JP6644717B2 - 異種ポリペプチドを分泌させるための方法及び組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１４日出願の米国特許出願第６１／９５３，６２９号、及び２０１５年１月２６日出願の米国特許出願第６２／１０７，９８１号、及び２０１５年１月２７日出願の米国特許出願第６２／１０８，４７６号の優先権を主張し、これらの内容はその全体が参照として本明細書中に援用される。

配列表
本出願は、配列表を含み、この配列表はＡＳＣＩＩ形式でオンライン提出されており、その全体が本明細書により参照として援用される。本ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年３月１２日に、Ｐ５８０４Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名で作成されており、ファイルサイズは２１，９７１バイトである。

発明の分野
本発明は、概して、分子生物学及びタンパク質工学の分野に関する。より詳細には、本発明は、細菌から異種ポリペプチドを分泌させるためのシグナルペプチドに関する。本発明はまた、原核生物により産生された組換えポリペプチド及びその使用にも関する。

近年、異種ポリペプチド、例えば抗体を、様々な障害及び疾患の診断及び治療薬として利用する見込みが高まってきている。多くの研究及び臨床用途で、大量の機能性ポリペプチドが必要とされ、したがって、ポリペプチド製造用のスケールアップした、それでいて経済的なシステムが求められている。特に有用であるのは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核生物から酵母菌、植物、昆虫細胞、及び哺乳類細胞にいたるまで、多岐にわたる発現宿主を用いた抗体の遺伝子組換え産生である。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ（１９９９）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２：１７３−２０１。

他のポリペプチド産生系と比較して、細菌、特にＥ．ｃｏｌｉは、特有の利点を多く提供する。使用される原材料（すなわち細菌細胞）は安価かつ培養が容易であり、したがって、製品原価が安くなる。原核生物宿主は、例えば、哺乳類細胞よりもずっと速く成長し、遺伝子操作の分析をより迅速に行うことができる。一世代の時間がより短く、またスケールアップが容易であることも、細菌発酵を大量タンパク質製造のためのより魅力的な手段にしている。Ｅ．ｃｏｌｉをはじめとする多くの細菌種のゲノム構造及び生物活性が、十分に研究されてきており、広範囲にわたり適切なベクターを利用することができるので、所望の抗体をより都合よく発現させることができる。真核生物と比較して、製造プロセスに関わる工程は少なく、そのような工程として組換え遺伝子の操作、宿主への複数のコピーの安定した形質転換、発現誘導、及び産物の特性決定が挙げられる。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｐａｃｋ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ３：８３−１０５。

細菌中で組換えポリペプチドを作るのに様々なアプローチが用いられてきた。組換えタンパク質は、細胞質で発現した封入体の再折り畳みを通じて、または発現に続いての細菌ペリプラズムへの分泌を通じて、いずれかにより細菌から得ることができる。分泌と再折り畳みのどちらを選択するかは、一般に、複数の考慮事項から導かれる。通常、分泌の方が速く、抗体産生にはより一般的に用いられる戦略である。Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ及びｉｔｔｌｅ（１９９９）、上記。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉの分泌及び再折り畳み能力は、他の発現宿主よりも低いレベルに限られることが多い。

原核生物系での抗体発現は、様々な規模で行うことができる。Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体産生の総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｐａｃｋ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ３：８３−１０５；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ｉｎ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ｐｐ２０３−２５２（Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ｉｎ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰ ＰＨＡＲＭＣＯＬ ＶＯＬ ３：ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＣＯＬ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｐｐ２６９−３１５（ｅｄ． Ｍ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｇ．Ｐ． Ｍｏｏｒｅ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）を参照のこと。

多くの生物学アッセイ（Ｘ線結晶構造解析など）及び臨床用途（タンパク質療法など）が大量のタンパク質を必要としている。したがって、適切に構築された、溶解性かつ機能性の異種ポリペプチド、例えば抗体を産生する、高収率のただし簡潔なシステムが必要とされている。

本明細書中引用される参照文献は、特許出願及び公報も含めて、全て、それらの全体が参照として援用される。

本発明は、抗体などの異種タンパク質の産生を増加させる新規手段を提供する。異種タンパク質（例えば、抗体）の高レベル産生手段としてペリプラズム分泌を利用することは、頻繁に遭遇する複数の問題によって制限される可能性がある。第一に、目的のタンパク質の分泌効率が低い可能性がある。第二に、多くの場合、前駆体が成熟タンパク質になるプロセシングが不十分である。第三に、過剰発現した異種タンパク質は、不適切に折り畳まれるか、凝集して不溶性封入体になるか、またはＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼによりタンパク質分解を受けることが多い。第四に、抗体は、２つの異なるポリペプチド、重鎖及び軽鎖からなる複雑な多量体タンパク質であり、これらがペリプラズムに搬出されて、適切に折り畳まれて、適切なジスルフィド結合を形成しなければならない。このタンパク質の折り畳み及び分泌の複雑さが、Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体製造に困難さを加えている。Ｅ．ｃｏｌｉの分泌及び再折り畳み能力は、他の発現宿主よりも低いレベルに限られることが多い。ＴＩＲ最適化は、より効率的なタンパク質分泌をもたらすのに有用であることが示されているものの、他のアプローチは、Ｅ．ｃｏｌｉでの異種タンパク質分泌を常法的に改善することが示されていない。例えば、シグナルタンパク質の最適化は、ペリプラズム空間への組換えシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）分泌を低下させることが示された。Ｊｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１２）；２２：４８−５８。

本研究において、本発明者らは、シグナルペプチドの平均疎水性を上昇させると、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムへの溶解性抗体の分泌が増加したことを実証する。平均疎水性の上昇した変異型シグナルペプチドを開発して、本発明者らは、平均疎水性の上昇したシグナルペプチド変異体を用いると、溶解性抗体のペリプラズム分泌が増加し、平均疎水性の低下したシグナルペプチド変異体を用いると、溶解性抗体のペリプラズム分泌が減少したことを実証した。

１つの態様において、提供されるのは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からの抗体重鎖及び／または抗体軽鎖分泌を増加させる方法であり、本方法は、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第一シグナルペプチドをコードする第一ポリヌクレオチドであって、このシグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５超である、第一ポリヌクレオチド；及び／または（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第二シグナルペプチドをコードする第二ポリヌクレオチドであって、この第二シグナルペプチドの平均疎水性は約０．５超である、第二ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、そうすることにより宿主細胞での抗体発現の際に、重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することを含む。

１つの態様において、提供されるのは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞から抗体重鎖及び／または抗体軽鎖を作る方法であり、本方法は、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第一シグナルペプチドをコードする第一ポリヌクレオチドであって、このシグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５超である、第一ポリヌクレオチド；及び／または（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第二シグナルペプチドをコードする第二ポリヌクレオチドであって、この第二シグナルペプチドの平均疎水性は約０．５超である、第二ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、そうすることにより宿主細胞での抗体発現の際に、重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、宿主細胞培養物から異種ポリペプチドを回収することを含む。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、宿主細胞培養培地から回収される。いくつかの実施形態において、本方法は、回収された異種ポリペプチドを、薬学上許容される担体、賦形剤、または担体と組み合わせて、異種ポリペプチドを含む医薬製剤を調剤することを含む。

１つの態様において、提供されるのは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞から抗体重鎖及び／または抗体軽鎖を作る方法であり、本方法は、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第一シグナルペプチドをコードする第一ポリヌクレオチドであって、このシグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５超である、第一ポリヌクレオチド；及び／または（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第二シグナルペプチドをコードする第二ポリヌクレオチドであって、この第二シグナルペプチドの平均疎水性は約０．５超である、第二ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、そうすることにより宿主細胞での抗体発現の際に、重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することを含む。

１つの態様において、提供されるのは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞から抗体重鎖及び／または抗体軽鎖を移行させる方法であり、本方法は、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第一シグナルペプチドをコードする第一ポリヌクレオチドであって、このシグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５超である、第一ポリヌクレオチド；及び／または（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第二シグナルペプチドをコードする第二ポリヌクレオチドであって、この第二シグナルペプチドの平均疎水性は約０．５超である、第二ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み、そうすることにより宿主細胞での抗体発現の際に、重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することを含む。

いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．６超である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．７超である。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．６超である。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．７超である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチド及び第二シグナルペプチドの平均疎水性は、同様である（例えば、ほぼ等しい）。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチド及び第二シグナルペプチドの平均疎水性は、異なる。

いくつかの実施形態において、第一及び／または第二シグナルペプチドは、変異型共翻訳シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第一及び／または第二シグナルペプチドは、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドは、残基Ｌ１１に変異を有し、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドは、配列番号３の野生型ＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｌ１１ＩまたはＳ１８Ｙである。いくつかの実施形態において、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドは、配列番号１３または１５の配列を含む。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、Ｓｆｍｃシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｓｆｍｃシグナルペプチドは、野生型ＳｆｍｃシグナルペプチドのＴＩＲ強度とは異なるＴＩＲ強度を有する。いくつかの実施形態において、Ｓｆｍｃシグナルペプチドの相対翻訳強度（ＴＩＲ強度とも呼ぶ）は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、またはそれ以上、例えば約８、約９、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、Ｓｆｍｃシグナルペプチドの相対翻訳強度は、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８である。いくつかの実施形態において、Ｓｆｍｃシグナルペプチドの相対翻訳強度は、２〜５、３〜７、または４〜８である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、またはＴｏｒＴである。いくつかの実施形態において、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、またはＴｏｒＴシグナルペプチドは、野生型ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、またはＴｏｒＴシグナルペプチドの相対翻訳強度とは異なる相対翻訳強度を有する。いくつかの実施形態において、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、またはＴｏｒＴシグナルペプチドのＴＩＲ強度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、またはそれ以上、例えば約８、約９、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、またはＴｏｒＴシグナルペプチドの相対翻訳強度は、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８である。いくつかの実施形態において、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、またはＴｏｒＴシグナルペプチドの相対翻訳強度は、２〜５、３〜７、または４〜８である。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、Ｓｆｍｃではない。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＴｏｒＴではない。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、及びＴｏｒＴのいずれか１つでもいずれか複数でもない。

いくつかの実施形態において、第一及び／または第二シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約８である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの相対翻訳強度は約５であり、第二シグナル配列の相対翻訳強度は約８である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの相対翻訳強度は約８であり、第二シグナル配列の相対翻訳強度は約５である。いくつかの実施形態において、Ｓｆｍｃシグナルペプチドの相対翻訳強度は、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８である。いくつかの実施形態において、Ｓｆｍｃシグナルペプチドの相対翻訳強度は、２〜５、３〜７、または４〜８である。

いくつかの実施形態において、宿主細胞中のポリヌクレオチドは、さらに、プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、及びＴ７プロモーターからなる群より選択される原核生物プロモーターである。

いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、内因性プロテアーゼ活性が欠損している株の細胞である。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子型は、ｄｅｇＰ遺伝子及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、突然変異ｓｐｒ遺伝子を抱えている。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、さらに、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ、及びＦｋｐＡからなる群より選択される少なくとも１種の原核生物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの両方をコードする。

いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、宿主細胞培養培地から回収される。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、回収した抗体を、薬学上許容される担体、賦形剤、または担体と組み合わせて、抗体を含む医薬製剤を調剤することを含む。いくつかの実施形態において、形成される免疫グロブリンポリペプチド複合体の少なくとも５０％は、抗体である。いくつかの実施形態において、形成される免疫グロブリンポリペプチド複合体の少なくとも７０％は、抗体である。いくつかの実施形態において、形成される免疫グロブリンポリペプチド複合体の少なくとも８０％は、抗体である。いくつかの実施形態において、形成される免疫グロブリンポリペプチド複合体の少なくとも９０％は、抗体である。

いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は二重特異性抗体である。

別の態様において、提供されるのは、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドであり、この変異型は、平均疎水性が０．５超であるＨ領域を有する。

別の態様において、提供されるのは、残基Ｓ１１に変異を有する変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドであり、この変異型は、配列番号３のＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｌ１１Ｉ及び／またはＳ１８Ｙである。

別の態様において、提供されるのは、残基Ｓ１１に変異を有する変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドであり、この変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドは、配列番号１のＳＴＩＩシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｓ１１Ａ、Ｓ１１Ｉ、またはＳ１１Ｌである。

別の態様において、提供されるのは、配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、変異型シグナルペプチドである。

別の態様において、提供されるのは、本明細書中開示される変異型シグナルペプチドのいずれかが異種タンパク質と融合したものである。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、抗体重鎖である。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、抗体軽鎖である。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、抗体軽鎖及び重鎖である。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、多量体ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、イムノアドヘシンである。

別の態様において、提供されるのは、本明細書中開示される変異型シグナルペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列である。

別の態様において、提供されるのは、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した、本明細書中開示される変異型シグナルペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列であり、それにより、宿主細胞での異種ポリペプチド発現の際に、異種ポリペプチドは、折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する。

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核生物宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

別の態様において、提供されるのは、抗体をコードするポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そうすることにより、宿主細胞での抗体発現の際に、重鎖及び軽鎖は、折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成し、第一シグナルペプチドは、本明細書中開示される変異型シグナルペプチドのいずれか１種の変異型シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１３、１５、３１、３３、または４２の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドであり、この変異型は、０．５超である平均疎水性を持つＨ領域を有する。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、残基Ｓ１１に変異を有する変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドであり、この変異型は、配列番号３のＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｌ１１Ｉ及び／またはＳ１８Ｙである。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、残基Ｓ１１に変異を有する変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドであり、この変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドは、配列番号１のＳＴＩＩシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｓ１１Ａ、Ｓ１１Ｉ、またはＳ１１Ｌである。

いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１３、１５、３１、３３、または４２の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドであり、この変異型は、０．５超である平均疎水性を持つＨ領域を有する。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、残基Ｓ１１に変異を有する変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドであり、この変異型は、配列番号３のＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｌ１１Ｉ及び／またはＳ１８Ｙである。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、残基Ｓ１１に変異を有する変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドであり、この変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドは、配列番号１のＳＴＩＩシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する。いくつかの実施形態において、変異は、Ｓ１１Ａ、Ｓ１１Ｉ、またはＳ１１Ｌである。

いくつかの実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、さらに、（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第三シグナルペプチドをコードするポリペプチドを含む。第三シグナルペプチドは、例えば、本明細書中開示される変異型シグナルペプチドのいずれかであってよい。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１３、１５、３１、３３、または４２の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらに、異種ポリペプチドと作動可能に連結したプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｒｐ、及びＴ７プロモーターからなる群より選択される原核生物プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ｐｈｏＡプロモーターである。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ａ）第一プロモーターであって、軽鎖と作動可能に連結している、第一プロモーター及び（ｂ）第二プロモーターであって、重鎖と作動可能に連結している、第二プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、第一プロモーター及び第二プロモーターは、両方ともｐｈｏＡプロモーターである。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらに、（ｃ）第三プロモーターであって、Ｆｃポリペプチドと作動可能に連結している、第三プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、このプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーターである。

いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、プロテアーゼ、イムノアドヘシン、受容体の細胞外ドメイン、ヘテロ多量体タンパク質、または抗体である。

いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、抗体断片、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。

本明細書中開示されるポリヌクレオチドのいずれかのポリヌクレオチドを含むベクター。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。

本明細書中開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物。

本明細書中開示されるポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉは、内因性プロテアーゼ活性が欠損している株のものである。いくつかの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子型は、ｄｅｇＰ遺伝子及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、突然変異ｓｐｒ遺伝子を抱えている。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、さらに、原核生物シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、原核生物シャペロンタンパク質は、ＤｓｂＡ及び／またはＤｓｂＣである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核生物シャペロンタンパク質を過剰発現する。

別の態様において、提供されるのは、異種ポリペプチドの作成方法であり、本方法は、核酸が発現されるように本明細書中開示される宿主細胞のいずれかを培養することを含み、そうすることにより、宿主細胞でのこのポリヌクレオチド発現の際に、異種ポリペプチドは折り畳まれて生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態において、本方法は、さらに、宿主細胞培養物から異種ポリペプチドを回収する方法を含む。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、宿主細胞培養培地から回収される。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、回収された異種ポリペプチドを、薬学上許容される担体、賦形剤、または担体と組み合わせて、異種ポリペプチドを含む医薬製剤を調剤することを含む。

別の態様において、提供されるのは、細胞から異種ポリペプチドを分泌させる方法であり、本方法は、核酸が発現して異種ポリペプチドが分泌されるように、本明細書中提供される宿主細胞のいずれかを培養することを含む。

別の態様において、提供されるのは、細胞から異種ポリペプチドを移行させる方法であり、本方法は、核酸が発現して異種ポリペプチドが移行されるように、本明細書中提供される宿主細胞のいずれかを培養することを含む。

本明細書中提供される方法のいずれかにより得られる異種ポリペプチド。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。

いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドの使用は、例えば、野生型（非変異型）シグナルペプチドの使用と比較して、例えば、異種ポリペプチド（例えば、抗体、例えば、重鎖及び／または軽鎖）の産生増加、異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、成熟異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、成熟異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、可溶性異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、可溶性異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、ペリプラズム側での封入体の局在増加、及び／または異種ポリペプチドの産生を増加させ、そうすることにより異種ポリペプチドを、分泌、折り畳み、及び構築させて、例えば生物学的に活性なポリペプチド（例えば、抗体）にするという結果をもたらす。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度（ＴＩＲ強度とも呼ばれる）は約１である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、またはそれ以上、例えば約８、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約４である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約５である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約６である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約８である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドと第二シグナルペプチドの相対翻訳強度は、ほぼ等しい。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドと第二シグナルペプチドの相対翻訳強度は、異なっている。

１つの態様において、提供されるのは、本発明の変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、変異型は、ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ、ＤｓｂＡ、またはＳＴＩＩシグナルペプチドの変異型である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、または３５のアミノ酸をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１２または１５のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３１または３３のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３２、３４、または３５のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３６、３７、３８、３９、または４０のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、または２８のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２９のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２７または３０のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

別の態様において、本発明は、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された本発明の変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そうすることにより宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）における異種ポリペプチドの発現に際して、異種ポリペプチドが折り畳まれ構築されて生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する、ポリヌクレオチドを提供する。異種ポリペプチドの例は、本明細書中さらに開示される。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、抗体重鎖である。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、抗体軽鎖である。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、Ｆｃポリペプチドである。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、多量体ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドはヘテロ多量体である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、本明細書中開示される変異型シグナルペプチドのいずれか１種である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１２または１５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号３１または３３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号３２、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４４、４５、または４６の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２６、２８、３０、３６、３７、３８、４５、または４６の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７または３０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４５または４６のポリヌクレオチド配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

別の態様において、本発明は、（１）第一異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び（２）第二異種をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それにより、宿主細胞での抗体発現の際に、第一及び第二の異種ポリペプチドが折り畳まれ構築されて、生物学的に活性なポリペプチド複合体を形成する、ポリヌクレオチドを提供する。

別の態様において、本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドは、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それにより、宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）での抗体発現の際に、重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する。

いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、共翻訳シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、ＤｓｂＡシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、ＳＴＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、本明細書で開示される変異型シグナルペプチドのいずれか１種である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号１２または１５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号３１または３３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号３２、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２８、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７または３０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、ＤｓｂＡシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、ＳＴＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、本明細書で開示される変異型シグナルペプチドのいずれか１種である。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号１２または１５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号３１または３３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号３２、３５、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、または２８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７または３０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）からなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含み、かつ第二シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、及び３５のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３６及び３８のいずれか１種である）のシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号１２または１５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号３６または３８のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、配列番号３７、３９、または４０のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、または２８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７または３０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）からなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含み、かつ第一シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、及び３５のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３１及び３３のいずれか１種である）のアミノ酸配列を含む、その配列からなる、または本質的にその配列からなるシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３５、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号１２または１５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号３１または３３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号３３、３４、または３５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２８、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７または３０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。

いくつかの実施形態において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、さらに、（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第三シグナルペプチドをコードするポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３１、３２、３３、３４、及び３５のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３１及び３３のいずれか１種である）のアミノ酸配列を含む、その配列からなる、または本質的にその配列からなるシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号８、１１、または１３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドは、配列番号１２または１５のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドは、配列番号３１または３３のアミノ酸配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、２４、２５、２６、２８、３６、３７、３８、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７及び３０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６または３８の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３７、３９、または４０の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む。いくつかの実施形態において、第三シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）である。

いくつかの実施形態、例えば、抗体をコードするポリヌクレオチドがさらに（３）第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む実施形態において、第一シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）を含み、かつ第二シグナルペプチドは、シグナルペプチド（例えば、当該分野で既知の任意のシグナルペプチド）を含む。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドは、シグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含み、かつ第二シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３６、３７、３８、３９、及び４０のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３１及び３３のいずれか１種である）のシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドは、シグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含み、かつ第一シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３６、３７、３８、３９、及び４０のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３１及び３３のいずれか１種である）のシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態、例えば、抗体をコードするポリヌクレオチドがさらに（３）第三シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む実施形態において、第一シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３６、３、３８、３９、及び４０のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３１及び３３のいずれか１種である）のシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含み、かつ第二シグナルペプチドは、本明細書中開示されるシグナルペプチド、例えば、配列番号８、１１、１２、１３、１４、１５、３６、３７、３８、３９、及び４０のいずれか１種（いくつかの実施形態において、配列番号８、１１、及び１３のいずれか１種であり、またいくつかの実施形態において、配列番号３１及び３３のいずれか１種である）のシグナルペプチドからなる、本質的にそのシグナルペプチドからなる、またはそのシグナルペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドの使用は、例えば、野生型（非変異型）シグナルペプチドの使用と比較して、例えば、異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、成熟異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、成熟異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、可溶性異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、可溶性異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、異種ポリペプチドの産生を増加させ、それにより異種ポリペプチドを、分泌、折り畳み、及び構築させて、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、抗体）にするという結果をもたらす。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドの使用であって、例えば、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度がほぼ等しい場合での野生型（非変異型）シグナルペプチドの使用と比較して、例えば、異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、成熟異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、成熟異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、可溶性異種ポリペプチド（例えば、抗体）の産生増加、可溶性異種ポリペプチド（例えば、抗体）の分泌増加、異種ポリペプチドの産生を増加させ、それにより異種ポリペプチドを、分泌、折り畳み、及び構築させて、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、抗体）にするという結果をもたらす。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約１である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、またはそれ以上、例えば約８、またはそれ以上などである。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約４である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約５である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約６である。いくつかの実施形態において、変異型シグナルペプチドと野生型（非変異型）シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約８である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドと第二シグナルペプチドの相対翻訳強度は、ほぼ等しい。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドと第二シグナルペプチドの相対翻訳強度は異なる。

１つの態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／または免疫（自己免疫など）障害などの疾患の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本発明の方法を用いて生成させた異種ポリペプチドの使用を提供する。異種ポリペプチドは、本明細書記載される形態のいずれのものでもよく、抗体、抗体断片、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチド）、またはそれらの組み合わせが含まれる。

１つの態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／または免疫（自己免疫など）障害などの疾患の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本明細書中開示されるシグナルペプチドまたは本明細書中開示されるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。

１つの態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／または免疫（自己免疫など）障害などの疾患の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本明細書中開示される発現ベクターの使用を提供する。

１つの態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／または免疫（自己免疫など）障害などの疾患の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本明細書中開示される宿主細胞の使用を提供する。

１つの態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、免疫（自己免疫など）障害、及び／または血管新生関連障害（創傷治癒）などの疾患の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本明細書中開示される製造品の使用を提供する。

１つの態様において、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／または免疫（自己免疫などの）障害などの疾患の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本明細書中開示されるキットの使用を提供する。

図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃは、５Ｄ５全長抗体及び重鎖レベルでのシグナルペプチド変異体の効果を示す。発現ベクターを抱えたＥ．ｃｏｌｉ宿主株６４Ｂ４を、震盪フラスコ中、２４時間、完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地で増殖させ、終点時の試料を、ＯＤ_５５０で正規化した。（１Ａ）上段パネル：可溶性重鎖含有種のウエスタンブロット。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）を保有する６４Ｂ４細胞を溶解させて、水溶性画分を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、続いてＨＲＰ結合型αＦｃ抗体をプローブとして用いるウエスタンブロットにより分離した。得られるブロットは、上から下に向かって、全長５Ｄ５抗体、重鎖−重鎖−軽鎖、及び重鎖−軽鎖に該当する重鎖含有種を示す。下段パネル：終点時の試料を、ＯＤ_５５０を１として正規化し、ペレット化した。全タンパク質を、０．２ＭのＤＴＴを含有するトリシン試料緩衝液と混合することにより、変性及び還元した。重鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４９ｋＤａの分子量で単独バンドとして移動し、αＦｃ抗体でプローブされた。ゲル上での移動がより遅い重鎖バンドは、前駆体を含んでいたことが、Ｅｄｍａｎタンパク質配列決定により確認された。（１Ｂ）ペリプラズム中の可溶性重鎖レベル。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）を抱えている６４Ｂ４細胞の終点時の試料を、浸透圧ショックで処理した。上清を収集し、０．２ＭのＤＴＴを含有するトリシン緩衝液で変性及び還元した。還元した重鎖は、４９ｋＤａ前後の単独バンドとして移動し、αＦｃでプローブされた。（１Ｃ）上段パネル：ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＰｈｏＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＭａｌＥ１）を保有する６４Ｂ４細胞の非還元ウエスタンブロット。中段パネル：同一試料のＯＤ_５５０を１とするペレット中の全重鎖をＤＴＴにより還元してウエスタンブロットで分析した。下段パネル：同一試料のペリプラズム抽出物を還元し、αＦｃ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した。発現プラスミドは全て、第一シグナルペプチドＴＩＲ変異が軽鎖について、かつ第二シグナルペプチドＴＩＲ変異が重鎖についてであるように命名する。例えば、ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５は、軽鎖についてＴＩＲが１でありかつ上流にｍｌｕＩ制限部位があるＳＴＩＩシグナル配列を意味し；ｂＳＴＩＩ１は、ＨＣについてＴＩＲが１でありかつ上流にｂｓｔシグナル配列があるＳＴＩＩシグナル配列を意味し；５Ｄ５は、抗体名である。 図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃは、５Ｄ５全長抗体及び重鎖レベルでのシグナルペプチド変異体の効果を示す。発現ベクターを抱えたＥ．ｃｏｌｉ宿主株６４Ｂ４を、震盪フラスコ中、２４時間、完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地で増殖させ、終点時の試料を、ＯＤ_５５０で正規化した。（１Ａ）上段パネル：可溶性重鎖含有種のウエスタンブロット。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）を保有する６４Ｂ４細胞を溶解させて、水溶性画分を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、続いてＨＲＰ結合型αＦｃ抗体をプローブとして用いるウエスタンブロットにより分離した。得られるブロットは、上から下に向かって、全長５Ｄ５抗体、重鎖−重鎖−軽鎖、及び重鎖−軽鎖に該当する重鎖含有種を示す。下段パネル：終点時の試料を、ＯＤ_５５０を１として正規化し、ペレット化した。全タンパク質を、０．２ＭのＤＴＴを含有するトリシン試料緩衝液と混合することにより、変性及び還元した。重鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４９ｋＤａの分子量で単独バンドとして移動し、αＦｃ抗体でプローブされた。ゲル上での移動がより遅い重鎖バンドは、前駆体を含んでいたことが、Ｅｄｍａｎタンパク質配列決定により確認された。（１Ｂ）ペリプラズム中の可溶性重鎖レベル。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）を抱えている６４Ｂ４細胞の終点時の試料を、浸透圧ショックで処理した。上清を収集し、０．２ＭのＤＴＴを含有するトリシン緩衝液で変性及び還元した。還元した重鎖は、４９ｋＤａ前後の単独バンドとして移動し、αＦｃでプローブされた。（１Ｃ）上段パネル：ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＰｈｏＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＭａｌＥ１）を保有する６４Ｂ４細胞の非還元ウエスタンブロット。中段パネル：同一試料のＯＤ_５５０を１とするペレット中の全重鎖をＤＴＴにより還元してウエスタンブロットで分析した。下段パネル：同一試料のペリプラズム抽出物を還元し、αＦｃ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した。発現プラスミドは全て、第一シグナルペプチドＴＩＲ変異が軽鎖について、かつ第二シグナルペプチドＴＩＲ変異が重鎖についてであるように命名する。例えば、ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５は、軽鎖についてＴＩＲが１でありかつ上流にｍｌｕＩ制限部位があるＳＴＩＩシグナル配列を意味し；ｂＳＴＩＩ１は、ＨＣについてＴＩＲが１でありかつ上流にｂｓｔシグナル配列があるＳＴＩＩシグナル配列を意味し；５Ｄ５は、抗体名である。 図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃは、５Ｄ５全長抗体及び重鎖レベルでのシグナルペプチド変異体の効果を示す。発現ベクターを抱えたＥ．ｃｏｌｉ宿主株６４Ｂ４を、震盪フラスコ中、２４時間、完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地で増殖させ、終点時の試料を、ＯＤ_５５０で正規化した。（１Ａ）上段パネル：可溶性重鎖含有種のウエスタンブロット。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）を保有する６４Ｂ４細胞を溶解させて、水溶性画分を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、続いてＨＲＰ結合型αＦｃ抗体をプローブとして用いるウエスタンブロットにより分離した。得られるブロットは、上から下に向かって、全長５Ｄ５抗体、重鎖−重鎖−軽鎖、及び重鎖−軽鎖に該当する重鎖含有種を示す。下段パネル：終点時の試料を、ＯＤ_５５０を１として正規化し、ペレット化した。全タンパク質を、０．２ＭのＤＴＴを含有するトリシン試料緩衝液と混合することにより、変性及び還元した。重鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４９ｋＤａの分子量で単独バンドとして移動し、αＦｃ抗体でプローブされた。ゲル上での移動がより遅い重鎖バンドは、前駆体を含んでいたことが、Ｅｄｍａｎタンパク質配列決定により確認された。（１Ｂ）ペリプラズム中の可溶性重鎖レベル。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）を抱えている６４Ｂ４細胞の終点時の試料を、浸透圧ショックで処理した。上清を収集し、０．２ＭのＤＴＴを含有するトリシン緩衝液で変性及び還元した。還元した重鎖は、４９ｋＤａ前後の単独バンドとして移動し、αＦｃでプローブされた。（１Ｃ）上段パネル：ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＰｈｏＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＭａｌＥ１）を保有する６４Ｂ４細胞の非還元ウエスタンブロット。中段パネル：同一試料のＯＤ_５５０を１とするペレット中の全重鎖をＤＴＴにより還元してウエスタンブロットで分析した。下段パネル：同一試料のペリプラズム抽出物を還元し、αＦｃ抗体を用いたウエスタンブロットで分析した。発現プラスミドは全て、第一シグナルペプチドＴＩＲ変異が軽鎖について、かつ第二シグナルペプチドＴＩＲ変異が重鎖についてであるように命名する。例えば、ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５は、軽鎖についてＴＩＲが１でありかつ上流にｍｌｕＩ制限部位があるＳＴＩＩシグナル配列を意味し；ｂＳＴＩＩ１は、ＨＣについてＴＩＲが１でありかつ上流にｂｓｔシグナル配列があるＳＴＩＩシグナル配列を意味し；５Ｄ５は、抗体名である。 図２Ａ及び図２Ｂは、免疫金電子顕微鏡法による、重鎖の細胞分布に対する様々なシグナルペプチドの使用の効果を示す。様々なシグナルペプチドを発現する構築物を保有するＡ６４Ｂ４細胞を、震盪フラスコ中で２４時間、培養した。終点時の試料を、固定し、包埋し、凍結切片化した。凍結切片を、ＨＲＰ結合型αＦｃ抗体及び金結合型αＨＲＰ二次抗体でプローブした。免疫染色した試料を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で視覚化した。（２Ａ）は、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）を保有するＡ６４Ｂ４細胞を示す。（２Ｂ）は、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）を保有するＡ６４Ｂ４細胞を示す。ペリプラズム空間は、黒矢印で指摘してある。免疫金シグナルは、黒矢頭で指摘してある。 図２Ａ及び図２Ｂは、免疫金電子顕微鏡法による、重鎖の細胞分布に対する様々なシグナルペプチドの使用の効果を示す。様々なシグナルペプチドを発現する構築物を保有するＡ６４Ｂ４細胞を、震盪フラスコ中で２４時間、培養した。終点時の試料を、固定し、包埋し、凍結切片化した。凍結切片を、ＨＲＰ結合型αＦｃ抗体及び金結合型αＨＲＰ二次抗体でプローブした。免疫染色した試料を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で視覚化した。（２Ａ）は、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）を保有するＡ６４Ｂ４細胞を示す。（２Ｂ）は、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）を保有するＡ６４Ｂ４細胞を示す。ペリプラズム空間は、黒矢印で指摘してある。免疫金シグナルは、黒矢頭で指摘してある。 図３Ａ及び図３Ｂは、ペリプラズムへの重鎖蓄積に対するシグナルペプチド疎水性の効果を示す。（３Ａ）は、軽鎖不在下での可溶性重鎖のペリプラズム中レベルを示す。ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌコドン１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＳＴＩＩ１コドン１）、またはｐＢＲ−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌコドン２−５Ｄ５ＨＣ（ｂＳＴＩＩ１コドン２）を保有する６４Ｂ４細胞由来のペリプラズム抽出物を、ウエスタンブロットで分析した。還元した重鎖は、４９ｋＤａ前後で移動し、αＦｃ抗体でプローブされた。（３Ｂ）は、軽鎖を共発現する可溶性重鎖のペリプラズム中レベルを示す。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ）を保有する６４Ｂ４由来のペリプラズム抽出物を、ウエスタンブロットで分析した。還元した重鎖を、αＦｃ抗体で検出した。 図３Ａ及び図３Ｂは、ペリプラズムへの重鎖蓄積に対するシグナルペプチド疎水性の効果を示す。（３Ａ）は、軽鎖不在下での可溶性重鎖のペリプラズム中レベルを示す。ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌコドン１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＳＴＩＩ１コドン１）、またはｐＢＲ−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌコドン２−５Ｄ５ＨＣ（ｂＳＴＩＩ１コドン２）を保有する６４Ｂ４細胞由来のペリプラズム抽出物を、ウエスタンブロットで分析した。還元した重鎖は、４９ｋＤａ前後で移動し、αＦｃ抗体でプローブされた。（３Ｂ）は、軽鎖を共発現する可溶性重鎖のペリプラズム中レベルを示す。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ）を保有する６４Ｂ４由来のペリプラズム抽出物を、ウエスタンブロットで分析した。還元した重鎖を、αＦｃ抗体で検出した。 図４Ａ及び図４Ｂは、全長５Ｄ５レベルに対するシグナルペプチド疎水性の効果を示す。上段パネル：（Ａ）ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）（Ｂ）ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ）を抱える６４Ｂ４由来の全細胞溶解液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析した。重鎖含有種を、矢印で示す。下段パネル：上段パネルで使用したのと同一の試料によるＯＤ_５５０が１であるペレット中の全重鎖タンパク質を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウエスタンブロットにより分析した。４９ｋＤａで移動する重鎖はαＦｃ抗体でプローブされた。 図４Ａ及び図４Ｂは、全長５Ｄ５レベルに対するシグナルペプチド疎水性の効果を示す。上段パネル：（Ａ）ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｉ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）（Ｂ）ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｉ）を抱える６４Ｂ４由来の全細胞溶解液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析した。重鎖含有種を、矢印で示す。下段パネル：上段パネルで使用したのと同一の試料によるＯＤ_５５０が１であるペレット中の全重鎖タンパク質を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウエスタンブロットにより分析した。４９ｋＤａで移動する重鎖はαＦｃ抗体でプローブされた。 封入体の細胞分布に対するシグナルペプチド及びその疎水性の効果を示す。ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＭａｌＥ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＰｈｏＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＭａｌＥ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＭａｌＥ１）、またはｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｍＰｈｏＡ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｍＰｈｏＡ１）を保有する６４Ｂ４の培養物の終点時の試料を、固定し、包埋し、超薄切片に切断して、ＴＥＭで視覚化した。ペリプラズム空間を、矢印で示し、封入体を矢頭で示す。 Ｃ末端領域にＳｅｒ／Ｔｙｒ変異がある場合のウエスタンブロット分析を示す。上段パネル：ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｙ２２Ｓ−５Ｄ５（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｙ２２Ｓ）、ｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１）、またはｐＢＲ−ｂＤｓｂＡ１ Ｓ１８Ｙ−５Ｄ５ＨＣ（ｂＤｓｂＡ１ Ｓ１８Ｙ）を抱える６４Ｂ４細胞の全細胞溶解液を、αＦｃをプローブに用いる非還元ウエスタンブロットにより分析した。全長５Ｄ５、重鎖−重鎖−軽鎖、及び重鎖−軽鎖を含む重鎖含有種を示す。下段パネル：ＯＤ_５５０が１であるペレット中の全タンパク質をＤＴＴにより還元して、ウエスタンブロットで分析した。還元した重鎖は約４９ｋＤａで移動した。 図７Ａ及び７Ｂは、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２について、全長抗体レベル及びペリプラズム中の可溶性重鎖レベルに対するシグナルペプチド疎水性の効果を示す。（７Ａ）上段パネルは、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）を抱える６４Ｂ４の全細胞溶解液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。重鎖含有種は、矢印で示してある。中段パネル：同一試料からペリプラズムタンパク質を抽出し、ＤＴＴで還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。下段パネルは、同一試料のＯＤ_５５０が１であるペレット中の全重鎖タンパク質を、ＤＴＴで還元し、ウエスタンブロットにより分析したものを示す。（７Ｂ）上段パネルは、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）を抱える６４Ｂ４の全細胞溶解液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。重鎖含有種は、矢印で示してある。中段パネルは、同一試料からペリプラズムタンパク質を抽出し、ＤＴＴで還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。下段パネルは、同一試料のＯＤ_５５０が１であるペレット中の全重鎖タンパク質を、ＤＴＴで還元し、ウエスタンブロットにより分析したものを示す。 図７Ａ及び７Ｂは、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２について、全長抗体レベル及びペリプラズム中の可溶性重鎖レベルに対するシグナルペプチド疎水性の効果を示す。（７Ａ）上段パネルは、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−ｍＡｂ１（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）を抱える６４Ｂ４の全細胞溶解液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。重鎖含有種は、矢印で示してある。中段パネル：同一試料からペリプラズムタンパク質を抽出し、ＤＴＴで還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。下段パネルは、同一試料のＯＤ_５５０が１であるペレット中の全重鎖タンパク質を、ＤＴＴで還元し、ウエスタンブロットにより分析したものを示す。（７Ｂ）上段パネルは、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＳＴＩＩ１ Ｓ１１Ｌ）、ｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１）、及びｐＢＲ−ｍＳＴＩＩ１−ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ−ｍＡｂ２（ｍＳＴＩＩ１、ｂＤｓｂＡ１ Ｌ１１Ｓ）を抱える６４Ｂ４の全細胞溶解液を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。重鎖含有種は、矢印で示してある。中段パネルは、同一試料からペリプラズムタンパク質を抽出し、ＤＴＴで還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてαＦｃ抗体でプローブするウエスタンブロットにより分析したものを示す。下段パネルは、同一試料のＯＤ_５５０が１であるペレット中の全重鎖タンパク質を、ＤＴＴで還元し、ウエスタンブロットにより分析したものを示す。

一般的な技法
本明細書中記載または参照される技法及び手順は、概して、当業者に十分に理解されており従来の方法論を用いて一般的に使用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ． ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））に記載されている広く利用される方法論である。

定義
「ベクター」という用語は、本明細書中使用される場合、自身に連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を示すものとする。ベクターの種類の１つは「プラスミド」であり、プラスミドは、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを示す。ベクターの別の種類は、ファージベクターである。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、この場合追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結することができる。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律増殖することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込み、それにより宿主ゲノムの複製とともに複製させることができる。さらに、ある特定のベクターは、そのベクターが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書中、「組換え発現ベクター」（または単に「組換えベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法で利用される発現ベクターは、プラスミドの形をしていることが多い。プラスミドが最も一般的に使用される形のベクターであることから、本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、同義で用いてもよいものとする。

「シストロン」という用語は、本明細書中使用される場合、ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列及び隣接制御領域を含む翻訳単位と広義には等価である遺伝子エレメントを示すものとする。「隣接制御領域」として、例えば、翻訳開始領域（ＴＩＲ；本明細書中以下で定義されるとおり）及び終止領域が挙げられる。

「ポリシストロン」発現ベクターは、複数のシストロンを含有し、ただ１つのプロモーターの調節制御下でそれらを発現する単独ベクターを示す。ポリシストロンベクターの一般例として、２つの異なるポリペプチドを含有し１つのプロモーターの制御下でそれらを発現する「ジシストロン」ベクターがある。ジシストロンまたはポリシストロンベクターの発現に際して、複数の遺伝子が単独の転写単位として最初に転写され、次いで別々に翻訳される。

本発明による「セパレートシストロン」発現ベクターは、少なくとも２つの別個のプロモーターシストロン対を含み、個々のシストロンはそれ自身のプロモーターの制御下にある、単独ベクターを示す。セパレートシストロン発現ベクターの発現に際して、異なる遺伝子の転写及び翻訳プロセスは両方とも、分離かつ独立している。

「翻訳開始領域」またはＴＩＲまたは翻訳開始領域または翻訳開始配列は、本明細書中使用される場合、目的の遺伝子の翻訳開始の効力を提供する核酸領域を示す。一般に、特定のシストロン内のＴＩＲは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ならびにＲＢＳに対して５’及び３’の配列を包含する。ＲＢＳは、最低限、シャイン・ダルガーノ領域及び開始コドン（ＡＵＧ）を含有すると定義される。したがって、ＴＩＲは、翻訳される核酸配列の少なくとも一部分も含む。好ましくは、ＴＩＲは、シストロン内の軽鎖または重鎖をコードする配列に先行するシグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列を含む。ＴＩＲ変異体は、ＴＩＲの性質、例えば本明細書中以下に定義されるとおりのＴＩＲの翻訳強度などを改変する配列変異（特に置換）をＴＩＲ領域内に有する。好ましくは、本発明のＴＩＲ変異体は、シストロン内の軽鎖または重鎖をコードする配列に先行する分泌シグナル配列の最初の２〜約１４、好ましくは約４〜１２、より好ましくは約６コドン内に配列置換を有する。

「翻訳強度」という用語は、本明細書中使用される場合、制御系中で分泌されたポリペプチドの測定量を示し、測定では１つまたは複数の変異型ＴＩＲを用いて、ポリペプチドの分泌を指示させ、その結果を、同じ培養及びアッセイ条件下の野生型ＴＩＲまたはある他の対照と比較する。

「シグナルペプチド」（「シグナル配列」とも呼ぶ）は、新たに合成された目的タンパク質に、原核生物の細胞膜を通過、通常は内膜または内膜及び外膜の両方を通過するよう指示するのに使用可能な短ペプチドを示す。分泌シグナル配列によりコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞にとって内因性でも、外因性でもよく、そのようなシグナルペプチドとして、発現させようとするポリペプチドにとって生来のシグナルペプチドが挙げられる。シグナルペプチドは、典型的には、発現させようとするポリペプチドのアミノ末端に存在し、また典型的には、生合成と細胞質からのポリペプチド分泌との間に酵素により除去される。すなわち、シグナルペプチドは、通常、成熟タンパク質産物に存在しない。シグナルペプチド（例えば原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉシグナルペプチド）は、一般に、３つの異なる領域で構成される：Ｎ末端領域（この領域は典型的には少なくとも１つまたは２つの正電荷を帯びたアミノ酸残基を含有する）、Ｈ領域と呼ばれる（Ｈドメインとも呼ぶ）疎水性コア領域、及びシグナルペプチダーゼにより認識されるＣ末端領域。所定のシグナルペプチドのＮ末端領域、Ｈ領域、及びＣ末端領域をどのように定義するかは、当業者には自明である。

ペプチド（またはペプチドの一部分）の「平均疎水性」により、以下の式を用いて計算されるとおりの平均疎水性を意味する：ペプチド（またはペプチドの一部分）の平均疎水性＝ペプチド（またはペプチドの一部分）の総合（合計）疎水性／ペプチド（またはペプチドの一部分）のアミノ酸数。「総合」または「合計」疎水性は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ． ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９８４）１７９：１２５−１４２．表Ｉ（１２６頁）に従って、ペプチド（またはペプチドの一部分）の各アミノ酸に正規化統一疎水性値を割り当て、次いでペプチド（またはペプチドの一部分）のアミノ酸の正規化統一疎水性値を合計することにより、計算する。いくつかの実施形態において、平均疎水性は、シグナルペプチドのＨドメインについて計算される。

「作動可能に連結した」は、そのように記載される成分が、それぞれ、それら自身の目的とする様式で機能できるような関係性にある、２つ以上の成分の並置を示す。例えば、プロモーターが、シスで作動して、連結されたコード配列の転写の制御または調節を行うならば、そのプロモーターは、コード配列と作動可能に連結している。必然ではないが、一般に、「作動可能に連結した」ＤＮＡ配列は近接しており、２つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合または分泌リーダーの場合には、近接しておりかつ読み枠内にある。しかしながら、作動可能に連結したプロモーターは、一般にコード配列の上流に位置するものの、必ずしもそれに近接してはない。作動可能に連結したエンハンサーは、コード配列の上流、配列内、または下流に位置することができ、プロモーターから相当な距離を置くことができる。連結は、当該分野で既知の組換え方法、例えば、ＰＣＲ法を用いて、アニーリングにより、または好都合な制限部位での核酸連結により、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合は、従来の慣用手段に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。

「調節エレメント」は、本明細書中使用される場合、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをポリペプチドへと転写及び翻訳するのに必要な、シスで存在するヌクレオチド配列を示す。転写調節エレメントは、通常、発現させようとする遺伝子配列のプロモーター５’、転写開始点及び終了点、ならびにポリアデニル化信号配列を含む。「転写開始点」は、一次転写物、すなわち、ｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる第一核酸に相当する構築物中の核酸を示し；転写開始点は、プロモーター配列と重なり合っていてもよい。

「プロモーター」は、自身が作動可能に連結した遺伝子または配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を示す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始のシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択した配列の発現が企図される宿主細胞の細胞型において、機能的であるだろう。多様な起原に由来する、構成的、誘導性、及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが、当該分野で既知であり（ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースで同定されており）、クローン化ポリヌクレオチドとして、またはそれに含まれるものとして、（例えば、ＡＴＣＣなどの保存機関、ならびに他の商業供給元または個別の供給元から）入手可能である。誘導型プロモーターについては、プロモーターの活性はシグナルに反応して上昇または低下する。

「宿主細胞」（または「組換え宿主細胞」）という用語は、本明細書中使用される場合、外因性ポリヌクレオチド、例えば組換えプラスミドまたはベクターの導入により、遺伝子改変されてしまった、または遺伝子改変することができる細胞を示すものとする。そのような用語は、特定の対象細胞のみを示すのではなく、そのような細胞の子孫も示すものとすることが理解されるべきである。経代していくうちに、突然変異または環境影響によるある特定の修飾が起こる可能性があるため、そうした子孫は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書中使用される場合、依然として「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

「単離された」ポリペプチド（例えば、抗体）とは、その本来の環境の成分から、同定及び分離及び／または回収されたものである。その本来の環境の夾雑成分とは、抗体としての診断または治療用途に干渉する可能性がある物質であり、そのような物質として、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を挙げることができる。好適な実施形態において、ポリペプチドは、（１）ローリー法により測定した場合に、ポリペプチドの９５重量％超、特に好ましくは９９重量％超、（２）スピニングカップ配列決定装置を用いてＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度、または（３）クーマシーブルーまたは、好ましくは銀染色を用いて還元または非還元条件下で行うＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）で均一であるまで、精製されるだろう。単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕのポリペプチドも含まれ、これは、ポリペプチドの本来の環境の成分の少なくとも１種は存在しないだろうからである。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製されるだろう。

「単離された」核酸分子とは、その核酸の本来の起原において通常はその核酸分子に付随する少なくとも１種の夾雑核酸分子から、同定及び分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は、その核酸分子が本来見いだされる形状または状況にはない。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書中同義で使用される場合に、任意の長さのヌクレオチドポリマーを示し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によりポリマーに導入することが可能な任意の置換体であることが可能である。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造に対する修飾が存在する場合、そのような修飾は、ポリマー構築の前後どちらに施されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後、標識結合などにより、さらに修飾されてもよい。他の種類の修飾として、例えば、「キャップ」、１つまたは複数の天然ヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、無電荷連結（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）及び電荷を帯びた連結（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）による修飾、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などを含有する修飾、介入物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を用いた修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）を用いた修飾、ならびに非修飾型ポリヌクレオチド（複数可）が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホナート基、ホスファート基により置換されてもよいし、標準的な保護基で保護されてもよいし、活性化してさらなるヌクレオチドとさらなる連結を形成してもよいし、固体または半固体支持体に結合させてもよい。５’末端ＯＨ及び３’末端ＯＨは、ホスホリル化することも、アミンまたは１〜２０個の炭素原子を持つ有機キャップ基部分で置換することもできる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基へ誘導体化することができる。ポリヌクレオチドは、当該分野で一般的に知られるリボースまたはデオキシリボース糖類の類似型も含有することができ、そのような類似型として、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−もしくは２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファアノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノース、キシロース、またはリキソースなど、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース、非環式類似体、及び塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなどが挙げられる。１つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替連結基で置換することができる。そうした代替連結基として、ホスファートをＰ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）で置換する実施形態が挙げられるがこれらに限定されず、式中、各ＲまたはＲ’は、独立してＨまたは置換もしくは無置換のアルキル（１−２０Ｃ）であり、このアルキルは随意にエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルを有する。ポリヌクレオチド中の連結が全て同一である必要はない。上記の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡをはじめとして、本明細書中記載される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。

「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中使用される場合、概して、短く、一般に一本鎖の、一般に合成のポリヌクレオチドを示し、このポリヌクレオチドは、一般に長さが約２００ヌクレオチド未満であるが、必ずしもそうとは限らない。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、お互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、等しく全てオリゴヌクレオチドに当てはまる。

本明細書中使用される場合、「ポリペプチド」は、概して、任意の細胞源に由来する、約１０より多いアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を示す。「異種」ポリペプチドとは、利用する宿主細胞にとって外来のポリペプチド、例えばＥ．ｃｏｌｉにより産生されるヒトタンパク質などである。異種ポリペプチドは、原核生物のものでも真核生物のものでもよいが、好ましくは、真核生物のものであり、より好ましくは哺乳類のものであり、特に好ましくはヒトのものである。好ましくは、異種ポリペプチドは、組換えで産生された、すなわち組換えポリペプチドである。「異種」ポリペプチドとは、利用する宿主細胞にとって外来のポリペプチド、例えばＥ．ｃｏｌｉにより産生されるヒトタンパク質などである。異種ポリペプチドは、原核生物のものでも真核生物のものでもよいが、好ましくは、真核生物のものであり、より好ましくは哺乳類のものであり、特に好ましくはヒトのものである。好ましくは、異種ポリペプチドは、組換えで産生された、すなわち組換えポリペプチドである。

哺乳類ポリペプチドの例として、例えば、レニンなどの分子、ヒト成長ホルモンをはじめとする成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；１−アンチトリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィルブランド因子など；抗凝固因子、例えばＣタンパク質など；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）及びその変異体、例えばＲＥＴＥＶＡＳＥ（商標）及びＴＮＫＡＳＥ（商標）；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子アルファ及びベータ；２Ｃ４などのＥｒｂＢ２ドメイン（複数可）に対する抗体（ＷＯ０１／００２４５；ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ−１２６９７）、この抗体はＥｒｂＢ２の細胞外ドメインの領域に結合する（例えば、ＥｒｂＢ２の残基２２前後〜残基５８４前後を含むその領域のいずれか１つまたは複数の残基）、エンケファリナーゼ；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；ＤＮＡ分解酵素；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；ＡまたはＤタンパク質；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ；カルジオトロフィン（心肥大因子）、例えばカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなど、ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、またはＴＧＦ−５を含む；インシュリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（Ｉ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９など；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成因子（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマなど；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦなど；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０など；抗−ＨＥＲ−２抗体；Ａｐｏ２リガンド；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳ外被の一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；抗体；ならびに上記ポリペプチドのいずれかの断片などが挙げられる。

いくつかの実施形態において、本明細書のポリペプチドとして、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２Ｃ４、組織因子、抗組織因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ−２、ヘレグリン、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、ＶＥＧＦならびにそれに対する受容体及び抗体、例えばｒｈｕＦａｂ Ｖ２及びＡＶＡＳＴＩＮ（商標）など、成長ホルモン及びその変異体、例えばｈＧＨ、成長ホルモン受容体、成長ホルモン放出タンパク質（ＧＨＲＰ）、ＬＩＶ−１（ＥＰ１，２６３，７８０）、ＴＲＡＩＬ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びそれに対する抗体、ＴＮＦ受容体及び関連抗体、ＴＮＦ−受容体−ＩｇＧ、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）及びそれらの阻害剤、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン、インターフェロン、例えばインターフェロン−ガンマなど、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−ベータなど、抗ＴＧＦ、例えば抗ＴＧＦ−ベータなど、アクチビン、インヒビン、抗アクチビン、抗インヒビン、組織−プラスミノーゲン活性化因子及びそれらの変異体、例えばｔ−ＰＡ、ＲＥＴＥＰＬＡＳＥ（商標）、及びＴＮＫアーゼなど、抗Ｆａｓ抗体、Ａｐｏ−２リガンド；Ａｐｏ−２リガンド阻害剤；Ａｐｏ−２受容体、Ａｐｏ−３、アポトーシス因子、Ｃｅｄ−４、ＤｃＲ３、細胞死受容体及びアゴニスト抗体（ＤＲ４、ＤＲ５）、リンホトキシン（ＬＴ）、プロラクチン、プロラクチン受容体、ＳＯＢタンパク質、ＷＩＳＰ（ｗｎｔ誘導型分泌タンパク質）、神経毒−３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び抗ＮＧＦ、ＤＮＡ分解酵素、肝炎抗原、単純ヘルペス抗原、レプチン、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２など、ならびにそれらの結合タンパク質及び受容体、例えばＩＧＦＢＰ−１−ＩＧＦＢＰ−６など、インシュリン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えばＦＧＦ−１７など、Ｔｏｌｌタンパク質、ＴＩＥリガンド、ＣＤ４０及び抗ＣＤ４０、イムノアドヘシン、スブチリシン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−８、ＩＬ−９、及びそれに対する抗体、ならびに前立腺特異的癌抗原（ＰＳＣＡ）が挙げられる。

特に好適なポリペプチドは、組換えポリペプチドであり、いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体及びヒト化抗体を含む抗体である。そのような抗体は、全長抗体でもよいし、抗体断片でもよい。いくつかの実施形態において、そうした抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗ｃ−ｍｅｔ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗組織因子、２Ｃ４、抗Ｈｅｒ−２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０、または抗ＣＤ１１ａ抗体である。ポリペプチドの定義に包含される抗体断片は、いくつかの実施形態において、軽鎖を含み、いくつかの実施形態において、カッパ軽鎖を含む。そのような断片の例として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、またはＦ（ａｂ’）_２−ロイシンジッパー（ＬＺ）融合物、及び一本腕抗体が挙げられる。

タンパク質「発現」は、遺伝子にコードされる情報から、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へ、そしてタンパク質への変換を示す。

「免疫複合体」（同義で、「抗体薬物複合体」、または「ＡＤＣ」とも示す）は、１種または複数の細胞障害性剤、例えば化学療法薬、薬物、増殖抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌起原、真菌起原、植物起原、または動物起原の酵素活性な毒素、あるいはそれらの断片など）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）と複合した抗体を意味する。

「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合した抗原の生物活性を阻害または低下させるものである。いくつかの実施形態において、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を完全に阻害する。

「アゴニスト抗体」は、本明細書中使用される場合、目的のポリペプチド（例えば、ＨＧＦ）の機能活性のうち少なくとも１種を模倣する抗体である。

「結合親和性」は、概して、分子（例えば、抗体）の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の全合計の強度を示す。特に記載のない限り、本明細書中使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映した固有の結合親和性を示す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。望ましくは、Ｋｄは、１×１０^−７、１×１０^−８、５×１０^−８、１×１０^−９、３×１０^−９、５×１０^−９、または１×１０^−１０でさえあり、またはそれを超える。親和性は、本明細書中開示される方法をはじめとして、当該分野で既知の一般方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、また解離しやすい傾向にあるが、高親和性抗体は、一般に、より速く抗原に結合し、もっと長く結合を保つ傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が、当該分野で既知であり、そのいずれも本発明の目的で使用することができる。具体的な例示の実施形態を以下に説明する。１つの実施形態において、本発明による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、以下のアッセイに記載されるとおり目的の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて行う放射標識化抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定され、以下のアッセイとは、未標識抗原の力価検定用系列希釈物の存在下、Ｆａｂを最小濃度の（^１２５Ｉ）標識化抗原と平衡させ、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングしたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することにより、Ｆａｂの抗原に対する溶液結合親和性を測定するものである（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３：８６５−８８１）。アッセイ用条件を確立するため、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中、捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）５μｇ／ｍｌで一晩コーティングし、続いて２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳを用いて、室温（約２３℃）で２〜５時間ブロックする。無吸着剤プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［^１２５Ｉ］抗原を、目的のＦａｂの系列希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：４５９３−４５９９における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の査定と一致）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかしながら、インキュベーションをより長く（例えば、６５時間）続けて、確実に平衡に到達させてもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移して、室温でインキュベーションする（例えば、１時間）。次いで、溶液を除去し、プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間計数する。最大結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択して、競合結合アッセイに使用する。別の実施形態によれば、ＫｄまたはＫｄ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、２５℃で、約１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイにより測定する。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、取扱説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入して、約１０反応単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。動態測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭへ）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に加えて、２５℃で、約２５μｌ／分の流速で注入する。いくつかの実施形態において、表面プラズモン共鳴アッセイ方法に以下の変更を用いる：抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定して、約４００ＲＵとし、動態測定のため、標的タンパク質の２倍系列希釈物をＰＢＳＴ緩衝液に加えて、２５℃で、約３０ｕｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を、単純１対１ラングミュラー結合モデルを用いて（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）、会合及び解離のセンサーグラムを同時に当てはめることにより、計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３：８６５−８８１を参照。オン速度が上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０^６Ｍ^−１Ｓ^−１を超える場合は、オン速度は、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを用いるＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計８０００シリーズ（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光測定機で測定されるとおりの抗原濃度を増加させながら、抗原の存在下、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）を加えたＰＢＳ（ｐＨ７．２）の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光技法（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）を用いることにより、測定することができる。

本発明による「オン速度」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋ_ｏｎ」は、上記に記載されるのと同じ表面プラズモン共鳴技法で、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、２５℃で、約１０反応単位（ＲＵ）で固定した抗原ＣＭ５チップを用いても測定することができる。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、取扱説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２ｕＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入して、約１０反応単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入に続いて、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。動態測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭへ）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に加えて、２５℃で、約２５μｌ／分の流速で注入する。いくつかの実施形態において、表面プラズモン共鳴アッセイ方法に以下の変更を用いる：抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定して、約４００ＲＵとし、動態測定のため、標的タンパク質の２倍系列希釈物をＰＢＳＴ緩衝液に加えて、２５℃で、約３０ｕｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を、単純１対１ラングミュラー結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合及び解離のセンサーグラムを同時に当てはめることにより、計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３：８６５−８８１を参照。しかしながら、オン速度が上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０^６Ｍ^−１Ｓ^−１を超える場合は、オン速度は、好ましくは、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを用いるＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計８０００シリーズ（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光測定機で測定されるとおりの抗原濃度を増加させながら、抗原の存在下、２５℃で、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）を加えたＰＢＳ（ｐＨ７．２）の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光技法（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）を用いることにより、測定することができる。

「ネイキッド抗体」とは、異種分子、例えば細胞毒性部分または放射標識と結合していない抗体である。

ある示された抗体の「生物学的特性」を有する抗体とは、その抗体を同一抗原に結合する他の抗体から区別する生物学的特性のうち１種または複数を保持する抗体である。

目的の抗体により結合される抗原のエピトープと結合する抗体を選出する目的で、常用クロスブロッキングアッセイ、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるものなどを行うことができる。

本発明のアミノ酸配列を含有する抗体またはポリペプチドの半減期を延ばすため、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、抗体（特に抗体断片）にサルベージ受容体結合エピトープを接続することができる。例えば、操作された核酸分子により発現する融合タンパク質がサルベージ受容体結合エピトープ及び本発明のポリペプチド配列を含むように、サルベージ受容体結合エピトープをコードする核酸分子を、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸に対してインフレームで連結することができる。本明細書中使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、またはＩｇＧ_４）のｉｎ ｖｉｖｏでの血清中半減期を延ばすのに貢献するＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを示す（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：７３９−７６６（２０００）、表１）。Ｆｃ領域に置換があり、血清中半減期が延びた抗体は、ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０２／０６０９１９；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１−６６０４（２００１）；Ｈｉｎｔｏｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：６２１３−６２１６（２００４））にも記載されている。別の実施形態において、血清中半減期は、例えば、他のポリペプチド配列を接続することにより延ばすこともできる。例えば、本発明の方法において有用な抗体または他のポリペプチドを、血清アルブミンが抗体またはポリペプチドと結合するように、血清アルブミンもしくはＦｃＲｎ受容体と結合する血清アルブミンの一部分または血清アルブミン結合ペプチドに接続させることができ、例えば、そのようなポリペプチド配列は、ＷＯ０１／４５７４６に開示される。１つの好適な実施形態において、接続させようとする血清アルブミンペプチドは、ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、Ｆａｂの半減期は、これらの方法により延長されている。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）も参照。

「断片」により、言及する核酸分子またはポリペプチドの完全長の、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含有する、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、２００、３００、４００、５００、６００、またはそれ以上のヌクレオチド、あるいは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００またはそれ以上のアミノ酸を含んでいてもよい。

「抗体」という用語は、本明細書中、最も広義の意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。

「抗体断片」は、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体が結合する抗原に結合するそのインタクト抗体の一部分を含む分子を示す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

参照抗体としての「同一エピトープに結合する抗体」とは、参照抗体がその抗原に結合するのを、競合アッセイにおいて、５０％以上ブロックする抗体を示し、またその逆もしかりで、参照抗体は、該抗体のその抗原への結合を、競合アッセイにおいて、５０％以上ブロックする。競合アッセイの例は、本明細書中に提示される。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の提供源または種に由来し、一方、重鎖及び／または軽鎖の残部は、異なる提供源または種に由来する、抗体を示す。

抗体の「クラス」は、抗体の重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域の種類を示す。５つの主要な抗体クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、それらのうちの複数はさらにサブクラス（アイソタイプ）に分割することができ、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２などである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書中、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するのに用いられる。この用語は、天然型配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。１つの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から始まり、カルボキシル末端まで続く。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書中特に記載がない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるとおりの、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ぶ）に従う。

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を示す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において、以下の順に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書中、同義で用いられて、天然型抗体構造と実質的に同様な構造を有する、または本明細書中定義されるとおりのＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を示す。

「ヒト抗体」とは、ヒトまたはヒト細胞により産生される抗体、あるいはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト提供源に由来する抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体についてのこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

「ヒト共通フレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選定において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選定は、可変ドメイン配列のサブグループから行われる。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるとおりのサブグループである。１つの実施形態において、ＶＬについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（上記）にあるとおりのサブグループカッパＩである。１つの実施形態において、、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（上記）にあるとおりのサブグループＩＩＩである。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を示す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、可変ドメイン中、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のものに相当し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てはヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、随意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を示す。

「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書中使用される場合、配列が超可変性である（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、及び／または構造的に定義されたループを形成する（「超可変ループ」）、及び／または抗原接触残基を含有する（「抗原接触部」）、抗体可変ドメインの領域のそれぞれを示す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含む：ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。本明細書中の代表的なＨＶＲとして、以下が挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触部（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２−７４５（１９９６））；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）の組み合わせ。
他に特に記載がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書中、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（上記）に従って番号付けされる。

「多重特異性抗体」という用語は、本明細書中、最も広義の意味で使用され、具体的には、複数のエピトープに対する特異性を有する抗体を包含する。そのような多重特異性抗体として、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位が複数のエピトープに対する特異性を有する抗体、２つ以上のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインを有し、各Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位が異なるエピトープに結合する抗体、２つ以上の単独可変ドメインを有し、各単独可変ドメインが異なるエピトープに結合する抗体、全長抗体、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなど、共有結合または非共有結合で連結されている抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「複数のエピトープに対する特異性」は、同一または異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を示す。「一特異性」は、１つのエピトープにのみ結合する能力を示す。１つの実施形態に従って、多重特異性抗体は、各エピトープに対して５μＭ〜０．００１ｐＭ、３μＭ〜０．００１ｐＭ、１μＭ〜０．００１ｐＭ、０．５μＭ〜０．００１ｐＭ、または０．１μＭ〜０．００１ｐＭの親和性で結合するＩｇＧ抗体である。

単数または複数の「一本腕抗体」という用語は、（１）ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドとペプチド結合により結合した可変ドメイン、及び（２）第二のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、ただし可変ドメインは、第二のＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドとペプチド結合により結合していない、を含む抗体を示す。１つの実施形態において、一本腕抗体は、３つのポリペプチド、（１）可変ドメイン（例えば、ＶＨ）、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む第一ポリペプチド、（２）可変ドメイン（例えば、ＶＬ）及びＣＬドメインを含む第二ポリペプチド、ならびに（３）ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む第三ポリペプチドを含む。ある実施形態において、第三ポリペプチドは、可変ドメインを含まない。別の実施形態において、一本腕抗体は、２つのシステイン残基を含有する部分ヒンジ領域を有し、２つのシステイン残基が定常重鎖を連結するジスルフィド結合を形成する。１つの実施形態において、一本腕抗体の可変ドメインは、抗原結合領域を形成する。別の実施形態において、一本腕抗体の可変ドメインは、単独可変ドメインであり、各単独可変ドメインは抗原結合領域である。

「ノブと穴（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」または「ＫｎＨ」技術は、本明細書中記載される場合、２つのポリペプチドが相互作用する界面において一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（穴）を導入することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで２つのポリペプチドが一緒になり対を形成するように仕向ける技術を示す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されてきた（例えば、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：７８１−７８８）。この技術は、多重特異性抗体の製造中に２種の異なる重鎖が一緒になり対を形成するように駆動するのに特に有用である。例えば、Ｆｃ領域にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域と連結した単独可変ドメインをさらに含むことができ、または同様なもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対を形成する異なる重鎖可変ドメインをさらに含むことができる。ＫｎＨ技術は、２つの異なる受容体細胞外ドメイン、または異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列（例えば、アフィボディ、ペプチボディ、及び他のＦｃ融合体を含む）を一緒にして対を形成させるのにも使用できる。

抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び残部の「Ｆｃ」断片が生成し、この命名は、容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１つの重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を伴った全Ｌ鎖からなる。抗体のペプシン処理は、１つの大きなＦ（ａｂ’）_２断片をもたらし、この断片は、おおまかには、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィドで連結されたＦａｂ断片に相当し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインをはじめとするさらにいくつかの残基を有する点でＦａｂ断片とは異なっている。本明細書中、定常領域のシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’については、Ｆａｂ’−ＳＨと指定する。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、最初、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片をカップリングする他の化学反応も既知である。

本明細書中使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質の結合特異性（「アドヘシン」）を、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と併せ持つ分子を指定する。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（このアミノ酸配列は抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比べて「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣＨ２及び／またはＣＨ３配列）の融合体を含む。アドヘシン配列の例として、目的のタンパク質に結合する受容体またはリガンドの一部分を含む近接アミノ酸配列が挙げられる。アドヘシン配列は、目的のタンパク質に結合する配列であるが、受容体またはリガンド配列ではない配列であることが可能である（例えば、ペプチボディのアドヘシン配列）。そのようなポリペプチド配列は、ファージディスプレイ技法及び高処理ソーティング方法をはじめとする様々な方法により選択または同定することができる。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭから得ることができる。

「ヒンジ領域」とは、抗体または半抗体の文脈において、概して、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで続くものと定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置で重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を並べることにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。

Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、通常、Ｃ末端から直ちに始まりヒンジ領域まで続く残基の並び、すなわちＦｃ領域の残基２３３〜２３９と定義される。本発明以前、ＦｃガンマＲ結合は、概して、ＩｇＧのＦｃ領域の下部ヒンジ領域中のアミノ酸残基に起因していた。

ヒトＩｇＧのＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＩｇＧの残基２３１付近から３４０付近まで続く。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対形成しない点で独特である。そうではなく、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、未変化の天然型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿置されている。この炭水化物が、ドメインドメイン対形成の代わりとなって、ＣＨ２ドメインの安定化を助けているのではないかと推測されてきた。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわちＩｇＧのアミノ酸残基３４１付近からアミノ酸残基４４７付近まで）の残基の並びを含む。

「機能的Ｆｃ領域」は、天然型配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を保持する。「エフェクター機能」の例として、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせるためにＦｃ領域を必要とし、また様々なアッセイ、例えば本明細書中の定義に開示されるとおりのアッセイを用いて査定することができる。

「天然型配列のＦｃ領域」は、自然で見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然型配列のヒトＦｃ領域として、天然型配列のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然型配列のヒトＩｇＧ２のＦｃ領域；天然型配列のヒトＩｇＧ３のＦｃ領域；及び天然型配列のヒトＩｇＧ４のＦｃ領域、ならびにそれらの天然変異型が挙げられる。

「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸置換のおかげで、天然型配列のＦｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然型配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、例えば、天然型配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に、約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。変異型Ｆｃ領域は、本明細書中、好ましくは、天然型配列のＦｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％相同性を有し、特に好ましくはそれらと少なくとも約９０％相同性を、より好ましくはそれらと少なくとも約９５％相同性を有するだろう。

「Ｆｃ複合体」は、本明細書中使用される場合、Ｆｃ領域の一緒に相互作用する２つのＣＨ２ドメイン及び／またはＦｃ領域の一緒に相互作用する２つのＣＨ３ドメインを示し、ＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメインは、ペプチド結合ではない結合及び／または力（例えば、ファン・デル・ワールス力、疎水性力、親水性力）を通じて相互作用する。

「Ｆｃ成分」は、本明細書中使用される場合、Ｆｃ領域のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメインを示す。

「Ｆｃ ＣＨ成分」または「ＦｃＣＨ」は、本明細書中使用される場合、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを示す。

本明細書中使用される場合、「抗体突然変異体」または「抗体変異体」は、種依存性抗体のアミノ酸残基の１つまたは複数が修飾されている抗体のアミノ酸配列変異体を示す。そのような突然変異体は、必ず、種依存性抗体と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。１つの実施形態において、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％の、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の、アミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するだろう。この配列に関して同一性または類似性は、本明細書中、配列を整列させ、必要があればギャップを導入して配列同一性パーセントを最大にした後の、候補配列中の、種依存性抗体の残基と同一である（すなわち同一残基）または類似する（すなわち、共通する側鎖特性に基づき同じ群に属するアミノ酸残基、以下を参照）アミノ酸残基のパーセンテージと定義される。いくつかの実施形態において、可変ドメイン外側の抗体配列への、Ｎ末端、Ｃ末端、及び内部での拡張、削除、及び挿入のどれも、配列同一性または類似性に影響を及ぼすとは解釈されるべきである。

「障害」または「疾患」とは、本発明の物質／分子または方法を用いた治療で効果が得られる可能性がある任意の状態である。この状態には、哺乳類にとって問題の障害の素因になる病理学的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患が含まれる。本明細書中治療しようとする障害の制限ではなく例として、悪性及び良性腫瘍；細胞腫、芽細胞腫、及び肉腫が挙げられる。

「治療」は、治療的処置及び予防または防止手段の両方を示す。治療を必要とする対象として、良性、前癌性、または非転移性腫瘍を既に患っている対象、ならびに癌の発症または再発を予防しようとする対象が挙げられる。

「治療上有効量」という用語は、哺乳類の疾患または障害を治療または予防するための治療薬の量を示す。癌の場合、治療薬の治療上有効量は、癌細胞の数を減少させる；原発性腫瘍の大きさを減少させる；癌細胞が周辺器官に浸潤するのを阻止する（すなわち、ある程度遅くさせる及び好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻止する（すなわち、ある程度遅くさせる及び好ましくは停止させる）；腫瘍増殖を、ある程度、阻止する；及び／または障害に関連した症状の１つまたは複数をある程度緩和する、可能性がある。薬物が既存の癌細胞の増殖を防ぐ及び／または死滅させる可能性がある限り、その薬物は、細胞分裂阻害性及び／または細胞傷害性である可能性がある。癌治療の場合、ｉｎ ｖｉｖｏでの効力は、例えば、生存期間、腫瘍増殖停止期間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、及び／または生活の質を査定することにより、測定することができる。

「自己免疫疾患」とは、本明細書中、個体自身の組織から発生した、個体自身の組織に対して向けられた非悪性疾患または障害である。自己免疫疾患は、本明細書中、具体的には、悪性または癌性の疾患または症状を除外し、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、及び慢性骨髄芽球性白血病を除外する。自己免疫疾患または障害の例として、炎症性反応、例えば乾癬及び皮膚炎をはじめとする炎症性皮膚疾患など（例えばアトピー性皮膚炎）；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患に関連した反応（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；呼吸促迫症候群（成人呼吸促迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ぶどう膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹及び喘息などのアレルギー性症状ならびにＴ細胞の浸潤及び慢性炎症性反応が関与する他の症状；粥状動脈硬化；白血球粘着不全；リウマチ様関節炎；全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；真性糖尿病（例えばＩ型真性糖尿病またはインシュリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー病；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年発症糖尿病；ならびに、典型的には、結核、類肉腫症、多発性筋炎、肉芽腫症、及び血管炎で見られる、サイトカイン及びＴリンパ球が介在する急性及び遅発型過敏症に関連した免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外漏出が関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症またはクームズ陽性貧血が挙げられるが、これらに限定されない）；重症筋無力症；抗原抗体複合体性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート・イートン筋無力症症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌不全症；ライター病；全身硬直症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎障害；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または自己免疫性血小板減少症などが挙げられるが、これらに限定されない。

「癌」及び「癌性」という用語は、無制御の細胞増殖を典型的な特徴とする哺乳類の生理的状態を示す、またはそのような状態を説明する。この定義に含まれるものは、良性及び悪性の癌である。「初期癌」または「初期腫瘍」により、浸潤性でも転移性でもない癌を意味する、またはステージ０、Ｉ、もしくはＩＩの癌として分類される。癌の例として、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫及び滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリン産生腫瘍、及び膵島細胞癌を含む）、中皮腫、シュワン細胞腫（聴神経腫瘍を含む）、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病またはリンパ系腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例として、扁平細胞癌（例えば上皮性扁平細胞癌）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、及び肺扁平上皮細胞腫を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または消化管癌を含む胃癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌（転移性乳癌を含む）、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮細胞腫、唾液腺細胞腫、腎臓または腎性癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、ならびに頭頸部癌及び多発性骨髄腫が挙げられる。

「前癌性」という用語は、典型的には癌に進行するまたは癌を発症する状態または増殖を示す。「前癌性」増殖は、異常な細胞周期制御、増殖、または分化を特長とする細胞を有するだろうし、細胞周期制御、細胞増殖、または分化のマーカーにより判定することができる。

「異形成」により、組織、器官、または細胞の任意の異常な増殖または発達を意味する。好ましくは、異形成は、高悪性度または前癌性である。

「転移」により、癌が、体内でその原発部位から他の場所へと拡散することを意味する。癌細胞は、原発性腫瘍から離脱して、リンパ管及び血管に侵入し、血流に乗って循環し、遠く離れた体内のどこかの正常組織で増殖する（転移する）ことができる。転移は、局所的または遠隔的であり得る。転移は、逐次過程であり、原発性腫瘍から離脱して、血流に乗って循環し、遠い部位で停止する腫瘍細胞次第である。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立させ、命に関わる塊を形成するように増殖できる。

腫瘍細胞内の刺激性及び抑制性分子経路の両方が、この挙動を制御するが、遠い部位での腫瘍細胞と宿主細胞の相互作用もまた重要である。

「非転移性」により、良性であるか、または原発部位にとどまっており、リンパ管もしくは血管系または原発部位以外の組織にまだ侵入していない癌を意味する。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ、またはＩＩであるいずれかの癌であり、場合によっては、ステージＩＩＩの癌である。

「原発性腫瘍」または「原発性癌」により、起原となる癌であって、対象の体内の別の組織、器官、または場所にある転移性病変ではないことを意味する。

「良性腫瘍」または「良性癌」により、起原となる場所に局在したままで、遠い部位に浸潤する、侵入する、または転移する能力を有さない腫瘍を意味する。

「腫瘍負荷」により、体内の、癌細胞数、腫瘍の大きさ、または癌の量を意味する。腫瘍負荷は、腫瘍量とも称する。

「腫瘍数」により、腫瘍の個数を意味する。

「対象」により、哺乳類を意味し、哺乳類として、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、対象はヒトである。

「抗癌治療」という用語は、癌を治療するのに有用な療法を示す。抗癌治療薬の例として、例えば、化学療法薬、増殖抑制剤、細胞障害性剤、放射線療法に使用される作用剤、抗血管新生剤、アポトーシス作用剤、抗チューブリン剤、及び他の癌治療作用剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、もしくはＶＥＧＦ受容体（複数可）の１種または複数と結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生体活性及び有機化学作用剤などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの併用もまた、本発明に含まれる。

「細胞障害性剤」という用語は、本明細書中使用される場合、細胞の機能を阻害または阻止する及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を示す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、及びＲｅ^１８６）、化学療法薬、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物、もしくは動物起原の酵素活性な毒素、またはその断片を含むものとする。

「化学療法薬」とは、癌の治療に有用な化学合成品である。化学療法薬の例として、癌の治療に有用な化学合成品が挙げられる。化学療法薬の例として、アルキル化剤、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなど；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなど；エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミンなど；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体のトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（その合成類似体であるアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシンを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体のＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、メクロルエタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなど；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質など（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）；ジネミシン、例えばジネミシンＡなど；ビスホスホネート、例えばクロドロネートなど；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣなど、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎作用剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフオルニチン；酢酸エリプチニウム；エポシロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモフォールフリー、パクリタキセルのアルブミン結合ナノ粒子配合物（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈoｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）など；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンを５−ＦＵ及びロイコボリンと併用する治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸など；カペシタビン；コンブレタスタチン；ＶＥＬＣＡＤＥすなわちボルテゾミブ；ＲＥＶＬＩＭＩＤすなわちレナリドミド；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン、オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含む；細胞増殖を減少させる、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標）））、及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかのものの薬学上許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。

同じくこの定義に含まれるのは、腫瘍でのホルモン作用を制御または抑制する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体修飾剤（ＳＥＲＭ）であり、そのような抗ホルモン剤として、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン；副腎でのエストロゲン産生を制御する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなど；及び抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなど；ならびに、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、接着細胞増殖に関与するシグナル伝達経路において遺伝子発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、及びＨ−Ｒａｓなど；リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）リボザイム）、及びＨＥＲ２発現阻害剤など；ワクチン、例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン、及びエスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照）、ならびに上記のもののいずれかの薬学上許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。

「プロドラッグ」という用語は、本明細書中で使用される場合、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低下しており、酵素の作用により活性化またはより活性な親の形に変換されることが可能な、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体型を示す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）及びＳｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照。本発明のプロドラッグとして、より活性の高い細胞傷害性遊離薬物に変換することが可能な、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、随意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは随意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するためにプロドラッグ形に誘導体化することが可能な細胞障害性薬の例として、上記の化学療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。

「放射線療法」により、細胞の正常機能能力を制限するまたは細胞を完全に破壊するために、定方向ガンマ線またはベータ線を使用して細胞に十分な損傷を引き起こすことを意味する。当然のことながら、治療の線量及び期間を決定する方法は、当該分野で多数知られている。典型的な治療は、１回投与として与えられ、典型的な線量は、１日あたり１０〜２００単位（グレイ）の範囲である。

「生物学的に活性な」または「機能性」ポリペプチド（異種ポリペプチドなど）とは、構造、調節、生化学的、または生物物理学的事象において、その本来の活性のうち１つまたは複数を発揮することができるものである。

「生物学的に活性な」または「機能性」抗体とは、構造、調節、生化学的、または生物物理学的事象において、その本来の活性のうち１つまたは複数を発揮することができるものである。例えば、生物学的に活性な抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有していてもよく、その結合が、次いで、細胞または分子事象、例えばシグナル伝達または酵素活性などを誘発または改変してもよい。生物学的に活性な抗体はまた、受容体のリガンド活性化を遮断してもよいし、アゴニスト抗体として作用してもよい。抗体が持つ、その本来の活性のうち１つまたは複数を発揮する能力は、ポリペプチド鎖の適切な折り畳み及び構築をはじめとする複数の要因に依存する。

本発明の組成物及びそれを用いた方法
本明細書中提供するのは、例えば、異種ポリペプチド（例えば、抗体、例えば、全長抗体）の製造方法に適した、シグナルペプチド、及び変異型シグナルペプチドを用いた方法である。シグナルペプチドを特性決定する方法は、当該分野で既知である。１つの図式において、シグナルペプチドは、一般的に３つの異なる領域から構成される：１つまたは２つの正電荷を帯びたアミノ酸残基を含有するＮ末端領域、Ｈ領域と称する（Ｈドメインとも呼ぶ）ことの多い疎水性コア領域、及びシグナルペプチダーゼにより認識されるＣ末端領域である。いくつかの実施形態において、Ｈ領域は、長さが約１０〜１６残基である。シグナルペプチドの疎水性は、アイゼンベルグ尺度を用いて計算してもよい。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ． ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９８４）１７９：１２５−１４２を参照。簡単に述べると、各アミノ酸に、正規化された統一疎水性値を割り当てる（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．上記、表Ｉ（１２６頁）を参照）。シグナルペプチドの各アミノ酸の統一疎水性値（または、例えば、Ｈ領域の総合疎水性値を計算するために、Ｈ領域の各アミノ酸の統一疎水性値）を合計することで、合計疎水性（総合疎水性とも呼ぶ）を計算する。平均疎水性は、以下の式を用いて計算する：平均疎水性＝総合（合計）疎水性／アミノ酸の数。いくつかの実施形態において、全シグナルペプチドの平均疎水性が計算される。いくつかの実施形態において、Ｈ領域（Ｈドメインとも呼ぶ）の平均疎水性が計算される。

シグナルペプチド配列の突然変異は、当該分野で既知の方法を用いて行ってもよい。この様式でＤＮＡを遺伝子修飾する技法は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｅｄ．，（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．（１９９１）に総説が記載されており、そのような技法として、例えば、部位特異的突然変異誘発、カセット変異導入法、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発が挙げられる。突然変異誘発の他の方法として、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発及び重複伸長ＰＣＲが挙げられる。

別の態様において、提供されるのは、例えば、本発明の方法のいずれか、例えば、異種ポリペプチド（例えば、抗体）を作るための、細胞から異種ポリペプチドを分泌させるための、可溶性異種ポリペプチドを作るための、可溶性異種ポリペプチドをペリプラズムに分泌させるための、成熟異種ポリペプチドを作るための、成熟異種ポリペプチドをペリプラズムに分泌させるための、異種ポリペプチドを移動させるための、異種ポリペプチドの分泌を最適化するための方法において使用するための、ＤｓｂＡシグナルペプチドより高い平均疎水性（例えば、Ｈ領域の平均疎水性、または全シグナルペプチドの平均疎水性）を持つシグナルペプチドの使用である。ＤｓｂＡより高い平均疎水性を有するシグナルペプチドの例として以下が挙げられる：ＦｌｇＩ、ＮｉｋＡ、ＡｓｍＡ、ＴｏｌＢ、ＹｒａＩ、ＦｅｃＢ、ＣｅｍＨ、ＴｒｅＡ、ＦｏｃＣ、ＴｒａＵ、ＳｆｍＬ、ＴｏｒＴ、ＳｆｍＣ。

いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５超である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．６超である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．７超である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７、またはそれより高い。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．６超である。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．７超である。いくつかの実施形態において、第二シグナルペプチドの平均疎水性は、約０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７、またはそれより高い。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドと第二シグナルペプチドの平均疎水性は、同様である（例えば、ほぼ等しい）。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドと第二シグナルペプチドの平均疎水性は、異なっている。

ＤｓｂＡシグナルペプチド及びＳＴＩＩシグナルペプチドは、当該分野で周知である。ＤｓｂＡシグナルペプチド及びＳＴＩＩシグナルペプチドの配列を、表７及び表８に示す。ＤｓｂＡ及びＳＴＩＩのＮ末端領域、Ｈ領域、及びＣ末端領域の配列を、表７及び表８に示す。

異種ポリペプチドの産生及び分泌を特性決定する方法は、当該分野で既知であり、その方法のいくつかを、本明細書中で説明及び例示する。例えば、異種タンパク質（例えば、抗体）と作動可能に連結した変異型シグナルペプチドをコードする発現ベクター（複数可）を抱える宿主株を培養し、ポリペプチドを抽出する。可溶性画分を非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動で分離し、続いてウエスタンブロット分析により、産生された全長異種タンパク質のレベルを測定する。成熟ポリペプチド対前駆ポリペプチドの有無またはレベルは、当該分野で既知であるとおり、例えば、ウエスタンブロットゲル上のバンドから単離されたタンパク質のＥｄｍａｎ配列決定、及び単離されたポリペプチドのシグナルペプチドを有するか欠いているかについての特性決定により判定してもよい。完全抗体（または、例えば、他のヘテロ多量体タンパク質）の産生は、変性条件下でウエスタンブロットを実行することにより判定してもよい。異種ポリペプチド（例えば、抗体）の活性は、当該分野で既知であるとおり、常用の機能アッセイを用いて判定してもよい。タンパク質の機能は、適切な機能アッセイを用いて判定してもよい。例えば、結合活性を、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、及び当該分野で周知である他の方法を用いて、試験してもよい。他の機能は、特定の異種ポリペプチドに適切なように、当該分野で周知であるアッセイを用いて試験してもよい。

翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、タンパク質の全体の翻訳レベルの主要な決定要因である。ＴＩＲは、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含み、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列のすぐ上流からに始まって開始コドンの約２０ヌクレオチド下流まで続く。このポリヌクレオチド配列の修飾（いくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードする配列の最初の約２〜約１４、約４〜１２、約６コドン内の修飾）は、翻訳開始の効率を改変し、それにより下流タンパク質の翻訳レベルを調節することができる。ＴＩＲは、様々な翻訳強度を有する。いくつかの実施形態において、第一及び第二の翻訳開始領域（例えば、第一及び第二の異種ポリペプチドと作動可能に連結している）（ならびに、いくつかの実施形態において、例えば、第三異種ポリペプチドと作動可能に連結している、第三翻訳開始領域）は、ほぼ等しい翻訳強度を提供する。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、約１または２である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、約１である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、約２である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、１及び／または２である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、約３または約４である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、１、２、３、４、５、またはそれ以上（例えば６または７またはそれ以上）のうちの１つまたは複数から選択される。いくつかの実施形態において、第一及び第二のＴＩＲの相対翻訳強度は、約１である。いくつかの実施形態において、第一及び第二のＴＩＲの相対翻訳強度（ＴＩＲ強度とも呼ぶ）は、約２である。いくつかの実施形態において第一、第二、及び第三のＴＩＲの相対翻訳強度は、約１である。いくつかの実施形態において第一、第二、及び第三のＴＩＲの相対翻訳強度は、約２である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、約２、約３、およそ４、約５、約６、約７、またはそれ以上、例えば、約８、約９、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、または６〜８である。いくつかの実施形態において、相対翻訳強度は、２〜５、３〜７、または４〜８である。いくつかの実施形態において、第一及び／または第二シグナルペプチドの相対翻訳強度は、約１、約２、約３、約４、約５、およそ６、約７、または約８である。いくつかの実施形態において、第一シグナルペプチドの相対翻訳強度は約５であり、かつ第二シグナル配列の相対翻訳強度は約８である。いくつかの実施形態において、第一と第二のＴＩＲの相対翻訳強度は、ほぼ等しい。いくつかの実施形態において、第一と第二のＴＩＲの相対翻訳強度は、異なっている。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチド（変異型シグナルペプチドなど）をコードするポリヌクレオチドは、目的の遺伝子を発現するのに適切なエレメントを持つベクターに挿入されているだろう。いくつかの実施形態において、ベクターは、シグナル配列の５’にあるプロモーター、目的の遺伝子またはレポーター遺伝子を挿入するためのシグナル配列の３’にある制限酵素認識部位、及び得られるプラスミドで形質転換された細菌の選択及び／または維持のための選択性マーカー、例えば薬物耐性マーカーを含む。プラスミドベクターについては、本明細書中でさらに説明及び例示する。原核生物宿主で用いるのに適したプロモーターは、当該分野で既知であり、そのいくつかを本明細書中で説明及び例示する。

ある様式で定量することが可能であればどのようなレポーター遺伝子を用いてもよい。したがって、例えば、アルカリホスファターゼ産生を、ｐｈｏＡ遺伝子産物の分泌レベルの尺度として定量することができる。他の例として、例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。

ポリペプチドの分泌レベルは、例えば、目的のポリペプチド用の機能アッセイ、利用可能であれば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、またはＰＡＧＥ及び目的のポリペプチドの正確な分子量の視覚化により、測定することができる。分泌されたポリペプチドのレベルを測定する方法は、当該分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中で例示する。

ポリペプチド
異種ポリペプチドの例として、膜貫通分子（例えば、受容体チロシンキナーゼなどの受容体）または増殖因子などのリガンドが挙げられる。異種ポリペプチドの例として、分子、例えばレニンなど；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンをはじめとする成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォン・ヴィルブランド因子など；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃなど；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）など；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（正常Ｔ細胞の活性化で制御され、発現し、分泌される物質）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼなど；ＤＮＡ分解酵素；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４など；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）など、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−βなど；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、例えばａＦＧＦ及びｂＦＧＦなど；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファ、及びＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５をはじめとするＴＧＦ−ベータなど；インシュリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様増殖因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ４０など；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦなど；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０など；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊加速因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳ外被の一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体など；及び上記のポリペプチドのいずれかの断片が挙げられる。

イムノアドヘシンは、本発明による異種ポリペプチドとして、明確に企図される。

抗体
抗体またはヘテロ多量体ポリペプチドまたはポリペプチドまたはイムノアドヘシンの標的の例として、以下の一覧が挙げられるが、それらに限定されない：ＢＭＰＩ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦＩ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡＩ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢＩ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬＩ、ＦＥＬＩ（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬＩ（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−ａ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１Ｉ（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬＩＲ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬＩＯＲＡ、ＩＬＩＯＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦＩ、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、ＴＨＰＯ、ＣＣＬＩ（Ｉ−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−ｌａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−ｌｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬＨ（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−ｌｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−Ｉ）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−ｌｂ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＩ／ＣＫＲ−ＬＩ）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬＩ（ＶＳＨＫＩ）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）、ＣＭＫＬＲＩ、ＣＭＫＯＲＩ（ＲＤＣＩ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰＩＯ、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦＩＡ、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭＩ、ＴＲＥＭ２、ＶＨＬ、ＡＢＣＦＩ；ＡＣＶＲＩ；ＡＣＶＲＩＢ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬＩ；ＡＤ０ＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦＩ；ＡＩＧＩ；ＡＫＡＰＩ；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴＩ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣＩ；ＡＲ；ＡＺＧＰＩ（亜鉛−ａ−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＡＧＩ；ＢＡＨ；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰＩ；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦＩＯ）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲＩＡ；ＢＭＰＲＩＢ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧＩ（プレクチン）；ＢＲＣＡＩ；Ｃ１９ｏｒｆｌＯ（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴＩ；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶＩ；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬＩ（１−３０９）；ＣＣＬＩＩ（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭｌＰ−ｌｄ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ−２）；ＳＬＣ；エクソダス−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−Ｉ）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ−ｌａ）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ−ｌｂ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡＩ；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤＩ；ＣＣＮＥＩ；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲＩ／ＣＫＲ−ＬＩ）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬＩ（ＶＳＨＫＩ）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤＩＣ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨＩ（Ｅ−カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮＩＡ（ｐ２１Ｗａｐｌ／Ｃｉｐｌ）；ＣＤＫＮＩＢ（ｐ２７Ｋｉｐｌ）；ＣＤＫＮＩＣ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲＩ；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン−７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲＩ；ＣＭＫＯＲＩ（ＲＤＣＩ）；ＣＮＲＩ；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬＩＡＩ；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢＩ（ｂ−カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬＩＩ（ｌ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２、（ＧＲ０２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣＩ；ＣＹＳＬＴＲＩ；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１ Ｊ０１ １８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦＩ；ＥＤＧＩ；ＥＦＮＡＩ；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮ０１；ＥＮ０２；ＥＮ０３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲＩ；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲＩＡ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦＩ（ａＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬＩ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬＩ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴＩ；ＦＯＳ；ＦＯＳＬＩ（ＦＲＡ−Ｉ）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢＩ；ＧＡＧＥＣＩ；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴ Ａ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲＩＯ）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣＩＯ（ＣＩＯ）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰＩ；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦＩＡ；ＨＤＰＩ；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；ＩＤ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡＩ；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷＩ；ＩＧＢＰＩ；ＩＧＦＩ；ＩＧＦＩＲ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−Ｉ；ＩＬ１０；ＭＯＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹＩ；
ＩＬ１Ｒｌ；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫＩ；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡＩ；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧＩ；ＪＡＫＩ；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＮ；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧまたはＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＩＢＩ；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン−ｌｌｌ）；ＭＴＳＳＩ；ＭＵＣＩ（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹＤ８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢＩ；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ；ＮＭＥＩ（ＮＭ２３Ａ）；Ｎ０Ｘ５；ＮＰＰＢ；ＮＲＯＢＩ；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲＩＤＩ；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１Ｉ２；ＮＲ１Ｉ３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰＩ；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤＩ；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴＩ；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤＧＦＡ；ＰＤＧＦＢ；ＰＥＣＡＭＩ；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣＩ；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦＩＩＯ（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢ０２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡＩ；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥＩ（ＰＡＩ−Ｉ）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲＩＢ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＤＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＩＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲＩＯ；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦＩＡ；ＴＮＦＲＳＦＩＢ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦＩＯ（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦＩ１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭＩ；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦＩ；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭＩ；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬＣ５；ＶＬＡ−４；ＸＣＬＩ（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−ｌｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹＩ；及びＺＦＰＭ２。

いくつかの実施形態において、標的として、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４など；ＣＤ６４、ＣＤ２００、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体など；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｄ、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファまたはベータサブユニットいずれかを含むアルファｖ／ベータ３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）など；増殖因子、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃなど；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファｌＦＮ）；ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩｇＥなど；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、タンパク質Ｃなど、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）−１またはＬＲＰ−８またはトランスフェリン受容体、ならびに以下１）ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、２）アルファ−セクレターゼ、３）ガンマ−セクレターゼ、４）タウ−セクレターゼ、５）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６）細胞死受容体６（ＤＲ６）、７）アミロイドベータペプチド、８）アルファ−シヌクレイン、９）パーキン、１０）ハンチンチン、１１）ｐ７５ＮＴＲ、及び１２）カスパーゼ−６からなる群より選択される少なくとも１種の標的、が挙げられる。

抗体（例えば、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体）は、少なくとも２種の標的分子、例えば、以下からなる群より選択される少なくとも２種の標的分子に結合してもよいことが理解される：ＩＬ−１アルファとＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２とＩＬ−１８；ＩＬ−１３とＩＬ−９；ＩＬ−１３とＩＬ−４；ＩＬ−１３とＩＬ−５；ＩＬ−５とＩＬ−４；ＩＬ−１３とＩＬ−１ベータ；ＩＬ−１３とＩＬ−２５；ＩＬ−１３とＴＡＲＣ；ＩＬ−１３とＭＤＣ；ＩＬ−１３とＭＥＦ；ＩＬ−１３とＴＧＦ−β；ＩＬ−１３とＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２とＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３とＣＬ２５；ＩＬ−１３とＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３とＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３とＡＤＡＭ８、ＩＬ−１３とＰＥＤ２、ＩＬ１７ＡとＩＬ１７Ｆ、ＣＤ３とＣＤ１９、ＣＤ１３８とＣＤ２０；ＣＤ１３８とＣＤ４０；ＣＤ１９とＣＤ２０；ＣＤ２０とＣＤ３；ＣＤ３８とＣＤ１３８；ＣＤ３８とＣＤ２０；ＣＤ３８とＣＤ４０；ＣＤ４０とＣＤ２０；ＣＤ−８とＩＬ−６；ＣＤ２０とＢＲ３、ＴＮＦアルファとＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦアルファとＩＬ−１ベータ；ＴＮＦアルファとＩＬ−２、ＴＮＦアルファとＩＬ−３、ＴＮＦアルファとＩＬ−４、ＴＮＦアルファとＩＬ−５、ＴＮＦアルファとＩＬ６、ＴＮＦアルファとＩＬ８、ＴＮＦアルファとＩＬ−９、ＴＮＦアルファとＩＬ−１０、ＴＮＦアルファとＩＬ−１１、ＴＮＦアルファとＩＬ−１２、ＴＮＦアルファとＩＬ−１３、ＴＮＦアルファとＩＬ−１４、ＴＮＦアルファとＩＬ−１５、ＴＮＦアルファとＩＬ−１６、ＴＮＦアルファとＩＬ−１７、ＴＮＦアルファとＩＬ−１８、ＴＮＦアルファとＩＬ−１９、ＴＮＦアルファとＩＬ−２０、ＴＮＦアルファとＩＬ−２３、ＴＮＦアルファとＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファとＣＤ４、ＴＮＦアルファとＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファとＭＩＦ、ＴＮＦアルファとＩＣＡＭ−１、ＴＮＦアルファとＰＧＥ４、ＴＮＦアルファとＰＥＧ２、ＴＮＦアルファとＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファとＴｅ３８；ＴＮＦアルファとＢＡＦＦ；ＴＮＦアルファとＣＤ２２；ＴＮＦアルファとＣＴＬＡ−４；ＴＮＦアルファとＧＰ１３０；ＴＮＦａとＩＬ−１２ｐ４０；ＶＥＧＦとＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡとＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡとＰＤＧＦ、ＨＥＲ１とＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２とＤＲ５、ＶＥＧＦとＩＬ−８、ＶＥＧＦとＭＥＴ、ＶＥＧＦＲとＭＥＴ受容体、ＶＥＧＦＲとＥＧＦＲ、ＨＥＲ２とＣＤ６４、ＨＥＲ２とＣＤ３、ＨＥＲ２とＣＤ１６、ＨＥＲ２とＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲＩ）とＨＥＲ２、ＥＧＦＲとＨＥＲ３、ＥＧＦＲとＨＥＲ４、ＩＬ−１３とＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４とＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１とＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１とＩＬ−６Ｒ及びＴＮＦＲ１とＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭとＣＤ３、ＭＡＰＧとＣＤ２８、ＥＧＦＲとＣＤ６４、ＣＳＰＧとＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ−４とＢＴＮ０２；ＩＧＦ１とＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２とＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧとＲＧＭ Ａ；ＮｇＲとＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡとＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐとＲＧＭ Ａ；ＰＤＬ−ＩとＣＴＬＡ−４；及びＲＧＭ ＡとＲＧＭ Ｂ。

いくつかの実施形態において、標的は、抗ＶＥＧＦ、抗ｃ−ｍｅｔ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ４０、抗組織因子（ＴＦ）、抗ＨＥＲ２、及び抗ＴｒｋＣ抗体である。非ポリペプチド抗原（腫瘍関連糖脂質抗原など）に対する抗体もまた、企図されている。本発明が包含する抗体の標的のさらなる例として、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、及びＣＤ４６など；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体など；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、及びαまたはβサブユニットいずれかを含むαｖ／β３インテグリン（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）など；増殖因子、例えばＶＥＧＦなど；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β、アルファインターフェロン（α−ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８など；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、細胞死受容体；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；タンパク質Ｃなどが挙げられる。二重特異性抗体は、本発明により明確に企図される。

１つの実施形態において、抗体（複数可）、例えば、本明細書中の方法で使用される抗体（複数可）は、以下の第１〜６節に記載されるとおりの特長をいずれも、単独でまたは組み合わせて取り入れてよい：

１．抗体断片
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、一本腕抗体、ならびに以下に記載される他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９−１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ． １１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照；同じく、ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みｉｎ ｖｉｖｏ半減期の長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。

ダイアボディは、二価であっても二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を持つ抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディについても、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。

単独ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全体もしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態において、単独ドメイン抗体は、ヒト単独ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。

一本腕抗体（すなわち、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、単独抗原結合腕を形成する）は、例えば、ＷＯ２００５／０６３８１６；Ｍａｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００６），１２：６１４４に開示される。アンタゴニスト機能を必要とする病態の治療に関して、及び抗体の二価性が望ましくないアゴニスト効果をもたらす場合に、一本腕抗体（すなわち、単独抗原結合腕を有する抗体）の一価という特性は、抗体の標的分子との結合に際してアンタゴニスト機能をもたらす及び／またはそのような機能を確実にする。そのうえさらに、Ｆｃ領域を含む一本腕抗体は、同様な／実質的に同一の抗原結合特性を有するＦａｂ型よりも優れた薬物動態特質（ｉｎ ｖｉｖｏでの、向上した半減期及び／または排出速度の低下など）を特長とし、したがって従来の一価Ｆａｂ抗体の使用における主要な欠点を克服する。一本腕抗体を作る技法として、「ノブと穴」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が挙げられるが、これに限定されない。オナルツズマブは、一本腕抗体の例である。

抗体断片は、様々な技法で作ることができ、そのような技法として、本明細書中記載されるとおり、インタクト抗体のタンパク質消化、ならびに組換え宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生が挙げられるが、これらに限定されない。

２．キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。１つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものと異なるクラスまたはサブクラスに変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、キメラ抗体の抗原結合断片も含まれる。

ある特定の実施形態において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒト化されて、ヒトに対する免疫原性が低下しており、その一方で親の非ヒト抗体が持つ特異性及び親和性を維持している。一般に、ヒト化抗体は、１つまたは複数の可変ドメインを有し、可変ドメインにおいて、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部分）は、非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、随意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むだろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来元である抗体）由来の該当する残基で置換されて、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善させる。

ヒト化抗体及びその作成方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９−１６３３（２００８）に総説が記載されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト法を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再処理法（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフル法」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフル法に対して「誘導選択」アプローチを記載）に記載されている。

ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域として、以下が挙げられるが、それらに限定されない：「ベストフィット」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体共通配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞的に変異された）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９−１６３３（２００８）を参照）；ならびにＦＲライブラリーをスクリーニングすることに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照）。

３．ヒト抗体
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で既知の様々な技法を用いて製造することができる。ヒト抗体については、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０：４５０−４５９（２００８）に総合的な記載がある。

ヒト抗体は、抗原負荷に反応して未変化ヒト抗体またはヒト可変領域を持つインタクト抗体を産生するように修飾された遺伝子導入動物に、免疫原を投与することにより製造することができる。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有し、この遺伝子座は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えているか、あるいは動物の染色体外に存在するまたは染色体中に無作為に組み込まれている。そのような遺伝子導入マウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、概して遺伝子的に不活性化されている。遺伝子導入動物からヒト抗体を得る方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号、及び同第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号も参照。そのような動物により生成されるインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾してもよい。

ヒト抗体はまた、ハイブリドーマを利用した方法により作ることもできる。ヒトモノクローナル抗体産生用のヒト骨髄腫及びマウスヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ． ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成させたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法として、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びＮｉ， Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載される。

ヒト抗体はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成させてもよい。そのような可変ドメイン配列を、次いで、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する技法を、以下に記載する。

４．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の１種の活性または複数の活性を持つ抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を保有する抗体についてそのライブラリーをスクリーニングする様々な方法が、当該分野で既知である。そうした方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に総説が記載されており、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ， ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。

Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるとおり、ある特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により別々にクローン化されて、ファージライブラリー中で無作為に組換えられ、次いで、それらを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片としてまたはＦａｂ断片としていずれかで、抗体断片を表示する。免疫化された抗体源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原に対して高い親和性の抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ， １２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるとおり、ナイーブレパートリーをクローン化（例えば、ヒトから）して、どのような免疫化もせずに幅広い非自己及び自己抗原に対する抗体の単独抗体源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるとおり、ナイーブライブラリーは、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローン化し、超可変性ＣＤＲ３領域をコードするための及びｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列を達成するためのランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いることにより、合成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報として、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書中、ヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。

５．多重特異性抗体
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の１つは、ｃ−ｍｅｔに対するものであり、その他は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ｃ−ｍｅｔの２つの異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体はまた、ｃ−ｍｅｔを発現する細胞に細胞障害性剤を局在させるのにも使用することができる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。

多重特異性抗体を作る技法として、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３６５５（１９９１）を参照）、及び「ノブと穴」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作るために静電ステアリング効果を操作することにより（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ以上の抗体または断片を架橋することにより（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５）を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を製造することにより（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）；二重特異性抗体断片を作るための「ダイアボディ」技術を使用して（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することにより（例えばＧｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；ならびに、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）に記載されるとおり、三重特異性抗体を調製することにより、作ることもできる。

「オクトパス抗体」をはじめとする３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えばＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照）。

本明細書中の抗体または断片には、ｃ−ｍｅｔならびに別の異なる抗原、例えばＥＧＦＲに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」すなわち「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照）。

二重特異性抗体を作る方法は、当該分野で既知である。従来、二重特異性抗体の組換え製造は、２本の重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖軽鎖対の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為分類のおかげで、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、そのうちの１種のみが、正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、非常に厄介で、製造収率は低い。同様な手順が、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．， １０：３６５５（１９９１）に開示される。

異なる、そしてもっと好適なアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を持つ抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。融合は、好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインで起こる。軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合体の少なくとも１つに存在していることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時形質移入する。これにより、構築に用いられる３つのポリペプチド鎖の比率が均等でないことで最適収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調節する大幅な柔軟性が得られる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖が等比で発現することが高収率をもたらす場合または比率が特に重要ではない場合に、１つの発現ベクターに２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。

このアプローチの好適な実施形態において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を一方の腕に持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖軽鎖対（第二の結合特性を提供する）で構成される。二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することが分離を手軽にする方法を提供することから、この非対称構造は、所望の二重特異性化合物を、望まない免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離しやすくすることがわかった。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照。

別のアプローチによれば、対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化することができる。好適な界面は、抗体定常ドメインのＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面から１つまたは複数の小アミノ酸側鎖を、それより大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）（ノブまたは隆起）に置き換える。この大きな側鎖（複数可）と同一または同様な大きさを持つ代償的「空洞」（穴）を、第二抗体分子の界面に、大きなアミノ酸側鎖をそれより小さいもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることにより、作成する。これにより、他の望まない最終生成物、例えばホモ二量体よりもヘテロ二量体の収率を高める機構が得られる。ノブと穴について、本明細書中さらに説明する。

６．抗体変異体
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体のアミノ酸配列変異体も企図されている。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的性質を改善することが望ましいかもしれない。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により、製造されてもよい。そのような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列から残基を削除、及び／または抗体のアミノ酸配列に残基を挿入、及び／または抗体のアミノ酸配列内で残基を置換することが挙げられる。削除、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができるが、ただし、最終構築物は、所望の特性、例えば、抗原結合性を保持するものである。

ある特定の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換による変異誘発の目的部位として、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入してもよく、生成物を、所望の活性、例えば、抗原結合性が保持／改善されているか、免疫原性が低下しているか、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣが改善されているかについてスクリーニングしてもよい。

置換変異体の種類の１つは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換が関与する。一般に、得られた変異体（複数可）でさらなる試験のために選択されたものは、親抗体に比べてある特定の生物学的性質に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）を有しているだろう、及び／または親抗体のある特定の生物学的性質を実質的に保持するだろう。置換変異体の例は、親和性成熟した抗体であり、この抗体は、例えば、ファージディスプレイを利用した親和性成熟技法、例えば本明細書中記載されるものなどを用いて、都合よく生成することもできる。簡単に述べると、１つまたは複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージで表示させ、特定の生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。

アミノ酸配列挿入物として、長さが残基１つから１００以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ及び／またはカルボキシル末端融合物、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入物が挙げられる。末端挿入物の例として、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体として、抗体のＮまたはＣ末端に、抗体の血清中半減期を延ばす酵素（例えばＡＤＥＰＴに対する）またはポリペプチドが融合したものが挙げられる。

ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、改変されることにより、抗体がグリコシル化される度合いが拡大または縮小されている。抗体にグリコシル化部位を付加または削除することは、１つまたは複数のグリコシル化部位が作られるまたは除去されるように、アミノ酸配列を改変することにより、都合よく達成されてもよい。

抗体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に結合した炭水化物が改変されてもよい。哺乳類細胞が産生する天然型抗体は、典型的には、分岐した二アンテナ状オリゴ糖を含み、このオリゴ糖は、通常、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に、Ｎ結合で結合している。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸など、ならびに二アンテナ状オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体におけるオリゴ糖修飾は、ある特定の性質が改善された抗体変異体を作成する目的で行われてもよい。

１つの実施形態において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に結合（直接または間接的に）したフコースを欠く炭水化物構造を有するように提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるとおり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定して、Ａｓｎ２９７に結合した全糖構造体（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース量構造体）の合計に対してＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより求められる。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の２９７位付近（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号）に位置するアスパラギン残基を示す；しかしながら、抗体中のわずかな配列変異のため、Ａｓｎ２９７は、２９７位から±３アミノ酸上流または下流付近、すなわち２９４〜３００位の間にも位置する可能性がある。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。例えば、米国特許公開第ＵＳ ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する文献の例として、以下が挙げられる：ＵＳ ２００３／０１５７１０８；ＷＯ ２０００／６１７３９；ＷＯ ２００１／２９２４６；ＵＳ ２００３／０１１５６１４；ＵＳ ２００２／０１６４３２８；ＵＳ ２００４／００９３６２１；ＵＳ ２００４／０１３２１４０；ＵＳ ２００４／０１１０７０４；ＵＳ ２００４／０１１０２８２；ＵＳ ２００４／０１０９８６５；ＷＯ ２００３／０８５１１９；ＷＯ ２００３／０８４５７０；ＷＯ ２００５／０３５５８６；ＷＯ ２００５／０３５７７８；ＷＯ ２００５／０５３７４２；ＷＯ ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４（２００４）。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ ２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ；及びＷＯ ２００４／０５６３１２ Ａ１、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、特に実施例１１）、ならびにノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照）などが挙げられる。

抗体変異体は、二分されたオリゴ糖類、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二アンテナ状オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されたものでさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）；及びＵＳ ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）に記載される。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有する可能性がある。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ １９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）；ＷＯ １９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ， Ｓ．）；及びＷＯ １９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ， Ｓ．）に記載される。

ある特定の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸修飾が、本明細書中提供される抗体のＦｃ領域に導入されて、それによりＦｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。

ある特定の実施形態において、本発明は、エフェクター機能の一部を保持するが全部を保持してはない抗体変異体を企図しており、そのように保持することにより、その抗体は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期は重要であるがある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）は不要であるまたは有害である用途にとって望ましい候補となる。

エフェクター機能の低下した抗体として、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つまたは複数が置換されているものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体として、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されているいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体をはじめとする、２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７位のアミノ酸の２つ以上が置換されているＦｃ突然変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

ＦｃＲに対する結合が改善されたまたは弱められたある特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照）。

ある特定の実施形態において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号）での置換が行われたＦｃ領域を含む。

いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるとおり、改変された（すなわち、改善されたまたは減弱されたのいずれかである）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域になされる。

半減期が向上し、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合が改善された抗体が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９（１９９４））。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合を改善する１つまたは複数の置換を持つＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体として、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４の１つまたは複数に置換を持つもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を持つものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。

Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ ９４／２９３５１もまた参照。

ある特定の実施形態において、システイン操作された抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましいかもしれない。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の到達可能な部位に出現する。こうした残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は抗体の到達可能部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるとおり、反応性チオール基を使用して、抗体を、他の部分、例えば薬物部分またはリンカー薬物部分などと結合させて、免疫複合体を作成することができる。ある特定の実施形態において、以下の残基のいずれか１つまたは複数を、システインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるとおりに生成させてもよい。

ノブと穴
多重特異性抗体及び／または一本腕抗体及び／またはイムノアドヘシンを製造する方法としてノブと穴を利用することは、当該分野で既知である。米国特許第５，７３１，１６８号（１９９８年３月４日付与、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに対して譲渡）、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００９０８９００４号（２００９年７月１６日公開、Ａｍｇｅｎに対して譲渡）、及び米国特許出願公開第２００９０１８２１２７号（２００９年７月１６日公開、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに対して譲渡）を参照。Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｃｉａ（２００５）２６（６）：６４９−６５８及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒａｃｏｌ． Ｓｉｎ．， ２６：１−９も参照。簡単な説明を、本明細書に提示する。

「隆起」は、例えば、ヘテロ多量体を安定化し、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が優先されるようにする、第一のポリペプチドの界面から突出し、したがって、隣接する界面（すなわち第二のポリペプチドの界面）の代償的空洞に配置可能である、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を示す。隆起は、本来の界面に存在してもよいし、合成で導入されてもよい（例えば、界面をコードする核酸を改変することにより）。通常は、第一のポリペプチドの界面をコードする核酸を、隆起をコードするように改変する。これを達成するために、第一のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「本来の」アミノ酸残基をコードする核酸を、本来のアミノ酸残基より大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「輸入」アミノ酸残基をコードする核酸で置換する。本来の残基及び相当する輸入残基は複数存在することができることが理解される。置換される本来の残基の個数の上限は第一のポリペプチドの界面中の、残基の総数である。様々なアミノ残基の側鎖体積を以下の表に示す。

表Ｂ
^ａアミノ酸分子量から水分子量を引いたもの。Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，４３ｒｄ ｅｄ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９６１より値を引用。
^ｂＡ．Ａ． Ｚａｍｙａｔｎｉｎ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４：１０７−１２３，１９７２より値を引用。
^ｃＣ． Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：１−１４，１９７５より値を引用。到達可能表面積は、この引用文献の図６〜２０で定義される。

隆起を形成するのに好適な輸入残基は、一般に、天然アミノ酸残基であり、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。特に好適であるのは、トリプトファン及びチロシンである。１つの実施形態において、隆起を形成するための本来の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなど、側鎖体積が小さいものである。隆起を形成するためのＣＨ３ドメインのアミノ酸置換の例として、特に制限なく、Ｔ３６６Ｗ置換が挙げられる。

「空洞」は、第二のポリペプチドの界面から落ち窪んでおり、したがって第一のポリペプチドの隣接する界面上の該当する隆起を収容できる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を示す。空洞は、本来の界面に存在していてもよいし、合成で導入されてもよい（例えば、界面をコードする核酸を改変することにより）。通常は、第二のポリペプチドの界面をコードする核酸を、空洞をコードするように改変する。これを達成するために、第二のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「本来の」アミノ酸残基をコードする核酸を、本来のアミノ酸残基より小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「輸入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置換する。本来の残基及び相当する輸入残基は複数存在することができることが理解される。置換される本来の残基の個数の上限は第二のポリペプチドの界面中の、残基の総数である。様々なアミノ残基の側鎖体積を上記の表Ｂに示す。空洞を形成するのに好適な輸入残基は、通常、天然アミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。特に好適であるのは、セリン、アラニン、またはトレオニンである。１つの実施形態において、空洞を形成するための本来の残基は、例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなど、側鎖体積が大きいものである。空洞を生成するためのＣＨ３ドメインのアミノ酸置換の例として、特に制限なく、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｌ３６８Ａ置換、及びＹ４０７Ａ置換が挙げられる。

「本来の」アミノ酸残基とは、本来の残基より小さいまたは大きい側鎖体積を持ち得る「輸入」残基により置換されるものである。輸入アミノ酸残基は、天然アミノ酸残基でも、非天然アミノ酸残基でも可能であるが、天然アミノ酸残基が好ましい。「天然」アミノ酸残基とは、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸残基であり、上記の表Ｂに列挙されるものである。「非天然」アミノ酸残基により、遺伝暗号によりコードされないが、ポリペプチド鎖において隣接アミノ酸残基（複数可）と共有結合することができる残基を意味する。非天然アミノ酸残基の例として、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び他のアミノ酸残基類似体、例えば、Ｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． ２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるものなどがある。そのような非天然アミノ酸残基を作製するために、Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（上記）の手順を使用することができる。簡単に述べると、この手順は、抑制因子ｔＲＮＡを非天然アミノ酸残基で化学的に活性化し、続いてＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳を行うことを含む。本発明の方法は、少なくとも１つの本来のアミノ酸残基を置換することを含むが、複数の本来の残基を置換することができる。通常、第一または第二のポリペプチドの界面中の残基総数以下の残基が、置換される本来のアミノ酸残基を構成する。典型的には、置換対象の本来の残基は、「埋められる」。「埋められる」により、残基が溶媒にとって本質的に到達可能ではないことを意味する。一般に、輸入残基は、ジスルフィド結合の酸化または誤対合の可能性を防ぐために、システインではない。

隆起は、空洞に「配置可能」であり、配置可能とは、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドそれぞれの界面上の隆起及び空洞の空間配置ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面での第一のポリペプチドと第二のポリペプチドの正常な会合を大きく乱すことなく、隆起が空洞中に配置され得るようになっていることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐなどの隆起は、典型的には、界面の軸から垂直に伸びておらず、好適な立体構造を有していないため、隆起とそれに該当する空洞の整列は、三次元構造、例えば、Ｘ線結晶構造解析または核磁気共鳴（ＮＭＲ）により得られるものなどに基づいた隆起／空洞対のモデリングに依存する。これは、当該分野で広く受け入れられている技法を用いて達成することができる。

「本来のまたはテンプレート核酸」により、隆起または空洞をコードするように「改変」する（すなわち遺伝子操作するまたは変異させる）ことが可能な、目的のポリペプチドをコードする核酸を意味する。本来のまたは出発核酸は、天然に生じる核酸であってもよいし、既に改変を受けた核酸を含んでもよい（例えば、ヒト化抗体断片）。核酸を「改変する」により、本来の核酸が、目的のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンでの、挿入、削除、または置換により、変異していることを意味する。通常、本来の残基をコードするコドンは、輸入残基をコードするコドンで置換される。この様式でＤＮＡを遺伝子修飾する技法は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｅｄ．，（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．（１９９１）に総説が記載されており、そのような技法として、例えば、部位特異的突然変異誘発、カセット変異導入、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発が挙げられる。本来の／テンプレート核酸を変異させることにより、本来の／テンプレート核酸によりコードされる本来の／テンプレートポリペプチドもそれに応じて改変される。

隆起または空洞は、合成手段により、例えば、組換え技法、ｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド合成、既に記載した非天然アミノ酸残基の導入用技法、ペプチドの酵素的または化学的カップリングにより、またはそれらの技法のある組み合わせにより、第一または第二ポリペプチドの界面に「導入する」ことができる。したがって、「導入された」隆起または空洞は、「天然に生じない」または「非天然」のものであり、このことは、隆起または空洞が、自然には存在しないし、本来のポリペプチドにも存在しないことを意味する（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）。

一般に、隆起を形成するための輸入アミノ酸残基は、比較的少数の「回転異性体」（例えば、約３〜６）を有する。「回転異性体」は、アミノ酸側鎖のエネルギー的に好適な立体構造である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の個数は、Ｐｏｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９３：７７５−７９１（１９８７）に総説が記載される。

１つの実施形態において、第一のＦｃポリペプチドと第二のＦｃポリペプチドは、界面で会合／相互作用する。第一のＦｃポリペプチドと第二のＦｃポリペプチドが界面で会合するいくつかの実施形態において、第二のＦｃポリペプチド（配列）の界面は、隆起（「ノブ」とも呼ぶ）を含み、この隆起は第一のＦｃポリペプチド（配列）の界面にある空洞（「穴」とも呼ぶ）中に配置可能である。１つの実施形態において、第一のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、空洞をコードするように改変されている、または第二のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、隆起をコードするように改変されている、あるいは、その両方である。１つの実施形態において、第一のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、空洞をコードするように改変されており、かつ第二のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、隆起をコードするように改変されている。１つの実施形態において、第二のＦｃポリペプチドの界面は、隆起を含み、この隆起は第一のＦｃポリペプチドの界面にある空洞中に配置可能であり、空洞または隆起、あるいは両方とも、それぞれ、第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドの界面に導入されたものである。第一のＦｃポリペプチドと第二のＦｃポリペプチドが界面で会合するいくつかの実施形態において、第一のＦｃポリペプチド（配列）の界面は、隆起を含み、この隆起は第二のＦｃポリペプチド（配列）の界面にある空洞中に配置可能である。１つの実施形態において、第二のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、空洞をコードするように改変されており、または第一のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、隆起をコードするように改変されている、あるいは、その両方である。１つの実施形態において、第二のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、空洞をコードするように改変されており、かつ第一のＦｃポリペプチドが、テンプレート／本来のポリペプチドから、隆起をコードするように改変されている。１つの実施形態において、第一のＦｃポリペプチドの界面は、隆起を含み、この隆起は第二のＦｃポリペプチドの界面にある空洞中に配置可能であり、空洞または隆起、あるいは両方とも、それぞれ、第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドの界面に導入されたものである。

１つの実施形態において、隆起及び空洞は、それぞれ、天然アミノ酸残基を含む。１つの実施形態において、隆起を含むＦｃポリペプチドは、テンプレート／本来のポリペプチドの界面から、本来の残基を、本来の残基より大きい側鎖体積を有する輸入残基で置換することにより生成する。１つの実施形態において、隆起を含むＦｃポリペプチドは、このポリペプチドの界面の本来の残基をコードするポリヌクレオチドを、本来の残基より大きい側鎖体積を有する輸入残基で置換する工程を含む方法により生成する。１つの実施形態において、本来の残基は、トレオニンである。１つの実施形態において、本来の残基は、Ｔ３６６である。１つの実施形態において、輸入残基は、アルギニン（Ｒ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、フェニルアラニン（Ｆ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、チロシン（Ｙ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、トリプトファン（Ｗ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、Ｒ、Ｆ、Ｙ、またはＷである。１つの実施形態において、隆起は、テンプレート／本来のポリペプチドの２つ以上の残基を置換することにより生成する。１つの実施形態において、隆起を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンをトリプトファンで置換することを含み、アミノ酸番号は、ＫａｂａｔらのＥＵ番号付け方法による（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｖｏｌ． １（１９９１；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のｐｐ．６８８−６９６）。

いくつかの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、テンプレート／本来のポリペプチドの界面から、本来の残基を、本来の残基より小さい側鎖体積を有する輸入残基で置換することにより生成する。例えば、空洞を含むＦｃポリペプチドは、このポリペプチドの界面の本来の残基をコードするポリヌクレオチドを、本来の残基より小さい側鎖体積を有する輸入残基をコードするポリヌクレオチドで置換する工程を含む方法により生成させてもよい。１つの実施形態において、本来の残基は、トレオニンである。１つの実施形態において、本来の残基は、ロイシンである。１つの実施形態において、本来の残基は、チロシンである。１つの実施形態において、輸入残基は、システイン（Ｃ）ではない。１つの実施形態において、輸入残基は、アラニン（Ａ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、セリン（Ｓ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、トレオニン（Ｔ）である。１つの実施形態において、輸入残基は、バリン（Ｖ）である。空洞は、テンプレート／本来のポリペプチドの１つまたは複数の本来の残基を置換することにより生成することができる。例えば、１つの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、トレオニン、ロイシン、及びチロシンからなる群より選択される２つ以上の本来のアミノ酸の置換を含む。１つの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群より選択される２つ以上の輸入残基を含む。いくつかの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、トレオニン、ロイシン、及びチロシンからなる群より選択される２つ以上の本来のアミノ酸の置換を含み、これらの本来のアミノ酸は、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群より選択される輸入残基で置換される。いくつかの実施形態において、置換される本来のアミノ酸は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及び／またはＹ４０７である。１つの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンをセリンで置換することを含み、アミノ酸番号は、ＫａｂａｔらのＥＵ番号付け方法（上記）による。１つの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、３６８位のロイシンをアラニンで置換することを含み、アミノ酸番号は、ＫａｂａｔらのＥＵ番号付け方法（上記）による。１つの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、４０７位のチロシンをバリンで置換することを含み、アミノ酸番号は、ＫａｂａｔらのＥＵ番号付け方法（上記）による。１つの実施形態において、空洞を含むＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖからなる群より選択される２つ以上のアミノ酸の置換を含み、アミノ酸番号は、ＫａｂａｔらのＥＵ番号付け方法（上記）による。これらの抗体断片のいくつかの実施形態において、隆起を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンをトリプトファンで置換することを含み、アミノ酸番号は、ＫａｂａｔらのＥＵ番号付け方法（上記）による。

１つの実施形態において、抗体は、ＷＯ２００５／０６３８１６に記載されるとおり、「ノブ」及び「穴」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、穴変異は、Ｆｃポリペプチド中のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、及び／またはＹ４０７Ｖの１つまたは複数の変異が可能であり、ノブ変異はＴ３６６Ｗが可能である。

ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、当該分野で既知の容易に入手できる非タンパク質性部分を追加で含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に適した部分として、水溶性重合体が挙げられるが、これらに限定されない。水溶性重合体の制限ではなく例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（同種重合体またはランダム共重合体いずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール同種重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性故に製造で有利であるかもしれない。重合体は、任意の分子量のものであってよいし、分岐していてもいなくてもよい。抗体に結合させる重合体の個数は、様々であってよく、複数の重合体を結合させる場合、それらは同一分子種でも異なる分子種でも可能である。一般に、誘導体化に使用される重合体の個数及び／または種類は、抗体の改善しようとする特定の性質または機能、抗体誘導体が指定された条件下で治療に使用されるかどうかなど、これらに限定されないがこういった考慮に基づいて決めることができる。

別の実施形態において、抗体と、放射線曝露により選択的に過熱することが可能な非タンパク質性部分との結合体が提供される。１つの実施形態において、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってよく、普通の細胞には有害ではないが、非タンパク質性部分を加熱して、抗体非タンパク質性部分の近位の細胞が死滅する温度にする波長が挙げられるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、医薬は、１種または複数の細胞障害性剤、例えば化学療法剤または薬物、増殖抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起原の酵素活性な毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体と結合した抗体（ｃ−ｍｅｔ抗体など）を含む免疫複合体である。

１つの実施形態において、免疫複合体は、抗体が１種または複数の薬物と結合した抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であり、薬物としてメイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第ＥＰ ０ ４２５ ２３５ Ｂ１号を参照）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）など（米国特許第５，６３５，４８３号、及び同第５，７８０，５８８号、及び同第７，４９８，２９８号を参照）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：３３３６−３３４２（１９９３）；ならびにＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：２９２５−２９２８（１９９８）を参照）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシンなど（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １３：４７７−５２３（２００６）；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １６：３５８−３６２（２００６）；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １６：７１７−７２１（２００５）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：８２９−８３４（２０００）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ． ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ １２：１５２９−１５３２（２００２）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４５：４３３６−４３４３（２００２）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキセート；ビンデシン；タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなど；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態において、免疫複合体は、酵素活性な毒素またはその断片と結合した本明細書中記載される抗体を含み、そのような毒素として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルジー（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカ・キャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態において、免疫複合体は、本明細書中記載される抗体が放射性原子と結合して放射性結合体を形成したものを含む。放射性結合体の製造用に、様々な放射性同位体を入手することができる。例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。検出用に放射性結合体を使用する場合、放射性結合体は、シンチグラフィー検査用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）用のスピンラベル、例えば、再度になるがヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などを含んでもよい

抗体と細胞障害性剤の結合体は、様々なニ官能性タンパク質カップリング剤、例えば３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルのニ官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアン酸化合物（２，６−ジイソシアン酸トルエンなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を用いて作ることができる。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるとおりに調製することができる。炭素１４標識化１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体と結合させるためのキレート化剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。リンカーは、細胞中で細胞毒性薬の放出を促進するための「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。

本明細書中の免疫結合体またはＡＤＣとして、架橋試薬を用いて調製されたそのような結合体が明らかに企図されているが、それらに限定されず、架橋試薬として、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（（４−ビニルスルホン）安息香酸スクシンイミジル）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．から）。

ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
異種ポリペプチド（例えば、抗体）の組換え産生のため、異種ポリペプチドをコードする核酸を単離して、さらなるクローン化（ＤＮＡの増幅）用または発現用に反復可能ベクターに挿入する。ポリペプチド（例えば、抗体）をコードするＤＮＡは、従来手順を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離及び配列決定される。多くのベクターを利用することができる。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に一部依存する。一般に、好適な宿主細胞は、原核生物起原いずれかのものである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域をはじめとする任意のアイソタイプの定常領域を、この目的で使用することができ、そのような定常領域は、任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されるだろう。

ａ．原核生物宿主細胞を用いた抗体の生成：
ｉ．ベクター構築
本発明のポリペプチド（例えば、抗体）のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離して配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技法を用いて合成することができる。いったん得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入する。数多くのベクターが利用可能でありまた当該分野で既知であり、本発明の目的に使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入する予定の核酸のサイズ及びそのベクターで形質転換する予定の特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいは両方）及びそのベクターが滞在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分として、一般に以下が挙げられるが、それらに限定されない：複製開始点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物、及び転写終結配列。

一般に、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン配列及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、そうした宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞で表現型選択を提供することができるマーキング配列を保有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、大抵、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２で形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、したがって、形質転換細胞を容易に同定する手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内在性タンパク質の発現用に微生物が使用することができるプロモーターも含んでいてもよい、またはそのようなプロモーターを含むように修飾されてもよい。特定の抗体発現用のｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載される。

また、宿主細胞と適合性のあるレプリコン配列及び制御配列を含有するファージベクターを、そうした宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１などのバクテリオファージを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するのに使用することができる組換えベクターを作るのに利用してもよい。

本発明の発現ベクターは、ポリペプチド成分のそれぞれをコードする２つ以上のプロモーターシストロン対を含んでいてもよい。プロモーターは、シストロンの上流（５’）に位置する翻訳されない制御配列であり、シストロンの発現を調節する。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス、誘導性及び常在型に分類される。誘導性プロモーターとは、培養条件の変化、例えば栄養の有無または温度変化に反応して、このプロモーターの制御下にあるシストロンの転写レベルの上昇を開始させるプロモーターである。

宿主細胞として可能な様々な細胞により認識されるプロモーターは非常に数多く知られている。選択されたプロモーターは、提供源のＤＮＡから制限酵素消化によりプロモーターを取り出し、単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡと作動可能に連結することができる。天然型プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を、標的遺伝子の直接増幅及び／または発現に使用することができる。一般に、異種プロモーターの方が、天然型の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現される標的遺伝子をより多く転写しより高い収率をもたらすので、いくつかの実施形態において、異種プロモーターが利用される。

原核生物宿主とともに使用するのに適したプロモーターとして、ＰｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースのプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターまたはｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌中で機能性である他のプロモーター（他の既知の細菌プロモーターまたはファージプロモーターなど）も適切である。それらのヌクレオチド配列は、公開されているので、当業者は、任意の必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを用いて、それらを、標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに作動可能に連結することができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。

翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、タンパク質の全翻訳レベルの主要な決定要因である。ＴＩＲは、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含み、シャイン・ダルガーノ配列のすぐ上流から始まり開始コドンの約２０ヌクレオチド下流まで続く。一般に、ベクターはＴＩＲを含むだろうし、ＴＩＲ及び変異型ＴＩＲは、当該分野で既知であり、ＴＩＲを生成する方法は当該分野で既知である。ある範囲の翻訳強度を持つ一連の核酸配列変異体を作成し、それにより、多くの異なるポリペプチドの分泌に最適なようにこの要因を調節する都合のよい手段を提供することができる。これらの変異体と融合したレポーター遺伝子、例えばＰｈｏＡなどの使用は、異なる翻訳開始領域の相対翻訳強度を定量する方法を提供する。変異型または突然変異ＴＩＲは、成熟ポリペプチドの発現を最大にするのに最適な翻訳強度範囲を確立するように、プラスミドベクターのバックグラウンドに提供され、それにより、目的の遺伝子を挿入してその発現を測定することができるプラスミドの組を提供することができる。変異型ＴＩＲは、ＵＳＰ ８，２４１，９０１に開示される。

本発明の１つの態様において、組換えベクター内の各シストロンは、発現したポリペプチドに膜を横断して移行するよう指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの一成分であってもよいし、ベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部分であってもよい。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞に認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドにとって本来のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列を、例えば、本発明のシグナルポリペプチドから選択される原核生物シグナル配列に置換する。また、ベクターは、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群より選択されるシグナル配列を含んでもよい。

１つの態様において、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）が、集団で抗体をコードする。１つの実施形態において、１つのポリヌクレオチドが、抗体の軽鎖をコードし、別のポリヌクレオチドが抗体の重鎖をコードする。１つの実施形態において、１つのポリヌクレオチドが、抗体の軽鎖及び重鎖をコードする。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）が、集団で一本腕抗体をコードする。１つの実施形態において、１つのポリヌクレオチドが、（ａ）一本腕抗体の軽鎖及び重鎖、ならびに（ｂ）Ｆｃポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、１つのポリヌクレオチドが、一本腕抗体の軽鎖及び重鎖をコードし、別のポリヌクレオチドが、Ｆｃポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、別々のポリヌクレオチドが、それぞれ、一本腕抗体の軽鎖成分、一本腕抗体の重鎖成分、及びＦｃポリペプチドをコードする。一本腕抗体の製造は、例えば、ＷＯ２００５０６３８１６に記載される。

本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞として、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物などが挙げられる。有用な細菌の例として、大腸菌属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腸内細菌、シュードモナス属の種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、リゾビウム属、ビトレオシラ属、またはパラコッカス属が挙げられる。１つの実施形態において、グラム陰性細胞が使用される。１つの実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が本発明の宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例として、遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する３３Ｄ３株（米国特許第５，６３９，６３５号）を含む、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７）、ｐｐ．１１９０−１２１９；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体、ならびに６３Ｃ１株、６６Ｆ８株、及び６４Ｂ４株が挙げられる。他の株及びその誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉλ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）なども適している。これらの例示は、制限ではなく、模範例である。定義された遺伝子型を有する上記の細菌のいずれかについて誘導体を構築する方法は、当該分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。細菌の細胞内でのレプリコンの反復可能性を考慮して適切な細菌を選択することが、一般に必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア属、またはサルモネラ属の種は、周知のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などを用いてレプリコンを供給する場合に、宿主として適切に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、タンパク質分解酵素を最小限の量でしか分泌しないべきであり、細胞培養物にプロテアーゼ阻害剤を追加で組み込むことが望ましいかもしれない。

ｉｉ．抗体産生
宿主細胞を、上記の発現ベクターで形質転換して、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように修飾された通常の栄養培地で培養する。

形質転換は、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体によりのいずれかで複製可能なように、原核生物宿主にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞に応じて、そのような細胞に適した標準技法を用いて形質転換を行う。相当な細胞壁障壁を有する細菌細胞には、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が一般に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術として、電気穿孔法がある。

本発明のポリペプチドを産生させるのに使用する原核細胞を、当該分野で既知の、選択した宿主細胞の培養に適した培地で増殖させる。適切な培地の例として、ルリア培地（ＬＢ）に必要な栄養補充を追加したものが挙げられる。いくつかの実施形態において、培地は、発現ベクターの構成に基づいて選択された、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に許容する選択作用剤も含有する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞が増殖するように、アンピシリンを培地に添加する。

炭素、窒素、及び無機リン酸源の他に必要な任意の補充成分を、単独でまたは別の補充成分もしくは培地との混合物、例えば複合窒素源などとして、適切な濃度で含ませることも可能である。任意選択で、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコラート、ジチオエリスリトール、及びジチオトレイトールからなる群より選択される１種または複数の還元剤を含有してもよい。

原核生物宿主細胞を、適切な温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉ増殖の場合、例えば、好適な温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであってよい。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは、好ましくは、約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。

誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の１つの態様において、ポリペプチドの転写を制御するためにＰｈｏＡプロモーターが使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導用のリン酸制限培地で培養される。好ましくは、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照）またはＷＯ２００２／０６１０９０に記載される培地である。当該分野で既知のとおり、採用したベクター構築物に応じて、他の様々な誘導因子も使用することができる。

１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、発現すると、宿主細胞のペリプラズムに分泌されて、そこから回収される。タンパク質回収は、大抵、微生物を破壊することを含み、破壊は一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による。細胞を破壊してしまったら、細胞片または全細胞を、遠心分離または濾過により除去してもよい。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーにより、さらに精製してもよい。あるいは、タンパク質は、培養培地に移動させてその中で単離することもできる。細胞を培養物から除去し、培養上清を濾過して、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濃縮してもよい。発現したポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなどの一般的に知られる方法を用いて、さらに単離及び同定することができる。

本発明の１つの態様において、抗体産生は、発酵プロセスにより大規模に行われる。組換えタンパク質の産生に、様々な大規模流加培養発酵手順を利用することができる。大規模発酵は、容積が、少なくとも１０００リットル、好ましくは容積が約１，０００〜１００，０００リットルある。こうした発酵槽は、酸素及び栄養、特にグルコース（好適な炭素／エネルギー源）を分配するために撹拌翼を使用する。小規模発酵は、一般に、容積が約１００リットル以下の発酵槽での発酵を指し、容積は、約１リットル〜約１００リットルの範囲が可能である。

発酵プロセスでは、タンパク質発現の誘導は、大抵、細胞が適切な条件下で所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０まで増殖した後に開始され、この段階では細胞は初期定常期にある。当該分野で既知のとおり、及び上記に記載したとおり、採用したベクター構築物に応じて、様々な誘導因子を使用してもよい。細胞は、誘導前に短期間増殖させてもよい。細胞は、通常、約１２〜５０時間誘導するが、それより長いまたは短い誘導時間を用いてもよい。

本発明のポリペプチドの産生収率及び品質を改善するため、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な構築及び折り畳みを改善するため、シャペロンタンパク質、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロリルｃｉｓ，ｔｒａｎｓイソメラーゼ）などを過剰発現する追加ベクターを用いて、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞で産生された異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解性を促進することが実証されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１９６０１−１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，０２７，８８８号；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１００−１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１７１０６−１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３９：１９９−２１０。いくつかの実施形態において、ＤｓｂＡ及びＣが、細菌宿主細胞で発現する（例えば、過剰発現する）。いくつかの実施形態において、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、及びＦｋｐＡが、細菌宿主細胞で発現する（例えば、過剰発現する）。

発現した異種タンパク質（特にタンパク質分解に敏感なもの）のタンパク質分解を最小限にするため、タンパク質分解酵素を欠失したある特定の宿主株を本発明に使用することができる。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えばプロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせなどをコードする遺伝子に遺伝子変異（複数可）を起こすように修飾してもよい。Ｅ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が、複数種、利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８），上記；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ２：６３−７２（１９９６）に記載される。

１つの実施形態において、タンパク質分解酵素を欠失しており、１種または複数のシャペロンタンパク質及び／またはＦｋｐＡを過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株が、本発明の発現系において宿主細胞として使用される。

ｉｉｉ．抗体精製
当該分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を採用することができる。以下の手順は、適切な精製手順の例である：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのまたはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲル濾過。

１つの態様において、本発明の抗体産物の免疫親和性精製のために、固相に固定されたタンパク質Ａを用いる。タンパク質Ａとは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質であり、これは抗体のＦｃ領域と高い親和性で結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２：１−１３。タンパク質Ａを固定する固相は、好ましくはガラスまたはシリカ表面を有するカラム、より好ましくは孔の制御されたガラスカラムまたはケイ酸カラムである。いくつかの応用において、カラムは、夾雑物の非特異的付着を防ぐ目的で、グリセロールなどの試薬でコーティングされている。

精製の第一工程として、上記のとおりの細胞培養物に由来する調製物を、タンパク質Ａを固定した固相に接触させて、目的の抗体をタンパク質Ａと特異的に結合させる。次いで、固相を洗って、固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に、溶出により、目的の抗体を固相から回収する。

本発明はまた、例えば、細胞障害性剤、例えば化学療法薬、薬物、増殖抑制剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起原の酵素活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体）などと結合した本明細書中記載される抗体のいずれかを含む、免疫複合体（同義で「抗体薬物結合体」または「ＡＤＣ」と称する）も提供する。

使用
異種ポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドが認識する特定のポリペプチドを精製、検出、及び標的とするのに使用することができ、そのような用途として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ両方での診断方法及び治療方法が挙げられる。

１つの態様において、本発明の抗体は、生体試料中の特定抗原を定性的及び定量的に測定する免疫アッセイで使用することができる。抗原抗体結合を検出する従来方法として、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、または免疫組織化学的組織検査が挙げられる。多くの方法で、検出を目的として抗体に標識を結合させて使用してもよい。抗体とともに使用される標識は、抗体との結合に干渉しない任意の検出可能な官能基である。多数の標識が知られており、そのような標識として、放射性同位体^３２Ｐ、^３２Ｓ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、及び^１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば、希土類キレートまたはフルオレセイン及びその誘導体など、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼなど（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど、ラクトペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカル、画像化放射性核種（テクネチウムなど）などが挙げられる。

従来方法を利用して、こうした標識を異種ポリペプチドに共有結合させることができる。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビスイミダート、ビスジアゾ化ベンジジンなどのカップリング剤を用いて、抗体に、上記の蛍光標識、化学発光標識、及び酵素標識をタグ付けすることができる。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光定量）及び米国特許第３，６４５，０９０号（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４−１０２１（１９７４）；Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０：２１９−２３０（１９８１）；ならびにＮｙｇｒｅｎ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ３０：４０７−４１２（１９８２）を参照。本明細書中好適な標識は、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどである。酵素をはじめとするそのような標識の抗体ポリペプチドとの結合は、免疫アッセイ技法において、当業者にとって標準的な手技手順である。例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｅｄ． Ｊ．Ｊ． Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｈ． Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ， Ｖｏｌ． ７３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８１），ｐｐ．１４７−１６６を参照。そのような結合方法は、本発明の異種ポリペプチドと合わせて使用するのに適している。

異種ポリペプチドを標識化する代わりに、検出可能な物質で標識された競合抗原標準及び未標識異種ポリペプチドを用いる競合免疫アッセイにより、生体液中で抗原をアッセイすることができる。このアッセイでは、生体試料、標識化した抗原標準、及び異種ポリペプチドを組み合わせて、未標識異種ポリペプチドに結合した標識化抗原標準の量を測定する。生体試料中の試験される抗原の量は、異種ポリペプチドに結合した標識化抗原標準の量と反比例する。

１つの態様において、異種ポリペプチド（抗体など）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、特定の表面抗原の発現を検出及び特性測定するのに、特に有用である。先に記載したとおり、一般に、非グリコシル化抗体は、エフェクター機能（すなわち、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性）を発揮しない。したがって、抗体が細胞表面抗原に結合する場合、それは、望ましくない細胞障害性事象を開始させないだろう。表面抗原は、特定の細胞型または組織型に対して特異的となり得るので、したがって、細胞型または組織型のマーカーとして役立つ可能性がある。好ましくは、表面抗原マーカーは、特定の細胞型または組織型の様々な分化段階において、異なって発現される。したがって、そのような表面抗原に向かう抗体は、マーカーを発現する細胞または組織集団をスクリーニングするのに使用することができる。例えば、抗体は、胚幹細胞、造血幹細胞、及び間葉系幹細胞などの幹細胞のスクリーニング及び単離に使用することができる。抗体はまた、腫瘍関連表面抗原、例えば、ｃ−ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体などを発現する腫瘍細胞を検出するのにも使用できる。

抗体または他の異種ポリペプチドは、親和性精製剤として使用されてもよい。この目的では、ポリペプチドは、当該分野で既知である方法を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの固相に固定される。固定されたポリペプチドを、精製しようとする抗原を含有する試料と接触させ、その後支持体を、精製しようとする抗原以外は試料中の実質的に全ての物質を除去する適切な溶媒で洗う。抗原は、固定されたポリペプチドに結合している。最後に、支持体を、ポリペプチドから抗原を放出させる別の適切な溶媒、例えばグリシン緩衝液（ｐＨ５．０）で洗う。

１つの態様において、本発明は、疾患、例えば、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／または免疫（自己免疫など）障害の治療及び／または予防的治療用医薬の調製における、本発明の方法を用いて生成させた異種ポリペプチドの使用を提供する。異種ポリペプチドは、本明細書中記載される型のいずれでも可能であり、そのような型として、抗体、抗体断片、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチド）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、抗原はヒトタンパク質分子であり、対象は、ヒト対象である。

ポリペプチドは、１種または複数の抗原分子の異常な発現及び／または活性に関連する疾患、障害、または症状を、診断、治療、阻止、または予防するために使用することができ、そのような疾患、障害、または症状として、悪性及び良性腫瘍；非白血病及びリンパ系腫瘍；神経細胞性、グリア細胞性、星細胞性、視床下部性及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、及び胞胚腔性の障害；ならびに炎症性、血管新生性、及び免疫性障害が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態において、タンパク質（例えば、抗体）が、対象に投与される。ある特定の実施形態において、抗体を含む免疫複合体が、対象に投与される。好ましくは、免疫複合体及び／または免疫複合体が結合した抗原は、細胞により内部移行する。

異種ポリペプチドは、治療において、単独でまたは他の組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、異種ポリペプチドは、抗体、化学療法薬（複数可）（化学療法薬カクテルを含む）、他の細胞障害性剤（複数可）、血管新生抑制剤（複数可）、サイトカイン、及び／または増殖抑制剤（複数可）と同時投与されてもよい。異種ポリペプチドが腫瘍増殖を阻害する場合、異種ポリペプチドを、同じく腫瘍増殖を阻害する１種または複数の他の治療薬と併用することが特に望ましいかもしれない。あるいは、またはこれに加えて、患者は、併用放射線療法（例えば、外部放射線照射または放射性標識化作用剤、例えば抗体などを用いた治療）を受けてもよい。上記のそのような併用療法は、まとめての投与（２種以上の作用剤が、同一または別個の配合物に含まれている場合）、及び個別の投与を含み、そのような場合、抗体の投与は、１種または複数の補助療法の投与の前及び／または後に行うことができる。

異種ポリペプチド（及び任意選択で、補助治療薬）は、任意の適切な手段により投与され、そのような手段として、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内、ならびに、局所治療が望ましい場合は、病巣内投与が挙げられる。非経口注入として、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。また、抗体は、パルス点滴、特に抗体の用量を減らしながらのものにより、適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与が短期間であるか長期間であるかに一部応じて、注射により、特に好ましくは静脈内または皮下注射により投与される。

異種ポリペプチドは、良好な医療行為と一致する様式で、配合、用量決定、及び投与されるだろう。この文脈において考慮される要因として、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床上の状態、障害の原因、作用剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医療実務者に既知の他の要因が挙げられる。抗体は、問題の障害を予防または治療するのに現在使用されている１種または複数の作用剤と共に配合される必要はないが、任意選択で共に配合される。そのような他の作用剤の有効量は、配合物中に存在する抗体の量、疾患または治療の種類、及び上記に記載の他の要因に依存する。これらは、一般に、上記に用いられていたのと同じ投薬量及び投与経路で、またはこれまでに採用されていた投薬量の約１〜９９％で使用される。

疾患の予防または治療について、抗体の適切な投薬量（単独で使用、または他の作用剤、例えば化学療法薬と併用される場合）は、治療しようとする疾患の種類、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、これまでに受けた治療、患者の既往歴及び抗体に対する反応、ならびに担当医の自由裁量に依存するだろう。抗体は、１回でまたは一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、例えば、１回の投与にするのかまたは複数回の別々の投与にするのか、それとも連続注入するのかによって、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与する投薬量の最初の候補となる。数日以上にわたる繰返し投与の場合、状態に応じて、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで、治療を継続する。抗体の好適な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内になるだろう。最初の負荷投与量を多くし、続いて用量を減らして１回または複数回投与してもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この治療の進行は、従来の技法及びアッセイにより容易に監視される。

製品
本発明の別の実施形態において、上記の障害の治療に有用な物質を含有する製品を提供する。製品は、容器、及び容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器として、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されていてよい。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌の出し入れ口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針で穴をあけることができる栓を有する、静脈内注射液の袋またはバイアルであってもよい）。組成物の活性成分の少なくとも１種は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、特定の症状、例えば癌などの治療に使用されることを示す。そのうえ、製品は、（ａ）抗体を含む組成物が入った第一容器；及び（ｂ）さらなる細胞障害性剤を含む組成物が入った第二容器を含んでもよい。本発明のこの実施形態の製品は、さらに、第一及び第二の抗体組成物が、癌治療に使用可能であることを示す添付文書を含んでもよい。あるいは、またはそれに加えて、製品は、薬学上許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びブドウ糖液を含む第二（または第三）容器をさらに含んでもよい。製品は、商業及び使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよく、そのような材料として、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジが挙げられる。

以下の実施例は、本発明の実施を例示することのみを目的とし、制限するために提供されるのではない。本明細書中引用される全ての特許文献及び学術文献の開示は、その全体が参照として明白に援用される。

材料及び方法
株及びプラスミド。この試験で使用した株及びプラスミドを表１に列挙する。重鎖のみの発現ベクターを構築するため、全長抗体発現ベクターを、ＳｐｅＩ及びＮｓｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。シグナルペプチド配列及び重鎖配列を含有して得られる断片を、ｐＢＲ３２２由来クローニングベクターのＳｐｅＩ及びＮｓｉＩ部位にクローン導入した。ｐＢＲ３２２由来クローニングベクターは、切断型軽鎖断片（１２２−２３７）、重鎖配列と融合したｐｈｏＡプロモーター、及びラムダｔ_０転写ターミネーターを含むものであった。ακＬｃ抗体をプローブとして用いるウエスタンブロット分析により、この重鎖のみのベクターで軽鎖は発現しなかったことを確認した。翻訳強度測定用のＰｈｏＡレポータープラスミドを構築するため、目的のシグナルペプチド変異体を、通常ＰＣＲまたはスプライシングオーバーラップ伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲ法を介してｐｈｏＡ遺伝子と融合させた。得られた断片を、ｐＰｈｏＡ５１のＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）部位にクローン導入した［１］。シグナルペプチド配列の部位特異的変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により導入した。

表１．この試験で使用した株及びプラスミド

細菌の増殖。細菌は、示すとおり、バッフル付震盪フラスコ中、３７℃または３０℃で、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）または完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２）で増殖させた。抗生物質を以下の濃度で添加した：カルベニシリン５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌ。タンパク質発現を誘導するため、全長抗体発現ベクターまたは重鎖のみの発現ベクターを抱える宿主株６４Ｂ４を、ＬＢにテトラサイクリン２０μＬ／ｍＬ及び５ｍＭのリン酸ナトリウムを補充した培地（ｐＨ７）５ｍＬに播種し、震盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。一晩培養物０．５ｍＬを、完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地２５ｍＬに播種し［２］、細菌を、震盪しながら３０℃で２４時間インキュベートした。終点培養物の吸光度を５５０ｎｍで測定した。ウエスタンブロット分析またはＮ末端配列決定分析用に細菌試料を収集した。

翻訳強度測定。シグナルペプチド変異体の翻訳強度を、先行文献［１、３］を応用したアルカリホスファターゼアッセイで求めた。ＰｈｏＡレポーターベクターを抱える株２７Ｃ７を、５ｍＬの選択ＬＢに播種し、震盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。一晩培養物を、１００倍希釈で５ｍＬの選択ＬＢに添加し、震盪しながら３０℃でさらに４時間インキュベートした。細菌を、波長６００ｎｍでＯＤを１として正規化し、ペレット状にした。ペレットを、１ｍＬの厳密ＡＰ培地（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６）に直ちに懸濁させ、−２０℃で一晩貯蔵した。翌日、細菌を解凍して、トルエン２０μＬを添加して、震盪しながら３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。次いで、各試料４０μＬを、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８、１ｍＭ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物（ＰＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有）１ｍＬに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）１００μＬを添加して反応を停止させた。各試料２００μＬを、直ちに９６ウェルプレートのウェルに移し、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＯＤ_４１０を測定した。各試料のＡ_４１０から２７Ｃ７／ｐＢＲ３２２（空ベクター）のＡ_４１０を差し引き、次いで数値を２７Ｃ７／ｐＰｈｏＡ８６のＡ_４１０で割ることにより、相対翻訳強度を計算した。ｐＰｈｏＡ８６の相対ＴＩＲ強度を１と定義した。

抗体抽出及びウエスタンブロット分析。終点試料を震盪フラスコ培養物から収集した。全重鎖レベルを測定するため、細菌を、５５０ｎｍでＯＤを１として正規化し、１６，０００×ｇ及び４℃で３分間遠心することにより採取した。ペレットを、０．２Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ）含有トリシン緩衝液２００μＬに再懸濁させ、９５℃で５分間加熱して、ジスルフィド結合を破壊しタンパク質を変性させた。

細菌から可溶性タンパク質を抽出するため、全細胞ブロスをチルド溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、及び５ｍＭのヨード酢酸）に希釈して、最終ＯＤ_５５０を３とし、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、試料を１０×１秒パルスで２回超音波処理し、１６，０００×ｇ及び４℃で１５分間遠心した。上清を注意して収集した。上清１００μＬを、トリシン緩衝液とまたはトリシン緩衝液１００μＬと混合して、９５℃で５分間沸騰させた。

ペリプラズムタンパク質を、記載のとおりに抽出した［４、５］。簡単に述べると、ＯＤ_５５０が１０の細胞を、３，０００×ｇ及び４℃で２０分間遠心することにより、採取した。ペレットを、冷ＴＢＳ緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）１錠を加えたもの１ｍＬ中に穏やかに再懸濁させた。試料を氷上で３０分間インキュベートし、１６，０００×ｇ及び４℃で３０分間遠心した。上清を注意して収集した。上清１００μＬを、０．２ＭのＤＴＴ含有トリシン緩衝液１００μＬと混合して、９５℃で５分間加熱した。

ＤＴＴを含むまたは含まないトリシン緩衝液中のタンパク質試料を、１０％ビス−ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加して、電気泳動により分離させた。等量の全タンパク質が添加されたことを確実にするため、ＯＤが１の溶解液を含むゲルを、クーマシーブルーで染色した。染色していないゲルのタンパク質を、ｉＢｌｏｔ半乾式トランスファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、またはＣＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭのＮ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、３％メタノール、ｐＨ１１）を用いて湿式トランスファー（Ｂｉｏｒａｄ）によりセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。重鎖含有種を、ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体、ＨＲＰ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）でプローブした。軽鎖含有種を、ヤギ抗ヒトｋＬｃ抗体、ＨＲＰ結合体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でプローブした。免疫ブロット上の標的タンパク質を、増強化学発光法（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により検出した。
重鎖Ｎ末端のＥｄｍａｎ配列決定。震盪フラスコ培養物から採取した終点試料を、ＯＤ_５５０を１として正規化し、１６，０００×ｇで３分間遠心することにより採取した。ペレットを、０．２ＭのＤＴＴ含有トリシン緩衝液２００μＬに再懸濁させ、９５℃で５分間加熱した。タンパク質を、８％または１０％ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での電気泳動により分離させた。空のｐＢＲ３２２ベクターを抱える６４Ｂ４由来のＯＤ_５５０が１または４の細胞溶解液もまた、対照として添加した。電気泳動後、タンパク質を、ＣＡＰＳ緩衝液での湿式トランスファー（Ｂｉｏｒａｄ）によりＰＶＤＦ膜に移した。膜上の約４９ｋＤａの重鎖バンドを切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅ配列決定装置モデル４９４ＨＴを用いて、Ｅｄｍａｎ配列決定により分析した。成熟重鎖対前駆体の比を、ピーク強度に基づいて見積もった。半定量化のため、各アミノ酸のピコモル値を、配列分析プログラムＳＥＱＸを用いて、未補正のフェニルチオヒダントインアミノ酸標準に対して計算した（Ｈｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８７）。１０回のサイクルの平均を用いて、平均反応収率プロットを作成し、直線回帰を計算して、主要及び少数配列の初収量を、プロットした直線のｙ接線と定義した。重鎖プロセシング効率を、分泌された重鎖のパーセンテージ（成熟重鎖の初収量／（前駆体の初収量＋成熟重鎖の初収量））として計算した。

透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）。震盪フラスコ培養物から採取した終点試料を、修飾カルノウスキー固定液（２％パラホルムアルデヒド及び２．５％グルタルアルデヒド含有０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐｈ７．２）で最初に固定し、次いで１％四酸化オスミウム水溶液（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）で１時間、後固定し、続いて、０．５％酢酸ウラニル中で４０Ｃで一晩インキュベーションした。次いで、試料を一連のエタノール濃度（５０％、７０％、９０％、１００％）、続いてプロピレンオキシドを通して脱水し（各工程は１５分）、Ｅｐｏｎａｔｅ １２（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）に包埋した。超薄切片（８０ｎｍ）をＵｌｔｒａｃｕｔミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）で切り出し、０．２％クエン酸鉛で染色し、ＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で１２０ｋＶで調べた。ＧＡＴＡＮ Ｕｌｔｒａｓｃａｎ １０００ ＣＣＤカメラでデジタル画像を撮影した。

免疫金電子顕微鏡法（免疫ＥＭ）。免疫金ＥＭ実験では、試料を、凍結切断用に調製した。凍結切断のため、細胞を、４％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒド含有リン酸緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．２）で固定し、ＰＢＳで数回洗浄し、１２％ゼラチンに包埋し、４℃で一晩、２．３Ｍスクロースに浸潤させた。次いで、試料を、凍結切断チャンバー（液体窒素が供給される）中の凍結したクライオウルトラミクロトーム用ピンに乗せた。凍結切断チャンバーを備えたウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ；Ｌｅｉｃａ）を使用して、−８０℃で、ダイヤモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ）で超薄凍結切片（１００ｎｍ）を調製した。解凍した凍結切片を、２．３Ｍスクロースの液滴を用いて、フォルムバール及びカーボンでコーティングしたＥＭグリッド（ニッケル）に移し、免疫標識し（以下を参照）、０．５％酢酸ウラニル含有２％メチルセルロースを用いてＲＴで１分間、ＥＭ用に対比染色した。免疫金標識化について：グリッド上の解凍した凍結切片を、ブロッキング剤（Ａｕｒｉｏｎ Ｉｎｃ）で３０分間ブロッキングし、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに、室温で４５分間インキュベートし、続いてヤギ抗ＨＲＰ金結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに３０分間インキュベートした。次いで、切片を上記のとおり対比染色した。免疫金標識化切片を、ＪＥＯＬ ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で１２０ｋＶにて、可視化して調べた。ＧＡＴＡＮ Ｕｌｔｒａｓｃａｎ １０００ ＣＣＤカメラでデジタル画像を撮影した。

結果及び考察
Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体（例えば全長抗体）産生は、抗体重鎖及び軽鎖が細胞質からペリプラズムへ分泌されることにより達成され得る［２］。分泌には、重鎖及び軽鎖のＮ末端に融合したＥ．ｃｏｌｉシグナルペプチドが介在する。ペリプラズムの酸化環境及び酵素は、重鎖及び軽鎖が抗体へと構築されるのを促進する。異種タンパク質（例えば、抗体）の高レベル産生手段としてペリプラズム分泌を利用することは、頻繁に遭遇する問題が複数あるために、制限される可能性がある。第一に、目的のタンパク質（例えば、抗体）の分泌効率が低い可能性がある。第二に、多くの場合、前駆体が成熟タンパク質になるプロセシングが不十分である。第三に、過剰発現した異種タンパク質は、不適切に折り畳まれるか、凝集して不溶性封入体になるか、またはＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼによりタンパク質分解を受けることが多い。第四に、抗体は、２つの異なるポリペプチド、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）からなる複雑な多量体タンパク質であり、これらポリペプチドがペリプラズムに搬出されて、適切に折り畳まれて、適切なジスルフィド結合を形成しなければならない。このタンパク質の折り畳み及び分泌の複雑さが、Ｅ．ｃｏｌｉでの抗体製造に困難さを加えている。

ＴＩＲ最適化は、より効率的なタンパク質分泌をもたらすのに有用であることが示されているものの、他のアプローチは、Ｅ．ｃｏｌｉでの異種タンパク質分泌を常法的に改善することが示されていない。例えば、シグナルタンパク質の最適化は、ペリプラズム空間への組換えシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）分泌を低下させることが示された。Ｊｏｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１２）；２２：４８−５８。

シグナルペプチドの２つの側面が、ペリプラズムでのタンパク質蓄積に影響を及ぼし、それは翻訳強度及び移行効率である。翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、タンパク質の全翻訳レベルの主要決定要因である。ＴＩＲは、シグナル配列をコードし、シャイン・ダルガーノ配列のすぐ上流から始まり開始コドンの約２０ヌクレオチド下流まで続くポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチド配列の修飾は、翻訳開始の効率を改変し、それにより下流タンパク質の翻訳レベルを調節することができる。シグナルペプチド配列を変異させる効果を調べる先行研究は、核酸配列での変化ため、概して、ＴＩＲ強度に与える潜在的影響を制御できなかった；しかしながら、本発明者らの先の研究では、異なるシグナルペプチドを使用して、ＴＩＲ強度を制御しつつ、全抗体産生を駆動することを調べた。相対ＴＩＲ強度が約１では、ＤｓｂＡシグナルペプチドと重鎖の融合は、概して、ＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、またはＰｈｏＡのシグナルペプチドと融合させるよりも高いレベルの全長抗体産生をもたらした（軽鎖シグナルペプチドは、各試験においてＳＴＩＩであった）（図１Ａ）。本試験では、本発明者らは、ＤｓｂＡシグナルペプチドが、試験した他のシグナルペプチドよりも疎水性が高いと仮定して、シグナルペプチドの疎水性が、重鎖のペリプラズムへの移行及び全長抗体産生に重要であることを実証した。

［シグナルペプチドは、抗体重鎖のペリプラズム蓄積及びプロセシングに影響を及ぼした。］［訳者注：上記［ ］で囲まれている箇所は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０７８３では、下線が引かれている。］本発明者らは、ペリプラズムでの重鎖蓄積に対するシグナルペプチド変異体の効果を調べた。転写強度に対するシグナルペプチド疎水性の変化の影響の可能性を制御するために、全ての変異体において、相対ＴＩＲ強度は、約１であった。先行研究は、概して、修飾されたシグナルペプチドの翻訳強度を制御してこなかった。もし本研究で行ったように注意して制御を行わなかったら、シグナルペプチド疎水性における変調は、ＴＩＲの翻訳強度を変化させる可能性がある（例えば、ＴＩＲポリヌクレオチド配列での変化を介して）。ＴＩＲの翻訳強度の変化は、分泌効率及びタンパク質産生レベルに影響するかもしれない。

抗体５Ｄ５重鎖のＮ末端を、ＳＴＩＩシグナルペプチド（ｂＳＴＩＩ１）、ＤｓｂＡシグナルペプチド（ｂＤｓｂＡ１）、ＭａｌＥシグナルペプチド（ｂＭａｌＥ１）、またはＰｈｏＡシグナルペプチド（ｂＰｈｏＡ１）と融合させた。これらのシグナルペプチドは、それぞれ同様な翻訳レベルを持つ（表３）。各場合において、抗体５Ｄ５軽鎖を、同じＳＴＩＩシグナルペプチド（ｍＳＴＩＩ１）と融合させた。重鎖及び軽鎖両方の発現を、震盪フラスコ培養物中でリン酸制御により誘導した。ペリプラズムタンパク質抽出物を、浸透圧ショック及び遠心により単離した。上清のウエスタンブロット分析は、ＤｓｂＡシグナルペプチドの使用が、ＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、またはＰｈｏＡシグナルペプチドを使用した場合よりも顕著に高いレベルの可溶性ペリプラズム重鎖をもたらしたことを示した（図１Ｂ）。ｂＭａｌＥ１及びｂＰｈｏＡ１のＴＩＲ強度はｂＳＴＩＩ１及びｂＤｓｂＡ１のＴＩＲ強度より高いため、ＴＩＲが高くなると不十分な分泌を引き起こすという可能性を排除するため、本発明者らは、ｂＳＴＩＩ１及びｂＤｓｂＡ１のＴＩＲ強度よりわずかに低いＴＩＲ強度を持つ２種の追加シグナルペプチド、ｍＭａｌＥ１及びｍＰｈｏＡ１を操作した（表３）。重鎖と融合したｍＭａｌＥ１及びｍＰｈｏＡ１は両方とも、ｂＤｓｂＡ１よりも明らかに少ない全長５Ｄ５及び可溶性ペリプラズム重鎖をもたらした（図１Ｃ）。

細胞質からペリプラズムへの重鎖分泌に対するシグナルペプチドの効果を判定するため、本発明者らは、成熟重鎖及び前駆体重鎖の存在を観測した。細胞質中または内膜中の未分泌ペリプラズムタンパク質は、シグナルペプチド配列を維持するだろう。ペリプラズムに移行する間に、シグナルペプチドはペプチダーゼにより切断される［６、７］。したがって、ペリプラズムに放出された成熟タンパク質は、シグナルペプチドを含有しないだろう。前駆体重鎖と成熟重鎖の分子量の差は、１〜２ｋＤａにすぎず、この差は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解するのが困難である。したがって、Ｎ末端タンパク質配列決定を行って、前駆体重鎖と成熟重鎖を識別した。全細胞試料由来の還元重鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単独バンドとして移動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。重鎖バンドをＰＶＤＦ膜から切り出し、Ｅｄｍａｎ配列決定に供した。重鎖がＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、またはＰｈｏＡシグナルペプチドと融合していた場合、前駆体とまたは成熟重鎖と一致する配列が両方とも検出され（表４）、重鎖によっては、細胞質中または内膜中に保持されることを示唆した。重鎖がＤｓｂＡシグナルペプチドと融合していた場合、前駆体と一致する配列は極めて少ないかまたは検出不能であった。本発明者らは、ピーク強度を用いて成熟重鎖対前駆体重鎖の比を見積もり、初収量を用いて分泌重鎖のパーセンテージを半定量化した。どちらの方法も、ＤｓｂＡシグナルペプチドと融合した場合に、配列決定されたペプチドの大部分が成熟重鎖に一致することを示し（表４）、重鎖がペリプラズム空間に効率的に分泌されたことを示唆した（表４）。したがって、ＤｓｂＡシグナルペプチドは、ＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、またはＰｈｏＡシグナルペプチドが行うよりも効率的に、重鎖のプロセシング（重鎖前駆体から成熟重鎖へ）を仲介した。

本発明者らは、免疫金電子顕微鏡法（免疫ＥＭ）も行って、重鎖を様々なシグナルペプチドと融合させた場合のその細胞分布を直接視覚化した。震盪フラスコ培養物から収集した細菌を、凍結切断に供し、αＦｃ−ＨＲＰ抗体、続いてαＨＲＰ−１８ｎｍ金粒子二次抗体でプローブし、そして透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。ＳＴＩＩ軽鎖及びＳＴＩＩ重鎖を発現する細菌の場合、ペリプラズムには極わずかの免疫金シグナルしか見られなかった。金標識の大部分は、細胞質側で観測され、重鎖が主に細胞質に閉じ込められていることを示した（図２Ａ）。対照的に、ＳＴＩＩ軽鎖及びＤｓｂＡ重鎖を発現する細菌の場合、金標識は、主にペリプラズム側で検出された（図２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、同様な翻訳レベルでは、ＤｓｂＡシグナルペプチドの使用が、他の３種のシグナルペプチドを用いた場合よりも効率的な重鎖移行及びペリプラズムでのより多い重鎖蓄積をもたらしたことを実証する。

［シグナルペプチドの疎水性は、抗体重鎖のペリプラズムへの分泌及びペリプラズムでの蓄積に重要であった。］［訳者注：上記［ ］で囲まれている箇所は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０７８３では、下線が引かれている。］なぜＤｓｂＡシグナルペプチドが重鎖分泌により効率的であったのかという機構を調べるため、本発明者らは、ＤｓｂＡシグナルペプチドのアミノ酸配列をＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、及びＰｈｏＡシグナルペプチドのアミノ酸配列と比較した。一次配列における多様性にも関わらず、シグナルペプチドは、一般的に３つの別個の領域で構成される：１つまたは２つの正電荷を帯びたアミノ酸残基を含有するＮ末端領域、Ｈ領域と称することが多い疎水性コア領域、及びシグナルペプチダーゼが認識するＣ末端領域である［８］。ＤｓｂＡシグナルペプチドは、Ｈ領域及び全長配列が両方とも、ＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、及びＰｈｏＡシグナルペプチドのそれら領域よりも疎水性である（表２）。本発明者らは、シグナルペプチドの疎水性が、抗体重鎖のペリプラズムへの移行に重要な役割を果たしたのではないかと考えた。

［ＤｓｂＡ及びＳＴＩＩシグナルペプチドの疎水性を、部位特異的突然変異誘発により調節した。］［訳者注：上記［ ］で囲まれている箇所は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０７８３では、下線が引かれている。］ＤｓｂＡシグナルペプチドにおいてロイシン１１（Ｌ１１）をセリン（Ｓ）に置換すると、ＤｓｂＡシグナルペプチドの全体の疎水性及び平均疎水性が低下した（表７及び表２）。ＤｓｂＡシグナルペプチドにおけるロイシン１１からイソロイシン（Ｉ）への変異を、対照として作製した。ＳＴＩＩシグナルペプチド配列において、セリン１１をロイシンまたはイソロイシンに変異させると、疎水性が上昇した（表７及び表２）。変異させたシグナルペプチドを、ＴＩＲ強度測定のため、それぞれ、成熟ＰｈｏＡタンパク質と融合させた。ＳＴＩＩシグナルペプチドＴＩＲ１またはＤｓｂＡシグナルペプチドＴＩＲ１と同様なＴＩＲ強度を持つ疎水性シグナルペプチド変異体（表３）を抗体５Ｄ５重鎖と融合させた。重鎖と相互作用する及び／または同一分泌機構について競合する可能性がある軽鎖による影響の可能性を排除するため、本発明者らは、重鎖のみを発現し軽鎖は発現しないプラスミドを設計した。

ペリプラズム中の重鎖蓄積に対するシグナルペプチド疎水性変異体の効果を、ペリプラズム抽出物のウエスタンブロット分析により観測した（図３Ｂ）。軽鎖発現がない場合、ＤｓｂＡシグナルペプチドの使用は、ＳＴＩＩシグナルペプチドを使用した場合よりも多くペリプラズム中の可溶性重鎖をもたらした。Ｌ１１Ｓ変異によりＤｓｂＡシグナルペプチドの疎水性を低下させると、可溶性重鎖のペリプラズムレベルは大きく低下し、一方ＤｓｂＡシグナルペプチドＬ１１Ｉ対照の使用は、重鎖レベルに大きな変化を示さなかった（図３Ａ）。一方で、ＳＴＩＩシグナルペプチドの疎水性の上昇は、ペリプラズム中の可溶性重鎖のレベルを上昇させた（図３Ａ）。

５Ｄ５重鎖分泌に対するシグナルペプチド疎水性の効果をさらに確かめるため、本発明者らは、様々な異なる疎水性を持つ追加のシグナルペプチド変異体（表２；表８）を作成し、それらを５Ｄ５重鎖と融合させた。ＳＴＩＩシグナル配列において、セリン１１をアラニン（Ａ）に変異させると、全疎水性及び平均疎水性が上昇し、チロシン（Ｙ）への変異は、疎水性をわずかに上昇させるのみであり、またはグルタミン（Ｑ）への変異は、ＳＴＩＩの疎水性を低下させる。本発明者らは、Ａｌａ６（Ａ６）からロイシンへ、アラニン１０（Ａ１０）からロイシンへ、及びセリン１１（Ｓ１１）からロイシンへの三重変異体（ＳＴＩＩ Ａ６Ｌ、Ａ１０Ｌ、Ｓ１１Ｌ）を作ることにより高疎水性ＳＴＩＩシグナルペプチド変異体も作成した。ＤｓｂＡ配列において、ロイシン１１をアラニン（Ａ）またはグルタミン（Ｑ）に変異させると、全疎水性及び平均疎水性が低下した。シグナルペプチド変異体は全て、ＳＴＩＩシグナルペプチドＴＩＲ１またはＤｓｂＡシグナルペプチドＴＩＲ１と同様なＴＩＲ強度を有した（表３）。

軽鎖不在下での５Ｄ５重鎖のペリプラズムへの分泌効率を、上記のとおりＮ末端配列決定により求めた（表５）。ＤｓｂＡシグナルペプチドの使用は、重鎖の大部分が成熟重鎖であり前駆体重鎖の存在は極わずかであるという結果をもたらし、ＤｓｂＡシグナルペプチドを介した５Ｄ５重鎖分泌が効率的であることを示した。同様な結果は、対照である、ＤｓｂＡ Ｌ１１Ｉ変異体についても観察された。Ｌ１１Ａ、Ｌ１１Ｓ、またはＬ１１ＱによりＤｓｂＡシグナルペプチドの疎水性を低下させると、成熟５Ｄ５重鎖よりも前駆体の方が多く検出されたとおり、分泌効率が低下した。一方で、非定量的Ｅｄｍａｎ配列決定を用いると、ＳＴＩＩとＳＴＩＩ Ｓ１１Ｑのどちらも、５Ｄ５重鎖の効率的な分泌を仲介しなかったが、ＳＴＩＩ Ｓ１１Ｌは分泌を改善した。半定量的Ｅｄｍａｎ配列決定は、ＳＴＩＩ及びＳＴＩＩ Ｓ１１Ｙが５Ｄ５重鎖の非効率的な分泌を仲介したことを示した；しかしながら、ＳＴＩＩ Ｓ１１Ｑ変異は、分泌された５Ｄ５重鎖のパーセンテージを上昇させた。Ｓ１１Ａ変異またはＳ１１Ｌ変異によるＳＴＩＩシグナルペプチド疎水性の上昇は、分泌効率を上昇させた。そのうえ、同様な翻訳強度を持つ高疎水性ＳＴＩＩシグナルペプチドシグナル変異体（ＳＴＩＩ Ａ６Ｌ、Ａ１０Ｌ、Ｓ１１Ｌ）が分泌効率をさらに上昇させることがなかったことから、Ｓ１１Ｌ単独の残基変異で、効率的な５Ｄ５重鎖分泌に十分であった。まとめると、ＴＩＲ強度を制御しながらシグナルペプチド疎水性を調節することは、５Ｄ５重鎖のペリプラズムへの分泌効率に大きく影響した。

同様な結果が、軽鎖を重鎖と同時発現させた場合に、観察された。抗体５Ｄ５軽鎖をＳＴＩＩシグナルペプチドと融合させた場合（ｍＳＴＩＩ１）、ＤｓｂＡ Ｌ１１Ｓシグナルペプチドの使用は、ＤｓｂＡまたはＤｓｂＡ Ｌ１１Ｉシグナルペプチドを使用した場合よりも明らかに少ないペリプラズム中の水溶性重鎖をもたらした。同様に、ＳＴＩＩ Ｓ１１ＬまたはＳＴＩＩ Ｓ１１Ｉシグナルペプチドの使用は、ＳＴＩＩシグナルペプチドを使用した場合よりも多いペリプラズム中の可溶性重鎖蓄積を仲介した（図３Ｂ）。まとめると、シグナルペプチド疎水性の調節は、ペリプラズム中の５Ｄ５重鎖蓄積を顕著に変更した。単独のアミノ酸変更による疎水性の上昇は、可溶性重鎖のペリプラズムレベルを顕著に改善し、一方で疎水性の低下は反対の効果を有した。

本発明者らは、さらに、Ｎ末端配列決定により、重鎖プロセシングに対するシグナルペプチド疎水性の効果を分析した（表４）。各場合において、５Ｄ５軽鎖をＳＴＩＩシグナルペプチドと融合させた（ｍＳＴＩＩ１）。重鎖をＤｓｂＡ及びＤｓｂＡ Ｌ１１Ｉシグナルペプチドと融合させた場合、大部分を占める成熟重鎖シグナル及び極わずかな前駆体シグナルがＮ末端配列決定で検出された。ピーク強度に基づき見積もると、ＤｓｂＡシグナルペプチドを用いた構築物について成熟重鎖対前駆体重鎖の比は、１０：１超であった。ＤｓｂＡシグナルペプチドにおけるＬ１１Ｓ変異は、成熟重鎖シグナルよりも多くの前駆体重鎖シグナルが検出されたとおり、成熟／前駆体比を１：３に低下させた。ＳＴＩＩシグナルペプチドは、前駆体シグナルよりも少ない成熟重鎖シグナルを与え、成熟／前駆体比は１：３であった。Ｓ１１Ｌ変異またはＳ１１Ｉ変異によりＳＴＩＩシグナルペプチド疎水性を改善すると、前駆体重鎖よりも多い成熟重鎖をもたらした（３：１及び４：１）。Ｅｄｍａｎ配列決定から初収量を用いて半定量化することにより、５Ｄ５重鎖の分泌に対するシグナルペプチド疎水性の効果を確かめた。ＤｓｂＡシグナルペプチドの使用は、約８６％の分泌重鎖をもたらした；Ｌ１１Ｓ変異は、分泌重鎖のパーセンテージを３９％に低下させた。ＳＴＩＩは、３９％の分泌重鎖を仲介した；Ｓ１１Ｌ変異及びＳ１１Ｉ変異は、重鎖分泌を６０％超に増加させた。まとめると、シグナルペプチドの疎水性は、抗体重鎖プロセシング及びペリプラズムへの分泌に重要であった。

５Ｄ５分泌に対するシグナルペプチド疎水性の効果は、ＳｆｍＣ由来の高疎水性シグナルペプチドの研究によっても支持された。ＳｆｍＣは、ペリプラズムに局在する予測ピリンタンパク質である。ＳｆｍＣの分泌は、共翻訳分泌経路のシグナル識別粒子（ＳＲＰ）に依存している（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００５． ２９８３−２９９１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１４． ＰＬＯＳ Ｏｎｅ）。ＳｆｍＣのシグナルペプチドは、ＤｓｂＡまたはＳＴＩＩどちらのシグナルペプチドよりも疎水性である（表３）。本発明者らは、ＳｆｍＣシグナルペプチドのＴＩＲ１変異体及びＴＩＲ２変異体を作製し、それらをそれぞれ５Ｄ５重鎖と融合させた。変異体は両方とも、５Ｄ５重鎖の非常に効率的な分泌を仲介した（１００％分泌重鎖）。

［全長抗体レベルに対するシグナルペプチド疎水性の効果。］［訳者注：上記［ ］で囲まれている箇所は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０７８３では、下線が引かれている。］次に、本発明者らは、全長抗体産生に対するシグナルペプチド疎水性の効果を分析した。５Ｄ５重鎖及び軽鎖を発現する宿主細胞由来の溶解液を収集し、完全に構築された抗体５Ｄ５のレベルを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、続いてウエスタンブロットにより分析した。各場合において、５Ｄ５軽鎖をＳＴＩＩシグナルペプチドと融合させた（ｍＳＴＩＩ１核酸配列を用いる）。重鎖と融合したＤｓｂＡ Ｌ１１Ｓシグナルペプチドは、重鎖と融合したＤｓｂＡまたはＤｓｂＡ Ｌ１１Ｉシグナルペプチドの使用と比べて、全長５Ｄ５レベルの明らかな低下をもたらした（図４Ａ）。一方で、ＳＴＩＩシグナルペプチドのＳ１１Ｌ変異及びＬ１１Ｉ変異の両方が、ＳＴＩＩシグナルペプチドの使用と比べて、全長５Ｄ５抗体レベルを上昇させた（図４Ｂ）。したがって、シグナルペプチドの疎水性の上昇は、全長５Ｄ５抗体の産生を促進した。

本発明者らは、シグナルペプチド疎水性の効果が、他の抗体重鎖の分泌にも当てはまるのかどうかを知りたいと考えた。この目的で、本発明者らは、ＳＴＩＩ、ＳＴＩＩ Ｓ１１Ｌ、ＤｓｂＡ、またはＤｓｂＡ Ｌ１１Ｓ ＴＩＲ１シグナルペプチドを、ｍＡｂ１またはｍＡｂ２の重鎖と融合させて、Ｅｄｍａｎ配列決定を用いて、軽鎖の不在下で重鎖の分泌効率を測定した（表６）。両方の抗体重鎖について、ＤｓｂＡは、ＳＴＩＩよりも多い分泌重鎖を仲介した。Ｌ１１Ｓ変異によりＤｓｂＡの疎水性を低下させると、分泌重鎖のパーセンテージが低下し、Ｓ１１Ｌ変異によりＳＴＩＩの疎水性を上昇させると、反対の効果を示した。

本発明者らは、さらに、２種の他のモノクローナル抗体、ｍａｂ１及びｍａｂ２の全長抗体産生に対するシグナルペプチド疎水性の効果を試験した（図７）。ｍａｂ１及びｍａｂ２は、それぞれ全長ＩｇＧ１抗体である。どちらの場合も、軽鎖をｍＳＴＩＩ１と融合させ、重鎖を、同様なＴＩＲ強度を持つＳＴＩＩ、ＤｓｂＡ、ＳＴＩＩ Ｓ１１Ｌ、またはＤｓｂＡ Ｌ１１Ｓと融合させた。全長抗体レベル、ペリプラズム可溶性重鎖レベル、及び総合重鎖レベルを、上記のとおり求めた。ｍＡｂ１の場合、重鎖と融合したＳＴＩＩまたはＤｓｂＡシグナルペプチドは、同様なレベルの全長抗体及びペリプラズム可溶性重鎖をもたらした；しかしながら、疎水性の低下したＤｓｂＡ Ｌ１１Ｓシグナルペプチド変異体の使用は、全長ｍＡｂ１及びペリプラズム可溶性重鎖のレベルを明らかに低下させ、シグナルペプチド疎水性がｍＡｂ１産生及びペリプラズムへの分泌についても依然として重要な要因であることを示唆した。ｍＡｂ２の場合、ＳＴＩＩシグナルペプチドの使用は、ＤｓｂＡシグナルペプチドを使用した場合よりも少ない全長抗体及びより少ないペリプラズム可溶性重鎖をもたらした。Ｓ１１Ｌ変異によるＳＴＩＩシグナルペプチド疎水性の上昇は、全長ｍＡｂ２の増加、ならびにペリプラズム可溶性重鎖蓄積の増加を引き起こし、一方Ｌ１１Ｓ変異によるＤｓｂＡシグナルペプチドの疎水性の低下は、反対の効果を有した。したがって、シグナルペプチド疎水性は、ｍＡｂ２産生及びＥ．ｃｏｌｉペリプラズムへの分泌に重要である。

［シグナルペプチド疎水性の調節は、封入体の細胞分布を変化させた。］［訳者注：上記［ ］で囲まれている箇所は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０７８３では、下線が引かれている。］Ｅ．ｃｏｌｉ中の過剰発現した組換えタンパク質は、細胞質中またはペリプラズム中の、封入体として知られる巨大不溶性集合体に含まれていることが多い。目的のタンパク質を含有する封入体の形成は、可溶性の標的タンパク質が低レベルであることと関係することが多い。そのうえ、細胞質での封入体形成は、ペリプラズムへのタンパク質分泌が不十分であることを示す。透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を用いて、本発明者らが観察したところ、封入体は、ｍＳＴＩＩ１と融合した軽鎖及びＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、またはＰｈｏＡシグナルペプチドと融合した重鎖を発現する宿主細胞の細胞質において顕著であり（図５）、これらの細胞ではタンパク質分泌が不十分であることを示唆した。対照的に、ＳＴＩＩ−ＬＣ及びＤｓｂＡ−ＨＣを発現する宿主細胞の場合、封入体は、それほど一般的に観察されず、主にペリプラズムに局在しており（図５）、十分なタンパク質分泌を示した。興味深いことに、ＳＴＩＩ Ｓ１１Ｌシグナルペプチド（上昇した疎水性を持つ）の使用は、ＤｓｂＡシグナルペプチドの表現型と同様な表現型を示した：封入体は、ペリプラズム側に主に局在していた（図５）。ＤｓｂＡ Ｌ１１Ｓシグナルペプチド（低下した疎水性を持つ）の使用は、封入体が細胞質で主に観測されるという結果になった（図５）。まとめると、シグナルペプチド疎水性の調節は、封入体の細胞分布を改変した。

［シグナルペプチドのＣ末端ドメインにおける変異は、全長抗体産生を改変しなかった。］［訳者注：上記［ ］で囲まれている箇所は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２０７８３では、下線が引かれている。］シグナルペプチドのＣ末端領域は、ペプチダーゼによるシグナルペプチドの切断に非常に重要である。先行研究は、この領域が、典型的に、切断部位中の１位及び３位に短い側鎖を持つアミノ酸残基を好むことを示す［６］。ＳＴＩＩシグナルペプチド及びＤｓｂＡシグナルペプチドは両方とも、１位及び３位に小残基（Ａｌａ）を有する（図３Ａ）。しかしながら、ＤｓｂＡ配列の２位には、小残基Ｓｅｒがあるのに対して、ＳＴＩＩ配列の同じ位置には、かさ高い残基（Ｔｙｒ（Ｙ））がある。図６は、切断部位中の２位アミノ酸における側鎖の大きさの変更が、抗体５Ｄ５産生に影響しないことを示す。ＳＴＩＩシグナルペプチドにおけるＴｙｒ２２からＳｅｒへの変異は、５Ｄ５レベルを変更しなかった。同様に、ＤｓｂＡシグナルペプチドにおけるＳｅｒ１８からＴｙｒへの変異は、５Ｄ５レベルに影響しなかった。したがって、２位アミノ酸における側鎖の大きさは、ペリプラズム中の５Ｄ５レベルに影響しなかった。

表２：シグナルペプチド変異体のアミノ酸配列
下線＝アミノ酸配列中の変異
合計疎水性（ｓｕｍ ｈｙｄｒｏ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらにより開発された正規化共通尺度［２０］に基づいて計算。
平均疎水性＝シグナル配列の合計疎水性をアミノ酸残基の個数で割ったもの
合計疎水性（Ｈ）＝Ｈ領域の合計疎水性
平均疎水性（Ｈ）＝Ｈ領域の平均疎水性

表３．シグナルペプチド変異体のＤＮＡ配列及び相対ＴＩＲ強度
太字＝ＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩ、またはＸｂａＩ制限部位
下線＝アミノ酸配列を変更するためになされた変異

表４．５Ｄ５軽鎖を同時発現する５Ｄ５重鎖の分泌
^＊推定成熟／前駆体比は、ピーク強度の概算に基づく。
^＊＊分泌ＨＣ％は、材料及び方法の節で記載したとおり、成熟重鎖及び前駆体の初収量の半定量化により求める。

表５．５Ｄ５軽鎖不在下での５Ｄ５重鎖の分泌
^＊分泌ＨＣ％は、材料及び方法の節で記載したとおり、成熟重鎖及び前駆体の初収量の半定量化により求める。

表６．軽鎖不在下でのｍＡｂ１重鎖及びｍＡｂ２重鎖の分泌。
^＊分泌ＨＣ％は、材料及び方法の節で記載したとおり、成熟重鎖及び前駆体の初収量の半定量化により求める。

表７．ＤｓｂＡシグナル配列、ＳＴＩＩシグナル配列、及び疎水性を改変した変異体シグナル配列のアミノ酸配列。Ｎ末端領域を太字で示し、Ｈ領域を斜体で示し、Ｃ末端領域を通常の字体で示す。変異した残基には下線を付してある。

表８．ＤｓｂＡシグナル配列、ＳＴＩＩシグナル配列、疎水性を改変した変異体シグナル配列、及びＳｆｍＣシグナル配列のアミノ酸配列。Ｎ末端領域を太字で示し、Ｈ領域を斜体で示し、Ｃ末端領域を通常の字体で示す。変異した残基には下線を付してある。

部分的参考文献一覧
１． Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｌ．Ｃ． ａｎｄ Ｄ．Ｇ． Ｙａｎｓｕｒａ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６．１４（５）：ｐ．６２９−３４．
２． Ｓｉｍｍｏｎｓ， Ｌ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２．２６３（１−２）：ｐ．１３３−４７．
３． ＵＳ ８３６１７４４
４． Ｑｕａｎ，Ｓ．， ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１３．９６６：ｐ．３５９−６６．
５． Ｏｌｉｖｅｒ， Ｄ．Ｂ． ａｎｄ Ｊ． Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ｃｅｌｌ，１９８２．３０（１）：ｐ．３１１−９．
６． Ａｕｃｌａｉｒ， Ｓ．Ｍ．， Ｍ．Ｋ． Ｂｈａｎｕ， ａｎｄ Ｄ．Ａ． Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，２０１２．２１（１）：ｐ．１３−２５．
７． Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ， Ｌ．Ｇ． ａｎｄ Ｌ．Ｌ． Ｒａｎｄａｌｌ，Ｃｅｌｌ，１９８１．２５（１）：ｐ．１５１−７．
８． Ｉｚａｒｄ ＪＷ， Ｋ．Ｄ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４．１３（５）：ｐ．７６５−７３．

理解を深める目的で、本発明を例示及び模範例というやり方である程度詳細に記載してきたものの、記載及び例示は、本発明の範囲を制限するものと見なされるべきではない。本明細書中引用される全ての特許及び学術文献の開示は、その全体が参照として明らかに援用される。

Claims (53)

1. Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からの抗体重鎖及び抗体軽鎖を含む抗体の分泌の増加方法であって、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第一シグナルペプチドをコードする第一ポリヌクレオチド；及び（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第二シグナルペプチドをコードする第二ポリヌクレオチド、を含むポリヌクレオチドを含み、第一及び／または第二シグナルペプチドが以下：
   ａ）残基Ｌ１１に変異を含み、配列番号３のＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有し、前記変異がＬ１１Ｉである、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチド、
   ｂ）残基Ｓ１１に変異を含み、配列番号１のＳＴＩＩシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有し、前記変異が、Ｓ１１Ａ、Ｓ１１Ｉ、またはＳ１１Ｌである、変異型ＳＴＩＩシグナルペプチド、または、
   ｃ）配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列を含む、変異型シグナルペプチド
   からなる群から選択され、
   そうすることにより、宿主細胞での抗体の発現に際して、前記重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することを含む、方法。
2. 前記第一及び／または第二シグナルペプチドが、残基Ｌ１１に変異を含み、配列番号３のＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有し、前記変異がＬ１１Ｉである変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
3. 前記第一及び／または第二シグナルペプチドが、残基Ｓ１１に変異を含み、配列番号１のＳＴＩＩシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有し、前記変異が、Ｓ１１Ａ、Ｓ１１Ｉ、またはＳ１１Ｌである変異型ＳＴＩＩシグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
4. 前記第一及び／または第二シグナルペプチドが、配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列を含む変異型シグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
5. 前記第一及び／または第二シグナルペプチドが、配列番号１３または１５の配列を含む変異型ＤｓｂＡシグナルペプチドである、請求項１に記載の方法。
6. 前記宿主細胞中の前記ポリヌクレオチドは、プロモーターをさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記プロモーターは、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、及びＴ７プロモーターからなる群より選択される原核生物プロモーターである、請求項６に記載の方法。
8. 前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、内因性プロテアーゼ活性が欠損した株のものである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子型が、ｄｅｇＰ遺伝子及びｐｒｃ遺伝子を欠いており、かつ突然変異ｓｐｒ遺伝子を抱えている、請求項８に記載の方法。
10. 前記宿主細胞は、さらに、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ、及びＦｋｐＡからなる群より選択される少なくとも１種の原核生物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. ポリヌクレオチドが、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの両方をコードする、請求項１０に記載の方法。
12. 抗体を宿主細胞培養物から回収することをさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記モノクローナル抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１３に記載の方法。
15. 残基Ｌ１１及び／またはＳ１８に変異を含み、配列番号３のＤｓｂＡシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有し、前記変異がＬ１１Ｉ及び／またはＳ１８Ｙである、変異型ＤｓｂＡシグナルペプチド。
16. 配列番号１のＳＴＩＩシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する、残基Ｓ１１に変異を含む変異型ＳＴＩＩシグナルペプチド。
17. 前記変異が、Ｓ１１Ａ、Ｓ１１Ｉ、またはＳ１１Ｌである、請求項１６に記載の変異型ＳＴＩＩシグナルペプチド。
18. 配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列を含む、変異型シグナルペプチド。
19. 異種タンパク質と融合した、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の変異型シグナルペプチド。
20. 異種ポリペプチドは、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体軽鎖及び抗体重鎖、多量体ポリペプチド、及びイムノアドヘシンからなる群から選択される、請求項１９に記載の変異型シグナルペプチド。
21. 請求項１５から１８のいずれか１項に記載の変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド。
22. 異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した請求項２１に記載のポリヌクレオチドであって、それにより、宿主細胞中での前記異種ポリペプチドの発現に際して、前記異種ポリペプチドは折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する、ポリヌクレオチド。
23. 前記宿主細胞は、原核生物宿主細胞である、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
24. 前記宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
25. 抗体をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それにより、宿主細胞中での前記抗体発現の際に、前記重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成し、前記第一及び／または第二シグナルペプチドは請求項１５から１７のいずれか１項に記載の変異型シグナルペプチドであるか、または前記第一及び／または第二シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列を含む、ポリヌクレオチド。
26. 前記第一シグナルペプチドが、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の変異型シグナルペプチドである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
27. 前記第一シグナルペプチドが、配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
28. 前記第二シグナルペプチドが、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の変異型シグナルペプチドである、請求項２５から２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
29. 前記第二シグナルペプチドが、配列番号８、１１、１３、１５、３１、または３３の配列を含む、請求項２５から２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
30. 抗体をコードする前記ポリヌクレオチドは、（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第三シグナルペプチドをコードするポリペプチドをさらに含む、請求項２５から２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
31. 前記第三シグナルペプチドは、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の変異型シグナルペプチドであるか、あるいは前記第三シグナルペプチドは、配列番号８、１１、１３、１５、３１、３３、または４２の配列を含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
32. 前記異種ポリペプチドと作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項２２から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
33. 前記プロモーターは、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｒｐ、及びＴ７プロモーターからなる群より選択される原核生物プロモーターである、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
34. 前記プロモーターが、ｐｈｏＡプロモーターである、請求項３３に記載のポリヌクレオチド。
35. （ａ）第一プロモーターであって、軽鎖と作動可能に連結している前記第一プロモーター、及び（ｂ）第二プロモーターであって、重鎖と作動可能に連結している前記第二プロモーター、をさらに含む、請求項２２から３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
36. 前記第一プロモーター及び第二プロモーターが、両方ともｐｈｏＡプロモーターである、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
37. （ｃ）第三プロモーターであって、Ｆｃポリペプチドと作動可能に連結している前記第三プロモーター、をさらに含む、請求項３５または３６に記載のポリヌクレオチド。
38. 前記プロモーターが、ｐｈｏＡプロモーターである、請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
39. 前記異種ポリペプチドは、プロテアーゼ、イムノアドヘシン、受容体の細胞外ドメイン、ヘテロ多量体タンパク質、または抗体である、請求項２２から２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
40. 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２５から３８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
41. 前記モノクローナル抗体は、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、抗体断片、一本腕抗体断片、またはヒト抗体である、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
42. 請求項２２から４１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
43. 請求項２２から４１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
44. 請求項２１から４１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
45. 原核細胞である、請求項４４に記載の宿主細胞。
46. 原核生物シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４４または４５に記載の宿主細胞。
47. 原核生物シャペロンタンパク質を過剰発現する、請求項４６に記載の宿主細胞。
48. 異種ポリペプチドの作成方法であって、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の宿主細胞を、核酸が発現されるように培養することを含み、それにより、該宿主細胞中での前記ポリヌクレオチドの発現の際に、前記異種ポリペプチドが折り畳まれて生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する、方法。
49. 細胞からの異種ポリペプチドの分泌方法であって、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の宿主細胞を、核酸が発現され、かつ前記異種ポリペプチドが分泌されるように培養することを含む、方法。
50. 細胞からの異種ポリペプチドの移行方法であって、請求項４４から４７のいずれか１項に記載の宿主細胞を、核酸が発現され、かつ前記異種ポリペプチドが移行されるように培養することを含む、方法。
51. 異種ポリペプチドが、抗体重鎖及び／または抗体軽鎖である、請求項４８から５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 請求項４８から５１のいずれか１項に記載の方法により得られる異種ポリペプチド。
53. 抗体である、請求項５２に記載の異種ポリペプチド。