ES2617777T3 - Producción de proteínas heteromultiméricas - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar una proteína heteromultimérica que comprende un primer polipéptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerización y un segundo polipéptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerización, en el que el segundo dominio de heterodimerización interacciona con el primer dominio de heterodimerización, y en el que el primer y el segundo polipéptidos que contienen bisagras se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, y en el que cada uno del primer y el segundo polipéptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y del segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el método las etapas de: (a) cultivar una primera célula hospedadora, que comprende un primer ácido nucleico que codifica el primer polipéptido que contiene bisagra, en condiciones en las que el polipéptido que contiene bisagra se expresa y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer par; (b) cultivar una segunda célula hospedadora, que comprende un primer ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido que contiene bisagra, en condiciones en las que el polipéptido que contiene bisagra se expresa y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el segundo par; (c) romper las membranas celulares de la primera y la segunda células hospedadoras, para liberar el primer y el segundo polipéptidos que contienen bisagra de las células hospedadoras para formar una proteína heteromultimérica, en el que la primera y la segunda células hospedadoras se han combinado entre sí en una única suspensión; y (d) recuperar la proteína heteromultimérica, en el que dicho método no requiere la adición de un reductor.

Description

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DESCRIPCION
Produccion de protemas heteromultimericas
La presente invencion se refiere a metodos para la produccion de protemas heteromultimericas.
Antecedentes
Los anticuerpos monoclonales del tipo IgG contienen dos ramas de union a antigeno identicas y un dominio constante (Fc). En la naturaleza no aparecen anticuerpos con una especificidad diferente en sus ramas de union y, por lo tanto, tienen que fabricarse con la ayuda de la ingeniena qmmica (por ejemplo, reticulacion qmmica, etc.), ADN recombinante y/o tecnologfa de fusion celular.
Los anticuerpos biespedficos pueden unirse simultaneamente con dos antigenos diferentes. Esta propiedad permite el desarrollo de estrategias terapeuticas que no son posibles con anticuerpos monoclonales convencionales. El gran panel de formatos de anticuerpos biespedficos imaginativos que se ha desarrollado refleja el fuerte interes por estas moleculas. Vease Berg J, Lotscher E, Steimer KS, et al., “Bispecific antibodies that mediate killing of cells infected with human immunodeficiency virus of any strain,” Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88(11): 4723-4727 y Fischer N y Leger O., “Biospecific Antibodies: Molecules That Enable Novel Therapeutic Strategies”, Pathobiology (2007) 74: 314.
Otra clase de moleculas multiespedficas es la de las protemas de fusion recombinantes. Las protemas de fusion recombinantes que consisten en el dominio extracelular de protemas inmunorreguladoras y el dominio constante (Fc) de inmunoglobulina (Ig) representan una clase creciente de productos terapeuticos humanos. Las inmunoadhesinas combinan la region de union de una secuencia proteica, con una especificidad deseada, con el dominio efector de un anticuerpo. Las inmunoadhesinas tienen dos propiedades importantes que son significativas para su potencial como agentes terapeuticos: la especificidad de diana, y la estabilidad farmacocinetica (semivida in vivo que es comparable a la de anticuerpos). Las inmunoadhesinas pueden usarse como antagonistas para inhibir o bloquear interacciones deletereas o como agonistas para imitar o potenciar las respuestas fisiologicas. Vease Chamow SM, Zhang DZ, Tan XY, et al., “A humanized, bispecific immunoadhesin-antibody that retargets CD3+ effectors to kill HIV-1-infected cells”, J Hematother 1995; 4(5): 439-446.
Otras moleculas multiespedficas se han analizado en otra parte. Los ejemplos incluyen pero sin limitacion: Fisher et al., Pathobiology (2007) 74: 3-14 (revision de diversos formatos biespedficos); Patente de Estados Unidos n.° 6.660.843, expedida el 9 de diciembre de 2003 de Feige et al. (pepticuerpos); Publicacion de Patente de Estados Unidos n.° 2002-004587 publicada el 10 de enero de 2002 (anticuerpos multiespedficos); Patente de Estados Unidos n.° 7612181 expedida el 3 de noviembre de 2009 de Wu et al. (formato de dominio Variable Doble); Patente de Estados Unidos n.° 6.534.628, Nord K et al., Prot Eng (1995) 8: 601-608, Nord K et al., Nat Biotech (1997) 15: 772-777 y Gronwall et al., Biotechnol Appl Biochem. (2008) Jun; 50(Pt2): 97-112 (aficuerpos); Martens et al., Clin Cancer Res (2006), 12: 6144-6152 y Jin et al., Cancer Res (2008) 68(11): 4360-4368 (anticuerpos de una rama); Bostrom et al., Science (2009) 323: 1610-1614 (Fab de Accion Doble, tambien conocido como anticuerpos de valencia mixta). Los expertos en la materia conocen otros formatos.
La fabricacion de material de uso clfnico sigue siendo un reto para las moleculas multiespedficas descritas anteriormente. Como se ha indicado anteriormente, existen muchas rutas para la produccion de moleculas con ramas de union mixtas, es decir, ramas de union que no son identicas entre sf. Cada uno de estos metodos tiene sus desventajas.
La reticulacion qmmica es laboriosa ya que puede ser aun necesario purificar la especie relevante de homodfmeros y otros productos secundarios indeseados. Ademas, las etapas de modificacion qmmica pueden alterar la integridad de las protemas conduciendo de este modo a escasa estabilidad. Por lo tanto, este metodo es con frecuencia ineficaz y puede conducir a perdida de la actividad de anticuerpo.
La tecnologfa de fusion celular (por ejemplo, hibridomas dbridos) expresa dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que se ensamblan aleatoriamente lo que conduce a la generacion de 10 combinaciones de anticuerpos. Los anticuerpos heteromultimericos deseados son solamente una fraccion pequena de los anticuerpos producidos de este modo. La purificacion de las protemas heteromultimericas deseadas reduce drasticamente los rendimientos de produccion y aumenta los costes de fabricacion.
Se han usado tecnicas de ADN recombinante para generar diversos formatos heteromultimericos, por ejemplo, Fv monocatenarios, diacuerpos, etc., que no comprenden un dominio Fc. Una desventaja importante de este tipo de molecula de anticuerpo es la falta del dominio Fc y por lo tanto la capacidad del anticuerpo para desencadenar una funcion efectora (por ejemplo, activacion del complemento, union a receptor de Fc, etc.). Por lo tanto, se desea un anticuerpo biespedfico que comprenda un dominio Fc funcional.
Tambien se han usado tecnicas de ADN recombinante para generar anticuerpos biespedficos de “boton en ojal”.
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Vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos 20030078385 y documentos WO 98/50431 (Arathoon et al., Genentech), US 5.807.706 (Carter et al, Genentech) y otros. Una restriccion de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales tienen que ser identicas para evitar el desapareamiento y la formacion de moleculas indeseadas y/o inactivas debido a que se expresan en la misma celula.
El documento WO 2006/028956 describe la preparacion de anticuerpos biespedficos con una especificidad por el receptor Fcy RIIB, usando la tecnologfa de boton en ojal. El documento WO 2004/009618 se refiere a produccion recombinante de mezclas de anticuerpos.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de metodos alternativos para producir protemas heteromultimericas. La invencion descrita en el presente documento proporciona dichos metodos. Estos y otros aspectos y ventajas de la invencion resultaran evidentes a partir de la descripcion de la invencion proporcionada en el presente documento.
Breve sumario de la invencion
La produccion de protemas heteromultimericas, por ejemplo, anticuerpos multiespedficos, usando tecnicas actuales tiene desventajas incluyendo la produccion de una mezcla de productos, rendimiento reducido y/o reduccion/eliminacion de la funcion efectora entre otros. Por lo tanto, es deseable producir protemas heteromultimericas eficazmente y a altos niveles.
La produccion de moleculas de anticuerpo, por diversos medios, en general se entiende bien. La patente de Estados Unidos 6331415 (Cabilly et al.), por ejemplo, describe un metodo para la produccion recombinante de inmunoglobulina en el que las cadenas pesadas y ligeras se expresan simultaneamente a partir de un unico vector o a partir de dos vectores distintos en una unica celula. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2): 191-202) y Lee y Kwak (2003, J. Biotechnology 101: 189-198) describen la produccion de anticuerpos monoclonales a partir de cadenas pesadas y ligeras producidas por separado, usando plasmidos expresados en distintos cultivos de E. coli. Diversas otras tecnicas relevantes para la produccion de anticuerpos se describen, por ejemplo, en Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988) y documento WO2006028936. Aun asf cada uno de estos tiene desventajas tales como bajo rendimiento y uso de productos qmmicos.
Los metodos de la invencion proporcionan la expresion de cada componente, por ejemplo, una rama de un anticuerpo, de una protema heteromultimerica que contiene una bisagra en una celula hospedadora separada y el ensamblaje de la protema heteromultimerica que contiene bisagra, por ejemplo, un anticuerpo multiespedfico, sin la adicion de un reductor.
La presente invencion proporciona un proceso/metodo de produccion facil y eficaz que permite la produccion economica de protemas heteromultimericas, por ejemplo, anticuerpos multiespedficos.
La invencion proporciona metodos eficaces y nuevos para producir complejos de inmunoglobulina multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos multiespedficos) y otras protemas multimericas (denominadas colectivamente en el presente documento protemas heteromultimericas) que superan limitaciones de metodos tradicionales. Pueden proporcionarse protemas heteromultimericas, tales como anticuerpos biespedficos, como un polipeptido heteromultimerico altamente homogeneo de acuerdo con metodos de la invencion. Ademas, los metodos proporcionados en el presente documento no se basan en la adicion de un reductor para conseguir la formacion de al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro enlaces disulfuro intercatenarios en la protema heteromultimerica.
(1) Un metodo para preparar una protema heteromultimerica que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario y
en el que cada uno del primero y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y el segundo par comprenden secuencias de dominio variable diferentes,
comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) cultivar una primera celula hospedadora que comprende un primer acido nucleico que codifica el primer polipeptido que contiene bisagra en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer par;
(b) cultivar una segunda celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica el segundo polipeptido que contiene bisagra en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el segundo par;
(c) romper las membranas celulares de las primera y segunda celulas hospedadoras para liberar el primer y
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el segundo polipeptidos que contienen bisagra de las celulas hospedadoras para formar una protema heteromultimerica, en el que la primera y la segunda celulas hospedadoras se han combinado entre sf en una unica suspension; y
(d) recuperar la protema heteromultimerica, en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
(2) Un metodo para preparar una protema heteromultimerica que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario y
en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y el segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable,
comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) cultivar una primera celula hospedadora que comprende un primer acido nucleico que codifica el primer polipeptido que contiene bisagra en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa, emparejado con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer par y secretarse al medio de cultivo;
(b) cultivar una segunda celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica el segundo polipeptido que contiene bisagra en condiciones en las que se expresa el polipeptido que contiene bisagra, emparejado con una cadena ligera de anticuerpo para formar el segundo par y secretarse al medio de cultivo;
y
(c) recuperar la protema heteromultimerica del medio de cultivo, en el que el medio de cultivo de la primera y la segunda celulas hospedadoras se han combinado entre sf para formar la protema heteromultimerica,
en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
(3) El metodo de (1) o (2), en el que el primer dominio de heterodimerizacion y el segundo dominio de heterodimerizacion se encuentran en una interfaz, y la parte de interfaz del segundo dominio de heterodimerizacion comprende una protuberancia (un boton) que puede situarse en una cavidad (un ojal) en la parte de interfaz del primer dominio de heterodimerizacion, en el que la protuberancia comprende una cadena lateral de aminoacido que se proyecta desde la parte de interfaz del segundo dominio de heterodimerizacion, y la cavidad comprende una cadena lateral de aminoacido que forma un hueco desde la parte de interfaz del primer dominio de heterodimerizacion.
(4) El metodo de (1) o (2), en el que dicho enlace disulfuro intercatenario esta entre regiones bisagra.
(5) El metodo de (l) o (2), en el que la celula hospedadora es una celula procariota, particularmente una celula E. coli, mas particularmente una celula E. coli deficiente en Ipp.
(6) El metodo de (1) o (2), en el que la celula hospedadora es una celula de mairnfero, particularmente una celula CHO.
(7) El metodo de uno cualquiera de (1) a (6), en el que las celulas de las etapas (a) y (b) estan en distintos cultivos celulares.
(8) El metodo de uno cualquiera de 1 a (6), en el que las celulas de las etapas (a) y (b) estan en un cultivo mixto que comprende ambas celulas hospedadoras.
(9) El metodo de (7), en el que las celulas de las etapas (a) y (b) se (i) combinan, (ii) centrifugan y (iii) resuspenden en tampon antes de romper la membrana celular o se (i) centrifugan, (ii) resuspenden en tampon y (iii) combinan antes de romper la membrana celular.
(10) El metodo de (1) o (2), en el que la etapa de recuperacion comprende ademas al menos una etapa de purificacion.
(11) El metodo de (1) o (2), en el que la protema heteromultimerica es un anticuerpo biespedfico o un anticuerpo multiespedfico.
(12) El metodo de (11), en el que dicho anticuerpo es humanizado o humano.
(13) El metodo de (11), en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
(14) El metodo de (11), en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA e IgD, particularmente el anticuerpo es IgG, mas particularmente IgG1 o IgG2.
(15) El metodo de (1) o (2), en el que al menos 45 % de los polipeptidos estan en un complejo que comprende el primer par de polipeptido que contiene bisagra y cadena ligera y el segundo par de polipeptido que contiene bisagra y cadena ligera.
(16) El metodo de (10), en el que no mas del 10% de los polipeptidos aislados estan presentes como monomeros u homodfmeros antes de la etapa de purificacion de la protema heteromultimerica.
(17) Un metodo para generar una biblioteca de protemas heteromultimericas combinatoria que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, y en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y
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esta emparejado con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y el segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el metodo las etapas de:
cultivar una primera celula hospedadora y al menos dos celulas hospedadoras adicionales, en el que dicha primera celula hospedadora comprende un primer acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene bisagra; y
dichas celulas hospedadoras adicionales comprenden un acido nucleico que codifica un segundo polipeptido que contiene bisagra;
en condiciones en las que los polipeptidos que contienen bisagra se expresan y se emparejan con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer y el segundo par;
romper las membranas celulares de la primera celula hospedadora y las al menos dos celulas hospedadoras adicionales de modo que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se liberan al medio extracelular, en el que la primera celula hospedadora y las al menos dos celulas hospedadoras adicionales se han combinado entre sf en una unica suspension; y recuperar los complejos de protemas heteromultimericas,
en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
(18) Un metodo para generar una biblioteca de protemas heteromultimericas combinatoria que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, y en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena de anticuerpo pesada y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y el segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el metodo las etapas de:
cultivar una primera celula hospedadora y al menos dos celulas hospedadoras adicionales, en el que dicha primera celula hospedadora comprende un primer acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene bisagra; y
dichas celulas hospedadoras adicionales comprenden un acido nucleico que codifica un segundo polipeptido que contiene bisagra;
en condiciones en las que los polipeptidos que contienen bisagra se expresan, y se emparejan con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer y el segundo par y se secretan al medio de cultivo; y recuperar los complejos de protemas heteromultimericas del medio de cultivo, en el que el medio de cultivo de la primera celula hospedadora y las al menos dos celulas hospedadoras adicionales se han combinado entre sf para formar la protema heteromultimerica, en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
Adicionalmente, en el presente documento se describe un metodo para la preparacion de una protema heteromultimerica que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) cultivar la primera celula hospedadora que comprende un primer acido nucleico que codifica el primer polipeptido que contiene bisagra en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa;
(b) cultivar una segunda celula hospedadora que comprende un acido nucleico que codifica el segundo polipeptido que contiene bisagra en condiciones en las que se expresa el polipeptido que contiene bisagra;
(c) romper las membranas celulares de modo que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se liberen al medio extracelular, en el que la primera y la segunda celulas se han combinado entre sf en una unica suspension; y
(d) recuperar la protema heteromultimerica,
en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
Se describe ademas un metodo para preparar una protema heteromultimerica que comprende protema heteromultimerica que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) proporcionar un primer polipeptido que contiene bisagra purificado que tiene un primer dominio de
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heterodimerizacion;
(b) proporcionar un segundo polipeptido que contiene bisagra purificado que tiene un segundo dominio de
heterodimerizacion;
(c) combinar el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra;
(d) replegar el primer polipeptido que contiene bisagra con el segundo polipeptido que contiene bisagra; y
(e) recuperar el complejo de protemas heteromultimericas.
Adicionalmente, en el presente documento se describe un metodo para preparar una protema heteromultimerica que comprende incubar un primer par de polipeptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, y un segundo par de polipeptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, en condiciones que permiten la multimerizacion del primer y el segundo par de polipeptidos para formar una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, en el que las condiciones no comprenden la adicion de un reductor; en el que el primer par de polipeptidos es capaz de unirse con una primera diana; en el que el segundo par de polipeptidos es capaz de unirse con una segunda molecula diana; y en el que el polipeptido de Fc del primer polipeptido de cadena pesada y el polipeptido de Fc del segundo polipeptido de cadena pesada se encuentran en una interfaz, y la interfaz del segundo polipeptido de Fc comprende una protuberancia que puede situarse en una cavidad en la interfaz del primer polipeptido de Fc.
Adicionalmente, en el presente documento se describe un metodo para generar una biblioteca combinatoria de protemas heteromultimericas, comprendiendo dicho metodo un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, comprendiendo el metodo las etapas de:
(a) cultivar una primera celula hospedadora y al menos dos celulas hospedadoras adicionales, en el que
a. dicha primera celula hospedadora comprende un primer acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene dominio de heterodimerizacion; y
b. dichas celulas hospedadoras adicionales comprenden un acido nucleico que comprende un segundo polipeptido que contiene dominio de heterodimerizacion,
(b) combinar la primera y al menos dos celulas hospedadoras adicionales;
(c) tratar las celulas de modo que el primer y el segundo polipeptidos que contienen dominio de
heterodimerizacion se liberan al medio extracelular; y
(d) recuperar las protemas heteromultimericas,
en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
Adicionalmente, en el presente documento se describen las protemas heteromultimericas producidas por los metodos descritos en el presente documento.
Debe entenderse que los metodos descritos en el presente documento pueden incluir otras etapas que en general son etapas rutinarias evidentes para el inicio y/o la complecion del proceso abarcado por metodos de la invencion como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en una realizacion, la etapa (a) de un metodo como se describe en el presente documento se precede de una etapa en la que un acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene bisagra se introduce en una primera celula hospedadora, y un acido nucleico que codifica un segundo polipeptido que contiene bisagra se introduce en una segunda celula hospedadora. En una realizacion, los metodos descritos en el presente documento comprenden ademas una etapa de purificar protemas heteromultimericas que tienen especificidad de union por al menos dos dianas distintas. En una realizacion, no estan presentes mas de aproximadamente 10 %, 15 % o 20 % de polipeptidos aislados como monomeros o dfmeros de cadena pesada-ligera antes de la etapa de purificacion de las protemas heteromultimericas.
En una realizacion, el primer y/o segundo polipeptido que contiene bisagra es una cadena pesada de anticuerpo. En una realizacion adicional, la cadena pesada de anticuerpo se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para proporcionar un par de cadenas pesada-ligera. En algunas realizaciones, el par de cadenas pesada-ligera esta unido covalentemente. En otra realizacion, el par de cadenas pesada-ligera define una rama de union a diana. En algunas realizaciones, las ramas de union a diana son identicas. En algunas realizaciones, las ramas de union a diana reconocen cada una dos dianas distintas.
En algunas realizaciones, el primer y/o segundo polipeptido que contiene bisagra comprende una region Fc. En otra realizacion el primer y/o segundo polipeptido que contiene bisagra comprende al menos un dominio pesado constante. En otra realizacion, el primer y/o segundo polipeptido que contiene bisagra comprende un dominio de cadena pesada variable. En otra realizacion, el primer y/o segundo polipeptido que contiene bisagra comprende un dominio de union a receptor. En algunas realizaciones, el primer y/o segundo polipeptido que contiene bisagra son sustancialmente identicos (es decir, el dominio de heterodimerizacion puede no ser identico a las regiones fuera del dominio de heterodimerizacion que son identicas). En algunas realizaciones, el primer y/o el segundo polipeptido
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que contiene bisagra no son identicos.
En algunas realizaciones, la protema heteromultimerica se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo multiespedfico, un anticuerpo de una rama, anticuerpo monovalente monoespedfico, un anticuerpo monovalente multiespedfico, un maxicuerpo biespedfico, un monocuerpo, una inmunoadhesina, un pepticuerpo, un pepticuerpo biespedfico, un pepticuerpo monovalente, un aficuerpo y una protema de fusion del receptor.
En algunas realizaciones, dichas protemas heteromultimericas comprenden una region bisagra que tiene al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o cualquier numero entero hasta todos, de los restos de cistema que normalmente son capaces de formar un enlace disulfuro entre cadenas pesadas. En algunas realizaciones, se han introducido cistemas adicionales en la region bisagra.
Una protema heteromultimera descrita en el presente documento tambien puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como, por ejemplo, un Fc o polipeptido de fusion de Fc, siempre que comprenda la region bisagra de una inmunoglobulina. Un polipeptido de fusion de Fc generalmente comprende un polipeptido de Fc (o fragmento del mismo) fusionado con una secuencia polipeptfdica heterologa (tal como un dominio de union a antfgeno), tal como un dominio extracelular de receptor (ECD) fusionado con un polipeptido de Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, ECD de receptor de Fit fusionado con un IgG2 Fc). Por ejemplo, en una realizacion, un polipeptido de fusion de Fc comprende un dominio de union a VEGF, que puede ser un receptor de VEGF, que incluye fit, flk, etc. Una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento comprende en general un dominio constante de cadena pesada y un dominio constante de cadena ligera. En una realizacion, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento comprende una modificacion (por ejemplo, pero sin limitacion, insercion de uno o mas aminoacidos, por ejemplo, para formar una secuencia de dimerizacion tal como una cremallera de leucina) para la formacion de dimerizacion o multimerizacion entre cadenas pesadas. En algunas realizaciones, esta ausente una parte (pero no todo) del polipeptido Fc en un heteromultfmero descrito en el presente documento, siempre que conserve la region bisagra de una inmunoglobulina. En algunas de estas realizaciones, la secuencia ausente del polipeptido de Fc es una parte de o todo el dominio CH2 y/o CH3. En algunas de estas realizaciones, la protema heteromultimerica comprende un dominio de dimerizacion (tal como una secuencia de cremallera de leucina), por ejemplo fusionado con el extremo C terminal del fragmento de cadena pesada. En algunas de estas realizaciones, la protema heteromultimerica comprende un dominio de dimerizacion que comprende mutaciones para proporcionar un dominio de dimerizacion de “boton en ojal” (como se define adicionalmente posteriormente).
En algunas realizaciones de los metodos y protemas heteromultimericas descritas en el presente documento, los polipeptidos que contienen bisagra comprenden al menos una caractenstica que promueve la heterodimerizacion, mientras que minimiza la homodimerizacion, del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra (por ejemplo, entre polipeptidos de Fc de las cadenas pesadas). Dicha caractenstica o dichas caractensticas mejoran el rendimiento y/o la pureza y/o homogeneidad de las poblaciones de protemas heteromultimericas que pueden obtenerse por metodos como se describen en el presente documento. En una realizacion, los polipeptidos de Fc de un primer polipeptido que contiene bisagra y un segundo polipeptido que contiene bisagra se encuentran/interaccionan en una interfaz. En algunas realizaciones en las que los polipeptidos de Fc del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se encuentran en una interfaz, la interfaz del segundo polipeptido de Fc comprende una protuberancia que puede situarse en una cavidad en la interfaz del primer polipeptido de Fc. En una realizacion, el primer polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la cavidad o el segundo polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la protuberancia, o ambos. En una realizacion, el primer polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la cavidad y el segundo polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la protuberancia, o ambos. En una realizacion, la interfaz del segundo polipeptido de Fc comprende una protuberancia que puede situarse en una cavidad en la interfaz del primer polipeptido de Fc, en el que la cavidad o protuberancia, o ambos, se han introducido en la interfaz del primer y el segundo polipeptidos de Fc, respectivamente. En algunas realizaciones en las que el primer y el segundo polipeptidos de Fc se encuentran en una interfaz, la interfaz del primer polipeptido de Fc comprende una protuberancia que puede situarse en una cavidad en la interfaz del segundo polipeptido de Fc. En una realizacion, el segundo polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la cavidad o el primer polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la protuberancia, o ambos. En una realizacion, el segundo polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la cavidad y el primer polipeptido de Fc se ha alterado a partir de un polipeptido molde/original para codificar la protuberancia, o ambos. En una realizacion, la interfaz del primer polipeptido de Fc comprende una protuberancia que puede situarse en una cavidad en la interfaz del segundo polipeptido de Fc, en el que la protuberancia o cavidad, o ambas, se han introducido en la interfaz del primer y segundo polipeptidos de Fc, respectivamente.
En una realizacion, la protuberancia y cavidad comprenden cada una un resto de aminoacido de origen natural. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende la protuberancia se genera reemplazando un resto original de la interfaz de un polipeptido molde/original con un resto importado que tiene un mayor volumen de cadena lateral que el resto original. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende la protuberancia se genera por un metodo que comprende una etapa en la que el acido nucleico que codifica un resto original de la interfaz de dicho polipeptido
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se reemplaza con acido nucleico que codifica un resto importado que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el original. En una realizacion, el resto original es treonina. En una realizacion, el resto importado es arginina (R). En una realizacion, el resto importado es fenilalanina (F). En una realizacion, el resto importado es tirosina (Y). En una realizacion, el resto importado es triptofano (W). En una realizacion, el resto importado es R, F, Y o W. En una realizacion, se genera una protuberancia reemplazando dos o mas restos en un polipeptido molde/original. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una protuberancia comprende reemplazo de treonina en la posicion 366 con triptofano, numeracion de aminoacidos de acuerdo con el esquema de numeracion de EU de Kabat et al. (pags. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, MD)).
En algunas realizaciones, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad se genera reemplazando un resto original en la interfaz de un polipeptido molde/original con un resto importado que tiene un volumen de cadena lateral menor que el resto original. Por ejemplo, el polipeptido de Fc que comprende la cavidad puede generarse por un metodo que comprende una etapa en la que el acido nucleico que codifica un resto original de la interfaz de dicho polipeptido se reemplaza con acido nucleico que codifica un resto importado que tiene un volumen de cadena lateral menor que el original. En una realizacion, el resto original es treonina. En una realizacion, el resto original es leucina. En una realizacion, el resto original es tirosina. En una realizacion, el resto importado no es cistema (C). En una realizacion, el resto importado es alanina (A). En una realizacion, el resto importado es serina (S). En una realizacion, el resto importado es treonina (T). En una realizacion, el resto importado es valina (V). Puede generarse una cavidad reemplazando uno o mas restos originales de un polipeptido molde/original. Por ejemplo, en una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende reemplazo de dos o mas aminoacidos originales seleccionados del grupo que consiste en treonina, leucina y tirosina. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende dos o mas restos importados seleccionados del grupo que consiste en alanina, serina, treonina y valina. En algunas realizaciones, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende reemplazo de dos o mas aminoacidos originales seleccionados del grupo que consiste en treonina, leucina y tirosina y en el que dichos aminoacidos originales se reemplazan con restos importados seleccionados del grupo que consiste en alanina, serina, treonina y valina. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende reemplazo de treonina en la posicion 366 con serina, numeracion de aminoacidos de acuerdo con el esquema de numeracion de EU de Kabat et al., mencionado anteriormente. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende reemplazo de leucina en la posicion 368 con alanina, numeracion de aminoacidos de acuerdo con el esquema de numeracion de EU de Kabat et al., mencionado anteriormente. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende reemplazo de tirosina en la posicion 407 con valina, numeracion de aminoacidos de acuerdo con el esquema de numeracion de EU de Kabat et al., mencionado anteriormente. En una realizacion, el polipeptido de Fc que comprende una cavidad comprende dos o mas reemplazos de aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en T366S, L368A y Y407V, numeracion de aminoacidos de acuerdo con el esquema de numeracion de EU de Kabat et al., mencionado anteriormente. En algunas realizaciones de estos fragmentos de anticuerpo, el polipeptido de Fc que comprende la protuberancia comprende reemplazo de treonina en la posicion 366 con triptofano, numeracion de aminoacidos de acuerdo con el esquema de numeracion de EU de Kabat et al., mencionado anteriormente.
En diversas realizaciones, el polipeptido de Fc del primer y el segundo polipeptidos de cadena pesada pueden ser o no identicos, siempre que sean capaces de dimerizar para formar una region de Fc (como se define en el presente documento). Un primer polipeptido de Fc esta en general unido de forma contigua a uno o mas dominios de una cadena pesada de inmunoglobulina en un unico polipeptido, por ejemplo con secuencias de dominio bisagra, constante y/o variable. En una realizacion, el primer polipeptido de Fc comprende al menos una parte (incluyendo toda) de una secuencia bisagra, al menos una parte (incluyendo toda) de un dominio Ch2 y/o al menos una parte (incluyendo todo) de un dominio Ch3. En una realizacion, el primer polipeptido de Fc comprende la secuencia bisagra y los dominios Ch2 y Ch3 de una inmunoglobulina. En una realizacion, el segundo polipeptido de Fc comprende al menos una parte (incluyendo toda) de una secuencia bisagra, al menos una parte (incluyendo toda) de un dominio Ch2 y/o al menos una parte (incluyendo todo) de un dominio Ch3. En una realizacion, el segundo polipeptido de Fc comprende la secuencia bisagra y los dominios Ch2 y Ch3 de una inmunoglobulina. En una realizacion, un anticuerpo como se describe en el presente documento comprende primer y segundo polipeptidos de Fc cada uno de los cuales comprende al menos una parte del al menos un dominio constante de anticuerpo. En una realizacion, el dominio constante de anticuerpo es un dominio Ch2 y/o Ch3. En cualquiera de las realizaciones de un anticuerpo como se describe en el presente documento que comprende un dominio constante, el dominio constante de anticuerpo puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo una IgG. La fuente de inmunoglobulina puede ser de cualquier especie de origen adecuada (por ejemplo, una IgG puede ser IgGi humana) o de forma sintetica.
En una realizacion, un primer polipeptido de cadena ligera y un segundo polipeptido de cadena ligera en una primera y una segunda rama de union de molecula diana, respectivamente, de un anticuerpo como se describe en la invencion comprenden diferentes/distintos determinantes de union a antfgeno (por ejemplo, diferentes/distintas secuencias de dominio variable). En una realizacion, un primer polipeptido de cadena ligera y un segundo polipeptido de cadena ligera en una primera y una segunda rama de union a molecula diana, respectivamente, de un anticuerpo como se describe en el presente documento comprenden el mismo (es decir, uno comun) determinante de union a antfgeno, por ejemplo, la misma secuencia de dominio variable).
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Los metodos descritos en el presente documento son capaces de generar moleculas heteromultimericas con alta homogeneidad. En consecuencia, la divulgacion proporciona metodos en los que al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de polipeptidos estan en un complejo que comprende un primer par de polipeptidos de cadena pesada y ligera y un segundo par de polipeptidos de cadena pesada y ligera. En una realizacion, la divulgacion proporciona metodos en los que entre aproximadamente el 60 y el 99 %, el 70 y el 98 %, el 75 y el 97 %, el 80 y el 96 %, el 85 y el 96 %, o el 90 y el 95 % de los polipeptidos estan en un complejo que comprende un primer par de polipeptidos de cadena pesada y ligera y un segundo par de polipeptidos de cadena pesada y ligera.
En una realizacion, un anticuerpo como se describe en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgE, IgA, IgM e IgD. En algunas realizaciones, la region bisagra de un anticuerpo como se describe en el presente documento es preferentemente de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA e IgD. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una region de anticuerpo o bisagra de un anticuerpo es de IgG, que en algunas realizaciones es IgG1 o IgG2 (por ejemplo, IgG2a o IgG2b). En algunas realizaciones, un anticuerpo como se describe en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA e IgD. En una realizacion, el anticuerpo es de origen humano, humanizado, quimerico o no humano (por ejemplo, murino).
Protemas heteromultimericas como se describe en el presente documento son en general capaces de unirse, preferentemente de forma espedfica, con antigenos. Dichos antfgenos incluyen, por ejemplo, antfgenos tumorales, factores reguladores de la supervivencia celular, factores reguladores de la proliferacion celular, moleculas asociadas con (por ejemplo, que se sabe o se sospecha que contribuyen funcionalmente a) el desarrollo o la diferenciacion tisular, moleculas de superficie celular, linfocinas, citocinas, moleculas implicadas en la regulacion del ciclo celular, moleculas implicadas en la vasculogenesis y moleculas asociadas con (por ejemplo, que se sabe o se sospecha que contribuyen funcionalmente a) la angiogenesis. Un antfgeno con el que una protema heteromultimerica, como se describe en el presente documento, es capaz de unirse puede ser un miembro de un subconjunto de una de las categonas anteriormente mencionadas, en el que el otro o los otros subconjuntos de dicha categona comprenden otras moleculas/antfgenos que tienen una caractenstica definida (con respecto al antfgeno de interes). Tambien puede considerarse que un antfgeno de interes pertenece a dos o mas categonas. En una realizacion, la divulgacion proporciona una protema heteromultimerica que se une, preferentemente de forma espedfica, con un antfgeno tumoral que no es una molecula de superficie celular. En una realizacion, un antfgeno tumoral es una molecula de superficie celular, tal como un polipeptido receptor. En otro ejemplo, en algunas realizaciones, una protema heteromultimerica, como se describe en el presente documento se une, preferentemente de forma espedfica, con un antfgeno tumoral que no es un factor de diferenciacion de grupos. En otro ejemplo, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es capaz de unirse, preferentemente de forma espedfica, con un factor de diferenciacion de grupos, que en algunas realizaciones, por ejemplo, no es CD3 o CD4. En algunas realizaciones, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo anti VEGF. En algunas realizaciones, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo biespedfico seleccionado del grupo que consiste en IL-1alfa/IL-1beta, IL-12/IL-18; IL- 13/IL-9; IL-13/IL-4; IL-13/IL-5; IL-5/IL-4; IL-13/IL-Ibeta; IL-13/IL-25; IL-13/TARC; IL-13/MDC; IL-13/MEF; IL-13/TGF-p IL-13/agonista de LHR; IL-12/TWEAK, IL-13/CL25; IL-13/SPRR2a; IL-13/SPRR2b; IL-13/ADAM8, IL-13/PED2, IL17A/IL17F, CD3/CD19, CD138/CD20; CD138/CD40; CD19/CD20; CD20/CD3; CD38/CD138; CD38/CD20; CD38/CD40; CD40/CD20; CD-8/IL-6; CD20/BR3, TNFalfa/TGF-beta, TNFalfa/IL-1 beta; TNFalfa/IL-2, TNFalfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNFalfa/IL-15, TNFalfa/IL-20, TNFalfa/IL-23, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, TNFalfa/VEGF, TNFalfa/MIF, TNFalfa/ICAM-1, TNFalfa/PGE4, TNFalfa/PEG2, TNFalfa/ligando RANK, TNFalfa/Te38; TNFalfa/BAFF; TNFalfa/CD22; TNFalfa/CTLA-4; TNFalfa/GP130; TNFa/IL- 12p40; VEGF-A/HER2, VEGF-A/HER2, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, HER2/DR5, VEGF/MET, VEGFR/receptor MET, VEG-FR/EGFR, HER2/CD64, HER2/CD3, HER2/CD16, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R, TNFR1/IL-18R, EpCAM/CD3, MAPG/CD28, EGFR/CD64, CSPGs/RGM A; CTLA-4/BTNO2; IGF1/IGF2; IGF1/2/Erb2B; MAG/RGM A; NgR/RGM A; NogoA/RGM A; OMGp/RGM A; PDL-I/CTLA-4; Y RGM A/RGM B, IL1p/IL18, NRP1/VEGFA, VEGFA/NRP2, cMET/EGFR, ALK1/BMP9, VEG-FA/a5p1, HER1/HER3-BU y CMV. En algunas realizaciones, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento se une con al menos dos moleculas diana seleccionadas del grupo que consiste en: a5p1, ALKl, BMP9, IL-1alfa, IL-1beta, TARC, MDC, MEF, TGF-p, agonista LHR CD3, CD4, CD16, CD3, CD4, CD16, CD3, CD4, CD16, CD28, CD40, CD38, CD64, CD138, CD-8, BR3, TNFalfa, TGF-beta, IL-11, IL-12, IL-13, IL-11, IL-10, IL-11, IL-3, I L-4, I L-5, IL-17, IL-17, IL-17, IL-17, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-23, IL-25, IFNalfa, MIF, ICAM-1, PGE4, PEG2, ligando RANK, Te38, BAFF, CTLA-4, GP130, IL-12p40, VEGF, VEGF-A, PDGF, HER1, HER2, HER3, HER3-BU, HER4, VEGF-C, VEGF-D, DR5, CMET, MET, receptor de MET, VEGFR, EGFR, CD40L, TNFR1, IL-1R, IL-6R, IL-18R, EpCAM, MAPG, CSPGs, BTNO2, IGF1, IGF2, IGF1/2, Erb2B, MAG, NgR , NRP1, NRP2, OMGp, PDL-I, RGM A y RGM B. En algunas realizaciones, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento se une con CD3 y al menos una molecula diana adicional seleccionada de BLR1, BR3, CD19, CD20, CD22, CD72, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CR2, FcRH1, FcRH2, FcRH5, FCER2, FCRL4, HLA-DOB y NAG14.
Las primera y segunda celulas hospedadoras en metodos de la invencion pueden cultivarse en cualquier situacion que permita la expresion y el aislamiento de los polipeptidos de interes. Por ejemplo, en una realizacion, la primera
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celula hospedadora y la segunda celula hospedadora en un metodo de la invencion se cultivan como cultivos celulares distintos. En otra realizacion, la primera celula hospedadora y la segunda celula hospedadora en un metodo de la invencion se cultivan como un cultivo mixto que comprende ambas celulas hospedadoras.
En algunas realizaciones, al menos una, al menos dos, al menos tres o mas celulas hospedadoras que expresan polipeptidos que contienen bisagra adicionales pueden cultivarse bien en el mismo cultivo o bien en distintos cultivos como la primera y/o la segunda celulas hospedadoras que contienen bisagra. En algunas realizaciones, el polipeptido o los polipeptidos que contienen bisagras adicionales comprenden el mismo dominio de heterodimerizacion que el primer polipeptido que contiene bisagra. En algunas realizaciones, el polipeptido o los polipeptidos que contiene bisagras adicionales comprenden el mismo dominio de heterodimerizacion que el segundo polipeptido que contiene bisagra.
Las protemas heteromultimericas pueden modificarse para potenciar y/o anadir caractensticas deseadas adicionales. Dichas caractensticas incluyen funciones biologicas tales como funciones efectoras inmunitarias, una semivida/eliminacion in vivo deseable, biodisponibilidad, biodistribucion u otras caractensticas farmacocineticas. Dichas modificaciones se conocen bien en la tecnica y tambien pueden determinarse empmcamente, y pueden incluir modificaciones por restos que pueden estar o no basados en peptidos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden estar glucosilados o aglucosilados, generalmente dependiendo al menos en parte de la naturaleza de la celula hospedadora. Preferentemente, los anticuerpos como se describen en el presente documento estan aglucosilados. Un anticuerpo aglucosilado producido por un metodo de la invencion puede posteriormente glucosilarse, por ejemplo, usando metodos de glucosilacion in vitro bien conocidos en la tecnica. Como se ha descrito anteriormente y en el presente documento, pueden producirse protemas heteromultimericas como se describe en el presente documento en una celula procariota, tal como, por ejemplo, E. coli. Las protemas heteromultimericas producidas por E. coli en general estan aglucosiladas y carecen de las funciones biologicas normalmente asociadas con perfiles de glucosilacion hallados en protemas heteromultimericas producidas por celulas hospedadoras de mairnfero (por ejemplo, CHO).
La divulgacion tambien proporciona inmunoconjugados que comprenden una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento conjugada con un resto heterologo. Cualquier resto heterologo sena adecuado siempre que su conjugacion con el anticuerpo no reduzca sustancialmente una funcion y/o caractenstica deseada del anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un resto heterologo que es un agente citotoxico. En algunas realizaciones, dicho agente citotoxico se selecciona del grupo que consiste en un isotopo radiactivo, un agente quimioterapeutico y una toxina. En algunas realizaciones, dicha toxina se selecciona del grupo que consiste en calicheamicina, maitansina y tricoteno. En algunas realizaciones, un inmunoconjugado comprende un resto heterologo que es un marcador detectable. En algunas realizaciones, dicho marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un isotopo radiactivo, un miembro de un par de ligando-receptor, un miembro de un par de enzima-sustrato y un miembro de un par de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia.
En un aspecto, la divulgacion proporciona composiciones que comprenden una protema heteromultimerica de la invencion y un vehmulo, que en algunas realizaciones es farmaceuticamente aceptable.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona composiciones que comprenden un inmunoconjugado como se describe en el presente documento y un vehmulo, que en algunas realizaciones es farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto, la divulgacion proporciona una composicion que comprende una poblacion de protemas heteromultimericas multiespedficas como se describe en el presente documento. Como resultana evidente para un experto en la materia, en general dicha composicion no sena completamente (es decir, 100%) homogenea. Sin embargo, como se describe en el presente documento, los metodos de la invencion son capaces de producir una poblacion sustancialmente homogenea de protemas heteromultimericas multiespedficas. Por ejemplo, la divulgacion proporciona una composicion que comprende protemas heteromultimericas, en las que al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 % , 97 %, 98 %, 99 % de dichas protemas heteromultimericas son un anticuerpo multiespedfico (por ejemplo, un anticuerpo biespedfico, etc.) como se describe en el presente documento.
En un aspecto, la divulgacion proporciona un cultivo celular que comprende una mezcla de una primera celula hospedadora y una segunda celula hospedadora, en la que la primera celula hospedadora comprende acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene bisagra, y la segunda celula hospedadora comprende acido nucleico que codifica un segundo polipeptido que contiene bisagra, y en la que los dos pares tienen diferentes especificidades de union a diana. En un aspecto, la divulgacion proporciona un cultivo celular que comprende una mezcla de una primera celula hospedadora y una segunda celula hospedadora, en la que la primera celula hospedadora expresa un primer par de polipeptidos de cadena pesada y ligera, y la segunda celula hospedadora expresa un segundo par de polipeptidos de cadena pesada y ligera, y en la que los dos pares tienen diferentes especificidades de union a diana.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona artmulos de fabricacion que comprenden un recipiente y una
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composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende una protema heteromultimerica (por ejemplo, un anticuerpo) de la invencion. En otro aspecto, la divulgacion proporciona artmulos de fabricacion que comprenden un recipiente y una composicion contenida en el mismo, en el que la composicion comprende un inmunoconjugado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, estos artmulos de fabricacion comprenden ademas instrucciones para usar dicha composicion.
En otro aspecto mas, la divulgacion proporciona polinucleotidos que codifican una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento. En otra realizacion mas, la divulgacion proporciona polinucleotidos que codifican un inmunoconjugado como se describe en el presente documento.
En un aspecto, la divulgacion proporciona vectores recombinantes para expresar una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) como se describe en el presente documento. En otro aspecto, la divulgacion proporciona vectores recombinantes para expresar un inmunoconjugado como se describe en el presente documento.
Puede usarse cualquiera de varias celulas hospedadoras en metodos de la invencion. Dichas celulas se conocen en la tecnica (algunas de las cuales se describen en el presente documento) o pueden determinarse empmcamente con respecto a conveniencia para uso en metodos de la invencion usando tecnicas rutinarias conocidas en este campo. En una realizacion, una celula hospedadora es procariota. En algunas realizaciones, una celula hospedadora es una celula bacteriana gram negativa. En una realizacion, una celula hospedadora es E. coli. En algunas realizaciones, la E. coli es de una cepa deficiente en lipoprotema (Alpp). En algunas realizaciones, el genotipo de una celula hospedadora E. coli carece de genes degP y prc y alberga un gen de spr mutante. En una realizacion, una celula hospedadora es de mairnfero, por ejemplo, una celula de Ovario de Hamster Chino (CHO).
En un aspecto, la divulgacion proporciona celulas hospedadoras que comprenden un polinucleotido o vector recombinante como se describe en el presente documento. En una realizacion, una celula hospedadora es una celula de mai^ero, por ejemplo una celula de Ovario de Hamster Chino (CHO). En una realizacion, una celula hospedadora es una celula procariota. En algunas realizaciones, una celula hospedadora es una celula bacteriana gram negativa, que en algunas realizaciones es E. coli. Las celulas hospedadoras como se describen en el presente documento pueden comprender ademas un polinucleotido o vector recombinante que codifica una molecula cuya expresion en una celula hospedadora potencia la produccion de una protema heteromultimerica en un metodo de la invencion. Por ejemplo, dicha molecula puede ser una protema chaperona. En una realizacion, dicha molecula es un polipeptido procariota seleccionado del grupo que consiste en DsbA, DsbC, DsbG y FkpA. En algunas realizaciones, dicho polinucleotido o vectores recombinantes codifica tanto DsbA como DsbC. En algunas realizaciones, una celula hospedadora E. coli es de una cepa deficiente en actividades proteasa endogenas. En algunas realizaciones, el genotipo de una celula hospedadora E. coli es el de una cepa de E. coli que carece de genes de degP y prc y alberga un gen de spr mutante. En algunas realizaciones, el genotipo de una celula hospedadora E. coli es Alpp.
Las protemas heteromultimericas como se describen en el presente documento encuentran una diversidad de usos en una diversidad de situaciones. En un ejemplo, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo terapeutico. En otro ejemplo, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo agonista. En otro ejemplo, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo antagonista. Una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento tambien puede ser un anticuerpo de diagnostico. En otro ejemplo mas, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo de bloqueo. En otro ejemplo, una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento es un anticuerpo neutralizante.
En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para tratar o retardar una enfermedad en un sujeto, comprendiendo dichos metodos administrar una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento a dicho sujeto. En una realizacion, la enfermedad es cancer. En otra realizacion, la enfermedad esta asociada con la desregulacion de la angiogenesis. En otra realizacion, la enfermedad es un trastorno inmunitario, tal como artritis reumatoide, purpura trombocitopenica inmunitaria, lupus eritematoso sistemico, etc.
En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de una protema heteromultimerica (por ejemplo, un anticuerpo) como se describe en el presente documento en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con angiogenesis.
En un aspecto, la divulgacion proporciona el uso de un acido nucleico de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con angiogenesis.
En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de un vector de expresion de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con angiogenesis.
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En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de una celula hospedadora de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con angiogenesis.
En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de un artmulo de fabricacion de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, una enfermedad proliferativa celular, un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con angiogenesis.
En un aspecto, la divulgacion proporciona uso de un kit de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento terapeutico y/o profilactico de una enfermedad, tal como un cancer, un tumor, un trastorno proliferativo celular, un trastorno inmunitario (tal como autoinmunitario) y/o un trastorno relacionado con angiogenesis.
Otros objetos, elementos y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada y los ejemplos espedficos, aunque indican realizaciones preferidas de la invencion, se proporcionan solamente como ilustracion, ya que diversos cambios y modificaciones resultaran evidentes para un experto en la materia a partir de esta descripcion detallada.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1A ilustra un semianticuerpo completamente oxidado. No se muestran los dominios de “boton” u “ojal” u otro de heterodimerizacion. El semianticuerpo representado en esta figura es un isotipo IgG1. Un experto en la materia apreciara que los otros isotipos de inmunoglobulina pueden preverse como semianticuerpos con los enlaces inter e intracatenarios correspondientes. En un Ab intacto las cistemas de bisagra formaran enlaces disulfuro intercatenarios.
La Figura 1B ilustra un anticuerpo biespedfico de longitud completa. No se representan los enlaces disulfuro entre cadenas pesadas en la region bisagra.
La Figura 2A y B ilustra plasmidos que codifican los semianticuerpos de boton y ojal, respectivamente.
La Figura 3A ilustra la produccion de protemas heteromultimericas, por ejemplo, anticuerpos biespedficos, usando el metodo de cadena ligera comun. El BsAb producido tiene dos cadenas pesadas diferentes emparejandose cada una con una cadena ligera comun.
La Figura 3B ilustra la produccion de protemas heteromultimericas, por ejemplo, anticuerpos biespedficos, usando semianticuerpos expresados y modificados tecnicamente por separado. El BsAb producido tfpicamente tiene dos cadenas pesadas diferentes, cada una emparejada con su cadena ligera afm. En este metodo cada cadena ligera no es necesariamente igual para cada semianticuerpo.
La Figura 4A es un diagrama de flujo para la produccion de anticuerpos biespedficos usando semianticuerpos expresados y modificados tecnicamente por separado. En este metodo, se usa qrnmica redox.
La Figura 4B muestra un gel tenido con Coomassie. Los dos semianticuerpos se analizaron en condiciones reductoras y no reductoras mediante SDS-PAGE. La fraccion predominante es el par de cadena pesada-cadena ligera de 75 kD para cada semianticuerpo en condiciones no reductoras. En condiciones reductoras (por ejemplo, tratamiento con DTT) cada cadena es visible como una banda separada.
La Figura 4C muestra los resultados de la espectrometna de masas de ESI-TOF de un semianticuerpo con y sin tratamiento con N-etilmaleimida (NEM) 1 mM. No se observa ningun cambio en la masa del semianticuerpo tras el tratamiento con NEM lo que indica que todas las cistemas estan completamente oxidadas. Las cistemas de bisagra oxidadas se representan como un disulfuro dclico en la secuencia de aminoacidos representada. La masa esperada para el semianticuerpo es de 72.548 Dalton, que es lo que se observa mediante espectrometna de masas lo que indica que no hay aductos covalentes.
La Figura 4D muestra el cromatograma de carboximetilo (CM), una fotograffa de un gel de SDS-PAGE y la masa desconvolucionada para la produccion de un anticuerpo biespedfico anti EGFR/anti c-met. La cromatograffa de CM produce un unico pico que se analiza posteriormente mediante SDS-PAGE. La banda principal en el gel es el anticuerpo biespedfico de longitud completa (es decir, intacto). Tambien puede verse una banda menor en el intervalo de 75 kD. La banda mayor se analizo posteriormente mediante espectrometna de masas e indico que el unico producto de anticuerpo intacto detectable estaba de acuerdo con la PM teorica de un anticuerpo biespedfico anti EGFR/anti c-met.
La Figura 5A es un diagrama de flujo para la produccion a gran escala de anticuerpos biespedficos usando semianticuerpos expresados y modificados tecnicamente por separado.
La Figura 5B es una fotograffa de un gel que muestra que los semianticuerpos purificados eran principalmente la especie de ~75 kD en condiciones no reductoras. En condiciones reductoras (por ejemplo, tratamiento con DTT) cada cadena es visible como una banda separada.
La Figura 5C muestra los resultados del analisis de SDS-PAGE del biespedfico purificado despues de retirada de agregados que indican que la especie principal es el anticuerpo biespedfico intacto a 150 kD. Tambien se muestran las mismas muestras en condiciones reductoras lo que indica que todo el producto aislado es una cadena de anticuerpo ligera o pesada.
La Figura 6A es una grafica que muestra la actividad biologica de los anticuerpos en un ensayo de proliferacion de celulas TF-2 que ensaya la neutralizacion de las citocinas IL-4 e IL-13. La grafica muestra que el biespedfico
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posee actividad similar a los dos anticuerpos de longitud completa, producidos por mairffferos, anadidos juntos o por separado.
La Figura 6B es un panel de tres graficas que muestran las propiedades farmacocineticas (PK) de un anticuerpo biespedfico anti IL-4/anti IL-13 en monos cinomolgus para el Fc de tipo silvestre y un Fc mutado como se determina por ELISA. La primera grafica muestra las propiedades PK a una dosis de 2 mg/kg para el Fc de tipo silvestre. La grafica media muestra las propiedades PK a una dosis de 20 mg/kg, tambien para el Fc de tipo silvestre. La grafica final muestra las propiedades PK a una dosis de 20 mg/kg para el Fc mutante. El biespedfico muestra las dos eliminaciones de compartimento esperadas en los animales ensayados. Las hembras estan representadas por sfmbolos cerrados y los machos estan representados por sfmbolos abiertos. En tres animales, se vio una respuesta antiterapeutica como se indica por la reduccion aguda en el anticuerpo medido en el suero el dfa 21.
La Figura 7 es una fotograffa de un gel de poliacrilamida. Se mezclo caldo de cultivo de fermentacion completo antes de la lisis a diversas relaciones. Despues se extrajo protema de lisis y se cargo en el gel en condiciones no reductoras. Son visibles biespedficos purificados formados durante este procedimiento como la banda superior en el gel.
La Figura 8A es una fotograffa de dos geles de poliacrilamida que comparan la produccion de anticuerpos biespedficos cuando las celulas se cultivan por separado con un cocultivo de las celulas que expresan los semianticuerpos. El biespedfico intacto se forma en un nivel mucho mayor en condiciones de cocultivo. Cuando los semianticuerpos se expresan y se purifican de forma independiente, y despues se mezclan, los semianticuerpos forman menos del 5 % del biespedfico intacto. En condiciones de cocultivo, mas del 40 % es un biespedfico intacto como se determina por 150 kD/(150 kD + 75 kD) usando determinaciones de protema de nucleo-Li.
La Figura 8B es un esquema de un experimento de cocultivo que vana la poblacion celular del inoculo inicial. Las relaciones usadas y la cantidad relativa de biespedfico de longitud completa se muestran en la parte de abajo de la figura.
La Figura 8C es una fotograffa de un gel para tres procesamientos de fermentacion de 10 litros separados de una relacion celular 1:1 de anti EGFR y anti c-Met. Cada procesamiento produjo como el producto principal el biespedfico de longitud completa lo que indica la reproducibilidad del proceso.
La Figura 8D es un diagrama de flujo del proceso de cocultivo para la produccion de protemas heteromultimericas, por ejemplo anticuerpos biespedficos.
La Figura 8E es un cromatograma de la absorbancia de UV a 280 nm que identifica dos picos significativos en tiempos de retencion de 91,79 y 102,35. El analisis posterior por espectrometna de masas indico que el anticuerpo biespedfico intacto se separaba eficazmente del semianticuerpo en exceso.
La Figura 8F muestra el analisis del Pico 91,79 de la Figura 8E mediante SDS-PAGE y espectrometna de masas. La desconvolucion de los datos de espectrometna de masas produjo un unico pico en 146.051,89 Dalton, que esta de acuerdo con la masa esperada del anticuerpo biespedfico. No se detectaron especies homodimericas contaminantes.
La Figura 8G es una comparacion de los flujos de trabajo para produccion independiente y produccion de cocultivo de protemas heteromultimericas.
La Figura 9A muestra tres cromatogramas. El cromatograma superior no muestra ningun pico de absorbancia durante la elucion para la muestra sin EDTA. El cromatograma medio muestra que la muestra con EDTA tiene un pico de elucion distinto del que se recuperaron aproximadamente 1,5 mg de protema. El cromatograma inferior muestra que la muestra tratada con EDTA y Mg tambien mostraba un pico de elucion similar del que se recuperaron 1,1 mg de protema. Las protemas recuperadas de la muestra de EDTA, muestra de EDTA mas Mg y un grupo de fracciones del mismo tiempo de retencion de la muestra de EDTA no tratada se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras.
La Figura 9B es una fotograffa del gel de SDS-PAGE descrito en la Figura 9A. Las muestras tratadas con EDTA han producido anticuerpo biespedfico intacto que se ha liberado al medio de cultivo.
La Figura 9C-1, Figura 9C-2 y Figura 9C-3 muestran los cromatogramas de espectrometna de masas para las muestras recuperadas y descritas en la Figura 9A. Las muestras con el EDTA mostraron la masa esperada para el anticuerpo biespedfico y una masa para el semianticuerpo en exceso.
La Figura 9D es una fotograffa de un gel de SDS-PAGE y cromatogramas de masas de las bandas indicadas. El Carril 1 es marcadores de PM, el Carril 2 es anti IL-13 expresado de forma independiente, el Carril 3 es anti IL-4 expresado de forma independiente y el Carril 4 es un cocultivo de las dos celulas. El analisis de espectrometna de masas de las tres muestras muestra que el cocultivo produce el biespedfico intacto y un exceso de un semianticuerpo, anti IL-4. Esto indica que el semianticuerpo anti IL-13 es estequiometricamente limitante. Cuando se expresan y se purifican de forma independiente semianticuerpos, y despues se mezclan, los semianticuerpos forman aproximadamente 2% (anti IL-13) y 3% (anti IL-4) del biespedfico intacto. En condiciones de cocultivo, aproximadamente 60 % es un biespedfico intacto como se determina por 150 kD/(150 kD + 75 kD) usando determinaciones de protema de Nucleo Li.
La Figura 9E-1 y Figura 9E-2 muestran dos cromatogramas de HIC para dos cocultivos que teman diferentes relaciones celulares en el inoculo de fermentacion inicial como se indica. Se observa una clara diferencia en el producto que refleja la relacion de inoculo inicial. Usando este enfoque resulta evidente que la relacion de inoculo inicial puede alterarse para conseguir produccion optima de la protema heteromultimerica.
La Figura 9F es un panel de cuatro fotograffas que muestran el analisis de SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de ocho anticuerpos biespedficos diferentes producidos por el proceso de cocultivo
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descrito en el presente documento. Los geles no reductores para las protemas heteromultimericas anti CD3/anti CD19 no se muestran. Las flechas indican los anticuerpos biespedficos intactos.
La Figura 10 es un esquema de un enfoque de matriz para explorar protemas heteromultimericas.
La Figura 11 muestra dos graficas para actividad in vitro de anticuerpos biespedficos producidos usando los metodos descritos en el presente documento.
La Figura 12 es una grafica que muestra que el biespedfico anti EGFR/anti c-met posee actividad antitumoral en un modelo in vivo de xenoinjerto pancreatico KP4.
La Figura 13 es una grafica que muestra que el biespedfico anti EGFR/anti c-met posee actividad antitumoral en un modelo in vivo de xenoinjerto de carcinoma epidermoide A431.
La Figura 14 muestra el HIC de A) preensamblaje de boton, B) preensamblaje de ojal, C) post ensamblaje biespedfico. La Figura 14D es un gel de preensamblaje de cada rama.
La Figura 15 muestra un electroforetograma de material ensamblado que indica que el 86 % del material esta completamente oxidado.
Figura 16: caracterizacion de biespedfico de ensamblado A) cromatograma de HIC de biespedfico hibridado indica que el material es >90,5 por ciento biespedfico, B) gel de material purificado, C) desconvolucion de espectrometna de masas de la muestra final y D) tabla de masas teoricas.
La Figura 17 es un esquema del procedimiento redox (con calor): a) la muestra se calienta durante una hora para permitir la ciclacion de enlaces disulfuro, b) despues se enfna y las cistemas se reducen usando DTT 2 mM durante dos horas, y c) despues se concentran y las cistemas se oxidan al aire por dialisis a temperatura ambiente.
La Figura 18 es un esquema de procedimiento redox (sin calor): a) la muestra se mezcla durante dos horas, b) las cistemas se reducen usando DTT 2 mM durante dos horas y c) despues se concentran y las cistemas se oxidan al aire mientras que se retira EDTA por dialisis a temperatura ambiente.
Figura 19: analftica de biespedfico ensamblado A) cromatograma de HIC usando procedimiento de redox con etapa de calentamiento, B) cromatograma de HIC usando procedimiento redox sin etapa de calentamiento.
Abreviaturas
ADCC = Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo
API = Inmunoadhesinas anti patogenos
BPI = Protema que aumenta la permeabilidad/bactericida
C1q = Factor de complemento 1q
CD = Grupo de Diferenciacion
CDC = Citotoxicidad dependiente del complemento
CH1 o Ch1 = Primer dominio constante de cadena pesada
CH2 o Ch2 = Segundo dominio constante de cadena pesada
CH3 o Ch3 = Tercer dominio constante de cadena pesada
CH4 o Ch4 = Cuarto dominio constante de cadena pesada
CL o Cl = Dominio constante de cadena ligera
CTLA = Molecula asociada a linfocito T citotoxico
Fc = Fragmento cristalizable
Fc(R) = Receptor gamma para la parte Fc de IgG
VIH = Virus de la inmunodeficiencia humana
ICAM = Molecula de adhesion intercelular
BsAb = Anticuerpo biespedfico
BsDb = Diacuerpo biespedfico
dsFv = Fv estabilizado por disulfuro
Fc = Fragmento constante de un anticuerpo
Fd = Vh + Ch1 de un anticuerpo
FcR = Receptor de Fc
Fv = Fragmento variable de un anticuerpo
IgG = Inmunoglobulina G
mAb = Anticuerpo monoclonal
PBL = Linfocito de sangre periferica
scDb = Diacuerpo monocatenario
scFv = Fv monocatenario
(scFv)2 = Tandem de scFv-scFv
Tandab = Diacuerpo en tandem
VH o Vh = Dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo VL o Vl = Dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo
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Descripcion detallada
La invencion se describira ahora en detalle por medio de referencia solamente usando las siguientes definiciones y ejemplos.
A no ser que se defina de otro modo en el presente documento, todos los terminos tecnicos y cientificos en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a los expertos en la materia un diccionario general de muchos de los terminos usados en la presente invencion. Aunque puede usarse cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la practica o el ensayo de la presente invencion, los metodos y materiales preferidos se describen. Los intervalos numericos incluyen los numeros que definen el intervalo. A no ser que se indique de otro modo, los acidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientacion de 5' a 3'; las secuencias de aminoacidos se escriben de izquierda a derecha en orientacion de amino a carboxilo, respectivamente. Los practicantes se dirigen particularmente a Sambrook et al., 1989 y Ausubel FM et al., 1993, para definiciones y terminos de la tecnica. Debe entenderse que la presente invencion no esta limitada a la metodologfa, los protocolos y los reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.
Los intervalos numericos incluyen los numeros que definen el intervalo.
A no ser que se indique de otro modo, los acidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientacion de 5' a 3'; las secuencias de aminoacidos se escriben de izquierda a derecha en orientacion de amino a carboxilo, respectivamente.
Los encabezamientos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invencion que pueden tenerse por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. En consecuencia, los terminos definidos inmediatamente a continuacion se definen mas completamente por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.
I. Definiciones
Un “heteromultfmero”, “complejo heteromultimerico” o “protema heteromultimerica” se refiere a una molecula que comprende al menos un primer polipeptido que contiene bisagra y un segundo polipeptido que contiene bisagra, en el que el segundo polipeptido que contiene bisagra difiere en su secuencia de aminoacidos del primer polipeptido que contiene bisagra en al menos un resto de aminoacido. El heteromultfmero puede comprender un “heterodfmero” formado por el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra o pueden formar estructuras terciarias de mayor orden en las que estan presentes polipeptidos ademas del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra. Los polipeptidos del heteromultimero pueden interaccionar entre sf por un enlace covalente, no peptfdico (por ejemplo, enlace disulfuro) y/o una interaccion no covalente (por ejemplo, enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, fuerzas de van der Waals y/o interacciones hidrofobas).
Como se usa en el presente documento, “dominio de heteromultimerizacion” se refiere a alteraciones o adiciones a una molecula biologica para promover la formacion de heteromultimeros y obstaculizar la formacion de homomultimeros. Cualquier dominio de heterodimerizacion que tenga una fuerte preferencia por formar heterodfmeros frente a homodfmeros esta dentro del alcance de la invencion. Los ejemplos ilustrativos incluyen pero sin limitacion, por ejemplo Solicitud de Patente de Estados Unidos 20030078385 (Arathoon et al. - Genentech; que describe botones en ojales); documento WO2007147901 (Kj^rgaard et al. - Novo Nordisk: que describe interacciones ionicas); documento WO 2009089004 (Kannan et al. - Amgen: que describe efectos de direccion electrostatica); Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos 61/243.105 (Christensen et al. - Genentech; que describe superenrollamientos). Vease tambien, por ejemplo, Pack, P. & Pluckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992) que describe cremallera de leucina o Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993) que describe el motivo de helice - vuelta - helice. La expresion “dominio de heteromultimerizacion” y “dominio de heterodimerizacion” se usan indistintamente en el presente documento.
La expresion “polipeptido que contiene bisagra” como se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido que comprende una region correspondiente a la region bisagra de una inmunoglobulina como se entiende en la tecnica, por ejemplo, la region entre los dominios Ch1 y Ch2 de la cadena pesada. La “region bisagra”, “secuencia bisagra” y variaciones de las mismas, como se usa en el presente documento, incluye el significado conocido en la tecnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway's Immunobiology, (Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, NY) (7a ed., 2008); Bloom et al., Protein Science (1997), 6: 407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209: 193-202. Vease tambien, por ejemplo, Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985) y Papadea, C. y I. J. Check (1989) “Human immunoglobulin G and immunoglobulin G subclasses: biochemical, genetic, and clinical aspects.” Crit Rev Clin Lab Sci 27(1): 27-58. Un experto en la materia apreciara que el numero de aminoacidos asf como el numero de restos de cistema disponibles para formacion de enlaces disulfuro intercatenarios vana entre las clases e isotipos de inmunoglobulinas. Todas estas regiones bisagra pueden estar en los polipeptidos que contienen bisagra
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y estan dentro del alcance de la invencion.
El termino “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido mas amplio y se refiere a cualquier molecula de inmunoglobulina (Ig) que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y cualquier fragmento, mutante, variante o derivacion de la misma siempre que muestren la actividad biologica deseada (por ejemplo, actividad de union a epftopo). Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos) y fragmentos de anticuerpo como se describe en el presente documento. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o de afinidad madurada.
Como marco de referencia, como se usa en el presente documento un anticuerpo se referira a la estructura de una inmunoglobulina G (IgG). Sin embargo, un experto en la materia entendena/reconocena que anticuerpo de cualquier clase de inmunoglobulina puede utilizarse en el metodo de la invencion descrito en el presente documento. Para mayor claridad, una molecula de IgG contiene un par de cadenas pesadas (HC) identicas y un par de cadenas ligeras (LC) identicas. Cada LC tiene un dominio variable (Vl) y un dominio constante (Cl), mientras que cada HC tiene un dominio variable (Vh) y tres constantes (Ch1, Ch2 y Ch3). Los dominios Ch1 y Ch2 estan conectados por una region bisagra. Esta estructura se conoce bien en la tecnica. Se hace referencia a la Figura 1B.
Como se usa en el presente documento, “semianticuerpo” se refiere a una cadena pesada de inmunoglobulina asociada con una cadena ligera de inmunoglobulina. Un semianticuerpo ejemplar se representa en la Figura 1A. Un experto en la materia apreciara facilmente que un semianticuerpo tambien puede tener un dominio de union a antfgeno que consiste en un unico dominio variable.
El termino “maxicuerpo” se refiere a una proterna de fusion que comprende un scFv fusionado con un polipeptido Fc. Se hace referencia a la Figura 8a del documento WO 2009089004. Se hace referencia a la Figura 2 del documento WO 2009089004 para un maxicuerpo biespedfico.
La expresion “dominio Ch2” de una region Fc de IgG humana se extiende habitualmente de aproximadamente los restos 231 a aproximadamente 340 del IgG de acuerdo con el sistema de numeracion de EU. El dominio Ch2 es unico porque no se empareja estrechamente con otro dominio. En su lugar, dos cadenas de carbohidratos ramificadas con enlaces N se interponen entre los dos dominios Ch2 de una molecula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el carbohidrato puede proporcionar un sustituto para el emparejamiento dominio-dominio y ayudar a estabilizar el dominio Ch2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (l985).
La expresion “dominio Ch3” comprende el tramo de restos C terminales de un dominio Ch2 en una region Fc (es decir, de aproximadamente el resto de aminoacido 341 a aproximadamente el resto de aminoacido 447 de un IgG de acuerdo con el sistema de numeracion de EU).
La expresion “region Fc”, como se usa en el presente documento, se refiere en general a un complejo dimerico que comprende las secuencias polipeptfdicas C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia polipeptfdica C terminal es la que puede obtenerse por digestion con paparna de un anticuerpo intacto. La region Fc puede comprender secuencias de Fc nativas o variantes. Aunque los Kmites de la secuencia de Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrian variar, se define habitualmente que la secuencia de Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde un resto de aminoacido en aproximadamente la posicion Cys226, o de aproximadamente la posicion Pro230, al extremo carboxilo terminal de la secuencia de Fc. A no ser que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeracion de los restos de aminoacidos en la region Fc o region constante es de acuerdo con el sistema de numeracion de EU, tambien denominado el mdice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. La secuencia de Fc de una inmunoglobulina comprende en general dos dominios constantes, un dominio Ch2 y un dominio Ch3, y opcionalmente comprende un dominio Ch4. Por “polipeptido de Fc” en el presente documento se entiende uno de los polipeptidos que componen una region Fc, por ejemplo, un Fc monomerico. Un polipeptido de Fc puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgG-i, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. La region Fc comprende las partes carboxilo terminales de ambas cadenas H mantenidas unidas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la region Fc; esta region tambien es la parte reconocida por receptores de Fc (FcR) hallados en ciertos tipos de celulas. En algunas realizaciones, un polipeptido de Fc comprende parte de o toda una secuencia bisagra de tipo silvestre (generalmente en su extremo N terminal). En algunas realizaciones, un polipeptido de Fc no comprende una secuencia bisagra funcional o de tipo silvestre.
Una “region Fc funcional” posee una “funcion efectora” de una region Fc de secuencia nativa. Las “funciones efectoras” ejemplares incluyen union a C1q; CDC; union al receptor de Fc; ADCC; fagocitosis; regulacion negativa de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la region Fc se combine con un dominio de union (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y puede evaluarse usando diversos ensayos como se desvela, por ejemplo, en definiciones del presente documento.
Una “region Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de
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aminoacidos de una region Fc hallada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una region Fc IgG1 humana de secuencia nativa (de alotipos distintos de A y A); region Fc IgG2 humana de secuencia nativa; region Fc IgG3 humana de secuencia nativa; y region Fc IgG4 humana de secuencia nativa asf como variantes de origen natural de las mismas.
Una “region Fc variante” comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la de una region Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificacion de aminoacido, preferentemente una o mas sustituciones de aminoacidos. Preferentemente, la region Fc variante tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con una region Fc de secuencia nativa o con la region Fc de un polipeptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoacidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoacidos en una region Fc de secuencia nativa o en la region Fc del polipeptido parental. La region Fc variante del presente documento preferentemente poseera al menos aproximadamente 80 % de homologfa con una region Fc de secuencia nativa y/o con una region Fc de un polipeptido parental, y mas preferentemente al menos aproximadamente 90 % de homologfa con la misma, mas preferentemente, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de homologfa con la misma.
El “componente de Fc” como se usa en el presente documento se refiere a una region bisagra, un dominio Ch2 o un dominio Ch3 de una region Fc.
En ciertas realizaciones, el polipeptido que contiene bisagra comprende una region Fc IgG, preferentemente derivada de una region Fc IgG humana de tipo silvestre. Por Fc IgG humana de tipo “silvestre” se entiende una secuencia de aminoacidos que aparece de forma natural dentro de la poblacion humana. Por supuesto, al igual que la secuencia de Fc puede variar ligeramente entre individuos, pueden realizarse una o mas alteraciones a una secuencia de tipo silvestre y aun permanecer dentro del alcance de la invencion. Por ejemplo, la region Fc puede contener alteraciones adicionales que no estan relacionadas con la presente invencion, tales como una mutacion en un sitio de glucosilacion o inclusion de un aminoacido no natural.
La expresion “region variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que esta implicada en la union del anticuerpo con el antfgeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (Vh y Vl, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (vease, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W. H. Freeman and Co., pagina 91 (2007).). Un unico dominio Vh o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de union a antfgeno. Ademas, pueden aislarse anticuerpos que se unan con un antfgeno particular usando un dominio Vh o Vl de un anticuerpo que se une con el antfgeno para explorar una biblioteca de dominios Vl o Vh complementarios, respectivamente. Vease, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
El termino “Fab” como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de union a antfgeno de un anticuerpo. Como se ha indicado anteriormente, puede usarse papama para digerir un anticuerpo intacto. La digestion con papama de anticuerpos produce dos fragmentos de union a antfgeno identicos, es decir, fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual (es decir, la region Fc, mencionada anteriormente). El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de region variable de la cadena H (Vh), y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1).
La expresion “rama de union a antigeno”, “rama de union a molecula diana”, “rama de union a diana” y variaciones de las mismas, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte componente de una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento que tiene la capacidad para unirse espedficamente con una diana de interes. En general y preferentemente, la rama de union a antfgeno es un complejo de secuencias polipeptfdicas de inmunoglobulina, por ejemplo, CDR y/o secuencias de dominio variable de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina.
Una “diana” o “molecula diana” se refiere a un resto reconocido por una rama de union de la protema heteromultimerica. Por ejemplo, si la protema heteromultimerica es un anticuerpo, entonces la diana puede ser epttopos en una unica molecula o en diferentes moleculas, o un patogeno o una celula tumoral, dependiendo del contexto. De forma similar, si la protema heteromultimerica es una protema de fusion de Fc-receptor la diana sena el companero de union afm para el receptor. Un experto en la materia apreciara que la diana se determina por la especificidad de union de la rama de union a diana y que diferentes ramas de union a diana pueden reconocer diferentes dianas. Una diana preferentemente se une con una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento con afinidad mayor de 1 pM Kd (de acuerdo con el analisis de Scatchard). Los ejemplos de moleculas diana incluyen, pero sin limitacion, protemas solubles en suero y/o sus receptores, tales como citocinas y/o receptores de citocinas, adhesinas, factores de crecimiento y/o sus receptores, hormonas, partmulas virales (por ejemplo, protema F de VSR, CMV, StaphA, gripe, virus de la hepatitis C), micoorganismos (por ejemplo, protemas de celulas bacterianas, celulas fungicas), adhesinas, protemas CD y sus receptores.
Un ejemplo de un anticuerpo “intacto” o “de longitud completa” es uno que comprende una rama de union a antfgeno
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as^ como un Cl y al menos dominios constantes de cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoacidos de los mismos.
El termino “acoplamiento” como se usa en el presente documento se refiere a las etapas necesarias para ligar el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra entre sf, por ejemplo, formacion de un enlace covalente. Dichas etapas comprenden la reduccion, hibridacion y/u oxidacion de restos de cistema en el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra para formar un enlace disulfuro intercatenario. El acoplamiento puede conseguirse mediante reticulacion qmmica o mediante el uso de un sistema redox. Vease, por ejemplo, Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1998)217: 1-10 y Zhu et al., Cancer Lett., (1994) 86: 127-134.
La expresion “anticuerpo multiespedfico” se usa en el sentido mas amplio y espedficamente abarca un anticuerpo que tiene especificidad poliepitopica. Dichos anticuerpos multiespedficos incluyen, pero sin limitacion, un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl), en el que la unidad VhVl tiene especificidad poliepitopica, anticuerpos que tienen dos o mas dominios Vl y Vh uniendose cada unidad VhVl con un epttopo diferente, anticuerpos que tienen dos o mas dominios variables individuales uniendose cada dominio variable individual con un epttopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespedficos y triacuerpos, fragmentos de anticuerpo que se han unido covalentemente o de forma no covalente. “Especificidad poliepitopica” se refiere a la capacidad para unirse espedficamente con dos o mas epttopos diferentes en la misma o diferentes dianas. “Monoespedfico” se refiere a la capacidad de unirse con un solo epftopo. De acuerdo con una realizacion el anticuerpo multiespedfico es un anticuerpo IgG que se une con cada epftopo con una afinidad de 5 pM a 0,001 pM, de 3 pM a 0,001 pM, de 1 pM a 0,001 pM, de 0,5 pM a 0,001 pM o de 0,1 pM a 0,001 pM. Se proporciona un dibujo ilustrativo de un biespedfico en la Figura 1B.
“Fragmentos de anticuerpo” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la region de union a antfgeno o una variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos (Db); diacuerpos en tandem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.641.870, Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos de una rama, anticuerpos de unico dominio variable, minicuerpos, moleculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, incluyendo pero sin limitacion, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3 y (scFV)4-Fc).
La expresion “anticuerpos monocatenarios” (sdAb) o “anticuerpos de un unico dominio variable (SVD)” generalmente se refieren a anticuerpos en los que un unico dominio variable (Vh o Vl) puede conferir union a antfgeno. En otras palabras, no es necesario que el dominio variable individual interaccione con otro dominio variable para reconocer el antfgeno diana. Los anticuerpos de un unico dominio consisten en un unico dominio de anticuerpo variable monomerico (Vh o Vl) en cada rama de union a antfgeno. Los ejemplos de anticuerpos de un unico dominio incluyen los derivados de camelidos (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburones nodriza) y los derivados de metodos recombinantes de seres humanos y anticuerpos de raton (Ward et al., Nature (1989) 341: 544-546; Dooley y Flajnik, Dev Comp Immunol (2006) 30: 43-56; Muyldermans et al., Trend Biochem Sci (2001) 26 : 230-235; Holt et al., Trends Biotechnol (2003): 21: 484-490; documentos WO 2005/035572; WO 03/035694; Davies y Riechmann, Febs Lett (1994) 339: 285-290; documentos WO00/29004; WO 02/051870). Un anticuerpo de un unico dominio variable puede estar presente en una rama de union a antfgeno (por ejemplo, homo o hetero-multimero) con otras regiones variables o dominios variables, en cuyo caso no es un anticuerpo de un unico dominio.
La expresion “anticuerpos lineales” se refiere en general a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tandem (Vh-Ch1 - Vh-Ch1) que, junto con polipeptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de union a antfgeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespedficos o monoespedficos.
La expresion tecnologfa de “boton en ojal” o “KnH” como se ha mencionado en el presente documento se refiere a la tecnologfa que dirige el emparejamiento de dos polipeptidos juntos in vitro o in vivo introduciendo una protuberancia (boton) en un polipeptido y una cavidad (ojal) en el otro polipeptido en una interfaz en la que interaccionan. Por ejemplo, se han introducido KnH en las interfaces de union de Fc:Fc, interfaces de Cl:Ch1 o interfaces de Vh/Vl de anticuerpos (por ejemplo, documentos US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431 y Zhu et al. (1997) Protein Science 6: 781-788). Esto es especialmente util para conducir el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes juntas durante la fabricacion de anticuerpos multiespedficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespedficos que tienen KnH en sus regiones Fc pueden comprender ademas dominios variables individuales unidos a cada region Fc, o comprender ademas diferentes dominios variables de cadena pesada que se emparejan con dominios variables de cadena ligera similares o diferentes. La tecnologfa de KnH tambien puede usarse para emparejar dos dominios extracelulares de receptores diferentes juntos o cualquier otra secuencia polipeptfdica que comprenda diferentes secuencias de reconocimiento de diana (por ejemplo, incluyendo aficuerpos, pepticuerpos y otras fusiones de Fc).
“Fv” consiste en un dfmero de un dominio de region variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en
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asociacion no covalente, estrecha. A partir del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada una de las cadenas H y L) que aportan los restos de aminoacidos para union a antigeno y confieren especificidad de union a antigeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR espedficas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse con antfgeno, aunque con frecuencia a una menor afinidad que el sitio de union completo.
“Fv monocatenario” tambien abreviado como “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo Vh y Vl conectados en una unica cadena polipeptidica. Preferentemente, el polipeptido sFv comprende ademas un enlazador polipeptfdico entre los dominios VH y VL, que permite que el sFv forme la estructura deseada para union a antigeno. Para una revision de sFv, vease Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995.
El termino “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequenos preparados construyendo fragmentos sFv (vease parrafo precedente) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 restos) entre los dominios Vh y Vl de modo que se consigue emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, fragmento que tiene dos sitios de union a antfgeno. Los diacuerpos biespedficos son heterodfmeros de dos fragmentos sFv “de cruce” en los que los dominios Vh y Vl de los dos anticuerpos estan presentes en diferentes cadenas polipeptfdicas. Se describen diacuerpos mas completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
La expresion “anticuerpo de una rama” o “anticuerpos de una rama” se refiere a un anticuerpo que comprende (1) un dominio variable unido por un enlace peptfdico con un polipeptido que comprende un dominio Ch2, un dominio Ch3 o un dominio Ch2-Ch3 y (2) un segundo dominio Ch2, Ch3 o Ch2-Ch3, en el que un dominio variable no se une por un enlace peptfdico con un polipeptido que comprende el segundo dominio Ch2, Ch3 o Ch2-Ch3. En una realizacion, el anticuerpo de una rama comprende 3 polipeptidos (1) un primer polipeptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, Vh), Ch1, Ch2 y Ch3, (2) un segundo polipeptido que comprende un dominio variable (por ejemplo, Vl) y un dominio Cl, y (3) un tercer polipeptido que comprende un dominio Ch2 y Ch3. En otra realizacion, el anticuerpo de una rama tiene una region bisagra parcial que contiene los dos restos de cistema que forman enlaces disulfuro que unen las cadenas pesadas constantes. En una realizacion, los dominios variables del anticuerpo de una rama forman una region de union a antfgeno. En otra realizacion, los dominios variables del anticuerpo de una rama son dominios variables individuales, en los que cada dominio variable individual es una region de union a antfgeno. En una realizacion, el anticuerpo de una rama es un anticuerpo de un unico dominio variable.
Los anticuerpos como se describe en el presente documento pueden ser anticuerpos “quimericos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica a u homologa de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas es identico a u homologo de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biologica deseada (Patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes en el presente documento incluyen anticuerpos primatizados que comprenden secuencias de union a antfgeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y secuencias de region constante humana.
Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quimericos que contienen secuencia minima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se han reemplazado restos de una region hipervariable del receptor por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo deseadas. En algunos casos, se reemplazan restos de region marco conservada (Fr) de la inmunoglobulina humana por estos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
“Pepticuerpo” o “pepticuerpos” se refiere a una fusion de peptidos generados aleatoriamente con un dominio Fc. Vease Patente de Estados Unidos N.° 6.660.843, expedida el 9 de diciembre de 2003 de Feige et al. Incluyen uno o mas peptidos unidos con el extremo N terminal, el extremo C terminal, cadenas laterales de aminoacidos, o con mas de uno de estos sitios. La tecnologfa de pepticuerpos permite el diseno de agentes terapeuticos que incorporen
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peptidos que se dirijan a uno o mas ligandos o receptores, peptidos de direccion tumoral, peptidos transportadores de membrana y similares. La tecnologfa de pepticuerpos ha demostrado ser util en el diseno de varias de estas moleculas, incluyendo peptidos lineales y restringidos por disulfuro, “multimeros peptidicos en tandem” (es decir, mas de un peptido en una unica cadena de un dominio Fc). Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 6.660.843; Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0195156, publicada el 16 de octubre de 2003 (correspondiente al documento WO 02/092620, publicada el 21 de noviembre de, 2002); Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0176352, publicada el 18 de septiembre de 2003 (correspondiente al documento WO 03/031589, publicado el 17 de abril de 2003); N.° de Serie de Estados Unidos 09/422.838, presentada el 22 de octubre de 1999 (correspondiente al documento WO 00/24770, publicado el 4 de mayo de 2000); Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0229023, publicada el 11 de diciembre de 2003; documento WO 03/057134, publicado el 17 de julio de 2003; Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0236193, publicada el 25 de diciembre de 2003 (correspondiente al documento PCT/US04/010989, presentado el 8 de abril de 2004); N.° de Serie de Estados Unidos, presentada el 18 de septiembre de 2003 (correspondiente al documento WO 04/026329, publicado el 1 de abril de 2004).
“Aficuerpos” o “aficuerpo” se refiere al uso de una protema unida por un enlace peptfdico con una region Fc, en la que la protema se usa como un armazon para proporcionar una superficie de union para una molecula diana. La protema es con frecuencia una protema de origen natural tal como una protema estafilococica A o dominio B de union a IgG, o la protema Z derivada del mismo (vease Nilsson et al (1987) Prot Eng 1, 107-113, y Patente de Estados Unidos N.° 5.143.844) o un fragmento o derivado de la misma. Por ejemplo, pueden crearse aficuerpos a partir de protemas Z variantes que tienen afinidad de union alterada con molecula o moleculas diana, en las que un segmento de la protema Z se ha mutado por mutagenesis aleatoria para crear una biblioteca de variantes capaz de unirse con una molecula diana. Los ejemplos de aficuerpos incluyen Patente de Estados Unidos N.° 6.534.628, Nord K et al, Prot Eng 8:601-608 (1995) y Nord K et al, Nat Biotech 15: 772-777 (1997). Biotechnol Appl Biochem. Jun 2008; 50(Pt 2): 97-112.
Como se usa en el presente documento, el termino “inmunoadhesina” designa moleculas que combinan la especificidad de union de una protema heterologa (una “adhesina”) con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de una secuencia de aminoacidos con una especificidad de union deseada, cuya secuencia de aminoacidos es distinta del sitio de reconocimiento y union al antfgeno de un anticuerpo (es decir, es “heterologa” en comparacion con una region constante de un anticuerpo) y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina (por ejemplo, CH2 y/o CH3 de una IgG). Las secuencias de adhesina ejemplares incluyen secuencias de aminoacidos contiguas que comprenden una parte de un receptor o un ligando que se une con una protema de interes. Las secuencias de adhesina tambien pueden ser secuencias que se unen con una protema de interes, pero no son secuencias de receptor o ligando (por ejemplo, secuencias de adhesina en pepticuerpos). Dichas secuencias polipeptfdicas pueden seleccionarse o identificarse por diversos metodos, incluyendo tecnicas de presentacion en fagos y metodos de clasificacion de alto rendimiento. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA (incluyendo IgA1 e IgA2), IgE, IgD o IgM.
“Complejo” o “en complejo” como se usa en el presente documento se refiere a la asociacion de dos o mas moleculas que interaccionan entre sf mediante enlaces y/o fuerzas (por ejemplo, fuerzas de van der Waals, hidrofobas, hidrofilas) que no son enlaces peptfdicos. En una realizacion, el complejo es heteromultimerico. Debena entenderse que la expresion “complejo proteico” o “complejo polipeptfdico” como se usa en el presente documento incluye complejos que tienen una entidad no proteica conjugada con una protema en el complejo proteico (por ejemplo, incluyendo pero sin limitacion, moleculas qrnmicas tales como una toxina o un agente de deteccion).
Una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento “que se une con un antfgeno de interes es una que se une con la diana con suficiente afinidad de modo que la protema heteromultimerica sea util como un agente de diagnostico y/o terapeutico en la direccion de una protema o una celula o tejido que expresa la diana, y no reacciona de forma cruzada significativamente con otras protemas. En dichas realizaciones, el alcance de la union de la protema heteromultimerica con una protema “no diana” sera menor de aproximadamente 10 % de la union del anticuerpo con su protema diana particular como se determina por analisis de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitacion (RIA) O ELISA. Con respecto a la union de una protema heteromultimerica con una molecula diana, la expresion “union espedfica” o “se une espedficamente con” o es “espedfica para” un polipeptido particular o un epftopo en una diana polipeptfdica particular significa union que es sensiblemente diferente de una interaccion no espedfica (por ejemplo, una interaccion no espedfica puede ser union con albumina de suero bovino o casema). La union espedfica puede medirse, por ejemplo, determinando la union de una molecula en comparacion con la union de una molecula de control. Por ejemplo, la union espedfica puede determinarse por competicion con una molecula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la union espedfica se indica si la union de la diana marcada con una sonda se inhibe competitivamente por exceso de diana no marcada. La expresion “union espedfica” o “se une espedficamente con” o es “espedfica para” un polipeptido particular o un epftopo en una diana polipeptfdica particular como se usa en el presente documento puede mostrarse, por ejemplo, por una molecula que tiene una Kd para la diana de al menos aproximadamente 200 nM, como alternativa al menos aproximadamente 150 nM, como
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alternativa al menos aproximadamente 100 nM, como alternativa al menos aproximadamente 60 nM, como alternativa al menos aproximadamente 50 nM, como alternativa al menos aproximadamente 40 nM, como alternativa al menos aproximadamente 30 nM, como alternativa al menos aproximadamente 20 nM, como alternativa al menos aproximadamente 10 nM, como alternativa al menos aproximadamente 8 nM, como alternativa al menos aproximadamente 6 nM, como alternativa al menos aproximadamente 4 nM, como alternativa al menos aproximadamente 2 nM, como alternativa al menos aproximadamente 1 nM, o mayor. En una realizacion, la expresion “union espedfica” se refiere a la union en la que una protema heteromultimerica se une con un polipeptido particular o epftopo en un polipeptido particular sin unirse sustancialmente con ningun otro polipeptido o epftopo polipeptfdico.
La “afinidad de union” se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un unico sitio de union de una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) y su companero de union (por ejemplo, un antigeno). A no ser que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, “afinidad de union” se refiere a la afinidad de union intrmseca que refleja una interaccion 1:1 entre miembros de un par de union (por ejemplo, anticuerpo y antigeno). La afinidad de una molecula X por su companera Y puede en general representarse por la constante de disociacion (Kd). Por ejemplo, la Kd puede ser de aproximadamente 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, o mas fuerte. La afinidad puede medirse por metodos habituales conocidos en la tecnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen con el antigeno lentamente y tienden a disociarse facilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen con el antigeno mas rapido y tienden a permanecer unidos mas tiempo. Se conoce en la tecnica una diversidad de metodos para medir la afinidad de union, cualquiera de los cuales puede usarse para fines de la presente invencion.
En una realizacion, el “Kd” o “valor de Kd” de acuerdo con la presente invencion se mide usando ensayos de resonancia de plasmon superficial usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con microplacas CM5 con diana inmovilizada (por ejemplo, antigeno) a ~10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, se activan microplacas biosensoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxi-succinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antfgeno se diluye con acetato sodico 10 mM, pH 4,8, en 5 |ig/ml (~0,2 |iM) antes de la inyeccion a un caudal de 5 ^l/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de protema acoplada. Despues de la inyeccion del antigeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear grupos que no han reaccionado. Para mediciones cineticas, se inyectan diluciones en serie dobles de Fab (por ejemplo, 0,78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 0,05 % (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 |il/min. Se calculan las velocidades de asociacion (kon) y velocidades de disociacion (koff) usando un modelo de union de Langmuir de uno a uno sencillo (Software BIAcore Evaluation version 3.2) ajustando simultaneamente el sensograma de asociacion y disociacion. La constante de disociacion en equilibrio (Kd) se calcula como la relacion koff/kon. Vease, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociacion supera 106 M-1 S'1 por el ensayo de resonancia de plasmon superficial anterior, la velocidad de asociacion puede determinarse usando una tecnica de interrupcion de fluorescencia que mide el aumento o la reduccion de la intensidad de emision de fluorescencia (excitacion = 295 nm; emision = 340 nm; pase de banda 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antfgeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2 en presencia de concentraciones crecientes de antfgeno como se mide en un espectrometro, tal como un espectrofotometro equipado con detencion de flujo (Aviv instruments) o un espectrofotometro SLM- Aminco serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
“Biologicamente activo” y “actividad biologica” y “caractensticas biologicas” con respecto a una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento, tal como un anticuerpo, fragmento, o derivado del mismo, significa que tiene la capacidad de unirse con una molecula biologica, excepto cuando se especifique otra cosa.
“Aislado”, cuando se usa para describir los diversos polipeptidos heteromultimericos significa un heteromultimero que se ha separado y/o recuperado de una celula o un cultivo celular del que se expreso. Son componentes contaminantes de su ambiente natural materiales que interferinan con los usos de diagnostico o terapeuticos para el heteromultfmero, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En ciertas realizaciones, el heteromultimero se purificara (1) hasta mas del 95 % en peso de protema como se determina por el metodo de Lowry, y mas preferentemente mas del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoacidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta su homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tincion de plata. Habitualmente, sin embargo, se preparara polipeptido aislado por al menos una etapa de purificacion.
Los heteromultfmeros descritos en el presente documento se purifican en general hasta su homogeneidad sustancial. Las expresiones “sustancialmente homogeneo”, “forma sustancialmente homogenea” y “homogeneidad sustancial” se usan para indicar que el producto esta sustancialmente desprovisto de productos secundarios originados de combinaciones de polipeptidos no deseadas (por ejemplo, homomultimeros).
Expresado con respecto a pureza, la homogeneidad sustancial significa que la cantidad de productos secundarios
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“Molecula biologica” se refiere a un acido nucleico, una protema, un carbohidrato, un lfpido y combinaciones de los mismos. En una realizacion, la molecula biologica existe en la naturaleza.
Por “unido” o “enlaces” como se usa en el presente documento se entiende una union por enlace peptidico directa entre una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o un enlace que implica una tercera secuencia de aminoacidos que esta unida por enlace peptidico con y entre la primera y la segunda secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, un peptido enlazador se unio al extremo C terminal de una secuencia de aminoacidos y al extremo N terminal de la otra secuencia de aminoacidos.
Por “enlazador” como se usa en el presente documento se entiende una secuencia de aminoacidos de dos o mas aminoacidos de longitud. El enlazador puede consistir en aminoacidos polares o no polares neutros. Un enlazador puede ser, por ejemplo, de 2 a 100 aminoacidos de longitud, tal como entre 2 y 50 aminoacidos de longitud, por ejemplo, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoacidos de longitud. Un enlazador puede ser “escindible”, por ejemplo, mediante auto-escision, o escision enzimatica o qmmica. Se conocen bien en la tecnica y tambien se describen en el presente documento sitios de escision en secuencias de aminoacidos y enzimas y productos qmmicos que escinden en dichos sitios.
Por un “anclaje” como se usa en el presente documento se entiende un enlazador de aminoacidos que une otras dos secuencias de aminoacidos. Un anclaje como se describe en el presente documento puede unir el extremo N terminal de un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina con el extremo C terminal de un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina. En realizaciones particulares, un anclaje es de entre aproximadamente 15 y 50 aminoacidos de longitud, por ejemplo, entre 20 y 26 aminoacidos de longitud (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 aminoacidos de longitud). Un anclaje puede ser “escindible”, por ejemplo, mediante auto-escision, o escision enzimatica o qmmica usando metodos y reactivos convencionales en la tecnica.
La escision enzimatica de un “enlazador” o un “anclaje” puede implicar el uso de una endopeptidasa tal como, por ejemplo, Lys-C, Asp-N, Arg-C, V8, Glu-C, quimiotripsina, tripsina, pepsina, papama, trombina, Genenasa, Factor Xa, TEV (cistema proteasa del virus del grabado del tabaco), Enteroquinasa, HRV C3 (proteasa C3 de rinovirus humano), Quininogenasa, asf como proprotema convertasas de tipo subtilisina (por ejemplo, Furina (PC1), PC2 o PC3) o convertasa dibasica de N-arginina. La escision qmmica puede implicar el uso de, por ejemplo, hidroxilamina, N-clorosuccinimida, N-bromosuccinimida o bromuro de cianogeno.
Un “sitio de escision de endopeptidasa Lys-C” como se usa en el presente documento es un resto de Lisina en una secuencia de aminoacidos que puede escindirse en el extremo C terminal mediante endopeptidasa Lys-C. La endopeptidasa Lys-C escinde en el extremo C terminal de un resto de Lisina.
Por un “agente caotropico” se entiende una sustancia soluble en agua que altera la estructura tridimensional de una protema (por ejemplo, un anticuerpo) interfiriendo con interacciones intra-moleculares estabilizantes (por ejemplo, enlaces de hidrogeno, fuerzas de van der Waals o efectos hidrofobos). Los agentes caotropicos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, urea, Guanidina-HCl, perclorato de litio, Histidina y Arginina.
Por un “detergente suave” se entiende una sustancia soluble en agua que altera la estructura tridimensional de una protema (por ejemplo, un anticuerpo) interfiriendo con interacciones intra-moleculares estabilizantes (por ejemplo, enlaces de hidrogeno, fuerzas de van der Waals o efectos hidrofobos), pero que no altera permanentemente la estructura proteica para provocar una perdida de actividad biologica (es decir, no desnaturaliza la protema). Los detergentes suaves ejemplares incluyen, pero sin limitacion, Tween (por ejemplo, Tween-20), Triton (por ejemplo, Triton X-100), NP-40 (nonil fenolxilpolietoxiletanol), Nonidet P-40 (octil fenoxilpolietoxiletanol) y Dodecil Sulfato Sodico (SDS).
Las “funciones efectoras” de anticuerpo se refieren a las actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de secuencia nativa o region Fc variante de secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo, y vanan con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: union de C1 q y citotoxicidad dependiente de complemento; union al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulacion negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activacion de linfocitos B.
“Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig unida a receptores de Fc (FcRs) presente en ciertas celulas citotoxicas (por ejemplo, linfocitos Citolfticos Naturales (NK), neutrofilos y macrofagos) permite que estas celulas efectoras citotoxicas se unan espedficamente con una celula diana portadora de antfgenos y posteriormente destruyan la celula diana con agentes citotoxicos. Los anticuerpos “arman” las celulas citotoxicas y se requieren absolutamente para dicha destruccion. Las celulas primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resumen en la Tabla 3 en la pagina 464
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de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de Estados Unidos N.° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos Citoltticos Naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998).
“Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une con la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano. Ademas, un FcR preferido es uno que se une con un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRiII, incluyendo variantes alelicas y formas con corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activador”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmaticos de las mismas. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmatico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibicion basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmatico (vease revision M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Se revisan FcR en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan abarcados por el termino “FcR” en el presente documento. El termino tambien incluye el receptor neonatal FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternos al feto (Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., European J. Immunol. 24: 2429-2434 (1994)).
“Celulas efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las celulas expresan al menos FcyRIII y realizan funcion efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), linfocitos citolfticos naturales (Nk), monocitos, linfocitos T citotoxicos y neutrofilos; prefiriendose las PBMC y linfocitos NK. Las celulas efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
“Citotoxicidad dependiente de complemento” o “CDC” se refiere a la lisis de una celula diana en presencia de complemento. La activacion de la ruta del complemento clasica se inicia mediante la union del primer componente del sistema de complemento (C1q) con anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen con su antigeno afm. Para evaluar la activacion del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol., Methods 202: 163 (1996).
La expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o derivado para tratar una enfermedad o un trastorno en un sujeto. En el caso del tumor (por ejemplo, un tumor canceroso), la cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo multiespedfico) puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano de tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar en algun grado y preferentemente detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; inhibir (es decir, ralentizar en algun grado y preferentemente detener) la metastasis tumoral; inhibir, en algun grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algun grado uno o mas de los smtomas asociados con el trastorno. En la medida en que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueda evitar el crecimiento y/o destruir celulas cancerosas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico. Para terapia de cancer, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, evaluando la duracion de la supervivencia, el tiempo hasta la progresion de enfermedad (TTP), las velocidades de respuesta (RR), la duracion de respuesta y/o la calidad de vida.
Por “reducir o inhibir” se entiende la capacidad para provocar una reduccion general preferentemente del 20 % o mayor, mas preferentemente del 50 % o mayor, y mas preferentemente del 75 %, 85 %, 90 %, 95 % o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los smtomas del trastorno que se trate, la presencia o el tamano de las metastasis, el tamano del tumor primario o el tamano o el numero de los vasos sangumeos en trastornos angiogenicos.
Los terminos “cancer” y “canceroso” se refieren a o describen la condicion fisiologica en mairnferos que se caracteriza tfpicamente por crecimiento/proliferacion celular desregulado. Se incluyen en esta definicion canceres benignos y malignos. Los ejemplos de cancer incluyen pero sin limitacion, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon microdtico, cancer de pulmon no microdtico, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma escamoso de pulmon, cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o de estomago incluyendo cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, glioma, cancer del cuello uterino, cancer ovarico, cancer de dgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de endometrio o uterino, carcinoma de glandula salivares, cancer de rinon (por ejemplo, carcinoma de celulas renales), cancer de dgado, cancer de prostata, cancer vulvar, cancer tiroideo, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma y diversos tipos de cancer de cabeza y cuello. Por “cancer de estadio temprano” se entiende un cancer que no es invasivo o metastasico o se clasifica como un cancer de Estadio 0, I o II. El termino “precanceroso” se refiere a una afeccion o un crecimiento que tfpicamente precede a o se desarrolla en un cancer. Por “no metastasico” se entiende un cancer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema de vasos sangumeos o linfaticos o en tejidos distintos del sitio primario. En general, un cancer no metastasico es cualquier
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cancer que sea cancer de Estadio 0, I o II, y ocasionalmente un cancer de Estadio III.
Un “trastomo alergico o inflamatorio” en el presente documento es una enfermedad o un trastorno que resulta de hiperactivacion del sistema inmunitario de un individuo. Los trastornos alergicos o inflamatorios ejemplares incluyen, pero sin limitacion, asma, psoriasis, artritis reumatoide, dermatitis atopica, esclerosis multiple, lupus eritematoso sistemico, eccema, trasplante de organos, degeneracion macular relacionada con la edad, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esofagitis eosinofila y enfermedades autoinmunitarias asociadas con inflamacion.
Una “enfermedad autoinmunitaria” en el presente documento es una enfermedad o un trastorno que surge de y se dirige contra los tejidos del propio individuo o un cosegregado o manifestacion del mismo o condicion resultante del mismo. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, pero sin limitacion artritis (artritis reumatoide tal como artritis aguda, artritis reumatoide cronica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria cronica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriasica, artritis vertebral y artritis reumatoide de aparicion juvenil, osteartritis, artritis cronica progrediente, artritis deformante, poliartritis cronica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades cutaneas hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tales como psoriasis en placas, psoriasis gutata, psoriasis pustular y psoriasis de las unas, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto cronica, dermatitis alergica, dermatitis de contacto alergica, dermatitis herpetiforme y dermatitis atopica, smdrome de hiper IgM ligado a X, urticaria tal como urticaria alergica cronica y urticaria idiopatica cronica, incluyendo urticaria autoinmunitaria cronica, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrolisis epidermica toxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistemica), esclerosis tal como esclerosis sistemica, esclerosis multiple (EM) tal como EM espinooptica, EM progresiva primaria (EMPP) y EM recidivante remitente (EMRR), esclerosis sistemica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada y esclerosis ataxica, enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por autoinmunidad, colitis tal como colitis ulcerosa, colitis microscopica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante y colitis transmural, y enfermedad inflamatoria del intestino autoinmunitaria), piodermia gangrenosa, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, epiescleritis), smdrome de dificultad respiratoria, incluyendo smdrome de dificultad respiratoria del adulto o agudo (SDRA), meningitis, inflamacion de toda o parte de la uvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematologico autoinmunitario, espondilitis reumatoide, perdida de audicion repentina, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y rinitis alergica y atopica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis ftmbica y/o del tronco encefalico, uveftis, tal como uveitis anterior, uveftis anterior aguda, uveitis granulomatosa, uveftis no granulomatosa, uveftis facoantigenica, uveftis posterior o uveftis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin smdrome nefrotico tal como glomerulonefritis cronica o aguda tal como GN primaria, GN mediada por inmunidad, GN membranosa (nefropatfa membranosa), GN membranosa idiopatica o nefropatfa membranosa idiopatica, GN membranoproliferativa o proliferativa membranosa (GNPM), incluyendo de Tipo I y de Tipo II, y GN progresiva rapida, afecciones alergicas, reaccion alergica, eccema incluyendo eccema alergico o atopico, asma tal como asma bronquial, y asma autoinmunitario, afecciones que implican la infiltracion de linfocitos T y respuestas inflamatorias cronicas, enfermedad inflamatoria pulmonar cronica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesion de leucocitos, lupus eritematoso sistemico (LES) tal como LES cutaneo, lupus eritematoso cutaneo subagudo, smdrome de lupus neonatal (LEN), lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediatrico, no renal, extra renal, discoide, alopecia), diabetes mellitus de aparicion juvenil (Tipo I), incluyendo diabetes mellitus insulinodependiente pediatrica (IDDM), diabetes mellitus de aparicion en adultos (diabetes de tipo II), diabetes autoinmunitaria, diabetes insfpida idiopatica, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumatica y arteritis de celulas gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliartritis nodosa), poliarteritis microscopica, vasculitis del SNC, vasculitis necrotizante, cutanea o de hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistemica y vasculitis asociada con ANCA tal como vasculitis o smdrome de Churg-Strauss (SCS), arteritis temporal, anemia aplasica, anemia aplasica autoinmunitaria, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolftica o anemia hemolftica inmunitaria incluyendo anemia hemolftica autoinmunitaria (AIHA), anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia de globulos rojos pura o aplasia (PRCA), deficiencia de Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, smdrome de lesion de multiples organos tal como los secundarios de septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por complejo de antfgeno-anticuerpo, enfermedades de membrana basal antiglomerular, smdrome de anticuerpo anti fosfoftpido, neuritis alergica, enfermedad de Bechet o de Behcet, smdrome de Castleman, smdrome de Goodpasture, smdrome de Reynaud, smdrome de Sjogren, smdrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso o penfigoide cutaneo, penfigo (incluyendo penfigo vulgar, penfigo foliaceo, penfigoide de membrana mucosa y penfigo eritematoso), poliendocrinopatfas autoinmunitarias, enfermedad o smdrome de Reiter, nefritis de complejo inmunitario, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis optica, polineuropatfas, neuropatfa cronica tal como polineuropatfas de IgM o neuropatfa mediada por IgM, trombocitopenia (como se desarrolla por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo) incluyendo purpura trombocitopenica trombotica (TTP) y trombocitopenia autoinmunitaria o mediada por inmunidad tal como purpura trombocitopenica idiopatica (ITP) incluyendo ITP cronica o aguda, enfermedad autoinmunitaria del testmulo y el ovario incluyendo orquitis autoinmunitaria y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis, tal como tiroiditis
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autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis cronica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopatico, enfermedad de Graves, smdromes poliglandulares tales como smdromes poliglandulares autoinmunitarios (o smdromes de endocrinopatia poliglandular), smdromes paraneoplasicos, incluyendo smdromes paraneoplasicos neurologicos tales como smdrome miastenico de Lambert- Eaton o smdrome de Eaton-Lambert, smdrome del hombre rigido o la persona ngida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alergica y encefalomielitis alergica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave asociada con timoma, degeneracion cerebelar, neuromiotoma, opsoclono o smdrome de mioclono opsoclono (OMS) y neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, smdrome de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis cronica, hepatitis lupoide, hepatitis de celulas gigantes, hepatitis activa cronica o hepatitis activa cronica autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopatica, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumocirrosis, smdrome de enteropatia autoinmunitaria, enfermedad cetiaca, esprue celfaco, (enteropatia por gluten), esprue refractario, esprue idiopatico, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrofica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad otica autoinmunitaria tal como enfermedad del ofdo interno autoinmunitaria (AIED), perdida de audicion autoinmunitaria, smdrome de mioclono opsoclono (OMS), policondritis tal como policondritis refractaria o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatia monoclonal benigna y gammapatia monoclonal de significacion indeterminada, MGUS), neuropatia periferica, smdrome paraneoplasico, canalopatias tales como epilepsia, migrana, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, paralisis periodica y canalopatias del SNC, autismo, miopatia inflamatoria, glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS), oftalmopatia endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatologico autoinmunitario, fibromialgia, insuficiencia endocrina multiple, smdrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gastrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias, nefropatia diabetica, smdrome de Dressler, alopecia areata, smdrome de CREST (calcinosis, fenomeno de Raynaud, dismobilidad esofagica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmunitaria masculina y femenina, enfermedad de tejidos conectivos mixtos, enfermedad de Chagas, fiebre reumatica, aborto recurrente, pulmon del granjero, eritema multiforme, smdrome postcardiotoirna, smdrome de Cushing, pulmon de criador de pajaros, angitis granulomatosa alergica, angitis linfocftica benigna, smdrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alergica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reaccion a la transfusion, lepra, malaria, leishmaniosis, quipanosomiasis, esquitosomiasis, ascariasis, aspergilosis, smdrome de Sampter, smdrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endiomiocardica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis qmstica, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofila, smdrome de Shulman, smdrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis cronica, ciclitis heterocronica, iridociclitis o ciclitis de Fuch, purpura de Henoch-Schonlein, infeccion por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infeccion por ecovirus, cardiomiopatia, enfermedad de Alzheimer, infeccion por parvovirus, infeccion por virus de la rubeola, smdromes postvacunacion, infeccion de rubeola congenita, infeccion por virus de Epstein-Barr, paperas, smdrome de Evans, insuficiencia gonadal autoimunitaria, corea de Sydenham, nefritis postestreptococica, tromboangitis obliterante, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de celulas gigantes, oftalmopatia endocrina, neumonitis de hipersensibilidad cronica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidemica, smdrome nefritico idiopatico, nefropatia de cambio mmimo, lesion familiar benigna y de reperfusion por isquemia, autoinmunidad retiniana, inflamacion de las articulaciones, bronquitis, enfermedad obstructiva cronica de las vfas respiratorias, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleroticos, aspermiogenesis, hemolisis autoinmunitaria, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilactica, enteritis alergica, eritema nodoso leproso, paralisis facial idiopatica, smdrome de fatiga cronica, fiebre reumatica, enfermedad de Hamman-Rich, perdida de audicion sensoneural, hemoglobinuria paroxfstica, hipogonadismo, ileftis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopatico primario, nefrosis, oftalmia sinfatica, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, piodermia gangrenosa, tiroiditis de Quervain, atrofia esplenica adquirida, infertilidad debida a anticuerpos antiespermatozoides, timoma no maligno, vitiligo, SCID y enfermedades asociadas con virus de Epstein-Barr, smdrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades parasitarias tales como leishmania, smdrome de choque toxico, intoxicacion alimentaria, afecciones que implican la infiltracion de linfocitos T, deficiencia de adhesion de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, smdrome de lesion organica multiple, enfermedades mediadas por complejos antigeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, neuritis alergica, poliendocrinopatias autoinmunitarias, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrofica autoinmunitaria, oftalmia simpatica, enfermedades reumaticas, enfermedad del tejido conectivo mixto, smdrome nefrotico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatia periferica, smdrome poliglandular autoinmunitario tipo I, hipoparatiroidismo idiopatico de aparicion en adultos (HIAA), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, smdrome nefrotico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o cronica, sinusitis de etmoides, frontal, maxilar o de esfenoides, un trastorno relacionado con eosinofilos tal como eosinofilia, eosinofilia de infiltracion pulmonar, smdrome de eosinofilia-mialgia, smdrome de Loffler, neumoma eosinofila cronica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumonica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinofilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativos, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerotica, epiesclerotica, candidiasis mucocutanea cronica, smdrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, smdrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, trastornos autoinmunitarios asociados con la enfermedad del colageno, reumatismo, enfermedad neurologica,
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trastorno de reperfusion isquemica, reduccion en la respuesta de presion sangumea, disfuncion vascular, angiectasia, lesion tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y vascularizacion que acompana a enfermedad, trastornos de hipersensibilidad alergica, glomerulonefritis, lesion por reperfusion, lesion por reperfusion de tejidos miocardicos u otros, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, smdromes asociados con transfusion de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, inflamacion aguda grave, inflamacion intratable cronica, pielitis, neumonocirrosis, retinopatfa diabetica, trastorno de arterias grandes diabeticas, hiperplasia endoarterial, ulcera peptica, valvulitis y endometriosis.
La expresion “agente citotoxico” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la funcion de una celula y/o provoca destruccion de una celula. Se pretende que la expresion incluya isotopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, Ra223, P32, e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolfticas, antibioticos y toxinas tales como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los diversos agentes antitumorales, anticancerosos y quimioterapeuticos desvelados en el presente documento. Se describen en el presente documento otros agentes citotoxicos. Un agente tumoricida provoca destruccion de celulas tumorales.
Un “agente quimioterapeutico” es un compuesto qmmico util en el tratamiento del cancer. Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9- tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; acido betulmico; una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; acido podofilmico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW- 2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrogeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma 1 (vease, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)), dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; asf como cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos de antibioticos de enediina de cromoprotema relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, oligomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de acido folico tal como acido frolmico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevulmico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; desfofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacaridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2”-triclorotrietilamina, tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano, vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), dacarbazina, manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacetilosina; arabinosido (“Ara-C”); tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), formulacion en nanopartfculas modificadas con albumina, sin Cremophor ABRAXANETM de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL) y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo, gemcitabina (GEMZAR®), 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®), oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; capecitabina (XELODA®); sales, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores farmaceuticamente aceptables; asf como combinaciones de dos o mas de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura para un
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regimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATINTM) combinado con 5-FU y leucovovina.
Tambien se incluyen en esta definicion agentes antihormonales que actuan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento del cancer, y estan con frecuencia en la forma de tratamiento sistemico o de cuerpo completo. Pueden ser en sf mismos hormonas. Los ejemplos incluyen antiestrogenos y moduladores del receptor de estrogenos selectivos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; reguladores negativos del receptor de estrogenos (ERD); agentes que actuan para suprimir o inactivar los ovarios, por ejemplo, agonistas de hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) tales como acetato de leuprolide LUPROn® y ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas adrenales tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®. Ademas, dicha definicion de agentes quimioterapeuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato DIDrOcAL®, NE-58095, acido zoledronico/zoledronato ZOMEtA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® o risedronato ACTONEL®; asf como troxacitabina (un analogo de 1,3-dioxolano de nucleosido de citosina); oligonucleotidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresion de genes en las rutas de senalizacion implicadas en la proliferacion de celulas aberrantes, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF-R); vacunas tales como vacuna de THERATOPE® y vacunas de terapia genica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 LURtOtECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de moleculas pequenas tirosina quinasa doble de ErbB-2 y EGFR tambien conocido como GW572016); y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o una composicion que inhibe el crecimiento de una celula in vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de celulas en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresion del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen detencion en G1 y detencion en fase M. Los bloqueadores de fase M clasicos incluyen las vincas (por ejemplo, vincristina y vinblastina), taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido y bleomicina. Los agentes que detienen G1 tambien tienen efectos en detencion en fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse informacion adicional en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capttulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son farmacos antineoplasicos derivados ambos del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado del tejo europeo, es un analogo semisintetico de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtubulos de dfmeros de tubulina y estabilizan microtubulos evitando la despolimerizacion, lo que da como resultado la inhibicion de mitosis en celulas.
"Terapia antineoplasica" como se usa en el presente documento se refiere a un tratamiento que reduce o inhibe el cancer en un sujeto. Los ejemplos de terapia antineoplasica incluyen radioterapia citotoxica asf como la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente citotoxico, un agente quimioterapeutico, un agente inhibidor del crecimiento, una vacuna de cancer, un inhibidor de angiogenesis, un profarmaco, una citocina, un antagonista de citocina, un corticosteroide, un agente inmunosupresor, un antihemetico, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un analgesico al sujeto.
El termino "profarmaco" como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmaceuticamente activa que es menos citotoxico para celulas tumorales en comparacion con el farmaco parental y es capaz de activarse enzimaticamente o convertirse en la forma parental mas activa. Vease, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profarmacos incluyen, pero sin limitacion, profarmacos que contienen fosfato, profarmacos que contienen tiofosfato, profarmacos que contienen sulfato, profarmacos que contienen peptido, profarmacos modificados con D-aminoacido, profarmacos glucosilados, profarmacos que contienen beta-lactama, profarmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profarmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profarmacos de 5- fluorouridina que pueden convertirse en el farmaco libre citotoxico mas activo. Los ejemplos de farmacos citotoxicos que pueden derivatizarse en una forma de profarmaco incluyen, pero sin limitacion, los agentes quimioterapeuticos descritos anteriormente.
El termino “citocina” es un termino generico para protemas liberadas por una poblacion celular que actuan en otra celula como mediadores intercelulares. Son ejemplos de dichas citocinas linfocinas, monocinas y hormonas polipeptfdicas tradicionales. Se incluyen entre las citocinas hormona del crecimiento tal como hormona del
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crecimiento humana (HGH), hormona del crecimiento humana de N-metionilo y hormona del crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glucoproteicas tales como hormona estimulante del folmulo (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento epidermico (EGF); factor de crecimiento hepatico; factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); prolactina; lactogeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; peptido asociado con gonadotropina de raton; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como NGF-alfa; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento de tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferon-alfa, -beta y -gamma, factores estimulantes de colonias (CSF), tales como CSF de macrofagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrofagos (GM- CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-18 un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptfdicos incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el termino citocina incluye protemas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
Por "antagonista de citocinas" se entiende una molecula que parcialmente o completamente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biologica de al menos una citocina. Por ejemplo, los antagonistas de citocinas pueden inhibir la actividad de citocinas inhibiendo la expresion y/o secrecion de citocinas, o mediante union con una citocina o con un receptor de citocina. Los antagonistas de citocinas incluyen anticuerpos, peptidos sinteticos o de secuencia nativa, inmunoadhesinas y antagonistas de moleculas pequenas que se unen con una citocina o con un receptor de citocina. El antagonista de citocina se conjuga opcionalmente con o se fusiona con un agente citotoxico. Son antagonistas de TNF ejemplares etanercept (ENBrEl®), infliximab (REMICADE®) y adalimumab (HUMIRA™).
La expresion "agente inmunosupresor" como se usa en el presente documento se refiere a sustancias que actuan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario del sujeto que se trata. Esto incluye sustancias que suprimen la produccion de citocinas, regulan negativamente o suprimen la expresion de autoantfgeno, o enmascaran los antfgenos del MHC. Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5 sustituidas (vease Patente de Estados Unidos n.° 4.665.077); mofetil micofenolato tal como CELLCEPT®; azatioprina (IMURAN®, AZASAN®/6-mercaptopurina; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehfdo (que enmascara los antfgenos del MHC, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.120.649); anticuerpos antiidiotfpicos para antfgenos del MHC y fragmentos del MHC; ciclosporina A; esteroides tales como corticosteroides y glucocorticosteroides, por ejemplo prednisona, prednisolona tal como PEDIAPRED® (fosfato sodico de prednisolona) u ORAPRED® (solucion oral de fosfato sodico de prednisolona), metilprednisolona y dexametasona; metotrexato (oral o subcutaneo) (RHEUMATREX®, TREXALL™); hidroxicloroquina/cloroquina; sulfasalazina; leflunomida; antagonistas de citocinas o receptores de citocinas incluyendo anticuerpos anti-interferon y, P o a, anticuerpos antifactor de necrosis tumoral a (infliximab o adalimumab), inmunoadhesina anti-TNFa (ENBREL®, etanercept), anticuerpos antifactor de necrosis tumoral p, anticuerpos anti-interleucina-2 y anticuerpos antirreceptor de IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CD11 y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti- linfocitos heterologa; anticuerpos policlonales o pan-T o anticuerpos monoclonales anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; peptido soluble que contiene un dominio de union a LFA-3 (documento WO 90/08187); estreptoquinasa; TGF-p; estreptodornasa; ARN o ADN del hospedador; FK506; RS-61443; desoxiespergualina; rapamicina; receptor de linfocitos T (Cohen et al., patente de Estados Unidos n.° 5.114.721); fragmentos de receptores de linfocitos T (Offner et al. Science 251: 430-432 (1991); documento WO 90/11294; laneway, Nature 341: 482 (1989); y documento WO 91/01133); anticuerpos del receptor de linfocitos T (documento EP 340.109) tal como T10B9; ciclofosfamida (CYTOXAN®); dapsona; penicilamina (CUPRIMINE®); intercambios de plasma; o inmunoglobulina intravenosa (IVIG). Estos pueden usarse solos o en combinacion entre sf, particularmente combinaciones de esteroide y otro agente inmunosupresor o dichas combinaciones seguidas de una dosis de mantenimiento con un agente no esteroideo para reducir la necesidad de esteroides.
Un "analgesico" se refiere a un farmaco que actua para inhibir o suprimir el dolor en un sujeto. Los analgesicos ejemplares incluyen farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) incluyendo ibuprofeno (MOTRIN®), naproxeno (NAPROSYN®), acido acetilsalidlico, indometacina, sulindac y tolmetina, incluyendo sales y derivados de los mismos, asf como diversas otras medicaciones usadas para reducir los dolores punzantes que puedan aparecer, incluyendo anticonvulsivos (gabapentina, fenitoma, carbamazepina) o antidepresivos tridclicos. Los ejemplos espedficos incluyen paracetamol, aspirina, amitriptilina (ELAVIL®), carbamazepina (TEGRETOL®), fenitoma (DILANTIN®), gabapentina (NEURONTIN®), (E)-N-vanilil-8-metil-6-noneamida (CAPSAICIN®), o un bloqueador nervioso.
"Corticosteroide" se refiere a una cualquiera de varias sustancias de origen natural o sinteticas con la estructura qmmica general de esteroides que imitan o aumentan los efectos de los corticosteroides de origen natural. Los ejemplos de corticosteroides sinteticos incluyen prednisona, prednisolona (incluyendo metilprednisolona), triamcinolona de dexametasona y betametasona.
Una “vacuna de cancer” como se usa en el presente documento es una composicion que estimula una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un cancer. Las vacunas de cancer tfpicamente consisten en una fuente de material o
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celulas asociados a cancer (antigeno) que pueden ser autologos (del mismo) o alogenicos (de otros) con respecto al sujeto, junto con otros componentes (por ejemplo, adyuvantes) para estimular adicionalmente y reforzar la respuesta inmunitaria contra el antigeno. Las vacunas de cancer pueden dar como resultado la estimulacion del sistema inmunitario del sujeto para producir anticuerpos para uno o varios antigenos espedficos y/o para producir linfocitos T citoltticos para atacar celulas cancerosas que tienen esos antigenos.
"Radioterapia citotoxica” como se usa en el presente documento se refiere a terapia de radiacion que inhibe o previene la funcion de celulas y/o provoca la destruccion de celulas. La terapia de radiacion puede incluir, por ejemplo, irradiacion de haz externo o terapia con un agente marcado radiactivo, tal como un anticuerpo. Se pretende que la expresion incluya uso de isotopos radiactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi, Ra223, P32 e isotopos radiactivos de Lu).
Un “sujeto” es un vertebrado, tal como un marnffero, por ejemplo un ser humano. Los mairnferos incluyen, pero sin limitacion, animales de granja (tales como vacas), animales deportivos, mascotas (tales como perros, gatos y caballos), primates, ratones y ratas.
Excepto cuando el contexto indica otra cosa, los terminos “primer” polipeptido y “segundo” polipeptido, y variaciones de los mismos, son unicamente identificadores genericos, y no debe interpretarse que identifiquen un polipeptido o componente espedfico o particular de anticuerpos descritos en el presente documento.
Se usaron reactivos disponibles en el mercado a los que se hace referencia en los ejemplos de acuerdo con las instrucciones del fabricante a no ser que se indique de otro modo. La fuente de esas celulas identificadas en los siguientes Ejemplos, y a lo largo de la memora descriptiva, mediante numeros de referencia de ATCC es la coleccion americana de cultivos tipo, Manassas, VA. A no ser que se indique de otro modo, se usan en el presente documento procedimientos convencionales de tecnologfa de ADN recombinante, tales como los descritos anteriormente en el presente documento y en los siguientes libros de texto: Sambrook et al., mencionado anteriormente; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, Nueva York, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc., Nueva York, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, se entendera que la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, implica la inclusion de un numero entero o grupo de numeros enteros indicado pero no la exclusion de ningun otro numero entero o grupo de numeros enteros.
II. Construccion de proteinas heteromultimericas
Tfpicamente, las proteinas heteromultimericas descritas en el presente documento comprenderan una parte significativa de una region Fc de anticuerpo. En otros aspectos, sin embargo, la cadena pesada comprende solamente una parte de los dominios Ch1, Ch2 y/o Ch3.
Dominios de heteromultimerizacion
Las proteinas heteromultimericas comprenden un dominio de heteromultimerizacion. Para generar una poblacion sustancialmente homogenea de molecula heterodimerica, el dominio de heterodimerizacion debe tener una fuerte preferencia por formar heterodfmeros frente a homodfmeros. Aunque las proteinas heteromultimericas ejemplificadas en el presente documento usan la tecnologfa de botones en ojales para facilitar la heteromultimerizacion, los expertos en la materia apreciaran otros dominios de heteromultimerizacion utiles en la presente invencion.
Botones en ojales
El uso de botones en ojales como un metodo para producir anticuerpos multiespedficos se conoce bien en la tecnica. Vease patente de Estados Unidos n.° 5.731.168 concedida en 24 de marzo de 1998 asignada a Genentech, PCT Pub. n.° WO2009089004 publicada el 16 de julio de 2009 y asignada a Amgen, y patente de Estados Unidos Pub. N.° 20090182127 publicada el 16 de julio de 2009 y asignada a Novo Nordisk A/S. Vease tambien Marvin y Zhu, Acta Pharmacologica Sincia (2005) 26(6): 649-658 y Kontermann (2005) Acta Pharmacol. Sin., 26: 1-9. Se proporciona en el presente documento un breve analisis.
Una “protuberancia” se refiere a al menos una cadena lateral de aminoacido que se proyecta desde la interfaz de un primer polipeptido y se puede situar por lo tanto en una cavidad compensatoria en la interfaz adyacente (es decir la interfaz de un segundo polipeptido) para estabilizar el heteromultimero, y de este modo favorecer la formacion de heteromultfmero frente a la formacion de homomultimero, por ejemplo. La protuberancia puede existir en la interfaz original o puede introducirse sinteticamente (por ejemplo alterando el acido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, el acido nucleico que codifica la interfaz del primer polipeptido se altera para codificar la
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protuberancia. Para conseguir esto, el acido nucleico que codifica al menos un resto de aminoacido “original” en la interfaz del primer polipeptido se reemplaza con acido nucleico que codifica al menos un resto de aminoacido “importado” que tiene un volumen de cadena lateral mayor que el resto de aminoacido original. Se apreciara que puede haber mas de un resto importado original y correspondiente. El lfmite superior para el numero de restos originales que se reemplazan es el numero total de restos en la interfaz del primer polipeptido. Los volumenes de cadena lateral de los diversos restos de aminoacidos se muestran en la siguiente tabla.
TABLA 1
Propiedades de restos de aminoacidos
Aminoacido
Abreviatura de una letra MASAa (daltons) VOLUMEN" (Angstrom3) Area de superficie accesiblec (Angstrom2)
Alanina (Ala)
A 71,08 88,6 115
Arginina (Arg)
R 156,20 173,4 225
Asparagina (Asn)
N 114,11 117,7 160
Acido aspartico(Asp)
D 115,09 111,1 150
Cistema (Cys)
C 103,14 108,5 135
Glutamina (Gln)
Q 128,14 143,9 180
Acido glutamico (Glu)
E 129,12 138,4 190
Glicina (Gly)
G 57,06 60,1 75
Histidina (His)
H 137,15 153,2 195
Isoleucina (Ile)
I 113,17 166,7 175
Leucina (Leu)
L 113,17 166,7 170
Lisina (Lys)
K 128,18 168,6 200
Metionina (Met)
M 131,21 162,9 185
Fenilalinina (Phe)
F 147,18 189,9 210
Prolina (Pro)
P 97,12 122,7 145
Serina (Ser)
S 87,08 89,0 115
Treonina (Thr)
T 101,11 116,1 140
Triptofano (Trp)
W 186,21 227,8 255
Tirosina (Tyr)
Y 163,18 193,6 230
Valina (Val)
V 99,14 140,0 155
a Peso molecular del aminoacido menos el del agua. Valores de Handbook of Chemistry and Physics, 43a ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961. b Valores de A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24: 107-123, 1972.
c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105: 1-14, 1975. El area de superficie accesible se define en las Figuras 6-20 de esta referencia.
Los restos importados preferidos para la formacion de una protuberancia son en general restos de aminoacidos de origen natural y se seleccionan preferentemente de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptofano (W). Se prefieren mas triptofano y tirosina. En una realizacion, el resto original para la formacion de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeno, tal como alanina, asparagina, acido aspartico, glicina, serina, treonina o valina.
Una “cavidad” se refiere a al menos una cadena lateral de aminoacido que forma un hueco desde la interfaz de un segundo polipeptido y por lo tanto se ajusta a una protuberancia correspondiente en la interfaz adyacente de un primer polipeptido. La cavidad puede existir en la interfaz original o puede introducirse de forma sintetica (por ejemplo alterando el acido nucleico que codifica la interfaz). Normalmente, el acido nucleico que codifica la interfaz del segundo polipeptido se altera para codificar la cavidad. Para conseguir esto, el acido nucleico que codifica al menos un resto de aminoacido “original” en la interfaz del segundo polipeptido se reemplaza con ADN que codifica al menos un resto de aminoacido “importado” que tiene un volumen de cadena lateral menor que el resto de aminoacido original. Se apreciara que puede haber mas de un resto importado original y correspondiente. El lfmite superior para el numero de restos originales que se reemplazan es el numero total de restos en la interfaz del segundo polipeptido. Los volumenes de cadena lateral de los diversos restos de aminoacidos se han mostrado en la Tabla 1 anterior. Los restos importados preferidos para la formacion de la cavidad son habitualmente restos de aminoacidos de origen natural y se seleccionan preferentemente de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). Se prefieren mas serina, alanina o treonina. En una realizacion, el resto original para la formacion de la cavidad tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptofano
Un resto de aminoacido “original” es uno que se reemplaza por un resto “importado” que puede tener un volumen de cadena lateral menor o mayor que el resto original. El resto de aminoacido importado puede ser un resto de aminoacido de origen natural o de origen no natural, pero preferentemente es el primero. Son restos de aminoacidos “de origen natural” los restos codificados por el codigo genetico y enumerados en la Tabla 1 anterior. Por resto de aminoacido “de origen no natural” se entiende un resto que no esta codificado por el codigo genetico, pero que es capaz de unirse covalentemente con resto o restos de aminoacidos adyacentes en la cadena polipeptfdica. Son ejemplos de restos de aminoacidos de origen no natural norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros analogos de restos de aminoacidos tales como los descritos en Ellman et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por ejemplo.
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Para generar dichos restos de aminoacidos de origen no natural, pueden usarse los procedimientos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) y Ellman et al., mencionado anteriormente. Brevemente, esto implica activar qmmicamente un ARNt supresor con un resto de aminoacido de origen no natural seguido de transcripcion y traduccion in vitro del ARN. El metodo descrito en el presente documento implica reemplazar al menos un resto de aminoacido original, pero puede reemplazarse mas de un resto original. Normalmente, no mas de los restos totales en la interfaz del primer o segundo polipeptido comprenderan restos de aminoacidos originales que se reemplazan. Tfpicamente, los restos originales para reemplazo estan “internados”. Por “internado” se entiende que el resto esta esencialmente inaccesible al disolvente. En general, el resto importado no es cistema para evitar la posible oxidacion o el posible desapareamiento de enlaces disulfuro.
La protuberancia es “posicionable” en la cavidad lo que significa que la localizacion espacial de la protuberancia en la cavidad de la interfaz de un primer polipeptido y segundo polipeptido respectivamente y los tamanos de la protuberancia y la cavidad son tales que la protuberancia puede localizarse en la cavidad sin alterar significativamente la asociacion normal del primer y el segundo polipeptidos en la interfaz. Ya que las protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp no se extienden tfpicamente en direccion perpendicular desde el eje de la interfaz y tienen conformaciones preferidas, el alineamiento de una protuberancia con una cavidad correspondiente se basa en la modelacion del par de protuberancia/cavidad basandose en una estructura tridimensional tal como la obtenida por cristalograffa de rayos X o resonancia magnetica nuclear (RMN). Esto puede conseguirse usando tecnicas ampliamente aceptadas en este campo.
Por “acido nucleico original o molde” se entiende el acido nucleico que codifica un polipeptido de interes que puede “alterarse” (es decir modificarse por ingeniena genetica o mutarse) para codificar una protuberancia o cavidad. El acido nucleico original o de partida puede ser un acido nucleico de origen natural o puede comprender un acido nucleico que se ha sometido a alteracion previa (por ejemplo un fragmento de anticuerpo humanizado). Por “alterar” el acido nucleico se entiende que el acido nucleico original se muta insertando, suprimiendo o reemplazando al menos un codon que codifica un resto de aminoacido de interes. Normalmente, un codon que codifica un resto original se reemplaza por un codon que codifica un resto importado. Se han revisado tecnicas para modificar geneticamente un ADN de esta manera en Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido. (1991)), e incluye mutagenesis dirigida, mutagenesis por casete y mutagenesis de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Mutando un acido nucleico original/molde, se altera por lo tanto de forma correspondiente un polipeptido original/molde codificado por el acido nucleico original/molde.
La protuberancia o cavidad puede “introducirse en la interfaz de un primer o un segundo polipeptido por medios sinteticos, por ejemplo mediante tecnicas recombinantes, smtesis peptfdica in vitro, las tecnicas para introducir restos de aminoacidos de origen no natural previamente descritas, mediante acoplamiento enzimatico o qmmico de peptidos o alguna combinacion de estas tecnicas. En consecuencia, la protuberancia o cavidad que se “introduce” es “de origen no natural” o “no nativa”, lo que significa que no existe en la naturaleza o en el polipeptido original (por ejemplo un anticuerpo monoclonal humanizado).
En general, el resto de aminoacido importado para formar la protuberancia tiene un numero relativamente pequeno de “rotameros” (por ejemplo aproximadamente 3-6). Un "rotamero" es una conformacion energeticamente favorable de una cadena lateral de aminoacido. El numero de rotameros de los diversos restos de aminoacidos se revisa en Ponders y Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).
III. Vectores, celulas hospedadoras y metodos recombinantes
Para produccion recombinante de una protema heteromultimerica (por ejemplo, un anticuerpo) descrita en el presente documento, el acido nucleico que la codifica se afsla y se inserta en un vector replicable para clonacion adicional (amplificacion del ADN) o para expresion. El ADN que codifica el anticuerpo se afsla y secuencia facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas oligonucleotfdicas que son capaces de unirse espedficamente con genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Estan disponibles muchos vectores. La eleccion del vector depende en parte de la celula hospedadora para usar. Generalmente, las celulas hospedadoras preferidas son de origen procariota o eucariota (generalmente mairnferos, pero tambien incluyendo celulas de hongos (por ejemplo, levadura), insectos, plantas y nucleadas de otros organismos multicelulares). Se apreciara que pueden usarse regiones constantes de cualquier isotipo para este fin, incluyendo regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, y que dichas regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal.
a. Generar proteinas heteromultimericas usando celulas hospedadoras procariotas
i. Construccion de vector
Pueden obtenerse secuencias polinucleotfdicas que codifican componentes polipeptfdicos de las proteinas heteromultimericas (por ejemplo, un anticuerpo) descritas en el presente documento usando tecnicas recombinantes convencionales. Las secuencias polinucleotfdicas deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir de, por ejemplo, celulas productoras de anticuerpos tales como hibridoma. Como alternativa, pueden sintetizarse polinucleotidos
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usando sintetizadores de nucleotidos o tecnicas de PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipeptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleotidos heterologos en hospedadores procariotas. Muchos vectores que estan disponibles y se conocen en la tecnica pueden usarse para el fin de la presente invencion. La seleccion de un vector apropiado dependera principalmente del tamano de los acidos nucleicos para insertar en el vector y la celula hospedadora particular para transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su funcion (amplificacion o expresion de polinucleotido heterologo, o ambas) y su compatibilidad con la celula hospedadora particular en la que reside. Los componentes del vector generalmente incluyen pero sin limitacion: un origen de replicacion, un gen marcador de seleccion, un promotor, un sitio de union a ribosomas (RBS), una secuencia senal, el inserto de acido nucleico heterologo y una secuencia de terminacion de la transcripcion.
En general, se usan vectores plasirndicos que contienen secuencias de replicon y de control que derivan de especies compatibles con la celula hospedadora en relacion con estos hospedadores. El vector porta habitualmente un sitio de replicacion, asf como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar seleccion fenotfpica en celulas transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma tfpicamente usando pBR322, un plasmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por lo tanto proporciona medios sencillos para identificar celulas transformadas. pBR322, sus derivados, u otros plasmidos microbianos o bacteriofagos tambien pueden contener, o modificarse para contener, promotores que puede usar el organismo microbiano para expresion de protemas endogenas. Se describen ejemplos de derivados de pBR322 usados para expresion de anticuerpos particulares en detalle en Carter et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.648.237.
Ademas, pueden usarse vectores de fagos que contienen secuencias de replicon y de control que son compatibles con el microorganismo hospedador como vectores transformantes en relacion con estos hospedadores. Por ejemplo, puede utilizarse bacteriofago tal como yGEM.TM.-11 en la preparacion de un vector recombinante que puede usarse para transformar celulas hospedadoras susceptibles tales como E. coli LE392.
El vector de expresion descrito en el presente documento puede comprender dos o mas pares de promotor-cistron, que codifican cada uno de los componentes polipeptfdicos. Un promotor es una secuencia reguladora no traducida localizada cadena arriba (5') de un cistron que modula su expresion. Los promotores procariotas tfpicamente se clasifican en dos clases, inducibles y constitutivos. Un promotor inducible es un promotor que inicia niveles aumentados de transcripcion del cistron bajo su control en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
Se conoce bien un gran numero de promotores reconocidos por una diversidad de celulas hospedadoras potenciales. El promotor seleccionado puede unirse operativamente con ADN cistronico que codifica, por ejemplo, la cadena ligera o pesada retirando el promotor del ADN fuente mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora aislada en el vector descrito en el presente documento. Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterologos pueden usarse para amplificacion y/o expresion directa de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterologos, ya que permiten en general mayor transcripcion y mayores rendimientos del gen diana expresado en comparacion con el promotor polipeptfdico diana nativo.
Los promotores adecuados para uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor de PhoA, los sistemas promotores de p-galactamasa y lactosa, un sistema promotor de triptofano (trp) y promotores hfbridos tales como el promotor de tac o trc. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fagos conocidos) tambien son adecuados. Sus secuencias de nucleotidos se han publicado, permitiendo de este modo que un trabajador experto los ligue operativamente con cistrones que codifican los genes de la protema heteromultimerica, por ejemplo, las cadenas ligera y pesada diana (Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269), usando enlazadores o adaptadores para aportar cualquier sitio de restriccion requerido.
En un aspecto de la invencion, cada cistron dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia senal de secrecion que dirige la traslocacion de los polipeptidos expresados a traves de una membrana. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN polipeptfdico diana que se inserta en el vector. La secuencia senal seleccionada para el fin de la presente invencion debena ser una que se reconozca y procese (es decir, se escinda por una peptidasa senal) por la celula hospedadora. Para celulas hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan las secuencias senal nativas de los polipeptidos heterologos, la secuencia senal se sustituye por una secuencia senal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o lfderes de enterotoxina termoestable II (STII), LamB, PhoE, PeIB, OmpA y MBP. En una realizacion, las secuencias senal usadas en ambos cistrones del sistema de expresion son secuencias senal de STII o variantes de las mismas.
En otro aspecto, la produccion de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invencion puede suceder en el citoplasma de la celula hospedadora, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias senal de secrecion dentro de cada cistron. A este respecto, se expresan cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, se pliegan y se ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas hospedadoras (por ejemplo, las
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cepas de E. coli trxB) proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formacion de enlaces disulfuro, permitiendo de este modo el plegamiento y ensamblaje apropiado de subunidades proteicas expresadas. Vease, Proba y Pluckthun Gene, 159: 2O3 (1995).
Las celulas hospedadoras procariotas adecuadas para expresar protemas heteromultimericas (por ejemplo, anticuerpos) como se describe en el presente documento incluyen Arqueobacterias y Eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos. Los ejemplos de bacterias utiles incluyen Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacilos (por ejemplo, B. subtilis), Enterobacterias, especies de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus. En una realizacion, se usan celulas gram negativas. En una realizacion, se usan celulas de E. coli como hospedadores. Los ejemplos de cepas de E. coli incluyen la cepa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; N.° de Deposito de ATCC 27.325) y derivados de la misma, incluyendo la cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente de Estados Unidos N° 5.639.635). Otras cepas y derivados de las mismas, tales como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31.537) y E. coli RV308 (ATCC 31.608) tambien son adecuados. En una realizacion, E. coli Alpp encuentra uso particular. Estos ejemplos son ilustrativos mas que limitantes. Se conocen en la tecnica metodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas que tienen genotipos definidos y se describen en, por ejemplo, Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Es necesario en general seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en consideracion la capacidad de replicacion del replicon en las celulas de una bacteria. Por ejemplo, E. coli, especies de Serratia o de Salmonella pueden usarse convenientemente como el hospedador cuando se usen plasmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para proveer el replicon. Tfpicamente la celula hospedadora debena secretar cantidades mmimas de enzimas proteolfticas y pueden incorporarse convenientemente inhibidores de proteasa adicionales en el cultivo celular.
ii. Produccion de polipeptidos
Se transforman celulas hospedadoras con los vectores de expresion descritos anteriormente y se cultivan en medio nutriente convencional modificado segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
La transformacion significa introducir ADN en el hospedador procariota de modo que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosomico o mediante integrante cromosomico. Dependiendo de la celula hospedadora usada, la transformacion se realiza usando tecnicas convencionales apropiadas para dichas celulas. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio se usa en general para celulas bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro metodo para transformacion emplea polietilenglicol/DMSO. Otra tecnica mas usada es electroporacion.
Las celulas procariotas usadas para producir los polipeptidos descritos en el presente documento se cultivan en medios conocidos en la tecnica y adecuados para cultivo de las celulas hospedadoras seleccionadas. Los ejemplos de medios adecuados incluyen caldo de cultivo Luria (LB) mas complementos de nutrientes necesarios. En algunas realizaciones, el medio tambien contiene un agente de seleccion, seleccionado basandose en la construccion del vector de expresion, para permitir selectivamente el crecimiento celulas procariotas que contienen el vector de expresion. Por ejemplo, se anade ampicilina al medio para cultivo de celulas que expresan gen resistente a ampicilina.
Tambien puede incluirse cualquier complemento necesario ademas de fuentes de carbono, nitrogeno y fosfato inorganico a concentraciones apropiadas introducidos solo o como una mezcla con otro complemento o medio tal como una fuente de nitrogeno compleja. Opcionalmente el medio de cultivo puede contener uno o mas agentes reductores seleccionados del grupo que consiste en glutation, cistema, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol.
Las celulas hospedadoras procariotas se cultivan a temperaturas adecuadas. Para el cultivo de E. coli, por ejemplo, la temperatura preferida vana de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 39 °C, mas preferentemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, o mas preferentemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que vana de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo hospedador. Para E. coli, el pH es preferentemente de aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,4 y mas preferentemente aproximadamente 7,0.
Si se usa un promotor inducible en el vector de expresion descrito en el presente documento, se induce expresion de protemas en condiciones adecuadas para la activacion del promotor. En un aspecto de la invencion, se usan promotores de PhoA para controlar la transcripcion de los polipeptidos. En consecuencia, las celulas hospedadoras transformadas se cultivan en un medio con fosfato limitante para induccion. Preferentemente, el medio con fosfato limitante es el medio C.R.A.P. (vease, por ejemplo, Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Puede usarse una diversidad de otros inductores, de acuerdo con la construccion de vector empleada, como se conoce en la tecnica.
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En una realizacion, la primera y la segunda celulas hospedadoras que contienen bisagras se cultivan por separado y los polipeptidos expresados se secretan al y se recuperan del periplasma de las celulas hospedadoras por separado. En una segunda realizacion, la primera y la segunda celulas hospedadoras que contienen bisagras se cultivan por separado y antes del aislamiento de los polipeptidos que contienen bisagras, los dos cultivos de celulas hospedadoras se mezclan entre sf y las celulas se sedimentan. En una tercera realizacion, la primera y la segunda celulas hospedadoras que contienen bisagras se cultivan por separado, se centrifugan y se resuspenden por separado y despues se mezclan entre sf antes del aislamiento de los polipeptidos que contienen bisagras. En una cuarta realizacion, la primera y la segunda celulas hospedadoras que contienen bisagras se cultivan juntas en el mismo recipiente de cultivo. La recuperacion de protemas ffpicamente implica romper la membrana celular del microorganismo, generalmente por medios tales como choque osmotico, ultrasonidos o lisis. Una vez que se han roto las celulas, el residuo celular o las celulas completas pueden retirarse por centrifugacion o filtracion. Las protemas pueden purificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante cromatograffa en resina de afinidad. Como alternativa, las protemas pueden transportarse al medio de cultivo y aislarse en el mismo. Las celulas pueden retirarse del cultivo y el sobrenadante de cultivo que se filtra y concentrarse para purificacion adicional de las protemas producidas. Los polipeptidos expresados pueden aislarse e identificarse adicionalmente usando metodos conocidos habitualmente tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y ensayo de transferencia de Western. Los polipeptidos aislados se usaran para producir las protemas heteromultimericas.
En un aspecto de la invencion, se realiza produccion de protema heteromultimerica (por ejemplo, anticuerpo) en gran cantidad por un proceso de fermentacion. Estan disponibles diversos procedimientos de fermentacion semidiscontinuos a gran escala para produccion de protemas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferentemente de aproximadamente 1000 a 100.000 litros de capacidad. Estos fermentadores usan propulsores agitadores para distribuir oxfgeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente de energfa/carbono preferida). La fermentacion a gran escala se refiere en general a fermentacion en un fermentador que no tiene mas de aproximadamente 100 litros de capacidad volumetrica, y puede variar de aproximadamente 1 litro a aproximadamente 100 litros.
En un proceso de fermentacion, la induccion de expresion de protemas se inicia ffpicamente despues de haberse cultivado las celulas en condiciones adecuadas hasta una densidad deseada, por ejemplo, una DO550 de aproximadamente 180-220, en cuyo estadio las celulas estan en la fase estacionaria temprana. Puede usarse una diversidad de inductores, de acuerdo con la construccion de vector empleada, como se conoce en la tecnica y se ha descrito anteriormente. Las celulas pueden cultivarse durante periodos mas cortos antes de la induccion. Las celulas se inducen habitualmente durante 12-50 horas, aunque puede usarse tiempo de incubacion mas largo o mas corto.
Para mejorar el rendimiento de produccion y la calidad de los polipeptidos descritos en el presente documento, pueden modificarse diversas condiciones de fermentacion. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje y plegamiento apropiado de las protemas heteromultimericas secretadas (por ejemplo, anticuerpos), pueden usarse vectores adicionales que sobreexpresan protemas chaperonas, tales como protemas de Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y/o DsbG) o FkpA (una peptidilpropil cis,trans-isomerasa con actividad de chaperona) para co-transformar las celulas procariotas hospedadoras. Se ha demostrado que las protemas chaperonas facilitan el plegamiento y la solubilidad apropiados de protemas heterologas producidas en celulas hospedadoras bacterianas. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274: 19601-19605; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 6.083.715; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 6.027.888; Bothmann y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm y Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39: 199-210.
Para minimizar la proteolisis de protemas heterologas expresadas (especialmente las que son proteolfticamente sensibles), ciertas cepas hospedadoras deficientes para enzimas proteolfticas pueden usarse para la presente invencion. Por ejemplo, pueden modificarse cepas de celulas hospedadoras para efectuar una mutacion o mutaciones geneticas en los genes que codifican proteasas bacterianas conocidas tales como Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas deficientes en proteasa de E. coli estan disponibles y se describen en, por ejemplo, Joly et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2773-2777; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.264.365; Georgiou et al., Patente de Estados Unidos N.° 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).
En una realizacion, se usan cepas de E. coli deficientes para enzimas proteolfticas y transformadas con plasmidos que sobreexpresan una o mas protemas chaperonas como celulas hospedadoras en el sistema de expresion descrito en el presente documento. En una segunda realizacion, la cepa de E. coli es deficiente para una lipoprotema de una membrana externa (Alpp).
iii. Purificacion de protemas heteromultimericas
En una realizacion, la protema heteromultimerica producida en el presente documento se purifica adicionalmente para obtener preparaciones que son sustancialmente homogeneas para ensayos y usos adicionales. Pueden emplearse metodos de purificacion de protemas convencionales conocidos en la tecnica. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificacion adecuados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatograffa en sflice o en
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una resina de intercambio cationico, tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitacion con sulfato de amonio y filtracion en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.
En un aspecto, la Protema A inmovilizada en una fase solida se usa para purificacion de inmunoafinidad de, por ejemplo, productos de anticuerpos de longitud completa como se describe en el presente documento. La protema A es una protema de pared celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se une con una alta afinidad con la region Fc de anticuerpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13. La fase solida en la que se inmoviliza la Protema A es preferentemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sflice, mas preferentemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de acido silfcico. En algunas aplicaciones, la columna se ha recubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento de prevenir la adherencia no espedfica de contaminantes.
Como la primera etapa de purificacion, la preparacion derivada del cultivo celular como se ha descrito anteriormente se aplica a la fase solida con Protema A inmovilizada para permitir la union espedfica del anticuerpo de interes con Protema A. La fase solida se lava despues para retirar contaminantes unidos de forma no espedfica con la fase solida. La protema heteromultimerica (por ejemplo, anticuerpo) se recupera de la fase solida por elucion.
b. Generacion de protenas heteromultimericas usando celulas hospedadoras eucariotas:
Los componentes de vector generalmente incluyen, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes: una secuencia senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminacion de la transcripcion.
i. Componente de secuencia senal
Un vector para uso en una celula hospedadora eucariota tambien puede contener una secuencia senal u otro polipeptido que tenga un sitio de escision espedfico en el extremo N terminal de la protema madura o el polipeptido de interes. La secuencia senal heterologa seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa senal) por la celula hospedadora. En expresion de celulas de mairnfero, estan disponibles secuencia senal de marnffero, asf como lfderes secretores virales, por ejemplo, la senal de gD del herpes simple. El ADN para dicha region precursora se liga en fase de lectura con ADN que codifica la protema o las protemas heteromultimericas deseadas (por ejemplo, anticuerpos).
ii. Origen de replicacion
En general, para vectores de expresion de marnffero no es necesario un componente de origen de replicacion. Por ejemplo, puede usarse tfpicamente el origen de SV40, pero solamente porque contiene el promotor temprano.
iii. Componente de gen de seleccion
Los vectores de expresion y clonacion pueden contener un gen de seleccion, tambien denominado marcador seleccionable. Los genes de seleccion tfpicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotroficas de complemento, cuando sean relevantes, o (c) aportan nutrientes cnticos no disponibles del medio complejo.
Un ejemplo de un esquema de seleccion utiliza un farmaco para detener el crecimiento de una celula hospedadora. Las celulas que se transforman con exito con un gen heterologo producen una protema que confiere resistencia a farmacos y por lo tanto sobreviven al regimen de seleccion. Los ejemplos de dicha seleccion dominante usan los farmacos neomicina, acido micofenolico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para celulas de marnffero son los que permiten la identificacion de celulas competentes para captar el acido nucleico de anticuerpo, tales como DHFr, timidina quinasa, metalotionema I y II, preferentemente genes de metalotionema de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.
Por ejemplo, se identifican en primer lugar celulas transformadas con el gen de seleccion de DHFR cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una celula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la lmea celular de ovario de hamster chino (ChO) deficiente en actividad de DHFR (por ejemplo, AtCc CRL-9096).
Como alternativa, pueden seleccionarse celulas hospedadoras (particularmente hospedadores de tipo silvestre que contienen DHFR endogeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, protema de DHFR de tipo silvestre, y otro marcador seleccionable tal como aminoglucosido 3'-fosfotransferasa (APH) por cultivo celular en medio que contiene un agente de seleccion para el marcador seleccionable tal como un antibiotico aminoglucosfdico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4.965.199.
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iv. Componente de promotor
Los vectores de expresion y clonacion habitualmente contienen un promotor que el organismo hospedador reconoce y se unen operativamente con el acido nucleico de polipeptido o polipeptidos que contienen bisagras deseados (por ejemplo, anticuerpos). Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Practicamente todos los genes eucariotas tienen una region rica en AT localizada de aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripcion. Otra secuencia hallada de 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de la transcripcion de muchos genes es una region CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleotido. En el extremo 3' de la mayona de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la senal para adicion de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresion eucariotas.
La transcripcion de polipeptido o polipeptidos que contienen bisagras deseados (por ejemplo, anticuerpo) de vectores en celulas hospedadoras de mairnfero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como, por ejemplo, virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus del Simio 40 (SV40), de promotores de mamfferos heterologos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, o de promotores de choque termico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de celulas hospedadoras.
Los promotores temprano y tardm del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restriccion de SV40 que tambien contiene el origen de replicacion viral SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restriccion de HindIII E. Se desvela un sistema para expresar ADN en hospedadores mamfferos usando el virus del papiloma bovino como un vector en la Patente de Estados Unidos N.° 4.419.446. Se describe una modificacion de este sistema en la Patente de Estados Unidos N.° 4.601.978. Vease tambien Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre la expresion de ADNc de p- interferon humano en celulas de raton bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Como alternativa, puede usarse repeticion terminal larga de Virus del Sarcoma de Rous como el promotor.
v. Componente de elemento potenciador
La transcripcion de ADN que codifica el polipeptido o los polipeptidos que contienen bisagras deseados (por ejemplo, anticuerpo) por eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora a partir de genes de mai^ero (por ejemplo, genes de globina, elastasa, albumina, a-fetoprotema e insulina). Tambien, se puede usar un potenciador de un virus de celula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardfo del origen de replicacion (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardfo del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus. Vease tambien Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) para una descripcion de elementos para potenciar la activacion de promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posicion 5' o 3' de la secuencia codificante de polipeptido de anticuerpo, siempre que se consiga potenciacion, pero en general se localiza en un sitio 5' del promotor.
vi. Componente de terminacion de la transcripcion
Los vectores de expresion usados en celulas hospedadoras eucariotas contendran tambien tfpicamente secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias estan disponibles habitualmente en las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminacion de la transcripcion util es la region de poliadenilacion de hormona del crecimiento bovina. Vease el documento WO94/11026 y el vector de expresion desvelado en el mismo.
vii. Seleccion y transformacion de celulas hospedadoras
Las celulas hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores del presente documento incluyen celulas eucariotas superiores descritas en el presente documento, incluyendo celulas hospedadoras de vertebrados. La propagacion de celulas de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Son ejemplos de lmeas celulares hospedadoras de mai^ero utiles la lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para crecer en cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celulas de rinon de cna de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); celulas de sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celulas de rinon de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, AtCc cRl-1587); celulas de carcinoma del cuello uterino humano (HELA, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas de hngado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas de tngado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MmT 060562, AtCc CCL51); celulas
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TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una lmea de hepatoma humano (Hep G2).
Las celulas hospedadoras se transforman con los vectores de expresion o clonacion anteriormente descritos para produccion de polipeptido o polipeptidos que contienen bisagras deseados (por ejemplo, anticuerpo) y se cultivan en medio nutriente convencional modificado segun sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
viii. Cultivo de las celulas hospedadoras
Las celulas hospedadoras usadas para producir un polipeptido o polipeptidos que contienen bisagras deseados (por ejemplo, anticuerpo) descritos en el presente documento pueden cultivarse en una diversidad de medios. Medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mmimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las celulas hospedadoras. Ademas, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes de Estados Unidos N.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o Patentes de Estados Unidos Re. 30.985 puede usarse como medio de cultivo para las celulas hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidermico), sales (tales como cloruro sodico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleotidos (tales como adenosina y timidina), antibioticos (tales como farmaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorganicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energfa equivalente. Tambien puede incluirse cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que conoceffan los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente usadas con la celula hospedadora seleccionada para expresion, y resultaran evidentes para los expertos habituales en la materia.
ix. Purificacion de protemas heteromultimericas
Cuando se usan tecnicas recombinantes, los polipeptidos que contienen bisagra pueden producirse intracelularmente, o secretarse directamente al medio. Si el polipeptido que contiene bisagra se produce intracelularmente, como una primera etapa, los residuos en parffculas, bien celulas hospedadoras o bien fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, mediante centrifugacion o ultrafiltracion. Cuando el polipeptido que contiene bisagra se secreta al medio, en general en primer lugar se concentran sobrenadantes de dichos sistemas de expresion usando un filtro de concentracion de protemas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibioticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.
La composicion heteromultimerica preparada a partir de las celulas puede purificarse usando, por ejemplo, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis y cromatograffa de afinidad, siendo la cromatograffa de afinidad la tecnica de purificacion preferida. La conveniencia de la protema A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que este presente en el anticuerpo. La protema A puede usarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas y1, y2 o y4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La protema G se recomienda para todos los isotipos de raton y para y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz con la que se une el ligando de afinidad es con mas frecuencia agarosa, pero estan disponibles otras matrices. Matrices mecanicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirendivinil)benceno permiten caudales mas rapidos y tiempos de procesamiento mas cortos que los que pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio Ch3, la resina Bakerbond aBx™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es util para purificacion. Otras tecnicas para purificacion de protemas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio ionico, precipitacion con etanol, HPLC de fase inversa, cromatograffa en sflice, cromatograffa en heparina, cromatograffa sEpHAROSE™ en una resina de intercambio anionico o cationico (tal como una columna de acido poliaspartico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitacion con sulfato de amonio tambien estan disponibles dependiendo del anticuerpo para recuperar.
Despues de cualquier etapa o etapas de purificacion preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interes y contaminantes puede someterse a cromatograffa de interaccion hidrofoba de pH bajo usando un tampon de elucion a un pH entre aproximadamente 2,5 y 4,5, preferentemente realizado a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, sal de aproximadamente 0-0,25 M). La produccion de las protemas heteromultimericas puede como alternativa o adicionalmente (a cualquiera de los metodos particulares anteriores) comprender dializar una solucion que comprenda una mezcla de los polipeptidos.
x. Produccion de anticuerpos usando baculovirus
Pueden generarse baculovirus recombinantes cotransfectando un plasmido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y ADN de virus BaculoGoldTM (Pharmingen) en una celula de insecto tal como una celula de
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Spodoptera frugiperda (por ejemplo, celulas Sf9; ATCC CRL 1711) o una celula S2 de Drosophila melanogaster usando, por ejemplo, lipofectina (disponible en el mercado de GIBCO-BRL). En un ejemplo particular, una secuencia de anticuerpo se fusiona cadena arriba de un marcador epitopico contenido dentro de un vector de expresion de baculovirus. Dichos marcadores epitopicos incluyen marcadores de poli-His. Puede emplearse una diversidad de plasmidos, incluyendo plasmidos derivados de plasmidos disponibles en el mercado tales como pVL1393 (Novagen) o pAcGP67B (Pharmingen). Brevemente, la secuencia que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo puede amplificarse mediante PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restriccion flanqueantes (seleccionados). El producto puede despues digerirse con las enzimas de restriccion seleccionadas y subclonarse en el vector de expresion.
Despues de transfeccion con el vector de expresion, las celulas hospedadoras (por ejemplo, celulas Sf9) se incuban durante 4-5 dfas a 28 °C y el virus liberado se recoge y se usa para amplificaciones adicionales. Puede realizarse infeccion viral y expresion de protemas como se describe, por ejemplo, en O'Reilley et al. (Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994)).
Despues puede purificarse anticuerpo marcado con poli His expresado, por ejemplo, mediante cromatograffa de afinidad de quelado de Ni2+ de la siguiente manera. Pueden prepararse extractos de celulas Sf9 infectadas por virus recombinante como se describe en Rupert et al. (Nature 362: 175-179 (1993)). Brevemente, las celulas Sf9 se lavan, se resuspenden en tampon para ultrasonidos (25 ml de HEPES pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol 10 %; nP-40 0,1 %; KCl 0,4 M), y se someten a ultrasonidos dos veces durante 20 segundos en hielo. Los productos de los ultrasonidos se aclaran por centrifugacion, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampon de carga (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; glicerol 10 % pH 7,8) y se filtra a traves de un filtro de 0,45 pm. Se prepara una columna de agarosa Ni2+-NTA (disponible en el mercado de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua, y se equilibra con 25 ml de tampon de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta la lmea basal A280 con tampon de carga, en cuyo momento se inicia la recogida de fraccion. A continuacion, la columna se lava con un tampon de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; glicerol 10 % pH 6,0), que eluye protema unida de forma no espedfica. Despues de alcanzar de nuevo la lmea basal de A280, la columna se desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampon de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tincion de plata o transferencia de Western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Se agrupan fracciones que contienen el anticuerpo marcado con His10 eluido y se dializan frente a tampon de carga.
Como alternativa, puede realizarse purificacion del anticuerpo usando tecnicas de cromatograffa conocidas, incluyendo por ejemplo, cromatograffa en columna de protema A o protema G. en una realizacion, el anticuerpo de interes puede recuperarse de la fase solida de la columna mediante elucion en una solucion que contiene un agente caotropico o detergente suave. Los agentes caotropicos y detergentes suaves ejemplares incluyen, pero sin limitacion, guanidina-HCl, urea, perclorato de litio, arginina, histidina, SDS (dodecilsulfato sodico), Tween, Triton y NP-40, todos los cuales estan disponibles en el mercado.
IV. Formacion/ensamblaje de protema heteromultimerica
La formacion de la protema heteromultimerica completa implica el reensamblaje del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagras por formacion de enlaces disulfuro que en la presente divulgacion se denomina replegamiento. El replegamiento incluye la asociacion del primer polipeptido que contiene bisagra con el segundo polipeptido que contiene bisagra y la formacion de los enlaces disulfuro intercatenarios. El replegamiento, tambien denominado renaturalizacion, en la presente invencion se realiza in vitro sin la adicion de reductor.
Las celulas hospedadoras pueden cultivarse usando los metodos anteriormente descritos bien como cultivos distintos o bien como un unico cultivo. En un metodo, las primeras celulas hospedadoras y segundas celulas hospedadoras se cultivan en el mismo recipiente de cultivo (denominado en ocasiones en el presente documento cocultivado o un cultivo mixto). En otro metodo, la primera y la segunda celulas hospedadoras se cultivan en distintos recipientes de cultivo. En un metodo, los distintos cultivos se procesan por separado y despues se mezclan/combinan antes de la rotura de la membrana celular. En otro metodo, los distintos cultivos se mezclan y despues se procesan antes de la rotura de la membrana celular. En un metodo, los distintos cultivos se mezclan sin procesamiento adicional antes de la rotura de la membrana celular. En un metodo, el cultivo individual que comprende la primera y la segunda celula hospedadora se procesa antes de la rotura de la membrana celular. En otro metodo, las celulas cocultivadas no se procesan antes de la rotura de la membrana celular. El procesamiento de las celulas comprende centrifugacion y resuspension en un tampon apropiado (por ejemplo, tampon de extraccion).
Se conocen en la tecnica tampones de extraccion y los expertos en la materia podran determinar que tampon usar sin experimentacion indebida.
Las membranas de celulas hospedadoras se rompen usando metodos conocidos en la tecnica. Dichos metodos incluyen permeabilizacion de la membrana celular y disgregacion de la membrana celular. La permeabilizacion de la membrana celular se refiere a hacer a la membrana “filtrante”, por ejemplo, introduciendo agujeros, sin destruir la integridad general de la membrana de modo que la celula siga siendo viable. En otras palabras, la permeabilizacion
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proporciona movimiento macromolecular a traves de la membrana celular y conserva la estructura celular lo suficiente para permitir la viabilidad celular continuada. Por el contrario, la disgregacion de la membrana celular da como resultado que los contenidos celulares se liberen al medio extracelular y muerte celular.
Los metodos para romper las membranas celulares incluyen pero sin limitacion lisis enzimatica, ultrasonidos, choque osmotico, pase a traves de un microfluidificador, adicion de EDTA, uso de diversos detergentes, disolventes (tales como tolueno, dimetil sulfoxido, etc.), tensioactivos (tales como Triton-X 100, Tween 20, etc.), tampones hipotonicos, uso de tecnicas de congelacion/descongelacion, electroporacion y pase a traves de un homogeneizador de bola de acero inoxidable.
Una vez que los polipeptidos que contienen bisagra se liberan de la celula (bien por permeabilizacion o disgregacion) los dominios de heteromultimerizacion conduciran la asociacion de las protemas heteromultimericas. La formacion de disulfuro intercatenario de los polipeptidos que contienen bisagra asociados continua sin la adicion de agentes reductores. Despues se purifica la protema heteromultimerica con enlaces disulfuro resultante. Opcionalmente, puede formularse para investigacion, diagnostico, terapia u otros fines.
V. Moleculas diana
Los ejemplos de moleculas que pueden ser diana de una protema heteromultimerica como se describen en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, protemas de suero solubles y sus receptores y otras protemas unidas a membrana (por ejemplo, adhesinas).
En otra realizacion la protema heteromultimerica descrita en el presente documento es capaz de unirse con una, dos o mas citocinas, protemas relacionadas con citocinas y receptores de citocinas seleccionados del grupo que consiste en BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FELI (EPSELON), FELI (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (ligando OX40), TNFSF5 (ligando CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando CD27), TNFSF8 (ligando CD30), TNFSF9 (ligando 4-1 BB), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, IL1R2, ILlRLI, LL1 RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILI0RA, ILI0RB, IL1IRA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIFI, HGF, LEP (leptina), PTN y THPO.
En otra realizacion, una molecula diana es una quimiocina, un receptor de quimiocinas, o una protema relacionada con quimiocinas seleccionada del grupo que consiste en CCLI (I- 309), cCl2 (MCP -1 / MCAF), CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp-2), CCLH (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP- Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / exodus-2), CCL22 (MDC / STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina- 3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-Ib), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCRI (CKRI / HM145), CCR2 (mcp-IRB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBII), CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR- LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), XCRI (GPR5 / CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33/ Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREMI, TREM2 y VHL.
En otra realizacion las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento son capaces de unirse con una o mas dianas seleccionadas del grupo que consiste en ABCfI; ACVRI; ACVRIB; ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; AD0RA2A; Aggrecan; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (cinc-a-glucoprotema); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLys); BAGI; BAII; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR2; BPAGI (plectina); BRCAI; C19orflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTI; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6 / JAB61); CCLI (1-309); CCLII (eotaxina); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Id); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MTP-2); SLC; exodus- 2; CCL22 (MDC / STC-I); CCL23 (MPIF- 1); CCL24 (MPIF-2 / eotaxina-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Ia); CCL4 (MDP- Ib); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNAI; CCNA2; CCNDI; CCNEI; CCNE2; CCRI (CKRI / HM145); CCR2 (mcp-IRB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 /STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBII); CCR8 (CMKBR8 / TERI / CKR-LI); CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20;
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DNCLI; DPP4; E2F1; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLTI; FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEBI; GAGECI; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (gelsolina); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamina y receptores de histamina; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNAI; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFNgamma; DFNWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-I; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11 RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HYI; IL1RI; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20RA; IL21 R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glucoprotema 130); EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSL4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (integrina a6); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (integrina b4); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAII; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (queratina 19); KRT2A; KHTHB6 (queratina H de tipo espedfico del cabello); LAMAS; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG o Omgp ; MAP2K7 (c- Jun); MDK; MIBI; midkina; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectina-III); MTSSI; MUCI (mucina); MYC; MYD88; NCK2; neurocan; NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR- Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); N0X5; NPPB; NROBI; NR0B2; NRIDI; NR1 D2; NR1 H2; NR1 H3; NR1 H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPI; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRDI; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacan; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1 D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mammaglobina 2); SCGB2A2 (mammaglobina 1); sCyEI (citocina activadora de monocitos endoteliales); SDF2; SERPINAI; SERPINA3; SERP1 NB5 (maspina); SERPINEI (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondina-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; factor tisular; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFS- FIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (ligando OX40); TNFSF5 (ligando CD40); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (ligando CD27); TNFSF8 (ligando CD30); TNFSF9 (ligando 4-1 BB); TOLLIP; receptores de tipo Toll; TOP2A (topoisomerasa Ea); TP53; TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicano; VHL C5; VLA-4; XCLI (linfotactina); XCL2 (SCM-Ib); XCRI(GPR5 / CCXCRI); YYI; y ZFPM2.
Las moleculas diana moleculares preferidas para anticuerpos abarcados por la presente divulgacion incluyen protemas CD tales como CD3, Cd4, CD8, CD16, CD19, cD20, CD34; miembros Cd64, CD200 de la familia de receptores ErbB tal como el receptor de EGF, receptor HER2, HER3 o HER4; moleculas de adhesion celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, vCaM, integrina alfa4/beta7 e integrina alfav/beta3 incluyendo subunidades alfa o beta de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11 a, anti-CD18 o anti-CD11 b); factores de crecimiento tales como VEGF-A, VEGF-C; factor tisular (TF); interferon alfa (alfaIFN); TNFalfa, una interleucina, tal como IL-1beta, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-9, IL-13, IL17A/F, IL-18, IL-13Ralfa1, IL13Ralfa2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; antfgenos de grupo sangumeo; receptor de flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; RANKL, RANK, protema F de VSR, protema C, etc.
En una realizacion, las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento se unen con protema relacionada con receptor de lipoprotemas de baja densidad (LRP)-1 o LRP-8 o receptor de transferrina, y al menos una diana seleccionada del grupo que consiste en 1) beta-secretasa (BACE1 o BACE2), 2) alfa-secretasa, 3) gamma-secretasa, 4) tau-secretasa, 5) protema precursora amiloide (APP), 6) receptor de muerte 6 (DR6), 7) peptido beta amiloide, 8) alfa-sinucleina, 9) parquina, 10) Huntingtina, 11) p75 NTR y 12) caspasa 6.
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En una realizacion, las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento se unen con al menos dos moleculas diana seleccionadas del grupo que consiste en: IL-1 alfa e IL-1 beta, IL-12 e IL-18; IL-13 e IL-9; IL-13 e IL- 4; IL-13 e IL-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-1 beta; IL-13 e IL- 25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MEF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-12 y TWEAK, IL-13 y CL25; IL-13 y SPRR2a; IL-13 y SPRR2b; IL-13 y ADAM8, IL-13 y PED2, IL17A e IL17F, CD3 y CD19, CD138 y CD20; CD138 y CD40; CD19 y CD20; CD20 y CD3; CD38 y CD138; CD38 y CD20; CD38 y CD40; CD40 y CD20; CD-8 e IL-6; CD20 y BR3, TNFalfa y TGF-beta, TNFalfa e IL-1 beta; TNFalfa e IL-2, TNF alfa e IL-3, TNFalfa e IL-4, TNFalfa e IL-5, TNFalfa e IL6, TNFalfa e IL8, TNFalfa e IL-9, TNFalfa e IL-10, TNFalfa e IL- 11, TNFalfa e IL-12, TNFalfa e IL-13, TNFalfa e IL-14, TNFalfa e IL-15, TNFalfa e IL-16, TNFalfa e IL-17, TNFalfa e IL-18, TNFalfa e IL-19, TNFalfa e IL-20, TNFalfa e IL-23, TNFalfa y IFNalfa, TNFalfa y CD4, TNFalfa y VEGF, TNFalfa y MIF, TNFalfa y ICAM-1, TNFalfa y PGE4, TNFalfa y PEG2, TNFalfa y ligando RANK, TNFalfa y Te38; TNFalfa y BAFF; TNFalfa y CD22; TNFalfa y CTLA-4; TNFalfa y GP130; TNFa e IL-12p40; VEGF y HER2, VEGF-A y HER2, VEGF-A y PDGF, HER1 y HER2, VEGF-A y VEGF-C, VEGF-C y VEGF-D, HER2 y DR5, VEGF e IL-8, VEGF y MET, VEGFR y receptor de MET, VEGFR y EGFR, HER2 y CD64, HER2 y CD3, HER2 y CD16, HER2 y HER3; EGFR (HER1) y HER2, EGFR y HER3, EGFR y HER4, IL-13 y CD40L, IL4 y CD40L, TNFR1 e IL-1 R, TNFR1 e IL-6R y TNFR1 e IL-18R, EpCAM y CD3, MAPG y CD28, EGFR y CD64, CSPGs y RGM A; CTLA-4 y BTNO2; IGF1 y IGF2; IGF1/2 y Erb2B; MAG y RGM A; NgR y RGM A; NogoA y RGM A; OMGp y RGM A; PDL-I y CTLA-4; y RGM A y RGM B.
Pueden usarse anffgenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados con otras moleculas, como inmunogenos para generar anticuerpos. Para moleculas transmembrana, tales como receptores, pueden usarse fragmentos de estos (por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor) como el inmunogeno. Como alternativa, pueden usarse como el inmunogeno celulas que expresan la molecula transmembrana. Dichas celulas pueden derivar de una fuente natural (por ejemplo, lmeas celulares cancerosas) o pueden ser celulas que se han transformado por tecnicas recombinantes para expresar la molecula transmembrana. Otros anffgenos y formas de los mismos utiles para preparar anticuerpos resultaran evidentes para los expertos en la materia.
VI. Ensayos de actividad
Las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento pueden caracterizarse por sus propiedades ffsicas/qmmicas y funciones biologicas por diversos ensayos conocidos en la tecnica.
Las protemas heteromultimericas purificadas pueden caracterizarse adicionalmente por una serie de ensayos incluyendo, pero sin limitacion, secuenciacion N terminal, analisis de aminoacidos, cromatograffa ffquida de alta presion de exclusion por tamano no desnaturalizante (HPLC), espectrometffa de masas, cromatograffa de intercambio ionico y digestion con papama.
En ciertas realizaciones las inmunoglobulinas producidas en el presente documento se analizan con respecto a su actividad biologica. En algunas realizaciones, las inmunoglobulinas descritas en el presente documento se ensayan con respecto a su actividad de union a anffgeno. Los ensayos de union a anffgeno que se conocen en la tecnica y pueden usarse en el presente documento incluyen, sin limitacion, cualquier ensayo de union competitiva o directo usando tecnicas tales como transferencias de western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sandwich", ensayos de inmunoprecipitacion, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de protema A. Se proporciona posteriormente un ensayo de union a anffgeno ilustrativo en la seccion de Ejemplos.
En una realizacion, la presente divulgacion contempla un anticuerpo alterado que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que lo hace un candidato deseado para muchas aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante pero ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o deletereas. En ciertas realizaciones, las actividades de Fc de la protema heteromultimerica producida se miden para asegurar que solamente se mantengan las propiedades deseadas. Pueden realizarse ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reduccion/el agotamiento de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de union a receptor de Fc (FcR) para asegurar que la protema heteromultimerica carezca de union a FcyR (que por lo tanto probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva la capacidad de union al FcRn. Las celulas primarias para mediar en ADCC, linfocitos NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molecula de interes se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos citoffticos naturales (NK). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998). Tambien pueden llevarse a cabo ensayos de union a C1q para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unirse con C1q y por lo tanto carece de actividad CDC. Para evaluar la activacion del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), tambien pueden realizarse determinaciones de union de FcRn y eliminacion/semivida in vivo usando metodos conocidos en la tecnica.
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VII. Proteinas coniuaadas
La divulgacion tambien proporciona protemas conjugadas tales como anticuerpos conjugados o inmunoconjugados (por ejemplo, “conjugados anticuerpo-farmaco” o "ADC"), que comprenden cualquiera de las proteinas heteromultimericas descritas en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo preparado de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento) en las que una de las regiones constantes de la cadena ligera o la cadena pesada se conjuga con una molecula qmmica tal como un colorante o agente citotoxico tal como un agente quimioterapeutico, un farmaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmented de la misma), un isotopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). En particular, como se describe en el presente documento, el uso de dominios de heteromultimerizacion permite la construccion de anticuerpos que contienen dos cadenas pesadas diferentes (HC1 y HC2) asf como dos cadenas ligeras diferentes (LC1 y LC2). Un inmunoconjugado construido usando los metodos descritos en el presente documento puede contener el agente citotoxico conjugado con una region constante de solamente una de las cadenas pesadas (HC1 o HC2) o solamente una de las cadenas ligeras (LC1 o LC2). Tambien, debido a que el inmunoconjugado puede tener el agente citotoxico unido a solamente una cadena pesada o ligera, la cantidad del agente citotoxico que se administra a un sujeto se reduce en relacion con la administracion de un anticuerpo que tiene el agente citotoxico unido a ambas cadenas pesadas o ligeras. La reduccion de la cantidad del agente citotoxico que se administra a un sujeto limita los efectos secundarios graves asociados con el agente citotoxico.
El uso de conjugados de anticuerpo-farmaco para el suministro local de agentes citotoxicos o citostaticos, es decir, farmacos para destruir o inhibir celulas tumorales en el tratamiento de cancer (Syrigos y Epenetos, Anticancer Research 19: 605-614 (1999); Niculescu- Duvaz y Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26: 151-172 (1997); patente de Estados Unidos n.° 4.975.278) permite el suministro dirigido del resto farmacologico a tumores, y la acumulacion intracelular en los mismos, cuando la administracion sistemica de estos agentes farmacologicos no conjugados pueda dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad a celulas normales asf como las celulas tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986): 603-605 (1986); Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506). Se busca de este modo maxima eficacia con minima toxicidad. Se ha indicado que tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales son utiles en estas estrategias (Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-187 (1986)). Los farmacos usados en estos metodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) mencionado anteriormente). Las toxinas usadas en los conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como toxina difterica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de moleculas pequenas tales como geldanamicina (Mandler et al., Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581 (2000); Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028 (2000); Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13: 786-791 (2002)), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996)) y calicheamicina (Lode et al., Cancer Res. 58: 2928 (1998); Hinman et al., Cancer Res. 53: 3336-3342 (1993)). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotoxicos y citostaticos por mecanismos que incluyen union a tubulina, union a ADN o inhibicion de topoisomerasa. Algunos farmacos citotoxicos tienden a estar inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos de receptores de proteinas.
Se describen en el presente documento agentes quimioterapeuticos utiles en la generacion de inmunoconjugados (por ejemplo, anteriormente). Las toxinas enzimaticamente activas y fragmented de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de difteria, fragmented activos que no se unen de la toxina difterica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteinas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAPS), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Vease, por ejemplo, documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Esta disponible una diversidad de radionuclidos para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los
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ejemplos incluyen Bi, I, In, Y y Re. Se preparan conjugados del anticuerpo y agente citotoxico usando una diversidad de agentes de acoplamiento a proteinas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de iminoesteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehfdos (tales como glutaraldetedo), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazonio-benzoil)- etilenediamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminopentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugacion de radionucleotido con el anticuerpo. Vease, por ejemplo, documento WO94/11026.
Tambien se contemplan en el presente documento conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de moleculas pequenas, tales como calicheamicina, maitansinoides, dolastatinas, aurostatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad toxica.
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i. Maitansina y maitansinoides
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo (de longitud completa o fragmentos) como se describe en el presente documento conjugado con una o mas moleculas maitansinoides.
Los maitansinoides son inhibidores mitoticos que actuan inhibiendo la polimerizacion de tubulina. La maitansina se aislo por primera vez del arbusto africano oriental Maytenus serrata (patente de Estados Unidos n.° 3.896.111). Posteriormente, se ha descubierto que ciertos microbios tambien producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres de maitansinol C-3 (patente de Estados Unidos n.° 4.151.042). Se desvelan maitansinol sintetico y derivados y analogos del mismo, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.
Los restos farmacologicos de maitansinoides son restos farmacologicos atractivos en conjugados farmacologicos de anticuerpo porque son: (i) facilmente accesibles para preparar por fermentacion o modificacion qmmica, derivatizacion de productos de fermentacion, (ii) susceptibles de derivatizacion con grupos funcionales adecuados para conjugacion a traves de los enlazadores distintos de disulfuro con anticuerpos, (iii) estables en plasma, y (iv) eficaces contra una diversidad de lmeas celulares tumorales.
Se desvelan inmunoconjugados que contienen maitansinoides, metodos para prepararlos y su uso terapeutico, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5.208.020, 5.416.064 y patente europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron inmunoconjugados que comprendfan un maitansinoide designado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cancer colorrectal humano. Se descubrio que el conjugado era altamente citotoxico para celulas cancerosas de colon cultivadas, y mostraron actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento de tumor in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que se conjugo maitansinoide mediante un enlazador disulfuro con el anticuerpo murino A7 que se urna con un antfgeno en lmeas celulares de cancer de colon humano, o con otro anticuerpo monoclonal murino TA.1 que se une con el oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado de TA.1- maitansinoide se ensayo in vitro en la lmea celular de cancer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antfgenos de superficie de HER-2 por celula. El conjugado farmacologico consiguio un grado de citotoxicidad similar al farmaco maitansinoide libre, que podna aumentarse aumentando el numero de moleculas maitansinoides por molecula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostro baja citotoxicidad sistemica en ratones.
Se preparan conjugados de anticuerpo-maitansinoide uniendo qmmicamente un anticuerpo con una molecula de maitansinoide sin reducir significativamente la actividad biologica del anticuerpo o la molecula de maitansinoide. Vease, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.208.020. Un promedio de 3-4 moleculas de maitansinoide conjugadas por molecula de anticuerpo ha mostrado eficacia en la potenciacion de la citotoxicidad de celulas diana sin afectar negativamente a la funcion o solubilidad del anticuerpo, incluso aunque se esperana que una molecula de toxina/anticuerpo potenciara la citotoxicidad frente al uso de anticuerpo desnudo. Se conocen bien en la tecnica maitansinoides y pueden sintetizarse por tecnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Se desvelan maitansinoides adecuados, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.208.020 y en otras patentes y publicaciones no de patente indicadas en el presente documento anteriormente. Los maitansinoides preferidos son maitansinol y analogos de maitansinol modificados en el anillo aromatico o en otras posiciones de la molecula de maitansinol, tales como diversos esteres de maitansinol.
Existen muchos grupos de enlace conocidos en la tecnica para preparar conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los desvelados en la patente de Estados Unidos n.° 5.208.020 o patente EP 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) y publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0169933. Pueden prepararse conjugados de anticuerpo-maitansinoide que comprenden el componente enlazador SMCC como se desvela en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005/0169933. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioeter, grupos labiles por acidos, grupos fotolabiles, grupos labiles por peptidasa o grupos labiles por esterasa, como se ha desvelado en las patentes anteriormente identificadas, prefiriendose los grupos de disulfuro y tioeter. Se describen y ejemplifican en el presente documento grupos de enlace adicionales.
Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y maitansinoide usando una diversidad de agentes de acoplamiento de protemas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N- maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehfdos (tales como glutaraldehfdo), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.
El enlazador puede unirse con la molecula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo del
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enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace ester por reaccion con un grupo hidroxilo usando tecnicas de acoplamiento convencionales. La reaccion puede producirse en la posicion C 3 que tiene un grupo hidroxilo, la posicion C 14 modificada con hidroximetilo, la posicion C 15 modificada con un grupo hidroxilo y la posicion C 20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realizacion preferida, el enlace se forma en la posicion C 3 de maitansinol o un analogo de maitansinol.
ii. Auristatinas y dolastatinas
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado con dolastatinas o analogos peptfdicos de dolastatina y derivados, las auristatinas (patentes de Estados Unidos n.° 5.635.483 y 5.780.588). Se ha mostrado que las dolastatinas y auristatinas interfieren con dinamicas de microtubulos, hidrolisis de GTP y division nuclear y celular (Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584 (2001)) y tienen actividad antineoplasica (patente de Estados Unidos n.° 5.663.149) y antifungica (Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965 (1998)). El resto farmacologico de dolastatina o auristatina puede unirse con el anticuerpo a traves del extremo N- (amino) terminal o el extremo C- (carboxilo) terminal del resto farmacologico peptfdico (documento WO 02/088172).
Las realizaciones de auristatina ejemplares incluyen los restos farmacologicos de monometilauristatina ligados al extremo N DE y DF, desvelados en "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," publicacion de solicitud de Estados Unidos n.° 2005/0238649.
Tfpicamente, pueden prepararse restos farmacologicos basados en peptidos formando un enlace peptfdico entre dos o mas aminoacidos y/o fragmentos peptfdicos. Dichos enlaces peptfdicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el metodo de smtesis en fase lfquida (vease E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides," volumen 1, pp. 76136, 1965, Academic Press) que se conoce bien en el campo de la qmmica peptfdica. Los restos farmacologicos de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los metodos de: patentes de Estados Unidos 5.635.483 y 5.780.588; Pettit et al., J. Nat. Prod. 44: 482-485 (1981); Pettit et al., Anti-Cancer Drug Design 13: 47-66 (1998); Poncet, Curr. Pharm. Des. 5: 139-162 (1999); y Pettit, Fortschr. Chem. Org. Naturst. 70: 1-79 (1997). Vease tambien Doronina, Nat. Biotechnol. 21 (7): 778-784 (2003); y "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," publicacion de solicitud de Estados Unidos n.° 2005/0238649 (que desvela, por ejemplo, enlazadores y metodos para preparar compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados con enlazadores).
iii. Calicheamicina
En otras realizaciones, el inmunoconjugado comprende uno como se ha descrito en el presente documento conjugado con una o mas moleculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antibioticos es capaz de producir roturas de ADN bicatenarias a concentraciones subpicomolares. Para la preparacion de conjugados de la familia de calicheamicina, vease patentes de Estados Unidos n.° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los analogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero sin limitacion, Y11, a2I, as1, N-acetil- Y11, PSAG y 9^ (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos anteriormente mencionadas de American Cyanamid). Otro farmaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de accion y no cruzan facilmente la membrana plasmatica. Por lo tanto, la captacion celular de estos agentes a traves de internalizacion mediada por anticuerpos potencia en gran medida sus efectos citotoxicos.
iv. Otros agentes citotoxicos
Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos descritos en el presente documento o prepararse de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento incluyen BCNU, estreptozocina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrita en las patentes de Estados Unidos n.° 5.053.394 y 5.770.710, asf como esperamicinas (patente de Estados Unidos n.° 5.877.296).
Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena A de la difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina difterica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, protemas de Aleurites fordii, protemas de diantina, protemas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos (vease, por ejemplo, documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993).
La presente divulgacion contempla ademas un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolftica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNasa).
Para destruccion selectiva de un tumor, el anticuerpo puede comprender un atomo altamente radiactivo. Esta
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disponible una diversidad de isotopos radiactivos para la produccion de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isotopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para deteccion, puede comprender un atomo radiactivo para estudios escintigraficos, por ejemplo tc99m o I123, o un marcador de espm para captura de imagenes por resonancia magnetica nuclear (rMn) (tambien conocida como captura de imagenes por resonancia magnetica, irm), tal como de nuevo yodo 123, yodo 131, indio 111, fluor 19, carbono 13, nitrogeno 15, oxfgeno 17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de diversas maneras. Por ejemplo, el peptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por smtesis de aminoacidos qrnmica usando precursores de aminoacidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor 19 en lugar de hidrogeno. Pueden unirse marcadores tales
QQm 19o 1 1 -j OQ 1 111 1 J 1
como tc o I , Re , Re e In mediante un resto de cistema en el peptido. Puede unirse itrio 90 mediante un resto de lisina. El metodo de IODOGEN (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 (1978)) puede usarse para incorporar yodo 123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros metodos en detalle.
Pueden prepararse conjugados del anticuerpo y agente citotoxico usando una diversidad de agentes de acoplamiento a protemas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tales como dimetil adipimidato HCl), esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehfdos (tales como glutaraldehfdo), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis- diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de fluor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El acido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triaminopentaacetico marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugacion de radionucleotido con el anticuerpo. Vease, por ejemplo, documento WO94/11026. El enlazador puede ser un “enlazador escindible” que facilite la liberacion del farmaco citotoxico en la celula. Por ejemplo, puede usarse un enlazador labil por acidos, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolabil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); patente de Estados Unidos n.° 5.208.020).
Los compuestos de la divulgacion contemplan de forma expresa, pero sin limitacion, ADC preparado con reactivos de reticulacion: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) que estan disponibles en el mercado (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., Estados Unidos). Vease paginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. Preparacion de anticuerpos conjugados
En los anticuerpos conjugados descritos en el presente documento, un anticuerpo esta conjugado con uno o mas restos (por ejemplo, restos farmacologicos), por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 restos por anticuerpo, opcionalmente mediante un enlazador. Los anticuerpos conjugados pueden prepararse por varias vfas, empleando reacciones qmmicas organicas, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo: (1) reaccion de un grupo nucleofilo de un anticuerpo con un reactivo de enlazador bivalente mediante un enlace covalente, seguido de reaccion con un resto de interes, y (2) reaccion de un grupo nucleofilo de un resto con un reactivo de enlazador bivalente mediante un enlace covalente, seguido de reaccion con el grupo nucleofilo de un anticuerpo. Se describen en el presente documento metodos adicionales para preparar anticuerpos conjugados.
El reactivo de enlazador puede estar compuesto de uno o mas componentes enlazadores. Los componentes enlazadores ejemplares incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ("MP"), valina-citrulina ("val-cit"), alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonilo ("PAB"), N-succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ("SMCC”) y N-succinimidil (4-yodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Se conocen en la tecnica componentes enlazadores adicionales y algunos se describen en el presente documento. Vease tambien "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," publicacion de solicitud de Estados Unidos n.° 2005/0238649.
En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender restos de aminoacidos. Los componentes de enlazadores de aminoacidos ejemplares incluyen un dipeptido, un tripeptido, un tetrapeptido o un pentapeptido. Los dipeptidos ejemplares incluyen: valina-citrulina (vc o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe). Los tripeptidos ejemplares incluyen: glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Los restos de aminoacidos que comprenden un componente enlazador de aminoacidos incluyen los de origen natural, asf como aminoacidos menores y analogos de aminoacidos de origen no natural, tales como citrulina. Pueden disenarse componentes de enlazadores de aminoacidos y optimizarse en su selectividad para escision enzimatica por enzimas particulares, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores, catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
Los grupos nucleofilos en anticuerpos incluyen, pero sin limitacion: (i) grupos amino N terminales, (ii) grupos amino de cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cistema y (iv) grupos hidroxilo o amino de azucares en los que el anticuerpo esta glucosilado. Los grupos de amina, tiol e hidroxilo son nucleofilos y
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son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres de NHS, esteres de HOBt, haloformatos y haluros acidos; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas; (iii) aldetndos, cetonas carboxilo y grupos de maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducibles, es decir, enlaces de cistema. Pueden prepararse anticuerpos reactivos para conjugacion con reactivos enlazadores mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Cada enlace de cistema formara por lo tanto, teoricamente, dos nucleofilos de tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleofilos adicionales en anticuerpos mediante la reaccion de lisinas con 2- iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversion de una amina en un tiol. Pueden introducirse grupos de tiol reactivos en el anticuerpo (o fragmentos del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o mas restos de cistema (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o mas restos de aminoacidos de cistema no nativos).
Tambien pueden producirse anticuerpos conjugados como se describe en el presente documento mediante modificacion del anticuerpo para introducir restos electrofilos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofilos en el reactivo enlazador o farmaco u otro resto. Los azucares de anticuerpos glucosilados pueden estar oxidados, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldetndo o cetona que pueden reaccionar con el grupo de amina de reactivos enlazadores o farmaco u otros restos. Los grupos de base de Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable, o pueden reducirse, por ejemplo, por reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una realizacion, la reaccion de la parte de carbohidrato de un anticuerpo glucosilado con galactosa oxidasa o metaperyodato sodico puede producir grupos de carbonilo (aldetndo y cetona) en la protema que pueden reaccionar con grupos apropiados en el farmaco u otro resto (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra realizacion, protemas que contienen restos de serina o treonina N terminales pueden reaccionar con metaperyodato sodico, dando como resultado la produccion de un aldetndo en lugar del primer aminoacido (Geoghegan y Stroh, Bioconjugate Chem. 3: 138-146 (1992); patente de Estados Unidos n.° 5.362.852). Dicho aldetndo puede hacerse reaccionar con un resto farmacologico o nucleofilo enlazador.
De forma similar, los grupos nucleofilos en un resto (tal como un resto farmacologico) incluyen, pero sin limitacion: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidracina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos en restos enlazadores y reactivos enlazadores incluyendo: (i) esteres activos tales como esteres de NHS, esteres de HOBt, haloformatos y haluros acidos; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas; y (iii) aldetndos, cetonas, carboxilo y grupos maleimida.
Como alternativa, puede prepararse una protema de fusion que comprende el anticuerpo y agente citotoxico, por ejemplo, mediante tecnicas recombinantes o smtesis peptfdica. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos partes del conjugado bien adyacentes entre sf o bien separadas por una region que codifica un peptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En otra realizacion mas, el anticuerpo puede conjugarse con un “receptor” (tal como estreptavidina) para utilizacion en la predireccion tumoral en la que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al individuo, seguido de retirada del conjugado no unido de la circulacion usando un agente de clasificacion y despues administracion de un “ligando” (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotoxico (por ejemplo, un radionucleotido).
VIII. Utilidad
Los presentes metodos proporcionados en el presente documento encuentran aplicabilidad industrial en la produccion de protemas heteromultimericas. Los metodos de la invencion reducen la cantidad de trabajo implicado en dos fermentaciones separadas y aislamientos asf como las dificultades tecnicas inherentes en dos fermentaciones separadas. Ademas, la eliminacion de las etapas de hibridacion y redox de los procedimientos de los metodos anteriores puede aumentar el rendimiento y reducir la complejidad y los costes de procesamiento.
Las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento encuentran uso, por ejemplo, en metodos terapeuticos in vitro, ex vivo e in vivo. La divulgacion proporciona diversos metodos basados en el uso de una o mas de estas moleculas. En ciertas condiciones patologicas, es necesario y/o deseable utilizar protemas heteromultimericas, por ejemplo, anticuerpos multiespedficos. La divulgacion proporciona estas protemas heteromultimericas que pueden usarse para una diversidad de fines, por ejemplo como productos terapeuticos, profilacticos y de diagnostico. Por ejemplo, la divulgacion proporciona metodos para tratar una enfermedad, comprendiendo dichos metodos administrar a un sujeto que necesite tratamiento una protema heteromultimerica como se describe en el presente documento por la que se trata la enfermedad. Puede usarse cualquiera de las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento en metodos terapeuticos (o profilacticos o de diagnostico) descritos en el presente documento.
Por ejemplo, cuando la protema heteromultimerica es multivalente, un beneficio valioso es la avidez potenciada que presenta por su antfgeno. Ademas de tener alta afinidad intrmseca basandose en una unidad de union (es decir, un Fab) con respecto a antfgeno, los anticuerpos IgG normales tambien aprovechan el efecto de avidez para aumentar su asociacion con antfgenos como resultado de su union bivalente para las dianas.
Una protema heteromultimerica dirigida contra dos epftopos distintos en la misma molecula de antfgeno puede no
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solamente proporcionar el beneficio de potenciar la avidez de union (debido a la union bivalente), sino que tambien adquieren nuevas propiedades que no se asocian con ninguno de los anticuerpos parentales. Por lo tanto, las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento encuentran uso, por ejemplo, en el bloqueo de interacciones de receptor-ligando.
Las protemas heteromultimericas descritas en el presente documento tambien encuentran uso en la aplicacion de bloqueo simultaneo de las rutas de senalizacion de dos dianas con una molecula.
IX. Usos terapeuticos
Las protemas heteromultimericas tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo y/o fragmento del mismo preparado de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento) pueden usarse para aplicaciones terapeuticas. Por ejemplo, dichas protemas heteromultimericas pueden usarse para el tratamiento de tumores, incluyendo tumores precancerosos, no metastasicos, metastasicos y cancerosos (por ejemplo, cancer de estadio temprano), para tratamiento de trastornos alergicos o inflamatorios, o para el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria o para tratamiento de un sujeto en riesgo de desarrollar cancer (por ejemplo, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma de celulas renales, glioma o cancer ovarico), un trastorno alergico o inflamatorio o una enfermedad autoinmunitaria.
El termino cancer abarca una coleccion de trastornos proliferativos, incluyendo pero sin limitacion crecimientos precancerosos, tumores benignos y tumores malignos. Los tumores benignos permanecen localizados en el sitio de origen y no tienen la capacidad de infiltran, invadir o metastatizar a sitios distantes. Los tumores malignos invadiran y danaran otros tejidos alrededor de ellos. Tambien pueden obtener la capacidad de separarse de donde se iniciaron y propagarse a otras partes del cuerpo (metastatizar), habitualmente a traves del torrente sangumeo o a traves del sistema linfatico en el que se localizan los ganglios linfaticos. Los tumores primarios se clasifican segun el tipo de tejido del que surgen; los tumores metastasicos se clasifican segun el tipo de tejido del que derivan las celulas cancerosas. A lo largo del tiempo, las celulas de un tumor maligno se hacen mas anomalas y aparecen menos como celulas normales. Este cambio en la apariencia de celulas cancerosas se denomina el grado de tumor y las celulas cancerosas se describen como bien diferenciadas, moderadamente diferenciadas, escasamente diferenciadas o indiferenciadas. Las celulas bien diferenciadas tienen apariencia bastante normal y se asemejan a las celulas normales de las que se originan. Las celulas indiferenciadas son celulas que se han vuelto tan anomalas que ya no es posible determinar el origen de las celulas.
El tumor puede ser un tumor solido o un tumor no solido o de tejido blando. Los ejemplos de tumores de tejido blando incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielogena cronica, leucemia mielogena aguda, leucemia linfoblastica aguda de adulto, leucemia mielogena aguda, leucemia linfoblastica aguda de linfocitos B maduros, leucemia linfodtica cronica, leucemia polilinfodtica o leucemia por tricoleucitos) o linfoma (por ejemplo linfoma no de Hodgkin, linfoma de linfocitos T cutaneo o enfermedad de Hodgkin). Un tumor solido incluye cualquier cancer de tejidos corporales distintos de sangre, medula osea o el sistema linfatico. Los tumores solidos pueden separarse adicionalmente en los de origen en celulas epiteliales y los que no tienen origen en celulas epiteliales. Los ejemplos de tumores solidos de celulas epiteliales incluyen tumores del tracto gastrointestinal, colon, mama, prostata, pulmon, rinon, hugado, pancreas, ovario, cabeza y cuello, cavidad oral, estomago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesmula biliar, labio, nasofaringe, piel, utero, organos genitales masculinos, organos urinarios, vejiga y piel. Los tumores solidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores cerebrales y tumores oseos.
Los canceres epiteliales generalmente evolucionan desde un tumor benigno hasta un estadio preinvasivo (por ejemplo, carcinoma in situ), a un cancer maligno, que ha penetrado en la membrana basal e invadido el estroma subepitelial.
Tambien pueden usarse complejos proteicos multiespedficos en estas aplicaciones terapeuticas, y en particular pueden usarse anticuerpos que se unen con HER2 para tratar el cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma de celulas renales, glioma o cancer ovarico.
Otros sujetos que son candidatos para recibir composiciones como se describe en el presente documento tienen, o estan en riesgo de desarrollar, proliferacion anomala de tejido fibrovascular, acne rosacea, smdrome de inmunodeficiencia adquirido, oclusion arterial, queratitis atopica, ulceras bacterianas, enfermedad de Bechet, tumores portados por la sangre, enfermedad obstructiva carotida, neovascularizacion coroidal, inflamacion cronica, desprendimiento cronico de la retina, uveftis cronica, vitreitis cronica, exceso de uso de lentes de contacto, rechazo de injerto corneano, neovascularizacion corneana, neovascularizacion de injerto corneano, enfermedad de Crohn, enfermedad de Eales, queratoconjuntivitis epidemica, ulceras fungicas, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zoster, smdromes de hiperviscosidad, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneracion de lfpidos, enfermedad de Lyme, queratolisis marginal, ulcera de Mooren, infecciones por micobacterias distintas de lepra, miopfa, enfermedad neovascular ocular, fosas opticas, smdrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu), osteoartritis, enfermedad de Paget, pars planitis, pemfigoide, filectenulosis, poliarteritis, complicaciones poslaser, infecciones protozoarias, pseudoxantoma elastico, queratitis seca ptengica, queratotoirna radial, neovascularizacion retiniana, retinopatfa del prematuro, fibroplasia retrolental, sarcoidosis, escleritis, anemia falciforme, smdrome de Sogren,
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tumores solidos, enfermedad de Stargart, enfermedad de Steven's Johnson, queratitis ftmbica superior, s^filis, lupus sistemico, degeneracion marginal de Terrien, toxoplasmosis, tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiosarcoma, colitis ulcerosa, oclusion de las venas, deficiencia de vitamina A, sarcoidosis de Wegener, angiogenesis no deseada asociada con diabetes, enfermedades parasitarias, curacion de heridas anomala, hipertrofia despues de cirugfa, lesion o traumatismo (por ejemplo, lesion pulmonar aguda/SDRA), inhibicion del crecimiento del cabello, inhibicion de la ovulacion y formacion del cuerpo luteo, inhibicion de la implantacion e inhibicion del desarrollo del embrion en el utero.
Los ejemplos de trastornos alergicos o inflamatorios o enfermedad o trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse usando un anticuerpo preparado de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitacion, artritis (artritis reumatoide, tal como artritis aguda, artritis reumatoide cronica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria cronica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriasica, artritis vertebral y artritis reumatoide de aparicion juvenil, osteoartritis, artritis cronica progrediente, artritis deformante, poliartritis cronica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades cutaneas hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tal como psoriasis en placas, psoriasis gutata, psoriasis pustular, y psoriasis de las unas, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto cronica, dermatitis alergica, dermatitis de contacto alergica, dermatitis herpetiforme y dermatitis atopica, smdrome de hiper IgM ligado a X, urticaria tal como urticaria alergica cronica y urticaria idiopatica cronica, incluyendo urticaria autoinmunitaria cronica, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrolisis epidermica toxica, esclerodermia (incluyendo esclerodermia sistemica), esclerosis tal como esclerosis sistemica, esclerosis multiple (EM), tal como EM espino- optica, EM progresiva primaria (EMPP) y EM recidivante remitente (EMRR), esclerosis sistemica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada y esclerosis ataxica, enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por autoinmunidad, colitis tales como colitis ulcerosa, colitis microscopica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante y colitis transmural y enfermedad inflamatoria del intestino autoinmunitaria), piodermia gangrenosa, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), smdrome de dificultad respiratoria, incluyendo smdrome de dificultad respiratoria del adulto o agudo (SDRA), meningitis, inflamacion de toda o parte de la uvea, iritis, coroidits, un trastorno hematologico autoinmunitario, espondilitis reumatoide, perdida de audicion repentina, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxis y renitis alergica y atopica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis ftmbica y/o del tronco encefalico, uveftis, tal como uveitis anterior, uveftis anterior aguda, uveitis granulomatosa, uveftis no granulomatosa, uveftis facoantigenica, uveftis posterior, o uveftis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin smdrome nefrotico tal como glomerulonefritis cronica y aguda tal como GN primaria, GN mediada por inmunidad, GN membranosa (nefropatfa membranosa), GN membranosa idiopatica o nefropatfa membranosa idiopatica, GN membrano proliferativa o membranosa proliferativa (GNMP), incluyendo el Tipo I y Tipo II, y GN de progresion rapida, afecciones alergicas, reaccion alergica, eccema incluyendo eccema alergico atopico, asma tal como asma bronquial y asma autoinmunitaria, afecciones que implican la infiltracion de linfocitos T y respuestas inflamatorias cronicas, enfermedad inflamatoria pulmonar cronica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia en la adhesion de leucocitos, lupus eritamatoso sistemico (LES) tal como LES cutaneo, lupus eritematoso cutaneo subagudo, smdrome de lupus neonatal (LEN), lupus eritematoso diseminado, lupus (incluyendo nefritis, cerebritis, pediatrico, no renal, extra-renal, discoide, alopecia), diabetes mellitus de aparicion juvenil (Tipo I), incluyendo diabetes mellitus insulinodependiente pediatrica (IDM), diabetes mellitus de aparicion en adultos (diabetes de Tipo II), diabetes autoinmunitaria, diabetes insfpida idiopatica, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitos, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumatica y arteritis de celulas gigantes (Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa), poliarteritis microscopica, vasculitis del SNC, vasculitis necrotizante, cutanea o de hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistemica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis o smdrome de Churg-Strauss (CSS)), arteritis temporal, anemia aplasica, anemia aplasica autoinmunitaria, anemia Coombs positiva, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolftica o anemia hemolftica inmunitaria incluyendo anemia hemolftica autoinmunitaria (AIHA), anemia perniciosa, enfermedad de Addison, anemia de globulos rojos pura o aplasia (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, smdrome de lesion de organos multiples tal como las secundarias de septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedad mediadas por complejo de antfgeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, smdrome de anticuerpos anti-fosfolipfdicos, neuritis alergica, enfermedad de Bechet o Behcet, smdrome de Castleman, smdrome de Goodpasture, smdrome de Reynaud, smdrome de Sjogren, smdrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide ampolloso y penfigoide cutaneo, penfigo (incluyendo penfigo vulgar, penfigo foliaceo, penfigo de mucus-penfigoide de membrana y penfigo eritematoso), poliendocrinopatfas autoinmunitarias, enfermedad o smdrome de Reiter, nefritis de complejo inmunitario, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis optica, polineuropatfas, neuropatica cronica, tal como polineuropatfas de IgG o neuropatfa mediada por IgM, trombocitopenia (como se desarrolla por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo purpura trombocitopenica trombotica (TTP) y trombocitopenia autoinmunitaria o mediada por inmunidad tal como purpura trombocitopenica idiopatica (ITP) incluyendo ITP cronica o aguda, enfermedad autoinmunitaria del testmulo y el ovario incluyendo orquitis autoinmunitaria y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis de
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Hashimoto, tiroiditis cronica (tiroiditis de Hashimoto) o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopatico, enfermedad de Graves, smdromes poliglandulares tales como smdromes poliglandulares autoinmunitarios (o smdromes de endocrinopatia poliglandular), smdromes paraneoplasicos, incluyendo smdromes paraneoplasicos neurologicos tales como smdrome miastenico de Lambert-Eaton o smdrome de Eaton-Lambert, smdrome del hombre rigido o la persona ngida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alergica y encefalomielitis alergica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave asociada a timoma, degeneracion cerebelar, neuromiotorna, opsoclono o smdrome de opsoclono mioclono (SOM) y neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, smdrome de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis cronica, hepatitis lupoide, hepatitis de celulas gigantes, hepatitis activa cronica o hepatitis activa cronica autoinmunitaria, pneumonitis intersticial linfoide,
bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopatica, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, pneumocirrosis, smdrome de enteropatia autoinmunitaria, enfermedad Cetiaca, esprue celfaco (enteropatia del gluten), esprue refractario, esprue idiopatico, crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrofica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad otica autoinmunitaria tal como enfermedad del ofdo interno autoinmunitaria (EOIA), perdida de audicion autoinmunitaria, smdrome de opsoclono mioclono (SOM), policondritis tal como policondritis refractaria o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitos no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatia monoclonal benigna y gammapatia monoclonal de significacion indeterminada, GMSI), neuropatia periferica, smdrome
paraneoplasico, canalopatias tales como epilepsia, migrana, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, paralisis periodica y canalopatias del SNC, autismo, miopatia inflamatoria, glomeruloesclerosis segmental focal (FSGS), oftalmopatia endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatologico autoinmunitario, fibromialgia, insuficiencia endocrina multiple, smdrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gastrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias, nefropatia diabetica, smdrome de Dressler, alopecia areata, smdrome de CREST (calcinosis, fenomeno de Raynaud, dismovilidad esofagica, esclerodactilia y telangiectasia), infertilidad autoinmunitaria masculina y femenina, enfermedad del tejido conectivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumatica, aborto recurrente, pulmon de granjero, eritema multiforme, smdrome pos-cardiotoirtia, smdrome de Cushing, pulmon de criador de pajaros, angitis granulomatosa alergica, angitis linfocftica benigna, smdrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alergica y alveolitis fibrosante,
enfermedad pulmonar intersticial, reaccion de transfusion, lepra, malaria, leishmaniosis, quipanosomiasis,
esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, smdrome de Sampter, smdrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocardica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis qmstica, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofila, smdrome de Shulman, smdrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis cronica, ciclitis heterocronica, iridociclitis o ciclitis de Fuch, purpura de Henoch-Schonlein, infeccion por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infeccion por ecovirus, cardiomiopatia, enfermedad de Alzheimer, infeccion por parvovirus, infeccion por virus de la rubeola, smdromes post-vacunacion, infeccion por rubeola congenica, infeccion por virus de Epstein-Barr, paperas, smdrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmunitaria, corea de Sydenham, nefritis post-estreptococica, tromboangitis obliterante, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de celulas gigantes, oftalmopatia endocrina, neumonitis de hipersensibilidad cronica, queratoconjuntivis seca, queratoconjuntivis epidemica, smdrome nefritico idiopatico, nefropatia de cambio mmimo, lesion de reperfusion por isquemia y familiar benigna, autoinmunidad retiniana, inflamacion de las articulaciones, bronquitis, enfermedad de las vfas respiratorias obstructiva cronica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleroticos, aspermiogenesis, hemolisis autoinmunitaria, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilactica, enteritis alergica, eritema nodoso leproso, paralisis facial idiopatica, smdrome de fatiga cronica, fiebre reumatica, enfermedad de Hamman-Rich, perdida de audicion sensoneural, hemoglobinuria paroxfstica, hipogonadismo, ileftis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopatico primario, nefrosis, oftalmia simpatica, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, piodermia gangrenosa, tiroiditis de Quervain, atrofia esplenica adquirida, infertilidad debida a anticuerpos antiespermatozoides, timoma no maligno, vitiligo, SCID y enfermedades asociadas con virus de Epstein-Barr, smdrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades parasitarias tales como Leishmania, smdrome de choque toxico, intoxicacion alimentaria, afecciones que implican la infiltracion de linfocitos T, deficiencia de adhesion de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, smdrome de lesion organica multiple, enfermedades mediadas por complejos de antigeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, neuritis alergica, poliendocrinopatias autoinmunitarias, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrofica autoinmunitaria, oftalmia simpatica, enfermedades reumaticas, enfermedad del tejido conectivo mixto, smdrome nefrotico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatia periferica, smdrome poliglandular autoinmunitario de tipo I, hipoparatiroidismo idiopatico de aparicion de adultos (HIAA), alopecia total, cardiomiopatia dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, smdrome nefrotico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o cronica, sinusitis del etmoides, frontal, maxilar o esfenoides, un trastorno relacionado con eosinofilos tales como eosinofilia, eosinofilia de infiltracion pulmonar, smdrome de mialgia- eosinofilia, smdrome de Loffler, neumoma eosinofila cronica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumonica, aspergiloma o granulomas que contienen eosinofilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerotica, epiesclerotica, candidiasis mucocutanea cronica, smdrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, smdrome de Wiskott- Aldrich, ataxia telangiectasia, trastornos autoinmunitarios asociados con enfermedad de colageno, reumatismo, enfermedad neurologica, trastorno de reperfusion por isquemia, reduccion de la respuesta de la tension sangumea,
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disfuncion vascular, angiectasia, lesion tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad que acompana a vascularizacion, trastornos de hipersensibilidad alergica, glomerulonefritis, lesion por reperfusion, lesion por reperfusion de tejidos miocardicos u otros, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, smdromes asociados con transfusion de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, inflamacion grave aguda, inflamacion intratable cronica, pielitis, neumonocirrosis, retinopatfa diabetica, trastorno de arterias grandes diabeticas, hiperplasia endarterial, ulcera peptica, valvulitis y endometriosis.
Ademas de los usos terapeuticos, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para otros fines, incluyendo metodos de diagnostico, tales como metodos de diagnostico para las enfermedades y afecciones descritas en el presente documento.
X. Dosificacion, formulaciones y duracion
Las protemas descritas en el presente documento se formularan, dosificaran y administraran de una manera coherente con la buena practica medica. Los factores para consideracion en este contexto incluyen el trastorno particular que se trate, el mairnfero particular que se trate, la afeccion clmica del sujeto individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el metodo de administracion, el programa de administracion y otros factores conocidos por los practicantes medicos. La “cantidad terapeuticamente eficaz” de las protemas para administrar estara controlada por dichas consideraciones, y es la cantidad minima necesaria para prevenir, aliviar o tratar un trastorno particular (por ejemplo, un cancer, trastorno alergico o inflamatorio o trastorno autoinmunitario). No es necesario que las protemas se formulen, pero se pueden formular opcionalmente, con uno o mas agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de protemas presentes en la formulacion, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan en general en las mismas dosificaciones y con vfas de administracion como se han usado anteriormente en el presente documento o de aproximadamente 1 a 99 % de las dosificaciones empleadas hasta el momento. En general, el alivio o el tratamiento de un cancer implican la reduccion de uno o mas smtomas o problemas medicos asociados con el cancer. La cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede conseguir uno o una combinacion de los siguientes: reducir (en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o mas) el numero de celulas cancerosas, reducir o inhibir el tamano tumoral o la carga tumoral; inhibir (es decir, reducir en algun grado y/o detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; reducir la secrecion hormonal en el caso de adenomas; reducir la densidad vascular; inhibir la metastasis tumoral; reducir o inhibir el crecimiento tumoral; y/o aliviar en algun grado uno o mas de los smtomas asociados con el cancer. En algunas realizaciones, las protemas se usan para prevenir la aparicion o reaparicion de cancer o un trastorno autoinmunitario en el sujeto.
En una realizacion, las protemas descritas en el presente documento pueden usarse para aumentar la duracion de la supervivencia de un sujeto humano susceptible de o al que se diagnostica un cancer o trastorno autoinmunitario. La duracion de supervivencia se define como el tiempo desde la primera administracion del farmaco hasta la muerte. La duracion de la supervivencia tambien puede medirse por la relacion de riesgo estratificado (HR) del grupo de tratamiento frente al grupo de control, que representa el riesgo de muerte para un sujeto durante el tratamiento.
En otra realizacion mas, el tratamiento descrito en el presente documento aumenta significativamente la tasa de respuesta en un grupo de sujetos humanos susceptibles de o a los que se diagnostica un cancer que se tratan con diversas terapias antineoplasicas. La tasa de respuesta se define como el porcentaje de sujetos tratados que respondieron al tratamiento. En un aspecto, el tratamiento de combinacion descrito en el presente documento, usando protemas como describe en el presente documento y cirugfa, terapia de radiacion o uno o mas agentes quimioterapeuticos aumenta significativamente la tasa de respuesta en el grupo de sujetos tratado en comparacion con el grupo tratado con cirugfa, terapia de radiacion o quimioterapia sola, teniendo el aumento un p valor de Chi cuadrado de menos de 0,005. Se describen mediciones adicionales de la eficacia terapeutica en el tratamiento de canceres en la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20050186208.
Se preparan formulaciones terapeuticas usando metodos convencionales conocidos en la tecnica mezclando el principio activo que tiene el grado de pureza deseado con vehmulos, excipientes o estabilizantes fisiologicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences (20a edicion), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadelfia, PA). Los vehmulos aceptables incluyen solucion salina, o tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (menores de aproximadamente 10 restos); protemas, tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona, aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azucares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG.
Opcionalmente, pero preferentemente, la formulacion contiene una sal farmaceuticamente aceptable, preferentemente cloruro sodico, y preferentemente a concentraciones aproximadamente fisiologicas. Opcionalmente, las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener un conservante farmaceuticamente
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aceptable. En algunas realizaciones la concentracion del conservante vana de 0,1 a 2,0%, tipicamente v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en la tecnica farmaceutica. Son conservantes preferidos alcohol bendlico, fenol, m-cresol, metilparabeno y propilparabeno. Opcionalmente, las formulaciones descritas en el presente documento pueden incluir un tensioactivo farmaceuticamente aceptable a una concentracion de 0,005 a 0,02 %.
La formulacion del presente documento tambien puede contener mas de un compuesto activo necesario para la indicacion particular que se trate, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan de forma adversa entre sf Dichas moleculas estan convenientemente presentes en combinacion en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.
Los principios activos tambien pueden inmovilizarse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsula de poli-(metil-metacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se desvelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, mencionado anteriormente.
Puede prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen la protema heteromultimerica, estando dichas matrices en forma de artmulos moldeados, por ejemplo, pelmulas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidrxoetil- metacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de Estados Unidos N.° 3.773.919), copolfmeros de acido L- glutamico y y etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copoUmeros de acido lactico-acido glicolico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolide), y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco. Aunque polfmeros tales como etilenvinil acetato y acido lactico-acido glicolico permiten la liberacion de moleculas durante mas de 100 dfas, ciertos hidrogeles liberan protemas durante periodos de tiempo mas cortos. Cuando permanecen en el cuerpo una protema o protemas heteromultimericas encapsuladas durante un largo tiempo, estas pueden desnaturalizarse, o agregarse como resultado de la exposicion a humedad a 37 °C, dando como resultado perdida de la actividad biologica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para estabilizacion dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregacion es formacion de enlaces S-S intermoleculares mediante el intercambio de tio-disulfuro, puede conseguirse estabilizacion modificando restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matrices polimericas espedficas.
Las protemas descritas en el presente documento (por ejemplo, una protema heteromultimerica tal como un anticuerpo multiespedfico preparado de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento) se administran a un sujeto humano, de acuerdo con metodos conocidos, tales como administracion intravenosa como una embolada o mediante infusion continua durante un periodo de tiempo, mediante vfas intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal, subcutanea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o de inhalacion. La administracion local puede desearse particularmente si se asocian efectos secundarios o toxicidad extensivos con el antagonismo de la molecula diana reconocida por las protemas. Puede usarse tambien una estrategia ex vivo para aplicaciones terapeuticas. Las estrategias ex vivo implican transfectar o transducir celulas obtenidas del sujeto con un polinucleotido que codifica una protema como se describe en el presente documento. Las celulas transfectadas o transducidas se devuelven despues al sujeto. Las celulas pueden ser cualquiera de una amplia serie de tipos incluyendo, sin limitacion, celulas hemopoyeticas (por ejemplo, celulas de medula osea, macrofagos, monocitos, celulas dendnticas, linfocitos T o linfocitos B), fibroblastos, celulas epiteliales, celulas endoteliales, queratinocitos o celulas musculares.
En un ejemplo, el complejo proteico (por ejemplo, una protema heteromultimerica tal como un anticuerpo multi espedfico preparado de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento), se administra por via local, por ejemplo, mediante inyecciones directas, cuando el trastorno o localizacion del tumor lo permita, y las inyecciones pueden repetirse periodicamente. El complejo proteico tambien puede suministrarse de forma sistemica al sujeto o directamente a las celulas tumorales, por ejemplo, a un tumor o a un lecho tumoral despues de escision quirurgica del tumor, para prevenir o reducir la reaparicion local o metastasis.
XI. Articulos de fabricacion
Otra realizacion descrita en el presente documento es un artfculo de fabricacion que contiene uno o mas complejos proteicos descritos en el presente documento, y materiales utiles para el tratamiento o diagnostico de un trastorno (por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria o cancer). El artfculo de fabricacion comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden formarse de una diversidad de materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente contiene una composicion que es eficaz para tratar la afeccion y puede tener un orificio de acceso esteril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por
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una aguja de inyeccion hipodermica). Al menos un agente activo en la composicion es una protema heteromultimerica (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) como se describe en el presente documento. La etiqueta o el prospecto indican que la composicion se usa para tratar la afeccion particular. La etiqueta o el prospecto comprenderan ademas instrucciones para administrar la composicion de protema heteromultimerica al sujeto. Tambien se contemplan artmulos de fabricacion y kits que comprenden terapias combinatorias descritas en el presente documento.
El prospecto se refiere a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapeuticos que contienen informacion acerca de las indicaciones, el uso, la dosificacion, la administracion, las contraindicaciones y/o las advertencias con respecto al uso de dichos productos terapeuticos. En ciertas realizaciones, el prospecto indica que la composicion se usa para tratar cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de pulmon, carcinoma de celulas renales, glioma o cancer ovarico.
Adicionalmente, el artmulo de fabricacion puede comprender ademas un segundo recipiente que comprende un tampon farmaceuticamente aceptable, tal como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y solucion de dextrosa. Puede incluir ademas otros materiales considerados desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Tambien se proporcionan kits que son utiles para diversos fines, por ejemplo, para purificacion o inmunoprecipitacion de un antfgeno (por ejemplo, HER2 o EGFR) de celulas. Para aislamiento y purificacion de un antfgeno (por ejemplo, HER2 o EGFR), el kit puede contener una protema heteromultimerica (por ejemplo, un anticuerpo de EGFR/HER2) acoplada a perlas (por ejemplo, perlas de sepharose). Pueden proporcionarse kits que contienen la protema o las protemas heteromultimericas para deteccion y cuantificacion del antfgeno in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia de Western. Como con el artmulo de fabricacion, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto en o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composicion que comprende al menos una protema heteromultimerica (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo multiespedfico) como se describe en el presente documento. Pueden incluirse recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes y tampones o anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto pueden proporcionar una descripcion de la composicion asf como instrucciones para el uso de diagnostico o in vitro pretendido.
Se considera que la descripcion escrita anterior es suficiente para permitir al experto en la materia practicar la invencion. Se ofrecen los siguientes Ejemplos solamente para fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invencion de ninguna manera. De hecho, diversas modificaciones de la invencion ademas de las mostradas y descritas en el presente documento resultaran evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripcion anterior y quedan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
En la divulgacion experimental a continuacion, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); |jM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); jmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); jg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); jl (microlitros); cm (centimetros); mm (milfmetros); jm (micrometros); nm (nanometros); °C (grados centfgrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos); ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo); BsAb (anticuerpo biespedfico); Cl (dominio constante de cadena ligera); Ch (dominio constante de cadena pesada); CMC (citotoxicidad mediada por complemento); Fab (fragmento de union a antfgeno); Fc (fragmento cristalizado); Fv (fragmento variable (Vl + Vh)); EGFR (receptor del factor de crecimiento epidermico); HC (cadena pesada); IGFR (receptor del factor de crecimiento de tipo insulina); LC (cadena ligera); scFv (fragmento variable monocatenario (Vl y Vh anclados por un enlazador de aminoacidos), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), VEGFR2 (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2); Vh (dominio pesado variable); Vl (dominio ligero variable).
Ejemplos
La presente invencion se describe en mas detalle en los siguientes ejemplos que no se pretende en ningun modo que limiten el alcance de la invencion como se reivindica. Se pretende que las figuras adjuntas se consideren partes integrales de la memoria descriptiva y descripcion de la invencion. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar, la invencion reivindicada.
Ejemplo 1
Construccion de vectores de expresion
Este ejemplo ilustra la construccion de acido nucleico usada para transformar celulas hospedadoras.
En general, las secuencias codificantes de ADN, tanto de cadena pesada como de cadena ligera, se clonaron en un plasmido de expresion que contema elementos promotores distintos para cada una de las secuencias y una resistencia a antibioticos para la seleccion de celulas bacterianas que contienen el plasmido de expresion. Las construcciones de vector tambien codifican la senal de secrecion de enterotoxina termoestable II (STII) (Picken et
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al., 1983, Infect. Immun. 42: 269-275, y Lee et al., 1983, Infect. Immun. 42: 264-268) para la exportacion de los polipeptidos de anticuerpos al espacio periplasmico de la celula bacteriana. La transcripcion de cada cadena se controla por el promotor de phoA (Kikuchi et al., 1981, Nucleic Acids Res., 9: 5671-5678) y se proporciona control de la traduccion por variantes de secuencia senal de STII previamente descritas de fuerza traduccional relativa medida, que contienen cambios de codones silenciosos en la region de inicio de la traduccion (TIR) (Simmons y Yansura, 1996, Nature Biotechnol. 14: 629-634 y Simmons et al., 2002, J. Immunol Methods, 263: 133-147). Se muestra un dibujo esquematico de los plasmidos de boton y ojal en las Figuras 2A y 2B, respectivamente.
Aunque la presente invencion no se basa en secuencias de union a anticuerpo espedficas, y es aplicable a cualquier combinacion de semianticuerpos, los Ejemplos del presente documento se dirigen a anticuerpos heteromultimericos dirigidos a c-met, EGFr, IL-4 e iL-13. Se proporcionan ejemplos de anticuerpos anti c-met en la Patente de Estados Unidos n.° 7.472.724 y Patente de Estados Unidos n.° 7.498.420. Se proporcionan ejemplos de anticuerpos anti EGFR en la Solicitud Provisional de Estados Unidos 61/210.562 (presentada el 20 de marzo de 2009), Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20080274114 (publicada el 6 de noviembre de 2008) y Patente de Estados Unidos n.° 5.844.093 (concedida el 1 de diciembre de 1998). Se describen ejemplos de anticuerpos anti IL-13 en la Patente de Estados Unidos n.° 7.501.121 (concedida el 10 de marzo de 2009), Patente de Estados Unidos n. ° 7.615.213 (concedida el 10 de noviembre de 2009), documento WO 2006/085938 (publicado el 17 de agosto de 2006), Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20090214523 (publicada el 27 de agosto de 2009) y Patente de Estados Unidos n.° 7.674.459 (concedida el 9 de marzo de 2010). Se describen ejemplos de anticuerpos anti IL-4 en la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° US 20080241160 (publicada el 2 de octubre de 2008) y Patente de Estados Unidos n.° 6.358.509 (concedida el 19 de marzo de 2002).
Cada semianticuerpo tuvo un boton (protuberancia) o un ojal (cavidad) introducido por ingeniena genetica en la cadena pesada como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 7.642.228. Brevemente, se genero en primer lugar un mutante de boton de Ch3. Despues se creo una biblioteca de mutantes de ojal de Ch3 introduciendo aleatoriamente restos 366, 368 y 407 que estan proximos al boton en el dominio Ch3 companero. En los siguientes ejemplos, la mutacion de boton es T366W, y el ojal tiene mutaciones T366S, L368A y Y407V en una cadena principal de IgG1. Un experto en la materia determina facilmente mutaciones equivalentes en otros isotipos de inmunoglobulina. Ademas, el experto en la materia apreciara facilmente que se prefiere que los dos semianticuerpos usados para el biespedfico sean del mismo isotipo. Pueden usarse semianticuerpos de diferentes isotipos pero pueden necesitar mutaciones adicionales.
Aunque el vector descrito en este Ejemplo es para semianticuerpo anti c-Met o anti EGFR, un experto en la materia apreciara facilmente que cualquier anticuerpo puede codificarse en el plasmido. El plasmido de partida para todas las construcciones usadas en el presente documento es el plasmido de cistron separado anti factor tisular descrito previamente, paTF50, con TIR relativos de 1 para pesada y 1 para ligera (Simmons et al., 2002, J. Immunol Methods, 263:133-147, y Patente de Estados Unidos n.° 6.979.556). Se uso un aumento en las fuerzas de TIR relativas para aumentar los tftulos de expresion de estos semianticuerpos.
Ejemplo 2
Produccion de proteinas heteromultimericas usando distintos cultivos celulares
El siguiente ejemplo muestra la produccion de proteinas heteromultimericas cuando las celulas que expresan los componentes monomericos se cultivan en distintos cultivos. En este metodo las celulas se cultivan y se induce que expresen el semianticuerpo en distintos cultivos. En un metodo, los cultivos de celulas hospedadoras pueden combinarse antes de la purificacion de proteinas. En otro metodo los componentes pueden purificarse primero y despues combinarse para formar la protema heteromultimerica.
En ambos metodos, se introduce un acido nucleico que codifica el primer polipeptido que contiene bisagra (por ejemplo, un semianticuerpo (boton)) en una primera celula hospedadora y un acido nucleico que codifica el segundo polipeptido que contiene bisagra (por ejemplo, un semianticuerpo (ojal)) se introduce en una segunda celula hospedadora. Aunque este ejemplo ilustra la formacion de un BsAb, un experto en la materia apreciara facilmente que los metodos descritos son aplicables a cualquier protema heteromultimerica que comprende una region bisagra, por ejemplo, aficuerpos, etc.
Metodo n.° 1 - Produccion independiente de semianticuerpo de boton y semianticuerpo de ojal en distintos cultivos, purificacion separada de los semianticuerpos, mezcla y redox para formar BsAb intacto.
Se generaron semianticuerpos que conteman las mutaciones de boton o de ojal en distintos cultivos expresando las cadenas pesadas y ligeras usando las construcciones descritas en el Ejemplo 1 en una celula hospedadora bacteriana, por ejemplo, E. coli. Vease Figura 3B y 4A. En este metodo n.° 1, el semianticuerpo de boton fue un anti EGFR y el semianticuerpo de ojal fue un anti c-met. Los plasmidos de expresion del Ejemplo 1 se introdujeron en cepas hospedadoras de E. coli 33D3 (Ridgway et al. 1999, Cancer Res. 59 (11): 2718) o 64B4 (W3110 AfhuA AphoA ilvG+ Aprc spr43H1 AdegP AmanA lacF AompT) y se seleccionaron transformantes en placas de LB que conteman carbenicilina. Despues se usaron transformantes para inocular un cultivo iniciador de LB que contiene carbenicilina y
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este se cultivo durante una noche con agitacion a 30 °C. El cultivo iniciador se diluyo 100X en un medio con fosfato limitante C.R.A.P. (Simmons et al., 2002, J. Immunol Methods, 263: 133-147) que contema carbenicilina, y este se cultivo durante 24 horas con agitacion a 30 °C. Los cultivos se centrifugaron, y los sedimentos celulares se congelaron hasta el inicio de la purificacion de anticuerpos. Los sedimentos se descongelaron y se resuspendieron en un tampon de extraccion que contema base Tris 25 mM ajustado a pH 7,5 con acido clorhffdrico, NaCl 125 mM y EDTA 5 mM (TEB o Tampon de Extraccion de Tris) con una relacion de volumen con respecto a peso de 100 ml de TEB por cada 5 gramos de sedimento celular, y se extrajeron rompiendo las celulas usando microfluidos pasando la mezcla resuspendida a traves de un microfluidificador modelo 110f de Microfluidics Corporation (Newton, MA) tres veces. El extracto de celulas bacterianas se clasifico despues por centrifugacion durante 20 minutos a 15.000 x g y el sobrenadante se recogio y se filtro a traves de un filtro de acetato de 0,22 micrometros antes de la purificacion.
Cada semianticuerpo se purifico por separado por captura de Protema A seguido de cromatograffa de intercambio cationico. Se cargaron extractos celulares clarificados del semianticuerpo de boton en una columna HiTrap MabSelect SURE de 1 ml de GE Healthcare (Pistcataway, NJ) a 2 ml/min. Despues de la carga la columna se lavo con 10 volumenes de columna (VC) de citrato sodico 40 mM, pH 6,0, cloruro sodico 125 mM y EDTA 5 mM seguido de 5 volumenes de columna de citrato sodico 20 mM a pH 6,0 para facilitar la captura por la columna de intercambio cationico. Los semianticuerpos capturados por afinidad se eluyeron con 10 volumenes de columna (VC) de acido acetico 0,2 mM (pH 2-3) y se capturaron directamente en una columna de intercambio cationico fuerte SP-HP HiTrap de 1 ml de gE Healthcare. La columna se lavo con 10 VC de tampon A que contema acido 2-(N- morfolino)etanosulfonico (MES) 25 mM pH 5,8. Los semianticuerpos se eluyeron con un gradiente lineal de tampon B 0-50 % (MES 25 mM, pH 5,8 y cloruro sodico 1 M (NaCl)). Ambas protemas se eluyeron entre 20-40 % de B y el pico eluyente como se determino por absorbancia de UV a 280 nm y por analisis de SDS-PAGE no reductor de las fracciones recogidas se agruparon por separado como el semianticuerpo de boton o de ojal. Ambas protemas mostraron en general un pico de elucion principal y todas las fracciones que conteman especies de cadena pesada y cadena ligera que se oxidaron entre sf se incluyeron en el grupo. Se muestra analisis de los semianticuerpos purificados por SDS-PAGE reductor y no reductor en la Figura 4B. Los resultados indican que la mayona de la protema expresada y capturada es de un tamano de 75 kD. Se confirmo esto mediante espectrometna de masas ESI-TOF mostrada en la Figura 4C. La masa de los semianticuerpos fueron las masas esperadas que indicaban que no habfa ningun aducto de disulfuro en ninguna cistema, incluyendo los dos restos de cistema en la region bisagra. Para determinar si las cistemas bisagra se redudan mostrando un tiol libre reactivo, las protemas se hicieron reaccionar a pH neutro con N-etilmaleimida (NEM) 1 mM durante una hora antes del analisis por espectrometna de masas. La masa de la protema no cambio, lo que indicaba que las cistemas bisagra se oxidaron entre sf mas probablemente en un disulfuro intracatenario, por ejemplo, un disulfuro dclico. Para ensamblar un anticuerpo biespedfico completamente intacto, usando estos dos semianticuerpos (boton y ojal), fue necesario en primer lugar reducir los disulfuros intracatenarios en la region bisagra para liberar los tioles sin cistema de modo que pudieran oxidarse posteriormente con la otra cadena pesada para formar el anticuerpo biespedfico de 150 kD.
Para conseguir la hibridacion, reduccion y reoxidacion de los dos semianticuerpos complementarios para formar las moleculas biespedficas intactas, se desarrollo el siguiente procedimiento. Despues de aislamiento independiente, las protemas purificadas se combinaron entre sf a masa igual en la etapa de agrupamiento del procedimiento (mostrada en la Figura 5A), el pH del grupo se ajusto a 7,5 anadiendo un decimo de volumen de Tris 1 M, pH 7,5, y las protemas se redujeron con Tris[2-carboxietil]fosfina (TCEP) 0,5 mM a temperatura ambiente. Despues de reduccion durante 2 horas se intercambio el tampon de las protemas agrupadas en Tris 25 mM, pH 7,5 y NaCl 125 mM usando columnas de centrifugacion de Desalacion Zeba de 5 ml (Pierce, Rockford, IL) dando como resultado un volumen de aproximadamente 4 ml de una concentracion de protema de 1 mg/ml. Las protemas se hibridaron despues calentando la mezcla hasta 52 °C durante 25 minutos seguido de enfriamiento a temperatura ambiente, aproximadamente 20 °C. Los anticuerpos hibridados se concentraron usando concentradores de centrifugacion de punto de corte de 10 kD de PM a un volumen de 0,5 ml con una concentracion de protema de aproximadamente 8 mg/ml y se oxidaron mediante la adicion de acido deshidroascorbico (DHAA) 300 micromolar a la mezcla de reaccion desde una solucion de reserva de DHAA 100 mM disuelta en dimetilsulfoxido. La cantidad de DHAA anadida para oxidacion es aproximadamente 10 veces mas que la concentracion molar de la protema. Despues de oxidacion durante una noche a temperatura ambiente, el material oxidado se proceso en una columna de filtracion en gel S-200 (22 ml de Tricorn S200 de GE Healthcare) en un tampon que contema MES 25 mM pH 6,0 y NaCl 300 mM. El anticuerpo intacto se agrupo y se diluyo 10 veces en agua. La protema BsAb se purifico despues por cromatograffa de intercambio cationico debil usando una resina de carboximetilo (CM) (HiTrap CM-FF 1 ml, GE Healthcare) con una elucion en gradiente de pH de 4,5 a 9,2. La composicion del tampon A y B consistio en citrato sodico 20 mM, MES 30 mM, HEPES 20 mM, imidazol 20 mM, Tris 20 mM, CAPS 20 mM y NaCl 25 mM, en la que el tampon A se ajusta a pH 4,2 con HCl y el tampon B se ajusta a pH 9,2 (o 10,4) usando NaOH. El material purificado obtenido despues de la cromatograffa de CM se analizo por espectrometna de masas para determinar la composicion molecular exacta (Figura 4D). El analisis de espectrometna de masas indico que el unico producto de anticuerpo intacto detectable tema una PM de 146.051,89, que coincide casi identicamente con la especie de boton- ojal heterodimerica anti EGFR/anti c-met con un PM teorico de 145.051,75. El rendimiento de este procedimiento, comenzando con aproximadamente 2 mg del boton y 2 mg del ojal fue de aproximadamente 0,5-1 mg.
Para produccion a gran escala de anticuerpos para experimentacion in vivo tal como la determinacion de propiedades farmacocineticas en primates no humanos, son necesarias cantidades de anticuerpo en escala de
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100 mg a gramos. Se desarrollo un procedimiento usando un cultivo separado, independiente para cada semianticuerpo como se muestra en la Figura 5A para producir anticuerpos biespedficos intactos en estas cantidades. Para estas preparaciones, se requenan fermentaciones de 10 litros para producir sedimentos celulares o caldo de cultivo completo con suficientes cantidades de anticuerpo (Simmons et al., 2002. J. Immunol. Methods, 263: 133-147 y Patente de Estados Unidos n.° 6.979.556). Durante la experimentacion se usaron sedimentos celulares o cultivos bacterianos completos para biomasa que contema semianticuerpos expresados. En algunos casos, una fraccion significativa del anticuerpo se hada filtrado al medio, en el que el caldo de cultivo completo proporciono rendimientos mayores. Para sedimentos celulares, el material se resuspendio en tampon de extraccion que contema Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM y NaCl 125 mM y se liso por microfluidificacion usando un microfluidificador Modelo HC80003A de Microfluidics (Newton, MA). Se microfluidifico directamente caldo de cultivo completo sin la adicion de aditivos. En ambos casos, se realizaron tres pases del material a traves del instrumento. En este ejemplo, se prepararon 500 mg de dos versiones de un anticuerpo biespedfico que se dirigfa a las citocinas interleucina 4 (boton) e interleucina 13 (ojal).
La primera version del biespedfico contema un Fc IgG1a humano solamente con las mutaciones de boton y ojal y el segundo contema un Fc modificado adicionalmente con dos mutaciones, T307Q y N434A, que conducen a una mayor afinidad por el receptor de Fc neonatal FcRn). Se espera que las segundas versiones transmitan una eliminacion mas lenta y semivida mas larga para el anticuerpo. El anticuerpo de ojal (que se dirige a IL-4) y el anticuerpo de boton (que se dirige a IL-13) de ambas versiones del Fc (WT-Fc para el primero y variante de FcRn para el segundo) se cultivaron ambos por separado en 10 litros de fermentacion y el caldo de cultivo completo que contema medio de cultivo y celulas bacterianas se homogeneizaron y se purificaron de forma independiente. Despues de la microfluidificacion del caldo de cultivo completo, el extracto se trato con un volumen igual de polietilenimina (PEI) 0,4 % (pH 9,0) para preparar el extracto para clarificacion por centrifugacion. La mezcla se agito durante 3 horas a temperatura ambiente o durante una noche a 4 °C. PEI provoco precipitacion extensiva del extracto que se clarifico por centrifugacion a 15.000 Xg durante 45 minutos. El sobrenadante se filtro posteriormente por filtros de 0,22 micrometres antes de cargar en una columna de captura de Protema A Mab Select SURE de 100 ml. El extracto se cargo a 20 ml/min y se lavo con citrato sodico 40 mM, pH 6,0 y NaCl 100 mM hasta que la absorbancia de UV a 280 alcanzo una lmea basal estable, generalmente de aproximadamente 10 volumenes de columna (VC). El tampon de lavado se cambio a citrato sodico 20 mM, pH 6,0 y se lavo durante aproximadamente 2 VC. El semianticuerpo capturado se eluyo usando acido acetico 0,2 M. Despues de aislamiento por Protema A los anticuerpos se purificaron por cromatograffa de intercambio cationico usando resina de S-FF (GE Healthcare) o cromatograffa de filtracion en gel usando resina S200 (GE Healthcare) para retirar impurezas y agregados. Los semianticuerpos purificados fueron en su mayona las especies de ~75 kD como se ve en la Figura 5B. Despues de la segunda etapa de aislamiento, se agruparon 500 mg de cada semianticuerpo juntos a una concentracion de 1 mg/ml y el pH se ajusto a 7,5 usando Tris 1 M, pH 7,5. La mezcla se calento a 37 °C en un incubador y se superviso por filtracion en gel con respecto a aparicion de la especie de anticuerpo de 150 kD. Despues de 2 horas, la hibridacion se completo mostrando conversion completa a la especie dimerica de 150 kD y la mezcla se enfrio a temperatura ambiente. Las protemas se redujeron mediante la adicion de DTT 2 mM durante dos horas a 24 °C y posteriormente se concentraron a 20 mg/ml usando filtros de centrifugacion de punto de corte de 10 kD. La solucion concentrada se oxido por dialisis durante una noche en un tampon que contema solamente Tris 25 mM, pH 8,0. El material oxidado se analizo posteriormente con respecto a pureza y agregacion. Se determino por espectrometna de masas que la especie de anticuerpo intacta era la molecula biespedfica heterodimerica completamente oxidada, intacta, sin embargo, la filtracion en gel y el analisis de SDS-PAGE indicaron la presencia de cantidades significativas de agregado, parte del cual era claramente el resultado de multimeros con enlaces disulfuro (datos no mostrados). Para purificar adicionalmente el anticuerpo biespedfico para experimentacion in vivo, el anticuerpo se separo sobre una columna de filtracion en gel S-200 en Tris, pH 7,5 y NaCl 125 mM. El material purificado mostro una perdida mayor del 30 % de material debido a la retirada de agregados introducidos. Para los estadios finales de la preparacion, la protema se adhirio a una columna de intercambio cationico, se lavo con TX114 al 0,1 % en acetato sodico 50 mM, pH 5,0, para retirar la endotoxina contaminante, y se eluyo con un tampon de pH alto que contema Tris 50 mM, pH 8,0. La protema eluida se formulo despues por dialisis en un tampon adecuado para experimentacion in vivo y se almaceno a 4 °C. El material final que consistfa en el WT-Fc y el FcRn-variante se analizo por SDS-PAGE, espectrometna de masas, ensayos de LAL para determinar los niveles de endotoxina contaminante y analisis de filtracion en gel. Los resultados del SDS-PAGE se muestran en la Figura 5C, e indican que la especie principal es el anticuerpo biespedfico intacto a 150 kD. La Figura 6A muestra la actividad biologica de los anticuerpos en un ensayo de proliferacion de celulas TF-2 que ensaya la neutralizacion de las citocinas IL-4 e IL- 13. Para el ensayo, se usaron anticuerpos biespedficos anti IL-4/IL-13, anti IL-4 y anti IL-13 a una concentracion de partida de 25 pg/ml y se diluyeron en serie 10 veces en una placa de cultivo de 96 pocillos (Falcon, Cat n.° 353072) hasta una concentracion final de 0,025 pg/ml en medio de ensayo (medio de cultivo sin rhGM-CSF) o medio de ensayo que contema IL-4 humano 0,4 ng/ml (R&D Systems, Catalogo n.° 204-IL) mas IL-13 humana 20 ng/ml (Genentech Inc.) en un volumen final de 50 pl/pocillo. Los anticuerpos diluidos se preincubaron durante 30 minutos a 37 °C.
Despues de la preincubacion, las celulas TF-1 cultivadas en RPMI 1640 (Genentech, Inc.), suero bovino fetal al 10% (HyClone, Cat n.° SH300071.03), L-glutamina 2 mM 100 unidades/ml, penicilina 100 pg/ml, estreptomicina (Gibco, Cat n.° 10378) y rhGM-CSF 2 ng/ml (R & D Systems, Cat n.° 215-GM) se lavaron 2 veces con medio de ensayo y se resuspendieron en medio de ensayo para obtener una concentracion final de 2 x 105 celulas/ml. Se
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anadieron 50 pl de celulas a cada pocillo que contema los anticuerpos diluidos, medio de ensayo mas citocinas IL-4 e IL-13 (control de proliferacion maximo) o medio de ensayo solamente (control de fondo). Todas las muestras se sembraron en placas por duplicado. Las placas se incubaron a 37 °C a CO2 5 % durante 4 dfas. Se anadio 1 pCi de 3H Timidina (Perkin Elmer, Cat n.° NET027005MC) a cada pocillo durante las ultimas 4 horas de incubacion. Las placas se recogieron en un Unifilter-96 GF/C (Perkin Elmer, Cat n.° 6005174) usando un Packard Filtermate, la incorporacion de 3H timidina se midio usando un TopCount NXT (Perkin Elmer). Los datos se representaron usando KaleidaGraph. Los resultados indican que el anticuerpo biespedfico anti IL-4/anti IL-13 WT es tan eficaz como combinaciones de anticuerpos IgG de IL-4 e IL-13 en la neutralizacion de la actividad de IL-4 e IL-13.
Los dos anticuerpos (WT anti-IL-4/anti-IL-13 y variante de FcRn anti-IL-4/anti-IL-13) se ensayaron despues con respecto a sus propiedades farmacocineticas (PK) en mono cinomologus. Usando una inyeccion de una unica dosis, la molecula WT formulada en acetato de histidina 20 mM, pH 5,5, sacarosa 240 mM, y Tween 20 0,02 % a 10,8 mg/ml y 1 mg/ml y la variante de FcRn en fosfato sodico 20 mM, pH 7,5, sacarosa 240 mM, y Tween 20 0,02 % a 10,5 mg/ml, se administraron por inyeccion IV. El nivel de dosificacion fue de 20 mg/kg y 2 mg/kg para las dos concentraciones WT y 20 mg/kg para la variante de FcRn. Se tomaron muestras de suero de dos monos macho y dos hembra a los que se les inyectaron los tres tratamientos periodicamente a lo largo de 42 dfas. Las muestras de suero se ensayaron con respecto al anticuerpo biespedfico intacto por ELISA en el que un antfgeno, bien IL-4 o IL- 13, se extendio sobre las placas y el anticuerpo se capturo posteriormente del suero. La cantidad de anticuerpo biespedfico capturado presente se determino por deteccion con un segundo ligando biotinilado bien IL-13 o IL-4 (en el ligando que no se hubiera extendido sobre las placas) y estreptavidina acoplada a enzima. Los resultados de la Figura 6B muestran las eliminaciones de dos compartimentos esperadas de las tres muestras. Las propiedades PK de las dos versiones diferentes del anticuerpo se muestran en la Tabla 2 en comparacion con otros dos anticuerpos que derivan de hospedadores de produccion CHO (Avastin y Herceptin) y contienen glucosilacion de Fc. Resulta evidente que el anticuerpo biespedfico producido por E. coli es similar a los anticuerpos derivados de CHO de un proceso convencional y que la variante de FcRn tiene una semivida mas larga.
Tabla 2
Poblacion Media (% de RSE) Vc (ml/kg) WT 29,0 (9,48)
FcRn 15,8(5,72)
Avastin Herceptin
CL (ml/kg/dfa) T1/2 (dfa)

4,49 (7,66) ~ 10

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Metodo n.° 2 - Produccion de semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal en distintos cultivos (es dedr. independientes), mezcla de caldo de cultivo completo antes de la purificacion de los semi-anticuerpos y lisis sin la adicion de un reductor para formar BsAb intacto.
Este metodo fue un intento de reducir el numero de etapas en el proceso purificando los semi-anticuerpos de boton y ojal al mismo tiempo. Por lo tanto, los caldos de fermentacion se mezclaron antes de sedimentar y resuspender en tampon de extraccion. Se ha crefdo que cada celula hospedadora liberana su semi-anticuerpo expresado que contiene el disulfuro dclico dentro de la region bisagra en el tampon de extraccion tras rotura de la membrana celular. Posteriormente, la purificacion de ambos semi-anticuerpos podna realizar simultaneamente seguido de la etapa de redox-hibridacion para formar el BsAb intacto. Sorprendentemente, se ha descubierto que los anticuerpos de boton-ojal se heterodimerizaron y oxidaron por sf solos para formar un anticuerpo de longitud completa (~150 kD) a mas de 20 % del total combinado del semi-anticuerpo y el anticuerpo intacto (~75 kD) (vease Tabla 3).
Se cultivaron las celulas hospedadoras que expresaban el semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal y se indujeron en distintos cultivos usando el proceso como se ha descrito en el Metodo n.° 1 anterior. El caldo de cultivo de fermentacion celular completo de cada cultivo se mezclo con el otro a tres relaciones de volumenes diferentes y despues se centrifugo para formar un unico sedimento celular. Los caldos de cultivo de fermentacion de celulas completas se mezclaron juntos hasta un volumen final de 500 ml a una relacion de (anti-c-met):(anti-EGFR) de 1:1, 2:1 o 1:2, con la intencion de igualar la recuperacion de los dos anticuerpos en abundancia relativamente igual y sabiendo que el semi-anticuerpo anti-EGFR se expreso de forma similar al anticuerpo de cMet en las mismas condiciones. Cada segmento celular se resuspendio en tampon de extraccion y se liso. Se extrajo y se purifico protema por cromatograffa de Protema-A seguido de cromatograffa de intercambio cationico como se describe en el Ejemplo 2, Metodo n.° 1. El tampon de extraccion contema Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 125 mM y EDTA 5 mM. Cuando se purificaron por separado, cada uno del semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal forman un disulfuro dclico dentro de la region bisagra, es decir, un disulfuro intracatenario, evitando la asociacion covalente de las cadenas pesadas de boton y ojal. Sin embargo, se descubrio que cuando la primera y la segunda celulas hospedadoras se lisaron entre sf despues de cocultivar o despues de mezclar caldos de cultivo de fermentacion completos antes de la centrifugacion, hubo algun nivel de ensamblaje en la especie de anticuerpo intacta. La Figura 7 muestra la especie de anticuerpo intacta observada en las tres relaciones. Esto sugiere que las modificaciones del procedimiento podnan dar como resultado formacion espontanea del anticuerpo biespedfico intacto que podna eliminar sustancialmente la necesidad de etapas qmmicas adicionales.
Se realizo cuantificacion de las dos especies proteicas separando 5 microgramos de protema por SDS-PAGE
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usando un gel de Tris-Glicina 4-20 % Novex (Invitrogen, Carlsbad CA). Despues de electroforesis el gel se tino con tincion de Cooomassie coloidal que contema sulfato de amonio 150 mM, acido acetico 1,74 M, metanol 10% y colorante de Coomassie R250 0,4 g/l en agua. El gel se destino con acido acetico 10 % en agua y posteriormente se equilibro en solucion de secado Gel-Dry (Invitrogen) y se seco entre dos laminas de celofan. Despues de secar el gel, las bandas proteicas se cuantificaron por el sistema de captura de imagenes Odyssey IR (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) a 700 nm.
Tabla 3. Senales fluorescentes de licor para anticuerpos intactos y semi-anticuerpos despues de aislamientos mixtos de dos cultivos de boton y ojal cultivados por separado. [Esta es una medida de una bisagra]
Relacion en volumen Combinado
(c-met:EGFR)
UFR 150 kD UFR 75 kD UFR % de UFR 150/total
1:1
36,01 98,78 134,8 26,72
2:1
36,8 107 143,8 25,59
1:2
34,64 107,83 142,5 24,31
Metodo n.° 3 - Produccion de semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal en cultivos independientes, centrifugacion independiente, sedimentos mezclados y resuspendidos seguido de lisis, y purificacion del BsAB sin la adicion de un reductor
Este metodo es un intento de reducir el numero de etapas en el proceso de purificacion del boton y el ojal al mismo tiempo.
Las celulas se cultivan independientemente y se sedimentan por centrifugacion. Los sedimentos se mezclan y se resuspenden juntos en tampon de extraccion. Se cree que los semi-anticuerpos se liberaran al tampon de extraccion tras rotura de las membranas celulares y que se vera un perfil de producto similar al del Metodo n.° 2, anterior.
Ejemplo 3
Produccion de proteinas heteromultimericas usando un cultivo de celulas mixtas individuales
Este ejemplo ilustra la formacion de protema heteromultimericas de un cultivo que comprende dos poblaciones de celulas hospedadoras, en el que no hay ninguna adicion de un reductor en el proceso.
Metodo n.°4 - Produccion de semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal de diferentes poblaciones celulares en el mismo cultivo para formar BsAb sin la adicion de reductor.
Se realizaron en primer lugar experimentos de co-cultivo en matraces de agitacion de 0,5 litros con dos transformantes de E. coli diferentes que conteman un semi-anticuerpo de boton o de ojal. Para este experimento, se produjo un cultivo iniciador de los semi-anticuerpos tanto de boton (anti-EGFR) como de ojal (anti-cMet) por cultivo durante una noche en medio LB (carbenicilina 100 |ig/ml) en cultivos de 5 ml a 30 °C. Los cultivos de una noche de DO600 igual se usaron para inocular 500 ml de medio CRAP completo (carbenicilina 100 |ig/ml) en tres relaciones diferentes (anti-EGFR:anti-cMet; 1.5:1, 1:1 y 1:1.5) manteniendo el volumen de siembra total a 1/100 del cultivo. Las celulas se cultivaron durante 24 horas a 30 °C, 200 rpm. Las celulas se sedimentaron despues por centrifugacion (6750 x g, 10 minutos, 4 °C) y se usaron para purificacion.
Las celulas se resuspendieron en tampon de extraccion que contema Tris 25 mM, pH 7,5, EDTA 7 mM y NaCl 125 mM a una relacion de 100 ml por cada 10 g de sedimento celular. Despues de la extraccion por microfluidizacion y preparacion para cromatograffa como se describe en el Ejemplo 2, los extractos celulares de las tres relaciones diferentes se purificaron capturando en primer lugar el anticuerpo biespedfico en una columna HiTrap de 1 ml Mab Select SURE (GE Healthcare, S. San Francisco, CA) y con un tampon de lavado de columna que contiene solamente citrato sodico 40 mM a pH 6,0. Despues del lavado y la elucion como se describe en el Ejemplo 2, los grupos de captura de protema A se cargaron en una columna de intercambio cationico SP-HP y se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Despues de separacion por intercambio cationico, los picos cromatograficos de cada una de las tres purificaciones se agruparon y se concentraron a un volumen de aproximadamente 50 - 100 microlitros, y con una concentracion de proteinas de aproximadamente 15 mg/ml. Las relaciones de inoculacion inicial paredan suponer una diferencia en la cantidad final de anticuerpo intacto, y esta fue una mayor proporcion de anticuerpo biespedfico intacto con respecto a formas de menor peso molecular de lo que se observo cuando los sedimentos celulares se mezclaron entre sf despues de cultivar durante una noche a 37 °C. Vease Tabla 4.
Tabla 4
Relacion de inoculacion
UFR 150 kD UFR 75 kD UFR combinadas % de UFR 150/ total
1,5 frente 1
11,71 10,28 22,0 53,25
1 frente 1
9,09 8,96 18,1 50,36
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Para determinar si el co-cultivo puede extenderse a la escala de fermentacion de 10 litros, lo que es cntico para procedimientos de aumento de escala, se realizaron varios experiments con los semi-anticuerpos anti-EGFR y anti- cMet. Para fermentaciones de 10 litros, se uso un cultivo iniciador de inoculacion que contema una relacion celular 1:1 de anti-EGFR y anti-cMet. Los co-cultivos de 10 litros se cultivaron en condiciones identicas a las de los cultivos de semi-anticuerpos individuales descritos en el Ejemplo 2. Se uso sedimento celular o caldo de cultivo completo para extraccion y aislamiento del material de anticuerpo, tambien como se ha descrito anteriormente. Para extraccion de material de los sedimentos celulares, se produjeron aproximadamente 2,5 kg de pasta a partir de una fermentacion de 10 litros. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 5 litros de tampon que contema Tris 25 mM, pH 7,5 y NaCl 125 mM. El sedimento se trato con un mezclador polytron durante 2 minutos antes de resuspender el sedimento, y despues se microfluidifico, se clarifico y se preparo para captura de Protema A como se ha descrito en el Ejemplo 2. El experimento de fermentacion se repitio dos veces mas y los resultados del aislamiento de co-cultivo de fermentadores de 10 litros se muestran en la Figura 8C. Se uso espectrometna de masas para caracterizar la protema de ~ 150 kD y la protema de ~ 75 kD para determinar los componentes moleculares. Sorprendentemente, la protema de mayor PM dominante es el anticuerpo biespedfico y la protema de ~ 75 kD fue principalmente el semi-anticuerpo de cMet debido a su perfil de expresion diferencial. Esto indica que el anticuerpo biespedfico se ha formado completamente sin la necesidad de etapas qmmicas adicionales. Debido a que el anticuerpo biespedfico es una combinacion estequiometrica 1:1 de los semi-anticuerpos de boton y ojal, la presencia de solamente una protema de 75 kD indica que la mayona del semi-anticuerpo limitante se ha incorporado espontaneamente en el anticuerpo biespedfico intacto.
Esta observacion condujo al desarrollo de un esquema de expresion y purificacion simplificado como se muestra en la Figura 8D. Despues de captura de protema A, el anticuerpo se diluyo 1:1 con un tampon que contema sulfato de amonio 1,5 M y fosfato sodico 25 mM, pH 6,5 y se cargo en una columna de interaccion hidrofoba (HIC) Dionex Pro Pac HIC-10 4,6 mm x 100 mm (Sunnyvale, CA). Un gradiente de 30-60 % de B, con el tampon A compuesto de fosfato sodico 25 mM, pH 6,95, y sulfato de amonio 1,5 M y el tampon B compuesto de fosfato sodico 25 mM, pH 6,95 y alcohol isopropflico 25 %. Las protemas se separaron con un gradiente de 15 VC. La protema se separo en dos especies principales, una que contema el anticuerpo biespedfico intacto y la otra que contema el semi- anticuerpo anti-EGFR en exceso. Los resultados de la separacion cromatografica se muestran en la Figura 8E. Las fracciones que contienen el anticuerpo intacto se agruparon y se trataron para retirar cualquier endotoxina contaminante restante por adherencia a una columna de S-FF en un tampon de acetato sodico 25 mM a pH 5,0, lavando con el mismo tampon de acetato que contiene Triton X114 0,1 % y despues retirando el detergente lavando con el tampon de acetato de partida. La protema se eluyo de la columna S-FF usando Tris 25 mM, pH 8,0, se agrupo y se analizo mediante SDS-PAGE, espectrometna de masas y ensayos de LAL para endotoxinas. La protema contema 0,076 UE/mg de endotoxina en la preparacion final, lo que indica que es adecuada para aplicaciones in vivo. La caracterizacion final se muestra en la Figura 8F. El analisis de SDS-PAGE muestra que una mayona de la protema es el anticuerpo biespedfico intacto final, y el analisis de espectrometna de masas muestra el peso molecular esperado para el anticuerpo biespedfico, y la falta de cualquier especie contaminante, en particular las formas homodimericas que podnan estar presentes. La comparacion del procedimiento modificado usando co-cultivo en comparacion con el procedimiento que requiere hibridacion y qmmica redox se muestra en la Figura 8G.
Metodo n.° 5 - Produccion de semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal en el mismo cultivo para formar BsAb intacto usando diferentes relaciones de boton:ojal
Este ejemplo muestra que celulas hospedadoras que usan construcciones de expresion similares (que difieren solamente en el semi-anticuerpo para expresar) no crecen de forma diferente entre sf y producen BsAb intacto.
Los experimentos han demostrado que el control de la relacion de una de las cadenas se realizo facilmente ajustando la relacion de inoculacion antes de expansion y expresion. Las dos cepas no crecen de forma diferente entre sf.
Para determinar si se conserva la relacion de inoculo frente a la fermentacion de un co-cultivo, se realizo un experimento para determinar la cantidad de la cadena pesada de boton u ojal que estaba presente al final de una fermentacion de 24 horas de co-cultivos con relaciones celulares diferentes. Se cultivaron celulas que albergaban el plasmido de boton (anti-EGFR) u ojal (anti c-Met) por separado en medio LB (carbenicilina 100 |ig/ml) durante una noche a 30 °C. El cultivo iniciador se uso para inocular medio CRAP completo (carbenicilina 100 |ig/ml) con diferentes relaciones de cultivo de una noche manteniendo el volumen de inoculacion combinado a 1:100 del cultivo final. Las relaciones ensayadas para anti-EGFR:anti-c-Met fueron 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10. Despues de cultivar durante 24 horas a 30 °C se obtuvieron muestras celulares y se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor (TrisGlicina al 12 %) seguido de transferencia de Western con Anticuerpo IgG-Fc de Cabra anti-Humano conjugado con HRP (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX). Las cadenas pesadas de las dos especies se resuelven por SDS-PAGE y el resultado se muestra en la Figura 8B. La cantidad de cada semi-anticuerpo se correlaciona con la relacion de inoculacion del co-cultivo, lo que indica que las celulas que albergan plasmidos que codifican semi- anticuerpos diferentes no crecen en forma diferente entre sf en un co-cultivo.
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Metodo n.° 6 - Produccion de semi-anticuerpo de boton y semi-anticuerpo de ojal en el mismo cultivo para formar permeabilizacion de membrana a BsAb intacto.
Este ejemplo muestra que la permeabilizacion de membrana libera los semi-anticuerpos al medio y con la formacion posterior de un BsAb intacto sin la necesidad de qmmica adicional (por ejemplo, redox o acoplamiento).
Se sabe que mutaciones que conducen a la perdida de smtesis de lipoprotemas alteran la membrana celular de E. coli lo que confiere filtracion de protemas periplasmicas al medio y tambien hace a E. coli hipersensible a EDTA (Hirota, Y. et al. PNAS 74: 1417-1420 (1977)). Se comparo la liberacion de anticuerpo expresado de la cepa 65G4 (W3110 AfhuA AphoA ilvG+ Aprc spr43H1 AdegP AmanA lacfi AompT A/pp) con y sin adicion de EDTA. Se co- cultivaron celulas que expresaban a-IL-4 (ojal) o a-IL-13 (boton) como se ha descrito en el metodo n.° 4 en una relacion 1:1 y se cultivaron en un agitador incubador a 200 rpm durante 20 horas a 30 °C. Al final de la incubacion el cultivo se dividio en tres almuotas iguales. Una muestra actuo como un control sin EDTA anadido. A las otras dos muestras se anadio EDTA, pH 8,0 a una concentracion final de 10 mM. La incubacion continuo para todas las muestras durante 30 minutos, despues de lo cual se anadio MgCh a una concentracion final de 20 mM a una de las muestras tratadas con EDTA. Todas las muestras se incubaron durante 30 minutos adicionales en el agitador incubador antes de retirar celulas por centrifugacion (9200 x g, 20 minutos, 4 °C) y el sobrenadante se filtro a traves de un filtro de GF/F (Whatman, Piscataway, NJ) y filtro PES de 0,2 |im (Nalgene, Rochester, NY). Puede anadirse DNasal, de pancreas bovino (Sigma, St. Louis, MO) a 4 mg/l para mejorar la filtracion.
El sobrenadante filtrado se cargo despues directamente sobre una columna de Protema A MabSelect SURE HiTrap de 1 ml (GE Healthcare) como se ha descrito previamente. La protema capturada se eluyo con acido acetico como se ha descrito anteriormente y puede verse recuperacion de pico de la protema en la Figura 9A. Los resultados muestran que la absorbancia de UV total aumenta en las muestras tratadas con EDTA. Esta absorbancia es anticuerpo espedfico intacto y semi-anticuerpo en exceso. Vease Figuras 9B y 9C.
En un experimento separado los semi-anticuerpos anti-IL-4 y anti-IL-13 se expresaron por separado o como un co- cultivo 1:1 de celulas 65G4. Se cultivaron celulas como se ha descrito anteriormente (Metodo n.° 4) con la excepcion de complementar el medio CRAP completo con Antiespumante de Silicona (Fluka, Buchs, Suiza) hasta 0,02 % (v/v). Despues de cultivar las celulas durante 24 horas, 30 °C, 200 rpm en un agitador incubador, se anadio EDTA, pH 8,0, a una concentracion final 10 mM y la incubacion continuo durante una hora antes de anadir MgCh hasta 20 mM. Las celulas se recogieron por centrifugacion (6750 x g, 10 minutos, 4 °C), el sobrenadante se filtro (PES 0,2 |i, Nalgene, Rochester, NY) y los anticuerpos se capturaron por la protema A como se ha descrito anteriormente y se analizaron mediante SDS-PAGE y espectrometna de masas. Los resultados mostrados en la Figura 9D indican que la formacion de anticuerpos biespedficos intactos se observa solamente en presencia de ambas mitades del biespedfico. Adicionalmente, la mayona del anticuerpo anti-IL-13 se incorporo en el anticuerpo biespedfico sin ninguna qmmica redox adicional ya que el analisis de espectrometna de masas indico que la banda proteica de 75 kD era principalmente el semi-anticuerpo anti-IL-4. El anticuerpo biespedfico purificado por protema A se diluyo 1:1 con tampon de sulfato de amonio y se purifico adicionalmente con una columna ProPac HIC-10 de 7,5 mm x 150 mm (Dionex, Sunnyvale, CA) usando el mismo procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 3. Se descubrio que el anticuerpo biespedfico intacto se elrna a un tiempo de retencion de 99,68. Este pico se agrupo y se analizo mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y se descubrio que estaba compuesto casi completamente por la especie de anticuerpo intacta. Para confirmar que esta protema era una molecula biespedfica heterodimerica pura, se analizo la protema mediante ESI-TOF CL/EM. Se inyectaron aproximadamente 10 microgramos del anticuerpo biespedfico en una columna de fase inversa PLRP-S 300 A de 3 micrometros 50 x 2,1 mm (Polymer Laboratories) y se separo por un gradiente de 4,3 minutos de 34-45 % 0,5 % de TFA y acetonitrilo usando una HPLC Agilent Serie 1200 y un caudal de 0,5 ml/min y un calentador de columna a 80 °C. Se analizo la protema que elrna de la CL mediante un TOF Agilent 6210. Se observo un unico pico que contema protema, y este pico se desconvoluciono usando software Agilent Mass Hunter version B.02.00 usando un intervalo de masas de 50.000160.000, etapa de 1,0 Da, umbral de 30,0 S/N, masa promedio de 90, un intervalo de masa limitada y una anchura de isotopos ajustada a automatica. La mayona de la senal representa la masa esperada de la molecula biespedfica. La masa para el biespedfico heterodimerico intacto calculada a partir de la secuencia de aminoacidos es de 144.044 que esta en un intervalo de 1-2 Daltons de la masa medida, mientras que las masas calculadas de las posibles protemas homodimericas son 144.954,6 para anti-IL-4 y 145.133,4 para anti-IL-13.
Se ensayo si diferentes relaciones de inoculacion persistinan de nuevo a lo largo del cultivo para este conjunto de anticuerpos y tambien en el contexto de la supresion en Ipp de 65G4. Se usaron cultivos de siembra con anti-IL-4 (ojal) o anti-IL-13 (boton) de DO600 igual para inocular 500 ml de medio CRAP a relaciones 2:1 y 1:2, se cultivaron y se permeabilizaron al final de la fermentacion como se ha descrito anteriormente (vease Metodo n.° 6). Las dos preparaciones de medios diferentes se purificaron mediante captura por Protema A seguido de separacion por HIC como se ha descrito anteriormente, excepto que el pH de los tampones de HIC A y B se redujeron a 6,5. Los resultados de las dos relaciones de cultivos iniciadores diferentes se muestran en la Figura 9E. Se observa que la mayona de la protema es el anticuerpo biespedfico intacto. Los otros picos se caracterizaron por espectrometna de masas y se marcaron en la Figura 9E. El semi-anticuerpo anti-IL-13 se detecta ligeramente, y se ve una cantidad significativa mas de anti-IL-4. En la relacion 33/66 de anti-IL-4 con respecto a anti-IL-13, hay mas anti-IL-13 observado con una cantidad ligera de anti-IL-4 restante. Aqm se ven que la relacion de inoculacion se mantiene a lo
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largo del cultivo y que la optimizacion del proceso podna conseguirse equilibrando las relaciones de mitades de anticuerpos expresadas mediante manipulacion de relaciones de cultivos iniciadores.
Se ha continuado ensayando este proceso de expresion de co-cultivo en celulas delta-lpp en varias variantes de anticuerpos diferentes. En la Figura 9F se muestran protemas purificadas finales despues de formulacion post- cromatograffa de HIC de algunos semi-anticuerpos ejemplares.
Ejemplo 4
Bibliotecas de protemas heteromultimericas
Este ejemplo ilustra la construccion de una biblioteca de protemas heteromultimericas.
Ciertos metodos que puede usarse para explorar mezclas de anticuerpos biespedficos o para generar rapidamente grandes matrices de anticuerpos biespedficos usando los metodos descritos.
Metodo n.° 7
En algunos casos la eleccion de anticuerpo biespedfico se desconoce, pero podna ser el resultado de la combinacion de muchos semi-anticuerpos diferentes. Como alternativa, puede desearse una combinacion diana espedfica, por ejemplo, anti-IL-4/anti-lL-13 pero hay varios semi-anticuerpos candidatos de los que elegir. Puede conseguir hallar la combinacion de semi-anticuerpos espedfica que produce la mejor union o eficacia combinando los semi-anticuerpos en un formato de matriz, y se pueden producir muchas variantes de anticuerpos biespedficos rapidamente. Para este experimento, puede producirse un anticuerpo tal como anti-CD3 en un exceso de aproximadamente 10 veces (o mayor) frente a la cantidad de anticuerpo necesaria para explorar. Esta molecula puede despues hibridarse y oxidarse usando el procedimiento descrito en el Ejemplo n.° 1. Aproximadamente un decimo de la cantidad total del primer anticuerpo puede usarse para combinar con una cantidad igual de aproximadamente 10 semi-anticuerpos que se dirigen a antfgenos diferentes (tales como anti-CD19, anti-CD20, etc.) como se representa en diagrama en la Figura 10. Si es necesario combinar un semi-anticuerpo primario adicional con el segundo repertorio de semi-anticuerpo, esto puede hacerse para producir un conjunto de moleculas de exploracion.
En una segunda modificacion del metodo, el anticuerpo primario (tal como anti-CD3) puede cultivarse como un co- cultivo usando celulas hospedadoras de E. coli “normales” o con una cepa mutante que tiene un fenotipo de lipoprotemas no funcionales. Este semi-anticuerpo puede despues anadirse sistemicamente a cada uno de los semi- anticuerpos variables produciendo una matriz de moleculas biespedficas que contienen todas el semi-anticuerpo de direccion primario.
Metodo n.° 8
El semi-anticuerpo primario puede combinarse con una serie de semi-anticuerpos companeros alternativos en una manera que consiste en producir este semi-anticuerpo en cantidad suficiente para combinar con todos los otros semi-anticuerpos combinados. Despues puede realizarse una hibridacion a granel en una unica reaccion de modo que el semi-anticuerpo primario sea la version de boton o de ojal de la cadena pesada y el conjunto de semi- anticuerpos de direccion secundarios sean el mutante complementario. Aqrn, puede producirse una mezcla compleja de anticuerpos que puede ser util para tratar la enfermedad como una combinacion.
Como alternativa, puede usarse un enfoque de co-cultivo usando los metodos descritos en los Ejemplos anteriores para producir una mezcla compleja de anticuerpos biespedficos con un semi-anticuerpo primario determinado y un semi-anticuerpo secundario variable. Dicha mezcla podna despues aislarse a granel y usarse como un material de exploracion de modo que un resultado positivo en el grupo de variantes biespedficas podna despues desconvolucionarse para determinar la especie de anticuerpo biespedfica activa, o la mezcla combinada podna usarse como una mezcla terapeutica mas eficaz.
Ejemplo 5
Actividad in vitro
Aqrn se ejemplifica que los anticuerpos biespedficos descritos en el presente documento poseen actividad en sistemas in vitro. Se emplearon dos lmeas celulares en este Ejemplo 5 y en el Ejemplo 6, posterior. En estos experimentos KP4, una lmea celular de carcinoma ductal pancreatico, y A431, una lmea celular de carcinoma epidermoide, estan ambas fuertemente conducidas por Met o EGFR, respectivamente, por lo tanto estas son buenas lmeas celulares y xenoinjertos tumorales para explorar la eficacia de bsAb contra cada diana de forma independiente.
La lmea celular KP4 se obtuvo del Banco de Celulas del Centro Riken BioResource (n.° de lmea Celular RCB1005;
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3-1-1 Koyadai, Tuskubashi, Ibaraki 305-0074 Japon). La lmea celular A431 (CRL-1555) se obtuvo de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA).
Se lavaron una vez celulas cancerosas A431, con PBS, se resuspendieron en medio sin suero, se contaron y despues se anadieron a placas de 96 pocillos (2500 celulas/pocillo). Despues las celulas se trataron con HGF humano (0,5 nM) y TGFah (0,05 nM) solos o con un intervalo de dosis de (1) anti EGFR, (2) anticuerpo anti c-met (c- Met “de una rama”), (3) la combinacion de anticuerpo anti EGFR y anti c-met o (4) el anticuerpo biespedfico anti EGFR/anti c-met. Se realizaron ensayos de tres dfas de AlamarBlue™ de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (BioSource International; Camarillo, CA). Se determinaron los valores de CI50 mediante analisis de regresion no lineal con un modelo de cuatro parametros (Software KaleidaGraph ver. 3.6, Synergy, Reading, PA).
En el ensayo de celulas KP4 que es dependiente de Met in vitro e in vivo, el crecimiento estimulado por tratamiento con TGF-alfa y HGF puede inhibirse mediante anticuerpo anti c-met, la combinacion de anticuerpo anti c-met y anti EGFR y el anticuerpo biespedfico. El tratamiento con anti EGFR muestra actividad limitada como un unico agente en estas celulas. Hubo, sin embargo, inhibicion mas potente por el anticuerpo biespedfico en celulas KP4 que Ab anti c-met solo o anti c-met mas anti EGFR anadidos por separado. En celulas A431, que se conducen principalmente por EGFR, ni el anticuerpo anti EGFR ni el anticuerpo anti c-met por sf solos fueron capaces de inhibir significativamente la proliferacion celular. La combinacion de ambas moleculas sf mostro algo de inhibicion de la proliferacion celular, sin embargo, el anticuerpo biespedfico mostro mayor actividad a las mismas concentraciones. Ademas, las celulas mostraron apoptosis ademas de anti proliferacion.
En estos ensayos el anticuerpo biespedfico mostro rendimiento mejorado en relacion con los otros anticuerpos solos o la combinacion de anticuerpos anti Met y anti EGFR anadidos por separado. Estos datos sugieren que es la disposicion de anticuerpos anti Met y anti EGFR juntos en un anticuerpo lo que hace al biespedfico superior. Los resultados se muestran en la Figura 11.
Ejemplo 6
Actividad in vivo
Este ejemplo demuestra que los anticuerpos biespedficos descritos en el presente documento poseen actividad en modelos in vivo.
Se obtuvieron ratones hembras desnudos que teman 6-8 semanas de edad y pesaban 22-30 g de Charles River Laboratories, Inc. (Hollister, CA). Los ratones se alojaron en Genentech en jaulas microaislantes de roedores convencionales y se aclimataron a las condiciones de estudio durante al menos 3 dfas antes de la implantacion de celulas tumorales. Solamente se usaron para el estudio animales que paredan ser sanos y que estaban libres de anomalfas evidentes. Todos los procedimientos experimentales se adaptaron a los principios directrices de la Sociedad de Fisiologfa American y se aprobaron por el Comite de Cuidado y Uso Animal Institucional de Genentech. Se inyectaron a los ratones por via subcutanea celulas cancerosas pancreaticas KP4 humanas (5 millones de celulas en Solucion Salina Equilibrada de Hank (HBSS) mas Matrigel (BD Biosciences) por raton) o celulas de carcinoma epidermoide A431 humano (5 millones de celulas en HBSS mas Matrigel/raton). Cuando los tumores alcanzaron ~150mm3, los ratones se clasificaron aleatoriamente y se trataron con vehfculo o el EGFR/c-met biespedfico (bsEGFR/c-met) (50 mg/kg IP 1x/semana) durante 2 semanas.
Los volumenes tumorales se midieron en dos dimensiones (longitud y anchura) usando calibradores Ultra Cal-IV (Modelo 54-10-111, Fred V. Fowler Co, Newton, MA) y se analizaron usando Excel, version 11.2 (Microsoft Corporation Redmond, WA). Se representaron graficas de inhibicion tumoral usando KaleidaGraph, version 3.6 (Software Synergy, Reading, PA). El volumen tumoral se calculo con la siguiente formula:
Tamano del tumor (mm3) = (medida mas larga x medida mas corta2) x 0,5
Los datos se analizaron por el enfoque de modelacion mixta descrito posteriormente. Aqrn, no se calculan un promedio y desviacion tfpica estrictos. En lugar de proporcionar desviaciones tfpicas para representar la variabilidad, se usan intervalos de confianza. Estos se presentan en la tabla como los lfmites superior e inferior en el parentesis al lado de ABC/dfa % de TGI. Se midieron los pesos corporales animales usando una escala Adventura Pro AV812 (Ohaus Corporation; Pine Brook, NJ). Se generaron graficas usando KaleidaGraph, version 3.6. Se calculo el porcentaje de cambio de peso usando la siguiente formula:
Porcentaje de cambio de peso de grupo = (nuevo peso - peso inicial)/peso inicial) x 100
Para analizar apropiadamente la medicion repetida de los volumenes tumorales de los mismos animales a lo largo del tiempo, se uso un enfoque de modelizacion mixta (Pinheiro et al., Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. (2008) R package version 3.1-89). Este enfoque aborda tanto mediciones repetidas como bajas modestas debido a cualquier muerte no relacionada con el tratamiento de animales antes del final del estudio.
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Se usaron splines de regresion cubica para ajustar un perfil no lineal a los ciclos temporales del volumen tumoral log2 a cada nivel de dosis. Estos perfiles no lineales se relacionaron despues con la dosis dentro del modelo mixto. Se calculo la inhibicion del crecimiento tumoral como porcentaje del vetnculo (% TGI) como el porcentaje del area bajo la curva ajustada (ABC) para el grupo de dosis respectivo por dfa en relacion con el vetnculo, usando la siguiente formula:
% de TGI = 100 X (1 - ABCdosis/ABCveh)
Para determinar los intervalos de incertidumbre (II) para % de TGI, la curva ajustada y la matriz de covarianza ajustada se usaron para generar una muestra aleatoria como una aproximacion a la distribucion del % de TGI. La muestra aleatoria estaba compuesta de 1000 realizaciones simuladas del modelo mixto-ajustado, en el que el % de TGI se ha recalculado para cada realizacion. Los II indicados fueron los valores para los que el 95 % del tiempo, los valores recalculados del % de TGI quedanan en esta region dado el modelo ajustado. Los percentiles 2,5 y 97,5 de la distribucion simulada se usaron como los II superior e inferior.
Se realizo y genero representacion usando R, version 2.8.1 (R Development Core Team 2008; R Foundation for Statistical Computing; Viena, Austria) y Excel, version 12.0.1 (Microsoft Corporation). Los datos se analizaron usando R, version 2.8.1, y los modelos mixtos se ajustaron dentro de R usando el paquete nlme, version 3.1-89 (Pinheiro et al., 2008).
Las Figuras 12 y 13 muestran la actividad in vivo del anticuerpo biespedfico anti EGFR/c-met en modelo de xenoinjerto pancreatico KP4 y modelo de xenoinjerto de carcinoma epidermoide A431, respectivamente. El anticuerpo biespedfico fue capaz de inhibir el crecimiento de los tumores in vivo para ambos modelos en comparacion con animales de control que recibieron solamente el vetnculo como un tratamiento. Las graficas indican que el volumen tumoral se redujo por la administracion del anticuerpo biespedfico con el volumen tumoral ajustado por efectos mixtos lineales (lMe) de 505 mm3 en xenoinjertos KP4 a los 20 dfas despues del tratamiento en comparacion con 1710 mm3 para la rama solo de vetnculo y 328 mm3 en xenoinjertos de A431 despues de 20 dfas en comparacion con 495 mm3 en el control solo de vetnculo. En general hubo un cambio significativo en el ABC/dfa expresado como % de TGI. Para el tratamiento de anticuerpos biespedficos en los xenoinjertos de KP4, hubo 85 % de inhibicion del crecimiento tumoral (TGI) y en los modelos de xenoinjerto de A431 hubo una TGI del 68 %.
Ejemplo 7
Produccion de proteinas heteromultimericas usando cultivos de celulas CHO
Este ejemplo ilustra la formacion de proteinas heteromultimericas a partir de un cultivo que comprende dos poblaciones de celulas CHO hospedadoras.
Se generaron semianticuerpos que conteman las mutaciones de boton y ojal en distintos cultivos expresando transitoriamente las cadenas pesadas y ligeras usando construcciones y tecnicas bien conocidas en este campo. (Vease, por ejemplo Ye et al., Biotechnol Bioeng. 15 de jun de 2009; 103(3): 542-51.) Las celulas se cultivaron en 1 litro de medio (vease, por ejemplo, Wong et al., J. Biol. Chem. 2007 282(31): 22953-22963) y se recogieron despues de 14 dfas.
Cada semianticuerpo se capturo en una columna MabSURE SELECT de 5 ml. La columna se lavo despues con 10 volumenes de columna (VC) del tampon de equilibrado seguido de 10 VC de un tampon de baja conductividad de citrato sodico (tampon de equilibrado que consiste en TRIS 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 0,05 %, Triton X-114 0,05 %; tampon de lavado de baja conductividad que consiste en citrato sodico 25 mM pH 6,0). Cada rama se eluyo con Acetato Sodico 0,15 M pH 2,7.
Cada semianticuerpo se dializo en TRIS 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM a una relacion de 1 a 300 a temperatura ambiente durante una noche. Despues cada rama se centrifugo, se filtro usando filtros de acetato de celulosa de 0,22 micrometros y las dos ramas se mezclaron entre sf a una relacion de 1 a 1 (la concentracion total fue menor de 2 mg/ml). La mezcla se proceso despues de una de dos formas de la siguiente manera:
Redox (con bano de agua): la mezcla se calento despues en un bano de agua a 37 °C. Despues de una hora, la mezcla de redox se retiro del bano de agua y se dejo enfriar a temperatura ambiente. Una vez que la mezcla alcanzo temperatura ambiente, se anadio agente reductor recien preparado, ditiotreitol (DTT), para conseguir una concentracion final de DTT 2 mM. La mezcla se dejo a temperatura ambiente durante dos horas, despues se concentro usando filtros de centnfuga Amicon Ultracell (10K) a 11 mg/ml y se dializo en TRIS 50 mM pH 8,0, 150 ml NaCl (1:300) durante una noche.
Redox (sin bano de agua): la mezcla se dejo a temperatura ambiente durante 3 horas, despues de lo cual se anadio agente reductor recien preparado, ditiotreitol (DTT), para conseguir una concentracion final de DTT 2 mM. La mezcla se dejo a temperatura ambiente durante dos horas, se concentro usando filtros de centnfuga Amicon Ultracell (10K) hasta 11 mg/ml, y se dializo en TRIS 50 mM pH 8,0, 150 ml de NaCl (1:300) durante una noche.
Despues de redox, el material ensamblado se purifico en una columna de HIC ProPac 10 de 15 ml usando un gradiente de 20 VC similar a la seccion anterior. El tampon de ejecucion fue Fosfato Potasico 25 mM, Sulfato de Amonio 0,7 M pH 6,5 y el tampon de elucion fue Fosfato Potasico 25 mM pH 6,5, isopropanol 25 %. Se recogieron fracciones de 1 ml y se separaron fracciones pico mediante Tris-Glicina SDS-PAGE 4-20 % para analizar la pureza y 5 agrupar en consecuencia. Los grupos se concentraron despues usando filtros de centnfuga Amicon Ultracell (10K) hasta aproximadamente 1,5 mg/ml y se dializaron en TRIS 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM y se filtro a 0,22 pm.
La identidad de cada biespedfico ensamblado se confirmo por Espectrometna de Masas. La pureza se analizo mediante gel de Tris-Glicina SDS PAGE 4-20% y bioanalizador. Los niveles de agregados se determinaron 10 mediante SEC-MALS.
Los resultados se muestran en las Figuras 14-19. Este ejemplo demuestra que pueden producirse anticuerpos biespedficos usando celulas hospedadoras CHO. Un experto en la materia reconocera que el metodo puede usarse para producir otras protemas heteromultimericas.
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Claims (18)

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    1. Un metodo para preparar una protema heteromultimerica que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagras se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, y
    en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y del segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) cultivar una primera celula hospedadora, que comprende un primer acido nucleico que codifica el primer polipeptido que contiene bisagra, en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer par;
    (b) cultivar una segunda celula hospedadora, que comprende un primer acido nucleico que codifica el segundo polipeptido que contiene bisagra, en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el segundo par;
    (c) romper las membranas celulares de la primera y la segunda celulas hospedadoras, para liberar el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra de las celulas hospedadoras para formar una protema heteromultimerica, en el que la primera y la segunda celulas hospedadoras se han combinado entre sf en una unica suspension; y
    (d) recuperar la protema heteromultimerica,
    en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
  2. 2. Un metodo para preparar una protema heteromultimerica que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario, y
    en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y el segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) cultivar una primera celula hospedadora, que comprende un primer acido nucleico que codifica el primer polipeptido que contiene bisagra, en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa, se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer par y se secreta al medio de cultivo;
    (b) cultivar una segunda celula hospedadora, que comprende un primer acido nucleico que codifica el segundo polipeptido que contiene bisagra, en condiciones en las que el polipeptido que contiene bisagra se expresa, se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar el segundo par y se secreta al medio de cultivo; y
    (c) recuperar la protema heteromultimerica del medio de cultivo, en el que el medio de cultivo de la primera y la segunda celulas hospedadoras se han combinado entre sf para formar la protema heteromultimerica,
    en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que el primer dominio de heterodimerizacion y el segundo dominio de heterodimerizacion se encuentran en una interfaz, y la parte de interfaz del segundo dominio de heterodimerizacion comprende una protuberancia (un boton) que puede situarse en una cavidad (un ojal) en la parte de interfaz del primer dominio de heterodimerizacion, en el que la protuberancia comprende una cadena lateral de aminoacido que se proyecta desde la parte de interfaz del segundo dominio de heterodimerizacion, y la cavidad comprende una cadena lateral de aminoacido que forma un hueco desde la parte de interfaz del primer dominio de heterodimerizacion.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho enlace disulfuro intercatenario esta entre las regiones bisagra.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la celula hospedadora es una celula procariota, particularmente una celula de E. coli, mas particularmente una celula de E. coli deficiente en lpp.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la celula hospedadora es una celula de mairnfero, particularmente una celula CHO.
  7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las celulas de las etapas (a) y (b) estan en distintos cultivos celulares.
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  8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las celulas de las etapas (a) y (b) estan en una mezcla de cultivo que comprende ambas celulas hospedadoras.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que las celulas de las etapas (a) y (b) se (i) combinan, (ii) centrifugan y (iii) resuspenden en tampon antes de romper la membrana celular o se (i) centrifugan, (ii) resuspenden en tampon y (iii) combinan antes de romper la membrana celular.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la etapa de recuperacion comprende ademas al menos una etapa de purificacion.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la protema heteromultimerica es un anticuerpo biespedfico o un anticuerpo multiespedfico.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que dicho anticuerpo es humanizado o humano.
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 11, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA e IgD, particularmente el anticuerpo es IgG, mas particularmente IgG1 o IgG2.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que al menos el 45 % de los polipeptidos estan en un complejo que comprende el primer par de polipeptido que contiene bisagra y cadena ligera y el segundo par de polipeptido que contiene bisagra y cadena ligera.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 10, en el que no mas del 10 % de los polipeptidos aislados estan presentes como monomeros u homodfmeros antes de la etapa de purificacion de la protema heteromultimerica.
  17. 17. Un metodo para generar una biblioteca de protemas heteromultimericas combinatorias que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario y
    en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y del segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) cultivar una primera celula hospedadora y al menos dos celulas hospedadoras adicionales, en el que
    i. dicha primera celula hospedadora comprende un primer acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene bisagra; y
    ii. dichas celulas hospedadoras adicionales comprenden un acido nucleico que codifica un segundo polipeptido que contiene bisagra;
    en condiciones en las que los polipeptidos que contienen bisagra se expresan y se emparejan con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer y el segundo par;
    (b) romper las membranas celulares de la primera celula hospedadora y las al menos dos celulas hospedadoras adicionales de modo que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se liberan al medio extracelular, en el que la primera celula hospedadora y las al menos dos celulas hospedadoras adicionales se han combinado entre sf en una unica suspension; y
    (c) recuperar los complejos de protemas heteromultimericas,
    en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
  18. 18. Un metodo para generar una biblioteca de protemas heteromultimericas combinatorias que comprende un primer polipeptido que contiene bisagra que tiene un primer dominio de heterodimerizacion y un segundo polipeptido que contiene bisagra que tiene un segundo dominio de heterodimerizacion, en el que el segundo dominio de heterodimerizacion interacciona con el primer dominio de heterodimerizacion, y en el que el primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra se unen por al menos un enlace disulfuro intercatenario y
    en el que cada uno del primer y el segundo polipeptidos que contienen bisagra es una cadena pesada de anticuerpo y se empareja con una cadena ligera de anticuerpo para formar un primer par y un segundo par, y en el que las cadenas ligeras del primer par y del segundo par comprenden diferentes secuencias de dominio variable, comprendiendo el metodo las etapas de:
    (a) cultivar una primera celula hospedadora y al menos dos celulas hospedadoras adicionales, en el que
    i. dicha primera celula hospedadora comprende un primer acido nucleico que codifica un primer polipeptido que contiene bisagra; y
    ii. dichas celulas hospedadoras adicionales comprenden un acido nucleico que codifica un segundo polipeptido que contiene bisagra;
    5
    en condiciones en las que los polipeptidos que contienen bisagra se expresan, se emparejan con una cadena ligera de anticuerpo para formar el primer y el segundo par y se secretan al medio de cultivo; y (b) recuperar los complejos de protemas heteromultimericas del medio de cultivo, en el que el medio de cultivo de la primera celula hospedadora y las al menos dos celulas hospedadoras adicionales se han combinado entre 10 sf para formar la protema heteromultimerica,
    en el que dicho metodo no requiere la adicion de un reductor.
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