CN112469440A - 靶向前列腺特异性膜抗原(psma)的构建体和其用途 - Google Patents

靶向前列腺特异性膜抗原(psma)的构建体和其用途 Download PDF

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Abstract

本申请提供了包含特异性结合于PSMA(例如在细胞表面上表达的PSMA)的抗体部分的构建体。还提供了制造和使用这些构建体的方法。

Description

靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的构建体和其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年6月18日提出的美国临时申请第62/686,605号的优先权，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表以ASCII文本文件形式提交
以ASCII文本文件提交的以下内容以全文引用的方式并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：750042001540SEQLIST.TXT，记录日期：2019年6月14日，大小：487KB)。
技术领域
本公开涉及特异性结合前列腺-特异性膜抗原(PSMA)的多肽构建体，和其用途，包括治疗和诊断疾病。
背景技术
前列腺癌是美国男性中第二常见的癌症并且是癌症相关的死亡的第二大原因。每年，美国超过27,000例死亡是由前列腺癌引起的(美国癌症协会)。在经历根除性前列腺切除术或根除性放射线疗法的前列腺癌患者中有35％-61％最终会复发。这些患者可能短暂地对雄激素剥夺疗法有反应，但大多数将随后进展至缺乏治愈性全身性疗法的激素难治性疾病(普拉巴汗(Perambakam S)等人，临床与研发免疫学(Clin.Dev.Immunol.)2010；电子版2011年1月5日)。
前列腺-特异性膜抗原(PSMA)是一种具有750个氨基酸的II型跨膜糖蛋白，其在所有肿瘤阶段都在前列腺肿瘤细胞的表面上高度表达，并且已知在去势抵抗性和转移性前列腺癌中上调(阿夫沙尔﹒乌鲁米耶(Afshar-Oromieh,A.)等人，核医学杂志(J.Nucl.Med.)2016,57:79S)。在包括结肠癌、卵巢癌、乳腺癌和肾癌的其它实体瘤中，已经在肿瘤新生血管上观测到升高的PSMA表达，但正常血管中没有，这表明PSMA在血管生成中的作用。大部分PSMA表达似乎被限制于前列腺，但在脑、肾脏、唾液腺和小肠中见到较低水平的表达。
小分子PSMA配体已经用于成像研究中以检测淋巴结和骨骼中前列腺癌的癌转移。考虑到PSMA的表达模式，也已经将其作为治疗目标进行探索。当前靶向PSMA的免疫疗法包括基于肽、细胞、载体或DNA的疫苗、施用单克隆抗体(mAb)或表达针对PSMA的由DNA编码的mAb(姆斯玛妮(Muthumani,K.)等人，癌症免疫学，免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.)2017,66:1577)和嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(荣汉斯(Junghans,RP)等人，前列腺(Prostate.)2016,76:1257)。尽管报告PSMA在正常组织中表达，但在使用抗PSMA CAR T细胞的I期临床研究中未观测到抗PSMA毒性。
因此，所属领域中仍然需要靶向PSMA以诊断和/或治疗癌症的药剂(例如多肽构建体)。本申请解决这些和其它需求。
本文所提及的所有公开案、专利、专利申请和公开专利申请的公开内容特此以全文引用的方式并入本文中。
发明内容
在一些实施例中，提供了一种抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)构建体，其包含特异性识别细胞表面结合的PSMA的胞外域的抗体部分，所述胞外域包含SEQ ID NO:44中所阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，PSMA在癌细胞的表面上表达。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌细胞为前列腺癌细胞、肾细胞癌细胞、子宫癌细胞或肝癌细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌细胞为前列腺癌细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，前列腺癌细胞为激素难治性前列腺癌细胞或转移性前列腺癌细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌细胞为肾癌细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，肾癌细胞为透明细胞肾细胞癌(CCRCC)细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，PSMA在选自由以下组成的群组的细胞的表面上表达：LNCaP、MDA PCa 2b、VCaP、22Rv1、Caki-1、HCC1482和HuH-7。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)重链可变域(VH)，所述重链可变域包括包含SEQ ID NO:1-2中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3-4中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5-6中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H3；和ii)轻链可变域(VL)，所述轻链可变域包括包含SEQ ID NO:7-8中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-L1、包含氨基酸序列GNS或SSN或包含约2个氨基酸取代的其变体的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9-10中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-L3。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:1-2中的任一个的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3-4中的任一个的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5-6中的任一个的氨基酸序列的CDR-H3；和ii)VL，所述VL包括包含SEQ ID NO:7-8中的任一个的氨基酸序列的CDR-L1、包含GNS或SNN的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9-10中的任一个的氨基酸序列的CDR-L3。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3；和ii)轻链可变域(VL)，所述轻链可变域包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、包含氨基酸序列GNS的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)VH，所述VH包括包含SEQID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR-H3；和ii)VL，所述VL包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1、包含氨基酸序列SNN的CDR-L2和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含SEQ ID NO:16或17中阐述的重链可变域(VH)的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ IDNO:18或19中阐述的轻链可变域(VL)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含SEQ ID NO:16中阐述的VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:18中阐述的VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含SEQID NO:16中阐述的VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:18中阐述的VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)包含与SEQ ID NO:16或17具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列的VH和ii)包含与SEQ ID NO:18或19具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列的VL。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)包含与SEQ ID NO:16或17具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VH和ii)包含与SEQ IDNO:18或19具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VL。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)包含与SEQ ID NO:16或17具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的VH和ii)包含与SEQ ID NO:18或19具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的VL。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH和包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的VL。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述抗体部分包含：i)包含SEQ ID NO:1、3和5的氨基酸序列的重链可变域(VH)和包含SEQID NO:7、GNS和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变域(VL)；或ii)包含SEQ ID NO:2、4和6的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8、SSN和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，特异性识别PSMA的抗体部分为嵌合、人源、部分人源化、完全人源化或半合成的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，特异性识别PSMA的抗体部分为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在根据(或如适用于)上述任何实施例的一些实施例中，特异性识别PSMA的抗体部分为scFv。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，scFv包含SEQ ID NO:20中阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，scFv包含SEQ ID NO:21中阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，特异性识别PSMA的抗体部分为Fab或Fab'。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，特异性识别PSMA的抗体部分与Fc片段任选地经由接头融合。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，Fc片段为人类IgG Fc片段。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，人类IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA抗体部分为全长抗体。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，全长抗体包括包含SEQ ID NO:39中阐述的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:40中阐述的氨基酸序列的轻链。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，全长抗体包括包含SEQ ID NO:41中阐述的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42中阐述的氨基酸序列的轻链。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体为单特异性的。在根据(或如适用于)上述任何实施例的一些实施例中，抗PSMA构建体为多特异性的。在根据(或如适用于)上述任何实施例的一些实施例中，抗PSMA构建体为双特异性的。在根据(或如适用于)上述任何实施例的一些实施例中，抗PSMA构建体为串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双可变域(DVD)抗体、杵臼(KiH)抗体、锚栓(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚体抗体或异源结合抗体。
在根据(或如适用于)上述任何实施例的一些实施例中，抗PSMA构建体为包含两个由肽接头连接的scFv的串联scFv。在根据(或如适用于)上述任何实施例的一些实施例中，抗PSMA构建体进一步包含特异性识别第二抗原的第二抗体部分。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第二抗原为T细胞表面上的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，T细胞选自由以下组成的群组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞和自然杀伤T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第二抗原选自由以下组成的群组：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第二抗原为CD3ε。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体为包含特异性识别PSMA的N端scFv和特异性识别CD3ε的C端scFv的串联scFv。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包含SEQ ID NO:25或26中阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包含SEQ ID NO:27或28中阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体的表达通过激活工程化T细胞来诱导。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，工程化T细胞为包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合于PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR结合于除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，工程化T细胞为包含嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构建体(caTCR)的T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合于PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR结合于除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，由抗PSMA构建体的第二抗体部分结合的第二抗原为在B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞的表面上的抗原。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体为包含以下的CAR：(a)包含抗PSMA抗体部分的胞外域；(b)跨膜域；以及(c)胞内信号传导域。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，胞内信号传导域包含来源于CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的初级免疫细胞信号传导序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，胞内信号传导域进一步包含来源于CD28、4-1BB、ICOS或OX40的共刺激信号传导序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，胞内信号传导域包含CD3ζ胞内信号传导序列和CD28胞内信号传导序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包含SEQ ID NO:29中阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包含SEQ ID NO:30中阐述的氨基酸序列。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体为包含以下的caTCR：(a)包含抗PSMA抗体部分的胞外域；和(b)包括包含第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)和包含第二TCR-TM的第二TCRD的T细胞受体模块(TCRM)，其中所述TCRM促进至少一种TCR相关信号传导分子的募集。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第一TCR-TM来源于天然存在的第一TCR的跨膜域之一且第二TCR-TM来源于天然存在的第一TCR的另一跨膜域。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，TCR-TM中的至少一者为非天然存在的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，包含至少一个非天然存在的TCR-TM的TCRM相较于包含天然存在的第一T细胞受体跨膜域的TCRM，增强至少一种TCR相关信号传导分子的募集。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第一和第二TCR-TM为天然存在的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第一天然存在的TCR为γ/δTCR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含SEQ ID NO:31中阐述的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:32中阐述的氨基酸序列的第二多肽链。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含SEQ ID NO:34中阐述的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:35中阐述的氨基酸序列的第二多肽链。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，第一天然存在的TCR为α/βTCR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，TCR相关信号传导分子选自由CD3δε、CD3γε和CD3ζζ组成的群组。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体为包含以下的嵌合信号传导受体(CSR)：i)能够结合PSMA或与PSMA相互作用的配体结合模块；ii)跨膜模块；以及iii)能够提供共刺激信号至效应细胞的共刺激免疫细胞信号传导模块，其中配体结合模块和共刺激免疫细胞信号传导模块不来源于同一分子，且其中CSR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CSR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，配体结合模块包含技术方案1至23中任一例的抗PSMA构建体。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CSR的跨膜模块包含来源于CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜域。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，共刺激免疫细胞信号传导模块来源于TCR的共刺激受体的胞内域。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，共刺激受体选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27和CD40。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CSR的表达在激活工程化T细胞时为诱导性的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，工程化T细胞为包含CAR的T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合于PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR结合于除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，工程化T细胞为包含caTCR的T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合于PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR结合于除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包含SEQ ID NO 37中阐述的氨基酸序列。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体包含SEQ ID NO 38中阐述的氨基酸序列。
在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，抗PSMA构建体结合于效应分子。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应分子为选自由以下组成的群组的治疗剂：药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽和核酸。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，治疗剂为药物或毒素。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应分子为可检测标记。
在本发明的另一方面中，提供了一种效应细胞，其用编码根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA CAR或根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA caTCR的一或多种核酸进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞用编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR的一或多种其它核酸进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标抗原为PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标抗原为除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞用编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv的一或多种其它核酸进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标抗原为PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标为除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，提供了一种效应细胞，其用编码根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA串联scFv或根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA CSR的一或多种核酸进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA串联scFv或抗PSMA CSR的一或多种核酸还编码CAR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞经一或多种编码CAR的其它核酸进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA串联scFv或抗PSMA CSR的一或多种核酸还编码caTCR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞用编码caTCR的一或多种其它核酸进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞为免疫细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
在本发明的另一方面中，提供了一种产生效应细胞的方法，其包含用编码根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA CAR或根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMAcaTCR的一或多种核酸对细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含进一步用编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR的一或多种其它核酸对细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标抗原为PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标抗原为除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含进一步用编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv的一或多种其它核酸对细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标抗原为PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，目标为除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，提供了一种产生效应细胞的方法，其包含用编码根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA串联scFv或根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA CSR的一或多种核酸对细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA串联scFv或抗PSMA CSR的一或多种核酸还编码CAR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含进一步用编码CAR的一或多种其它核酸对细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的一或多种核酸还编码caTCR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含进一步用编码caTCR的一或多种其它核酸对细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞为免疫细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
在本发明的另一方面中，提供编码根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体的多肽部分的核酸。还提供了一种载体，其包含根据(或如适用于)上述任何实施例的核酸。还提供了一种宿主细胞，其包含根据(或如适用于)上述任何实施例的核酸或载体。
还提供了一种制造根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体的方法，其包含在表达抗PSMA构建体的条件下培养根据(或如适用于)上述任何实施例的宿主细胞，且回收由宿主细胞产生的抗PSMA构建体。
在本发明的另一方面中，提供了一种药物组合物，其包含根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体、根据(或如适用于)上述任何实施例的效应细胞、根据(或如适用于)上述任何实施例的核酸或根据(或如适用于)上述任何实施例的载体和药学上可接受的载剂。
在本发明的另一方面中，提供了一种试剂盒，其包含根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体、根据(或如适用于)上述任何实施例的效应细胞、根据(或如适用于)上述任何实施例的核酸、根据(或如适用于)上述任何实施例的载体和/或根据(或如适用于)上述任何实施例的宿主细胞。
本发明的另一方面提供了一种检测样品中的PSMA的方法，其包含使所述样品与结合于可检测标记的根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体接触，且检测所述标记的存在。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，假定样品包含表达PSMA的细胞。
本发明的另一方面提供了一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体施用有效量的根据(或如适用于)上述任何实施例的药物组合物。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，提供了一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体施用用编码根据(如适用于)上述任何实施例的抗PSMA CAR或根据(如适用于)上述任何实施例的抗PSMA caTCR的一或多种核酸进行基因修饰的效应细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含在施用前用一或多种核酸对效应细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的一或多种核酸还编码CSR或串联scFv。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含进一步用编码CSR或串联scFv的一或多种其它核酸对效应细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，串联scFv特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，串联scFv特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CSR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CSR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，提供了一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体施用用编码根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA串联scFv或根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA CSR的一或多种核酸进行基因修饰的效应细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含在施用前用一或多种核酸对效应细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，编码抗PSMA CSR或抗PSMA串联scFv的一或多种核酸还编码CAR或caTCR。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法包含进一步用编码CAR或caTCR的一或多种其它核酸对效应细胞进行基因修饰。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，CAR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合PSMA。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，caTCR特异性结合除PSMA外的抗原。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应细胞为免疫细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，免疫细胞为T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，所述方法进一步包含在对效应细胞进行基因修饰和施用前从个体获得效应细胞。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应从中获得细胞的个体为施用经过基因修饰的效应细胞的个体。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，效应从中获得细胞的个体不为施用经过基因修饰的效应细胞的个体。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，经过基因修饰的效应细胞与施用经过基因修饰的效应细胞的个体是同种异体的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，经过基因修饰的效应细胞与施用经过基因修饰的效应细胞的个体系同基因型的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，经过基因修饰的效应细胞与施用经过基因修饰的效应细胞的个体是异种的。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法包含向所述个体施用其它疗法。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，PSMA相关疾病或病症为癌症。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、肾癌细胞、子宫癌和肝癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌症为前列腺癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，前列腺癌为激素难治性前列腺癌或转移性前列腺癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌症为肾癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，肾癌为透明细胞肾细胞癌(CCRCC)。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，患有PSMA相关疾病或病症的个体为哺乳动物。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，哺乳动物为人。
本发明的另一方面提供了一种诊断怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：a)向所述个体施用有效量的结合于可检测标记的根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体；以及b)确定所述个体中标记的水平，其中标记的水平超过阈值水平指示所述个体患有PSMA相关疾病或病症。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，提供了一种诊断怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：a)使来源于所述个体的样品与结合于可检测标记的根据(或如适用于)上述任何实施例的抗PSMA构建体接触；以及b)确定样品中与抗PSMA构建体结合的细胞的数目，其中与抗PSMA构建体结合的细胞的数目的值指示所述个体患有PSMA相关疾病或病症。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，PSMA相关疾病或病症为癌症。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、肾癌细胞、子宫癌和肝癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌症为前列腺癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，前列腺癌为激素难治性前列腺癌或转移性前列腺癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，癌症为肾癌。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，肾癌为透明细胞肾细胞癌(CCRCC)。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，怀疑患有与PSMA表达、异常表达和/或异常活性相关的疾病或病症的个体为哺乳动物。在根据上述任何实施例(或如适用于上述任何实施例)的一些实施例中，哺乳动物为人。
附图说明
图1展示用于评定噬菌体克隆A和B与PSMA阳性和PSMA阴性细胞的结合的流式细胞术实验的结果。
图2展示用于评定表达包含来源于克隆A或克隆B的scFv部分的CAR的T细胞对目标细胞的特异性杀死的实验结果。
图3展示用于评定表达包含来源于克隆A或克隆B的scFv部分的CAR的T细胞的特异性IFNγ释放的实验结果。
图4提供例示性caTCR的示意性描绘。Fab片段来源于克隆A或克隆B。
图5展示证实克隆A和克隆B可呈多种受体构型(例如CAR或caTCR+CSR)使用以刺激响应于抗原的T细胞增殖的流式细胞术实验的结果。
图6展示用于评定表达呈不同抗PSMA构建体构型和构建体组合的克隆A和/或克隆B的T细胞对三种PSMA+目标细胞系的特异性杀死的实验的结果。
图7展示用于评定表达呈不同抗PSMA构建体构型和构建体组合的克隆A和/或克隆B的T细胞对三种PSMA+目标细胞系的特异性杀死的其它实验的结果。
图8展示用于评定表达呈不同抗PSMA构建体构型和构建体组合的克隆A和/或克隆B的T细胞对两种PSMA+目标细胞系的特异性杀死的实验的结果。
具体实施方式
本申请提供了分离的构建体(在本文中称为“抗PSMA构建体”)，其包含特异性结合于在例如癌细胞的细胞的表面上表达的前列腺特异性膜抗原或“PSMA”(例如PSMA，例如人PSMA)的抗体部分(在本文中称为“抗PSMA抗体部分”)。抗PSMA构建体允许特异性靶向表达PSMA的细胞(例如在表面上表达PSMA的细胞)，例如表达(或过度表达)PSMA的疾病细胞。当呈由T细胞表达的嵌合抗原受体(CAR)或嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)存在时，抗PSMA抗体部分特异性重新引导人类T细胞，从而杀死表达PSMA的目标细胞(例如癌细胞)。此外，当与可检测标记融合时，抗PSMA抗体部分可用于目测表达PSMA的细胞的数目和定位的变化。这类信息又可用于诊断和/或预测PSMA相关疾病或病症。
本申请提供了包含特异性结合于PSMA (例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗体部分的构建体(例如分离的构建体)。例示性构建体包括(但不限于)例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA构建体(例如双特异性抗PSMA抗体)、抗PSMA嵌合抗原受体(“CAR”)、抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)、抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)、抗PSMA免疫结合物以及其它构建体，如下文更详细地描述。本文所述的构建体中的每一种展示对天然形式(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达)的人PSMA具有高特异性。
本申请还提供了编码本文所述的抗PSMA构建体(或其多肽部分)的核酸。
本文还提供了包含本文所述的抗PSMA构建体或表达本文所述的抗PSMA构建体或与其相关的效应细胞(例如表达抗PSMA CAR、抗PSMA caTCR或抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)的T细胞)的组合物(例如药物组合物或调配物)。
本申请还提供了制造和使用抗PSMA构建体(或表达抗PSMA构建体或与抗PSMA构建体相关的效应细胞)的方法，以治疗、达成诊断目的、达成预后目的和包括于适用于PSMA相关的疾病和病症的治疗、诊断和/或预后的试剂盒和制品中。
定义
详细描述所公开实施例之前，应了解本公开不限于特定组合物或生物系统，当然，其可以变化。还应了解，本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的且不意图为限制性的。
如在本说明书和随附权利要求书中所用，除非文中另外明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，举例来说，提及“分子”任选地包括两个或更多个这类分子的组合等等。
如本文所用，除非另有指示，否则“前列腺特异性膜抗原”或“PSMA”是指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猕猴或恒河猴))和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然PSMA。所述术语涵盖“全长”的未加工的PSMA以及在细胞中加工所产生的任何形式的PSMA。所述术语还涵盖天然存在的PSMA变体，例如剪接变体、等位基因变体和同种型。PSMA为最初由鼠类单克隆抗体(mAb)7E11-C5.3表征的II型膜蛋白且在前列腺组织的所有形式(包括癌瘤)中表达。PSMA蛋白具有3部分结构：19个氨基酸的内部部分、24个氨基酸的跨膜部分和707个氨基酸的外部部分(例如胞外域)。人PSMA的一例示性氨基酸序列为
Figure BDA0002905287580000151
人PSMA的胞外域的一例示性氨基酸序列为
Figure BDA0002905287580000152
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”为用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的，有益或期望临床结果包括(但不限于)以下中的一或多种：缓解一或多种由疾病产生的症状、降低疾病程度、使疾病稳定化(例如预防或延迟疾病恶化)、预防或延迟疾病扩散(例如转移)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病病况、提供疾病缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一或多种其它药物的剂量、延迟疾病进展、增加或改善生活质量、增加体重增长和/或延长生存期。“治疗”还涵盖癌症的病理性结果(例如肿瘤体积)降低。本文所提供的方法涵盖这些治疗方面中的任一或多种。
术语“复发(recurrence)”、“复发(relapse)”“复发(relapsed)”是指癌症或疾病在疾病消失的临床评估之后的恢复。远处癌转移或局部复发的诊断可视为复发。
术语“难治性”或“抵抗性”是指对治疗无反应的癌症或疾病。
如关于T细胞在本文所用的“激活”是指被充分刺激而诱导可检测细胞增殖的T细胞状态。激活还可以诱导细胞因子产生且产生可检测的效应功能。
术语“抗体部分”包括全长抗体和其抗原结合片段。全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。每条链中的可变区一般包含三个高变环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR，包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；重链(HC)CDR，包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过卡巴特(Kabat)、乔西亚(Chothia)或奥拉兹卡妮(Al-Lazikani)公约(奥拉兹卡妮1997；乔西亚1985；乔西亚1987；乔西亚1989；卡巴特1987；卡巴特1991)界定或鉴定。重链或轻链的三个CDR插入于称为框架区(FR)的侧接伸长部之间，所述框架区比CDR更高度保守并且形成支撑高变环的架构。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但展现各种效应功能。抗体基于其重链恒定区的氨基酸序列分类。抗体的五种主要类别或同型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征为分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别分成如下子类：lgG1(γ1重链)、lgG2(γ2重链)、lgG3(γ3重链)、lgG4(γ4重链)、lgA1(α1重链)或lgA2(α2重链)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指包括(但不限于)例如以下的抗体片段：双价抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定化的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定化的双价抗体(ds双价抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双价抗体)、由包含一或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体或结合于抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够结合于与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合抗原相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段可包含接枝至来自一或多种不同人源抗体的框架区的来自特定人源抗体的一或多种CDR。
如本文所用的术语“表位”是指抗体或抗体部分所结合的抗原上的一组特定原子或氨基酸。如果两种抗体或抗体部分对抗原展现竞争性结合，那么其可结合抗原内的相同表位(或重叠表位)。
如本文所用，在存在等摩尔浓度的第一抗体部分下当第一抗体部分抑制第二抗体部分与PSMA的结合达至少约50％(例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)时第一抗体部分与第二抗体部分“竞争”结合于PSMA，或反之亦然。基于交叉竞争对抗体“分箱(binning)”的高通量方法描述于PCT公开案第WO03/48731号中。
如本文所用，术语“特异性结合”或“对……具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用(例如目标与抗体或抗体部分之间的结合)，其决定在分子(包括生物分子)的非均匀群体存在下目标是否存在。举例来说，特异性结合于目标(其可为表位)的抗体或抗体部分为与其与其它目标的结合相比，以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合此目标的抗体或抗体部分。在一些实施例中，特异性结合于抗原的抗体或抗体部分以其对其它目标的结合亲和力的至少约10倍与抗原的一或多个抗原决定子(例如，PSMA胞外域上的表位)反应。
如本文所用，“分离”的抗PSMA构建体是指(1)与自然界中发现的蛋白质无关，(2)不含来自相同来源的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中的抗PSMA构建体。
如本文所用的术语“分离的核酸”欲意指基因组核酸、cDNA或合成来源的核酸或其某一组合的核酸，借助于其来源，“分离的核酸”(1)与在自然界中发现“分离的核酸”的多核苷酸整个或一部分不相关联，(2)可操作地连接于在自然界中不与其连接的多核苷酸，或(3)在自然界中不作为较大序列的一部分存在。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”欲意指在重链与轻链多肽的可变区内发现的非邻接抗原组合位点。这些特定区域已描述于卡巴特等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》252:6609-6616(1977)；卡巴特等人，美国卫生与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services),“免疫学上关注的蛋白质的序列(Sequencesof proteins of immunological interest)”(1991)；乔西亚等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)；和麦卡勒姆(MacCallum)等人，《分子生物学杂志》262:732-745(1996)，其中在彼此比较时所述定义包括重叠氨基酸残基或亚群。尽管如此，应用任一定义来提及抗体或接枝抗体的CDR或其变体意图属于如本文所定义和使用的术语的范围。涵盖如上文所引用的每个参考文献所定义的CDR的氨基酸残基阐述于下表1中，作为比较。
表1：CDR定义
卡巴特<sup>1</sup> 乔西亚<sup>2</sup> 麦卡勒姆<sup>3</sup> IMGT<sup>4</sup> AHo<sup>5</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1残基编号遵循以下命名法：卡巴特等人，《生物化学杂志》252:6609-6616(1977)；卡巴特等人，美国卫生与人类服务部,“免疫学上关注的蛋白质的序列”(1991)。
2残基编号遵循以下命名法：乔西亚等人，《分子生物学杂志》196:901-917(1987)；奥拉兹卡妮(Al-Lazikani B.)等人，《分子生物学杂志》,273:927-948(1997)。
3残基编号遵循以下命名法：麦卡勒姆等人，《分子生物学杂志》262:732-745(1996)；阿比南丹(Abhinandan)和马丁(Martin),《分子免疫学(Mol.Immunol.)》,45:3832-3839(2008)。
4残基编号遵循以下命名法：莱朗恩克(Lefranc M.P.)等人，《发育与比较免疫学》,27:55-77(2003)；和奥涅格(Honegger)和普吕克(Plückthun),《分子生物学杂志》,309:657-670(2001)。
5残基编号遵循以下命名法：奥涅格和普吕克,《分子生物学杂志》,309:657-670(2001)。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中的对应序列同一或同源，而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的对应序列同一或同源的抗体，以及这类抗体的片段，只要其展现所关注的生物活性(例如结合于例如癌细胞的细胞的表面上的PSMA、例如人PSMA)(参见美国专利第4,816,567号；和莫里森(Morrison)等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,81:6851-6855(1984))。
在提及抗体或抗体部分时术语“半合成”意指所述抗体或抗体部分具有一或多个天然存在的序列和一或多个非天然存在的(即合成)序列或氨基酸。
“Fv”为含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区域与一个轻链可变区域的二聚体组成。由这两个域的折叠产生六个高变环(各来自重链和轻链的3个环)，其促进氨基酸残基的抗原结合并且赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单一可变域(或仅包含三个特异性针对抗原的CDR的Fv的一半)能够识别和结合抗原，但亲和力比整个结合位点低。
“单链Fv”(又缩写为“sFv”或“scFv”)为包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体域的抗体片段。在一些实施例中，scFv多肽进一步包含介于VH与VL域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见普吕克(Pluckthün),《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,罗森堡(Rosenburg)和莫尔(Moore)编辑,施普林格出版社(Springer-Verlag),纽约(New York),第269-315页(1994)。
术语“双价抗体”是指如下制备的小抗体片段：通常用VH与VL域之间的短接头(例如约5至约10个残基)构建scFv片段(参见先前段落)，以使得达成V域的链间而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双价抗体为两个“交叉”scFv片段的杂二聚体，其中两个抗体的VH和VL域存在于不同多肽链上。双价抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和霍林格(Hollinger)等人，《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)。
非人类(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式为含有源自非人源抗体的最小序列的嵌合抗体。大部分情况下，人源化抗体为其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基经来自例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基置换，具有所需抗体特异性、亲和力和能力的人类免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基经相应非人类残基置换。此外，人源化抗体可以包含在接受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体效能(例如针对目标抗原的亲和力)。一般来说，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域中的基本上所有，其中所有或基本上所有高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环并且所有或基本上所有FR为人类免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于其它细节，参见约翰(Jones)等人，《自然(Nature)》321:522-525(1986)；理查曼(Riechmann)等人，《自然》332:323-329(1988)；和普瑞斯塔(Presta),《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》2:593-596(1992)。
关于本文中鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”或“同源性”定义为在考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分下对序列进行比对后，候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于测定氨基酸序列一致性百分比目的的比对可以用所属领域中的技能范围内的各种方式达成，例如使用公开可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。所属领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长内达成最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE产生氨基酸序列一致性％值(埃德加(Edgar,R.C.),《核酸研究(Nucleic Acids Research)》32(5):1792-1797,2004；埃德加,《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》5(1):113,2004)。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合于抗体Fc区的受体。在一些实施例中，FcR为结合IgG抗体(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体(包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式)的FcR。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，两者具有相似的氨基酸序列，不同的处主要在于其细胞质域。激活受体FcγRIIA在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。(参见评述达埃龙(M.
Figure BDA0002905287580000201
),《免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)》15:203-234(1997))。所述术语包括异型，例如FcγRIIIA异型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。FcR评述于拉文奇(Ravetch)和凯奈特(Kinet),《免疫学年评》9:457-92(1991)；卡博尔(Capel)等人，《免疫方法(Immunomethods)》4:25-34(1994)；和德·哈斯(de Haas)等人，《实验室和临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》126:330-41(1995)。其它FcR，包括将来鉴定的FcR，涵盖于本文术语“FcR”中。所述术语还包括负责母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(古耶尔(Guyer)等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。
术语“FcRn”是指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn结构上类似于主要组织相容性复合体(MHC)并且由非共价结合于β2-微球蛋白的α链组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能评述于杰蒂(Ghetie)和瓦德(Ward)(2000)《免疫学年评》18,739-766。FcRn在从母体向幼体被动递送免疫球蛋白IgG和血清IgG含量调节中起作用。FcRn可充当救助受体，其在细胞内并且跨越细胞结合和输送完整形式的经胞饮的IgG，并将其从默认降解路径中挽救。
人类IgG Fc区的“CH1域”(又称作“H1”域的“C1”)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”一般定义为自人类IgG1的Glu216延伸至Pro230(波顿(Burton),《分子免疫学(Molec.Immunol.)》22:161-206(1985))。其它IgG同型的铰链区可以通过将形成重链间S-S键的第一个半胱氨酸残基和最后一个半胱氨酸残基放在相同位置而与IgG1序列对齐。
人类IgG Fc区的“CH2域”(又称作“H2”域的“C2”)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2域的独特之处在于其不与另一域紧密配对。实际上，两个N连接的分支链碳水化合物链插入于完整天然IgG分子的两个CH2域之间。已推测碳水化合物可以为域-域配对提供替代品并帮助CH2域稳定化。波顿,《分子免疫学》22:161-206(1985)。
“CH3域”(又称为“C2”或“H3”域)包含C末端残基至Fc区中的CH2域的片段(即，从抗体序列的约氨基酸残基341至C末端，所述C末端通常位于IgG的氨基酸残基446或447)。
“功能性Fc片段”具有天然序列Fc区的“效应功能”。例示性“效应功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等。所述效应功能一般需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合并且可使用所属领域中已知的各种分析法来评估。
具有“改变”的FcR结合亲和力或ADCC活性的变异型IgG Fc的抗体为相较于亲本多肽或包含天然序列Fc区的多肽，具有增强或减弱的FcR结合活性(例如FcγR或FcRn)和/或ADCC活性的抗体。“展现”与FcR的“结合增强”的变异型Fc结合至少一种FcR的亲和力高于(例如更低的表观Kd或IC50值)亲本多肽或天然序列IgG Fc。根据一些实施例，结合相较于亲本多肽提高约3倍，如约5、10、25、50、60、100、150、200或至多500倍中的任一个，或结合提高约25％至1000％。“展现”与FcR的“结合减少”的多肽变体结合至少一种FcR的亲和力低于亲本多肽(例如较高表观Kd或较高IC50值)。结合相较于亲本多肽的减少可为约40％或更多的结合减少。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指如下细胞毒性形式，其中结合于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的受体(FcR)的所分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合于负载抗原的目标细胞并随后用细胞毒素杀死目标细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这类杀死所绝对需要的。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于拉文奇和凯奈特,《免疫学年评》9:457-92(1991)的第464页的表3中。为了评估所关注分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC分析，例如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中描述的分析。适用于这类分析的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可例如在动物模型中，例如克莱因斯(Clynes)等人《美国国家科学院院刊(PNAS(USA)》95:652-656(1998)中所公开的动物模型中体内评估所关注分子的ADCC活性。
在人效应细胞存在下比具有野生型IgG Fc的多肽或亲本多肽更有效地“展现增强的ADCC”或介导ADCC的包含变异型Fc区的多肽是当具有变异型Fc区的多肽与具有野生型Fc区的多肽(或亲本多肽)的量在分析中基本上相同时，在体外或体内大体上更有效地介导ADCC的多肽。一般来说，这类变体将使用所属领域中已知的任何体外ADCC分析法鉴定，例如用于例如在动物模型中测定ADCC活性的分析法或方法等。在一些实施例中，变体比野生型Fc(或亲本多肽)有效约5倍至约100倍(例如约25倍至约50倍)地介导ADCC。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指目标细胞在补体存在下溶解。经典补体路径的激活是由补体系统(C1q)的第一组分结合于(适当子类的)与同源抗原结合的抗体起始。为了评估补体激活，可进行CDC分析法，例如如加扎诺(Gazzano)-桑托罗(Santoro)等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》202:163(1996)中所描述。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或减少的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利第6,194,551B1号和WO99/51642中。那些专利公开案的内容以引用的方式特别并入本文中。还参见伊杜索吉(Idusogie)等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》164:4178-4184(2000)。
除非另外指定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并型式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。词组编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，达到编码蛋白质的核苷酸序列可在一些型式中含有内含子的程度。
术语“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的功能性连接，其引起后者的表达。举例来说，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列可操作地连接第二核酸序列。举例来说，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子可操作地连接于编码序列。一般来说，可操作地连接的DNA序列为连续的，且当需要接合两个蛋白质编码区时，其在相同阅读框中。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列一致性。当两个比较序列两者中的一个位置被相同碱基或氨基酸单体子单元占据时，例如如果两个DNA分子中的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，那么所述分子在所述位置处同源。两个序列之间的同源性百分比是由所述两个序列共享的匹配或同源位置的数目除以比较位置的数目×100的函数。举例来说，如果所述两个序列中的10个位置中的6个匹配或同源，那么所述两个序列为60％同源。举例来说，DNA序列ATTGCC与TATGGC共享50％同源性。一般来说，当两个序列经过比对以产生最大同源性时进行比较。
如本文所公开的抗PSMA构建体或组合物的“有效量”为足以进行特定陈述的目的的量。“有效量”可以凭经验和通过与所述目的相关的已知方法确定。
术语“治疗有效量”是指如本文所公开的抗PSMA构建体或组合物有效“治疗”个体的疾病或病症的量。在癌症的情况下，治疗有效量的如本文所公开的抗PSMA构建体或组合物可减少癌细胞的数目；减小肿瘤尺寸或重量；抑制(即在一定程度上减缓且优选阻止)癌细胞浸润至周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓且优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一或多种症状。在如本文中所公开的抗PSMA构建体或组合物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，其可为细胞生长抑制和/或细胞毒性的。在一些实施例中，治疗有效量为生长抑制量。在一些实施例中，治疗有效量为延长患者生存的量。在一些实施例中，治疗有效量为改善患者的无恶化生存期的量。
如本文所用，“药学上可接受”或“药理学上相容”意指物质不在生物学上或在其它方面不合需要，例如，所述物质可并入至施用于患者的药物组合物中而不会引起任何显著不良的生物效应或以有害方式与含有其的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载剂或赋形剂优选满足毒理学和制造测试的所要求标准和/或包括于美国食品药物管理局(U.S.Food and Drug administration)制定的非活性成分指南(Inactive IngredientGuide)中。
术语“标记”当在本文中使用时是指可直接或间接与抗PSMA抗体部分结合的可检测化合物或组合物。标记自身可为可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可催化底物化合物或组合物的化学改变，这个改变是可检测的。
术语“嵌合抗原受体(CAR)”是指一种人工构建的混杂单链蛋白质或单链多肽，其含有单链可变片段(scFv)作为细胞外抗原结合域的一部分直接或间接地连接至跨膜域(例如TCR跨膜域)，跨膜域又直接或间接地连接至细胞内免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)信号传导域。胞内信号传导域(ISD)包含来自抗原依赖性TCR相关的T细胞激活分子的初级信号传导序列或初级免疫细胞信号传导序列，例如CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的胞内域的一部分。ISD可进一步包含共刺激信号传导序列；例如如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等的非抗原依赖性共刺激分子的胞内域的一部分。CAR的特征包括其以MHC限制性(在TCR模拟抗体的情况下)或非MHC限制性(在针对细胞表面蛋白质的抗体的情况下)方式，利用单克隆抗体的抗原结合特性重新引导免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)对所选目标的特异性和反应性的能力。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)识别与抗原加工无关的抗原的能力，因此绕过肿瘤逃避的主要机制。
目前存在三代CAR。“第一代”CAR通常为单链多肽，由scFv作为抗原结合域与跨膜域融合，跨膜域与细胞质/胞内域融合构成，其包含来自T细胞受体(TCR)复合物的分子，即抗原依赖性TCR相关的T细胞激活分子，例如CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的初级免疫细胞信号传导序列。“第一代”CAR通常具有来自CD3ξ链的胞内域，CD3ξ链为内源性TCR中的信号的主要发射器。“第一代”CAR可提供从头抗原识别并通过其在单一融合分子中的CD3ζ链信号传导域引起CD4+和CD8+T细胞的激活，与HLA介导的抗原呈递无关。“第二代”CAR将来自各种共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40)的胞内域加入至CAR的初级免疫细胞信号传导序列以向T细胞提供其它信号。“第二代”CAR包含提供共刺激作用(例如CD28或4-IBB)和激活作用(例如CD3ζ)的片段。临床前研究已表明，“第二代”CAR可提高T细胞的抗肿瘤活性。举例来说，经过“第二代”CAR修饰的T细胞的稳定功效在慢性淋巴母细胞性白血病(CLL)和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)患者中靶向CD19分子的临床试验中得到证实。“第三代”CAR包含提供多种共刺激作用(例如CD28和4-1BB)和激活作用(CD3ζ)的CAR。
如本文所用，术语“嵌合抗体-T细胞受体构建体”(或caTCR)是指包含两条分开的多肽链的功能性多肽复合物，一条包括抗体重链可变区(VH)和抗体重链恒定区(CH)，且另一条包括抗体轻链可变区(VL)和抗体轻链恒定区(CL)。因此，如本文所定义的caTCR为2亚基构建体，每个亚基大体上类似于细胞膜锚定的与跨膜域(例如TCR跨膜域)和细胞内免疫细胞信号传导域融合的抗体重链或轻链。在一些实施例中，caTCR不包括共刺激域(例如CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ的胞内域的一部分)。在一些实施例中，caTCR包含a)包含抗体部分的胞外域，和b)能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含a)包含特异性结合于PSMA的胞外区或其一部分(例如SEQ ID NO:44或其一部分)的抗PSMA抗体部分的胞外域和b)能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。
如本文所定义的caTCR包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链包含与抗体CH融合的抗体VH，所述抗体CH与跨膜域和细胞内免疫细胞信号传导域融合，且第二多肽包含与抗体CL融合的抗体VL，所述抗体CL与跨膜域和细胞内免疫细胞信号传导域融合。在一些实施例中，第一多肽链和第二多肽链例如通过共价键(例如，肽键或其它化学键)或非共价键连接。在一些实施例中，抗PSMA caTCR为杂二聚体，其包含第一多肽链和第二多肽链。在一些实施例中，第一多肽链和第二多肽链通过至少一个二硫键连接。抗PSMA caTCR的特异性来源于赋予PSMA的胞外区或其一部分(例如SEQ ID NO:44或其一部分)结合特异性的抗体部分。
术语“嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)”与“抗体-TCR嵌合分子或构建体(abTCR或AbTCR)”在本文中可互换使用。caTCR和abTCR的进一步描述和实例可见于例如WO2017/070608和PCT/US2018/029217(现作为WO 2018/200582公开)，其内容以全文引用的方式并入本文中。
应了解，本文所述的本发明实施例包括“由”实施例“组成”和/或“基本上由”实施例“组成”。
本文中，对“约”一个值或参数的参考包括(和描述)针对所述值或参数本身的变化。举例来说，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，提及“不为”一个值或参数一般意指且描述“除一个值或参数外”。举例来说，方法不用于治疗X型癌症意指方法用于治疗除X以外的类型的癌症。
抗PSMA构建体
本文提供了特异性结合于前列腺特异性膜抗原(PSMA)的构建体，其包含特异性结合于PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗体部分。这类构建体在本文中又称为“抗PSMA构建体”。抗PSMA构建体对PSMA的特异性来源于特异性结合于细胞表面所结合的PSMA的抗PSMA抗体部分(例如全长抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，PSMA的胞外域包含SEQ ID NO:44中阐述的氨基酸序列。
在本申请的范围内，抗PSMA构建体包括(但不限于)例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA构建体、抗PSMA CAR、抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)、抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)、抗PSMA免疫结合物等等，如下文所述。
举例来说，在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如分离的抗PSMA构建体)包含特异性结合于PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，如通过所属领域中已知的方法，例如ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所测定，抗PSMA抗体与非目标多肽的结合程度小于抗PSMA抗体部分与PSMA的结合的约10％。特异性结合可例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量，对照分子通常是不具有结合活性的具有类似结构的分子。举例来说，可以通过与目标(例如过量的未标记的目标)类似的对照分子的竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果标记的目标与探针的结合受过量的未标记目标竞争性抑制，那么指示特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异性针对”特定多肽或特定多肽目标上的表位可展现例如分子对目标的KD为至少约10-4M，或者至少约10-5M，或者至少约10-6M，或者至少约10-7M，或者至少约10-8M，或者至少约10-9M，或者至少约10-10M，或者至少约10-11M，或者至少约10-12M或更少。在一个实施例中，术语“特异性结合”是指其中分子结合于特定多肽(例如PSMA)或特定多肽(例如PSMA)上的表位而大体上不结合于任何其它多肽或多肽表位的结合。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包含特异性结合于PSMA (例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)且与特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的第二抗PSMA抗体(或抗体部分)竞争结合于PSMA的抗PSMA抗体部分，且包含：(a)包含SEQ ID NO:1或2中阐述的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3或4中阐述的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5或6中阐述的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ IDNO:7或8中阐述的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列GNS或SNN的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:9或10中阐述的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，抗PSMA构建体包含特异性结合于与特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的第二抗PSMA抗体(或抗体部分)相同的PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的表位的抗PSMA抗体部分，且包含：(a)包含SEQ ID NO:1或2中阐述的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3或4中阐述的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5或6中阐述的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7或8中阐述的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列GNS或SNN的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:9或10中阐述的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由以下组成的群组的互补决定区(CDR)序列的抗PSMA抗体部分：(a)包含GYX1FX2SYW(SEQ IDNO:11)中阐述的氨基酸序列的CDR-H1，其中X1为S或N；且X2为T或A；(b)包含IYPX1DSDT(SEQID NO:12)中阐述的氨基酸序列的CDR-H2，其中X1为G或D；(c)包含ARX1X2X3X4X5X6YX7X8X9DV(SEQ ID NO:13)中阐述的氨基酸序列的CDR-H3，其中X1为S或无氨基酸；X2为M或无氨基酸；X3为G或无氨基酸；X4为S或无氨基酸；X5为S或D；X6为L或S；X7为A或Y；X8为S或G；且X9为S或I；(d)包含SSNIGX1X2X3X4(SEQ ID NO:14)中阐述的氨基酸序列的CDR-L1，其中X1为A或S；X2为G或N；X3为Y或T；且X4为D或无氨基酸；(e)包含氨基酸序列X1NX2的CDR-L2，其中X1为G或S；且X2为S或N；和(f)包含X1X2X3DX4SLX5GYV(SEQ ID NO:15)中阐述的氨基酸序列的CDR-L3，其中X1为Q或A；X2为S或A；X3为Y或W；X4为S或D；且X5为S或N。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由以下组成的群组的互补决定区(CDR)序列的抗PSMA抗体部分：(a)包含SEQ ID NO:1或2中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3或4中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5或6中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7或8中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列GNS或SNN或包含至多约3个(例如约1、2或3个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:9或10中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L3。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含以下的抗PSMA抗体部分：(a)包含SEQ IDNO:1或2中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3或4中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5或6中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7或8中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列GNS或SNN或包含至多约3个(例如约1、2或3个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:9或10中阐述的氨基酸序列或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L3。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含一个、两个、三个、四个、五个或六个选自由以下组成的群组的互补决定区(CDR)序列的抗PSMA抗体部分：(a)包含SEQ ID NO:1或2中阐述的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3或4中阐述的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5或6中阐述的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7或8中阐述的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列GNS或SNN的CDR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:9或10中阐述的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包括包含以下的抗PSMA抗体部分：a)包含SEQ IDNO:1或2中阐述的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:3或4中阐述的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:5或6中阐述的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7或8中阐述的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列GNS或SNN的CDR-L2；和(f)包含SEQ IDNO:9或10中阐述的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施例中，CDR为人类CDR。
SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列提供于下表2中：
表2
Figure BDA0002905287580000281
在一些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，所述抗PSMA抗体部分包含氨基酸序列与SEQ ID NO:16或17中阐述的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的抗体重链可变域(VH)的一个、两个或三个CDR。或者或另外，在一些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，所述抗PSMA抗体部分包含氨基酸序列与SEQID NO:18或19中阐述的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变域(VL)的一个、两个或三个CDR。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，所述抗PSMA抗体部分包含氨基酸序列与SEQ ID NO:16或17中阐述的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的重链可变域(VH)和/或氨基酸序列与SEQ ID NO:18或19中阐述的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的轻链可变域(VL)。SEQ ID NO:16-19的氨基酸序列提供于下表3中：CDR序列呈加下划线的粗体字。
表3
Figure BDA0002905287580000282
重链和轻链可变域可以呈成对组合进行组合以产生可并入至本公开的抗PSMA构建体中和/或用于本公开的抗PSMA构建体的其它抗PSMA抗体部分。
在某些实施例中，抗PSMA构建体包括包含以下的抗PSMA抗体部分：(a)包含GYSFTSYW(SEQ ID NO:1)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H1，(b)包含IYPGDSDT(SEQ ID NO:3)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H2，(c)包含ARSMGSSLYASSDV(SEQ ID NO:5)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H3，(d)包含SSNIGAGYD(SEQ ID NO:7)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L1，(e)包含GNS或包含至多约3个(例如约1、2或3个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L2，和(f)包含QSYDSSLSGYV(SEQ ID NO:9)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L3。在某些实施例中，抗PSMA构建体包括包含以下的抗PSMA抗体部分：(a)包含GYSFTSYW(SEQ ID NO:1)的CDR-H1；(b)包含IYPGDSDT(SEQ ID NO:3)的CDR-H2；(c)包含ARSMGSSLYASSDV(SEQ ID NO:5)的CDR-H3；(d)包含SSNIGAGYD(SEQ ID NO:7)的CDR-L1；(e)包含GNS的CDR-L2；和(f)包含QSYDSSLSGYV(SEQ ID NO:9)的CDR-L3。在一些实施例中，CDR为人类CDR。在某些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，所述抗PSMA抗体部分包括包含SEQ ID NO:16的VH域的一个、两个或三个CDR和包含SEQ ID NO:18的VL域的一个、两个或三个CDR。在某些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，其包含氨基酸序列与SEQ ID NO:16至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)同一的VH域和/或氨基酸序列与SEQ ID NO:18至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)同一的VL域。在某些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，其包括包含SEQ ID NO:16的VH域和包含SEQ ID NO:18的VL域。包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的抗PSMA抗体部分在本文中替代地称为“克隆A抗PSMA抗体部分”。
在某些实施例中，抗PSMA构建体包括包含以下的抗PSMA抗体部分：(a)包含GYNFASYW(SEQ ID NO:2)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H1，(b)包含IYPDDSDT(SEQ ID NO:4)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H2，(c)包含ARDSYYGIDV(SEQ ID NO:6)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-H3，(d)包含SSNIGSNT(SEQ ID NO:8)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L1，(e)包含SNN或包含至多约3个(例如约1、2或3个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L2，和(f)包含AAWDDSLNGYV(SEQ ID NO:10)或包含至多约5个(例如约1、2、3、4或5个中的任一个)氨基酸取代的其变体的CDR-L3。在某些实施例中，抗PSMA构建体包括包含以下的抗PSMA抗体部分：(a)包含GYNFASYW(SEQ ID NO:2)的CDR-H1，(b)包含IYPDDSDT(SEQ ID NO:4)的CDR-H2；(c)包含ARDSYYGIDV(SEQ ID NO:6)的CDR-H3；(d)包含SSNIGSNT(SEQ ID NO:8)的CDR-L1；(e)包含SNN的CDR-L2；和(f)包含AAWDDSLNGYV(SEQ IDNO:10)的CDR-L3。在一些实施例中，CDR为人类CDR。在某些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，所述抗PSMA抗体部分包括包含SEQ ID NO:17的VH域的一个、两个或三个CDR和包含SEQ ID NO:19的VL域的一个、两个或三个CDR。在某些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，其包含氨基酸序列与SEQ ID NO:17至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)同一的VH域和/或氨基酸序列与SEQ ID NO:19至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)同一的VL域。在某些实施例中，抗PSMA构建体包含如下抗PSMA抗体部分，其包括包含SEQ ID NO:17的VH域和包含SEQ ID NO:19的VL域。包含SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:19的抗PSMA抗体部分在本文中替代地称为“克隆B抗PSMA抗体部分”。
在一些实施例中，抗PSMA构建体的抗PSMA抗体部分为全长抗体。在一些实施例中，抗PSMA构建体的抗PSMA抗体部分为抗PSMA抗体的抗原结合片段，例如选自由以下组成的群组的抗原结合片段：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)和单链抗体分子(scFv)。在一些实施例中，抗PSMA构建体的抗PSMA抗体部分为scFv。在一些实施例中，抗PSMA抗体部分为人源、人源化或半合成的。
下表4提供两种例示性抗PSMA scFv的氨基酸序列。每种scFv中的VL呈纯文本(即，不加下划线)，每种scFv中的VH加下划线，且接头呈斜体字。CDR呈粗体字和加下划线的粗体字。
表4
Figure BDA0002905287580000301
在一些实施例中，抗PSMA scFv包含与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA构建体包含结合人PSMA、小鼠PSMA、大鼠PSMA、食蟹猕猴PSMA和/或恒河猴PSMA的抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，抗PSMA构建体包含特异性结合人PSMA的抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，抗PSMA构建体包含特异性结合于细胞表面上存在或在细胞表面上表达的PSMA的抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，细胞为癌细胞。在一些实施例中，与参考细胞相比，细胞表达异常高水平的PSMA。在一些实施例中，参考细胞为获自或来源于未患病(例如非癌)组织的细胞。在一些实施例中，表达异常高水平的PSMA的细胞为癌细胞。在一些实施例中，癌细胞是在实体瘤中。在一些实施例中，癌细胞为前列腺癌细胞、肾细胞癌细胞、子宫癌细胞或肝癌细胞。在一些实施例中，癌细胞为转移性癌细胞。
包含抗PSMA抗体部分序列变体的抗PSMA构建体
在一些实施例中，本申请的抗PSMA构建体包含本文所述的抗PSMA抗体部分的变体(例如氨基酸序列变体)。举例来说，可能需要改良抗PSMA构建体的抗PSMA抗体部分的结合亲和力和/或其它生物特性。抗PSMA抗体部分的氨基酸序列变体可以通过将适当修饰引入至编码所述抗体部分的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如在抗PSMA抗体部分的氨基酸序列内的残基的缺失、插入和/或取代。为了达成最终抗PSMA抗体部分，缺失、插入和取代可以进行任何组合，只要最终抗体部分具有所需特征，例如结合于PSMA (例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)。
在一些实施例中，抗PSMA抗体部分序列变体包含一或多个氨基酸取代。用于取代型突变诱发的相关位点包括CDR和框架区(FR)。氨基酸取代可以引入所关注的抗PSMA抗体部分中，并且针对所需活性筛检产物，例如保留/提高的与PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的结合、降低的免疫原性或提高的ADCC或CDC等。氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗PSMA抗体部分。抗PSMA抗体部分的其它插入变体包括抗体部分的N端或C端与酶(例如对于ADEPT来说)或延长抗PSMA抗体部分的血清半衰期的多肽的融合物。
在一些实施例中，抗PSMA抗体部分序列变体包含一或多个保守氨基酸取代，如以下表5中所示。
表5：保守取代
初始残基 例示性取代 优选取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可根据常见侧链特性分组为不同类别：
Figure BDA0002905287580000321
非保守性取代将需要将这些类别中的一类的成员换成另一个类别。
一种示例性取代型变体为亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术便利地产生。简单地说，使一或多个CDR残基突变并且在噬菌体上展示变异抗体部分且针对特定生物活性(例如结合亲和力)筛检。变化(例如取代)可于CDR中进行以例如提高抗体部分亲和力。可在CDR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变的密码子所编码的残基(参见例如乔杜里(Chowdhury),《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》207:179-196(2008))和/或决定特异性的残基(SDR)中进行这类改变，其中测试所得变异VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库再选择进行亲和力成熟已描述于例如胡金波姆(Hoogenboom)等人《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》178:1-37(奥布赖恩(O'Brien)等人编辑,人力出版社(Human Press),新泽西州托托瓦(Totowa,NJ),(2001))。
在一些实施例中，本文提供的一或多个CDR序列未改变，或含有至多一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。在一些实施例中，本文提供的VH和/或VL序列未改变，或含有至多一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。在一些实施例中，本文提供的VH和/或VL序列内的一或多个CDR序列未改变，或含有至多一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。
可以通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导的突变诱发)中的任一种将多样性引入被选择用于成熟的可变基因中。随后产生二级文库。随后筛检所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体部分变体。引入多样性的另一方法包括CDR导向法，其中将几个CDR残基(例如一次4-6个残基)随机分组。涉及抗原结合的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变诱发或模型化而特异性鉴定。尤其通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
抗PSMA抗体或抗PSMA抗体部分还可以通过针对具有所需活性的抗体筛检组合文库来鉴定。举例来说，所属领域中已知多种用于产生多肽展示文库和针对具有所需结合特征的抗体筛检这类文库的方法。这类方法评述于例如胡金波姆等人，《分子生物学方法》178:1-37(奥布赖恩等人编辑,人力出版社,新泽西州托托瓦,2001)且进一步描述于例如麦卡弗蒂(McCafferty)等人，《自然》348:552-554；克莱克森(Clackson)等人，《自然》352:624-628(1991)；马克斯(Marks)等人，《分子生物学杂志》222:581-597(1992)；马克斯和布拉德伯雷(Bradbury),《分子生物学方法》248:161-175(罗(Lo)编辑,人力出版社,新泽西州托托瓦,2003)；西度(Sidhu)等人，《分子生物学杂志》338(2):299-310(2004)；李(Lee)等人，《分子生物学杂志》340(5):1073-1093(2004)；菲鲁斯(Fellouse),《美国国家科学院院刊》101(34):12467-12472(2004)；和李等人，《免疫学方法杂志》284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的谱系分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆并在噬菌体文库中随机重组，其接着可如温特尔(Winter)等人，《免疫学年评》12:433-455(1994)中所述，针对抗原结合噬菌体进行筛检。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式展示抗体片段。来自免疫来源的文库向免疫原提供高亲和力抗体而无需构建融合瘤。或者，可克隆原始谱系(例如从人类)以提供针对各种非自体抗原以及自体抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫接种，如格里菲思(Griffiths)等人，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》,12:725-734(1993)所述。最终，还可以用合成方式通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列以编码高度可变CDR3区和实现体外重排的PCR引物制备原始文库，如通过胡金波姆和温特尔,《分子生物学杂志》,227:381-388(1992)描述。描述人源抗体噬菌体文库的专利公开案包括例如：美国专利第5,750,373号和美国专利公开案第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。
抗PSMA抗体部分序列变体可使用噬菌体展示，针对特异性针对PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的抗体筛检文库来制备。文库可为具有多个、至少1×109(例如至少约1×109、2.5×109、5×109、7.5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、7.5×1010或1×1011)个独特人源抗体片段的人类scFv噬菌体展示文库。在一些实施例中，文库为由从来自健康供体的人类PMBC和脾提取的DNA构建的未处理人类文库，包涵所有人类重链和轻链子家族。在一些实施例中，文库为由从PBMC提取的DNA构建的未处理人类文库，所述PBMC从各种疾病患者，如自身免疫疾病患者、癌症患者和感染性疾病患者分离。在一些实施例中，文库为半合成人类文库，其中重链CDR3完全随机化，在任何给出的位置处所有氨基酸(除半胱氨酸的外)同等可能存在(参见例如胡伊特(Hoet,R.M.)等人，《自然-生物技术(Nat.Biotechnol.)》23(3):344-348,2005)。在一些实施例中，半合成人类文库的重链CDR3的长度为约5至约24(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24中的任一个)个氨基酸。在一些实施例中，文库为非人类噬菌体展示文库。
可以通过噬菌体与结合于固相支持体(例如用于溶液淘选的珠粒或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)的PSMA反复结合，接着去除未结合的噬菌体和通过洗脱特异性结合的噬菌体来选择以高亲和力结合于PSMA(例如细胞表面结合的人PSMA)的噬菌体克隆。在溶液淘选的一实例中，PSMA可进行生物素标记以固定至固相支持体。生物素标记的PSMA与噬菌体文库和固相支持体，例如抗生蛋白链菌素结合的戴诺珠粒M-280混合，且接着PSMA-噬菌体-珠粒复合体进行分离。结合的噬菌体克隆接着进行洗脱且用于感染适当宿主细胞，例如大肠杆菌XL1-Blue，用于表达和纯化。
在细胞淘选的另一实例中，表达细胞表面结合的PSMA的哺乳动物细胞(例如表达人PSMA的Jurkat细胞)与噬菌体文库混合，之后收集细胞并洗脱结合的克隆且用于感染适当宿主细胞，用于表达和纯化。可以经由溶液淘选、细胞淘选或两者的组合进行多轮(例如约2、3、4、5、6轮或更多轮)淘选，以富集特异性结合于PSMA的噬菌体克隆。可以通过所属领域中已知的任何方法，包括例如ELISA和FACS测试富集的噬菌体克隆与PSMA的特异性结合。
一种适用于鉴定可靶向用于突变诱发的抗PSMA抗体部分的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”，如由坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)(1989)《科学(Science)》,244:1081-1085所描述。在这种方法中，鉴定残基或一组目标残基(例如带电残基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并被中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)置换以确定抗体部分与抗原的相互作用是否受影响。可以在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置处引入其它取代。或者或另外，可以对抗原-抗体部分复合体的晶体结构进行测定以鉴定抗体与抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代候选物的目标或排除在取代候选物之外。可以筛检变体以确定其是否含有所需特性。
本文提供的抗PSMA抗体部分可另外包含一或多个肽标签序列、肽接头序列(包括自裂解型接头)、裂解位点或其它肽序列(例如信号肽)。一示例性信号肽序列为METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:128)。示例性肽接头序列、裂解位点和肽标签序列展示于以下表6A和6B中。
表6A.示例性肽接头和裂解位点
Figure BDA0002905287580000351
表6B.示例性肽标签
Figure BDA0002905287580000352
全长抗PSMA抗体
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA构建体为或包含全长抗体，例如包含抗PSMA抗体部分的全长抗体，在本文中又称为“全长抗PSMA抗体”。在一些实施例中，全长抗体为单克隆抗体，如本文中的其它地方进一步详细描述。
在一些实施例中，全长抗PSMA抗体包含来自免疫球蛋白，例如人类免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的Fc序列。在一些实施例中，全长抗PSMA抗体包含例如人类IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一个的Fc序列。在一些实施例中，全长抗PSMA抗体包含兔、大鼠或小鼠免疫球蛋白的Fc序列。在一些实施例中，全长抗PSMA抗体包含非人类灵长类动物(例如恒河猴或食蟹猕猴)的Fc序列。在一些实施例中，全长抗PSMA抗体包含经过改变或另外变化，使得其具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能和/或增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)效应功能的Fc序列，如本文中的其它地方进一步详细描述。
包含人类IgG1 Fc区的示例性全长抗PSMA抗体的氨基酸序列提供于下表7中。每条轻链中的VL加下划线，且每条重链中的VH加下划线。CDR呈粗体字。
表7
Figure BDA0002905287580000361
Figure BDA0002905287580000371
在一些实施例中，全长抗PSMA IgG1抗体包括包含本文所述的VH的重链和包含本文所述的VL的轻链。在一些实施例中，全长抗PSMA IgG1抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO:39至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一的重链和氨基酸序列与SEQ ID NO:40至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一的轻链。在一些实施例中，全长抗PSMA IgG1抗体包含氨基酸序列与SEQ ID NO:41至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一的重链和氨基酸序列与SEQ ID NO:42至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一的轻链。
人源和人源化抗PSMA抗体和抗体部分
在一些实施例中，抗PSMA构建体包含人源或人源化的抗PSMA抗体部分。非人类(例如鼠类)抗体部分的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或通常含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的全长抗体的其它抗原结合子序列。人源化抗体部分包括其中来自接受者的一或多个CDR的残基被来自例如具有所需特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔抗体的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基(输入残基)置换的人类免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基被相应非人类残基置换。人源化抗体还可以包含在接受者抗体中和在所输入的CDR或框架序列中均不存在的残基。一般来说，人源化抗体可包含至少一个且通常两个可变域的基本上所有，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人类免疫球蛋白的那些CDR区且所有或基本上所有FR区为人类免疫球蛋白共有序列的那些FR区。在一些实施例中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的至少一部分。参见例如约翰等人，《自然》,321:522-525(1986)；理查曼等人，《自然》,332:323-329(1988)；普瑞斯塔,《结构生物学新见》,2:593-596(1992)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988)；和美国专利第4,816,567号。
作为人源化的替代方案，可产生人源抗体。举例来说，目前可产生在免疫接种后能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整人源抗体谱系的转基因动物(例如小鼠)。举例来说，已描述了嵌合和生殖系突变小鼠中的抗体重链接合区(JH)基因的同型接合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球蛋白基因阵列转移至这类生殖系突变小鼠中将导致在抗原攻击时产生人源抗体。参见例如雅克博维次(Jakobovits)等人，《美国国家科学院院刊》,90:2551(1993)；雅克博维次等人，《自然》,362:255-258(1993)；布吕格曼(Bruggemann)等人，《免疫学年(Year in Immunol.)》,7:33(1993)；美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号、第5,545,807号和第WO 97/17852号。或者，可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物(例如已使内源免疫球蛋白基因部分或完全无活性的小鼠)中来制备人源抗体。在攻击之后，观察人源抗体的产生，其在所有方面与在人类中所见极其类似，包括基因重排、装配和抗体谱系。这种方法描述于例如美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号和第5,661,016号，以及马克斯等人，《生物技术(Bio/Technology)》,10:779-783(1992)；伦贝格(Lonberg)等人，《自然》,368:856-859(1994)；莫里森,《自然》,368:812-813(1994)；菲希维尔德(Fishwild)等人，《自然-生物技术》,14:845-851(1996)；纽伯格(Neuberger),《自然-生物技术》,14:826(1996)；伦贝格和胡萨尔(Huszar),《国际免疫学评论(Intern.Rev.Immunol.)》,13:65-93(1995)。
人源抗体还可以通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)或通过使用所属领域中已知的各种技术，包括噬菌体展示文库产生。胡金波姆和温特尔,《分子生物学杂志》,227:381(1991)；马克斯等人，《分子生物学杂志》,222:581(1991)。科尔(Cole)等人和伯尔纳(Boerner)等人的技术也可以用于制备人类单克隆抗体。科尔等人，《单克隆抗体和癌症(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》,阿兰﹒里斯(AlanR.Liss),第77页(1985)和伯尔纳等人，《免疫学杂志》,147(1):86-95(1991)。
单克隆抗PSMA抗体和抗体部分
在一些实施例中，本公开的抗PSMA构建体包含单克隆抗PSMA抗体或单克隆抗PSMA抗体部分。单克隆抗体可例如使用融合瘤方法，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein),《自然》,256:495(1975)和Sergeeva(塞尔赫瓦)等人，《血液(Blood)》,117(16):4262-4272所述的方法，使用本文和下文实例中所述的噬菌体展示方法，或使用重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)来制备。
在融合瘤方法中，仓鼠、小鼠或其它适当宿主动物通常用免疫接种剂进行免疫接种以产生淋巴细胞，其产生或能够产生将特异性结合于免疫接种剂的抗体。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫接种。免疫接种剂可包括多肽或所关注蛋白质的融合蛋白或包含至少两种分子的复合物。一般来说，如果需要人类来源的细胞，那么使用外周血淋巴细胞(“PBL”)；或如果需要非人类哺乳动物来源的细胞，那么使用脾细胞或淋巴结细胞。接着使用适合融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成融合瘤细胞。参见例如戈丁(Goding),《单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles andPractice)》(纽约:学术出版社(Academic Press),1986),第59-103页。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛类和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。融合瘤细胞可在优选含有一或多种抑制未融合的永生化细胞生长或生存的物质的适合培养基中培养。举例来说，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于融合瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，其阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，支持所选产抗体细胞稳定高水平地表达抗体且对于如HAT培养基的培养基敏感。在一些实施例中，永生化细胞系为鼠类骨髓瘤细胞系，其可例如从加利福尼亚圣迭戈的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute CellDistribution Center,San Diego,California)和弗吉尼亚州马纳萨斯的美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)获得。还已经描述了用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类杂骨髓瘤细胞系。库布(Kozbor),《免疫学杂志》,133:3001(1984)；布罗德(Brodeur)等人《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》(马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.):纽约,1987)第51-63页。
接着可分析培养融合瘤细胞的培养基中针对所述多肽的单克隆抗体的存在。可以通过免疫沉淀或通过体外结合分析(例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))测定由融合瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。所述技术和分析法是所属领域中已知的。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过蒙森(Munson)和波拉德(Pollard),《分析生物化学(Anal.Biochem.)》,107:220(1980)的史卡查分析(Scatchard analysis)测定。
在鉴定所需融合瘤细胞之后，克隆可以通过限制稀释程序亚克隆并通过标准方法生长。戈丁,前述。出于这个目的的适合培养基包括例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和RPMI-1640培养基。或者，融合瘤细胞可以呈腹水形式在哺乳动物中体内生长。
亚克隆所分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)从培养基或腹水分离或纯化。
在某些实施例中，抗PSMA抗体或抗体部分为单价。用于制备单价抗体的方法是所属领域中已知的。一种示例性方法涉及免疫球蛋白轻链与经过修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任一点将重链截短以防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基经另一氨基酸残基取代或缺失以防止交联。
体外方法也适合于制备单价抗体。可使用所属领域中已知的任何方法实现抗体的消化以产生其片段，尤其Fab片段。
具有所需结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原组合位点)可与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选与包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在一些实施例中，含有轻链结合所需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合物中的至少一种中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入独立的表达载体中，并共转染至适合的宿主生物体中。对于产生双特异性抗体的其它细节，参见例如苏雷什(Suresh)等人，酶学方法(Methods in Enzymology),121:210(1986)。
单克隆抗体还可以通过重组DNA法，例如美国专利第4,816,567号中所描述的那些方法制得。编码单克隆抗PSMA抗体的DNA可容易使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合于编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。如上文所述的融合瘤细胞或PSMA特异性噬菌体克隆可以充当这类DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，接着转染于不会另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。DNA还可以进行如下修饰，例如通过用人类重链和轻链恒定域和/或框架区的编码序列替代同源非人类序列(美国专利第4,816,567号；莫里森等人，前述)或通过使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价接合于免疫球蛋白编码序列。这类非免疫球蛋白多肽可取代抗PSMA抗体的恒定域，或可取代抗PSMA抗体的一个抗原组合位点的可变域，从而产生嵌合二价抗体。
多特异性抗PSMA构建体
在一些实施例中，抗PSMA构建体为多特异性的。本文提供的多特异性抗PSMA构建体展现对至少两种不同抗原或两种不同表位(例如同一抗原上的两种不同表位)的结合特异性。还涵盖具有超过二价和/或超过两种抗原特异性的多特异性构建体。举例来说，可制备三特异性抗体。参见例如塔特(Tutt)等人《免疫学杂志》147:60(1991)。因此，在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体包含抗PSMA抗体部分和至少一种其它结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体部分。
在一些实施例中，多特异性(例如双特异性)抗PSMA构建体包含a)特异性结合于PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)；和b)第二结合部分(例如抗原结合部分)。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于PSMA上不与抗PSMA抗体部分所结合的表位重叠的表位(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于不同抗原(即，除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于例如癌细胞或免疫细胞的细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，第二抗原结合部分特异性结合于淋巴细胞，如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞表面上的抗原。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于效应T细胞，如细胞毒性T细胞(又称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或T杀伤细胞)。在一些实施例中，第二结合部分为抗体部分。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体包含a)特异性结合于PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)；和b)特异性结合于CD3的第二结合部分。在一些实施例中，第二结合部分为结合CD3的抗体部分。在一些实施例中，第二抗原结合部分为人源、人源化或半合成抗体部分。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合CD3ε。在一些实施例中，第二结合部分特异性结合于CD3ε的激动表位。在一些实施例中，术语“激动表位”是指在结合多特异性分子时，任选地在同一细胞上结合若干多特异性分子时允许所述多特异性分子激活TCR信号传导和诱发T细胞激活的表位。在一些实施例中，术语“激动表位”是指仅仅由CD3的ε链的氨基酸残基构成并在展示于T细胞上天然环境(即被TCR、CD3γ链等包围)时可由多特异性分子结合的表位。在一些实施例中，术语“激动表位”是指在多特异性分子结合时不引起CD3ε的空间位置相对于CD3γ稳定化的表位。在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体进一步包含至少一个(例如至少约2、3、4、5或更多个中的任一个)其它抗原结合部分。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体包含a)特异性结合于PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)；和b)特异性结合于效应细胞的表面上的抗原，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68和GDS2D的第二结合部分。在一些实施例中，第二结合部分为抗体部分。在一些实施例中，第二抗原结合部分为人源、人源化或半合成抗体部分。在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体进一步包含至少一个(例如至少约2、3、4、5或更多个中的任一个)其它抗原结合部分。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体包含a)特异性结合于PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)；和b)特异性结合于补体系统的组分，例如C1q的第二结合部分。C1q为激活血清补体系统的C1酶复合体的亚基。在一些实施例中，第二结合部分为抗体部分。在一些实施例中，第二抗原结合部分为人源、人源化或半合成抗体部分。在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体进一步包含至少一个(例如至少约2、3、4、5或更多个中的任一个)其它抗原结合部分。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体包含a)特异性结合于PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)；和b)特异性结合于Fc受体、例如Fcγ受体(FcγR)的第二结合部分。FcγR可为存在于自然杀伤(NK)细胞表面上的FcγRIII或存在于巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞表面上的FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIBI、FcγRIIB2和FcγRIIIB中的一种。在一些实施例中，第二结合部分为抗体部分。在一些实施例中，第二抗原结合部分为人源、人源化或半合成抗体部分。在一些实施例中，第二结合部分为Fc区或其功能片段。在一些实施例中，“功能片段”是指仍以足够允许负载FcγR的效应细胞、尤其巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞通过细胞毒性溶解或吞噬作用杀死目标细胞的特异性和亲和力能够结合于FcR、尤其FcγR的抗体Fc区的片段。功能Fc片段能够竞争性地抑制原始全长Fc部分与例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIBI、FcγRIIB2或FcγRIIIB的FcR的结合。在一些实施例中，功能Fc片段保留其对FcγR、例如激活FcγR的亲和力的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，Fc区或其功能片段为增强型Fc区或其功能片段。如本文所用，术语“增强型Fc区”是指一种Fc区，其经过修饰以增强Fc受体介导的效应功能，尤其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体介导的吞噬作用。举例来说，Fc区可以增加对激活受体(例如在自然杀伤(NK)细胞上表达的FcγRIIIA(CD16A))的亲和力和/或减少与抑制受体(例如FcγRIIB1/B2(CD32B))的结合的方式进行改变。在一些实施例中，第二抗原结合部分为以足够允许负载FcγR的效应细胞、尤其巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或树突状细胞通过细胞毒性溶解或吞噬作用杀死目标细胞的特异性和亲和力特异性结合于FcR、尤其FcγR的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体进一步包含至少一个(例如至少约2、3、4、5或更多个中的任一个)其它抗原结合部分。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体允许杀死在表面上表达PSMA的目标细胞(例如癌细胞)。在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体有效地重新引导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)以溶解在表面上表达(例如过度表达)PSMA的目标细胞(例如癌细胞)。在一些实施例中，多特异性(例如双特异性)抗PSMA构建体具有在10至500ng/ml范围内的体外EC50值。在一些实施例中，多特异性(例如双特异性)抗PSMA构建体能够诱导以约1:1至约50:1(例如约1:1至约15:1或约2:1至约10:1)的CTL:目标细胞的比率通过CTL重新引导约50％目标细胞的溶解。
在一些实施例中，多特异性(例如双特异性)抗PSMA构建体能够以使目标细胞溶解的方式交联经过刺激或未刺激的CTL和目标细胞。这提供了如下益处：多特异性抗PSMA构建体欲发挥其所需活性，无需树突状细胞产生目标特异性T细胞克隆或通用抗原呈递。在一些实施例中，本文提供的多特异性抗PSMA构建体能够在不存在其它激活信号下重新引导CTL以使目标细胞(例如癌细胞)溶解。在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体的第二抗原结合部分特异性结合于CD3(例如CD3ε)，且重新引导CTL以使目标细胞(例如癌细胞)溶解无需通过CD28和/或IL-2的信号传导。
用于测量多特异性抗PSMA构建体同时结合于两种抗原(例如两种不同细胞上的两种不同抗原或替代地同一细胞的两种不同抗原)的优先选择的方法在一般技术者的能力范围内。举例来说，当多特异性抗PSMA构建体的第二结合部分特异性结合于CD3时，多特异性抗PSMA构建体可与CD3+/PSMA-细胞与CD3-/PSMA+细胞的混合物接触。接着可以通过荧光显微法、荧光激活细胞分选术(FACS)和/或所属领域中已知的其它方法评估多特异性抗PSMA构建体所结合的单细胞的数目和多特异性抗PSMA构建体所结合的交联细胞的数目。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体为例如双特异性抗体、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线形二聚scDb(LD-scDb)、圆形二聚scDb(CD-scDb)、双重双价抗体、串联scFv、串联双scFv、串联三scFv、三功能抗体、双特异性Fab2、双微型抗体、四功能抗体、scFv-Fc-scFv融合物、双亲和力再靶向(DART)抗体、双可变域(DVD)抗体、IgG-scFab、scFab-ds-scFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合物、锚栓(DNL)抗体、杵臼(KiH)抗体(通过KiH技术制备的双特异性IgG)、DuoBody(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)、杂多聚体抗体或异源结合抗体。在一些实施例中，多特异性抗PSMA分子为串联scFv(例如串联双scFv)。应了解一般技术者可选择所属领域中已知的多种多特异性构建体的适当特征且将彼此组合以形成在本公开的范围内的另一多特异性抗PSMA构建体。
适用于制造多特异性构建体(例如双特异性抗体)的方法是所属领域中所众所周知的。举例来说，双特异性抗体的产生可基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两对各具有不同特异性，且在缔合后产生杂二聚体抗体(参见例如米尔斯坦和奎洛(Cuello),《自然》,305:537-539(1983)；WO 93/08829和特劳内克(Traunecker)等人，《欧洲分子生物学组织杂志》.10:3655(1991))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些融合瘤(四源融合瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有适当双特异性结构。适当分子的纯化通常通过亲和色谱法步骤实现。类似程序公开于WO 93/08829和特劳内克等人，《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO)》,10:3655-3659(1991)中。或者，重链和轻链的组合可以通过利用物种限制的配对来定向(参见例如林德霍夫(Lindhofer)等人，《免疫学杂志》,155:219-225(1995))且重链的配对可以通过使用CH3域的“杵臼”工程化来定向(参见例如美国专利第5,731,168号；Ridgway等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》,9(7):617-621(1996))。多特异性抗体还可以通过工程化静电转向效应以制造抗体Fc-杂二聚体分子来制得(参见例如WO 2009/089004A1)。在另一方法中，稳定双特异性抗体可以通过受控的Fab臂交换产生，其中具有相异抗原特异性和CH3域中的匹配点突变的两个亲本抗体在还原条件下混合以允许分离、重新装配和再氧化而形成高度纯双特异性抗体。拉宾因(Labrigin)等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》,110(13):5145-5150(2013)。包含重链/轻链对的混合物的这类抗体在本文中又称为“杂多聚体抗体”。
具有不同特异性的抗体或其抗原结合片段还可以发生化学交联以产生多特异性异源结合抗体。举例来说，各具有针对不同抗原的特异性的两个F(ab')2分子可以用化学方式连接。普拉卡特(Pullarkat)等人，《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》,48:9-21(1999)。举例来说，已经提出这类抗体可以使免疫系统细胞靶向非所需细胞(美国专利第4,676,980号)且用于治疗HIV感染。WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089。预期抗体可以使用合成蛋白质化学中的已知方法(包括涉及交联剂的方法)在体外制备。举例来说，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键而构建。适于达成此目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯和公开于例如美国专利第4,676,980号中的试剂。
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体可以使用重组DNA技术制备。举例来说，双特异性抗体可以通过将两个scFv融合，例如通过经过肽接头将其融合，产生串联scFv(例如串联双scFv)而工程化。术语“抗PSMA串联双scFv”与“双特异性抗PSMA抗体”在本文中可互换使用。在一些实施例中，串联scFv包含抗CD3 scFv至包含本文所述的抗PSMA结合部分的scFv，引起T细胞重新引导至表达(例如过度表达)PSMA的目标细胞。关于构建和表达串联scFv的其它细节提供于例如马克(Mack)等人，《美国国家科学院院刊》,92:7021-7025(1995)；布瑞斯奇(Brischwein)等人,《分子免疫学》,43(8):1129-1143(2006)。关于本公开的串联scFv的其它细节提供于本文中的其它地方。
通过缩短两个可变域之间的肽接头长度，可防止可变域自装配且迫使其与第二多肽上的域配对，从而产生紧凑型双特异性抗体，称为双价抗体(Db)。霍利格(Holliger)等人，《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)。Db的两个多肽各自包含通过太短而无法允许相同链上的两个域之间的配对的接头连接至VL的VH。因此，一个多肽的VH和VL域被迫与另一多肽的互补VL和VH域配对，进而形成两个抗原结合位点。以此型式的修饰，两个多肽通过另一肽接头连接，产生单链双价抗体(scDb)。在Db型式的另一修饰中，双亲和力再靶向(DART)双特异性抗体可以通过在每个多肽的C端处的半胱氨酸残基之间引入二硫键，任选地在C端半胱氨酸残基之前包括驱动所需杂二聚体结构的装配的域而产生。维瑞(Veri)等人，《关节炎与风湿病学(Arthritis Rheum.)》,62(7):1933-1943(2010)。所属领域中还已知双可变域免疫球蛋白(DVD-IgTM)，其中两个单克隆抗体的目标结合可变域经由天然存在的接头组合以产生四价双特异性抗体。古(Gu)和加伊尔(Ghayur),《酶学方法(MethodsEnzymol.)》,502:25-41(2012)。在另一型式中，通过利用来源于人类cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的调控亚基的肽(DDD2)与来源于人类A激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定域的肽(AD2)进行二聚化来制备锚栓(DNL)双特异性抗体。罗西(Rossi)等人，《美国国家科学院院刊》,103:6841-6846(2006)。
还已经描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。举例来说，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。科斯切尔尼(Kostelny)等人，《免疫学杂志》,148(5):1547-1553(1992)。此方法还可以用于产生抗体同型二聚体。
串联scFv构建体
在一些实施例中，多特异性抗PSMA构建体为包括包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)的第一scFv和结合于第二目标的第二scFv的串联scFv构建体(“抗PSMA串联scFv”)。在一些实施例中，串联scFv为双scFv(包含两个scFv)或串联三scFv(包含三个scFv)。在一些实施例中，抗PSMA串联scFv进一步包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个scFv。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于PSMA (例如与第一scFv的抗PSMA抗体部分所结合的表位不重叠的表位)。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于另一抗原(即，除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于例如表达PSMA的细胞(例如癌细胞)的细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于不表达PSMA的细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于细胞毒性细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于淋巴细胞，如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于效应T细胞，如细胞毒性T细胞表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于效应细胞，包括例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、CD16a、CD56、CD68和GDS2D的表面上的抗原。在一些实施例中，第一scFv和/或第二scFv为人源、人源化或半合成的。
在一些实施例中，抗PSMA串联scFv包含a)包含特异性结合于PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)的第一scFv；和b)特异性结合于T细胞表面上的抗原的第二scFv。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于效应T细胞，如细胞毒性T细胞表面上的抗原。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于例如CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L或HVEM。在一些实施例中，第二scFv特异性结合于T细胞表面上的抗原上的激动表位，其中第二scFv与激动表位的结合增强T细胞激活。在一些实施例中，第一scFv和/或第二scFv为人源、人源化或半合成的。
在一些实施例中，抗PSMA串联scFv包含a)包含特异性结合于PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)的第一scFv；和b)特异性结合于CD3ε的第二scFv。在一些实施例中，第一scFv经由肽接头融合至第二scFv。在一些实施例中，肽接头的长度介于约5至约20(如约5、10、15或20中的任一个，包括这些值之间的任何范围)个氨基酸之间。在一些实施例中，肽接头包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:140)(例如由其组成或基本上由其组成)，不过可使用替代接头(例如表6A中的那些接头)。在一些实施例中，第一scFv和/或第二scFv为人源、人源化或半合成的。
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA串联scFv的结合PSMA的scFv以介于约0.1pM至约500nM之间(例如约0.1pM、2.5pM、1.0pM、5pM、10pM、25pM、50pM、75pM、100pM、250pM、500pM、750pM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、75nM、100nM、250nM或500nM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的Kd结合于PSMA (例如细胞表面结合的PSMA)。在一些实施例中，本文提供的抗PSMA串联scFv的结合PSMA的scFv以介于约1nM至约500nM之间(例如约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500nM中的任一个，包括这些值之间的任何范围)的Kd结合于PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)。
示例性抗PSMA抗CD3串联双scFv的氨基酸序列提供于下表8中。各串联双scFv中的抗PSMA scFv呈纯文本(即，不加下划线)。各串联双scFv中的抗CD3 scFv加下划线。连接抗PSMA scFv和抗CD3 scFv的接头呈粗斜体字。
表8
Figure BDA0002905287580000471
虽然表8中的序列包含特定肽接头和肽标签，但可以使用任何接头或标签(参见例如表6A和6B)。
在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv包含与SEQ ID NO:25、26、27或28具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。
抗PSMA嵌合抗原受体(抗PSMA CAR)
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA构建体为包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述的抗PSMA抗体部分)的嵌合抗原受体(CAR)(在本文中又称为“抗PSMA CAR”)。如本文中的其它地方进一步详述，本公开还提供了包含、表达或与抗PSMA CAR相关的CAR效应细胞(例如T细胞)。这类效应细胞在本文中又称为“抗PSMA CAR效应细胞”，例如“抗PSMA CAR免疫细胞”或“抗PSMA CAR T细胞”)。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包含a)包含特异性结合于PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)的胞外域和b)胞内信号传导域。在一些实施例中，抗PSMA CAR在胞外域与胞内域之间包含跨膜域。在一些实施例中，抗PSMA CAR进一步包含间隔子。在一些实施例中，间隔子连接抗PSMA CAR的胞外域和跨膜域。在一些实施例中，间隔子连接抗PSMA CAR的胞内域和跨膜域。在一些实施例中，间隔域为用于将多肽链中的跨膜域连接至胞外域或胞内域的任何寡肽或多肽。举例来说，间隔域可包含至多约300个氨基酸，包括例如约10个与约100个氨基酸之间或约25个与约50个氨基酸之间。
抗PSMA CAR的跨膜域可来源于天然来源或合成来源。在来源为天然时，所述域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。举例来说，在一些实施例中，抗PSMA CAR包含来源于不限于T细胞受体、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的α、β、δ或γ链的跨膜域(例如至少一个跨膜域或至少一个跨膜区)。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含合成跨膜域，在这种情况下，跨膜域可主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，在合成跨膜域的每一端可发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施例中，例如长度在约2与约10个氨基酸之间(例如长度为约2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸中的任一个)的短寡肽或多肽接头可在抗PSMACAR的跨膜域与胞内信号传导域之间形成键。在一些实施例中，接头为甘氨酸-丝氨酸二联体。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包含与抗PSMA CAR的胞内域中一个序列天然缔合的跨膜域。举例来说，如果抗PSMA CAR胞内域包含CD28共刺激序列，那么抗PSMA CAR的跨膜域来源于CD28跨膜域。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含经过选择或通过氨基酸取代进行修饰以将与受体复合物的其它成员的相互作用降至最低和/或避免与相同或不同表面膜蛋白的跨膜域结合的跨膜域。
抗PSMA CAR的胞内信号传导域负责激活其中表达抗PSMA CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。T细胞的效应功能例如可为细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，在一些实施例中，术语“胞内信号传导域”是指转导效应功能信号和引导细胞执行专门功能的抗PSMA CAR部分。尽管通常可采用整个胞内信号传导域，但在多数情况下，不必使用整条链。在使用胞内信号传导域的截短部分的程度上，这类截短部分可用于替代完整链，只要其转导效应功能信号即可。在一些实施例中，术语“胞内信号传导序列”是指足以转导效应功能信号的胞内信号传导域的任何截短部分。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包括包含在抗原受体啮合后共同用以起始信号转导的T细胞受体(TCR)和辅助受体的细胞质序列的胞内信号传导。在一些实施例中，抗PSMACAR包括包含T细胞受体(TCR)和辅助受体的衍生物或变体和/或具有相同功能能力的任何合成序列的胞内信号传导域。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全激活T细胞且还需要二级或共刺激信号。因此，可以称T细胞激活是通过两种不同类别的胞内信号传导序列介导的：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的序列(初级信号传导序列或初级免疫细胞信号传导序列)和以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列(共刺激信号传导序列)。
初级信号传导序列或初级免疫细胞信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级信号传导序列可含有信号传导基序，其被称为免疫受体酪氨酸激活基序(或ITAM)。因此，在一些实施例中，抗PSMA CAR包含一或多个ITAM。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含来源于(不限于)TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，抗PSMA CAR进一步包含共刺激信号传导序列。在一些实施例中，共刺激信号传导序列为包括(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等的共刺激分子的胞内域的一部分。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含超过一个共刺激信号传导序列。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含单独或与可用于本文提供的抗PSMA CAR的情况下的任何其它所需胞内信号传导序列组合的来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列。举例来说，在一些实施例中，抗PSMA CAR包括包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列和共刺激信号传导序列的胞内域。在一些实施例中，共刺激信号传导序列为包括(例如)CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等的共刺激分子的胞内域的一部分。在一些实施例中，共刺激信号传导序列来源于例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含超过一个共刺激信号传导序列。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包括包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列和来源于CD28的共刺激信号传导序列的胞内信号传导域。在一些实施例中，抗PSMA CAR包括包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列和来源于4-1BB的共刺激信号传导序列的胞内信号传导域。在一些实施例中，抗PSMA CAR的胞内信号传导域包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列和来源于CD28和4-1BB的共刺激信号传导序列。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包含a)包含特异性结合于PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)的胞外域、b)跨膜域和c)能够激活免疫细胞的胞内信号传导域。在一些实施例中，胞内信号传导域包含初级免疫细胞信号传导序列和共刺激信号传导序列。在一些实施例中，初级免疫细胞信号传导序列包含CD3ζ胞内信号传导序列。在一些实施例中，共刺激信号传导序列包含CD28或4-1BB胞内信号传导序列。在一些实施例中，胞内域包含CD3ζ胞内信号传导序列和CD28或4-1BB胞内信号传导序列。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含与包含CD3ζ胞内信号传导序列和CD28胞内信号传导序列的SEQ IDNO:22的氨基酸序列(参见以下)融合的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)。在一些实施例中，抗PSMA CAR包含与包含CD3ζ胞内信号传导序列和4-1BB胞内信号传导序列的SEQ ID NO:23的氨基酸序列(参见以下)融合的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)。
Figure BDA0002905287580000501
Figure BDA0002905287580000502
在一些实施例中，抗PSMA抗体部分为scFv(例如多特异性抗PSMA scFv，例如抗PSMA串联双scFv)。在一些实施例中，scFv包含通过肽接头连接的重链和轻链可变区，所述肽接头包括(但不限于)包含SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的肽接头。
下表9提供示例性抗PSMA CAR的氨基酸序列。每个CAR包含(依序从N端至C端)抗PSMA scFv(纯文本，即不加下划线)、myc标签(粗体加下划线)、接头(粗斜体字)、来源于CD28的序列(加下划线)和来源于CD3ζ的序列(粗体字和加下划线)。
表9
Figure BDA0002905287580000511
虽然表9中的序列包含特定肽接头和肽标签，但可以使用任何接头或标签(参见例如表6A和6B)。
在一些实施例中，抗PSMA CAR包含与SEQ ID NO:29或30具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。
抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构建体(caTCR)
在一些实施例中，抗PSMA构建体为包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述的抗PSMA抗体部分)的嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)。这类构建体在本文中又称为“抗PSMAcaTCR”。示例性caTCR论述于PCT/US2016/058305(现以WO 2017/070608公开)中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗PSMA caTCR特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)且能够募集至少一种TCR相关信号传导分子(例如CD3δε、CD3γε和/或CD3ζζ)。
如在下文更详细地描述，本公开还提供了一种包含、表达抗PSMA-caTCR或与其相关联的效应细胞(例如T细胞)。这类效应细胞在本文中又称为“抗PSMA caTCR效应细胞”，例如“抗PSMA caTCR T细胞”)。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含a)抗原结合模块，所述抗原结合模块包含特异性识别PSMA(例如细胞表面结合的人PSMA)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)；和b)T细胞受体模块(TCRM)，所述T细胞受体模块包括包含来源于天然存在的TCR(例如αβTCR或γδTCR)的跨膜域中的一者的第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)和包含来源于天然存在的TCR(例如αβTCR或γδTCR)的其它跨膜域的第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM促进至少一种TCR相关信号传导分子(例如CD3δε、CD3γε和/或CD3ζζ)的募集且其中所述抗体部分连接于第一和/或第二TCRD。在一些实施例中，第一TCR-TM和第二TCR-TM来源于γ/δTCR。在一些实施例中，第一TCR-TM来源于TCRγ链且第二TCR-TM来源于TCRδ链。在一些实施例中，第一TCR-TM来源于TCRδ链且第二TCR-TM来源于TCRγ链。在一些实施例中，第一TCR-TM和第二TCR-TM来源于α/βTCR。在一些实施例中，第一TCR-TM来源于TCRα链且第二TCR-TM来源于TCRβ链。在一些实施例中，第一TCR-TM来源于TCRβ链且第二TCR-TM来源于TCRα链。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含天然存在的TCR域。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含至少一个非天然存在的TCR域。举例来说，γ/δTCR、α/βTCR、TCRγ链、TCRδ链、TCRα链和/或TCRβ链可原名天然存在或非天然存在的。抗PSMA caTCR的抗原结合模块提供抗原特异性且TCRM允许CD3募集和信号传导。在一些实施例中，抗原结合模块不为天然存在的T细胞受体抗原结合部分。在一些实施例中，抗原结合模块连接于TCRM中的多肽链的N端。在一些实施例中，抗原结合模块为选自由Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv组成的群组的抗PSMA抗体部分。TCRM包含来源于一或多个TCR、例如αβ和/或γδTCR的跨膜域的跨膜模块(TCR-TM)，且任选地进一步包含TCR的连接肽或其片段和/或一或多个TCR胞内域或其片段中的一个或两个。在一些实施例中，TCRM包含两条多肽链，每条多肽链从N端至C端包含连接肽、跨膜域和任选地存在的TCR胞内域。在一些实施例中，TCRM包含一或多个非天然存在的TCR域。举例来说，在一些实施例中，TCRM包含一或两个非天然存在的TCR跨膜域。非天然存在的TCR域可以是天然存在的TCR的对应域，其通过一或多个氨基酸的取代和/或通过用来自另一TCR的类似域的一部分置换对应域的一部分而进行修饰。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链和第二多肽链一起形成抗原结合模块和TCRM。在一些实施例中，第一多肽链和第二多肽链为单独的多肽链，且caTCR为多聚体，例如二聚体。在一些实施例中，第一多肽链与第二多肽链共价连接，例如通过肽键或通过另一种化学键(例如二硫键)连接。在一些实施例中，第一多肽链和第二多肽链通过至少一个二硫键连接。在一些实施例中，抗PSMA caTCR进一步包含一或多个T细胞共刺激信号传导序列。一或多个共刺激信号传导序列可个别地为共刺激分子的胞内域的全部或一部分，包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等等。在一些实施例中，一或多个共刺激信号传导序列处于第一TCR-TM与第一TCR胞内域之间和/或第二TCR-TM与第二TCR胞内域之间。在一些实施例中，一或多个共刺激信号传导序列位于第一TCRD和/或第二TCRD的C端。在一些实施例中，抗PSMA caTCR缺乏T细胞共刺激信号传导序列。在一些实施例中，caTCR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。在一些实施例中，caTCR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR进一步包含稳定化模块，所述稳定化模块包含第一稳定化域和第二稳定化域，其中所述第一稳定化域和所述第二稳定化域对彼此具有使所述抗PSMAcaTCR稳定的结合亲和力。在一些实施例中，稳定化模块位于抗原结合模块与TCRM之间。在一些实施例中，抗PSMA caTCR进一步包含位于任两个caTCR模块或域之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包含连接两个caTCR模块或域的一或多个肽接头。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包括包含VH和CH1抗体域的第一抗原结合域和包含第一TCR亚基的第一跨膜域的第一T细胞受体域(TCRD)；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包括包含VL和CL抗体域的第二抗原结合域和包含第二TCR亚基的第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原结合域的VH和CH1域与第二抗原结合域的VL和CL域形成特异性结合PSMA的抗原结合模块，且其中第一TCRD与第二TCRD形成能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。在一些实施例中，抗原结合模块在CH1域中的残基与CL域中的残基之间包含二硫键。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包括包含VH抗体域的第一抗原结合域和包含第一TCR亚基的第一跨膜域的第一TCRD；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包括包含VL抗体域的第二抗原结合域和包含第二TCR亚基的第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原结合域的VH域与第二抗原结合域的VL域形成特异性结合PSMA的抗原结合模块，其中第一TCRD与第二TCRD形成能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含TCRM，所述TCRM包含a)包含第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一T细胞受体域(TCRD)和b)包含第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM有助于募集至少一种TCR相关信号传导分子。在一些实施例中，两个TCR-TM均为天然存在的。在一些实施例中，所述TCR-TM中的至少一个为非天然存在的。在一些实施例中，两个TCR-TM均为非天然存在的。在一些实施例中，第一TCR-TM来源于T细胞受体(例如αβTCR或γδTCR)的跨膜域中的一种，且第二TCR-TM来源于T细胞受体的另一跨膜域。在一些实施例中，相较于包含T细胞受体跨膜域的TCRM，所述TCRM增强至少一种TCR相关信号传导分子的募集。TCR相关信号传导分子的募集可以通过所属领域中已知的方法测定，所述方法例如针对TCR-CD3复合物表面表达的FACS分析或CD3亚基与caTCR的共免疫沉淀。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含如下抗原结合模块，其包括包含VH抗体域(例如本文所述的VH抗体域)的第一抗原结合域和包含VL抗体域(例如本文所述的VL抗体域)的第二抗原结合域。在一些实施例中，VH抗体域和VL抗体域CDR来源于相同抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，VH抗体域和VL抗体域CDR中的一些来源于不同抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，VH抗体域和/或VL抗体域为人源、人源化、嵌合、半合成或全合成的。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含连接于本文所述的TCRM的本文所述的抗原结合模块，任选地包括稳定化模块。举例来说，在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含连接于TCRD中的一个或两个的N端的抗原结合模块。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含位于TCRM与抗原结合模块之间的稳定化模块。在一些实施例中，抗PSMA caTCR进一步包含位于任两个抗PSMA caTCR模块或域之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包含长度在约5至约70(例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70中的任一个，包括这些值之间的任何范围)个氨基酸之间的一或多个肽接头。在一些实施例中，抗PSMA caTCR进一步包含一或多个辅助胞内域。在一些实施例中，一或多个辅助胞内域位于第一TCRD和/或第二TCRD的羧基端。在一些实施例中，一或多个辅助胞内域位于第一TCR-TM与第一TCR胞内域之间和/或第二TCR-TM与第二TCR胞内域之间。在一些实施例中，一或多个辅助胞内域个别地包含TCR共刺激域。在一些实施例中，TCR共刺激域包含免疫共刺激分子(例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等等)的胞内域的全部或一部分。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含a)抗原结合模块，所述抗原结合模块包含识别细胞表面结合的PSMA的抗体部分(例如本文所述)；和b)T细胞受体模块(TCRM)，所述T细胞受体模块包括包含来源于天然存在的TCR(例如αβTCR或γδTCR)的跨膜域中的一个的第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)、和包含来源于天然存在的TCR(例如αβTCR或γδTCR)的其它跨膜域的第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM促进至少一种TCR相关信号传导分子(例如CD3δε、CD3γε和/或CD3ζζ)的募集且其中所述抗体部分连接于第一和/或第二TCRD。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包括包含VH和CH1抗体域的第一抗原结合域和包含第一TCR亚基的第一跨膜域的第一T细胞受体域(TCRD)；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包括包含VL和CL抗体域的第二抗原结合域和包含第二TCR亚基的第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原结合域的VH和CH1域与第二抗原结合域的VL和CL域形成特异性结合PSMA (例如细胞表面结合的PSMA)的抗原结合模块，且其中第一TCRD与第二TCRD形成能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含如下抗原结合模块，其在CH1域中的残基与CL域中的残基之间包含二硫键。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：a)第一多肽链，所述第一多肽链包括包含VH抗体域的第一抗原结合域和包含第一TCR亚基的第一跨膜域的第一TCRD；和b)第二多肽链，所述第二多肽链包括包含VL抗体域的第二抗原结合域和包含第二TCR亚基的第二跨膜域的第二TCRD，其中第一抗原结合域的VH域与第二抗原结合域的VL域形成特异性结合PSMA (例如细胞表面结合的PSMA)的抗原结合模块，其中第一TCRD与第二TCRD形成能够募集至少一个TCR相关信号传导模块的T细胞受体模块(TCRM)。
示例性抗PSMA caTCR的氨基酸序列提供于下表10A中。每条链1中的抗PSMA VH/CH序列呈纯文本(即，不加下划线)。每条链1中的TCRδ链序列加下划线。每条链2中的抗PSMAVL/CL序列为粗体加下划线。每条链2中的TCRγ链序列呈斜体字。
表10A
Figure BDA0002905287580000551
Figure BDA0002905287580000561
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:31具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:32具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:34具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:35具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。
在一些实施例中，编码示例性抗PSMA caTCR克隆A的核酸表达包含如下氨基酸序列的多肽(具有与表9中所示的标记对应的标记)：
Figure BDA0002905287580000562
在一些实施例中，编码示例性抗PSMA caTCR克隆B的核酸表达包含如下氨基酸序列的多肽(具有与表9中所示的标记对应的标记)：
Figure BDA0002905287580000563
SEQ ID NO:33和36中呈粗体字的序列对应于信号肽和/或自裂解肽。虽然SEQ IDNO:33和36包含特定肽接头，但可以使用任何可裂解接头(参见例如表6A)。
在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR的核酸表达与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:36具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的多肽。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为二价caTCR。在一些实施例中，二价抗PSMAcaTCR为包含两个包含一致VH序列和一致VL序列的抗PSMA抗体部分的同二价抗PSMA caTCR。示例性同二价抗PSMA caTCR的氨基酸序列提供于下表10B中。SEQ ID NO:165包含克隆AscFv和克隆A VH-CH1，且SEQ ID NO:166包含克隆A VL-CL。SEQ ID NO:167包含克隆A VH和克隆A VH-CH1，且SEQ ID NO:168包含克隆A VL和克隆A VL-CL。SEQ ID NO:169包含克隆BscFv VH和克隆B VH-CH1，且SEQ ID NO:170包含克隆A VL-CL。SEQ ID NO:171包含克隆B VH和克隆B VH-CH1，且SEQ ID NO:168包含克隆B VL和克隆B VL-CL。
表10B.
Figure BDA0002905287580000571
Figure BDA0002905287580000581
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:165具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:166具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:167具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:168具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:169具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:170具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:171具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:172具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。
在一些实施例中，编码示例性同二价克隆A抗PSMA caTCR#1的核酸表达包含SEQID NO:47的多肽。
Figure BDA0002905287580000591
在一些实施例中，编码示例性同二价克隆A抗PSMA caTCR#2的核酸表达包含SEQID NO:48的多肽。
Figure BDA0002905287580000592
在一些实施例中，编码示例性同二价克隆B抗PSMA caTCR#1的核酸表达包含SEQID NO:49的多肽。
Figure BDA0002905287580000601
在一些实施例中，编码示例性同二价克隆B抗PSMA caTCR#1的核酸表达包含SEQID NO:50的多肽。
Figure BDA0002905287580000602
虽然SEQ ID NO:47-50包含特定肽接头，但可以使用任何接头(参见例如表6A)。
在一些实施例中，编码同二价抗PSMA caTCR的核酸表达与SEQ ID NO:47-50中的任一个具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的多肽。
在一些实施例中，二价抗PSMA caTCR为包含两个抗PSMA抗体部分的异二价抗PSMAcaTCR，其中每个抗PSMA抗体部分包含不同VH序列和/或不同VL序列。示例性异二价抗PSMAcaTCR的氨基酸序列提供于下表10C中。SEQ ID NO 173包含克隆A scFv和克隆B VH-CH1，且SEQ ID NO:174包含克隆B VL-CL。SEQ ID NO:175包含克隆B VL-CL，且SEQ ID NO:176包含克隆A scFv和B VH-CH1。SEQ ID NO 177包含克隆AVH和克隆B VH-CH1，且SEQ ID NO:178包含克隆A VL和克隆B VL-CL。SEQ ID NO 179包含克隆A VL和克隆B VL-CL，且SEQ ID NO:178包含克隆A VH和克隆B VH-CH1。
表10C
Figure BDA0002905287580000603
Figure BDA0002905287580000611
Figure BDA0002905287580000621
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:173具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:174具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:175具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:176具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:177具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:178具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含与SEQ ID NO:179具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链1和与SEQ ID NO:180具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的链2。
在一些实施例中，编码示例性异二价克隆A/克隆B抗PSMA caTCR#1的核酸表达包含SEQ ID NO:91的多肽。
Figure BDA0002905287580000631
在一些实施例中，编码示例性异二价克隆B/克隆A抗PSMA caTCR#1的核酸表达包含SEQ ID NO:181的多肽。
Figure BDA0002905287580000632
在一些实施例中，编码示例性异二价克隆A/克隆B抗PSMA caTCR#2的核酸表达包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的多肽。
Figure BDA0002905287580000633
在一些实施例中，编码示例性异二价克隆B/克隆A抗PSMA caTCR#2的核酸表达包含氨基酸序列SEQ ID NO:182的多肽。
Figure BDA0002905287580000634
虽然SEQ ID NO:91-92和181-182包含特定肽接头，但可以使用任何接头(参见例如表6A)。
在一些实施例中，编码异二价抗PSMA caTCR的核酸表达与SEQ ID NO:91-92和181-182中的任一个具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的多肽。
虽然上文所论述的包含CH1序列的示例性caTCR包含ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO:122)中阐述的CH1序列，但可以使用替代CH1序列。例如，可以使用包含S64E和S66V突变(EU编号)的ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYELVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO 123)。虽然上文所论述的包含CL序列的示例性caTCR包含GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:124)中阐述的CL序列，即λ轻链的恒定区，但可以使用替代CL序列。例如，可以使用TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:125)，即κ轻链的恒定区，或TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLLSSLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:126)，包含S69L和T71S突变(EU编号)的κ轻链的恒定区。
抗PSMA嵌合共刺激受体构建体(CSR)
本文还提供了PSMA特异性嵌合共刺激受体构建体，其在本文中可替代地称为嵌合信号传导受体构建体(即，“抗PSMA CSR”)。示例性CSRs论述于PCT/US2018/029218(现以WO2018/200583公开)中，其内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，抗PSMA CSR在免疫细胞(例如T细胞)的表面上表达。抗PSMA CSR结合于在细胞(例如癌细胞)的表面上表达或与其表面相关联的PSMA，且在结合于PSMA时，能够刺激上面表达抗PSMA CSR的免疫细胞。抗PSMA CSR包含PSMA结合模块(例如包含本文所述的抗PSMA抗体部分)、跨膜(TM)模块和允许刺激其中或上面表达抗PSMA CSR的免疫细胞的共刺激免疫细胞信号传导模块。在一些实施例中，抗PSMA CSR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，抗PSMA CSR缺乏初级免疫细胞信号传导序列。在一些实施例中，抗PSMA CSR包括包含PSMA结合模块(例如包含本文所述的抗PSMA抗体部分)、跨膜模块和共刺激信号传导模块的单一多肽链。在一些实施例中，抗PSMA CSR包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链与所述第二多肽链一起形成PSMA结合模块(例如包含本文所述的抗PSMA抗体部分)、跨膜模块和共刺激信号传导模块。在一些实施例中，第一多肽链和第二多肽链为单独的多肽链，且抗PSMA CSR为多聚体，例如二聚体。在一些实施例中，第一多肽链与第二多肽链共价连接，例如通过肽键或通过另一种化学键(例如二硫键)连接。在一些实施例中，第一多肽链和第二多肽链通过至少一个二硫键连接。
还提供了表达本公开的抗PSMA CSR的效应细胞(例如T细胞)。这类效应细胞(例如T细胞)通过将编码本文所述的抗PSMA CSR的核酸(或包含这类核酸的载体)引入(例如转导或转染)至效应细胞(例如T细胞)中而产生。
用于抗PSMA CSR的共刺激免疫细胞信号传导域的实例包括(但不限于)可在caTCR啮合后与caTCR共同用以起始信号转导的T细胞受体(TCR)的辅助受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。因此，在一些实施例中，提供了一种表达caTCR和抗PSMA CSR的效应细胞(例如T细胞)。表达caTCR和抗PSMA CSR的效应细胞(例如T细胞)(即，“caTCR加抗PSMA CSR效应细胞”)进一步详细描述于下文中。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全激活T细胞且还需要二级或共刺激信号。因此，可以称T细胞激活是通过两种不同类别的胞内(IC)信号传导序列介导的：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的序列(本文中称为“初级T细胞信号传导序列”)和以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列(本文中称为“共刺激T细胞信号传导序列”)。
以刺激方式起作用的初级免疫细胞信号传导序列可含有信号传导基序，其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM。含ITAM的初级免疫细胞信号传导序列的实例包括来源于CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些序列。“功能性”初级免疫细胞信号传导序列为在与适当受体可操作地偶合时能够转导免疫细胞激活信号的序列。可包含初级免疫细胞信号传导序列的片段或变体的“非功能性”初级免疫细胞信号传导序列不能转导免疫细胞激活信号。因此，在一些实施例中，本文所述的抗PSMACSR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导序列，例如包含ITAM的功能性信号传导序列。在一些实施例中，本文所述的抗PSMA CSR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。
在一些实施例中，抗PSMA CSR包含如下共刺激信号传导模块，所述共刺激信号传导模块包含(例如由以下组成或基本上由以下组成)包括例如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体等等的免疫细胞共刺激分子的胞内(IC)域的全部或一部分。在一些实施例中，CSR包含免疫细胞共刺激分子的片段(fCSM)，其中fCSM包含CSR跨膜(TM)域和CSR胞内(IC)共刺激信号传导域。下文提供了示例性IC共刺激免疫细胞信号传导模块序列：
4-1BB IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000661
Figure BDA0002905287580000662
CD27 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000663
Figure BDA0002905287580000664
CD28 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000665
Figure BDA0002905287580000666
CD30 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000667
OX40 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000668
Figure BDA0002905287580000669
myc标签+截短CD28序列：
Figure BDA00029052875800006610
截短CD28序列：
Figure BDA00029052875800006611
myc标签+截短4-1BB序列：
Figure BDA00029052875800006612
截短4-1BB序列：
Figure BDA00029052875800006613
myc标签+截短CD27序列：
Figure BDA00029052875800006614
截短CD27序列：
Figure BDA00029052875800006615
myc标签+截短CD30序列：
Figure BDA00029052875800006616
截短CD30序列：
Figure BDA00029052875800006617
myc标签+截短OX40序列：
Figure BDA0002905287580000671
截短OX40序列：
Figure BDA0002905287580000672
myc标签+CD8 TM序列和CD27 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000673
CD8 TM序列和CD27 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000674
myc标签+CD8 TM序列和CD30 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000675
CD8 TM序列和CD30 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000676
myc标签+CD8 TM序列和OX40 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000677
CD8 TM序列和OX40 IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000678
myc标签+CD8 TM序列和4-1BB IC信号传导序列：
Figure BDA0002905287580000679
CD8 TM序列和4-1BB IC信号传导序列：
Figure BDA00029052875800006710
在一些实施例中，本公开的抗PSMA CSR的PSMA结合模块为抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，抗PSMA抗体部分为Fab、Fab'、(Fab')2、Fv或单链Fv(scFv)。在一些实施例中，抗PSMA抗体部分包含对PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达或与其表面相关联的PSMA)具有特异性的抗体部分的CDR或可变域(VH和/或VL域)，例如本文中的其它地方描述的抗PSMA抗体部分中的任一个。
在一些实施例中，本公开的抗PSMA CSR的跨膜模块包含来源于例如CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的一或多个跨膜域。在一些实施例中，CSR包含跨膜蛋白的片段(fTMP)，其中fTMP包含CSR跨膜域。下文提供示例性跨膜域(TM)序列：
CD8 TM序列：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:94)
4-1BB TM序列：IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:95)
CD27 TM序列：ILVIFSGMFLVFTLAGALFLH(SEQ ID NO:96)
CD28 TM序列：FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:97)
CD30 TM序列：PVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLC(SEQ ID NO:98)
OX40 TM序列：VAAILGLGLVLGLLGPLAILL(SEQ ID NO:99)
在一些实施例中，抗PSMA CSR进一步包含位于配体结合模块、跨膜模块和共刺激信号传导模块中的任一个之间的间隔模块。在一些实施例中，间隔模块包含连接两个CSR模块的一或多个肽接头。在一些实施例中，间隔模块包含长度在约5至约70(例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70中的任一个，包括这些值之间的任何范围)个氨基酸之间的一或多个肽接头。
示例性抗PSMA CSR的氨基酸序列提供于下表11中。抗PSMA序列呈纯文本(即，不加下划线)，且来源于CD28(参见SEQ ID NO:37-38、51-55和70)、4-1BB(参见SEQ ID NO:56、57、71和72)、CD27(参见SEQ ID NO:58、59、73和74)、CD30(参见SEQ ID NO:60、61、75和76)、OX40(参见SEQ ID NO:62、63、77和78)、CD8和CD27(参见SEQ ID NO:64、65、79和80)、CD8和CD30(参见SEQ ID NO:66、67、81和82)、CD8和OX40(参见SEQ ID NO:68、69、83和84)的序列加下划线。
表11
Figure BDA0002905287580000681
Figure BDA0002905287580000691
Figure BDA0002905287580000701
Figure BDA0002905287580000711
Figure BDA0002905287580000721
Figure BDA0002905287580000731
表11中呈粗体字的序列对应于myc标签EQKLISEEDL(SEQ ID NO:136)。表11中呈粗斜体字的序列对应于信号肽METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:128)。
在一些实施例中，CSR为包含两个抗PSMA抗体部分的二价抗PSMA CSR。在一些实施例中，二价抗PSMA CSR为同二价，例如包含两个包含相同VH序列和相同VL序列的抗PSMA抗体部分。在一些实施例中，二价抗PSMA CSR为异二价，例如包含两个抗PSMA抗体部分，其中每个抗PSMA抗体部分包含不同VH序列和不同VL序列。四个示例性异二价抗PSMA CSR的氨基酸序列展示如下(即，SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:183-185)。克隆A抗PSMA scFv序列呈纯文本(即，不加下划线)，克隆B抗PSMA scFv加下划线，连接序列呈粗体文本，myc标签序列(当存在时)呈粗体文本且加下划线，且来源于CD28的序列为斜体。
Figure BDA0002905287580000732
Figure BDA0002905287580000741
Figure BDA0002905287580000742
Figure BDA0002905287580000743
在一些实施例中，SEQ ID NO:37-38、55-84和93中的任一个进一步包含N端信号肽，例如SEQ ID NO:128的信号肽。在一些实施例中，SEQ ID NO:37-38、51-84和93中的任一个进一步包含肽接头和/或肽标签(参见例如表6A和6B)。在一些实施例中，抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:37-38、51-84和93中的任一个具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。
本公开还提供了表达caTCR或CAR和抗PSMA CSR(例如本文所述的抗PSMA CSR)的效应细胞(例如T细胞)。这类效应细胞在本文中又称为“caTCR加抗PSMA CSR效应细胞”。在一些实施例中，caTCR加抗PSMA CSR效应细胞(例如T细胞)包含编码可操作地连接于诱导型启动子，包括本文所述的任一诱导型启动子的抗PSMA CSR的核酸序列。在一些实施例中，抗PSMA CSR在caTCR加抗PSMA CSR效应细胞(例如T细胞)中的表达在通过caTCR传导信号时为诱导性的。在一些这些实施例中，caTCR加抗PSMA CSR效应细胞(例如T细胞)包含编码可操作地连接于启动子或对通过caTCR传导信号起反应的调控组件的抗PSMA CSR的核酸序列。在一些实施例中，编码抗PSMA CSR的核酸序列可操作地连接于激活的T细胞(NFAT)衍生的启动子的核因子。在一些实施例中，NFAT衍生的启动子为NFAT衍生的最小启动子(参见例如杜兰德(Durand,D.)等人，《分子与细胞生物学(Molec.Cell.Biol.)》8,1715-1724(1988)；利斯顿(Clipstone,NA),克拉布特里(Crabtree,GR.)《自然》.1992 357(6380):695-7；赫梅莱夫斯基(Chmielewski,M.)等人，《癌症研究(Cancer research)》71.17(2011):5697-5706；和张(Zhang,L.)等人，《分子治疗(Molecular therapy)》19.4(2011):751-759)。在一些实施例中，由caTCR加抗PSMA CSR效应细胞(例如T细胞)表达的caTCR为抗PSMA caTCR。在一些实施例中，由caTCR加抗PSMA CSR效应细胞(例如T细胞)表达的caTCR不为抗PSMAcaTCR且靶向不同抗原。CSR的进一步描述可见于2017年4月26日提出的美国申请第62/490,578号中，其以全文引用的方式并入本文中。
构建体组合
还提供了包含至少两种本文所述的不同抗PSMA构建体的构建体组合。在一些实施例中，所述至少两种不同抗PSMA构建体为相同格式，例如至少两种不同抗体(例如两种不同全长IgG抗体或两种不同双特异性抗体)、至少两种不同CAR、至少两种不同caTCR或至少两种不同CSR。在一些实施例中，至少两种不同抗PSMA构建体为不同格式，例如抗体和CAR；抗体和caTCR；CAR和CSR；caTCR和CSR等。
在一些实施例中，构建体组合包含抗PSMA caTCR和抗PSMA CSR(即，“抗PSMAcaTCR+抗PSMA CSR构建体组合”)，其中抗PSMA caTCR包含：
包含与SEQ ID NO:31具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:32具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:35具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:165具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:166具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:167具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:168具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:169具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:170具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:171具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:172具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:173具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:174具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:175具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:176具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:177具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:178具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
包含与SEQ ID NO:179具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:180具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2；
且其中所述抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:37-38、55-84和93中的任一个具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：包含与SEQ ID NO:31具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:32具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:55具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:31的链1和包含SEQ ID NO:32的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：包含与SEQ ID NO:31具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:32具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:70具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:31的链1和包含SEQ ID NO:32的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：包含与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:35具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:55具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:34的链1和包含SEQ ID NO:35的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR包含：包含与SEQ ID NO:34具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:35具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:70具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:34的链1和包含SEQ ID NO:35的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为同二价抗PSMA caTCR，其包含：包含与SEQ IDNO:165具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:166具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:70具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:165的链1和包含SEQ ID NO:166的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为同二价抗PSMA caTCR，其包含：包含与SEQ IDNO:165具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:166具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:38和70-84中的任一个具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:165的链1和包含SEQ ID NO:166的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:38和70-84中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为同二价抗PSMA caTCR，其包含：包含与SEQ IDNO:169具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:170具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:55具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:169的链1和包含SEQ ID NO:170的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为同二价抗PSMA caTCR，其包含：包含与SEQ IDNO:169具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:170具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:37和55-69中的任一个具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:169的链1和包含SEQ ID NO:170的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:37和55-69中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为同二价抗PSMA caTCR，其包含：包含与SEQ IDNO:167具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:168具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:38和70-84中的任一个具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:167的链1和包含SEQ ID NO:168的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:38和70-84中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR为同二价抗PSMA caTCR，其包括包含与SEQ IDNO:171具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链1和包含与SEQ ID NO:172具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列的链2，且抗PSMA CSR包含与SEQ ID NO:37和55-69中的任一个具有至少85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一个)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA caTCR包括包含SEQ ID NO:171的链1和包含SEQ ID NO:172的链2，且抗PSMA CSR包含SEQ ID NO:37和55-69中的任一个的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文提供的构建体组合的抗PSMA caTCR和抗PSMA CSR在单独的核酸上编码。在一些实施例中，单独的核酸各自在细胞(例如抗PSMA效应细胞，在本文中的其它地方进一步详细描述)中表达(例如分别)和翻译(例如分别)。在一些实施例中，本文提供的构建体组合的抗PSMA caTCR和抗PSMA CSR在相同核酸(例如单一核酸)上编码。在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR和抗PSMA CSR构建体组合的单一核酸进行表达和翻译，产生单一多肽，随后被加工(例如例如在翻译期间或的后裂解)成单独的多肽，例如抗PSMAcaTCR多肽和抗PSMA CSR多肽。
在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的单一核酸表达包含SEQ ID NO:85-90中的任一个的多肽，其氨基酸序列在下文提供：
Figure BDA0002905287580000801
Figure BDA0002905287580000811
Figure BDA0002905287580000821
在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的单一核酸表达与SEQ ID NO:91-92和181-182中的任一个具有至少约85％(例如至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列一致性的多肽。
在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的单一核酸表达包含(从N端至C端)抗PSMA caTCR构建体的氨基酸序列、肽接头和抗PSMA CSR构建体的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的单一核酸表达包含(从N端至C端)抗PSMA CSR构建体的氨基酸序列、肽接头和抗PSMA caTCR构建体的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，核酸进一步编码例如一或多个肽接头、肽间隔子、肽标签、信号肽和/或其它氨基酸序列(示例性连接序列和标签序列参见例如表6A和6B)。
在一些实施例中，编码抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的单一核酸表达包含下表12中第1-128行中的每一行中所列序列的多肽。
表12
Figure BDA0002905287580000822
Figure BDA0002905287580000831
Figure BDA0002905287580000841
Figure BDA0002905287580000851
Figure BDA0002905287580000861
Figure BDA0002905287580000871
Figure BDA0002905287580000881
Figure BDA0002905287580000891
Figure BDA0002905287580000901
Figure BDA0002905287580000911
在一些实施例中，编码表12中第1-128行中的任一行的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR的单一核酸进一步编码信号肽(例如位于编码caTCR的链1和/或链2的序列上游和/或编码抗PSMA CSR的序列上游)。在一些实施例中，信号肽包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列。虽然特定接头在表12中的第1-128行中列出，但可以使用替代接头(参见例如表6A)。在一些实施例中，编码表12中第1-128行中的任一个的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR的单一核酸进一步编码一或多个肽接头(例如可裂解接头)和/或肽标签(参见例如表6A和6B)。
抗PSMA效应细胞
本文提供了一种效应细胞(例如免疫细胞，例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)，其包含、表达本文所述的抗PSMA CAR、抗PSMAcaTCR、抗PSMA多特异性构建体(例如串联scFv，例如串联双scFv)、抗PSMA CSR或抗PSMA构建体组合或与之相关联。这类细胞又称为“抗PSMA效应细胞”。
在一些实施例中，本公开的抗PSMA效应细胞(在本文中又称为“抗PSMA免疫细胞”或“抗PSMA T细胞”)能够在体内复制，具有长期持久性，因此可持续控制与PSMA相关的疾病(例如癌症，例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)。
在一些实施例中，抗PSMA效应细胞(例如淋巴细胞，例如T细胞)包含(例如表达)为包含、表达本文所述的抗PSMA CAR或与其相关联的抗PSMA CAR效应细胞。在一些实施例中，抗PSMA CAR效应细胞进一步包含(例如表达)多特异性构建体。这类效应细胞在本文中称为“抗PSMA CAR加多特异性构建体效应细胞”。在一些实施例中，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，在通过抗PSMA CAR传导信号后，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，多特异性构建体选自由以下组成的群组：串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体和双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，多特异性构建体为串联scFv。这类效应细胞在本文中又称为“抗PSMA CAR加串联scFv效应细胞”。在一些实施例中，串联scFv为串联双scFv，例如包含任选地由肽接头连接的第一scFv和第二scFv的串联双scFv。在一些实施例中，第一scFv靶向T细胞表面抗原(例如CD3或CD16a)、可溶性免疫抑制剂(例如TGF-β1至4、IL-4或IL-10)或免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，第二scFv靶向疾病相关抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为除PSMA外的抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为PSMA。在一些实施例中，串联双scFv为包含特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗体部分(例如本文所述)和特异性结合CD3的第二结合部分的抗PSMA抗CD3串联双scFv。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv包含SEQ ID NO:25-28中的任一个中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于NFAT来源启动子的核酸编码。在一些实施例中，NFAT来源启动子为NFAT来源最小启动子。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于IL-2启动子的核酸编码。
在一些实施例中，抗PSMA CAR效应细胞进一步包含(例如表达)CSR(参见例如2017年4月26日提出的美国申请第62/490,578号，其以全文引用的方式并入本文中)。这类效应细胞称为“抗PSMA CAR加CSR效应细胞”。在一些实施例中，CSR为抗PSMA CSR(即，包含PSMA结合模块的CSR)，例如例如本文所述。在一些实施例中，CSR结合于除PSMA外的目标配体。
在一些实施例中，抗PSMA效应细胞(例如淋巴细胞，例如T细胞)包含(例如表达)为包含、表达本文所述的抗PSMA caTCR或与其相关联的抗PSMA caTCR效应细胞。在一些实施例中，抗PSMA caTCR效应细胞包含(例如表达)多特异性构建体。这类效应细胞在本文中称为“抗PSMA caTCR加多特异性构建体效应细胞”。在一些实施例中，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，在通过抗PSMA caTCR传导信号后，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，多特异性构建体选自由以下组成的群组：串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体和双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，多特异性构建体为串联scFv。这类效应细胞在本文中又称为“抗PSMA caTCR加串联scFv效应细胞”。在一些实施例中，串联scFv为串联双scFv，例如包含任选地由肽接头连接的第一scFv和第二scFv的串联双scFv。在一些实施例中，第一scFv靶向T细胞表面抗原(例如CD3或CD16a)、可溶性免疫抑制剂(例如TGF-β1至4、IL-4或IL-10)或免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，第二scFv靶向疾病相关抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为除PSMA外的抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为PSMA。在一些实施例中，串联双scFv为包含特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗体部分(例如本文所述)和特异性结合CD3的第二结合部分的抗PSMA抗CD3串联双scFv。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv包含SEQ ID NO:25-28中的任一个中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于NFAT来源启动子的核酸编码。在一些实施例中，NFAT来源启动子为NFAT来源最小启动子。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于IL-2启动子的核酸编码。
在一些实施例中，抗PSMA caTCR效应细胞包含(例如表达)CSR(参见例如2017年4月26日提出的美国申请第62/490,578号，其以全文引用的方式并入本文中)。这类效应细胞称为“抗PSMA caTCR加CSR效应细胞”。在一些实施例中，CSR为抗PSMA CSR(即，包含PSMA结合模块的CSR)，例如例如本文所述。在一些实施例中，CSR结合于除PSMA外的目标配体。在一些实施例中，抗PSMA caTCR加CSR效应细胞包含(例如表达)本文中的其它地方所述的抗PSMA caTCR加抗PSMA CSR构建体组合中的任一种。
在一些实施例中，效应细胞(例如淋巴细胞，例如T细胞)包含不靶向PSMA的CAR或caTCR和例如本文所述的抗PSMA多特异性构建体(即，抗PSMA串联scFv，例如抗PSMA串联双scFv)。在一些实施例中，效应细胞称为“CAR加抗PSMA串联scFv效应细胞”或“caTCR加抗PSMA串联scFv效应细胞”。
一些实施例中，效应细胞(例如淋巴细胞，例如T细胞)包含不靶向PSMA的CAR或caTCR和例如本文所述的抗PSMA CSR(即，包含PSMA结合模块的CSR)。在一些实施例中，效应细胞称为“CAR加抗PSMA CSR效应细胞”或“caTCR加抗PSMA CSR效应细胞”。
本文还提供了产生本文所述的效应细胞的方法。
举例来说，提供了一种产生抗PSMA CAR效应细胞、例如抗PSMA CAR免疫细胞或抗PSMA CAR T细胞的方法，其包含用编码抗PSMA CAR的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染)。
在一些实施例中，所述方法包含用编码多特异性构建体的另一核酸、核酸集合、载体或载体集合对抗PSMA CAR效应细胞进行基因修饰。在一些实施例中，产生抗PSMA CAR加多特异性构建体效应细胞(例如“抗PSMA CAR加串联scFv效应细胞”)的方法包含用编码抗PSMA caTCR和多特异性构建体的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染)。在一些实施例中，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，在通过抗PSMA CAR传导信号后，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，多特异性构建体选自由以下组成的群组：串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体和双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，多特异性构建体为串联scFv。这类效应细胞在本文中又称为“抗PSMA caTCR加串联scFv效应细胞”。在一些实施例中，串联scFv为串联双scFv，例如包含任选地由肽接头连接的第一scFv和第二scFv的串联双scFv。在一些实施例中，第一scFv靶向T细胞表面抗原(例如CD3或CD16a)、可溶性免疫抑制剂(例如TGF-β1至4、IL-4或IL-10)或免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，第二scFv靶向疾病相关抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为除PSMA外的抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为PSMA。在一些实施例中，串联双scFv为包含特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗体部分(例如本文所述)和特异性结合CD3的第二结合部分的抗PSMA抗CD3串联双scFv。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv包含SEQ ID NO:25-28中的任一个中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于NFAT来源启动子的核酸编码。在一些实施例中，NFAT来源启动子为NFAT来源最小启动子。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于IL-2启动子的核酸编码。
在一些实施例中，所述方法包含用编码包含特异性结合于目标配体的配体结合域和能够向免疫细胞提供刺激信号的共刺激信号传导域的CSR的另一核酸、核酸集合、载体或载体集合对抗PSMA CAR效应细胞进行基因修饰。在一些实施例中，产生抗PSMA CAR加CSR效应细胞的方法包含用编码抗PSMA CAR和CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染)。关于CSR的其它细节描述于2017年4月26日提出的美国申请第62/490,578号中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，在通过抗PSMA CAR传导信号后，CSR的表达为诱导性的。在一些实施例中，CSR为抗PSMA CSR(即，包含PSMA结合模块的CSR)，例如例如本文所述。在一些实施例中，CSR结合于除PSMA外的目标配体。
还提供了一种产生抗PSMA caTCR效应细胞，例如抗PSMA caTCR免疫细胞或抗PSMAcaTCR T细胞的方法，其包含用编码抗PSMA caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染)。
在一些实施例中，所述方法包含用编码多特异性构建体的另一核酸、核酸集合、载体或载体集合对抗PSMA caTCR效应细胞进行基因修饰。在一些实施例中，产生抗PSMAcaTCR加多特异性构建体效应细胞(例如“抗PSMA caTCR加串联scFv效应细胞”)的方法包含用编码抗PSMA caTCR和多特异性构建体的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染)。在一些实施例中，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，在通过抗PSMA caTCR传导信号后，多特异性构建体的表达为诱导性的。在一些实施例中，多特异性构建体选自由以下组成的群组：串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体和双可变域(DVD)抗体。在一些实施例中，多特异性构建体为串联scFv。这类效应细胞在本文中又称为“抗PSMA caTCR加串联scFv效应细胞”。在一些实施例中，串联scFv为串联双scFv，例如包含任选地由肽接头连接的第一scFv和第二scFv的串联双scFv。在一些实施例中，第一scFv靶向T细胞表面抗原(例如CD3或CD16a)、可溶性免疫抑制剂(例如TGF-β1至4、IL-4或IL-10)或免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，第二scFv靶向疾病相关抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为除PSMA外的抗原。在一些实施例中，疾病相关抗原为PSMA。在一些实施例中，串联双scFv为包含特异性结合PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA)的抗体部分(例如本文所述)和特异性结合CD3的第二结合部分的抗PSMA抗CD3串联双scFv。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv包含SEQ ID NO:25-28中的任一个中所阐述的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于NFAT来源启动子的核酸编码。在一些实施例中，NFAT来源启动子为NFAT来源最小启动子。在一些实施例中，抗PSMA抗CD3串联双scFv由可操作地连接于IL-2启动子的核酸编码。
在一些实施例中，所述方法包含用编码包含特异性结合于目标配体的配体结合域和能够向免疫细胞提供刺激信号的共刺激信号传导域的CSR的另一核酸、核酸集合、载体或载体集合对抗PSMA caTCR效应细胞进行基因修饰。在一些实施例中，产生抗PSMA caTCR加CSR效应细胞的方法包含用编码抗PSMA caTCR和CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染)。关于CSR的其它细节描述于2017年4月26日提出的美国申请第62/490,578号中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，在通过抗PSMAcaTCR传导信号后，CSR的表达为诱导性的。在一些实施例中，CSR为抗PSMA CSR(即，包含PSMA结合模块的CSR)，例如例如本文所述。在一些实施例中，CSR结合于除PSMA外的目标配体。
在一些实施例中，所述方法包含用编码例如本文所述的抗PSMA多特异性构建体(即，抗PSMA串联scFv，例如抗PSMA串联双scFv)的其它核酸、核酸集合、载体或载体集合对包含编码不靶向PSMA的CAR或caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合的细胞(例如淋巴细胞，例如T细胞)进行基因修饰。在一些实施例中，所述方法包含用编码不靶向PSMA的CAR或caTCR和抗PSMA多特异性构建体(即，抗PSMA串联scFv，例如抗PSMA串联双scFv)的核酸、核酸集合、载体或载体集合对效应细胞进行基因修饰。
在一些实施例中，所述方法包含用编码例如本文所述的抗PSMA CSR(即，包含PSMA结合模块的CSR)的其它核酸、核酸集合、载体或载体集合对包含编码不靶向PSMA的CAR或caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合的细胞(例如淋巴细胞，例如T细胞)进行基因修饰。在一些实施例中，所述方法包含用编码不靶向PSMA的CAR或caTCR和抗PSMA CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合对效应细胞进行基因修饰。
简单地说，在细胞(例如T细胞)扩增和基因修饰之前，从个体获得T细胞来源。举例来说，T细胞可以从许多来源，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、肋膜积液、脾组织和肿瘤获得。在一些实施例中，可以使用多种在所属领域中可用的T细胞系。在一些实施例中，T细胞可以从使用所属领域的技术人员已知的多项技术(例如FicollTM分离)从个体收集的血液单元获得。在一些实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，通过单采血液成分术收集的细胞可以进行洗涤以去除血浆部分并将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一些实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些实施例中，洗涤溶液缺乏钙且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。如一般技术者将易于了解，洗涤步骤可以通过所属领域的技术人员已知的方法实现，例如通过根据制造商说明书使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、BaxterCytoMate或Haemonetics细胞保存器5)。在洗涤之后，细胞可再悬浮于多种生物相容性缓冲剂中，如无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyte A或其它具有或不具有缓冲剂的生理盐水溶液。或者，可去除单采血液成分术样品的非所要组分且细胞直接再悬浮于培养基中。
在一些实施例中，通过溶解红细胞和例如通过经PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析耗尽单核细胞而从外周血淋巴细胞分离T细胞。T细胞的特定亚群(例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞)可以通过阳性选择或阴性选择技术进一步分离。举例来说，在一些实施例中，T细胞通过与抗CD3/抗CD28(即3×28)结合珠粒，例如
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M-450CD3/CD28 T一起培育持续足以对所需T细胞进行阳性选择的时段而分离。在一些实施例中，时段为约30分钟。在一些实施例中，时段在30分钟至36小时或更长和其间所有整数值的范围内。在一些实施例中，时段为至少1、2、3、4、5或6小时。在一些实施例中，时段为10至24小时。在一些实施例中，培育时段为24小时。为从患有白血病的患者分离T细胞，使用较长培育时间(例如24小时)可提高细胞产量。在相较于其它细胞类型存在极少T细胞的任何情况下可使用较长培育时间来分离T细胞，例如从肿瘤组织或免疫功能不全个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，使用较长培育时间可提高CD8+T细胞的捕捉效率。因此，只通过缩短或延长允许T细胞结合于CD3/CD28珠粒的时间和/或通过增加或减小珠粒与T细胞的比率，可在培养开始时或工艺期间的其它时间点优先选择或淘汰T细胞亚群。此外，通过增加或降低珠粒或其它表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可在培养开始时或其它所要时间点优先选择或淘汰T细胞子群。所属领域的技术人员将认识到还可以使用多轮选择。在一些实施例中，可能需要进行选择程序且在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞还可以进行其它多轮选择。
通过阴性选择来富集T细胞群体可使用针对阴性选择细胞所独有的表面标志物的抗体组合来实现。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述方法使用针对阴性选择细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。举例来说，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD 14、CD20、CD11b、CD 16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施例中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。或者，在一些实施例中，T调节细胞通过抗CD25结合珠粒或其它类似选择方法耗尽。
为了通过阳性选择或阴性选择来分离所要细胞群体，细胞浓度和表面(例如粒子，例如珠粒)可以变化。在一些实施例中，可能需要显著减小珠粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒最大程度接触。举例来说，在一些实施例中，使用约20亿个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用约10亿个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用大于约1亿个细胞/毫升。在一些实施例中，使用约10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000中的任一数目个细胞/毫升的细胞浓度。在一些实施例中，使用约75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000中的任一数目个细胞/毫升的浓度。在一些实施例中，使用约125,000,000或约150,000,000个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可增加细胞产量、细胞激活和细胞扩展。另外，使用高细胞浓度允许更有效地捕捉可能微弱表达所关注的目标抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这类细胞群体可能具有治疗价值且将需要获得。举例来说，使用高细胞浓度允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，T细胞直接从治疗之后的患者获得。就此来说，已观测到在某些癌症治疗之后，尤其使用破坏免疫系统的药物治疗之后，在治疗之后不久在患者通常将从治疗恢复的时段期间，获得的T细胞质量可最佳或其离体扩增的能力得到改良。同样，在使用本文所描述的方法离体操纵之后，这些细胞可呈移植和体内扩增增强的优选状态。因此，在本公开的上下文内，预期在此回收期期间收集包括T细胞、树突状细胞或造血谱系的其它细胞在内的血细胞。此外，在一些实施例中，移动(例如用GM-CSF移动)和调节方案可用于建立个体内的条件，其中尤其在治疗之后的界定时间窗期间宜进行特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增。说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞和免疫系统的其它细胞。
无论在任选地用CSR(例如抗PSMA CSR)或串联scFv(例如抗PSMA串联scFv)对T细胞进行基因修饰以表达例如抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR之前还是之后，一般都可以使用如例如以下所描述的方法激活T细胞并扩增：美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；和美国专利申请公开案第20060121005号。
一般来说，本文所述的进行基因修饰的细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)通过与附接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增。详细地说，T细胞群体可例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定于表面上的抗CD2抗体接触，或通过同与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓虫素)接触而刺激。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。举例来说，T细胞群体可与抗CD3抗体和抗CD28抗体在适于刺激T细胞增殖的条件下接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。可使用的抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松的戴亚克隆(Diaclone,
Figure BDA0002905287580000991
France))，还可以使用所属领域中通常已知的其它方法(贝格(Berg)等人，《移植学会会报(Transplant Proc.)》30(8):3975-3977,1998；哈宁(Haanen)等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190(9):13191328,1999；格雷(Garland)等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)》227(1-2):53-63,1999)。
免疫结合物和其制备
本文还提供了包含抗PSMA构建体(例如本文所述)附接至效应分子的免疫结合物(“抗PSMA免疫结合物”)。在一些实施例中，效应分子为治疗剂，如癌症治疗剂(或化学治疗剂)，或具有细胞毒性的、抑制细胞生长或以其它方式提供一些治疗效益的毒素。在一些实施例中，效应分子为标记(例如直接或间接产生可检测信号的标记)。
包含治疗剂的抗PSMA免疫结合物(又称为“抗体-药物结合物”或“ADC”)可用于局部递送细胞毒性或细胞生长抑制剂，即杀死或抑制在癌症治疗期间增殖的肿瘤细胞的药物。药物部分靶向递送至表达或过度表达PSMA的细胞(例如癌细胞)允许治疗剂在细胞内累积。参见例如希里格斯(Syrigos)和埃佩内托斯(Epenetos),《抗癌研究(AnticancerResearch)》19:605-614(1999)；尼库雷斯库.杜瓦兹(Niculescu-Duvaz)和施普林格(Springer),《先进药物输送评论(Adv.Drg.Del.Rev.)》26:151-172(1997)；美国专利第4,975,278号。相比之下，全身施用未结合的治疗剂可引起对正常细胞以及设法消除的目标细胞来说不可接受的毒性水平(鲍德温(Baldwin)等人，《柳叶刀(Lancet)》(1986年3月15日):603-605(1986)；索普(Thorpe),(1985)“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载剂：回顾(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review)”,《单克隆抗体'84：生物和临床应用(Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications)》,平凯拉(A.Pinchera)等人(编辑),第475-506页)。由此寻求功效最大、毒性最小。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和例如(但不限于)例如道诺霉素(daunomycin)、小红莓(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或长春地辛(vindesine)的化学治疗剂(罗兰德(Rowland)等人，《癌症免疫学与免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)》21:183-187(1986))。在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒素)、小分子毒素(例如格尔德霉素(geldanamycin)(曼德勒(Mandler)等人，《国立癌症研究所杂志(J.Nat.Cancer Inst.)》92(19):1573-1581(2000)；曼德勒等人，《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)》10:1025-1028(2000)；曼德勒等人，《生物共轭化学(BioconjugateChem.)》13:786-791(2002))、类美登素(maytansinoid)(EP 1391213；刘(Liu)等人，《美国国家科学院院刊》93:8618-8623(1996))、卡奇霉素(calicheamicin)(罗德(Lode)等人，《癌症研究(Cancer Res.)》58:2928(1998)；欣曼(Hinman)等人，《癌症研究》53:3336-3342(1993))、海兔毒素(dolastatin)、奥利斯他汀(aurostatin)、单端孢霉烯族毒素(trichothecene)、CC1065或展现毒素活性的其衍生物。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和酶促活性毒素(或展现毒素活性的其片段)。这类酶促毒素包括(但不限于)例如白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白(例如PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)或霉菌毒素(tricothecene)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和具有细胞内活性的治疗剂。在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物被内化并且具有细胞内活性的治疗剂为阻断细胞中的蛋白质合成、由此引起细胞死亡的细胞毒素。阻断蛋白质合成(例如通过核糖体失活)的示例性毒素包括(但不限于)例如白树素(gelonin)、波甘宁(bouganin)、沙泊宁(saporin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、榄香胶素(bryodin)、白喉毒素、局限曲菌素、绿脓杆菌外毒素A和其变体。在一些实施例中，包含阻断细胞中的蛋白质合成的细胞毒素的抗PSMA免疫结合物在结合于目标细胞时必须被内化以使蛋白质对细胞来说具有细胞毒性。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和抑制DNA合成的治疗剂。抑制DNA合成/DNA复制的示例性治疗剂包括(但不限于)例如烯二炔(例如卡奇霉素和埃斯培拉霉素(esperamicin))和非烯二炔小分子药剂(例如博来霉素(bleomycin)、甲锭丙基-EDTA-Fe(II))。根据本申请适用的其它癌症治疗剂包括(但不限于)道诺霉素、小红莓、偏端霉素(distamycin)A、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素C、海鞘素(ecteinascidin)、倍癌霉素(duocarmycin)/CC-1065和博来霉素/培洛霉素(pepleomycin)。在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含本文所述的抗PSMA抗体部分和具有核分解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含本文所述的抗PSMA抗体部分和结合微管或微管蛋白的药剂。在一些实施例中，结合微管或微管蛋白的药剂使微管细胞骨架稳定以对抗解聚。或者，在一些实施例中，结合微管或微管蛋白的药剂抑制微管蛋白聚合。这类治疗剂包括(但不限于)例如根瘤菌素/美登素(rhizoxin/maytansine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、奥瑞他汀海兔毒素10MMAE(auristatin dolastatin 10MMAE)和派罗苷A(peloruside A)。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和烷基化剂，例如但不限于例如Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安(Busulfan)NSC 750、羧基邻苯二甲酸铂NSC 271674、CBDCA NSC 241240、CCNU NSC 79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥(chlorambucil)NSC 3088、氯脲菌素(chlorozotocin)NSC178248、顺铂NSC 119875、氯乙矾(clomesone)NSC 338947、氰基(N-吗啉基)小红莓NSC357704、塞迪逊(cyclodisone)NSC 348948、卫康醇(dianhydrogalactitol)NSC 132313、氟多潘(fluorodopan)NSC 73754、海普法姆(hepsulfam)NSC 329680、羟胺硫蒽酮(hycanthone)NSC 142982、美法仑(melphalan)NSC 8806、甲基CCNU NSC 95441、丝裂霉素CNSC 26980、米托唑酰胺NSC 353451、氮芥NSC 762、PCNU NSC 95466、哌嗪NSC 344007、哌嗪二酮NSC 135758、哌泊溴烷(pipobroman)NSC25154、泊非罗霉素(porfiromycin)NSC56410、螺乙内酰脲芥(spirohydantoin mustard)NSC172112、替罗昔隆(teroxirone)NSC296934、四铂NSC 363812、噻替派(thio-tepa)NSC6396、三亚乙基三聚氰胺NSC 9706、尿嘧啶氮芥NSC 34462和Yoshi-864 NSC 102627。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含本文所述的抗PSMA抗体部分和抗有丝分裂剂，包括(但不限于)例如别秋水仙碱(allocolchicine)NSC 406042、软海绵素(Halichondrin)B NSC 609395、秋水仙碱NSC 757、秋水仙碱衍生物NSC 33410、海兔毒素10NSC 376128(NG-奥瑞他汀衍生物)、美登素NSC 153858、根瘤菌素NSC 332598、紫杉醇NSC125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫代秋水仙碱NSC 361792、三苯甲基半胱氨酸NSC83265、硫酸长春碱NSC 49842和硫酸长春新碱NSC 67574。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和拓朴异构酶I抑制剂，例如喜树碱(camptothecin)NSC 94600、喜树碱、Na盐NSC 100880、氨基喜树碱NSC 603071、喜树碱衍生物NSC 95382、喜树碱衍生物NSC 107124、喜树碱衍生物NSC643833、喜树碱衍生物NSC 629971、喜树碱衍生物NSC 295500、喜树碱衍生物NSC 249910、喜树碱衍生物NSC 606985、喜树碱衍生物NSC 374028、喜树碱衍生物NSC 176323、喜树碱衍生物NSC 295501、喜树碱衍生物NSC 606172、喜树碱衍生物NSC 606173、喜树碱衍生物NSC610458、喜树碱衍生物NSC 618939、喜树碱衍生物NSC 610457、喜树碱衍生物NSC 610459、喜树碱衍生物NSC 606499、喜树碱衍生物NSC 610456、喜树碱衍生物NSC 364830、喜树碱衍生物NSC 606497和吗啉基阿霉素NSC 354646。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和拓朴异构酶II抑制剂，例如但不限于例如小红莓NSC 123127、氨萘非特(amonafide)NSC308847、m-AMSA NSC 249992、蒽吡唑衍生物NSC 355644、派拉瑞丁(pyrazoloacridine)NSC366140、盐酸比山群(bisantrene HCL)NSC 337766、道诺霉素NSC 82151、脱氧小红莓NSC267469、米托蒽醌(mitoxantrone)NSC 301739、美诺立尔(menogaril)NSC269148、N,N-二苯甲基道诺霉素NSC 268242、氧杂蒽唑(oxanthrazole)NSC 349174、柔红霉素苯腙(rubidazone)NSC 164011、VM-26NSC 122819和VP-16NSC 141540。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和RNA或DNA抗代谢物，例如但不限于L-丙氨菌素(L-alanosine)NSC 153353、5-氮杂胞苷(5-azacytidine)NSC 102816、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)NSC 19893、阿西维辛(acivicin)NSC 163501、氨基蝶呤衍生物NSC 132483、氨基蝶呤衍生物NSC 184692、氨基蝶呤衍生物NSC 134033、抗叶酸剂NSC 633713、抗叶酸剂NSC 623017、贝氏(Baker's)可溶性抗叶酸剂NSC 139105、二氯烯丙基指甲花醌NSC 126771、布喹那(brequinar)NSC368390、替加氟(ftorafur)(前药)NSC 148958、5,6-二氢-5-氮杂胞苷NSC 264880、甲氨蝶呤NSC 740、甲氨蝶呤衍生物NSC 174121、N-(膦酰乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)NSC224131、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)NSC 143095、曲美沙特(trimetrexate)NSC 352122、3-HP NSC 95678、2'-脱氧-5-氟尿苷NSC 27640、5-HP NSC 107392、α-TGDR NSC 71851、甘氨酸阿非迪霉素NSC303812、ara-C NSC 63878、5-氮杂-2'-脱氧胞苷NSC 127716、β-TGDR NSC 71261、环胞苷NSC 145668、胍唑NSC 1895、羟基脲NSC 32065、肌苷乙醇醛NSC 118994、麦克菌素(macbecin)Il NSC 330500、吡唑并咪唑NSC 51143、硫鸟嘌呤(thioguanine)NSC 752和硫代嘌呤(thiopurine)NSC 755。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和放射性同位素。多种放射性同位素为所属领域中所众所周知的且用于产生放射性结合多肽。实例包括(但不限于)例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和用于肿瘤预靶向的“受体”(例如抗生蛋白链菌素)，其中所述抗体-受体结合物施用于患者，接着使用清除剂从循环中去除未结合的结合物，且接着施用与细胞毒性剂(例如本文所述或所属领域中已知的细胞毒性剂中的任一或多种)结合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和前药激活酶。在一些实施例中，前药激活酶将前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO81/01145)转化为活性药物，例如抗癌药物。在一些实施例中，包含前药激活酶的抗PSMA免疫结合物用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)中。在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和以下各物：碱性磷酸酶，其将含磷酸的前药转化成游离药物；芳基硫酸酯酶，其将含硫酸的前药转化成游离药物；胞嘧啶脱胺酶，其将无毒5-氟胞嘧啶转化成抗癌药5-氟尿嘧啶；蛋白酶(例如沙雷菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶或组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L))，其将含肽前药转化成游离药物；D-丙氨酰基羧肽酶，其转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶(例如β-半乳糖苷酶和神经氨糖酸苷酶)，其将糖基化前药转化成游离药物；β-内酰胺酶，其将经过β-内酰胺衍生化的药物转化成游离药物；或青霉素酰胺酶(例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶)，其将在胺氮上经过苯氧基乙酰基或苯乙基衍生化的药物分别转化成游离药物。在一些实施例中，前药激活酶共价连接于抗PSMA体部分。在一些实施例中，提供了一种编码包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和酶(例如前药激活酶)的抗PSMA免疫结合物的核酸。参见例如纽伯格等人，《自然》312:604-608。产生这类免疫结合物需要用所述核酸转型、转染或转导宿主细胞，在使免疫结合物得以表达的条件下培养宿主细胞，且收获免疫结合物。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和核酸，例如(但不限于)例如反义RNA、基因或其它多核苷酸。在一些实施例中，与抗PSMA抗体部分结合的多核苷酸包含一或多种核酸类似物，例如硫鸟嘌呤和硫代嘌呤。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和直接或间接地产生可检测信号的标记。这类抗PSMA免疫结合物可用于研究或诊断应用，包括例如癌细胞(例如患有或怀疑患有癌症的个体中或从这类个体获得的样品中)的体内或体外检测。在一些实施例中，标记是不透射线的。在一些实施例中，标记为放射性同位素，例如不限于3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I。在一些实施例中，标记为荧光化合物(荧光团)或化学发光化合物(生色团)，例如异硫氰酸荧光素、若丹明或荧光素。在一些实施例中，标记为酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化酶。在一些实施例中，标记为显影剂或金属离子。在一些实施例中，标记为用于闪烁摄影研究的放射性原子，例如99Tc或123I，或用于核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂络合且结合于抗体，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含抗PSMA抗体部分(例如本文所述)和间接地产生可检测信号的标记。举例来说，对于抗PSMA免疫结合物具有特异性且包含可检测标记的二级抗体可用于检测抗PSMA免疫结合物。
抗PSMA免疫结合物可以使用所属领域中已知的任何方法制备。参见例如WO2009/067800、WO 2011/133886和美国专利申请公开案第2014322129号，以全文引用的方式并入本文中。
抗PSMA免疫结合物中的抗PSMA抗体部分可以通过使抗PSMA抗体部分可与效应分子关联或连接的任何方式“附接至”效应分子。在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含本文所述的抗PSMA抗体部分和标记或治疗剂，其中所述标记或所述治疗剂分子共价附接至抗PSMA抗体部分。抗PSMA免疫结合物的抗PSMA抗体部分可以通过化学或重组方式附接至效应分子。制备融合物或结合物的化学方式是所属领域中已知对且可用于制备抗PSMA免疫结合物。用于使抗PSMA抗体部分和效应分子(即，标记或治疗剂)结合的方法必须能够在不干扰抗PSMA抗体部分结合于在目标细胞上表达的PSMA的能力下使结合蛋白与效应分子接合。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物包含间接连接于效应分子(即，标记或治疗剂)的抗PSMA抗体部分(例如本文所述)。举例来说，抗PSMA免疫结合物的抗PSMA抗体部分可直接连接于含有效应分子效应分子标记或治疗剂)的脂质体。效应分子和/或抗PSMA抗体部分也可以结合于固体表面。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物的抗PSMA抗体部分和效应分子(即，标记或治疗剂)都是蛋白质且可以使用所属领域中众所周知的技术结合。可使两种蛋白质结合的多种交联剂上所属领域中所众所周知的。(参见例如“蛋白质结合和交联化学(Chemistry ofProtein Conjugation and Crosslinking)”.1991,黄珊(Shans Wong),CRC出版社(CRCPress),安阿伯(Ann Arbor))。一般基于抗PSMA抗体部分和/或效应分子(即，标记或治疗剂)上可利用或插入的反应性官能团选择交联剂。另外，如果不存在反应性基团，那么可以使用光可激活交联剂。在某些情况下，可能需要在抗PSMA抗体部分与效应分子之间包括间隔子。所属领域已知的交联剂包括同型双官能剂：戊二醛、己二亚胺酸二甲酯和双(重氮联苯胺)和异型双官能剂：间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺和磺酸基-间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺。
在一些实施例中，抗PSMA免疫结合物的抗PSMA抗体部分可以用特定残基进行工程化以化学附接效应分子(即，标记或治疗剂)。所属领域已知的用于化学附接分子的特定残基包括赖氨酸和半胱氨酸。基于抗PSMA抗体部分上插入和效应分子上可利用的反应性官能团选择交联剂。
抗PSMA免疫结合物还可以使用重组DNA技术制备。在这种情况下，编码抗PSMA抗体部分的DNA序列与编码效应分子的DNA序列融合，产生嵌合DNA分子。将嵌合DNA序列转染至表达融合蛋白的宿主细胞中。可以从细胞培养物回收融合蛋白并使用所属领域中已知的技术纯化。
使可检测标记附接至结合分子(例如抗PSMA抗体部分)的示例性方法描述于亨特(Hunter)等人，《自然》144:945(1962)；戴维(David)等人，《生物化学(Biochemistry)》13:1014(1974)；佩恩(Pain)等人，《免疫学方法杂志》40:219(1981)；尼格伦(Nygren),《组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.and Cytochem.)》30:407(1982)；温塞尔(Wensel)和米尔斯(Meares),《放射免疫显像与放射免疫疗法(Radioimmunoimaging AndRadioimmunotherapy)》,纽约爱思唯尔(Elsevier,N.Y.)(1983)；和科尔(Colcher)等人，“使用单克隆抗体作为定位无胸腺小鼠中的人癌异种移植物的放射线药物(Use OfMonoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of HumanCarcinoma Xenografts In Athymic Mice)”,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》,121:802-16(1986)。
放射性标记(或其它标记)可以用已知方式并入免疫结合物中。举例来说，抗PSMA抗体部分可以生物合成或可以通过化学氨基酸合成，使用适合氨基酸前体(包括例如氟-19替代氢)而合成。例如99Tc或123I、186Re、188Re和111In的标记可以经由抗PSMA抗体部分中的半胱氨酸残基连接。钇-90可经由赖氨酸残基附接。IODOGEN法(弗雷克(Fraker)等人，《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》80:49-57(1978))可用于并入碘-123。“免疫闪烁法中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy)”(沙塔尔(Chatal),CRC出版社1989)详细描述其它方法。
可使用多种双官能蛋白质偶合剂制得抗PSMA免疫结合物，所述双官能蛋白质偶合剂例如N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(例如己二亚胺酸二甲酯HCI)、活性酯(例如辛二酸二丁二酰亚胺基酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。举例来说，蓖麻毒素免疫毒素可如委特塔(Vitetta)等人，《科学(Science)》238:1098(1987)中所述来制备。碳14标记的1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于将放射核种结合于抗PSMA免疫结合物的抗PSMA抗体部分的示例性螯合剂。参见例如WO 94/11026。接头可为“可裂解接头”，促进细胞毒性药物在细胞中释放。举例来说，可使用酸不稳定型接头、肽酶敏感型接头、光不稳定型接头、二甲基接头或含二硫键的接头(沙里(Chari)等人，《癌症研究》52:127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。
本公开的抗PSMA免疫结合物包括但不限于用以下各物制备的免疫结合物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，和SVSB(丁二酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，即可购得(例如从美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL,U.S.A)购得)的交联试剂。参见第467-498页,2003-2004《申请手册和目录(Applications Handbook and Catalog)》。
核酸、载体、宿主细胞和制造抗PSMA构建体的方法
还提供了编码本文所述的抗PSMA构建体的多肽部分的核酸分子(包括核酸分子集合)。在一些实施例中，核酸(或核酸集合)编码全长抗PSMA抗体。在一些实施例中，核酸(或核酸集合)编码多特异性抗PSMA分子(例如多特异性抗PSMA抗体、双特异性抗PSMA抗体或包含抗PSMA抗体部分的串联双scFv)或其多肽部分。在一些实施例中，核酸(或核酸集合)编码抗PSMA CAR。在一些实施例中，核酸(或核酸集合)编码抗PSMA caTCR。在一些实施例中，抗PSMA caTCR的两条链在相同核酸上编码。在一些实施例中，抗PSMA caTCR的两条链在单独核酸上编码。在一些实施例中，核酸编码抗PSMA CAR。在一些实施例中，核酸(或核酸集合)编码抗PSMA免疫结合物或其多肽部分。
还提供了编码本文所述的抗PSMA构建体的多肽部分的核酸序列变体。举例来说，所述变体包括在至少中等严格的杂交条件下与编码本文所述的抗PSMA构建体或抗PSMA抗体部分的核酸序列杂交的核苷酸序列。
还提供了包含本文所述的一或多种核酸的载体(例如表达载体)。
本文所述的抗PSMA构建体或其多肽部分，例如抗PSMA CAR，可以从编码抗PSMA构建体或其多肽部分的天然或合成核酸表达。简单地说，核酸可插入至适当表达载体中，使得核酸可操作地连接于5'和3'调控组件，包括例如启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3'非翻译区(UTR)。载体优选适合于真核宿主细胞中的复制和整合。典型克隆和表达载体含有转录和翻译终止子、起始序列和适用于调控所要核酸序列表达的启动子。
本文所述的核酸还可以用于使用标准基因递送方案的核酸免疫接种和基因疗法。基因递送方法是所属领域中已知的。参见例如美国专利第5,399,346号；第5,580,859号；和第5,589,466号；以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，提供基因疗法载体。
本文所述的核酸可以克隆至所属领域中已知的多种载体中的任一种中。举例来说，核酸(或核酸集合)可以克隆至例如质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和/或粘质粒中。尤其受关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
在一些实施例中，包含编码本文所述的抗PSMA构建体或抗PSMA抗体部分的核酸的表达载体为病毒载体。病毒载体技术是所属领域中众所周知的且描述于例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人(2001,《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,纽约冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,New York))和其它病毒学和分子生物学手册中。适用作载体的病毒包括(但不限于)反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，适合载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、适宜的限制性核酸内切酶位点和一或多种可选标志物(参见例如WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经针对基因转移至哺乳动物细胞中开发出多个基于病毒的系统。举例来说，反转录病毒为基因递送系统提供适宜的平台。所选基因可插入载体中并使用所属领域中已知的技术封装于反转录病毒粒子中。接着可分离重组型病毒并在体内或离体递送至个体的细胞中。所属领域中已知许多反转录病毒系统。在一些实施例中，病毒载体为腺病毒载体。多个腺病毒载体为所属领域中已知。在一些实施例中，病毒载体为慢病毒载体。来源于反转录病毒(例如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的适合工具，因为其允许长期稳定整合转基因和其在子细胞中的传播。慢病毒载体具有优于来源于致癌反转录病毒(例如鼠类白血病病毒)的载体的额外优势，因为其可转导非增殖性细胞。其还具有低免疫原性的额外优势。
额外启动子组件(例如强化子)调控转录起始频率。通常，这些组件定位于起始位点上游30-110bp区中，不过最近多个启动子已展示含有也在起始位点下游的功能性组件。启动子组件之间的间距通常为灵活的，使得在组件倒置或相对于彼此移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子组件之间的间距在活性开始减退之前可增加至相隔50bp。
适合启动子的一个实例为即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱使任何与其可操作地连接的多核苷酸序列高水平表达的强组成性启动子序列。适合启动子的另一实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可以使用其它组成性启动子序列，包括(但不限于)猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒即刻早期启动子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、劳斯肉瘤病毒启动子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人类基因启动子，例如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。此外，本文所述的抗PSMA构建体的表达不应限于使用组成性启动子。还涵盖诱导性启动子。诱导性启动子的使用提供分子开关，所述分子开关能够在需要表达时打开其可操作地连接的多核苷酸序列的表达或在不需要表达时关闭表达。诱导性启动子的实例包括(但不限于)金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评定多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有可选标志物基因或报告基因或两者以促进从设法通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面中，可选标志物可携载于单独一片DNA上且用于共转染程序。可选标志物与报告基因均可侧接适当调控序列以能够在宿主细胞中表达。示例性可选择标志物包括(但不限于)例如抗抗生素基因，例如neo等等。
报告基因用于鉴定潜在转染细胞和评估调控序列的功能。一般来说，报告基因是在接受者生物体或组织中不存在或表达且编码表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶促活性)体现的多肽的基因。在DNA已引入受体细胞中之后的适合时间分析报告基因的表达。适合报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如威特尔(Ui-Tel)等人，2000《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》479:79-82)。适合表达系统是众所周知的且可以使用已知技术制备或可购得。一般来说，其中最小5'侧接区展示报告基因最高表达量的构建体被鉴定为启动子。这类启动子区域可连接至报告基因且用于评估调节启动子驱动的转录的能力的试剂。
向细胞中引入和表达基因的方法是所属领域中已知的。在表达载体的情形下，载体可以通过所属领域中的任何方法容易地引入至宿主细胞(例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。举例来说，表达载体可以通过物理、化学或生物方式转移至宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入至宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。用于制造包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是所属领域中众所周知的。参见例如萨姆布鲁克等人(2001,《分子克隆：实验指南》,纽约冷泉港实验室)。在一些实施例中，通过磷酸钙转染将多核苷酸引入至宿主细胞中。
将所关注的多核苷酸引入至宿主细胞中的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体和尤其反转录病毒载体已经成为将基因插入哺乳动物(例如人类)细胞中的最常用方法。其它病毒载体可来源于慢病毒、痘病毒、1型单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
将多核苷酸引入宿主细胞中的化学方式包括胶态分散系统，例如大分子复合物、纳米囊剂、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、微胞、混合微胞和脂质体。用作体外和体内递送媒剂的一示例性胶态系统为脂质体(例如人工膜泡)。
另一示例性递送媒剂为脂质体。预期使用脂质调配物将核酸引入至宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面中，核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可囊封于脂质体的水性内部中，穿插于脂质体的脂质双层内，经由与脂质体和寡核苷酸两者相关联的连接分子附接至脂质体，包覆于脂质体中，与脂质体复合，分散于含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以悬浮液形式含于脂质中，含有微胞或与微胞复合，或以其它方式与脂质相关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。举例来说，其可以存在于双层结构中，以微胞形式存在或具有“塌陷”结构。其还可以简单地穿插于溶液中，可能形成尺寸或形状上不均匀的聚集物。脂质为可为天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。举例来说，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪滴以及含有长链脂族烃和其衍生物的化合物类别(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)。
无论用于将外源性核酸引入至宿主细胞中的方法如何，为了证实宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种分析。这类分析包括例如所属领域的技术人员众所周知的“分子生物”分析，例如南方和北方墨点法、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方式(ELISA和西方墨点法)或通过本文所述的分析来鉴定在本公开的范围内的试剂。
包含Fc区变体的抗PSMA构建体
在一些实施例中，一或多种氨基酸修饰可以引入至本文提供的抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)的Fc区中，由此产生Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体具有增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应功能，这通常与结合于Fc受体(FcR)相关。在一些实施例中，Fc区变体具有降低的ADCC效应功能。存在可改变效应功能的Fc序列的变化或突变的多个实例。举例来说，WO 00/42072和希尔兹(Shields)等人《生物化学杂志(J Biol.Chem.)》9(2):6591-6604(2001)描述了具有提高或下降的与FcR的结合的抗体变体。这些出版物的内容以引用的方式特别并入本文中。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是针对肿瘤细胞的治疗性抗体的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，其中免疫系统的效应细胞活跃地溶解目标细胞(例如癌细胞)，所述目标细胞的膜表面抗原已由特异性抗体(例如抗PSMA抗体)结合。典型ADCC涉及通过抗体激活NK细胞。NK细胞表达作为Fc受体的CD16。此受体识别与目标细胞表面结合的抗体的Fc部分，且结合于所述Fc部分。NK细胞表面上的最常见Fc受体称作CD16或FcγRIII。Fc受体与抗体的Fc区的结合导致NK细胞激活、溶细胞颗粒的释放和随之而来的目标细胞凋亡。ADCC对肿瘤细胞杀死的贡献可以通过使用已经用高亲和力FcR转染的NK-92细胞的特定测试来测量。结果与不表达FcR的野生型NK-92细胞相比。
在一些实施例中，提供了一种包含具有一些但并非所有效应功能的变异Fc区的抗PSMA构建体，这使得其成为抗PSMA构建体体内半衰期具有重要意义，而某些效应功能(如CDC和ADCC)不必要或有害的应用的所需候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性分析以证实CDC和/或ADCC活性的降低/损耗。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞(即，NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于拉文奇和凯奈特,《免疫学年评》9:457-492(1991)的第464页的表3中。用以评定所关注分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(参见例如赫尔斯特罗姆(Hellstrom,I.)等人《美国国家科学院院刊》83:7059-7063(1986))和赫尔斯特罗姆等人，《美国国家科学院院刊》82:1499-1502(1985)；美国专利第5,821,337号(参见布吕格曼等人，《实验医学杂志》166:1351-1361(1987))中。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(加利福尼亚州山景城的细胞技术公司(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.))；和CytoTox 96TM非放射性细胞毒性分析(威斯康星州麦迪逊市的普洛麦格(Promega,Madison,Wis.))。适用于这类分析的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，所关注分子的ADCC活性可在体内，例如在例如克莱因斯等人《美国国家科学院院刊》95:652-656(1998)中公开的动物模型中评定。还可以进行C1q结合分析以证实抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评定补体激活，可进行CDC分析(加扎诺-桑托罗等人等人，《免疫学方法杂志》202:163(1996)；卡格(Cragg,M.S.)等人，《血液(Blood)》101:1045-1052(2003)；以及卡格和格莱尼(M.J.Glennie),《血液》103:2738-2743(2004))。可使用所属领域中已知的方法进行FcRn结合和体内消除率/半衰期测定(参见例如佩特科娃(Petkova,S.B.)等人，《国际免疫学(Int'l.Immunol.)》18(12):1759-1769(2006))。
效应功能减小的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一或多个进行取代的抗体(美国专利第6,737,056号)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多于两个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
描述具有提高或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；和希尔兹等人，《生物化学杂志》9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)包含包括一或多个改善ADCC的氨基酸取代的变异Fc区。在一些实施例中，变异Fc区包含一或多个改善ADCC的氨基酸取代，其中取代发生于变异Fc区的位置298、333和/或334(EU残基编号)。在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)在其变异Fc区中包含以下氨基酸取代：S298A、E333A和K334A。
在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)的Fc区中发生改变，从而改变(即，提高或减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如如美国专利第6,194,551号、第WO 99/51642号和伊杜索吉等人，《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)中所述。
在一些实施例中，包含变异Fc区的抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)包含一或多个增加半衰期和/或改善与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。具有增加的半衰期和改善的与FcRn的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(辛顿(Hinton)等人)中。这类抗体包含其中具有一或多个改善Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。这类Fc变体包括在Fc区残基中的一或多个处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利第7,371,826号)。
关于Fc区变体的其它实例，还参见邓肯(Duncan)和温特尔,《自然》322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；和WO 94/29351。
涵盖包含本文所述的Fc变体中的任一个或其组合的抗PSMA构建体(如全长抗PSMA抗体)。
抗PSMA构建体的糖基化变体
在一些实施例中，本文提供的抗PSMA构建体被改变成增加或降低抗PSMA构建体糖基化的程度。抗PSMA构建体中的糖基化位点的添加或缺失宜通过改变抗PSMA构建体或其多肽部分的氨基酸序列以便建立或去除一或多个糖基化位点来实现。
在抗PSMA构建体包含Fc区的情况下，可改变附接于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支链双触角寡糖，其一般通过N键附接于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如赖特(Wright)等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc上的岩藻糖。在一些实施例中，可对本文所述的抗PSMA构建体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善特性的抗PSMA构建体糖基化变体。
在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)包含如下Fc区，其中附接至Fc区的碳水化合物结构具有减少的岩藻糖或不具有岩藻糖，这能够改善ADCC功能。在一些实施例中，相对于在野生型CHO细胞(例如产生天然糖基化模式的CHO细胞，例如含有天然FUT8基因的CHO细胞)中产生的相同抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)上岩藻糖的量，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)具有减少的岩藻糖。在一些实施例中，抗PSMA构建体是上面小于约50％、40％、30％、20％、10％或5％的N-连接型聚糖包含岩藻糖的构建体。举例来说，这类抗PSMA构建体中的岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％，或20％至40％。在一些实施例中，抗PSMA构建体为上面N连接型聚糖中没有一个包含岩藻糖的构建体，即，其中抗PSMA构建体完全不含岩藻糖，或不具有岩藻糖或非岩藻糖基化。岩藻糖的量是通过相对于如通过MALDI-TOF质谱分析测量的附接于Asn 297的所有糖结构(例如复合、混杂和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内Asn297处的岩藻糖的平均量来确定，如例如WO2008/077546中所描述。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中少量序列变异，Asn297还可以位于位置297的上游或下游约±3个氨基酸处，即介于位置294与300之间。这类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开案第US 2003/0157108号(普瑞斯塔(Presta,L.))；US2004/0093621(日本协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体相关的公开案的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；冈崎(Okazaki)等人《分子生物学杂志》336:1239-1249(2004)；山根妙子(Yamane-Ohnuki)等人《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(里普卡(Ripka)等人《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249:533-545(1986)；美国专利申请第US 2003/0157108 A1号，普瑞斯塔；和WO2004/056312 A1,亚当斯(Adams)等人，特别是在实例11)和基因剔除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)剔除CHO细胞(参见例如山根妙子等人《生物技术与生物工程》87:614(2004)；神田(Kanda,Y.)等人，《生物技术与生物工程》,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)是包含等分寡糖的糖基化变体，例如其中附接至抗PSMA构建体的Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc等分。这类抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)糖基化变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(吉恩﹒迈雷(Jean-Mairet)等人)；美国专利第6,602,684号(乌马纳(Umana)等人)；US 2005/0123546(乌马纳等人)和费拉拉(Ferrara)等人，《生物技术与生物工程(Biotechnology and Bioengineering)》,93(5):851-861(2006)。在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)是在附接至Fc区的寡糖中包含至少一个半乳糖残基的糖基化变体。这类抗PSMA构建体糖基化变体可具有改善的CDC功能。这类糖基化变体描述于例如WO1997/30087(帕特尔(Patel)等人)；WO 1998/58964(拉吉(Raju,S.))；和WO 1999/22764(拉吉)。
在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)糖基化变体包含能够结合于FcγRIII的Fc区。在一些实施例中，包含Fc区的抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)糖基化变体在人效应细胞存在下具有ADCC活性，或与包含人类野生型IgG1 Fc区的抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)相比，在人效应细胞存在下ADCC活性增加。
经过半胱氨酸工程化的抗PSMA构建体变体
在一些实施例中，抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)被工程化，使得一或多个氨基酸残基用半胱氨酸残基取代。在一些实施例中，经取代的残基存在于抗PSMA构建体的表面和/或溶剂可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基从而定位于抗PSMA构建体的可接近位点处且可用于使抗PSMA构建体与其它部分(例如药物部分或接头-药物部分)结合以产生抗PSMA免疫结合物(如本文中的其它地方进一步详细描述)。经过半胱氨酸工程化的抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体)可如例如美国专利第7,521,541号中所描述产生。
衍生化的抗PSMA构建体
在一些实施例中，可以对抗PSMA构建体进行进一步修饰以含有所属领域中已知且可易于获得的其它非蛋白质部分。适合于将本公开的抗PSMA构建体衍生化的部分包括(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和其混合物。聚乙二醇丙醛因其于水中的稳定性而可在制造中具有优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支链或未分支链。附接至衍生化的抗PSMA构建体的聚合物的数目可变化，且如果附接超过一种聚合物，那么聚合物可为相同或不同分子。一般来说，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可基于包括(但不限于)待改善的抗PSMA构建体的特定特性或功能、抗PSMA构建体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等考虑因素来确定。
在一些实施例中，提供抗PSMA构建体与可以通过暴露于放射线而选择性地加热的非蛋白质部分的结合物。在一个实施例中，非蛋白质部分为碳纳米管(卡姆(Kam)等人，《美国国家科学院院刊》102:11600-11605(2005))。放射线可以具有任何波长，且包括(但不限于)不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀死抗PSMA构建体-非蛋白质部分近侧细胞的温度的波长。
药物组合物
本文还提供了包含本文所述的抗PSMA构建体或抗PSMA构建体组合的组合物(例如药物组合物，在本文中又称为“药物调配物”或“调配物”)。在一些实施例中，组合物进一步包含与抗PSMA构建体或抗PSMA构建体组合相关联的细胞(例如效应细胞，例如T细胞)。在一些实施例中，药物组合物包含抗PSMA构建体或抗PSMA构建体组合和药学上可接受的载剂。在一些实施例中，药物组合物进一步包含与抗PSMA构建体或抗PSMA构建体组合相关联的细胞(例如效应细胞，例如T细胞)。在其它实施例中，药物组合物包含编码抗PSMA构建体或抗PSMA构建体组合的核酸。
抗PSMA构建体或构建体组合的适合调配物通过将具有所需纯度的抗PSMA构建体或构建体组合与任选地选用的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》第16版,奥索尔(Osol,A.)编(1980))混合成冻干调配物或水溶液形式而获得。在所采用的剂量和浓度下，可接受的载剂、赋形剂或稳定剂对接受者来说是无毒的，且其包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，例如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。例示性调配物描述于WO98/56418中，所述专利以引用的方式明确并入本文中。适用于皮下施用的冻干调配物描述于WO97/04801中。这类冻干调配物可以通过适合稀释剂复原至高蛋白质浓度且复原的调配物可皮下施用至本文中的待治疗个体。脂质体(Lipofectin)或脂质体(liposome)可用于递送本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合至细胞中。
在一些实施例中，视所治疗的特定适应症需要，药物组合物包含除抗PSMA构建体或构建体组合之外的一或多种活性化合物。优选地，药物组合物中的活性化合物不会不利地影响彼此活性。在一些实施例中，一或多种活性化合物为抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂，即除抗PSMA构建体或构建体组合之外。这类分子宜以有效达成预期目的的量组合存在。这类其它药剂的有效量视调配物中存在的抗PSMA构建体或构建体组合的量、疾病或病症或治疗的类型和本文中的其它地方论述的其它因素而定。这些药剂一般以与本文所述相同的剂量和施用途径使用或以迄今为止采用的剂量的约1％至99％使用。
抗PSMA构建体或构建体组合还可以包覆于微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合法所制备的微胶囊，例如分别为羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；包覆于胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或巨乳液中。这类技术公开于《雷氏药学大全》第16版,奥索尔编(1980)中。可制备持续释放型制剂。
可制备抗PSMA构建体或构建体组合的持续释放型制剂。持续释放型制剂的适合实例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯))或聚(乙烯醇)、聚乳酸交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸与L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德构成的可注射微球体))和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物允许持续超过100天释放分子，但某些水凝胶持续较短时间段释放蛋白质。当囊封抗体长时间留存于体内时，其可因在37℃下暴露于水分而变性或聚集，引起生物活性损失和免疫原性可能变化。视所涉及的机制而定，可以设计使抗PSMA构建体或构建体组合稳定的合理策略。举例来说，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么稳定化可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现。
在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、丁二酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(吐温80(Tween 80))或前述的任何组合的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于包含约50mM至约100mM NaCl的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体于包含约10mM至约50mM丁二酸盐的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于具有介于约5.1与5.6之间的pH值的缓冲液中配制。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合于包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中配制，其中所述调配物在pH 5.5下。
用于体内施用的医药调配物必须是无菌的。这容易通过例如用无菌过滤膜过滤来完成。
使用抗PSMA构建体的治疗方法
本文所述的抗PSMA构建体、抗PSMA构建体组合和/或组合物可施用于个体(例如哺乳动物，例如人类)以治疗PSMA相关疾病或病症。在一些实施例中，PMSA相关疾病或病症的特征在于PSMA表达、PSMA过度表达和/或异常PSMA活性。这类疾病或病症包括(例如)PSMA相关癌症，例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。
因此，本文提供了一种治疗个体的PSMA相关疾病(例如癌症)的方法，所述方法包含向所述个体施用有效量的包含本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合的组合物(例如药物组合物)。在一些实施例中，组合物进一步包含与抗PSMA构建体或构建体组合相关联的细胞(例如效应细胞)(例如表达本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合的效应细胞)。在一些实施例中，癌症为例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，个体为人。
在一些实施例中，所述方法中使用的抗PSMA构建体或构建体组合是非天然存在的。在一些实施例中，所述方法中使用的抗PSMA构建体为全长抗体、多特异性(例如双特异性)抗PSMA构建体、抗PSMA嵌合抗原受体(CAR)、抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)、抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)、抗PSMA免疫结合物或本文中的其它地方进一步详细描述的任何其它抗PSMA构建体。在一些实施例中，所述方法中使用包含抗PSMA caTCR与抗PSMA CSR的构建体组合(例如本文中的其它地方描述的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合)。本文所述的构建体或构建体组合中的每一个展示对天然形式(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达)的人PSMA具有高特异性。在一些实施例中，所述方法中使用的药物组合物进一步包含表达抗PSMA构建体或构建体组合或与其相关联的细胞(例如效应细胞)。在一些实施例中，PSMA相关疾病为癌症。在一些实施例中，癌症为例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，个体为人。
在本文所述的用于治疗PSMA相关疾病的任一方法的一些实施例中，在施用于个体前抗PSMA构建体或构建体组合结合于细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)。因此，提供了一种治疗个体的PSMA相关疾病的方法，其包含a)使本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合中的任一种结合于细胞(例如免疫细胞，例如T细胞)以形成抗PSMA构建体/细胞结合物；和b)向所述个体施用有效量的包含抗PSMA构建体/细胞结合物的组合物。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合所结合的细胞来源于所治疗的个体。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合所结合的细胞不来源于所治疗的个体。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合通过经共价键连接于细胞表面上的分子而结合于细胞。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合通过经非共价键连接于细胞表面上的分子而结合于细胞。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合通过抗PSMA构建体或构建体的一部分插入细胞外膜中而结合于细胞。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合是非天然存在的。在一些实施例中，所述方法中使用的抗PSMA构建体为全长抗体、多特异性(例如双特异性)抗PSMA构建体(例如串联双scFv)、抗PSMA免疫结合物或本文中的其它地方进一步详细描述的任何其它抗PSMA构建体。在一些实施例中，所述方法中使用包含抗PSMA caTCR与抗PSMA CSR的构建体组合(例如本文中的其它地方描述的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合)。在一些实施例中，PSMA相关疾病为癌症。在一些实施例中，癌症为例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，个体为人。
在本文所述的用于治疗PSMA相关疾病的任一方法的一些实施例中，治疗包含向有需要的接受者施用用编码本文所公开的抗PSMA CAR、抗PSMA caTCR、抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)或抗PSMA CSR或本文所公开的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)的细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)。在一些实施例中，经过基因修饰的细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞和抑制T细胞)表达由核酸、核酸集合、载体或载体集合编码的抗PSMACAR、抗PSMA caTCR、抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)、抗PSMA CSR或抗PSMAcaTCR+抗PSMA CSR构建体组合。在一些实施例中，接受者为哺乳动物，例如人，例如患有或怀疑患有PSMA相关疾病的人。
在用于治疗PSMA相关疾病的方法的一些实施例中，在施用接受者前治疗进一步包含用编码抗PSMA CAR、抗PSMA caTCR、抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)或抗PSMA CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)的步骤。在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)，且进一步用编码多特异性scFv(例如串联双scFv)或CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，多特异性scFv(例如串联双scFv)靶向PSMA。在一些实施例中，多特异性scFv(例如串联双scFv)靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，CSR靶向PSMA。在一些实施例中，CSR靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)或抗PSMA CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)，且进一步用编码CAR或caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，CAR靶向PSMA。在一些实施例中，CAR靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，caTCR靶向PSMA。在一些实施例中，caTCR靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，构建体组合包含抗PSMA caTCR和抗PSMA CSR(例如本文中的其它地方描述的抗PSMAcaTCR+抗PSMA CSR构建体组合)。
在用于治疗PSMA相关疾病的方法的一些实施例中，在用编码例如如上所述的抗PSMA CAR、抗PSMA caTCR、抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)、抗PSMA CSR或抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR构建体组合的核酸、核酸集合、载体或载体集合对细胞进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)的步骤前治疗进一步包含从个体(例如哺乳动物，例如人，例如患有或怀疑患有PSMA相关疾病的人)获得(例如分离)细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)的步骤。在一些实施例中，经过基因修饰的细胞所施用的接受者是从中获得细胞的个体。这类经过基因修饰的免疫细胞称为“自体抗PSMA效应细胞”。在一些实施例中，经过基因修饰的细胞所施用的接受者不是从中获得细胞的个体。这类经过基因修饰的免疫细胞称为“异源抗PSMA效应细胞”。在一些实施例中，异源抗PSMA细胞相对于接受者为同种异体、同基因型或异种的。
在一些实施例中，个体为哺乳动物(例如人、非人类灵长类动物(例如恒河猴或食蟹猕猴)、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、犬、猫等)。在一些实施例中，个体是人。在一些实施例中，个体为临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，个体小于约60岁(包括例如小于约50、40、30、25、20、15或10岁中的任一年龄)。在一些实施例中，个体年龄大于约60岁(包括例如年龄大于约70、75、80、85、90、95、100或超过100岁中的任一年龄)。在一些实施例中，个体被诊断为患有或在遗传上易患一或多种本文所述的PSMA相关疾病或病症(例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)。在一些实施例中，个体具有与一或多种本文所述的PSMA相关疾病或病症相关的一或多种风险因素。
还提供了一种向表达PSMA(例如细胞表面结合的PSMA)的细胞递送抗PSMA构建体(例如本文所述的任一抗PSMA构建体)或抗PSMA构建体组合(例如本文所述的任一抗PSMA构建体组合)的方法，所述方法包含向所述个体施用包含抗PSMA构建体或构建体组合的组合物。在一些实施例中，待递送的抗PSMA构建体或构建体组合与细胞(例如效应细胞，例如T细胞)相关联。
所属领域中已知PSMA相关癌症，例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌或任何其它PSMA相关疾病，例如展现PSMA表达的疾病和那些疾病的临床描述的许多诊断方法。这类方法包括(但不限于)例如免疫组织化学、PCR和荧光原位杂交(FISH)。
在一些实施例中，本公开的抗PSMA构建体、抗PSMA构建体组合和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如抗赘生性剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合施用以治疗PSMA相关疾病或病症，例如涉及PSMA表达的疾病。在一些实施例中，抗PSMA构建体或构建体组合与增加PSMA在患病细胞(例如癌细胞)上的表达的药剂组合施用。在一些实施例中，药剂为化学治疗剂，包括例如拓朴替康(topotecan)、依托泊苷(etoposide)、顺铂、太平洋紫杉醇和长春碱。
可例如通过包括(但不限于)例如肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、达至进展的时间、生存持续时间、无进展生存率、整体反应率、反应持续时间、生活质量、PSMA蛋白质表达和/或PSMA活性的多种众所周知的方法评估癌症治疗的功效。可采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射成像测量反应。
在一些实施例中，治疗方法的功效测量为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，其是使用等式100-(T/C×100)计算，其中T为所治疗肿瘤的平均相对肿瘤体积，且C为未治疗肿瘤的平均相对肿瘤体积。在一些实施例中，％TGI为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或超过95％(例如至多100％)中的任一值，包括这些值之间的任何范围。
抗PSMA构建体的给药和施用
包含本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合的药物组合物施用于个体(例如人类)的剂量可随特定组合物、施用模式和所治疗疾病的类型变化。在一些实施例中，药物组合物的量有效产生客观反应(例如在实体瘤的情况下，部分反应(PR)或完全反应(CR)，例如根据艾森豪尔(Eisenhauer)等人(2009)《欧洲癌症杂志(European Journal of Cancer)》,45(2):228-247或赛拉斯(Therasse)等人(2000)《国立癌症研究所杂志(J.Nat'l.CancerInst.)》92(3):205-216中描述的RECIST标准)。在一些实施例中，包含抗PSMA构建体(或构建体组合)的组合物施用于有需要的个体的量(例如，当作为单一药剂施用时)足以在利用包含本文所述的抗PSMA构建体(或构建体组合)的药物组合物治疗的个体群体中产生超过约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中的任一百分比的整体反应率。个体对本文所述的方法的治疗的反应可例如基于RECIST水平测定。
在一些实施例中，药物组合物施用于有需要的个体的量足以延长个体的无恶化生存期。在一些实施例中，组合物施用于有需要的个体的量足以延长个体的总生存率。在一些实施例中，组合物施用于有需要的个体的量足以在用抗PSMA构建体组合物治疗的个体群体中产生超过约50％、60％、70％或77％中的任一百分比的临床效益率。
在一些实施例中，组合物施用于有需要的个体的量(例如作为单一药剂或与第二、第三和/或第四药剂组合)足以减小肿瘤的尺寸、降低癌细胞的数目或降低肿瘤的生长速率，与相同个体中治疗之前的对应肿瘤尺寸、癌细胞数目或肿瘤生长率相比或与不接受治疗的其它个体中的对应活性相比，幅度达至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一百分比(包括这些值之间的任何范围)。标准方法可用于测量此作用的量值，如通过纯化酶的体外分析、基于细胞的分析、动物模型或人类测试。
在一些实施例中，药物组合物中抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA构建体、抗PSMA CAR、抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)、抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)、抗PSMA免疫结合物或本文中的其它地方进一步详细描述的任何其它抗PSMA构建体或构建体组合)的量低于诱发毒理学作用的水平。在一些实施例中，药物组合物中抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA构建体、抗PSMA CAR、抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)、抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)、抗PSMA免疫结合物或本文中的其它地方进一步详细描述的任何其它抗PSMA构建体或构建体组合)的量处于在组合物施用于个体时可控制或耐受潜在副作用的水平下。
在一些实施例中，施用于有需要的个体的药物组合物的量靠近按照相同给药方案的组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施例中，组合物的量大于MTD的约80％、90％、95％或98％中的任一百分比。
在一些实施例中，药物组合物中抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA构建体、抗PSMA CAR、抗PSMA嵌合抗体-T细胞受体构建体(caTCR)、抗PSMA嵌合信号传导受体(CSR)、抗PSMA免疫结合物或本文中的其它地方进一步详细描述的任何其它抗PSMA构建体或构建体组合)的量包括在约0.001μg至约1000μg的范围内。
在一些实施例中，组合物中抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA构建体、抗PSMA免疫结合物或本文中的其它地方进一步详细描述的任何其它抗PSMA构建体或构建体组合)的有效量在每公斤总体重约0.1μg至约100mg的范围内。
包含本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合的药物组合物可经由任何已知的可利用途径施用于个体(例如人)，包括(例如)静脉内、门静脉内、动脉内、腹膜内、肝内、肝动脉输注、肺内、经口、吸入、囊泡内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经粘膜和经皮。在一些实施例中，可使用包含本文所述的抗PSMA构建体的药物组合物的持续连续释放调配物。
抗PSMA效应细胞疗法
在一些实施例中，治疗PSMA相关疾病或病症的方法包含使用抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA CAR效应细胞、抗PSMA caTCR效应细胞、抗PSMA caTCR加串联双scFv效应细胞和/或抗PSMA caTCR加CSR效应细胞)将效应细胞(例如初级T细胞)的特异性重新引导至PSMA(例如在例如癌细胞的细胞的表面上表达或与其相关联的PSMA)。因此，本文提供了一种刺激个体中针对目标细胞群体和/或组织(例如包含表达PSMA的细胞的目标细胞群体和/或组织)的效应细胞介导的反应(例如T细胞介导的免疫反应)的方法，所述方法包含向所述个体施用本文所述的抗PSMA效应细胞(例如T细胞)的步骤。
抗PSMA效应细胞(例如T细胞)，例如本文中的其它地方进一步详细描述的那些效应细胞，可输注至有需要的个体(例如患有或怀疑患有PSMA相关疾病或病症，例如癌症的个体)。输注的抗PSMA效应细胞能够杀死个体中的表达PSMA的细胞。不同于治疗性抗体，抗PSMA效应细胞(例如T细胞)能够在体内复制，产生可持续控制肿瘤的长期持久性。在一些实施例中，抗PSMA效应细胞(例如T细胞)发展成特异性记忆T细胞，其可再激活以抑制任何其它肿瘤形成或生长。
本文所述的抗PSMA效应细胞(例如T细胞)还可以充当用于个体中的离体免疫接种和/或体内疗法的一种类型疫苗。在一些实施例中，个体为哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物为人类或非人类灵长类动物(例如恒河猴或食蟹猕猴)。
关于离体免疫接种，在细胞施用于个体前在体外进行以下中的至少一个：i)扩增细胞；ii)将编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的核酸引入细胞；和/或iii)将细胞冷冻保存。
离体程序是所属领域中众所周知的且在下文中更全面论述。简单地说，将细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)从个体(例如哺乳动物，优选人类)分离并用编码本文所公开的抗PSMA CAR、抗PSMA caTCR、抗PSMA串联多特异性scFv(例如抗PSMA串联双scFv)和/或抗PSMA CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。
在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)，且进一步用编码多特异性scFv(例如串联双scFv)或CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR和多特异性scFv(例如串联双scFv)的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR和CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，多特异性scFv(例如串联双scFv)靶向PSMA。在一些实施例中，多特异性scFv(例如串联双scFv)靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，CSR靶向PSMA。在一些实施例中，CSR靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。
在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)或抗PSMA CSR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)，且进一步用编码CAR或caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)或抗PSMA CSR和CAR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)用编码抗PSMA串联多特异性scFv(例如串联双scFv)或抗PSMA CSR和caTCR的核酸、核酸集合、载体或载体集合进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)。在一些实施例中，CAR靶向PSMA。在一些实施例中，CAR靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。在一些实施例中，caTCR靶向PSMA。在一些实施例中，caTCR靶向不同抗原(例如除PSMA外的抗原)。
在一些实施例中，如上所述进行基因修饰(即，转导或转染，例如体外)的细胞(例如T细胞，例如αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞)施用于接受者。在一些实施例中，接受者为哺乳动物，例如类，例如患有或怀疑患有PSMA相关疾病的人。在一些实施例中，经过基因修饰的细胞所施用的接受者是从中获得细胞的个体。这类经过基因修饰的免疫细胞称为“自体抗PSMA效应细胞”。在一些实施例中，经过基因修饰的免疫细胞所施用的接受者不是从中获得细胞的个体。这类经过基因修饰的免疫细胞称为“异源抗PSMA效应细胞”。在一些实施例中，异源抗PSMA效应细胞相对于接受者为同种异体、同基因型或异种的。
用于造血干细胞和祖细胞的离体扩增的程序描述于美国专利第5,199,942号，其以全文引用的方式并入本文中。其它合适方法也是所属领域中已知的，且本公开不限于任何特定的细胞离体扩增方法。简单地说，T细胞离体培养和扩增包含：(1)从个体(例如哺乳动物，例如人)从外周血收获物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增这类细胞。除美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子之外，例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-试剂盒配体的其它因子也可以用于培养和扩增细胞。
除在离体免疫接种方面使用基于细胞的疫苗之外，本公开还提供了用于体内免疫接种以在有需要的个体(例如患有或怀疑患有PSMA相关疾病，例如癌症的个体)中引发针对抗原的免疫反应的组合物和方法。
本公开的抗PSMA效应细胞(例如T细胞)可单独或呈与稀释剂和/或例如IL-2或其它细胞因子或细胞群体的其它组分组合的药物组合物施用。这类组合物可包含缓冲液，例如中性缓冲生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水等等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些实施例中，效应细胞(例如T细胞)组合物被配制用于静脉内施用。
本公开的抗PSMA效应细胞(例如T细胞)有待施用于有需要的个体的确切量可由医师，考虑个体年龄、体重、肿瘤尺寸、疾病阶段和/或严重程度、癌转移存在或不存在、个体状况和其它因素确定。在一些实施例中，包含本公开的抗PSMA效应细胞(例如T细胞)的药物组合物以每公斤体重约104至约109个细胞，例如每公斤体重约104至约105个、约105至约106个、约106至约107个、约107至约108个或约108至约109个细胞中的任一值，包括那些范围内的所有整数值的剂量施用。抗PSMA效应细胞(例如T细胞)组合物还可以呈这些剂量施用多次。细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见例如罗森博格(Rosenberg)等人，新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)319:1676,1988)。特定患者的最优剂量和治疗方案可由医药领域的技术人员通过监测患者的疾病征象和相应调整治疗而容易地确定。
在一些实施例中，可能需要向个体施用激活的本文所述的抗PSMA效应细胞(例如T细胞)，随后再抽取血液(或进行单采血液成分术)，激活从再抽取的血液获得的本文所述的抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA T细胞)，并向个体再输注激活和扩增的抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA T细胞)。在一些实施例中，此过程每几周进行多次。在一些实施例中，从10cc至400cc的抽取血液激活抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA T细胞)。在一些实施例中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽取血液激活抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA T细胞)。
本文所述的抗PSMA效应细胞(例如抗PSMAT细胞)的施用可以通过任何适宜方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。包含本文所述的抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA T细胞)的组合物可皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用患者。在一些实施例中，包含本公开的抗PSMA效应细胞(例如抗PSMA T细胞)的组合物通过直接静脉内注射至肿瘤、淋巴结或疾病部位中施用。
提供了治疗个体的PSMA相关疾病的方法，其包含向所述个体施用有效量的包含本公开的抗PSMA效应细胞(例如抗PSMAT细胞)的组合物。在一些实施例中，PSMA相关疾病为癌症。在一些实施例中，癌症为例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，个体为人。在一些实施例中，包含抗PSMA效应细胞(例如抗PSMAT细胞)的组合物所施用的个体是患有(例如经诊断患有)或怀疑患有PSMA相关疾病的个体。在一些实施例中，PSMA相关疾病难以用至少一种常规治疗医治。在一些实施例中，包含抗PSMA效应细胞(例如抗PSMAT细胞)的组合物所施用的个体是患有(例如经诊断患有)PSMA相关疾病且在针对PSMA相关疾病的至少一种常规治疗之后复发的个体。
癌症
本文所述的抗PSMA构建体和效应细胞可用于治疗癌症，例如PSMA相关癌症。可使用本文所述的任一方法治疗的癌症包括未血管化，或尚未大体上血管化的肿瘤，以及血管化肿瘤。癌症可包含非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包含实体瘤。待用本文所述的抗PSMA构建体和效应细胞治疗的癌症类型包括(但不限于)癌瘤、母细胞瘤和肉瘤，以及白血病或淋巴恶性病、良性和恶性肿瘤以及恶性病，例如黑色素瘤。还涵盖成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血性)癌的实例包括白血病，例如急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和骨髓母细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(例如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高度恶性形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病、骨髓发育不良综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。
实体瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可能是良性或恶性的。不同类型的实体瘤是关于形成其的细胞类型进行命名(如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤(例如肉瘤和癌瘤)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌瘤、淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、子宫癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓性癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、威耳姆士瘤(Wilms'tumor)、子宫颈癌(例如子宫颈癌瘤和侵袭前子宫颈发育不良)、肛门癌、肛管癌或肛肠癌、阴道癌、外阴癌(例如鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌和纤维肉瘤)、阴茎癌、口咽癌症、头癌(例如鳞状细胞癌)、颈癌(例如鳞状细胞癌)、睪丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎上皮癌、绒膜癌、肉瘤、雷迪格细胞瘤(Leydig cell tumor)、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤和脂肪瘤)、膀胱癌、黑色素瘤、子宫癌(例如子宫内膜癌)、尿道上皮癌(例如鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌、尿管癌和膀胱癌)和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤(例如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、神经胶母细胞瘤(又称为多形性神经胶母细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、胚细胞瘤、神经管胚细胞瘤、神经鞘瘤颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在一些实施例中，过度表达PSMA的癌症为前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌为腺癌。在一些实施例中，前列腺癌为肉瘤、神经内分泌肿瘤、小细胞癌、导管癌或淋巴瘤。在一些实施例中，根据惠特摩尔-朱厄特分期系统(Whitmore-Jewett staging system)、TNM(即，肿瘤、结节、癌转移)分期系统或AUA(修改的惠特摩尔-朱厄特)分期系统，前列腺癌处于A、B、C或D四期中的任一期。在一些实施例中，前列腺癌为A期前列腺癌(例如无法在直肠测验期间感知癌症)。在一些实施例中，前列腺癌为B期前列腺癌(例如肿瘤涉及前列腺内的更多组织，且可在直肠测验期间感知，或通过进行的活检因高PSA含量而发现)。在一些实施例中，前列腺癌为C期前列腺癌(例如癌症已扩散出前列腺到达附近组织)。在一些实施例中，前列腺癌为D期前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌为雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)。在一些实施例中，前列腺癌为雄激素依赖性前列腺癌。在一些实施例中，前列腺癌难以用激素疗法治疗。
癌症治疗可例如通过肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、达至进展的时间、生存持续时间、无恶化生存期、整体反应率、反应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性评估。可采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射成像测量反应。
用于诊断和成像的方法
本文所述的标记的抗PSMA构建体(例如特异性结合于在例如癌细胞的细胞的表面上表达的PSMA的构建体)可用于达成诊断目的，以例如检测、诊断PSMA相关疾病或病症、例如与PSMA的表达、异常表达和/或活性相关联的疾病或病症、监测其进展，和/或监测患者对PSMA相关的疾病的治疗的反应。示例性PSMA相关疾病或病症包括本文所述的疾病和病症中的任一种，例如癌症(例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)。举例来说，本文所述的抗PSMA构建体可用于原位、体内、离体和体外诊断分析或成像分析中。
在一些实施例中，提供诊断个体(例如哺乳动物，例如人类或非人类灵长类动物，例如恒河猴或食蟹猕猴)中与PSMA表达或异常表达相关联的疾病或病症的方法。所述方法包含检测所述个体中异常表达PSMA的细胞。在一些实施例中，提供了一种诊断个体(例如哺乳动物，例如人类或非人类灵长类动物，例如恒河猴或食蟹猕猴)中PSMA相关疾病或病症的方法，其包含(a)向所述个体施用有效量的本文所述的标记的抗PSMA构建体；以及(b)测定所述个体中标记的水平，使得标记的水平超过阈值水平指示所述个体患有所述疾病或病症。阈值水平可以通过多种方法测定，包括例如通过根据本文所述的诊断方法在患有所述疾病或病症的第一组个体和未患所述疾病或病症的第二组个体中检测标记，和将阈值设定为允许区分第一组与第二组的水平。在一些实施例中，阈值水平为零，且方法包含确定个体中标记的存在或不存在。在一些实施例中，所述方法进一步包含在步骤(a)的施用后等待一段时间间隔，以允许标记的抗PSMA构建体优先集中在个体中表达PSMA的部位(且清除未结合的标记的抗PSMA构建体)。在一些实施例中，所述方法进一步包含减去标记的背景水平。背景水平可以通过多种方法测定，包括例如通过检测个体中在施用标记的抗PSMA构建体前的标记，或通过根据本文所述的诊断方法检测未患所述疾病或病症的个体中的标记。在一些实施例中，疾病或病症为癌症。在一些实施例中，癌症选自例如由以下组成的群组：前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，个体为人。在一些实施例中，怀疑个体患有与PSMA表达、异常表达和/或活性相关的疾病或病症。
在一些实施例中，提供了一种诊断个体(例如哺乳动物，例如人类或非人类灵长类动物，例如恒河猴或食蟹猕猴)的PSMA相关疾病或病症的方法，其包含(a)使根据本文所述的实施例中的任一个的标记的抗PSMA构建体与获自或来源于所述个体的样品(例如均质化组织)接触；以及(b)测定样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，使得与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目的值超过阈值水平指示所述个体患有所述疾病或病症。阈值水平可以通过多种方法测定，包括例如通过根据本文所述的诊断方法检测患有所述疾病或病症的第一组个体和未患所述疾病或病症的第二组个体中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，和将阈值设定为允许区分第一组与第二组的水平。在一些实施例中，阈值水平为零，且方法包含确定样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的存在或不存在。在一些实施例中，方法进一步包含减去与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目的背景水平。背景水平可以通过多种方法测定，包括例如通过测定个体中在施用标记的抗PSMA构建体前与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，或通过根据本文所述的诊断方法检测未患所述疾病或病症的个体中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目。在一些实施例中，疾病或病症为癌症。在一些实施例中，癌症选自例如由以下组成的群组：前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，癌症为转移性的。在一些实施例中，个体为人。在一些实施例中，怀疑个体患有PSMA相关疾病或病症。
在一些实施例中，提供了一种诊断个体(例如哺乳动物，例如人类或非人类灵长类动物，例如恒河猴或食蟹猕猴)的PSMA相关癌症的方法，其包含(a)使根据本文所述的实施例中的任一个的标记的抗PSMA构建体与来源于所述个体的组织样品接触；以及(b)测定组织样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，使得组织样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目的值超过阈值水平指示所述个体患有PSMA相关癌症。阈值水平可以通过多种方法测定，包括例如通过根据本文所述的诊断方法测定来自患有PSMA相关癌症的第一组个体的组织样品和来自未患PSMA相关癌症的第二组个体的组织样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，和将阈值设定为允许区分来自第一组与第二组的组织样品的水平。在一些实施例中，阈值水平为零，且方法包含测定组织样品中与标记的抗PSMA抗体部分结合的细胞的存在或不存在。在一些实施例中，方法进一步包含减去与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目的背景水平。背景水平可以通过多种方法测定，包括例如通过测定个体中在与标记的抗PSMA构建体接触前组织样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，或通过根据本文所述的诊断方法测定组织样品中与标记的抗PSMA构建体结合的细胞的数目，所述组织样品获自或来源于未患PSMA相关癌症的个体。在一些实施例中，PSMA相关癌症选自例如由以下组成的群组：前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌。在一些实施例中，个体为人。在一些实施例中，怀疑个体患有PSMA相关癌症。
本文提供的抗PSMA构建体可用于使用所属领域的技术人员已知的方法分析生物样品中PSMA的水平。适合标记为所属领域中已知且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、鎝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、钐(153Sm)、镏(177Lu)、钆(159Gd)、钷(149Pm)、镧(140La)、镱(175Yb)、钬(166Ho)、钇(90Y)、钪(47Sc)、铼(186Re、188Re)、镨(142Pr)、铑(105Rh)和钌(97Ru)；鲁米诺(luminol)；荧光标记，例如荧光素和若丹明；以及生物素。
所属领域中已知的技术可应用于本文提供的标记的抗PSMA构建体。这类技术包括(但不限于)使用双官能结合剂(参见例如美国专利第5,756,065号；第5,714,631号；第5,696,239号；第5,652,361号；第5,505,931号；第5,489,425号；第5,435,990号；第5,428,139号；第5,342,604号；第5,274,119号；第4,994,560号；和第5,808,003号)。除上述分析以外，所属领域的技术人员可使用各种体内和离体分析。举例来说，可将个体体内的细胞暴露于任选地用可检测标记，例如放射性同位素进行标记的抗PSMA构建体，且可例如通过外部扫描放射性或通过分析来源于预先暴露于抗PSMA构建体的个体的样品(例如切片或其它生物样品)来评估抗PSMA抗体部分与细胞的结合。
制品和试剂盒
本文提供了包含适用于诊断或治疗PSMA相关疾病，例如癌症(例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)，用于递送抗PSMA构建体或构建体组合至在表面上表达PSMA的细胞，或用于分离或检测个体中表达PSMA的细胞的材料的制品。所述制品可包含容器和容器上或容器随附的标签或药品说明书。适合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。一般来说，容器装有有效诊断或治疗本文所述的PSMA相关疾病或病症的组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可为具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本文提供的抗PSMA构建体或构建体组合。标签或药品说明书指示所述组合物用于治疗特定病状。标签或药品说明书将进一步包含关于向有需要的个体(例如患有或怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体)施用抗PSMA构建体或构建体组合(或例如包含这类构建体或构建体组合的组合物)的说明书。还涵盖包含组合疗法(例如除本文所述的抗PSMA构建体或构建体组合之外的一或多种治疗剂)的制品和试剂盒。
药品说明书是指治疗性产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或关于使用这类治疗性产品的警告的信息。在一些实施例中，药品说明书指示组合物用于治疗PSMA相关癌症(例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)。
另外，制品可进一步包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、无菌注射用水(SWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)和右旋糖溶液。其可进一步包括就商业和使用者观点来说所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
还提供了适用于达成多个目的的试剂盒，例如用于治疗本文所述的PSMA相关疾病或病症，用于递送抗PSMA构建体或构建体组合至在表面上表达PSMA的细胞，或用于分离或检测个体中结合PSMA的细胞，任选地与制品组合。本文所提供的试剂盒包括一或多个包括包含抗PSMA构建体或构建体组合(或其单位剂型和/或制品)的组合物的容器，且在一些实施例中，进一步包含另一药剂(例如本文所述的药剂)和/或根据本文所述的任一方法的使用说明书。试剂盒可进一步包含选择适合于治疗的个体的说明。虽然供应在本文中的试剂盒中的说明书通常是在标签或药品说明书上的书面说明书(例如试剂盒中所包括的纸张)，但机器可读说明书(例如在存储磁盘或光盘上携带的说明书)也是可接受的。
举例来说，在一些实施例中，试剂盒包括包含抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、单特异性抗PSMA构建体、多特异性抗PSMA构建体(例如双特异性抗PSMA抗体)或抗PSMA免疫结合物)或抗PSMA构建体组合(例如抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR)的组合物。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含抗PSMA构建体或构建体组合的组合物，和b)有效量的至少一种其它治疗剂。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含抗PSMA构建体或构建体组合的组合物，和b)关于向个体施用组合物以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。抗PSMA构建体(或构建体组合)和其它药剂可存在于单独容器或单一容器中。举例来说，试剂盒可包含一种独特组合物或两种或更多种组合物，其中一种组合物包含抗PSMA构建体或构建体组合且另一组合物包含另一药剂。
在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、单特异性抗PSMA构建体、多特异性抗PSMA构建体(例如双特异性抗PSMA抗体)、抗PSMA免疫结合物或本文所述的其它抗PSMA构建体)或抗PSMA构建体组合(例如抗PSMA caTCR+抗PSMACSR)的组合物；和b)用于将抗PSMA构建体或构建体组合与细胞(例如来源于个体的细胞，例如免疫细胞)组合以形成包含抗PSMA构建体-细胞结合物的组合物且向个体施用抗PSMA构建体-细胞结合物组合物以治疗PSMA相关疾病(包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)的说明书。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含抗PSMA构建体或构建体组合(例如本文所述)的组合物和b)细胞(例如细胞毒性细胞)。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含抗PSMA构建体或构建体组合(例如本文所述)的组合物；b)细胞(例如细胞毒性细胞)；和c)用于将抗PSMA构建体或构建体组合与细胞组合以形成包含抗PSMA构建体-细胞结合物的组合物且向个体施用抗PSMA构建体-细胞结合物组合物以治疗PSMA相关疾病(包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌)的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括包含抗PSMA构建体或构建体组合(例如本文所述)与细胞(例如细胞毒性细胞)联合的组合物。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含抗PSMA构建体或构建体组合(例如本文所述)的组合物与细胞(例如细胞毒性细胞)联合；和b)用于将组合物施用于个体以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。在一些实施例中，联合是通过抗PSMA构建体或构建体组合与细胞表面上的分子结合。在一些实施例中，联合是通过将抗PSMA构建体或构建体组合的一部分插入至细胞外膜中。
在一些实施例中，试剂盒包含编码抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、单特异性抗PSMA构建体、多特异性抗PSMA构建体(例如双特异性抗PSMA构建体(例如双特异性抗PSMA抗体，例如抗PSMA串联双scFv))、抗PSMA CAR、抗PSMA免疫结合物或本文所述的其它抗PSMA构建体)、本文所述的抗PSMA构建体组合或其多肽部分的核酸(或核酸集合)。在一些实施例中，试剂盒包含：a)编码抗PSMA构建体(或构建体组合)或其多肽部分的核酸(或核酸集合)，和b)用于表达核酸(或核酸集合)的宿主细胞(例如效应细胞，例如T细胞)。在一些实施例中，试剂盒包含：a)编码抗PSMA构建体(或构建体组合)或其多肽部分的核酸(或核酸集合)；和b)用于i)在宿主细胞(例如效应细胞，例如T细胞)中表达抗PSMA构建体(或构建体组合)，ii)制备包含抗PSMA构建体(或构建体组合)的组合物或表达抗PSMA构建体(或构建体组合)的宿主细胞(例如效应细胞，例如T细胞)，和iii)向个体施用包含抗PSMA构建体(或构建体组合)的组合物或表达抗PSMA构建体(或构建体组合)的宿主细胞以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。在一些实施例中，宿主细胞(例如效应细胞，例如T细胞)来源于个体。在一些实施例中，试剂盒包含：a)编码抗PSMA构建体(或构建体组合)或其多肽部分的核酸(或核酸集合)；b)用于表达核酸(或核酸集合)的宿主细胞(例如效应细胞，例如T细胞)；和c)用于i)在宿主细胞中表达抗PSMA构建体(或构建体组合)，ii)制备包含抗PSMA构建体(或构建体组合)的组合物或表达抗PSMA构建体(或构建体组合)的宿主细胞，和iii)向个体施用包含抗PSMA构建体(或构建体组合)的组合物或表达抗PSMA构建体(或构建体组合)的宿主细胞以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含编码抗PSMA CAR的核酸。在一些实施例中，试剂盒包括包含编码抗PSMA CAR的核酸的载体。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含编码抗PSMACAR的核酸的载体；和b)用于i)将载体引入至效应细胞，例如来源于个体的T细胞中，ii)制备包含抗PSMA CAR效应细胞的组合物，和iii)向个体施用抗PSMA CAR效应细胞组合物以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含编码抗PSMA caTCR的核酸。在一些实施例中，试剂盒包括包含编码抗PSMA caTCR的核酸的载体。在一些实施例中，试剂盒进一步包含编码双特异性构建体，例如串联双scFv(例如抗PSMA串联双scFv)或CSR(例如抗PSMA CSR)的核酸。在一些实施例中，试剂盒包含：a)包含编码抗PSMA caTCR的核酸的载体；和b)用于i)将载体引入至效应细胞，例如来源于个体的T细胞中，ii)制备包含抗PSMA caTCR效应细胞的组合物，和iii)向个体施用抗PSMA caTCR效应细胞组合物以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包含：a)包含编码双特异性构建体，例如串联双scFv(例如抗PSMA串联scFv)的核酸的载体；和b)用于i)与编码抗PSMA caTCR的载体同时或依次将编码串联双scFv的载体引入至宿主细胞中，ii)制备包含抗PSMA caTCR加串联双scFv效应细胞的组合物，和iii)向个体施用抗PSMA caTCR加串联双scFv效应细胞组合物以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包含：a)包含编码CSR(例如抗PSMA CSR)的核酸的载体；和b)用于i)与编码抗PSMA caTCR的载体同时或依次将编码CSR的载体引入至宿主细胞中，ii)制备包含抗PSMA caTCR加CSR效应细胞的组合物，和iii)向个体施用抗PSMA caTCR加CSR效应细胞组合物以治疗PSMA相关疾病，包括例如前列腺癌(例如激素难治性或转移性前列腺癌)、肾细胞癌细胞(例如透明细胞肾细胞癌)、子宫癌或肝癌的说明书。
本文所述的试剂盒是在适合包装中。适合包装包括(但不限于)小瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如密封Mylar或塑料袋)等等。试剂盒可任选地提供例如缓冲剂的额外组分和说明性信息。本申请因此还提供了制品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、罐、柔性包装等等。
与包含抗PSMA构建体(或构建体组合)的组合物的使用相关的说明书通常包括关于所期望治疗的剂量、给药时程和施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。举例来说，可提供含有足够剂量的抗PSMA构建体(例如全长抗PSMA抗体、多特异性抗PSMA分子(例如双特异性抗PSMA抗体)、抗PSMA CAR、抗PSMA免疫结合物或本文所述的其它抗PSMA构建体或构建体组合)以为个体提供长时间，例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更多个月有效治疗的试剂盒。试剂盒还可以包括多个单位剂量的抗PSMA构建体(或构建体组合)和药物组合物和使用说明书且以对于在药房，例如医院药房和配药房中存储和使用来说足够的量包装。
所属领域的技术人员将认识到，在本申请的范围和精神内，数个实施例为可能的。现将参照以下非限制性实例来更详细地描述实施例。以下实例进一步说明本公开的方法和组合物，但当然，不应解释为以任何方式限制其范围。
实例
实例1：材料与方法
下文论述的试剂用于实例2-9中。
细胞系包括：前列腺癌细胞系：LNCaP(ATCC CRL-1740，PSMA阳性)、PC-3(ATCCCRL-1438，PSMA阴性)、PC-3-PSMA(通过慢病毒转导进行工程化以表达PSMA的PC-3)，T细胞系：Jurkat克隆E61(ATCC TIB-152)和Jurkat-PSMA(通过慢病毒转导进行工程化以表达PSMA的Jurkat)。细胞系在37℃/5％CO2下于补充有10％FBS、2.05mM L-谷酰胺的RPMI 1640(海克隆(Hyclone)，SH30027.02)中培养。
以下实例中使用的其它PSMA阳性人类癌细胞系包括MDA PCa 2b、VCaP、22Rv1、Caki-1、HCC1482和HuH-7。还使用了以下PSMA阴性人类癌细胞系：PrEC LH、PC-3、NCI-H660和DU 145。
实例2.选择和表征对PSMA具有特异性的scFv
PSMA特异性抗体的鉴定
由优瑞科生物技术公司(Eureka Therapeutics)构建的一批人类scFv抗体噬菌体展示文库(多样性＝10×1010)(即，
Figure BDA0002905287580001341
噬菌体展示文库)用于选择特异性针对PSMA的人类mAb。具体地说，
Figure BDA0002905287580001342
噬菌体展示文库用于淘选被工程化成表达PSMA的Jurkat细胞系。亲本Jurkat细胞系用于阴性选择。通过流式细胞术分析，发现在这次筛检中分离的两种独特scFv克隆，即克隆A和克隆B，对PSMA具有特异性。克隆A和克隆B的序列提供于下表13中。每种scFv中的VL加下划线，每种scFv中的VH加双下划线，且接头呈粗斜体字。CDR呈加下划线的粗体字和加双下划线的粗体字。
表13：抗PSMA scFv克隆
Figure BDA0002905287580001343
经由流式细胞术评估克隆A和克隆B针对PSMA阳性细胞系和PSMA阴性细胞系的结合特异性。PSMA阳性细胞系包括LNCaP，一种表达PSMA的人类前列腺腺癌细胞系；PC3-PSMA，一种被工程化成表达hPSMA的PSMA阴性人类前列腺癌细胞系；以及Jurkat-PSMA，即一种被工程化成表达hPSMA的PSMA阴性人类T淋巴细胞系。PSMA天然细胞系包括：PC3和Jurkat。如图1中所示，克隆A与B证明特异性结合于表达PSMA的细胞系。
实例3：细胞毒性分析和干扰素-γ(IFN-γ)释放分析中表达抗PSMA CAR构建体的T细胞的表征
为了评估克隆A和克隆B重新引导T细胞和产生细胞毒性和释放IFN-γ的能力，将编码克隆A和克隆B ScFv的核酸克隆至CD28/CD3ζ嵌合抗原受体(CAR)构建体中，且将每种CAR(即，克隆A-CAR和克隆-B CAR)转导至初级人类T细胞中。克隆A-CAR和克隆B-CAR的氨基酸序列提供于下表14中。每种CAR包含(从N端至C端依序)抗PSMA scFv(加下划线)、myc标签(粗体、加下划线)、接头(粗斜体字)、来源于CD28的序列(加双下划线)和来源于CD3ζ的序列(粗体、加双下划线)。
表14
Figure BDA0002905287580001351
模拟和用编码CAR的核酸转导的T细胞在1:1效应细胞与目标细胞(E:T)比率下培育16小时。这些分析中使用的目标细胞包括：LNCaP(PSMA+)、PC3(PSMA-)、PC3-PSMA(PSMA+)、Jurkat(PSMA-)和Jurkat-PSMA(PSMA+)。
使用LDH细胞毒性分析(普洛麦格，G1780)评估细胞毒性。如图2中所示，当表达克隆A-CAR或克隆B-CAR构建体的效应细胞与表达PSMA的细胞一起培育时观测到目标细胞的特异性杀死。在模拟效应细胞(即，不表达靶向PSMA的CAR的模拟T细胞)或PSMA阴性目标细胞下未观测到特异性杀死。
通过测量IFN-γ释放来评估表达克隆A-CAR或克隆B-CAR的T细胞的目标依赖性激活。简单地说，如上所述，模拟和转导的T细胞在1:1效应细胞与目标细胞(E:T)比率下培育16小时。使用Bio-Plex Pro人类细胞因子8-plex分析(伯乐(Bio-Rad)，M50000007A)来测量培养上清液中的IFN-γ水平。如图3中所示，当表达克隆A-CAR或克隆B-CAR的T细胞与表达PSMA的细胞一起培育时检测到IFN-γ的特异性释放。在模拟效应细胞(即，不表达靶向PSMA的CAR的模拟T细胞)或PSMA阴性目标细胞下未观测到特异性释放。
实例4：抗PSMA scFv克隆的亲和力成熟
使用例如GeneMorph II随机突变诱发试剂盒(安捷伦科技有限公司(AgilentTechnologies))，使编码克隆A和克隆B scFv的DNA经历随机突变诱发。在突变诱发之后，将DNA序列克隆至表达scFv的噬菌粒载体中以构建变异抗体噬菌体文库。针对克隆A和克隆B构建单独突变文库。针对与相应亲本克隆相比增强的与细胞表面人PSMA的结合，测试来自富集的噬菌体淘选池的个别噬菌体克隆(例如变异克隆)。此外，进行竞争细胞结合分析法以比较变异克隆的结合亲和力与亲本克隆的结合亲和力。
简单地说，与相应亲本克隆相比，变异克隆的相对结合亲和力通过抗体滴定流式细胞术，使用例如LNCaP、PC3、PC3-PSMA、Jurkat和Jurkat-PSMA细胞测定。基于流式细胞术结合信号计算每种变异克隆的EC50和表观KD。
又如实例3中所述，针对重新引导T细胞和产生细胞毒性和释放IFN-γ的能力，评估变异克隆。作为基础，平行评估亲本克隆，即克隆A和克隆B，以测量变异克隆展现的细胞毒性和IFN-γ释放水平的相对变化。
实例5：PSMA特异性scFv克隆所结合的表位的表征
表位结合
为了评定克隆A、克隆B和其亲和力成熟变体所结合的PSMA的表位，如下进行结合竞争分析法：克隆A和B每一个结合于荧光标签。将表达PSMA的细胞系与1μg/ml未标记的克隆A一起培育。在预培育之后，在不洗涤下将递增浓度(例如0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL)的标记克隆B直接加入至样品，且再培育30分钟。在阻断之后，使用FACS进行检测和分析。由MFI(平均荧光强度)确定结合百分比且样品针对同型对照物标准化。进行一组平行实验，其中将表达PSMA的细胞系与1μg/ml未标记克隆B一起在递增浓度(例如0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL)的标记克隆A存在下培育。进行另外的实验，其中表达PSMA的细胞系与1μg/ml未标记J591(即，单克隆鼠类抗hPSMA抗体)一起在递增浓度的标记克隆A和在单独一组实验中递增浓度的标记克隆B存在下培育。
表位定位
为了鉴定作为克隆A和克隆B(以及其亲和力成熟变体)所结合的表位的组分的PSMA残基，使用标准重组DNA技术产生各自表达在胞外域中包含至少一个丙氨酸取代的不同PSMA突变体的多种哺乳动物细胞系。证实PSMA突变体在各哺乳动物细胞系的表面上的表达。经由流式细胞术，针对与表达各不同PSMA突变体的细胞的结合，评估克隆A和B(和其亲和力成熟变体)。KO7辅助噬菌体作为阴性对照物平行评估。还平行评估J591，一种单克隆鼠类抗hPSMA抗体。
实例6：抗PSMA双特异性抗体
利用人类抗PSMA抗体产生双特异性抗体构建体
此实例描述了具有结合原生格式的人PSMA(即，细胞表面表达的PSMA)的第一抗体部分(例如scFv)和结合T细胞上的CD3的第二抗体部分(例如scFv)的抗PSMA双特异性抗体构建体(串联双scFv)的构建。本文所述的串联双scFv可用于引导T细胞来杀死表达人PSMA的目标细胞。
串联双scFv利用单链格式构建，所述单链格式包含位于N端的克隆A或克隆B的VL-VH scFv序列和位于C端的抗人类CD3ε小鼠单克隆scFv(抗PSMA抗CD3串联双scFv；参见例如布瑞斯奇(Brischwein,k.)等人，《分子免疫学》43:1129-1143,2006)。使用例如金唯智(Genewiz)或金斯瑞(Genscript)合成编码克隆A scFv、克隆B scFv和抗人类CD3εscFv的DNA片段并使用标准重组DNA技术亚克隆至例如pQD-T(优瑞科生物技术公司)的哺乳动物表达载体中。六聚组氨酸标签HHHHHH(SEQ ID NO:158)插入每个串联双scFv的C端，用于纯化和检测。
HEK293细胞用编码克隆A-串联双scFv或克隆B-串联双scFv的表达载体转染并培养七天，以表达串联双scFv。基于细胞培养物的体积，利用FPLC AKTA系统的HisTrap HP柱(通用医疗(GE healthcare))或His GraviTrap柱(通用医疗)从HEK293细胞上清液中纯化每个串联双scFv。通过凝胶电泳，在非还原条件下，测量纯化的串联双scFv的分子量。预期观测到作为凝胶上的主要物种的与每种构建体(克隆A抗PSMA抗CD3串联双scFv和克隆B抗PSMA抗CD3串联双scFv)对应的条带(约98kD)。
克隆A抗PSMA抗CD3串联双scFv和克隆B抗CD3串联双scFv的氨基酸序列提供于下表15中。每个串联双scFv中的抗PSMA scFv加下划线。每个串联双scFv中的抗CD3 scFv加双下划线。连接抗PSMA scFv和抗CD3 scFv的接头呈粗斜体字。
表15
Figure BDA0002905287580001371
Figure BDA0002905287580001381
如下所述进一步表征串联双scFv。
评估抗PSMA双特异性抗体构建体与人类癌细胞系的结合
经由流式细胞术，评估克隆A抗PSMA抗CD3串联双scFv和克隆B抗PSMA抗CD3串联双scFv构建体与表达人PSMA的癌细胞系(包括例如前列腺癌细胞系LNCaP、MDA PCa 2b、VCaP和22Rv1；肾癌细胞系Caki-1；子宫癌细胞系HCC1482；以及肝癌细胞系HuH-7)的结合。平行评估不表达PSMA的人类癌细胞系(例如前列腺癌细胞系PrEC LH、PC-3、NCI-H660、DU 145)的结合。平行测试其它双特异性抗体构建体(包含例如非PSMA结合scFv与抗人类CD3εscFv和/或例如包含来自J591的PSMA结合部分的scFv和抗人类CD3εscFv)。
实例7：表达嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)构建体的T细胞的产生和表征
使用标准分子生物学技术将编码来自克隆A抗PSMA scFv或克隆B抗PSMA scFv的VH和VL域的核酸各与编码Ig CH1和CL恒定区和γδTCR的跨膜域的核酸融合，产生编码克隆A-caTCR和克隆B-caTCR的核酸。克隆A-caTCR和克隆B-caTCR构建体的示意图提供于图4中。克隆A-caTCR和克隆B-caTCR的氨基酸序列提供于下表16中。每条链1中的抗PSMA VH/CH序列加下划线。每条链1中的TCRδ链序列加双下划线。每条链2中的抗PSMA VL/CL序列为粗体加下划线。每条链2中的TCRγ链序列呈斜体字。
表16
Figure BDA0002905287580001391
使用WO 2017/070608、PCT/US2018/029217(现作为WO 2018/200582公开)和米隆(Milone)等人(《分子治疗》,17:1453-1464,2009)中所描述方法产生克隆A-caTCR T细胞和克隆B-caTCR T细胞。
对由通过每种抗PSMA caTCR激活所产生的T细胞表型进行表征。将克隆A-caTCR-T细胞单独培育，与表达PSMA的LNCaP细胞共培育，或与其中已经剔除PSMA的LNCaP细胞以2:1的效应细胞:目标细胞的比率在布雷菲尔德菌素(brefeldin)存在下共培育。使用克隆B-caTCR-T细胞进行平行组培育。在培育之后，经由流式细胞术分析克隆A-caTCR-T细胞和克隆B-caTCR-T细胞的包括例如CD69和CD25的激活标志物以及包括例如CD107a的细胞脱粒标志物的表达。另外，进行克隆A-caTCR-T细胞和克隆B-caTCR-T细胞的细胞内流式细胞分析以测量与未表达PSMA的细胞相比，回应于表达PSMA的细胞，由CD4+caTCR+细胞和CD4-CD8+caTCR+细胞表达的TNFα、IL-2和IFNγ的水平。
如实例3中所述评估克隆A-caTCR-T细胞和克隆B-caTCR-T细胞的杀死肿瘤活性。一定百分比的克隆A-caTCR阳性、克隆B-caTCR阳性、克隆A-caTCR阴性和克隆B-caTCR阴性T细胞各与多种表达PSMA和未表达PSMA的细胞系，包括例如LNCaP、PC3、PC3-PSMA、Jurkat和Jurkat-PSMA共同培养。如实例3中所述，测量一系列效应细胞:目标细胞比率中目标细胞的特异性溶解。
基于荧光的分析用于评定克隆A-caTCR-T细胞和克隆B-caTCR-T细胞在抗原刺激后的体外增殖。简单地说，使克隆A-caTCR-T细胞或克隆B-caTCR-T进行血清饥饿过夜，然后在室温下用例如1μM CFSE(赛默飞世尔(ThermoFisher Scientific))标记5分钟。使标记细胞再悬浮于无血清培养基中且与目标细胞(例如LNCaP细胞、PC3-PSMA细胞或Jurkat-PSMA细胞)在2:1的效应细胞:目标细胞比率下共同培养。为顾及转导效率的差异，供体匹配的未转导T细胞用来标准化受体阳性细胞的百分比。通过流式细胞术监测细胞分裂。
实例8：包含人类IgG1 Fc区的全长抗PSMA抗体的产生和表征
在例如HEK293和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中克隆A和克隆B被重新格式化为包含人类IgG1 Fc区的全长抗体，如(富松(Tomimatsu K.)等人，《生物科学生物技术和生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)》73(7):1465-1469,2009)所描述。简单地说，将抗体可变区克隆A和克隆B各亚克隆至哺乳动物表达载体中，利用匹配的人类λ或κ轻链恒定区和人类IgG1恒定区序列。应用相同的克隆策略，产生具有小鼠IgG1重链和轻链恒定区的嵌合PSMA全长抗体。通过电泳，在还原与非还原条件下测量纯化的全长IgG抗体的分子量以评定抗体样品的纯度。还通过如下进行SDS-PAGE评估样品纯度：将2μg每种抗体与2.5μL NuPAGE LDS样品缓冲液(生命技术公司(Life Technologies)，NP0008)混合并将每个样品的体积用去离子水调节至10μL。将样品在70℃下加热10分钟，接着负载至凝胶上。在180V下进行凝胶电泳1小时。
经由FACS，针对与Jurkat细胞、表达PSMA的Jurkat细胞、PC3细胞、表达PSMA的PC3细胞和LNCaP人类前列腺腺癌细胞的结合，评估包含抗体可变区克隆A或克隆B每一个的抗PSMA嵌合IgG1抗体。将10μg/mL各抗体加入至每种细胞系中且冰上培育。在洗涤之后，添加R-PE结合的抗小鼠IgG(H+L)(维克特实验室公司(Vector Labs)#EI-2007)以检测抗体结合。通过福特生物(ForteBio)Octet QK测定抗PSMA嵌合IgG1抗体的结合亲和力。将5μg/mL生物素化PSMA(胞外域)负载至抗生蛋白链菌素生物传感器上。在洗去过量抗原之后，测试10μg/mL的每种抗体的缔合和解离动力学。使用1:1结合位点的部分拟合模型计算结合参数。
全长克隆A-IgG1和全长克隆A-IgG1抗体的氨基酸序列提供于下表17中。每条轻链中的VL加下划线，且每条重链中的VH加双下划线。CDR呈粗体字。
表17
Figure BDA0002905287580001411
实例9：体内功效研究
小鼠中的PSMA CAR-T细胞治疗
在SCID-beige(无功能性T细胞、B细胞、NK细胞)小鼠中产生表达人PSMA的前列腺癌(皮下)异种移植模型。动物在平均皮下肿瘤体积达至200mm3时被随机化。将小鼠划分成6组(n＝8-10只小鼠/组)，其接受以下中的一种：(i)无治疗；(ii)107个模拟转导的CAR T细胞，1×/周，历时4周；(iii)107个克隆A-CAR T细胞，1×/周，历时4周；(iv)2×106个克隆A-CAR T细胞，1×/周，历时4周；(v)107个克隆B-CAR T细胞，1×/周，历时4周；或(iv)2×106个克隆B-CAR T细胞，1×/周，历时4周。监测每组中的动物的肿瘤体积、不良反应、人类细胞因子概况、肿瘤中人CD3+细胞的肿瘤和CAR T细胞浸润的器官的病理组织学、来自肿瘤组织的细胞上的PSMA表达、体重和总体健康状况(例如进食、步行、日常活动)。克隆A-CAR和克隆B-CAR的氨基酸序列提供于下表13中。
小鼠中的PSMA caTCR-T细胞治疗
在SCID-beige(无功能性T细胞、B细胞、NK细胞)小鼠中产生表达人PSMA的前列腺癌(皮下)异种移植模型。动物在平均皮下肿瘤体积达至200mm3时被随机化。将小鼠划分成4组(n＝8-10只小鼠/组)，其接受以下中的一种：(i)无治疗；(ii)107个模拟转导的caTCR T细胞，1×/周，历时4周；(iii)107个克隆A-caTCR T细胞，1×/周，历时4周；(iv)2×106个克隆A-caTCR T细胞，1×/周，历时4周；(v)107个克隆B-caTCR T细胞，1×/周，历时4周；或(iv)2×106个克隆B-caTCR T细胞，1×/周，历时4周。监测每组中的动物的肿瘤体积、不良反应、人类细胞因子概况、caTCR-T细胞浸润的肿瘤和器官中人CD3+细胞的肿瘤的病理组织学、来自肿瘤组织的细胞上的PSMA表达、体重和总体健康状况(进食、步行、日常活动)。克隆A-caTCR和克隆B-caTCR的氨基酸序列提供于下表15中。
实例10：表达单价和二价caTCR构建体的T细胞的产生和表征
根据实例7中的描述，产生编码单价抗PSMA克隆A caTCR构建体和单价抗PSMA克隆B caTCR构建体的核酸。SEQ ID NO:33为抗PSMA克隆A caTCR构建体的示例性氨基酸序列。这类构建体在本文中可替代地称为克隆A caTCR、抗PSMA caTCR#1或Ax1-caTCR。SEQ IDNO:36为抗PSMA克隆B caTCR构建体的示例性氨基酸序列。抗PSMA克隆B caTCR构建体在本文中可替代地称为克隆B caTCR、抗PSMA caTCR#2或Bx1-caTCR。
Figure BDA0002905287580001421
Figure BDA0002905287580001422
为了增加抗PSMA caTCR与PSMA的结合，设计二价caTCR构建体。详细地说，产生编码以下“同”二价caTCR构建体的核酸。
1.Ax2-caTCR-1(其在本文中可替代地称为“Ax2-caTCR”或“二价克隆A caTCR-1”)为包含1个scFv和1个Fab的二价抗PSMA克隆A caTCR。参见例如以下SEQ ID NO:47。
Figure BDA0002905287580001431
2.Ax2-caTCR-2(其在本文中可替代地称为“二价克隆A caTCR-2”)为包含2个Fab的二价抗PSMA克隆A caTCR。参见例如以下SEQ ID NO:48。
Figure BDA0002905287580001432
3.Bx2-caTCR-1(其在本文中可替代地称为“Bx2-caTCR”或“二价克隆B caTCR-1”)为包含1个scFv和1个Fab的二价抗PSMA克隆B caTCR。参见例如以下SEQ ID NO:49。
Figure BDA0002905287580001433
4.Bx2-caTCR-2(其在本文中可替代地称为“二价克隆B caTCR-2”)为包含2个Fab的二价抗PSMA克隆B caTCR。参见例如以下SEQ ID NO:50。
Figure BDA0002905287580001434
通过用包含编码caTCR构建体的核酸的病毒转导初级人类T细胞产生表达Ax2-caTCR-1、Ax2-caTCR-2、Bx2-caTCR-1或Bx2-caTCR-2的T细胞。使用实例7中描述的方法评估转型T细胞的特征和功能。这类T细胞表达编码的caTCR构建体，增殖良好，重新引导T细胞的特异性，且展示阳性PSMA特异性细胞毒性/杀死肿瘤活性。
在两种代表性肿瘤细胞杀死实验中，产生表达Bx2-caTCR(即，Bx2-caTCR-1)(参见图6)、Ax2-caTCR(即，Ax2-caTCR-1)(参见图6和7)、Bx2-caTCR+A-CSR(参见图6和7)、A-CAR(参见图6和7)、Ax1-caTCR+B-CSR(参见图6和7)、B-CAR(参见图7)或Bx1-caTCR+A-CSR(参见图7)的T细胞，且受体(caTCR或CAR)阳性T细胞百分比用模拟转导的T细胞标准化为60％。随后，模拟转导的T细胞、表达caTCR的T细胞和表达抗PCMACAR的T细胞在2:1效应细胞与目标细胞(E:T)比率(0.2M:0.1M，受体阳性效应:目标比率1.2:1)下培育16小时。使用以下三种PSMA+目标细胞系：LNCaP、22RV1和PC3-PMSA。肿瘤细胞杀死实验的结果显示于图6和7中。简单地说，表达任一上列构建体的T细胞能够引起PSMA特异性目标细胞溶解，而模拟转导的T细胞则不。
另外，产生编码下文描述的“异”二价caTCR构建体的核酸且用于转导初级人类T细胞。使用实例7和当前实例中描述的方法表征转导的caTCR-T细胞以评定转导的T细胞是否表达编码的caTCR构建体，增殖良好，重新引导T细胞的特异性，和诱发PSMA特异性细胞毒性/肿瘤细胞杀死。
5.Ax1-Bx1-caTCR-1(其在本文中可替代地称为“克隆A克隆B caTCR-1”)为包含克隆A scFv和克隆B Fab的抗PSMA caTCR。参见例如以下SEQ ID NO:91。
Figure BDA0002905287580001441
6.Ax1-Bx1-caTCR-2(其在本文中可替代地称为“克隆A克隆B caTCR-2”)为包含克隆A Fab和克隆B Fab的抗PSMA caTCR。参见例如以下SEQ ID NO:92。
Figure BDA0002905287580001442
Figure BDA0002905287580001451
实例11：表达具有caTCR和CSR受体的构建体组合的T细胞的产生和表征
将编码抗PSMA克隆A嵌合信号传导受体(CSR)或抗PSMA克隆B CSR的核酸与编码实例10中所述的单价或二价抗PSMA caTCR构建体的核酸融合以产生编码多种caTCR+CSR构建体组合的全长核酸。包含全长核酸的病毒用于转导初级人类T细胞，从而使得caTCR+CSR构建体组合在T细胞的表面上表达。
具体地说，设计编码以下所列的抗PSMA CSR构建体的核酸且已经产生许多。
克隆A-CSR-1A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+来源于CD28的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001452
克隆A-CSR-1B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+来源于CD28的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001453
克隆A-CSR-2A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+来源于4-1BB的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001454
克隆A-CSR-2B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+来源于4-1BB的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001455
克隆A-CSR-3A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+来源于CD27的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001456
克隆A-CSR-3B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+来源于CD27的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001461
克隆A-CSR-4A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+来源于CD30的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001462
克隆A-CSR-4B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+来源于CD30的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001463
克隆A-CSR-5A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+来源于OX40的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001464
克隆A-CSR-5B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+来源于OX40的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001465
克隆A-CSR-6A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+CD8 TM和CD27 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001466
克隆A-CSR-6B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+CD8 TM和CD27 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001467
克隆A-CSR-7A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+CD8 TM和CD30 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001471
克隆A-CSR-7B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+CD8 TM和CD30 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001472
克隆A-CSR-8A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+myc标签(粗体)+CD8 TM和OX40 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001473
克隆A-CSR-8B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆A scFv+CD8 TM和OX40 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001474
克隆B-CSR-1A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+来源于CD28的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001475
克隆B-CSR-1B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+来源于CD28的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001476
克隆B-CSR-2A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+来源于4-1BB的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001477
克隆B-CSR-2B(从N端至C端：抗PSMA克隆B scFv+来源于4-1BB的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001481
克隆B-CSR-3A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+来源于CD27的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001482
克隆B-CSR-3B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+来源于CD27的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001483
克隆B-CSR-4A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+来源于CD30的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001484
克隆B-CSR-4B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+来源于CD30的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001485
克隆B-CSR-5A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+来源于OX40的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001486
克隆B-CSR-5B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+来源于OX40的序列(加下划线))
Figure BDA0002905287580001487
克隆B-CSR-6A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+CD8 TM和CD27 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001491
克隆B-CSR-6B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+CD8 TM和CD27 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001492
克隆B-CSR-7A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+CD8 TM和CD30 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001493
克隆B-CSR-7B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+CD8 TM和CD30 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001494
克隆B-CSR-8A(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+myc标签(粗体)+CD8 TM和OX40 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001495
克隆B-CSR-8B(从N端至C端依序为：抗PSMA克隆B scFv+CD8 TM和OX40 IC(加下划线))
Figure BDA0002905287580001496
设计编码以下所列的caTCR+CSR构建体组合的核酸且已经产生这些核酸中的许多。
Ax1-caTCR+A-CSR-1A(Ax1-caTCR+P2A自裂解肽(粗体)+信号序列(斜体)+克隆A-CSR-1A(加下划线))
Figure BDA0002905287580001501
A-CSR-1A+Ax1-caTCR(信号序列(斜体)+克隆A-CSR-1A(加下划线)+P2A自裂解肽(斜体)+Ax1-caTCR)
Figure BDA0002905287580001502
Ax1-caTCR+B-CSR-1A(Ax1-caTCR+P2A自裂解肽(粗体)+信号序列(斜体)+克隆B-CSR-1A(加下划线))
Figure BDA0002905287580001503
B-CSR-1A+Ax1-caTCR(信号序列(斜体)+克隆B-CSR-1A(加下划线)+P2A自裂解肽(斜体)+Ax1-caTCR)
Figure BDA0002905287580001504
Bx1-caTCR+A-CSR-1A(Bx1-caTCR+P2A自裂解肽(粗体)+信号序列(斜体)+克隆A-CSR-1A(加下划线))
Figure BDA0002905287580001511
A-CSR-1A+Bx1-caTCR(信号序列(斜体)+克隆A-CSR-1A(加下划线)+P2A自裂解肽(斜体)+Bx1-caTCR)
Figure BDA0002905287580001512
Bx1-caTCR+B-CSR-1A(Bx1-caTCR+P2A自裂解肽(粗体)+信号序列(斜体)+克隆B-CSR-1A(加下划线))
Figure BDA0002905287580001513
B-CSR-1A+Bx1-caTCR(信号序列(斜体)+克隆A-CSR-1A(加下划线)+P2A自裂解肽(斜体)+Bx1-caTCR)
Figure BDA0002905287580001514
Ax2-caTCR-1+B-CSR-1A(从N端至C端：Ax2-caTCR+P2A自裂解肽(粗体)+信号序列(斜体)+克隆A-CSR-1A(加下划线))
Figure BDA0002905287580001521
还设计了编码以下和表12(以下再现)中以粗体列出的caTCR+CSR构建体组合的核酸。
编码B-CSR-1A+Ax2-caTCR-1的核酸包含编码(自5'至3')以下主要组件的序列：B-CSR-1A(SEQ ID NO:70)、与SEQ ID NO:133(即，RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)的P2A自裂解肽融合的弗林裂解位点和包含SEQ ID NO:47(Ax2-caTCR-1)的多肽。
编码Ax2-caTCR-1+B-CSR-1B的核酸包含编码(自5'至3')以下的序列：包含SEQ IDNO:47(Ax2-caTCR-1)的多肽、SEQ ID NO:132(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)的P2A自裂解肽和B-CSR-1B(SEQ ID NO:38)。(还参见以下再现的表12中第3行。)
编码B-CSR-1B+Ax2-caTCR-1的核酸包含编码(自5'至3')以下的序列：B-CSR-1B(SEQ ID NO:38)、与SEQ ID NO:133的P2A自裂解肽融合的弗林裂解位点和包含SEQ ID NO:47(Ax2-caTCR-1)的多肽。(还参见以下再现的表12中第4行。)
表12
Figure BDA0002905287580001522
Figure BDA0002905287580001531
Figure BDA0002905287580001541
Figure BDA0002905287580001551
Figure BDA0002905287580001561
Figure BDA0002905287580001571
Figure BDA0002905287580001581
Figure BDA0002905287580001591
Figure BDA0002905287580001601
Figure BDA0002905287580001611
编码表12中第1-128行中的任一行的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR的单一核酸可进一步编码一或多种信号肽(例如在编码caTCR的链1和/或链2的序列上游和/或编码抗PSMACSR的序列上游)。虽然特定接头在表12中的第1-128行中列出，但可以使用替代接头(参见例如表6A)。编码表12中第1-128行中的任一行的抗PSMA caTCR+抗PSMA CSR的单一核酸可进一步编码一或多种肽接头(例如可裂解接头)和/或肽标签。参见例如表6A和6B。
表达在本实例中描述的caTCR+CSR构建体组合中的一些构建体组合的T细胞通过用包含对应核酸的病毒转导初级人类T细胞产生，且使用实例3和7中所述的方法评估其特征和功能。载有这类标签的CSR构建体中的myc标签用作表达标志物。这类T细胞表达编码的caTCR和CSR构建体，增殖良好，重新引导T细胞的特异性，且展示阳性PSMA特异性细胞毒性/杀死肿瘤活性。
在实例10中描述的两种代表性肿瘤细胞杀死实验中，连同模拟转导的T细胞和用编码caTCR的核酸转导的T细胞一起，一些初级T细胞用编码多种caTCR+CSR组合的核酸转导并且也被标准化为60％受体阳性，且与相同三种目标细胞系在2:1E:T比率(受体阳性效应:目标比率1.2:1)下一起培育16小时。这些实验的结果展示于图6和图7中，所述图展现这些T细胞的阳性PSMA特异性细胞毒性。与表达单独caTCR的T细胞相比，在大多数情况下表达抗PSMA caTCR与抗PSMA CSR的T细胞杀死较高百分比的PSMA+肿瘤细胞。
在另一代表性肿瘤细胞杀死实验中，用编码Ax2-caTCR+B-CSR或Bx2-caTCR+A-CSR组合的核酸转导的T细胞，连同表达包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的抗PSMA CAR构建体或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的抗PSMA CAR构建体的T细胞一起，标准化为53％受体阳性，且与目标细胞在2:1E:T比率(0.2M:0.1M，受体阳性效应:目标比率1.06:1)下一起培育16小时。使用两种PSMA+目标细胞系：LNCaP和PC3-PMSA。这个肿瘤细胞杀死实验的结果展示于图8中，所述图展示这些T细胞的阳性PSMA特异性细胞毒性。另外，将这个实验重复实验中的细胞短暂离心，且收集上清液用于Luminex分析以测量包括例如IL-6的若干炎性细胞因子的多种细胞因子的释放水平。结果表明用编码caTCR+CSR的核酸转导的T细胞分泌比用编码CAR的核酸转导的T细胞所分泌水平(资料未示出)低的水平的炎性细胞因子，包括IL-6。
除肿瘤细胞杀死实验之外，用表达构建体组合Ax1-caTCR+B-CSR(又称为Ax1-caTCR+B-CSR-1A，SEQ ID NO:86)或Bx1-caTCR+A-CSR(又称为Bx1-caTCR+A-CSR-1A,SEQ IDNO:87)的T细胞以及表达克隆A CAR(SEQ ID NO:29)或克隆B CAR(SEQ ID NO:30)的T细胞进行如实例7中所述的基于荧光的流式细胞术分析以评定T细胞增殖，所述T细胞均用模拟转导的T细胞标准化为50％受体阳性。LNCaP用作PSMA+目标细胞系且E:T比率为2:1(0.1M/0.05M，受体阳性效应:目标比率1:1)。用CFSE染色T细胞。每7天用0.1M目标细胞再攻击T细胞，多达4个周期(4次啮合)。在每个啮合期的D3、D5和D7，通过流式细胞术检查CFSE信号传导。结果展示于图5中，所述图展现两种caTCR+CSR构建体组合以及CAR能够通过抗原识别刺激T细胞增殖。
使用表达表12中所示的caTCR+CSR构建体组合的T细胞重复上述实验。
实施例的清单
1.一种抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)构建体，其包含特异性识别细胞表面结合的PSMA的胞外域的抗体部分，所述胞外域包含SEQ ID NO:44中所阐述的氨基酸序列。
2.实施例1的抗PSMA构建体，其中所述PSMA在癌细胞的表面上表达。
3.实施例3的抗PSMA构建体，其中所述癌细胞为前列腺癌细胞、肾细胞癌细胞、子宫癌细胞或肝癌细胞。
4.实施例3的抗PSMA构建体，其中所述癌细胞为前列腺癌细胞。
5.实施例4的抗PSMA构建体，其中所述前列腺癌细胞为激素难治性前列腺癌细胞或转移性前列腺癌细胞。
6.实施例3的抗PSMA构建体，其中所述癌细胞为肾癌细胞。
7.实施例6的抗PSMA构建体，其中所述肾癌细胞为透明细胞肾细胞癌(CCRCC)细胞。
8.实施例1至7中任一例的抗PSMA构建体，其中所述PSMA在选自由以下组成的群组的细胞的表面上表达：LNCaP、MDA PCa 2b、VCaP、22Rv1、Caki-1、HCC1482和HuH-7。
9.实施例1至8中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
i)重链可变域(VH)，所述重链可变域包括包含SEQ ID NO:1-2中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3-4中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5-6中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H3；和
ii)轻链可变域(VL)，所述轻链可变域包括包含SEQ ID NO:7-8中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-L1、包含氨基酸序列GNS或SSN或包含约2个氨基酸取代的其变体的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9-10中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-L3。
10.实施例9的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：i)VH，所述VH包括包含SEQID NO:1-2中的任一个的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3-4中的任一个的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5-6中的任一个的氨基酸序列的CDR-H3；和ii)VL，所述VL包括包含SEQ ID NO:7-8中的任一个的氨基酸序列的CDR-L1、包含GNS或SNN的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9-10中的任一个的氨基酸序列的CDR-L3。
11.实施例9或10的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含
i)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3；和
ii)轻链可变域(VL)，所述轻链可变域包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、包含氨基酸序列GNS的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。
12.实施例9或10的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含
i)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；和
ii)VL，所述VL包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1、包含氨基酸序列SNN的CDR-L2和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。
13.实施例1至8中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:16或17中阐述的重链可变域(VH)的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:18或19中阐述的轻链可变域(VL)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
14.实施例13的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:16中阐述的VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:18中阐述的VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
15.实施例13的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:17中阐述的VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:19中阐述的VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
16.实施例1至8中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：i)包含与SEQID NO:16或17具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列的VH和ii)包含与SEQ ID NO:18或19具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列的VL。
17.实施例1至16中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：i)包含与SEQID NO:16或17具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VH和ii)包含与SEQ ID NO:18或19具有至少约90％序列一致性的氨基酸序列的VL。
18.实施例1至17中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：i)包含与SEQID NO:16或17具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的VH和ii)包含与SEQ ID NO:18或19具有至少约95％序列一致性的氨基酸序列的VL。
19.实施例1至18的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL。
20.实施例1至18的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。
21.实施例1至8中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
i)包含SEQ ID NO:1、3和5的氨基酸序列的重链可变域(VH)和包含SEQ ID NO:7、GNS和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变域(VL)；或
ii)包含SEQ ID NO:2、4和6的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8、SSN和SEQ IDNO:10的氨基酸序列的VL。
22.一种抗PSMA构建体，其包含与实施例19或实施例20的抗PSMA构建体竞争特异性结合于PSMA的抗体部分。
23.实施例1至22中任一例的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为嵌合、人源、部分人源化、完全人源化或半合成的。
24.实施例1至23中任一例的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。
25.实施例24的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为scFv。
26.实施例25的抗PSMA构建体，其中所述scFv包含SEQ ID NO:20中阐述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少85％、90％或95％序列一致性的氨基酸序列。
27.实施例25的抗PSMA构建体，其中所述scFv包含SEQ ID NO:21中阐述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％、90％或95％序列一致性的氨基酸序列。
28.实施例24的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为Fab或Fab'。
29.实施例1至28中任一例的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分与Fc片段任选地经由接头融合。
30.实施例29的抗PSMA构建体，其中所述Fc片段为人类IgG Fc片段。
31.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述人类IgG为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
32.实施例1至23中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗PSMA抗体部分为全长抗体。
33.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述全长抗体包括包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的轻链。
34.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述全长抗体包括包含与SEQ ID NO:39具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:40具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的轻链。
35.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述全长抗体包括包含与SEQ ID NO:39具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:40具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的轻链。
36.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述全长抗体包括包含与SEQ ID NO:41具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:42具有至少85％序列一致性的氨基酸的轻链。
37.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述全长抗体包括包含与SEQ ID NO:41具有至少90％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:42具有至少90％序列一致性的氨基酸的轻链。
38.实施例30的抗PSMA构建体，其中所述全长抗体包括包含与SEQ ID NO:41具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含与SEQ ID NO:42具有至少95％序列一致性的氨基酸的轻链。
39.实施例1至38中任一例的抗PSMA构建体，其中所述构建体为单特异性的。
40.实施例1至38中任一例的抗PSMA构建体，其中所述构建体为多特异性的。
41.实施例40的抗PSMA构建体，其中所述构建体为双特异性的。
42.实施例40或41的抗PSMA构建体，其中所述构建体为串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双可变域(DVD)抗体、杵臼(KiH)抗体、锚栓(DNL)抗体、化学交联抗体、杂多聚体抗体或异源结合抗体。
43.实施例42的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含两个由肽接头连接的scFv的串联scFv。
44.实施例40至43中任一例的抗PSMA构建体，其中所述构建体进一步包含特异性识别第二抗原的第二抗体部分。
45.实施例44的抗PSMA构建体，其中所述第二抗原为T细胞表面上的抗原。
46.实施例45的抗PSMA构建体，其中所述第二抗原选自由以下组成的群组：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。
47.实施例46的抗PSMA构建体，其中所述第二抗原为CD3ε。
48.实施例47的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含特异性识别PSMA的N端scFv和特异性识别CD3ε的C端scFv的串联scFv。
49.实施例48的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:25或26具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
50.实施例48的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:27或28具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
51.实施例45的抗PSMA构建体，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助T细胞和自然杀伤T细胞组成的群组。
52.实施例45至51中任一例的抗PSMA构建体，其中所述抗PSMA构建体的表达通过激活工程化T细胞来诱导。
53.实施例52的抗PSMA构建体，其中所述工程化T细胞为包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
54.实施例53的抗PSMA构建体，其中所述CAR特异性结合于PSMA。
55.实施例53的抗PSMA构建体，其中所述CAR结合于除PSMA外的抗原。
56.实施例52的抗PSMA构建体，其中所述工程化T细胞为包含嵌合抗体-T细胞受体(TCR)构建体(caTCR)的T细胞。
57.实施例56的抗PSMA构建体，其中所述caTCR特异性结合于PSMA。
58.实施例56的抗PSMA构建体，其中所述caTCR结合于除PSMA外的抗原。
59.实施例44的抗PSMA构建体，其中所述第二抗原为B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞的表面上的抗原。
60.实施例1至27中任一例的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含以下的CAR：
(a)包含所述抗PSMA抗体部分的胞外域；
(b)跨膜域；以及
(c)胞内信号传导域。
61.实施例60的抗PSMA构建体，其中所述胞内信号传导域包含来源于CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的初级免疫细胞信号传导序列。
62.实施例61的抗PSMA构建体，其中所述胞内信号传导域进一步包含来源于CD28、4-1BB、ICOS或OX40的共刺激信号传导序列。
63.实施例60、61或62的抗PSMA构建体，其中所述胞内信号传导域包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列和来源于CD28的共刺激信号传导序列。
64.实施例60至63中任一例的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:29具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
65.实施例60至63中任一例的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:30具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
66.实施例1至23中任一例的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含以下的caTCR：
(a)包含所述抗PSMA抗体部分的胞外域；以及
(b)T细胞受体模块(TCRM)，其包括包含第一TCR跨膜域(TCR-TM)的第一TCR域(TCRD)和包含第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM促进至少一种TCR相关信号传导分子的募集。
67.实施例66的抗PSMA构建体，其中所述第一TCR-TM来源于第一天然存在的TCR的跨膜域中的一个，且所述第二TCR-TM来源于所述第一天然存在的TCR的另一跨膜域。
68.实施例67的抗PSMA构建体，其中所述TCR-TM中的至少一个为非天然存在的。
69.实施例68的抗PSMA构建体，其中所述包含至少一个非天然存在的TCR-TM的TCRM相较于包含所述第一天然存在的T细胞受体跨膜域的TCRM，增强至少一种TCR相关信号传导分子的募集。
70.实施例66或67的抗PSMA构建体，其中所述第一TCR-TM和所述第二TCR-TM为天然存在的。
71.实施例66至70中任一例的抗PSMA构建体，其中所述第一TCR-TM和所述第二TCR-TM来源于γ/δTCR，
任选地其中所述第一TCR-TM来源于TCRγ链且所述第二TCR-TM来源于TCRδ链，或
任选地其中所述第一TCR-TM来源于TCRδ链且所述第二TCR-TM来源于TCRγ链。
72.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:31具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:32具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
73.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:34具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:35具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
74.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:165具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:166具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
75.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:167具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:168具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
76.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:169具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:170具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
77.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:171具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:172具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
78.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:173具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:174具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
79.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:175具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:176具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
80.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:177具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:178具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
81.实施例71的抗PSMA构建体，其中所述构建体包括包含与SEQ ID NO:179具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含与SEQ ID NO:180具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
82.实施例66至70中任一例的抗PSMA构建体，其中所述第一TCR-TM和所述第二TCR-TM来源于α/βTCR，
任选地其中所述第一TCR-TM来源于TCRα链且所述第二TCR-TM来源于TCRβ链，或
任选地其中所述第一TCR-TM来源于TCRβ链且所述第二TCR-TM来源于TCRα链。
83.实施例66至82中任一例的抗PSMA构建体，其中所述TCR相关信号传导分子选自由CD3δε、CD3γε和CD3ζζ组成的群组。
84.实施例66至83中任一例的抗PSMA构建体，其中所述caTCR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。
85.实施例1至23中任一例的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含以下的嵌合信号传导受体(CSR)：
i)能够与PSMA结合或相互作用的配体结合模块；
ii)跨膜模块；以及
iii)共刺激免疫细胞信号传导模块，其能够向效应细胞提供共刺激信号，
其中所述配体结合模块和所述共刺激免疫细胞信号传导模块并非来源于同一分子，且其中所述CSR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。
86.实施例85的抗PSMA构建体，其中所述CSR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。
87.实施例85或86的抗PSMA构建体，其中所述配体结合模块包含实施例1至25中任一例的抗PSMA构建体。
88.实施例85至87中任一例的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块和所述CSR的所述共刺激免疫细胞信号传导模块来自同一分子。
89.实施例88的抗PSMA构建体，其中所述分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
90.实施例89的抗PSMA构建体，其中所述分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30和CD27。
91.实施例85至87中任一例的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块和所述CSR的所述共刺激免疫细胞信号传导模块来自不同分子。
92.实施例85至91中任一例的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块包含来源于CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、4-1BB、OX40或T细胞受体的α、β、δ、γ或ζ链的跨膜域。
93.实施例85至92中任一例的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块包含CD8、4-1BB、CD27、CD28、CD30或OX40的跨膜域。
94.实施例93的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块包含与SEQ ID NO:94-99中的任一个具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的序列。
95.实施例85至94中任一例的抗PSMA构建体，其中所述共刺激免疫细胞信号传导模块来源于TCR的共刺激受体的胞内域。
96.实施例95的抗PSMA构建体，其中所述共刺激受体选自由4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、ICOS和CD40组成的群组。
97.实施例96的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述共刺激免疫细胞信号传导模块包含与SEQ ID NO:100-103和183中的任一个具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的序列。
98.实施例85至97中任一例的抗PSMA构建体，其中所述CSR的表达在激活工程化T细胞时为诱导性的。
99.实施例98的抗PSMA构建体，其中所述工程化T细胞为包含CAR的T细胞。
100.实施例99的抗PSMA构建体，其中所述CAR特异性结合于PSMA。
101.实施例99的抗PSMA构建体，其中所述CAR结合于除PSMA外的抗原。
102.实施例98的抗PSMA构建体，其中所述工程化T细胞为包含caTCR的T细胞。
103.实施例102的抗PSMA构建体，其中所述caTCR特异性结合于PSMA。
104.实施例102的抗PSMA构建体，其中所述caTCR结合于除PSMA外的抗原。
105.实施例85至104中任一例的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:3、55-69、93和184-186中的任一个具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
106.实施例105的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:37具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
107.实施例85至104中任一例的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO:38、70-84、93和184-186中的任一个具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
108.实施例107的抗PSMA构建体，其包含与SEQ ID NO 38具有至少85％、90％、95％或100％序列一致性的氨基酸序列。
109.实施例85至108中任一例的抗PSMA构建体，其包含信号肽。
110.实施例109的抗PSMA构建体，其中所述信号肽包含METDTLLLWVLLLWVPGSTGSEQ ID NO:128的序列。
111.实施例1至42中任一例的抗PSMA构建体，其结合于效应分子。
112.实施例111的抗PSMA构建体，其中所述效应分子为选自由以下组成的群组的治疗剂：药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽和核酸。
113.实施例112的抗PSMA构建体，其中所述治疗剂为药物或毒素。
114.实施例111的抗PSMA构建体，其中所述效应分子为可检测标记。
115.一种效应细胞，其用编码实施例60至65中任一例的抗PSMA CAR或实施例66至84中任一例的抗PSMA caTCR的一或多种核酸进行基因修饰。
116.实施例115的效应细胞，其中编码所述抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR。
117.实施例115的效应细胞，其用编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR的一或多种其它核酸进行基因修饰。
118.实施例116或117的效应细胞，其中所述目标抗原为PSMA。
119.实施例116或117的效应细胞，其中所述目标抗原为除PSMA外的抗原。
120.实施例115的效应细胞，其中编码所述抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv。
121.实施例115的效应细胞，其用编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv的一或多种其它核酸进行基因修饰。
122.实施例120或121的效应细胞，其中所述目标抗原为PSMA。
123.实施例120或121的效应细胞，其中所述目标为除PSMA外的抗原。
124.一种效应细胞，其用编码实施例43至59中任一例的抗PSMA串联scFv或实施例85至110中任一例的抗PSMA CSR的一或多种核酸进行基因修饰。
125.实施例124的效应细胞，其中编码所述抗PSMA串联scFv或抗PSMA CSR的所述一或多种核酸还编码CAR。
126.实施例124的效应细胞，其用编码CAR的一或多种其它核酸进行基因修饰。
127.实施例125或126的效应细胞，其中所述CAR特异性结合PSMA。
128.实施例125或126的效应细胞，其中所述CAR特异性结合除PSMA外的抗原。
129.实施例124的效应细胞，其中编码所述抗PSMA串联scFv或抗PSMA CSR的所述一或多种核酸还编码caTCR。
130.实施例124的效应细胞，其用编码caTCR的一或多种其它核酸进行基因修饰。
131.实施例129或130的效应细胞，其中所述caTCR特异性结合PSMA。
132.实施例129或130的效应细胞，其中所述caTCR特异性结合除PSMA外的抗原。
133.实施例115至132中任一例的效应细胞，其中所述效应细胞为免疫细胞。
134.实施例133的效应细胞，其中所述免疫细胞为T细胞。
135.实施例122的效应细胞，其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
136.一种产生效应细胞的方法，其包含用编码实施例60至65中任一例的抗PSMACAR或实施例66至84中任一例的抗PSMA caTCR的一或多种核酸对细胞进行基因修饰。
137.实施例136的方法，其中编码所述抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR。
138.实施例136的方法，其包含进一步用编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR的一或多种其它核酸对所述细胞进行基因修饰。
139.实施例137或138的方法，其中所述目标抗原为PSMA。
140.实施例137或138的方法，其中所述目标抗原为除PSMA外的抗原。
141.实施例136的方法，其中编码所述抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv。
142.实施例136的方法，其包含进一步用编码包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv的一或多种其它核酸对所述细胞进行基因修饰。
143.实施例141或142的方法，其中所述目标抗原为PSMA。
144.实施例141或142的方法，其中所述目标为除PSMA外的抗原。
145.一种产生效应细胞的方法，其包含用编码实施例37至53中任一例的抗PSMA串联scFv或实施例85至110中任一例的抗PSMA CSR的一或多种核酸对细胞进行基因修饰。
146.实施例145的方法，其中编码所述抗PSMA串联scFv或抗PSMA CSR的所述一或多种核酸还编码CAR。
147.实施例145的方法，其包含进一步用编码CAR的一或多种其它核酸对所述细胞进行基因修饰。
148.实施例146或147的方法，其中所述CAR特异性结合PSMA。
149.实施例146或147的方法，其中所述CAR特异性结合除PSMA外的抗原。
150.实施例145的方法，其中编码抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码caTCR。
151.实施例145的方法，其包含进一步用编码caTCR的一或多种其它核酸对所述细胞进行基因修饰。
152.实施例150或151的方法，其中所述caTCR特异性结合PSMA。
153.实施例150或151的方法，其中所述caTCR特异性结合除PSMA外的抗原。
154.实施例136至153中任一例的方法，其中所述效应细胞为免疫细胞。
155.实施例154的方法，其中所述免疫细胞为T细胞。
156.实施例155的方法，其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
157.一种核酸，其编码实施例1至110中任一例的抗PSMA构建体的多肽部分。
158.一种载体，其包含实施例157的核酸。
159.一种宿主细胞，其包含实施例157的核酸或158的载体。
160.一种产生实施例1至59中任一例的抗PSMA构建体的方法，其包含在表达所述抗PSMA构建体的条件下培养实施例159的宿主细胞，且回收由所述宿主细胞产生的所述抗PSMA构建体。
161.一种药物组合物，其包含实施例1至59和111至113中任一例的抗PSMA构建体、实施例115至135中任一例的效应细胞、实施例157的核酸或实施例158的载体和药学上可接受的载剂。
162.一种试剂盒，其包含实施例1至59和111至113中任一例的抗PSMA构建体、实施例115至135中任一例的效应细胞、实施例157的核酸或实施例158的载体和/或实施例159的宿主细胞。
163.一种检测样品中的PSMA的方法，其包含使所述样品接触实施例114的抗PSMA构建体，和检测所述标记的存在。
164.实施例163的方法，其中所述样品包含表达PSMA的细胞。
165.一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体施用有效量的实施例161的药物组合物。
166.一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体施用用编码实施例60至65中任一例的抗PSMA CAR或实施例66至84中任一例的抗PSMA caTCR的一或多种核酸进行基因修饰的效应细胞。
167.实施例166的方法，其包含在施用前用所述一或多种核酸对所述效应细胞进行基因修饰。
168.实施例167的方法，其中编码所述抗PSMA CAR或所述抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码CSR或串联scFv。
169.实施例167的方法，其包含进一步用编码CSR或串联scFv的一或多种其它核酸对所述效应细胞进行基因修饰。
170.实施例168或169的方法，其中所述串联scFv特异性结合PSMA。
171.实施例168或169的方法，其中所述串联scFv特异性结合除PSMA外的抗原。
172.实施例168或169的方法，其中所述CSR特异性结合PSMA。
173.实施例168或169的方法，其中所述CSR特异性结合除PSMA外的抗原。
174.一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含向所述个体施用用编码实施例43至59中任一例的抗PSMA串联scFv或实施例85至110中任一例的抗PSMA CSR的一或多种核酸进行基因修饰的效应细胞。
175.实施例174的方法，其包含在施用前用所述一或多种核酸对所述效应细胞进行基因修饰。
176.实施例175的方法，其中编码所述抗PSMA CSR或抗PSMA串联scFv的所述一或多种核酸还编码CAR或caTCR。
177.实施例175的方法，其包含进一步用编码CAR或caTCR的一或多种其它核酸对所述效应细胞进行基因修饰。
178.实施例176或177的方法，其中所述CAR特异性结合PSMA。
179.实施例176或177的方法，其中所述CAR特异性结合除PSMA外的抗原。
180.实施例176或177的方法，其中所述caTCR特异性结合PSMA。
181.实施例176或177的方法，其中所述caTCR特异性结合除PSMA外的抗原。
182.实施例166至181中任一例的方法，其中所述效应细胞为免疫细胞。
183.实施例182的方法，其中所述免疫细胞为T细胞。
184.实施例183的方法，其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
185.实施例166至184中任一例的方法，其中所述方法进一步包含在对所述效应细胞进行基因修饰和施用前从个体获得效应细胞。
186.实施例185的方法，其中从中获得所述效应细胞的所述个体为施用所述经过基因修饰的效应细胞的个体。
187.实施例186的方法，其中从中获得所述效应细胞的所述个体不为施用所述经过基因修饰的效应细胞的个体。
188.实施例187的方法，其中所述经过基因修饰的效应细胞与施用所述经过基因修饰的效应细胞的个体是同种异体的。
189.实施例188的方法，其中所述经过基因修饰的效应细胞与施用所述经过基因修饰的效应细胞的个体系同基因型的。
190.实施例188的方法，其中所述经过基因修饰的效应细胞与施用所述经过基因修饰的效应细胞的个体是异种的。
191.实施例165至190中任一例的方法，其进一步包含向所述个体施用其它疗法。
192.实施例165至191中任一例的方法，其中所述PSMA相关疾病或病症为癌症。
193.实施例192的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、肾癌细胞、子宫癌和肝癌。
194.实施例193的方法，其中所述癌症为前列腺癌。
195.实施例194的方法，其中所述前列腺癌为激素难治性前列腺癌或转移性前列腺癌。
196.实施例193的方法，其中所述癌症为肾癌。
197.实施例196的方法，其中所述肾癌为透明细胞肾细胞癌(CCRCC)。
198.实施例165至197中任一例的方法，其中患有所述PSMA相关疾病或病症的所述个体为哺乳动物。
199.实施例198的方法，其中所述哺乳动物为人。
200.一种诊断怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
a)向所述个体施用有效量的实施例114的抗PSMA构建体；以及
b)测定所述个体中所述标记的水平，其中所述标记的水平超过阈值水平指示所述个体患有所述PSMA相关疾病或病症。
201.一种诊断怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
a)使包含来源于所述个体的细胞的样品接触实施例114的抗PSMA构建体；以及
b)测定所述样品中结合于所述抗PSMA构建体的细胞的数目，其中结合于所述抗PSMA构建体的细胞的数目的值超过阈值水平指示所述个体患有所述PSMA相关疾病或病症。
202.实施例200或201的方法，其中PSMA相关疾病或病症为癌症。
203.实施例202的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：前列腺癌、肾癌细胞、子宫癌和肝癌。
204.实施例203的方法，其中所述癌症为前列腺癌。
205.实施例204的方法，其中所述前列腺癌为激素难治性前列腺癌或转移性前列腺癌。
206.实施例203的方法，其中所述癌症为肾癌。
207.实施例206的方法，其中所述肾癌为透明细胞肾细胞癌(CCRCC)。
208.实施例200至207中任一例的方法，其中所述怀疑患有与PSMA表达、异常表达和/或异常活性相关的疾病或病症的个体为哺乳动物。
209.实施例208的方法，其中所述哺乳动物为人。
序列表
<110> 优瑞科生物技术公司(Eureka Therapeutics, Inc.)
<120> 靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的构建体和其用途
<130> 75004-20015.40
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<160> 186
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = S或N
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223>Xaa = T或A
<400> 11
Gly Tyr Xaa Phe Xaa Ser Tyr Trp
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = G或D
<400> 12
Ile Tyr Pro Xaa Asp Ser Asp Thr
1 5
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = S或不存在
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = M或不存在
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = G或不存在
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = S或不存在
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = L或S
<220>
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = A或Y
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = S或G
<220>
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = S或I
<400> 13
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Asp Val
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = A或S
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = G或N
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = Y或T
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = D或不存在
<400> 14
Ser Ser Asn Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Q或A
<220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = S或A
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = Y或W
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = S或D
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = S或N
<400> 15
Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Ser Leu Xaa Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 20
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 21
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 22
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
1 5 10 15
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
20 25 30
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
35 40 45
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
50 55 60
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
65 70 75 80
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
85 90 95
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
100 105 110
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
115 120 125
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
130 135 140
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
145 150 155 160
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
165 170 175
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
180 185 190
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
195 200 205
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 23
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
50 55 60
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
85 90 95
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
100 105 110
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
115 120 125
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
130 135 140
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
145 150 155 160
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
165 170 175
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
180 185 190
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
195 200 205
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
210 215 220
Arg
225
<210> 24
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 25
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
260 265 270
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
275 280 285
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
290 295 300
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
305 310 315 320
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser
325 330 335
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
340 345 350
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
355 360 365
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr
370 375 380
Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile
385 390 395 400
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
405 410 415
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp
420 425 430
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr
435 440 445
Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
450 455 460
Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala
465 470 475 480
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly
485 490 495
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
500 505 510
<210> 26
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
260 265 270
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
275 280 285
Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
290 295 300
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn
305 310 315 320
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser
325 330 335
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
340 345 350
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp
355 360 365
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr
370 375 380
Ser Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile
385 390 395 400
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
405 410 415
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp
420 425 430
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr
435 440 445
Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
450 455 460
Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala
465 470 475 480
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly
485 490 495
Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
500
<210> 27
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
275 280 285
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
290 295 300
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
305 310 315 320
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
325 330 335
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
385 390 395 400
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
405 410 415
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
420 425 430
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
435 440 445
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
450 455 460
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
485 490 495
Glu Ile Lys His His His His His His
500 505
<210> 28
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
260 265 270
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
275 280 285
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
290 295 300
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
305 310 315 320
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
325 330 335
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
355 360 365
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
385 390 395 400
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
405 410 415
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
420 425 430
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
435 440 445
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
450 455 460
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
465 470 475 480
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
485 490 495
Glu Ile Lys
<210> 29
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：克隆A‐CAR
<400> 29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln
245 250 255
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr
260 265 270
Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His
275 280 285
Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser
290 295 300
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
325 330 335
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
340 345 350
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
355 360 365
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 30
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：克隆B‐CAR
<400> 30
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
260 265 270
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
275 280 285
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
290 295 300
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
305 310 315 320
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
325 330 335
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
340 345 350
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
355 360 365
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
370 375 380
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
385 390 395 400
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
405 410 415
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
420 425 430
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
435 440 445
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
450 455 460
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
465 470 475 480
Arg
<210> 31
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu
225 230 235 240
Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val
245 250 255
His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg
260 265 270
Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys
275 280 285
Leu Phe Phe Leu
290
<210> 32
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile
210 215 220
Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu
225 230 235 240
Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu
260 265 270
Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
275 280
<210> 33
<211> 648
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：抗PSMA caTCR #1
(又称抗PSMA克隆A caTCR、“Ax1‐caTCR”或“克隆A‐caTCR”)
<400> 33
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
35 40 45
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro
245 250 255
Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro
260 265 270
Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val
275 280 285
Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu
290 295 300
Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly
305 310 315 320
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
325 330 335
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu
340 345 350
Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu
355 360 365
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
370 375 380
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
385 390 395 400
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
405 410 415
Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
420 425 430
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
435 440 445
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr
450 455 460
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
465 470 475 480
Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
485 490 495
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
500 505 510
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
515 520 525
Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
530 535 540
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
545 550 555 560
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
565 570 575
Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro
580 585 590
Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu
595 600 605
Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser
610 615 620
Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala
625 630 635 640
Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
645
<210> 34
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr
210 215 220
Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln
225 230 235 240
Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys
245 250 255
Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala
260 265 270
Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
275 280 285
<210> 35
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr
210 215 220
Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu
225 230 235 240
Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg
260 265 270
Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
275 280
<210> 36
<211> 643
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：抗PSMA caTCR #2
(又称抗PSMA克隆B caTCR、“Bx1‐caTCR”或“克隆B‐caTCR”)
<400> 36
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
35 40 45
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
65 70 75 80
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu
245 250 255
Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val
260 265 270
His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg
275 280 285
Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys
290 295 300
Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys
305 310 315 320
Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
325 330 335
Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu
340 345 350
Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro
355 360 365
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
370 375 380
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
385 390 395 400
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro
405 410 415
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
420 425 430
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
435 440 445
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly
450 455 460
Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr
465 470 475 480
Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu
485 490 495
Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp
500 505 510
Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro
515 520 525
Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu
530 535 540
Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr
545 550 555 560
His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
565 570 575
Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser
580 585 590
Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala
595 600 605
Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala
610 615 620
Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly
625 630 635 640
Glu Lys Ser
<210> 37
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
245 250 255
Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
260 265 270
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
275 280 285
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
290 295 300
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
305 310 315 320
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
325 330 335
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
340 345 350
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
355 360
<210> 38
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met
245 250 255
Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile
260 265 270
His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
275 280 285
Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
290 295 300
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
305 310 315 320
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
325 330 335
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
340 345 350
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
355
<210> 39
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 40
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 41
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 42
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 43
<211> 750
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 44
<211> 707
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Lys Ser Ser Asn Glu Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys
1 5 10 15
Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr
20 25 30
Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln
35 40 45
Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser
50 55 60
Val Glu Leu Ala His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr
65 70 75 80
His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe
85 90 95
Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser
100 105 110
Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu
115 120 125
Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys
130 135 140
Leu Glu Arg Asp Met Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala
145 150 155 160
Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu
165 170 175
Ala Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe
180 185 190
Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly
195 200 205
Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro
210 215 220
Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile
225 230 235 240
Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr
245 250 255
Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro
260 265 270
Asp Ser Ser Trp Arg Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro
275 280 285
Gly Phe Thr Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His
290 295 300
Ser Thr Asn Glu Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg
305 310 315 320
Gly Ala Val Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp
325 330 335
Ser Trp Val Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val
340 345 350
His Glu Ile Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg
355 360 365
Pro Arg Arg Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly
370 375 380
Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln
385 390 395 400
Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn
405 410 415
Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His
420 425 430
Asn Leu Thr Lys Glu Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys
435 440 445
Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser
450 455 460
Gly Met Pro Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val
465 470 475 480
Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys
485 490 495
Asn Trp Glu Thr Asn Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val
500 505 510
Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys
515 520 525
Tyr His Leu Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu
530 535 540
Ala Asn Ser Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val
545 550 555 560
Leu Arg Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro
565 570 575
Gln Glu Met Lys Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala
580 585 590
Val Lys Asn Phe Thr Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln
595 600 605
Asp Phe Asp Lys Ser Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln
610 615 620
Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp
625 630 635 640
Arg Pro Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys
645 650 655
Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile
660 665 670
Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln
675 680 685
Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser
690 695 700
Glu Val Ala
705
<210> 45
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：克隆A‐CAR
<400> 45
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
245 250 255
Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
260 265 270
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
275 280 285
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
290 295 300
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
305 310 315 320
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
325 330 335
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
340 345 350
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
355 360 365
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
370 375 380
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
385 390 395 400
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
405 410 415
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
420 425 430
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
435 440 445
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
450 455 460
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475
<210> 46
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：克隆B‐CAR
<400> 46
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met
245 250 255
Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile
260 265 270
His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro
275 280 285
Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
290 295 300
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
305 310 315 320
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
325 330 335
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
340 345 350
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 47
<211> 907
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：具有1个scFv和1个Fab的二价抗PSMA克隆A caTCR
(又称“Ax2‐caTCR‐1”或“二价克隆A caTCR‐1”)
<400> 47
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln
180 185 190
Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp
195 200 205
Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser
245 250 255
Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
275 280 285
Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro
305 310 315 320
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp
325 330 335
Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp
340 345 350
Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser
355 360 365
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr
370 375 380
Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
405 410 415
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
420 425 430
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
435 440 445
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
450 455 460
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
485 490 495
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His
500 505 510
Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys
515 520 525
His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser
530 535 540
Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val
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<220>
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(又称“Ax2‐caTCR‐2”或“二价克隆A caTCR‐2”)
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<213> 人工序列
<220>
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(又称“Bx2‐caTCR‐1”或“二价克隆B caTCR‐1”)
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Ser
<210> 50
<211> 891
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：具有2个Fab的二价抗PSMA克隆B caTCR
(又称“Bx2‐caTCR‐2”或“二价克隆B caTCR‐2”)
<400> 50
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Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu
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Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln
435 440 445
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
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<220>
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340 345 350
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
355 360 365
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
370 375 380
<210> 53
<211> 389
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp
100 105 110
Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
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130 135 140
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
165 170 175
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Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
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Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
355 360 365
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
370 375 380
Ala Ala Tyr Arg Ser
385
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<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
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Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp
100 105 110
Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
115 120 125
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130 135 140
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
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Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
165 170 175
Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser
195 200 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
210 215 220
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
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245 250 255
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275 280 285
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370 375
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
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Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
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Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
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370
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
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Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
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Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355 360
<210> 57
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
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Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
245 250 255
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Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
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340 345 350
Leu
<210> 58
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
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Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
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Ala Cys Ser Pro
385
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<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
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Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
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Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
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Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
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Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
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275 280 285
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370 375
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<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
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Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
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<210> 61
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
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Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
245 250 255
Ala Thr Gly Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr
260 265 270
Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu
275 280 285
Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala
290 295 300
Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro
305 310 315 320
Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser
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Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser
405 410 415
Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg
420 425 430
Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile
435 440 445
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<400> 62
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln
245 250 255
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Asp Arg Asp
260 265 270
Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro
275 280 285
Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro
290 295 300
Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile
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Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu
325 330 335
Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala
340 345 350
His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu
355 360 365
Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
370 375
<210> 63
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
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210 215 220
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Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
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260 265 270
Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro
275 280 285
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Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu
305 310 315 320
Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln
325 330 335
Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg
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Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys
355 360 365
Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
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50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
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100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
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Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
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305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
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<220>
<223> 合成构建体
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
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130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
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Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
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260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
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His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
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340 345 350
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
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Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
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450 455 460
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485 490 495
Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
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Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
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165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
260 265 270
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
275 280 285
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
290 295 300
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
305 310 315 320
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
325 330 335
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340 345 350
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Ser
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<211> 358
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala
260 265 270
Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro
275 280 285
Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe
290 295 300
Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg
305 310 315 320
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
325 330 335
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
340 345 350
Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355
<210> 72
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
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210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ala
245 250 255
Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg
260 265 270
Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser
290 295 300
Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
305 310 315 320
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
325 330 335
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
340 345
<210> 73
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
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Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
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260 265 270
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Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln
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Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
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Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Pro Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg
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Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly
305 310 315 320
Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu
325 330 335
Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu
340 345 350
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Pro Ala Cys Ser Pro
370
<210> 75
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
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Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Pro Thr Gln Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro
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305 310 315 320
Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val
325 330 335
Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg
340 345 350
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420 425 430
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485 490 495
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Thr Ala Ala Ser Gly Lys
530
<210> 76
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
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1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Ala Pro
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260 265 270
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340 345 350
Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg
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Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu
370 375 380
Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr
385 390 395 400
Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp
405 410 415
Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro
420 425 430
Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile
435 440 445
Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro
450 455 460
Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu
465 470 475 480
Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro
485 490 495
Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly
500 505 510
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515 520
<210> 77
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
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Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
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Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
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Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
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Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu
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355 360 365
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<210> 78
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
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Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
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Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260 265 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275 280 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290 295 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Cys Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro
325 330 335
Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu
340 345 350
Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala
355 360 365
Cys Ser Pro
370
<210> 81
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys His Arg Arg
325 330 335
Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val
340 345 350
Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg
355 360 365
Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala
370 375 380
Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser
385 390 395 400
Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro
405 410 415
Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser
420 425 430
Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala
435 440 445
Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg
450 455 460
Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala
465 470 475 480
Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly
485 490 495
Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp
500 505 510
Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
515 520
<210> 82
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260 265 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275 280 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290 295 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu
325 330 335
His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val
340 345 350
Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser
355 360 365
Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu
370 375 380
Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro
385 390 395 400
Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu
405 410 415
Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys
420 425 430
Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala
435 440 445
Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu
450 455 460
Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu
465 470 475 480
Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu
485 490 495
Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
500 505 510
<210> 83
<211> 375
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
245 250 255
Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr
325 330 335
Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala
355 360 365
His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
370 375
<210> 84
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
260 265 270
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
275 280 285
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
290 295 300
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro
325 330 335
Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln
340 345 350
Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
355 360 365
<210> 85
<211> 1064
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
35 40 45
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro
245 250 255
Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro
260 265 270
Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val
275 280 285
Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu
290 295 300
Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly
305 310 315 320
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
325 330 335
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu
340 345 350
Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu
355 360 365
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
370 375 380
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
385 390 395 400
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
405 410 415
Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
420 425 430
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
435 440 445
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr
450 455 460
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
465 470 475 480
Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
485 490 495
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
500 505 510
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
515 520 525
Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
530 535 540
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
545 550 555 560
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
565 570 575
Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro
580 585 590
Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu
595 600 605
Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser
610 615 620
Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala
625 630 635 640
Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
645 650 655
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu
660 665 670
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser
675 680 685
Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro
690 695 700
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly
705 710 715 720
Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
725 730 735
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
740 745 750
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr
755 760 765
Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp
770 775 780
Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
785 790 795 800
Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
805 810 815
Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
820 825 830
Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser
835 840 845
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro
850 855 860
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp
865 870 875 880
Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp
885 890 895
Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser
900 905 910
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr
915 920 925
Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
930 935 940
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val
945 950 955 960
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
965 970 975
Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
980 985 990
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
995 1000 1005
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
1010 1015 1020
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1025 1030 1035 1040
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
1045 1050 1055
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
1060
<210> 86
<211> 1059
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：PSMA克隆A caTCR + PSMA克隆B‐CSR‐1A
(又称“Ax1‐caTCR + B‐CSR”或“Ax1‐caTCR + B‐CSR ‐1A”)
<400> 86
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
35 40 45
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
65 70 75 80
Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
100 105 110
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro
245 250 255
Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro
260 265 270
Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val
275 280 285
Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu
290 295 300
Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly
305 310 315 320
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
325 330 335
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu
340 345 350
Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu
355 360 365
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
370 375 380
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
385 390 395 400
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
405 410 415
Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
420 425 430
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
435 440 445
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr
450 455 460
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
465 470 475 480
Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
485 490 495
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
500 505 510
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
515 520 525
Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
530 535 540
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
545 550 555 560
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
565 570 575
Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro
580 585 590
Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu
595 600 605
Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser
610 615 620
Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala
625 630 635 640
Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
645 650 655
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu
660 665 670
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser
675 680 685
Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro
690 695 700
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly
705 710 715 720
Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys
725 730 735
Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg
740 745 750
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly
755 760 765
Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp
770 775 780
Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
785 790 795 800
Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
805 810 815
Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
820 825 830
Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly
835 840 845
Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly
850 855 860
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr
865 870 875 880
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Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp
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<211> 1059
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：PSMA克隆B caTCR + PSMA克隆A‐CSR‐1A
(又称“Bx1‐caTCR + A‐CSR”或“Bx1‐caTCR + A‐CSR‐1A”)
<400> 87
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165 170 175
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro
355 360 365
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370 375 380
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
385 390 395 400
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450 455 460
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465 470 475 480
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<211> 1054
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：PSMA克隆B caTCR + PSMA克隆A‐CSR‐1A
(又称“Bx1‐caTCR + A‐CSR”或“Bx1‐caTCR + A‐CSR‐1A”)
<400> 88
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530 535 540
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545 550 555 560
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Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val
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Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr
690 695 700
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705 710 715 720
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser
725 730 735
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740 745 750
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp
755 760 765
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr
770 775 780
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly
785 790 795 800
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met
805 810 815
Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly
820 825 830
Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser
835 840 845
Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala
865 870 875 880
Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala
885 890 895
Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
900 905 910
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915 920 925
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1045 1050
<210> 89
<211> 1318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体：具有1个scFv和1个Fab的二价PSMA克隆A caTCR + PSMA克隆B‐CSR‐1A，
在PCT图中将称作“Ax2‐caTCR + B‐CSR”。
<400> 89
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Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln
180 185 190
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195 200 205
Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser
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Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser
245 250 255
Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
275 280 285
Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser
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Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro
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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp
325 330 335
Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp
340 345 350
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355 360 365
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Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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435 440 445
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450 455 460
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys
580 585 590
Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr
595 600 605
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675 680 685
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
690 695 700
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
705 710 715 720
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
725 730 735
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
740 745 750
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
755 760 765
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
770 775 780
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
785 790 795 800
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu
865 870 875 880
Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg
885 890 895
Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser Gly Ser Gly Ala Thr
900 905 910
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
915 920 925
Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val
930 935 940
Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
945 950 955 960
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser
965 970 975
Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
980 985 990
Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
995 1000 1005
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
1010 1015 1020
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
1025 1030 1035 1040
Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
1045 1050 1055
Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1060 1065 1070
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
1075 1080 1085
Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
1090 1095 1100
Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln
1105 1110 1115 1120
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1155 1160 1165
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1170 1175 1180
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1220 1225 1230
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275 1280
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1285 1290 1295
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1315
<210> 90
<211> 1313
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp
100 105 110
Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
115 120 125
Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
165 170 175
Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser
195 200 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
210 215 220
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
225 230 235 240
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile
245 250 255
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro
275 280 285
Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala
290 295 300
Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
305 310 315 320
Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro
325 330 335
Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr
340 345 350
Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr
355 360 365
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly
370 375 380
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
385 390 395 400
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
405 410 415
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
420 425 430
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
435 440 445
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
450 455 460
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
465 470 475 480
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val
485 490 495
Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr
500 505 510
Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr
515 520 525
Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu
530 535 540
Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe
545 550 555 560
Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr
565 570 575
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
580 585 590
Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp
595 600 605
Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
610 615 620
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625 630 635 640
Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
645 650 655
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly
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Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
675 680 685
Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys
705 710 715 720
Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe
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Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys
740 745 750
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala
755 760 765
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770 775 780
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945 950 955 960
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965 970 975
Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn
980 985 990
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
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1285 1290 1295
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
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Ser
<210> 91
<211> 902
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln
180 185 190
Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp
195 200 205
Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser
245 250 255
Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
275 280 285
Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp
325 330 335
Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp
340 345 350
Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
450 455 460
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465 470 475 480
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Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala
565 570 575
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625 630 635 640
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675 680 685
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755 760 765
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Cys Asn Gly Glu Lys Ser
900
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<211> 896
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
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Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
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Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
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115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
145 150 155 160
Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser
165 170 175
Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro
180 185 190
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp
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Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser
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Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp
245 250 255
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
275 280 285
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290 295 300
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
305 310 315 320
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
325 330 335
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
340 345 350
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355 360 365
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Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala
435 440 445
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Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser
545 550 555 560
Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu
565 570 575
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val
580 585 590
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser
610 615 620
Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser
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Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
645 650 655
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660 665 670
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
675 680 685
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
690 695 700
Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
705 710 715 720
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro
725 730 735
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
740 745 750
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
755 760 765
Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln
770 775 780
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820 825 830
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835 840 845
Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met
850 855 860
Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr
865 870 875 880
Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
885 890 895
<210> 93
<211> 633
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
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50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro
260 265 270
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275 280 285
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
290 295 300
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325 330 335
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly
355 360 365
Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu
385 390 395 400
Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile
405 410 415
Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp
420 425 430
Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr
435 440 445
Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val
450 455 460
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465 470 475 480
Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser
485 490 495
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
500 505 510
Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu
515 520 525
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530 535 540
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
545 550 555 560
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
565 570 575
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580 585 590
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
595 600 605
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
610 615 620
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
625 630
<210> 94
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 94
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1 5 10 15
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20
<210> 95
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
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1 5 10 15
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20 25
<210> 96
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Leu Phe Leu His
20
<210> 97
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 97
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
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20 25
<210> 98
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu
1 5 10 15
Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys
20 25
<210> 99
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ile Leu Leu
20
<210> 100
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 101
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 102
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 103
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 104
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val
1 5 10 15
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
20 25 30
Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
35 40 45
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
50 55 60
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
65 70 75 80
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
85 90 95
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
100 105 110
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
115 120
<210> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 106
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu
35 40 45
Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe
50 55 60
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
65 70 75 80
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
85 90 95
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
100 105
<210> 107
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala
20 25 30
Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg
35 40 45
Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
50 55 60
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
65 70 75 80
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
85 90
<210> 108
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Pro
1 5 10 15
Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly
20 25 30
His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu
35 40 45
Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile
50 55 60
Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg
100 105 110
Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro
115 120 125
Glu Pro Ala Cys Ser Pro
130
<210> 109
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala
1 5 10 15
Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr
20 25 30
Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe
35 40 45
Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu
50 55 60
Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys
65 70 75 80
Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro
85 90 95
Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys
100 105 110
Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
115
<210> 110
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Ala
1 5 10 15
Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr Pro Glu Asn Gly
20 25 30
Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu Leu Val Asp Ser
35 40 45
Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala Pro Val Ala Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe Trp
65 70 75 80
Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu Leu
85 90 95
Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu
100 105 110
Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser
115 120 125
Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr
130 135 140
Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu
145 150 155 160
Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln
165 170 175
Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu
180 185 190
Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr
195 200 205
Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu
210 215 220
Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu
225 230 235 240
Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu
245 250 255
Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu
260 265 270
Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
275 280 285
<210> 111
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 111
Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn Pro Thr Pro Glu Asn
1 5 10 15
Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln Ser Leu Leu Val Asp
20 25 30
Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr Ser Ala Pro Val Ala
35 40 45
Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala Gly Pro Val Leu Phe
50 55 60
Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly Ser Ser Ala Phe Leu
65 70 75 80
Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His
85 90 95
Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp
100 105 110
Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val
115 120 125
Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met
130 135 140
Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu
145 150 155 160
Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro
165 170 175
Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile
180 185 190
Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu
195 200 205
Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu
210 215 220
Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr
225 230 235 240
Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu
245 250 255
Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
260 265 270
<210> 112
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Asp
1 5 10 15
Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala
20 25 30
Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln
35 40 45
Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala
50 55 60
Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala
65 70 75 80
Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro
85 90 95
Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln
100 105 110
Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
115 120 125
<210> 113
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro
1 5 10 15
Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser
20 25 30
Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val
35 40 45
Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu
50 55 60
Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro
65 70 75 80
Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile
85 90 95
Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
100 105 110
<210> 114
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
20 25 30
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
50 55 60
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Cys Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
85 90 95
Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu
100 105 110
Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro
115 120 125
Ala Cys Ser Pro
130
<210> 115
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu
65 70 75 80
Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu
85 90 95
Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu
100 105 110
Pro Ala Cys Ser Pro
115
<210> 116
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
20 25 30
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
50 55 60
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys
85 90 95
Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala
115 120 125
Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro
130 135 140
Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu
145 150 155 160
Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp
165 170 175
Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu
180 185 190
Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys
195 200 205
Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu
210 215 220
Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln
225 230 235 240
Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val
245 250 255
Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
260 265 270
<210> 117
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 117
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln
65 70 75 80
Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu
85 90 95
Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln
115 120 125
Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser
130 135 140
Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg
145 150 155 160
Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile
165 170 175
Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val
180 185 190
Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro
195 200 205
Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu
210 215 220
Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser
225 230 235 240
Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly
245 250 255
Lys
<210> 118
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 118
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
20 25 30
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
50 55 60
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro
85 90 95
Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile
100 105 110
Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
115 120 125
<210> 119
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 119
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu
65 70 75 80
Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro
85 90 95
Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
100 105 110
<210> 120
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
20 25 30
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
50 55 60
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
85 90 95
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
100 105 110
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
115 120 125
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
65 70 75 80
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
85 90 95
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
100 105 110
<210> 122
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 123
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Glu
50 55 60
Leu Val Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 124
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
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Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 125
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 126
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 127
<211> 902
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln
180 185 190
Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp
195 200 205
Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser
245 250 255
Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
275 280 285
Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro
305 310 315 320
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp
325 330 335
Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp
340 345 350
Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser
355 360 365
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp
370 375 380
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
385 390 395 400
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
405 410 415
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
420 425 430
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
435 440 445
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
450 455 460
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
465 470 475 480
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
485 490 495
Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys
500 505 510
Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys
515 520 525
Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu
530 535 540
Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu
545 550 555 560
Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala
565 570 575
Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
580 585 590
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp
595 600 605
Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr
610 615 620
Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser
625 630 635 640
Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr
645 650 655
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn
660 665 670
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
675 680 685
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
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Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe
705 710 715 720
Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro
725 730 735
Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys
740 745 750
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr
755 760 765
Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr
770 775 780
Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr
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Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys
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820 825 830
Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp
835 840 845
Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn
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Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val
865 870 875 880
Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys
885 890 895
Cys Asn Gly Glu Lys Ser
900
<210> 128
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Arg Ala Lys Arg Ser
1 5
<210> 130
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 131
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn
1 5 10 15
Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25 30
<210> 132
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 133
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 134
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu
1 5 10 15
Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val
20 25 30
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Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys
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Leu Phe Phe Leu
65
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<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 135
Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser
1 5 10 15
Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala
35 40 45
Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly
50 55 60
Glu Lys Ser
65
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 136
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 137
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
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<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Glu Met Ala
20
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 140
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 142
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Ala Ala Ala Thr Gly
1 5
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Ser Gly
1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Ala Ala Ala
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Gly Gly Ser Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 147
Ser Gly Gly Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 148
Gly Ser Gly Ser
1
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 150
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 151
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 152
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 153
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 154
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 155
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 157
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 157
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
His His His His His His
1 5
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 159
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 160
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 161
<211> 1064
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 161
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
145 150 155 160
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln
180 185 190
Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp
195 200 205
Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser
210 215 220
Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys
225 230 235 240
Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser
245 250 255
Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile
275 280 285
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
290 295 300
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
305 310 315 320
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn
385 390 395 400
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
405 410 415
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
420 425 430
Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
435 440 445
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser
450 455 460
Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
465 470 475 480
Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
485 490 495
Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
500 505 510
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
515 520 525
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser
530 535 540
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
545 550 555 560
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
565 570 575
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
580 585 590
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
595 600 605
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
610 615 620
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
625 630 635 640
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
645 650 655
Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro
660 665 670
Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro
675 680 685
Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val
690 695 700
Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu
705 710 715 720
Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly
725 730 735
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
740 745 750
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu
755 760 765
Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu
770 775 780
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
785 790 795 800
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
805 810 815
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
820 825 830
Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
835 840 845
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
850 855 860
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr
865 870 875 880
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
885 890 895
Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
900 905 910
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
915 920 925
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
930 935 940
Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser
945 950 955 960
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
965 970 975
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
980 985 990
Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro
995 1000 1005
Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu
1010 1015 1020
Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser
1025 1030 1035 1040
Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala
1045 1050 1055
Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
1060
<210> 162
<211> 1059
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 162
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp
100 105 110
Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
115 120 125
Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
165 170 175
Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser
195 200 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
210 215 220
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
225 230 235 240
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile
245 250 255
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys
260 265 270
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro
275 280 285
Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
290 295 300
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
305 310 315 320
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
325 330 335
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
355 360 365
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
370 375 380
Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
385 390 395 400
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr
405 410 415
Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu
420 425 430
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
435 440 445
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
450 455 460
Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
465 470 475 480
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
485 490 495
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu
500 505 510
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515 520 525
Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln
530 535 540
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
545 550 555 560
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
565 570 575
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
580 585 590
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
595 600 605
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610 615 620
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
625 630 635 640
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740 745 750
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770 775 780
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785 790 795 800
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
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820 825 830
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
835 840 845
Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
850 855 860
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865 870 875 880
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915 920 925
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<211> 1058
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 163
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1 5 10 15
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
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Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser
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Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys
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1045 1050 1055
Lys Ser
<210> 164
<211> 1054
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 164
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
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130 135 140
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
165 170 175
Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met
180 185 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser
195 200 205
Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
210 215 220
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
225 230 235 240
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile
245 250 255
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys
260 265 270
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro
275 280 285
Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
290 295 300
Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys
305 310 315 320
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
325 330 335
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
340 345 350
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu
420 425 430
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser
435 440 445
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp
450 455 460
Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
465 470 475 480
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485 490 495
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu
500 505 510
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
515 520 525
Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
530 535 540
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
545 550 555 560
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
565 570 575
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
580 585 590
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
595 600 605
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
610 615 620
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
625 630 635 640
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp
645 650 655
Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro
660 665 670
Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val
675 680 685
Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys
690 695 700
Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu Arg
705 710 715 720
Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe
725 730 735
Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met
740 745 750
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly
755 760 765
Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
770 775 780
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile
785 790 795 800
Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
805 810 815
Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
820 825 830
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
835 840 845
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
850 855 860
Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val
865 870 875 880
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
885 890 895
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
900 905 910
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser
915 920 925
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn
930 935 940
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
945 950 955 960
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
965 970 975
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp
980 985 990
Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp
995 1000 1005
Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu
1010 1015 1020
Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys
1025 1030 1035 1040
Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
1045 1050
<210> 165
<211> 551
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
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Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
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Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
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165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
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Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
260 265 270
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
275 280 285
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
290 295 300
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
305 310 315 320
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
325 330 335
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
340 345 350
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp
355 360 365
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
370 375 380
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
405 410 415
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
420 425 430
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
435 440 445
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
450 455 460
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
465 470 475 480
Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys
485 490 495
Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys
500 505 510
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515 520 525
Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu
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545 550
<210> 166
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu
245 250 255
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260 265 270
Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
275 280
<210> 167
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 167
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
145 150 155 160
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
180 185 190
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp
225 230 235 240
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
275 280 285
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
290 295 300
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
305 310 315 320
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
325 330 335
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
340 345 350
Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys
355 360 365
Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys
370 375 380
Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu
385 390 395 400
Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu
405 410 415
Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
420
<210> 168
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 168
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln
115 120 125
Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys
130 135 140
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser
165 170 175
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
180 185 190
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
195 200 205
Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe
210 215 220
Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro
225 230 235 240
Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys
245 250 255
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr
260 265 270
Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr
275 280 285
Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr
290 295 300
Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys
305 310 315 320
Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr
325 330 335
Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp
340 345 350
Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn
355 360 365
Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val
370 375 380
Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys
385 390 395 400
Cys Asn Gly Glu Lys Ser
405
<210> 169
<211> 542
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
245 250 255
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu
260 265 270
Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val
275 280 285
Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr
290 295 300
Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly
305 310 315 320
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
325 330 335
Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
340 345 350
Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
355 360 365
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
370 375 380
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
405 410 415
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
420 425 430
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
435 440 445
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
450 455 460
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp Ser
465 470 475 480
Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser
485 490 495
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Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
530 535 540
<210> 170
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 170
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr
210 215 220
Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu
225 230 235 240
Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg
260 265 270
Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
275 280
<210> 171
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser
130 135 140
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp
145 150 155 160
Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
165 170 175
Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln
180 185 190
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu
195 200 205
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
245 250 255
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
260 265 270
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
275 280 285
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
290 295 300
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr Asp
340 345 350
Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro
355 360 365
Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val
370 375 380
Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys
385 390 395 400
Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
405 410 415
<210> 172
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 172
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro
115 120 125
Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg
165 170 175
Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser
180 185 190
Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
195 200 205
Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr
210 215 220
Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val
225 230 235 240
Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr
245 250 255
Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala
260 265 270
Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys
275 280 285
Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser
290 295 300
Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val
305 310 315 320
Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys
325 330 335
Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys
340 345 350
Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser
355 360 365
Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe
370 375 380
Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn
385 390 395 400
Gly Glu Lys Ser
<210> 173
<211> 547
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 173
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys
260 265 270
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe
275 280 285
Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
290 295 300
Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly
305 310 315 320
Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
325 330 335
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
340 345 350
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu
465 470 475 480
Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn
485 490 495
Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His
500 505 510
Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met
515 520 525
Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu
530 535 540
Phe Phe Leu
545
<210> 174
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 174
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
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165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg
260 265 270
Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser
275 280
<210> 175
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 175
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
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115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp
210 215 220
His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser
225 230 235 240
Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met
245 250 255
Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala
260 265 270
Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
275 280
<210> 176
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 176
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys
260 265 270
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe
275 280 285
Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
290 295 300
Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly
305 310 315 320
Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
325 330 335
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
340 345 350
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln
355 360 365
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
370 375 380
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
385 390 395 400
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
405 410 415
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
420 425 430
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
435 440 445
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
450 455 460
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro
465 470 475 480
Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys
485 490 495
Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr
500 505 510
Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile
515 520 525
Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu
530 535 540
Lys Ser
545
<210> 177
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe
145 150 155 160
Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly
180 185 190
Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
260 265 270
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
275 280 285
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
290 295 300
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
305 310 315 320
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu
340 345 350
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355 360 365
Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His
370 375 380
Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met
385 390 395 400
Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu
405 410 415
Phe Phe Leu
<210> 178
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 178
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln
115 120 125
Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys
130 135 140
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln
165 170 175
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr
180 185 190
Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly
210 215 220
Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr
225 230 235 240
Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala
245 250 255
Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val
260 265 270
Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr
355 360 365
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370 375 380
Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys
385 390 395 400
Asn Gly Glu Lys Ser
405
<210> 179
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 179
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
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Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln
115 120 125
Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys
130 135 140
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln
145 150 155 160
Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln
165 170 175
Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr
180 185 190
Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly
210 215 220
Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr
225 230 235 240
Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala
245 250 255
Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val
260 265 270
Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr
275 280 285
Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu
290 295 300
Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln
305 310 315 320
Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr
385 390 395 400
Ala Lys Leu Phe Phe Leu
405
<210> 180
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe
145 150 155 160
Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly
180 185 190
Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
260 265 270
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
275 280 285
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
290 295 300
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
305 310 315 320
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro
340 345 350
Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys
355 360 365
Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr
370 375 380
Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile
385 390 395 400
Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu
405 410 415
Lys Ser
<210> 181
<211> 902
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 181
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly
20 25 30
Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
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Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly
165 170 175
Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser
180 185 190
Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln
195 200 205
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210 215 220
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Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn
245 250 255
Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr
260 265 270
Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys
275 280 285
Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser Arg
290 295 300
Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe
305 310 315 320
Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met
325 330 335
Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly
340 345 350
Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile
370 375 380
Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
385 390 395 400
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
405 410 415
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
420 425 430
Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr
435 440 445
Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
450 455 460
Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
485 490 495
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
500 505 510
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met
515 520 525
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser
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Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
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580 585 590
Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
595 600 605
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
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Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly
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Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly
645 650 655
Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr
660 665 670
Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys
675 680 685
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp
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Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
755 760 765
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770 775 780
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
785 790 795 800
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Ile Val His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly
865 870 875 880
Leu Arg Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr
885 890 895
Ala Lys Leu Phe Phe Leu
900
<210> 182
<211> 896
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 182
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
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Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala
130 135 140
Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val
165 170 175
Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr
180 185 190
Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly
225 230 235 240
Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
245 250 255
Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
260 265 270
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
275 280 285
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly
290 295 300
Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
305 310 315 320
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
325 330 335
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
340 345 350
Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp
355 360 365
Pro Lys Asp Asn Cys Ser Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln
370 375 380
Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys
385 390 395 400
Ser Val Val Tyr Phe Ala Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr
405 410 415
Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser
420 425 430
Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
435 440 445
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu
450 455 460
Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Glu Val Gln
465 470 475 480
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys
485 490 495
Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
500 505 510
Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile
515 520 525
Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln
530 535 540
Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp
545 550 555 560
Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
565 570 575
Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
580 585 590
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
595 600 605
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu
610 615 620
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr
625 630 635 640
Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
645 650 655
Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe
660 665 670
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
675 680 685
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
690 695 700
Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
705 710 715 720
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
725 730 735
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
740 745 750
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
755 760 765
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
770 775 780
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
785 790 795 800
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
805 810 815
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835 840 845
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850 855 860
Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Met Leu Phe Ala
865 870 875 880
Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu
885 890 895
<210> 183
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 183
His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg
20 25 30
Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu
35 40 45
Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr
50 55 60
Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro
85 90 95
Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile
100 105 110
Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro
115 120 125
Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu
130 135 140
Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro
145 150 155 160
Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly
165 170 175
Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 184
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 184
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
130 135 140
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg
180 185 190
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
195 200 205
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Ser
225 230 235 240
Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro
260 265 270
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
275 280 285
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu
290 295 300
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro
305 310 315 320
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
325 330 335
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly
355 360 365
Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu
385 390 395 400
Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile
405 410 415
Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp
420 425 430
Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr
435 440 445
Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val
450 455 460
Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser
465 470 475 480
Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser
485 490 495
Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
500 505 510
Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
515 520 525
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
530 535 540
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
545 550 555 560
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
565 570 575
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
580 585 590
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
595 600 605
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
610 615 620
<210> 185
<211> 633
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 185
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala
260 265 270
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile
275 280 285
Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
290 295 300
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
305 310 315 320
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
325 330 335
Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr
340 345 350
Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
355 360 365
Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
385 390 395 400
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
405 410 415
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met
420 425 430
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser
435 440 445
Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
450 455 460
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
465 470 475 480
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu
485 490 495
Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
500 505 510
Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala Ala Ile Glu
515 520 525
Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
530 535 540
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
545 550 555 560
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
565 570 575
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
580 585 590
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
595 600 605
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
610 615 620
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
625 630
<210> 186
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 186
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ser
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Met Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn
145 150 155 160
Phe Ala Ser Tyr Trp Val Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr
180 185 190
Gly Pro Ala Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile
195 200 205
Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala
210 215 220
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Gly Ile Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala
260 265 270
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile
275 280 285
Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala
290 295 300
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro
305 310 315 320
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile
325 330 335
Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr
340 345 350
Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
355 360 365
Val Leu Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Leu Glu Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly
385 390 395 400
Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly
405 410 415
Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met
420 425 430
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser
435 440 445
Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
450 455 460
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
465 470 475 480
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Gly Ser Ser Leu
485 490 495
Tyr Ala Ser Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
500 505 510
Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
515 520 525
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
530 535 540
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
545 550 555 560
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
565 570 575
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
580 585 590
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
595 600 605
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
610 615 620

Claims (50)

1.一种抗前列腺特异性膜抗原PSMA构建体，其包含特异性识别细胞表面结合的PSMA的胞外域的抗体部分，所述胞外域包含SEQ ID NO:44中所阐述的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
i)重链可变域(VH)，所述重链可变域包括包含SEQ ID NO:1-2中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3-4中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5-6中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-H3；和
ii)轻链可变域(VL)，所述轻链可变域包括包含SEQ ID NO:7-8中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-L1、包含氨基酸序列GNS或SSN或包含约2个氨基酸取代的其变体的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9-10中的任一个的氨基酸序列或包含至多约5个氨基酸取代的其变体的CDR-L3。
3.根据权利要求2所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：i)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:1-2中的任一个的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3-4中的任一个的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5-6中的任一个的氨基酸序列的CDR-H3；和ii)VL，所述VL包括包含SEQ ID NO:7-8中的任一个的氨基酸序列的CDR-L1、包含GNS或SNN的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9-10中的任一个的氨基酸序列的CDR-L3。
4.根据权利要求2或3所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
a)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变域(VL)，所述轻链可变域包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1、包含氨基酸序列GNS的CDR-L2和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3；或
b)VH，所述VH包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；和VL，所述VL包括包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR-L1、包含氨基酸序列SNN的CDR-L2和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L3。
5.根据权利要求1所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含SEQ ID NO:16或17中阐述的重链可变域(VH)的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:18或19中阐述的轻链可变域(VL)的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
6.根据权利要求5所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
(a)SEQ ID NO:16中阐述的VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:18中阐述的VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(b)SEQ ID NO:17中阐述的VH的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3和SEQ ID NO:19中阐述的VL的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
i)包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:16或17具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列的VH；和包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:18或19具有至少约85％序列一致性的氨基酸序列的VL；
ii)包含SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的VL；
iii)包含SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:16具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:18具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的VL；
iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL；或
v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL。
8.根据权利要求1所述的抗PSMA构建体，其中所述抗体部分包含：
i)包含SEQ ID NO:1、3和5的氨基酸序列的重链可变域(VH)和包含SEQ ID NO:7、GNS和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变域(VL)；或
ii)包含SEQ ID NO:2、4和6的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:8、SSN和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为嵌合、人源的、部分人源化、完全人源化或半合成的。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)。
11.根据权利要求10所述的抗PSMA构建体，其中所述特异性识别PSMA的抗体部分为scFv。
12.根据权利要求11所述的抗PSMA构建体，其中所述scFv包含：
i)SEQ ID NO:20中阐述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少85％序列一致性的氨基酸序列；或
ii)SEQ ID NO:21中阐述的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21具有至少85％、90％或95％序列一致性的氨基酸序列。
13.根据权利要求10所述的抗PSMA构建体，其中所述抗PSMA构建体为全长抗体，且其中所述全长抗体包含：
i)包含SEQ ID NO:39或与SEQ ID NO:39具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:40或与SEQ ID NO:40具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的轻链；或
ii)包含SQEID NO:41或与SEQ ID NO:41具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:42或与SEQ ID NO:42具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的轻链。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为单特异性的。
15.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为多特异性的。
16.根据权利要求15所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为双特异性的。
17.根据权利要求15或16所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为串联scFv、双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、双亲和力再靶向(DART)抗体、F(ab')2、双可变域DVD抗体、杵臼KiH抗体、锚栓DNL抗体、化学交联抗体、杂多聚体抗体或异源结合抗体。
18.根据权利要求15至17中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体进一步包含特异性识别第二抗原的第二抗体部分。
19.根据权利要求18所述的抗PSMA构建体，其中所述第二抗原为B细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞或T细胞的表面上的抗原，任选地其中所述T细胞的表面上的所述抗原选自由以下组成的群组：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、CD40L和HVEM。
20.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含以下的CAR：
(a)包含所述抗PSMA抗体部分的胞外域；
(b)跨膜域；以及
(c)胞内信号传导域。
21.根据权利要求20所述的抗PSMA构建体，其中所述胞内信号传导域包含来源于CD3ζ、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的初级免疫细胞信号传导序列。
22.根据权利要求21所述的抗PSMA构建体，其中所述胞内信号传导域进一步包含来源于CD28、4-1BB、ICOS或OX40的共刺激信号传导序列。
23.根据权利要求20至22中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述胞内信号传导域包含来源于CD3ζ的初级免疫细胞信号传导序列和来源于CD28的共刺激信号传导序列。
24.根据权利要求20至23中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其包含：
i)SEQ ID NO:29或与SEQ ID NO:29具有至少85％序列一致性的氨基酸序列；或
ii)i)SEQ ID NO:30或与SEQ ID NO:30具有至少85％序列一致性的氨基酸序列。
25.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含以下的caTCR：
(a)包含所述抗PSMA抗体部分的胞外域；以及
(b)T细胞受体模块TCRM，其包括包含第一TCR跨膜域TCR-TM的第一TCR域TCRD和包含第二TCR-TM的第二TCRD，其中所述TCRM促进至少一种TCR相关信号传导分子的募集。
26.根据权利要求25所述的抗PSMA构建体，其中所述第一TCR-TM和所述第二TCR-TM来源于γ/δTCR，
任选地其中所述第一TCR-TM来源于TCRγ链且所述第二TCR-TM来源于TCRδ链，或
任选地其中所述第一TCR-TM来源于TCRδ链且所述第二TCR-TM来源于TCRγ链。
27.根据权利要求27所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体包含：
i)包含SEQ ID NO:31或与SEQ ID NO:31具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:32或与SEQ ID NO:32具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
ii)包含SEQ ID NO:34或与SEQ ID NO:34具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:35或与SEQ ID NO:35具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
iii)包含SEQ ID NO:165或与SEQ ID NO:165具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:166或与SEQ ID NO:166具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
iv)包含SEQ ID NO:167或与SEQ ID NO:167具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:168或与SEQ ID NO:168具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
v)包含SEQ ID NO:169或与SEQ ID NO:169具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:170或与SEQ ID NO:170具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
vi)包含SEQ ID NO:171或与SEQ ID NO:171具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:172或与SEQ ID NO:172具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
vii)包含SEQ ID NO:73或与SEQ ID NO:173具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:174或与SEQ ID NO:174具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
viii)包含SEQ ID NO:175或与SEQ ID NO:175具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:176或与SEQ ID NO:176具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；
ix)包含SEQ ID NO:177或与SEQ ID NO:177具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:178或与SEQ ID NO:178具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链；或
x)包含SEQ ID NO:179或与SEQ ID NO:179具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第一多肽链和包含SEQ ID NO:180或与SEQ ID NO:180具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的第二多肽链。
28.根据权利要求25至27中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述TCR相关信号传导分子选自由CD3δε、CD3γε和CD3ζζ组成的群组。
29.根据权利要求25至28中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述caTCR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。
30.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述构建体为包含以下的嵌合信号传导受体CSR：
i)能够与PSMA结合或相互作用的配体结合模块；
ii)跨膜模块；以及
iii)共刺激免疫细胞信号传导模块，其能够向效应细胞提供共刺激信号，
其中所述配体结合模块和所述共刺激免疫细胞信号传导模块并非来源于同一分子，且其中所述CSR缺乏功能性初级免疫细胞信号传导域。
31.根据权利要求30所述的抗PSMA构建体，其中所述CSR缺乏任何初级免疫细胞信号传导序列。
32.根据权利要求30或31所述的抗PSMA构建体，其中所述配体结合模块包含根据权利要求1至24中任一权利要求所述的抗PSMA构建体。
33.根据权利要求30至32中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块和所述CSR的所述共刺激免疫细胞信号传导模块来自同一分子，
任选地其中所述分子选自由以下组成的群组：CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD27、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体。
34.根据权利要求30至33中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其中所述CSR的所述跨膜模块和所述CSR的所述共刺激免疫细胞信号传导模块来自不同分子，
任选地其中所述CSR的所述跨膜模块包含来源于CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、4-1BB、OX40、T细胞受体的α、β、δ、γ或ζ链、包含SEQ ID NO 94-99中的任一个的序列或与SEQ IDNO 94-99中的任一个具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的跨膜域，
任选地其中所述共刺激免疫细胞信号传导模块来源于TCR的共刺激受体的胞内域，任选地其中所述共刺激受体选自由以下组成的群组：4-1BB、CD27、CD28、CD30、OX40、ICOS、CD40、SEQ ID NO:100-103和183中的任一个或与SEQ ID NO:100-103和183中的任一个具有至少85％序列一致性的序列。
35.根据权利要求31至34中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其包含SEQ ID NO:37-38、55-84、93和184-186中的任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:37-38、55-84、93和184-186中的任一个具有至少85％序列一致性的氨基酸序列；
任选地其中所述抗PSMA构建体进一步包含信号肽，
任选地其中所述信号肽包含METDTLLLWVLLLWVPGSTG SEQ ID NO:128的序列。
36.根据权利要求1至19中任一权利要求所述的抗PSMA构建体，其结合于效应分子，其中所述效应分子为可检测标记或选自由以下组成的群组的治疗剂：药物、毒素、放射性同位素、蛋白质、肽和核酸。
37.一种效应细胞，其用编码根据权利要求20至24中任一权利要求所述的抗PSMA CAR或根据权利要求25至29中任一权利要求所述的抗PSMA caTCR的一或多种核酸进行基因修饰，
其中编码所述抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR或包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv；或
其中所述效应细胞用编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR或包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv的一或多种其它核酸进行基因修饰，
任选地其中所述效应细胞为免疫细胞，
任选地其中所述免疫细胞为T细胞，
任选地其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
38.一种效应细胞，其用编码根据权利要求17至19中任一权利要求所述的抗PSMA串联scFv或根据权利要求30至35中任一权利要求所述的抗PSMACSR的一或多种核酸进行基因修饰，
任选地其中所述效应细胞为免疫细胞，
任选地其中所述免疫细胞为T细胞，
任选地其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
39.一种产生效应细胞的方法，其包含用编码根据权利要求20至24中任一权利要求所述的抗PSMA CAR或根据权利要求25至29中任一权利要求所述的抗PSMA caTCR的一或多种核酸对细胞进行基因修饰，
任选地其中编码所述抗PSMA CAR或抗PSMA caTCR的所述一或多种核酸还编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR或包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv；或
任选地其中所述方法进一步包含用编码包含结合目标抗原的配体结合模块的CSR或包含结合目标抗原的第一scFv的串联scFv的一或多种其它核酸对所述细胞进行基因修饰；
任选地其中所述效应细胞为免疫细胞，
任选地其中所述免疫细胞为T细胞，
任选地其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
40.一种产生效应细胞的方法，其包含用编码根据权利要求17至19中任一权利要求所述的抗PSMA串联scFv或根据权利要求30至35中任一权利要求所述的抗PSMA CSR的一或多种核酸对细胞进行基因修饰；
任选地其中所述效应细胞为免疫细胞，
任选地其中所述免疫细胞为T细胞，
任选地其中所述T细胞为细胞毒性T细胞、辅助T细胞或自然杀伤T细胞。
41.一种核酸，其编码根据权利要求1至35中任一权利要求所述的抗PSMA构建体的多肽部分。
42.一种载体，其包含根据权利要求41所述的核酸。
43.一种宿主细胞，其包含根据权利要求41所述的核酸或根据权利要求42所述的载体。
44.一种产生根据权利要求1至19中任一权利要求所述的抗PSMA构建体的方法，其包含在表达所述抗PSMA构建体的条件下培养根据权利要求43所述的宿主细胞，且回收由所述宿主细胞产生的所述抗PSMA构建体。
45.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至19和36中任一权利要求所述的抗PSMA构建体、根据权利要求37或38所述的效应细胞、根据权利要求41所述的核酸和/或根据权利要求42所述的载体和药学上可接受的载剂。
46.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至19和36中任一权利要求所述的抗PSMA构建体、根据权利要求37或38所述的效应细胞、根据权利要求41所述的核酸、根据权利要求42所述的载体和/或根据权利要求43所述的宿主细胞。
47.一种检测样品中的PSMA的方法，其包含使所述样品接触根据权利要求36所述的抗PSMA构建体，其中所述效应分子为可检测标记，且检测所述标记的存在。
48.一种治疗患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
i)向所述个体施用有效量的根据权利要求45所述的药物组合物；或
ii)向所述个体施用根据权利要求37或38所述的效应细胞；
任选地其中所述方法进一步包含向所述个体施用其它疗法；
任选地其中所述PSMA相关疾病或病症为癌症；
任选地其中所述哺乳动物为人。
49.一种诊断怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
a)向所述个体施用有效量的根据权利要求36所述的抗PSMA构建体，其中所述效应分子为可检测标记；以及
b)测定所述个体中所述标记的水平，其中所述标记的水平超过阈值水平指示所述个体患有所述PSMA相关疾病或病症；
任选地其中PSMA相关疾病或病症为癌症；
任选地其中所述哺乳动物为人。
50.一种诊断怀疑患有PSMA相关疾病或病症的个体的方法，其包含：
a)使包含来源于所述个体的细胞的样品接触根据权利要求114所述的抗PSMA构建体；以及
b)测定所述样品中结合于所述抗PSMA构建体的细胞的数目，其中结合于所述抗PSMA构建体的细胞的数目的值超过阈值水平指示所述个体患有所述PSMA相关疾病或病症；
任选地其中PSMA相关疾病或病症为癌症；
任选地其中所述哺乳动物为人。
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