1725249Β1 H-MC-MMAE (Total Ab) H-MC-MMAE (Conj . ) 5 mg/kg (Exemplo de referência) 279 90,6 18.9 62.9 79, 6 62,9 7,65 4,46 33 H-MC-MMAF (Total 299 6,74 49, 1 11, 6 37 Ab) H-MC-MMAF 110 18,26 50,2 4,54 (Conj.) H-MC-vc-MMAF, 306 6,6 33,4 78,7 11, 9 19, 6 wo/PAB, (Total 59, 9 82,8 2,1 Ab) H-MC-vc- MMAF, wo/PAB, (Conj . ) H-Me-vc-PAB-MMAF 186 10,8 46, 9 8,3 45,3 (Total Ab) H-Me-vc-PAB-MMAF 84,0 23, 8 49, 6 4,3 (Conj . ) H-Me-vc-PAB-MMAE 135 15, 0 44, 9 11,2 23, 8 (Total Ab) 31,9 63, 8 45,2 3, 0 H-Me-vc-PAB-MMAE (Conj . ) (Exemplo de referência) H-MC-vc-MMAF, 306 6, 6 78,7 11,9 19, 6 wo/PAB, (Total 59, 9 33,4 82,8 2,1 Ab) H-MC-vc- MMAF, wo/PAB, (Conj . ) H-MC-(D)vai- 107 19,2 30,6 9, 6 38,1 (L)cit-PAB-MMAE 40 50,4 33,7 3, 98 (Total Ab) H-MC- (D)vai-(L)cit- PAB-MMAE (Conj.) 226 ΕΡ1725249Β1 (Exemplo de referência) H-MC-(Me)-vc-PAB-MMAE, Total Ab H-MC-(Me)-vc-PAB-MMAE, Conj. (Exemplo de referência) 135, 1 31,9 15, 0 63, 8 44, 9 45,2 11,2 2,96 23, 8 H-MC-(D)val-(D)cit-PAB-MMAE, Total Ab H-MC-(D)vai-(D)cit-PAB-MMAE, Conj. (Exemplo de referência) 88,2 33, 6 22,8 59, 8 33, 8 36, 0 10,5 4,43 38,3 H-MC-vc-PAB-MMAE, Total Ab H-MC-vc-PAB-MMAE, Conj. H ligado a MC por lisina [lys] (Exemplo de referência) 78,6 31,1 26.3 64.4 39,5 33,2 5, 8 3, 00 40, 6 MMAF 200 mg/kg 0,99 204 280 0,224 - MMAE 206 mg/kg exemplo) (Exemplo de referência) 3,71 62,6 649 0,743 HER F(ab')2-MC-vc-MMAE, Total Ab HER F(ab')2-MC- 9,3 8,8 217 227 34,4 36, 9 0,35 0,29 95 227 ΕΡ1725249Β1 vc-MMAE, Conj. (Exemplo de referência) 4D5-H-Fab-MC-vc- 43, 8 46,2 38,5 1,49 68 MMAF, Total Ab 4D5-H-Fab-MC-vc-MMAF, Conj. 29, 9 68,1 34,1 1,12 4D5-H-Fab-MC-vc- MMAE, 71,5 70,3 108 1, 18 59 Total Ab 4D5-H-Fab-MC-vc-MMAE, Conj. (Exemplo de referência) 42,2 118, 9 114 0,74 4D5-H-Fab 93, 4 53, 9 133 1, 08 - H-MC-vc-PAB- 170 12,03 47,9 8,44 49, 5 MMAF, Total Ab H-MC-vc-PAB-MMAF, Conj. 83, 9 23, 96 44,7 4, 01 H-MC-vc-PAB- 211 9,8 39, 8 8,53 34,3 MMAF-DMAEA, Total Ab H-MC-VC-PAB-MMAF-DMAEA, Conj. 71,5 28,2 38,8 3, 64 H-MC-vc-PAB- 209 9,75 53,2 8,32 29,7 MMAF-TEG, Total Ab H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG, Conj. 63,4 31,8 34,9 4,36
Dose de 2 mg/kg exceto onde mencionado de outro modo. AUCinf é a área sob a curva de concentração plasmática-tempo do momento da dosagem até o infinito e é uma medida da exposição total à entidade medida (fármaco, ADC) . CL é definida como o volume de plasma depurado da entidade 228 ΕΡ1725249Β1 medida em unidade de tempo e é expressa pela normalização ao peso corporal. 0 termo TVi é a semivida do fármaco no corpo medida durante sua fase de eliminação. 0 termo % de Conj. é a quantidade relativa de ADC comparada com anticorpo total detetado por testes separados de imunoafinidade ELISA ("Analytical Methods for Biotechnology Products", Ferraiolo et ai., páginas 85-98 no Pharmacokinetics of Drugs (1994) P.G. Welling e L.P. Balant, Eds., Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 110, Springer-Verlag. O cálculo da % de Conj. é simplesmente AUCinf de ADC + AUCinf total de Ab, e é um indicador geral de estabilidade do ligante, embora outros fatores e mecanismos possam estar presentes. A Figura 11 mostra um gráfico de um estudo de depuração de concentração plasmática após administração dos conjugados de anticorpo- fármaco: H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG e H-MC-vc-PAB-MMAF a ratos Sprague-Dawley. Concentrações totais de anticorpo e ADC foram medidas periodicamente. A Figura 12 mostra um gráfico de um estudo de duas fases de depuração de concentração plasmática onde ADC foi administrado em dosagens diferentes e as concentrações de anticorpo e ADC totais foram medidas com periodicamente.
EFICÁCIA IN VIVO A eficácia in vivo do ADC da invenção foi medida por um modelo de ratinho de explante transgénico com alta expressão de HER2. Um aloenxerto foi propagado do ratinho transgénico Fo5 mmtv que não responde, ou responde muito pouco, a terapêutica com HERCEPTIN®. Os indivíduos foram tratados uma vez com ADC e monitorizados durante 3-6 semanas para medir o tempo para o tumor dobrar, registo de morte de célula, e diminuição do tumor. Acompanhamento 229 ΕΡ1725249Β1 resposta-dose e experiências de doses múltiplas foram conduzidos. 0 tumor aparece prontamente em ratinhos transgénicos que expressam uma forma ativada por mutação de neu, um homólogo de rato para HER2, mas o HER2 que é sobre-expresso nos cancros de mama não sofre mutação e a formação do tumor é muito menos robusta em ratinhos transgénicos que sobre-expressam HER2 sem mutação (Webster et al. (1994) Semin. Câncer Biol. 5:69-76).
Para melhorar a formação de tumor com HER2 sem mutação, foram produzidos ratinhos transgénicos usando plasmideo ADNc HER2 nos quais uma ATG a montante foi deletada de modo a impedir o inicio de tradução nestes codões ATG a montante, que, do contrário, reduziriam a frequência de inicio de tradução do codão de inicio autêntico a jusante de HER2 (por exemplo, veja-se Child et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:24335-24341). Adicionalmente, um intrão quimérico foi adicionado à extremidade 5', que deveria, também, aumentar o nível de expressão conforme relatado anteriormente (Neuberger e Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713; Buchman e Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395; Brinster et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:836). 0 intrão quimérico foi derivado de um vetor Promega, vetor de expressão de pCI-neo de mamífero (bp 890-1022). A extremidade 3' de ADNc é flanqueada por exões de crescimento humano 4 e 5, e sequências de poliadenilação. Além do mais, ratinhos FVB foram usados porque esta estirpe é mais suscetível a desenvolvimento de tumor. O promotor de MMTV- LTR foi usado para garantir expressão de HER2 específica de tecido na glândula mamária. Os animais foram alimentados com a dieta AIN 7 6A de modo a aumentar a suscetibilidade à formação de tumor (Rao et al. (1997) Breast Câncer Res. and Treatment 45:149-158). 230 ΕΡ1725249Β1
Quadro 2d - Medições de Tumor em Modelo de Ratinho de Aloenxerto - Tumor Mamário MMTV-HER2 Fo5, Ratinho nu
Atimico dose única no dia 1 (T = 0) exceto onde indicado H = trastuzumab ligado via uma cisteina [cys] exceto onde indicado Fármacos de Amostra por anticorpo Dose Ti PR CR Tempo de duplicação de tumor (dias) Registo médio de mortalidade de célula Veiculo 2-5 0 H-MC-vc-PAB-MMAE 8,7 MMAE/Ab (Exemplo de ref. ) 1250 pg/m2 5/5 4/7 0/7 18 1,5 H-MC-vc-PAB-MMAF 3,8 MMAF/Ab 555 pg/m2 2/5 2/7 5/7 69 6, 6 H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF >50 6,4 H-MC-MMAF 4,8 MMAF/Ab 9,2 mg/kg Ab 55 0 pg/m2 a 0, 7, 14 e 21 dias 7/7 6/7 0/7 63 9 H-MC-MMAF 4,8 MMAF/Ab 14 mg/kg Ab 840 pg/m2 a 0, 7, 14 e 21 dias 5/5 5/7 2/7 >63 H-MC-vc-PAB-MMAF 5,9 MMAF/Ab 3,5 mg/kg Ab 30 0 pg/m2 a 0, 21, e 42 dias 5/6 1/7 3/7 >36 231 ΕΡ1725249Β1 H-MC-vc-PAB-MMAF 5,9 MMAF/Ab 4, 9 mg/kg Ab 425 pg/m2 a 0, 21, e 42 dias 4/7 2/7 5/7 >90 H-MC-vc-PAB-MMAF 5,9 MMAF/Ab 6,4 mg/kg Ab 55 0 pg/m2 a 0, 21, e 42 dias 3/6 1/7 6/7 >90 H- (L)val-(L)cit-MMAE 8,7 MMAE/Ab (Exemplo de ref. ) 10 mg/kg 7/7 1/7 0/7 15,2 1,1 H-MC-MMAE 4,6 MMAE/Ab (Exemplo de ref. ) 10 mg/kg 7/7 0/7 0/7 4 0,1 H-(D)val-(D)cit-MMAE 4,2 MMAE/Ab (Exemplo de ref. ) 10 mg/kg 7/7 0/7 0/7 3 H-(D)val-(L)cit-MMAE 3,2 MMAE/Ab Exemplo de referência 13 mg/kg 7/7 0/7 0/7 9 0,6 H-MC(Me)-vc-MMAE 3,0 MMAE/Ab Exemplo de referência 13 mg/kg 7/7 3/7 0/7 17 1,2 232 ΕΡ1725249Β1 H-(L)val-(D)cit-MMAE 3,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 12 mg/kg 7/7 0/7 0/7 5 0,2 H-vc-MMAE 8,7 MMAE/Ab Exemplo de referência 10 mg/kg 7/7 17 H-cys-vc-MMAF 3,8 MMAF/Ab 1 mg/kg 7/7 3 H-cys-vc-MMAF 3,8 MMAF/Ab 3 mg/kg 7/7 >17 H-cys-vc-MMAF 3,8 MMAF/Ab 10 mg/kg 4/7 4/7 3/7 >17 H-MC-vc-MMAF-TEG 4 MMAF/Ab 10 mg/kg 3/6 1/7 6/7 81 00 r- H-MC-vc-MMAF-TEG 4 MMAF/Ab 10 mg/kg q3 sem x 3 0/5 0/7 7/7 81 7,9 H-vc-MMAF (lot 1) 10 mg/kg 4/6 2/8 5/8 H-vc-MMAF (lot 2) 10 mg/kg 7/8 1/8 1/8 H-MC-MMAF 10 mg/kg 550 pg/m2 8/8 1/8 0/8 18 H-(Me)-vc-MMAF 10 mg/kg 3/7 2/8 5/8 233 ΕΡ1725249Β1 H-vc-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 3,7 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 dias 6/6 0/7 1/7 17 2,3 H-vc-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 7,5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 dias 5/7 3/7 3/7 69 10 anti IL8-vc-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 7,5 mg/kg a 0,7,14,21, 28 dias 7/7 0/7 0/7 5 LO O anti IL8-vc-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 3,7 mg/kg a 0,7,14,21, 28 dias 6/6 0/7 0/7 3 0,2 H-fk-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 7,5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 dias 7/7 1/7 0/7 31 4,4 H-fk-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 3,7 mg/kg a 0,7,14,21, 28 dias 7/7 0/7 0/7 8,3 0,9 anti IL8-fk-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de referência 7,5 mg/kg a 0,7,14,21, 28 dias 7/7 0/7 0/7 6 0,5 anti IL8-fk-MMAE 7,5 MMAE/Ab Exemplo de 3,7 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 dias 7/7 0/7 0/7 3 0,1 234 ΕΡ1725249Β1 referência Trastuzumab 7,5 mg/kg a 0, 7, 14, 21, 28 dias 7/7 0/7 0/7 5 0,4 H-vc-MMAE 8,7 MMAE/Ab Exemplo de referência 10 mg/kg 1250 pg/m2 6/6 3/6 0/6 15 1,3 H-vc-MMAE Exemplo de referência 10 mg/kg 1250 pg/m2 a 0, 7, e 14 dias 7/7 5/7 >19 H-vc-MMAE Exemplo de referência 3 mg/kg a 0, 7, e 14 dias 7/7 8 H-vc-MMAE Exemplo de referência 1 mg/kg a 0, 7, e 14 dias 7/7 7 H-vc-MMAF 10 mg/kg 8/8 5/8 >21 H-vc-MMAF 10 mg/kg a 0, 7, e 14 dias 4/7 4/7 3/7 >21 H-vc-MMAF 3 mg/kg a 0, 7, e 14 dias 7/7 6 H-vc-MMAF 1 mg/kg a 0, 7, e 14 dias 8/8 4 Trastuzumab 10 mg/kg a 0 e 7 dias 8/8 3 235 ΕΡ1725249Β1
Hg-MC-vc-PAB-MMAF 4,1 MMAF/Ab 10 mg/kg a 0 dias 6/7 3/8 5/8 56 5,1 Fc8-MC-vc-PAB-MMAF 4,4 MMAF/Ab 10 mg/kg a 0 dias 7/7 6/8 0/8 25 2,1 7C2-MC-vc-PAB-MMAF 4 MMAF/Ab 10 mg/kg a 0 dias 5/6 6/8 1/8 41 3,7 H-MC-vc-PAB-MMAF 5, 9 MMAF/Ab 10 mg/kg a 0 dias 3/8 3/8 5/8 62 5,7 2H9-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 9/9 >14 dias 2H9-MC-vc- PAB-MMAF 9/9 >14 dias HDlO-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 9/9 >14 dias HDlO-vc- PAB-MMAF 9/9 11 dias 7C2 = anticorpo de murino anti-HER2 que se liga a um epitopo diferente de trastuzumab. Fc8 = mutante que não se liga a FcRn Hg = 4D5 humanizado de comprimento total "Sem Articulação", com cisteínas de cadeia pesada articuladas que sofreram mutação em serinas. Expressa em E. coli (portanto, não glicosilada). 2H9 = Anti-EphB2R 11D10= Anti-0772P
0 termo Ti é ο número de animais no grupo de estudo com tumor em T = 0 t total de animais no grupo. 0 termo PR 236 ΕΡ1725249Β1 é o número de animais que obtiveram remissão parcial do tumor e animais com tumor em T = 0 no grupo. 0 termo CR é o número de animais que obtiveram remissão completa do tumor -r animais com tumor em T = 0 no grupo. 0 termo registo de mortalidade de célula é o tempo em dias para o volume do tumor dobrar - o tempo em dias para o volume do tumor de controlo dobrar dividido por 3,32 x tempo para o volume do tumor dobrar nos animais de controlo (dosados com Veiculo). 0 cálculo de registo de mortalidade da célula considera o atraso de crescimento do tumor resultante de tratamento e o tempo para duplicação de volume do tumor do grupo de controlo. Atividade anti-tumoral de ADC é classificada com valores de destruição celular em Log de: á 3,4 (altamente ativo) + + + + + + inativo = 2,5-3,4 = 1,7-2,4 = 1,0-1,6 = 0 A Figura 13 mostra a alteração média no volume do tumor durante um período de tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor mamário MMTV-HER2 dosados no Dia 0 com: Veículo, Trastuzumab- MC-vc-PAB-MMAE (1250 pg/m2) e Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (555 pg/m2) . (H = Trastuzumab) . O crescimento de tumores foi retardado pelo tratamento com ADC se comparado com o nível de crescimento do controlo (Veículo). A Figura 14 mostra a alteração média de volume de tumor durante um período de tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor mamário MMTV-HER2 Fo5 dosados no Dia 0 com 10 mg/kg (660 pg/m2) de Trastuzumab-MC-MMAE e 1250 pg/m2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. A Figura 15 mostra a alteração média no volume do tumor durante um período de tempo em ratinhos nus atímicos com aloenxertos de tumor mamário MMTV-HER2 Fo5 dosados com 650 237 ΕΡ1725249Β1 μg/m2 de Trastuzumab-MC-MMAF. 0 quadro 2d e Figuras 13-15 mostram que o ADC possui potente atividade anti-tumoral no aloenxerto de um tumor positivo para HER2 (Fo5) que originalmente surgir no ratinho transgénico MMTV-HER2. 0 anticorpo sozinho (por exemplo, Trastuzumab) não possui atividade anti-tumoral significativa neste modelo (Erickson et al. Patente US N° 6632979) . Conforme ilustrado nas Figuras 13-15, o crescimento dos tumores foi retardado pelo tratamento com ADC se comparado com o nivel do controlo (Veículo) de crescimento.
Numa descoberta surpreendente e inesperada, os resultados da atividade anti-tumoral in vivo do ADC no quadro 2d mostram, de forma geral, que ADC com um número médio baixo de frações de fármaco por anticorpo mostrou eficácia, por exemplo, tempo de duplicação do tumor > 15 dias e registo médio de mortalidade de célula > 1,0. A Figura 16 mostra que para o conjugado de anticorpo-fármaco, trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, o volume médio do tumor diminuiu e não progrediu onde a proporção de MMAF:trastuzumab era de 2 e 4, enquanto o tumor progrediu numa taxa de 5,9 e 6, mas numa taxa mais lenta que no Veículo (tampão) . A taxa de progressão do tumor neste modelo de xenoenxerto de ratinho foi aproximadamente igual, isto é, 3 dias, para Veículo e trastuzumab. Os resultados sugerem que pelo menos para trastuzumab ADC, a proporção ideal de frações de fármaco por anticorpo pode ser menor que cerca de 8, e pode ser de cerca de 2 a cerca de 4.
4.5.5 TOXIDADE EM ROEDOR
Conjugados de anticorpo-fármaco e controlo menos ADC, "Veículo", foram avaliados num modelo de rato de toxicidade aguda. A toxicidade de ADC foi investigada por tratamento de ratos Sprague-Dawley macho e fêmea com o ADC e inspeção 238 ΕΡ1725249Β1 subsequente e análise dos efeitos em vários órgãos. Observações gerais incluíram alterações nos pesos corporais e sinais de lesões e sangramento. Parâmetros de patologia clínica (soro, química e hematologia), histopatologia, e necropsia foram conduzidos nos animais dosados.
Considera-se que a perda de peso, ou alteração no peso relativa a animais dosados apenas com Veículo, em animais após dosagem com ADC é um indicador bruto e geral de toxicidade sistémica ou localizada. As Figuras 17-19 mostram os efeitos de vários ADC e controlo (Veículo) após dosagem no peso corporal de ratos. A hepatotoxicidade foi medida por enzimas hepáticas elevadas, números aumentados de figuras mitóticas e apoptóticas e necrose de hepatócito. A toxicidade hematolinfoide foi observa pela depleção de leucócitos, primariamente granulócitos (neutrófilos) e/ou plaquetas, e envolvimento de órgão linfoide, isto é, atrofia ou atividade apoptótica. A toxicidade foi também observada por lesões no trato gastrintestinal tais como números aumentados de figuras mitóticas e apoptóticas e enterocolite degenerativa.
Enzimas indicativas de danos hepáticos que foram estudadas incluem: AST (aminotransferase aspartato)
Localização: citoplasmática; fígado, coração, musculoesquelética, rins Fígado: proporção plasmática 7000:1 T^: 17 horas ALT (aminotransferase alanina) 239 ΕΡ1725249Β1
Localização: citoplasmática; fígado, rins, coração, musculoesquelética Fígado: proporção plasmática 3000:1 Th: 42 horas, variação diurna GGT (g-glutamil transferase)
Localização: membrana plasmática de células com alta capacidade secretória ou de absorção; fígado, rim, intestino
Prognóstico inadequado para danos hepáticos; comummente elevado em distúrbios do duto biliar.
Os perfis de toxicidade de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF foram estudados em ratos Sprague- Dawley fêmeas (Exemplo 19) . O anticorpo trastuzumab humanizado não se liga de forma apreciável a tecido de rato, e qualquer toxicidade seria considerada não específica. Variantes nos níveis da dose de 840 e 2105 ug/m2 de MMAF foram comparados com trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF a 2105 ug/m2.
Os animais nos grupos 1, 2, 3, 4, 6 e 7 (Veículo, 9,94 & 24,90 mg/kg de Trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, 10,69 mg/kg de trastuzumab- MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, e 10,17 & 25,50 mg/kg de trastuzumab-MC-MMAF, respetivamente) ganharam peso durante o estudo. Os animais nos grupos 5 e 8 (26,78 mg/kg de trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF e 21,85 mg/kg de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, respetivamente) perderam peso durante o estudo. No Dia 5 do Estudo, a alteração nos pesos corporais de animais nos grupos 2, 6 e 7 não foi significativamente diferente dos animais do grupo 1. A alteração nos pesos corporais de animais nos grupos 3, 4, 5 e 8 foi estatisticamente diferente dos animais do grupo 1 (Exemplo 19). 240 ΕΡ1725249Β1
Ratos tratados com trastuzumab-MC-MMAF (grupos 6 e 7) não foram distinguíveis dos animais de controlo tratados com veículo em ambos os níveis de dosagem; isto é, este conjugado mostrou um perfil de segurança superior neste modelo. Os ratos tratados com trastuzumab-MC-val-cit-MMAF (sem a fração PAB auto-sacrifical; grupos 2 e 3) mostroram alterações dependentes da dosagem típica para conjugados MMAF; a extensão das alterações foi menor se comparada com um conjugado de comprimento total MC-val-cit-PAB-MMAF (grupo 8) . As contagens de plaquetas no dia 5 estavam a cerca de 30 % dos valores basais em animais do grupo 3 (alta dose de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF) comparado com 15 % nos animais do grupo 8 (alta dose de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF) . A elevação das enzimas hepáticas AST e ALT, de bilirrubina e a extensão de trombocitopenia foi mais evidente em animais tratados com trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF (grupos 4 e 5) de uma maneira dependente da dose; animais do grupo 5 (grupo de alta dosagem) mostrou, no dia 5, níveis de ALT de cerca de ΙΟχ o valor basal e as plaquetas estavam reduzidas em cerca de 90 % no momento da necropsia.
Ratos Sprague-Dawley fêmeas foram também dosados com altos níveis (Exemplo 19, Estudo de Alta Dosagem: Grupos 2, 3, 4) com trastuzumab-MC-MMAF, e Veículo de controlo (Grupo 1) . Sinais leves de toxicidade foram observados, incluindo uma elevação dependente da dosagem das enzimas hepáticas ALT, AST e GGT. No dia 5 os animais no grupo de dosagem mais elevada mostraram uma elevação de 2 vezes na ALT e uma elevação de 5 vezes na AST; GGT também está elevada (6U/L). Os níveis enzimáticos mostraram uma tendência para normalização no dia 12. Havia uma granulocitose em todos os três grupos de dosagem no dia 5, a contagem de plaquetas permaneceu essencialmente inalterada em todos os animais. Alterações morfológicas eram leves; os animais tratados no 241 ΕΡ1725249Β1 nível de dose de 4210 pg/m2 (Grupo 2) mostram histologia não relevante do fígado, baço, timo, intestinos e medula óssea. Atividade apoptótica e mitótica levemente aumentada foi observada no timo e fígado, respetivamente nos animais tratados no nível de dose de 5500 pg/m2 (Grupo 3). A medula óssea estava normocelular, mas mostrava evidência de hiperplasia granulocítica, que é consistente com a granulocitose absoluta observada nas contagens sanguíneas periféricas nestes animais. Animais na dose mais elevada no grupo 4 mostram qualitativamente as mesmas características; a atividade mitótica no fígado parece um pouco aumentada se comparada com animais no Grupo 3. Também, hematopoiese foi observada no baço e fígado.
EphB2R é um tipo de recetor de tirosina cinase 1 TM com homologia próxima entre ratinho e ser humano, e é sobre-expressa em células de cancro colorretal. 2H9 é um anticorpo contra EphB2R. O anticorpo nu não possui efeito no crescimento do tumor, mas 2H9-val-cit-MMAE mataram células que expressam EphB2R e mostraram eficácia num modelo de xenoenxerto usando tumores de cólon humano CXF1103 (Mao et al. (2004) Câncer Res. 64:781-788). 2H9 e 7C2 são ambos anticorpos de ratinho IgGl anti-HER2. Os perfis de toxicidade de 2H9-MC-val-cit-PAB-MMAF (3,7 MMAF/Ab), 7C2-MC-val-cit-PAB-MMAF (4 MMAF/Ab), e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF (5,9 MMAF/Ab) foram comparados. As diferenças na estrutura de cada imuno-conjugado ou fração de fármaco do imuno-conjugado podem afetar a farmacocinética e em último caso, o perfil de segurança. O anticorpo trastuzumab humanizado não se liga de forma apreciável a tecido de rato, e qualquer toxicidade seria considerada não específica. 242 ΕΡ1725249Β1
TOXIDADE/SEGURANÇA EM MACACO CYNOMOLGUS
Similar ao estudo de toxicidade/segurança com ratos, macacos cynomolgus foram tratadas com ADC seguido por medições de enzima hepática e inspeção e análise dos efeitos em vários órgãos. Observações gerais incluíram alterações nos pesos corporais e sinais de lesões e sangramento. Parâmetros de patologia clínica (química sérica e hematologia) , histopatologia, e necropsia foram conduzidos em animais dosados (Exemplo 19). 0 conjugado de anticorpo-fármaco, H-MC-vc-PAB-MAAE (H = trastuzumab ligada através de cisteína) não mostraram evidência de toxicidade hepática em qualquer nível de dosagem testado. Granulócitos sanguíneos periféricos mostraram depleção após uma dose única de 1100 mg/m2 com recuperação completa 14 dias após a dose. O conjugado de anticorpo- fármaco H-MC-vc-PAB-MMAF mostrou elevação de enzimas hepáticas no nível de dosagem de 550 (transiente) e 880 mg/m2, nenhuma evidência de granulocitopenia, e um declínio transiente, dependente da dose (grupos 2 & 3) de plaquetas.
4.6 SÍNTESE DOS COMPOSTOS DA INVENÇÃO
Os Compostos Exemplares e Conjugados Exemplares podem ser feitos usando os procedimentos sintéticos descritos a seguir nos Esquemas 5-16. Conforme descrito em maiores pormenores a seguir, os compostos Exemplares ou Conjugados Exemplares podem ser convenientemente preparados usando um Ligante que tem um local reativo para ligação ao Fármaco e Ligando. Num aspeto, um Ligante tem um local reativo que tem um grupo eletrofílico que é reativo a um grupo nucleofílico presente num Ligando, tal como, mas não limitado a um anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis de um 243 ΕΡ1725249Β1 anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos sulfidrilo, hidroxilo e amino. 0 heteroátomo do grupo nucleofilico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofilico de um Ligante e forma uma ligação covalente com uma unidade de Ligante. Grupos eletrofilicos úteis incluem, mas não se limitam a grupos maleimida e haloacetamida. 0 grupo eletrofilico proporciona um local conveniente para anexação do anticorpo.
Numa outra forma de realização, um Ligante possui um local reativo que tem um grupo nucleofilico que é reativo a um grupo eletrofilico presente num anticorpo. Grupos eletrofilicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos aldeido e cetona carbonilo. 0 heteroátomo de um grupo nucleofilico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofilico num anticorpo e formar uma ligação covalente para uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofilicos úteis num Ligante incluem, mas não se limitam a hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, hidrazina carboxilato, e arilidrazida. 0 grupo eletrofilico num anticorpo proporciona um local conveniente para anexação a um Ligante.
Grupos funcionais de ácido carboxilico e grupos funcionais de cloroformato são também locais reativos úteis para um Ligante porque podem reagir com grupos amino secundários de um Fármaco para formar uma ligação de amida. Também útil como um local reativo é um grupo funcional carbonato num Ligante, tal como, mas não limitado a carbonato de p-nitrofenilo, que pode reagir com um grupo amino de um Fármaco, tal como, mas não limitado a N-metil valina, para formar uma ligação de carbamato. Tipicamente, Fármacos à base de péptido podem ser preparados pela formação de uma ligação de péptido entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de péptido. Estas ligações de 244 ΕΡ1725249Β1 péptido podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (veja-se E. Schrõder e K. Lubke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptido. A síntese de um Estirador que tem um grupo maleimida eletrofílico é ilustrada a seguir nos Esquemas 8-9. Métodos sintéticos gerais úteis para a síntese de um Ligante são descritos no Esquema 10. O Esquema 11 mostra a construção de uma unidade de Ligante que tem um grupo val-cit, um grupo maleimida eletrofílico e um grupo Espaçador auto-sacrifical. O esquema 12 ilustra a síntese de um Ligante que tem o grupo phe-lys, um grupo maleimida eletrofílico, com e sem o grupo Espaçador auto-sacrifical PAB. O Esquema 13 apresenta uma descrição geral para a síntese de um Composto de Fármaco-Ligante, enquanto o Esquema 14 apresenta uma via alternativo para preparar um Composto de Fármaco-Ligante. O Esquema 15 ilustra a síntese de um ligante ramificado que contém um grupo BHMS. O Esquema 16 descreve a anexação de um anticorpo a um Composto de Fármaco-Ligante para formar um Conjugado de Fármaco-Ligante-Anticorpo, e o Esquema 14 ilustra a síntese de conjugados Fármaco-Ligante-Anticorpo que tem, por exemplo, mas não limitado a 2 ou 4 fármacos por Anticorpo.
Conforme descrito em maiores pormenores a seguir, os Conjugados Exemplares são convenientemente preparados usando um Ligante que tem dois ou mais Locais Reativos para ligação ao Fármaco e um Ligando. Num aspeto, um Ligante tem um local Reativo que possui um grupo eletrofílico que é reativo a um grupo nucleofílico presente num Ligando, tal como um anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos sulfidrilo, hidroxilo e amino. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um 245 ΕΡ1725249Β1 anticorpo é reativo a um grupo eletrofílico num Ligante e forma uma ligação covalente com uma unidade de Ligante. Grupos eletrofilicos úteis incluem, mas não se limitam a grupos maleimida e haloacetamida. 0 grupo eletrofílico proporciona um local conveniente para anexação de anticorpo.
Numa outra forma de realização, um Ligante tem um local Reativo que tem um grupo nucleofilico que é reativo a um grupo eletrofílico presente num Ligando, tal como um anticorpo. Grupos eletrofilicos úteis num anticorpo incluem, mas não se limitam a grupos aldeído e cetona carbonilo. 0 heteroátomo de um grupo nucleofilico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico num anticorpo e formar uma ligação covalente com uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofilicos úteis num Ligante incluem, mas não se limitam a hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, hidrazida carboxilato, e arilidrazida. 0 grupo eletrofílico num anticorpo proporciona um local conveniente para anexação a um Ligante.
4.6.1 SÍNTESE DE FRAÇÃO DE FÁRMACO
Tipicamente, Fármacos baseados em péptido podem ser preparados pela formação de uma ligação de péptido entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de péptido. Estas ligações de péptido podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (veja-se e. Schrõder e K. Lubke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965, Academíc Press) que é bem conhecido no campo da química de péptido.
As frações de fármaco auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos gerais de: Patente US N° 5635483; Patente US N° 5780588; Pettit et al. (1989) 246 ΕΡ1725249Β1 J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; e Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863.
Numa forma de realização, um Fármaco é preparado pela combinação de um equipamento aproximadamente estequiométrico de um dipéptido e um tripéptido, preferivelmente numa reação de um pote sob condições de condensação adequadas. Esta abordagem é ilustrada nos Esquemas 5-7, a seguir. de a 0 Esquema 5 ilustra a síntese de uma unidade F tripéptido N- terminal que é um intermediário útil para síntese dos compostos de fármaco de Fórmula Ib.
Esquema 5
Rs Re % 1 Rs ή2 o m PEPC, Et3N % H Ο Π7
VfVrY
SVRsRe Ra O
Ra Ο I
g F
Conforme ilustrado no Esquema 5, um aminoácido protegido A (onde GP representa um grupo protetor de amina, R4 é selecionado a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -arilo, alquil-arilo, alquilo-(carbociclo C3- C8) , heterociclo C3-C8, alquilo- (heterociclo C3-C8) , onde R5 é selecionado a partir de H e metilo; ou R4 e R5, conjuntamente, têm a fórmula -(CRaRb)n- 247 ΕΡ1725249Β1 onde Ra e Rb são, independentemente, selecionados a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8 e carbociclo C3-C8 e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; e forma um anel com o átomo de carbono ao qual eles são unidos) é acoplado a éster t-butílico B (onde R6 é selecionado a partir de -H e alquilo -Ci-C8; e R7 é selecionado a partir de hidrogénio, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -arilo, alquil-arilo, alquilo-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo-(heterociclo C3-C8) , sob condições de acoplamento adequadas, por exemplo, na presença de PyBrop e diisopropiletilamina, ou usando DCC (veja-se, por exemplo, Miyazaki, K. et ai. Chem. Pharm. Buli. 1995, 43(10), 1706-1718) .
Grupos protetores adequados GP, e métodos sintéticos adequados para proteger um grupo amino com um grupo protetor são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Greene, T.W. e Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2a. Edição, 1991, John Wiley & Sons. Aminoácidos protegidos exemplares A são GP-lle e, especificamente, GP-Val, enquanto outros aminoácidos protegidos adequados incluem sem limitação: GP-cicloexilglicina, GP- cicloexilalanina, ácido GP-aminociclopropano-1- carboxilico, ácido GP-aminoisobutirico, GP-fenilalanina, GP-fenilglicina, e GP-terc-butilglicina. Z é um grupo protetor exemplar. Fmoc é um outro grupo protetor exemplar. Um éster t-butílico B exemplar é éster t-butilico dolaisoleucina. O dipeptideo C pode ser purificado, por exemplo, usando cromatografia, e subsequentemente desprotegido, por exemplo, usando H2 e 10 % de Pd-C em etanol quando GP é benziloxicarbonilo, ou usando dietilamina para remoção de um grupo protetor Fmoc. A amina D resultante prontamente forma uma ligação de péptido com um aminoácido BB (onde R1 248 ΕΡ1725249Β1 é selecionado a partir de -H, alquilo - Ci-C8, e carbociclo -C3-C8; e R2 é selecionado a partir de -H e alquilo -Ci-C8; ou R1 e R2, conjuntamente, têm a fórmula -(CRaRb)n- onde Ra e Rb são, independentemente, selecionados a partir de -H, alquilo -Ci-C8 e carbociclo -C3-C8 e n é selecionado a partir de 2, 3,4, 5 e 6; e forma um anel com o átomo de nitrogénio ao qual eles são unidos; e R3 é selecionado a partir de hidrogénio, alquilo Ci-C8, carbociclo C3-C8, -0- (alquilo Ci-Cs) , -arilo, alquil-arilo, alquilo-(carbociclo C3-C8) , heterociclo C3-C8, e alquilo-(heterociclo C3- C8) ) . N,N-Dialquil aminoácidos são aminoácidos exemplares para BB, tal como o comercialmente disponível, N,N-dimetil valina. Outros N,N-dialquil aminoácidos podem ser preparados por bis-alquilação redutiva usando procedimentos conhecidos (veja-se, por exemplo, Bowman, R.E., Stroud, H.H. J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340). Fmoc-Me-L-Val e Fmoc-Me-L-glicina são dois aminoácidos exemplares BB úteis para a síntese de derivados de iV-monoalquilo. A amina D e o aminoácido BB reagem para proporcionar o tripéptido E usando reagente de acoplamento DEPC com trietilamina como a base. 0 grupo protetor de terminal C de E é subsequentemente desprotegido usando HC1 para proporcionar o composto de tripéptido de fórmula F.
Metodologia ilustrativa de acoplamento de DEPC e a metodologia de acoplamento de PyBrop mostrada no Esquema 5 são descritas a seguir no Procedimento Geral A e Procedimento Geral B, respetivamente. Metodologia ilustrativa para a desproteção de uma amina protegida Z através de hidrogenação catalítica é descrita a seguir no Procedimento Geral C.
Procedimento Geral A: Síntese de Péptido usando DEPC. 0 aminoácido N-protegido ou N, N-bissubstituído ou péptido D (1,0 eq.) e uma amina BB (1,1 eq.) são diluídos com um 249 ΕΡ1725249Β1 solvente orgânico aprótico, tal como diclorometano (0,1 a 0,5 M). Uma base orgânica tal como trietilamina ou diisopropiletilamina (1,5 eq.) é, então, adicionada, seguido por DEPC (1,1 eq.). A solução resultante é agitada, preferivelmente sob árgon, durante até 12 horas enquanto é monitorizada por HPLC ou TLC. O solvente é removido a vácuo na temperatura ambiente, e o produto bruto é purificado usando, por exemplo, HPLC ou cromatografia de coluna de fulgor (coluna de sílica gel) . Frações relevantes são combinadas e concentradas á vácuo para suportar tripéptido E que é seco sob vácuo durante a noite.
Procedimento Geral B: Síntese de Péptido usando PyBrop. O aminoácido B (1,0 eq.), opcionalmente que tem um grupo protetor carboxilo, é diluído com um solvente orgânico aprótico tal como diclorometano ou DME para proporcionar uma solução com uma concentração entre 0,5 e 1,0 mM, e então é adicionada diisopropiletilamina (1,5 eq.) . Aminoácido A protegido por Fmoc- ou Z- (1,1 eq.) é adicionado como um sólido numa fração, então é adicionado PyBrop (1,2 eq.) à mistura resultante. A reação é monitorizada por TLC ou HPLC, seguido por um procedimento de preparação similar àquele descrito no Procedimento Geral A.
Procedimento Geral C: Remoção de Z através de hidrogenação catalítica. Aminoácido protegido por Z ou péptido C é diluído com etanol para proporcionar uma solução com uma concentração entre 0,5 e 1,0 mM num recipiente adequado, tal como um balão de fundo redondo de paredes espessas. Adiciona-se 10 % de paládio em carbono (5-10 % p/p) e a mistura de reação é colocada sob atmosfera de hidrogénio. O progresso da reação é monitorizado usando HPLC e está completa, geralmente, dentro de 1-2 horas. A mistura de reação é filtrada através de uma almofada de 250 ΕΡ1725249Β1 celite pré-lavada e a celite é novamente lavada com um solvente orgânico polar, tal como metanol após a filtração. A solução de eluente é concentrada a vácuo para suportar um resíduo que seja diluído com um solvente orgânico, preferivelmente tolueno. 0 solvente orgânico é, então, removido a vácuo para suportar a amina desprotegida C. 0 esquema 6 mostra um método útil para preparar um dipéptido de terminal C de fórmula K e um método para acoplamento do dipéptido de fórmula K com o tripéptido de fórmula F para preparar compostos de fármaco de Fórmula Ib.
Esquema 6
0 dipéptido K pode ser prontamente preparado pela condensação do aminoácido modificado Boc-dolaproína G (veja-se, por exemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 251 ΕΡ1725249Β1 1996, 719-725), com uma amina de fórmula H usando agentes de condensação bem conhecidos para química de péptido, tal como, por exemplo, DEPC na presença de trietilamina, conforme mostrado no Esquema 5. 0 dipéptido de fórmula K pode, então, ser acoplado com um tripéptido de fórmula F usando o Procedimento Geral D para preparar os compostos de fármaco protegidos Fmoc de fórmula L, que podem ser subsequentemente desprotegidos usando o Procedimento Geral E de modo a proporcionar os compostos de fármaco de fórmula (Ib).
Procedimento Geral D: Síntese de Fármaco. Uma mistura de dipéptido K (1,0 eq.) e tripéptido F (1 eq.) é diluída com um solvente orgânico aprótico, tal como diclorometano, para formar uma solução de 0,1 M; então um ácido forte, tal como ácido trifluoroacético (1/2 p/p) é adicionado e a mistura resultante é agitada sob atmosfera de nitrogénio durante duas horas a 0 °C. A reação pode ser monitorizada usando TLC ou, preferivelmente, HPLC. O solvente é removido a vácuo e o resíduo resultante é azeotropicamente seco duas vezes, preferivelmente usando tolueno. O resíduo resultante é seco sob alto vácuo durante 12 horas e então diluído com um solvente orgânico aprótico, tal como diclorometano. Uma base orgânica tal como trietilamina ou diisopropiletilamina (1,5 eq.) é, então, adicionada, seguida tanto por PyBrop (1,2 eq.) quanto por DEPC (1,2 eq.) dependendo da funcionalidade química no resíduo. A mistura de reação é monitorizada tanto por TLC quanto HPLC e ao término, a reação é submetida a um procedimento de preparação similar ou idêntico àquele descrito no Procedimento Geral A.
Procedimento Geral E: Remoção de Fmoc usando dietilamina. Um Fármaco protegido por Fmoc L é diluído com um solvente orgânico aprótico tal como diclorometano e à 252 ΕΡ1725249Β1 solução resultante é adicionada dietilamina (1/2 p/p). 0 progresso da reação é monitorizado por TLC ou HPLC e está tipicamente completa dentro de 2 horas. A mistura de reação é concentrada a vácuo e o resíduo resultante é seco azeotropicamente, preferivelmente usando tolueno, então é seco sob vácuo elevado para suportar o Fármaco lb que tem o grupo amino desprotegido. 0 Esquema 7 mostra um método útil para preparar derivados de MMAF.
Esquema 7
(Ib) onde Z é -O- e R11 é -H 253 ΕΡ1725249Β1 0 polipéptido Ο pode ser prontamente preparado pela condensação do aminoácido modificado Boc-dolaproina G (veja-se, por exemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), com uma amina de fórmula M usando agentes de condensação bem conhecidos para química de péptido, tal como, por exemplo, DEPC na presença de trietilamina, conforme mostrado nos Esquemas 5 e 6. 0 dipéptido de fórmula O pode, então, ser acoplado com um tripéptido de fórmula F usando o Procedimento Geral D para preparar os compostos MMAF protegidos com Fmoc de fórmula P, que podem ser subsequentemente desprotegidos usando o Procedimento Geral E de modo a proporcionar os compostos de fármaco MMAF.
Dessa maneira, os métodos acima são úteis para preparar Fármacos que podem ser usados na presente invenção.
4.6.2 SÍNTESE DE LIGANTE DE FÁRMACO
Para preparar um Composto de Fármaco-Ligante da presente invenção, o Fármaco é feito reagir com um local reativo no Ligante. No geral, o Ligante pode ter a estrutura:
Local Reativo 2
Ww-Yy.
Local Reativo 1 de o quando uma unidade de Espaçador (-Y-) e uma unidade Estirador (-A-) estão presentes. Alternativamente, Ligante pode ter a estrutura:
Local Reativo 2
Aa~Ww
Local Reativo 1 quando a unidade de Espaçador (-Y-) está ausente. 254 ΕΡ1725249Β1 0 Ligante pode também ter a estrutura: ΕΡ1725249Β1 Local Reativo 2
Ww
Local Reativo 1 quando a unidade de Estirador (-A-) e a unidade de Espaçador (-Y-) estão ausentes. 0 Ligante pode ter também a estrutura:
Local Reativo 2.
Aa·
Local Reativo 1 quando a unidade de Aminoácido (W) e a unidade de Espaçador (Y) estão ausentes.
No geral, um Ligante adequado tem uma unidade Aminoácido ligada a uma unidade de Estirador opcional e uma Unidade de Espaçador opcional. 0 Local Reativo 1 está presente no terminal do Espaçador e o local Reativo 1 está presente no terminal do Estirador. Se uma unidade de Espaçador não estiver presente, então o local Reativo 1 está presente no terminal C da unidade de Aminoácido.
Numa forma de realização exemplar da invenção, o Local Reativo N° 1 é reativo a um átomo de nitrogénio do Fármaco, e o Local Reativo N° 2 é reativo a um grupo sulfidrilo no Ligando. Locais Reativos 1 e 2 podem ser reativos a grupos funcionais diferentes.
Num aspeto da invenção, o Local Reativo N- 1 é COOH.
Num outro aspeto da invenção, o Local Reativo N° 1 é
Em ainda um outro aspeto da invenção, o Local Reativo N° 1 é um p-nitrofenilo carbonato que tem a fórmula 255 ΕΡ1725249Β1 Ο
Num aspeto da invenção, o Local Reativo N° 2 é um grupo de aceitação de tiol. Grupos de aceitação de tiol adequados incluem grupos haloacetamida que tem a fórmula
orV
O em que X representa um grupo abandonante, preferivelmente O-mesilo, O-tosilo, -Cl, -Br, ou -I, ou um grupo maleimida que tem a fórmula
O
o
Ligantes úteis podem ser obtidos através de fontes comerciais, tal como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO) , ou preparados conforme resumido nos Esquemas 8-10 a seguir. 256 ΕΡ1725249Β1
Esquema 8
em que X é -CH2- ou - CH2OCH2-; e n é um número inteiro de 0-10 quando X é - CH2-; ou 1-10 quando X é - CH2OCH2- 0 método mostrado no Esquema 9 combina maleimida com um glicol sob condições de Mitsunobu e faz um Estirador polietileno glicol maleimida (veja-se, por exemplo, Walker, M.A. J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5), seguido por instalação de um grupo de Local Reativo carbonato de p-nitrofenilo. 257 ΕΡ1725249Β1
Esquema 9 ΕΡ1725249Β1
Q οπ ρ w Ο
ο Cl
d^.DCM t
o R em que E é -CH2- ou -CH2OCH2-; e n é um número inteiro de 0-8
Alternativamente, estiradores PEG-maleimida e peg-haloacetamida podem ser preparados conforme descrito por Frisch, et al., Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-186. 0 Esquema 10 ilustra uma síntese geral de uma unidade de Ligante ilustrativa contendo um grupo Estirador maleimida e opcionalmente um Espaçador auto-sacrifical p-aminobenzil éter. 258 ΕΡ1725249Β1
Esquema 10
1. NsHCíJj, DME/HgO a. SEQQ,
HaN-
PmoCs
iH S{m»0} 1, ífiatifeírana,
í, NaHCQu, DMBHaO 2. dialílarrena .CHjCU 3. co!T>pQsto B, OMP a. R, Dl EA, CHjCÍ2 3.(S9Í4- nitfofeni:i)caibon3Ío DiEA, CHgCIu
M % R‘= ΕημίζϊϊοΙ. R^CH^íNHMft (U) R1k isoprapBo; R^CHjjjNHCONHz (V)
em que Q é alquilo -Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4, e n é um número inteiro que varia de 0-10.
Estiradores úteis podem ser incorporados a um Ligante usando os intermediários comercialmente disponíveis da Molecular Biosciences (Boulder, CO) descritos a seguir, através da utilização de técnicas conhecidas de síntese orgânica. Estiradores de Fórmula (Illa) podem ser introduzidos num Ligante através da reação dos intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido conforme ilustrados nos Esquemas 11 e 12.
em que n é um número inteiro que varia de 1-10 e T é -H ou -S03Na; 259 ΕΡ1725249Β1
e
Unidades de Estirador de fórmula introduzidas num Ligante pela reação dos seguir com o terminal N de uma unidade de (Illb) podem ser intermediários a Aminoácido: 260 ΕΡ1725249Β1
em que X e -Br ou -I
intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido:
261 ΕΡ1725249Β1
Unidades de Estirador de fórmula (Va) podem ser introduzidas num Ligante através da reação dos intermediários a seguir com o terminal N de uma unidade de Aminoácido:
Outros Estiradores úteis podem ser sintetizados de acordo com procedimentos conhecidos. Estiradores de Aminooxi da fórmula mostrada a seguir podem ser preparados através do tratamento de haletos de alquilo com N- Boc-hidroxilamina de acordo com os procedimentos descritos por Jones, D.S. et al., Tetrahedron Letters, 2000, 41(10), 1531-1533; e Gilon, C. et al., Tetrahedron, 1967, 23(11), 4441-4447. NH2-0-R1'7-c(o>-; em que R17 é selecionado a partir de alquileno -C1-C10-, carbociclo -C3-C8-, -O-(alquilo Ci-C8)-, -arileno-, alquileno-arileno -Ci-Ci0-, -arileno-Ci-Ci0 alquileno-, alquileno - C1-C1O- (carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno Ci-Ci0-, heterociclo - C3-C8-, alquileno -Ci-Ci0- 262 ΕΡ1725249Β1 (heterociclo C3-C8)-, - (heterociclo C3-C8)-alquileno -C1-C10-, - (CH2CH20) r-, e (CH2CH20) r-CH2-; e r é um inteiro que varia de 1-10.
Estiradores de isotiocianato da fórmula mostrada a seguir podem ser preparados de cloretos de ácido isotiocianato carboxilico conforme descrito na Angew. Chem. 1975, 87 (14) :517. S=C=N-Rn-C(0>- em que R17 é conforme descrito no presente documento. O Esquema 11 mostra um método para obter um ligante de dipéptido val-cit que tem um Estirador de maleimida e opcionalmente um Espaçador auto-sacrifical p-aminobenzila 263 ΕΡ1725249Β1
Esquema 11
A» 2» Hf /=» em que Q é alquilo -Ci-Cs, -O- (alquilo Ci-Cs) , halogénio, nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4.
O Esquema 12 ilustra a síntese de uma unidade de Ligante de dipéptido phe-lys(Mtr) que tem uma unidade de Estirador maleimida e uma unidade de Espaçador auto-sacrifical p-aminobenzilo. Material de partida AD (lys(Mtr)) está comercialmente disponível (Bachem,
Torrance, CA) ou pode ser preparado de acordo com Dubowchik, et al. Tetrahedron Letters (1997) 38:5257-60. 264 ΕΡ1725249Β1
Esquema 12
p-niircfemi-OCOa· p-nitrefenilo (2.0 DiEA(Í.Ssq.),DMF
em que Q é alquilo -Ci-C8, -0-(alquilo Ci-C8) , -haloqénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4.
Conforme mostrado no Esquema 13, um Ligante pode ser feito reagir com um grupo amino de um Composto de Fármaco de Fórmula (Ib) para formar um Composto de Fármaco-Ligante que contém um grupo amida ou carbamato, ligando a unidade de Fármaco com a unidade de Ligante. Quando o Local de Reação N° 1 é um grupo ácido carboxilico, como no Ligante AJ, a reação de acoplamento pode ser executada usando HATU ou PyBrop e uma base de amina apropriada, resultando num 265 ΕΡ1725249Β1
Composto de Fármaco-Ligante AK, contendo uma ligação de amida entre a unidade de Fármaco e a unidade de Ligante. Quando o Local de Reação N° 1 for um carbonato, como no Ligante AL, o Ligante pode ser acoplado ao Fármaco usando HOBt numa mistura de DMF/piridina para proporcionar um Composto de Fármaco-Ligante AM, contendo uma ligação carbamato entre a unidade de Fármaco e a unidade de Ligante
Alternativamente, quando o Local Reativo N- 1 for um bom grupo abandonante, tal como no Ligante AN, o Ligante pode ser acoplado com um grupo amina de um Fármaco através de um processo de substituição nucleofilico para proporcionar um Composto de Fármaco-Ligante que tem uma ligação de amina (AO) entre a unidade de Fármaco e a unidade de Ligante. Métodos ilustrativos úteis para ligação de um Fármaco a um Ligando para formar um Composto de Fármaco-Ligante são ilustrados no Esquema 13 e são descritos nos Procedimentos Gerais G-H.
Esquema 13HATU
HOBt Qt -**
Fàrmaco-NH-C(O)* Ligante AK
Fármaco 4· Ligante-COOH (Ib) AJ Ϊ Fármaco + Ligante -O C O (lb) AL
OII Fârmaco-NH—G—O- LiganteAM base
Fármaco—N- Ligante AO Fármaco + (Ib)
Ligante -XAN
Procedimento Geral G: Formação de Amida usando HATU.
Um Fármaco (Ib) (1,0 eq.) e um Ligante N-protegido contendo um local Reativo de ácido carboxilico (1,0 eg.) são 266 ΕΡ1725249Β1 diluídos com um solvente orgânico adequado, tal como diclorometano, e a solução resultante é tratada com HATU (1,5 eq.) e uma base orgânica, preferivelmente piridina (1,5 eq.) . A mistura de reação é deixada agitar sob uma atmosfera inerte, preferivelmente árgon, durante 6 horas, em cujo período de tempo a mistura de reação é monitorizada usando HPLC. A mistura de reação é concentrada e o resíduo resultante é purificado usando HPLC para resultar na amida de fórmula AK.
Procedimento H: Formação de carbamato usando HOBt. Uma mistura de um Ligante AL que tem um local Reativo carbonato de p-nitrof enilo (1,1 eq.) e Fármaco (Ib) (1,0 eq.) é diluída com um solvente orgânico aprótico, tal como DMF, para proporcionar uma solução que tem uma concentração de 50-100 nM, e a solução resultante é tratada com HOBt (2,0 eq.) e colocada em atmosfera inerte, preferivelmente árgon. A mistura de reação é deixada agitar durante 15 minutos, então uma base orgânica, tal como piridina (1/4 v/v) é adicionada e o progresso da reação é monitorizado usando HPLC. O Ligante é tipicamente consumido dentro de 16 horas. A mistura de reação é, então, concentrada no vácuo e o resíduo resultante é purificado usando, por exemplo, HPLC para resultar no carbamato AM.
Um método alternativo para preparar Compostos Fármaco-Ligante é descrito no Esquema 14. Usando o método do Esquema 14, o fármaco é unido a uma unidade Ligante parcial (por exemplo, ZA) , que não possui uma unidade de Estirador unida. Isto proporciona o intermediário AP, que tem uma unidade de Aminoácido que tem terminal N protegido com Fmoc. O grupo Fmoc é, então, removido e o intermediário de Amina AQ resultante é, então, unido a uma unidade de Estirador através de uma reação de acoplamento catalisada usando PyBrop ou DEPC. A construção de Compostos Fármaco- 267 ΕΡ1725249Β1 ΕΡ1725249Β1 um
Ligante contendo um Estirador de bromoacetamida AR ou Estirador de maleimida PEG AS é ilustrado no Esquema 14. 268 ΕΡ1725249Β1
Esquema 14 ΕΡ1725249Β1 + Fãrmaco m HOBt pírkfina
O
O
AP
Dtetiismina:
em que Q é alquilo -Ci-C8, -0- (alquilo Ci-C8) , -halogénio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro que varia de 0-4. A metodologia útil para a preparação de uma unidade de Ligante contendo um espaçador ramificado é mostrada no Esquema 15. 269 ΕΡ1725249Β1 Esquema 15
1.1 ΜΗΟ,ΤΗΡ 3. fianey hkfraztna MeCWTHF
BA Ra
NOa 0 Esquema 15 ilustra a síntese de um ligante dipéptido val-cit que tem uma unidade de Estirador de maleimida e uma unidade bis(4- hidroxímetil)estíreno (BHMS). A síntese do intermediário BHMS (AW) foi melhorada em relação a procedimento anteriores da literatura (veja-se Publicação Internacional N° WO 9813059 de Firestone et al., e Crozet, M.P.; Archaimbault, G.; Vanelle, P., Nouguier, R. Tetrahedron Lett. (1985) 26:5133-5134) e utiliza como materiais de partida dietil(4-nitrobenzil)fosfonato (AT) , comercialmente disponível, e 2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-ona 270 ΕΡ1725249Β1 (AU), comercialmente disponível. Ligantes AY e BA podem ser preparados do intermediário AW usando a metodologia descrita no Esquema 9.
4.6.3 LIGANTES DENDRÍTICOS 0 ligante pode ser um ligante do tipo dendrítico para anexação covalente de mais de uma fração de fármaco através de uma fração ligadora de ramificação, multifuncional a um Ligando, tal como, mas não limitada a um anticorpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Ligantes dendríticos podem aumentar a proporção molar de fármaco para anticorpo, isto é, a carga, que está relacionada com a potência do Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando. Dessa maneira, onde um anticorpo engenheirado de cisteina suporta apenas um grupo cisteina tiol reativo, uma variedade de frações de fármaco pode ser unida através de um ligante dendrítico.
As formas de realização exemplares a seguir de reagentes de ligante dendrítico permitem que até nove reagentes de fração de fármaco nucleofílicos sejam conjugados pela reação com os grupos funcionais cloroetil mostarda nitrogenada:
271 ΕΡ1725249Β1
CHaOCHgC H3CMHCH3CYâ
4.6.4 CONJUGAÇÃO DE FRAÇÕES DE FARMACO A ANTICORPOS O Esquema 16 ilustra metodologia útil para preparar conjugados Fármaco-Ligante-Ligando que tem cerca de 2 a cerca de 4 fármacos por anticorpo. Um anticorpo é tratado com um agente de redução, tal como ditiotreitol (DTT) para reduzir alguns ou todos os resíduos de bissulfeto de cisteína para formar grupos cisteina tiol altamente nucleofílicos (- CH2SH) . 0 anticorpo parcialmente reduzido reage, dessa maneira, com compostos fármaco-ligante, ou reagentes de ligante, com grupos funcionais eletrofilicos tais como maleimida ou α-halo carbonilo, de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773.
Esquema 16
Composto de DTT . Fármaco-Líganie Conjugado de Fàrnaaco-Ligante-Lkjaude
Anticorpo ► Anticorpo Parciaimente Reduzido a- com Carga de Fãrmsco Reduzida 272 ΕΡ1725249Β1
Por exemplo, um anticorpo, isto é, ACio, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio com pH 8,0 é tratado com um excesso de 100 mM de ditiotreitol (DTT). Após incubação a 37 °C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição com resina Sephadex G25 e eluida com PBS com 1 mM DTPA. O valor tiol/Ab é verificado por determinação da concentração do anticorpo reduzido da absorvância de 280 nm da solução e a concentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e determinação da absorvância 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é arrefecido em gelo. O ligante de fármaco, por exemplo, MC-val-cit-PAB- MMAE em DMSO, dissolvido em acetonitrilo e água na concentração conhecida é adicionado ao anticorpo reduzido arrefecido em PBS. Após cerca de 1 hora, maleimida em excesso é adicionada para resfriar rapidamente a reação e capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o ADC, por exemplo, ACi0-MC-vc-PAB-MMAE, é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 pm sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Uma variedade de conjugados de anticorpo fármaco (ADC) foi preparada, com uma variedade de ligantes, e as frações de fármaco MMAE e MMAF. O quadro a seguir é um grupo exemplar de ADC que foi preparado seguindo o protocolo do Exemplo 27, e caracterizado por HPLC e ensaio de carga de fármaco.
Quantidade Isolada (mg) 1,75 46, 8
Proporção de Fármaco/Ab 4 4,4
Alvo ADC (antigénio)
0772P 16E12-MC-vc-PAB-MMAE
Exemplo de referência 0772P llDIO-MC-vc-PAB-MMAE
Exemplo de referência 273 ΕΡ1725249Β1 0772Ρ llDIO-MC-vc-PAB-MMAF 54,5 co 00 Brevican Brevi can-MC-MMAF 2 6 Brevican Brevican-MC-vc-MMAF 2 6 Brevican Brevican-MC-vc-PAB-MMAF 1,4 6 CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 38,1 4,3 CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAF 43 4,1 CRIPTO 11F4-MC-VC-PAB-MMAF 6 4,8 CRIPTO 25G8-MC-vc-PAB-MMAF 7,4 4,7 EI 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 2,3 4,6 EI 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 2,9 4,6 EI 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 1,4 3,8 EI 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 5,1 4 EI 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 3 4,6 EI 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 4,8 4,1 EI 6 385-MC-vc-PAB-MMAF 24,7 4,4 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 29, 9 7,1 EphB2R 2H9-MC-fk-PAB-MMAE Exemplo de referência 25 7,5 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 175 4,1 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 150 3,8 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 120 3,7 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 10,7 4,4 IL-20Ra IL2 ORa-fk-MMAE Exemplo de referência 26 6,7 IL-20Ra IL2 ORa-vc-MMAE Exemplo de referência 27 7,3 EphB2 IL8-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 251 3,7 MDP MDP-vc-MMAE Exemplo de referência 32 MPF 19C3-vc-MMAE Exemplo de referência 1,44 6,5 MPF 7D9-VC-MMAE Exemplo de referência 4,3 3,8 MPF 19C3-vc-MMAE Exemplo de referência 7,9 3 MPF 7D 9-MC-vc-P AB-MMAF 5 4,3 Napi3b lOHl-vc-MMAE Exemplo de referência 4,5 4,6 Napi3b 4C9-vc-MMAE 3,0 5,4 274 ΕΡ1725249Β1
Napi3b Exemplo de referência lOHl-vc-MMAE 4,5 Napi3b Exemplo de referência lOHl-vc-MMAF 6,5 NCA 3E 6 -MC- f k-P AB-MMAE 49,6 NCA Exemplo de referência 3E 6-MC-vc-P AB-MMAE 56,2 PSCA Exemplo de referência PSCA-fk-MMAE 51,7 PSCA Exemplo de referência PSCA-vc-MMAE 61,1 Napi3b Exemplo de referência lOHl-MC-vc-PAB-MMAE 75 Napi3b lOHl-MC-vc-PAB-MMAF 95 Napi3b 10H1-MC-MMAF 92 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 79 EphB2R Exemplo de referência 2H9-MC-MMAF 92 0772P 11D10(quimera de Fc) 79 0772P -MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 11D10(quimera de Fc) 70 0772P -MC-vc-PAB-MMAF 11D10 (quimera de Fc)-MC- 23 Brevican MMAF 6D2-MC-vc-PAB-MMAF 0,3 Brevican 6D2-MC-MMAF 0,36 EphB2R 2H9(quimera de Fc) 1983 EI 6 -MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 14,1 EI 6 12B9-MC-vc-PAB-MMAF 16,4 EI 6 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 10,5 EI 6 Exemplo de referência 12G12-MC-vc-PAB-MMAF 10,2 EI 6 3B5-MC-vc-P AB-MMAE 58, 6 EI 6 Exemplo de referência 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 8 0772P 11D10(quimera de Fc) 340 Steapl -MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência (Steapl-92) 3,5 Steapl -MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de referência (Steapl-92)-MC-vc-PAB-MMAF 4,7 Steapl (Steapl-120)-MC-vc-PAB-MMAE 2 Steapl Exemplo de referência (Steapl-120)-MC-vc-PAB-MMAF 2,3 EI 6 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 52,2 ΕΡ1725249Β1
4. 7 COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO
Em outras formas de realização, é descrita uma composição incluindo uma quantidade eficaz de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar e um portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável. Para conveniência, as unidades de Fármaco e Compostos Fármaco-Ligante e Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser referidos como Conjugados Exemplares. As composições são adequadas para administração humana e veterinária.
As composições presentes podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um sólido, liquido ou gás (aerossol) . Vias tipicas de administração incluem, sem limitação, administração oral, tópica, parentérica, sublingual, retal, vaginal, ocular, intratumoral, e intranasal. Administração parentérica inclui injeções subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intra-esternal ou técnicas de infusão. Num aspeto, as composições são administradas parentericamente. Em ainda um outro aspeto, os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições são administrados intravenosamente.
Composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo a permitir que um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar esteja biodisponivel quando a composição é administrada a um paciente. Composições podem ter a forma de uma ou mais unidades de dosagem, onde, por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem, e um recipiente de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar na forma aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem. 276 ΕΡ1725249Β1
Materiais usados na preparação das composições farmacêuticas podem ser atóxicas na quantidade usada. Ficará evidente para aqueles com especialização ordinária na técnica que a dosagem ideal do(s) principio(s) ativo(s) na composição farmacêutica dependerá de uma variedade de fatores. Fatores relevantes incluem, sem limitação, o tipo de animal (por exemplo, ser humano), a forma especifica do Composto Exemplar ou Conjugado Exemplar, a maneira de administração, e a composição utilizada. 0 portador ou veiculo farmaceuticamente aceitável pode ser particulado, de modo que as composições estão, por exemplo, na forma de comprimido ou pó. 0(s) portador(es) pode(m) ser liquido(s), com as composições sendo, por exemplo, um xarope oral ou liquido injetável. Além disso, o(s) portador(es) pode(m) ser gasoso(s) ou particulado(s) , de modo a proporcionar uma composição aerossol útil, por exemplo, para administração inalante.
Quando destinada para administração oral, a composição está preferivelmente na forma sólida ou liquida, e formas semissólidas, semilíquidas, em suspensão ou gel estão incluídas dentro das formas consideradas no presente documento como sólidas ou líquidas.
Como uma composição sólida para administração oral, a composição pode ser formulada num pó, grânulo, comprimido, pílula, cápsula, goma de mascar, bolacha ou forma similar. Esta composição sólida tipicamente contém um ou mais diluentes inertes. Além disso, um ou mais dentre os seguintes pode estar presente: aglutinantes tais como carboxi metil celulose, etil celulose, celulose microcristalina, ou gelatina; excipientes, tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes de desintegração tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho 277 ΕΡ1725249Β1 e similares; lubrificantes tais como estearato de magnésio ou Sterotex; agentes de brilho tais como dióxido de silício; agentes adoçantes tais como sacarose ou sacarina, um agente aromatizante tal como hortelã, salicilato de metilo ou aromatizante de laranja e um agente de coloração.
Quando a composição estiver na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, um portador líquido tal como polietileno glicol, ciclodextrina ou um óleo gordo. A composição pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, um xarope, solução, emulsão ou suspensão. 0 líquido pode ser útil para administração oral ou para administração por injeção. Quando destinado para administração oral, uma composição pode compreender um ou mais dentre um agente adoçante, preservativos, tintura/corante e intensificador de sabor. Numa composição para administração por injeção, um ou mais dentre um tensioativo, preservativo, agente de humedecimento, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotónico podem também ser incluídos.
As composições líquidas, sejam soluções, suspensões ou de outra forma similar, podem também incluir um ou mais dentre os seguintes: diluentes estéreis tais como água para injeção, solução salina, preferivelmente solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotónico, óleos fixos tais como mono ou diglicéridos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfeto de sódio; agentes quelantes tais como ácido etileno diamina tetraacético; 278 ΕΡ1725249Β1 tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. Uma composição parentérica pode ser contida numa ampola, uma seringa descartável ou um balão de doses múltiplas feito de vidro, plástico ou outro material. Solução salina fisiológica é um adjuvante exemplar. Uma composição injetável é preferivelmente estéril. A quantidade de Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar que é efetiva no tratamento de uma distúrbio ou condição especifica dependerá da natureza da distúrbio ou condição e pode ser determinada por técnicas clinicas padrão. Além disso, ensaios in vitro ou in vivo podem, opcionalmente, ser utilizados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais. A dose precisa a ser utilizada nas composições dependerá também da via de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e com as circunstâncias de cada paciente.
As composições compreendem uma quantidade eficaz de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar de modo que uma dosagem adequada seja obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos cerca de 0,01 % de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar em peso da composição. Quando destinada para administração oral, esta quantidade pode variar de cerca de 0,1 % a cerca de 80 % em peso da composição. Num aspeto, composições orais podem compreender de cerca de 4 % a cerca de 50 % do Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar em peso da composição. Em ainda um outro aspeto, as composições presentes são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parentérica contenha de cerca de 0,01 % a cerca de 2 % em peso do Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar. 279 ΕΡ1725249Β1
Para administração intravenosa, a composição pode compreender de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar por kg de peso corporal do animal. Num aspeto, a composição pode incluir de cerca de 1 a cerca de 100 mg de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar por kg do peso corporal do animal. Num outro aspeto, a quantidade administrada estará no intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal do Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar.
De forma geral, a dosagem de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar administrada a um paciente é tipicamente de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 2000 mg/kg de peso corporal do animal. Num aspeto, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do animal; num outro aspeto, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 250 mg/kg do peso corporal do animal; em ainda um outro aspeto, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg do peso corporal do animal; em ainda um outro aspeto, a dosagem administrada está entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do animal, e em ainda um outro aspeto, a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do animal.
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.). A administração pode ser sistémica ou local. Vários sistemas de administração são conhecidos, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., e podem ser usados para 280 ΕΡ1725249Β1 administrar um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar ou composição. Em certas formas de realização, mais que um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar ou composição é administrado a um paciente.
Em formas de realização especificas, pode ser desejado administrar um ou mais Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições localmente à área que necessita de tratamento. Isto pode ser obtido, por exemplo, e não de forma limitativa, por infusão local durante cirurgia; aplicação tópica, por exemplo, em conjunto com um curativo após cirurgia; por injeção, por meios de um cateter, por meio de um supositório; ou por meio de um implante, sendo o implante de um material poroso ou não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. Numa forma de realização, a administração pode ser por injeção direta no local (ou antigo local) de um cancro, tumor ou tecido neoplástico ou pré-neoplásico. Numa outra forma de realização, a administração pode ser por injeção direta no local (ou antigo local) de uma manifestação de uma doença autoimune.
Em certas formas de realização, pode ser desejável introduzir um ou mais Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições no sistema nervoso central por uma via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal. Injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, unido a um reservatório, tal como um reservatório de Ommaya.
Administração pulmonar pode também ser utilizada, por exemplo, através da utilização de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente para aerossol, ou via perfusão num tensioativo pulmonar de fluorocarbono ou sintético. 281 ΕΡ1725249Β1
Em ainda uma outra forma de realização, os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições podem ser administrados num sistema de libertação controlada, tal como, mas não limitado, uma bomba ou vários materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda uma outra forma de realização, um sistema de libertação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo dos Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares ou composições, por exemplo, o cérebro, dessa maneira requerendo apenas uma fração da dose sistémica (veja-se, por exemplo, Goodson, no Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-118 (1984)). Outros sistemas de libertação controlada discutidos na análise por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)) podem ser usados. O termo "portador" se refere a um diluente, adjuvante ou excipiente, com o qual um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar é administrado. Estes portadores farmacêuticos podem ser líquidos, tal como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Os portadores podem ser solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, ceratina, sílica coloidal, ureia, e similares. Além disso, agentes auxiliares, estabilizantes, espessadores, lubrificantes e corantes podem ser usados. Numa forma de realização, quando administrado a um paciente, o Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar ou composições e portadores farmaceuticamente aceitáveis são estéreis. Água é um portador exemplar quando os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares são administrados intravenosamente. Soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas podem também ser utilizadas como portadores líquidos, especificamente para soluções injetáveis. Portadores farmacêuticos adequados também incluem excipientes tais 282 ΕΡ1725249Β1 como amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, silica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, nata seca de leite, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. As presentes composições, se for desejado, podem também conter quantidades minimas de agentes de humedecimento e emulsificantes, ou agentes tampão de pH.
As composições presentes podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pilulas, contas, cápsulas, cápsulas contendo líquidos, pós, formulações de libertação sustentada, supositórios, emulsões, aerossóis, pulverizadores, suspensões, ou qualquer outra forma adequada para utilização. Outros exemplos de portadores farmacêuticos adequados são descritos por E.W. Martin na "Remington's Pharmaceutical Sciences".
Numa forma de realização, os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares são formulados de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a animais, especificamente seres humanos. Tipicamente, os portadores ou veículos para administração intravenosa são soluções tampão aquosas, estéreis e isotónicas. Onde necessário, as composições pode também incluir um agente solubilizante. Composições para administração intravenosa podem, opcionalmente, compreender um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. De forma geral, os ingredientes são supridos tanto separadamente como misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, tal como pó liofilizado seco ou concentrado isento de água, num recipiente hermeticamente vedado tal como uma ampola ou sache indicando a quantidade do agente ativo. Onde um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar deve ser 283 ΕΡ1725249Β1 administrado por infusão, ele pode ser aplicado, por exemplo, com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Onde o Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar é administrado por injeção, uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção pode ser provida, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
Composições para administração oral podem estar na forma de comprimidos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, grânulos, pós, emulsões, cápsulas, xaropes, ou elixires, por exemplo. Composições administradas oralmente podem conter, opcionalmente, um ou mais agentes, por exemplo, agentes adoçantes tais como frutose, aspartame ou sacarina; agentes aromatizantes tais como hortelã, óleo de gualtéria, ou cereja; agentes corantes; e agentes preservativos, para proporcionar uma preparação farmaceuticamente palatável. Além do mais, quando na forma de tablete ou pílula, as composições podem ser revestidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrintestinal, proporcionando assim uma ação sustentada durante um período estendido de tempo. Membranas seletivamente permeáveis, envolvendo um composto de ação osmoticamente ativo, são também adequadas para compostos administrados oralmente. Nestas plataformas posteriores, fluido do ambiente envolvendo a cápsula é embebido pelo composto de ação, que incha para deslocar o agente ou composição de agente através de uma abertura. Estas plataformas de administração podem proporcionar um perfil de administração de ordem essencialmente zero em oposição a perfis perfurados de formulações de libertação imediata. Um material de atraso de tempo tal como monoestearato de glicerol ou estearato de glicerol pode também ser usado. 284 ΕΡ1725249Β1
As composições podem ser destinadas para administração tópica, caso em que o portador pode estar na forma de uma solução, emulsão, unguento ou base de gel. Se destinado para administração transdérmica, a composição pode estar na forma de um curativo transdérmico ou um dispositivo de iontoforese. Formulações tópicas podem compreender uma concentração de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar de cerca de 0,05 % a cerca de 50 % peso/volume (peso por unidade de volume da composição) ; num outro aspeto, de 0,1 % a 10 % p/v. A composição pode ser destinada para administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório que irá derreter no reto e libertar o Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar. A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma proteção de revestimento ao redor dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o revestimento protetor são tipicamente inertes, e podem ser selecionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser envolvidos numa cápsula de gelatina.
As composições podem consistir de unidades de dosagem gasosa, por exemplo, podem estar na forma de aerossol. O termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas que variam daqueles de natureza coloidal até aqueles sistemas que consistem de pacotes pressurizados. A administração pode ser feita através de um gás liquefeito ou comprimido ou através de um sistema de bomba adequado que dispensa os ingredientes ativos. 285 ΕΡ1725249Β1
Se na forma sólida, líquida ou gasosa, as presentes composições podem incluir um agente farmacológico usado no tratamento de cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa.
4.8 USOS TERAPÊUTICOS DOS CONJUGADOS EXEMPLARES
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares úteis para tratar cancro, uma doença autoimune ou uma doença infeciosa num paciente.
4.8.1_TRATAMENTO DE CANCRO
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares são úteis para inibir a multiplicação de uma célula de tumor ou célula cancerígena, causando apoptose numa célula de tumor ou cancerígena num paciente. Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares podem ser usados, consequentemente, numa variedade de ajustes para o tratamento de cancros em animais. Os Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser usados para administrar um Fármaco ou unidade de Fármaco a uma célula de tumor ou célula cancerígena. Sem estar limitado por teoria, numa forma de realização, a unidade de Ligando de um Conjugado Exemplar se liga ou se associa a um antigénio associado com uma célula cancerígena ou célula de tumor, e o Conjugado Exemplar pode ser absorvido dentro de uma célula de tumor ou célula cancerígena através de endocitose mediada por recetor. 0 antigénio pode ser unido a uma célula de tumor ou célula cancerígena ou pode ser uma proteína de matriz extracelular associada com a célula de tumor ou célula cancerígena. Uma vez dentro da célula, uma ou mais sequências de péptido específicas dentro da unidade de Ligante são hidroliticamente clivadas por uma ou mais proteases associadas com célula de tumor ou célula cancerígena, resultando na libertação de um Fármaco ou um 286 ΕΡ1725249Β1
Composto de Fármaco-Ligante. 0 Fármaco libertado ou Composto de Fármaco-Ligante está, então, livre para migrar dentro da célula e induzir atividades citotóxicas ou citostáticas. Numa forma de realização alternativa, o Fármaco ou unidade de Fármaco é clivado do Conjugado Exemplar fora da célula de tumor ou célula cancerígena, e o Fármaco ou Composto de Fármaco-Ligante penetra subsequentemente na célula.
Numa forma de realização, a unidade de Ligando liga-se à célula de tumor ou célula cancerígena.
Numa outra forma de realização, a unidade de Ligando se liga a um antigénio de célula de tumor ou célula cancerígena que está na superfície da célula de tumor ou célula cancerígena.
Numa outra forma de realização, a unidade de Ligando liga-se a um antigénio de célula de tumor ou célula cancerígena que é uma proteína de matriz extracelular associada com a célula de tumor ou célula cancerígena. A especificidade da unidade de Ligando para uma célula de tumor ou célula cancerígena pode ser importante para determinar aqueles tumores ou cancros que são mais efetivamente tratados. Por exemplo, Conjugados Exemplares que tem uma unidade de Ligando BR96 podem ser úteis para tratar carcinomas de antigénio positivo incluindo aqueles do pulmão, mama, cólon, ovários, e pâncreas. Conjugados Exemplares que tem uma unidade de Ligando Anti-CD30 ou anti-CD40 podem ser úteis para o tratamento de malignidades hematológicas. 287 ΕΡ1725249Β1
Outros tipos específicos de cancros que podem ser tratados com Conjugados Exemplares incluem, mas não se limitam àqueles apresentados no Quadro 3. QUADRO 3
Tumores sólidos incluindo, mas não limitados a:
Fibrossarcoma
Mixossarcoma
Lipossarcoma
Condrossarcoma
Sarcoma osteogénico
Cordoma
Angiossarcoma
Endoteliossarcoma
Linfangiossarcoma
Linfangioendoteliossarcoma
Sinovioma
Mesotelioma
Tumor de Ewing
Leiomiossarcoma
Rabdomiossarcoma
Cancro do cólon
Cancro colorretal
Cancro dos rins
Cancro pancreático
Cancro ósseo
Cancro de mama
Cancro do ovário 288 ΕΡ1725249Β1
Cancro prostático
Tumores sólidos incluindo, mas não limitados a:
Cancro esofágico
Cancro estomacal
Cancro oral
Cancro nasal
Cancro da garganta
Carcinoma de células escamosas
Carcinoma de célula basal
Adenocarcinoma
Carcinoma da glândula sudorífera Carcinoma da glândula sebácea
Carcinoma papilar Adenocarcinomas papilares Cistadenocarcinoma Carcinoma medular Carcinoma broncogénico Carcinoma de célula renal Hepatoma
Carcinoma do duto biliar
Coriocarcinoma
Seminoma
Carcinoma embrionário Tumor de Wilms Cancro do colo do útero Cancro uterino 289 ΕΡ1725249Β1
Cancro testicular
Carcinoma pulmonar de célula pequena
Carcinoma de bexiga
Cancro do pulmão
Carcinoma epitelial
Glioma
Glioblastoma multiforme
Astrocitoma
Meduloblastoma
Craniofaringioma
Ependimoma
Pinealoma
Hemangioblastoma
Neuroma acústico
Oligodendroglioma
Meningioma
Cancro da pele
Melanoma
Neuroblastoma
Retinoblastoma não
Cancros originários do sangue, incluindo, mas limitados a:
Leucemia linfoblástica aguda "ALL"
Leucemia de célula B linfoblástica aguda Leucemia de célula T linfoblástica aguda Leucemia mieloblástica aguda "AML" 290 ΕΡ1725249Β1
Leucemia promielocítica aguda "APL' Leucemia monoblástica aguda Leucemia eritroleucémica aguda Leucemia megacarioblástica aguda Leucemia mielomonocitica aguda Leucemia não linfocitica aguda Leucemia não diferenciada aguda Leucemia mielocitica crónica "CML" Leucemia linfocitica crónica "CLL" Leucemia de célula capilar Mieloma múltiplo Leucemias agudas e crónicas: Linfoblástica Mielógena Linfocitica
Leucemias mielociticas Linfornas:
Doença de Hodgkin Linfoma não de Hodgkin Mieloma múltiplo
Macroglobulinemia de Waldenstrõm Doença de cadeia pesada Policitemia vera
Os Conjugados Exemplares proporcionam direcionamento de conjugação específica a tumor ou cancro, reduzindo dessa maneira a toxicidade geral destes compostos. As unidades 291 ΕΡ1725249Β1
Ligadoras estabilizam os Conjugados Exemplares no sangue, e ainda são cliváveis pelas proteases especificas do tumor dentro da célula, libertando um Fármaco.
4.8.2 TERAPÊUTICA DE MÚLTIPLAS MODALIDADES PARA CANCRO
Cancros, incluindo, mas não limitados a um tumor, metástase, ou outra doença ou distúrbio caracterizada por crescimento descontrolado de célula, podem ser tratados ou prevenidos pela administração de um Conjugado Exemplar e/ou um Composto Exemplar. Métodos para tratar ou prevenir cancro são descritos no presente documento, incluindo a administração de uma quantidade eficaz de um Conjugado Exemplar e um agente quimioterápico a um paciente em necessidade dos mesmos. Num método, o agente quimioterápico é aquele com o qual o tratamento do cancro não foi considerado refratário. Num ouro método, o agente quimioterápico é aquele com o qual o tratamento de cancro foi considerado refratário. Os Conjugados Exemplares podem ser administrados a um paciente que também foi submetido à cirurgia como tratamento de cancro.
Num método, o método adicional de tratamento é terapêutica de radiação.
Num método especifico, o Conjugado Exemplar é administrado concomitantemente com o agente quimioterápico ou com terapêutica de radiação. Numa outra forma de realização especifica, o agente quimioterápico ou terapêutica de radiação é administrado antes ou subsequentemente à administração de um Conjugado Exemplar, num aspeto pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês; em aspetos adicionais vários meses 292 ΕΡ1725249Β1 (por exemplo, até três meses), anteriormente ou subsequentemente à administração de um Conjugado Exemplar.
Um agente quimioterápico pode ser administrado durante uma série de sessões. Qualquer um ou uma combinação dos agentes quimioterápicos listados no quadro 4 pode ser administrado. Com relação à radiação, qualquer protocolo de terapêutica de radiação pode ser usado, dependendo do tipo de cancro a ser tratado. Por exemplo, mas não de forma limitativa, radiação de raio x pode ser administrada; em especial, megavoltagem de alta energia (radiação maior que 1 MeV de energia) pode ser usada para tumores profundos, e feixe de elétron e radiação de raio X de ortovoltagem pode ser usada para cancros da pele. Radioisótopos que emitem raio gama, tal como isótopos radioativos de rádio, cobalto e outros elementos, podem também ser administrados.
Adicionalmente, são proporcionados métodos de tratamento de cancro com um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar como uma alternativa à quimioterapia ou terapêutica de radiação, quando a quimioterapia ou a terapêutica de radiação são ou podem ser muito tóxicas, por exemplo, resultando em efeitos secundários inaceitáveis ou insuportáveis, para os indivíduos que estão recebendo o tratamento. 0 animal que está a ser tratado pode, opcionalmente, ser tratado com um outro tratamento para cancro tal como cirurgia, terapêutica de radiação ou quimioterapia, dependendo de qual tratamento seria aceitável ou suportável.
Os Compostos Exemplares e/ou Conjugados Exemplares podem também ser usados de uma maneira in vitro ou in vivo, como para o tratamento de certos cancros, incluindo, mas não limitados a leucemias e linfomas, este tratamento envolvendo transplantes de célula estaminal autóloga. Isto 293 ΕΡ1725249Β1 pode envolver um processo de etapas múltiplas, no qual as células estaminais hematopoiéticas autólogas do animal são colhidas e purgadas de todas as células cancerígenas; a população de célula da medula óssea remanescente do animal é, então, erradicada através da administração de uma alta dose de um Composto Exemplar e/ou Conjugado Exemplar com ou sem o acompanhamento de uma alta dose de terapêutica de radiação, e o enxerto de célula estaminal é infundido de volta no animal. Tratamento de suporte é, então, proporcionado enquanto a função da medula óssea é recuperada e o animal se recupera.
4.8.3 TERAPÊUTICA DE FÁRMACOS MÚLTIPLOS PARA CANCRO Métodos para tratar cancro incluindo a administração a um paciente em necessidade da mesma de uma quantidade eficaz de um Conjugado Exemplar e um outro agente terapêutico que é um agente anti-cancro são apresentados. Agentes anticancro adequados incluem, mas não são limitados a metotrexato, taxol, L-asparaginase, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiureia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureias, cisplatina, carboplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, topotecan, mostardas nitrogenadas, citoxan, etoposida, 5-fluorouracil, BCNU, irinotecan, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, aspariginase, vimblastina, vincristina, vinorrelbina, paclitaxel, docetaxel. Num aspeto, o agente anti-cancro inclui, mas não se limita a um fármaco listado no Quadro 4. 294 ΕΡ1725249Β1 QUADRO 4
Agentes de Alquilação mostardas nitrogenadas: Ciclofosfamida ifosfamida trofosfamida clorambucil melfalan nitrosoureias: carmustina (BCNU) lomustina (CCNU) Alquilsulfonatos Bussulfam treossulfam triazenos: Decarbazina compostos contendo platina: Cisplatina carboplatina alcaloides de planta Alcaloides vinca: Vincristina vimblastina vindesina vinorrelbina Agentes de Alquilação taxoides: Paclitaxel Docetaxol epipodofilinas: Etoposida teniposida topotecan 9-aminocamptotecina camptotecina crisnatol mitomicinas: mitomicina C Antimetabolitos antifolatos: inibidores de DHRF: Metotrexato trimetrexato inibidores de desidrogenase IMP ácido micofenólico tiazofurina ribavirina EICAR 295 ΕΡ1725249Β1
Inibidores de redutase de ribonucleótido: Hidroxiureia deferoxamina análogos de pirimidina: análogos de uracilo 5-fluorouracilo Floxuridina Doxifluridina Ratitrexed análogos de citosina citarabina (ara C) citosina arabínosídeo fludarabina análogos de purina: Mercaptopurina tioguanina terapêuticas hormonais: antagonistas de recetor: Antiestrogénio Tamoxifeno raloxifeno megestrol agonistas de LHRH: Goserrelina acetato de leuprolida antiandrogénios: Flutamida bicalutamida Retinoides/Deltoldes análogos de vitamina D3: EB 1089 CB 1093 KH 1060 Retinoides/Deltoldes terapêuticas fotodinámicas: vertoporfina (BPD-MA) ftalocianina fotossensibilizador Pc4 demetoxi-hipocrelina A (2BA-2-DMHA) citocinas: interferão-a interferão-y fator de necrose de tumor outros: Gemcitabina Velcade Revamid thalamid inibidores de isoprenilação: Lovastatina neurotoxinas dopaminérgicas: ião de 1 -metil-4-fenilpiridínio 296 ΕΡ1725249Β1 inibidores de ciclo celular: Estaurosporina actinomicinas: actinomicina D Dactinomicina bleomicinas: bleomicina A2 bleomicina B2 peplomicina antraciclinas: daunorrubicina Doxorrubicina (adriamicina) idarrubicina epirrubicina pirarrubicina zorrubicina mtoxantrona inibidores de MDR: verapamil inibidores de Ca2+ ATPase: tapsigargina
4.8.4_TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTO IMUNES
Os Conjugados Exemplares são úteis para eliminar ou inibir a replicação de uma célula que produz uma doença autoimune ou para o tratamento de uma doença autoimune. Os Conjugados Exemplares podem ser usados adequadamente numa variedade de ajustes para o tratamento de uma doença autoimune num paciente. Os Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser usados para aplicar um Fármaco a uma célula alvo. Sem estar limitado por qualquer teoria, numa forma de realização, o Conjugado de Fármaco-Ligante-Ligando associa-se com um antigénio na superfície de uma célula alvo, e o Conjugado Exemplar é, então, absorvido dentro de uma célula alvo através de uma endocitose mediada por recetor. Uma vez dentro da célula, um ou mais sequências de péptido dentro da unidade de Ligante são enzimaticamente ou hidroliticamente clivadas, resultando na libertação de um Fármaco. 0 Fármaco libertado está, então, livre para migrar no citosol e induzir atividades citotóxicas ou 297 ΕΡ1725249Β1 citostáticas. Numa forma de realização alternativa, o Fármaco é clivado do Conjugado Exemplar fora da célula alvo, e o Fármaco subsequentemente penetra a célula.
Numa forma de realização, a unidade de Ligando liga-se a um antigénio autoimune. Num aspeto, o antigénio está na superfície de uma célula envolvida numa condição autoimune.
Numa outra forma de realização, a unidade de Ligando se liga a um antigénio autoimune que está na superfície de uma célula.
Numa forma de realização, o Ligando liga-se a linfócitos ativados que estão associados com o estado da doença autoimune.
Numa forma de realização adicional, os Conjugados Exemplares destroem ou inibem a multiplicação de células que produzem um anticorpo autoimune associado com uma doença autoimune especifica.
Tipos específicos de doenças autoimunes que podem ser tratados com os Conjugados Exemplares incluem, mas não se limitam a distúrbios relacionadas com linfócito Th2 (por exemplo, dermatite atópica, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistémica, e doença de enxerto versus hospedeiro) ; distúrbios relacionadas com linfócito Thl (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de Sjorgren, tireoidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, e tuberculose); distúrbios relacionados com linfócito B ativado (por exemplo, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatoide, e diabete tipo I), e aquelas apresentadas no Quadro 5. 298 ΕΡ1725249Β1 QUADRO 5
Hepatite Ativa Crónica Doença de Addison Alveolite Alérgica Reação Alérgica Rinite Alérgica Sindrome de Alport Anafilaxia
Espondilite ancilosante
Sindrome antifosfolipido
Artrite
Ascariase
Aspergilose
Alergia Atópica
Dermatite Atrópica
Rinite Atrópica
Doença de Behcet
Pulmão de "Bird-Fancier"
Asma brônquica
Sindrome de Caplan
Cardiomiopatia
Doença celiaca
Doença de Chagas
Glomerulonefrite crónica
Sindrome de Cogan
Doença de Aglutinina Fria
Infeção por Rubéola Congénita
Sindrome de CREST 299 ΕΡ1725249Β1
Doença de Crohn
Crioglobulinemia Síndrome de Cushing
Dermatomiosite Lúpus Discoide Síndrome de Dressier Síndrome de Eaton-Lambert
Infeção por Echovírus
Encefalomielite
Oftalmopatia endócrina
Infeção por Vírus Epstein-Barr
Asma equina
Eritematose Síndrome de Evan Síndrome de Felty
Fibromialgia
Ciclite de Fuch
Atrofia Gástrica
Alergia Gastrintestinal
Arterite de Células Gigantes
Glomerulonefrite Síndrome de Goodpasture
Doença do Enxerto contra Hospedeiro
Doença de Grave
Doença de Guillain-Barre
Tireoidite de Hashimoto
Anemia hemolítica Púrpura de Henoch-Schonlein 300 ΕΡ1725249Β1
Atrofia Adrenal Idiopática Fibrite Pulmonar Idiopática Nefropatia de IgA
Enteropatias Intestinais Inflamatórias Diabete Melito dependente de Insulina Artrite Juvenil
Diabete Melito Juvenil (Tipo 1)
Sindrome de Lambert-Eaton
Laminite Líquen plano
Hepatite Lupoide Lúpus
Linfopenia
Doença de Meniere
Doença de Tecido Conectivo Mista
Esclerose Múltipla
Miastenia Grave
Anemia Perniciosa Síndromes Poliglandulares
Demência Pré-senil
Agamaglobulinemia Primária
Cirrose Biliar Primária
Psoríase
Artrite Psoriática Fenómeno de Raynauds Aborto Recorrente Sindrome de Reiter Febre Reumática 301 ΕΡ1725249Β1
Artrite Reumatoide Síndrome de Sampter
Esquistossomose Síndrome de Schmidt
Esclerodermia Síndrome de Shulman Síndrome de Sjorgen Síndrome do Homem Rígido
Oftalmia Simpática Lúpus Eritematoso Sistémico
Arterite de Takayasu
Arterite Temporal
Tireoidite
Trombocitopenia
Tirotoxicose
Necrólise Epidérmica Tóxica Resistência à Insulina Tipo B Diabete Melito Tipo 1 Colite Ulcerativa Uveíte Vitiligo
Macroglobulinemia de Waldenstrom Granulomatose de Wegener
4.8.5_TERAPÊUTICA DE FÁRMACOS MÚLTIPLOS PARA DOENÇAS
AUTOIMUNES Métodos para o tratamento de uma doença autoimune são também revelados incluindo a administração a um paciente de 302 ΕΡ1725249Β1 uma quantidade eficaz de um Conjugado Exemplar e um outro agente terapêutico conhecido para o tratamento de uma doença autoimune que necessite dos mesmos. Numa forma de realização, o agente de doença anti-autoimune inclui, mas não se limita aos agentes listados no Quadro 6.
Quadro 6 Ciclosporina Ciclosporina A micofenilato mofetil Sirolimus Tacrolimus Enanercept Prednisona Azatioprina metotrexato ciclofosfamida
Prednisona ácido aminocaproico
Cloroquina hidroxicloroquina
Hidrocortisona dexametasona
Clorambucil
DHEA
Danazol bromocriptina
Meloxicam
Infliximab
4.8.6 TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECIOSAS
Os Conjugados Exemplares são úteis para eliminar ou inibir a multiplicação de uma célula que produz uma doença infeciosa ou para o tratamento de uma doença infeciosa. Os Conjugados Exemplares podem ser usados de acordo com uma 303 ΕΡ1725249Β1 variedade de ajustes para o tratamento de uma doença infeciosa num paciente. Os Conjugados de Fármaco-Ligante-Ligando podem ser usados para aplicar um Fármaco a uma célula alvo. Numa forma de realização, a unidade de Ligando liga-se à célula da doença infeciosa.
Numa forma de realização, os Conjugados eliminam ou inibem a multiplicação de células que produzem uma doença infeciosa especifica.
Tipos específicos de doenças infeciosas que podem ser tratadas com os Conjugados Exemplares incluem, mas não se limitam àqueles apresentados no Quadro 7. QUADRO 7
Doenças Bacterianas:
Difteria
Coqueluche
Bacterinemia Oculta
Infeção do Trato Urinário
Gastroenterite
Celulite
Epiglotidite
Traqueíte
Hipertrofia do Tecido Adenoide
Abcesso Retrofaríngico
Impetigo
Ectimia
Pneumonia
Endocardite
Artrite Séptica
Pneumococose
Peritonite
Bacteriemia
Meningite
Meningite Purulenta Aguda 304 ΕΡ1725249Β1
Uretrite Cervicite Proctite
Doenças Bacterianas: Faringite Salpingite Epididimite Gonorreia Sífilis Listeriose Antraz Nocardiose Salmonela Febre tifoide Disenteria Conjuntivite Sinusite Brucelose Tularemia Cólera
Peste Bubónica Tétano
Enterite Necrosante Actinomicose Infeção Anaeróbica Mista Sífilis
Febre Recorrente
Leptospirose
Doença de Lyme
Febre da mordida de rato
Tuberculose
Linfadenite
Lepra
Clamidiose
Pneumonia por Clamídia 305 ΕΡ1725249Β1
Tracoma
Conjuntivite de Inclusão Doenças Fúngicas Sistémicas:
Histoplasmose Coccidiodomicose Blastomicose Esporotricose Criptococose Candidiase Sistémica Aspergilose Mucormicose Micetoma Cromomicose Doenças Rickettisiais:
Tifo
Febre Maculosa das Montanhas Rochosas Erliquiose
Rickettsiose Transmitida pelo Carrapato do Leste Varíola por rickéttsia Febre Q Bartonelose Doenças Parasíticas:
Malária
Babesiose
Doença do Sono Africana
Doença de Chagas
Leishmaniose
Febre Dum-Dum
Toxoplasmose
Meningoencefalite
Ceratite
Entamebiase
Giardiase
Criptosporidiose
Isosporiose 306 ΕΡ1725249Β1
Ciclosporiase Doenças Parasíticas:
Microsporidiose
Ascariase
Infeção dos vermes intestinais Infeção de ancilóstomo duodenal Infeção por nematoide Doenças Bacterianas:
Ocular Larva Migrans Triquinose
Doença da "Guinea Worm"
Filariase Linfática Loiase
Cegueira "River"
Infeção por Dirofilária Canina Esquistossomose Prurido dos Nadadores Trematódeo Pulmonar Oriental Trematódeo Hepático Oriental Fascioliase Fasciolopsiase Opistorquiase Infeções por ténia Doença Hidática Doença Hidática Alveolar Doenças Virais:
Sarampo
Panencefalite esclerosante subaguda
Arrefecido Comum
Caxumba
Rubéola
Roséola
Quinta Doença
Catapora
Infeção virai sincicial respiratório 307 ΕΡ1725249Β1
Crupe
Bronquiolite Mononucleose Infeciosa Poliomielite Herpangina
Doença da mão-pé-e-boca Doença de Bornholm Herpes Genital Verruga Genital Meningite Asséptica Miocardite Pericardite Gastroenterite Doenças Virais: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH) Síndrome de Reye Síndrome de Kawasaki
Influenza
Bronquite
Pneumonia Virai "Walking"
Doença Respiratória Febril Aguda Febre Faringoconjuntival Aguda Ceratoconjuntivite Epidémica Vírus da Herpes Simplex 1 (HSV-1) Vírus da Herpes Simplex 2 (HSV-2)
Doenças Bacterianas:
Herpes Zoster
Doença de Inclusão Citomegálica Raiva
Leucoencefalopatia Progressiva Multifocal Kuru
Insónia Familiar Fatal
Doença de Creutzfeldt-Jakob
Doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker 308 ΕΡ1725249Β1
Paraparesia Espástica Tropical Doenças Virais:
Encefalite Equina Ocidental Encefalite da Califórnia Encefalite de St. Louis Febre Amarela Dengue
Coriomeningite Linfocitica
Febre de Lassa
Febre Hemorrágica
Sindrome Pulmonar do Hantavirus
Infeções por Vírus Marburg
Infeções por Vírus Ebola
Varíola
4.8.7_TERAPÊUTICA DE FÁRMACOS MÚLTIPLOS PARA DOENÇAS
INFECIOSAS São apresentados métodos para o tratamento de uma doença infeciosa incluindo a administração a um paciente de um Conjugado Exemplar e um outro agente terapêutico que é um agente antiinfecioso de doença que necessite dos mesmos. Numa forma de realização, o agente anti-infecioso de doença são agentes listados no Quadro 8, mas não limitados a eles. QUADRO 8
Antibióticos β-Lactama:
Penicilina G
Penicilina V
Cloxacilina
Dicloxacilina
Meticilina
Nafcilina
Oxacilina
Ampicilina
Amoxicilina
Bacampicilina 309 ΕΡ1725249Β1
Azlocil ina Carbeni cilina Mezloci lina Piperac ilina Ticarci lina Aminoglicós idos: Amicaci na Gentami cina Canamic ina Neomici na Netilmi cina Aminoglicós idos: Estrept omicina Tobrami cina Macrólidos:
Az itromicina Claritromicina Eritromicina Lincomicina Clindamicina Tetraciclinas:
Demeclociclina Doxiciclina Minociclina Oxitetraciclina Tetraciclina Quinolonas:
Cinoxacina Ácido nalidixico Fluoroquinolonas: Ciprofloxacina Fluoroquinolonas: Enoxacina Grepafloxacina Levofloxacina 310 ΕΡ1725249Β1
Lomefloxacina Norfloxacina Ofloxacina Esparfloxacina Trovafloxicina
Polipéptidos:
Bacitracina Colistina Polimixina B
Sulfonamidas:
Sulfissoxazol Sulfametoxazol Sulfadiazina Sulfametizol Sulfacetamida
Agentes Antibacterianos Variados: Trimetoprim Sulfametazol Cloranfenicol Vancomicina Metronidazol Quinupristina Dalfopristina Rifampina Espetinomicina Nitrofurantoina Agentes Antivirais
Agentes Antivirais Gerais: Idoxuradina Vidarabina Trifluridina Aciclovir Faneiciclovir Peneiciclovir Valaciclovir 311 ΕΡ1725249Β1
Ganciciclovir Fosca rnet
Agentes Antivirais Gerais: Ribavirina Amantadina Rimantadina Cidofovir
Oligonucleótidos Antissense
Imunoglobulinas
Interferões Fármacos para Infeção por VIH: Tenofovir Entricitabina Zidovudina Didanosina Zalcitabina Estavudina Lamivudina Neviparina Delavirdina Saquinavir Ritonavir Indinavir Nelfinavir
5. EXEMPLOS
Exemplo 1 - Preparação do composto AB 312 ΕΡ1725249Β1
ΑΒ
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq., Patente US N° 6214345 de Firestone et al.) foi diluído com DMF (120 ml, 0,2 M) e a esta solução foi adicionada dietilamina (60 ml) . A reação foi monitorizada por HPLC e foi completada em 2 horas. A mistura de reação foi concentrada e o resíduo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (ca. 100 ml) sob exposição a ondas sonoras durante 10 minutos. Éter (200 ml) foi adicionado e o precipitado foi exposto a ondas sonoras adicionalmente durante 5 minutos. A solução foi deixada descansar durante 30 minutos sem agitação e foi, então, filtrada e seca sob vácuo elevado para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Rendimento: 8,84 g (96 %). Val-cit- PAB-OH (8,0 g 21 mmol) foi diluído com DMF (110 ml) e a solução resultante foi tratada com MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate
Chem. 4:251; 6,5 g, 21 mmol, 1,0 eq.). A reação foi completada após 2 horas de acordo com HPLC. A mistura de reação foi concentrada e o óleo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (50 ml) . Após exposição a ondas sonoras durante 15 minutos, éter (400 ml) foi adicionado e a mistura foi exposta a ondas sonoras adicionalmente até todas as partículas grandes serem quebradas. A solução foi, 313 ΕΡ1725249Β1 então, filtrada e o sólido foi seco para proporcionar um intermediário sólido esbranquiçado. Rendimento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H]
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq., Patente US N° 6214345 de Firestone et al.) foi diluído com DMF (120 ml, 0,2 M) e a esta solução foi adicionada dietilamina (60 ml) . A reação foi monitorizada por HPLC e foi completada em 2 horas. A mistura de reação foi concentrada e o resíduo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (ca. 100 ml) sob exposição a ondas sonoras durante 10 minutos. Éter (200 ml) foi adicionado e o precipitado foi exposto a ondas sonoras adicionalmente durante 5 minutos. A solução foi deixada descansar durante 30 minutos sem agitação e foi, então, filtrada e seca sob vácuo elevado para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Rendimento: 8,84 g (96 %). Val-cit- PAB-OH (8,0 g 21 mmol) foi diluído com DMF (110 ml) e a solução resultante foi tratada com MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate
Chem. 4:521; 6,5 g 21 mmol, 1,0 eq.). A reação foi completada após 2 horas, de acordo com HPLC. A mistura de reação foi concentrada e o óleo resultante foi precipitado usando acetato de etilo (50 ml) . Após exposição a ondas sonoras durante 15 minutos, éter (400 ml) foi adicionado e a mistura foi exposta a ondas sonoras adicionalmente até todas as partículas grandes serem quebradas. A solução foi, então, filtrada e o sólido foi seco para proporcionar um intermediário sólido esbranquiçado. Rendimento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H].
O intermediário sólido esbranquiçado (8,0 g, 14,0 mmol) foi diluído com DMF (120 ml, 0,12 M) e à solução resultante foi adicionado bis(4-nitrofenil)carbonato (8,5 g 2 8,0 mmol, 2,0 eq.) e DIEA (3,66 ml, 21,0 mmol, 1,5 eq.). A 314 ΕΡ1725249Β1 reação estava completa em 1 hora de acordo com HPLC. A mistura de reação foi concentrada para proporcionar um óleo que foi precipitado com EtOAc, e então triturado com EtOAc (ca. 25 ml) . 0 soluto foi precipitado adicionalmente com éter (ca. 200 ml) e triturado durante 15 minutos. O sólido foi filtrado e seco sob vácuo elevado para proporcionar o Composto AB que era 93 % puro de acordo com HPLC e usado na próxima etapa sem purificação adicional. Rendimento: 9,7 g (94 %) .
Exemplo 2 - Preparação do Composto 1
Sal de HC1 de éster t-butilico de fenilalanina (868 mg, 3 mmol) , N-Boc- Dolaproina (668 mg, 1 eq.), DEPC (820 pL, 1,5 eq.), e DIEA (1,2 ml) foram diluídos com diclorometano (3 ml) . Após 2 horas (h) na temperatura ambiente (cerca de 28 graus Centígrados), a mistura de reação foi diluída com diclorometano (20 ml) , lavada sucessivamente com NaHC03 aquoso (aq.) saturado (2x10 ml), NaCl saturado aq. (2 x 10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi novamente suspenso em acetato de etilo e foi purificado através de cromatografia de fulgor em acetato de etilo. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar o dipéptido como um sólido branco: 684 mg (46 %). ES-MS m/z 491,3 [M+H]+.
Para clivagem seletiva de Boc na presença de éster t-butílico, o dipéptido acima (500 mg, 1,28 mmol) foi diluído 315 ΕΡ1725249Β1 com dioxano (2 ml). 4M HCl/dioxano (960 pL, 3 eq.) foi adicionado, e a mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Desproteção quase completa de
Boc foi observada por RP-HPLC com quantidade minima de clivagem de éster t-butilico. A mistura foi arrefecida num banho de gelo, e trietilamina (500 pL) foi adicionado. Após 10 minutos, a mistura foi removida do banho de arrefecimento, diluída com diclorometano (20 ml), lavada sucessivamente com NaHC03 aquoso (aq.) saturado (2x10 ml), NaCl saturado aq. (2x10 ml). A camada orgânica foi concentrada para proporcionar uma espuma amarela: 287 mg (57 %) . O intermediário foi usado sem purificação adicional. 0 tripéptido Fmoc-Meval-val-dil-O-t-Bu (preparado conforme descrito no documento WO 02/088172, intitulado "Pentapeptide Compounds and Uses Related Thereto"; 0,73 mmol) foi tratado com TFA (3 ml) , diclorometano (3 ml) durante 2 horas na temperatura ambiente. A mistura foi concentrada até secagem, o resíduo foi co-evaporado com tolueno (3 x 20 ml), e seca sob vácuo durante a noite. O resíduo foi diluído com diclorometano (5 ml) e adicionado ao dipéptido desprotegido (287 mg, 0,73 mmol), seguido por DIEA (550 pL, 4 eq.), DEPC (201 pL, 1,1 eq.). Após 2 horas na temperatura ambiente, a mistura de reação foi diluída com acetato de etilo (50 ml), lavada sucessivamente com ácido cítrico aq. a 10 % (2x20 ml) , NaHC03 aq. saturado (2x10 ml) , NaCl saturado aq. (2x10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi novamente suspenso em acetato de etilo e foi purificado através de cromatografia de fulgor em acetato de etilo. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar Fmoc-Meval- val-dil-dap-phe-O-f-Bu como um 316 ΕΡ1725249Β1 sólido branco: 533 mg (71 %) . Rf 0,4 (EtOAc) . ES-MS m/ z 1010,6 [M+H]+. 0 produto (200 mg, 0,2 mmol) foi i diluído com diclorometano (3 ml) , dietilamina (1 ml) . A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Solventes foram removidos para proporcionar um óleo que foi purificado por cromatografia de fulgor de sílica gel num gradiente de etapas 0-10 % de MeOH em diclorometano para proporcionar o Composto 1 como um sólido branco: 137 mg (87 %) . Rf 0,3 (10 % de MeOH/CH2Cl2) . ES-MS m/z 788, 6 [M+H] + .
Exemplo 3 - Preparação do Composto 2
2 O Composto 2 foi preparado a partir do composto 1 (30
mg, 0,038 mmol) pelo tratamento com 4M HCl/dioxano (4 ml) durante 7 horas na temperatura ambiente. O solvente foi removido, e o resíduo foi seco sob vácuo durante a noite para proporcionar o Composto 2 como um sólido branco hidroscópico: 35 mg (120 % calculado para sal HC1) . ES-MS m/z 732,56 [M+H]+. 317 ΕΡ1725249Β1
3
Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-f-Bu (Exemplo 2, 50 mg) foi tratado com 4M HCl/dioxano (4 ml) durante 16 horas na temperatura ambiente. O solvente foi removido, e o resíduo foi seco sob vácuo durante a noite para proporcionar 50 mg de um intermediário sólido branco hidroscópico. 0 intermediário sólido branco (20 mg, 0,02 mmol) foi diluído com diclorometano (1 ml); DEPC (5 pL, 0,03 mmol, 1,5 eq.) foi adicionado seguido por DIEA (11 pL, 0,06 mmol, 3 eq.), e t-butilamina (3,2 pL, 0,03 mmol 1,5 eq.). Após 2 horas na temperatura ambiente, a reação ainda não estava completa de acordo com RP-HPLC. Mais DEPC (10 pL) e t-butilamina (5 pL) foram adicionados e a reação foi agitada por mais 4 horas. A mistura de reação foi diluída com diclorometano (15 ml), lavada sucessivamente com água (5 ml), 0,1 M HC1 aq. (10 ml), NaCl aq. saturado (10 ml). A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi diluído com diclorometano e purificado através de cromatografia de fulgor num gradiente de etapas 0-5 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar o intermediário de Fmoc protegido como um sólido branco: 7,3 mg (36 %). Rf 0,75 (10 % de MeOH/CH2Cl2) . O intermediário de Fmoc protegido foi diluído com diclorometano (0,5 ml) e tratado com dietilamina (0,5 ml) 318 ΕΡ1725249Β1 durante 3 horas na temperatura ambiente. A mistura de reação foi concentrada até a secagem. 0 produto foi isolado por cromatografia de fulgor de sílica gel num gradiente de etapas de 0-10 % de MeOH em diclorometano para proporcionar o Composto 3 como um sólido branco: 4 mg (70 %). Rf 0,2 (10 % MeOH/CH2C12) . ES-MS m/z 787 [M+H]+, 809 [M+Na] + .
Exemplo 5 - Preparação do Composto 4
Boc-L-Fenilalanina (265 mg, 1 mmol, 1 eq.) e trietileno glicol monometil éter (164 pL, 1 mmol, 1 eq.) foram diluídos com diclorometano (5 ml) . Então, DCC (412 mg, 2 mmol, 2 eq.) foi adicionado, seguido por DMAP (10 mg) . A mistura de reação foi agitada durante a noite na
temperatura ambiente. O precipitado foi filtrado. O solvente foi removido sob vácuo, o residuo foi diluído com acetato de etilo, e purificado por cromatografia de fulgor de sílica gel em acetato de etilo. As frações contendo produto foram retiradas, concentradas, e secas em vácuo para proporcionar um sólido branco: 377 mg (91 %) . Rf 0,5 (EtOAc). ES-MS m/z 434 [M+Na]+.
A remoção do grupo de proteção Boc foi executada pelo tratamento do material acima em dioxano (10 ml) com 4M HCl/dioxano (6 ml) durante 6 horas na temperatura ambiente. O solvente foi removido sob vácuo, o resíduo foi seco em vácuo para proporcionar um sólido branco. O sal HC1 de fenilalanina-trietileno glicol monometil éter éster (236 mg, 0,458 mmol, 1 eq.) e iV-Boc-Dolaproína (158 mg, 0,55 mmol, 1,2 eq.) foram diluídos com 319 ΕΡ1725249Β1 diclorometano (3 ml). DEPC (125 yL, 1,5 eq.) (SIC) e adicionado à mistura seguido por DIEA (250 yL, 3 eq.). Após 2 horas na temperatura ambiente a mistura de reação foi diluída com acetato de etilo (30 ml), lavada sucessivamente com NaHC03 aq. saturado (2x10 ml), ácido cítrico aq. a 10 % (2x10 ml) , NaCl saturado aq. (2x10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi novamente suspenso em acetato de etilo e foi purificado através de cromatografia de fulgor de sílica gel em acetato de etilo. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar um intermediário de espuma branca: 131 mg (50 %) . Rf 0,25 (EtOAc) . ES-MS m/z 581,3 [M+H]+. A desproteção de Boc foi efetuada em diclorometano (2 ml), TFA (0,5 ml) na temperatura ambiente durante 2 horas. Solvente foi removido sob vácuo, e o resíduo foi co-evaporado com tolueno (3 x 25 ml), então seco em vácuo para proporcionar 138 mg de sal de dipéptido TFA.
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Exemplo 2, 147 mg, 0,23 mmol, 1 eq.) e sal de dipéptido TFA (138 mg) foram diluídos com diclorometano (2 ml). À mistura foi adicionado DEPC (63 yL, 1,5 eq.), seguido por DIEA (160 yL, 4 eq.). Após 2 horas na temperatura ambiente, a mistura de reação foi diluído com diclorometano (30 ml), lavada sucessivamente com ácido cítrico aq. a 10 % (2x20 ml), NaCl aq. saturado (20 ml). A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi suspenso novamente em diclorometano e foi purificado através de cromatografia de fulgor em sílica gel num gradiente de etapa de 0-5 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar uma espuma branca: 205 mg (81 %). Rf 0,4 (10 % de MeOH/CH2CI2) . ES-MS m/z 1100,6 [M+H]+, 1122,4 [M+Na] + . 320 ΕΡ1725249Β1 0 grupo protetor Fmoc foi removido por tratamento com dietilamina (2 ml) em diclorometano (6 ml) . Após 6 horas a temperatura ambiente, solvente foi removido sob vácuo, o produto foi isolado por cromatografia de fulgor em sílica gel num gradiente de etapa de 0-5 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas. Após evaporação de diclorometano/hexano, 1:1, o Composto 4 foi obtido como uma espuma branca: 133 mg (80 %) . Rf 0,15 (10 % de MeOH/CH2Cl2) . ES-MS m/z 878, 6 [M+H] + . ΕΡ1725249Β1 Exemplo 6 - Preparação do Composto 5
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Exemplo 2, 0,50 g, 0,78 mmol) e dap- phe-OMe HC1 (0,3 g, 0,78 mmol, preparado de acordo com Pettit, G.R., et al. Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243-277) foram dissolvidos em CH2CI2 (10 ml) seguido pela adição de diisopropiletilamina (0,30 ml, 1,71 mmol, 2,2 eq.) . DEPC (0,20 ml, 1,17, 1,5 eq.) foi adicionado e o conteúdo permaneceu sob Ar. A reação estava completa em 1 hora de acordo com HPLC. A mistura foi concentrada num óleo e purificada por cromatografia de Si02 (coluna 300 x 25 mm) e eluída com EtOAc a 100 %. O produto foi isolado como um sólido espumoso branco: 0,65 g (87 %) . ES-MS m/z 968,35 [M+H], 991,34 [M+Na]+; UV 215, 265 nm. O péptido protegido com Fmoc (0,14 g, 0,14 mmol) em cloreto de metileno (5 ml) foi tratado com dietilamina (2 ml) e o conteúdo foi mantido na temperatura ambiente durante 2 horas. A reação, completa de acordo com HPLC, foi 321 ΕΡ1725249Β1 concentrada num óleo, colocada em 2 ml de DMSO e injetada num HPLC preparativo (coluna Ci2-RP, 5 μ, 100 Â, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 25 ml/minuto). Frações contendo o produto foram evaporadas para suportar um pó branco para o sal de trifluoroacetato. Rendimento: 0,126 g (98 %) . Rf 0,28 (100
% EtOAc) . ES-MS m/z 746, 59 [M+H]+, 768, 51 [M+Na]+; UV 215 nm.
Exemplo 7 - Preparação do Composto 6
6 0 sal de trifluoroacetato do Composto 5 (0,11 g, 0,13 mmol) , composto AB (0,103 g, 0,14 mmol, 1,1 eq.) e HOBt (3,4 mg, 26 μπιοί, 0,2 eq.) foram suspensos em DMF/piridina (2 ml/0,5 ml, respetivamente). Diisopropiletilamina (22,5 μL, 0,13 mmol, 1,0 eq.) foi adicionado e a solução amarela foi agitada enquanto mantida sob árgon. Após 3 horas, 1,0 eq. adicional de DIEA foi adicionado. 24 horas mais tarde, 0,5 eq. do ligante ativado foi incluído na mistura de reação. Após um total de 40 horas, a reação estava completa. 0 conteúdo foi evaporado, colocado em DMSO e injetado em HPLC preparatória (coluna Ci2-RP, 5 μ, 100 Â, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 50 ml/minuto) . As frações desejadas foram evaporadas para proporcionar o produto como um óleo amarelo. Cloreto de metileno (ca. 2 ml) e éter em excesso foram adicionados para proporcionar o Composto 6 como um 322 ΕΡ1725249Β1 precipitado branco que foi filtrado e seco. Rendimento: 90 mg (52 %) . ES-MS m/z 1344,32 [M+H]+, 1366,29 [M+Na]+; UV Xmax 215, 24 8 nm.
Exemplo 8 - Preparação do Composto 7
7
O Composto 4 (133 mg, 0,15 mmol, 1 eq.), Composto AB (123 mg, 0,167 mmol, 1,1 eq.), e HOBt (4 mg, 0,2 eq.) foram diluídos com DMF (1,5 ml). Após 2 minutos, piridina (5 ml) foi adicionada e a reação foi monitorizada usando RP-HPLC. A reação estava completa dentro de 18 horas. A mistura de reação foi diluída com diclorometano (20 ml), lavada sucessivamente com 10 % de ácido cítrico (2x10 ml) , água (10 ml) , NaCl aq. saturado (10 ml) . A camada orgânica foi separada e concentrada. O resíduo resultante foi suspenso novamente em diclorometano e foi purificado através de cromatografia de fulgor em sílica gel com um gradiente de etapas de 0-10 % de MeOH em diclorometano. As frações relevantes foram combinadas e concentradas para proporcionar o Composto 7 como uma espuma branca: 46 mg (21 %) . Rf 0,15 (10 % de MeOH/CH2CI2) . ES-MS m/z 1476, 94 [M+H] + .
Exemplo 9 - Preparação de éster t-butílico de MC-Val-Cit-PAB-MMAF 8 323 ΕΡ1725249Β1
s.
NH3 8 0 Composto 1 (83 mg, 0,11 mmol) , Composto AB (85 mg, 0,12 mmol, 1,1 eq.), e HOBt (2,8 mg, 21 μπιοί, 0,2 eq.) foram colocados em DMF seco (1,5 ml) e piridina (0,3 ml) enquanto mantidos sob árgon. Após 30 horas, a reação estava essencialmente completa de acordo com HPLC. A mistura foi evaporada, colocada numa quantidade minima de DMSO e purificada por HPLC preparatória (coluna Ci2-RP, 5 μ, 100 Á, gradiente linear de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 25 ml/minuto) para proporcionar o Composto 8 como um sólido branco. Rendimento: 103 mg (71 %) . ES- MS m/z 1387,06 [M+H]+, 1409, 04 [M+Na]+; UV Xmax 205, 248 nm.
K.
Exemplo 10 - Preparação de MC-Val-Cit-PAB-MMAF 9
NHj 9 O Composto 8 (45 mg, 32 ymol) foi suspenso em cloreto de metileno (6 ml) seguido pela adição de TFA (3 ml) . A solução resultante descansou durante 2 horas, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo e purificada por HPLC preparatória (coluna Ci2-RP, 5 μ, 100 Â, gradiente linear 324 ΕΡ1725249Β1 de MeCN em água (contendo 0,1 % de TFA) de 10 a 100 % em 40 minutos, seguido por 20 minutos a 100 %, numa taxa de fluxo de 25 ml/minuto). As frações desejadas foram concentradas para proporcionar maleimidocaproil-valina- citrulina-p-hidroximetilaminobenzeno-MMAF (MC-val-cit-PAB-MMAF) 9 como um sólido esbranquiçado. Rendimento: 11 mg (25 %) . ES-MS m/z 1330,29 [M+H]+, 1352,24 [M+Na]+; UV 205, 248 nm.
Exemplo 11 - Preparação de terc-butil amida de MC-Val-Cit-PAB-MMAF 10
10 O Composto 3 (217 mg, 0,276 mmol, 1,0 eq.) , Composto AB (204 mg, 0,276 mmol, 1,0 eq.), e HOBt (11 mg, 0,0828 mmol, 0,3 eq.) foram diluidos com piridina/DMF (6 ml) . À esta mistura foi adicionado DIEA (0, 048 ml), e a mistura foi agitada durante 16 horas. Orgânicos voláteis foram evaporados sob vácuo. 0 resíduo bruto foi purificado por Chromatotron® (cromatografia de camada final radial) com um gradiente de etapas (0-5 metanol a 10 % em DCM) para proporcionar terc-butil amida de MC-val-cit-PAB-MMAF 10. Rendimento: 172 mg (45 %); ES-MS m/z 1386,33 [M+H]+, 14 0 8,36 [M+Na]+; UV Xmax 215, 248 nm.
Exemplo 12 - Preparação de ACi0-MC-MMAE pela Conjugação de ACio e MC-MMAE ACio, dissolvido em 500 mM de borato de sódio e 500 mM de cloreto de sódio a um pH de 8,0, é tratado com um excesso de 100 mM de ditiotreítol (DTT) . Após incubação a 325 ΕΡ1725249Β1 37 °C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição sobre resina Sephadex G25 e eluido com PBS com 1 mM DTPA. O valor de tiol/Ab é verificado por determinação da concentração de anticorpo reduzido da absorvância a 280 nm da solução e a concentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e determinação da absorvância a 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é arrefecido em gelo. O reagente de fármaco ligante, maleimidocaproil-monometil auristatina E, isto é, MC-MMAE, dissolvido em DMSO, é diluído em acetonitrilo e água em concentração conhecida, e adicionado ao anticorpo reduzido arrefecido ACio em PBS. Após aproximadamente uma hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriar rapidamente a reação e capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não feito reagir. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e ACi0-MC-MMAE é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 μπι sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Exemplo 13 - Preparação de AC10-MC-MMAE pela conjugação de AC10 e MC-MMAF ACio-MC-MMAF foi preparado pela conjugação de ACio e MC- MMAF seguindo o procedimento do Exemplo 12.
Exemplo 14 - Preparação de ACi0-MC-val-cit-PAB-MMAE pela
conjugação de ACio e MC-val-cit-PAB-MMAE ACio-MC-val-cit-PAB-MMAE foi preparado pela conjugação de ACio e MC-val-cit-PAB-MMAE seguindo o procedimento do Exemplo 12. 326 ΕΡ1725249Β1
Exemplo 15 - Preparação de ACi0-MC-val-cit-PAB-MMAF pela conjugação de ACi0 e MC-val-cit-PAB-MMAF (9) ACio-MC-val-cit-PAB-MMAF foi preparado pela conjugação de AC 10 e MC-val-cit-PAB-MMAF (9) seguindo o procedimento do Exemplo 12.
Exemplo 16 - Determinação de citotoxicidade de compostos selecionados A atividade citotóxica de MMAF e dos Compostos 1-5 foi avaliada nas linhas de célula positiva Lewis Y OVCAR-3, carcinoma de mama H3396, carcinoma de pulmão L2987 e linhas de célula positiva Lewis Y de carcinoma de cólon LS174t podem ser analisadas quanto à toxicidade. Para avaliar a citotoxicidade dos Compostos 1-5, as células podem ser semeadas a cerca de 5 - 10.000 por poço em 150 μΐ de meio de cultura então tratadas com doses graduadas dos Compostos 1-5 em quadruplicatas no inicio do ensaio. Os ensaios de citotoxicidade são usualmente executados durante 96 horas após a adição dos compostos de teste. Cinquenta μΐ de corante resazurina podem ser adicionados a cada poço durante as últimas 4 a 6 horas da incubação para avaliar as células viáveis ao final da cultura. A redução do corante pode ser determinada por espetrometria de fluorescência usando a excitação e emissão de comprimentos de onda de 535 nm e 590 nm, respetivamente. Para análise, a extensão de redução de resazurina pelas células tratadas pode ser comparada àquela das células de controlo não tratadas.
Para ensaios de exposição de 1 hora, as células podem ser pulsadas com o fármaco durante 1 hora e então lavadas; o efeito citotóxico pode ser determinado após 96 horas de incubação. 327 ΕΡ1725249Β1 EXEMPLO 17 - dados de citotoxicidade in vitro para compostos selecionados 0 Quadro 10 mostra o efeito citotóxico de Conjugados de cAClO dos Compostos 7-10, analisados como descrito no Procedimento Geral I numa linha de célula CD30+ Karpas 299. Os dados de duas experiências separadas são apresentados. Os conjugados de cAClO dos Compostos 7 e 9 tiveram resultados ligeiramente mais ativos que cAClO-val-cit-MMAE. QUADRO 10
Conjugado IC50 (ng/ml) cAC10-val-cit-MMAE 6 CAC10-7 1,0 CAC10-8 15 CAC10-9 0,5 cAClO-10 20
Em outras experiências, BR96-val-cit-MMAF foi pelo menos 250 vezes mais potente que o MMAF livre.
Procedimento Geral I - Determinação de Citotoxicidade.
Para avaliar a citotoxicidade dos Conjugados Exemplares 7-10, as células foram semeadas a cerca de 5 - 10.000 por poço em 150 μΐ de meio de cultura, então tratadas com doses graduadas de Conjugados Exemplares 7-10 em quadruplicatas no inicio do ensaio. Análises de citotoxicidade foram executadas durante 96 horas após a adição dos compostos de teste. Cinquenta μΐ do corante resazurina foram adicionados a cada poço durante as últimas 4 a 6 horas da incubação para avaliar as células viáveis no final da cultura. A redução de corante foi determinada por espetrometria de fluorescência usando a excitação e emissão dos comprimentos de onda de 535 nm e 590 nm, respetivamente. Para análise, a 328 ΕΡ1725249Β1 extensão de redução de resazurina pelas células tratadas foi comparada àquela das células de controlo não tratadas.
Exemplo 18 - ensaio de proliferação de célula in vitro A eficácia de ADC pode ser medida por um ensaio de proliferação de célula utilizando o protocolo a seguir (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Câncer Res. 62:5485-5488): 1. Uma aliquota de 100 μΐ de cultura de célula contendo cerca de 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 ou MDA-MB-468) no meio foi depositada em cada poço de uma lâmina de parede opaca de 96 poços. 2. Poços de controlo foram preparados contendo meio e sem células. 3. ADC foi adicionado aos poços experimentais e incubado durante 3-5 dias. 4. As lâminas foram equilibradas na temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos. 5. Um volume de Reagente CellTiter-Glo igual ao volume de meio de cultura de célula presente em cada poço foi adicionado. 6. O conteúdo foi misturado durante 2 minutos num agitador orbital para induzir lise das células. 7. A lâmina foi incubada na temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência. 8. A luminescência foi registada e relatada em gráficos como ULR = unidades de luminescência relativa.
Exemplo 19 - Depuração plasmática em ratos 329 ΕΡ1725249Β1 A farmacocinética de depuração plasmática de conjugados de anticorpo- fármaco e anticorpo total foi estuda em ratos Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 250-275 g cada) . Os animais foram dosados por bolo de injeção da veia da cauda (IV Push). Aproximadamente 300 μΐ de sangue total foi colhido através da cânula jugular, ou alfinetada na cauda, em recipientes de anticoagulante de lítio/heparina em cada ponto no tempo: 0 (pré-dose), 10 e 30 minutos; 1, 2, 4, 8, 24 e 36 horas; e 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28 dias após a dose. O anticorpo total foi medido por ELISA - ECD/GxhuFc-HRP. Conjugado de anticorpo- fármaco foi medido por ELISA - MMAE/MMAF/ECD-Bio/SA-HRP.
Exemplo 20 - Depuração plasmática em macaco A farmacocinética de depuração plasmática de conjugados de anticorpo-fármaco e anticorpo total pode ser estuda em macacos Cynomolgus. A Figura 12 mostra um estudo de depuração da concentração plasmática de dois estágios após administração de H-MC-vc-MMAE a macacos Cynomolgus em doses diferentes: 0,5, 1,5, 2,5, e 3,0 mg/kg, administrada no dia 1 e dia 21. Concentrações de anticorpo total e ADC foram medidas periodicamente. (H = Trastuzumab).
Exemplo 21 - Eficácia in vivo de volume de tumor em explantes de ratinhos transgénicos
Animais adequados para experiências transgénicos podem ser obtidos de fontes comerciais padrões tais como Taconic (Germantown, N.Y.). Muitas estirpes são adequadas, mas ratinhos FVB fêmeas são preferidos devido a sua alta suscetibilidade ã formação de tumor. FVB machos podem ser usados para acasalamento e machos CD.1 vasectomizados podem ser usados para estimular pseudogravidez. Ratinhos vasectomizados podem ser obtidos de qualquer fornecedor 330 ΕΡ1725249Β1 comercial. Fundadores podem ser criados tanto com ratinhos FVB quanto com ratinhos 129/BL6 x FVB p53 heterozigóticos. Os ratinhos com heterozigosidade no alelo p53 podem ser usados para aumentar potencialmente a formação de tumor. Alguns tumores F1 são de estirpe mista. Tumores primários podem ser apenas FVB.
Animais que têm tumores (aloenxerto propagados de ratinho transgénico Fo5 mmtv) podem ser tratados com uma dose única ou múltipla por injeção IV de ADC. 0 volume do tumor pode ser avaliado em vários pontos no tempo após a injeção.
Exemplo 22 - Síntese de MC-MMAF via éster t-butílico Síntese 1:
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (composto 1, 128,6 mg, 0,163 mmol) foi suspenso em CH2C12 (0,500 ml). Ácido 6-maleimidocaproico (68,9 mg, 0,326 mmol) e 1,3- diisopropilcarbodiimida (0,0505 ml, 0,326 mmol) foram adicionados seguido por piridina (0,500 ml). A mistura de reação foi deixada agitar durante 1,0 hora. Análise por 331 ΕΡ1725249Β1 HPLC indicou consumo completo do composto 1 de partida. Orgânicos voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O produto foi isolado através de cromatografia de fulgor de coluna, usando um gradiente de etapa de 0 a 5 % de Metanol em CH2C12. Um total de 96 mg de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (12) puro (60 % de rendimento) foi recuperado. ES-MS m/z 981,26 [M+H]+, 1003, 47 [M+Na]+; 979, 65 [M-H]-. MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Composto 12, 74 mg, 0,0754 mmol) foi suspenso em CH2C12 (2,0 ml) e TFA (1 ml) na temperatura ambiente. Após 2,5 horas, análise de HPLC indicou consumo completo do material de partida. Orgânicos voláteis foram evaporados sob pressão reduzida, e o produto foi isolado através de RP-HPLC preparatória, usando uma Coluna Phenomenex C22 Synergi Max-RP 80Â (250 x 21,2 mm) . Eluente: gradiente linear 10 % a 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq.) durante 30 minutos, então 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 20 minutos. ES-MS m/z 925,33 [M+H ]+; 947,30 [M+Na]+; 923, 45 [M-H]-.
Exemplo 23a - Síntese de MC-MMAF (11) via éster dimetoxibenzilico Síntese 2:
jO C/tãV —~
cçr-
Phe-ODMÔ
Fmec-PhQ-ODMB
.PrV
&2NK/CH4CI£ - - ^ . OCH,0 £ Fmoc-Dop-PíwODMB
OCMj O O Dap-PheOODMB 332 ΕΡ1725249Β1
Frroc-MeVal-Va|.Dn-Oap-Ptie-OOMa
MeVal-Val-DIJ-Dap-Pfte-ODMS
dimetoxibenzílico (Fmoc-Phe-ODMB).
Um balão de fundo redondo de 5 L, 3 tubuladuras, foi carregado com Fmoc-L-fenilalanina (200 g, 516 mmol Bachem), álcool 2,4-dimetoxibenzílico (95,4 g, 567 mmol, Aldrich), e CH2C12 (2,0 L). N,N-dimetilformamida t-butil acetal (155 ml, 586 mmol, Fluka) foi adicionado à suspensão resultante durante 20 minutos sob N2, o gue resultou numa solução límpida. A reação foi, então, agitada na temperatura ambiente durante a noite, e após este período de tempo análise TLC (0,42, Heptano/EtOAc = 2:1) indicou gue a reação estava completa. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para proporcionar um óleo amarelo claro, gue foi redissolvido em CH2C12 (200 ml) e purificado através de um plugue curto de sílica gel (25 cm x 25 cm, 333 ΕΡ1725249Β1 CH2C12) para proporcionar uma espuma incolor (250 g). MeCN (1 L) foi adicionado na espuma resultante, que dissolveu totalmente o lote. Ela foi então concentrada até secagem e redissolvida em MeCN (1 L) e a suspensão resultante foi agitada durante 1 hora, filtrada e o bolo de filtragem foi enxaguado com MeCN (2 x 200 ml) para proporcionar éster Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibenzílico como um sólido branco (113,58 g, 41 %, 95,5 % AUC por análise de HPLC) .
Dados: HPLC.
Preparação de éster L-fenilalanina-2,4-dimetoxibenzilico (Phe-ODMB).
Um balão de fundo redondo de 500 ml foi carregado com éster Fmoc- L-fenilalanina-2,4-dimetoxibenzílico (26,00 g, 48,3 mmol), CH2C12 (150 ml) e dietilamina (75 ml, Acros). A mistura foi agitada na temperatura ambiente e o término foi monitorizado por HPLC. Após 4 horas, a mistura foi concentrada (temperatura do banho < 30 °C) . O resíduo foi novamente suspenso em CH2C12 (20 ml), e concentrado. Isso foi repetido mais uma vez. Ao resíduo foi adicionado MeOH (20 ml), o que causou a formação de um gel. Este resíduo
foi diluído com CH2C12 (200 ml), concentrado e 0 óleo turvo foi deixado sob vácuo durante a noite. 0 resíduo foi suspenso em CH2C12 (100 ml ) , então tolueno (120 ml) foi adicionado. A mistura foi concentrada e 0 resíduo foi deixado sob vácuo durante a noite. Dados: HPLC, 1H RMN
Preparação de Fmoc-Dolaproína (Fmoc-Dap)
Boc-Dolaproína (58,8 g, 0,205 mol) foi suspenso em 4 N HC1 em 1,4-dioxano (256 ml, 1,02 mol, Aldrich). Após agitação durante 1,5 horas, análise de TLC indicou que a 334 ΕΡ1725249Β1 reação estava completa (10 % de MeOH/CH2Cl2) e a mistura foi concentrada até secagem quase completa. 1,4-dioxano adicional foi carregado (50 ml) e a mistura foi concentrada até secagem e seca sob vácuo durante a noite. O sólido branco resultante foi dissolvido em H20 (400 ml) e transferido para um balão de fundo redondo, de 3 L, três tubuladuras, com um agitador mecânico e sonda de temperatura. N,N-diisopropiletilamina (214,3 ml, 1,23 mol, Acros) foi adicionado durante um minuto, causando uma exoterma de 20,5 a 28,2 °C (interna). A mistura foi arrefecida num banho de gelo e 1,4-dioxano foi adicionado (400 ml). Uma solução de Fmoc-OSu (89, 90 g, 0,267 mol,
Advanced ChemTech) em 1,4-dioxano (400 ml) foi adicionada de um funil de adição durante 15 minutos, mantendo a temperatura de reação a seguir de 9 °C. A mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada durante 19 horas, após o que a mistura foi concentrada por evaporação giratória até uma pasta aquosa (390 g) . A suspensão foi diluída com H20 (750 ml) e Et20 (750 ml) , causando a formação copiosa de um precipitado branco. As camadas foram separadas, mantendo os sólidos com a camada orgânica. A camada aquosa foi acidificada usando HC1 concentrado (30 ml) e extraída com EtOAc (3 x 500 ml). Os extratos combinados foram secos com MgS04, filtrados e concentrados para proporcionar 59,25 de um óleo amarelo A. O extrato de Et20 foi extraído uma vez com "sat" (SIC) .
NaHC03 (200 ml), mantendo os sólidos com a camada aquosa. A suspensão aquosa foi acidificada usando HC1 concentrado (50 ml) e extraída com Et20 (50 ml) , mantendo os sólidos com a camada orgânica. A camada orgânica foi filtrada e concentrada para proporcionar 32,33 g de um óleo amarelo B. Os dois óleos (A e B) foram combinados e purificados por cromatografia de fulgor em sílica gel eluindo com CH2C12 (3,5 L) , então 3 % de MeOH/CH2Cl2 (9 L) para proporcionar 335 ΕΡ1725249Β1 68,23 g de Fmoc-dolaproína como uma espuma branca (81 %, 97,5 % de pureza por HPLC (AUC)).
Preparação de Fmoc-Dap-Phe-ODMB
Phe-ODMB bruto (48,3 mmol) foi suspenso em DMF anidro (105 ml, Acros) durante 5 minutos e Fmoc-Dap (19,80 g, 48,3 mmol) foi adicionado. A mistura foi arrefecida num banho de gele e TBTU (17,08 g, 53,20 mmol, Matrix Innovations) foi adicionado. N,N-diisopropiletilamina (25,3 ml, 145,0 mmol, Acros) foi adicionada através de seringa durante 3 minutos. Após 1 hora, o banho de gelo foi removido e a mistura foi deixada aguecer durante 30 minutos. A mistura foi colocada em água (1 L) e extraída com acetato de etilo (300 ml) . Após separação, a camada aguosa foi novamente extraída com acetato de etilo (2 x 150 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (150 ml), secas (MgS04) e filtradas (filtro de papel) para remover os insolúveis (inorgânicos e um pouco de dibenzofulveno). Após concentração, o resíduo (41 g) foi absorvido em sílica (41 g) e purificado por cromatografia (coluna de 22 cm x 8 cm; 65 % de Heptano/EtOAc (2,5 L) ; 33 % de Heptano/EtOAc (3,8 L) , para proporcionar 29,4 g de produto como uma espuma branca (86 %, 92 % de pureza por HPLC).
Dados: HPLC, 1H RMN, TLC (1:1 EtOAc/Heptano Rf = 0,33, vermelho em coloração com vanilina).
Preparação de Dap-Phe-ODMB
Um balão de fundo redondo de 1 L foi carregado com Fmoc-Dap- Phe-ODMB (27,66 g), CH2C12 (122 ml) e dietilamina (61 ml, Acros). A solução foi agitada na temperatura ambiente e o término foi monitorizado por HPLC. Após 7 horas, a mistura foi concentrada (temperatura do banho < 30 336 ΕΡ1725249Β1 °C) . 0 resíduo foi suspenso em CH2C12 (300 ml) e concentrado. Isto foi repetido duas vezes. Ao resíduo foi adicionado MeOH (20 ml) e CH2C12 (300 ml) , e a solução foi concentrada. O resíduo foi suspenso em CH2C12 (100 ml) e tolueno (400 ml) , concentrado, e o resíduo foi deixado sob vácuo durante a noite para proporcionar um resíduo tipo creme.
Dados: HPLC, 1H RMN, MS Preparação de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Dap-Phe-ODMB bruto (39,1 mmol) foi suspenso em DMF anidro (135 ml, Acros) durante 5 minutos e Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (24,94 g, 39,1 mmol, veja-se Exemplo 2 para preparação) foi adicionado. A mistura foi arrefecida num banho de gelo e TBTU (13,81 g, 43,0 mmol, Matrix
Innovations) foi adicionado. N,N-diisopropiletilamina (20,5 ml, 117,3 mmol, Acros) foi adicionada através de seringa durante 2 minutos. Após 1 hora, o banho de gelo foi removido e a mistura foi deixada aguecer durante 30 minutos. A mistura foi colocada em água (1,5 L) e diluída com acetato de etilo (480 ml) . Após descansar durante 15 minutos, as camadas foram separadas e a camada aguosa foi extraída com acetato de etilo (300 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (200 ml) , secas (MgSCg) e filtradas (filtro de papel) para remover os insolúveis (inorgânicos e um pouco de dibenzofulveno). Após concentração, o resíduo (49 g) foi raspado do balão e absorvido em sílica (49 g) e purificado por cromatografia (coluna dia de 15 cm x 10 cm; 2:1 EtOAc/Heptano (3 L) , EtOAc (5L); frações de 250 ml) para proporcionar 31,84 g de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB como uma espuma branca (73 %, 93 % de pureza por HPLC (AUC)). 337 ΕΡ1725249Β1
Dados, HPLC, TLC (2:1 EtOAc/heptano, Rf = 0,21, vermelho em coloração com vanilina).
Preparação de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Um balão de fundo redondo de 1 litro foi carregado com Fmoc- MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (28,50 g) , CH2C12 (80 ml) e dietilamina (40 ml). A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite e então foi concentrada sob pressão reduzida. O residuo foi absorvido em sílica (30 g) e purificado por cromatografia de fulgor (coluna dia de 15 cm x 8 cm; 2 % de MeOH/DCM (2L), 3 % de MeOH/DCM (1 L), 6 % de MeOH/DCM (4 L) ; frações de 250 ml) para proporcionar 15,88 g de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB como uma espuma branca (69 %, 96 % de pureza por HPLC (AUC)).
Dados: HPLC, TLC (6 % de MeOH/DCM, Rf = 0,24, vermelho em coloração com vanilina).
Preparação de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Um balão de fundo redondo, 50 ml, foi carregado com MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (850 mg, 0,85 mmol), DMF anidro (4 ml), ácido maleimidocaproico (180 mg, 0,85 mmol), e TBTU (300 mg, 0,93 mmol, Matrix Innovations) na temperatura ambiente. N,N-diisopropiletilamina (450 pL, 2,57 mmol) foi adicionado através de seringa. Após 1,5 horas, a mistura foi colocada em água (50 ml) e diluída com acetato de etilo (30 ml) . NaCl foi adicionado para melhorar a separação. Após separação das camadas, a camada aguosa foi extraída com acetato de etilo (25 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas (MgS04) , filtradas e concentradas. O óleo resultante (1 g) foi purificado por cromatografia de fulgor [100 ml de sílica; 25 % de Heptano/EtOAc (100 ml), 10 % de Heptano/EtOAc (200 ml), EtOAc (1,5 L) ] para 338 ΕΡ1725249Β1 proporcionar MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (13) como uma espuma branca (521 mg, 57 %, 94 % de pureza por HPLC (AUC)).
Dados: 1H RMN, HPLC.
Preparação de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH (MC-MMAF) (11)
Um balão de fundo redondo de 50 ml foi carregado com MC- MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (Composto 13, 428 mg, 0,39 mmol) e dissolvido em 2,5 % de TFA/CH2CI2 (20 ml). A solução tornou-se rosa-roxa durante 2 minutos. O término foi monitorizado por HPLC e TLC (6 % de MeOH/DCM, coloração com KMnCg) . Após 40 minutos, três gotas de água foram adicionadas e a mistura turva rosa-roxo foi concentrada para proporcionar 521 mg de um resíduo de cor rosa. Purificação por cromatografia (15 % IPA/DCM) proveu 270 mg de MC- MMAF (73 %, 92 % de pureza por HPLC) como um sólido branco.
Exemplo 23b - Síntese de análogo de mc-MMAF
339 ΕΡ1725249Β1
MB-MeM-Val-Dfl-Dap-Phe -OtBu
ti
O
MB-MMAF
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Composto 1, 35 mg, 0,044 mmol) foi suspenso em DMF (0,250 ml). Ácido 4-(2,5-Dioxo-2,5-diidro-pirrol-l-il)- benzoico (11 mg, 0,049 mmol) e HATU (17 mg, 0,044 mmol) foram adicionados, seguidos por DIEA (0,031 ml, 0,17 mmol) . Esta mistura de reação foi deixada agitar durante 2,0 horas. Análise de HPLC indicou consumo completo do composto 1 de partida. O produto foi isolado através de RP-HPLC preparatória, usando uma Coluna Phenomenex Ci2 Synergi Max-RP 80 À (250 x 21,20 mm) . Eluente: gradiente linear 10 % a 80 % de MeCN/0,05 % de TF A (aq) durante 8 minutos, então 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 12 minutos. Um total de 20 mg de produto puro (14) foi isolado (0,02 mmol, 46 % de rendimento). ES-MS m/z 987,85 [M+H]+, 1019,41 [M+Na] +; 985, 54 [M-H] ~.
MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Composto 14, 38 mg, 0,0385 mmol) foi suspenso em CH2C12 (1 ml) e TFA (1 ml). A mistura foi agitada durante 2,0 horas, e então os orgânicos voláteis foram evaporados sob pressão reduzida. O produto foi purificado por RP-HPLC preparatória, usando uma Coluna Phenomenex Ci2 Synergi Max-RP 80 Á (250 x 21,20 mm). Eluente: gradiente linear 10 % a 80 % de MeCN/0,05 % de TFA 340 ΕΡ1725249Β1 (aq) durante 8 minutos, então 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 12 minutos. Um total de 14,4 mg de produto MB-MMAF foi isolado (0,015 mmol, 40 % de rendimento). ES-MS m/z 930, 96 [M+H]+, 952, 98 [M+Na]+; 929,37 [M-H] .
Exemplo 23c - Preparação de MC—MeVal—Cit—PAB—MMAF (16)
NH* A uma suspensão na temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OH (3,03 g, 8,57 mmol) e carbonato de N,N'-dissuccimidilo (3,29 g, 12,86 mmol) em CH2C12 (80 ml) foi adicionado DIEA (4,48 ml, 25,71 mmol). Esta mistura de reação foi deixada agitar durante 3,0 horas, e então foi colocada num funil de separação onde a mistura orgânica foi extraída com 0,1 M HC1 (aq). O resíduo orgânico bruto foi concentrado sob pressão reduzida, e o produto foi isolado por cromatografia de fulgor de coluna em sílica gel usando um gradiente linear de 20-100 % de acetato de etila/hexanos. Um total de 2,18 g de Fmoc-MeVal- OSu puro (4,80 mmol, 56 % de rendimento) foi recuperado. A uma suspensão de Fmoc-MeVal-OSu (2,18 g, 4,84 mmol) em DME (13 ml) e THF (6,5 ml) na temperatura ambiente foi adicionada uma solução de L-citrulina (0,85, 4,84 mmol) e NaHC03 (0,41 g, 4,84 mmol) em H20 (13 ml). A suspensão foi deixada agitar na temperatura ambiente durante 16 horas, então foi extraída em terc-BuOH/CHCl3/H20, acidificada a um pH = 2-3 com 1 M HC1. A fase orgânica foi separada, seca e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado 341 ΕΡ1725249Β1 com dietil éter resultando em 2,01 g de Fmoc- MeVal-Cit-COOH que foi usado sem purificação adicional. O Fmoc-MeVal-cit-COOH bruto foi suspenso em CH2CI2/MeOH a 2:1 (100 ml), e a ele foi adicionado álcool p-aminobenzí lico (0,97 g, 7,9 mmol) e EEDQ (1,95 g, 7,9 mmol). Esta suspensão foi deixada agitar durante 125 horas, então os orgânicos voláteis foram removidos sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de fulgor em sílica gel, usando 10 % de MeOH/CH2Cl2. Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH puro (0,55 g, 0,896 mmol, 18,5 % de rendimento) foi recuperado. ES-MS m/z 616,48 [M+H]+. A uma suspensão de Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0,55 g, 0, 896 mmol) em CH2CI2 (40 ml) foi adicionado STRATOSPHERES™ (ligado a piperazina-resina) (> 5 mmol/g, 150 mg). Após ser agitada na temperatura ambiente durante 16 horas, a mistura foi filtrada através de celite (pré-lavada com MeOH), e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com dietil éter e hexanos. O material sólido resultante, MeVal-Cit-PAB-OH, foi suspenso em CH2C12 (20 ml) , e a ele foi adicionado MC-OSu (0,28 g, 0,896 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,99 mmol), e DMF (15 ml) . Esta suspensão foi agitada durante 16 horas, mas análise de HPLC da mistura de reação indicou reação incompleta, assim a suspensão foi concentrada sob pressão reduzida até um volume de 6 ml, então uma solução a 10 % de NaHCCh (aq) foi adicionada e a suspensão foi agitada por mais 16 horas. Solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de fulgor em sílica gel, usando um gradiente de 0-10 % de MeOH/CH2Cl2, resultando em 42 mg (0,072 mmol, 8 % de rendimento) de MC-MeVal-Cit-PAB-OH. A uma suspensão de MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2,37 g, 4,04 mmol) e bis(nitrofenil)carbonato (2,59 g, 8,52 mmol) em 342 ΕΡ1725249Β1 CH2C12 (10 ml) foi adicionado DIEA (1,06 ml, 6,06 mmol) .
Esta suspensão foi agitada durante 5,5 horas, concentrada sob pressão reduzida e purificada por trituração com dietil éter. MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0,196 mmol) foi suspensa numa solução de 1:5 de piridina/DMF (3 ml), e a isto foi adicionado HOBt (5 mg, 0,039 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,978 mmol) e MMAF (composto 2, 150 mg, 0,205 mmol). Esta mistura de reação foi agitada durante 16 horas na temperatura ambiente, e então purificada por RP-HPLC preparatória (x3), usando uma Coluna Phenomenex Ci2 Synergi Max-RP 80 Á (250 x 21,20 mm). Eluente: gradiente linear 10 % a 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) durante 30 minutos, então 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (aq) isocrático durante mais 20 minutos. MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16) foi obtido como um sólido amarelado (24,5 mg, 0,0182, 0,45 % de rendimento). ES-MS m/z 1344,95 [M+H]+, 1366,94 [M+Na]+.
Exemplo 23d - Preparação de éster de succinimida de suberil Vai—Cit—PAB—MMAF (17)
Composto 17
O composto 1 (300 mg, 0,38 mmol), Fmoc-Val-cit-PAB-pNP (436 mg, 0,57 mmol, 1,5 eq.) foram suspensos em piridina anidra, 5 ml. HOBt (10 mg, 0,076 mmol, 0,2 eq.) foi adicionado seguido por DIEA (199 μΐ, 1,14 mmol, 3 eq.). A mistura de reação foi exposta a ondas sonoras durante 10 minutos, e então foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. Piridina foi removida sob pressão reduzida, o 343 ΕΡ1725249Β1 resíduo foi novamente suspenso em CH2CI2. A mistura foi separada por cromatografia de fulgor de sílica gel num gradiente de etapa de MeOH, de 0 a 10 %, em CH2C12. As frações contendo produto foram extraídas, concentradas, secas em vácuo durante a noite para proporcionar 317 mg (59 % de rendimento) de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu. ES-MS m/z 1415,8 [M+H] + .
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu (100 mg) foi agitado em 20 % de TFA/CH2CI2 (10 ml), durante 2 horas. A mistura foi diluída com CH2C12 (50 ml) . A camada orgânica foi lavada sucessivamente com água (2 x 30 ml) e salmoura (1 x 30 ml). A fase orgânica foi concentrada, carregada numa almofada de sílica gel em 10 % de MeOH/CH2Cl2. O produto foi eluído com 30 % de MeOH/CH2Cl2. Após secagem sob vácuo durante a noite, Fmoc-Val-Cit- PAB-MMAF foi obtido como um sólido branco, 38 mg, 40 % de rendimento. ES- MS m/z 1357,7 [M-H].
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF, 67 mg, foi suspenso em CH2C12 (2 ml) dietilamina (2 ml) e DMF (2 ml) . A mistura foi agitada durante 2 horas na temperatura ambiente. Solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi co-evaporado com piridina (2 ml), então com tolueno (2x5 ml), seco sob vácuo. Val-Cit-PAB-MMAF foi obtido como um óleo amarronzado, e usado sem purificação adicional.
Todo Val-Cit-PAB-MMAF preparado de 67 mg de Fmoc-Val-cit- PAB-MMAF, foi suspenso em piridina (2 ml) , e adicionado a uma solução de suberato de dissuccinimidilo (74 mg, 0,2 mmol, 4 eq.), em piridina (1 ml). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente. Após 3 horas, éter (20 ml) foi adicionado. Precipitado foi colhido, lavado com uma quantidade adicional de éter. Um sólido avermelhado foi suspenso em 30 % de MeOH/ CH2C12, filtrado através de uma almofada de sílica gel com 30 % de MeOH/ 344 ΕΡ1725249Β1 CH2CI2 como um eluente. 0 Composto 17 foi obtido como um sólido branco, 20 mg (29 % de rendimento). ES-MS m/z 1388,5 [M-H] .
Exemplo 24 - Eficácia Jn vivo de Conjugados Anticorpo-
Fármaco mcMMAF
Eficácia de cAClO-mcMMAF em xenoenxertos de Karpas-1299 ALCL: Para avaliar a eficácia in vivo de cAClO-mcMMAF com uma média de 4 frações de fármaco por anticorpo (cAClO-mcF4), células Karpas-299 humana ALCL foram implantadas subcutaneamente em ratinhos C.B-17 SCID imunodeficiente (5xl06 células por ratinho) . Os volumes de tumor foram calculados usando a fórmula (0,5xLxW2) onde L e W são as duas medições bidirecionais, mais longa e mais curta. Quando o volume médio do tumor nos animais do estudo atingiu cerca de 100 mm3 (intervalo 48-162), os ratinhos foram divididos em 3 grupos (5 ratinhos por grupo) e foram tanto deixados sem tratamento quanto foram proporcionados com uma injeção intravenosa única através da veia da cauda com 1 ou 2 mg/kg cAC10-mcF4 (Figura 1) . Os tumores nos ratinhos não tratados cresceram rapidamente até um volume médio de > 1.000 mm3 dentro de 7 dias do inicio da terapêutica. Em contraste, todos os tumores tratados com cAC10-mcF4 mostraram regressão rápida com 3/5 no grupo de 1 mg/kg e 5/5 no grupo de 2 mg/kg obtendo resposta completa do tumor. Embora o tumor num dos indivíduos totalmente respondedores no grupo de 2 mg/kg tenha recorrido cerca de 4 semanas mais tarde, não houve tumores detetáveis nos 4/5 das respostas remanescentes neste grupo e nos 3 casos de resposta completa no grupo de 1 mg/kg nas 10 semanas após a terapêutica.
Eficácia de cBR96-mcMMAF nos Xenoenxertos L2987 NSCLC: cBR96 é um anticorpo quimérico que reconhece o antigénio 345 ΕΡ1725249Β1
LeY. Para avaliar a eficácia in vivo de cBR96-mcMMAF com 4 fármacos por anticorpo (cBR96-mcF4) fragmentos de tumor de cancro de pulmão de célula grande L2987 (NSCLC) foram implantadas em ratinho nu atímico. Quando os tumores atingiram uma média de cerca de 100 mm3, os ratinhos foram divididos em 3 grupos: grupo não tratado e 2 grupos de terapêuticas. Para terapêutica, conforme mostrado na Figura 3a, os ratinhos receberam cBR96- mcF4 em doses de 3 ou 10 mg/kg/in jeção cada 4 dias para um total de 4 injeções (q4dx4). Conforme mostrado na Figura 3b, cBR96-mcF4 ou um conjugado de controlo não ligando foi administrado aos ratinhos em injeções de 3 ou 10 mg/kg a cada 4 dias, num total de 4 injeções (q4dx4). Conforme mostrado nas Figuras 3a e 3 b, BR96-mcF4 produziu atraso pronunciado no crescimento do tumor se comparado aos controlos. A Figura 2 mostra um ensaio de eficácia in vivo, de dose única de cAClO-mcMMAF em L540CY subcutaneamente. Para este estudo existiam 4 ratinhos no grupo sem tratamento e 10 em cada um dos grupos de tratamento.
Exemplo 25 - Eficácia In vitro de Conjugados de Anticorpo-Fármaco mc-MMAF
Atividade de conjugados de cAClO- anticorpo-fármaco contra linhas de célula CD30+. As Figuras 4a e 16b mostram curvas de resposta a dosagem de uma experiência representativa onde culturas de Karpas 299 (linfoma de célula grande anaplástico) e L428 (Linfoma de Hodgkin) foram incubadas com cAClO-mcMMAF diluído (Figura 4a) ou cAC-10-vcMMAF (Figura 4b) de forma serial durante 96 horas. As culturas foram marcadas durante 4 horas com 50 μΜ de resazurina [10-óxido de 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona] e a fluorescência foi medida. Os dados foram reduzidos no GraphPad Prism, versão 4.000, usando o procedimento de 346 ΕΡ1725249Β1 ajuste de curva de dose - resposta de 4 de parâmetros. Os valores IC50 são definidos como a concentração onde o crescimento é reduzido 50 % se comparado com culturas de controlo não tratadas. Cada concentração foi testada quatro vezes.
Atividade de conjugados de cBR96- anticorpo-fármaco contra linhas de célula LeY+. As Figuras 5a e 5b mostram curvas de resposta de dose de uma experiência representativa onde culturas de H3396 (carcinoma de mama) e L2987 (carcinoma de pulmão de célula grande) foram incubadas com cBR96-mcMMAF (Figura 5a) ou -vcMMAF (Figura 5b) diluídos de forma serial durante 96 horas. As culturas foram marcadas durante 4 horas com resazurina 50 μΜ e a fluorescência foi medida. Os dados foram reduzidos no GraphPad Prism, versão 4.000, usando o procedimento de ajuste de 4-dose de parâmetro-curva de resposta. Os valores IC50 são definidos como a concentração onde o crescimento é reduzido 50 % se comparado com culturas de controlo não tratadas. Cada concentração foi testada quatro vezes.
Atividade de conjugados de clF6- anticorpo-fármaco contra linhas de célula de carcinoma de célula renal CD70+. As Figuras 6a e 6b mostram curvas de resposta-dose de uma experiência representativa onde culturas de células Caki-1 e 786-0 foram incubadas com clF6-mcMMAF (Figura 6a) ou -vcMMAF (Figura 6b) diluídos de forma serial durante 96 horas. As culturas foram marcadas durante 4 horas com resazurina 50 μΜ e a fluorescência foi medida. Os dados foram reduzidos no GraphPad Prism, versão 4.000, usando o procedimento de ajuste de curva de dose - resposta de 4 parâmetros. Os valores IC50 são definidos como a concentração onde o crescimento é reduzido 50 % se comparado com culturas de controlo não tratadas. Cada concentração foi testada quatro vezes. 347 ΕΡ1725249Β1
Exemplo 26 - Purificação de Trastuzumab
Um balão contendo 440 mg de anticorpo HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Patente US N° 5821337) foi dissolvido em 50 ml de tampão MES (25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5,6) e carregados numa coluna de troca catiónica (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que havia sido equilibrada no mesmo tampão. A coluna foi, então, lavada com o mesmo tampão (5 volumes de coluna). Trastuzumab foi eluído por elevação da concentração de NaCl do tampão para 200 mM.
Frações contendo o anticorpo foram agrupadas, diluídas a 10 mg/ml, e dialisadas num tampão contendo 50 mm de fosfato de potássio, 50 mM NaCl, 2 MM EDTA, pH 6,5.
Exemplo 27 - Preparação de Trastuzumab-MC-MMAE por
Conjugação de Trastuzumab e MC-MMAE
Trastuzumab dissolvido em borato de sódio 500 mM e cloreto de sódio 500 mM a um pH de 8,0 é tratado com um excesso de ditiotreitol (DTT) 100 mM. Após incubação a 37 °C durante cerca de 30 minutos, o tampão é trocado por eluição com resina Sephadex G25 e eluído com PBS com DTPA 1 mM. O valor tiol/Ab é verificado por determinação da concentração de anticorpo reduzido a partir da absorvância a 280 nm da solução e a concentração de tiol pela reação com DTNB (Aldrich, Milwaukee, Wl) e a determinação da absorvância a 412 nm. O anticorpo reduzido dissolvido em PBS é arrefecido em gelo. O reagente de ligante de fármaco, maleimidocaproí1-monometil auristatina E (MMAE), isto é MC-MMAE, dissolvido em DMSO, é diluído em acetonitrilo e água em concentração conhecida, e adicionado ao anticorpo trastuzumab reduzido arrefecido em PBS. Após cerca de 1 hora, um excesso de maleimida é adicionado para resfriar rapidamente a reação e 348 ΕΡ1725249Β1 capear quaisquer grupos tióis de anticorpo não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e trastuzumab-MC-MMAE é purificado e dessalinizado por eluição através de resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 um sob condições estéreis, e congelado para armazenagem.
Exemplo 28 - Preparação de Trastuzumab-MC-MMAF por
Conjugação de Trastuzumab e MC-MMAF
Trastuzumab-MC-MMAF foi preparado pela conjugação de trastuzumab e MC-MMAF seguindo o procedimento do Exemplo 27 .
Exemplo 29 - Preparação de Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE por Conjugação de Trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAE
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE foi preparado pela conjugação de trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAE seguindo o procedimento do Exemplo 27.
Exemplo 30 - Preparação de Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF por Conjugação de trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAF 9
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF foi preparado pela conjugação de trastuzumab e MC-val-cit-PAB-MMAF 9 seguindo o procedimento do Exemplo 27.
Exemplo 31 - Toxicidade em Rato O perfil de toxicidade aguda de fármacos e ADC livres foi avaliado em ratos Sprague-Dawley adolescentes (75-125 g cada, Charles River Laboratories (Hollister, CA)) Os animais foram injetados no dia 1, perfis completos da química e hematologia foram obtidos na linha basal, dia 3 e 349 ΕΡ1725249Β1 dia 5 e uma necropsia completa foi executada no dia 5. Medições de enzima hepática foram efetuadas em todos os animais e histologia de rotina foi executada em três animais de forma aleatória para cada grupo para os tecidos a seguir: esterno, fígado, rins, timo, baço, intestino grosso e delgado. Os grupos experimentais foram como se segue:
Grupo Administrado mg/kg pg MMAF/m2 MMAF/MAb N/sexo 1 Veiculo 0 0 0 2/F 2 trastuzumab-MC-val-cit- MMAF 9, 94 840 4,2 6/F 3 trastuzumab-MC-val-cit- MMAF 24,90 2105 4,2 6/F 4 trastuzumab-MC(Me)-val-cit- PAB-MMAF 10,69 840 3,9 6/F 5 trastuzumab-MC(Me)-val-cit- PAB-MMAF 26,78 2105 3,9 6/F 6 trastuzumab-MC-MMAF 10, 17 840 4,1 6/F 7 trastuzumab-MC-MMAF 25, 50 2105 4,1 6/F 8 trastuzumab-MC-val-cit-PAB- MMAF 21, 85 2105 4,8 6/F
Para trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit- PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF e trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, o pg MMAF/m2 foi calculado usando 731,5 como o Peso Molecular (PM) de MMAF e 145167 como o PM de Herceptin. A área superficial corporal foi calculada como se segue: [{(peso corporal em gramas a 0,667 de força) x 11,8J/10000] . (Guidance for Industry and Reviewers, 2002) .
As soluções de dose foram administradas por uma injeção única intravenosa em bolo na veia da cauda no Dia 1 350 ΕΡ1725249Β1 do Estudo num volume de dose de 10 ml/kg. Os pesos corporais dos animais foram medidos antes da dose no Dia 1 do Estudo e diariamente no período restante. Sangue total foi colhido em tubos contendo EDTA para análise hematológica. Sangue total foi colhido em tubos com separador de soro para análise de química clínica. Amostras de sangue foram colhidas antes da dose no Dia 4 do Estudo, Dia 3 do Estudo e Dia 5 do Estudo. Sangue total foi também colhido em tubos contendo heparina de sódio na necropsia e o plasma foi congelado a -70 °C para possível análise posterior. Os tecidos a seguir foram colhidos e colocados em formalina tamponada neutra na necropsia: fígado, rins, coração, timo, baço, cérebro, esterno e seções do trato GI, incluindo estômago, intestino grosso e delgado. O esterno, intestino delgado, intestino grosso, fígado, timo, baço e rins foram examinados.
Os níveis de enzima sérico associados com o fígado em cada ponto no tempo foram comparados a um intervalo (de 5 a 95 por cento) de ratos Sprague-Dawley fêmeas normais. Contagens de leucócitos e plaquetas em cada ponto no tempo foram comparadas com um intervalo (5 a 95 por cento) de ratos Sprague-Dawley fêmeas normais.
Estudo de alta dose em ratos Sprague-Dawley fêmeas normais:
Grupo 1 : Veículo Grupo 2 : trastuzumab-MC-MMAF, 52,24 mg/kg, 4210 pg/m2 Grupo 3 : trastuzumab-MC-MMAF, 68,25 mg/kg, 5500 pg/m2 Grupo 4 : trastuzumab-MC-MMAF, 86,00 mg/kg, 6930 pg/m2
Tecidos de 11 animais foram submetidos a histologia de rotina. Estes animais haviam participado de um estudo de toxicidade aguda de intervalo de dosagem usando um imuno- 351 ΕΡ1725249Β1 conjugado trastuzumab-MC-MMAF. Os animais foram acompanhados durante 12 dias após a dosagem.
Exemplo 32 - Toxicidade/Segurança em Macaco Cynomolgus
Três grupos de quatro (2 machos, 2 fêmeas) Macaca fascicularis naive (macaco cynomolgus) foram estudados em relação a tratamento com trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE e trastuzumab-MC- vc-PAB-MMAF. A administração intravenosa foi conduzida nos dias 1 e 22 dos estudos.
Amostra Grupo Dose Veículo 1 Dia 1 1M/1F Dia 22 H-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de 2 180 pg/m2 (0,5 mg/kg/) no dia 1 referência 2M/2F 1100 pg/m2 (3,0 mg/kg) no dia 22 H-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de 3 550 pg/m2 (1,5 mg/kg/) no dia 8 referência 2M/2F 550 pg/m2 (1,5 mg/kg) no dia 29 H-MC-vc-PAB-MMAE Exemplo de 4 880 pg/m2 (2,5 mg/kg/) no dia 15 referência 2M/2F 880 pg/m2 (2,5 mg/kg) no dia 36
Amostra Grupo Dose Veículo 1 Dia 1 1M/1F Dia 22 H-MC-vc-PAB-MMAF 2 180 pg/m2 (0,5 mg/kg/) no dia 1 2M/2F 1100 pg/m2 (3,0 mg/kg) no dia 22 H-MC-vc-PAB-MMAF 3 550 pg/m2 (1,5 mg/kg/) no dia 1 2M/2F 550 pg/m2 (1,5 mg/kg) no dia 22 H-MC-vc-PAB-MMAF 4 880 pg/m2 (2,5 mg/kg/) no dia 1 2M/2F 880 pg/m2 (2,5 mg/kg) no dia 22 H = trastuzumab 352 ΕΡ1725249Β1 A dosagem é expressa na área superficial de um animal de modo a ser relevante a outras espécies, isto é, dosagem em pg/m2 é dependente da espécie e, dessa maneira, comparável entre espécies. As formulações de ADC continham PBS, fosfato de sódio a 5,4 mM, fosfato de potássio a 4,2 mM, cloreto de sódio a 140 mM, pH 6,5. O sangue foi colhido para análise hematológica antes da dose, e 5 minutos, 6 horas, 10 horas, e 1, 3, 5, 7, 14, 21 dias após cada dose. Contagens de eritrócito (RBC) e plaqueta (PLT) foram efetuadas pelo método de difusão de luz. A contagem de leucócitos (WBC) foi efetuada pelo método de peroxidase / basófilo. A contagem de reticulócito foi efetuada pelo método de difusão de luz com corante catiónico. Contagens de célula foram efetuadas num aparelho Advia 120. ALT (aminotransferase alanina) e AST (aminotransferase aspartato) foram medidos em U/L por UV/NADH; metodologia IFCC num equipamento Olympus AU400, e usando os testes Ab ELISA Total - ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA - MMAE/MMAF//ECD- Bio/SA-HRP.
Exemplo 33 - Produção, Caracterização e Humanização de Anticorpo Monoclonal Anti-Erbb2 4D5 0 anticorpo monoclonal de murino 4D5 que se liga especificamente ao domínio extracelular de ErbB2 foi produzido conforme descrito em Fendly et al. (1990) Câncer Research 50:1550-1558. Em resumo, células NIH 3T3/HER2-340o (que expressam cerca de 1 x 105 moléculas ErbB2/célula) produzidas conforme descrito em Hudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84:7158-7163 (1987) foram colhidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo EDTA a 25 mM e usadas para imunizar ratinhos BALB/c. Os ratinhos receberam injeções i.p. de 107 células em 0,5 ml de PBS nas semanas 0, 2, 5 e 7. Os ratinhos com antissoro que 353 ΕΡ1725249Β1 precipitou imunologicamente 32P-ErbB2 marcado receberam injeções i.p. de um extrato de membrana de ErbB2 purificado de aglutinina/Sepharose de germe de trigo (WGA) nas semanas 9 e 13. Isto foi seguido por uma injeção i.v. de 0,1 ml da preparação de ErbB2 e os esplenócitos foram fundidos com a linha de mieloma de ratinho X63-Ag8.653. Flutuantes de hibridoma foram explorados quanto à ligação a ErbB2 por ELISA e radioimunoprecipitação.
Mapeamento e Caracterização de Epítopo O epitopo de ErbB2 ligado por anticorpo monoclonal 4D5 foi determinado por análise de ligação competitiva (Fendly et al. Câncer Research 50:1550-1558 (1990). Estudos de bloqueio cruzado foram efetuados por fluorescência direta em células intactas usando a "PANDEX™ Screen Machine" para quantificar a fluorescência. O anticorpo monoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceina (FITC), usando procedimentos estabelecidos (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel e Schiigi (eds.) São
Francisco: W.J. Freeman Co • (1980)). Monocamadas confluentes de células de NIH 3T3/HER2- “3400 foram tripsinizadas , lavadas uma vez, e suspensas novamente a 1,75 x 106 células/ml em PBS frio contendo 0,5 % de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 % de NaN3 Uma concentração final de 1 % de partículas de látex (IDC,
Portland, OR) foi adicionado para reduzir a coagulação das membranas da lâmina PANDEX™. Células em suspensão, 20 e 20 μΐ de anticorpos monoclonais purificados (100 pg/ml a 0,1 pg/ml) foram adicionadas aos poços da lâmina PANDEX™ e incubados em gelo durante 30 minutos. Uma diluição predeterminada para o anticorpo monoclonal marcado com FITC em 20 μΐ foi adicionada em cada poço, incubada durante 30 minutos, lavada, e a fluorescência foi quantificada pelo PANDEX™. Anticorpos monoclonais partilham um epitopo se 354 ΕΡ1725249Β1 cada ligação bloqueada do outro em 50 % ou mais, em comparação com um controlo de anticorpo monoclonal irrelevante. Neste experiência, o anticorpo monoclonal 4D5 foi designado epítopo I (resíduos de aminoácido de cerca de 529 a cerca de 625, inclusive dentro do domínio extracelular de ErbB2) .
As características inibidoras de crescimento de anticorpo monoclonal 4D5 foram avaliadas usando a linha de célula de tumor, SK-BR-3 (veja-se Hudziak et al. (1989) Molec. Cell. Biol. 9(3):1165-1172). Em resumo, células SK-BR-3 foram separadas usando 0,25 % (vol/vol) de tripsina e suspensas em meio completo a uma densidade de 4 x 105 células por ml. Alíquotas de 100 μΐ (4 x 104 células) foram colocadas na lâmina em lâminas de microdiluição de 96 poços, as células foram deixadas aderir, e 100 μΐ de meio sozinho ou meio contendo anticorpo monoclonal (concentração final 5 pg/ml) foram adicionados. Após 72 horas, as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS (pH 7,5), coradas com violeta cristal (0,5 % em metanol), e analisadas quando a proliferação relativa de célula conforme descrito por Sugarman et al. (1985) Science 230:943-945. Anticorpo monoclonal 4D5 inibiu a proliferação relativa de célula SK-BR-3 em cerca de 56 %. O anticorpo monoclonal 4D5 foi também avaliado quanto à sua capacidade para inibir fosforilação de tirosina estimulada por HRG das proteínas nos intervalos de Mr 180.000 de lisados de célula total de células MCF7 (Lewis et al. (1996) Câncer Research 56:1457-1465) . É relatado que células MCF7 expressam todos os recetores ErbB conhecidos, mas em níveis relativamente baixos. Visto que ErbB2, ErbB3, 3 ErbB4 têm tamanhos moleculares quase idênticos, não é possível discernir qual proteína está se tornando fosforilada por tirosina quando lisados de célula total são 355 ΕΡ1725249Β1 avaliados por análise de Western blot. Entretanto, estas células são ideias para análises de fosforilação de tirosina HRG porque, sob as condições de análise usadas, na ausência de HRG adicionado de forma exógena, elas exibem níveis de baixos a indetetáveis de proteínas de fosforilação de tirosina no intervalo de Mr 180.000.
As células MCF7 foram cultivadas em placas de 24 poços e anticorpos monoclonais para ErbB2 foram adicionados a cada poço e incubados durante 30 minutos na temperatura ambiente, então, rHRGpli77_244 foi adicionado a cada poço a uma concentração final de 0,2 nM, e a incubação foi continuada durante 8 minutos. O meio foi cuidadosamente aspirado de cada poço, e as reações foram cessadas pela adição de 100 μΐ de tampão de amostra SDS (5 % de SDS, 25 nM de DTT, e 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8) . Cada amostra (25 μΐ) passou por eletroforese num gel de gradiente de 4-12 % (Novex) e então foi transferida eletroforeticamente para membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunoblots de antifosfotirosina (4G10, da UBI, usada a 1 pg/ml) foram desenvolvidas, e a intensidade do intervalo reativa predominante a Mr 180.000 foi quantificada por densitometria de refletância, conforme descrito previamente (Holmes et al. (1992) Science 256:1205-1210; Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)).
Anticorpo monoclonal 4D5 inibiu significativamente a geração de sinal de fosforilação de tirosina induzida por HRG a Mr 180.000 . Na ausência de HRG, mas foi incapaz de estimular fosforilação de tirosina de proteínas no intervalo de Mr 180.000 (SIC) . Também, este anticorpo não tem reação cruzada;om EGFR (Fendly et al. Câncer Research 50:1550- 1558 (1990)), ErbB3, ou ErbB4. O anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de bloquear a estimulação de HRG de fosforilação de tirosina em 50 %. 356 ΕΡ1725249Β1 0 efeito inibidor de crescimento de anticorpo monoclonal 4D5 em células MDA-MB-175 e SK-BR-3 na presença ou ausência de rHFU^l exógeno foi avaliado (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Os níveis de ErbB2 em células MDA-MB-175 são 4-6 vezes mais elevados do que o nível encontrado em células epiteliais de mama normais e o recetor ErbB2-ErbB4 é constitutivamente fosforilado por tirosina em células MDA-MB-175. 0 anticorpo monoclonal 4D5 foi capaz de inibir a proliferação de célula de células MDA-MB-175 tanto na presença quanto na ausência de HRG exógeno. A inibição de proliferação de célula pelo 4D5 é dependente do nível de expressão de ErbB2 (Lewis et al. Câncer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)). Uma inibição máxima de 66 % nas células SK-BR3 poderia ser detetada. Entretanto, este efeito seria suplantado por HRG exógeno. 0 anticorpo monoclonal de murino 4D5 foi humanizado, usando uma estratégia de "mutagénese de conversão de gene", conforme descrito na Patente US N° 5821337, a descrição total da qual é expressamente incorporada no presente documento por referência. 0 anticorpo monoclonal humanizado 4D5 usado nas experiências a seguir é designado huMAb4D5-8. Este anticorpo é do isotipo IgGl.
Lista De Sequências <110> Doronina, Svetlana 0.
Toki, Brian E.
Senter, Peter D.
Ebens, Allen J.
Polakis, Paul Sliwkowski, Mark X.
Spencer, Susan D Kline, Toni Beth
<120> COMPOSTOS DE MONOMETILVALINA CAPAZES DE CONJUGAÇÃO A LIGANDOS 357 ΕΡ1725249Β1 < 13 0 > 018891-001020PC <141> 05-11-2004 <150> <151> US 60/598.899 04-08-2004 <150> <151> US 60/557.116 26-03-2004 <150> <151> US 60/518.534 06-11-2003 <160> 35 <210> <211> <212> <213> 1 502 PRT Homo sapien <400> 1
Met Leu Leu Arg Ser Ala Gly Lys Leu Asn Val Gly Thr Lys Lys 1 5 10 15 Glu Asp Gly Glu Ser Thr Ala Pro Thr Pro Arg Pro Lys Val Leu 20 25 30 Arg Cys Lys Cys His His His Cys Pro Glu Asp Ser Val Asn Asn 35 40 45 Ile Cys Ser Thr Asp Gly TV* Cys Phe Thr Met Ue Glu Glu Asp 50 55 60 Asp Ser Gly Leu Pro Vai Val Thr Ser Gly Cys Leu Gly Leu Glu .65 70 75 Gly Ser Asp Phe Gin Cys Arg Asp Thr Pro Ile Pro His Gin Arg 80 85 90 Arg Ser lie Glu Cys Cys Thr Glu Arg Asn Glu Cys Asn Lys Asp 95 100 105 Leu His Pro Thr Leu Pro Pro Leu Lys Asn Arg Asp Phe Val Asp 110 115 120 Gly Pro Ile His His Arg Ala Leu Leu Ile Ser Val Thr Val Cys 125 130 135 358 ΕΡ1725249Β1
Ser Leu Leu Leu Val Leu Ile Ile Leu Phe Cys Tyr Phe Arg Tyr 140 145 150 Lys Arg Gin Glu Thr Arg Pro Arg Tyr Ser Ile Gly Leu Glu Gin 155 160 165 Asp Glu Thr Tyr Ile Pro Pro Gly Glu Ser Leu Arg Asp Leu lie no 175 180 Glu Gin Ser Gin Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Leu Leu 185 190 195 val Gin Arg Thr Ile Ala Lys Gin Ile Gin Met Val Lys Gin Ile 200 205 210 Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg Gly 215 220 225 Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser 230 235 240 Trp Phe Arg Glu Thr Glu ile Tyr Gin Thr Val Leu Met Arg His 245 250 255 Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly 260 265 270 Ser Trp Thr Gin Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly 275 280 285 Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Lys Ser Thr Thr Leu Asp Ala Lys Ser 290 295 300 Met Leu Lys Leu Ala Tyr Ser Ser Val Ser Gly Leu Cys His Leu 305 310 315 His Thr Glu Ile Phe Ser Thr Gin Gly Lys Pro Ala Ile Ala His 320 325 330 Arg Asp Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr 335 340 345 Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Lys Phe Ile Ser Asp 350 355 360 Thr Asn Glu Val Asp Ile Pro Pro Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys 365 370 375 Arg Tyr Met Pro Pro Glu Val Leu Asp Glu Ser Leu Asn Arg Asn 380 385 390 His Phe Gin Ser Tyr Ile Met Ala Asp Met Tyr Ser Phe Gly Leu 395 400 405 lie Leu Trp Glu Val Ala Arg Arg Cys Val Ser Gly Gly Ile Val 410 415 420 Glu Glu Tyr Gin Leu Pro Tyr His Asp Leu Val Pro Ser Asp Pro 425 430 435 Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Ile Val Cys Ile Lys Lys Leu Arg 359 ΕΡ1725249Β1 440 445 450
Pro Ser Phe Pro Asn Arg Trp Ser Ser Asp Glu Cys Leu Arg Gin 455 460 465 Met Gly Lys Leu Met Thr Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser 470 475 480 Arg Leu Thr Ala Leu Arg Vai Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Ser 485 490 495 Glu Ser Gin Asp Ile Lys Leu 500 <210> 2 <211> 507 <212> PRT <213> Homo <4 0 0> 2 sapien 360 ΕΡ1725249Β1
Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala 1 5 10 15 Ala Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys 20 25 30 Ser Ala Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Vai Thr 35 40 45 Leu Gin Arg Asn Ile Thr Leu Leu Asn Gly Vai Ala Ile Ile Vai 50 55 60 Gly Thr Ile Ile Gly Ser Gly Ile Phe Vai Thr Pro Thr Gly Vai 65 70 75 Leu Lys Glu Ala Gly Ser Pro Gly Leu Ala Leu Vai Vai Trp Ala 30 85 90 Ala Cys Gly Vai Phe Ser Ile Vai Gly Ala Leu Cys Tyr Ala Glu 95 100 105 Leu Gly Thr Thr Ile Ser Lys Ser Gly Gly Asp Tyr Ala Tyr Met 110 115 120 Leu Glu Vai Tyr Gly Ser Leu Pro Ala Phe Leu Lys Leu Trp Ile 125 130 135 Glu Leu Leu Ile Ile Arg Pro Ser Ser Gin Tyr Ile Vai Ala Leu 140 145 150 Vai Phe Ala Thr Tyr Leu Leu Lys Pro Leu Phe Pro Thr Cys Pro 155 160 165 Vai Pro Glu Glu Ala Ala Lys Leu Vai Ala Cys Leu Cys Vai Leu 170 175 180 Leu Leu Thr Ala Vai Asn Cys Tyr Ser Vai Lys Ala Ala Thr Arg 185 190 195 Vai Gin Asp Ala Phe Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu 200 205 210 361 ΕΡ1725249Β1
Ile Ile Leu Leu Gly Phe Vai Gin Ile Gly Lys Gly Val Val Ser 21S 220 225 Asn Leu Asp Pro Asn Phe Ser Phe Glu Gly Thr Lys Leu Asp Val 230 235 240 Gly Asn lie Vai Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Phe Ala Tyr Gly 245 250 255 Gly Trp Asn Tyr Leu Asn Phe Val Thr Glu Glu Met Ile Asn Pro 260 265 270 Tyr Arg Asn Leu Pro Leu Ala Ile Ile Ile Ser Leu Pro Ile Val 275 280 285 Thr Leu vai Tyr Vai Leu Thr Asn Leu Ala Tyr Phe Thr Thr Leu 290 295 300 Sei Thr Glu Gin Met Leu Ser Ser GlU Ala Val Ala Val Asp Phe 305 310 315 Gly Asn Tyr His Leu Gly Vai Met Ser Trp Ile Ile Pro Val Phe 320 325 330 Vai Gly Leu Ser Cys Phe Gly Ser Val Asn Gly Ser Leu Phe Thr 335 340 345 Ser Ser Arg Leu Phe Phe Val Gly Ser Arg Glu Gly His Leu Pro 350 355 360 Ser Ile Leu Ser Met Ile His Pro Gin Leu Leu Thr Pro Val Pro 365 370 375 Ser Leu Vai Phe Thr Cys Val Met Thr Leu Leu Tyr Ala Phe Ser 380 385 390 Lys Asp Ile Phe Ser Val Ile Asn Phe Phe Ser Phe Phe Asn Trp 395 400 405 Leu Cys Vai Ala Leu Ala Ile Ile Gly Met Ile Trp Leu Arg His 410 415 420 Arg Lys Pro Glu Leu Glu Arg Pro Ile Lys Val Asn Leu Ala Leu 425 430 435 Pro Vai Phe Phe Ile Leu Ala Cys Leu Phe Leu Ile Ala Val Ser 440 445 450 Phe Trp Lys Thr Pro Val Glu Cys Gly Ile Gly Phe Thr Ile Ile 455 460 465 Leu Ser Gly Leu Pro Val Tyr Phe Phe Gly Val Trp Trp Lys Asn 470 475 480 Lys Pro Lys Trp Leu Leu Gin Gly Ile Phe Ser Thr Thr Val Leu 485 490 4 95 Cys Gin Lys Leu Met Gin Val Val Pro Gin Glu Thr 500 505 362 ΕΡ1725249Β1 <2 10 > 3 <2 11 > 339 <2 12 > PRT <2 13 > Homo <4 00 > 3 sapien 363 ΕΡ1725249Β1
Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gin Glu Glu Leu Trp Lys 1 5 10 15 Met Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys 20 25 30 Asp Thr Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Vai Leu Leu His 35 40 45 Leu His Gin Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu 50 55 60 Leu Gin His Thr Gin Glu Leu Phe Pro Gin Trp His Leu Pro Ile 65 70 75 Lys Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu 90 85 90 Leu Arg Glu Vai Ile His Pro Leu Ala Thr ser His Gin Gin Tyr 95 100 105 Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu Vai Ile Asn Lys Vai Leu Pro Met 110 115 120 Vai Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu Vai Tyr Leu Pro Gly Val Ile 125 130 135 Ala Ala Ile Vai Gin Leu His Asn Gly Thr Lys Tyr Lys Lys Phe 140 145 150 Pxo His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr Arg Lys Gin Phe Gly 155 160 165 Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Vai Leu His Ala Ile Tyr Ser Leu - 170 175 180 Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu Leu Asn Trp 185 190 195 Ala Tyr Gin Gin Vai Gin Gin Asn Lys Glu Asp Ala Trp Ile Glu 200 205 210 His Asp Vai Trp Arg Met Glu Ile Tyr Vai Ser Leu Gly Ile Val 215 220 225 Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Vai Thr Ser Ile Pro Ser 230 235 240 Vai Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gin Ser 245 250 255 Lys Leu Gly Ile Vai Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu 260 265 270 Ile Phe Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gin Phe Val Trp 364 ΕΡ1725249Β1 275 280 285
Tyr Thr Pro Pro Thr Phe Met Ile Ala Vai Phe Leu Pro Ile Vai 290 29S 300
Vai Leu Ile Phe Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys 305 310 315
Lys Ile Leu Lys Ile Arg His Gly Trp Giu Asp Vai Thr Lys Ile 320 325 330
Asn Lys Thr Glu Ile Cys Ser Gin Leu 335 <210> <211> <212> <213> <4 Ο 0> 4 6995
PRT
Homo sapien 4 365 ΕΡ1725249Β1
Pro Vai Thr Ser Leu Leu Thr Pro Gly Leu Vai Ile Thr Thr Asp 1 5 10 15 Arg Met Gly lie Ser Arg Glu Pro Gly Thr Ser Ser Thr Ser Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Thr Ser His Glu Arg Leu Thr Thr Leu Glu Asp Thr 35 40 45 Vai Asp Thr Glu Ala Met Gin Pro Ser Thr His Thr Ala Vai Thr 50 55 60 Asn Vai Arg Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gin Ser Ser Vai 65 70 75 Leu Ser Asp Ser Glu Thr Pro Lys Ala Thr Ser Pro Met Gly Thr 80 85 90 Thr Tyr Thr Met Gly Glu Thr Ser Vai Ser Ile Ser Thr Ser Asp 95 100 105 Phe Phe Glu Thr Ser Arg Ile Gin Ile Glu Pro Thr Ser Ser Leu 110 115 120 Thr Ser Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ser Ser Glu Arg Ile Ser Ser 125 130 135 Ala Thr Glu Gly Ser Thr Vai Leu Ser Glu Vai Pro Ser Gly Ala 140 145 150 Thr Thr Glu Vai Ser Arg Thr Glu Vai Ile Ser Ser Arg Gly Thr 155 160 165 Ser Met Ser Gly Pro Asp Gin Phe Thr Ile Ser Pro Asp Ile Ser 170 175 180 Thr Glu Ala Ile Thr Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Met Thr Glu 135 190 195 Ser Ala Glu Ser Ala Ile Thr Ile Glu Thr Gly Ser Pro Gly Ala 200 205 210 366 ΕΡ1725249Β1
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Gly Thr Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala 4235 4240
Gly Pro Leu Leu Vai Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile 4250 4255
Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg 4265 4270
Asn Thr Thr Glu Arg Vai Leu Gin Thr Leu Vai Gly Pro 4280 4285
Lys Asn Thr Ser Vai Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg 4295 4300
Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Vai 4310 4315 lie Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Vai 4325 4330
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Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr 4355 4360
Gly Phe Thr His Trp Ile Pro Vai Pro Thr ser Ser Thr 4370 4375
Thr Ser Thr Vai Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser 4385 4390
Ser Pro Thr Ser Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu Vai Pro 4400 4405
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp 4415 4420
Cys Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Vai 4430 4435
Ser Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Vai Gly 4445 4450
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Ala Ala Thr Gly Vai Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu
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<212> PRT <213> Homo sapien <400> 6 392 ΕΡ1725249Β1
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Asn Ser Ser Ile Met Ser Asn Pro Leu Leu Gly Leu Val Ile Gly 140 145 150 Vai Leu Val Thr Val Leu Val Gin Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser 155 160 165 Ile Val Val Ser Met Val Ser Ser Ser Leu Leu Thr Val Arg Ala 170 175 180 Ala Ile Pro Ile Ile Met Gly Ala Asn Ile Gly Thr Ser Ile Thr 185 190 195 Asn Thr Ile Val Ala Leu Met Gin Val Gly Asp Arg Ser Glu Phe 200 205 210 Arg Arg Ala Phe Ala Gly Ala Thr Val His Asp Phe Phe Asn Trp 215 220 225 Leu Ser Val Leu Val Leu Leu Pro Val -Glu Val Ala Thr His Tyr 230 235 240 Leu Glu Ile ile Thr Gin Leu ile val Glu Ser Phe His Phe Lys 245 250 255 Asn Gly Glu Asp Ala Pro Asp Leu Leu Lys Val Ile Thr Lys Pro 260 265 270 Phe Thr Lys Leu Ile Val Gin Leu Asp Lys Lys Val Ile Ser Gin 275 280 285 Ile Ala Met Asn Asp Glu Lys Ala Lys Asn Lys Ser Leu Val Lys 290 295 300 Ile Trp Cys Lys Thr Phe Thr Asn Lys Thr Gin Ile Asn Val Thr 305 310 315 Vai Pro Ser Thr Ala Asn Cys Thr Ser Pro Ser Leu Cys Trp Thr 320 325 330 Asp Gly Ile Gin Asn Trp Thr Met Lys Asn Val Thr Tyr Lys Glu 335 340 345 Asn Ile Ala Lys Cys Gin His Ile Phe Val Asn Phe His Leu Pro 350 355 360 Asp Leu Ala Val Gly Thr Ile Leu Leu Ile Leu Ser Leu Leu Val 365 370 375 Leu Cys Gly Cys Leu Ile Met Ile Val Lys Ile Leu Gly Ser Val 380 385 390 Leu Lys Gly Gin Val Ala Thr Val Ile Lys Lys Thr Ile Asn Thr 395 400 405 Asp Phe Pro Phe Pro Phe Ala Trp Leu Thr Gly Tyr Leu Ala Ile 410 415 420 Leu Val Gly Ala Gly Met Thr Phe Ile Val Gin Ser Ser Ser Val 425 430 435 Phe Thr Ser Ala Leu Thr Pro Leu Ile Gly Ile Gly Val Ile Thr 394 ΕΡ1725249Β1 440 445 450 lie Glu Arg Ala Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Ser Asn Ile Gly Thr 455 460 4 65 Thr Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Ser Pro Gly Asn Ala 470 475 480 Leu Arg Ser Ser Leu Gin Ile Ala Leu Cys His Phe Phe Phe Asn 485 490 495 Ile Ser Gly Ile Leu Leu Trp Tyr Pro Ile Pro Phe Thr Arg Leu 500 505 510 Pro Ile Arg Met Ala Lys Gly Leu Gly Asn Ile Ser Ala Lys Tyr 515 520 525 Arg Trp Phe Ala Vai Phe Tyr Leu Ile lie Phe Phe Phe Leu Ile 530 535 540 Pro Leu Thr Vai Phe Gly Leu Ser Leu Ala Gly Trp Arg Vai Leu 545 550 555 Vai Gly Vai Gly Vai Pro Vai Vai Phe lie Ile lie Leu Vai Leu 560 565 570 Cys Leu Arg Leu Leu Gin Ser Arg Cys Pro Arg Vai Leu Pro Lys 575 580 585 Lys Leu Gin Asn Trp Asn Phe Leu Pro Leu Trp Met Arg Ser Leu 590 595 600 Lys Pro Trp Asp Ala Vai Vai Ser Lys Phe Thr Gly Cys Phe Gin 605 610 615 Met Arg Cys Cys Tyr Cys Cys Arg Vai Cys Cys Arg Ala Cys Cys 620 625 630 Leu Leu Cys Gly Cys Pro Lys Cys Cys Arg Cys Ser Lys Cys Cys 635 640 645 Glu Asp Leu Glu Glu Ala Gin Glu Gly Gin Asp Vai Pro Vai Lys 650 655 660 Ala Pro Glu Thr Phe Asp Asn Ile Thr Ile Ser Arg Glu Ala Gin 665 670 675 Gly Glu Vai Pro Ala Ser Asp Ser Lys Thr Glu Cys Thr Ala Leu 680 685 690 <210> 7 <211> 1093 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 7 395 ΕΡ1725249Β1
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Ser Glu Pro Ser Ser Glu Gin Gin Leu Cys Ala Leu Ser Lys His 35 40 45 Pro Thr Vai Ala Phe Glu Asp Leu Gin Pro Trp Vai Ser Asn Phe 50 55 60 Thr Tyr Pro Gly Ala Arg Asp Phe Ser Gin Leu Ala Leu Asp Pro 65 70 75 Ser Gly Asn Gin Leu Ile Vai Gly Ala Arg Asn Tyr Leu Phe Arg 80 85 90 Leu Ser Leu Ala Asn Vai Ser Leu Leu Gin Ala Thr Glu Trp Ala 95 100 105 Ser Ser Glu Asp Thr Arg Arg Ser Cys Gin Ser Lys Gly Lys Thr 110 115 120 Glu Glu Glu Cys Gin Asn Tyr Vai Arg Vai Leu Ile Vai Ala Gly 125 130 135 Arg Lys Vai Phe Met Cys Gly Thr Asn Ala Phe Ser Pro Met Cys 140 145 150 Thr Ser Arg Gin Vai Gly Asn Leu Ser Arg Thr Thr Glu Lys Ile 155 160 165 Asn Glv Vai Ala Arg Cys Pro Tyr Asp Pro Arg His Asn Ser Thr 170 175 180 Ala Vai lie Ser Ser Gin Gly Glu Leu Tyr Ala Ala Thr Vai Ile 185 190 195 Asp Phe Ser Gly Arg Asp Pro Ala Ile Tyr Arg Ser Leu Gly Ser 200 205 210 Gly Pro Pro Leu Arg Thr Ala Gin Tyr Asn Ser Lys Trp Leu Asn 215 220 225 Glu Pro Asn Phe Vai Ala Ala Tyr Asp Ile Gly Leu Phe Ala Tyr 230 235 240 Phe Phe Leu Arg Glu Asn Ala Vai Glu His Asp Cys Gly Arg Thr 245 250 255 Vai Tyr Ser Arg Vai Ala Arg Vai Cys Lys Asn Asp Vai Gly Gly 260 265 270 Arg Phe Leu Leu Glu Asp Thr Trp Thr Thr Phe Met Lys Ala Arg 275 280 285 Leu Asn Cys Ser Arg Pro Gly Glu Vai Pro Phe Tyr Tyr Asn Glu 290 295 300 Leu Gin Ser Ala Phe Uls Leu Pro Glu Gin Asp Leu Ile Tyr Gly 305 310 315 Vai Phe Thr Thr Asn Vai Asn Ser Ile Ala Ala Ser Ala Vai Cys 320 325 330 397 ΕΡ1725249Β1
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Ala Cys Leu Ile Ala Ser Ala Gly'Tyr Gin Ser Phe Cys Ser Pro 80 85 90
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Cys Asn Gly Pro Arg Pro Lys Lys Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala 110 115 120
Leu Arg Pro Gly Leu Arg Thr Thr Ile Leu Phe Leu Lys Leu Ala 125 130 135
Leu Phe Ser Ala His Cys 140 <210> 9 <211> 442
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 9 401 ΕΡ1725249Β1
Met Gin Pro Pro Pro Ser Leu Cys Gly Arg Ala Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Vai Leu Ala Cys Gly Leu Ser Arg Ile Trp Gly Glu Glu Arg Gly 20 25 30 Phe Pro Pro Asp Arg Ala Thr Pro Leu Leu Gin Thr Ala Glu Ue 35 40 45 Met Thr Pro Pro Thr Lys Thr Leu Trp Pro Lys Gly Ser Asn Ala 50 55 60 Ser Leu Ala Arg Ser Leu Ala Pro Ala Glu Val Pro Lys Gly Asp 65 70 75 Arg Thr Ala Gly Ser Pro Pro Arg Thr Ile Ser Pro Pro Pro Cys 80 85 90 Gin Gly Pro Ile Glu Ile Lys Glu Thr Phe Lys Tyr Ile Asn Thr 95 100 105 Val Val Ser Cys Leu Val Phe Val Leu Gly Ile Ile Gly Asn Ser 110 115 120 Thr Leu Leu Arg Ile Ile Tyr Lys Asn Lys Cys Met Arg Asn Gly 125 130 135 Pro Asn Ue Leu Ile Ala Ser Leu Ala Leu Gly Asp Leu Leu His 140 145 150 Ile Val Ile Asp Ile Pro Ile Asn Val Tyr Lys Leu Leu Ala Glu 155 160 165 Asp Trp Pro Phe Gly Ala Glu Met Cys Lys Leu Val Pro Phe Ue 170 175 180 Gin Lys Ala Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Ser Leu Cys Ala Leu 185 190 195 Ser Ile Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg Ile Lys 200 205 ·' 210 Gly Ile Gly Val Pro Lys Trp Thr Ala Val Glu Ile Val Leu Ile 215 220 225 Trp Val Val Ser Val Val Leu Ala Val Pro Glu Ala Ile Gly Phe 230 235 240 Asp Ile Ile Thr Met Asp Tyr Lys Gly Ser Tyr Leu Arg Ile Cys 402 ΕΡ1725249Β1 245 250 255 Leu Leu His Pro Vai Gin Lys Thr Ala Phe Met Gin Phe Tyr Lys 260 265 270 Thr Ala Lys Asp Trp Trp Leu Phe Ser Phe Tyr Phe Cys Leu Pro 275 280 285 Leu Ala Ile Thr Ala Phe Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met 290 295 300 Leu Arg Lys Lys Ser Gly Met Gin Ile Ala Leu Asn Asp His Leu 305 310 315 Lys Gin Arg Arg Glu Vai Ala Lys Thr Vai Phe Cys Leu Vai Leu 320 325 330 Vai Phe Ala Leu Cys Trp Leu Pro Leu His Leu Ser Arg Ile Leu 335 340 345 Lys Leu Thr Leu Tyr Asn Gin Asn Asp Pro Asn Arg Cys Glu Leu 350 355 360 Leu Ser Phe Leu Leu Vai Leu Asp Tyr Ile Gly Ile Asn Met Ala 365 370 375 Ser Leu Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ala Leu Tyr Leu Vai Ser 380 385 390 Lys Arg Phe Lys Asn Cys Phe Lys Ser Cys Leu Cys Cys Trp Cys 395 400 405 Gin Ser Phe Glu Glu Lys Gin Ser Leu Glu Glu Lys Gin Ser Cys 410 415 420 Leu Lys Phe Lys Ala Asn Asp HiS Gly Tyr Asp Asn Phe Arg Ser 425 4 30 435 Ser Asn Lys Tyr Ser Ser Ser 440 <210> 10 <211> 783
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 10 403 ΕΡ1725249Β1
Met Ser Gly Gly His Gin Leu Gin Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp 1 5 10 15 Leu Leu Met Ala Thr Leu Gin Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu 20 25 30 Vai Leu Ala Ala Ala Vai Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gin Lys 35 40 45 Ala Xle Ile Arg Vai Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys 50 55 60 Leu Asn Leu Thr Leu Glu Gly Vai Phe Ala Gly Vai Ala Glu Ile 65 70 75 404 ΕΡ1725249Β1
Thr Pro Ala Glu Gly Lys Leu Met Gin Ser His Pro Leu Tyr Leu 80 85 90 Cys Asn Ala Ser Asp Asp Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser 95 100 105 Ile val Lys Lôu Glu Ser Pro Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu 110 115 120 Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser 125 130 135 Ale Vai Leu Phe Asp Ile Thr Glu Asp Arg Ala Ala Ala Glu Gin 140 145 150 Leu Gin Gin Pro Leu Gly Leu Thr Trp Pro Val Val Leu Ile Trp 155 160 165 Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu Phe Val Tyr Lys Asn Gin 170 175 180 Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu Pro Pro Ala Trp Pro 185 190 195 Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val Gly Thr Ile Phe 200 205 210 Vai Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys Arg Pro Arg 215 220 225 His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gin Gin Arg Thr Ala Trp Ala Ile 230 235 24 0 Ser Gin Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gin Alá Ser Cys Arg Gin Ala 245 250 255 Arg Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro 260 265 270 Val Cys Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gin Glu Leu 275 280 285 Arg Val Ile Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp 290 295 300 Pro Trp Leu His Gin His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Val Phe Asn 305 310 315 Ile Thr Glu Gly Asp Ser Phe Ser Gin Ser Leu Gly Pro Ser Arg 320 325 330 Ser Tyr Gin Glu Pro Gly Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gin His 335 340 345 Pro Gly His Ala His Tyr His Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly 350 355 360 Pro Ser Arg Ser Ala Val Ala Arg Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe 365 370 375 405 ΕΡ1725249Β1
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Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp 740 745 750
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Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu 770 775 780 <210> 11 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapien <4 0 0> 11 407 ΕΡ1725249Β1
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Thr Leu Glu Arg Pro 1170 428 ΕΡ1725249Β1
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Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arg 1220 1225 1230
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PRT
Homo sapien 18 429 ΕΡ1725249Β1
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<212> PRT <213> Homo sapien <400> 19 431 ΕΡ1725249Β1
Met Trp Ser Gly 1
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Trp Trp Leu Trp Pro Leu Vai Ala Vai Cys Thr 5 10 15 Arg Asp Glu Ala Glu Arg Ile Met Arg Asp Ser 20 25 30 Gly His Asn Asp Leu Pro Trp Gin Leu Leu Asp 35 40 45 Arg Leu Gin Asp Glu Arg Ala Asn Leu Thr Thr 50 55 60 His Thr Asn Ile Pro Lys Leu Arg Ala Gly Phe 65 70 75 Phe Trp Ser Vai Tyr Thr Pro Cys Asp Thr Gin 80 85 90 Vai Arg Arg Thr Leu Glu Gin Met Asp Vai Vai 95 100 105 Arg Met Tyr Pro Glu Thr Phe Leu Tyr Vai Thr 110 115 120 432 ΕΡ1725249Β1
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Met Ala Gin Leu Phe Leu Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Gin Ala Pro Ala Ala Leu Ala Asp Val Leu Glu Gly Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Asp Arg Ala Phe Arg Val Arg Ile Ala Gly Asp Ala Pro Leu 35 40 45 Gin Gly Vai Leu Gly Gly Ala Leu Thr Ile Pro Cys His Val His 50 55 60 Tyr Leu Arg Pro Pro Pro Ser Arg Arg Ala Val Leu Gly Ser Pro 65 70 75 Arg Vai Lys Trp Thr Phe Leu Ser Arg Gly Arg Glu Ala Glu Val 80 85 90 Leu Vai Ala Arg Gly Vai Arg Val Lys Val Asn Glu Ala Tyr Arg 95 100 105 Phe Arg Vai Ala Leu Pro Ala Tyr Pro Ala Ser Leu Thr Asp val 110 115 120 Ser Leu Ala Leu Ser Glu Leu Arg Pro Asn Asp Ser Gly Ile Tyr 125 130 135 Arg Cys Glu Vai Gin His Gly Ile Asp Asp Ser Ser Asp Ala Val 140 145 150 Glu Vai Lys Vai Lys Gly Val Val Phe Leu Tyr Arg Glu Gly Ser 155 160 165 Ala Arg Tyr Ala Phe Ser Phe Ser Gly Ala Gin Glu Ala Cys Ala 170 175 180 Arg Ile Gly Ala His Ile Ala Thr Pro Glu Gin Leu Tyr Ala Ala 195 190 195 Tyr Leu Gly Gly Tyr Glu Gin Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ser Asp 200 205 210 Gin Thr Vai Arg Tyr Pro Ile Gin Thr Pro -Ί Arg Glu Ala Cys Tyr 215 220 225 Gly Asp Met Asp Gly Phe Pro Gly Val Arg Asn Tyr Gly Val Val 230 235 240 Asp Pro Asp Asp Leu Tyr Asp Val Tyr Cys Tyr Ala Glu Asp Leu 245 250 255 Asn Gly Glu Leu Phe Leu Gly Asp Pro Pro Glu Lys Leu Thr Leu 260 265 270 Glu Glu Ala Arg Ala Tyr Cys Gin Glu Arg Gly Ala Glu Ile Ala 275 280 285 Thr Thr Gly Gin Leu Tyr Ala Ala Trp Asp Gly Gly Leu Asp His 290 295 300 438 ΕΡ1725249Β1
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Met 1 Ala Leu Arg Arg 5 Leu Gly Leu Ala Ala Vai Glu ao Glu Thr Ala Glu Leu Gly Trp 3S Met Val Vai Ser Gly Tyr Asp 50 Glu Asn Vai Cys Asn Val Phe 65 Glu Ser Lys Phe Ile Arg Arg 80 Arg Gly Lys Phe Ser Val Arg 95 Asp Cys Sex Cys Lys Glu Thr 110 Phe Asn Asp Ser Ala Thr Lys 125 Thr Phe Vai Lys Vai Asp Thr 140 Ile Ala Asp Leu Gly Gly Arg 155 val Met Phe Gly Pro Val Ser 170 Arg Ser Tyr Gly Gly Cys Mat 185 Ser Leu Lys Cys Pro Arg Ile 200 Ile Gin Leu Ser Gly Ala Glu 215 Ser Thr Cys Ile Ala Asn Ala 230 Glu Glu Cys Asn Gly Asp Gly 245 Glu Trp Cys Lys Ala Gly Phe 260 Glu Ala
Ala Ala Leu Leu Leu Leu Pro Leu 10 15 Leu Met Asp Ser Thr Thr Ala Thr 25 30 His Pro Pro Ser Gly Trp Glu Glu 40 45 Met Asn Thr Ile Arg Thr Tyr Gin 55 60 Ser Gin Asn Asn Trp Leu Arg Thr 70 75 Ala Hás Arg Ile His Val Glu Met 85 90 Ser Ser Ile Pro Ser Val Pro Gly 100 105 Leu Tyr Tyr Tyr Glu Ala Asp Phe 115 120 Pro Asn Trp Met Glu Asn Pro Trp 130 135 Ala Asp Glu Ser Phe Ser Gin Val 145 150 Lys Ile Asn Thr Glu Val Arg Ser 160 165 Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gin Asp 175 180 Ile Ala val Arg val Phe Tyr Arg 190 195 Asn Gly Ala Ile Phe Gin Glu Thr 205 210 Ser Leu Val Ala Ala Arg Gly Ser 220 225 Val Asp Val Pro Ile Lys Leu Tyr 235 240 Leu Val Pro Ile Gly Arg Cys Met 250 255 Val Glu Asn Gly Thr Val Cys Arg 265 270 442 ΕΡ1725249Β1
Gly Cys Pro Ser Gly Thr Phe Lys Ala Asn Gin Gly Asp Glu Ala 275 280 285 Cys Thr His Cys Pro Ile Asn Ser Arg Thr Thr Ser Glu Gly Ala 290 295 300 Thr Asn Cys Vai Cys Arg Asn Gly Tyr Tyr Arg Ala Asp Leu Asp 305 310 315 Pro Leu Asp Hôt Pro Cys Thr Thr lie Pro Ser Ala Pro Gin Ala 320 325 330 Vai Ile Ser Ser Vai Asn Glu Thr Ser Leu Met Leu Glu Trp Thr· 335 340 345 Pro Pro Arg Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Leu Vai Tyr Asn Ile 350 355 360 Ile Cys Lys Ser Cys Gly Ser Gly Arg Gly Ala Cys Thr Arg Cys 365 370 375 Gly Asp Asn Vai Gin Tyr Ala Pro Arg Gin Leu Gly Leu Thr Glu 380 385 390 Pro Arg Ile Tyr Ile Ser Asp Leu Leu Ala Mis Thr Gin Tyr Thr 395 400 405 Phe Glu Ile Gin Ala Vai Asn Gly vai Thr Asp Gin Ser Pro Phe 410 415 420 Ser Pro Gin Phe Ala Ser Vai Asn Ile Thr Thr Asn Gin Ala Ala 425 430 435 Pro Ser Ala Vai Ser Ile Met 81$ Gin Vai Ser Arg Thr Val Asp 440 445 4 50 Ser Ile Thr Leu Ser Trp Ser Gin Pro Asp Gin Pro Asn Gly Val 455 460 4 65 Ile Leu Asp Tyr Glu Leu Gin Tyr Tyr Glu Lys Glu Leu Ser Glu 470 475 480 Tyr Asn Ala Thr Ala Ile Lys ser Pro Thr Asn Thr val Thr Val 485 490 4 95 Gin Gly Leu Lys Ala Gly Ala Ile Tyr Vai Phe Gin Val Arg Ala 500 505 510 Arg Thr Vai Ala Gly Tyr Gly Arg Tyr Ser Gly Lys Met Tyr Phe 515 520 525 Gin Thr Met Thr Glu Ala Glu Tyr Gin Thr Ser Ile Gin Glu Lys 530 535 540 Leu Pro Leu Ile Ile Gly Ser Ser Ala Ala Gly Leu vai Phe Leu 545 550 555 Ile Ala Vai Vai Vai Ile Ala lie Vai Cys Asn Arg Arg Arg Gly 560 565 570 Phe Glu Arg Ala Asp Ser Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Gin His Tyr 443 ΕΡ1725249Β1 575 580 585 Thr Ser Gly His Met Thr Pro Gly Met Lys Ile Tyr Ile Asp Pro 590 595 600 Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Vai Arg Glu Phe Ala Lys 605 610 615 GlU Ile Asp Ile Ser Cys Vai Lys Ile Glu Gin Val Ile Gly Ala 620 625 630 Gly Glu Phe Gly Glu Vai Cys Ser Gly His Leu Lys Leu Pro Gly 635 640 645 Lys Arg Glu ile Phe vai Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ser Gly Tyr 650 655 660 Thr Glu Lys Gin Arg Arg Asp Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met 665 670 675 Gly Gin Phe Asp His Pro Asn vai Ile His Leu Glu Gly Val Val 680 685 690 Thr Lys Ser Thr Pro Vai Met Ile Ile Thr Glu Phe Met Glu Asn 695 700 705 Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Arg Gin Asn Asp Gly Gin Phe Thr 710 715 720 Vai Ile Gin Leu Vai Gly Met Leu Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met 725 730 735 Lys Tyr Leu Ala Asp Met Asn Tyr Vai His Arg Asp Leu Ala Ala 740 745 750 Arg Asn He Leu Vai Asn Ser Asn Leu Vai Cys Lys Val Ser Asp 755 760 765 Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Asp Asp Thr Ser Asp Pro Thr 770 775 780 Tyr Thr Ser Ala Leu Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr Ala 785 790 795 Pro Glu Ala Ile Gin Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val SOO 805 810 Trp Ser Tyr Gly Ile Vai Met Trp Glu Vai Met Ser Tyr Gly Glu 815 820 825 Arg Pro Tyr Trp Asp Met Thr Asn Gin Asp val Ile Asn Ala ile 830 835 840 Glu Gin Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala 845 850 855 Leu His Gin Leu Met Leu Asp Cys Trp Gin Lys Asp Arg Asn His 860 8 65 870 Arg Pro Lys Phe Gly Gin Ile Vai Asn Thr Leu Asp Lys Met Ile Θ75 880 885 444 ΕΡ1725249Β1
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Met Ala Ser Leu Gly Gin Ile Leu Phe Trp Ser Ile lie Ser Ile 1 5 10 15 Ile lie Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly 20 25 30 Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Vai Thr Thr Vai Ala Ser Ala 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro 50 55 60 Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Vai Ile Gin Trp Leu Lys Glu Gly 65 70 75 Vai Leu Gly Leu Vai His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu 80 85 90 Ser Glu Gin Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Vai Phe Ala 95 100 105 Asp Gin Vai Ile Vai Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Vai 110 115 120 Gin Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser 125 130 135 Lys Gly Lys Lys Asn Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe 140 145 150 Ser Met Pró Glu Vêl Asn Vai Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr 155 160 165 Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gin Pro Thr Vai Vai 170 175 180 Trp Ala Ser Gin Vai Asp Gin Gly Ala Asn Phe Ser Glu Vai Ser 185 190 195 Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Vai Thr Met Lys Vai 200 205 210 Vai Ser Vai Leu Tyr Asn Vai Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys 215 220 225 Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp lie Lys Vai 230 235 240 Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gin Leu Leu Asn 245 250 255 Ser Lys Ala Ser Leu Cys Vai Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp 260 265 270 Ala Leu Leu Pro Leu Ser pro Tyr Leu Met Leu Lys 275 280 446 ΕΡ1725249Β1 <210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 24
Met 1 Lys Ale Vai Leu 5 Leu Ala Gin Pro Gly Thr Ala 20 Leu Leu Ser Asn Glu Asp Cys 35 Leu Gin Glu Gin Cys Trp Thr 50 Ala Arg Vai Ile Ser Lys Gly 65 Cys Ser Asp Tyr Tyr Vai Gly 80 Lys Lys Leu Cys Asn Ala Ser 95 Gly Ala Ile Leu Ala Leu Leu 110 Pro Ala Gly Gin Leu
Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu 10 15 Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gin Vai 25 30 Vai Glu Asn Cys Thr Gin Leu Gly 40 45 d> H H Arg Ala Vai Gly Leu Leu Thr 55 60 Leu Asn Cys Vai Asp Asp Ser Gin 70 75 Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp 85 90 His Ala Leu Gin Pro Ala Ala Ala 100 105 Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro 115 120 <2 Λ O \—1 25 <2 11> 236 <2 12> PRT <2 Λ 00 \—1 Homo <4 Λ O O 25 447 ΕΡ1725249Β1
Met Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Gin Glu Ala Ala Lys Leu Tyr Hi$ Thr Asn Tyr Val 20 25 30 Arg Asn Ser Arg Ala Ile Gly Vai Leu Trp Ala Ile Phe Thr Ile 35 40 45 Cys Phe Ala Ile Vai Asn Vai Vai Cys Phe Ile Gin Pro Tyr Trp 50 55 60 Ile Gly Asp Gly Vai Asp Thr Pro Gin Ala Gly Tyr Phe Gly Leu 65 70 75 Phe His Tyr Cys Ile Gly Asn Gly Phe Ser Arg Glu Leu Thr Cys 80 85 90 Arg Gly Ser Phe Thr Asp Phe Ser Thr Leu Pro Ser Gly Ala Phe 95 100 105 Lys Ala Ala Ser Phe Phe ile Gly Leu Ser Met Met Leu ile Ile 110 115 120 Ala Cys Ile Ile Cys Phe Thr Leu Phe Phe Phe Cys Asn Thr Ala 125 130 135 Thr Vai Tyr Lys Ile Cys Ala Trp Met Gin Leu Thr Ser Ala Ala 140 145 • 150 Cys Leu Vai Leu Gly Cys Met Ile Phe Pro Asp Gly Trp Asp Ser 155 160 165 Asp Glu Vai Lys Arg Met Cys Gly Glu Lys Thr Asp Lys Tyr Thr 170 175 180 Leu Gly Ala Cys Ser Vai Arg Trp Ala Tyr Ile Leu Ala Ile Ile 185 190 195 Gly Ile Leu Asp Ala Leu Ile Leu Ser Phe Leu Ala Phe Val Leu 200 205 210 Gly Asn Arg Gin Asp Ser Leu Met Ala Glu Glu Leu Lys Ala Glu 215 220 225 Asn Lys Vai Leu Leu Ser Gin Tyr Ser Leu Glu 230 235 <210> 26 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapien <4 0 0> 26 448 ΕΡ1725249Β1
Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Thr Pro Cys Vai Pro Ala Glu Cys Phe Asp Leu Leu Vai Arg 20 25 30 His Cys Vai Ala Cys Gly Leu Leu Arg Thr Pro Arg Pro Lys Pro 35 40 45 Ala Gly Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Thr Ala Leu Gin Pro Gin 50 55 60 Glu Ser Vai Gly Ala Gly Ala Gly Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro 65 70 75 Gly Leu Leu Phe Gly Ala Pro Ala Leu Leu Gly Leu Ala Leu Vai 80 85 90 Leu Ala Leu Vai Leu Vai Gly Leu Vai Ser Trp Arg Arg Arg Gin 95 100 105 Arg Arg Leu Arg Gly Ala Ser Ser Ala Glu Ala Pro Asp Gly Asp 110 115 120 Lys Asp Ala Pro Glu Pro Leu Asp Lys Vai Ile Ile Leu Ser Pro 125 130 135 Gly Ile Ser Asp Ala Thr Ala Pro Ala Trp Pro Pro Pro Gly Glu 140 145 150 Asp Pro Gly Thr Thr Pro Pro Gly His Ser Vai Pro Vai Pro Ala 155 160 165 Thr Glu Leu Gly Ser Thr Glu Leu Vai Thr Thr Lys Thr Ala Gly 170 175 180
Pro Glu Gin Gin <210> 27 <211> 847
<212> PRT <213> Homo sapien <400> 27 449 ΕΡ1725249Β1
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Vai Leu Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Ala Phe Ser Asp Ser Sêr Lys Trp Vai Phe Glu His Pro Glu 20 25 30 Thr Leu Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Vai Trp Ile Pro Cys Thr 35 40 45 Tyr Arg Ala Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His 50 55 60 Asn Pro Glu Tyr Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg 65 70 75 Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asp Gly Lys Vai Pro Ser Glu Gin Lys 80 85 90 Arg vai Gin Phe Leu Gly Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser 95 100 - 105 450 ΕΡ1725249Β1
Ile His Pro Vai HiS Leu Asn Asp Ser Gly Gin Leu Gly Leu Arg 110 115 120 Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp Met Glu Arg Ile His Leu Asn 125 130 135 Vai Ser Glu Arg Pro Phe Pro ΡΓΟ His Ile Gin Leu Pro Pro Glu 140 145 150 Ile Gin Glu Ser Gin Glu Vai Thr Leu Thr Cys Leu Leu Asn Phe 155 160 165 Ser Cys Tvr Gly Tyr Pro Ile Gin Leu Gin Trp Leu Leu Glu Gly 170 175 180 Vai Pro Met Arg Gin Ala Ala Vai Thr Ser Thr Ser Leu Thr Ile 185 190 195 Lys Ser Vai Phe Thr Arg ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro Gin Trp 200 205 210 Ser His His Gly Lys Ile Vai Thr Cys Gin Leu Gin Asp Ala Asp 215 220 225 Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Vai Gin Leu Asn Vai Lys His 230 235 240 Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Vai Thr Pro Ser Asp Ala Ile Vàl 245 250 255 Arg Glu Gly Asp Ser Vai Thr Met Thr Cys Glu Vai Ser Ser Ser 260 265 270 Asn Pro Glu Tyr Thr Thr Vai Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser 275 280 285 Leu Lys Lys Gin Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Vai Thr 290 295 300 Lys Asp Gin Ser Gly Lys Tyr Cys Cys Gin Vai Ser Asn Asp Vai 305 310 315 Gly Pro Gly Arg Ser GlU Glu Vai Phe Leu Gin Vai Gin Tyr Ala 320 325 330 Pro Glu Pro Ser Thr Vai Gin Ile Leu His Ser Pro Ala Vai Glu 335 340 345 Gly Ser Gin Vai Glu Phe Leu Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu 350 355 360 Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His Asn Gly Lys Glu Met Gin Gly 365 370 375 Arg Thr Glu Glu Lys Vai His Ile Pro Lys Ile Leu Pro Trp HÍS 380 385 390 Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Vai Ala Glu Asn Ile Leu Gly Thr Gly 395 400 405 Gin Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Vai Gin Tyr Pro Pro Lys 451 ΕΡ1725249Β1 410
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Met pro Gly Gly Pro Gly vai Leu Gin Ala Leu Pro Ala Thr Ile 1 5 10 15 Phe Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys 20 25 30 Gin Ala Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met val Ser 35 40 45 Leu Gly Glu Asp Ala HiS Phe Gin Cys Pro HiS Asn Ser Ser Asn 50 55 60 Asn Ala Asn Vai Thr Trp Trp Arg Vai Leu His Gly Asn Tyr Thr 65 70 75 Trp Pro Pro Glu Phe Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr 80 85 90 Leu Ile Ile Gin Asn Vai Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val 95 100 105 Cys Arg Vai Gin Glu Gly Asn Glu Ser Tyr Gin Gin Ser Cys Gly 110 115 120 Thr Tyr Leu Arg Vai Arg Gin Pro Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp 125 130 135 Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly ile 140 145 150 Ile Leu Leu Phe Cys Ala val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe 155 160 165 Arg Lys Arg Trp Gin Asn Glu Lys Leu Gly Leu Asp Ala Gly Asp 170 175 180 Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp 185 190 195 Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gin Gly Thr Tyr 200 205 210 Gin Asp Vai Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gin Leu Glu Lys 215 220 225
Pro <210> 29 <211> 372 <212> PRT <213> Homo sapien <4 0 0> 29 454 ΕΡ1725249Β1
Met Asn Tyr Pro Leu 1 5 Asp Leu Phe Trp Glu 20 Ser Leu Val Glu Asn 35 Met Ala Ser Phe Lys t 50 Ile Phe Leu Leu Gly 65 Leu Glu Arg His Arg 80 Phe His Leu Ala Val 95 Phe Ala Val Ala Glu 110 Leu Cys Lys Thr val 125 Ser Ser Leu Leu Leu 140 Ile Vai His Ala Val 155 Ile His lie Thr Cys
Thr Leu Glu Met Asp 10 Leu Asp Arg Leu Asp 25 His Leu Cys Pro Ala 40 Ala Val Phe Val Pro 55 Val Ile Gly Asn Val 70 Gin Thr Arg Ser Ser 85 Ala Asp Leu Leu Leu 100 Gly Ser Val Gly Trp 115 Ile Ala Leu His Lys 130 Ala Cys Ile Ala Val 145 His Ala Tyr Arg His 160 Gly Thr Ile Trp Leu
Leu Glu Asn Leu Glu 15 Asn Tyr Asn Asp Thr 30 Thr Glu Gly Pro Leu 45 Val Ala Tyr Ser Leu 60 Leu Val Leu Val Ile 75 Thr Glu Thr Phe Leu 90 Val Phe Ile Leu Pro 105 Val Leu Gly Thr Phe 120 Val Asn Phe Tyr Cys 135 Asp Arg Tyr Leu Ala 150 Arg Arg Leu Leu Ser 165 Val Gly Phe Leu Leu 455 ΕΡ1725249Β1 170 175 180 Ala Leu Pro Glu Ile Leu Phe Ala Lys Vai Ser Gin Gly His His 185 190 195 Asn Asn Ser Leu Pro Arg Cys Thr Phe Ser Gin Glu Asn Gin Ala 200 205 210 Glu Thr His Ala Trp Phe Thr Ser Arg Phe Leu Tyr His Vai Ala 215 220 225 Gly Phe Leu Leu Pro Met Leu Vai Met Gly Trp Cys Tyr Vai Gly 230 235 240 Vai Vai His Arg Leu Arg Gin Ala Gin Arg Arg Pro Gin Arg Gin 245 250 255 Lys Ala Vai Arg Vai Ala Ile Leu Vai Thr Ser Ile Phe Phe Leu 260 265 270 Cys Trp Ser Pro Tyr His Ile Vai Ile Phe Leu Asp Thr Leu Ala 275 280 285 Arg Leu Lys Ala Vai Asp Asn Thr Cys Lys Leu Asn Gly Ser Leu 290 295 300 Pro Vai Ala Xle Thr Met Cys Glu Phe Leu Gly Leu Ala His Cys 305 310 315 Cys Leu Asn Pro Met Leu Tyr Thr Phe Ala Gly Vai Lys Phe Arg 320 325 330 Ser Asp Leu Ser Arg Leu Leu Thr Lys Leu Gly Cys Thr Gly Pro 335 340 345 Ala Ser Leu Cys Gin Leu Phe Pro Ser Trp Arg Arg Ser Ser Leu 350 355 360 Ser Glu Ser Glu Asn Ala Thr Ser Leu Thr Thr Phe 365 370 <210> 30 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 30 456 ΕΡ1725249Β1
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Trp Vai Vai Ala Leu Leu Vai Asn 10 15 Met Thr Gin Gly Thr Asp Ser Pro 25 30 Lys Ala Asp Cys Tyr Phe Thr Asn 40 45 Vai Vai Arg Phe Ile Phe Asn Leu 55 60 Ser Asp Vai Gly Met Phe Vai Ala 70 75 Asp Ala Glu Gin Trp Asn Ser Arg 85 90 Arg Gin Ala Vai Asp Gly Vai Cys 100 105 Ala Pro Phe Thr Vai Gly Arg Lys 115 120 Tyr Pro Glu Arg Thr Pro Leu Leu 130 135 Cys Ser Vai Thr Gly Phe Tyr Pro 145 150 Phe Leu Asn Gly Gin Glu Glu Arg 160 165 Pro Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr 175 180 Glu Met Thr Pro Glu Leu Gly His 190 195 His Ser Ser Leu Leu Ser Pro Vai 205 210 Ser Glu Tyr Ser Trp Arg Lys Met 220 22S Leu Leu Gly Leu Ile Phe Leu Leu 235 240 Arg Ala Gin Lys Gly Tyr Vai Arg 250 255 Vai Ser Arg Ala Vai Leu Leu Pro 265 270 457 ΕΡ1725249Β1 <210> 31 <211> 422 <212> PRT <213> Homo sapien <4 0 0> 31
Het i Gly Gin Ala Gly Cys 5 Lys Gly Leu Cys 10 Leu Ser Leu Phe Asp 15 Tyr Lys Thr Glu Lys 20 Tyr Vai Ile Ala Lys 25 Asn Lys Lys Vai Gly 30 Leu Leu Tyr Arg Leu 35 Leu Gin Ala Ser lie 40 Leu Ala Tyr Leu Vai 45 Vai Trp Vai Phe Leu 50 Ile Lys Lys Gly Tyr 55 Gin Asp Vai Asp Thr 60 458 ΕΡ1725249Β1
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Met Ala Glu Ala Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Arg Phe Val Lys Ala 1 5 10 15 Pro Leu Lys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Leu Gly Gin Asp Pro Gly 20 25 30 Ala Asp Asp Asp Gly Glu Ile Thr Tyr Glu Asn Val Gin Val Pro 35 40 45 Ala Vai Leu Gly Val Prò Ser Ser Leu Ala Ser Ser Val Leu Gly 50 55 60 Asp Lys Ala Ala Val Lys Ser Glu Gin Pro Thr Ala Ser Trp Arg 65 70 75 Ala Val Thr Ser Pro Ala Val Gly Arg Ile Leu Pro Cys Arg Thr 80 85 90 Thr Cvs Leu Arg Tyr Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Thr Cys Leu 95 100 105 Leu Leu Gly Val Thr Ala Ile Cys Leu Gly Val Arg Tyr Leu Gin 110 115 120 Vai Ser Gin Gin Leu Gin Gin Thr Asn Arg Val Leu Glu val Thr 125 130 135 Asn Ser Ser Leu Arg Gin Gin Leu Arg Leu Lys Ile Thr Gin Leu 140 145 150 Gly Gin Ser Ala Glu Asp Leu Gin Gly Ser Arg Arg Glu Leu Ala 155 160 165 Gin Ser Gin Glu Ala Leu Gin Val Glu Gin Arg Ala Bis Gin Ala 170 175 180 Ala Glu Gly Gin Leu Gin Ala Cys Gin Ala Asp Arg Gin Lys Thr 185 190 195 Lys Glu Thr Leu Gin Çer Glu Glu Gin Gin Arg Arg Ala Leu Glu 200 205 210 461 ΕΡ1725249Β1
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Leu Asn Gly Pro Lys Ser Leu Lys His Leu Phe Leu Ile Gin Thr 125 130 135 Gly Ile Ser Asn Leu Glu Phe Ile Pro Vai His Asn Leu Glu Asn 140 145 150 Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Gly Ser Asn His Ile Ser Ser Ile Lys 155 160 165 Phe Pro Lys Asp Phe Pro Ala Arg Asn Leu Lys vai Leu Asp Phe 170 17S 180 Gin Asn Asn Ala Ile His Tyr Ile Ser Arg Glu Asp Met Arg Ser 185 190 195 Leu Glu Gin Ala lie Asn Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gly Asn Asn 200 205 210 Vai Lys Gly Ile Glu Leu Gly Ala Phe Asp Ser Thr Vai Phe Gin 215 220 225 Ser Leu Asn Phe Gly Gly Thr Pro Asn Leu Ser Vai Ile Phe Asn 230 235 240 Gly Leu Gin Asn Ser Thr Thr Gin Ser Leu Trp Leu Gly Thr Phe 245 250 255 Glu Asp lie Asp Asp Glu Asp Ile Ser Ser Ala Met Leu Lys Gly 260 265 270 Leu Cys Glu Met Ser Vai Glu Ser Leu Asn Leu Gin Glu His Arg 275 280 285 Phe Ser Asp lie Ser Ser Thr Thr Phe Gin Cys Phe Thr Gin Leu 290 295 300 Gin Glu Leu Asp Leu Thr Ala Thr HiS Leu Lys Gly Leu Pro Ser 305 310 315 Gly Met Lys Gly Leu Asn Leu Leu Lys Lys Leu Vai Leu Ser Vai 320 325 330 Asn His Phe Asp Gin Leu Cys Gin Ile Ser Ala Ala Asn Phe Pro 335 340 345 Ser Leu Thr His Leu Tyr Ile Arg Gly Asn Vai Lys Lys Leu His 350 355 360 Leu Gly Vai Gly Cys Leu Glu Lys Leu Gly Asn Leu Gin Thr Leu 365 370 375 Asp Leu Ser His Asn Asp Ile Glu Ala Ser Asp Cys Cys Ser Leu 380 385 • 390 Gin Leu Lys Asn Leu Ser His Leu Gin Thr Leu Asn Leu Ser His 395 400 405 Asn Glu Pro Leu Gly Leu Gin Ser Gin Ala Phe Lys Glu Cys Pro 410 415 420 Gin Leu Glu Leu Leu Asp Leu Ala Phe Thr Arg Leu His Ile Asn 464 ΕΡ1725249Β1 425 430 435
Ala Pro Gin Ser Pro Phe Gin Asn Leu His Phe Leu Gin Vai Leu 440 445 450 Asn Leu Thr Tyr Cys Phe Leu Asp Thr Ser Asn Gin His Leu Leu 455 460 465 Ala Gly Leu Pro Vai Leu Arg His Leu Asn Leu Lys Gly Asn His 470 475 480 Phe Gin Asp Gly Thr Ile Thr Lys Thr Asn Leu Leu Gin Thr Vai 485 490 495 Gly Ser Leu Glu Vai Leu Ile Leu Ser Ser Cys Gly Leu Leu Ser 500 505 510 Ile Asp Gin Gin Ala Phe His Ser Leu Gly Lys Met Ser His Vai 515 520 525 Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Thr Cys Asp Ser Ile Asp Ser . Leu 530 535 540 Ser His Leu Lys Gly Ile Tyr Leu Asn Leu Ala Ala Asn Ser Ile 545 550 555 Asn Ile Ile Ser Pro Arg Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gin Gin Ser 560 565 570 Thr Ile Asn Leu Ser His Asn Pro Leu Asp Cys Thr Cys Ser Asn 575 580 585 lie His Phe Leu Thr Trp Tyr Lys Glu Asn Leu His Lys Leu Glu 590 595 600 Gly Ser Glu Glu Thr Thr Cys Ala Asn Pro Pro Ser Leu Arg Gly 605 610 615 Vai Lys Leu Ser Asp Vai Lys Leu Ser Cys Gly Ile Thr Ala Ile 620 625 630 Gly Ile Phe Phe Leu Ile Vai Phe Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu 635 640 645 Leu Phe Phe Ala Vai Lys Tyr Leu Leu Arg Trp Lys Tyr Gin His 650 655 660
Ile
<210> 34 <211> 429 <212> PRT <213> Sarcophaga bullata <400> 34 465 ΕΡ1725249Β1
Met Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ile Cys Ala Pro 15 10
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Leu Cys Glu 15 Pro Thr Glu 30 466 ΕΡ1725249Β1
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Lys Arg Lys lie Gly Arg Arg Ser Ala Arg Asp Pro Leu Arg Ser 335 340 345 Leu Pro Ser Pro Leu Pro Gin Glu Phe Thr Tyr Leu Asn Ser Pro 350 355 360 Thr Pro Gly Gin Leu Gin Pro Ile Tyr Glu Asn Val Asn Val Val 365 370 375 Ser Gly Asp Glu Val Tyr Ser Leu Ala Tyr Tyr Asn Gin Pro Glu 380 385 390 Gin Glu Ser Val Ala Ala Glu Thr Leu Gly Thr His Met Glu Asp 395 400 405 Lys Val Ser Leu Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Arg Lys Ala Asn Ile 410 415 420 Thr Asp Val Asp Tyr Glu Asp Ala Met 425 <2 10> 35 <2 11> 977 <2 12> PRT <2 13> Homo <4 A O O 35 468 ΕΡ1725249Β1
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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição US 4975278 A [0005] EP 1391213 A [0005] US 4970198 A [0006] US 5079233 A [0006] US 5585089 A [0006] [0302] US 5606040 A [0006] US 5693762 A [0006] US 5739116 A [0006] US 5767285 A [0006] US 5773001 A [0006] US 5635483 A [0007] [0276] [0458] • US 20040018194 A [0008] • WO 04032828 A [0008] • WO 03043583 A [0008] • US 5677171 A [0011] [0419] • WO 9400136 A [0012] • US 5783186 A [0012] • US 5183884 A [0013] • US 5480968 A [0013] • EP 599274 A [0013] • US 5821337 A [0014] [0015] [0122] [0134] [0653] [0676] • US 6054297 A [0014] • US 6407213 B [0014] • US 6639055 B [0014] • WO 0118032 A2 [0017] 473 ΕΡ1725249Β1 wo 2004073656 A2 [0018] wo 2004010957 A2 [0019] us 4816567 A [0105] [0106] [0302] us 5641869 A [0117] us 5500362 A [0122] EP 404097 A [0132] wo 9311161 A [0132] wo 9321319 A [0134] wo 9845479 A [0148] us 4933294 A [0148] wo 9105264 A [0148] us 5401638 A [0148] us 4943533 A, Mendelsohn [0154] wo 9640210 A [0154] us 5212290 A [0154] us 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Lisboa, 2 de Abril de 2014 504

Claims (37)

  1. ΕΡ1725249Β1 REIVINDICAÇÕES ΕΡ1725249Β1 1. Um composto que tem a seguinte fórmula: HN
    R2 0 R6 R8 0 R8 O Ib R9 0 N
    Z
    Df ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: independentemente em cada localização: R2 é selecionado a partir de H e Ci-C8alquilo; R3 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo) , C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); R4 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); R5 é selecionado a partir de H e metilo; ou: R4 e R5 em conjunto formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CRaRb)n-, em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de H, Ci-C8 alquilo, e C3-C8 carbociclo, e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; R5 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R7 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, OH, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, e 0-(Ci-C8 alquil); R9 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; 1 ΕΡ1725249Β1 R10 é selecionado a partir de arilo e C3-C8 heterociclo; Z é O; e R11 é H.
  2. 2. Um conjugado que tem a seguinte fórmula: L- (LU-Df)p ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: L- é uma unidade de Ligando, LU é uma unidade de Ligando que pode estar presente ou ausente, p varia de 1 a 20, e DF é um grupo da seguinte fórmula:
    O z R11 R10 em que independentemente em cada localização: R2 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R3 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); R4 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-Cg alquil-arilo, Ci-Cg alquil-(C3-C8 carbociclo) , C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); R5 é selecionado a partir de H e metilo; ou: R4 e R5 em conjunto formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CRaRb)n-, em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de H, Ci~C8 alquilo, e C3-C8 carbociclo, e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; 2 ΕΡ1725249Β1 R6 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R7 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbo-ciclo), C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, OH, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, e 0-(Ci-C8 alquil); R9 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R10 é selecionado a partir de arilo e C3-C8 heterociclo; Z é 0; e R11 é H.
  3. 3. Um conjugado que tem a seguinte fórmula: lu-df ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: LU- é uma Unidade de Ligando que compreende um grupo funcional capaz de ligar-se a uma unidade de ligando, e Df é um grupo da seguinte fórmula:
    em que: independentemente em cada localização: R2 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R3 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3-C8 carbociclo) , C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); 3 ΕΡ1725249Β1 R4 é selecionado a partir de H, Ci-C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci~C8 alquil-(C3-C8 carbociclo), C3—C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); R5 é selecionado a partir de H e metilo; ou: R4 e R5 em conjunto formam um anel carbociclico e têm a fórmula -(CRaRb)n_í em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de H, Ci-C8 alquilo, e C3-C8 carbociclo, e n é selecionado a partir de 2, 3, 4, 5 e 6; R6 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R7 é selecionado a partir de H, Ci~C8 alquilo, C3-C8 carbociclo, arilo, Ci-C8 alquil-arilo, Ci-C8 alquil-(C3—C8 carbo-ciclo), C3-C8 heterociclo, e Ci-C8 alquil-(C3-C8 heterociclo); cada R8 é independentemente selecionado a partir de H, OH, Ci-Cg alquilo, C3-C8 carbociclo, e 0-(Ci-C8 alquil); R9 é selecionado a partir de H e Ci-C8 alquilo; R10 é selecionado a partir de arilo e C3-C8 heterociclo; Z é 0; e R11 é H.
  4. 4. Um conjugado de acordo com a reivindicação 2, em que o conjugado é um conjugado de anticorpo-fármaco que tem a Fórmula Ia': Ab-(-A—W—Y-Df )p las ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: Ab é um anticorpo, -Aa-Ww-Yy- é uma unidade de Ligando, A é uma unidade de Estirador, 4 ΕΡ1725249Β1 a é 0 ou 1, cada W é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, Y é uma unidade de Espaçador, y é 0, 1, ou 2, e p varia de 1 a 20.
  5. 5. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, que tem a fórmula: Ab
    N-R17-C(0)—Ww—Yy-DF
    P ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: R17 é Ci-Cio alquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(Ci-C8 alquil)-, -arileno-, -Ci-Cio alquileno-arileno=, -arileno-Ci=Cio alquileno-, -Ci-Cio alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-Ci-Cio alquileno-, -C3-C8 hetero-ciclo-, -Ci-Cio alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, - (C3 C8 heterociclo)-Ci-Cio alquileno-, - (CH2CH20) r-, ou (CH2CH20)r-CH2-; e r é um número inteiro que varia de 1 a 10.
  6. 6. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, que tem a fórmula: O
    P 5 ΕΡ1725249Β1
  7. 7. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, que tem a fórmula: ΕΡ1725249Β1 O
    em que: w e y são, cada um, 0.
  8. 8. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que: w é um número inteiro que varia de 2 a 12.
  9. 9. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 8, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que: w é 2.
  10. 10. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 9, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que: Ww é -valina-citrulina-, ou -fenilalanina-lisina-.
  11. 11. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 10, que tem a fórmula:
    HN
    6 ΕΡ1725249Β1 ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
  12. 12. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com reivindicação 10, que tem a fórmula:
    ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo. a
  13. 13. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 10, que tem a fórmula: O
    ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
  14. 14. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, em que DF é:
    7 ΕΡ1725249Β1
  15. 15. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 14, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que o anticorpo é selecionado a partir de: um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecifico, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um diacorpo, e um fragmento de anticorpo.
  16. 16. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, que tem a fórmula:
    Ab-MC-vc-PAB-MMAF ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: Ab é um anticorpo, Vai é valina, e Cit é citrulina.
  17. 17. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, que tem a fórmula:
    Ab-MC-MMAF ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: Ab é um anticorpo.
  18. 18. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 17, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que o anticorpo se liga ao antigénio CD70 . 8 ΕΡ1725249Β1 ΕΡ1725249Β1 de acordo com a farmaceuticamente o anticorpo é um
  19. 19. Um conjugado de anticorpo-fármaco reivindicação 16 ou 17, ou um sal aceitável ou solvato do mesmo, em que anticorpo monoclonal.
  20. 20. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 19, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que o anticorpo se liga ao antigénio CD70.
  21. 21. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que A, W, e Y estão, cada um, presentes.
  22. 22. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que w e y são, cada um, 0.
  23. 23. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 22, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que p é 3 a 5.
  24. 24. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 22, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que o anticorpo se liga ao antigénio CD70 .
  25. 25. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 24, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que p é 3 a 5.
  26. 26. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que o 9 ΕΡ1725249Β1 anticorpo se liga a CD30, CD20, CD33, ou o antigénio Lewis Y.
  27. 27. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: o anticorpo é unido à unidade de Ligando ou DF através de um resíduo cisteína do anticorpo.
  28. 28. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 25, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, e um diluente, portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  29. 29. Um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 25, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por meio de terapêutica.
  30. 30. Utilização de um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 25, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de cancro.
  31. 31. Utilização de acordo com a reivindicação 30, em que o tratamento de cancro compreende ainda tratamento com um agente anti-cancro adicional, um agente imunossupressor, ou um agente anti-infecioso.
  32. 32. Utilização de um conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 25, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, no 10 ΕΡ1725249Β1 fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune ou uma doença infeciosa.
  33. 33. Um conjugado de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a unidade de Ligando (LU) tem a fórmula: -Aa-Ww-Yy- ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo em que: -A- é uma unidade de Estirador, a é 0 ou 1, cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido, w é um número inteiro que varia de 0 a 12, -Y- é uma unidade de Espaçador, e y é 0, 1 ou 2.
  34. 34. Um conjugado de acordo com a reivindicação 3, que tem a fórmula:
  35. 35. Um composto de acordo com a reivindicação 1, que tem a seguinte fórmula, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo: 36. das
    Um composto ou conjugado de acordo reivindicações 1 a 25 e 33 a com qualquer uma 35, ou um sal 11 ΕΡ1725249Β1 farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, que está na forma isolada e purificada.
  36. 37. Um composto ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, 15, 21 a 25 e 33, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que R2 e R6 são, cada um, metilo, e R9 é -H.
  37. 38. Um composto ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, 15, 21 a 25 e 33, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo, em que R3 e R4 são, cada um, isopropilo, R2 e R6 são, cada um, metilo, R5 é -H, R7 é sec-butilo, cada ocorrência de R8 é -OCH3, e R9 é -H. Lisboa, 2 de Abril de 2014 12
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