ES2897765T3 - Procedimientos y composiciones para la secreción de polipéptidos heterólogos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de incremento de la secreción de una cadena pesada de anticuerpo y/o una cadena ligera de anticuerpo de una célula huésped de E. coli, que comprende cultivar una célula huésped de E. coli que comprende un polinucleótido que comprende (1) un primer polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5; y (2) un segundo polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo, en el que el primer y segundo péptido señal son un péptido señal DsbA variante, en el que el péptido señal DsbA variante comprende a) una mutación en el residuo L11 y/o S18Y de SEQ ID NO:3, en el que el péptido señal DsbA variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA natural de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50; o b) una mutación en el residuo L11 y/o S18Y, en el que la mutación en el residuo L11 es L11I y en el que el péptido señal DsbA variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA natural de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50; o c) secuencia de SEQ ID NO: 13 o 15.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones para la secreción de polipéptidos heterólogos

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la biología molecular y la tecnología de proteínas. Más específicamente, la invención se refiere a péptidos señal para la secreción de polipéptidos heterólogos de bacterias.

Antecedentes de la invención

En los últimos años se han observado signos crecientes del uso de polipéptidos heterólogos, por ejemplo, anticuerpos, como agentes de diagnóstico y terapéuticos para diversos trastornos y enfermedades. Muchas aplicaciones en investigación y clínicas requieren grandes cantidades de polipéptido funcional, lo que precisa, por tanto, sistemas aumentados a escala, pero económicos, para la producción de polipéptidos. En particular, es útil la producción recombinante de anticuerpos que usan una variedad de huéspedes de expresión, que varían de procariotas, tales como E. coli o B. subtilis, a levaduras, plantas, células de insecto y células de mamífero. Kipriyanov y Little (1999) Mol. Biotech. 12:173-201.

En comparación con otros sistemas de producción de polipéptidos, las bacterias, en particular, E. coli, proporcionan muchas ventajas únicas. Las materias primas usadas (es decir, células bacterianas) son económicas y fáciles de cultivar, lo que reduce, por lo tanto, el coste de los productos. Los huéspedes procarióticos crecen mucho más deprisa que, por ejemplo, las células de mamífero, lo que permite un análisis más rápido de las manipulaciones genéticas. El tiempo de generación más corto y la facilidad de aumentar a escala también hacen que la fermentación bacteriana sea un medio más atractivo para la producción de proteínas en grandes cantidades. Se han estudiado bien la estructura genómica y la actividad biológica de muchas especies bacterianas que incluyen E. coli y está disponible una amplia gama de vectores adecuados, lo que hace que la expresión de un anticuerpo deseable sea más conveniente. En comparación con los eucariotas, están implicadas menos etapas en el procedimiento de producción, incluyendo la manipulación de genes recombinantes, la transformación estable de múltiples copias en el huésped, la inducción de la expresión y la caracterización de los productos. Pluckthun y Pack (1997) Immunotech 3:83-105.

Se han usado diversos enfoques para preparar polipéptidos recombinantes en bacterias. Se pueden obtener proteínas recombinantes de bacterias a través del replegamiento de cuerpos de inclusión expresados en el citoplasma o bien a través de la expresión seguido de secreción al periplasma bacteriano. La elección entre secreción y replegamiento está guiada, en general, por varias consideraciones. La secreción es normalmente la estrategia más rápida y más usada comúnmente para producir anticuerpos. Kipriyanov y Little (1999), supra. Sin embargo, la capacidad de secreción y replegamiento en E. coli a menudo se limita a un nivel menor en comparación con otros huéspedes de expresión.

La expresión de anticuerpos en sistemas procarióticos se puede llevar a cabo en diferentes escalas. Para revisiones generales de producción de anticuerpos en E. coli, véanse Pluckthun y Pack (1997) Immunotech 3:83-105; Pluckthun et al. (1996) en ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH, pp 203-252 (Oxford Press); Pluckthun (1994) en HANDBOOK OF EXP PHARMCOL VOL 3: THE PHARMCOL OF MONOCLONAL ANT iBo DIES, pp269-315 (ed. M. Rosenberg y G.P. Moore; Springer-Verlag, Berlín).

El documento WO 2007/00665 se refiere a un procedimiento de presentación en fagos filamentosos en el que los polipéptidos de interés presentados en partículas de fago se translocan cotraduccionalmente a través de la membrana citoplásmica de bacterias gramnegativas, en particular, en base a la vía de las partículas de reconocimiento de señal. El documento WO 2010/057097 se refiere a un sistema indicador para la detección de interacciones proteína-proteína en el periplasma de una célula huésped procariótica. El documento WO 2011/057120 se refiere a secuencias señal para la secreción de polipéptidos heterólogos de bacterias. El documento WO 2002/006190 se refiere a formas cristalinas y salinas de un inhibidor de proteasa del VIH, composiciones farmacéuticas que comprenden el inhibidor de proteasa del VIH y procedimientos de uso de las mismas. El documento WO 2005/038031 se refiere al uso de un vector de expresión recombinante que expresa un fragmento de anticuerpo fusionado con una secuencia señal de E. coli en forma de proteína heterocigota para producir en masa el fragmento de anticuerpo. El documento WO 2009/021548 se refiere a un procedimiento para la producción de inmunoglobulinas de longitud completa en células procarióticas, en el que las inmunoglobulinas se secretan en el medio de cultivo. El documento e P 1908769 se refiere a procedimientos y composiciones para la expresión y producción de anticuerpos recombinantes en un sistema de células huésped, tal como sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos. El documento WO 2005/063816 se refiere a fragmentos de anticuerpo monovalente estabilizados y su uso como agentes terapéuticos.

Muchos ensayos biológicos (tales como cristalografía de rayos X) y aplicaciones clínicas (tales como tratamiento con proteínas) requieren grandes cantidades de proteína. En consecuencia, existe una necesidad de obtener sistemas de alto rendimiento, pero simples, para producir polipéptidos heterólogos solubles y funcionales apropiadamente ensamblados, tales como anticuerpos.

Sumario de la invención

La invención proporciona un medio novedoso para incrementar la producción de anticuerpos. El uso de la secreción periplásmica como medio para la producción de alto nivel de proteínas heterólogas (por ejemplo, anticuerpos) puede estar limitado por varios problemas que surgen con frecuencia. En primer lugar, la eficacia de secreción de la proteína de interés puede ser baja. En segundo lugar, el precursor, en muchos casos, se procesa de forma incompleta en una proteína madura. En tercer lugar, las proteínas heterólogas sobreexpresadas a menudo se pliegan inapropiadamente, se agregan en cuerpos de inclusión insolubles o se proteolizan por proteasas de E. coli. En cuarto lugar, los anticuerpos son proteínas multiméricas complejas preparadas a partir de dos polipéptidos diferentes, las cadenas pesada y ligera, que se deben exportar al periplasma, plegar apropiadamente y formar los enlaces disulfuro apropiados. La complejidad de este plegamiento y secreción de proteínas se suma a los desafíos de la preparación de anticuerpos en E. coli. La capacidad de secreción y replegamiento en E. coli a menudo se limita a un nivel menor en comparación con otros huéspedes de expresión. Aunque se ha demostrado que la optimización de TIR es útil para generar una secreción de proteínas más eficaz, no se ha demostrado que otros enfoques mejoren de forma rutinaria la secreción de proteínas heterólogas en E. coli. Por ejemplo, se demostró que la optimización de una proteína señal disminuía la secreción de ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa) recombinante en el espacio periplásmico. Jonet et al., J Mol Microbiol Biotechnol (2012); 22:48-58.

La materia objeto de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En el presente trabajo, los autores de la invención demuestran que incrementar la hidrofobia promedio del péptido señal incrementó la secreción de anticuerpo soluble al periplasma de E. coli. Se desarrollaron péptidos señal variantes con hidrofobia promedio incrementada y los autores de la invención demostraron una secreción periplásmica incrementada de anticuerpo soluble cuando se usaron variantes de péptido señal con hidrofobia promedio incrementada, y una sección periplásmica disminuida de anticuerpo soluble cuando se usaron variantes de péptido señal con hidrofobia promedio disminuida.

En un aspecto, se proporcionan procedimientos de incremento de la secreción de una cadena pesada de anticuerpo y/o una cadena ligera de anticuerpo de una célula huésped de E. coli, que comprenden cultivar una célula huésped de E. coli que comprende un polinucleótido que comprende (1) un primer polinucleótido que codifica un primer péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5; y (2) un segundo polinucleótido que codifica un segundo péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo a partir de una célula huésped de E. coli, que comprenden cultivar una célula huésped de E. coli que comprende un polinucleótido que comprende (1) un primer polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5; y (2) un segundo polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además recuperar el polipéptido heterólogo del cultivo de la célula huésped. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo se recupera del medio de cultivo de la célula huésped. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además combinar el polipéptido heterólogo recuperado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o vehículo para preparar una formulación farmacéutica que comprenda el polipéptido heterólogo.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de preparación de una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo a partir de una célula huésped de E. coli, que comprenden cultivar una célula huésped de E. coli que comprende un polinucleótido que comprende (1) un primer polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5; y (2) un segundo polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan procedimientos de translocación de una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo a partir de una célula huésped de E. coli, que comprenden cultivar una célula huésped de E. coli que comprende un polinucleótido que comprende (1) un primer polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5; y (2) un segundo polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo.

En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del primer péptido señal es mayor de aproximadamente 0,6. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del primer péptido señal es mayor de aproximadamente 0,7. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,6. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,7. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio de los primer y segundo péptidos señal es similar (por ejemplo, aproximadamente equivalente). En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio de los primer y segundo péptidos señal es diferente.

En algunos aspectos de la divulgación, el primer y/o segundo péptido señal es un péptido señal cotraduccional variante. De acuerdo con la invención, el primer y/o segundo péptido señal es un péptido señal DsbA variante como se define en las reivindicaciones. En algunos modos de realización, el péptido señal DsbA variante comprende una mutación en el residuo L11, en el que el péptido señal DsbA variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA natural de s Eq ID NO:3. En algunos modos de realización, en los que la mutación es L111 o S18Y. En algunos modos de realización, el péptido señal DsbA variante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 13 o 15.

En algunos modos de realización, el péptido señal es un péptido señal Sfmc. En algunos modos de realización, el péptido señal Sfmc tiene una fuerza de TIR que es diferente de la fuerza de TIR del péptido señal Sfmc natural. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa (también denominada fuerza de TIR) del péptido señal Sfmc es de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o más, tal como de aproximadamente 8, aproximadamente 9 o más. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal Sfmc está entre 1 y 3, entre 2 y 4, entre 3 y 5, entre 4 y 6, entre 5 y 7, entre 6 y 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal Sfmc está entre 2 y 5, entre 3 y 7, o entre 4 y 8. En algunos modos de realización, el péptido señal es FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL o TorT. En algunos modos de realización, el péptido señal FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL o TorT tiene una fuerza de traducción relativa que es diferente de la fuerza de traducción relativa del péptido señal FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL o TorT natural. En algunos modos de realización, la fuerza de TIR del péptido señal FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, o TorT es de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, o más, tal como de aproximadamente 8, aproximadamente 9 o más. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL o TorT está entre 1 y 3, entre 2 y 4, entre 3 y 5, entre 4 y 6, entre 5 y 7, entre 6 y 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL o TorT está entre 2 y 5, entre 3 y 7, o entre 4 y 8.

En algunos modos de realización, el péptido señal no es Sfmc. En algunos modos de realización, el péptido señal no es TorT. En algunos modos de realización, el péptido señal no es uno cualquiera o más de FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL o TorT.

En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del primer y/o segundo péptido señal es de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del primer péptido señal es de aproximadamente 5 y la fuerza de traducción relativa de la segunda secuencia señal es de aproximadamente 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del primer péptido señal es de aproximadamente 8 y la fuerza de traducción relativa de la segunda secuencia señal es de aproximadamente 5. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal Sfmc está entre 1 y 3, entre 2 y 4, entre 3 y 5, entre 4 y 6, entre 5 y 7, entre 6 y 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal Sfmc está entre 2 y 5, entre 3 y 7, o entre 4 y 8.

En algunos modos de realización, en los que el polinucleótido en la célula huésped comprende además un promotor. En algunos modos de realización, el promotor es un promotor procariótico seleccionado del grupo que consiste en promotor de phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara y T7.

En algún modo de realización, la célula huésped de E. coli es de una cepa carente de actividades proteasa endógena. En algunos modos de realización, el genotipo de la E. coli carece de los genes degP y prc y alberga un gen spr mutante. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende además un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido procariótico seleccionado del grupo que consiste en DsbA, DsbC, DsbG y FkpA. En algunos modos de realización, el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.

En algunos modos de realización, los procedimientos comprenden además recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped. En algunos modos de realización, el anticuerpo se recupera del medio de cultivo de la célula huésped. En algunos modos de realización, los procedimientos comprenden además combinar el anticuerpo recuperado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o vehículo para preparar una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo. En algunos modos de realización, al menos un 50 % de los complejos de polipéptido inmunoglobulina que se forman son el anticuerpo. En algunos modos de realización, al menos un 70 % de los complejos de polipéptido inmunoglobulina que se forman son el anticuerpo. En algunos modos de realización, al menos un 80 % de los complejos de polipéptido inmunoglobulina que se forman son el anticuerpo. En algunos modos de realización, al menos un 90 % de los complejos de polipéptido inmunoglobulina que se forman son el anticuerpo.

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado en afinidad, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan péptidos señal DsbA variantes, en los que la variante comprende una región H con una hidrofobia promedio que es mayor de 0,5.

En otro aspecto, se proporcionan péptidos señal DsbA variantes que comprenden una mutación en el residuo L11, en los que la variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3. En algunos modos de realización, la mutación es L11I y/o S18Y.

En otro aspecto, se proporcionan péptidos señal STII variantes que comprenden una mutación en el residuo S11, en los que el péptido señal STII variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO:1. En algunos modos de realización, la mutación es S11a , S11I o S11L.

En otro aspecto, se proporcionan péptidos señal variantes que consisten en, que consisten esencialmente en o que comprenden una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33.

En otro aspecto, se proporciona cualquiera de los péptidos señal variantes como se define en las reivindicaciones fusionado con una proteína heteróloga. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es una cadena pesada de anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es una cadena ligera de anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es una cadena ligera y pesada de anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es un polipéptido multimérico. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es una inmunoadhesina.

En otro aspecto, se proporcionan secuencias de polinucleótido que codifican cualquiera de los péptidos señal variantes como se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, se proporcionan secuencias de polinucleótido que codifican cualquiera de los péptidos señal variantes como se define en las reivindicaciones, enlazadas de forma funcional a un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, con lo que, tras la expresión del polipéptido heterólogo en una célula huésped, el polipéptido heterólogo se pliega y ensambla para formar un polipéptido heterólogo biológicamente activo.

En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula huésped procariótica. En algunos modos de realización, la célula huésped es E. coli.

En otro aspecto, se proporcionan polinucleótidos que codifican un anticuerpo, comprendiendo dichos polinucleótidos (1) un polinucleótido que codifica un primer péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo y (2) un polinucleótido que codifica un segundo péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo, en el que el primer péptido señal es un péptido señal variante de uno cualquiera de los péptidos señal variantes como se define en las reivindicaciones. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 o 42. En algunos modos de realización, el primer péptido señal es un péptido señal DsbA variante, en el que la variante comprende una región H con una hidrofobia promedio mayor de 0,5. En algunos modos de realización, el primer péptido señal es un péptido señal DsbA variante que comprende una mutación en el residuo L11, en el que la variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3. En algunos modos de realización, la mutación es L11I y/o S18Y, en algunos modos de realización, el primer péptido señal es un péptido señal STII variante que comprende una mutación en el residuo S11, en el que el péptido señal STII variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO: 1. En algunos modos de realización, la mutación es S11A, S11I o S11L.

En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31, 33 o 42. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal DsbA variante, en el que la variante comprende una región H con una hidrofobia promedio mayor de 0,5. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal DsbA variante que comprende una mutación en el residuo L11, en el que la variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3. En algunos modos de realización, la mutación es L11I y/o S18Y, en algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal STII variante que comprende una mutación en el residuo S11, en el que el péptido señal STII variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO: 1. En algunos modos de realización, la mutación es S11A, S11I o S11L.

En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un anticuerpo comprende además (3) un polinucleótido que codifica un tercer péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica un polipéptido con Fc. El tercer péptido señal puede ser, por ejemplo, cualquiera de los péptidos señal variantes como se define en las reivindicaciones. En algunos modos de realización, el tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33.

En algunos modos de realización, el polinucleótido comprende además un promotor enlazado de forma funcional al polipéptido heterólogo. En algunos modos de realización, el promotor es un promotor procariótico seleccionado del grupo que consiste en promotor de phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp y T7. En algunos modos de realización, el promotor es un promotor de phoA.

En algún modo de realización, el polinucleótido comprende (a) un primer promotor, en el que el primer promotor está enlazado de forma funcional a una cadena ligera y (b) un segundo promotor, en el que el segundo promotor está enlazado de forma funcional a una cadena pesada. En algunos modos de realización, los primer y segundo promotores son ambos promotores de phoA.

En algunos modos de realización, el polinucleótido comprende además (c) un tercer promotor, en el que el tercer promotor está enlazado de forma funcional a un polipéptido con Fc. En algunos modos de realización, el promotor es un promotor de phoA.

En algunos modos de realización, en los que el polipéptido heterólogo es una proteasa, una inmunoadhesina, un dominio extracelular de un receptor, una proteína heteromultimérica o un anticuerpo.

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo humano. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

Un vector que comprende un polinucleótido de cualquiera de los polinucleótidos como se define en las reivindicaciones. En algunos modos de realización, el vector es un vector de expresión.

Una composición que comprende cualquiera de los polinucleótidos como se define en las reivindicaciones.

Una célula huésped que comprende cualquiera de los polinucleótidos como se define en las reivindicaciones. En algunos modos de realización, la célula huésped es una célula procariótica. En algunos modos de realización, la célula procariótica es E. coli. En algunos modos de realización, la E. coli es de una cepa carente de actividades proteasa endógena. En algunos modos de realización, el genotipo de la E. coli carece de los genes degP y prc y alberga un gen spr mutante. En algunos modos de realización, la célula huésped comprende además un polinucleótido que codifica una proteína chaperona procariótica. En algunos modos de realización, la proteína chaperona procariótica es DsbA y/o DsbC. En algunos modos de realización, la célula huésped sobreexpresa una proteína chaperona procariótica.

En otro aspecto, se proporcionan procedimientos de preparación de un polipéptido heterólogo, comprendiendo dichos procedimientos cultivar cualquiera de las células huésped descritas en el presente documento de modo que se exprese el ácido nucleico, con lo que, tras la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped como se define en las reivindicaciones, el polipéptido heterólogo se pliega para formar un polipéptido heterólogo biológicamente activo. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además recuperar el polipéptido heterólogo del cultivo de la célula huésped. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo se recupera del medio de cultivo de la célula huésped. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además combinar el polipéptido heterólogo recuperado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o vehículo para preparar una formulación farmacéutica que comprenda el polipéptido heterólogo.

En otro aspecto, se proporcionan procedimientos de secreción de un polipéptido heterólogo de una célula, comprendiendo dicho procedimiento cultivar cualquiera de las células huésped proporcionadas en el presente documento de modo que se exprese el ácido nucleico y se secrete el polipéptido heterólogo.

En otro aspecto, se proporcionan procedimientos de translocación de un polipéptido heterólogo de una célula, comprendiendo dicho procedimiento cultivar cualquiera de las células huésped proporcionadas en el presente documento de modo que se exprese el ácido nucleico y se transloque el polipéptido heterólogo.

En el presente documento se divulga un polipéptido heterólogo obtenido por cualquiera de los procedimientos. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido es un anticuerpo.

En algunos modos de realización, el uso del péptido señal variante da como resultado, por ejemplo, una producción incrementada de polipéptido heterólogo (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena ligera, por ejemplo, de anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de polipéptido heterólogo maduro (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo maduro (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de polipéptido heterólogo soluble (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo soluble (por ejemplo, anticuerpo), localización incrementada de cuerpos de inclusión en el lado periplásmico y/o producción incrementada de un polipéptido heterólogo, con lo que el polipéptido heterólogo se secreta, pliega y ensambla en un polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, anticuerpo), por ejemplo, en comparación con el uso del péptido señal natural (no variante). En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa (también denominada fuerza de TIR) del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 1. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o más, tal como de aproximadamente 8 o más. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 4. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 5. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 6. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de los primer y segundo péptidos señal es aproximadamente igual. En algunos modos de realización, las fuerzas de traducción relativas de los primer y segundo péptidos señal son diferentes.

En un aspecto, se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica un péptido señal variante de la invención. En algunos modos de realización, las variantes son de un péptido señal DsbA o STII. En algunos modos de realización, la secuencia de polinucleótido codifica un aminoácido de SEQ ID NO:8, 11, 13, 14, 15, 31 o 33. En algunos modos de realización, la secuencia de polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 11 o 13. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos de la divulgación, la secuencia de polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos modos de realización, el polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o 33. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 34 o 35. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 36, 37, 38, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26 o 28. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO:29. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de una de SEQ ID NO:27 o 30. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 36 o 38. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 37, 39 o 40.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un péptido señal variante como se define en las reivindicaciones de la invención enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, con lo que, tras la expresión del polipéptido heterólogo en una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped procariótica, por ejemplo, una célula huésped de E. coli), el polipéptido heterólogo se pliega y ensambla para formar un polipéptido heterólogo biológicamente activo. Los ejemplos de polipéptidos heterólogos se divulgan además en el presente documento. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es una cadena pesada de anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es una cadena ligera de anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es un polipéptido con Fc. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es un polipéptido multimérico. En algunos modos de realización, el polipéptido heterólogo es un heteromultímero. En algunos aspectos de la divulgación, el péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34 o 35. En algunos aspectos de la divulgación, el péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 11 o 13. En algunos aspectos de la divulgación, el péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos de la divulgación, el péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos aspectos de la divulgación, el péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o 33. En algunos modos de realización, el péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 34 o 35. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 28, 2930, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 44, 45 o 46. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23, 26, 28, 30, 36, 37, 38, 45 o 46.

En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:29. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:27 o 30. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 36 o 38. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 37, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un péptido señal variante consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de polinucleótido de s Eq ID NO: 45 o 46.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido que comprende (1) un polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica un primer polipéptido heterólogo y (2) un polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido heterólogo, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, los primer y segundo polipéptidos heterólogos se pliegan y ensamblan para formar un complejo de polipéptido biológicamente activo.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un anticuerpo, comprendiendo dicho polinucleótido (1) un polinucleótido que codifica un primer péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo y (2) un polinucleótido que codifica un segundo péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped procariótica, por ejemplo, una célula huésped de E. coli), las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo.

En algunos modos de realización, el primer péptido señal es un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica). En algunos modos de realización, el péptido señal es un péptido señal cotraduccional. En algunos modos de realización, el primer péptido señal es un péptido señal DsbA. En algunos modos de realización, el primer péptido señal es un péptido señal STII. En algunos modos de realización, el primer péptido señal es uno cualquiera de los péptidos señal variantes divulgados aquí. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34 o 35. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 11 o 13. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o 33. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 34 o 35. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 28, 2930, 31, 32, 33, 34 o 35. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 28, 36, 37, 38, 39 o 40. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:29. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:27 o 30. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 36 o 38. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 37, 39 o 40.

En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica). En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal DsbA. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es un péptido señal STII. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal es uno cualquiera de los péptidos señal variantes divulgados aquí. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, 11, 12, 13, 14, 15, 31, 32, 33, 34 o 35. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 11 o 13. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o 33. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, 35 o 35. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 36, 37, 38, 39 o 40 . En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26 o 28. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:27 o 30. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:36 o 38. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:37, 39 o 40.

En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en o comprende un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica), y el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, un péptido señal de una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11, 13, 15, 31 y 33 (en algunos modos de realización, una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11 y 13, y en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 36 y 38). En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33. En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 11 o 13. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36 o 38. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 36, 37, 38, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26 o 28. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:29. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:27 o 30. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 36 o 38. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:37, 39 o 40.

En algunos modos de realización, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en o comprende un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica), y el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, un péptido señal que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11, 13, 15, 31 y 33 (en algunos modos de realización, una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11 y 13, y, en algunos modos de realización, una cualquiera de SEQ ID NO: 31 y 33). En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:8, 11, 13, 15, 31 o 33. En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 11 o 13. En algunos aspectos de la divulgación, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos de la divulgación, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos aspectos de la divulgación, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o 33. En algunos aspectos de la divulgación, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 34 o 35. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.30, 36, 37, 3839 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 28, 36, 37, 38, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:29. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de s Eq ID NO:27 o 30. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 36 o 38. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:37, 39 o 40. En algunos modos de realización, el polinucleótido que codifica un anticuerpo comprende además (3) un polinucleótido que codifica un tercer péptido señal como se define en las reivindicaciones enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica un polipéptido con Fc. En algunos modos de realización, el tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal divulgado en el presente documento, por ejemplo, un péptido señal que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de 8, 11, 13, 15, 31 y 33, (en algunos modos de realización, una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11 y 13, y, en algunos modos de realización, una cualquiera de SEQ ID NO: 31 y 33). En algunos modos de realización, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 8, 11 o 13. En algunos aspectos de la divulgación, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos aspectos de la divulgación, el tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 15. En algunos modos de realización, el tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o 33. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37, 38, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de Se Q ID NO:23, 24, 25, 26, 28, 36, 37, 38, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:29. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:27 y 30. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de SEQ ID NO:36 o 38. En algunos aspectos de la divulgación, el polinucleótido que codifica un tercer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende la secuencia de s Eq ID NO:37, 39 o 40. En algunos aspectos de la divulgación, el tercer péptido señal es un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica).

En algunos aspectos de la divulgación, por ejemplo, del polinucleótido que codifica un anticuerpo que comprende además (3) un polinucleótido que codifica un tercer péptido señal, el primer péptido señal comprende un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica) y el segundo péptido señal comprende un péptido señal (por ejemplo, cualquier péptido señal conocido en la técnica). En algunos aspectos de la divulgación, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal y el segundo péptido señal consiste, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal divulgado en el presente documento, por ejemplo, un péptido señal de una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 37, 38, 39 y 40 (en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11 y 13, y, en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 31 y 33). En algunos aspectos de la divulgación, el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal y el primer péptido señal consiste, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal divulgado en el presente documento, por ejemplo, un péptido señal de una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 37, 38, 39 y 40 (en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11 y 13, y, en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 31 y 33). En algunos aspectos de la divulgación, por ejemplo, del polinucleótido que codifica un anticuerpo que comprende además (3) un polinucleótido que codifica un tercer péptido señal, el primer péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal divulgado en el presente documento, por ejemplo, un péptido señal de una cualquiera de SEQ ID NO: 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 3, 38, 39 y 40 (en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 8,11, y 13, y, en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 31 y 33) y el segundo péptido señal consiste en, consiste esencialmente en, o comprende un péptido señal divulgado en el presente documento, por ejemplo, un péptido señal de una cualquiera de 8, 11, 12, 13, 14, 15, 36, 37, 38, 39 y 40 (en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ iD NO: 8, 11 y 13, y, en algunos aspectos de la divulgación, una cualquiera de SEQ ID NO: 31 y 33).

En algunos modos de realización, el uso del péptido señal variante da como resultado, por ejemplo, una producción incrementada de polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de un polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de un polipéptido heterólogo maduro (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo maduro (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de polipéptido heterólogo soluble (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo soluble (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de un polipéptido heterólogo, con lo que el polipéptido heterólogo se secreta, pliega y ensambla en un polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, anticuerpo), por ejemplo, en comparación con el uso del péptido señal natural (no variante). En algunos modos de realización, el uso del péptido señal variante da como resultado, por ejemplo, una producción incrementada de polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de un polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de un polipéptido heterólogo maduro (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo maduro (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de polipéptido heterólogo soluble (por ejemplo, anticuerpo), secreción incrementada de polipéptido heterólogo soluble (por ejemplo, anticuerpo), producción incrementada de un polipéptido heterólogo, con lo que el polipéptido heterólogo se secreta, pliega y ensambla en un polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, anticuerpo), por ejemplo, en comparación con el uso del péptido señal natural (no variante), en el que la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) son aproximadamente equivalentes. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 1. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o más, tal como de aproximadamente 8 o más. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 4. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 5. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 6. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del péptido señal variante y péptido señal natural (no variante) es de aproximadamente 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de los primer y segundo péptidos señal es aproximadamente igual. En algunos modos de realización, las fuerzas de traducción relativas de los primer y segundo péptidos señal son diferentes.

En un aspecto, la divulgación proporciona usos de un polipéptido heterólogo generado usando los procedimientos de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular y/o un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario). El polipéptido heterólogo puede ser de cualquier forma descrita en el presente documento, incluyendo anticuerpo, fragmento de anticuerpo, polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido) o una combinación de los mismos.

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un péptido señal divulgado en el presente documento o polinucleótido que codifica un péptido señal divulgado en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular y/o un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario).

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un vector de expresión divulgado en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular y/o un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario).

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de una célula huésped divulgada en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular y/o un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario).

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un artículo de fabricación divulgado en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmunitario (tal como como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con la angiogénesis (cicatrización).

En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de un kit divulgado en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular y/o un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario).

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A, 1B y 1C: representan los efectos de las variantes de péptido señal sobre los niveles de anticuerpo de longitud completa 5D5 y de cadena pesada. La cepa huésped de E. coli 64B4 que albergaba el vector de expresión se cultivó en medios limitantes de fosfato C.R.A.P. completos en un matraz de agitación durante 24 h y las muestras de valoración se normalizaron por DO550. (1A) Panel superior: inmunoelectrotransferencia de especies que contienen cadena pesada solubles. Se lisaron células 64B4 que llevaban pBR-mSTN1-bSTN1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTI11 -bDsbA1 -5D5 (mSTII1, bDsbA1) o pBR-mSTIM-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1) y la fracción soluble acuosa se separó por electroforesis SDS-PAGE no reductora seguido de sondeo por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc conjugado con HRP. La transferencia resultante muestra especies que contienen cadena pesada correspondientes al anticuerpo 5D5 de longitud completa, cadena pesada-cadena pesada-cadena ligera y cadena pesada-cadena ligera de arriba a abajo. Panel inferior: las muestras de valoración se normalizaron a 1 DO550 y se sedimentaron. Las proteínas totales se desnaturalizaron y redujeron por mezclado con tampón de muestra de tricina que contenía DTT 0,2 M. La cadena pesada migró como una única banda en SDS-PAGE a un peso molecular de alrededor de 49 kDa y se sondeó por el anticuerpo con aFc. Las bandas de la cadena pesada que migraron más lentamente en el gel contenían precursores, como se confirma por la secuenciación de proteínas de Edman. (1B) Niveles de cadena pesada soluble en el periplasma. Se trataron muestras de valoración de células 64B4 que albergaban pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTIII, bSTIII), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTIII, bMalEI), pBR-mSTI11 -bDsbAI-5D5 (mSTIII, bDsbAI) o pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTIII, bPhoAl) por choque osmótico. El sobrenadante se recogió, desnaturalizó y redujo con tampón tricina que contenía DTT 0,2 M. La cadena pesada reducida migró como una única banda a alrededor de 49 kDa y se sondeó con aFc. (1C) Panel superior: inmunoelectrotransferencia no reductora de células 64B4 que llevan pBR-mSTI11 -bSTII1-5D5 (mSTIII, bSTIII), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTIII, bDsbAI), pBR-mSTII1-mPhoA1-5D5 (mSTIII, mPhoAl) y pBR-mSTII1-mMalE1-5D5 (mSTIII, mMalEI). Panel central: se redujo la cadena pesada total en el sedimento a 1 DO550 de las mismas muestras por DTT y se analizó por inmunoelectrotransferencia. Panel inferior: se redujeron los extractos periplásmicos de las mismas muestras y se analizaron por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc. Todos los plásmidos de expresión se denominan de modo que la primera variante de TIR de péptido señal sea para la cadena ligera y la segunda variante de TIR de péptido señal sea para la cadena pesada. Por ejemplo, mSTII1-bSTII1-5D5 quiere decir secuencia señal de STII con una TIR de 1 para la cadena ligera y un sitio de restricción para mluI en dirección 5'; bSTIII quiere decir una secuencia señal de STII con una TIR de 1 para HC con una secuencia señal de bst en dirección 5'; 5D5 es el nombre del anticuerpo.

Las figuras 2A y 2B: representan el efecto del uso de diferentes péptidos señal sobre la localización celular de la cadena pesada por microscopia electrónica con inmunomarcaje con oro coloidal. Se cultivaron células A64B4 que llevaban construcciones que expresaban diversos péptidos señal en matraces de agitación durante 24 h. Las muestras de valoración se fijaron, incluyeron y criocortaron. Los criocortes se sondearon con anticuerpo con aFc conjugado con HRP y anticuerpo secundario frente a aHRP conjugado con oro. Las muestras inmunoteñidas se visualizaron por microscopio electrónico de transmisión (MET). (2A) muestra células A64B4 que llevan pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTI I1). (2B) muestra células A64B4 que llevan pBR-mSTI 11 -bDsbA1 -5D5 (mSTII1, bDsbA1). El espacio periplásmico está señalado por flechas negras. Las señales de inmunomarcaje con oro coloidal están señaladas por puntas de flecha negras.

Las figuras 3A y 3B: representan el efecto de la hidrofobia del péptido señal sobre la acumulación de cadena pesada en el periplasma. (3A) muestra los niveles de cadena pesada soluble periplásmica en ausencia de cadena ligera. Se analizaron por inmunoelectrotransferencia extractos periplásmicos de células 64B4 que llevaban pBR-bDsbA1-5D5HC (bDsbA1), pBR-bDsbA1 L11I-5D5HC (bDsbA1 L11I), pBR-bDsbA1 L11S-5D5HC (bDsbA1 L11S), pBR-bSTII1-5D5HC (bSTII1), pBR-bSTII1 S11L codón 1-5D5HC (bSTI11 codón 1) o pBR-bSTII1 S11L codón 2-5D5HC (bSTI 11 codón 2). La cadena pesada reducida migró a alrededor de 49 kDa y se sondeó por el anticuerpo con aFc. (3B) muestra los niveles de cadena pesada soluble periplásmica con coexpresión de cadena ligera. Se analizaron por inmunoelectrotransferencia extractos periplásmicos de 64B4 que llevaban pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTII1), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5 (mSTII1, bDsbA1), pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1), pBR-mSTI 11 -bDsbA1 L11I-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11I), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11S), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-5D5 (mSTII1, bSTI 11 S11L) o pBR-mSTII1-bSTI 11 S11I-5D5 (mSTII1, bSTI 11 S11I). Se detectó una cadena pesada reducida por el anticuerpo con aFc.

Las figuras 4A y 4B: representan el efecto de la hidrofobia del péptido señal en el nivel de 5D5 de longitud completa. Paneles superiores: se analizaron lisados de células completas de 64B4 que albergaban (A) pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTI 11), pBR-mSTII1-bDsbA1 L11I-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11I), pBR-mSTI 11 -bDsbA1 L11S-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11S), pBR-bDsbA1 -5D5HC (bDsbA1) (B) pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTI 11), pBR-bDsbA1-5D5HC (bDsbA1), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-5D5 (mSTII1, bSTI 11 S11L) o pBR-mSTII1-bSTII1 S11I-5D5 (mSTII1, bSTI 11 S11I) por gel SDS-PAGE no reductora seguido de sondeo por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc. Están señaladas las especies que contienen cadena pesada. Paneles inferiores: se analizó la proteína de cadena pesada total en el sedimento a 1 DO550 de las mismas muestras usadas en los paneles superiores por gel SDS-PAGE no reductora e inmunoelectrotransferencia. La cadena pesada que migra a 49 kDa se sondeó con anticuerpo con aFc.

La figura 5: representa el efecto del péptido señal y su hidrofobia sobre la localización celular de los cuerpos de inclusión. Se fijaron, incluyeron y cortaron muestras de valoración de cultivos de 64B4 que llevaban pBR-mSTII1-bSTI 11-5D5 (mSTII1, bSTI 11), pBR-mSTII1-bMalE1-5D5 (mSTII1, bMalE1), pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5 (mSTII1, bPhoA1), pBR-mSTI 11 -bDsbA1 -5D5 (mSTII1, bDsbA1), pBR-mSTI 11 -bDsbA1 L11S-5D5 (mSTII1, bDsbA1 L11S), pBR-mSTII1-bSTII1 S11L-5D5 (mSTII1, bSTI 11 S11L), pBR-mSTII1-mMalE1-5D5 (mSTII1, mMalE1), o pBR-mSTII1-mPhoA1-5D5 (mSTII1, mPhoA1) en cortes ultrafinos y se visualizaron bajo MET. El espacio periplásmico está señalado por flechas y los cuerpos de inclusión están señalados por puntas de flecha.

La figura 6: representa el análisis de inmunoelectrotransferencia de mutaciones de Ser/Tyr en la región C terminal. Panel superior: se analizaron lisados de células completas de células 64B4 que albergaban pBR-mSTII1-bSTII1-5D5 (mSTII1, bSTI 11), pBR-mSTII1-bSTII1 Y22S-5D5 (mSTII1, bSTI11 Y22S), pBR-bDsbA1 -5D5HC (bDsbA1) o pBR-bDsbA1 S18Y-5D5HC (bDsbA1 S18Y) por sondeo de inmunoelectrotransferencia no reductora con aFc. Se indican las especies que contienen cadena pesada que incluyen 5D5 de longitud completa, cadenas pesadapesada-ligera y pesada-ligera. Panel inferior: se redujeron las proteínas totales en el sedimento a 1 DO550 por DTT y se analizaron por inmunoelectrotransferencia. La cadena pesada reducida migró a ~ 49 kDa.

Las figuras 7A y 7B: representan los efectos de la hidrofobia del péptido señal sobre los niveles de anticuerpo de longitud completa y los niveles de cadena pesada soluble periplásmica para mAb1 y mAb2. (7A) El panel superior muestra lisados de células completas de 64B4 que albergaban pBR-mSTII1-bSTII1-mAb1 (mSTII1, bSTIM), pBR-mSTIM-bSTIM S11L-mAb1 (mSTII1, bSTI11 S11L), pBR-mSTI11 -bDsbA1 -mAb1 (mSTII1, bDsbA1) y pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-mAb1 (mSTII1, bDsbA1 L11S), que se analizaron por gel SDS-PAGE no reductora seguido de sondeo por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc. Las especies que contienen cadena pesada se indican con flechas. Panel central: muestra proteínas periplásmicas de las mismas muestras, que se extrajeron, redujeron con DTT y analizaron por gel SDS-PAGE seguido de sondeo por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc. El panel inferior muestra la proteína de cadena pesada total en los sedimentos a 1 DO550 de las mismas muestras, que se redujeron por DTT y analizaron por inmunoelectrotransferencia. (7B) El panel superior muestra lisados de células completas de 64B4 que albergaban pBR-mSTII1-bSTII1-mAb2 (mSTII1, bSTI 11), pBR-mSTI 11 -bSTI11 S11 L-mAb2 (mSTII1, bSTI 11 S11L), pBR-mSTI 11 -bDsbA1 -mAb2 (mSTII1, bDsbA1) y pBR-mSTII1-bDsbA1 L11S-mAb2 (mSTII1, bDsbA1 L11S), que se analizaron por gel SDS-PAGE no reductora seguido de sondeo por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc. Las especies que contienen cadena pesada se indican con flechas. El panel central muestra proteínas periplásmicas de las mismas muestras, que se extrajeron, redujeron con DTT y analizaron por gel SDS-PAGE seguido de sondeo por inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con aFc. El panel inferior muestra la proteína de cadena pesada total en los sedimentos a 1 DO550 de las mismas muestras, que se redujeron por DTT y analizaron por inmunoelectrotransferencia.

Descripción detallada de la invención

Técnicas generales

Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en el presente documento, en general, se entienden bien y se emplean comúnmente usando una metodología convencional por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3.a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, y ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).

Definiciones

Se pretende que el término "vector", como se usa en el presente documento, haga referencia a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico a la que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector de fago. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden fijar segmentos de ADN adicionales al genoma vírico. Determinados vectores se pueden replicar de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped, y, de este modo, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de los genes a los que se enlazan de forma funcional. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están, a menudo, en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar de manera intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada.

Se pretende que el término "cistrón", como se usa en el presente documento, haga referencia a un elemento genético ampliamente equivalente a una unidad traduccional que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica y regiones de control contiguas. Las "regiones de control contiguas" incluyen, por ejemplo, una región de iniciación traduccional (TIR, como se define a continuación en el presente documento) y una región de terminación.

Un vector de expresión "policistrónico" se refiere a un único vector que contiene y expresa múltiples cistrones bajo el control regulador de un único promotor. Un ejemplo común de vector policistrónico es un vector "dicistrónico" que contiene y expresa dos polipéptidos diferentes bajo el control de un promotor. Tras la expresión de un vector dicistrónico o policistrónico, se transcriben, en primer lugar, múltiples genes como una única unidad transcripcional, y, a continuación, se traducen por separado.

Un vector de expresión de "cistrón separado" de acuerdo con la presente invención se refiere a un único vector que comprende al menos dos pares promotor-cistrón separados, en el que cada cistrón está bajo el control de su propio promotor. Tras la expresión de un vector de expresión de cistrón separado, tanto los procesos de transcripción como de traducción de diferentes genes son separados e independientes.

La "región de iniciación traduccional" o TIR o región de iniciación traduccional o secuencia de iniciación traduccional, como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ácido nucleico que proporciona la eficacia de iniciación traduccional de un gen de interés. En general, una TIR dentro de un cistrón particular engloba el sitio de unión a ribosoma (RBS) y las secuencias 5' y 3' con respecto al RBS. El RBS se define para que contenga, como mínimo, la región de Shine-Dalgarno y el codón de inicio (AUG). En consecuencia, una TIR también incluye al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico que se va a traducir. Preferentemente, una TIR incluye una secuencia señal de secreción que codifica un péptido señal que precede a la secuencia que codifica la cadena ligera o pesada dentro de un cistrón. Una variante de TIR contiene variantes de secuencia (en particular, sustituciones) dentro de la región TIR que alteran la propiedad de la TIR, tal como su fuerza traduccional como se define a continuación en el presente documento. Preferentemente, una variante de TIR de la invención contiene sustituciones de secuencia dentro de los primeros 2 a aproximadamente 14, preferentemente de aproximadamente 4 a 12, más preferentemente de aproximadamente 6 codones de la secuencia señal de secreción que precede a la secuencia que codifica la cadena ligera o pesada dentro de un cistrón.

El término "fuerza traduccional" como se usa en el presente documento se refiere a una medición de un polipéptido secretado en un sistema de control en el que se usan una o más variantes de una TIR para dirigir la secreción de un polipéptido y los resultados se comparan con la TIR natural o algún otro control en las mismas condiciones de cultivo y ensayo.

"Péptido señal" (también denominado "secuencia señal") se refiere a un péptido corto que se puede usar para dirigir una proteína de interés recién sintetizada a través de una membrana celular, normalmente la membrana interior o tanto las membranas interior como exterior de los procariotas. El péptido señal codificado por la secuencia señal de secreción puede ser endógeno a las células huésped, o pueden ser exógenos, incluyendo péptidos señal naturales con respecto al polipéptido que se va a expresar. El péptido señal típicamente está presente en el extremo amino de un polipéptido que se va a expresar, y típicamente se retira enzimáticamente entre la biosíntesis y secreción del polipéptido del citoplasma. Por tanto, normalmente el péptido señal no está presente en un producto de proteína madura. Los péptidos señal (por ejemplo, péptidos señal procarióticos, por ejemplo, de E coli) se componen comúnmente de tres regiones distintas: una región N terminal que típicamente contiene al menos 1 o 2 residuos de aminoácido cargados positivamente, una región central hidrófoba denominada región H (también denominada dominio H) y una región C terminal reconocida por la peptidasa señal. Un experto en la técnica entiende cómo definir la región N terminal, la región H y las regiones C terminales de un péptido señal dado.

Por "hidrofobia promedio" de un péptido (o porción de un péptido) se quiere decir la hidrofobia promedio como se calcula usando la fórmula: hidrofobia promedio de un péptido (o porción de un péptido) = hidrofobia (suma) total del péptido (o porción de un péptido) / número de aminoácidos en el péptido (o porción de un péptido). La hidrofobia "total" o "suma" se calcula (a) asignando a cada aminoácido en el péptido (o porción de un péptido) un valor de hidrofobia consenso normalizado de acuerdo con Eisenberg, D. et al, J Mol Biol (1984) 179:125-142. Tabla I (página 126), a continuación, sumando los valores de hidrofobia consenso normalizado para los aminoácidos en el péptido (o porción del péptido). En algunos modos de realización, se calcula la hidrofobia promedio para el dominio H del péptido señal.

"Enlazado de forma funcional" se refiere a una yuxtaposición de dos o más componentes, en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. Por ejemplo, un promotor está enlazado de forma funcional a una secuencia codificante si actúa en cis para controlar o modular la transcripción de la secuencia enlazada. En general, pero no necesariamente, las secuencias de ADN que están "enlazadas de forma funcional" son contiguas y, si fuera necesario, unen dos regiones codificantes de proteínas o, en el caso de un líder secretor, contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, aunque un promotor enlazado de forma funcional se localiza, en general, en dirección 5' de la secuencia codificante, no es necesariamente contiguo a ella. Los potenciadores enlazados de forma funcional se pueden localizar en dirección 5', dentro o en dirección 3' de las secuencias codificantes y a distancias considerables del promotor. El enlace se logra por procedimientos recombinantes conocidos en la técnica, por ejemplo, usando metodología de PCR, por hibridación o por fijación en sitios de restricción convenientes. Si no existen sitios de restricción convenientes, entonces se usan adaptadores o conectores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

"Elementos reguladores", como se usa en el presente documento, se refieren a secuencias de nucleótidos presentes en cis, necesarias para la transcripción y traducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo en polipéptidos. Los elementos reguladores transcripcionales comprenden normalmente un promotor en 5' de la secuencia génica que se va a expresar, sitios de iniciación y terminación transcripcional y una secuencia señal de poliadenilación. El término "sitio de iniciación transcripcional" se refiere al ácido nucleico en la construcción correspondiente al primer ácido nucleico incorporado en el transcrito primario, es decir, el precursor del ARNm; el sitio de iniciación transcripcional se puede solapar con las secuencias promotoras.

Un "promotor" se refiere a una secuencia de polinucleótido que controla la transcripción de un gen o secuencia a la que se enlaza de forma funcional. Un promotor incluye señales para la unión a ARN polimerasa e iniciación de la transcripción. Los promotores usados serán funcionales en el tipo celular de la célula huésped en la que se contempla la expresión de la secuencia seleccionada. Un gran número de promotores incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles de una variedad de fuentes diferentes son bien conocidos en la técnica (y están identificados en bases de datos, tales como GenBank) y están disponibles como o dentro de polinucleótidos clonados (por ejemplo, de depósitos tales como ATCC, así como otras fuentes comerciales o individuales). Con los promotores inducibles, la actividad del promotor se incrementa o disminuye en respuesta a una señal.

Se pretende que el término "célula huésped" (o "célula huésped recombinante"), como se usa en el presente documento, haga referencia a una célula que se ha alterado genéticamente, o se puede alterar genéticamente por introducción de un polinucleótido exógeno, tal como un vector o plásmido recombinante. Se debe entender que no solo se pretende que dichos términos hagan referencia a la célula objeto particular, sino a la descendencia de una célula de este tipo. Puesto que se pueden producir determinadas modificaciones en generaciones subsiguientes debido a mutaciones o bien influencias ambientales, dicha descendencia no puede, de hecho, ser idéntica a la célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en el presente documento.

Un polipéptido "aislado" (por ejemplo, anticuerpo) es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En aspectos preferentes de la divulgación, el polipéptido se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso del polipéptido como se determina por el procedimiento de Lowry, y más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N terminales o internos por el uso de un secuenciador de vaso giratorio, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) en condiciones reductoras o no reductoras usando tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico aislado es distinta en la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero por ADN o ARN polimerasa, o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si están presentes, se puede conferir una modificación en la estructura de nucleótido antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar además después de la síntesis, tal como por conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del/de los polinucleótido(s). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los glúcidos se puede reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, proteger por grupos protectores estándar o activar para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o se puede conjugar a soportes sólidos o semisólidos. El OH terminal en 5' y 3' se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos del grupo caperuza orgánicos de desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivatizar a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de los glúcidos ribosa o desoxirribosa que, en general, son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de glúcidos carbocíclicos, glúcidos alfa anoméricos, glúcidos epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, glúcidos de piranosa, glúcidos de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos, tales como metil-ribósido. Se pueden reemplazar uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, en los que el fosfato se reemplaza por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo (1-20C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente un enlace éter (-O­ ), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No se necesita que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere, en general, a polinucleótidos, en general, sintéticos, en general, monocatenarios cortos, que, en general, tienen, pero no necesariamente, una longitud de menos de aproximadamente 200 nucleótidos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos.

Como se usa en el presente documento, "polipéptido" se refiere, en general, a péptidos y proteínas de cualquier fuente celular que tengan más de aproximadamente diez aminoácidos. Los polipéptidos "heterólogos" son aquellos polipéptidos exógenos a la célula huésped que se utiliza, tales como una proteína humana producida por E. coli. Aunque el polipéptido heterólogo puede ser procariótico o eucariótico, preferentemente es eucariótico, más preferentemente, de mamífero, y lo más preferentemente, humano. Preferentemente, es un polipéptido recombinante o producido de forma recombinante. Los polipéptidos "heterólogos" son aquellos polipéptidos exógenos a la célula huésped que se utiliza, tales como una proteína humana producida por E. coli. Aunque el polipéptido heterólogo puede ser procariótico o eucariótico, preferentemente es eucariótico, más preferentemente, de mamífero, y lo más preferentemente, humano. Preferentemente, es un polipéptido recombinante o producido de forma recombinante.

Los ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen moléculas, tales como, por ejemplo, renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; hormona liberadora de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; 1 -antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; trombopoyetina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular y factor de Von Willebrand; factores de anticoagulación, tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana, o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA) y variantes del mismo; tales como RETEVASE™ y TNKASE™; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; anticuerpos para el/los dominio(s) de ErbB2, tales como 2C4 (documento WO 01/00245; hibridoma ATCC HB-12697), que se unen a una región en el dominio extracelular de ErbB2 (por ejemplo, uno o más residuos en la región de aproximadamente el residuo 22 a aproximadamente el residuo 584 de ErbB2, inclusive), encefalinasa; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta lactamasa; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurótrofo, tal como factor neurótrofo derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardíaca), tal como cardiotrofina-1 (CT-1); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 o TGF-5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(I-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD, tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; seroalbúmina, tal como seroalbúmina humano (HSA) o seroalbúmina bovina (BSA); factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, de IL-1 a IL-10; anticuerpo anti-HER-2; ligando para Apo2; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del VIH; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

Los polipéptidos en el presente documento pueden incluir seroalbúmina humana (HSA), 2C4, tromboplastina tisular, anti tromboplastina tisular, anti-CD20, anti-HER-2, heregulina, anti-IgE, anti-CD11a, anti-CD18, VEGF y receptores y anticuerpos del mismo, tales como rrhuFab V2 y AVASTIN™, hormona de crecimiento y sus variantes, tales como hGH, receptores de la hormona de crecimiento, proteína liberadora de la hormona de crecimiento (GHRP), LIV-1 (documento EP 1.263.780), TRAIL, factor de necrosis tumoral (TNF) y anticuerpos del mismo, receptor de TNF y anticuerpos relacionados, receptor de TNF-IgG, factores asociados al receptor de TNF (TRAF) e inhibidores de los mismos, factor VIII, dominio B del factor VIII, interferones, tales como interferón gamma, factores de crecimiento y transformación (TGF), tales como TGF-beta, anti-TGF, tal como anti-TGF-beta, activina, inhibina, anti-activina, anti-inhibina, activadores tisulares del plasminógeno y sus variantes, tales como t-PA, RETEPLASE™ y TNKasa, anticuerpos anti-Fas, ligando Apo-2; inhibidor del ligando Apo-2; receptor Apo-2, Apo-3, factores apoptóticos, Ced-4, DcR3, anticuerpos agonistas del receptor de muerte (DR4, DR5), linfotoxina (LT), prolactina, receptor de prolactina, proteínas s Ob , WISP (proteínas secretadas inducidas por wnt-1), neurotoxina-3 (NT-3), factor de crecimiento nervioso (NGF) y anti-NGF, DNasa, antígeno de hepatitis, antígeno de herpes simple, leptina, factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), tales como IGF-1 e IGF-2 y sus proteínas de unión y receptores, tales como IGFBP-1-IGFBP-6, insulina, factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), tales como FGF-17, proteína Toll, ligandos TIE, CD40 y anti-CD40, inmunoadhesinas, subtilisina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), trombopoyetina (TPO), interleucinas, tales como IL-2, IL-12, IL-17, IL-22, IL-8, IL-9, y anticuerpos frente a las mismas, y antígeno específico del cáncer de próstata (PSCA).

Los polipéptidos preferentes, en particular, son polipéptidos recombinantes, en algunos aspectos de la divulgación, anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales y anticuerpos humanizados. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. En algunos aspectos de la divulgación, estos anticuerpos son anticuerpos humanos o humanizados. En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo anti-c-met, anti-IgE, anti-CD18, anti-VEGF, anti tromboplastina tisular, 2C4, anti-Her-2, anti-CD20, anti-CD40 o anti-CD11a. Los fragmentos de anticuerpo englobados en la definición de polipéptido, en algunos modos de realización, comprenden una cadena ligera, en algunos modos de realización, una cadena ligera kappa. Dichos fragmentos ejemplares incluyen, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2 o fusión F(ab')2-cremallera de leucinas (CL) y un anticuerpo de un brazo.

"Expresión" de proteínas se refiere a la conversión de la información codificada en un gen en ARN mensajero (ARNm) y, a continuación, a la proteína.

Un "inmunoconjugado" (denominado de manera intercambiable "conjugado anticuerpo-fármaco" o "CAF") quiere decir un anticuerpo conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como un agente quimioterápico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina proteica, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. En algunos aspectos de la divulgación, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben de forma completa la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista", como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés (por ejemplo, HGF).

"Afinidad de unión" se refiere, en general, a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar, en general, por la constante de disociación (Kd). De forma deseable, la Kd es 1 x 10'7, 1 x 10'8, 5 x 10'8, 1 x 10'9, 3 x 10'9, 5 x 10'9 o incluso 1 x 10'10 o más fuerte. Se puede medir la afinidad por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad, se unen, en general al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen, en general, al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de procedimientos de medición de la afinidad de unión son conocidos en la técnica, pudiéndose usar cualquiera para los propósitos de la presente invención. Se describen aspectos ilustrativos específicos de la divulgación en lo que sigue. En un aspecto de la divulgación, la "Kd" o "valor de Kd" de acuerdo con la presente invención se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en solución de Fab para el antígeno equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con 125I en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, a continuación, capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de microvaloración (Dynex) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.° 269620), se mezcla [125I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). A continuación, el Fab de interés se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se hayan secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleador (MicroScint-20; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva. De acuerdo con otro aspecto de la divulgación, se mide la Kd o valor de Kd usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con matrices CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan matrices de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 |jg/ml (~ 0,2 uM) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 |jl/min. En algunos aspectos de la divulgación, se usan las siguientes modificaciones para el procedimiento de ensayo de resonancia de plasmón superficial: el anticuerpo se inmoviliza en matrices de biosensor CM5 para lograr aproximadamente 400 UR, y, para las mediciones cinéticas, se inyectan en serie dos veces diluciones de la proteína diana en tampón PBST a 25 °C con un caudal de aproximadamente 30 ul/minuto. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIAcore, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Si la tasa de asociación sobrepasa 106 M-1 S-1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitada.

También se puede determinar una "tasa de asociación" o "kas" de acuerdo con la presente invención con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial descrita anteriormente usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con matrices CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan matrices de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, en 5 |jg/ml (~0,2 uM) antes de la inyección a un caudal de 5 jl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 jl/min. En algunos aspectos de la divulgación, se usan las siguientes modificaciones para el procedimiento de ensayo de resonancia de plasmón superficial: el anticuerpo se inmoviliza en matrices de biosensor CM5 para lograr aproximadamente 400 UR, y, para las mediciones cinéticas, se inyectan en serie dos veces diluciones de la proteína diana en tampón PBST a 25 °C con un caudal de aproximadamente 30 ul/minuto. Se calculan las tasas de asociación (kas) y las tasas de disociación (kdis) usando un simple modelo de unión uno a uno de Langmuir (programa informático de evaluación de BIAcore, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calculó como la proporción kdis/kas. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Si la tasa de asociación sobrepasa 106 M'1 S'1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, a continuación, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta roja agitada.

Un "anticuerpo no marcado" es un anticuerpo que no está conjugado a una molécula heteróloga, tal como un resto citotóxico o radiomarcador.

Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado es uno que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno.

Para cribar para determinar anticuerpos que se unen a un epítopo en un antígeno unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, tal como el que se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).

Para incrementar la semivida de los anticuerpos o polipéptidos que contienen las secuencias de aminoácidos de la presente divulgación, se puede fijar un epítopo de unión a receptor de rescate al anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo), como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5.739.277. Por ejemplo, se puede enlazar en marco una molécula de ácido nucleico que codifica el epítopo de unión a receptor de rescate a un ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica de la presente divulgación de modo que la proteína de fusión expresada por la molécula de ácido nucleico genomanipulada comprenda el epítopo de unión a receptor de rescate y una secuencia polipeptídica de la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, el término "epítopo de unión a receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG (por ejemplo, Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000), tabla 1). También se describen anticuerpos con sustituciones en una región Fc de los mismos y semividas en suero incrementadas en los documentos WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol.

Chem. 279:6213-6216 (2004)). En otro aspecto de la presente divulgación, la semivida en suero también se puede incrementar, por ejemplo, fijando otras secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, se pueden fijar anticuerpos u otros polipéptidos útiles en los procedimientos de la invención a seroalbúmina o a una porción de seroalbúmina que se una al receptor FcRn o un péptido de unión a seroalbúmina de modo que la seroalbúmina se una al anticuerpo o polipéptido, por ejemplo, dichas secuencias polipeptídicas se divulgan en el documento WO01/45746. En un aspecto preferente de la presente divulgación, el péptido para seroalbúmina que se va a fijar comprende una

secuencia de aminoácidos de D1CLPRWGCLW (SEQ ID NO: 48). En otro aspecto de la presente divulgación, la semivida de un Fab se incrementa por estos procedimientos. Véase también Dennis et al. J. Biol. Chem.

277:35035-35043 (2002) para secuencias peptídicas de unión a seroalbúmina.

Por "fragmento" se quiere decir una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico que contiene, preferentemente, al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de toda la longitud de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100, 200, 300, 400, 500, 600 o más nucleótidos o 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 aminoácidos o más.

Se usa el término "anticuerpo" en el presente documento en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo, siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, y y P, respectivamente.

Se usa el término "región Fc" en el presente documento para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un aspecto de la divulgación, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácido que se producen lo más comúnmente en una selección de secuencias de la región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias del VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias del dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación del NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En un aspecto de la divulgación, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un aspecto de la divulgación, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas de las HVR (por ejemplo, CDR) se corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas de las f R se corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR" como se usa en el presente documento se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos en contacto con el antígeno ("contactos con el antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:

(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(b) CDR que se producen en los residuos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) contactos con el antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48­ 56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.

El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que tiene especificidad poliepitópica. Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (V^h) y un dominio variable de la cadena ligera (V^l), donde la unidad V^hV^l tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios V^l y V^h, uniéndose cada unidad V^hV^l a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos, uniéndose cada dominio variable único a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado de forma covalente o no covalente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) diana(s) o diferente(s). "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solo a un epítopo. De acuerdo con un aspecto de la divulgación, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |jM a 0,001 pM, 3 |jM a 0,001 pM, 1 j M a 0,001 pM, 0,5 j M a 0,001 pM o 0,1 j M a 0,001 pM.

El término "anticuerpo de un brazo" o "anticuerpos de un brazo" se refiere a un anticuerpo que comprende (1) un dominio variable unido por un enlace peptídico a un polipéptido que comprende un dominio CH2, un dominio CH3 o un dominio CH2-CH3 y (2) un segundo dominio CH2, CH3 o CH2-CH3, en el que un dominio variable no está unido por un enlace peptídico a un polipéptido que comprende el segundo dominio CH2, CH3 o CH2-CH3. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo de un brazo comprende 3 polipéptidos (1) un primer polipéptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, VH), CH1, CH2 y CH3, (2) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, VL) y un dominio CL, y (3) un tercer polipéptido que comprende un dominio CH2 y CH3. En un aspecto de la divulgación, el tercer polipéptido no comprende un dominio variable. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo de un brazo tiene una región bisagra parcial que contiene los dos residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro que enlazan las cadenas pesadas constantes. En un aspecto de la divulgación, los dominios variables del anticuerpo de un brazo forman una región de unión a antígeno. En otro aspecto de la divulgación, un dominio variable del anticuerpo de un brazo es un dominio variable único, en el que cada dominio variable único es una región de unión a antígeno.

El término tecnología "botón en ojal" o "KnH" como se menciona en el presente documento se refiere a la tecnología que dirige el emparejamiento entre sí in vitro o in vivo de dos polipéptidos introduciendo una protuberancia (botón) en un polipéptido y una cavidad (ojal) en el otro polipéptido en una interfase en la que interactúan. Por ejemplo, se han introducido KnH en las interfases de unión Fc:Fc, interfases CL:CH1 o interfases VH/VL de anticuerpos (por ejemplo, los documentos US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 y Zhu et al. (1997) Protein Science 6:781-788). Esto es especialmente útil para fomentar el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes entre sí durante la preparación de anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos que tienen KnH en sus regiones Fc pueden comprender además dominios variables únicos enlazados a cada región Fc, o comprender además dominios variables de la cadena pesada diferentes que se emparejen con dominios variables de la cadena ligera similares o diferentes. También se puede usar la tecnología KnH para emparejar entre sí dos dominios extracelulares de receptores diferentes o cualquier otra secuencia polipeptídica que comprenda secuencias de reconocimiento de dianas diferentes (por ejemplo, que incluyan aficuerpos, pepticuerpos y otras fusiones de Fc).

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en toda una cadena L junto con el dominio de la región variable de la cadena H (V^h) y el primer dominio constante de una cadena pesada (C^h1). El tratamiento con pepsina de un anticuerpo proporciona un único fragmento F(ab')2 grande que se corresponde aproximadamente con dos fragmentos Fab enlazados por disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y todavía puede reticular el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxílico del dominio C^h1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para un Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con una especificidad de unión deseada, secuencia de aminoácidos que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga" en comparación con una región constante de un anticuerpo), y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencia del CH2 y/o CH3 de una IgG). Las secuencias de adhesina ejemplares incluyen secuencias de aminoácidos contiguas que comprenden una porción de un receptor o un ligando que se une a una proteína de interés. Las secuencias de adhesina también pueden ser secuencias que se unan a una proteína de interés, pero no son secuencias de receptor o ligando (por ejemplo, secuencias de adhesina en pepticuerpos). Dichas secuencias polipeptídicas se pueden seleccionar o identificar por diversos procedimientos, incluyendo técnicas de presentación en fagos y procedimientos de clasificación de alto rendimiento. Se puede obtener la secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

La "región bisagra" en el contexto de un anticuerpo o semianticuerpo se define, en general, como el tramo de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de IgG1 colocando los primer y último residuos de cisteína formando enlaces S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones.

La "región bisagra inferior" de una región Fc se define normalmente como el tramo de residuos inmediatamente C terminales con respecto a la región bisagra, es decir, los residuos de 233 a 239 de la región Fc. Antes de la presente invención, la unión a FcgammaR se atribuía, en general, a residuos de aminoácido en la región bisagra inferior de una región Fc de IgG.

El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana normalmente se extiende de aproximadamente los residuos 231 a aproximadamente 340 de la IgG. El dominio CH2 es único en tanto que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas glucídicas ramificadas unidas a N se intercalan entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG natural intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985).

El "dominio CH3" comprende el tramo de residuos C terminales con respecto a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, de aproximadamente el residuo de aminoácido 341 a aproximadamente el residuo de aminoácido 447 de una IgG).

Una "región Fc funcional" posee una "función efectora" de una región Fc de secuencia natural. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen unión a C1q; CDC; unión al receptor Fc; ADCC; fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B, BCR), etc. Dichas funciones efectoras requieren, en general, que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar usando diversos ensayos como se divulga, por ejemplo, en definiciones en el presente documento.

Una "región Fc de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia natural incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia natural (alotipos A y distinto a A); región Fc de IgG2 humana de secuencia natural; región Fc de IgG3 humana de secuencia natural; y región Fc de IgG4 humana de secuencia natural, así como variantes naturales de las mismas.

Una "región Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia natural en virtud de al menos una modificación aminoacídica, preferentemente una o más sustituciones aminoacídicas. Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución aminoacídica en comparación con una región Fc de secuencia natural o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones aminoacídicas y, preferentemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones aminoacídicas en una región Fc de secuencia natural o en la región Fc del polipéptido original. La región Fc variante en el presente documento poseerá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de un polipéptido original y, lo más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de homología con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de homología con la misma.

"Complejo Fc" como se usa en el presente documento se refiere a dos dominios CH2 de una región Fc que interactúan entre sí y/o dos dominios CH3 de una región Fc que interactúan entre sí, en los que los dominios CH2 y/o los dominios CH3 interactúan a través de enlaces y/o fuerzas (por ejemplo, fuerzas de van der Waals, hidrófobas, hidrófilas) que no sean enlaces peptídicos.

"Componente de Fc" como se usa en el presente documento se refiere a una región bisagra, un dominio CH2 o un dominio CH3 de una región Fc.

"Componente CH de Fc" o "FcCH" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que comprende un dominio CH2, un dominio CH3, o dominios CH2 y CH3 de una región Fc.

Como se usa en el presente documento, "mutante de anticuerpo" o "variante de anticuerpo" se refiere a una variante de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo en la que se han modificado uno o más de los residuos de aminoácido del anticuerpo dependiente de la especie. Dichos mutantes necesariamente tienen menos de un 100 % de identidad o similitud de secuencia con el anticuerpo dependiente de la especie. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo mutante tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad o similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada o bien ligera de anticuerpo dependiente de la especie, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95 %. En el presente documento se define identidad o similitud con respecto a esta secuencia como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, el mismo residuo) o similares (es decir, el residuo de aminoácido del mismo grupo en base a propiedades de cadena lateral comunes, véase a continuación) con los residuos de anticuerpo dependiente de la especie, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. En algún aspecto de la divulgación, ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N terminales, C terminales o internas en la secuencia de anticuerpo fuera del dominio variable se interpretará como que afecta a la identidad o similitud de secuencia.

Un "trastorno" o "enfermedad" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o procedimiento de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, incluyendo las afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se van a tratar en el presente documento incluyen tumores malignos y benignos; carcinoma, blastoma y sarcoma.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como profiláctico o a medidas preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen un tumor benigno, precanceroso o no metastásico, así como aquellos en los que se va a prevenir la aparición o recidiva del cáncer.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de los cánceres, la cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En el grado en el que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para el tratamiento del cáncer, la eficacia in vivo, por ejemplo, se puede medir evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión (THP) de la enfermedad, las tasas de respuesta (TR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

Una "enfermedad autoinmunitaria" en el presente documento es una enfermedad o trastorno no maligno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo. Las enfermedades autoinmunitarias en el presente documento excluyen específicamente enfermedades o afecciones malignas o cancerosas, que excluyen especialmente linfoma de linfocitos B, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (l Lc ), tricoleucemia y leucemia mieloblástica crónica. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, respuestas inflamatorias, tales como dermatosis inflamatorias, incluyendo psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica); esclerodermia generalizada y esclerosis; respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal (tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); síndrome de dificultad respiratoria (incluyendo síndrome de dificultad respiratoria del adulto, SDRA); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; colitis; glomerulonefritis; afecciones alérgicas, tales como eccema y asma y otras afecciones que implican infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas; ateroesclerosis; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus eritematoso diseminado (LED); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus de tipo I o diabetes mellitus insulinodependiente); esclerosis múltiple; síndrome de Raynaud; tiroiditis autoinmunitaria; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjogren; diabetes de tipo 1; y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T encontrados típicamente en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades que implican diapedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); síndrome de lesión multiorgánica; anemia hemolítica (incluyendo, pero no limitada a, crioglobulinemia o anemia positiva de Coombs); miastenia grave; enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo; enfermedad por anticuerpos anti-membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídico; neuritis alérgica; enfermedad de Graves-Basedow; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; pénfigo ampolloso; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; síndrome del hombre rígido; enfermedad de Behget; arteritis de células gigantes; nefritis por inmunocomplejos; nefropatía por IgA; polineuropatías por IgM; púrpura trombocitopénica inmunitaria (PTI) o trombocitopenia autoinmunitaria, etc.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la afección fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. En esta definición se incluyen cánceres benignos y malignos. Por "cáncer en fase precoz" o "tumor en fase precoz" se quiere decir un cáncer que no es invasivo ni metastásico o se clasifica como un cáncer en estadio 0, I o II. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma), sarcoma (incluyendo liposarcoma y sarcoma de células sinoviales), tumores neuroendocrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma e insulinoma), mesotelioma, schwannoma (incluyendo neurinoma del acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o neoplasias malignas linfáticas. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen carcinoma de células escamosas (por ejemplo, carcinoma de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, incluyendo carcinoma de pulmón microcítico (CPM), carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (incluyendo cáncer de mama metastásico), cáncer de colón, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer esofágico, tumores de las vías biliares, así como cáncer de cabeza y cuello y mieloma múltiple.

El término "precanceroso" se refiere a una afección o un crecimiento que típicamente precede o se desarrolla en un cáncer. Un crecimiento "precanceroso" tendrá células que se caracterizan por una regulación del ciclo celular, proliferación o diferenciación anómala, que se puede determinar por marcadores de regulación del ciclo celular, proliferación o diferenciación celular.

Por "displasia" se quiere decir cualquier crecimiento o desarrollo anómalo de tejido, órgano o células. Preferentemente, la displasia es de alto grado o precancerosa.

Por "metástasis" se quiere decir la diseminación del cáncer desde su sitio primario a otras partes del cuerpo, http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer. Las células cancerosas se pueden separar de un tumor primario, penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través de la circulación sanguínea y crecer en un foco a distancia (metastatizar) en los tejidos normales de cualquier parte del cuerpo. Las metástasis pueden ser locales o a distancia. La metástasis es un proceso secuencial, dependiente de que las células tumorales se separen del tumor primario, se desplacen a través de la circulación sanguínea y se detengan en un sitio a distancia. En el nuevo sitio, las células establecen un riego sanguíneo y pueden crecer para formar una masa potencialmente mortal.

Tanto las vías moleculares estimuladoras como inhibidoras dentro de la célula tumoral regulan este comportamiento, y las interacciones entre la célula tumoral y las células huésped en el sitio a distancia también son significativas.

Por "no metastásico" se quiere decir un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema linfático o de los vasos sanguíneos ni en tejidos distintos del sitio primario. En general, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer que sea un cáncer en fase 0, I o II y ocasionalmente un cáncer en fase III.

Por "tumor primario" o "cáncer primario" se quiere decir el cáncer original y no una lesión metastásica localizada en otro tejido, órgano o localización en el cuerpo del sujeto.

Por "tumor benigno" o "cáncer benigno" se quiere decir un tumor que permanece localizado en el sitio de origen y no tiene la capacidad de infiltrarse, invadir o metastatizar en un sitio a distancia.

Por "masa tumoral" se quiere decir el número de células cancerosas, el tamaño de un tumor o la cantidad de cáncer en el cuerpo. La masa tumoral también se denomina carga tumoral.

Por "número tumoral" se quiere decir el número de tumores.

Por "sujeto" se quiere decir un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, un mamífero humano o no humano, tal como bovino, equino, canino, ovino o felino. Preferentemente, el sujeto es un ser humano.

El término "tratamiento antineoplásico" se refiere a un tratamiento útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes terapéuticos antineoplásicos incluyen, pero se limitan a, por ejemplo, agentes quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénicos, agentes apoptóticos, agentes antitubulínicos y otros agentes para tratar el cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (mesilato de imatinib)), un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), interferones, citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a una o más de las siguientes dianas: receptor(es) ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o para VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. También se incluyen en la invención combinaciones de los mismos.

El término "agente citotóxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. Se pretende que el término incluya isótopos radioactivos (por ejemplo, I131,I125, Y90 y Re186), agentes quimioterápicos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterápico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina); criptoficinas (en particular, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafacina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, uramustina; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como antibióticos enodiinos (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma1I y calicheamicina omegaI1 (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos enodiinos de cromoproteínas relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet, pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente, toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de paclitaxel en nanopartículas genomanipuladas con albúmina libres de Cremophor ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) y doxetaxel TAXOTERE® (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11) (incluyendo la pauta de tratamiento con irinotecán con 5-FU y ácido folínico); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometililornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; bortezomib VELCADE; lenalidomida REVLIMID; ácido folínico (AF); oxaliplatino, incluyendo la pauta de tratamiento con oxaliplatino (FOLFOX); inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™)) y VEGF-A que reducen la proliferación celular y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre tumores, tales como antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (MSRE), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifina FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprorelina y goserelina; así como troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano nucleósido citosina); oligonucleótidos antisentido, en particular, los que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras, ribocimas, tales como un inhibidor de la expresión de VEGF (por ejemplo, ribocima ANGIOZYME®) y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, tales como las vacunas para el tratamiento génico, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; rIL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas (véase la pat. de EE. UU. n.° 4.675.187) y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El término "profármaco" como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco original y se puede activar o convertir enzimáticamente en la forma original más activa. Véanse, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con aminoácidos D, profármacos glucosilados, profármacos que contienen p-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterápicos descritos anteriormente.

Por "radioterapia" se quiere decir el uso de rayos gamma o rayos beta dirigidos para inducir suficiente daño en una célula para limitar su capacidad de funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que existirán maneras conocidas en la técnica para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos se dan como una administración de una vez y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (grays) por día.

Un polipéptido "biológicamente activo" o "funcional" (tal como un polipéptido heterólogo) es uno que puede ejercer una o más de sus actividades naturales en acontecimientos estructurales, reguladores, bioquímicos o biofísicos.

Un anticuerpo "biológicamente activo" o "funcional" es uno que puede ejercer una o más de sus actividades naturales en acontecimientos estructurales, reguladores, bioquímicos o biofísicos. Por ejemplo, un anticuerpo biológicamente activo puede tener la capacidad de unirse específicamente a un antígeno y la unión, a su vez, puede provocar o alterar un acontecimiento celular o molecular, tal como la transducción de señales o actividad enzimática. Un anticuerpo biológicamente activo también puede bloquear la activación del ligando de un receptor o actuar como un anticuerpo agonista. La capacidad de un anticuerpo de ejercer una o más de sus actividades naturales depende de varios factores, incluyendo el plegamiento y ensamblaje apropiados de las cadenas polipeptídicas.

Composiciones de la invención y procedimientos que usan las mismas

En el presente documento se proporcionan procedimientos que usan péptidos señal y péptidos señal variantes, adecuados, por ejemplo, para procedimientos de producción de polipéptidos heterólogos (por ejemplo, anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa). En la técnica son conocidos procedimientos para caracterizar péptidos señal. En un esquema, los péptidos señal se componen comúnmente de tres regiones distintas: una región N terminal que contiene 1 o 2 residuos de aminoácido cargados positivamente, una región central hidrófoba denominada, a menudo, región H (también denominada dominio H) y una región C terminal reconocida por la peptidasa señal. En algunos aspectos de la divulgación, la región H tiene una longitud de aproximadamente 10-16 residuos. La hidrofobia del péptido señal se puede calcular usando la escala de Eisenberg. Véase Eisenberg, D. et al, J Mol Biol (1984) 179:125-142. En resumen, a cada aminoácido se le asigna un valor de hidrofobia consenso normalizado (véase Eisenberg, et al. supra en la tabla I (página 126). La hidrofobia suma (también denominada hidrofobia total) se calcula sumando el valor de hidrofobia consenso para cada aminoácido del péptido señal (o, por ejemplo, para calcular el valor de hidrofobia total para la región H, el valor de hidrofobia consenso para cada amino se añade ácido en la región H). Se calcula la hidrofobia promedio usando la siguiente fórmula: hidrofobia promedio = hidrofobia (suma) total / número de aminoácidos. En algunos modos de realización, se calcula la hidrofobia promedio de todo el péptido señal. En algunos modos de realización, se calcula la hidrofobia promedio de la región H (también denominada dominio H).

La mutación de la secuencia del péptido señal se puede realizar usando procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido (1991), e incluyen mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis con casete y mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Otros procedimientos para la mutagénesis incluyen mutagénesis dirigida a sitio QuickChange y PCR de extensión por solapamiento.

En otro aspecto, se proporciona el uso del péptido señal con hidrofobia promedio (por ejemplo, hidrofobia promedio de la región H, o hidrofobia promedio de todo el péptido señal) mayor que el péptido señal DsbA, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos de la invención, por ejemplo, preparar un polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo), secretar un polipéptido heterólogo de una célula, preparar un polipéptido heterólogo soluble, secretar en el periplasma un polipéptido heterólogo soluble, preparar un polipéptido heterólogo maduro, secretar en el periplasma un polipéptido heterólogo maduro, translocar un polipéptido heterólogo, optimizar la secreción de un polipéptido heterólogo. Los péptidos señal ejemplares que tienen una hidrofobia promedio mayor que DsbA incluyen: FlgI, NikA, AsmA, TolB, YraI, FecB, CemH, TreA, FocC, TraU, SfmL, TorT, SfmC.

En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del primer péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del primer péptido señal es mayor de aproximadamente 0,6. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del primer péptido señal es mayor de aproximadamente 0,7. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del primer péptido señal es mayor de aproximadamente 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,6, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,7 o mayor. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,6. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,7. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,52, 0,53, 0,54, 0,55, 0,56, 0,57, 0,58, 0,59, 0,6, 0,61, 0,62, 0,63, 0,64, 0,65, 0,66, 0,67, 0,68, 0,69, 0,7 o mayor. En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio de los primer y segundo péptidos señal es similar (por ejemplo, aproximadamente equivalente). En algunos modos de realización, la hidrofobia promedio de los primer y segundo péptidos señal es diferente.

Los péptidos señal DsbA y STII son bien conocidos en la técnica. La secuencia de los péptidos señal DsbA y STII se muestra en las tablas 7 y 8. Las secuencias de la región N terminal, la región H y la región C terminal de DsbA y STII se muestran en las tablas 7 y 8.

Los procedimientos para caracterizar la producción y secreción de polipéptidos heterólogos son conocidos en la técnica y algunos procedimientos se describen y ejemplifican en el presente documento. Por ejemplo, se cultiva una cepa huésped que alberga un vector(es) de expresión que codifica(n) péptidos señal variantes enlazados de forma funcional a una proteína heteróloga (por ejemplo, anticuerpo) y se extrae el polipéptido. La fracción soluble se separa por electroforesis SDS-PAGE no reductora seguido de análisis de inmunoelectrotransferencia para determinar el nivel de proteína heteróloga de longitud completa que se produce. La presencia de ausencia o nivel de polipéptido maduro frente a precursor se puede determinar, por ejemplo, por secuenciación de Edman de proteína aislada de bandas en el gel de inmunoelectrotransferencia y caracterización del polipéptido aislado como que posee o carece de un péptido señal, como es bien conocido en la técnica. Se puede determinar la producción de anticuerpo completo (o por ejemplo, otras proteínas heteromultiméricas) ejecutando la inmunoelectrotransferencia en condiciones desnaturalizantes. La actividad del polipéptido heterólogo (por ejemplo, anticuerpo) se puede determinar usando ensayos funcionales rutinarios, como son bien conocidos en la técnica. La función de la proteína se puede determinar usando un ensayo funcional adecuado. Por ejemplo, la actividad de unión se puede someter a prueba usando ELISA, Biacore y otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Se pueden someter a prueba otras funciones usando ensayos bien conocidos en la técnica según sea apropiado para el polipéptido heterólogo específico.

La región de iniciación traduccional (TIR) es un determinante principal del nivel traduccional global de una proteína. La TIR incluye el polinucleótido que codifica la secuencia señal, y se extiende de inmediatamente en dirección 5' de la secuencia Shine-Dalgarno a aproximadamente veinte nucleótidos en dirección 3' del codón de iniciación. Las modificaciones de esta secuencia de polinucleótido (en algunos modos de realización, la modificación dentro de los primeros aproximadamente 2 a aproximadamente 14, aproximadamente 4 a 12, aproximadamente 6 codones de la secuencia que codifica el péptido señal) pueden alterar la eficacia de la iniciación traduccional, ajustando, de este modo, el nivel de traducción de la proteína en dirección 3'. Las TIR tienen diferentes fuerzas traduccionales. En algunos modos de realización, las primera y segunda regiones de iniciación traduccional (enlazadas de forma funcional, por ejemplo, a un primer y segundo polipéptido heterólogo) (y, en algún modo de realización, la tercera región de iniciación traduccional, enlazada de forma funcional, por ejemplo, a un tercer polipéptido heterólogo) proporcionan aproximadamente fuerzas traduccionales iguales. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa es de aproximadamente uno o dos. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa es de aproximadamente uno. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa es de aproximadamente dos. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa es de uno y/o dos. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa es de aproximadamente tres o aproximadamente cuatro. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa se selecciona de una o más de uno, dos, tres, cuatro, cinco o más (tal como seis o siete o más). En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de la primera y segunda TIR es de aproximadamente uno. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa (también denominada fuerza de TIR) de la primera y segunda TIR es de aproximadamente dos. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de la primera, segunda y tercera TIR es de aproximadamente uno. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de la primera, segunda y tercera TIR es de aproximadamente dos. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa es de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o más, tal como de aproximadamente 8, aproximadamente 9 o más. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa está entre 1 y 3, entre 2 y 4, entre 3 y 5, entre 4 y 6, entre 5 y 7 o entre 6 y 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa está entre 2 y 5, entre 3 y 7, o entre 4 y 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del primer y/o segundo péptido señal es de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7 o aproximadamente 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa del primer péptido señal es de aproximadamente 5 y la fuerza de traducción relativa de la segunda secuencia señal es de aproximadamente 8. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de una primera y segunda TIR es aproximadamente equivalente. En algunos modos de realización, la fuerza de traducción relativa de una primera y segunda TIR es diferente.

En algunos modos de realización, se proporcionará un polinucleótido que codifica un péptido señal (tal como un péptido señal variante) en un vector con elementos apropiados para la expresión de un gen de interés. En algunos modos de realización, el vector comprende un promotor en 5' con respecto a la secuencia señal, un sitio de reconocimiento de enzima de restricción en 3' con respecto a la secuencia señal para la inserción de un gen de interés o un gen indicador, y un marcador seleccionable, tal como un marcador de resistencia a fármacos, para la selección y/o mantenimiento de bacterias transformadas con los plásmidos resultantes. Se analizan y ejemplifican además vectores plasmídicos en el presente documento. Son conocidos en la técnica promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos y algunos se ejemplifican y describen en el presente documento.

Se puede usar cualquier gen indicador que se pueda cuantificar de alguna manera. Por tanto, por ejemplo, la producción de fosfatasa alcalina se puede cuantificar como una medida del nivel secretado del producto del gen phoA. Otros ejemplos incluyen, por ejemplo, el gen de p-lactamasa.

El nivel secretado de polipéptidos se puede determinar, por ejemplo, por un ensayo funcional para determinar el polipéptido de interés, si está disponible, radioinmunoanálisis (RIA), inmunoadsorción enzimática (ELISA) o por PAGE y visualización del peso molecular correcto del polipéptido de interés. Son conocidos en la técnica procedimientos para determinar el nivel de polipéptido secretado y algunos se ejemplifican en el presente documento.

Polipéptidos

Los polipéptidos heterólogos ejemplares incluyen una molécula transmembranaria (por ejemplo, un receptor, tal como una tirosina cinasa receptora) o un ligando, tal como un factor de crecimiento. Los polipéptidos heterólogos ejemplares incluyen moléculas tales como renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; hormona liberadora de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, tromboplastina tisular (TT) y factor de Von Willebrand; factores anticoagulación, tales como proteína C; péptido natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador del plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (regulada por activación, expresada y secretada por linfocitos T normales); proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa) humana; una seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; hormona antimülleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropinas de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoideos; un factor neurotrófico, tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5 o 6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento y transformación (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CDl9, CD20 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón, tal como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de linfocitos T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del VIH; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor, tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

Se contemplan expresamente inmunoadhesinas como polipéptidos heterólogos de acuerdo con la invención.

Anticuerpos

Las dianas ejemplares para anticuerpos o polipéptidos heteromultiméricos o polipéptidos o inmunoadhesinas incluyen, pero no se limitan a, la siguiente lista: b Mp I, BMP2, BMP3B (GDFIO), b Mp4, BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF1 1, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), IL1A, IL1 B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL1 1, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, I L16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, I L29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (ligando para OX40), TNFSF5 (ligando para CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando para CD27), TNFSF8 (ligando para CD30), TNFSF9 (ligando para 4-1 BB), TNFSFIO (TRAIL), TNFSF1 I (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, IL1 R2, IL1 RL1, IL1 RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL1 1 RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21 R, IL22R, IL1 HY1, IL1 RAP, IL1 RAPL1, IL1 RAPL2, IL1 RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (leptina), PTN, THPO, CCLI (I-309), CCL2 (MCP -1/MCAF), CCL3 (MIP-la), CCL4 (MIP-lb), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCLH (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC/exodus-2), CCL22 (MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL1 1 (I-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-lb), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCR1 (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/C KR-L3/STRL22/D RY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TERI/CKR-LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), XCRI (GPR5/CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2, VHL, ABCFI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; Aggrecan; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (a-glucoproteína de cinc); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAH; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (plectina); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTI; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6/JAB61); CCLI (1 -309); CCLII (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-ld); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC/STC-I); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-la); CCL4 (MDP-lb); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IRB/RA);CCR3 (CKR3/CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7 (CKR7/EBII); CCR8 (CMKBR8/TERI/CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD200; CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDHI (E-cadherina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Wapl/Cipl); CDKNIB (p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; quitinasa; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (claudina-7); CLN3; CLU (clusterina); CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1; COLIAI; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNBI (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP-10); CXCLII (1-TAC/IP-9); CXCLI2 (SDFI); CXCLI3; CXCL14; CXCL16; CXCL2, (GR02); CXCL3 (GR03); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451 J01 18; DNCLI; DPP4; E2F1; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; EN01; EN02; EN03; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLTI; FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GAT A3; GDF5; GFI 1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (gelsolina); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamina y receptores de histamina; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNgamma; DFNWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; MORA; IL10RB; IL1 1; IL1 1 RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1 B; ILIF10; IL1 F5; IL1 F6; IL1 F7; IL1 F8; IL1 F9; IL1 HYI; IL1 R1; IL1 R2; IL1 RAP; IL1 RAPL1; IL1 RAPL2; IL1 RL1; IL1 RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21 R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glucoproteína 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ETGAI; ITGA2; ITGA3; ETGA6 (a6 integrina); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 integrina); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAN; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (queratina 19); k Rt 2A; KHTHB6 (queratina H de tipo específica de cabello); LAMAS; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG o Omgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; midkina; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectina-lll); MTSSI; MUCI (mucina); MYC; MYD88; NCK2; neurocán; NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1 D2; NR1 H2; NR1 H3; NR1 H4; NR1 I2; NR1 I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacán; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROB02; S100A2; SCGB1 D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mamoglobina 2); SCGB2A2 (mamoglobina 1); SCYEI (citocina activadora de monocitos endoteliales); SDF2; SERPINAI; SERPiNa 3; SERP1 NB5 (maspina); SERPINEI (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondina-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; tromboplastina tisular; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSFI5 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligando para OX40); TNFSF5 (ligando para CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligando para CD27); TNFSF8 (ligando para CD30); TNFSF9 (ligando para 4-1 BB); TOLLIP; receptores de tipo Toll; TOP2A (topoisomerasa Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicán; VHL C5; VLA-4; XCLI (linfotactina); XCL2 (SCM-lb); XCRI(GPR5/CCXCRI); YYI; y ZFPM2.

En algunos aspectos de la divulgación, las dianas incluyen proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34; CD64, miembros CD200 de la familia de receptores ErbB, tales como el receptor para EGF, receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular, tales como LFA-1, Mad, p150.95, VLA-4, ICAM-1, Vc A m , integrina alfa4/beta7 e integrina alfav/beta3, incluyendo las subunidades alfa o bien beta de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CD1 1 a, anti-CD18 o anti-CD1 1 b); factores de crecimiento, tales como VEGF-A, VEGF-C; tromboplastina tisular (TT); interferón alfa (alfalFN); TNFalfa, una interleucina, tal como IL-1 beta, IL-3, IL-4, IL-5,1L-8,1L-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13Ralfal, IL13Ralfa2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; RANKL, RANK, proteína F de RSV, proteína C, etc., proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP)-l o LRP-8 o receptor de transferrina, y al menos una diana seleccionada del grupo que consiste en 1) beta-secretasa (BACE1 o BACE2), 2) alfa-secretasa, 3) gamma-secretasa, 4) tau-secretasa, 5) proteína precursora amiloide (APP), 6) receptor de muerte 6 (DR6), 7) péptido beta amiloidea, 8) alfa-sinucleína, 9) parkina, 10) huntingtina, 11) p75 NTR y 12) caspasa-6.

Se entiende que el anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, anticuerpo biespecífico) se puede unir a al menos dos moléculas diana, por ejemplo, al menos dos moléculas diana seleccionadas del grupo que consiste en: IL-1 alfa e IL-1 beta, IL-12 e IL-18; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1 beta; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MEF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-12 y TWEAK, IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8, IL-13 y PED2, IL17A e IL17L, CD3 y CD19, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD 19 y CD20; CD20 y CD3; CD38 y CD 138; CD38 y CD20; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD-8 e IL-6; CD20 y BR3, TNFalfa y TGF-beta, TNFalfa e IL-1 beta; TNFalfa e IL-2, TNF alfa e IL-3, TNFalfa e IL-4, TNFalfa e IL-5, TNFalfa e IL6, TNFalfa e IL8, TNFalfa e IL-9, TNFalfa e IL-10, TNFalfa e IL-1 1, TNFalfa e IL-12, TNFalfa e IL-13, TNFalfa e IL-14, TNFalfa e IL-15, TNFalfa e IL-16, TNFalfa e IL-17, TNFalfa e IL-18, TNFalfa e IL-19, TNFalfa e IL-20, TNFalfa e IL-23, TNFalfa e IFNalfa, TNFalfa y CD4, TNFalfa y VEGF, TNFalfa y MIF, TNFalfa e ICAM-1, TNFalfa y PGE4, TNFalfa y PEG2, TNFalfa y ligando para RANK. TNFalfa y Te38; TNFalfa y BAFF; TNFalfa y CD22; TNFalfa y CTLA-4; TNFalfa y GP130; TNFa e IL-12p40; VEGF y HER2, VEGF-A y HER2, VEGF-A y PDGF, HER1 y HER2, VEGF-A y VEGF-C, VEGF-C y VEGF-D, HER2 y DR5,VEGF e IL-8, VEGF y MET, VEGFR y receptor de MET, VEGFR y EGFR, HER2 y CD64, HER2 y CD3, HER2 y CD 16, HER2 y HER3; EGFR(HERI) y HER2, EGFR y HER3, EGFR y HER4, IL-13 y CD40L, IL4 y CD40L, TNFR1 e IL-1 R, TNFR1 e IL-6R y TNFR1 e IL-18R, EpCAM y CD3, MAPG y CD28, EGFR y CD64, CSPGs y RGM A; CTLA-4 y BTN02; IGF1 e IGF2; IGF1/2 y Erb2B; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-I y CTLA-4; y RGM A y RGM B.

En algunos aspectos de la divulgación, la diana es anticuerpos anti-VEGF, anti-c-met, anti-IgE, anti-CD11, anti-CD 18, anti-CD40, anti tromboplastina tisular (TT), anti-HER2 y anti-TrkC. También se contemplan anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos glucolípidicos asociados a tumor). Las dianas ejemplares adicionales para los anticuerpos englobados por la presente invención incluyen proteínas CD, tales como CD3, CD4, CD8, Cd 19, CD20, CD22, CD34, CD46; miembros de la familia de receptores ErbB, tales como el receptor para EGF, receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular, tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina a4/p7 e integrina av/p3, incluyendo las subunidades a o bien p de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento, tales como VEGF; tromboplastina tisular (TT); TGF-p; interferón alfa (a-IFN); una interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor de muerte, Apo2; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor de mpl; CTFA-4; proteína C, etc. Los anticuerpos biespecíficos se contemplan expresamente por la invención.

En un aspecto de la invención, el/los anticuerpo(s), por ejemplo, el/los anticuerpo(s) usado(s) en los procedimientos en el presente documento pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1-6 a continuación:

1. Fragmentos de anticuerpo

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv y scFv, un anticuerpo de un brazo y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); véanse también el documento WO 93/16185; y las patentes de Ee . UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión a receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1).

Se divulgan anticuerpos de un brazo (es decir, el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera forman un único brazo de unión a antígeno), por ejemplo, en el documento WO2005/063816; Martens et al, Clin Cancer Res (2006), 12: 6144. Para el tratamiento de afecciones patológicas que requieren una función antagonista, y si la bivalencia de un anticuerpo da como resultado un efecto agonista no deseable, el rasgo monovalente de un anticuerpo de un brazo (es decir, un anticuerpo que comprende un único brazo de unión a antígeno) da como resultado y/o garantiza una función antagonista tras la unión del anticuerpo a una molécula diana. Además, el anticuerpo de un brazo que comprende una región Fc se caracteriza por atributos farmacocinéticos superiores (tales como una semivida potenciada y/o tasa de aclaramiento reducida in vivo) en comparación con formas de Fab que tienen características de unión a antígeno similares/sustancialmente idénticas, lo que supera, por tanto, una desventaja principal en el uso de anticuerpos Fab monovalentes convencionales. Las técnicas para preparar anticuerpos de un brazo incluyen, pero no se limitan a, genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 5.731.168). Onartuzumab es un ejemplo de anticuerpo de un brazo.

Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

2. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinado aspecto de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 4.816.567 y en Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 81:68516855 (1984). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con clase cambiada" en el que se ha cambiado la clase o subclase de la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinado aspecto de la divulgación, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenicidad con respecto a los seres humanos, mientras que se retienen la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o porciones de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante humana. En algunos aspectos de la divulgación, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791,6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen el "barajado de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la estirpe germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

3. Anticuerpos humanos

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen, en general, anticuerpos humanos van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005).

Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584, que describen la tecnología XENOMOUSETM; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429, que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®. Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas de células de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology y Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185­ 91 (2005).

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias del dominio variable del clon de Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de seres humanos. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias del dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

4. Anticuerpos derivados de colecciones

Se pueden aislar los anticuerpos de la invención cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, es conocida en la técnica una variedad de procedimientos para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, n J, 2001) y se describen además, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624­ 628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que, a continuación, se pueden cribar para determinar el fago de unión a antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contengan secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente de EE. UU. n.° 5.750.373 y las publicaciones de patente de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

5. Anticuerpos multiespecíficos

En determinado aspecto de la divulgación, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados aspectos de la divulgación, una de las especificidades de unión es para c-met y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes de c-met. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan c-met. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tengan diferentes especificidades (véanse Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983), el documento WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y la genomanipulación por "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas en Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.676.980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

En el presente documento también se incluyen anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a c-met, así como a otro antígeno diferente, tal como EGFR (véase, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

Son conocidos en la técnica procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesadacadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, lo que normalmente se hace por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 publicado el 13 de mayo de 1993 y Traunecker et al., EMBO J , 10: 3655 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente y más preferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferente tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones con la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en aspectos de la divulgación cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de particular importancia.

En un aspecto preferente de la divulgación de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera de separación fácil. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para otros detalles de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede genomanipular para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferente comprende al menos una parte del dominio C^h3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, se reemplazan una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) (botones o protuberancias). Se crean "cavidades" compensatorias (ojales) de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros. Se describen además botones y ojales en el presente documento.

6. Variantes de anticuerpo

En determinados aspectos de la divulgación, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

En determinados aspectos de la divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) con respecto al anticuerpo original y/o habrán retenido sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, la afinidad de unión).

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amínico y/o carboxílico que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incremente la semivida en suero del anticuerpo.

En determinados aspectos de la divulgación, se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se cree o retire uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se fija, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio c H2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos aspectos de la divulgación, se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa fijada (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa en la cadena glucídica en Asn297, con respecto a la suma de todas las glucoestructuras fijadas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2008/077546. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos en dirección 5' o en dirección 3' de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. n.os US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec 13 CHO carentes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); la sol. de pat. de EE. UU. n.° US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente en el ejemplo 11) y líneas celulares con genes inactivados, tales como el gen alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes inactivados (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y el documento WO2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpo con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario fijado a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); la patente de EE. UU. n.° 6.602.684 (Umana et al.); y el documento US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido fijado a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

En determinados aspectos de la divulgación, se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando, de este modo, una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprenda una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.

En determinados aspectos de la divulgación, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que le convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo sea importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) sean innecesarias o perjudiciales.

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 con alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. (Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.737.056; el documento WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)

En determinado aspecto de la divulgación, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración EU de los residuos).

En algunos aspectos de la divulgación, se realizan alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, mejoradas o bien disminuidas), por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.194.551, el documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

En el documento US2005/0014934A1 (Hinton et al.) se describen anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (patente de EE. UU. n.° 7.371.826).

Véanse también Duncan y Winter, Nature 322:738-40 (1988); la patente de EE. UU. n.° 5.648.260; la patente de EE. UU. n.° 5.624.821; y el documento WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fc.

En determinados aspectos de la divulgación, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En aspectos particulares de la divulgación, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados aspectos de la divulgación, se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Se pueden generar anticuerpos genomanipulados con cisteína como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. Uu . n.° 7.521.541.

Botones en ojales

El uso de botones en ojales como procedimiento de producción de anticuerpos multiespecíficos y/o anticuerpos de un brazo y/o inmunoadhesinas es bien conocido en la técnica. Véanse la pat. de EE. UU. n.° 5.731.168 concedida el 24 de marzo de 1998 cedida a Genentech, pub. PCT n.° WO2009089004, publicada el 16 de julio de 2009 y cedida a Amgen, y pub. de pat. de EE. UU. n.° 20090182127, publicada el 16 de julio de 2009 y cedida a Novo Nordisk A/S. Véanse también Marvin y Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6):649-658 y Kontermann (2005) Acta Pharacol. Sin., 26:1-9. Aquí se proporciona un breve análisis.

Una "protuberancia" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que sobresale de la interfase de un primer polipéptido y es, por lo tanto, posicionable en una cavidad compensatoria en la interfase contigua (es decir, la interfase de un segundo polipéptido) para estabilizar el heteromultímero y, de este modo, favorecer la formación de heteromultímeros sobre la formación de homomultímeros, por ejemplo. La protuberancia puede existir en la interfase original o se puede introducir sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfase). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfase del primer polipéptido se altera para codificar la protuberancia. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfase del primer polipéptido se reemplaza por el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "de importación" que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo de aminoácido original. Se apreciará que puede existir más de un residuo original y residuo de importación correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfase del primer polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos residuos de aminoácido se muestran en la siguiente tabla.

Tabla B

Propiedades de residuos de aminoácido

a. Peso molecular del aminoácido menos el del agua. Valores de Handbook of Chemistry and Physics, 43.a ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.

b Valores de A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972.

c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975. El área de superficie accesible se define en las figuras 6-20 de esta referencia.

Los residuos de importación preferentes para la formación de una protuberancia, en general, son residuos de aminoácido naturales y se seleccionan preferentemente de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Los más preferentes son triptófano y tirosina. En un aspecto de la divulgación, el residuo original para la formación de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares en el dominio CH3 para formar la protuberancia incluyen, sin limitación, la sustitución T366W.

Una "cavidad" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que está ahuecada desde la interfase de un segundo polipéptido y, por lo tanto, aloja una protuberancia correspondiente en la interfase contigua de un primer polipéptido. La cavidad puede existir en la interfase original o se puede introducir sintéticamente (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica la interfase). Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfase del segundo polipéptido se altera para codificar la cavidad. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfase del segundo polipéptido se reemplaza por el ADN que codifica al menos un residuo de aminoácido "de importación" que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo de aminoácido original. Se apreciará que puede existir más de un residuo original y residuo de importación correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfase del segundo polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos residuos de aminoácido se muestran en la tabla B anterior. Los residuos de importación preferentes para la formación de una cavidad normalmente son residuos de aminoácido naturales y se seleccionan preferentemente de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). Los más preferentes son serina, alanina o treonina. En un aspecto de la divulgación, el residuo original para la formación de la cavidad tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares en el dominio CH3 para generar la cavidad incluyen, sin limitación, las sustituciones T366S, L368A e Y407A.

Un residuo de aminoácido "original" es uno que se reemplaza por un residuo "de importación" que puede tener un volumen de cadena lateral más pequeño o más grande que el residuo original. El residuo de aminoácido de importación puede ser un residuo de aminoácido natural o no natural, pero preferentemente es el primero. Los residuos de aminoácido naturales son los residuos codificados por el código genético y enumerados en la tabla B anterior. Por residuo de aminoácido "no natural" se quiere decir un residuo que no se codifica por el código genético, pero que puede unir de forma covalente residuo(s) de aminoácido contiguo(s) en la cadena polipeptídica. Los ejemplos de residuos de aminoácido no naturales son norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácido, tales como los descritos en Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991), por ejemplo. Para generar dichos residuos de aminoácido no naturales, se pueden usar los procedimientos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) y Ellman et al., supra. En resumen, esto implica activar químicamente un ARNt supresor con un residuo de aminoácido no natural seguido de transcripción y traducción in vitro del ARN. El procedimiento de la presente invención implica reemplazar al menos un residuo de aminoácido original, pero se puede reemplazar más de un residuo original. Normalmente, no más de los residuos totales en la interfase del primer o segundo polipéptido comprenderán residuos de aminoácido originales que se reemplazan. Típicamente, los residuos originales para el reemplazo están "enterrados". Por "enterrado" se quiere decir que el residuo es esencialmente inaccesible para el disolvente. En general, el residuo de importación no es cisteína para prevenir la posible oxidación o emparejamiento erróneo de los enlaces disulfuro.

La protuberancia es "posicionable" en la cavidad, lo que quiere decir que la localización espacial de la protuberancia y cavidad en la interfase de un primer polipéptido y segundo polipéptido respectivamente y los tamaños de la protuberancia y cavidad son tales que la protuberancia se puede localizar en la cavidad sin perturbar significativamente la asociación normal de los primer y segundo polipéptidos en la interfase. Puesto que las protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp típicamente no se extienden perpendicularmente del eje de la interfase y tienen conformaciones preferentes, la alineación de una protuberancia con una cavidad correspondiente se basa en la modelación del par protuberancia/cavidad en base a una estructura tridimensional, tal como la obtenida por cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (RMN). Esto se puede lograr usando técnicas ampliamente aceptadas en la técnica.

Por "ácido nucleico original o molde" se quiere decir el ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés que se puede "alterar" (es decir, genomanipular o mutar) para codificar una protuberancia o cavidad. El ácido nucleico original o de partida puede ser un ácido nucleico natural o puede comprender un ácido nucleico que se haya sometido a alteración anterior (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el ácido nucleico se quiere decir que el ácido nucleico original se muta insertando, delecionando o reemplazando al menos un codón que codifica un residuo de aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo original se reemplaza por un codón que codifica un residuo de importación. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido (1991), e incluyen mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis con casete y mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Al mutar un ácido nucleico original/molde, se altera, por tanto, de forma correspondiente un polipéptido original/molde codificado por el ácido nucleico original/molde.

La protuberancia o cavidad se puede "introducir" en la interfase de un primer o segundo polipéptido por medios sintéticos, por ejemplo, por técnicas recombinantes, síntesis peptídica in vitro, las técnicas para introducir residuos de aminoácido no naturales previamente descritos, por acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas. En consecuencia, la protuberancia o cavidad que se "introduce" es "no natural", lo que quiere decir que no existe en la naturaleza o en el polipéptido original (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado).

En general, el residuo de aminoácido de importación para formar la protuberancia tiene un número relativamente pequeño de "rotámeros" (por ejemplo, aproximadamente 3-6). Un "rotámero" es una conformación energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácido. El número de rotámeros de los diversos residuos de aminoácido se revisa en Ponders y Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).

En un aspecto de la divulgación, un primer polipéptido con Fc y un segundo polipéptido con Fc se encuentran/interactúan en una interfase. En algunos aspectos de la divulgación en los que el primer y segundo polipéptido con Fc se encuentran en una interfase, la interfase del segundo polipéptido con Fc (secuencia) comprende una protuberancia (también denominada "botón") que es posicionable en una cavidad (también denominada "ojal") en la interfase del primer polipéptido con Fc (secuencia). En un aspecto de la divulgación, el primer polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la cavidad o el segundo polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la protuberancia, o ambos. En un aspecto de la divulgación, el primer polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la cavidad y el segundo polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la protuberancia. En un aspecto de la divulgación, la interfase del segundo polipéptido con Fc comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfase del primer polipéptido con Fc, en la que la cavidad o protuberancia, o ambas, se han introducido en la interfase de los primer y segundo polipéptidos con Fc, respectivamente. En algunos aspectos de la divulgación en los que los primer y segundo polipéptidos con Fc se encuentran en una interfase, la interfase del primer polipéptido con Fc (secuencia) comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfase del segundo polipéptido con Fc (secuencia). En un aspecto de la divulgación, el segundo polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la cavidad o el primer polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la protuberancia, o ambos. En un aspecto de la divulgación, el segundo polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la cavidad y el primer polipéptido con Fc se ha alterado a partir de un polipéptido molde/original para codificar la protuberancia. En un aspecto de la divulgación, la interfase del primer polipéptido con Fc comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfase del segundo polipéptido con Fc, en la que la protuberancia o cavidad, o ambas, se han introducido en la interfase de los primer y segundo polipéptidos con Fc, respectivamente.

En un aspecto de la divulgación, la protuberancia y la cavidad comprenden cada una un residuo de aminoácido natural. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende la protuberancia se genera reemplazando un residuo original de la interfase de un polipéptido molde/original por un residuo de importación que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo original. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende la protuberancia se genera por un procedimiento que comprende una etapa en la que el polinucleótido que codifica un residuo original de la interfase de dicho polipéptido se reemplaza por un polinucleótido que codifica un residuo de importación que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el original. En un aspecto de la divulgación, el residuo original es treonina. En un aspecto de la divulgación, el residuo original es T366. En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es arginina (R). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es fenilalanina (F). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es tirosina (Y). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es triptófano (W). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es R, F, Y o W. En un aspecto de la divulgación, se genera una protuberancia reemplazando dos o más residuos en un polipéptido molde/original. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una protuberancia comprende el reemplazo de treonina en la posición 366 por triptófano, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración EU de Kabat et al. (pp. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5.a ed., vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, MD)).

En algunos aspectos de la divulgación, se genera el polipéptido con Fc que comprende una cavidad reemplazando un residuo original en la interfase de un polipéptido molde/original por un residuo de importación que tenga un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo original. Por ejemplo, se puede generar el polipéptido con Fc que comprende la cavidad por un procedimiento que comprende una etapa en la que el polinucleótido que codifica un residuo original de la interfase de dicho polipéptido se reemplaza por un polinucleótido que codifica un residuo de importación que tenga un volumen de cadena lateral más pequeño que el original. En un aspecto de la divulgación, el residuo original es treonina. En un aspecto de la divulgación, el residuo original es tirosina. En un aspecto de la divulgación, el residuo original es tirosina. En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación no es cisteína (C). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es alanina (A). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es serina (S). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es treonina (T). En un aspecto de la divulgación, el residuo de importación es valina (V). Se puede generar una cavidad reemplazando uno o más residuos originales de un polipéptido molde/original. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende el reemplazo de dos o más aminoácidos originales seleccionados del grupo que consiste en treonina, leucina y tirosina. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende dos o más residuos de importación seleccionados del grupo que consiste en alanina, serina, treonina y valina. En algunos aspectos de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende el reemplazo de dos o más aminoácidos originales seleccionados del grupo que consiste en treonina, leucina y tirosina, y en el que dichos aminoácidos originales se reemplazan por residuos de importación seleccionados del grupo que consiste en alanina, serina, treonina y valina. En algunos aspectos de la divulgación, un aminoácido original que se reemplaza es T366, L368 y/o Y407. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende el reemplazo de treonina en la posición 366 por serina, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración EU de Kabat et al. supra. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende el reemplazo de leucina en la posición 368 por alanina, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración EU de Kabat et al. supra. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende el reemplazo de tirosina en la posición 407 por valina, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración EU de Kabat et al. supra. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido con Fc que comprende una cavidad comprende dos o más reemplazos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en T366S, L368A e Y407V, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración EU de Kabat et al. supra. En algunos aspectos de la divulgación de estos fragmentos de anticuerpo, el polipéptido con Fc que comprende la protuberancia comprende el reemplazo de treonina en la posición 366 por triptófano, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración EU de Kabat et al. supra.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo comprende mutaciones en Fc que constituyen "botones" y "ojales" como se describe en el documento WO2005/063816. Por ejemplo, una mutación en ojal puede ser una o más de T366A, L368A y/o Y407V en un polipéptido con Fc, y una mutación en botón puede ser T366W.

En determinados aspectos de la divulgación, se puede modificar además un anticuerpo proporcionado en el presente documento para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)/polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la preparación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar, y, si se fija más de un polímero, pueden ser las mismas moléculas o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones, que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, independientemente de si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro aspecto de la divulgación, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a la radiación. En un aspecto de la divulgación, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células normales, pero que calientan el resto no proteínico a una temperatura en la que se destruyen las células proximales al anticuerpo-resto no proteínico.

En un aspecto de la divulgación, el medicamento es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo (tal como un anticuerpo frente a c-met) conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.

En un aspecto de la divulgación, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (CAF) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitarse a, un maitansinoide (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0425235 B1); una auristatina, tal como los restos de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.635.483 y 5.780.588 y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina, tal como daunomicina o doxorrubicina (véanse Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:15291532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente de EE. UU. n.° 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otro aspecto de la divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charanda, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otro aspecto de la divulgación, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Está disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, tc99m o I123, o un marcador de espín para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123, de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Se pueden preparar conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al, Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente de EE. UU. n.° 5.208.020).

Los inmunoconjugados o CAF en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

Vectores, células huésped y procedimientos recombinantes

Para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un anticuerpo), el ácido nucleico que lo codifica se aísla e inserta en un vector replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que se puedan unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. La elección del vector depende, en parte, de la célula huésped que se va a usar. En general, las células huésped preferentes son de cualquier origen procariótico. Se apreciará que se pueden usar regiones constantes de cualquier isotipo para este propósito, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que dichas regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humana o animal.

a. Generación de anticuerpos usando células huésped procarióticas:

i Construcción del vector

Las secuencias de polinucleótido que codifican componentes polipeptídicos del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) de la divulgación se pueden obtener usando técnicas recombinantes estándar. Se pueden aislar secuencias de polinucleótido deseadas y secuenciar a partir de células productoras de anticuerpos, tales como células de hibridoma. De forma alternativa, se pueden sintetizar polinucleótidos usando un sintetizador de nucleótidos o técnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante que puede replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en huéspedes procarióticos. Se pueden usar muchos vectores que están disponibles y son conocidos en la técnica para el propósito de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos que se van a insertar en el vector y la célula huésped particular que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo, o ambas) y de su compatibilidad con la célula huésped particular en la que reside. Los componentes del vector, en general, incluyen, pero no se limitan a: un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), una secuencia señal, la inserción de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped en conexión con estos huéspedes. Habitualmente, el vector lleva un sitio de replicación, así como secuencias de marcaje que pueden proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli típicamente se transforma usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y, por tanto, proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o modificarse para que contengan, promotores que se pueden usar por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas. Los ejemplos de derivados de pBR322 usados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Carter et al., patente de EE. UU. n.° 5.648.237.

Además, se pueden usar vectores de fago que contengan secuencias de replicón y de control que sean compatibles con el microorganismo huésped como vectores de transformación en conexión con estos huéspedes. Por ejemplo, se puede utilizar un bacteriófago, tal como XGEM.TM.-11 en la preparación de un vector recombinante que se puede usar para transformar células huésped susceptibles, tales como LE392 de E. coli.

El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares promotor-cistrón que codifiquen cada uno de los componentes polipeptídicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida localizada en dirección 5' con respecto a un cistrón que modula su expresión. Típicamente, los promotores procarióticos se encuentran en dos clases, inducibles y constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que inicia niveles de transcripción incrementados del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.

Un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. El promotor seleccionado se puede enlazar de forma funcional a ADN cistrónico que codifica la cadena ligera o pesada retirando el promotor del ADN fuente por medio de digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la invención. Se puede usar tanto la secuencia promotora natural como muchos promotores heterólogos para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunos modos de realización se utilizan promotores heterólogos, ya que, en general, permiten una mayor transcripción y mayores rendimientos del gen diana expresado en comparación con el promotor para el polipéptido diana natural.

Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor de PhoA, los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor de tac o el de trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos) también son adecuados. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, lo que posibilita, de este modo, que un trabajador experto los fije de forma funcional a cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada diana (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) usando conectores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.

La región de iniciación traduccional (TIR) es un determinante principal del nivel traduccional global de una proteína. La TIR incluye el polinucleótido que codifica la secuencia señal, y se extiende de inmediatamente en dirección 5' de la secuencia Shine-Dalgarno a aproximadamente veinte nucleótidos en dirección 3' del codón de iniciación. En general, el vector comprenderá una TIR. Las TIR y TIR variantes son conocidas en la técnica y los procedimientos para generar las TIR son conocidos en la técnica. Se puede crear una serie de variantes de secuencia de ácido nucleico con un intervalo de fuerzas traduccionales, proporcionando, de este modo, un medio conveniente por el que ajustar este factor para la secreción óptima de muchos polipéptidos diferentes. El uso de un gen indicador fusionado a estas variantes, tal como PhoA, proporciona un procedimiento de cuantificación de las fuerzas traduccionales relativas de regiones de iniciación traduccional diferentes. Las TIR variantes o mutantes se pueden proporcionar en el fondo de un vector plasmídico, proporcionando, de este modo, un conjunto de plásmidos en los que se puede insertar un gen de interés y medir su expresión, para establecer un intervalo óptimo de fuerzas traduccionales para la máxima expresión del polipéptido maduro. Se divulgan TIR variantes en el documento USP 8.241.901.

En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el propósito de la presente invención debe ser una que se reconozca y procese (es decir, se escinda por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células huésped procarióticas que no reconocen y procesan las secuencias señal naturales con respecto a los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye con una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de los polipéptidos señal de la presente invención. Además, el vector puede comprender una secuencia señal seleccionada del grupo que consiste en los líderes fosfatasa alcalina, penicilinasa, Lpp o enterotoxina termoestable II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP.

En un aspecto, uno o más polinucleótidos (por ejemplo, vectores de expresión) codifican conjuntamente un anticuerpo. En un modo de realización, un único polinucleótido codifica la cadena ligera de anticuerpo y un polinucleótido separado codifica la cadena pesada de anticuerpo. En un modo de realización, un único polinucleótido codifica la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo. En algunos modos de realización, uno o más polinucleótidos (por ejemplo, vectores de expresión) codifican conjuntamente un anticuerpo de un brazo. En un modo de realización, un único polinucleótido codifica (a) la cadena ligera y pesada del anticuerpo de un brazo, y (b) el polipéptido con Fc. En un modo de realización, un único polinucleótido codifica la cadena ligera y pesada del anticuerpo de un brazo, y un polinucleótido separado codifica el polipéptido con Fc. En un modo de realización, los polinucleótidos separados codifican el componente de cadena ligera del anticuerpo de un brazo, el componente de cadena pesada de anticuerpo de un brazo y el polipéptido con Fc, respectivamente. La producción de un anticuerpo de un brazo se describe, por ejemplo, en el documento WO2005063816.

Las células huésped procarióticas adecuadas para expresar los anticuerpos de la invención incluyen Archaebacteria y Eubacteria, tales como organismos gramnegativas o grampositivos. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), bacilos (por ejemplo, B. subtilis), enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. En un modo de realización, se usan células gramnegativas. En un modo de realización, se usan células de E. coli como huéspedes para la invención. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; n.° 27.325 de depósito ATCC) y derivados de la misma, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 ^A fhuA (^A tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ^A ompT^A (nmpc-fepE) degP41 kanR (pat. de EE. UU. n.° 5.639.635) y las cepas 63C1, 66F8 y 64B4. También son adecuadas otras cepas y derivados de la misma, tales como 294 de E. coli (31.446 de ATCC), B de E. coli, 1776 de E. coliX (31.537 de ATCC) y RV308 de E. coli (ATCC 31.608). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Son conocidos en la técnica procedimientos para construir derivados de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente que tienen genotipos definidos y se describen, por ejemplo, en Bass et al., Proteins, 8:309314 (1990). En general, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, se pueden usar de forma adecuada las especies de E. coli, Serratia o Salmonella como huésped cuando se usan plásmidos bien conocidos, tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar el replicón. Típicamente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas y se pueden incorporar de forma deseable inhibidores de proteasa adicionales en el cultivo celular.

ii Producción de anticuerpos

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Transformación quiere decir introducir ADN en el huésped procariótico de modo que el ADN sea replicable, como un elemento extracromosómico o bien como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio se usa, en general, para células bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro procedimiento para la transformación emplea polietilenglicol/DMSO. Aún otra técnica usada es la electroporación.

Las células procarióticas usadas para producir los polipéptidos de la divulgación se cultivan en medios conocidos en la técnica y adecuados para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo Luria (LB) más los complementos de nutrientes necesarios. En algunos modos de realización, el medio también contienen un agente de selección, elegido en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de células procarióticas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se añade ampicilina a los medios para el cultivo de células que expresan el gen resistente a ampicilina.

También se puede incluir cualquier complemento necesario, además de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico, en concentraciones apropiadas, introducido solo o como una mezcla con otro complemento o medio, tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente, el medio de cultivo puede contener uno o más agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutatión, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.

Las células huésped procarióticas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el cultivo de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferente varía de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, más preferentemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, incluso más preferentemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varíe de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli, el pH es preferentemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4 y más preferentemente de aproximadamente 7,0.

Si se usa un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, se induce la expresión de proteínas en condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, se usan promotores de PhoA para controlar la transcripción de los polipéptidos. En consecuencia, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato para la inducción. Preferentemente, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P. (véase, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147) o los medios descritos en el documento WO2002/061090. Se puede usar una variedad de otros inductores, de acuerdo con la construcción del vector empleada, como es conocido en la técnica.

En un modo de realización, los polipéptidos expresados de la presente divulgación se secretan en y recuperan del periplasma de las células huésped. La recuperación de proteínas típicamente implica romper el microorganismo, en general, por medios tales como choque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que se rompen las células, se pueden retirar los restos celulares o células completas por centrifugación o filtración. Las proteínas se pueden purificar además, por ejemplo, por cromatografía en resina de afinidad. De forma alternativa, las proteínas se pueden transportar en el medio de cultivo y aislar en el mismo. Las células se pueden retirar del cultivo y filtrar y concentrar el sobrenadante de cultivo para la purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados se pueden aislar e identificar además usando procedimientos conocidos comúnmente, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de inmunoelectrotransferencia.

En un aspecto de la invención, la producción de anticuerpos se lleva a cabo en grandes cantidades por un procedimiento de fermentación. Están disponibles diversos procedimientos de fermentación por lote alimentado a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferentemente de aproximadamente 1000 a 100000 litros de capacidad. Estos fermentadores usan impulsores con agitador para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de carbono/energía preferente). La fermentación a pequeña escala se refiere, en general, a la fermentación en un fermentador que no tenga más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, y que pueda variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.

En un procedimiento de fermentación, la inducción de la expresión de proteínas típicamente se inicia después de que las células se hayan cultivado en condiciones adecuadas a una densidad deseada, por ejemplo, una DO550 de aproximadamente 180-220, fase en la que las células se están en la fase estacionaria temprana. Se puede usar una variedad de inductores, de acuerdo con la construcción del vector empleada, como es conocido en la técnica y se describe anteriormente. Las células se pueden cultivar durante periodos más cortos antes de la inducción. Las células se inducen normalmente durante aproximadamente 12-50 horas, aunque se puede usar un tiempo de inducción más largo o más corto.

Para mejorar el rendimiento de producción y la calidad de los polipéptidos de la invención, se pueden modificar diversas condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegamiento apropiados de los polipéptidos anticuerpo secretados, se pueden usar vectores adicionales que sobreexpresen proteínas chaperonas, tales como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilprolil cis,transisomerasa con actividad chaperona) para cotransformar las células procarióticas huésped. Se ha demostrado que las proteínas chaperonas facilitan el plegamiento y la solubilidad apropiados de proteínas heterólogas producidas en células huésped bacterianas. Chen et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou et al., patente de EE. UU. n.° 6.083.715; Georgiou et al., patente de EE. UU. n.° 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm y Pluckthun, (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al., (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210. En algunos modos de realización, DsbA y C se expresan (por ejemplo, se sobreexpresan) en la célula huésped bacteriana. En algunos modos de realización, DsbA, DsbC y FkpA se expresan (por ejemplo, se sobreexpresan) en la célula huésped bacteriana.

Para minimizar la proteólisis de proteínas heterólogas expresadas (especialmente las que son proteolíticamente sensibles), se pueden usar determinadas cepas huésped carentes de enzimas proteolíticas para la presente invención. Por ejemplo, se pueden modificar cepas de células huésped para efectuar una mutación/mutaciones genética(s) en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas, tales como proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, proteasa I, proteasa Mi, proteasa V, proteasa VI y combinaciones de las mismas. Están disponibles algunas cepas carentes de proteasa de E. coli y se describen, por ejemplo, en Joly et al., (1998), supra; Georgiou et al., patente de EE. UU. n.° 5.264.365; Georgiou et al., patente de EE. UU. n.° 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

En un modo de realización, se usan cepas de E. coli carentes de enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas chaperonas y/o FkpA como células huésped en el sistema de expresión de la invención.

iii Purificación de anticuerpos

Se pueden emplear procedimientos de purificación de proteínas estándar conocidos en la técnica. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio y filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

En un aspecto, se usa proteína A inmovilizada en una fase sólida para la purificación por inmunoafinidad de los productos de anticuerpo de la invención. La proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se une con alta afinidad a la región Fc de los anticuerpos. Lindmark et al., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. La fase sólida a la que se inmoviliza la proteína A es preferentemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferentemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento de prevenir la adherencia no específica de contaminantes.

Como primera etapa de purificación, la preparación derivada del cultivo celular como se describe anteriormente se aplica en la fase sólida inmovilizada con proteína A para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la proteína A. A continuación, la fase sólida se lava para retirar los contaminantes unidos no específicamente a la fase sólida. Finalmente, se recupera el anticuerpo de interés de la fase sólida por elución.

La invención también proporciona inmunoconjugados (denominados de manera intercambiable "conjugados anticuerpo-fármaco" o "Ca F") que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterápico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Usos

Se puede usar un polipéptido heterólogo, por ejemplo, para purificar, detectar y seleccionar como diana un polipéptido específico que reconoce, incluyendo tanto procedimientos de diagnóstico como terapéuticos in vitro e in vivo.

En un aspecto, se puede usar un anticuerpo de la invención en inmunoanálisis para medir cualitativa y cuantitativamente antígenos específicos en muestras biológicas. Los procedimientos convencionales para detectar la unión antígeno-anticuerpo incluyen, por ejemplo, un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoanálisis (RIA) o inmunohistoquímica tisular. Muchos procedimientos pueden usar un marcador unido al anticuerpo para propósitos de detección. El marcador usado con el anticuerpo es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con su unión al anticuerpo. Son conocidos numerosos marcadores, incluyendo los radioisótopos 32P, 32S, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (pat. de EE. UU. n.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, lactoperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, radionúclidos de formación de imágenes (tales como tecnecio) y similares.

Están disponibles procedimientos convencionales para unir de forma covalente estos marcadores a los polipéptidos heterólogos. Por ejemplo, se pueden usar agentes de acoplamiento, tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bisimidatos, bencidina bisdiazotizada y similares, para marcar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos anteriormente. Véanse, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 3.940.475 (fluorimetría) y la pat. de EE. UU. n.° 3.645.090 (enzimas); Hunter et al. Nature 144: 945 (1962); David et al. Biochemistry 13:1014-1021 (1974); Pain et al. J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren Histochem. and Cytochem 30:407-412 (1982). Los marcadores preferentes en el presente documento son enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. La conjugación de dicho marcador, incluyendo las enzimas, al polipéptido anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para un experto en técnicas de inmunoanálisis. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," en Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone y H. Van Vunakis, vol. 73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), pp. 147-166. Dichos procedimientos de unión son adecuados para su uso con los polipéptidos heterólogos de la presente invención.

De forma alternativa al marcaje del polipéptido heterólogo, el antígeno se puede someter a ensayo en fluidos biológicos por un inmunoanálisis de competencia utilizando un patrón de antígeno competitivo marcado con una sustancia detectable y un polipéptido heterólogo no marcado. En este ensayo, se combinan la muestra biológica, los patrones de antígeno marcados y el polipéptido heterólogo y se determina la cantidad de patrón de antígeno marcado unido al polipéptido heterólogo no marcado. La cantidad de antígeno sometido a prueba en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de antígeno marcado unido al polipéptido heterólogo.

En un aspecto, un polipéptido heterólogo (tal como un anticuerpo), en particular, es útil para detectar y obtener el perfil de expresiones de antígenos de superficie específicos in vitro o in vivo. Como se analiza anteriormente, en general, un anticuerpo aglucosilado no ejerce funciones efectoras (es decir, actividad ADCC o CDC). Por lo tanto, cuando el anticuerpo se une al antígeno de superficie celular, no inicia acontecimientos citotóxicos no deseables. El antígeno de superficie puede ser específico para un tipo celular o tisular particular, por lo tanto, sirve como marcador del tipo celular o tisular. Preferentemente, el marcador de antígeno de superficie se expresa de forma diferencial en diversas fases de diferenciación de tipos celulares o tisulares particulares. Por tanto, se puede usar el anticuerpo dirigido contra dicho antígeno de superficie para el cribado de poblaciones celulares o tisulares que expresen el marcador. Por ejemplo, se puede usar el anticuerpo para el cribado y aislamiento de células madre, tales como células madre embrionarias, células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimales. El anticuerpo también se puede usar para detectar células tumorales que expresan antígenos de superficie asociados a tumor, tales como receptores c-met, HER2, HER3 o HER4.

Se puede usar un anticuerpo u otro polipéptido heterólogo como agente de purificación por afinidad. En este procedimiento, se inmoviliza el polipéptido en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno que se va a purificar y, después de esto, se lava el soporte con un disolvente adecuado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno que se va a purificar, que está unido al polipéptido inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que liberará el antígeno del polipéptido.

En un aspecto, la divulgación proporciona usos de un polipéptido heterólogo generado usando los procedimientos de la invención, en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno proliferativo celular y/o un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario). El polipéptido heterólogo puede ser de cualquier forma descrita en el presente documento, incluyendo anticuerpo, fragmento de anticuerpo, polipéptido (por ejemplo, un oligopéptido) o una combinación de los mismos. En algunos aspectos de la divulgación, el antígeno es una molécula de proteína humana y el sujeto es un sujeto humano.

Los polipéptidos se pueden usar para diagnosticar, tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones asociados con la expresión y/o actividad anómalas de una o más moléculas de antígeno, incluyendo, pero sin limitarse a, tumores malignos y benignos; neoplasias malignas distintas de leucemia y linfáticas; trastornos neuronales, neurogliales, astrocitales, hipotalámicos y otros glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.

En determinados aspectos de la divulgación, se administra una proteína (por ejemplo, anticuerpo) a un sujeto. En determinados aspectos de la divulgación, se administra un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo a un sujeto. Preferentemente, el inmunoconjugado y/o antígeno al que se une está(n) internalizados(s) por la célula.

Los polipéptidos heterólogos se pueden usar solos o bien en combinación con otras composiciones en un tratamiento. Por ejemplo, el polipéptido heterólogo se puede coadministrar con un anticuerpo, agente(s) quimioterápico(s) (incluyendo combinados de agentes quimioterápicos), otro(s) agente(s) citotóxico(s), agente(s) antiangiogénico(s), citocinas y/o agente(s) inhibidor(es) del crecimiento. Cuando el polipéptido heterólogo inhibe el crecimiento tumoral, puede ser, en particular, deseable combinar el polipéptido heterólogo con uno o más de otro(s) agente(s) terapéutico(s) que también inhibe(n) el crecimiento tumoral. De forma alternativa, o adicionalmente, el paciente puede recibir radioterapia combinada (por ejemplo, irradiación con haz externo o tratamiento con un agente marcado radioactivo, tal como un anticuerpo). Dichos tratamientos combinados indicados anteriormente incluyen la administración combinada (donde los dos o más agentes se incluyen en la misma formulación o separadas) y la administración separada, caso en el que se puede producir la administración del anticuerpo antes de y/o tras la administración del tratamiento o tratamientos complementario(s).

El polipéptido heterólogo (y, opcionalmente, un agente terapéutico complementario) se administra(n) por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente por infusión pulsada, en particular, con dosis decrecientes del anticuerpo. Preferentemente, la dosificación se administra por inyecciones, lo más preferentemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo, en parte, de si la administración es breve o prolongada.

El polipéptido heterólogo se formulará, dosificará y administrará de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de administración y otros factores conocidos por los médicos de cabecera. No es necesario, pero el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y con vías de administración que las usadas anteriormente en el presente documento o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones empleadas hasta ahora.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada del anticuerpo (cuando se usa solo o en combinación con otros agentes, tales como agentes quimioterápicos) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, la anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente de 1 |i/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, se prolonga el tratamiento hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. La dosis preferente del anticuerpo estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. La progresión de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Artículos de fabricación

En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección, tal como cáncer. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico. El artículo de fabricación en este aspecto de la divulgación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones de primer y segundo anticuerpo se pueden usar para tratar el cáncer. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

EJEMPLOS

Materiales y procedimientos

Cepas y plásmidos. Las cepas y plásmidos usados en este estudio se enumeran en la tabla 1. Para construir vectores de expresión solo de cadena pesada, los vectores de expresión de anticuerpo de longitud completa se digirieron con SpeI y NsiI (New England Biolabs). El fragmento resultante que contiene la secuencia del péptido señal y la secuencia de la cadena pesada se clonó en los sitios para SpeI y NsiI de un vector de clonación derivado de pBR322 que comprendía un fragmento de la cadena ligera truncado (122-237), un promotor de phoA fusionado a una secuencia de la cadena pesada y un terminador transcripcional lamda fe. El sondeo por análisis de inmunoelectrotransferencia con anticuerpo con ai<Lc confirmó que la cadena ligera no se expresó con el vector solo de cadena pesada. Para construir plásmidos indicadores de PhoA para la medición de la fuerza traduccional, la variante de péptido señal de interés se fusionó al gen phoA por medio de PCR regular o PCR de extensión por solapamiento de empalme (SOE). El fragmento resultante se clonó en los sitios para SpeI y Notl (New England Biolabs) de pPhoA51 [1]. Las mutaciones específicas de sitio en las secuencias del péptido señal se introdujeron por el kit de mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene).

Tabla 1. Cepas y plásmidos usados en este estudio

Cultivo bacteriano. Se cultivaron bacterias en medios Luria-Bertani (LB) o C.R.A.P. completos (Simmons et al., Journal of immunological methods, 2002) en matraces de agitación con deflectores a 37 °C o a 30 °C como se indica. Se añadieron antibióticos a las siguientes concentraciones: carbenicilina 50 |ig/ml, tetraciclina 20 |ig/ml. Para inducir la expresión de proteínas, la cepa huésped 64B4 que albergaba el vector de expresión de anticuerpo de longitud completa o el vector de expresión solo de cadena pesada se inoculó en 5 ml de LB complementado con 20 |il/ml de tetraciclina y fosfato de sodio 5 mM, pH 7, y se incubó con agitación a 30 °C durante la noche. Se inocularon 0,5 ml del cultivo durante la noche en 25 ml de medios limitantes de fosfato C.R.A.P. completos [2] y se cultivaron las bacterias a 30 °C con agitación durante 24 h. La densidad óptica del cultivo de valoración se midió a 550 nm. Se recogieron muestras bacterianas para el análisis de inmunoelectrotransferencia o análisis de secuenciación N terminal.

Medición de la fuerza traslacional. Las fuerzas traduccionales de las variantes de péptido señal se determinaron por el ensayo con fosfatasa alcalina adaptado de la publicación previa [1, 3]. La cepa 27C7 que albergaba el vector indicador de PhoA se inoculó en 5 ml de LB selectivo y se cultivó a 30 °C con agitación durante la noche. Se diluyó 100 veces el cultivo durante la noche en 5 ml de LB selectivo y se incubó a 30 °C con agitación durante otras 4 horas. Las bacterias se normalizaron a 1 DO a una longitud de onda de 600 nm y se sedimentaron. Los sedimentos se suspendieron inmediatamente en 1 ml de medios AP estrictos (Simmons et al., Nature Biotechnology, 1996) y se almacenan durante la noche a -20 °C. El día siguiente, las bacterias se descongelaron e incubaron con 20 |il de tolueno con agitación a 37 °C durante al menos 1 hora. A continuación, se le añadieron 40 |il de cada muestra a 1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8, que contenía sal disódica de fosfato de nitrofenilo 1 mM hexahidratado (PNPP, Sigma-Aldrich) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se le añadieron 100 |il de fosfato de sodio 1 M, pH 6,5 para detener la reacción. Se transfirieron inmediatamente 200 |il de cada muestra a pocillos de una placa de 96 pocillos y se midió la DO410 por un lector de placas (Molecular Technologies). Las fuerzas traduccionales relativas se calcularon restando A410 de 27C7/pBR322 (el vector vacío) de A410 de cada muestra y, a continuación, dividiendo el número por A410 de 27C7/pPhoA86. La fuerza de TIR relativa de pPhoA86 se definió como 1.

Extracción de anticuerpos y análisis de inmunoelectrotransferencia. Se recogieron muestras de valoración de cultivos en matraces de agitación. Para medir el nivel de cadena pesada total, las bacterias se normalizaron a 1 DO a 550 nm y se recogieron por centrifugación a 16.000 xg y 4 °C durante 3 min. Los sedimentos se resuspendieron en 200 |il de tampón tricina con ditiotreitol (DTT, Sigma) 0,2 M y se calentaron a 95 °C durante 5 min para romper los enlaces disulfuro y desnaturalizar las proteínas.

Para extraer proteínas solubles de bacterias, se diluyó caldo de células completas en tampón de lisis enfriado (Tris 10 mM, pH 6,8, EDTA 5 mM, 0,2 mg/ml de lisozima y ácido yodoacético 5 mM) a una DO550 final de 3 y se incubó en hielo durante 10 min. A continuación, las muestras se sometieron a sonicación por pulsos de 10 x 1 s dos veces y se centrifugaron durante 15 min a 16.000 xg y 4 °C. El sobrenadante se recogió cuidadosamente. Se mezclaron 100 |il de sobrenadante con 100 |il de tampón tricina o tampón tricina y se hirvieron a 95 °C durante 5 min.

Las proteínas periplásmicas se extrajeron como se describe [4, 5]. En resumen, se recogieron 10 DO550 de las células por centrifugación a 3.000 xg y 4 °C durante 20 min. Los sedimentos se resuspendieron suavemente en 1 ml de tampón TBS frío (Tris 200 mM, pH 8,0, sacarosa 0,5 mM, EDTA 1 mM) con 1 comprimido de combinado de inhibidor de proteasa (Roche). Las muestras se incubaron en hielo durante 30 min y se centrifugaron a 16.000 xg y 4 °C durante 30 min. El sobrenadante se recogió cuidadosamente. Se mezclaron 100 |il de sobrenadante con 100 |il de tampón tricina con DTT 0,2 M y se calentó a 95 °C durante 5 min.

Se cargaron muestras de proteínas en tampón tricina con o sin DTT en geles bis-tris SDS-PAGE al 10 % (Life Technologies) y se separaron por electroforesis. Para garantizar que se cargaran cantidades iguales de proteína total, los geles con lisados a 1 DO se tiñeron con azul de Coomassie. Las proteínas en geles no teñidos se transfirieron a membranas de celulosa (Biorad) por transferencia semiseca iBlot (Life Technologies) o por transferencia húmeda (Biorad) con tampón CAPS (ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico 10 mM, metanol al 3 %, pH 11). Se sondearon las especies que contenían cadena pesada con anticuerpo secundario anti-Fc humana caprino, conjugado con HRP (Pierce). Se sondearon las especies que contenían cadena ligera con anticuerpo antikLc humana caprino, conjugado con HRP (Bethyl Laboratories). Las proteínas diana en las inmunotransferencias se detectaron por quimioluminiscencia potenciada (GE Healthcare). Secuenciación de Edman del extremo N de la cadena pesada. Las muestras de valoración de cultivos en matraces de agitación se normalizaron a 1 DO550 y se recogieron por centrifugación a 16.000 xg durante 3 min. Los sedimentos se resuspendieron en 200 |jl de tampón tricina con DTT 0,2 M y se calentaron a 95 °C durante 5 min. Las proteínas se separaron por electroforesis en geles bis-tris SDS-PAGE al 8 % o 10 % (Life Technologies). 1 DO550 o 4 DO550 de lisado celular de 64B4 que albergaba un vector pBR322 vacío también se cargó como control. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF por transferencia húmeda (Biorad) en tampón CAPS. La banda de la cadena pesada a ~ 49 kDa en la membrana se cortó y se analizó por secuenciación de Edman usando el Applied Biosystems Procise Sequencer, modelo 494HT. La proporción de cadena pesada madura con respecto a precursora se estimó en base a la intensidad de pico. Para la semicuantificación, se calcularon los valores en picomoles de cada aminoácido por el programa de análisis de secuencias SEQX frente a los patrones de aminoácido de feniltiohidantiona sin corregir (Henzel et al., Journal of Chromatography, 1987). Se usó un promedio de 10 ciclos para producir el gráfico de rendimiento repetitivo para calcular la regresión lineal y se definieron los rendimientos iniciales de las secuencias mayoritaria y minoritaria como las intersecciones en y de las líneas trazadas. La eficacia de procesamiento de cadena pesada se calculó como el porcentaje de cadena pesada secretada (rendimiento inicial de cadena pesada madura/(rendimiento inicial de precursor+rendimiento inicial de cadena pesada madura)).

Microscopia electrónica de transmisión (MET). Las muestras de valoración de cultivos en matraces de agitación se fijaron en primer lugar en fijador de Karnovsky modificado (paraformaldehído al 2 % y glutaraldehído al 2,5 % en tampón cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,2) y, a continuación, se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio acuoso al 1 % (EM Sciences, Hatfield, PA) durante 1 hora seguido de incubación durante la noche en acetato de uranilo al 0,5 % a 40 °C. A continuación, las muestras se deshidrataron a través de una serie de concentraciones de etanol (50 %, 70 %, 90 %, 100 %), seguido de óxido de propileno (cada etapa fue de 15 min), y se incluyeron en Eponate 12 (Ted Pella, Redding, CA). Se cortaron cortes ultrafinos (80 nm) con un micrótomo Ultracut (Leica), se tiñeron con citrato de plomo al 0,2 % y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (MET) JEOL JEM-1400 a 120 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara CCD GATAN Ultrascan 1000.

Microscopia electrónica con inmunomarcaje con oro coloidal (immunoME). En los experimentos de ME con inmunomarcaje con oro coloidal, se prepararon muestras para criocorte. Para el criocorte, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % con glutaraldehído al 0,1 % en tampón fosfato (0,1 M; pH 7,2), se lavaron varias veces en PBS, se incluyeron en gelatina al 12 % y se infiltraron en sacarosa 2,3 M durante la noche a 4 °C. A continuación, las muestras se montaron en pasadores para crioultramicrotomía congeladas en una cámara de criocorte (suministrada con nitrógeno líquido). Se prepararon criocortes ultrafinos (100 nm) con una cuchilla de diamante (Diatome) a -80 °C usando un ultramicrótomo (Ultracut; Leica) equipado con una cámara de criocorte. Los criocortes descongelados se transfirieron a rejillas de ME recubiertas de Formvar y carbono (Nickel) con una gota de sacarosa 2,3 M y se inmunomarcaron (véase a continuación) y contratiñeron para ME con acetato de uranilo al 0,5 % en metilcelulosa al 2 % durante 1 min a TA. Para el inmunomarcaje con oro coloidal: los criocortes descongelados en las rejillas se bloquearon en agente de bloqueo (Aurion Inc) durante 30 min y se incubaron con un anticuerpo anti-Fc humana caprino conjugado con HRP (Pierce) durante 45 min a temperatura ambiente, seguido de incubación con anticuerpo conjugado con oro anti-HRP caprino (Jackson ImmunoResearch) durante 30 min. A continuación, los cortes se contratiñeron como se describe anteriormente. Se visualizaron cortes inmunomarcados con oro coloidal y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (MET) JEOL JEM1400 a 120 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara CCD GATAN Ultrascan 1000.

Resultados y análisis

Se puede lograr la producción de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa) en E. co lisecretando cadena pesada y ligera de anticuerpo del citoplasma en el periplasma [2]. La secreción está mediada por un péptido señal de E. coli, que se fusiona con el extremo N terminal de la cadena pesada y cadena ligera. El entorno oxidante y las enzimas en el periplasma facilitan el ensamblaje de la cadena pesada y la cadena ligera en un anticuerpo. El uso de la secreción periplásmica como medio para la producción de alto nivel de proteínas heterólogas (por ejemplo, anticuerpos) puede estar limitado por varios problemas que surgen con frecuencia. En primer lugar, la eficacia de secreción de la proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo) puede ser baja. En segundo lugar, el precursor, en muchos casos, se procesa de forma incompleta en una proteína madura. En tercer lugar, las proteínas heterólogas sobreexpresadas a menudo se pliegan inapropiadamente, se agregan en cuerpos de inclusión insolubles o se proteolizan por proteasas de E. coli. En cuarto lugar, los anticuerpos son proteínas multiméricas complicadas preparadas a partir de dos polipéptidos diferentes, las cadenas pesada (HC) y ligera (LC), que se deben exportar al periplasma, plegar apropiadamente y formar los enlaces disulfuro apropiados. La complejidad de este plegamiento de proteínas más la secreción se suma a los desafíos de la preparación de anticuerpos en E. coli.

Aunque se ha demostrado que la optimización de TIR es útil para generar una secreción de proteínas más eficaz, no se ha demostrado que otros enfoques mejoren de forma rutinaria la secreción de proteínas heterólogas en E. coli. Por ejemplo, se demostró que la optimización de una proteína señal disminuía la secreción de ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa) recombinante en el espacio periplásmico. Jonet et al J Mol Microbiol Biotechnol (2012); 22:48-58.

Dos aspectos del péptido señal afectan la acumulación de proteína en el periplasma: la fuerza traduccional y la eficacia de translocación. La región de iniciación traduccional (TIR) es un determinante principal del nivel traduccional global de una proteína. La TIR incluye el polinucleótido que codifica la secuencia señal, y se extiende de inmediatamente en dirección 5' de la secuencia Shine-Dalgarno a aproximadamente veinte nucleótidos en dirección 3' del codón de iniciación. Las modificaciones de esta secuencia de polinucleótido pueden alterar la eficacia de la iniciación traduccional, ajustando, de este modo, el nivel de traducción de la proteína en dirección 3'. Los estudios anteriores que examinaron los efectos de la secuencia del péptido señal mutante, en general, no controlaron el impacto potencial sobre la fuerza de TIR debido a cambios en la secuencia de ácido nucleico; sin embargo, en el estudio previo, se examinó el uso de diferentes péptidos señal para fomentar la producción de anticuerpos completos mientras se controlaba la fuerza de TIR. A una fuerza de TIR relativa de aproximadamente 1, la fusión del péptido señal DsbA a la cadena pesada, en general, dio como resultado un mayor nivel de producción de anticuerpos de longitud completa que la fusión de los péptidos señal de STII, MalE o PhoA (el péptido señal de cadena ligera era STII en cada estudio) (figura 1A). En el presente estudio, se planteó la hipótesis de que el péptido señal DsbA es más hidrófobo que los otros péptidos señal que se sometieron a prueba, y se demostró que la hidrofobia del péptido señal es importante para la translocación de la cadena pesada en el periplasma y la producción de anticuerpos de longitud completa.

Los péptidos señal afectaron a la acumulación periplásmica y al procesamiento de cadena pesada de anticuerpo. Se examinó el efecto de las variantes de péptido señal sobre la acumulación de cadena pesada en el periplasma. En todas las variantes, la fuerza de TIR relativa fue ~1 para controlar los posibles efectos del cambio de hidrofobia del péptido señal sobre la fuerza transcripcional. Los estudios anteriores, en general, no han controlado la fuerza traduccional de los péptidos señal modificados. Si no se controla cuidadosamente como en el presente estudio, la modulación de la hidrofobia del péptido señal posiblemente podría cambiar la fuerza traduccional de la TIR (por ejemplo, por medio de cambios en la secuencia de polinucleótido de TIR). Los cambios en la fuerza traduccional de la TIR podrían afectar a la eficacia de secreción y a los niveles de producción de proteínas.

El extremo N de la cadena pesada de anticuerpo 5D5 se fusionó al péptido señal STII (bSTI11), péptido señal DsbA (bDsbA1), péptido señal MalE (bMalE1) o péptido señal PhoA (bPhoA1), cada uno con un nivel traduccional similar (tabla 3). En cada caso, la cadena ligera de anticuerpo 5D5 se fusionó al mismo péptido señal STII (mSTII1). La expresión tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera se indujo tras la limitación de fosfato en cultivos en matraces de agitación. Se aislaron extractos de proteína periplásmica por choque osmótico y centrifugación. El análisis de inmunoelectrotransferencia del sobrenadante mostró que el uso del péptido señal DsbA dio como resultado niveles significativamente mayores de cadena pesada periplásmica soluble de lo que lo hizo el uso de los péptidos señal STII, MalE o PhoA (fig. 1B). Debido a que las fuerzas de TIR de bMalE1 y bPhoA1 son mayores que las de bSTI 11 y bDsbA1, para excluir la posibilidad de que una mayor TIR pueda provocar una secreción ineficaz, se genomanipularon dos péptidos señal adicionales, mMalE1 y mPhoA1, con fuerzas de TIR ligeramente menores que las de bSTI 11 y bDsbA1 (tabla 3). Tanto mMalE1 como mPhoA1 fusionados a la cadena pesada dieron como resultado significativamente menor cadena pesada periplásmica soluble y de 5D5 de longitud completa que bDsbA1 (fig. 1C).

Para determinar el efecto de los péptidos señal sobre la secreción de cadena pesada desde el citoplasma en el periplasma, se supervisó la presencia de cadena pesada madura y cadena pesada precursora. La proteína periplásmica no secretada en el citoplasma o en la membrana interior mantendrá la secuencia del péptido señal. Durante la translocación en el periplasma, el péptido señal se escinde por la peptidasa [6, 7]. Por tanto, la proteína madura que se libera en el periplasma no contendrá el péptido señal. La diferencia de peso molecular entre la cadena pesada precursora y madura solo es de 1-2 kDa, que es difícil de resolver en SDS-PAGE. En consecuencia, se realizó la secuenciación de la proteína N terminal para distinguir entre la cadena pesada precursora y madura. La cadena pesada reducida de las muestras de células completas migró como una única banda en s DS-PAGE. Las proteínas en la SDS-PAGE se transfieren a una membrana de PVDF. Las bandas de la cadena pesada de la membrana de PVDF se cortaron y se sometieron a secuenciación de Edman. Cuando la cadena pesada se fusionó al péptido señal STII, MalE o PhoA, se detectaron secuencias que coincidían tanto con la cadena pesada precursora como madura (tabla 4), lo que sugiere que se retuvo alguna cadena pesada en el citoplasma o en la membrana interior. Cuando la cadena pesada se fusionó al péptido señal DsbA, la secuencia que coincidía con la precursora era muy minoritaria o no detectable. Se estimó la proporción de cadena pesada madura con respecto a precursora usando la intensidad de pico y semicuantificando el porcentaje de cadena pesada secretada usando los rendimientos iniciales. Ambos procedimientos demostraron que, cuando se fusionaba al péptido señal DsbA, la mayor parte del péptido secuenciado correspondía a la cadena pesada madura (tabla 4), lo que sugiere que la cadena pesada se secretaba eficazmente en el espacio periplásmico (tabla 4). Por lo tanto, el péptido señal DsbA mediaba en un procesamiento más eficaz de la cadena pesada (del precursor de cadena pesada a la cadena pesada madura) que el péptido señal STII, MalE o PhoA.

También se realizó una microscopia electrónica con inmunomarcaje con oro coloidal (immunoME) para visualizar directamente la localización celular de la cadena pesada cuando se fusionó a diferentes péptidos señal. Las bacterias recogidas de cultivos en matraces de agitación se sometieron a criocortes, se sondearon con anticuerpo frente a ^a Fc-HRP seguido de anticuerpo secundario frente a ^a HRP-partículas de oro de 18 nm y se analizaron bajo microscopio electrónico de transmisión (MET). Para las bacterias que expresaban la cadena ligera de STII y la cadena pesada de STII, se encontraron muy pocas señales de inmunomarcaje con oro coloidal en el periplasma. La mayor parte del marcaje con oro se observó en el lado citoplásmico, lo que indica que la cadena pesada estaba atrapada predominantemente en el citoplasma (figura 2A). Por el contrario, para las bacterias que expresaban STII-cadena ligera y DsbA-cadena pesada, el marcaje con oro se detectó predominantemente en el lado periplásmico (figura 2B). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que, a un nivel traduccional similar, el uso del péptido señal DsbA dio como resultado una translocación de la cadena pesada más eficaz y más acumulación de cadena pesada en el periplasma de lo que lo hizo el uso de los otros tres péptidos señal.

La hidrofobia del péptido señal fue importante para la secreción de cadena pesada de anticuerpo y la acumulación en el periplasma. Para explorar el mecanismo de por qué el péptido señal DsbA era más eficaz en la secreción de cadena pesada, se compararon las secuencias de aminoácidos del péptido señal DsbA con los péptidos señal STII, MalE y PhoA. A pesar de la diversidad en las secuencias primarias, los péptidos señal se componen comúnmente de tres regiones distintas: una región N terminal que contiene 1 o 2 residuos de aminoácido cargados positivamente, una región central hidrófoba, denominada, a menudo, región H, y una región C terminal reconocida por la peptidasa señal [8]. Tanto la región H como la secuencia de longitud completa del péptido señal DsbA son más hidrófobas que las de los péptidos señal STII, MalE y PhoA (tabla 2). Se preguntó si la hidrofobia del péptido señal desempeñaba un papel importante en la translocación de la cadena pesada de anticuerpo en el periplasma.

La hidrofobia de los péptidos señal DsbA y STII se moduló por mutagénesis dirigida a sitio. La sustitución de leucina11 (L11) a serina (S) en el péptido señal DsbA redujo la hidrofobia global y promedio del péptido señal DsbA (tabla 7 y tabla 2). La mutación de leucina11 a isoleucina (I) en el péptido señal DsbA se generó como control. En la secuencia del péptido señal STII, la serina 11 se mutó a leucina o isoleucina para incrementar la hidrofobia (tabla 7 y tabla 2). Cada uno de los péptidos señal mutados se fusionó a una proteína PhoA madura para las mediciones de la fuerza de TIR. Las variantes de péptido señal con hidrofobia con fuerzas de TIR similares a TIR1 de péptido señal STII o TIR1 de péptido señal DsbA (tabla 3) se fusionaron a la cadena pesada de anticuerpo 5D5. Para excluir los posibles efectos debidos a que la cadena ligera interactúe potencialmente con la cadena pesada y/o compita en cuanto a la misma maquinaria de secreción, se diseñaron plásmidos que solo expresan la cadena pesada, pero no la cadena ligera.

El efecto de las variantes de hidrofobia del péptido señal sobre la acumulación de cadena pesada en el periplasma se supervisó por análisis de inmunoelectrotransferencia de los extractos de periplasma (figura 3B). En ausencia de expresión de cadena ligera, el uso del péptido señal DsbA dio como resultado una cadena pesada más soluble en el periplasma de lo que lo hizo el uso del péptido señal STII. La disminución de la hidrofobia del péptido señal DsbA por la mutación L11S disminuyó fuertemente el nivel periplásmico de la cadena pesada soluble, mientras que el uso del control con péptido señal DsbA L11I no mostró mucho cambio en el nivel de cadena pesada (figura 3A). Por otra parte, el incremento de la hidrofobia del péptido señal STII incrementó el nivel de cadena pesada soluble en el periplasma (figura 3A).

Para confirmar además el efecto de la hidrofobia del péptido señal sobre la secreción de cadena pesada de 5D5, se crearon variantes de péptido señal adicionales (tabla 2; tabla 8) con un intervalo de hidrofobia diferente y se fusionaron a la cadena pesada de 5D5. En la secuencia señal de STII, se mutó serina 11 a alanina (A), lo que incrementa la hidrofobia global y promedio, tirosina (Y) que solo incrementa ligeramente la hidrofobia, o a glutamina (Q) que disminuye la hidrofobia de STII. También se creó una variante de péptido señal STII altamente hidrófobo preparando la mutación triple de Ala6 (A6) a leucina, alanina 10 (A10) a leucina y serina 11 (S11) a leucina (STII A6L, A10L, S11L). En la secuencia de DsbA, se mutó leucina 11 a alanina (A) o glutamina (Q) para disminuir la hidrofobia global y promedio. Todas las variantes de péptido señal tenían fuerzas de TIR similares a TIR1 de péptido señal STII o TIR1 de péptido señal DsbA (tabla 3).

La eficacia de secreción de la cadena pesada de 5D5 en el periplasma en ausencia de cadena ligera se determinó por secuenciación N terminal como se describe anteriormente (tabla 5). El uso del péptido señal DsbA dio como resultado que la mayor parte de la cadena pesada fuera cadena pesada madura y una presencia muy minoritaria de cadena pesada precursora, lo que indica que la secreción de la cadena pesada de 5D5 mediada por el péptido señal DsbA es eficaz. Se observó un resultado similar para el control, la variante DsbA L11I. La disminución de la hidrofobia del péptido señal DsbA por L11A, L11S o L11Q disminuyó la eficacia de secreción a medida que se detectaba más precursor que cadena pesada de 5D5 madura. Por otra parte, ni STII ni STII S11Q mediaron en la secreción eficaz de la cadena pesada de 5D5 usando secuenciación de Edman no cuantitativa, mientras que STII S11L mejoró la secreción. La secuenciación de Edman semicuantitativa demostró que STII y STII S11Y mediaban en la secreción ineficaz de la cadena pesada de 5D5; sin embargo, la mutación STII S11Q incrementó el porcentaje de cadena pesada de 5D5 secretada. El incremento de la hidrofobia del péptido señal STII por una mutación S11A o S11L incrementó la eficacia de secreción. Además, la mutación de residuo único S11L fue suficiente para la secreción de cadena pesada de 5D5 eficaz, ya que una variante señal del péptido señal STII altamente hidrófoba con fuerza traduccional similar (STII A6L, A10L, S11L) no incrementó además la eficacia de secreción. Tomados conjuntamente, la modulación de la hidrofobia del péptido señal mientras se controla la fuerza de TIR afectó en gran medida a la eficacia de secreción de la cadena pesada de 5D5 en el periplasma.

Se observaron resultados similares cuando la cadena ligera se coexpresó con la cadena pesada. Cuando la cadena ligera de anticuerpo 5D5 se fusionó a un péptido señal STII (mSTII1), el uso del péptido señal DsbA L11S dio como resultado una cadena pesada significativamente menos soluble en agua en el periplasma que el uso de los péptidos señal DsbA o DsbA L11I. De forma similar, el uso del péptido señal STII S11L o STII S11I medió en una acumulación de cadena pesada más soluble en el periplasma de lo que lo hizo el péptido señal STII (fig. 3B). Conjuntamente, la modulación de la hidrofobia del péptido señal alteró significativamente la acumulación de cadena pesada de 5D5 en el periplasma. El incremento de la hidrofobia por un único cambio de aminoácido mejoró significativamente el nivel periplásmico de cadena pesada soluble, mientras que la disminución de la hidrofobia tuvo el efecto opuesto.

Se analizaron además los efectos de la hidrofobia del péptido señal sobre el procesamiento de cadena pesada por secuenciación N terminal (tabla 4). En cada caso, la cadena ligera de 5D5 se fusionó al péptido señal STII (mSTIM). Se detectaron la señal de cadena pesada madura mayoritaria y la señal precursora muy minoritaria por secuenciación N terminal cuando la cadena pesada se fusionó a los péptidos señal DsbA y DsbA L11I. Usando una estimación en base a la intensidad de pico, la proporción de cadena pesada madura con respecto a cadena pesada precursora para la construcción que usa el péptido señal DsbA fue más de 10:1. La mutación L11S en el péptido señal DsbA disminuyó la proporción madura/precursora a 1:3 a medida que se detectaba más señal precursora que de cadena pesada madura. El péptido señal STII dio una señal de cadena pesada menos madura que la señal precursora, con una proporción madura/precursora de 1:3. La mejora de la hidrofobia del péptido señal STII por una mutación S11L o S11I dio como resultado más cadena pesada madura que cadena pesada precursora (3:1 y 4:1). La semicuantificación usando los rendimientos iniciales de la secuenciación de Edman confirmó los efectos de la hidrofobia del péptido señal sobre la secreción de la cadena pesada de 5D5. El uso del péptido señal DsbA dio como resultado un ~86 % de cadena pesada secretada; la mutación L11S disminuyó el porcentaje de cadena pesada secretada a un 39 %. STII medió en un 39 % de cadena pesada secretada; la mutación S11L y S11I incrementó la secreción de cadena pesada a más de un 60 %. En conjunto, la hidrofobia del péptido señal fue importante para el procesamiento y la secreción de cadena pesada de anticuerpo en el periplasma.

Los efectos de la hidrofobia del péptido señal sobre la secreción de 5D5 también fueron respaldados por el estudio de un péptido señal altamente hidrófobo de SfmC. SfmC es una proteína pilina predicha localizada en el periplasma. La secreción de SfmC depende de la partícula de reconocimiento de señal (PRS) en la vía de secreción cotraduccional (Huber et al., J Bacteriol. 2005. 2983-2991; Zhou et al., 2014. PLOS One). El péptido señal SfmC es más hidrófobo que los péptidos señal de DsbA o bien STII (tabla 3). Se generaron variantes de TIR1 y TIR2 del péptido señal SfmC y se fusionó cada una a la cadena pesada de 5D5. Ambas variantes mediaron una secreción muy eficaz de la cadena pesada de 5D5 (un 100 % de cadena pesada secretada).

Los efectos de la hidrofobia del péptido señal sobre los niveles de anticuerpo de longitud completa. A continuación, se analizó el efecto de la hidrofobia del péptido señal sobre la producción de anticuerpos de longitud completa. Se recogieron lisados de las células huésped que expresan la cadena pesada y cadena ligera de 5D5 y se analizaron los niveles de anticuerpo 5D5 completamente ensamblado por electroforesis SDS-PAGE no reductora seguido de inmunoelectrotransferencia. En cada caso, la cadena ligera de 5D5 se fusionó al péptido señal STII (usando la secuencia de ácido nucleico de mSTII1). El péptido señal DsbA L11S fusionado a la cadena pesada dio como resultado una disminución significativa del nivel de 5D5 de longitud completa en comparación con el uso de los péptidos señal DsbA o DsbA L111 fusionados a la cadena pesada (figura 4A). Por otra parte, tanto las mutaciones S11L como L11I en el péptido señal STII incrementaron el nivel de anticuerpo 5D5 de longitud completa en comparación con el uso del péptido señal STII (figura 4B). Por lo tanto, el incremento de la hidrofobia del péptido señal promovió la producción de anticuerpo 5D5 de longitud completa.

Se quería conocer si el efecto de la hidrofobia del péptido señal se aplica a la secreción de otras cadenas pesadas de anticuerpo. Para este propósito, se fusionaron los péptidos señal STII, STII S11L, DsbA o DsbA L11S TIR1 a la cadena pesada de mAb1 o mAb2 y se midió la eficacia de secreción de la cadena pesada en ausencia de cadena ligera usando secuenciación de Edman (tabla 6). Para ambas cadenas pesadas de anticuerpo, DsbA mediaba en más cadena pesada secretada que STII. La disminución de la hidrofobia de DsbA por la mutación L11S disminuyó el porcentaje de cadena pesada secretada, y el incremento de la hidrofobia de STII por la mutación S11L mostró el efecto opuesto.

Se sometió a prueba además el efecto de la hidrofobia del péptido señal sobre la producción de anticuerpos de longitud completa de otros dos anticuerpos monoclonales, mab 1 y mab 2 (figura 7). Mab 1 y mab 2 son anticuerpos IgG1 de longitud completa. En ambos casos, la cadena ligera se fusionó a mSTII1 y la cadena pesada se fusionó a STII, DsbA, STII S11L o DsbA L11S con fuerzas de TIR similares. Los niveles de anticuerpo de longitud completa, los niveles de cadena pesada soluble periplásmica y los niveles de cadena pesada total se determinaron como se describe previamente. Para mAb1, los péptidos señal STII o DsbA fusionados a la cadena pesada dieron como resultado niveles similares de anticuerpo de longitud completa y cadena pesada soluble periplásmica; sin embargo, el uso de la variante de péptido señal DsbA L11S con hidrofobia disminuida disminuyó significativamente los niveles de mAb1 de longitud completa y cadena pesada soluble periplásmica, lo que sugiere que la hidrofobia del péptido señal todavía es un factor importante para la producción y secreción de mAb1 en el periplasma. Para mAb2, el uso del péptido señal STII dio como resultado menos anticuerpo de longitud completa y menos cadena pesada soluble periplásmica de lo que lo hizo el uso del péptido señal DsbA. El incremento de la hidrofobia del péptido señal STII por la mutación S11L provocó un incremento de mAb2 de longitud completa, así como la acumulación de cadena pesada soluble periplásmica, mientras que la disminución de la hidrofobia del péptido señal DsbA por la mutación L11S tuvo el efecto opuesto. Por lo tanto, la hidrofobia del péptido señal es importante para la producción y secreción de mAb2 en el periplasma de E. coli.

La modulación de la hidrofobia del péptido señal cambió la localización celular de los cuerpos de inclusión. Las proteínas recombinantes sobreexpresadas en E. coli, a menudo, están contenidas en grandes agregados insolubles conocidos como cuerpos de inclusión en el citoplasma o en el periplasma. La formación de cuerpos de inclusión que contienen proteínas de interés se asocia, a menudo, con bajos niveles de proteínas diana solubles. Además, la formación de cuerpos de inclusión en el citoplasma indica una secreción de proteínas ineficaz en el periplasma. Usando microscopia electrónica de transmisión (MET), se observaron de forma prominente cuerpos de inclusión en el citoplasma de las células huésped que expresaban la cadena ligera fusionada a mSTIIl y la cadena pesada fusionada al péptido señal STII, MalE o PhoA (figura 5), lo que sugiere una secreción de proteínas ineficaz en estas células. Por el contrario, para las células huésped que expresaban STII-LC y DsbA-HC, se observaron menos comúnmente cuerpos de inclusión y se localizaron principalmente en el periplasma (figura 5), lo que indica una secreción de proteínas eficaz. De forma interesante, el uso del péptido señal STII S11L (con hidrofobia incrementada) mostró un fenotipo similar al del péptido señal DsbA: los cuerpos de inclusión se localizaron principalmente en el lado periplásmico (figura 5). El uso del péptido señal DsbA L11S (con hidrofobia reducida) dio como resultado cuerpos de inclusión observados predominantemente en el citoplasma (figura 5). En resumen, la modulación de la hidrofobia del péptido señal alteró la localización celular de los cuerpos de inclusión.

Las mutaciones en el dominio C terminal del péptido señal no alteraron la producción de anticuerpos de longitud completa. La región C terminal del péptido señal es crítica para la escisión del péptido señal por peptidasa. Los estudios anteriores indican que típicamente esta región prefiere residuos de aminoácido con cadena lateral pequeña en la posición 1 y 3 en el sitio de escisión [6]. Tanto los péptidos señal STII como DsbA tienen el residuo pequeño (Ala) en la posición 1 y 3 (figura 3A). Sin embargo, en la posición 2 en la secuencia de DsbA existe un pequeño residuo Ser, mientras que en la misma posición en la secuencia de STII existe un residuo voluminoso (Tyr (Y)). La figura 6 muestra que las alteraciones en el tamaño de la cadena lateral en la posición de aminoácido 2 en el sitio de escisión no afectan a la producción de anticuerpos 5D5. La mutación de Tyr22 a Ser en el péptido señal STII no cambió el nivel de 5D5. De forma similar, la mutación de Seri8 a Tyr en el péptido señal DsbA no tuvo ningún efecto sobre el nivel de 5D5. Por lo tanto, el volumen de la cadena lateral en la posición de aminoácido 2 no afecta a los niveles de 5D5 en el periplasma.

Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de variantes de péptido señal

Subrayado = mutaciones en secuencias de aminoácidos

La hidrofobia suma (hidro. suma) se calcula en base a la escala de consenso normalizado desarrollada por Eisenberg et al [20].

Hidro. prom. = hidrofobia suma de la secuencia señal dividida por el número de residuos de aminoácido Hidro. suma (H) = hidrofobia suma de la región H

Hidro. prom. (H) = hidrofobia promedio de la región H

Tabla 3. Secuencias de ADN de variantes de péptido señal y fuerzas de TIR relativas

Negrita=sitio de restricción para BssHIl, MluI o Xbal

Subrayado = mutaciones realizadas para cambiar las secuencias de aminoácidos Tabla 4. Secreción de cadena pesada de 5D5 con coexpresión de cadena ligera de 5D5

* La proporción madura/precursora estimada se basa en una estimación aproximada de la intensidad de pico. ** El % de HC secretada se determina por semicuantificación de los rendimientos iniciales de las cadenas pesadas maduras y las precursoras, como se describe en la sección Materiales y procedimientos.

Tabla 5. Secreción de cadena pesada de 5D5 en ausencia de cadena ligera de 5D5

* El % de HC secretada se determina por semicuantificación de los rendimientos iniciales de las cadenas pesadas maduras y las precursoras, como se describe en la sección Materiales y procedimientos.

Tabla 6. Secreción de cadena pesada de mAb1 y cadena pesada de mAb2 en ausencia de cadena ligera.

* El % de HC secretada se determina por semicuantificación de los rendimientos iniciales de las cadenas pesadas maduras y las precursoras, como se describe en la sección Materiales y procedimientos.

Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de la secuencia señal de DsbA, secuencia señal de STII y secuencias señal variantes con hidrofobia alterada. La región N terminal está marcada en negrita, la región H está en cursiva y la región C terminal está en fuente normal. Los residuos mutados están subrayados.

Tabla 8. Secuencia de aminoácidos de la secuencia señal de DsbA, secuencia señal de STII, secuencias señal variantes con hidrofobia alterada y secuencia señal de SfmC. La región N terminal está marcada en negrita, la región H está en cursiva y la región C terminal está en fuente normal. Los residuos mutados están subrayados.

Lista de referencias parcial

1. Simmons, L.C. y D.G. Yansura, Nat Biotechnol, 1996. 14(5): p. 629-34.

2. Simmons, L.C., et al., J Immunol Methods, 2002. 263(1-2): p. 133-47.

3. Documento US 8361744

4. Quan, S., et al., Methods Mol Biol, 2013. 966: p. 359-66.

5. Oliver, D.B. y J. Beckwith, Cell, 1982. 30(1): p. 311-9.

6. Auclair, S.M., M.K. Bhanu y D.A. Kendall, Protein Sci, 2012. 21(1): p. 13-25.

7. Josefsson, L.G. y L.L. Randall, Cell, 1981. 25(1): p. 151-7.

8. Izard JW, K.D., Mol Microbiol, 1994. 13(5): p. 765-73.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de incremento de la secreción de una cadena pesada de anticuerpo y/o una cadena ligera de anticuerpo de una célula huésped de E. coli, que comprende cultivar una célula huésped de E. coli que comprende un polinucleótido que comprende

(1) un primer polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5; y

(2) un segundo polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, en el que la hidrofobia promedio del segundo péptido señal es mayor de aproximadamente 0,5, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo,

en el que el primer y segundo péptido señal son un péptido señal DsbA variante, en el que el péptido señal DsbA variante comprende

a) una mutación en el residuo L11 y/o S18Y de SEQ ID NO:3, en el que el péptido señal DsbA variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA natural de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50; o

b) una mutación en el residuo L11 y/o S18Y, en el que la mutación en el residuo L11 es L11I y en el que el péptido señal DsbA variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA natural de SEQ Id NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50; o

c) secuencia de SEQ ID NO: 13 o 15.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que

a) el polinucleótido en la célula huésped comprende además un promotor; o

b) el polinucleótido en la célula huésped comprende además un promotor, en el que el promotor es un promotor procariótico seleccionado del grupo que consiste en el promotor de phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara y T7.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la célula huésped de E. coli es de una cepa carente

a) de actividades proteasa endógena, o

b) de actividades proteasa endógena, en la que el genotipo de la E. coli carece de genes degP y prc y alberga un gen spr mutante.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la célula huésped comprende además un polinucleótido que codifica al menos un polipéptido procariótico seleccionado del grupo que consiste en

a) DsbA, DsbC, DsbG y FkpA, o

b) DsbA, DsbC, DsbG y FkpA, en el que el polinucleótido codifica tanto DsbA como DsbC.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo es

a) un anticuerpo monoclonal; o,

b) un anticuerpo monoclonal, en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo madurado en afinidad, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

6. Un péptido señal DsbA variante que comprende una mutación en el residuo L11 y/o S18Y de SEQ ID NO:3, en el que la variante tiene

a) una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50; o

b) una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50, y en el que la mutación en el residuo L11 es L11I.

7. Un péptido señal STII variante que comprende una mutación en el residuo S11 de SEQ ID NO:1, en el que el péptido señal STII variante tiene

a) una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO:1, que tiene una hidrofobia promedio de 0,40;

b) una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO:1, que tiene una hidrofobia promedio de 0,40, y en el que la mutación es S11 A, S11I o S11L.

8. Un péptido señal variante que consiste en una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33.

9. El péptido señal variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, fusionado a

a) una proteína heteróloga, o

b) una proteína heteróloga, en la que el polipéptido heterólogo es

i) una cadena pesada de anticuerpo; o

ii) una cadena ligera de anticuerpo; o

iii) una cadena ligera y pesada de anticuerpo; o

iv) un polipéptido multimérico; o

v) una inmunoadhesina.

10. Una secuencia de polinucleótido que codifica un péptido señal variante de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7.

11. La secuencia de polinucleótido de la reivindicación 10 enlazada de forma funcional a un polinucleótido que codifica un polipéptido heterólogo, con lo que, tras la expresión del polipéptido heterólogo en una célula huésped, el polipéptido heterólogo se pliega y ensambla para formar

a) un polipéptido heterólogo biológicamente activo; o

b) un polipéptido heterólogo biológicamente activo, en el que la célula huésped es

i) una célula huésped procariótica; o

ii) E. coli.

12. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo, comprendiendo dicho polinucleótido (1) un polinucleótido que codifica un primer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena pesada de anticuerpo y (2) un polinucleótido que codifica un segundo péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica una cadena ligera de anticuerpo, con lo que, tras la expresión del anticuerpo en una célula huésped, las cadenas pesada y ligera se pliegan y ensamblan para formar un anticuerpo biológicamente activo, en el que

a) el primer y/o segundo péptido señal es un péptido señal variante de la reivindicación 6 o 7 o en el que el primer y/o segundo péptido señal consiste en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33; o

b) el primer y/o segundo péptido señal es un péptido señal variante de la reivindicación 6 o 7 o en el que el primer y/o segundo péptido señal consiste en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33, en el que el polinucleótido que codifica un anticuerpo comprende además (3) un polinucleótido que codifica un tercer péptido señal enlazado de forma funcional a un polinucleótido que codifica un polipéptido con Fc, en el que el tercer péptido señal

i) es un péptido señal DsbA variante de SEQ ID NO: 3, en el que la variante comprende una región H con una hidrofobia promedio que es mayor de 0,5; o

ii) es un péptido señal DsbA variante que comprende una mutación en el residuo L11 y/o S18 de SEQ ID NO:3, en el que la variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50; o

iii) es un péptido señal DsbA variante que comprende una mutación en el residuo L11 y/o S18 de SEQ ID NO:3, en el que la variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal DsbA de SEQ ID NO:3, que tiene una hidrofobia promedio de 0,50, en el que la mutación es L11I y/o S18Y; o

iv) es un péptido señal STII variante que comprende una mutación en el residuo S11 de SEQ ID NO:1, en el que el péptido señal STII variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO:1, que tiene una hidrofobia promedio de 0,40; o

v) es un péptido señal STII variante que comprende una mutación en el residuo S11 de SEQ ID NO:1, en el que el péptido señal STII variante tiene una hidrofobia promedio mayor que un péptido señal STII de SEQ ID NO:1, que tiene una hidrofobia promedio de 0,40, en el que la mutación es S11A, S11I o S11L; o vi) consiste en, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:8, 11, 13, 15, 31 o 33.

13. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, que comprende además un promotor enlazado de forma funcional al

a) polipéptido heterólogo; o

b) polipéptido heterólogo, en el que el promotor es un promotor procariótico seleccionado del grupo que consiste en el promotor de phoA, tac, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp y T7.

14. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, que comprende además (a) un primer promotor, en el que el primer promotor está enlazado de forma funcional a una cadena ligera y (b) un segundo promotor, en el que el segundo promotor está enlazado de forma funcional a

a) una cadena pesada; o

b) una cadena pesada, en la que los primer y segundo promotores son ambos promotores de phoA.

15. El polinucleótido de la reivindicación 14, que comprende además (c) un tercer promotor, en el que el tercer promotor está enlazado de forma funcional a

a) un polipéptido con Fc, o

b) un polipéptido con Fc, en el que el tercer promotor es un promotor de phoA.

16. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que el anticuerpo es

a) un anticuerpo monoclonal; o

b) un anticuerpo monoclonal, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo humano; o

c) un fragmento de anticuerpo, en el que el fragmento de anticuerpo es un anticuerpo de un brazo.

17. Un vector que comprende

a) un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16; o

b) un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en el que el vector es un vector de expresión.

18. Una célula huésped que comprende

a) un polinucleótido de las reivindicaciones 10-16; o

b) un polinucleótido de las reivindicaciones 10-16, en la que la célula huésped es

i) una célula procariótica; o

ii) E. coli, opcionalmente en la que el genotipo de la E. coli carece de genes degP y prc y alberga un gen spr mutante; o

iii) E. coli de una cepa carente de i) actividades proteasa endógena; o ii) actividades proteasa endógena, en la que el genotipo de la E. coli carece de genes degP y prc y alberga un gen spr mutante.

19. La célula huésped de la reivindicación 18, en la que la célula huésped

a) comprende además un polinucleótido que codifica i) una proteína chaperona procariótica; o ii) una proteína chaperona procariótica, en la que la proteína chaperona procariótica es DsbA y/o DsbC; y/o b) en la que la célula huésped sobreexpresa una proteína chaperona procariótica.

20. Un procedimiento de preparación de un polipéptido heterólogo (tal como una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo), comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 18-19 de modo que se exprese el ácido nucleico, con lo que, tras la expresión de dicho polinucleótido en una célula huésped, el polipéptido heterólogo se pliega para formar un polipéptido heterólogo biológicamente activo.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que el procedimiento comprende además

a) recuperar el polipéptido heterólogo del i) cultivo de la célula huésped; o ii) el cultivo de la célula huésped, en el que el polipéptido heterólogo se recupera del medio de cultivo de la célula huésped; y/o

b) combinar el polipéptido heterólogo recuperado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, excipiente o vehículo para preparar una formulación farmacéutica que comprenda el polipéptido heterólogo.

22. Un procedimiento de secreción de un polipéptido heterólogo (tal como una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo) de una célula, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 18-19 de modo que se exprese el ácido nucleico y se secrete el polipéptido heterólogo.

23. Un procedimiento de translocación de un polipéptido heterólogo (tal como una cadena pesada y/o cadena ligera de anticuerpo) de una célula, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 18-19 de modo que se exprese el ácido nucleico y se transloque el polipéptido heterólogo.