JP2022166004A - 多重特異性抗体の精製 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年6月17日出願の米国仮特許出願第62/351,908号の優先権利益を主張するものであり、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる:コンピュータ可読形態(CRF)の配列表(ファイル名:146392036340SEQLIST.TXT、記録日:2017年6月9日、サイズ:32KB)。
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%-~5%未満の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%未満の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び/または
f)約5%以下の3/4抗体を含む。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸塩化、もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸(例えば、非天然アミノ酸などを含む)の1つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体を具体的に包含する。
”126:330-41(1995)に概説される。将来的に特定されるものも含む他のFcRは、本明細書における「FcR」という用語に包含される。この用語は、母体IgGsの胎児への移行に関与している新生児受容体FcRnも含む(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
100×分数X/Y
多重特異性抗体を精製するための方法が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、第1の標的を結合する第1のF(ab)及び第2の標的を結合する第2のF(ab)を含む二価のF(ab’)2である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、すなわち、アミノ酸配列において同一である2つの抗原結合アームを有する抗体であり、各Fabアームは、2つの抗原(二重作用Fab抗体など)を認識することが可能である。
表1
表2
表3:DNAの開始量:80pg/mg
表4
モノクローナル抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び/または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異体は除外され、そのような変異体は、概して、少量で存在する。したがって「モノクローナル」という修飾語は、個別のまたはポリクローナル抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化により得られた(例えば、Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992)及びBrennan et al.,Science229:81(1985)を参照されたい)。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Fab’-SH断片は、E.coliから直接回収され、化学的にカップリングされて、F(ab’)2断片を形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology10:163-167(1992)。別のアプローチに従って、F(ab’)2断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片を産生するための他の技法が、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185、米国特許第5,571,894号、及び米国特許第5,587,458号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されるように、「線状抗体」でもあり得る。そのような線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるタンパク質のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、タンパク質の結合親和性及び/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び/またはそれへの挿入、及び/またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われて、最終構築に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性を有することを条件とする。
表5
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。そのようなエピトープタグ形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用してポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方は、c-metに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、c-metの2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、細胞毒性薬を、c-metを発現する細胞に限局させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面が操作されて、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面由来の1つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)で置き換えられる(ノブまたは隆起)。大きい側鎖(複数可)と同一または同様の大きさの補償「空洞」(ホール)は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはトレオニン)で置き換えることによって第2の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物を上回るヘテロ二量体の収率を増大するための機序を提供する。ノブ及びホールは、本明細書にさらに記載されている。
表6:アミノ酸の特性
aアミノ酸の分子量から水の分子量を差し引いたもの。Handbook of Chemistry and Physics,43rd ed.Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961からの値。
bA.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.,24:107-123,1972からの値。
cC.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975からの値。接書可能表面領域は、この参考文献の図6~20に定義されている。
Schaefer et al.(Roche Diagnostics GmbH)は、人工的なリンカーを使用することなく、ヒト二価の二重特異性IgG抗体として、2つの存在する抗体に由来する2つの重鎖及び2つの軽鎖を発現するための方法を記載する(PNAS(2011)108(27):11187-11192及びUS2009/0232811)。方法は、2分の1の二重特異性抗体の抗原結合断片(Fab)内で1つ以上の重鎖及び軽鎖ドメインを交換することを含む(CrossMab)。軽鎖及びそれらの同種重鎖の正しい会合は、二重特異性抗体の2分の1の抗原結合断片(Fab)内での重鎖及び軽鎖ドメインの交換によって達成される。この「クロスオーバー」は、抗原結合親和性を保持するが、2つのアームを異なるようにするため軽鎖の誤対合はもはや生じ得ない。WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、及びWO2010/145793を参照されたく、各々がその全体において参照により本明細書に組み込まれる。例えば、多重特異性抗体の「ノブイントゥホール(Knobs into holes)」(KiH)または「CrossMab」技術発現のような方法論の開発に起因する、これらの最近の利点は、依然として、それらの生成に特異的に関連する生成物-特異的不純物の所望でない形成をもたらし得る。これらの生成物-特異的不純物は、例えば、1/2抗体(単一の重鎖/軽鎖対を含む)、3/4抗体(単一の軽鎖を欠乏する完全抗体を含む)、または生成物5/4抗体(追加の重鎖または軽鎖可変ドメインを含む)を含み得る。
二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)分子に使用される別の形式(例えば、Wolf et al.(2005)Drug Discovery Today10:1237-1244)は、一本鎖可変断片(scFv)モジュールに基づく。scFvは、柔軟なリンカーを介して融合された抗体の軽鎖及び重鎖可変領域からなり、それは、概して、適切に折り畳むことができるため、領域は同種抗原を結合し得る。BiTEは、一本鎖上でタンデムにおける2つのscFvの異なる特異性を連結する。この構成は、同じ重鎖可変領域の2つのコピーを有する分子の生成を排除する。加えて、リンカー構成は、それぞれの軽鎖及び重鎖の正しい対合を確実にするために設計されている。
Strop et al.(Rinat-Pfizer Inc.)は、対象の2つの抗体を別々に発現及び精製し、次いで、特定の酸化還元条件下でそれらを一緒に混合することによって安定な二重特性抗体を生成する方法を記載する(J.Mol.Biol.(2012)420:204-19)。
本明細書に記載される精製の方法で使用される多重特異性抗体は、組換え方法を含む、当技術分野で周知の方法を使用して得られてもよい。以下のセクションは、これらの方法に関する手引きを提供する。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。
以下の説明は、主に、ポリペプチドコードポリヌクレオチドを含むベクターで転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによるポリペプチドの生成に関する。当然、当該技術分野で周知の代替的な方法が、ポリペプチドを調製するために用いられ得ることが企図される。例えば、適切なアミノ酸配列またはその部分は、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る(Stewart et al.,Solid-Phase Peptide Synthesis W.H.Freeman Co.,San Francisco,Calif.(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)を参照されたい)。インビトロタンパク質合成は、手動技法を使用して、または自動で行われ得る。自動合成は、例えば、製造業者の指示を使用したApplied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City,Calif.)を使用して達成され得る。ポリペプチドの様々な部分が別個に化学的に合成され、化学的または酵素的方法を使用して組み合わせられて、所望のポリペプチドを産生することができる。
「ベクター」という用語は、発現ベクター、ならびに形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、または他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞であり得る。
ベクター構築
本明細書に提供される方法に従って精製される多重特異性抗体のポリペプチド構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得られることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはPCR技術を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチド(2つ以上の重鎖及び/または2つ以上の軽鎖)をコードする配列は、宿主細胞(E.coli細胞など)で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、当該技術分野で既知である多くのベクターが、本明細書に提供される方法及び組成物の目的のために使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方)及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。
シグナル配列構成成分
真核宿主細胞において使用するためのベクターもまた、目的とする成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドを含有してもよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のDNAは、リーディングフレームにおいて、所望のヘテロ多量体タンパク質(例えば、抗体)をコードするDNAにライゲーションされる。
一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、SV40起点が典型的に使用され得るが、これは単に、SV40起点が初期プロモーターを含有するためである。
発現及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、(b)栄養要求性欠損を補完するか(関連性のある場合)、または(c)複合培地から入手不可能な必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、所望のヒンジ含有ポリペプチド(複数可)(例えば、抗体)核酸に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。真核生物のためのプロモーター配列が既知である。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位からおよそ25~30塩基上流に位置するATに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から70~80塩基上流に見られる別の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大半の真核遺伝子の3’末端は、コード配列の3’末端へのポリA尾部の付加のためのシグナルであり得るAATAAA配列である。これらの配列は全て、真核発現ベクターに好適に挿入される。
より高次の真核生物による、所望のヒンジ含有ポリペプチド(複数可)(例えば、抗体)をコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加され得る。哺乳類遺伝子(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、及びインスリン遺伝子)由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。また、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用してもよい。例としては、複製起点の後半側のSV40エンハンサー(bp100~270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化を強化するための要素の説明に関しては、Yaniv,Nature297:17-18(1982)も参照されたい。エンハンサーは、エンハンサーが達成される限り、抗体ポリペプチドコード配列の5’位側でも3’位側でもベクターへとスプライシングされ得るが、一般には、プロモーターから5’部位に位置する。
原核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、一般に、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’非翻訳領域、時に、3’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするmRNAの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。1つの有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026及びそこで開示される発現ベクターを参照されたい。
本明細書におけるベクター中のDNAのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載のより高次の真核生物細胞が挙げられる。培養物(組織培養物)中での脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手技になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL1651)、ヒト胚腎臓株(293細胞または懸濁培養物中での成長のためにサブクローン化された293細胞、Graham et al.,J.Gen Viral.36:59(1977))、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10)、チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub et al.,Proc.Nat/.Acad.Sci.USA77:4216(1980);マウスセルトリ細胞(TM4、Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、サル腎臓細胞(CV1ATCC CCL70)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL2)、イヌ腎臓細胞(MOCK、ATCC CCL34)、バッファローラット肝細胞(BRL3A、ATCC CRL1442)、ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL75)、ヒト肝細胞(Hep G2、HB8065)、マウス乳房腫瘍(MMT060562、ATCC CCL51)、TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5細胞、FS4細胞、及びヒト肝臓癌株(Hep G2)である。
多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ham’s F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及びダルベッコ修飾イーグル培地((DMEM)、Sigma)などの市販されている培地は、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)、Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、同第4,560,655号、もしくは同第5,122,469号、WO90/03430、WO87/00195、または米国特許再発行第30,985号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び/または他の増殖因子(インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など)、緩衝液(HEPESなど)、ヌクレオチド(アデノシン及びチミジンなど)、抗生物質(GENTAMYCIN(商標)薬など)、微量要素(マイクロモルの範囲の最小濃度で通常存在する無機化合物と定義される)、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を産生する方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、半抗体を別々に産生することによって産生され、各半抗体は、特定のエピトープ(例えば、単一標的上で異なるエピトープ、または2つ以上の標的上で異なるエピトープ)を結合するVH/VL単位を含む。いくつかの実施形態では、各半抗体は、宿主細胞中で別々に産生される。いくつかの実施形態では、半抗体の各々は、同じ宿主細胞中で産生され得る。半抗体は、混合され、多重特異性抗体をアセンブリングすることを可能にされる。いくつかの実施形態では、半抗体の各々は、同じ宿主細胞中で一緒に産生される。いくつかの実施形態では、宿主細胞(原核生物宿主細胞、例えば、E.coli細胞など)は、FkpA、DsbA、及び/またはDsbCなどのシャペロンを発現し、半抗体の折り畳みを容易にする。
本明細書に記載される方法に従って精製される多重特異性抗体によって標的とされ得る分子の例としては、これらに限定されないが、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、ならびにタンパク質(例えば、アドヘシン)を結合する他の膜が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って精製される多重特異性抗体は、1つ、2つ、または2つ超のサイトカイン、サイトカイン-関連タンパク質、ならびに8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL33、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40リガンド)、TNFSF5(CD40リガンド)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27リガンド)、TNFSF8(CD30リガンド)、TNFSF9(4-1BBリガンド)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(レプチン)、PTN、及びTHPOからなる群から選択されるサイトカイン受容体を結合することが可能である。
(TRAIL);TNFSF11(TRANCE);TNFSF12(AP03L);TNFSF13(April);TNFSF13B;TNFSF14(HVEM-L);TNFSF15(VEGI);TNFSF18;TNFSF4(OX40リガンド);TNFSF5(CD40リガンド);TNFSF6(FasL);TNFSF7(CD27リガンド);TNFSFS(CD30リガンド);TNFSF9(4-1BBリガンド);TOLLIP;Toll様受容体;TOP2A(トポイソメラーゼEa);TP53;TPM1;TPM2;TRADD;TRAF1;TRAF2;TRAF3;TRAF4;TRAF5;TRAF6;TREM1;TREM2;TRPC6;TSLP;TWEAK;ユビキチン;VEGF;VEGFB;VEGFC;バーシカン;VHL C5;ビメンチン;VLA-4;XCL1(リンホタクチン);XCL2(SCM-1b);XCRI(GPR5/CCXCRI);YY1;ならびにZFPM2からなる群から選択される1つ以上の標的を結合することが可能である。
製剤及び本明細書に記載される方法によって精製される多重特異性抗体を含む製剤を作製する方法もまた本明細書に提供される。例えば、精製されたポリペプチドは、薬学的に許容される担体と組み合わされ得る。
本明細書に記載の方法によって精製される多重特異性抗体及び/または本明細書に記載の方法によって精製されるポリペプチドを含む製剤は、製品に含まれ得る。製品は、ポリペプチド及び/またはポリペプチド製剤を含む容器を含み得る。好ましくは、製品は、(a)本明細書に記載のポリペプチド及び/またはポリペプチド製剤を含む組成物を容器内に含む容器、ならびに(b)製剤を対象に投与するための指示を有する添付文書を含む。
配列表の説明
標的タンパク質X1及びY1-抗X1/抗Y1二重特異性抗体またはaX1/Y1二重特異性に対する二重特異性抗体は、以下のとおりにアセンブリングされた。各半抗体(aX1(ノブ)及びaY1(ホール)は独立して、プロテインA樹脂(MabSelect SuRe,GE Healthcare)を使用して親和性クロマトグラフィーのステップにかけられた。プロテインAのステップは独立して、類似のプロセス条件を使用して各半抗体を完了するが、異なる装填物密度の標的である。プロテインAカラムは、周囲温度(15~30℃)で行われ、装填物は、12~18℃に冷却された。プロテインAカラムは、溶出緩衝液の3つのカラムの体積、その後に再生成緩衝液の3つのカラムの体積を適用させることによって調製された。カラムは、次いで、装填材料を処理するのに十分なサイクルで平衡化、装填、3回洗浄(平衡化緩衝液洗浄、リン酸塩カリウム洗浄、平衡化緩衝液洗浄)、溶出、及び再生成された。プロテインAカラムのプールされた材料は、調節されたpHであり、必要な場合、溶出緩衝液の添加によってpH≦3.60を達成し、最低120分間維持する。このステップの後に、プールされた材料のpHは、さらなるプロセスのためにpH5.0±0.3に調節された。
表7:抗X1/抗Y1二重特異性抗体の宿主細胞-関連不純物及び生成物-関連不純物からの分離(POROS XS樹脂、結合/溶出モード)
表8:二重特異性抗体の宿主細胞-関連不純物及び生成物-関連不純物からの分離(Capto MMC樹脂、結合/溶出モード)
CHOP=CHO細胞タンパク質;HMWS=高分子量種;150kD=二重特異性及びホモ二量体;75kD=半抗体;LMWS=低分子量種
表9:二重特異性抗体の宿主細胞-関連不純物及び生成物-関連不純物からの分離
(QSFF樹脂、フロースルーモード)
CHOP=CHO細胞タンパク質;HMWS=高分子量種;150kD=二重特異性及びホモ二量体;75kD=半抗体;LMWS=低分子量種
表10:二重特異性抗体の
宿主細胞-関連不純物及び生成物-関連不純物からの分離(Capto(商標)Adhere樹脂、フロースルーモード)
CHOP=CHO細胞タンパク質;HMWS=高分子量種;75kD=半抗体;LOQ=定量下限
表11:Capto Adhere及びQSFFの比較
CHOP=CHO細胞タンパク質;HMWS=高分子量種;75kD=半抗体;LOQ=定量下限
90%純粋のF(ab’)2二重特異性を達成するための最初の試みは、低い収率(10%未満の開始材料)をもたらした。純度の損失なく許容可能な収率を維持する問題に加えることは、いくつかの困難であり、プロセス中間体の不安定性と、ホモ二量体、遊離軽鎖及び重鎖、ならびに未反応Fab’脱離基などの生成物-関連バリアントの存在とを含む。新規の単位操作は、所望の二重特異性F(ab’)2の効率的なアセンブリ及び精製を達成するために開発された。2つの異なるFab’分子を含む二重特異性F(ab’)2は、図2に提供される概略図に示されるようにアセンブリング及び精製された。
表12:F(ab’)2の宿主細胞-関連不純物及び生成物-関連不純物からの分離(POROS(登録商標)HS樹脂、結合及び溶出モード対Capto(商標)MMC、結合及び溶出モード)
F(ab’)2%=SECによって測定された二重特異性%;100kD=CE-SDSによって測定された対象のF(ab’)2二重特異性生成物;71kD=CE-SDSによって測定された誤形成ジスルフィドを有する生成物関連バリアント;ECP=E.coliタンパク質
別の実施例では、二重特異性抗体は、以下のとおりに精製された。各半抗体は、別々に生成され、親和性クロマトグラフィーにかけられ、その後に上記に記載されるアセンブリが続いた。アセンブリ後に、アセンブリ材料は、結合及び溶出モードでCapto(商標)Adhere樹脂を使用して、まずマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーにかけられた。アセンブリ材料は、pH7.5に調節され、150mMの酢酸塩/トリス緩衝液(pH7.5)で事前平衡化されたカラム上に装填された。装填後に、カラムは、平衡化緩衝液で洗浄され、結合タンパク質は、25mMの酢酸塩(pH5.0)で溶出された。溶出プールの収集は、A280nmのシグナルに基づいて引き起こされた。次いで、Capto(商標)Adhere溶出プールは、結合及び溶出モードでCapto(商標)MMC樹脂を使用してマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーにかけられた。Capto Adhere溶出プールは、pH6.5に調節され、25mMの酢酸塩、25mMのMES(pH6.5)緩衝液中に事前平衡化されたCapto MMCカラム上に装填された。装填後に、Capto(商標)MMCカラムは、平衡化緩衝液で洗浄され、結合タンパク質は、150mMのNa-酢酸塩、25mMのMES(pH6.5)で溶出された。Capto(商標)MMC溶出緩衝液。プール収集は、A280nmのシグナルに基づいた。この精製スキームは、図3Aに示される。
表13:抗X2/Y2プロセスにおいてCapto(商標)Adhere-QSFFステップで達成されるプロセス特異的不純物及び生成物-特異的不純物の浄化
表14:抗X2/Y2プロセスにおいてCapto(商標)Adhere-Capto(商標)MMCステップで達成される
プロセス特異的不純物及び生成物特異的不純物の浄化
抗X3ノブ半抗体は、プロテインAカラム上で捕捉された。カラムは、最初に、25mMのトリス、25mMの塩化ナトリウム(pH7.7)平衡化緩衝液を使用して平衡化された。次いで、抗X3半抗体を含むE.coli抽出物上清は、カラム上に装填された。抽出物上清の装填後に、カラムは、平衡化緩衝液、その後に0.4Mのリン酸塩(pH7)洗浄緩衝液で洗浄され、次いで、平衡化緩衝液で洗浄された。次いで、抗X3半抗体は、0.15Mの酢酸(pH2.9)溶出緩衝液を使用して溶出された。溶出プールは、A280によって収集された。溶出プールは、pH5.0に滴定され、次いで、抗Y3ホール半抗体との組み合わせまで保管された。抗Y3ホール半抗体は、抗X3半抗体について記載される同じプロテインAを使用して捕捉された。
表15
HMWS=SECによって測定された高分子量種;二重特異性%=逆相HPLCによって測定された二重特異性抗体の%;ECP=E.coli宿主細胞タンパク質
抗体
実施例6~7は、WO2011/117329もしくは配列番号1~配列番号4に記載されるANG2及びVEGFを結合する二重特異性抗体-A(抗Ang2/VEGF-A抗体;vanucizumab;RG7221)、またはWO2014/009465もしくは配列番号5~配列番号8に記載されるVEGF-A及びAng2に対する二重特異性抗体(抗VEGF-A/Ang2抗体;RG7716)を含む様々な例示的な抗体を使用する。また以下の実施例に記載されるように、いくつかの抗体が本明細書に含まれる。
SE HPLCは、SE HPLCカラムを用いることによって天然の条件下でサイズ異種性を監視するために使用され、抗体凝集体、単量体、及び断片を分離する。溶出物は、UV吸光度によって監視される。純度は、検出される全てのタンパク質のピークの合計に対して主ピーク、HMWS形態の合計、及びLMWS形態の合計の百分率(領域)で決定される。
勾配イオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換カラムを用いることによってカルボキシペプチダーゼBで処理される試料の荷電異種性を定量的に監視するために使用され、試料を主ピーク、酸性領域、及び塩基性領域に分離する。検出は、UV吸光度によって行われる。純度は、検出される全てのタンパク質のピークの合計に対して主ピーク、酸性領域、及び塩基性領域の百分率(領域)で決定される。
タンパク質の電気泳動分離のための従来のSDS-PAGE方法は、Caliper GXII/LabChip GXアッセイシステム(Caliper LifeScience,Inc./Perkin Elmer)におけるチップ形式に移行されている。タンパク質は、それらの相対的なサイズによって分離される。試料は、製造者の指示に従って検出及び分析され得る蛍光色素で標識することによって分離前に調製される。
試料のタンパク質濃度は、UVによって決定される。タンパク質吸収は、280nmの吸収から320nmの吸収を差し引くことによって修正した。この吸光値は、タンパク質濃度に直接正比例する。タンパク質濃度は、1.5mLmg-1cm-1の吸光係数を使用して計算される。
a)CHO HCPアッセイ
プロセス試料中の残留CHO HCP含量は、cobas e411免疫分析装置(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)上で電気化学発光免疫測定法(ECLIA)によって測定される。
q PCRに基づくアッセイは、CHO DNAの検出及び定量化に使用される。試料からのDNAは、シリカゲルに基づく膜を使用して商用のRNA抽出キットで抽出される。抽出されたDNAは、配列検出システムでPCRプライマー及びプローブを使用して定量的リアルタイムPCRにかけられる。アンプリコン(増幅産物)は、DNA増幅の間に連続的に測定された蛍光発光の増加に対して正比例して定量化される。標準曲線は、試料中のCHO細胞DNAの量を定量化するために使用される。
CHO発現培養から採取された細胞培養液(HCCF)は、結合溶出モードでMabSelect SuRe親和性クロマトグラフィーによって処理された。38gmAb/l樹脂の最大装填物密度までのカラム上へのHCCFの装填後、カラムは、5カラム体積に対して25mMのトリス、25mMのNaCl(pH7.2)で洗浄された。次いで、5カラム体積に対して0.7Mのトリス/HCl(pH7.2)で追加の洗浄が行われた。第3の洗浄ステップは、高純度精製水または10mMのトリス/HCl(pH7.5)を使用して行われた。カラム結合抗体は、50mMの酢酸塩(pH3.4)を使用して溶出された。溶出プールは、最大3カラム体積にわたる500~250mAU(路長1cm)のOD280に基づいて収集された。
表16:それぞれのクロマトグラフィーのステップ後の生成物-特異的不純物及びプロセス特異的不純物の分析的データ
表17:親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む4つのクロマトグラフィーカラムを使用するプロセス(4カラム(4C)プロセス)との比較
CHO発現培養から採取された細胞培養液(HCCF)は、結合溶出モードでCapture Select FcXL親和性クロマトグラフィーによって処理された。25gmAb/l樹脂の最大装填物密度までのカラム上へのHCCFの装填後、カラムは、2カラム体積に対して25mMのトリス/HCl、25mMのNaCl(pH7.2)で洗浄された。次いで、5カラム体積に対して精製水PWIIで追加の洗浄が行われた。カラム結合抗体は、30mMの酢酸塩(pH3.2)を使用して溶出された。溶出プールは、2500~1000mAU(路長1cm)のOD280に基づいて収集された。
表18:それぞれのクロマトグラフィーのステップ後の生成物-特異的不純物及びプロセス特異的不純物の分析的データ
表19:親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む4つのクロマトグラフィーカラムを使用するプロセス(4カラム(4C)プロセス)との比較
標的タンパク質X1及びY1-抗X1/抗Y1二重特異性抗体またはaX1/Y1二重特異性に対する二重特異性抗体は、以下のとおりにアセンブリングされる。各半抗体(aX1(ノブ)及びaY1(ホール)は独立して、実施例1に記載のように、プロテインA樹脂(MabSelect SuRe,GE Healthcare)を使用して親和性クロマトグラフィーのステップにかけられる。
実施形態の一覧
1.多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがVH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的な、
a)前記組成物を捕獲クロマトグラフィーにかけて、捕獲クロマトグラフィー溶出物を生成するステップと、
b)前記捕獲クロマトグラフィー溶出物を第1の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第1の混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記第1の混合モード溶出物を第2の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第2の混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
2.前記捕獲クロマトグラフィー溶出物が、前記第1の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはHICクロマトグラフィーにかけられる、実施形態1に記載の方法。
3.多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがVH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが別々に生成され、前記方法が、逐次的な、
a)前記多重特異性抗体の各アームを捕獲クロマトグラフィーにかけて、前記多重特異性抗体の各アームに対する捕獲溶出物を生成するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームの捕獲溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を第1の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第1の混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記第1の混合モード溶出物を第2の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第2の混合モード溶出物を生成することと、
e)前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
4.前記多重特異性抗体を含む前記組成物が、前記第1の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはHICクロマトグラフィーにかけられる、実施形態3に記載の方法。
5.前記捕獲クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーである、実施形態1~4のいずれか1つに記載の方法。
6.前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインLクロマトグラフィー、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、プロテインA及びプロテインGクロマトグラフィーである、実施形態5に記載の方法。
7.前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインAクロマトグラフィーである、実施形態5または実施形態6に記載の方法。
8.前記捕獲クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態1~7のいずれか1つに記載の方法。
9.前記第1の混合モードクロマトグラフィー及び前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、連続的である、実施形態1~8のいずれか1つに記載の方法。
10.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~9のいずれか1つに記載の方法。
11.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~10のいずれか1つに記載の方法。
12.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~9のいずれか1つに記載の方法。
13.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~10及び12のいずれか1つに記載の方法。
14.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態1~13のいずれか1つに記載の方法。
15.溶出が勾配溶出である、実施形態14に記載の方法。
16.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、実施形態1~13のいずれか1つに記載の方法。
17.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態1~16のいずれか1つに記載の方法。
18.前記溶出が勾配溶出である、実施形態17に記載の方法。
19.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、実施形態1~16のいずれか1つに記載の方法。
20.前記第2の混合モード溶出物を限外瀘過するステップをさらに含む実施形態1~19のいずれか1つに記載の方法。
21.前記限外濾過が、逐次的に、第1の限外濾過、透析濾過、及び第2の限外濾過を含む、実施形態20に記載の方法。
22.前記プロテインAクロマトグラフィーが、アガロースに連結されたプロテインAを含む、実施形態7~21のいずれか1つに記載の方法。
23.前記プロテインAクロマトグラフィーが、
MAbSelect(商標)、MAbSelect(商標)SuRe及びMAbSelect(商標)SuRe LX、Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus、プロテインAセファロースファストフロー、またはToyopearlプロテインAクロマトグラフィーである、実施形態7~21のいずれか1つに記載の方法。
24.前記プロテインAクロマトグラフィーが、プロテインA平衡化緩衝液、プロテインA装填緩衝液、またはプロテインA洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び/または洗浄緩衝液が、約pH7~約pH8である、実施形態7~23のいずれか1つに記載の方法。
25.前記プロテインA平衡化緩衝液が、約pH7.7である、実施形態24に記載の方法。
26.前記プロテインA平衡化緩衝液が、約25mMのトリス及び約25mMのNaClを含む、実施形態24または実施形態25に記載の方法。
27.前記プロテインAクロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、実施形態24~26のいずれか1つに記載の方法。
28.前記多重特異性抗体が、pH段階溶出によってプロテインAクロマトグラフィーから溶出される、実施形態7~27のいずれか1つに記載の方法。
29.前記多重特異性抗体が、低いpHを有するプロテインA溶出緩衝液を前記プロテインAクロマトグラフィーに適用することによって前記プロテインAから溶出される、実施形態7~28のいずれか1つに記載の方法。
30.前記プロテインA溶出緩衝液が、約150mMの酢酸、約pH2.9を含む、実施形態29に記載の方法。
31.前記プロテインA溶出物がプールされ、前記溶出物のOD280が約0.5を超える、実施形態7~30のいずれか1つに記載の方法。
32.前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、第四級アミン及び疎水性部分を含む、実施形態10~31のいずれか1つに記載の方法。
33.前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、高架橋アガロースに連結された第四級アミン及び疎水性部分を含む、実施形態32に記載の方法。
34.前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)AdhereクロマトグラフィーまたはCapto(商標)Adhere ImpResクロマトグラフィーである、実施形態33に記載の方法。
35.前記カチオン交換混合モードクロマトグラフィーが、N-ベンジル-n-メチルエタノールアミンを含む、実施形態11~34のいずれか1つに記載の方法。
36.前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)MMCクロマトグラフィーまたはCapto(商標)MMC ImpResクロマトグラフィーである、実施形態35に記載の方法。
37.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、前記混合モード装填緩衝液、及び/または前記混合モード洗浄緩衝液は、約pH6~約pH7である、実施形態1~36のいずれか1つに記載の方法。
38.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH5~約pH8である、実施形態1~37のいずれか1つに記載の方法。
39.前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH6.5である、実施形態37または実施形態38に記載の方法。
40.前記混合モード事前平衡化緩衝液が、約500mMの酢酸塩を含む、実施形態37~39のいずれか1つに記載の方法。
41.前記混合モード平衡化緩衝液が、約50mMの酢酸塩を含む、実施形態37~40のいずれか1つに記載の方法。
42.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、実施形態37~41のいずれか1つに記載の方法。
43.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、実施形態37~42のいずれか1つに記載の方法。
44.前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記第1の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び18~43のいずれか1つに記載の方法。
45.前記多重特異性抗体が、低いpHを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モードイオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第1の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び実施形態18~44のいずれか1つに記載の方法。
46.前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記第2の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び18~45のいずれか1つに記載の方法。
47.前記多重特異性抗体が、低いpHを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モード交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第2の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び実施形態18~46のいずれか1つに記載の方法。
48.前記イオン交換クロマトグラフィーが、第四級アミンを含む、実施形態2及び4~47のいずれか1つに記載される方法。
49.前記イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーであり、前記アニオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに連結された第四級アミンを含む、実施形態48に記載の方法。
50.前記混合モードアニオン交換クロマトグラフィーが、CaptoAdhereクロマトグラフィーである、実施形態49に記載の方法。
51.前記アニオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、またはアニオン交換装填緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び/またはアニオン交換装填緩衝液が、約pH6~約pH8である、実施形態48~50のいずれか1つに記載の方法。
52.前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び/または前記アニオン交換装填物が、約pH6.5である、実施形態51に記載の方法。
53.前記アニオン交換事前平衡化緩衝液が、約50mMのトリス、500mMの酢酸ナトリウムを含む、実施形態51または実施形態52に記載の方法。
54.前記アニオン交換平衡化緩衝液が、約50mMのトリスを含む、実施形態51~53のいずれか1つに記載の方法。
55.前記アニオン交換クロマトグラフィーが、装填後にアニオン交換平衡化緩衝液で洗浄される、実施形態51~54のいずれか1つに記載の方法。
56.前記多重特異性抗体が、塩勾配によって前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、実施形態51~55のいずれか1つに記載の方法。
57.前記多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有するアニオン交換溶出緩衝液を前記アニオン交換クロマトグラフィーに適用させることによって、前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、実施形態51~56のいずれか1つに記載の方法。
58.前記アニオン交換溶出緩衝液が、約50mMのトリス、100mMの酢酸ナトリウムを約pH8.5で含む、実施形態57に記載の方法。
59.前記アニオン交換溶出物がプールされ、前記溶出物のOD280が約0.5~約2.0を超える、実施形態51~58のいずれか1つに記載の方法。
60.前記多重特異性抗体のアームが、細胞中で産生される、実施形態1~59のいずれか1つに記載の方法。
61.前記細胞が、原核生物細胞である、実施形態60に記載の方法。
62.前記原核生物細胞が、E.coli細胞である、実施形態61に記載の方法。
63.前記細胞が、1つ以上のシャペロンを発現するように操作される、実施形態61または実施形態62に記載の方法。
64.前記シャペロンが、FkpA、DsbA、またはDsbCのうちの1つ以上である、実施形態63に記載の方法。
65.前記シャペロンが、E.coliシャペロンである、実施形態63または実施形態64に記載の方法。
66.前記細胞が、真核細胞である、実施形態1~60のいずれか1つに記載の方法。
67.前記真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、実施形態66に記載の方法。
68.前記真核細胞が、CHO細胞である、実施形態66または実施形態67に記載の方法。
69.前記細胞が、捕獲クロマトグラフィーの前に、溶解され、前記多重特異性抗体または前記多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解液を生成する、実施形態60~68のいずれか1つに記載の方法。
70.前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、実施形態69に記載の方法。
71.ポリエチレンイミン(PEI)が、クロマトグラフィーの前に前記細胞溶解液に添加される、実施形態69または実施形態70に記載の方法。
72.前記方法が、前記組成物中の宿主細胞タンパク質(HCP)、浸出されたプロテインA、核酸、細胞培養培地構成成分、またはウイルス性不純物のうちのいずれか1つの量を低減する、実施形態1~71のいずれか1つに記載の方法。
73.前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態1~72のいずれか1つに記載の方法。
74.前記二重特異性抗体が、ノブインホール(KiH)二重特異性抗体である、実施形態73に記載の方法。
75.前記二重特異性抗体が、CrossMab二重特異性抗体である、実施形態73または実施形態74に記載の方法。
76.前記画分が、少なくとも約95%の多重特異性抗体を含む、実施形態1~75のいずれか1つに記載の方法。
77.前記生成物特異的不純物が、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種(HMWS)、低分子量種(LMWS)、酸性バリアント、または塩基性バリアントのうちの1つ以上である、実施形態1~76のいずれか1つに記載の方法。
78.前記画分が、約5%以下の非対抗体のアームを含む、実施形態77に記載の方法。
79.前記画分が、約5%以下の抗体ホモ二量体を含む、実施形態77または実施形態78に記載の方法。
80.前記画分が、約2%以下の凝集体または高分子量種(HMWS)を含む、実施形態77~79のいずれか1つに記載の方法。
81.前記画分が、約2%以下のLMWSを含む、実施形態77~80のいずれか1つに記載の方法。
82.前記画分が、約50%以下の酸性バリアントを含む、実施形態77~81のいずれか1つに記載の方法。
83.前記画分が、約35%以下の塩基性バリアントを含む、実施形態77~82のいずれか1つに記載の方法。
84.前記画分が、約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態77~83のいずれか1つを含む方法。
85.前記画分が、
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%~約5%以下の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%以下の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び
f)約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態77に記載の方法。
86.実施形態1~85のいずれか1つに記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
87.がんまたは眼疾患の治療のための、実施形態1~85のいずれか1つに記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
88.マルチステップクロマトグラフィー方法でFc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップを含み、2つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップが後に続き、
それによって、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する、前記方法。
89.前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、
i.親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、
または
ii.親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、実施形態88に記載の方法。
90.前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、実施形態88~89のいずれか1つに記載の方法。
91.前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、正確に3つのクロマトグラフィーのステップを含む、実施形態88~90のいずれか1つに記載の方法。
92.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、フロースルーモードで行われる、実施形態89~91のいずれか1つに記載の方法。
93.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、7mS/cm未満の伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態89~92のいずれか1つに記載の方法。
94.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約6mS/cm~約2mS/cmの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態89~93のいずれか1つに記載の方法。
95.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約4.5mS/cmの伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態89~94のいずれか1つに記載の方法。
96.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、約7のpHで行われる、実施形態89~95のいずれか1つに記載の方法。
97.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約4.5mS/cmの伝導性及び約7のpHを有する溶液中に適用される、実施形態89~96のいずれか1つに記載の方法。
98.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、クロマトグラフィー材料の、1リットル当たり約100g~約300gの範囲で適用される、実施形態89~97のいずれか1つに記載の方法。
99.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である、実施形態89~98のいずれか1つに記載の方法。
100.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、36~44μmの平均粒子サイズ、及び0.08~0.11mmol Cl-/mLの培地のイオン容量を有する、実施形態89~99のいずれか1つに記載の方法。
101.前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィーの培地である、実施形態89~100のいずれか1つに記載の方法。
102.前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、36~44μmの平均粒子サイズ、及び25~39μmol/mLのイオン容量を有する、実施形態89~101のいずれか1つに記載の方法。
103.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、結合及び溶出モードで行われる、実施形態89~102のいずれか1つに記載の方法。
104.前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインA親和性クロマトグラフィー、またはプロテインG親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Fvリガンド親和性クロマトグラフィー、またはCaptureSelectクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはCaptureSelect FcXLクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、実施形態88~103のいずれか1つに記載の方法。
105.前記親和性クロマトグラフィーのステップが、プロテインAクロマトグラフィーのステップである、実施形態88~104のいずれか1つに記載の方法。
106.前記親和性クロマトグラフィーのステップが、CaptureSelect(商標)クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、実施形態88~105のいずれか1つに記載の方法。
107.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、抗体、二重特異性抗体、またはFc-融合タンパク質である、実施形態88~106のいずれか1つに記載の方法。
108.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、二重特異性抗体である、実施形態88~107のいずれか1つに記載の方法。
109.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、CrossMabである、実施形態90~108のいずれか1つに記載の方法。
110.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、
a)第1の抗原を特異的に結合する第1の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、第2の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む二重特異性抗体である、実施形態90~109のいずれか1つに記載の方法。
111.前記二重特異性抗体が、ANG2及びVEGFを結合する、実施形態108~110のいずれか1つに記載の方法。
112.前記CrossMabが、ANG2及びVEGFを結合する、実施形態108~110のいずれか1つに記載の方法。
113.前記二重特異性抗体が、vanucizumabである、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
114.前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号1、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号3、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号4を含む第2の抗原結合部位を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
115.前記二重特異性抗体が、配列番号9のアミノ酸配列を有する第1の重鎖、及び配列番号10のアミノ酸配列を有する第2の重鎖、ならびに配列番号11のアミノ酸配列を有する第1の軽鎖、及び配列番号12のアミノ酸配列を有する第2の軽鎖を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
116.前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号5、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号6を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号7、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号8を含む第2の抗原結合部位を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
117.前記二重特異性抗体が、配列番号13のアミノ酸配列を有する第1の重鎖、及び配列番号14のアミノ酸配列を有する第2の重鎖、ならびに配列番号15のアミノ酸配列を有する第1の軽鎖、及び配列番号16のアミノ酸配列を有する第2の軽鎖を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
118.精製されたFc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態108~117のいずれか1つに記載の方法。
119.マルチステップクロマトグラフィー方法でANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、
それによって、ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体を精製し、
二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号1、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号3、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号4を含む第2の抗原結合部位を含むか、
または重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号5、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号6を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号7、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号8を含む第2の抗原結合部位を含む、前記方法。
120.ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態119に記載の方法。
121.二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも約95%、二重特異性抗体を含む、前記組成物。
122.前記組成物が、約5%以下の非対抗体のアームを含む、実施形態121に記載の組成物。
123.前記組成物が、約5%以下の抗体ホモ二量体を含む、実施形態121または122に記載の組成物。
124.CrossMab抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも95%のCrossMab抗体を含む、前記組成物。
125.前記組成物が、約2%以下の凝集体または高分子量種(HMWS)を含む、実施形態121~124のいずれか1つに記載の組成物。
126.前記組成物が、約2%以下の低分子量種(LMWS)を含む、実施形態121~125のいずれか1つに記載の組成物。
127.前記組成物が、約50%以下の酸性バリアントを含む、実施形態121~126のいずれか1つに記載の組成物。
128.前記組成物が、約35%以下の塩基性バリアントを含む、実施形態121~127のいずれか1つに記載の組成物。
129.前記組成物が、約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態121~128のいずれか1つに記載の組成物。
130.前記組成物が、
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%~約5%以下の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%以下の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び
f)約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態121または実施形態122に記載の組成物。
131.前記二重特異性抗体が、ANG-2及びVEGFを結合する、実施形態121~130のいずれか1つに記載の組成物。
132.ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態131に記載の組成物。
133.ANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、約5%以下、約4%、約3%、約2%、または約1%の3/4抗体を含む、前記組成物。
134.ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態133に記載の組成物。
135.前記組成物が、実施形態119に記載の方法を使用して得られる、実施形態133または134に記載の組成物。
136.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のための、実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法の使用。
137.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法の使用。
138.がんまたは眼疾患の前記治療のための医薬品の製造のための、実施形態に88~118のいずれか1つに記載の方法で得られるFc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体。
139.がんまたは眼疾患の前記治療における使用のための、実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法から得られるFc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体。
140.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法であって、
i.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ii.前記Fc-含有ヘテロ二量体タンパク質を細胞または培養培地から回収するステップと、
iii.実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法で前記Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するステップと、を含み、
それによって、前記Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する、前記方法。
141.実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を産生する方法であって、
i.前記二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ii.前記二重特異性抗体を前記細胞または前記培養培地から回収するステップと、
iii.実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法で前記二重特異性抗体を精製するステップと、を含み、
それによって、ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体を生産する、前記方法。
実施形態の一覧
1.多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがVH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的な、
a)前記組成物を捕獲クロマトグラフィーにかけて、捕獲クロマトグラフィー溶出物を生成するステップと、
b)前記捕獲クロマトグラフィー溶出物を第1の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第1の混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記第1の混合モード溶出物を第2の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第2の混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
2.前記捕獲クロマトグラフィー溶出物が、前記第1の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはHICクロマトグラフィーにかけられる、実施形態1に記載の方法。
3.多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがVH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが別々に生成され、前記方法が、逐次的な、
a)前記多重特異性抗体の各アームを捕獲クロマトグラフィーにかけて、前記多重特異性抗体の各アームに対する捕獲溶出物を生成するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームの捕獲溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を第1の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第1の混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記第1の混合モード溶出物を第2の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第2の混合モード溶出物を生成することと、
e)前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
4.前記多重特異性抗体を含む前記組成物が、前記第1の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはHICクロマトグラフィーにかけられる、実施形態3に記載の方法。
5.前記捕獲クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーである、実施形態1~4のいずれか1つに記載の方法。
6.前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインLクロマトグラフィー、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、プロテインA及びプロテインGクロマトグラフィーである、実施形態5に記載の方法。
7.前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインAクロマトグラフィーである、実施形態5または実施形態6に記載の方法。
8.前記捕獲クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態1~7のいずれか1つに記載の方法。
9.前記第1の混合モードクロマトグラフィー及び前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、連続的である、実施形態1~8のいずれか1つに記載の方法。
10.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~9のいずれか1つに記載の方法。
11.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~10のいずれか1つに記載の方法。
12.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~9のいずれか1つに記載の方法。
13.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、実施形態1~10及び12のいずれか1つに記載の方法。
14.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態1~13のいずれか1つに記載の方法。
15.溶出が勾配溶出である、実施形態14に記載の方法。
16.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、実施形態1~13のいずれか1つに記載の方法。
17.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態1~16のいずれか1つに記載の方法。
18.前記溶出が勾配溶出である、実施形態17に記載の方法。
19.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、実施形態1~16のいずれか1つに記載の方法。
20.前記第2の混合モード溶出物を限外瀘過するステップをさらに含む実施形態1~19のいずれか1つに記載の方法。
21.前記限外濾過が、逐次的に、第1の限外濾過、透析濾過、及び第2の限外濾過を含む、実施形態20に記載の方法。
22.前記プロテインAクロマトグラフィーが、アガロースに連結されたプロテインAを含む、実施形態7~21のいずれか1つに記載の方法。
23.前記プロテインAクロマトグラフィーが、
MAbSelect(商標)、MAbSelect(商標)SuRe及びMAbSelect(商標)SuRe LX、Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus、プロテインAセファロースファストフロー、またはToyopearlプロテインAクロマトグラフィーである、実施形態7~21のいずれか1つに記載の方法。
24.前記プロテインAクロマトグラフィーが、プロテインA平衡化緩衝液、プロテインA装填緩衝液、またはプロテインA洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び/または洗浄緩衝液が、約pH7~約pH8である、実施形態7~23のいずれか1つに記載の方法。
25.前記プロテインA平衡化緩衝液が、約pH7.7である、実施形態24に記載の方法。
26.前記プロテインA平衡化緩衝液が、約25mMのトリス及び約25mMのNaClを含む、実施形態24または実施形態25に記載の方法。
27.前記プロテインAクロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、実施形態24~26のいずれか1つに記載の方法。
28.前記多重特異性抗体が、pH段階溶出によってプロテインAクロマトグラフィーから溶出される、実施形態7~27のいずれか1つに記載の方法。
29.前記多重特異性抗体が、低いpHを有するプロテインA溶出緩衝液を前記プロテインAクロマトグラフィーに適用することによって前記プロテインAから溶出される、実施形態7~28のいずれか1つに記載の方法。
30.前記プロテインA溶出緩衝液が、約150mMの酢酸、約pH2.9を含む、実施形態29に記載の方法。
31.前記プロテインA溶出物がプールされ、前記溶出物のOD280が約0.5を超える、実施形態7~30のいずれか1つに記載の方法。
32.前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、第四級アミン及び疎水性部分を含む、実施形態10~31のいずれか1つに記載の方法。
33.前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、高架橋アガロースに連結された第四級アミン及び疎水性部分を含む、実施形態32に記載の方法。
34.前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)AdhereクロマトグラフィーまたはCapto(商標)Adhere ImpResクロマトグラフィーである、実施形態33に記載の方法。
35.前記カチオン交換混合モードクロマトグラフィーが、N-ベンジル-n-メチルエタノールアミンを含む、実施形態11~34のいずれか1つに記載の方法。
36.前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)MMCクロマトグラフィーまたはCapto(商標)MMC ImpResクロマトグラフィーである、実施形態35に記載の方法。
37.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、前記混合モード装填緩衝液、及び/または前記混合モード洗浄緩衝液は、約pH6~約pH7である、実施形態1~36のいずれか1つに記載の方法。
38.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH5~約pH8である、実施形態1~37のいずれか1つに記載の方法。
39.前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH6.5である、実施形態37または実施形態38に記載の方法。
40.前記混合モード事前平衡化緩衝液が、約500mMの酢酸塩を含む、実施形態37~39のいずれか1つに記載の方法。
41.前記混合モード平衡化緩衝液が、約50mMの酢酸塩を含む、実施形態37~40のいずれか1つに記載の方法。
42.前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、実施形態37~41のいずれか1つに記載の方法。
43.前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、実施形態37~42のいずれか1つに記載の方法。
44.前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記第1の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び18~43のいずれか1つに記載の方法。
45.前記多重特異性抗体が、低いpHを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モードイオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第1の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び実施形態18~44のいずれか1つに記載の方法。
46.前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記第2の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び18~45のいずれか1つに記載の方法。
47.前記多重特異性抗体が、低いpHを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モード交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第2の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態15及び実施形態18~46のいずれか1つに記載の方法。
48.前記イオン交換クロマトグラフィーが、第四級アミンを含む、実施形態2及び4~47のいずれか1つに記載される方法。
49.前記イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーであり、前記アニオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに連結された第四級アミンを含む、実施形態48に記載の方法。
50.前記混合モードアニオン交換クロマトグラフィーが、CaptoAdhereクロマトグラフィーである、実施形態49に記載の方法。
51.前記アニオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、またはアニオン交換装填緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び/またはアニオン交換装填緩衝液が、約pH6~約pH8である、実施形態48~50のいずれか1つに記載の方法。
52.前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び/または前記アニオン交換装填物が、約pH6.5である、実施形態51に記載の方法。
53.前記アニオン交換事前平衡化緩衝液が、約50mMのトリス、500mMの酢酸ナトリウムを含む、実施形態51または実施形態52に記載の方法。
54.前記アニオン交換平衡化緩衝液が、約50mMのトリスを含む、実施形態51~53のいずれか1つに記載の方法。
55.前記アニオン交換クロマトグラフィーが、装填後にアニオン交換平衡化緩衝液で洗浄される、実施形態51~54のいずれか1つに記載の方法。
56.前記多重特異性抗体が、塩勾配によって前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、実施形態51~55のいずれか1つに記載の方法。
57.前記多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有するアニオン交換溶出緩衝液を前記アニオン交換クロマトグラフィーに適用させることによって、前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、実施形態51~56のいずれか1つに記載の方法。
58.前記アニオン交換溶出緩衝液が、約50mMのトリス、100mMの酢酸ナトリウムを約pH8.5で含む、実施形態57に記載の方法。
59.前記アニオン交換溶出物がプールされ、前記溶出物のOD280が約0.5~約2.0を超える、実施形態51~58のいずれか1つに記載の方法。
60.前記多重特異性抗体のアームが、細胞中で産生される、実施形態1~59のいずれか1つに記載の方法。
61.前記細胞が、原核生物細胞である、実施形態60に記載の方法。
62.前記原核生物細胞が、E.coli細胞である、実施形態61に記載の方法。
63.前記細胞が、1つ以上のシャペロンを発現するように操作される、実施形態61または実施形態62に記載の方法。
64.前記シャペロンが、FkpA、DsbA、またはDsbCのうちの1つ以上である、実施形態63に記載の方法。
65.前記シャペロンが、E.coliシャペロンである、実施形態63または実施形態64に記載の方法。
66.前記細胞が、真核細胞である、実施形態1~60のいずれか1つに記載の方法。
67.前記真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、実施形態66に記載の方法。
68.前記真核細胞が、CHO細胞である、実施形態66または実施形態67に記載の方法。
69.前記細胞が、捕獲クロマトグラフィーの前に、溶解され、前記多重特異性抗体または前記多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解液を生成する、実施形態60~68のいずれか1つに記載の方法。
70.前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、実施形態69に記載の方法。
71.ポリエチレンイミン(PEI)が、クロマトグラフィーの前に前記細胞溶解液に添加される、実施形態69または実施形態70に記載の方法。
72.前記方法が、前記組成物中の宿主細胞タンパク質(HCP)、浸出されたプロテインA、核酸、細胞培養培地構成成分、またはウイルス性不純物のうちのいずれか1つの量を低減する、実施形態1~71のいずれか1つに記載の方法。
73.前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態1~72のいずれか1つに記載の方法。
74.前記二重特異性抗体が、ノブインホール(KiH)二重特異性抗体である、実施形態73に記載の方法。
75.前記二重特異性抗体が、CrossMab二重特異性抗体である、実施形態73または実施形態74に記載の方法。
76.前記画分が、少なくとも約95%の多重特異性抗体を含む、実施形態1~75のいずれか1つに記載の方法。
77.前記生成物特異的不純物が、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種(HMWS)、低分子量種(LMWS)、酸性バリアント、または塩基性バリアントのうちの1つ以上である、実施形態1~76のいずれか1つに記載の方法。
78.前記画分が、約5%以下の非対抗体のアームを含む、実施形態77に記載の方法。
79.前記画分が、約5%以下の抗体ホモ二量体を含む、実施形態77または実施形態78に記載の方法。
80.前記画分が、約2%以下の凝集体または高分子量種(HMWS)を含む、実施形態77~79のいずれか1つに記載の方法。
81.前記画分が、約2%以下のLMWSを含む、実施形態77~80のいずれか1つに記載の方法。
82.前記画分が、約50%以下の酸性バリアントを含む、実施形態77~81のいずれか1つに記載の方法。
83.前記画分が、約35%以下の塩基性バリアントを含む、実施形態77~82のいずれか1つに記載の方法。
84.前記画分が、約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態77~83のいずれか1つを含む方法。
85.前記画分が、
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%~約5%以下の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%以下の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び
f)約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態77に記載の方法。
86.実施形態1~85のいずれか1つに記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
87.がんまたは眼疾患の治療のための、実施形態1~85のいずれか1つに記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
88.マルチステップクロマトグラフィー方法でFc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップを含み、2つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップが後に続き、
それによって、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する、前記方法。
89.前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、
i.親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、
または
ii.親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、実施形態88に記載の方法。
90.前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、実施形態88~89のいずれか1つに記載の方法。
91.前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、正確に3つのクロマトグラフィーのステップを含む、実施形態88~90のいずれか1つに記載の方法。
92.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、フロースルーモードで行われる、実施形態89~91のいずれか1つに記載の方法。
93.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、7mS/cm未満の伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態89~92のいずれか1つに記載の方法。
94.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約6mS/cm~約2mS/cmの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態89~93のいずれか1つに記載の方法。
95.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約4.5mS/cmの伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態89~94のいずれか1つに記載の方法。
96.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、約7のpHで行われる、実施形態89~95のいずれか1つに記載の方法。
97.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約4.5mS/cmの伝導性及び約7のpHを有する溶液中に適用される、実施形態89~96のいずれか1つに記載の方法。
98.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、クロマトグラフィー材料の、1リットル当たり約100g~約300gの範囲で適用される、実施形態89~97のいずれか1つに記載の方法。
99.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である、実施形態89~98のいずれか1つに記載の方法。
100.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、36~44μmの平均粒子サイズ、及び0.08~0.11mmol Cl-/mLの培地のイオン容量を有する、実施形態89~99のいずれか1つに記載の方法。
101.前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィーの培地である、実施形態89~100のいずれか1つに記載の方法。
102.前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、36~44μmの平均粒子サイズ、及び25~39μmol/mLのイオン容量を有する、実施形態89~101のいずれか1つに記載の方法。
103.前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、結合及び溶出モードで行われる、実施形態89~102のいずれか1つに記載の方法。
104.前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインA親和性クロマトグラフィー、またはプロテインG親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Fvリガンド親和性クロマトグラフィー、またはCaptureSelectクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはCaptureSelect FcXLクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、実施形態88~103のいずれか1つに記載の方法。
105.前記親和性クロマトグラフィーのステップが、プロテインAクロマトグラフィーのステップである、実施形態88~104のいずれか1つに記載の方法。
106.前記親和性クロマトグラフィーのステップが、CaptureSelect(商標)クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、実施形態88~105のいずれか1つに記載の方法。
107.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、抗体、二重特異性抗体、またはFc-融合タンパク質である、実施形態88~106のいずれか1つに記載の方法。
108.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、二重特異性抗体である、実施形態88~107のいずれか1つに記載の方法。
109.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、CrossMabである、実施形態90~108のいずれか1つに記載の方法。
110.前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、
a)第1の抗原を特異的に結合する第1の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、第2の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む二重特異性抗体である、実施形態90~109のいずれか1つに記載の方法。
111.前記二重特異性抗体が、ANG2及びVEGFを結合する、実施形態108~110のいずれか1つに記載の方法。
112.前記CrossMabが、ANG2及びVEGFを結合する、実施形態108~110のいずれか1つに記載の方法。
113.前記二重特異性抗体が、vanucizumabである、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
114.前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号1、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号3、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号4を含む第2の抗原結合部位を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
115.前記二重特異性抗体が、配列番号9のアミノ酸配列を有する第1の重鎖、及び配列番号10のアミノ酸配列を有する第2の重鎖、ならびに配列番号11のアミノ酸配列を有する第1の軽鎖、及び配列番号12のアミノ酸配列を有する第2の軽鎖を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
116.前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号5、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号6を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号7、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号8を含む第2の抗原結合部位を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
117.前記二重特異性抗体が、配列番号13のアミノ酸配列を有する第1の重鎖、及び配列番号14のアミノ酸配列を有する第2の重鎖、ならびに配列番号15のアミノ酸配列を有する第1の軽鎖、及び配列番号16のアミノ酸配列を有する第2の軽鎖を含む、実施形態108~112のいずれか1つに記載の方法。
118.精製されたFc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態108~117のいずれか1つに記載の方法。
119.マルチステップクロマトグラフィー方法でANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、
それによって、ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体を精製し、
二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号1、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号3、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号4を含む第2の抗原結合部位を含むか、
または重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号5、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号6を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号7、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号8を含む第2の抗原結合部位を含む、前記方法。
120.ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態119に記載の方法。
121.二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも約95%、二重特異性抗体を含む、前記組成物。
122.前記組成物が、約5%以下の非対抗体のアームを含む、実施形態121に記載の組成物。
123.前記組成物が、約5%以下の抗体ホモ二量体を含む、実施形態121または122に記載の組成物。
124.CrossMab抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも95%のCrossMab抗体を含む、前記組成物。
125.前記組成物が、約2%以下の凝集体または高分子量種(HMWS)を含む、実施形態121~124のいずれか1つに記載の組成物。
126.前記組成物が、約2%以下の低分子量種(LMWS)を含む、実施形態121~125のいずれか1つに記載の組成物。
127.前記組成物が、約50%以下の酸性バリアントを含む、実施形態121~126のいずれか1つに記載の組成物。
128.前記組成物が、約35%以下の塩基性バリアントを含む、実施形態121~127のいずれか1つに記載の組成物。
129.前記組成物が、約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態121~128のいずれか1つに記載の組成物。
130.前記組成物が、
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%~約5%以下の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%以下の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び
f)約5%以下の3/4抗体を含む、実施形態121または実施形態122に記載の組成物。
131.前記二重特異性抗体が、ANG-2及びVEGFを結合する、実施形態121~130のいずれか1つに記載の組成物。
132.ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態131に記載の組成物。
133.ANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、約5%以下、約4%、約3%、約2%、または約1%の3/4抗体を含む、前記組成物。
134.ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態133に記載の組成物。
135.前記組成物が、実施形態119に記載の方法を使用して得られる、実施形態133または134に記載の組成物。
136.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のための、実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法の使用。
137.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法の使用。
138.がんまたは眼疾患の前記治療のための医薬品の製造のための、実施形態に88~118のいずれか1つに記載の方法で得られるFc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体。
139.がんまたは眼疾患の前記治療における使用のための、実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法から得られるFc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体。
140.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法であって、
i.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ii.前記Fc-含有ヘテロ二量体タンパク質を細胞または培養培地から回収するステップと、
iii.実施形態88~118のいずれか1つに記載の方法で前記Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するステップと、を含み、
それによって、前記Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する、前記方法。
141.実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を産生する方法であって、
i.前記二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ii.前記二重特異性抗体を前記細胞または前記培養培地から回収するステップと、
iii.実施形態119~120のいずれか1つに記載の方法で前記二重特異性抗体を精製するステップと、を含み、
それによって、ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体を生産する、前記方法。
<配列表>
SEQUENCE LISTING
<110> Glen GIESE
Eva ROSENBERG
Bernard SALLIER
Susanne KONRAD
Wolfgang KOEHNLEIN
Steffen WILLMANN
Agathe BIALAS
Kimberly KALEAS
Yinges YIGZAW
<120> PURIFICATION OF MULTISPECIFIC ANTIBODIES
<130> 146392036340
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 62/351,908
<151> 2016-06-17
<160> 16
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 4
Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 5
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 6
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 8
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
<210> 9
<211> 463
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 10
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
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<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 11
Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 14
<211> 463
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 16
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210
Claims (141)
- 多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがVH/VL単位を含み、前記方法が、逐次的な、
a)前記組成物を捕獲クロマトグラフィーにかけて、捕獲クロマトグラフィー溶出物を生成するステップと、
b)前記捕獲クロマトグラフィー溶出物を第1の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第1の混合モード溶出物を生成するステップと、
c)前記第1の混合モード溶出物を第2の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第2の混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記捕獲クロマトグラフィー溶出物が、前記第1の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはHICクロマトグラフィーにかけられる、請求項1に記載の方法。
- 多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがVH/VL単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが別々に生成され、前記方法が、逐次的な、
a)前記多重特異性抗体の各アームを捕獲クロマトグラフィーにかけて、前記多重特異性抗体の各アームに対する捕獲溶出物を生成するステップと、
b)前記多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームの捕獲溶出物を含む混合物を形成するステップと、
c)前記多重特異性抗体を含む前記組成物を第1の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第1の混合モード溶出物を生成するステップと、
d)前記第1の混合モード溶出物を第2の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第2の混合モード溶出物を生成することと、
e)前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。 - 前記多重特異性抗体を含む前記組成物が、前記第1の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはHICクロマトグラフィーにかけられる、請求項3に記載の方法。
- 前記捕獲クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインLクロマトグラフィー、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、プロテインA及びプロテインGクロマトグラフィーである、請求項5に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインAクロマトグラフィーである、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記捕獲クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィー及び前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、連続的である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項1~10及び12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 溶出が勾配溶出である、請求項14に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶出が勾配溶出である、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の混合モード溶出物を限外瀘過するステップをさらに含む請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記限外濾過が、逐次的に、第1の限外濾過、透析濾過、及び第2の限外濾過を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記プロテインAクロマトグラフィーが、アガロースに連結されたプロテインAを含む、請求項7~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテインAクロマトグラフィーが、
MAbSelect(商標)、MAbSelect(商標)SuRe及びMAbSelect(商標)SuRe LX、Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus、プロテインAセファロースファストフロー、またはToyopearlプロテインAクロマトグラフィーである、請求項7~21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プロテインAクロマトグラフィーが、プロテインA平衡化緩衝液、プロテインA装填緩衝液、またはプロテインA洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び/または洗浄緩衝液が、約pH7~約pH8である、請求項7~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテインA平衡化緩衝液が、約pH7.7である、請求項24に記載の方法。
- 前記プロテインA平衡化緩衝液が、約25mMのトリス及び約25mMのNaClを含む、請求項24または請求項25に記載の方法。
- 前記プロテインAクロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、請求項24~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、pH段階溶出によって前記プロテインAクロマトグラフィーから溶出される、請求項7~27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、低いpHを有するプロテインA溶出緩衝液を前記プロテインAクロマトグラフィーに適用することによって前記プロテインAから溶出される、請求項7~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテインA溶出緩衝液が、約150mMの酢酸、約pH2.9を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記プロテインA溶出物がプールされ、前記溶出物のOD280が約0.5を超える、請求項7~30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、第四級アミン及び疎水性部分を含む、請求項10~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、高架橋アガロースに連結された第四級アミン及び疎水性部分を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)AdhereクロマトグラフィーまたはCapto(商標)Adhere ImpResクロマトグラフィーである、請求項33に記載の方法。
- 前記カチオン交換混合モードクロマトグラフィーが、N-ベンジル-n-メチルエタノールアミンを含む、請求項11~34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モードクロマトグラフィーが、Capto(商標)MMCクロマトグラフィーまたはCapto(商標)MMC ImpResクロマトグラフィーである、請求項35に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、前記混合モード装填緩衝液、及び/または前記混合モード洗浄緩衝液は、約pH6~約pH7である、請求項1~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH5~約pH8である、請求項1~37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び/または混合モード洗浄緩衝液が、約pH6.5である、請求項37または請求項38に記載の方法。
- 前記混合モード事前平衡化緩衝液が、約500mMの酢酸塩を含む、請求項37~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記混合モード平衡化緩衝液が、約50mMの酢酸塩を含む、請求項37~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、請求項37~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、請求項37~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記第1の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項15及び18~43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、低いpHを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モードイオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第1の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項15及び請求項18~44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、pH勾配によって前記第2の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項15及び18~45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、低いpHを有する混合モード溶出緩衝液を混合モード交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第2の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項15及び請求項18~46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーが、第四級アミンを含む、請求項2及び4~47のいずれか一項に記載される方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーであり、前記アニオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに連結された第四級アミンを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記混合モードアニオン交換クロマトグラフィーが、CaptoAdhereクロマトグラフィーである、請求項49に記載の方法。
- 前記アニオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、またはアニオン交換装填緩衝液のうちの1つ以上を使用し、前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び/またはアニオン交換装填緩衝液が、約pH6~約pH8である、請求項48~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び/または前記アニオン交換装填物が、約pH6.5である、請求項51に記載の方法。
- 前記アニオン交換事前平衡化緩衝液が、約50mMのトリス、500mMの酢酸ナトリウムを含む、請求項51または請求項52に記載の方法。
- 前記アニオン交換平衡化緩衝液が、約50mMのトリスを含む、請求項51~53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換クロマトグラフィーが、装填後にアニオン交換平衡化緩衝液で洗浄される、請求項51~54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、塩勾配によって前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項51~55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有するアニオン交換溶出緩衝液を前記アニオン交換クロマトグラフィーに適用させることによって、前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項51~56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アニオン交換溶出緩衝液が、約50mMのトリス、100mMの酢酸ナトリウムを約pH8.5で含む、請求項57に記載の方法。
- 前記アニオン交換溶出物がプールされ、前記溶出物の前記OD280が約0.5~約2.0を超える、請求項51~58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体の前記アームが、細胞中で産生される、請求項1~59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、原核生物細胞である、請求項60に記載の方法。
- 前記原核生物細胞が、E.coli細胞である、請求項61に記載の方法。
- 前記細胞が、1つ以上のシャペロンを発現するように操作される、請求項61または請求項62に記載の方法。
- 前記シャペロンが、FkpA、DsbA、またはDsbCのうちの1つ以上である、請求項63に記載の方法。
- 前記シャペロンが、E.coliシャペロンである、請求項63または請求項64
に記載の方法。 - 前記細胞が、真核細胞である、請求項1~60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項66に記載の方法。
- 前記真核細胞が、CHO細胞である、請求項66または請求項67に記載の方法。
- 前記細胞が、捕獲クロマトグラフィーの前に、溶解され、前記多重特異性抗体または前記多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解液を生成する、請求項60~68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、請求項69に記載の方法。
- ポリエチレンイミン(PEI)が、クロマトグラフィーの前に前記細胞溶解液に添加される、請求項69または請求項70に記載の方法。
- 前記方法が、前記組成物中の宿主細胞タンパク質(HCP)、浸出されたプロテインA、核酸、細胞培養培地構成成分、またはウイルス性不純物のうちのいずれか1つの量を低減する、請求項1~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項1~72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、ノブインホール(KiH)二重特異性抗体である、請求項73に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、CrossMab二重特異性抗体である、請求項73または請求項74に記載の方法。
- 前記画分が、少なくとも約95%の多重特異性抗体を含む、請求項1~75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生成物特異的不純物が、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種(HMWS)、低分子量種(LMWS)、酸性バリアント、または塩基性バリアントのうちの1つ以上である、請求項1~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、約5%以下の非対抗体のアームを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記画分が、約5%以下の抗体ホモ二量体を含む、請求項77または請求項78に記載の方法。
- 前記画分が、約2%以下の凝集体または高分子量種(HMWS)を含む、請求項77~79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、約2%以下のLMWSを含む、請求項77~80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、約50%以下の酸性バリアントを含む、請求項77~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、約35%以下の塩基性バリアントを含む、請求項77~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、約5%以下の3/4抗体を含む、請求項77~83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記画分が、
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%~約5%以下の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%以下の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び
f)約5%以下の3/4抗体を含む、請求項77に記載の方法。 - 請求項1~85のいずれか一項に記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
- がんまたは眼疾患の治療のための、請求項1~85のいずれか一項に記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
- マルチステップクロマトグラフィー方法でFc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップを含み、2つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップが後に続き、
それによって、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する、前記方法。 - 前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、
i.親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、
または
ii.親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、請求項88に記載の方法。 - 前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、請求項88~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、正確に3つのクロマトグラフィーのステップを含む、請求項88~90のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、フロースルーモードで行われる、請求項89~91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、7mS/cm未満の伝導値を有する溶液中に適用される、請求項89~92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約6mS/cm~約2mS/cmの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される、請求項89~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約4.5mS/cmの伝導値を有する溶液中に適用される、請求項89~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、約7のpHで行われる、請求項89~95のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約4.5mS/cmの伝導性及び約7のpHを有する溶液中に適用される、請求項89~96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、クロマトグラフィー材料の、1リットル当たり約100g~約300gの範囲で適用される、請求項89~97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項89~98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、36~44μmの平均粒子サイズ、及び0.08~0.11mmol Cl-/mLの培地のイオン容量を有する、請求項89~99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィーの培地である、請求項89~100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、36~44μmの平均粒子サイズ、及び25~39μmol/mLのイオン容量を有する、請求項89~101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、結合及び溶出モードで行われる、請求項89~102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインA親和性クロマトグラフィー、またはプロテインG親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Fvリガンド親和性クロマトグラフィー、またはCaptureSelectクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはCaptureSelect FcXLクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、請求項88~103のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーのステップが、プロテインAクロマトグラフィーのステップである、請求項88~104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親和性クロマトグラフィーのステップが、CaptureSelect(商標)クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、請求項88~105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、抗体、二重特異性抗体、またはFc-融合タンパク質である、請求項88~106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項88~107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、CrossMabである、請求項90~108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、
a)第1の抗原を特異的に結合する第1の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、第2の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、二重特異性抗体である、請求項90~109のいずれか一項に記載の方法。 - 前記二重特異性抗体が、ANG2及びVEGFを結合する、請求項108~110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CrossMabが、ANG2及びVEGFを結合する、請求項108~110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、vanucizumabである、請求項108~112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号1、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号3、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号4を含む第2の抗原結合部位を含む、請求項108~112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、配列番号9のアミノ酸配列を有する第1の重鎖、及び配列番号10のアミノ酸配列を有する第2の重鎖、ならびに配列番号11のアミノ酸配列を有する第1の軽鎖、及び配列番号12のアミノ酸配列を有する第2の軽鎖を含む、請求項108~112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号5、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号6を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号7、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号8を含む第2の抗原結合部位を含む、請求項108~112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、配列番号13のアミノ酸配列を有する第1の重鎖、及び配列番号14のアミノ酸配列を有する第2の重鎖、ならびに配列番号15のアミノ酸配列を有する第1の軽鎖、及び配列番号16のアミノ酸配列を有する第2の軽鎖を含む、請求項108~112のいずれか一項に記載の方法。
- 精製されたFc領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約5%以下の3/4抗体を含む、請求項108~117のいずれか一項に記載の方法。
- マルチステップクロマトグラフィー方法でANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、
それによって、ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体を精製し、
二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号1、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号2を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号3、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号4を含む第2の抗原結合部位を含むか、
または重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号5、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号6を含む第1の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン(VH)として配列番号7、及び軽鎖可変ドメイン(VL)として配列番号8を含む第2の抗原結合部位を含む、前記方法。 - ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、請求項119に記載の方法。 - 二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも約95%、二重特異性抗体を含む、前記組成物。
- 前記組成物が、約5%以下の非対抗体のアームを含む、請求項121に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5%以下の抗体ホモ二量体を含む、請求項121または122に記載の組成物。
- CrossMab抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも95%のCrossMab抗体を含む、前記組成物。
- 前記組成物が、約2%以下の凝集体または高分子量種(HMWS)を含む、請求項121~124のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約2%以下の低分子量種(LMWS)を含む、請求項121~125のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約50%以下の酸性バリアントを含む、請求項121~126のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約35%以下の塩基性バリアントを含む、請求項121~127のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、約5%以下の3/4抗体を含む、請求項121~128のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、
a)少なくとも約95%~約100%の多重特異性抗体、
b)約1%~約5%以下の非対抗体のアーム、
c)約1%~約5%以下の抗体ホモ二量体、
d)約1%または約2%以下のHMWS、
e)約1%または約2%以下のLMWS、及び
f)約5%以下の3/4抗体を含む、請求項121または請求項122に記載の組成物。 - 前記二重特異性抗体が、ANG-2及びVEGFを結合する、請求項121~130のいずれか一項に記載の組成物。
- ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、請求項131に記載の組成物。 - ANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、約5%、約4%、約3%、約2%、または約1%以下の3/4抗体を含む、前記組成物。
- ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体が、
a)前記第1の抗原結合部位を含む第1の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
b)前記定常ドメインCL及びCH1が互いによって置き換えられる、前記第2の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、請求項133に記載の組成物。 - 前記組成物が、請求項119に記載の方法を使用して得られる、請求項133または134に記載の組成物。
- Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のための、請求項88~118のいずれか一項に記載の方法の使用。
- Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、請求項88~118のいずれか一項に記載の方法の使用。
- がんまたは眼疾患の前記治療のための医薬品の製造のための、請求項88~118のいずれか一項に記載の方法で得られるFc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または請求項119~120のいずれか一項に記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体。
- がんまたは眼疾患の前記治療における使用のための、請求項88~118のいずれか一項に記載の方法から得られるFc-含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または請求項119~120のいずれか一項に記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体。
- Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法であって、
i.Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ii.前記Fc-含有ヘテロ二量体タンパク質を細胞または培養培地から回収するステップと、
iii.請求項88~118のいずれか一項に記載の方法で前記Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するステップと、を含み、
それによって、前記Fc-含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する、前記方法。 - 請求項119~120のいずれか一項に記載の方法を使用して得られるANG-2及びVEGFを結合する二重特異性抗体を産生する方法であって、
i.前記二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ii.前記二重特異性抗体を前記細胞または前記培養培地から回収するステップと、
iii.請求項119~120のいずれか一項に記載の方法で前記二重特異性抗体を精製するステップと、を含み、
それによって、ANG-2及びVEGFを結合する前記二重特異性抗体を産生する、前記方法。
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