TW201834685A

TW201834685A - Klk6-介導cns-特異性抗體前藥活化

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Publication number: TW201834685A
Application number: TW106146601A
Authority: TW
Inventors: 游傑華; 玉裕馮; 許甦怡; 胡智湧; 吳佳城
Original assignee: 財團法人生物技術開發中心
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-10-01
Also published as: CN110636856A; AU2017388894A1; US20190203192A1; JP2020504123A; WO2018126232A1; EP3598866A1; CA3048467A1

Abstract

本發明係關於一種能夠在中樞神經系統(CNS)中受到蛋白酶KLK6選擇性地活化之抗體前藥，其包括用於治療該CNS中之疾病或病症的抗體；與該抗體之重鏈及/或輕鏈之N端融合的KLK6可裂解肽；及與該KLK6可裂解肽之N端融合的阻斷劑。該疾病或病症為癌症、發炎性疾病、自體免疫疾病、傳染性疾病或神經元退化疾病。

Description

KLK6-介導CNS-特異性抗體前藥活化

本發明係關於用於治療各種CNS相關疾病的廣泛抗體分子。

疾病治療常常對病患會造成不良效應。為使不良效應降至最低，吾人需要增進治療劑之特異性，亦即僅攻擊疾病因子(disease agent)或細胞/組織。然而，具有此類選擇性並非永遠可行的。舉例而言，抗體以高親和力對其目標抗原具有高度特異性，且已經批准用於一些疾病中進行治療或診斷應用。然而，目標抗原表現不一定具有疾病特異性。因此，除靶向疾病病灶以外，大部分治療性抗體亦可能靶向正常組織，因而引起不良效應。另一種降低不良效應的方法為以前藥形式遞送治療劑，該等前藥僅在目標位點處活化。許多前藥顯示可有效降低非期望副作用。然而，大部分前藥為小分子。中樞神經系統(CNS)對治療劑之特異性靶向是獨特的挑戰。因此，仍需要更好的方法來治療CNS疾病或病症。

本發明之實施方案係關於使用含KLK6受質之重組蛋白質或肽與抗體之N端融合以產生抗原識別功能降低之前藥抗體(前抗體)。此等前抗體可在具有高濃度KLK6蛋白酶之組織中(諸如在CNS中)被活化。本發明之發明人發現，前抗體中之KLK6受質序列不會被血清中之KLK6裂解，此係由於KLK6在血清中的濃度較低。相比之下，前抗體被CNS中之KLK6裂解，此係由於KLK6在CNS中之濃度較高。因此，可在外周血液中壓制抗體之功能以預防不良效應並且使抗體在外周組織中之浪費降至最低。在此等前抗體進入CNS後，它們可被活化以靶向CNS相關疾病或病症。在一個態樣中，本發明之實施方案係關於能夠在中樞神經系統(CNS)中受到蛋白酶KLK6選擇性地活化之抗體前藥。根據本發明之一個實施方案的抗體前藥包括用於治療CNS中之疾病或病症的抗體或其結合片段；與該抗體之重鏈及/或輕鏈之N端融合的KLK6可裂解肽；及與該KLK6可裂解肽之N端融合的阻斷劑。根據本發明之實施方案，中樞神經系統(CNS)中之疾病或病症可為癌症、發炎性疾病、自體免疫疾病、傳染性疾病或神經元退化疾病。根據本發明之實施方案，阻斷劑包含蛋白質、蛋白質結構域或肽。根據本發明之實施方案，KLK6可裂解肽源自於天然KLK6受質、肽噬菌體庫、合成肽庫或可被KLK6裂解之任何肽序列。根據本發明之實施方案，抗體為單株抗體或其結合片段、雙特異性抗體、多特異性抗體、抗體藥物結合物(ADC)、免疫細胞介素、免疫激素或免疫毒素。抗體可為鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。根據本發明之實施方案，抗體可為任何適合之抗體，諸如抗VEGF抗體或抗PD-1抗體。在本發明之另一態樣中，本發明之實施方案係關於用於治療CNS中之疾病或病症的方法。根據本發明之一個實施方案的方法包含：向有需要之個體投與有效量的本發明之抗體前藥(亦即前抗體)。有效量為可達成所要治療效果之量。熟習此項技術者應瞭解，有效量將視疾病病狀、投藥途徑、患者條件(例如，年齡、體重、性別等)而定，且熟習此項技術者應能夠在無需過度實驗的情況下確定有效量。舉例而言，根據本發明之實施方案，按患者之重量計，有效量可在0.1 µg/Kg至10 mg/Kg、較佳地1 µg/Kg至1 mg/Kg、更佳地1 µg/Kg至0.1 mg/Kg的範圍內。本發明之其他態樣及優勢將自以下實施方式及所附申請專利範圍而顯而易見。

定義如本文所用，術語「抗體」係指單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或抗體藥物結合物(ADC)。「抗體藥物結合物」可為免疫細胞介素、免疫激素或免疫毒素。術語「免疫細胞介素」係指重組抗體-細胞介素融合蛋白質。術語「免疫激素」係指重組抗體-激素融合蛋白質。免疫激素之一個實例為抗體-瘦素融合蛋白質。術語「免疫毒素」係指重組抗體-毒素結合物。抗體之結合片段可為scFv、Fab或F(ab')₂ 。術語「與蛋白質之N端融合」係指在該蛋白質之N端形成融合蛋白質。術語「阻斷劑」係指用於降低或阻斷抗體之活性(亦即將該抗體轉化為前藥)的肽或蛋白質。另外，阻斷劑可用於促進向CNS系統中遞送，參見例如，Yu, Y. J.等人, 「Boosting brain uptake of a therapeutic antibody by reducing its affinity for a transcytosis target 」,Sci. Trans. Med. 3, 84ra44 (2011)。術語「KLK6可裂解肽」係指可被胰蛋白酶樣蛋白酶KLK6裂解之肽。各種KLK6可裂解肽序列為此項技術中已知的，或熟習此項技術者可在無需過度實驗的情況下容易地確定特定序列是否可被KLK6裂解。本發明之實施方案係關於用於治療中樞神經系統(CNS)中之疾病或病症的治療性抗體。此等抗體呈前藥(前抗體)形式，其包括附接至抗體可變域之N端的肽片段(阻斷肽或阻斷劑)以阻斷該抗體與目標抗原之結合。阻斷肽與某些酶原(proenzyme)之前肽類似。透過選擇性蛋白酶使阻斷肽裂解將會釋放活性抗體。本發明之實施方案依賴於激肽釋放素-6 (kallikrein-6，KLK-6)供用於前抗體之特異性活化。具體言之，本發明之實施方案使用含KLK6受質之重組蛋白質或肽與抗體之N端融合。含KLK6受質之重組蛋白質或肽如前肽一樣起作用以阻斷或降低抗體之抗原識別功能。由於KLK6在外周血液血清中之濃度較低，故KLK6受質不會被血液循環中之KLK6裂解達到任何明顯程度。然而，含KLK6受質之重組蛋白質或肽可被CNS中所見濃度之KLK6高效地裂解。因此，可在外周血液中使抗體之功能被阻斷或降至最低以預防不良效應並且減少抗體之不必要浪費。在此等前抗體進入CNS後，它們可被活化以靶向CNS相關疾病。人類激肽釋放素(KLK)家族包括在各種組織中表現的15種分泌型絲胺酸蛋白酶。其中，發現KLK6在CNS中高度表現，且亦在乳癌及卵巢癌組織中過度表現。KLK6亦稱為酶(zyme)、蛋白酶M及神經蛋白(neurosin)，其為胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶。KLK6在CNS中之寡樹突神經膠質細胞中持續性表現，且其表現在脊髓損傷(SCI)之後及在進展中的多發性硬化症(MS)病灶中增強。已展示許多蛋白質會被KLK6裂解，包括人類髓鞘鹼性蛋白(MBP)、β澱粉樣蛋白肽(Aβ)、纖維蛋白溶酶原、髓鞘質及α-突觸核蛋白等。 KLK6含量在各種人類體液中已被測定，且已發現相比於血液循環，KLK6在腦脊髓液(CSF)中顯著增濃。此差異性表現含量使得前藥有能夠在CNS中活化之機會。根據本發明之實施方案，為減少不合需要之副作用，已研發出在外周血液中功能降低之抗體前藥。此等抗體前藥可被中樞神經系統中之KLK6活化。本發明可適用於各種CNS相關疾病，例如癌症、發炎性疾病、自體免疫疾病、傳染性疾病或神經元退化疾病。圖1展示說明KLK6-介導CNS-特異性抗體前藥作用之策略的圖。根據本發明之實施方案，抗體之輕鏈及/或重鏈的N端可與阻斷劑(阻斷肽)融合以將該抗體轉化為前藥(亦即前抗體)。阻斷劑降低抗體之抗原識別。阻斷劑含有可被KLK6裂解之肽序列。此肽序列之作用為KLK6受質(KLK6s)。根據本發明之一些實施方案，僅輕鏈N端含有阻斷劑。根據本發明之其他實施方案，僅重鏈N端含有阻斷劑。因為抗原-抗體結合涉及重鏈及輕鏈兩者之可變域，所以阻斷重鏈或輕鏈N端之一將足以破壞抗原-抗體結合。根據本發明之一些實施方案，輕鏈N端及重鏈N端兩者各自含有阻斷劑。重鏈及輕鏈可變區之雙重阻斷可產生更好的抗原-抗體相互作用阻斷。根據本發明之實施方案，阻斷劑包含有含KLK6受質之蛋白質、蛋白質結構域或肽，以使得活性抗體將會僅在KLK6高於某一濃度之環境中被釋放。KLK6為胰蛋白酶樣蛋白酶，其偏好在精胺酸殘基之羧基側裂解。Li等人發現，KLK6偏好P1位置由Arg佔據之肽受質，而在P1'中強烈偏好Ser。(Protein Sci ., 17(4): 664-672 (2008))。Magklalra等人(Biochem. Biophys. Res. Commun ., 307(4): 948-55 (2003))亦發現，KLK6裂解效率在Arg的情況下比Lys高得多，且在P2位置中偏好Ser或Pro。基於此資訊，吾人可設計出會被KLK6高效地裂解之肽序列。熟習此項技術者應瞭解，許多肽序列將滿足此等基準，因此本發明之實施方案不限於在本說明書中所用之任何特定實例。此類肽在本說明書中一般將稱作KLK6受質(或KLK6s)。本發明之實施方案係基於以下觀測結果：KLK6在CNS中之存在濃度比在外周血液中高得多。KLK6在外周血液中之濃度在0至12.6 μg/L範圍內，而KLK6在CNS中之濃度在41至2053 μg/L範圍內。由於外周血液與CNS之間的KLK6濃度有這樣的顯著差異，本發明之阻斷劑融合抗體(前抗體)可在外周血液中維持其低活性以預防任何不良效應，但可受到CNS中之KLK6活化以得到其治療功能。以下描述使用具體實例來說明本發明之實施方案。熟習此項技術者應瞭解，此等實例僅用於說明，而不意欲限制本發明之範疇，此係因為可在不偏離本發明範疇的情況下進行變化及修改。在以下實例中，藉由構築含有所要序列之表現載體來製備各種融合蛋白質。可使用此項技術中已知的任何適合載體。在以下實例中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)來構築與含KLK6s之肽/蛋白質融合的抗體，且將其選殖至pTCAE8載體(質體)之多重選殖位點中。用於此等蛋白質及載體之特定cDNA序列為此項技術中已知且可容易獲得的。所用方法為習知的。各種載體及試劑可自商業來源獲得。因此，熟習此項技術者應能夠獲得此等試劑且在無需過度實驗的情況下進行所描述之實驗。實例1：阻斷蛋白質自前抗體之特異性裂解在此實例中，使用與瘦素-KLK6s融合之阿瓦斯汀Fab作為前抗體以測試KLK6釋放阿瓦斯汀Fab之能力。將融合蛋白質(前抗體)與分別為血清濃度、CSF濃度、1 μM或2 μM之KLK6一起培育24小時。圖2展示與含KLK6受質(KLK6s)之蛋白質融合之抗體Fab的活體外KLK6裂解結果。在此實例中，KLK6s (KLK6受質序列)為具有YMTRSAMG (SEQ ID NO: 1)序列之八肽，其含有有利KLK6裂解位點-R-S-。蛋白質藉由SDS-PAGE來分離且用考馬斯亮藍R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250) (CBR)染色(圖2A)，或藉由西方墨點法來分析(圖2B)。與對照組(色帶1、2及3)相比，KLK6在血清濃度下並未有效裂解阻斷劑(色帶4)，而如由箭頭所指示之經裂解蛋白質所證明，KLK6在CSF濃度或更高濃度下展示高效裂解(色帶5、6及7)。此等結果指示，根據本發明之實施方案的前抗體將在外周血液中存留下來，且一旦處於CNS中則可被高效活化。實例2：前抗體及再活化抗體之抗原結合在此實例中，藉由表面電漿共振(SPR) (BIAcore)來測定抗VEGF Fab (Lucentics®；蘭尼單抗(ranibizumab))或與瘦素-KLK6s融合之阿瓦斯汀Fab的結合動力學。圖3展示在KLK6消化之前和之後，與含KLK6受質(KLK6s)之蛋白質融合之抗體Fab的抗原識別能力。與Lucentics®對照組(圖3A)相比，未經KLK6消化的與瘦素-KLK6s融合之阿瓦斯汀Fab對其抗原VEGF未展示出結合親和力(圖3B)。相比之下，與瘦素-KLK6s融合之阿瓦斯汀Fab在KLK6消化之後對VEGF展示出良好結合親和力(圖3C)。此等結果展示，阻斷肽/蛋白質有效防止前抗體與其抗原結合，且在阻斷劑(前肽或前蛋白質)裂解之後，具活性抗體得到釋放且可特異性地結合至其目標。此等結果證實了本發明之方法。實例3：前肽之KLK6裂解的效率在此實例中，將與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-Leptin與CSF濃度之KLK6一起分別培育6、24或48小時，其中該FR1肽為阿瓦斯汀之構架區1。蛋白質隨後藉由SDS-PAGE來分離且用CBR染色。圖4展示與含KLK6受質(KLK6s)之肽融合之抗體的活體外KLK6裂解結果。與對照組(色帶1)相比，CSF濃度之KLK6在不同時間點展示如由箭頭所指示之經裂解蛋白質。在6小時之時，基本上裂解完全，指示裂解相當有效率。實例4：KLK6對阻斷劑之時間依賴性裂解在此實例中，藉由SPR (BIAcore)來測定抗VEGF抗體(阿瓦斯汀)或與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素的結合動力學。圖5展示在KLK6消化之前和之後，與含KLK6受質(KLK6s)之肽融合之抗體的抗原識別能力結果。與阿瓦斯汀對照組(圖5A)相比，未經KLK6消化的與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素表現出對其抗原VEGF之結合親和力降低(在圖5B中為0小時)，而隨著KLK6消化時間增加，與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素的VEGF結合再活化(在圖5C、5D及5E中分別為6、24及48小時)。此等結果證實本發明之實施方案可被KLK6活化。實例5：具有不同肽阻斷劑及KLK6受質之前抗體的KLK6-介導之阻斷劑裂解在此實例中，將與含不同KLK6s之肽阻斷劑融合的阿瓦斯汀與CSF濃度之KLK6一起培育24小時。圖6展示如由SDS-PAGE所分析且用CBR染色，與含KLK6s之肽融合之阿瓦斯汀的活體外KLK6裂解結果(圖6A及6B)。所有與含KLK6可裂解肽之阻斷劑融合的阿瓦斯汀均可被KLK6裂解。在KLK6消化之前和之後，藉由SPR (BIAcore)來測定在VEGF與阿瓦斯汀或阿瓦斯汀衍生物之間的相互作用(圖6C)。如與阿瓦斯汀對照組相比，未經KLK6消化的與含不同KLK6可裂解肽之阻斷劑融合之阿瓦斯汀展示反應減少，而在KLK6消化的情況下，與含不同KLK6可裂解肽之阻斷劑融合之阿瓦斯汀的VEGF結合再活化。在具有不可裂解連接子序列(SSYISNYG；SEQ ID NO: 13)的與肽阻斷劑融合之阿瓦斯汀中，與肽阻斷劑融合之阿瓦斯汀的VEGF結合能力展示在KLK6消化之前和之後反應單位減小。此等結果證實，具有不同阻斷劑序列或KLK6受質序列的本發明之實施方案可被KLK6活化。在此實例中，肽阻斷劑序列及KLK6s序列列於表1中。如所示，肽阻斷劑序列可包括充當間隔子之某些胺基酸以使KLK6受質序列與抗體序列分開。間隔子發揮確保KLK6可接近裂解序列之作用。處於裂解序列之N端側的肽阻斷劑序列可為任何蛋白質或任何肽序列。表 1 實例6：肽阻斷劑自Opdivo®之前抗體的特異性裂解在此實例中，將融合至抗PD-1 mAb (納武單抗(Nivolumab)；Opdivo®)之N端的含KLK6s之肽阻斷劑與CSF濃度之KLK6一起培育24小時。圖7A展示如用SDS-PAGE所分析且用CBR染色，與含KLK6s之肽融合之Opdivo®的活體外KLK6裂解結果。與含KLK6s之肽融合的Opdivo®可被KLK6裂解。在KLK6消化之前和之後，藉由SPR (BIAcore)來測定在PD-1與抗PD-1 mAb(Opdivo®)或Opdivo®衍生物之間的相互作用(圖7B)。如與Opdivo®對照組相比，未經KLK6消化的與含KLK6s之肽阻斷劑融合之Opdivo®展示反應減少，而在KLK6消化的情況下，與含KLK6s之肽阻斷劑融合之Opdivo®被再活化以與PD-1結合。此等結果證實，應用於不同抗體中的本發明之實施方案亦可被KLK6活化。在此實例中，肽阻斷劑序列及KLK6s序列列於表2中。表2 實例7：前抗體活化之活體內測試在此實例中，經由i.v.注射將與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素注射至BALB/c小鼠中。分別在注射後0.08、2、4及8小時之時採集血清樣本及大腦樣本。藉由ELISA測定活性抗體及總抗體濃度。圖8展示與含KLK6受質(KLK6s)之肽融合之抗體在小鼠中的活體內抗體活化結果。在血漿中，活性的與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素的百分比維持在減低水準，而大腦中的與FR1肽-KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素展示活性抗體之百分比增加。此等結果展示，與阻斷劑-KLK6s融合之抗體於活體內可在CNS中再活化。本發明之一些實施方案係關於用於治療CNS疾病之方法。根據本發明之一個實施方案的方法包含向有需要之個體投與有效量的本發明之前抗體。前抗體包含附接至抗體或其結合片段之重鏈及/或輕鏈之N端的阻斷肽。抗體之結合片段可為Fab、scFv或F(ab')₂ 等。雖然已就有限數目之實施方案來描述本發明，但因本發明之揭露而獲益的熟習此項技術者應瞭解，其他實施方案可被設計但仍不偏離如本文所揭示之本發明範疇。舉例而言，可使用其他抗體代替此等實例中所示之抗體。類似地，阻斷肽片段可包括藉由KLK6受質序列連接至抗體之任何蛋白質或肽。因此，本發明之範疇應僅受所附申請專利範圍限制。

圖1展示說明KLK6-介導CNS-特異性抗體前藥作用之策略的圖。圖2(A)展示藉由對蛋白質條帶進行考馬斯染色(Coomassie staining)而得到與含KLK6受質(KLK6s)之蛋白質融合之抗體Fab的活體外KLK6裂解的結果。圖2(B)展示西方墨點法。圖3(A)-圖3(C)展示在KLK6消化之前和之後，與含KLK6受質(KLK6s)之蛋白質融合之抗體Fab的抗原識別能力。圖3(A)展示如用表面電漿共振(BIAcore)所量測的抗VEGF Fab (Lucentics®)對照組之結合。圖3(B)展示前抗體不能結合抗原。圖3(C)展示在KLK6消化之後，前抗體被活化而展現與抗原結合。圖4展示與含KLK6受質(KLK6s)之肽融合之抗體的活體外KLK6裂解結果。圖5(A)-圖5(E)展示在KLK6消化之前和之後，與含 KLK6受質(KLK6s)之肽融合之抗體的抗原識別能力結果。圖5(A)展示阿瓦斯汀(Avastin)對照組之結合。圖5(B)展示，未進行KLK6消化之FR1肽-與KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素表現出對其抗原VEGF之結合親和力降低(在KLK6消化0小時之時)。隨著KLK6消化時間增加，FR1肽-與KLK6s融合之阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素對VEGF的結合逐漸地活化(在圖5(C)、5(D)及5(E)中分別為6、24及48小時)。圖6(A)及圖6(B)展示如由CBR染色所展現的活體外KLK6裂解具有不同肽阻斷劑及KLK6受質之阿瓦斯汀前藥之結果，而圖6(C)展示具有不同肽阻斷劑及KLK6受質之阿瓦斯汀前藥在KLK6消化之前和之後的抗原識別能力結果。圖7(A)展示活體外KLK6裂解PD-1 mAb Opdivo前藥之結果，而圖7(B)展示抗PD-1 mAb Opdivo前藥在KLK6消化之前和之後的抗原識別能力。圖8展示與含 KLK6受質(KLK6s)之肽融合之抗體在小鼠中的活體內抗體活化結果。

Claims

一種能夠在中樞神經系統(CNS)中受到蛋白酶KLK6選擇性地活化之抗體前藥，該抗體前藥包含：用於治療該CNS中之疾病或病症的抗體或其結合片段；與該抗體之重鏈及/或輕鏈之N端融合的KLK6可裂解肽；及與該KLK6可裂解肽之N端融合的阻斷劑。
如請求項1之抗體前藥，其中該阻斷劑包含蛋白質、蛋白質結構域或肽。
如請求項1或2之抗體前藥，其中該KLK6可裂解肽源自於天然KLK6受質、肽噬菌體庫、合成肽庫或可被KLK6裂解之肽序列。
如請求項1至3中任一項之抗體前藥，其中該抗體為單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或抗體藥物結合物(ADC)。
如請求項4之抗體前藥，其中該抗體藥物結合物為免疫細胞介素、免疫激素或免疫毒素。
如請求項1至5中任一項之抗體前藥，其中該抗體可用於其他抗體相關應用中。
如請求項6之抗體前藥，其中該抗體相關應用為用於嵌合抗原受體(CAR)-T細胞。
如請求項1至7中任一項之抗體前藥，其中該疾病或病症為癌症、發炎性疾病、自體免疫疾病、傳染性疾病或神經元退化疾病。
如請求項1至8中任一項之抗體前藥，其中該抗體為鼠類抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
如請求項1至9中任一項之抗體前藥，其中該抗體為抗VEGF抗體或抗PD-1抗體。
一種用於治療CNS中之疾病或病症的方法，其包含：向有需要之個體投與有效量的如請求項1至9中任一項之抗體前藥。