CN113840625A - 甲状旁腺激素变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甲状旁腺激素(PTH)变体和包括其的药物组合物。本发明进一步涉及具有改善的血清半衰期和峰谷比的PTH组合物以及用本发明的所述PTH变体和组合物控制血清钙水平的方法。本发明进一步涉及用本发明的所述PTH变体和组合物治疗甲状旁腺功能减退和/或由甲状旁腺功能减退引起的低钙血症的方法。

Description

甲状旁腺激素变体
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年1月29日提交的美国临时申请第62/798,113号、2019年2月4日提交的美国临时申请第62/800,744号和2019年8月9日提交的美国临时申请第62/884,730号的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及甲状旁腺激素变体和包括其的组合物。本发明进一步涉及具有改善的血清半衰期的甲状旁腺激素变体和组合物，以及用本发明的甲状旁腺激素组合物控制血清钙水平的方法。
背景技术
甲状旁腺激素(PTH)是哺乳动物甲状旁腺分泌的84个氨基酸的产物，通过其对各种组织(包含骨)的作用来控制血清钙水平。对患有某些形式PTH的人类进行的研究已经表明其对骨具有合成代谢作用并且引起对其用于治疗骨质疏松症和相关骨疾病以及甲状旁腺功能减退的极大兴趣。
已知前34个N末端氨基酸在唯一已知的PTH的受体“PTH1R”上具有与全长PTH(1-84)相同的激活作用。参见，例如，波茨(Potts)等人,美国医学杂志(Amer.Journ.of Med.),50:639-649(1971)；波茨等人,第三版国际内分泌学协会论文集(Proceed.of the 3rdIntern.Symp.of Endocrin.),伦敦,第333-349页(1971)；Tregear等人,内分泌学(Endocrin.),93:1349-1353(1973)。此外，已经表明C末端片段，诸如39-84和53-84，不与1-34片段竞争受体结合。此外，这些C末端片段没有激活腺苷酸环化酶，所有这些都导致了PTH肽的C末端部分无关紧要的结论。参见，塞格雷(Segre)等人,生物化学杂志(Journ.ofBio.Chem.),254:6980-6986(1979)；尼森森(Nissenson)等人,生物化学杂志,254:1469-1475(1979)；波茨等人,保护化学进展(Adv.in Prot.Chem.),35:323-396(1982)。
然而，即使PTH的C末端被认为与生物活性无关，但已经发现肽的C末端部分是正常运输和加工所必需的。参见，例如，坎伯(Kemper)等人.,美国国家科学院学报论文集(Proceed.of the Nat.Acad.of Sciences),71:3731-3735(1974)；弗里曼(Freeman)等人,分子内分泌学(Molec.Endocrin.),1:628-638(1987)；韦林(Wiren)等人,生物化学杂志,263:19771-19777(1988)；乔菲(Cioffi)等人,生物化学杂志,264:15052-15058(1989)；卡拉普利斯(Karaplis)等人,生物化学杂志,270:1629-1635(1995)；莉姆(Lim)等人,内分泌学,131:2325-2330(1992)。特别是，有证据表明全长PTH被切割成甲状旁腺内的C末端片段，并且这些片段响应于血液中增加的钙离子浓度而被分泌。迄今为止，没有证据表明除了以完整的PTH的形式外，N末端片段储存在腺体内或从腺体分泌。参见哈贝纳(Habener)等人,自然—新生物学(Nature—New Biol.),238:152-154(1972)；弗吕克(Flueck)等人,临床研究杂志(Journ.of Clin.Invest.),60:1367-1375(1977)；迈耶(Mayer)等人,内分泌学,104:1778-1784(1979)；楚(Chu)等人,内分泌学,93:915-924(1973)；哈贝纳等人,内分泌学,97:431-441(1975)；罗塞尔(Russell)等人,临床研究杂志,72:1851-1855(1983)；海因里希(Heinrich)等人,内分泌学,112:449-458(1983)；布鲁克曼(Brookman)等人,骨和矿物研究杂志(Journ.of Bone&Min.Res.),1:529-537(1986)；舍伍德(Sherwood)等人,美国国家科学院学报论文集,67:1631-1638(1970)；阿诺(Arnaud)等人,美国医学杂志,50:630-638(1971)；汉利(Hanley)等人,临床研究杂志,62:1247-1254(1978)；迪贝拉(Di Bella)等人.,临床内分泌和代谢杂志(Journ.of Clin.Endocrin.&Metab.),46:604-612(1978)；鲁斯(Roos)等人,临床内分泌和代谢杂志,53:709-721(1981)；麦格雷戈(MacGregor)等人,内分泌学,112:1019-1025(1983)；汉利等人,临床内分泌和代谢杂志,63:1075-1079(1986)；莫里西(Morrissey)等人,内分泌学,107:164-171(1980)；麦格雷戈等人,生物化学杂志,261:1929-1934(1986)；麦格雷戈等人,生物化学杂志,254:4428-4433(1979)；库布勒(Kubler)等人,实验和临床内分泌学(Experim.&Clin.Endocrin.),88:101-108(1986)；沙赫特(Schachter)等人,手术(Surgery),110:1048-1052(1991)；坦圭(Tanguay)等人,内分泌学,128:1863-1868(1991)。
此外，现在很明显，PTH的C末端区域具有新的受体，该新的受体对激素的该区域具有特异性。参见，例如，霍斯曼(Hodsman)等人，临床内分泌和代谢杂志,88,第5212-5220页(2003)。因此，全长PTH具有不同于N末端PTH类似物的生物学特性的生物学特性。
然而，全长甲状旁腺激素对骨生长、钙生理和补充的重要性和作用仍然不易被理解为，例如，钙的作用。血液中PTH水平的正常每日升高和降低对骨具有深远的影响，并且在其中骨因骨质疏松症而丢失的情况下，注射PTH可以刺激新骨的生长。
甲状旁腺功能减退是一种终身疾病，其特征在于甲状旁腺产生的甲状旁腺激素(PTH)不足。因为PTH对钙和磷酸盐水平的调节至关重要，PTH的丢失会降低血液和骨骼中的钙水平，并增加磷酸盐水平(低钙血症和高磷血症)。低钙血症导致诸如神经肌肉过敏的症状，包含感觉异常、肌肉抽搐、喉部痉挛(其可能导致无法说话，并提醒医疗服务提供者注意潜在的医疗状况，其导致延迟或不正确的治疗)，并且可能导致手足抽搐和癫痫发作。
与已经成功配制的其它蛋白质不同，PTH对各种形式的降解特别敏感。例如，氧化可以发生在8和18位的甲硫氨酸残基上，产生氧化的PTH物种ox-M(8)-PTH和ox-M(18)-PTH，而脱酰胺作用可以发生在16位的天冬酰胺上，产生d16-PTH。多肽链因N末端和C末端处的肽键的断裂而被截短。此外，PTH也可能吸附到表面，形成非特异性聚集体和/或沉淀，从而降低药物的可用浓度。所有这些降解反应及其组合导致PTH生物活性的部分或完全丧失。因此，PTH的制剂必须防止这些降解反应。
特立帕肽(PTH(1-34)，由礼来公司(Eli Lilly)和Co以品牌名称
Figure BDA0003215185110000031
销售)已经被确定为甲状旁腺功能减退的骨化三醇疗法的有效替代物，并且能够维持正常的血清钙水平不产生高钙尿症。
全长PTH(1-84)最近已经被批准为安全且有效的甲状旁腺功能减退的治疗药物(由希雷制药(Shire-NPS Pharmaceuticals)以品牌名称
Figure BDA0003215185110000032
出售)。它是甲状旁腺功能减退的第一种特异性激素替代品，并且是每日一次的皮下注射剂，可用作钙和维生素D的助剂。然而，由于体内半衰期较短，NATPARA的人体药代动力学概况表现出快速清除和高峰谷比，这导致显著的日间血清钙波动和对钙尿(一种与尿中升高的钙水平相关的病症)的不良控制。
因此，需要改进的PTH受体激动剂，特别是对PTH受体具有长效活性和更稳定的生理概况的激动剂。参见维纳KK(Winer KK)等人,临床内分泌和代谢杂志,2003,88(9),4214-20。
发明内容
下面描述本发明的各种非限制性方面和实施例。
在一个方面中，提供了甲状旁腺激素(PTH)变体。在一些实施例中，根据本发明的PTH变体可以是PTH-Fc融合蛋白，其包括与人IgG抗体的Fc区或其衍生物化学连接的PTH或其变体。在一个实施例中，与Fc连接的PTH或其变体可以是全长PTH(即，PTH(1-84))，或截短的PTH，例如C末端截短的PTH或其变体。在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是PTH(1-74)或PTH(1-64)或PTH(1-54)或PTH(1-44)。在一个实施例中，与Fc连接的PTH不是PTH(1-34)。在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是全长PTH(1-84)，例如突变的PTH(1-84)。
在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是从PTH(1-35)到PTH(1-83)的任何长度。在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是PTH(1-33)。
在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是PTH(1-84)或PTH(1-83)或PTH(1-82)或PTH(1-81)或PTH(1-80)或PTH(1-79)或PTH(1-78)或PTH(1-77)或PTH(1-76)或PTH(1-75)或PTH(1-74)或PTH(1-73)或PTH(1-72)或PTH(1-71)或PTH(1-70)或PTH(1-69)或PTH(1-68)或PTH(1-67)或PTH(1-66)或PTH(1-65)或PTH(1-64)或PTH(1-63)或PTH(1-62)或PTH(1-61)或PTH(1-60)或PTH(1-59)或PTH(1-58)或PTH(1-57)或PTH(1-56)或PTH(1-55)或PTH(1-54)或PTH(1-53)或PTH(1-52)或PTH(1-51)或PTH(1-50)或PTH(1-49)或PTH(1-48)或PTH(1-47)或PTH(1-46)或PTH(1-45)或PTH(1-44)或PTH(1-43)或PTH(1-42)或PTH(1-41)或PTH(1-40)或PTH(1-39)或PTH(1-38)或PTH(1-37)或PTH(1-36)或PTH(1-35)或PTH(1-33)。
在一个实施例中，与Fc连接的PTH的氨基酸序列包括选自氨基酸取代、添加或缺失的进一步修饰。在一个实施例中，与Fc连接的PTH包括F34A取代、F34D取代、V35S取代或V35T取代，或其组合。在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以被进一步修饰，例如聚乙二醇化、糖基化等。在一个实施例中，与Fc连接的PTH被聚乙二醇化。在一个实施例中，与Fc连接的PTH被糖基化。在一个实施例中，Fc是天然Fc形式。在另一个实施例中，Fc包括选自氨基酸取代、添加或缺失的进一步修饰。在一个实施例中，Fc是包括L234A和L235A取代的hFcLALA。在其它实施例中，可以修饰Fc以用于增加半衰期，例如如杨(Yang)等人，mAbs,2017,9,1105和本领域中公知的其它方法中所述。
在一个实施例中，提供了具有SEQ ID NO:8-11的氨基酸序列的Fc连接的PTH变体。
在一个实施例中，根据本发明的Fc连接的PTH变体以二价结构提供，即具有两个拷贝的PTH和一个拷贝的Fc。
在另一个实施例中，根据本发明的Fc连接的PTH变体以单价结构提供，即具有一个拷贝的PTH和一个拷贝的Fc。在一个实施例中，单价PTH-Fc变体可以使用本领域中已知的重链突变(例如，旋钮和孔等)制备。本领域中已知的一种方法描述于例如美国专利第8,679,785号中。在另一个实施例中，单价PTH-Fc变体可以使用单体Fc制备，其中两个Fc部分可以通过接头(例如氨基酸接头)连接。
在一个实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长。在一个实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长2倍、或长3倍、或长5倍、或长10倍、或长20倍、或长30倍或或长40倍。在一个实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长40倍。
在另一个实施例中，PTH-Fc融合蛋白的峰谷比低于外源性PTH(1-84)的峰谷比。在一个实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白的峰谷比比PTH(1-84)的峰谷比低至少2倍。在一个实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白的峰谷比比PTH(1-84)的峰谷比低至少10倍。
在一些实施例中，PTH变体由PTH变体前体多肽加工而成，该PTH变体前体多肽包括与PTH变体直接连接的信号肽。多肽上的信号肽可以促进从用于产生PTH变体的哺乳动物宿主细胞中分泌PTH变体，其中信号肽在分泌后从PTH变体中裂解。可以使用任何数量的信号肽。在一个实施例中，信号肽可以具有以下序列(IgK信号肽)：METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQID NO:3)。在另一个实施例中，信号肽可以具有以下序列(IgG重链信号肽)：MEFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:4)。在又一个实施例中，信号肽可以具有以下序列(CD33信号肽)：MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:5)。在一个特定的实施例中，具有序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:5)的CD33信号肽可以提供最佳的信号肽裂解，使PTH变体的位置1保持完整。
在另一个方面中，提供了一种包括至少一种本发明的PTH-Fc融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面中，提供了一种包括至少一种本发明的PTH-Fc融合蛋白或本发明的药物组合物的药物剂型。在一个实施例中，本发明的药物剂型是液体剂型。在一个实施例中，该药物剂型适于通过注射或输注施用。
在另一个方面中，提供了一种编码根据本发明的PTH变体的核酸。在一个实施例中，提供了一种编码PTH-Fc融合变体蛋白的核酸。
在另一个方面中，提供了一种包括编码根据本发明的PTH变体的核酸的表达载体。在一个实施例中，提供了一种包括编码PTH-Fc融合变体蛋白的核酸的表达载体。
在另一个方面中，提供了一种包括根据本发明的表达载体或编码PTH变体的核酸的宿主细胞。在一个实施例中，提供了包括表达载体或编码PTH-Fc融合变体蛋白的核酸的宿主细胞。在一个实施例中，宿主细胞是原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一个实施例中，宿主细胞是CHO细胞。
在另一个方面中，提供了一种控制有需要的受试者的血清钙和磷酸盐水平的方法，该方法包括向所述受试者施用本发明的PTH变体，或包括本发明的PTH变体的药物组合物，或包括本发明的PTH变体的药物剂型。
在另一个方面中，提供了一种控制有需要的受试者中尿钙水平的方法，该方法包括向所述受试者施用本发明的PTH变体，或包括本发明的PTH变体的药物组合物，或包括本发明的PTH变体的药物剂型。
在另一个方面中，提供了一种治疗患有甲状旁腺功能减退的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的PTH变体，或包括本发明的PTH变体的药物组合物，或包括本发明的PTH变体的药物剂型。
在另一个方面中，提供了一种治疗患有甲状旁腺功能减退的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的PTH变体，或包括本发明的PTH变体的药物组合物，或包括本发明的PTH变体的药物剂型。
在一些实施例中，本发明的PTH变体以每天两次、或每天一次、或每两天一次、或每三天一次、或每5-8天一次施用。在一个实施例中，本发明的PTH变体每天施用一次。在一个实施例中，本发明的PTH变体每周施用一次。在一个实施例中，本发明的PTH变体是皮下施用的。
在一些实施例中，由于群体差异，可能需要针对个体滴定本发明的PTH变体的剂量。在一个实施例中，本发明的PTH变体以约1μg/天至约500μg/天、或约2μg/天至约250μg/天、或约5μg/天至约100μg/天、或约10μg/天至约80μg/天、或约20μg/天至约100μg/天、或约50μg/天至约100μg/天、或约50μg/天、或约60μg/天、或约70μg/天、或约80μg/天、或约90μg/天或约100μg/天的量被施用。
在阅读了包含所附权利要求的本发明的以下详细描述之后，本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
本专利或申请文件包括至少一幅彩色绘图。本专利或专利申请出版物的带有彩色绘图的副本将在要求并支付必要的费用后由专利局提供。
图1是在单次皮下施用给大鼠后不同C末端截短的PTH-Fc融合变体的血清浓度随时间变化的比较。
图2(A-B)示出了，与媒介物(磷酸盐缓冲液)对照相比，在小鼠中单次皮下施用后PTH-66(PTH(1-74)-Fc融合)的血清钙(图2A)和尿钙(图2B)浓度随时间的变化。
图3(A-B)示出了在单次皮下注射后不同浓度的PTH-66(PTH(1-74)-Fc)融合对TxPTx大鼠中的血清钙的PK(图3A)和PD(图3B)数据。
图4(A-B)示出了来自比较PTH-66与PTH(1-84)的TPTx大鼠的单剂量PK(图4A)和PD(图4B)研究数据。
图5(A-D)示出了来自对TPTx大鼠每天皮下施用PTH-66的多剂量PK(图5A)和PD(图5B-D)研究数据。
图6(A-B)示出了来自野生型食蟹猴的比较PTH-66与PTH(1-84)的单剂量PK(图6A)和PD(图6B)研究数据。
图7示出了来自野生型食蟹猴的在每日皮下施用后将PTH-66与媒介物进行比较的多剂量PK和PD研究数据。
图8A描绘了使用2x5mL Mab Select Sure柱对约900mL CM表达PTH-66进行的微量层析纯化。图8B是概述根据本发明的实施例的PTH-66的纯化步骤的流程图。
图9A描绘了PTH-66的Mab select粗洗脱级分。图9B描绘了PTH-66的Mab select粗洗脱级分的考马斯蓝染色。
图10描绘了最终PTH-66产品的SDS-PAGE考马斯染色。
图11描绘了PTH-66下游工艺流程。
图12是满足少于10％片段化靶标的PTH-66的生产工艺的流程图。
图13A是PTH-66纯化的抛光步骤的发展的流程图；图13B是工艺流程的流程图。
图14A是Capto MMC ImpRes的高通量筛选图；图14B是确定最佳结合条件的CaptoAdhere ImpRes的高通量筛选图；图14C是Capto MMC的化学结构；图14D是Capto Adhere的化学结构。
图15描绘了Capto MMC ImpRes工艺流程。
图16描绘了Capto Adhere ImpRes工艺流程。
图17A是使用Capto MMC ImpRes的PTH-66梯度洗脱图；图17B是使用Capto AdhereImpRes的PTH-66溢流图。
图18A描绘了PTH-66的下游抛光步骤设计；图18B是示出了基于杂质清除率和工艺产率的具有稳定池的工艺稳健性的图。
图19A-F描绘了与来自PTH-66的中试规模生产的工艺开发的产率相比，来自用于纯化PTH-66的工业中试的分步产率。
具体实施方式
本文公开了本发明的详细实施例；然而，应当理解，所公开的实施例仅仅是可以以各种形式具体化的本发明的示例。此外，结合本发明的各种实施例给出的每个实例旨在是说明性的，而不是限制性的。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅仅是作为教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包含复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种方法”包含本文描述的类型的和/或在阅读本公开后对本领域技术人员来说将变得显而易见的一或多种方法，和/或步骤。
术语“治疗(treat或treatment)”状态、障碍或病症包含：(1)预防、延迟或降低在受试者中发展的所述状态、障碍或病症的至少一种临床或亚临床症状的发生率和/或出现的可能性，该受试者可能被所述状态、障碍或病症折磨或易患所述状态、障碍或病症，但尚未经历或显示所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状；或(2)抑制所述状态、障碍或病症，即阻止、减少或延迟所述疾病的发展或其复发或其至少一种临床或亚临床症状；或(3)缓解所述疾病，即引起所述状态、障碍或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。对待治疗受试者的益处在统计学上是显著的，或者至少对患者或医生是可感知的。
如本文所使用的“受试者”或“患者”或“个体”或“动物”是指人、兽用动物(例如，猫、狗、牛、马、羊、猪等)和疾病的实验动物模型(例如小鼠、大鼠)。在优选的实施例中，受试者是人。
如本文所使用的，用于剂量或量的术语“有效的”是指在对有需要的受试者施用时足以产生期望的活性的化合物或药物组合物的量。应当注意，当施用活性成分的组合时，组合的有效量可以包含或者可以不包含单独施用时将有效的每种成分的量。所需的确切量将随受试者而变化，取决于受试者的种类、年龄和一般状况、所治疗的病症的严重程度、所采用的一或多种特定药物、施用的方式等。
如与本发明的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其它成分，其在生理学上是可耐受的并且当施用给哺乳动物(例如人)时通常不产生不良反应。优选地，如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于哺乳动物，并且更具体用于人类。
如本文所使用的，术语“载体”和“稀释剂”是指可用于制备药物制剂的药学上可接受的(例如，对于施用给人是安全且无毒的)载体或稀释物质。示例性的稀释剂包含无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
如本文所使用的，术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指通过两种或更多种最初分离的蛋白质或其部分的连接产生的蛋白质。在一些实施例中，接头或间隔子将存在于每种蛋白质之间。
如本文所使用的，术语“半衰期”是诸如蛋白质浓度或活性的量降低至如在一个时间段开始时测量的其值的一半所需的时间。
如本文所使用的，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同物表示相对于基线测量值的值，所述基线测量值为诸如在开始本文所述的治疗之前在同一个体中的测量值，或在不存在本文所述的治疗的情况下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量值。“对照受试者”是患有与被治疗的受试者相同形式的疾病的受试者，其与被治疗的受试者年龄大致相同。
如本文所使用的，术语“体外”是指在人工环境中(例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在多细胞生物体内发生的事件。
如本文所使用的，术语“体内”是指发生在多细胞生物体(例如人和非人动物)内的事件。在基于细胞的系统的背景下，该术语可以用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。
如本文所使用的，术语“接头”在融合蛋白中是指除了在天然蛋白或衍生物中特定位置出现的氨基酸序列之外的氨基酸序列，并且通常被设计为柔性的或在两个蛋白部分之间插入结构，例如α-螺旋。接头也被称为间隔子。接头或间隔子通常自身不具有生物学功能。
如本文使用的术语“多肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域普通技术人员将理解，该术语不限于长链，并且可以指包括通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员已知的，多肽可以被加工和/或修饰。如本文所使用的，术语“多肽”和“肽”可互换使用。术语“多肽”也可以指蛋白质。
如本文所使用的，术语“PTH变体”是指天然PTH(1-84)的任何衍生物，包含但不限于包括氨基酸添加、缺失和/或取代的PTH(1-84)衍生物、截短的(例如C末端截短的)PTH(1-84)、直接或通过接头或间隔子与肽或蛋白质或蛋白质结构域融合的PTH，以及以本领域中已知的任何方式翻译后修饰的(例如，糖基化的、聚乙二醇化的等)的PTH或其组合。
PTH
甲状旁腺激素(PTH)是一种由哺乳动物甲状旁腺分泌的多肽。天然PTH为84个氨基酸长并且具有以下序列(SEQ ID NO：1)：
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQ，或
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly
Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu
Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala
Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser
Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val
Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys
Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln
如本文所使用的，术语“人PTH”或“hPTH”被包括在术语PTH或甲状旁腺激素中。人PTH可以在体内合成、重组地(在细胞中)合成或使用本领域中已知的标准技术合成。
PTH-Fc融合
在一些实施例中，本发明的PTH变体是PTH-Fc融合蛋白。如本文所使用的“Fc”是指人IgG抗体的Fc区。Fc-融合蛋白(也被称为Fc嵌合融合蛋白、Fc-Ig、基于Ig的嵌合融合蛋白和Fc-标签蛋白)由IgG的Fc结构域组成，该结构域与目标肽或蛋白(例如，PTH)化学连接。
可以使用来自任何IgG的Fc结构域。作为非限制性实例，可以使用IgG1或IgG2或IgG3或IgG4的Fc结构域，以及源自不同IgG的Fc结构域的各种组合，诸如，例如半IgG2和半IgG4。在一个非限制性实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白具有人IgG1抗体的Fc结构域。
沉默的效应子功能可以通过抗体的Fc区中的突变获得，并且不同的IgG可以具有本领域技术人员已知的不同的沉默子区域。例如，对于IgG1，以下沉默子区域是已知的并且在本领域中已经被描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,生物技术的最新观点(Curr.Opin.Biotechnol).第20(6)卷:685-691)；和D265A(鲍仲义(Baudino)等人,2008,免疫学杂志(J.Immunol.)181:6664-69；Strohl,W.,同上)。沉默的Fc IgG1抗体的示例包括所谓的LALA突变体(“hFcLALA”)，其在IgG1 Fc氨基酸序列中包括L234A和L235A(EU编号)突变。沉默的IgG1抗体的另一个示例包括D265A突变。另一种沉默的IgG1抗体包括N297A突变，其导致糖基化的/非糖基化的抗体。
如本文所使用的，IgG1 hFcLALA具有以下序列，其中LALA突变带有下划线(SEQ IDNO:2)：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
PTH序列可以直接或间接连接到Fc结构域。在一个实施例中，PTH与Fc结构域直接连接。在其它实施例中，PTH通过氨基酸接头与Fc结构域连接。
在一些实施例中，可以进一步修饰Fc区以进一步延长融合蛋白的半衰期。在一个非限制性实例中，半衰期延长技术，例如ArGenX的NHance技术，可以与本发明的PTH-Fc变体结合使用。例如，在美国专利第8,163,881号(其内容通过引用整体并入本文)中描述了NHance技术。
在一个实施例中，根据本发明的Fc连接的PTH变体以二价结构提供，即具有两个拷贝的PTH和一个拷贝的Fc。
在另一个实施例中，根据本发明的Fc连接的PTH变体以单价结构提供，即具有一个拷贝的PTH和一个拷贝的Fc。在一个实施例中，单价PTH-Fc变体可以使用本领域中已知的重链突变(例如，旋钮和孔等)制备。本领域中已知的一种方法描述于例如美国专利第8,679,785号中。在另一个实施例中，单价PTH-Fc变体可以使用单体Fc制备，其中两个Fc部分可以通过接头(例如氨基酸接头)连接。
信号肽和蛋白酶标签
在一些实施例中，本发明的PTH变体由包括与PTH变体直接连接的信号肽的PTH变体前体多肽加工而成。多肽上的信号肽可以促进从用于产生PTH变体的哺乳动物宿主细胞中分泌PTH变体，其中信号肽在分泌后从PTH变体中裂解。可以使用任何数量的信号肽。
在一些实施例中，IgK前导序列存在于本发明的变体中，其具有以下序列(SEQ IDNO:3)：
METPAQLLFLLLLWLPDTTG.
在一些实施例中，IgG重链信号肽存在于本发明的变体中，具有以下序列(SEQ IDNO:4)：
MEFGLSWLFLVAILKGVQC.
在一些实施例中，CD33信号肽存在于本发明的变体中，具有以下序列(SEQ ID NO:5)：
MPLLLLLPLLWAGALA.
在一个特定的实施例中，具有序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:5)的CD33信号肽可以提供最佳的信号肽裂解，使PTH变体的位置1保持完整。
在一些实施例中，多聚组氨酸标签(HIS标签)存在于本发明的变体中，以便于使用识别并结合至HIS标签的亲和层析树脂进行PTH蛋白纯化。在一个实施例中，TEV-HIS标签存在于本发明的PTH变体的C末端。TEV组分是蛋白酶识别位点，其允许在蛋白质纯化后去除HIS标签。在一个实施例中，TEV-HIS标签的序列是ENLYFQSHHHHHH(SEQ ID NO:6)。在一个实施例中，TEV识别序列的一部分ENLYFQ(SEQ ID NO:7)保留在蛋白质的末端，并且不影响蛋白质的活性。
蛋白质糖基化
如本文所使用的，糖基化是其中碳水化合物(聚糖)与肽或蛋白质连接的反应。识别了不同类别的聚糖，其中两种最突出的是：连接到氮或精氨酸侧链的N连接的聚糖和连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟基赖氨酸或羟基脯氨酸侧链的羟基氧的O连接的聚糖。
在一些实施例中，将插入糖基化位点的氨基酸取代引入到本发明的PTH变体中。在一些实施例中，这些氨基酸取代可以将丝氨酸部分引入到PTH变体中。在一些实施例中，本发明的PTH变体可以包括F34A、F34D和/或V35S或V35T突变，以将聚糖位点插入到PTH变体中。
在一些实施例中，可以在F34(例如F34A或F34D)和/或V35(例如V35S或V35T)处进行氨基酸改变，以使在特定细胞类型(例如CHO细胞)中表达分子期间在该区域中观察到的蛋白水解最小化。F34A和F34D突变可以减少蛋白水解。F34A和V35S(或V35T)突变的组合更大程度地减少蛋白水解。这些突变产生了共有的N连接的糖基化位点，其包含N33位。这导致N33位的糖基化，其大大减少了该位置的蛋白水解。
在一些实施例中，在N33处插入聚糖位点降低了宿主细胞表达期间的蛋白质裂解。聚糖为PTH变体引入了额外的大小和体积。聚糖位点也可能改善PTH变体的溶解性。聚糖位点也可能延长PTH变体的半衰期(T1/2)。在蛋白质突变的位点处的聚糖插入也可能降低突变序列的潜在免疫原性。在一些实施例中，插入糖基化位点的氨基酸取代可以与PTH变体的其它突变或序列截短或翻译后修饰组合。
在一些实施例中，可以在L59(例如，L59S或L59T)处进行氨基酸改变。这种突变在N57位产生糖基化位点，这可能减少宿主细胞表达期间的蛋白质裂解。
其它变体：在一些实施例中，将氨基酸取代引入到PTH变体中可以改善开发性特征。在一些实施例中，这些氨基酸取代导致表达期间PTH变体的裂解减少。在一些实施例中，这些氨基酸取代导致PTH变体的溶解度提高。在一些实施例中，这些氨基酸取代导致聚糖插入。在一些实施例中，这些氨基酸取代可以将天冬氨酸引入到序列中。
在一些实施例中，本发明的PTH变体可以包括F34D突变以降低表达期间的蛋白质裂解。在一些实施例中，含有F34D的PTH变体可以与PTH变体的其它突变或序列截短或转译后修饰组合。
通常，合适的PTH变体的体内半衰期为或大于约2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时或48小时。在一些实施例中，PTH变体具有2至48小时、2至44小时、2至40小时、3至36小时、3至32小时、3至28小时、4至24小时、6至24小时和6至18小时的体内半衰期。
选定甲状旁腺激素变体的清单
在以下清单和整个说明书中，使用了以下缩写：
PTH(1-N)表示甲状旁腺激素肽残基1至N，其中N可以是84(对于天然长度PTH和变体)或小于84(对于C末端截短的PTH变体)。例如，PTH(1-84)表示甲状旁腺激素肽残基1至84(全长序列)；PTH(1-74)表示甲状旁腺激素肽残基1至74，即PTH(1-84)的C末端截短变体，它是PTH的前74个残基，其中最后10个残基已被去除；PTH(1-34)表示甲状旁腺激素肽残基1至34，即PTH(1-84)的C末端截短变体，它是前34个残基，其中最后50个残基已被去除，等等。
根据标准惯例指定变体序列中的点突变；例如，F34A表示34位的苯丙氨酸氨基酸被丙氨酸氨基酸取代；F34D表示34位的苯丙氨酸氨基酸被天冬氨酸残基取代，V35S表示35位的缬氨酸被丝氨酸取代，等等。
Δ表示[缺失的序列]，例如，ΔLys表示赖氨酸残基的去除。对于本文所包括的构建体，所去除的Lys是Fc分子的C末端区域以尤其改善药物产品的同质性。
在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是全长PTH(1-84)，例如突变的PTH(1-84)。
在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是从PTH(1-35)到PTH(1-83)的任何长度的截短的PTH。在一个实施例中，与Fc连接的PTH可以是PTH(1-33)。
在本发明的一些实施例中，与Fc连接的PTH可以是PTH(1-84)或PTH(1-83)或PTH(1-82)或PTH(1-81)或PTH(1-80)或PTH(1-79)或PTH(1-78)或PTH(1-77)或PTH(1-76)或PTH(1-75)或PTH(1-74)或PTH(1-73)或PTH(1-72)或PTH(1-71)或PTH(1-70)或PTH(1-69)或PTH(1-68)或PTH(1-67)或PTH(1-66)或PTH(1-65)或PTH(1-64)或PTH(1-63)或PTH(1-62)或PTH(1-61)或PTH(1-60)或PTH(1-59)或PTH(1-58)或PTH(1-57)或PTH(1-56)或PTH(1-55)或PTH(1-54)或PTH(1-53)或PTH(1-52)或PTH(1-51)或PTH(1-50)或PTH(1-49)或PTH(1-48)或PTH(1-47)或PTH(1-46)或PTH(1-45)或PTH(1-44)或PTH(1-43)或PTH(1-42)或PTH(1-41)或PTH(1-40)或PTH(1-39)或PTH(1-38)或PTH(1-37)或PTH(1-36)或PTH(1-35)或PTH(1-33)。
在本发明的示例性实施例的以下描述中，信号肽用斜体标记，PTH区域用粗体标记，其中任何突变加下划线，并且任何融合序列用
Figure BDA0003215185110000143
标记。
分子名称‘PTH-66’(SEQ ID NO:8)
描述：PTH(1-74)-[F34A,V35S]-hFcLALA-ΔLys
信号肽,PTH1-74,插入聚糖位点的突变,
Figure BDA0003215185110000141
Figure BDA0003215185110000142
分子名称‘PTH-67’(SEQ ID NO:9)
描述：PTH(1-64)-[F34A,V35S]-hFcLALA-ΔLys
信号肽,PTH1-64,插入聚糖位点的突变,
Figure BDA0003215185110000151
Figure BDA0003215185110000152
分子名称‘PTH-68’(SEQ ID NO:10)
描述：PTH(1-54)-[F34A,V35S]-hFcLALA-ΔLys
信号肽,PTH1-54,插入聚糖位点的突变,
Figure BDA0003215185110000153
Figure BDA0003215185110000154
分子名称‘PTH-69’(SEQ ID NO:11)
描述：PTH(1-44)-[F34A,V35S]-hFcLALA-ΔLys
信号肽,PTH1-44,插入聚糖位点的突变,
Figure BDA0003215185110000155
Figure BDA0003215185110000156
分子名称‘PTH-11’(SEQ ID NO:12)
描述：PTH(1-84)-hFcLALA
Figure BDA0003215185110000157
Figure BDA0003215185110000161
其它PTH变体
在一个实施例中，根据本发明的PTH变体可以直接或通过接头与白蛋白或白蛋白的结构域缀合。在一个实施例中，根据本发明的PTH-白蛋白融合体可以通过在美国专利第7,592,010中描述的方法制备。PTH-白蛋白变体可以是单价结构，即具有一个拷贝的PTH和一个拷贝的白蛋白或白蛋白的结构域。在一个实施例中，PTH-白蛋白融合蛋白的血清半衰期长于PTH(1-84)的血清半衰期。在一个实施例中，本发明的PTH-白蛋白融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长2倍、或长3倍、或长5倍、或长10倍、或长20倍、或长30倍、或长40倍。在一个实施例中，本发明的PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长40倍。
在一个实施例中，与白蛋白连接的PTH可以是突变的PTH(1-84)或PTH(1-83)或PTH(1-82)或PTH(1-81)或PTH(1-80)或PTH(1-79)或PTH(1-78)或PTH(1-77)或PTH(1-76)或PTH(1-75)或PTH(1-74)或PTH(1-73)或PTH(1-72)或PTH(1-71)或PTH(1-70)或PTH(1-69)或PTH(1-68)或PTH(1-67)或PTH(1-66)或PTH(1-65)或PTH(1-64)或PTH(1-63)或PTH(1-62)或PTH(1-61)或PTH(1-60)或PTH(1-59)或PTH(1-58)或PTH(1-57)或PTH(1-56)或PTH(1-55)或PTH(1-54)或PTH(1-53)或PTH(1-52)或PTH(1-51)或PTH(1-50)或PTH(1-49)或PTH(1-48)或PTH(1-47)或PTH(1-46)或PTH(1-45)或PTH(1-44)或PTH(1-43)或PTH(1-42)或PTH(1-41)或PTH(1-40)或PTH(1-39)或PTH(1-38)或PTH(1-37)或PTH(1-36)或PTH(1-35)或PTH(1-33)。
核酸
在另一个方面中，提供了一种包括编码本文所述的PTH变体的序列的核酸。该序列可以与SEQ ID NOS:8-12中的任一个具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施例中，该核酸可以包括另外的非编码序列。该核酸可以进一步包括其特定片段、变体或共有序列，或包括这些序列中至少一个的沉积载体。核酸分子可以是RNA的形式，诸如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其它形式，或DNA的形式，包含但不限于通过克隆获得的、通过基因疗法(例如使用AAV)合成产生的cDNA和基因组DNA，或其任何组合。DNA可以是三链的、双链的或单链的，或其任意组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分都可以是编码链(也被称为有义链)，或者它可以是非编码链(也被称为反义链)。
在一些实施例中，编码转基因的核酸可以被修饰以提供编码的PTH变体的增加的表达，这也被称为密码子优化。例如，可以通过改变编码序列的开放阅读框来修饰编码转基因的核酸。如本文所使用的，术语“开放阅读框”与“ORF”同义，并且意指任何可能能够编码蛋白质或蛋白质的一部分的核苷酸序列。开放阅读框通常以起始密码子(例如，在标准代码中，对于RNA分子被表示为AUG，并且对于DNA分子被表示为ATG)开始，并以密码子三联体形式阅读，直到该框以终止密码子(例如，在标准代码中，对于RNA分子被表示为UAA、UGA或UAG，并且对于DNA分子被表示为TAA、TGA或TAG)结束。如本文所使用的，术语“密码子”是指在蛋白质合成期间指定特定氨基酸的核酸分子中的三个核苷酸的序列；也被称为三联体或密码子三联体。例如，在标准遗传密码中的64个可能的密码子中，两个密码子GAA和GAG编码氨基酸谷氨酰胺，而密码子AAA和AAG指定氨基酸赖氨酸。在标准遗传密码中，三个密码子是终止密码子，它们不指定氨基酸。如本文所使用的，术语“同义密码子”是指编码单个氨基酸的任何和所有密码子。除了甲硫氨酸和色氨酸，氨基酸由两到六个同义密码子编码。例如，在标准遗传密码中，编码氨基酸丙氨酸的四个同义密码子是GCA、GCC、GCG和GCU，指定谷氨酰胺的两个同义密码子是GAA和GAG，并且编码赖氨酸的两个同义密码子是AAA和AAG。
可以使用标准密码子优化方法来修饰编码PTH变体的开放阅读框的核酸。用于密码子优化的各种商业算法是可用的，并且可以用于实施本发明。通常，密码子优化不会改变编码的氨基酸序列。
核苷酸变化可以改变开放阅读框内的同义密码子，以便与在被选择成表达PTH变体的特定异源细胞中发现的内源性密码子使用一致。可替代地或另外地，核苷酸变化可以改变开放阅读框内的G+C含量，以更好地匹配在异源宿主细胞中存在的内源核酸序列中发现的开放阅读框的平均G+C含量。核苷酸变化也可以改变PTH变体序列中发现的多单核苷酸区域或内部调控或结构位点。因此，设想了多种修饰的或优化的核苷酸序列，包含但不限于在原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中提供增加的PTH变体表达的核酸序列。
如本文所述，多核苷酸可以进一步包含额外的序列，例如至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列，具有或不具有上述额外的编码序列，诸如至少一个内含子，以及额外的非编码序列，包含但不限于非编码5'和3'序列，诸如在转录、mRNA加工(包含剪接和多聚腺苷酸化信号)(例如-mRNA的核糖体结合和稳定性)中起作用的转录的非翻译序列；编码额外的氨基酸的额外编码序列，例如提供额外功能的氨基酸。因此，编码PTH变体或特定部分的序列可以与标记序列(诸如编码有助于纯化融合的PTH变体或包括PTH变体片段或部分的特定部分的肽的序列)融合。
除了本发明的多核苷酸之外，核酸可以进一步包括序列。例如，可以将包括一或多个核酸内切酶限制位点的多克隆位点插入到核酸中，以帮助分离多核苷酸。此外，可以插入可翻译序列以帮助分离本发明的翻译的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明的蛋白质的便利手段。本发明的核酸(不包括编码序列)任选地是用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体、衔接子或接头。
转基因的编码区可以包含一或多个沉默突变，以优化特定细胞类型的密码子使用。例如，PTH变体的密码子可以被优化以用于在脊椎动物细胞中表达。在一些实施例中，PTH变体的密码子可以被优化以用于在哺乳动物细胞中表达。在一些实施例中，PTH变体的密码子可以被优化以用于在人细胞中表达。在一些实施例中，PTH变体的密码子可以被优化以用于在CHO细胞中表达。
如本申请中所述的编码PTH变体的核酸序列可以被分子克隆(插入)到合适的载体中以用于在宿主细胞中增殖或表达，或者在一些实施例中也可以合成整个质粒。例如，将包括有效从宿主细胞分泌PTH变体的信号肽的PTH变体序列插入到合适的载体中，诸如选自SEQ ID NOS:8-12的序列。多种表达载体可以用于实施本发明，包含但不限于原核表达载体；酵母表达载体；昆虫表达载体和哺乳动物表达载体。适合于本发明的示例性载体包含但不限于基于病毒的载体(例如，基于AAV的载体、基于逆转录病毒的载体、基于质粒的载体)。在一些实施例中，可以将编码PTH变体的核酸序列插入到合适的载体中。通常，编码PTH变体的核酸与各种调控序列或元件可操作地连接。
各种调控序列或元件可以被掺入到适合于本发明的表达载体中。示例性的调控序列或元件包含但不限于启动子、增强子、阻遏子或抑制子、5'非翻译(或非编码)序列、内含子、3'非翻译(或非编码)序列。
如本文所使用的，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如，直接或通过其它启动子结合的蛋白质或物质)并启动编码序列的转录的DNA调控区。启动子序列通常在其3'末端通过转录起始位点结合，并向上游(5'方向)延伸，以包含在任何水平启动转录所需的最少数量的碱基或元件。启动子可以与表达控制序列(包含增强子和阻遏子序列)或待表达的核酸可操作地相关或可操作地连接。在一些实施例中，启动子可以是诱导型的。在一些实施例中，诱导型启动子可以是单向的或双向的。在一些实施例中，启动子可以是组成型启动子。在一些实施例中，启动子可以是杂合启动子，其中含有转录调控区的序列从一个来源获得，而含有转录起始区的序列从第二来源获得。用于将控制元件连接到转基因内的编码序列的系统在本领域中是熟知的(一般的分子生物学和重组DNA技术描述于桑布鲁克(Sambrook)，弗里奇(Fritsch)和曼尼阿提斯(Maniatis)，分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约，1989，其通过引用并入本文)。适合于插入转基因以用于在各种生长和诱导条件下在各种宿主细胞中表达的商业载体也是本领域中熟知的。
在一些实施例中，特异性启动子可以用于控制转基因在哺乳动物宿主细胞中的表达，例如但不限于SRa-启动子(武部(Takebe)等人,分子和细胞生物学(Molec.andCell.Bio.)8:466-472(1988))、人CMV立即早期启动子(博沙特(Boshart)等人，细胞(Cell)41:521-530(1985)；福克(Foecking)等人,基因(Gene)45:101-105(1986))、人CMV启动子、人CMV5启动子、鼠CMV立即早期启动子、EF1-α-启动子、用于肝脏特异性表达的杂合CMV启动子(例如，通过使CMV立即早期启动子与人α-1-抗胰蛋白酶(HAT)或白蛋白(HAL)启动子的转录启动子元件缀合而制备)，或用于肝癌特异性表达的启动子(例如，其中人白蛋白(HAL；约1000bp)或人α-1-抗胰蛋白酶(HAT，约2000bp)与人α-1-微球蛋白和比库蛋白前体基因(AMBP)的145长增强子元件结合；HAL-AMBP和HAT-AMBP)；SV40早期启动子区(本努瓦(Benoist)等人,自然(Nature)290:304-310(1981))，花旗松蛾(Orgyia pseudotsugata)立即早期启动子，疱疹胸苷激酶启动子(瓦格纳(Wagner)等人,美国国家科学院院刊,78:1441-1445(1981))；或金属硫蛋白基因的调控序列(布林斯特(Brinster)等人，自然,296:39-42(1982))。在一些实施例中，哺乳动物启动子是组成型启动子，诸如但不限于次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPTR)启动子、腺苷脱氨酶启动子、丙酮酸激酶启动子、β-肌动蛋白启动子以及本领域普通技术人员已知的其它组成型启动子
在一些实施例中，特异性启动子可以用于控制转基因在原核宿主细胞中的表达，诸如但不限于β-内酰胺酶启动子(维拉-科马罗夫(Villa-Komaroff)等人,美国国家科学院院刊,75:3727-3731(1978))；tac启动子(德波尔(DeBoer)等人,美国国家科学院院刊,80:21-25(1983))；T7启动子、T3启动子、M13启动子或M16启动子；在酵母宿主细胞中的表达，诸如但不限于GAL1、GAL4或GAL10启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶III(TDH3)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶II(TDH2)启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶I(TDH1)启动子、丙酮酸激酶(PYK)、烯醇酶(ENO)或磷酸丙糖异构酶(TPI)。
在一些实施例中，启动子可以是病毒启动子，其中许多启动子能够调控转基因在几种宿主细胞类型(包含哺乳动物细胞)中的表达。已显示驱动真核细胞中编码序列的组成型表达的病毒启动子包含，例如，猿猴病毒启动子、单纯疱疹病毒启动子、乳头瘤病毒启动子、腺病毒启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒和其它逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子以及本领域普通技术人员已知的其它病毒启动子
在一些实施例中，表达载体的基因控制元件还可以包含分别与转录和翻译起始有关的5'非转录序列和5'非翻译序列，诸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、Kozak序列等。增强子元件可以任选地用于增加待表达的多肽或蛋白质的表达水平。已显示在哺乳动物细胞中起作用的增强子元件的示例包含SV40早期基因增强子(如在迪耶科(Dijkema)等人,欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)(1985)4:761中所述)和源自劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复序列(LTR)的增强子/启动子(如在戈尔曼(Gorman)等人,美国国家科学院院刊,(1982b)79:6777中所述)和人巨细胞病毒(如在博沙特等人,细胞,(1985)41:521中所述)。表达载体的遗传控制元件还将包含与转录和翻译终止有关的3'非转录序列和3'非翻译序列。分别为，诸如用于稳定和处理由启动子转录的mRNA的3'末端的多聚腺苷酸化(polyA)信号。示例性的polyA信号包含，例如，兔β珠蛋白polyA信号、牛生长激素polyA信号、鸡β珠蛋白终止子/polyA信号和SV40晚期polyA区。
表达载体将优选地但任选地包含至少一个可选择标志物。在一些实施例中，可选择标志物是编码与一或多个遗传调控元件可操作地连接的抗性基因的核酸序列，以赋予宿主细胞在细胞毒性化学物质和/或药物的存在下生长时维持生存力的能力。在一些实施例中，可以使用可选择性试剂来维持表达载体在宿主细胞内的保留。在一些实施例中，可以使用可选择性试剂来防止表达载体内转基因序列的修饰(即甲基化)和/或沉默。在一些实施例中，使用可选择性试剂来维持载体在宿主细胞内的游离体表达。在一些实施例中，可以使用可选择性试剂来促进转基因序列稳定整合到宿主细胞基因组中。在一些实施例中，药剂和/或抗性基因可以包含但不限于用于真核宿主细胞的甲氨蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利第4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017号、氨苄青霉素、新霉素(G418)、博来霉素(zeomycin)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利第5,122,464；5,770,359；5,827,739号)；用于原核宿主细胞的四环素、氨苄青霉素、卡那霉素或氯霉素；和用于酵母宿主细胞的URA3、LEU2、HIS3、LYS2、HIS4、ADE8、CUP1或TRP1。
表达载体可以被转染、转化或转导到宿主细胞中。如本文所使用的，术语“转染”、“转化”和“转导”均指将外源性核酸序列引入到宿主细胞中。在一些实施例中，将含有编码PTH Fc融合的核酸序列的表达载体同时转染、转化或转导到宿主细胞中。在一些实施例中，将含有编码PTH变体的核酸序列的表达载体依次转染、转化或转导到宿主细胞中。
本领域熟知的转化、转染和转导方法的实例包含脂质体递送，即霍利-尼尔逊(Hawley-Nelson),病灶(Focus)15:73(1193)的LipofectamineTM(Gibco BRL)方法、电穿孔、格雷厄姆(Graham)和范德埃尔布(van der Erb),病毒学(Virology),52:456-457(1978)的CaPO4递送方法、DEAE-葡聚糖药制的递送、显微注射、基因枪粒子递送、聚芳烃介导的递送、阳离子介导的脂质递送、转导和病毒感染，诸如例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒腺相关病毒和杆状病毒(昆虫细胞)。
一旦引入到细胞内，表达载体可以被稳定地整合到基因组中或作为染色体外构建体存在。载体也可以被扩增，并且在基因组中可以存在或整合多个拷贝。在一些实施例中，本发明的细胞可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多拷贝的编码PTH变体的核酸。
宿主细胞
在另一个方面中，提供了一种包括本文所述的多核苷酸的宿主细胞，例如允许在宿主细胞中表达PTH变体的多核苷酸。宿主细胞可以是哺乳动物细胞，其中非限制性实例包含BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC编号:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6,CruCell,荷兰莱顿)；由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(亚克隆的HEK293或293细胞，用于悬浮培养生长，格雷厄姆等人，普通病毒学杂志(J.GenVirol.),36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK21，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO，乌尔劳布(Urlaub)和蔡辛(Chasin),美国国家科学院院刊,77:4216,1980)，包含CHO EBNA(达拉莫拉O(Daramola O)等人,生物技术进展(Biotechnol.Prog.),2014,30(1):132-41)和CHO GS(范L(Fan L)等人,生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)2012,109(4):1007-15；小鼠支持细胞(TM4,马瑟(Mather),生殖生物学(Biol.Reprod.),23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马瑟等人，纽约科学院年鉴(Annals N.Y.Acad.Sci.),383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。在一个实施例中，宿主细胞可以是中国仓鼠卵巢细胞。
多核苷酸可以在表达质粒中。表达质粒可以具有本领域普通技术人员已知的任何数量的复制起点。多核苷酸或表达质粒可以通过本领域普通技术人员已知的任何数量的方式被引入到宿主细胞中。例如，可以使用流式电穿孔系统，诸如MaxCyte
Figure BDA0003215185110000221
MaxCyte
Figure BDA0003215185110000222
或MaxCyte
Figure BDA0003215185110000223
转染系统，将多核苷酸或表达质粒引入到宿主细胞中。
在各种实施例中，宿主细胞表达核酸。宿主细胞可以以足以进行补料分批细胞培养规模或其它大规模的水平表达PTH变体。大规模生产重组PTH变体的替代方法包含辊瓶培养、生物反应器分批培养和灌注法。在一些实施例中，重组PTH变体蛋白由悬液培养的细胞产生。在一些实施例中，通过贴壁细胞来产生重组PTH变体蛋白。
生产
重组PTH变体可以通过任何可用的手段来生产。例如，重组PTH变体可以通过利用经工程改造以表达编码重组PTH变体的核酸的宿主细胞系统而重组产生。可替代地或另外地，重组PTH变体可以通过激活内源性基因产生。可替代地或另外地，重组PTH变体可以通过化学合成部分或完全制备。可替代地，重组PTH变体可以通过mRNA治疗或AAV/慢病毒基因疗法在体内产生。
在一些实施例中，重组PTH变体在哺乳动物细胞中产生。根据本发明可以使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包含BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC编号:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6,CruCell,荷兰莱顿)；由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(亚克隆的HEK293或293细胞，用于悬浮培养生长，格雷厄姆等人，普通病毒学杂志,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK21，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，乌尔劳布和蔡辛,美国国家科学院院刊,77:4216,1980)，包含CHO EBNA(达拉莫拉O等人,生物技术进展,2014,30(1):132-41)和CHO GS(范L等人,生物技术和生物工程,2012,109(4):1007-15；小鼠支持细胞(TM4,马瑟,生殖生物学,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(马瑟等人,纽约科学院年鉴,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
在一些实施例中，重组PTH变体由人细胞产生。在一些实施例中，重组PTH变体由CHO细胞或HT1080细胞产生。
在某些实施例中，基于某些优选的属性或在选择用于培养细胞的特定条件下的生长，选择宿主细胞用于产生细胞系。本领域技术人员将理解，这种属性可以基于已知的特征和/或已建立的细胞系(即表征的市售细胞系)的特征或通过经验评估来确定。在一些实施例中，可以根据细胞系在细胞的饲养层上生长的能力来选择细胞系。在一些实施例中，可以根据细胞系在悬浮液中生长的能力来选择细胞系。在一些实施例中，可以根据细胞系作为细胞的贴壁单层生长的能力来选择细胞系。在一些实施例中，可以选择用于优先翻译后修饰(例如糖基化)的细胞系。在一些实施例中，这样的细胞可以与任何组织培养容器或用合适的粘附底物处理的任何容器一起使用。在一些实施例中，合适的粘附底物选自由胶原(例如胶原I、II、II或IV)、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、BD MatrigelTM、基膜基质、硫酸皮肤素蛋白聚糖、聚-D-赖氨酸和/或其组合组成的组。在一些实施例中，可以选择贴壁宿主细胞并在特定生长条件下修饰以在悬浮液中生长。这种修饰贴壁细胞以使其在悬浮液中生长的方法在本领域中是已知的。例如，可以通过随时间从生长培养基中逐渐除去动物血清来调节细胞以在悬浮液培养物中生长。
通常，经工程改造以表达重组PTH变体的细胞可以包括编码本文所述的重组PTH变体的转基因。应当理解，编码重组PTH变体的核酸可以含有调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于表达重组PTH变体的其它合适序列。通常，编码区与这些核酸组分中的一或多种可操作地连接。
在一些实施例中，使用分批培养方法来表达PTH变体。在一些实施例中，分批培养持续时间可以持续7-14天。在一些实施例中，分批培养可以持续14-21天。在一些实施例中，使用灌注培养方法(每天随时间收集培养基)来表达PTH变体。在一些实施例中，使用假灌注培养方法来表达PTH变体(在单个时间点每日收集培养基，并用新鲜培养基替换)。在一些实施例中，可以使用特定的饲养方案/培养基来促进最佳的PTH变体产生(改善的聚糖，减少剪切)。在一些实施例中，可以控制/维持细胞密度以促进最佳PTH变体产生(改善的聚糖/减少的剪切)。
在一些实施例中，通过mRNA治疗在体内产生重组PTH变体。制备编码PTH变体的mRNA，并施用给需要PTH变体的患者。mRNA可以包括与SEQ ID NO:8-12的DNA序列相对应的序列。可以使用各种施用途径，诸如注射、肺部雾化和皮肤下电穿孔。mRNA可以被包封在病毒载体或非病毒载体中。示例性的非病毒载体包含脂质体、阳离子聚合物和立方晶(cubosomes)。
回收和纯化
可以使用用于从细胞中纯化PTH变体的各种方法。各种方法可以用于纯化或分离根据本文所述的各种方法产生的PTH变体。在一些实施例中，将表达的蛋白质分泌到培养基中，并且因此可以除去细胞和其它固体，如例如通过离心或过滤，作为纯化工艺的第一步。可替代地或另外地，表达的蛋白质被结合到宿主细胞的表面。在该实施例中，裂解表达多肽或蛋白质的宿主细胞以进行纯化。哺乳动物宿主细胞的裂解可以通过本领域普通技术人员熟知的任意数量的方法实现，包含通过玻璃珠的物理破碎、利用去污剂和暴露于高pH条件。在一些实施例中，PTH变体可以被表达为不溶性级分(包涵体)。在此类实施例中，例如可以通过离心来收集细胞，并使用本领域公知的变性剂裂解。
PTH变体可以通过标准方法(包含但不限于层析法(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石层析法)、凝胶过滤、离心或差速溶解度、乙醇沉淀)或通过任何其它可用的用于蛋白质纯化的技术来分离和纯化。参见，例如，斯科普斯(Scopes)，蛋白质纯化原理和实践(Protein Purification Principles and Practice)第二版，斯普林格出版社(Springer-Verlag),纽约,1987；希金斯(Higgins),S.J和黑姆斯(Hames),B.D.(编辑)，蛋白质表达：一种实用的方法(Protein Expression:A Practical Approach)，牛津大学出版社(Oxford Univ Press)，1999；和多伊彻(Deutscher),M.P.,西蒙(Simon),M.I.,阿贝尔森(Abelson),J.N.(编辑)，蛋白质纯化指南:酶学方法(Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology)(酶学方法系列(Methods in Enzymology Series)，第182卷)，学术出版社(Academic Press)，1997，所有内容通过引用并入本文。特别是对于免疫亲和层析法，可以通过将其结合到亲和柱上来分离蛋白质，所述亲和柱包括针对该蛋白质产生的并固定到固定支持物上的抗体。可替代地，亲和标签(诸如流感病毒外壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶)可以通过标准重组技术被连接到蛋白质上，以便于允许通过合适的亲和柱进行纯化。蛋白酶抑制剂诸如苯基甲基磺酰氟(PMSF)、亮蛋白胨、抑肽素或抑肽酶可以在任何或所有阶段加入，以便减少或消除纯化过程期间多肽或蛋白质的降解。当必须裂解细胞以便分离和纯化表达的多肽或蛋白质时，蛋白酶抑制剂是特别期望的。
PTH变体或特定部分可以通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包含但不限于蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、亲和层析法、混合模式层析法(例如MEPHypercelTM)、羟基磷灰石层析法和凝集素层析法。高效液相层析法(“HPLC”)也可以用于纯化。参见，例如，科利根(Colligan)，免疫学的当前协议(Current Protocols inImmunology)，或蛋白质科学的当前协议(Current Protocols in Protein Science)，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州纽约市(1997-2003)。
蛋白质A纯化后的中和应小心进行，以避免PTH-Fc融合蛋白的聚集/沉淀。
本发明的PTH变体或特定部分包含天然纯化的产物、化学合成过程的产物以及通过重组技术从真核宿主(包含例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。根据重组生产过程中使用的宿主和特定的PTH变体，本发明的PTH变体或特定部分可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。
制剂
在一些实施例中，本文所述的药物组合物进一步包括载体。合适的可接受载体包含但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(诸如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(诸如甘露醇、蔗糖或其它)、葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及它们的组合。如果需要，药物制剂可以与助剂(例如，稀释剂、缓冲剂、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，这些助剂不会与活性化合物发生有害反应或者干扰它们的活性。在一些实施例中，使用适合于静脉内施用的水溶性载体。
药学上可接受的助剂是优选的。制备这种无菌溶液的非限制性实例和方法在本领域是熟知的，诸如但不限于热纳罗(Gennaro)编辑,雷明顿制药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)，第18版，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)(宾夕法尼亚州伊斯顿)1990。可以常规地选择药学上可接受的载体，其适合于如本领域中熟知的或如本文所述的PTH变体组合物的施用方式、溶解度和/或稳定性。例如，可以使用微酸性或生理pH的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。pH缓冲剂可以是磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其是优选的缓冲液)、精氨酸、赖氨酸或醋酸盐或其混合物。优选的缓冲范围是pH 4-8，或pH6.5-8，或pH 7-7.5。在药物组合物中可以提供防腐剂，诸如对甲酚、间甲酚和邻甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯酚、苯甲醇、苯甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸苄酯、山梨酸、丙酸、对羟基苯甲酸的酯。可以在药物组合物中提供防止氧化、脱酰胺、异构化、外消旋化、环化、肽水解的稳定剂，诸如例如抗坏血酸、甲硫氨酸、色氨酸、EDTA、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。在药物组合物中可以提供防止聚集、原纤化和沉淀的稳定剂，诸如十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、羧甲基纤维素、环糊精。在药物组合物中可以提供用于增溶或防止聚集的有机改性剂，诸如乙醇、乙酸或乙酸酯及其盐。在药物组合物中可以提供等渗剂，诸如盐，例如氯化钠或碳水化合物，例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物。
可用于本发明组合物的药用赋形剂和添加剂包含但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包含单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它们可以单独或组合存在，且单独或组合地佔1-99.99重量或体积％。示例性的蛋白质赋形剂包含血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。代表性的氨基酸/PTH变体组分(其也可以发挥缓冲能力)包含丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。优选的氨基酸是甘氨酸。
可以使用碳水化合物赋形剂，例如单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇等。
PTH变体组合物还可包含缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。示例性的缓冲剂包含有机酸的盐，诸如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲液。
此外，本发明的PTH变体组合物可以包含聚合物赋形剂/添加剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(一种聚合糖)、右旋糖酐(例如环糊精，诸如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，诸如“吐温20”和“吐温80”)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
适合于根据本发明的PTH变体组合物的这些和其他的已知药物赋形剂和/或添加剂在本领域中是已知的，例如如在“雷明顿:药学的科学与实践(Remington:The Science&Practice of Pharmacy)”，第21版，威廉姆斯&威廉姆斯(Williams&Williams)，(2005)和“医生手册(Physician's Desk Reference)”，第71版，医学经济学(Medical Economics)，蒙特韦尔(Montvale),新泽西州(2017)(其公开内容通过引用整体并入本文)中所列出。优选的载体或赋形剂材料是盐(例如，氯化钠)、碳水化合物(例如，甘露醇)和缓冲剂(例如，柠檬酸盐)。
药物组合物可以被配制成适合通过于静脉内或皮下注射或输注施用的液体。液体可以包括一或多种溶剂。示例性的溶剂包含但不限于水；醇类，诸如乙醇和异丙醇；植物油；聚乙二醇；丙二醇；和甘油或它们的混合和组合。可以使用适合于静脉内施用的水溶性载体。例如，在一些实施例中，用于静脉内施用的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂，以减轻注射部位的疼痛。通常，这些成分以单位剂量形式(例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物)单独提供或一起混合在密封的容器中，诸如指示活性剂的量的安瓿或小袋。在组合物待通过输注被施用的情况下，可以用含有无菌药物级水、盐水或葡萄糖/水的输液瓶进行分配。在组合物通过注射施用的情况下，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得在施用前混合成分。
如上所述，制剂可以优选地包含含有盐水或选定盐的合适的缓冲液，以及任选的保存溶液和含有防腐剂的制剂，以及适合于药物或兽医用途的多用途保存制剂，其在药学上可接受的制剂中包括至少一种PTH变体。保存的制剂含有至少一种已知的防腐剂或任选地选自由至少一种苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、硝酸苯基汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、烷基对羟基本甲酸酯(甲基、乙基、丙基、丁基等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞，或它们在含水稀释剂中的混合物。可以使用如本领域中已知的任何合适的浓度或混合物，诸如0.001-5％，或其中的任何范围或值，诸如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或其中的任何范围或值。非限制性示例包含，无防腐剂、0.1-2％的间甲酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％的苯甲醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％的硫柳汞(例如，0.005、0.01)、0.001-2.0％的苯酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％的烷基对羟基本甲酸酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
PTH变体可以被配制成用于肠胃外施用，并且可以含有无菌水或盐水、聚亚烷基二醇诸如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等作为常用赋形剂。根据已知的方法，注射用水性或油性混悬液可以通过使用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备。注射用药剂可以是无毒的、非口服施用的稀释剂，诸如水溶液或无菌可注射溶液或溶剂中的悬浮液。作为可用的媒介物或溶剂，水、林格氏溶液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌不挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的非挥发性油和脂肪酸，包含天然的或合成的或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然的或合成的或半合成的单甘油酯或二甘油酯或三甘油酯。肠胃外施用在本领域是已知的，并且包含但不限于常规的注射手段、如美国专利第5,851,198号中描述的气压无针注射装置和如在美国专利第5,839,446号中描述的激光穿孔器装置。
药物组合物可以是延长释放制剂。该药物组合物也可以被配制成用于持续释放、延长释放、延迟释放或缓慢释放PTH变体，例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。延长释放(也被称为受控释放和持续释放)可以提供给可注射制剂。微球、纳米球、植入物、贮库和聚合物可以与本文所述的任何化合物、方法和制剂结合使用，以提供延长的释放概况。
本发明的PTH变体，例如包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，可以以约0.001至约100mg/mL、或约0.005至约50mg/mL、或约0.007至约20mg/mL、或约0.01至约10mg/mL、或约0.05至约5.0mg/mL、或约0.07至约2.0mg/mL、或约0.1至约1.0mg/mL的浓度配制。在一个实施例中，PTH变体可以以约0.01至约10mg/mL的浓度配制。在一个实施例中，PTH变体可以以约0.1至约1.0mg/mL的浓度配制。
包括PTH变体的制剂和组合物可以任选地进一步包括有效量的至少一种化合物或蛋白质，所述化合物或蛋白质选自糖尿病或胰岛素代谢相关药物、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于液体或电解质平衡的药物、血液药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼部、耳部或鼻部药物、局部药物、营养药物等中的至少一种。这类药物在本领域中是熟知的，包含本文所述的每种的制剂、适应症、剂量和施用(参见，例如，护理2001药物手册(Nursing2001Handbook of Drugs),第21版,春之屋公司(Springhouse Corp.),春之屋,宾夕法尼亚州(Pa.),2001；健康专家药物指南2001(Health Professional's Drug Guide 2001),编辑谢农(Shannon),威尔逊(Wilson),斯唐(Stang),普伦蒂斯霍尔公司(Prentice-Hall,Inc),新泽西州上马鞍河(Upper Saddle River,NJ)；药物疗法手册(PharmacotherapyHandbook),威尔斯(Wells)等人编辑,阿普尔顿&兰格(Appleton&Lange),斯坦福,康涅狄格州，每一篇均通过引用整体并入本文)。
PTH变体也可以被配制成缓释植入装置，用于延长的或持续的施用PTH变体。这种持续释放的制剂可以是位于身体外部的贴剂的形式。持续释放的制剂的实例包含生物相容性聚合物的复合物，诸如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、唾液酸、硅酸盐、胶原、脂质体等。当需要提供高局部浓度的PTH变体肽抗体时，持续释放的制剂可能是特别感兴趣的。
PTH变体组合物和制剂可以作为透明溶液或双小瓶形式提供给患者，所述双小瓶包括冻干的至少一种PTH变体(例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列)的小瓶或用含有水性稀释剂的第二小瓶重构的特定部分或变体。需要重构的单个溶液小瓶或双小瓶可以重复使用多次，并且可以满足单个或多个周期的患者治疗，并且因此提供了比目前可用的更方便的治疗方案。
PTH变体组合物和制剂可以通过向药房、诊所或其它此类机构和设施提供透明溶液或双小瓶被间接地提供给患者，所述双小瓶包括冻干的至少一种PTH变体(例如，包括SEQID NO:8的氨基酸序列)的小瓶或用含有水性稀释剂的第二小瓶重构的特定部分或变体。在这种情况下，透明溶液的体积可以高达1升或甚至更大，提供了大的容器，从该容器中可以一次或多次取出较小部分的PTH变体(例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列)或特定部分或变体溶液，以用于转移到较小的小瓶中，并由药房或诊所提供给它们的顾客和/或患者。此类产品可以包含包装材料。除了监管机构要求的信息外，包装材料还可以提供产品可以使用的条件。包装材料可以向患者提供在水性稀释剂中重构PTH变体(例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列)或特定部分或变体以形成溶液并在2-24小时或更长时间内使用该溶液用于两小瓶的湿/干产品的说明。
治疗
在另一个方面中，提供了一种用于治疗患有甲状旁腺功能减退和/或由于甲状旁腺功能减退引起的低钙血症的受试者的方法，包括使用有效控制受试者的血清和尿钙水平的给药方案用本发明的PTH变体治疗受试者。PTH变体可能对治疗甲状旁腺功能减退和/或由于甲状旁腺功能减退引起的低钙血症特别有效，因为它们具有比天然PTH(1-84)更长的半衰期。更长的半衰期允许PTH变体的每日施用并维持在更具生理学相关性的水平，这允许对血清和尿钙的更持续的控制。
在一些实施例中，该方法可有效地控制受试者的血清钙水平。在一个实施例中，与没有施用本发明的PTH变体的受试者的血清钙水平相比，该方法可有效地增加患有甲状旁腺功能减退和/或由于甲状旁腺功能减退引起的低钙血症的受试者的血清钙水平。在一个实施例中，与接受外源性天然PTH(1-84)的受试者的血清钙水平相比，该方法可有效地将受试者的血清钙水平维持在较低的峰谷比。在一个实施例中，该方法可有效地减少患有甲状旁腺功能减退的受试者的钙补充剂的量。
在一些实施例中，该方法可有效地控制受试者的尿钙分泌。在一个实施例中，该方法可有效地将尿钙输出降低至健康志愿者的水平(减少潜在的肾脏并发症)。
PTH变体，例如包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，可以被皮下或静脉内施用。在各种实施例中，根据给药方案进行多次施用。如本文所使用的，术语“QD”或“q.d.”是指每天施用一次，“Q2D”是指每两天施用一次等。“QW”是指每周施用一次。“BID”是指每日施用两次。给药可以为，例如，BID、每天一次(QD)、Q2D、Q3D、Q4D、Q5D、Q6D、QW、每8天一次、每9天一次、每10天一次、每11天一次、每12天一次、每13天一次、每两周一次、每15天一次、每16天一次、或每17天一次、每3周一次或每月一次。
PTH变体(例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列)可以根据0.001μg至1,000μg之间的剂量方案、每天两次、或每天一次、或每两天一次、或每5-8天一次、或每周(QW)一次皮下施用。可替代地，PTH变体可以每三周施用一次或每月施用一次，诸如用于维持目的。
PTH变体(例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列)可以根据约1μg/天至约500μg/天、或约2μg/天至约250μg/天、或约5μg/天至约100μg/天、或约10μg/天至约80μg/天、或约20μg/天至约100μg/天、或约20μg/天至约100μg/天、或约50μg/天、或约60μg/天、或约70μg/天、或约80μg/天、或约90μg/天、或约100μg/天一次(QD)的剂量方案皮下施用。PTH变体(例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列)可以以0.001至1,000μg/mL的浓度施用。
上述给药方案可以进行一个月、或两个月、或六个月、或一年、或两年、或五年、或长于五年的时间段，以治疗甲状旁腺功能减退和/或由于甲状旁腺功能减退引起的低钙血症。PTH变体可以被施用持续受试者一生的持续时间以用于维持。
如本文所使用的，术语“皮下组织”被定义为紧接在皮肤下面的一层松散的、不规则的结缔组织。例如，皮下施用可以通过将组合物注射到包含但不限于大腿区域、腹部区域、臀肌区域或肩胛区域的区域中来进行。出于这样的目的，可以使用注射器注射制剂。然而，用于施用制剂的其它装置是可用的，诸如注射装置(例如，Inject-easeTM和GenjectTM装置)；注射器笔(诸如Q-CliqTM和GenPenTM)；无针装置(例如MediJectorTM和BioJectorTM)；和皮下贴片递送系统。在一些实施例中，静脉内施用PTH变体，例如，包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或含有其的药物组合物。
在各种实施例中，上述治疗甲状旁腺功能减退和/或由于甲状旁腺功能减退引起的低钙血症的方法与治疗甲状旁腺功能减退和/或由于甲状旁腺功能减退引起的低钙血症的其它方法联合使用。
实例
以下实例说明了本说明书的特定方面。这些实例不应被解释为限制性的，因为这些实例仅仅提供了对实施例及其各个方面的具体理解和实践。
实例1：Fc融合PTH变体(以PTH-66为例)的生产和纯化
使PTH-66在CHO细胞中瞬时表达，并且将条件培养基储存在-20℃下直到进一步使用。在25℃水浴下解冻条件培养基，并通过0.2μm瓶子顶部过滤单元过滤。按照制造商的方案，将PTH-66蛋白在蛋白质A衍生的树脂MabSelect SuRe上纯化(图8)。将MabSelect SuRe柱用PBS预平衡。将解冻的条件培养基加载到柱上，然后用PBS广泛清洗。用pH 3.2的100mM柠檬酸钠缓冲液通过分步洗脱来洗脱PTH-66蛋白。在SDS-PAGE上分析洗脱级分(图9)。用1MTris pH 10使混合的洗脱级分的pH升至约pH6。将中和的混合洗脱级分透析到PTH-66储存缓冲液20mM磷酸钠缓冲液、50mM氯化钠、26mg/ml甘露醇(pH 6.0)中，并储存在-80℃下。
图8A描绘了使用2x5mL Mab Select Sure柱对约900mL CM表达PTH-66进行的微量层析纯化。图8B是概述根据本发明的实施例的PTH-66的纯化步骤的流程图。
图9A描绘了PTH-66的Mab select粗洗脱级分。图9B描绘了PTH-66的Mab select粗洗脱级分的考马斯蓝染色。
图10描绘了最终PTH-66产品的SDS-PAGE考马斯染色。最终产率约为75mg/900mL细胞培养基(CM)。蛋白质在PTH储存缓冲液中为3mg/mL。将蛋白质等分并储存在-80℃下。
实例2：PTH-Fc融合体的C末端截短的影响
根据实例1中概述的方法来制备包括不同长度的截短的PTH的PTH-Fc融合变体。产生了以下PTH-Fc融合变体：PTH-66(PTH(1-74)-Fc)、PTH-67(PTH(1-64)-Fc)、PTH-68(PTH(1-54)-Fc)、PTH-69(PTH(1-44)-Fc)和PTH(1-34)-Fc。
使用Immunotopics生物活性ELISA试剂盒(60-3000)评估了在以0.25mg/kg用截短的变体和全长PTH(1-84)-Fc对Spraque-Dawley大鼠进行单次皮下治疗后的PTH的血清浓度，并且结果在图1中示出。
如图1所示，PTH的C末端截短惊人地且出人意料地改善了PTH-Fc融合体的暴露量和药代动力学。
如图所示，本发明的截短的PTH-Fc融合变体优于天然长度PTH(1-84)-Fc融合体和特立帕肽-Fc(PTH(1-34)-Fc融合体)。甚至更令人惊讶的是，与天然长度的PTH(1-84)-Fc和其它类似物相比，PTH(1-74)具有特别长的体内半衰期。
实例3：正常小鼠中的PTH-66
将PTH-66以50nmol/kg的剂量施用给正常小鼠。在施用后2、8、24、48和72小时采集样品，并且绘制钙浓度并与磷酸盐缓冲液(媒介物)对照进行比较。
图2显示了血清钙水平(图2A)和尿钙水平(图2B)作为小鼠中PTH-66(50nmol/kg剂量)给药后的小时数的函数。如图2A所示，与PTH(1-84)和媒介物对照相比，PTH-66引发血清钙的长期升高。图2B，PTH-66显示尿钙水平的维持时间长于PTH(1-84)。PTH(1-84)治疗导致在最初几小时内尿钙的尖峰，与血清钙的升高和分子的短暂暴露一致。相反，尽管血清钙水平升高，但PTH-66显示出对尿钙水平的更长持续时间的控制，在12-24小时内保持接近媒介物的水平。总之，用PTH-66治疗导致对钙水平的持续影响。
实例4：TxPTx大鼠中的PTH-66
将PTH-66以5、20和60nmol/kg的不同剂量被施用给正常(完整)和甲状腺-甲状旁腺切除(TxPTx)大鼠。在施用后1、6、12、18、24、36、48和72小时采集系列样品，并与媒介物对照进行比较。
如图3A和B所示，用PTH-66治疗的TxPTx大鼠表现出剂量线性PK/PD应答，其中剂量依赖性血清Ca++水平在施用后升高并维持持续高达72小时。图3B显示，在施用后12-48小时，接受5nmol/kg PTH-66的TxPTx大鼠具有正常的血清钙水平(其恢复到完整大鼠的血清钙水平)，而用20和60nmol/kg PTH-66治疗显示与接受安慰剂媒介物的完整大鼠相比更高的血清钙水平。
图4(A-B)显示了来自TPTx大鼠的比较PTH-66与PTH(1-84)的单剂量PK(图4A)和PD(图4B)研究数据。大鼠TPTx数据显示明显的PK延伸超过PTH(1-84)，并且与PTH(1-84)相比，5nmol/kg的PTH-66可以使血清钙恢复至正常水平，而PTH(1-84)仅显示非常短暂的血清钙增加。
在一项单独的多剂量研究中，向正常(完整)和甲状腺-甲状旁腺切除(TxPTx)大鼠每天以2和4nmol/kg的剂量皮下施用PTH-66，持续10天。在给药前每天采集一次样品，并与媒介物对照进行比较。
图5(A-D)显示了来自向TPTx大鼠每天皮下施用PTH-66的多剂量PK(图5A)和PD(图5B-D)研究数据。图5A的PK数据显示剂量线性PK响应，达到接近稳态的PTH-66水平。如图5B所示，2和4nmol/kg的PTH-66使血清钙恢复并维持在正常范围(完整)水平。图5C显示，每天施用PTH-66也导致血清磷水平的正常化。图5D显示，当PTH-66维持如图5A所示的正常血清钙水平时，该分子也维持正常尿钙水平。这些数据表明，每天皮下施用PTH-66导致血清钙和磷酸盐，并且重要的是尿钙的完全正常化。
实例5：灵长类动物中的PTH-66
以2mmol/kg的剂量将PTH-66作为单剂量施用给野生型食蟹猴，而其它猴接受5mmol/kg的单剂量的Natpara(PTH(1-84))。在施用后0、1、3、6、9、12、18、24、36、48和72小时采集系列样品，并与Natpara以及媒介物对照进行比较。
图6(A-B)示出了来自野生型食蟹猴的比较PTH-66与PTH(1-84)的单剂量PK(图6A)和PD(图6B)研究数据。
图6中的数据显示在PTH-66中的PK延伸明显超过Natpara，并且2nmol/kg的PTH-66可以刺激并维持血清钙水平超过使用PTH(1-84)获得的水平。与PTH-66相比，Natpara半衰期短，并且对血清钙具有更加短暂的影响。
在一项单独的多剂量研究中，将PTH-66以1nmol/kg的剂量每天皮下施用给野生型食蟹猴，持续9天。每日在给药前以及末次给药后24、48、72和120小时采集样品，并与媒介物对照进行比较。
图7显示了来自用1nmol/kg的PTH-66每天皮下治疗野生型食蟹猴的多剂量PK和PD研究数据。PK数据表明，与媒介物对照相比，在研究期间获得了相对平坦的PTH-66的PK概况，导致血清钙的增加和血清磷的减少。
实例6：PTH cAMP效价测定
表1总结了根据本发明的示例性PTH变体的cAMP效价(EC50)测定的结果。表2总结了PTH变体的相关PK数据。
表1：Select PTH-Fc变体的EC50数据
Figure BDA0003215185110000331
Figure BDA0003215185110000341
表2:Select PTH-Fc变体的PK数据
Figure BDA0003215185110000342
如表1和2所示，所有PTH-Fc样品在亚纳摩尔EC50的情况下都是活性的，并且具有相对于PTH1-84的PK特性显著改善的PK特性。
实例6：PTH-66纯化中的多模式层析
在图11所示的下游平台之后，进行了作为初始捕获步骤的蛋白质A层析法。洗脱液在3.5的低pH下保持1小时，用于病毒灭活，然后被中和至pH 6，并在-80℃下冷冻。除剪切的物种和宿主细胞蛋白外，大部分杂质已经被充分去除。已经开发了下述抛光步骤来去除残留的宿主细胞和工艺杂质。
多模式(也被称为混合模式)层析法在抗体纯化中正在迅速发展，因为介质允许通过各种相互作用以高效率分离化合物。在下游抛光开发中，考虑了两个多模式柱步骤：阳离子CaptoTM MMC ImpRes和阴离子CaptoTM Adhere ImpRes。然而，鉴于复杂的介质特定相互作用，纯化过程通过缓冲液组分、离子强度、pH和盐类型来确定。由于难以估计最佳结合和洗脱条件，因此通过下述步骤确定了这两种树脂的分离条件，以实现最佳工艺性能。
PTH-66(PTH(1-74)-Fc融合体)已经观察到来自生物反应器的中度片段化，尽管循环半衰期增加，这可能负面地影响其效力。在下游加工前在收获的细胞培养物中添加蛋白酶抑制剂已经显示可防止未来的产物降解。细胞培养物中重组蛋白的片段化可能对药物的安全性和效力有害。在下游过程开发中，已使用多模式层析成功地从完整的Fc-融合蛋白中分离出从上游过程产生的具有改变的疏水性或电荷的片段同工型。在图12中描绘了满足少于10％片段化靶标的生产过程的流程图。
使用6μL PreDictor 96孔板对Capto MMC和Adhere ImpRes的初始操作条件进行了全面的高通量筛选(HTS)，以评估包含盐浓度和pH的宽范围的参数(参见图13A和13B)。
使用高通量工艺测定的阳离子交换(阳离子)Capto MMC ImpRes和阴离子交换(阴离子)Capto Adhere ImpRes的分离条件在图14A和14B中描绘。用于Capto MMC ImpRes的筛选的实验条件包含醋酸盐、MES和磷酸盐缓冲液系统，pH 5.0至7.0和0至750mM的盐(NaCl)浓度，树脂负载为50g/L，并且培养时间为1小时。用于Capto Adhere ImpRes的筛选的实验条件包含醋酸盐、MES、磷酸盐和Tris缓冲液系统，pH 5.0至8.0和0至1500mM的盐(NaCl)浓度，树脂负载为50g/L，并且培养时间为1小时。
用于Capto MMC ImpRes(一种具有图14C所示的结构的阳离子树脂)的最佳结合条件已经被确定为包含pH 6.0的50mM MES，不含任何盐。用于Capto Adhere ImpRes(一种具有图14D所示的结构的阴离子树脂)的最佳溢流条件已经被确定为包含pH 5.0的50mM醋酸盐缓冲液，不含任何盐。
第二步是优化通过HTS静态结合能力结果加速的实验室规模的工艺。Capto MMCImpRes以结合-和-洗脱模式进行，以最大化杂质清除能力。研究了清洗步骤，以减少过多的与工艺和产品相关的杂质，而没有不必要的产品损失(图15)。随后的Capto Adhere ImpRes步骤被开发为快速溢流(FT)步骤，允许该过程符合产品质量标准(图16)。进行了MMC和Adhere台面确认运行，以验证关于杂质清除率和分步产率的工艺稳健性。PTH-Fc的定量依赖于UV280来跟踪MMC和Adhere的产率。
来自高通量研究的条件被成功地转移到实验室规模，如图17-19所示。Capto MMCImpRes梯度洗脱迹线在图14A中描绘。使用0.66x10cm(3.4mL)柱，pH 6.0的50mM MES，以0至1M NaCl梯度洗脱，实现了更好的分离度。MMC有效地提供了HCP、DNA、HMW和剪切的物种的去除。
表3：Capto MMC ImpRes梯度洗脱
Figure BDA0003215185110000351
已经对MMC清洗步骤进行了研究，以减少其它与工艺和产品相关的杂质。在表4中描绘了MMC清洗优化。最佳清洗条件已经被确定为6CV的200mM NaCl和3CV的250mM NaCl。
表4：MMC清洗优化
Figure BDA0003215185110000361
下图17B所示和表5所示的Capto Adhere ImpRes溢流证明提供了额外的HCP和HMW去除能力。使用0.66x10cm(3.4mL)柱，pH 5.0的50mM乙酸钠缓冲液溢流，实现了更好的分离度。
表5：Capto Adhere ImpRes溢流
总PTH-66蛋白％ 片段化％
负载 100 5.4
溢流 82 4.11
在图18A中描绘了下游抛光步骤设计。具有基于杂质清除和工艺产率的稳定池的工艺稳健性在图15B以及下表6中示出。
表6：工艺稳健性
Figure BDA0003215185110000362
在图19A-F中表征了中试规模生产的质量属性。如这些图中所示，工业中试(PPO)(一种大规模纯化)的分步产率与工艺开发(PD)(一种小型实验室规模)的产率相当。通过比较这两种产率，可以得出结论：使用上述参数，纯化过程已经被成功放大。
通过将MMC洗出液和Adhere FT分别在环境温度和4-8℃下保存5天和4天，然后使用SEC-HPLC和完整质量分析(Intact Mass analysis)进行分析，来确定工艺中样品的稳定性。
因此，已经使用多模式层析成功地解决了Fc-融合蛋白片段化问题，并且已经建立了从线性梯度的逐步洗脱，以实现相对高的回收率，而不损害稳健的杂质清除率。
***
由于在不脱离本发明的范围和精神的情况下可以对上述主题进行各种改变，因此上述描述中包括的或所附权利要求中定义的所有主题都旨在被解释为对本发明的描述和说明。根据上述教导，本发明的多种修改和变化是可能的。因此，本说明书旨在包括落入所附权利要求的范围内的所有这些替换、修改和变化。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其它材料据此通过引用以其整体并入，如同实际存在于本说明书中一样。

Claims (47)

1.一种甲状旁腺激素(PTH)-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白包括与人IgG抗体的Fc区或其衍生物化学连接的C末端突变的和/或截短的PTH或其变体，并且其中所述C末端突变的和/或截短的PTH或其变体不是PTH(1-34)。
2.根据权利要求1所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述C末端突变的和/或截短的PTH或其变体选自突变的PTH(1-84)、PTH(1-74)、PTH(1-64)、PTH(1-54)和PTH(1-44)。
3.根据权利要求1所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述C末端突变的和/或截短的PTH或其变体选自突变的PTH(1-84)、PTH(1-83)或PTH(1-82)或PTH(1-81)或PTH(1-80)或PTH(1-79)或PTH(1-78)或PTH(1-77)或PTH(1-76)或PTH(1-75)或PTH(1-74)或PTH(1-73)或PTH(1-72)或PTH(1-71)或PTH(1-70)或PTH(1-69)或PTH(1-68)或PTH(1-67)或PTH(1-66)或PTH(1-65)或PTH(1-64)或PTH(1-63)或PTH(1-62)或PTH(1-61)或PTH(1-60)或PTH(1-59)或PTH(1-58)或PTH(1-57)或PTH(1-56)或PTH(1-55)或PTH(1-54)或PTH(1-53)或PTH(1-52)或PTH(1-51)或PTH(1-50)或PTH(1-49)或PTH(1-48)或PTH(1-47)或PTH(1-46)或PTH(1-45)或PTH(1-44)或PTH(1-43)或PTH(1-42)或PTH(1-41)或PTH(1-40)或PTH(1-39)或PTH(1-38)或PTH(1-37)或PTH(1-36)或PTH(1-35)或PTH(1-33)。
4.根据权利要求1至3所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述C末端突变的和/或截短的PTH或其变体是PTH(1-74)。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述Fc区或其衍生物是包括L234A和L235A取代的hFcLALA。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH或其变体包括F34A取代、F34D取代、V35S取代或V35T取代或其组合。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH或其变体被糖基化。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白是具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的PTH-66。
9.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白是具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的PTH-67。
10.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白是具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的PTH-68。
11.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白是具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的PTH-69。
12.一种核酸，其编码根据权利要求1至11中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白。
13.一种表达载体，其包括根据权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其包括根据权利要求12所述的核酸或根据权利要求13所述的表达载体。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
16.根据权利要求14或15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
17.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期长于PTH(1-84)的血清半衰期。
18.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长至少2倍。
19.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长至少10倍。
20.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白，其中所述PTH-Fc融合蛋白的血清半衰期比PTH(1-84)的血清半衰期长至少20倍。
21.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至11或17至20中任一权利要求所述的PTH-Fc融合蛋白和药学上可接受的载剂。
22.一种药物剂型，其包括根据权利要求1至11或17至20所述的PTH-Fc融合蛋白或根据权利要求21所述的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的药物剂型，其中所述剂型是适合于通过注射或输注施用的液体剂型。
24.一种控制有需要的受试者中的血清钙水平的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至11或17至20所述的PTH-Fc融合蛋白、根据权利要求21所述的药物组合物或根据权利要求22或23所述的药物剂型。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述受试者患有甲状旁腺功能减退。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型是皮下施用的。
27.根据权利要求24至26中任一权利要求所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型每天施用一次。
28.根据权利要求24至27中任一权利要求所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型每周施用一次。
29.根据权利要求24至28中任一权利要求所述的方法，其中以每天约20μg至每天约100μg的所述PTH-Fc融合蛋白的量向所述受试者提供所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型。
30.一种治疗患有甲状旁腺功能减退的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至11或17至20所述的PTH-Fc融合蛋白、根据权利要求21所述的药物组合物或根据权利要求22或23所述的药物剂型。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型是皮下施用的。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型每天施用一次。
33.根据权利要求30至32中任一权利要求所述的方法，其中以每天约20μg至每天约100μg的所述PTH-Fc融合蛋白的量向所述受试者提供所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型。
34.一种治疗患有由甲状旁腺功能减退引起的低钙血症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至11或17至20所述的PTH-Fc融合蛋白、根据权利要求21所述的药物组合物或根据权利要求22或23所述的药物剂型。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型是皮下施用的。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型每天施用一次。
37.根据权利要求34至36中任一权利要求所述的方法，其中以每天约20μg至每天约100μg的所述PTH-Fc融合蛋白的量向所述受试者提供所述PTH-Fc融合蛋白、所述药物组合物或所述药物剂型。
38.根据权利要求1至11或17至20所述的PTH-Fc融合蛋白、根据权利要求21所述的药物组合物或根据权利要求22或23所述的药物剂型，其中所述PTH-Fc融合蛋白包括一个拷贝的PTH和一个拷贝的Fc。
39.根据权利要求1至11或17至20所述的PTH-Fc融合蛋白、根据权利要求21所述的药物组合物或根据权利要求22或23所述的药物剂型，其中所述PTH-Fc融合蛋白包括两个拷贝的PTH和一个拷贝的Fc。
40.一种制备包括PTH(1-74)的C末端截短的甲状旁腺激素(PTH)-Fc融合蛋白或其变体的方法，其包括使用多模式色谱树脂纯化所述(PTH)-Fc融合蛋白。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多模式色谱树脂包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述阳离子交换树脂是Capto MMC ImpRes。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述(PTH)-Fc融合蛋白在pH 6.0下在50mM的MES缓冲液中结合。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述阴离子交换树脂为Capto Adhere ImpRes。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述(PTH)-Fc融合蛋白在pH 5.0下在50mM的乙酸盐缓冲液中洗脱。
46.根据权利要求40至45中任一权利要求所述的方法，其进一步包括从所述多模式色谱树脂中逐渐洗脱(PTH)-Fc融合蛋白。
47.根据权利要求40至46中任一权利要求所述的方法，其中所述纯化的(PTH)-Fc融合蛋白包括少于10％的总片段化杂质。
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