CN110636856A - Klk6-介导的cns-特异性抗体前药激活 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种能够在中枢神经系统(CNS)中由蛋白酶KLK6选择性激活的抗体前药，其包括用于治疗该CNS中的疾病或紊乱的抗体；与该抗体的重链和/或轻链的N末端融合的KLK6可裂解肽；及与该KLK6可裂解肽的N末端融合的阻断剂。所述疾病或紊乱为癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、传染病或神经元退化疾病。

Description

KLK6-介导的CNS-特异性抗体前药激活
发明背景
技术领域
本发明涉及用于治疗各种CNS相关疾病的基于抗体的分子。
背景技术
治疗常常与副作用有关。为使副作用最小化，需要改善治疗剂的特异性，如仅攻击疾病因子(disease agent)或细胞/组织。然而，具有这种选择性并不总是可行的。举例而言，抗体以高亲和力对其目标抗原具有高度特异性，且已经批准用于一些疾病的治疗或诊断。然而，目标抗原表现不一定具有疾病特异性。因此，除了靶向疾病病灶以外，大部分治疗性抗体也可能靶向正常组织，从而引起副作用。
另一种降低副作用的方法为以前药形式递送治疗剂，其仅在靶位点被激活。许多前药可有效降低非期望副作用。然而，大部分前药为小分子。
中枢神经系统(CNS)对治疗剂的特异性靶向提出了独特的挑战。因此，仍需要更好的方法来治疗CNS疾病或紊乱。
发明内容
本发明的实施方案涉及含有KLK6底物的重组蛋白质或肽与抗体的N末端融合以产生抗原识别功能降低的前药抗体(前抗体)。这些前抗体可在具有高浓度KLK6蛋白酶的组织中(诸如在CNS中)被激活。
本发明的发明人发现，由于KLK6在血清中的浓度较低，前抗体中的KLK6底物序列不会被血清中的KLK6裂解。相反，前抗体被CNS中的KLK6裂解，是由于KLK6在CNS中的浓度较高。因此，可在外周血液中抑制抗体的功能以防止副作用并且最小化外周组织中抗体的浪费。这些前抗体进入CNS后，它们可被激活以靶向CNS相关疾病或紊乱。
一方面，本发明的实施方案是关于能够在中枢神经系统(CNS)中受到蛋白酶KLK6选择性激活的抗体前药。根据本发明的一个实施方案的抗体前药包括用于治疗CNS中的疾病或紊乱的抗体或其结合片段；与该抗体的重链和/或轻链的N末端融合的KLK6可裂解肽；以及与该KLK6可裂解肽的N末端融合的阻断剂。
根据本发明的实施方案，所述中枢神经系统(CNS)中的疾病或紊乱可为癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、传染病或神经元退化疾病。
根据本发明的实施方案，所述阻断剂包括蛋白质、蛋白质结构域或肽。根据本发明的实施方案，所述KLK6可裂解肽衍生自天然KLK6底物、肽噬菌体库、合成肽库或可被KLK6裂解的任何肽序列。
根据本发明的实施方案，所述抗体为单克隆抗体或其结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体药物偶联物(ADC)、免疫细胞因子、免疫激素或免疫毒素。抗体可为鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。根据本发明的实施方案，所述抗体可为任何适合的抗体，诸如抗VEGF抗体或抗PD-1抗体。
在本发明的另一方面，本发明的实施方案是关于用于治疗CNS中的疾病或紊乱的方法。根据本发明的一个实施方案的方法包括：向有需要的对象施予有效量的本发明的抗体前药(即前抗体)。
有效量为可达成所要治疗效果的量。本领域技术人员应了解，有效量将视疾病病状、用药途径、患者条件(例如，年龄、体重、性别等)而定，且本领域技术人员应能够在无需过度实验的情况下确定有效量。举例而言，根据本发明的实施方案，按患者的重量计，有效量可在0.1μg/Kg至10mg/Kg、较佳地从1μg/Kg至1mg/Kg，更佳地从1μg/Kg至0.1mg/Kg的范围内。
从以下描述和所附的权利要求书中，本发明的其他方面和优点将显而易见。
附图说明
图1显示了说明KLK6-介导的CNS-特异性抗体前药作用的策略的图。
图2(A)显示通过对蛋白质条带进行考马斯染色(Coomassie staining)而得到的与含KLK6底物(KLK6s)的蛋白质融合的抗体Fab的体外KLK6裂解的结果。图2(B)显示Western印迹法。
图3(A)-图3(C)显示在KLK6消化之前和之后，与含KLK6底物(KLK6s)的蛋白质融合的抗体Fab的抗原识别能力。图3(A)显示了用表面等离子共振(BIAcore)测量的抗VEGF Fab对照的结合。图3(B)显示前抗体不能结合抗原。图3(C)显示在KLK6消化之后，前抗体被激活而展现与抗原结合。
图4显示与含KLK6底物(KLK6s)的肽融合的抗体的体外KLK6裂解结果。
图5(A)-图5(E)显示在KLK6消化之前和之后，与含KLK6底物(KLK6s)的肽融合的抗体的抗原识别能力结果。图5(A)显示阿瓦斯汀(Avastin)对照组的结合。图5(B)显示，未进行KLK6消化的FR1肽-与KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素表现出对其抗原VEGF的结合亲和力降低(KLK6消化0小时)。随着KLK6消化时间增加，FR1肽-与KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素对VEGF的结合逐渐地被激活(在图5(C)、5(D)及5(E)中分别为6、24和48小时)。
图6(A)及图6(B)显示通过CBR染色展现的体外KLK6裂解结果，和图6(C)显示具有不同肽阻断剂及KLK6底物的阿瓦斯汀前药在KLK6消化之前和之后的抗原识别能力结果。
图7(A)显示体外KLK6裂解结果，图7(B)显示抗PD-1 mAb Opdivo前药在KLK6消化之前和之后的抗原识别能力。
图8显示了小鼠中含与KLK6底物(KLK6s)的肽融合的抗体的体内抗体激活结果。
定义
如本文所用，术语“抗体”是指单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或抗体药物偶联物(ADC)。“抗体药物偶联物”可为免疫细胞因子、免疫激素或免疫毒素。术语“免疫细胞因子”是指重组抗体-细胞因子融合蛋白。术语“免疫激素”是指重组抗体-激素融合蛋白。免疫激素的一个实例为抗体-瘦素融合蛋白。术语“免疫毒素”是指重组抗体-毒素结合物。抗体的结合片段可为scFv、Fab或F(ab')2。
术语“与蛋白质的N末端融合”是指在该蛋白质的N末端形成融合蛋白。术语“阻断剂”是指用于降低或阻断抗体活性(即将该抗体转化为前药)的肽或蛋白质。另外，阻断剂可用于促进向CNS系统的输送，参见例如，Yu,Y.J.等人,“通过降低其对转胞吞靶标的亲和力来促进脑摄取治疗性抗体”(Boosting brain uptake of a therapeutic antibody byreducing its affinity for a transcytosis target),Sci.Trans.Med.3,84ra44(2011)。
术语“KLK6可裂解肽”是指可被胰蛋白酶样蛋白酶KLK6裂解的肽。各种KLK6可裂解肽序列为本领域所知晓，或本领域技术人员可在无需过度实验的情况下容易地确定特定序列是否可被KLK6裂解。
具体实施方式
本发明的实施方案涉及用于治疗中枢神经系统(CNS)中的疾病或紊乱的治疗性抗体。这些抗体为前药(前抗体)形式，包括连接于抗体可变区N末端的肽片段(阻断肽或阻断剂)以阻断该抗体与目标抗原的结合。阻断肽与某些酶原(proenzyme)的前肽类似。通过选择性蛋白酶使阻断肽裂解将释放活性抗体。
本发明的实施方案依赖于激肽释放酶-6(kallikrein-6，KLK-6)来特异性激活前抗体。具体地，本发明的实施方案使用含KLK6底物的重组蛋白质或肽与抗体的N末端融合。所述含KLK6底物的重组蛋白质或肽如前肽一样阻断或降低抗体的抗原识别功能。
由于KLK6在外周血液血清中的浓度较低，KLK6底物不会被血液循环中的KLK6裂解到任何明显程度。然而，含KLK6底物的重组蛋白质或肽可被CNS中所见浓度的KLK6有效裂解。因此，可在外周血液中使抗体的功能被阻断或降至最低以预防副作用并且减少抗体的不必要浪费。一旦这些前抗体进入CNS后，它们可被激活以靶向CNS相关疾病。
人类激肽释放酶(KLK)家族包括在各种组织中表现的15种分泌型丝氨酸蛋白酶。其中，发现KLK6在CNS中高表达，且在乳癌及卵巢癌组织中过表达。KLK6，也被称为酶(zyme)，蛋白酶M，和神经蛋白(neurosin)，是一胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。KLK6在CNS中的寡树突神经胶质细胞中持续表达，且在脊髓损伤(SCI)之后及在活动性多发性硬化症(MS)病灶中其表达会增强。已显示有许多蛋白质会被KLK6裂解，包括人类髓鞘碱性蛋白(MBP)、β淀粉样蛋白肽(Aβ)、纤维蛋白溶酶原、髓鞘质及α-突触核蛋白等。
各种人类体液中的KLK6水平已被测定，且发现相比于血液循环，KLK6在脑脊髓液(CSF)中显著富集。这种差异表达水平为前药在CNS中激活提供了机会。
根据本发明的实施方案，为减少不合需要的副作用，已研发出在外周血液中功能降低的抗体前药。这些抗体前药可被中枢神经系统中的KLK6激活。本发明可适用于各种CNS相关疾病，例如癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、传染病或神经元退化疾病。
图1说明了KLK6-介导的CNS-特异性抗体前药作用的策略。根据本发明的实施方案，抗体的轻链和/或重链的N末端可与阻断剂(阻断肽)融合以将该抗体转化为前药(即前抗体)。阻断剂降低抗体的抗原识别。阻断剂含有可被KLK6裂解的肽序列。该肽序列作为KLK6底物(KLK6s)发挥作用。
根据本发明的一些实施方案，仅轻链N末端含有阻断剂。根据本发明的其他实施方案，仅重链N末端含有阻断剂。因为抗原-抗体结合涉及重链及轻链两者的可变区，所以阻断重链或轻链N末端任一足以破坏抗原-抗体结合。
根据本发明的一些实施方案，轻链N末端和重链N末端两者各自含有阻断剂。重链和轻链可变区的双重阻断可产生更好的抗原-抗体相互作用的阻断。
根据本发明的实施方案，阻断剂包括含KLK6底物的蛋白质、蛋白质结构域或肽，以使得活性抗体将会仅在KLK6高于某一浓度的环境中被释放。KLK6为胰蛋白酶样蛋白酶，其偏好在精氨酸残基的羧基侧裂解。Li等人发现，KLK6更喜欢具有由Arg占据的P1位置的肽底物，并且在P1'中强烈偏好Ser。(“蛋白质科学”Protein Sci.,17(4):664-672(2008))。Magklalra等人(“生物化学生物物理研究通讯”Biochem.Biophys.Res.Commun.,307(4):948-55(2003))也发现，相较于Lys，在Arg之后的KLK6以更高的效率裂解，并且在P2位置优选选择Ser或Pro。基于这样的信息，可设计出会被KLK6高效地裂解的肽序列。本领域技术人员应了解，许多肽序列将满足这些标准，因此本发明的实施方案不限于在本说明书中所用的任何特定实例。这些肽在本说明书中一般将称作KLK6底物(或KLK6s)。
本发明的实施方案是基于以下观察，即KLK6在CNS中比在外周血液中有高得多的浓度。KLK6在外周血液中的浓度在0至12.6μg/L范围内，而KLK6在CNS中的浓度在41至2053μg/L范围内。由于KLK6在外周血液和CNS中的浓度之间存在这样显著的差异，本发明的阻断剂融合抗体(前抗体)可在外周血液中维持其低活性以预防任何副作用，而可被CNS中的KLK6激活以得到其治疗作用。
以下描述使用具体实例来说明本发明的实施方案。本领域技术人员应了解，这些实施例仅用于说明，而不意欲限制本发明的范围，因为可在不偏离本发明范围的情况下进行变化及修改。
在以下实施例中，借由构建含有所要序列的表达载体来制备各种融合蛋白质。可使用本领域所知晓任何合适载体。在以下实施例中，通过聚合酶链反应(PCR)构建含KLK6s的肽/蛋白质-融合抗体，克隆到pTCAE8载体(质体)的多克隆位点。用于这些蛋白质和载体的特定cDNA序列是本领域知晓且容易获得的。所用方法为已知的。各种载体及试剂可自商业来源获得。因此，本领域技术人员应能够获得这些试剂且在无需过度实验的情况下进行所描述的实验。
实施例1：自前抗体的阻断蛋白的特异性裂解
在此实施例中，使用与瘦素-KLK6s融合的阿瓦斯汀(Avastin)Fab作为前抗体以检测KLK6释放阿瓦斯汀Fab的能力。将融合蛋白质(前抗体)与分别为血清浓度、CSF浓度、1μM或2μM的KLK6一起孵育24小时。图2显示含KLK6底物(KLK6s)的蛋白质-融合抗体Fab的体外KLK6裂解结果。在此实施例中，KLK6s(KLK6底物序列)为具有YMTRSAMG(SEQ ID NO:1)序列的八肽，其含有有利KLK6裂解的位点-R-S-。
通过SDS-PAGE分离蛋白质且用考马斯亮蓝R-250(Coomassie Brilliant Blue R-250)(CBR)染色(图2A)，或通过Western印迹法来分析(图2B)。与对照组(泳道1、2和3)相比，KLK6在血清浓度下并未有效裂解阻断剂(泳道4)，而如由箭头所示的经裂解的蛋白质所证明的，KLK6在CSF浓度或更高浓度下显示高效裂解(泳道5、6和7)。
这些结果表明，根据本发明的实施方案的前抗体将在外周血液中存留下来，且一旦处于CNS中则可被高效激活。
实施例2：通过前抗体和再激活的抗体对抗原结合
在此实施例中，通过表面等离子共振(SPR)(BIAcore)测定抗VEGF Fab(兰尼单抗(ranibizumab))或与瘦素-KLK6s融合的阿瓦斯汀Fab的结合动力学。图3显示在KLK6消化之前和之后，含与KLK6底物(KLK6s)的蛋白质融合的抗体Fab的抗原识别能力。与对照组(图3A)相比，未经KLK6消化的与瘦素-KLK6s融合的阿瓦斯汀Fab对其抗原VEGF未显示出结合亲和力(图3B)。相反，与瘦素-KLK6s融合的阿瓦斯汀Fab在KLK6消化之后对VEGF显示出良好的结合亲和力(图3C)。
这些结果表明，阻断肽/蛋白质可有效防止前抗体与其抗原结合，且在阻断剂(前肽或前蛋白质)裂解之后，具活性的抗体得到释放且可特异性地与其目标结合。这些结果证实了本发明的方法。
实施例3：前肽的KLK6裂解的效率
在此实施例中，将与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-Leptin与CSF浓度的KLK6一起分别孵育6、24或48小时，其中该FR1肽为阿瓦斯汀的框架区1。蛋白质随后通过SDS-PAGE进行分离且用CBR染色。图4显示与含KLK6底物(KLK6s)的肽融合的抗体的体外KLK6裂解结果。与对照组(泳道1)相比，CSF浓度的KLK6在不同时间点显示如由箭头所示的经裂解蛋白质。在6小时时，裂解基本完成，表明裂解相当有效率。
实施例4：KLK6对阻断剂的时间依赖性裂解
在此实施例中，通过SPR(BIAcore)来测定抗VEGF抗体(阿瓦斯汀)或与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素的结合动力学。图5显示在KLK6消化之前和之后，与含KLK6底物(KLK6s)的肽融合的抗体的抗原识别能力的结果。与阿瓦斯汀对照组(图5A)相比，未经KLK6消化的与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素表现出对其抗原VEGF的结合亲和力降低(在图5B中的0小时)，而随着KLK6消化时间增加，与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素的VEGF结合再激活(在图5C、5D及5E中分别为6、24和48小时)。这些结果证实本发明的实施方案可被KLK6激活。
实施例5：具有不同肽阻断剂和KLK6底物的前抗体的KLK6-介导的阻断剂裂解
在此实施例中，将与含不同KLK6s的肽阻断剂融合的阿瓦斯汀与CSF浓度的KLK6一起孵育24小时。通过SDS-PAGE分析且用CBR染色，图6显示了含KLK6s的肽-融合的阿瓦斯汀的体外KLK6裂解结果(图6A及6B)。所有与含KLK6可裂解肽的阻断剂融合的阿瓦斯汀均可被KLK6裂解。在KLK6消化之前和之后，通过SPR(BIAcore)测定VEGF与阿瓦斯汀或阿瓦斯汀衍生物之间的相互作用(图6C)。
如与阿瓦斯汀对照组相比，未经KLK6消化的与含不同KLK6可裂解肽的阻断剂融合的阿瓦斯汀显示反应减少，而在KLK6消化的情况下，与含不同KLK6可裂解肽的阻断剂融合的阿瓦斯汀的VEGF结合被再激活。在具有不可裂解的接头序列(SSYISNYG；SEQ ID NO:13)的与肽阻断剂融合的阿瓦斯汀中，与肽阻断剂融合的阿瓦斯汀的VEGF结合能力显示在KLK6消化之前和之后反应单位减小。这些结果证实，具有不同阻断剂序列或KLK6底物序列的本发明的实施方案可被KLK6激活。在此实施例中，肽阻断剂序列及KLK6s序列列于表1中。如所示，肽阻断剂序列可包括某些氨基酸，其起到间隔子的作用以将KLK6底物序列与抗体序列分开。间隔子发挥确保KLK6可接近裂解序列的作用。处于裂解序列的N末端侧的肽阻断剂序列可为任何蛋白质或任何肽序列。
表1
实施例6：自前抗体的肽阻断剂的特异性裂解
在此实施例中，将融合至抗PD-1 mAbs(纳武单抗(Nivolumab)；)的N末端的含KLK6s的肽阻断剂与CSF浓度的KLK6一起孵育24小时。通过SDS-PAGE分析且用CBR染色，图7A显示了含KLK6s的肽-融合的的体外KLK6裂解结果。与含KLK6s的肽-融合的可被KLK6裂解。在KLK6消化之前和之后，通过SPR(BIAcore)来测定在PD-1与抗PD-1 mAb或衍生物之间的相互作用(图7B)。如与对照组相比，未经KLK6消化的与含KLK6s的肽阻断剂融合的显示反应减少，而在KLK6消化的情况下，与含KLK6s的肽阻断剂融合的被再激活以与PD-1结合。这些结果证实，应用于不同抗体中的本发明的实施方案也可被KLK6激活。在此实施例中，肽阻断剂序列及KLK6s序列列于表2中。
表2
实施例7：前抗体激活的体内测试
在此实施例中，将与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素静脉注射至BALB/c小鼠中。分别在注射后0.08、2、4及8小时采集血清样本及大脑样本。通过ELISA测定活性抗体及总抗体浓度。
图8显示与含KLK6底物(KLK6s)的肽融合的抗体在小鼠的体内抗体激活结果。在血浆中，活性的与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素的百分比维持在减低水平，而大脑中的与FR1肽-KLK6s融合的阿瓦斯汀-KLK6s-瘦素显示活性抗体的百分比增加。这些结果表明，与阻断剂-KLK6s-融合的抗体在体内可在CNS中再激活。
本发明的一些实施例是关于用于治疗CNS疾病的方法。根据本发明的一个实施方案的方法包括向有需要的对象施予有效量的本发明的前抗体。所述前抗体包括与抗体的重链和/或轻链的N末端或其结合片段连接的阻断肽。抗体的结合片段可为Fab、scFv或F(ab')2等。
虽然已经关于有限数量的实施例描述了本发明，但是受益于本公开的本领域技术人员将理解，可以设计出不脱离本文所公开的本发明的范围的其他实施例。例如，可以使用其他抗体代替这些实施例中所示的抗体。类似地，阻断肽片段可包括通过KLK6底物序列与抗体连接的任何蛋白质或肽。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求限制。

Claims (11)

1.一种能够在中枢神经系统(CNS)中由蛋白酶KLK6选择性激活的抗体前药，所述抗体前药包括：
用于治疗该CNS中的疾病或紊乱的抗体或其结合片段；
与所述抗体的重链和/或轻链的N末端融合的KLK6可裂解肽；和
与所述KLK6可裂解肽的N末端融合的阻断剂。
2.如权利要求1所述的抗体前药，其特征在于，所述阻断剂包括蛋白质、蛋白质结构域或肽。
3.如权利要求1或2所述的抗体前药，其特征在于，所述KLK6可裂解肽衍生自天然KLK6底物、肽噬菌体库、合成肽库或能被KLK6裂解的肽序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体前药，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或抗体药物偶联物(ADC)。
5.如权利要求4所述的抗体前药，其特征在于，所述抗体药物偶联物为免疫细胞因子、免疫激素或免疫毒素。
6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体前药，其特征在于，所述抗体可用于其他抗体相关应用中。
7.如权利要求6所述的抗体前药，其特征在于，所述抗体相关应用是用于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的抗体前药，其特征在于，所述疾病或紊乱为癌症、炎症性疾病、自身免疫性疾病、传染病或神经元退化疾病。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体前药，其特征在于，所述抗体为鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的抗体前药，其特征在于，所述抗体为抗VEGF抗体或抗PD-1抗体。
11.一种治疗CNS中的疾病或紊乱的方法，包括：向有需要的对象施予有效剂量的如权利要求1至9中任一项所述的抗体前药。
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