JP2020078305A - 異種ポリペプチドを分泌させるための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年3月14日出願の米国特許出願第61/953,629号、及び2015年1月26日出願の米国特許出願第62/107,981号、及び2015年1月27日出願の米国特許出願第62/108,476号の優先権を主張し、これらの内容はその全体が参照として本明細書中に援用される。
本出願は、配列表を含み、この配列表はASCII形式でオンライン提出されており、その全体が本明細書により参照として援用される。本ASCIIコピーは、2015年3月12日に、P5804R1−WO_SL.txtというファイル名で作成されており、ファイルサイズは21,971バイトである。
本発明は、概して、分子生物学及びタンパク質工学の分野に関する。より詳細には、本発明は、細菌から異種ポリペプチドを分泌させるためのシグナルペプチドに関する。本発明はまた、原核生物により産生された組換えポリペプチド及びその使用にも関する。
本明細書中記載または参照される技法及び手順は、概して、当業者に十分に理解されており従来の方法論を用いて一般的に使用されるものであり、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M. Ausubel, et al. eds.,(2003));the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press, Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J. MacPherson,B.D. Hames and G.R. Taylor eds.(1995))、Harlow and Lane,eds.(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I. Freshney,ed.(1987))に記載されている広く利用される方法論である。
「ベクター」という用語は、本明細書中使用される場合、自身に連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を示すものとする。ベクターの種類の1つは「プラスミド」であり、プラスミドは、追加のDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループを示す。ベクターの別の種類は、ファージベクターである。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、この場合追加のDNAセグメントは、ウイルスゲノムに連結することができる。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律増殖することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入に際して、宿主細胞のゲノムに組み込み、それにより宿主ゲノムの複製とともに複製させることができる。さらに、ある特定のベクターは、そのベクターが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書中、「組換え発現ベクター」(または単に「組換えベクター」)と称する。一般に、組換えDNA技法で利用される発現ベクターは、プラスミドの形をしていることが多い。プラスミドが最も一般的に使用される形のベクターであることから、本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、同義で用いてもよいものとする。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia and Lesk,J. Mol. Biol. 196:901−917(1987));
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、及び95〜102(H3)で生じるCDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991));
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、及び93〜101(H3)で生じる抗原接触部(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732−745(1996));及び
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、及び94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、及び/または(c)の組み合わせ。
他に特に記載がない限り、可変ドメイン中のHVR残基及び他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書中、Kabat et al.,(上記)に従って番号付けされる。
本明細書中提供するのは、例えば、異種ポリペプチド(例えば、抗体、例えば、全長抗体)の製造方法に適した、シグナルペプチド、及び変異型シグナルペプチドを用いた方法である。シグナルペプチドを特性決定する方法は、当該分野で既知である。1つの図式において、シグナルペプチドは、一般的に3つの異なる領域から構成される:1つまたは2つの正電荷を帯びたアミノ酸残基を含有するN末端領域、H領域と称する(Hドメインとも呼ぶ)ことの多い疎水性コア領域、及びシグナルペプチダーゼにより認識されるC末端領域である。いくつかの実施形態において、H領域は、長さが約10〜16残基である。シグナルペプチドの疎水性は、アイゼンベルグ尺度を用いて計算してもよい。Eisenberg,D. et al,J Mol Biol(1984)179:125−142を参照。簡単に述べると、各アミノ酸に、正規化された統一疎水性値を割り当てる(Eisenberg, et al.上記、表I(126頁)を参照)。シグナルペプチドの各アミノ酸の統一疎水性値(または、例えば、H領域の総合疎水性値を計算するために、H領域の各アミノ酸の統一疎水性値)を合計することで、合計疎水性(総合疎水性とも呼ぶ)を計算する。平均疎水性は、以下の式を用いて計算する:平均疎水性=総合(合計)疎水性/アミノ酸の数。いくつかの実施形態において、全シグナルペプチドの平均疎水性が計算される。いくつかの実施形態において、H領域(Hドメインとも呼ぶ)の平均疎水性が計算される。
異種ポリペプチドの例として、膜貫通分子(例えば、受容体チロシンキナーゼなどの受容体)または増殖因子などのリガンドが挙げられる。異種ポリペプチドの例として、分子、例えばレニンなど;ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンをはじめとする成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ−1−アンチトリプシン;インシュリンA鎖;インシュリンB鎖;プロインシュリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体ホルモン;グルカゴン;凝固因子、例えば、第VIIIC因子、第IX因子、組織因子(TF)、及びフォン・ヴィルブランド因子など;抗凝固因子、例えばタンパク質Cなど;心房性ナトリウム利尿因子;肺界面活性物質;プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)など;ボンベシン;トロンビン;造血性成長因子;腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ;エンケファリナーゼ;RANTES(正常T細胞の活性化で制御され、発現し、分泌される物質);ヒトマクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−アルファ);血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど;ミュラー管抑制物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼなど;DNA分解酵素;IgE;細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA)、例えばCTLA−4など;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子(VEGF);ホルモンまたは増殖因子の受容体;タンパク質AまたはD;リウマチ因子;神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子(BDNF)など、ニューロトロフィン−3、−4、−5、または−6(NT−3、NT−4、NT−5、またはNT−6)、または神経成長因子、例えばNGF−βなど;血小板由来成長因子(PDGF);線維芽細胞増殖因子、例えばaFGF及びbFGFなど;上皮増殖因子(EGF);トランスフォーミング増殖因子(TGF)、例えばTGF−アルファ、及びTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、またはTGF−β5をはじめとするTGF−ベータなど;インシュリン様増殖因子−I及び−II(IGF−I及びIGF−II);des(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インシュリン様増殖因子結合タンパク質;CDタンパク質、例えばCD3、CD4、CD8、CD19、CD20、及びCD40など;エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマなど;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、M−CSF、GM−CSF、及びG−CSFなど;インターロイキン(IL)、例えば、IL−1〜IL−10など;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊加速因子;ウイルス抗原、例えば、AIDS外被の一部分など;輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン、例えばCD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4、及びVCAM;腫瘍関連抗原、例えば、HER2、HER3、またはHER4受容体など;及び上記のポリペプチドのいずれかの断片が挙げられる。
抗体またはヘテロ多量体ポリペプチドまたはポリペプチドまたはイムノアドヘシンの標的の例として、以下の一覧が挙げられるが、それらに限定されない:BMPI、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、CSFI(M−CSF)、CSF2(GM−CSF)、CSF3(G−CSF)、EPO、FGFI(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int−2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST−2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNAI、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNBI、IFNG、IFNWI、FELI、FELI(EPSELON)、FELI(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF−b)、LTB、TNF(TNF−a)、TNFSF4(OX40リガンド)、TNFSF5(CD40リガンド)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27リガンド)、TNFSF8(CD30リガンド)、TNFSF9(4−1BBリガンド)、TNFSFIO(TRAIL)、TNFSF1I(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM−L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILIR1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILIORA、ILIORB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIFI、HGF、LEP(レプチン)、PTN、THPO、CCLI(I−309)、CCL2(MCP−1/MCAF)、CCL3(MIP−la)、CCL4(MIP−lb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP−3)、CCL8(mcp−2)、CCLH(エオタキシン)、CCL13(MCP−4)、CCL15(MIP−ld)、CCL16(HCC−4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP−3b)、CCL20(MIP−3a)、CCL21(SLC/エクソダス−2)、CCL22(MDC/STC−I)、CCL23(MPIF−I)、CCL24(MPIF−2/エオタキシン−2)、CCL25(TECK)、CCL26(エオタキシン−3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA−78)、CXCL6(GCP−2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(I−TAC)、CXCL12(SDFI)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(リンホタクチン)、XCL2(SCM−lb)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKRI/HM145)、CCR2(mcp−IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR−L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TERI/CKR−LI)、CCR9(GPR−9−6)、CCRLI(VSHKI)、CCRL2(L−CCR)、XCRI(GPR5/CCXCRI)、CMKLRI、CMKORI(RDCI)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCRIO)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR−L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCPIO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCCIO(CIO)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDFIA、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREMI、TREM2、VHL、ABCFI;ACVRI;ACVRIB;ACVR2;ACVR2B;ACVRLI;AD0RA2A;アグリカン;AGR2;AICDA;AIFI;AIGI;AKAPI;AKAP2;AMH;AMHR2;ANGPTI;ANGPT2;ANGPTL3;ANGPTL4;ANPEP;APC;APOCI;AR;AZGPI(亜鉛−a−糖タンパク質);B7.1;B7.2;BAD;BAFF(BLys);BAGI;BAH;BCL2;BCL6;BDNF;BLNK;BLRI(MDR15);BMPI;BMP2;BMP3B(GDFIO);BMP4;BMP6;BMP8;BMPRIA;BMPRIB;BMPR2;BPAGI(プレクチン);BRCAI;C19orflO(IL27w);C3;C4A;C5;C5R1;CANTI;CASP1;CASP4;CAVI;CCBP2(D6/JAB61);CCLI(1−309);CCLII(エオタキシン);CCL13(MCP−4);CCL15(MlP−ld);CCL16(HCC−4);CCL17(TARC);CCL18(PARC);CCL19(MIP−3b);CCL2(MCP−1);MCAF;CCL20(MIP−3a);CCL21(MTP−2);SLC;エクソダス−2;CCL22(MDC/STC−I);CCL23(MPIF−1);CCL24(MPIF−2/エオタキシン−2);CCL25(TECK);CCL26(エオタキシン−3);CCL27(CTACK/ILC);CCL28;CCL3(MTP−la);CCL4(MDP−lb);CCL5(RANTES);CCL7(MCP−3);CCL8(mcp−2);CCNAI;CCNA2;CCNDI;CCNEI;CCNE2;CCRI(CKRI/HM145);CCR2(mcp−IRB/RA);CCR3(CKR3/CMKBR3);CCR4;CCR5(CMKBR5/ChemR13);CCR6(CMKBR6/CKR−L3/STRL22/DRY6);CCR7(CKR7/EBII);CCR8(CMKBR8/TERI/CKR−LI);CCR9(GPR−9−6);CCRLI(VSHKI);CCRL2(L−CCR);CD164;CD19;CDIC;CD20;CD200;CD22;CD24;CD28;CD3;CD37;CD38;CD3E;CD3G;CD3Z;CD4;CD40;CD40L;CD44;CD45RB;CD52;CD69;CD72;CD74;CD79A;CD79B;CD8;CD80;CD81;CD83;CD86;CDHI(E−カドヘリン);CDH10;CDH12;CDH13;CDH18;CDH19;CDH20;CDH5;CDH7;CDH8;CDH9;CDK2;CDK3;CDK4;CDK5;CDK6;CDK7;CDK9;CDKNIA(p21Wapl/Cipl);CDKNIB(p27Kipl);CDKNIC;CDKN2A(P16INK4a);CDKN2B;CDKN2C;CDKN3;CEBPB;CERI;CHGA;CHGB;キチナーゼ;CHST10;CKLFSF2;CKLFSF3;CKLFSF4;CKLFSF5;CKLFSF6;CKLFSF7;CKLFSF8;CLDN3;CLDN7(クローディン−7);CLN3;CLU(クラスタリン);CMKLRI;CMKORI(RDCI);CNRI;COL18A1;COLIAI;COL4A3;COL6A1;CR2;CRP;CSFI(M−CSF);CSF2(GM−CSF);CSF3(GCSF);CTLA4;CTNNBI(b−カテニン);CTSB(カテプシンB);CX3CL1(SCYDI);CX3CR1(V28);CXCLI(GROI);CXCL10(IP−10);CXCLII(l−TAC/IP−9);CXCL12(SDFI);CXCL13;CXCL14;CXCL16;CXCL2、(GR02);CXCL3(GR03);CXCL5(ENA−78/LIX);CXCL6(GCP−2);CXCL9(MIG);CXCR3(GPR9/CKR−L2);CXCR4;CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo);CYB5;CYCI;CYSLTRI;DAB2IP;DES;DKFZp451 J01 18;DNCLI;DPP4;E2F1;ECGFI;EDGI;EFNAI;EFNA3;EFNB2;EGF;EGFR;ELAC2;ENG;EN01;EN02;EN03;EPHB4;EPO;ERBB2(Her−2);EREG;ERK8;ESRI;ESR2;F3(TF);FADD;FasL;FASN;FCERIA;FCER2;FCGR3A;FGF;FGFI(aFGF);FGF10;FGF11;FGF12;FGF12B;FGF13;FGF14;FGF16;FGF17;FGF18;FGF19;FGF2(bFGF);FGF20;FGF21;FGF22;FGF23;FGF3(int−2);FGF4(HST);FGF5;FGF6(HST−2);FGF7(KGF);FGF8;FGF9;FGFR3;FIGF(VEGFD);FELI(EPSILON);FILI(ZETA);FLJ12584;FLJ25530;FLRTI(フィブロネクチン);FLTI;FOS;FOSLI(FRA−I);FY(DARC);GABRP(GABAa);GAGEBI;GAGECI;GALNAC4S−6ST;GAT A3;GDF5;GFI1;GGT1;GM−CSF;GNASI;GNRHI;GPR2(CCRIO);GPR31;GPR44;GPR81(FKSG80);GRCCIO(CIO);GRP;GSN(ゲルゾリン);GSTPI;HAVCR2;HDAC4;HDAC5;HDAC7A;HDAC9;HGF;HIFIA;HDPI;ヒスタミン及びヒスタミン受容体;HLA−A;HLA−DRA;HM74;HMOXI;HUMCYT2A;ICEBERG;ICOSL;ID2;IFN−a;IFNAI;IFNA2;IFNA4;IFNA5;IFNA6;IFNA7;IFNB1;IFNガンマ;DFNWI;IGBPI;IGFI;IGFIR;IGF2;IGFBP2;IGFBP3;IGFBP6;IL−I;IL10;MORA;IL10RB;IL11;IL11RA;IL−12;IL12A;IL12B;IL12RB1;IL12RB2;IL13;IL13RA1;IL13RA2;IL14;IL15;IL15RA;IL16;IL17;IL17B;IL17C;IL17R;IL18;IL18BP;IL18R1;IL18RAP;IL19;IL1A;IL1B;ILIF10;IL1F5;IL1F6;IL1F7;IL1F8;IL1F9;IL1HYI;
IL1Rl;IL1R2;IL1RAP;IL1RAPL1;IL1RAPL2;IL1RL1;IL1RL2、ILIRN;IL2;IL20;IL20RA;IL21R;IL22;IL22R;IL22RA2;IL23;IL24;IL25;IL26;IL27;IL28A;IL28B;IL29;IL2RA;IL2RB;IL2RG;IL3;IL30;IL3RA;IL4;IL4R;IL5;IL5RA;IL6;IL6R;IL6ST(糖タンパク質130);EL7;EL7R;EL8;IL8RA;DL8RB;IL8RB;DL9;DL9R;DLK;INHA;INHBA;INSL3;INSL4;IRAKI;ERAK2;ITGAI;ITGA2;ITGA3;ITGA6(a6インテグリン);ITGAV;ITGB3;ITGB4(b4インテグリン);JAGI;JAKI;JAK3;JUN;K6HF;KAN;KDR;KITLG;KLF5(GC Box BP);KLF6;KLKIO;KLK12;KLK13;KLK14;KLK15;KLK3;KLK4;KLK5;KLK6;KLK9;KRT1;KRT19(ケラチン19);KRT2A;KHTHB6(毛髪特異的H型ケラチン);LAMAS;LEP(レプチン);Lingo−p75;Lingo−Troy;LPS;LTA(TNF−b);LTB;LTB4R(GPR16);LTB4R2;LTBR;MACMARCKS;MAGまたはOmgp;MAP2K7(c−Jun);MDK;MIBI;ミッドカイン;MEF;MIP−2;MKI67;(Ki−67);MMP2;MMP9;MS4A1;MSMB;MT3(メタロチオネクチン−lll);MTSSI;MUCI(ムチン);MYC;MYD88;NCK2;ニューロカン;NFKBI;NFKB2;NGFB(NGF);NGFR;NgR−Lingo;NgR−Nogo66(Nogo);NgR−p75;NgR−Troy;NMEI(NM23A);N0X5;NPPB;NROBI;NR0B2;NRIDI;NR1D2;NR1H2;NR1H3;NR1H4;NR1I2;NR1I3;NR2C1;NR2C2;NR2E1;NR2E3;NR2F1;NR2F2;NR2F6;NR3C1;NR3C2;NR4A1;NR4A2;NR4A3;NR5A1;NR5A2;NR6A1;NRPI;NRP2;NT5E;NTN4;ODZI;OPRDI;P2RX7;PAP;PARTI;PATE;PAWR;PCA3;PCNA;PDGFA;PDGFB;PECAMI;PF4(CXCL4);PGF;PGR;ホスファカン;PIAS2;PIK3CG;PLAU(uPA);PLG;PLXDCI;PPBP(CXCL7);PPID;PRI;PRKCQ;PRKDI;PRL;PROC;PROK2;PSAP;PSCA;PTAFR;PTEN;PTGS2(COX−2);PTN;RAC2(p21 Rac2);RARB;RGSI;RGS13;RGS3;RNFIIO(ZNF144);ROB02;S100A2;SCGB1D2(リポフィリンB);SCGB2A1(マンマグロビン2);SCGB2A2(マンマグロビン1);SCYEI(内皮単球活性化サイトカイン);SDF2;SERPINAI;SERPINA3;SERP1NB5(マスピン);SERPINEI(PAI−I);SERPDMF1;SHBG;SLA2;SLC2A2;SLC33A1;SLC43A1;SLIT2;SPPI;SPRRIB(Sprl);ST6GAL1;STABI;STAT6;STEAP;STEAP2;TB4R2;TBX21;TCPIO;TDGFI;TEK;TGFA;TGFBI;TGFBIII;TGFB2;TGFB3;TGFBI;TGFBRI;TGFBR2;TGFBR3;THIL;THBSI(トロンボスポンジン−1);THBS2;THBS4;THPO;TIE(Tie−1);TMP3;組織因子;TLRIO;TLR2;TLR3;TLR4;TLR5;TLR6;TLR7;TLR8;TLR9;TNF;TNF−a;TNFAEP2(B94);TNFAIP3;TNFRSFIIA;TNFRSFIA;TNFRSFIB;TNFRSF21;TNFRSF5;TNFRSF6(Fas);TNFRSF7;TNFRSF8;TNFRSF9;TNFSFIO(TRAIL);TNFSFI1(TRANCE);TNFSF12(AP03L);TNFSF13(April);TNFSF13B;TNFSF14(HVEM−L);TNFSF15(VEGI);TNFSF18;TNFSF4(OX40リガンド);TNFSF5(CD40リガンド);TNFSF6(FasL);TNFSF7(CD27リガンド);TNFSF8(CD30リガンド);TNFSF9(4−1BBリガンド);TOLLIP;Toll様受容体;TOP2A(トポイソメラーゼEa);TP53;TPMI;TPM2;TRADD;TRAFI;TRAF2;TRAF3;TRAF4;TRAF5;TRAF6;TREMI;TREM2;TRPC6;TSLP;TWEAK;VEGF;VEGFB;VEGFC;バーシカン;VHLC5;VLA−4;XCLI(リンホタクチン);XCL2(SCM−lb);XCRI(GPR5/CCXCRI);YYI;及びZFPM2。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片として、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv、及びscFv断片、一本腕抗体、ならびに以下に記載される他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、Hudson et al.Nat. Med. 9:129−134(2003)を参照。scFv断片の総説については、例えば、Pluckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer−Verlag、New York),pp.269−315(1994)を参照;同じく、WO93/16185;ならびに米国特許第5,571,894号及び同第5,587,458号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みin vivo半減期の長くなったFab及びF(ab’)2断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号;及びMorrison et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6851−6855(1984))に記載されている。1つの例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)及びヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものと異なるクラスまたはサブクラスに変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、キメラ抗体の抗原結合断片も含まれる。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で既知の様々な技法を用いて製造することができる。ヒト抗体については、van Dijk and van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5:368−74(2001)及びLonberg,Curr. Opin. Immunol. 20:450−459(2008)に総合的な記載がある。
本発明の抗体は、所望の1種の活性または複数の活性を持つ抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を保有する抗体についてそのライブラリーをスクリーニングする様々な方法が、当該分野で既知である。そうした方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1−37(O’Brien et al., ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)に総説が記載されており、さらに、例えば、McCafferty et al.,Nature 348:552−554;Clackson et al.,Nature 352:624−628(1991);Marks et al.,J. Mol. Biol. 222:581−597(1992);Marks and Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161−175(Lo, ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003);Sidhu et al.,J. Mol. Biol. 338(2):299−310(2004);Lee et al.,J. Mol. Biol. 340(5):1073−1093(2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467−12472(2004);及びLee et al.,J. Immunol. Methods 284(1−2):119−132(2004)に記載されている。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体とは、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性の1つは、c−metに対するものであり、その他は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、c−metの2つの異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体はまた、c−metを発現する細胞に細胞障害性剤を局在させるのにも使用することができる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製することができる。
ある特定の実施形態において、本明細書中提供される抗体のアミノ酸配列変異体も企図されている。例えば、抗体の結合親和性及び/または他の生物学的性質を改善することが望ましいかもしれない。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により、製造されてもよい。そのような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列から残基を削除、及び/または抗体のアミノ酸配列に残基を挿入、及び/または抗体のアミノ酸配列内で残基を置換することが挙げられる。削除、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物に到達することができるが、ただし、最終構築物は、所望の特性、例えば、抗原結合性を保持するものである。
多重特異性抗体及び/または一本腕抗体及び/またはイムノアドヘシンを製造する方法としてノブと穴を利用することは、当該分野で既知である。米国特許第5,731,168号(1998年3月4日付与、Genentechに対して譲渡)、PCT公開公報第WO2009089004号(2009年7月16日公開、Amgenに対して譲渡)、及び米国特許出願公開第20090182127号(2009年7月16日公開、Novo Nordisk A/Sに対して譲渡)を参照。Marvin and Zhu,Acta Pharmacologica Sincia(2005)26(6):649−658及びKontermann(2005)Acta Pharacol. Sin., 26:1−9も参照。簡単な説明を、本明細書に提示する。
aアミノ酸分子量から水分子量を引いたもの。Handbook of Chemistry and Physics,43rd ed. Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961より値を引用。
bA.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107−123,1972より値を引用。
cC. Chothia,J. Mol. Biol. 105:1−14,1975より値を引用。到達可能表面積は、この引用文献の図6〜20で定義される。
異種ポリペプチド(例えば、抗体)の組換え産生のため、異種ポリペプチドをコードする核酸を単離して、さらなるクローン化(DNAの増幅)用または発現用に反復可能ベクターに挿入する。ポリペプチド(例えば、抗体)をコードするDNAは、従来手順を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)、容易に単離及び配列決定される。多くのベクターを利用することができる。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に一部依存する。一般に、好適な宿主細胞は、原核生物起原いずれかのものである。IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgE定常領域をはじめとする任意のアイソタイプの定常領域を、この目的で使用することができ、そのような定常領域は、任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解されるだろう。
i.ベクター構築
本発明のポリペプチド(例えば、抗体)のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技法を用いて得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離して配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはPCR技法を用いて合成することができる。いったん得られたら、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入する。数多くのベクターが利用可能でありまた当該分野で既知であり、本発明の目的に使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入する予定の核酸のサイズ及びそのベクターで形質転換する予定の特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいは両方)及びそのベクターが滞在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含有する。ベクター成分として、一般に以下が挙げられるが、それらに限定されない:複製開始点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入物、及び転写終結配列。
宿主細胞を、上記の発現ベクターで形質転換して、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように修飾された通常の栄養培地で培養する。
当該分野で既知の標準的なタンパク質精製方法を採用することができる。以下の手順は、適切な精製手順の例である:免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカでのまたはDEAEなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、及び、例えば、Sephadex G−75を用いるゲル濾過。
異種ポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドが認識する特定のポリペプチドを精製、検出、及び標的とするのに使用することができ、そのような用途として、in vitro及びin vivo両方での診断方法及び治療方法が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、上記の障害の治療に有用な物質を含有する製品を提供する。製品は、容器、及び容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器として、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど様々な材料から形成されていてよい。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌の出し入れ口を有していてもよい(例えば、容器は、皮下注射針で穴をあけることができる栓を有する、静脈内注射液の袋またはバイアルであってもよい)。組成物の活性成分の少なくとも1種は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、特定の症状、例えば癌などの治療に使用されることを示す。そのうえ、製品は、(a)抗体を含む組成物が入った第一容器;及び(b)さらなる細胞障害性剤を含む組成物が入った第二容器を含んでもよい。本発明のこの実施形態の製品は、さらに、第一及び第二の抗体組成物が、癌治療に使用可能であることを示す添付文書を含んでもよい。あるいは、またはそれに加えて、製品は、薬学上許容される緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びブドウ糖液を含む第二(または第三)容器をさらに含んでもよい。製品は、商業及び使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよく、そのような材料として、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジが挙げられる。
株及びプラスミド。この試験で使用した株及びプラスミドを表1に列挙する。重鎖のみの発現ベクターを構築するため、全長抗体発現ベクターを、SpeI及びNsiI(New England Biolabs)で消化した。シグナルペプチド配列及び重鎖配列を含有して得られる断片を、pBR322由来クローニングベクターのSpeI及びNsiI部位にクローン導入した。pBR322由来クローニングベクターは、切断型軽鎖断片(122−237)、重鎖配列と融合したphoAプロモーター、及びラムダt0転写ターミネーターを含むものであった。ακLc抗体をプローブとして用いるウエスタンブロット分析により、この重鎖のみのベクターで軽鎖は発現しなかったことを確認した。翻訳強度測定用のPhoAレポータープラスミドを構築するため、目的のシグナルペプチド変異体を、通常PCRまたはスプライシングオーバーラップ伸長(SOE)PCR法を介してphoA遺伝子と融合させた。得られた断片を、pPhoA51のSpeI及びNotI(New England Biolabs)部位にクローン導入した[1]。シグナルペプチド配列の部位特異的変異を、QuickChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene)により導入した。
重鎖N末端のEdman配列決定。震盪フラスコ培養物から採取した終点試料を、OD550を1として正規化し、16,000×gで3分間遠心することにより採取した。ペレットを、0.2MのDTT含有トリシン緩衝液200μLに再懸濁させ、95℃で5分間加熱した。タンパク質を、8%または10%ビス−トリスSDS−PAGEゲル(Life Technologies)での電気泳動により分離させた。空のpBR322ベクターを抱える64B4由来のOD550が1または4の細胞溶解液もまた、対照として添加した。電気泳動後、タンパク質を、CAPS緩衝液での湿式トランスファー(Biorad)によりPVDF膜に移した。膜上の約49kDaの重鎖バンドを切り出し、Applied Biosystems Procise配列決定装置モデル494HTを用いて、Edman配列決定により分析した。成熟重鎖対前駆体の比を、ピーク強度に基づいて見積もった。半定量化のため、各アミノ酸のピコモル値を、配列分析プログラムSEQXを用いて、未補正のフェニルチオヒダントインアミノ酸標準に対して計算した(Henzel et al.,Journal of Chromatography,1987)。10回のサイクルの平均を用いて、平均反応収率プロットを作成し、直線回帰を計算して、主要及び少数配列の初収量を、プロットした直線のy接線と定義した。重鎖プロセシング効率を、分泌された重鎖のパーセンテージ(成熟重鎖の初収量/(前駆体の初収量+成熟重鎖の初収量))として計算した。
E.coliでの抗体(例えば全長抗体)産生は、抗体重鎖及び軽鎖が細胞質からペリプラズムへ分泌されることにより達成され得る[2]。分泌には、重鎖及び軽鎖のN末端に融合したE.coliシグナルペプチドが介在する。ペリプラズムの酸化環境及び酵素は、重鎖及び軽鎖が抗体へと構築されるのを促進する。異種タンパク質(例えば、抗体)の高レベル産生手段としてペリプラズム分泌を利用することは、頻繁に遭遇する問題が複数あるために、制限される可能性がある。第一に、目的のタンパク質(例えば、抗体)の分泌効率が低い可能性がある。第二に、多くの場合、前駆体が成熟タンパク質になるプロセシングが不十分である。第三に、過剰発現した異種タンパク質は、不適切に折り畳まれるか、凝集して不溶性封入体になるか、またはE.coliプロテアーゼによりタンパク質分解を受けることが多い。第四に、抗体は、2つの異なるポリペプチド、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)からなる複雑な多量体タンパク質であり、これらポリペプチドがペリプラズムに搬出されて、適切に折り畳まれて、適切なジスルフィド結合を形成しなければならない。このタンパク質の折り畳み及び分泌の複雑さが、E.coliでの抗体製造に困難さを加えている。
下線=アミノ酸配列中の変異
合計疎水性(sum hydro)は、Eisenbergらにより開発された正規化共通尺度[20]に基づいて計算。
平均疎水性=シグナル配列の合計疎水性をアミノ酸残基の個数で割ったもの
合計疎水性(H)=H領域の合計疎水性
平均疎水性(H)=H領域の平均疎水性
太字=BssHII、MluI、またはXbaI制限部位
下線=アミノ酸配列を変更するためになされた変異
*推定成熟/前駆体比は、ピーク強度の概算に基づく。
**分泌HC%は、材料及び方法の節で記載したとおり、成熟重鎖及び前駆体の初収量の半定量化により求める。
*分泌HC%は、材料及び方法の節で記載したとおり、成熟重鎖及び前駆体の初収量の半定量化により求める。
*分泌HC%は、材料及び方法の節で記載したとおり、成熟重鎖及び前駆体の初収量の半定量化により求める。
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Claims (81)
- E.coli宿主細胞からの抗体重鎖及び/または抗体軽鎖の分泌の増加方法であって、(1)抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第一シグナルペプチドをコードする第一ポリヌクレオチドであって、前記シグナルペプチドの平均疎水性は約0.5超である、前記第一ポリヌクレオチド;及び/または(2)抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結された第二シグナルペプチドをコードする第二ポリヌクレオチドであって、前記第二シグナルペプチドの平均疎水性は約0.5超である前記第二ポリヌクレオチド、を含むポリヌクレオチドを含み、そうすることにより、宿主細胞での抗体の発現に際して、前記重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成する、E.coli宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
- 前記第一シグナルペプチドの前記疎水性は、約0.6超である、請求項1に記載の方法。
- 前記第二シグナルペプチドの前記疎水性は、約0.6超である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第一及び/または第二シグナルペプチドは、変異型共翻訳シグナルペプチドである、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一及び/または第二シグナルペプチドは、変異型DsbAシグナルペプチドである、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異型DsbAシグナルペプチドは、残基L11に変異を有し、前記変異型DsbAシグナルペプチドは、配列番号3の野生型DsbAシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記変異は、L11IまたはS18Yである、請求項6に記載の方法。
- 前記変異型DsbAシグナルペプチドは、配列番号13または15の配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドは、Sfmcシグナルペプチドである、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一及び/または第二シグナルペプチドのTIR強度は、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、または約8である、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一シグナルペプチドの前記TIR強度は、約5であり、かつ前記第二シグナル配列の前記TIR強度は、約8である、請求項10に記載の方法。
- 前記宿主細胞中の前記ポリヌクレオチドは、さらに、プロモーターを含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターは、phoA、tac、lpp、lac−lpp、lac、ara、及びT7プロモーターからなる群より選択される原核生物プロモーターである、請求項12に記載の方法。
- 前記E.coli宿主細胞は、内因性プロテアーゼ活性が欠損した株のものである、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記E.coliの遺伝子型は、degP遺伝子及びprc遺伝子を欠いており、かつ突然変異spr遺伝子を抱えている、請求項14に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、さらに、DsbA、DsbC、DsbG、及びFkpAからなる群より選択される少なくとも1種の原核生物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは、DsbA及びDsbCの両方をコードする、請求項16に記載の方法。
- 宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体は、宿主細胞培養培地から回収される、請求項18に記載の方法。
- 前記回収した抗体を、薬学上許容される担体、賦形剤、または担体と組み合わせて、前記抗体を含む医薬製剤を調剤することを含む、請求項18または19に記載の方法。
- 形成される免疫グロブリンポリペプチド複合体のうち少なくとも50%は、前記抗体である、請求項19に記載の方法。
- 形成される免疫グロブリンポリペプチド複合体のうち少なくとも70%は、前記抗体である、請求項19に記載の方法。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項1から22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項23に記載の方法。
- 前記抗体は、二重特異性抗体である、請求項23に記載の方法。
- 平均疎水性が0.5超であるH領域を含む、変異型DsbAシグナルペプチド。
- 配列番号3のDsbAシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する、残基S11に変異を含む変異型DsbAシグナルペプチド。
- 前記変異は、L11I及び/またはS18Yである、請求項27に記載の変異型DsbAシグナルペプチド。
- 配列番号1のSTIIシグナルペプチドよりも高い平均疎水性を有する、残基S11に変異を含む変異型STIIシグナルペプチド。
- 前記変異は、S11A、S11I、またはS11Lである、請求項29に記載の変異型STIIシグナルペプチド。
- 配列番号8、11、13、15、31、または33の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、変異型シグナルペプチド。
- 異種タンパク質と融合した、請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチド。
- 前記異種ポリペプチドは、抗体重鎖である、請求項32に記載の変異型シグナルペプチド。
- 前記異種ポリペプチドは、抗体軽鎖である、請求項32に記載の変異型シグナルペプチド。
- 前記異種ポリペプチドは、抗体軽鎖及び重鎖である、請求項32に記載の変異型シグナルペプチド。
- 前記異種ポリペプチドは、多量体ポリペプチドである、請求項32に記載の変異型シグナルペプチド。
- 前記異種ポリペプチドは、イムノアドヘシンである、請求項32に記載の変異型シグナルペプチド。
- 請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
- 異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した請求項38に記載のポリヌクレオチド配列であって、それにより、宿主細胞中での前記異種ポリペプチドの発現に際して、前記異種ポリペプチドは折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する、ポリヌクレオチド配列。
- 前記宿主細胞は、原核生物宿主細胞である、請求項39に記載のポリヌクレオチド配列。
- 前記宿主細胞は、E.coliである、請求項40に記載のポリヌクレオチド配列。
- 抗体をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、(1)抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第一シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び(2)抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第二シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それにより、宿主細胞中での前記抗体発現の際に、前記重鎖及び軽鎖が折り畳まれ構築されて、生物学的に活性な抗体を形成し、前記第一シグナルペプチドは請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチドであるか、または前記第一シグナルペプチドは、配列番号8、11、13、15、31、33、または42の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
- 前記第一シグナルペプチドは、請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチドである、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第一シグナルペプチドは、配列番号8、11、13、15、31、33、または42の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第二シグナルペプチドは、シグナルペプチドである、請求項42から44のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第二シグナルペプチドは、請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチドであるか、あるいは前記第二シグナルペプチドは、配列番号8、11、13、15、31、33、または42の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、請求項42から44のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第二シグナルペプチドは、請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチドである、請求項42から44のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第二シグナルペプチドは、配列番号8、11、13、15、31、33、または42の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、請求項42から44のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 抗体をコードする前記ポリヌクレオチドは、さらに、(3)Fcポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結した第三シグナルペプチドをコードするポリペプチドを含む、請求項42から48のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第三シグナルペプチドは、請求項26から30のいずれか1項に記載の変異型シグナルペプチドであるか、あるいは前記第三シグナルペプチドは、配列番号8、11、13、15、31、33、または42の配列からなる、本質的にその配列からなる、またはその配列を含む、請求項49に記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種ポリペプチドと作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項39から50のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは、phoA、tac、lpp、lac−lpp、lac、ara、trp、及びT7プロモーターからなる群より選択される原核生物プロモーターである、請求項51に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは、phoAプロモーターである、請求項52に記載のポリヌクレオチド。
- (a)第一プロモーターであって、軽鎖と作動可能に連結している前記第一プロモーター、及び(b)第二プロモーターであって、重鎖と作動可能に連結している前記第二プロモーター、をさらに含む、請求項39から53のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記第一プロモーター及び第二プロモーターは、両方ともphoAプロモーターである、請求項54に記載のポリヌクレオチド。
- (c)第三プロモーターであって、Fcポリペプチドと作動可能に連結している前記第三プロモーター、をさらに含む、請求項54に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは、phoAプロモーターである、請求項56に記載のポリヌクレオチド。
- 前記異種ポリペプチドは、プロテアーゼ、イムノアドヘシン、受容体の細胞外ドメイン、ヘテロ多量体タンパク質、または抗体である、請求項39から41のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項42から57のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗体は、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、抗体断片、またはヒト抗体である、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗体断片は、一本腕抗体である、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗体は、二重特異性抗体である、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項39から62のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項63に記載のベクター。
- 請求項39から62のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項64に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 原核細胞である、請求項66に記載の宿主細胞。
- 前記原核細胞は、E.coliである、請求項67に記載の宿主細胞。
- 前記E.coliは、内因性プロテアーゼ活性が欠損した株のものである、請求項68に記載の宿主細胞。
- 前記E.coliの遺伝子型は、degP遺伝子及びprc遺伝子を欠いており、かつ突然変異spr遺伝子を抱えている、請求項68または69に記載の宿主細胞。
- 原核生物シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項66から70のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 前記原核生物シャペロンタンパク質は、DsbA及び/またはDsbCである、請求項71に記載の宿主細胞。
- 原核生物シャペロンタンパク質を過剰発現する、請求項71または72に記載の宿主細胞。
- 異種ポリペプチド(抗体重鎖及び/または軽鎖など)の作成方法であって、請求項66から73のいずれか1項に記載の宿主細胞を、核酸が発現されるように培養することを含み、それにより、宿主細胞中での前記ポリヌクレオチドの発現の際に、前記異種ポリペプチドが折り畳まれて生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する、前記方法。
- 宿主細胞培養物から前記異種ポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項74に記載の方法。
- 前記異種ポリペプチドは、宿主細胞培養培地から回収される、請求項75に記載の方法。
- 前記回収した異種ポリペプチドを、薬学上許容される担体、賦形剤、または担体と組み合わせて、前記異種ポリペプチドを含む医薬製剤を調剤することをさらに含む、請求項74または75に記載の方法。
- 細胞からの異種ポリペプチド(抗体重鎖及び/または軽鎖など)の分泌方法であって、請求項66から73のいずれか1項に記載の宿主細胞を、核酸が発現され、かつ前記異種ポリペプチドが分泌されるように培養することを含む、前記方法。
- 細胞からの異種ポリペプチド(抗体重鎖及び/または軽鎖など)の移行方法であって、請求項66から73のいずれか1項に記載の宿主細胞を、核酸が発現され、かつ前記異種ポリペプチドが移行されるように培養することを含む、前記方法。
- 請求項74から79のいずれか1項に記載の方法により得られる異種ポリペプチド。
- 抗体である、請求項80に記載のポリペプチド。
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