CN106103730B - 用于分泌异源多肽的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及分子生物学和蛋白质技术领域。更具体而言，本发明涉及用于从细菌分泌异源多肽的信号肽。本发明还涉及重组多肽及其用途。

Description

用于分泌异源多肽的方法和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年3月14日提交的美国专利申请号61/953,629、2015年1月26日提交的美国专利申请号62/107,981和2015年1月27日提交的美国专利申请号62/108,476的优先权，该专利申请的内容在此以其整体引入作为参考。
序列表
本申请包含序列表，其以ASCII格式以电子方式提交，在此以其整体引入作为参考。2015年3月12日创建的该ASCII拷贝命名为P5804R1-WO_SL.txt，大小为21,971字节。
技术领域
本发明一般地涉及分子生物学和蛋白质技术领域。更具体而言，本发明涉及用于从细菌分泌异源多肽的信号肽。本发明还涉及原核产生的重组多肽及其用途。
背景技术
近年来越来越多地看到用异源多肽(例如抗体)作为多种障碍和疾病的诊断剂和治疗剂的前景。许多研究和临床应用需要大量功能性多肽，从而需要规模放大但经济的用于多肽产生的系统。尤其有用的是用多种表达宿主(从原核生物(如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))至酵母、植物、昆虫细胞和哺乳动物细胞)重组产生抗体。Kipriyanov和Little(1999)Mol.Biotech.12:173-201。
与其他多肽产生系统相比，细菌(尤其是大肠杆菌)提供了许多独特的优势。所使用的原料(即细菌细胞)廉价且易于生长，因此降低了产物的成本。原核宿主比例如哺乳动物细胞生长得快得多，允许更快地分析遗传操作。较短的世代时间和规模放大的容易性也使细菌发酵成为更具吸引力的用于大量蛋白质产生的手段。许多细菌物种(包括大肠杆菌)的基因组结构和生物学活性已得到很好的研究，且有广范围的适宜载体可用，使得希望得到的抗体的表达更方便。与真核生物相比，产生方法涉及更少的步骤，包括操作重组基因、稳定转化多个拷贝进入宿主、表达诱导和产物表征。Pluckthun和Pack(1997)Immunotech3:83-105。
已用多种方法来在细菌中制备重组多肽。可以通过重折叠表达在胞质中的内含体或通过表达后分泌至细菌周质来从细菌获得重组蛋白质。分泌和重折叠之间的选择通常由几项考虑指导。分泌通常是更快和更常用的用于产生抗体的策略。Kipriyanov和Little(1999),上文。但是，与其他表达宿主相比，大肠杆菌分泌和重折叠能力常限于更低的水平。
原核系统中的抗体表达可以以不同规模进行。对于大肠杆菌中的抗体产生的一般综述，参见Pluckthun和Pack(1997)Immunotech 3:83-105；Pluckthun等(1996)inAntibody Engineering:A Practical Approach,203-252页(Oxford Press)；Pluckthun(1994)in Handbook of Exp Pharmcol第3卷:The Pharmcol of Monoclonal Antibodies,第269-315页(M.Rosenberg和G.P.Moore编辑；Springer-Verlag,柏林)。
许多生物学测定(如X射线晶体分析法)和临床应用(如蛋白质治疗)需要大量蛋白质。因此，存在对用于产生正确组装、可溶和有功能的异源多肽(如抗体)的高产率但简单的系统的需要。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，以其整体引入作为参考。
发明概述
本发明提供用于提高异源蛋白质(如抗体)的产生的新手段。用周质分泌作为用于高水平产生异源蛋白质(例如抗体)的手段可受限于几个常遇到的问题。第一，目的蛋白质的分泌效率可以很低。第二，前体在许多情况下不完整地加工为成熟蛋白质。第三，过量表达的异源蛋白质常不正确地折叠，聚集为不可溶的内含体，或被大肠杆菌蛋白酶酶解。第四，抗体是由两种不同多肽(重链和轻链)组成的复杂多体蛋白质，必须使这两种不同多肽输出进入周质，正确折叠，并形成适当的二硫键。此蛋白质折叠和分泌的复杂性增加了在大肠杆菌中制备抗体的挑战。与其他表达宿主相比，大肠杆菌分泌和重折叠能力常限于更低的水平。虽然已显示TIR优化对产生更有效的蛋白质分泌有用，但未显示其他方法惯常地改善大肠杆菌中的异源蛋白质分泌。例如，已显示信号蛋白质的优化减少了重组环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)分泌进入周质间隙。Jonet等,J Mol Microbiol Biotechnol(2012)；22:48-58。
在本研究中，发明人证明，提高信号肽的平均疏水性增加了可溶性抗体分泌至大肠杆菌周质。发展了平均疏水性提高的变体信号肽，发明人证明，在使用平均疏水性提高的信号肽变体时，可溶性抗体的周质分泌增加，在使用平均疏水性降低的信号肽变体时，可溶性抗体的周质分泌减少。
在一方面，提供增加抗体重链和/或抗体轻链从大肠杆菌宿主细胞的分泌的方法，其包括培养大肠杆菌宿主细胞，该大肠杆菌宿主细胞包含含有以下的多核苷酸：(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的第一多核苷酸，其中信号肽的平均疏水性高于约0.5；和/或(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的第二多核苷酸，其中第二信号肽的平均疏水性高于约0.5；由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体。
在一方面，提供从大肠杆菌宿主细胞制备抗体重链和/或轻链的方法，其包括培养大肠杆菌宿主细胞，该大肠杆菌宿主细胞包含含有以下的多核苷酸：(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的第一多核苷酸，其中信号肽的平均疏水性高于约0.5；和/或(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的第二多核苷酸，其中第二信号肽的平均疏水性高于约0.5；由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括从宿主细胞培养物回收异源多肽。在一些实施方案中，从宿主细胞培养基回收异源多肽。在一些实施方案中，该方法进一步包括将所回收的异源多肽与可药用载体、赋形剂或载体组合，以制备包含异源多肽的药物制剂。
在一方面，提供从大肠杆菌宿主细胞制备抗体重链和/或轻链的方法，其包括培养大肠杆菌宿主细胞，该大肠杆菌宿主细胞包含含有以下的多核苷酸：(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的第一多核苷酸，其中信号肽的平均疏水性高于约0.5；和/或(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的第二多核苷酸，其中第二信号肽的平均疏水性高于约0.5；由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体。
在一方面，提供从大肠杆菌宿主细胞易位抗体重链和/或轻链的方法，其包括培养大肠杆菌宿主细胞，该大肠杆菌宿主细胞包含含有以下的多核苷酸：(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的第一多核苷酸，其中信号肽的平均疏水性高于约0.5；和/或(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的第二多核苷酸，其中第二信号肽的平均疏水性高于约0.5；由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体。
在一些实施方案中，第一信号肽的平均疏水性高于约0.6。在一些实施方案中，第一信号肽的平均疏水性高于约0.7。在一些实施方案中，第二信号肽的平均疏水性高于约0.6。在一些实施方案中，第二信号肽的平均疏水性高于约0.7。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的平均疏水性相似(例如等同)。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的平均疏水性不同。
在一些实施方案中，第一和/或第二信号肽是变体共翻译信号肽。在一些实施方案中，第一和/或第二信号肽是变体DsbA信号肽。在一些实施方案中，变体DsbA信号肽在残基L11处包含突变，其中变体DsbA信号肽具有比SEQ ID NO:3的野生型DsbA信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，其中突变是L11I或S18Y。在一些实施方案中，变体DsbA信号肽包含序列SEQ ID NO:13或15。
在一些实施方案中，该信号肽是Sfmc信号肽。在一些实施方案中，该Sfmc信号肽具有不同于野生型Sfmc信号肽的TIR强度的TIR强度。在一些实施方案中，Sfmc信号肽的相对翻译强度(也称为TIR强度)为约2、约3、约4、约5、约6、约7或更多，如约8、约9或更多。在一些实施方案中，Sfmc信号肽的相对翻译强度在1和3之间、2和4之间、3和5之间、4和6之间、5和7之间、6和8之间。在一些实施方案中，Sfmc信号肽的相对翻译强度在2和5之间、3和7之间、或4和8之间。在一些实施方案中，该信号肽是FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT。在一些实施方案中，该FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT信号肽具有不同于野生型FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT信号肽的相对翻译强度的相对翻译强度。在一些实施方案中，该FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT信号肽的TIR强度为约2、约3、约4、约5、约6、约7或更多，如约8、约9或更多。在一些实施方案中，该FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT信号肽的相对翻译强度在1和3之间、2和4之间、3和5之间、4和6之间、5和7之间、6和8之间。在一些实施方案中，该FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT信号肽的相对翻译强度在2和5之间、3和7之间、或4和8之间。
在一些实施方案中，该信号肽不是Sfmc。在一些实施方案中，该信号肽不是TorT。在一些实施方案中，该信号肽不是FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL或TorT中任意一个或多个。
在一些实施方案中，第一和/或第二信号肽的相对翻译强度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、或约8。在一些实施方案中，第一信号肽的相对翻译强度为约5，第二信号肽的相对翻译强度为约8。在一些实施方案中，第一信号肽的相对翻译强度为约8，第二信号肽的相对翻译强度为约5。在一些实施方案中，Sfmc信号肽的相对翻译强度在1和3之间、2和4之间、3和5之间、4和6之间、5和7之间、6和8之间。在一些实施方案中，Sfmc信号肽的相对翻译强度在2和5之间、3和7之间、或4和8之间。
在一些实施方案中，其中宿主细胞中的多核苷酸进一步包含启动子。在一些实施方案中，该启动子是选自phoA、tac、lpp、lac-lpp、lac、ara和T7启动子的原核启动子。
在一些实施方案中，该大肠杆菌宿主细胞属于缺乏内源蛋白酶活性的菌株。在一些实施方案中，该大肠杆菌的基因型缺乏degP和prc基因，具有突变的spr基因。在一些实施方案中，该宿主细胞进一步包含编码选自DsbA、DsbC、DsbG和FkpA的至少一种原核多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸编码DsbA和DsbC二者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括从宿主细胞培养物回收抗体。在一些实施方案中，从宿主细胞培养基回收抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括将所回收的抗体与可药用载体、赋形剂或载体组合，以制备包含抗体的药物制剂。在一些实施方案中，所形成的免疫球蛋白多肽复合物中的至少50％是抗体。在一些实施方案中，所形成的免疫球蛋白多肽复合物中的至少70％是抗体。在一些实施方案中，所形成的免疫球蛋白多肽复合物中的至少80％是抗体。在一些实施方案中，所形成的免疫球蛋白多肽复合物中的至少90％是抗体。
在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是嵌合抗体、亲和力成熟抗体、双特异性抗体、人源化抗体、或人抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。
在另一方面，提供变体DsbA信号肽，其中变体包含平均疏水性高于0.5的H区。
在另一方面，提供在残基L11处包含突变的变体DsbA信号肽，其中变体具有比SEQID NO:3的DsbA信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，该突变是L11I和/或S18Y。
在另一方面，提供在残基S11处包含突变的变体STII信号肽，其中变体STII信号肽具有比SEQ ID NO:1的STII信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，该突变是S11A、S11I或S11L。
在另一方面，提供由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31或33组成、基本由序列SEQ IDNO:8、11、13、15、31或33组成、或包含序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31或33的变体信号肽。
在另一方面，提供与异源蛋白质融合的本文公开的任意变体信号肽。在一些实施方案中，该异源多肽是抗体重链。在一些实施方案中，该异源多肽是抗体轻链。在一些实施方案中，该异源多肽是抗体轻链和重链。在一些实施方案中，该异源多肽是多体多肽。在一些实施方案中，该异源多肽是免疫黏附素。
在另一方面，提供编码本文公开的任意变体信号肽的多核苷酸序列。
在另一方面，提供与编码异源多肽的多核苷酸有效连接的编码本文中所公开的任意变体信号肽的多核苷酸序列，由此在宿主细胞中表达异源多肽时，异源多肽折叠并组装形成具有生物学活性的异源多肽。
在一些实施方案中，该宿主细胞是原核宿主细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是大肠杆菌。
在另一方面，提供编码抗体的多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的核苷酸和(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的多核苷酸，由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体，其中第一信号肽是本文中公开的变体信号肽的任一种的变体信号肽。在一些实施方案中，第一信号肽由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42组成、基本由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42组成、或包含序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42。在一些实施方案中，第一信号肽是变体DsbA信号肽，其中变体包含平均疏水性高于0.5的H区。在一些实施方案中，第一信号肽是在残基L11处包含突变的变体DsbA信号肽，其中变体具有比SEQ ID NO:3的DsbA信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，该突变是L11I和/或S18Y。在一些实施方案中，第一信号肽是在残基S11处包含突变的变体STII信号肽，其中变体STII信号肽具有比SEQ ID NO:1的STII信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，该突变是S11A、S11I或S11L。
在一些实施方案中，第二信号肽是信号肽。在一些实施方案中，第二信号肽由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42组成、基本由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42组成、或包含序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42。在一些实施方案中，第二信号肽是变体DsbA信号肽，其中变体包含平均疏水性高于0.5的H区。在一些实施方案中，第二信号肽是在残基L11处包含突变的变体DsbA信号肽，其中变体具有比SEQ ID NO:3的DsbA信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，该突变是L11I和/或S18Y。在一些实施方案中，第二信号肽是在残基S11处包含突变的变体STII信号肽，其中变体STII信号肽具有比SEQ ID NO:1的STII信号肽高的平均疏水性。在一些实施方案中，该突变是S11A、S11I或S11L。
在一些实施方案中，编码抗体的多核苷酸进一步包含(3)与编码Fc多肽的多核苷酸有效连接的编码第三信号肽的多肽。第三信号肽可以是例如本文中公开的变体信号肽中的任一个。在一些实施方案中，第三信号肽由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42组成、基本由序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42组成、或包含序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33或42。
在一些实施方案中，该多核苷酸进一步包含与异源多肽有效连接的启动子。在一些实施方案中，该启动子是选自phoA、tac、lpp、lac-lpp、lac、ara、trp和T7启动子的原核启动子。在一些实施方案中，该启动子是phoA启动子。
在一些实施方案中，该多核苷酸包含：(a)第一启动子，其中第一启动子与轻链有效连接；和(b)第二启动子，其中第二启动子与重链有效连接。在一些实施方案中，第一和第二启动子都是phoA启动子。
在一些实施方案中，该多核苷酸进一步包含(c)第三启动子，其中第三启动子与Fc多肽有效连接。在一些实施方案中，该启动子是phoA启动子。
在一些实施方案中，其中异源多肽是蛋白酶、免疫黏附素、受体胞外域、异源多体蛋白质或抗体。
在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、抗体片段或人抗体。在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。
包含本文公开的任意多核苷酸的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，该载体是表达载体。
包含本文公开的任意多核苷酸的组合物。
包含本文公开的任意多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，该原核细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，该大肠杆菌属于缺乏内源蛋白酶活性的菌株。在一些实施方案中，该大肠杆菌的基因型缺乏degP和prc基因，具有突变的spr基因。在一些实施方案中，该宿主细胞进一步包含编码原核分子侣伴蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，该原核分子侣伴蛋白质是DsbA和/或DsbC。在一些实施方案中，宿主细胞过量表达原核分子侣伴蛋白质。
在另一方面，提供制备异源多肽的方法，该方法包括培养本文所述的任意宿主细胞，使得核酸表达，由此在宿主细胞中表达该多核苷酸时，异源多肽折叠形成具有生物学活性的异源多肽。在一些实施方案中，该方法进一步包括从宿主细胞培养物回收异源多肽。在一些实施方案中，从宿主细胞培养基回收异源多肽。在一些实施方案中，该方法进一步包括将所回收的异源多肽与可药用载体、赋形剂或载体组合，以制备包含异源多肽的药物制剂。
在另一方面，提供从细胞分泌异源多肽的方法，该方法包括培养本文提供的任意宿主细胞，使得核酸表达，并分泌异源多肽。
在另一方面，提供从细胞易位异源多肽的方法，该方法包括培养本文提供的任意宿主细胞，使得核酸表达，并易位异源蛋白质。
通过本文提供的任意方法获得的异源多肽。在一些实施方案中，该多肽是抗体。
在一些实施方案中，例如与使用野生型(非变体)信号肽相比，变体信号肽的使用导致例如异源多肽(例如抗体，例如重链和/或轻链)的产生增加、异源多肽(例如抗体)的分泌增加、成熟异源多肽(例如抗体)的产生增加、成熟异源多肽(例如抗体)的分泌增加、可溶性异源多肽(例如抗体)的产生增加、可溶性异源多肽(例如抗体)的分泌增加、周质侧的内含体定位增加、和/或异源多肽的产生增加，由此异源多肽分泌、折叠和组装为具有生物学活性的多肽(例如抗体)。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度(也称为TIR强度)为约1。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约2、约3、约4、约5、约6、约7或更多，如约8或更多。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约4。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约5。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约6。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约8。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的相对翻译强度相等。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的相对翻译强度不同。
在一个方面，提供编码本发明的变体信号肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，该变体属于PhoA、MalE、DsbA或STII信号肽。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:12或15。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:31或33。在一些实施方案中，该多核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35。在一些实施方案中，该多核苷酸由多核苷酸序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，或包含多核苷酸序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，该多核苷酸由多核苷酸序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28组成，或包含多核苷酸序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28。在一些实施方案中，该多核苷酸由多核苷酸序列SEQ ID NO:29组成，基本由多核苷酸序列SEQID NO:29组成，或包含多核苷酸序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，该多核苷酸由SEQID NO:27或30之一的多核苷酸序列组成，基本由SEQ ID NO:27或30之一的多核苷酸序列组成，或包含SEQ ID NO:27或30之一的多核苷酸序列。在一些实施方案中，该多核苷酸由多核苷酸序列SEQ ID NO:36或38组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:36或38组成，或包含多核苷酸序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，该多核苷酸由多核苷酸序列SEQ IDNO:37、39或40组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含多核苷酸序列SEQ ID NO:37、39或40。
在另一方面，本发明提供多核苷酸，其包含与编码异源多肽的多核苷酸有效连接的编码本发明的变体信号肽的多核苷酸，由此在宿主细胞(例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌宿主细胞)中表达异源多肽时，异源多肽折叠并组装形成具有生物学活性的异源多肽。本文中进一步公开异源多肽的实例。在一些实施方案中，该异源多肽是抗体重链。在一些实施方案中，该异源多肽是抗体轻链。在一些实施方案中，该异源多肽是Fc多肽。在一些实施方案中，该异源多肽是多体多肽。在一些实施方案中，该异源多肽是异源多体。在一些实施方案中，信号肽是本文公开的变体信号肽中的任一种。在一些实施方案中，该信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35。在一些实施方案中，该信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13。在一些实施方案中，该信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，基本由氨基酸序列SEQ IDNO:14组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，该信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，或包含氨基酸序列SEQID NO:12或15。在一些实施方案中，该信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或33。在一些实施方案中，该信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、44、45或46组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、44、45或46组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、44、45或46。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、26、28、30、36、37、38、45或46组成，基本由序列SEQ ID NO:23、26、28、30、36、37、38、45或46组成，或包含序列SEQ ID NO:23、26、28、30、36、37、38、45或46。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:29组成，基本由序列SEQ ID NO:29组成，或包含序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:27或30组成，基本由序列SEQ ID NO:27或30组成，或包含序列SEQID NO:27或30。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由多核苷酸序列SEQ IDNO:36或38组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:36或38组成，或包含多核苷酸序列SEQ IDNO:36或38。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由多核苷酸序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含多核苷酸序列SEQID NO:37、39或40。在一些实施方案中，编码变体信号肽的多核苷酸由多核苷酸序列SEQ IDNO:45或46组成，基本由多核苷酸序列SEQ ID NO:45或46组成，或包含多核苷酸序列SEQ IDNO:45或46。
在另一方面，本发明提供多核苷酸，其包含：(1)与编码第一异源多肽的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的多核苷酸；和(2)与编码第二异源(多肽)的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的多核苷酸；由此在宿主细胞中表达抗体时，第一和第二异源多肽折叠并组装形成具有生物学活性的多肽复合物。
在另一方面，本发明提供编码抗体的多核苷酸，该多核苷酸包含：(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的多核苷酸；和(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的多核苷酸；由此在宿主细胞(例如原核宿主细胞，例如大肠杆菌宿主细胞)中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体。
在一些实施方案中，第一信号肽是信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)。在一些实施方案中，该信号肽是共翻译信号肽。在一些实施方案中，第一信号肽是DsbA信号肽。在一些实施方案中，第一信号肽STII信号肽。在一些实施方案中，第一信号肽是本文公开的变体信号肽中的任一个。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或15。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或33。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:32、34或35。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:29组成，基本由序列SEQ ID NO:29组成，或包含序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:27或30组成，基本由序列SEQ ID NO:27或30组成，或包含序列SEQ ID NO:27或30。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ IDNO:36或38组成，基本由序列SEQ ID NO:36或38组成，或包含序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:37、39或40。
在一些实施方案中，第二信号肽是信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)。在一些实施方案中，第二信号肽是DsbA信号肽。在一些实施方案中，第二信号肽STII信号肽。在一些实施方案中，第二信号肽是本文公开的变体信号肽中的任一个。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ IDNO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或15。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或33。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:32、35或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:32、35或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:32、35或35。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:29组成，基本由序列SEQID NO:29组成，或包含序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:27或30组成，基本由序列SEQ ID NO:27或30组成，或包含序列SEQ IDNO:27或30。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:36或38组成，基本由序列SEQ ID NO:36或38组成，或包含序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:37、39或40。
在一些实施方案中，第一信号肽由信号肽组成、基本由信号肽组成或包含信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)，第二信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:36和38中的任一个)。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34或35。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或15。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:36或38组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:36或38组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，第二信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:37、39或40。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28组成，基本由序列SEQ IDNO:23、24、25、26或28组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26或28。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:29组成，基本由序列SEQ ID NO:29组成，或包含序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ IDNO:27或30组成，基本由序列SEQ ID NO:27或30组成，或包含序列SEQ ID NO:27或30。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:36或38组成，基本由序列SEQID NO:36或38组成，或包含序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，编码第二信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:37、39或40。
在一些实施方案中，第二信号肽由信号肽组成、基本由信号肽组成或包含信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)，第一信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如，包含SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的氨基酸序列、由SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的氨基酸序列组成或基本由SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的氨基酸序列组成的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:31和33中的任一个)。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、35或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、35或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、31、32、33、35或35。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ IDNO:8、11或13组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，或包含氨基酸序列SEQ IDNO:8、11或13。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或15。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ IDNO:31或33组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或33。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:33、34或35组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:33、34或35组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:33、34或35。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ IDNO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:29组成，基本由序列SEQ ID NO:29组成，或包含序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:27或30组成，基本由序列SEQID NO:27或30组成，或包含序列SEQ ID NO:27或30。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:36或38组成，基本由序列SEQ ID NO:36或38组成，或包含序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，编码第一信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:37、39或40。
在一些实施方案中，编码抗体的多核苷酸进一步包含(3)与编码Fc多肽的多核苷酸有效连接的编码第三信号肽的多肽。在一些实施方案中，第三信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如，由8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的氨基酸序列组成、基本由8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的氨基酸序列组成、或包含8、11、12、13、14、15、31、32、33、34和35中的任一个的氨基酸序列的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:31和33中的任一个)。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、11或13。在一些实施方案中，第一信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:14组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些实施方案中，第三信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:12或15组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或15。在一些实施方案中，第三信号肽由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，基本由氨基酸序列SEQ ID NO:31或33组成，或包含氨基酸序列SEQ ID NO:31或33。在一些实施方案中，编码第三信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、27、28、29、30、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第三信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:23、24、25、26、28、36、37、38、39或40。在一些实施方案中，编码第三信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:29组成，基本由序列SEQ ID NO:29组成，或包含序列SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，编码第三信号肽的多核苷酸由序列SEQ IDNO:27或30组成，基本由序列SEQ ID NO:27或30组成，或包含序列SEQ ID NO:27或30。在一些实施方案中，编码第三信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:36或38组成，基本由序列SEQID NO:36或38组成，或包含序列SEQ ID NO:36或38。在一些实施方案中，编码第三信号肽的多核苷酸由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，基本由序列SEQ ID NO:37、39或40组成，或包含序列SEQ ID NO:37、39或40。在一些实施方案中，第三信号肽是信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)。
在例如进一步包含(3)编码第三信号肽的多核苷酸的编码抗体的多核苷酸的一些实施方案中，第一信号肽包含信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)，第二信号肽包含信号肽(例如本领域已知的任意信号肽)。在一些实施方案中，第一信号肽由信号肽组成、基本由信号肽组成或包含信号肽，第二信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如，SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、36、37、38、39和40中的任一个的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:31和33中的任一个)。在一些实施方案中，第二信号肽由信号肽组成、基本由信号肽组成或包含信号肽，第一信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如，SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、36、37、38、39和40中的任一个的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:31和33中的任一个)。在例如进一步包含(3)编码第三信号肽的多核苷酸的编码抗体的多核苷酸的一些实施方案中，第一信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如，SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、36、3、38、39和40中的任一个的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:31和33中的任一个)，第二信号肽由本文公开的信号肽组成、基本由本文公开的信号肽组成或包含本文公开的信号肽，例如，SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、36、37、38、39和40中的任一个的信号肽(在一些实施方案中，SEQ ID NO:8、11和13中的任一个，在一些实施方案中，SEQ ID NO:31和33中的任一个)。
在一些实施方案中，例如与使用野生型(非变体)信号肽相比，变体信号肽的使用导致例如异源多肽(例如抗体)的产生增加、异源多肽(例如抗体)的分泌增加、成熟异源多肽(例如抗体)的产生增加、成熟异源多肽(例如抗体)的分泌增加、可溶性异源多肽(例如抗体)的产生增加、可溶性异源多肽(例如抗体)的分泌增加、异源多肽的产生增加，由此异源多肽分泌、折叠和组装为具有生物学活性的多肽(例如抗体)。在一些实施方案中，例如与使用野生型(非变体)信号肽相比，变体信号肽的使用导致例如异源多肽(例如抗体)的产生增加、异源多肽(例如抗体)的分泌增加、成熟异源多肽(例如抗体)的产生增加、成熟异源多肽(例如抗体)的分泌增加、可溶性异源多肽(例如抗体)的产生增加、可溶性异源多肽(例如抗体)的分泌增加、异源多肽的产生增加，由此异源多肽分泌、折叠和组装为具有生物学活性的多肽(例如抗体)，其中变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度大致等同。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约1。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约2、约3、约4、约5、约6、约7或更多，如约8或更多。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约4。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约5。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约6。在一些实施方案中，变体信号肽和野生型(非变体)信号肽的相对翻译强度为约8。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的相对翻译强度大致等同。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的相对翻译强度不同。
在一方面，本发明提供用本发明的方法产生的异源多肽在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍和/或免疫(如自身免疫)障碍)的药物中的用途。异源多肽可以属于本文所述的任意形式，包括抗体、抗体片段、多肽(例如寡肽)、或其组合。
在一方面，本发明提供本文公开的信号肽或编码本文公开的信号肽的多核苷酸在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍和/或免疫(如自身免疫)障碍)的药物中的用途。
在一方面，本发明提供本文公开的表达载体在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍和/或免疫(如自身免疫)障碍)的药物中的用途。
在一方面，本发明提供本文公开的宿主细胞在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍和/或免疫(如自身免疫)障碍)的药物中的用途。
在一方面，本发明提供本文公开的制品在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍、免疫(如自身免疫)障碍和/或血管发生相关障碍(创伤愈合))的药物中的用途。
在一方面，本发明提供本文公开的试剂盒在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍和/或免疫(如自身免疫)障碍)的药物中的用途。
附图简述
图1A、1B和1C显示信号肽变体对5D5全长抗体和重链水平的影响。在摇瓶中在完全C.R.A.P.磷酸盐限制培养基中培养含有表达载体的大肠杆菌宿主菌株64B424小时，并通过OD550归一化终点样品。(1A)上图：可溶性含重链种类的Western印迹。裂解携带pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bMalE1-5D5(mSTII1,bMalE1)、pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5(mSTII1,bDsbA1)或pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5(mSTII1,bPhoA1)的64B4细胞，通过非还原SDS-PAGE电泳分开水性可溶性级分，然后进行用HRP缀合的αFc抗体探测的Western印迹。所产生的印迹显示从上至下对应于全长5D5抗体、重链-重链-轻链和重链-轻链的含重链种类。下图：归一化终点样品至1OD550，并沉淀。通过与含0.2M DTT的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸样品缓冲液混合来变性和还原总蛋白质。重链按约49kDa的分子量在SDS-PAGE上作为单一条带迁移，通过αFc抗体检测。如通过Edman蛋白质测序确认，在凝胶上迁移较慢的重链条带包含前体。(1B)周质中的可溶性重链的水平。通过渗透压休克来处理含有pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bMalE1-5D5(mSTII1,bMalE1)、pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5(mSTII1,bDsbA1)或pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5(mSTII1,bPhoA1)的64B4细胞的终点样品。收集上清，通过含0.2M DTT的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液来变性和还原。还原的重链作为约49kDa处的单一条带迁移，用αFc探测。(1C)上图：携带pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5(mSTII1,bDsbA1)、pBR-mSTII1-mPhoA1-5D5(mSTII1,mPhoA1)和pBR-mSTII1-mMalE1-5D5(mSTII1,mMalE1)的64B4细胞的非还原Western印迹。中图：通过DTT还原相同样品的1OD550沉淀中的总重链，并通过Western印迹分析。下图：还原相同样品的外周提取物，并通过αFc抗体Western印迹分析。所有表达质粒均这样命名，使得第一信号肽TIR变体用于轻链，第二信号肽TIR变体用于重链。例如，mSTII1-bSTII1-5D5指TIR为1的STII信号序列用于轻链，上游为mluI限制位点；bSTII1指TIR为1的STII信号序列用于HC，上游为bst信号序列；5D5是抗体名称。
图2A和2B通过免疫金电镜术显示使用不同信号肽对重链细胞定位的影响。在摇瓶中培养携带表达多种信号肽的构建体的A64B4细胞24小时。固定、包埋终点样品，并进行冷冻切片。用HRP缀合的αFc抗体和金缀合的αHRP二抗探测冷冻切片。通过透射电镜(TEM)显示免疫染色的样品。(2A)显示携带pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)的A64B4细胞。(2B)显示携带pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5(mSTII1,bDsbA1)的A64B4细胞。通过黑色箭头指出周质间隙。通过黑色箭头指出免疫金信号。
图3A和3B显示信号肽疏水性对周质中的重链累积的影响。(3A)显示缺乏轻链的情况下周质可溶性重链的水平。通过Western印迹分析来自携带pBR-bDsbA1-5D5HC(bDsbA1)、pBR-bDsbA1L11I-5D5HC(bDsbA1L11I)、pBR-bDsbA1L11S-5D5HC(bDsbA1L11S)、pBR-bSTII1-5D5HC(bSTII1)、pBR-bSTII1S11L密码子1-5D5HC(bSTII1密码子1)或pBR-bSTII1S11L密码子2-5D5HC(bSTII1密码子2)的64B4细胞的周质提取物。(3B)显示共表达轻链时周质可溶性重链的水平。通过Western印迹分析来自携带pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bMalE1-5D5(mSTII1,bMalE1)、pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5(mSTII1,bDsbA1)、pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5(mSTII1,bPhoA1)、pBR-mSTII1-bDsbA1L11I-5D5(mSTII1,bDsbA1L11I)、pBR-mSTII1-bDsbA1L11S-5D5(mSTII1,bDsbA1L11S)、pBR-mSTII1-bSTII1S11L-5D5(mSTII1,bSTII1S11L)或pBR-mSTII1-bSTII1S11I-5D5(mSTII1,bSTII1S11I)的64B4的周质提取物。通过αFc抗体检测还原的重链。
图4A和4B显示信号肽疏水性对全长5D5水平的影响。上图：通过非还原SDS-PAGE凝胶后进行用αFc抗体探测的Western印迹来分析来自含有(A)pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bDsbA1L11I-5D5(mSTII1,bDsbA1L11I)、pBR-mSTII1-bDsbA1L11S-5D5(mSTII1,bDsbA1L11S)、pBR-bDsbA1-5D5HC(bDsbA1)，(B)pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-bDsbA1-5D5HC(bDsbA1)、pBR-mSTII1-bSTII1S11L-5D5(mSTII1,bSTII1S11L)或pBR-mSTII1-bSTII1S11I-5D5(mSTII1,bSTII1S11I)的64B4的全细胞裂解物。指出含重链种类。下图：通过还原SDS-PAGE凝胶和Western印迹分析来自与上图中所用样品相同的样品的1OD550沉淀中的总重链蛋白质。用αFc抗体探测按49kDa迁移的重链。
图5显示信号肽及其疏水性对内含体细胞定位的影响。将来自携带pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bMalE1-5D5(mSTII1,bMalE1)、pBR-mSTII1-bPhoA1-5D5(mSTII1,bPhoA1)、pBR-mSTII1-bDsbA1-5D5(mSTII1,bDsbA1)、pBR-mSTII1-bDsbA1L11S-5D5(mSTII1,bDsbA1L11S)、pBR-mSTII1-bSTII1S11L-5D5(mSTII1,bSTII1S11L)、pBR-mSTII1-mMalE1-5D5(mSTII1,mMalE1)或pBR-mSTII1-mPhoA1-5D5(mSTII1,mPhoA1)的64B4的培养物的终点样品固定、包埋、切为超薄切片，并在TEM下显示。通过箭头指出周质间隙，通过箭头指出内含体。
图6显示C端区域中Ser/Tyr突变的Western印迹分析。上图：通过用αFc探测的非还原Western印迹分析来自含有pBR-mSTII1-bSTII1-5D5(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bSTII1Y22S-5D5(mSTII1,bSTII1Y22S)、pBR-bDsbA1-5D5HC(bDsbA1)或pBR-bDsbA1S18Y-5D5HC(bDsbA1S18Y)的64B4细胞的全细胞裂解物。显示包括全长5D5、重链-重链-轻链和重链-轻链的含重链种类。下图：通过DTT还原并通过Western印迹分析1OD550沉淀中的总蛋白质。还原的重链按～49kDa迁移。
图7A和7B显示信号肽疏水性对mAb1和mAb2的全长抗体水平和周质可溶性重链水平的影响。(7A)上图显示通过非还原SDS-PAGE凝胶后用αFc抗体探测的Western印迹来分析的来自含有pBR-mSTII1-bSTII1-mAb1(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bSTII1S11L-mAb1(mSTII1,bSTII1S11L)、pBR-mSTII1-bDsbA1-mAb1(mSTII1,bDsbA1)和pBR-mSTII1-bDsbA1L11S-mAb1(mSTII1,bDsbA1L11S)的64B4的全细胞裂解物。箭头表示含重链的种类。中图显示提取、通过DTT还原并通过用αFc抗体探测的Western印迹来分析的来自相同样品的周质蛋白质。下图显示通过DTT还原并通过Western印迹分析的相同样品的1OD550沉淀中的总重链蛋白质。(7B)上图显示通过非还原SDS-PAGE凝胶后用αFc抗体探测的Western印迹来分析的来自含有pBR-mSTII1-bSTII1-mAb2(mSTII1,bSTII1)、pBR-mSTII1-bSTII1S11L-mAb2(mSTII1,bSTII1S11L)、pBR-mSTII1-bDsbA1-mAb2(mSTII1,bDsbA1)和pBR-mSTII1-bDsbA1L11S-mAb2(mSTII1,bDsbA1L11S)的64B4的全细胞裂解物。箭头表示含重链的种类。中图显示提取、通过DTT还原并通过SDS-PAGE凝胶后用αFc抗体探测的Western印迹来分析的来自相同样品的周质蛋白质。下图显示通过DTT还原并通过Western印迹分析的相同样品的1OD550沉淀中的总重链蛋白质。
发明详述
一般技术
本文描述或引用的技术和方法为本领域技术人员公知，并通常用常规方法利用，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等编辑,(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.)系列:PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane编辑(1988)；ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL；及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编辑(1987))中所述的广泛利用的方法。
定义
本文所用的术语“载体”旨在指能够转运与它连接的另一核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，其指其他DNA区段可以连接入其中的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中其他DNA区段可以连接入病毒基因组。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合入宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们有效连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
本文所用的术语“顺反子”旨在指大体等同于包含编码多肽链的核苷酸序列和相邻的控制区的翻译单位的遗传元件。“邻近控制区”包括例如翻译起始区(TIR；如下文中所定义)和终止区。
“多顺反子”表达载体指包含并在单个启动子的调控下表达多个顺反子的单个载体。多顺反子载体的常见实例是包含并在一个启动子控制下表达两种不同多肽的“双顺反子”载体。在表达双顺反子或多顺反子载体时，多个基因首先转录为单个转录单位，然后分别翻译。
本发明的“分开的顺反子”表达载体指包含至少两个分开的启动子-顺反子对的单个载体，其中每个顺反子处于其自己的启动子控制下。在表达分开的顺反子表达载体时，不同基因的转录和翻译过程都是分开的和独立的。
本文所用的“翻译起始区(translation initiation region)”或TIR或翻译起始区(translational initiation region)或翻译起始序列指提供目的基因的翻译起始效率的核算区域。通常，具体顺反子内的TIR涵盖核糖体结合位点(RBS)及RBS的5’和3’序列。RBS定义为最少包含Shine-Dalgarno区和起始密码子(AUG)。因此，TIR还包括至少部分待翻译的核酸序列。优选地，TIR包括顺反子内处于编码轻链或重链的序列之前的编码信号肽的分泌信号序列。TIR变体在TIR区内包含改变TIR特性(如下文定义的其翻译强度)的序列变体(尤其是取代)。优选地，本发明的TIR变体在顺反子内编码轻链或重链的序列之前的分泌信号序列的前2至约14、优选约4至12、更优选约6个密码子内包含序列取带。
本文所用的“翻译强度”指控制系统中的分泌多肽的测量，其中用一个或多个TIR变体来指导多肽的分泌，并将结果与相同培养和测定条件下的野生型TIR或一些其他对照相比较。
“信号肽”(也称为“信号序列”)指可用于指导新合成的目的蛋白质通过细胞膜(通常是原核生物的内膜或内膜和外膜二者)的短肽。分泌信号序列编码的信号肽对宿主细胞而言可以是内源的，或者它们可以是外源的，包括待表达的多肽的天然信号肽。信号肽通常存在于待表达的多肽的氨基端，且通常在生物合成和从胞质分泌多肽之间通过酶去除。因此，信号肽通常不存在于成熟蛋白质产物中。信号肽(例如原核信号肽，例如大肠杆菌信号肽)通常由三个不同区域组成：通常包含至少1或2个带正电荷的氨基酸残基的N端区、称为H区(也称为H结构域)的疏水核心区和信号肽酶识别的C端区。本领域技术人员知道如何确定给定信号肽的N端区、H区和C端区。
肽(或肽的部分)的“平均疏水性”指用以下公式计算的平均疏水性：肽(或肽的部分)的平均疏水性＝肽(或肽的部分)的总(总和)疏水性/肽(或肽的部分)中的氨基酸数。通过以下计算“总”或“总和”疏水性：(a)按照Eisenberg,D.等,J Mol Biol(1984)179:125-142.表I(126页)为肽(或肽的部分)中的每个氨基酸指定归一化共有疏水性值，然后加和肽(或肽的部分)中的氨基酸的归一化共有疏水性值。在一些实施方案中，计算信号肽的H结构域的平均疏水性。
“有效连接的”指两种或多种成分的并列，其中所述成分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系中。例如，如果启动子顺式作用来控制或调节所连接的序列的转录，则它与编码序列有效连接。通常，但并非必然，“有效连接的”DNA序列是相邻的，且在有必要连接两个蛋白质编码区时或在分泌前导序列的情况下是相邻和符合可读框的。但是，虽然有效连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它并非必然与它相邻。有效连接的增强子可以位于编码序列上游、编码序列内或编码序列下游，且距启动子相当的距离。通过本领域已知重组方法来实现连接，例如，使用PCR方法，通过退火，或通过在方便的限制位点处连接。如果不存在方便的限制位点，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
本文所用的“调节元件”指顺式存在的将编码异源多肽的多核苷酸转录和翻译为多肽所必需的核苷酸序列。转录调节元件通常包含待表达的基因序列5’的启动子、转录起始和终止位点及多腺苷酸化信号序列。术语“转录起始位点”指构建体中对应于掺入初级转录物(即mRNA前体)的第一核酸的核酸；转录起始位点可以与启动子序列重叠。
“启动子”指控制与之有效连接的基因或序列的转录的多核苷酸序列。启动子包括RNA聚合酶结合和转录起始的信号。所使用的启动子将在考虑在其中表达所选择的序列的宿主细胞的细胞类型中具有功能。大量来自多种不同来源的启动子(包括组成型、诱导型和阻抑型启动子)为本领域公知(并在诸如GenBank的数据库中标识)，并可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(来自例如诸如ATCC的保藏所以及其他商业或个人来源)。对于诱导型启动子，启动子的活性响应信号而提高或降低。
本文所用的术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)旨在指已进行遗传改变或能够通过引入外源多核苷酸(如重组质粒或载体)进行遗传改变的细胞。应理解，这类术语旨在不仅指具体个体细胞，还指这种细胞的后代。由于连续世代中可发生由突变或环境影响引起的某些修饰，这种后代实际上可以与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
“分离的”多肽(例如抗体)是已鉴定并从其天然环境的成分分开/取出的多肽。其天然环境的污染成分是干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，将多肽纯化至：(1)通过Lowry法测定多肽高于95wt％，最优选高于99wt％；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)使用考马斯蓝染色或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)显示同质。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为将不存在至少一种该多肽的天然环境的成分。但是，通常将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
“分离的”核酸分子是从在该核酸的天然来源中通常与之结合的至少一种污染核酸分子鉴定和分开的核酸分子。分离的核酸分子处于不同于见于自然界中的形式或背景。
本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任意长度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任意底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。核苷酸的序列可以由非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，如通过与标记缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的连接(例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些，包含悬垂部分(例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))的那些，具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些，包含螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些，包含烷化剂的那些，具有修饰的连接的那些(例如α异头核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖中的任意羟基可以例如通过膦酸基团、磷酸基团取代，通过标准保护基团保护，或活化以制备与附加核苷酸的附加连接，或可以缀合至固体或半固体支持物。5’和3’端OH可以磷酸化或用1至20个碳原子的胺或有机帽化基团部分取代。其他羟基也可以衍生至标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域公知的核糖或脱氧核糖的类似物形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物和碱性核苷类似物如甲基核苷。可以用备选的连接基团取代一个或多个磷酸二酯键。这些备选的连接基团包括但不限于其中用P(O)S(“硫代”)、P(S)S(“二硫代”)、(O)NR2(“酰胺”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“formacetal”)取代磷酸的实施方案，其中每个R或R'独立地是H或可选地包含醚(-O-)键的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸中的所有键无需相同。前面的描述适用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
本文所用的“寡核苷酸”指短的、通常为单链、通常合成的多核苷酸，其长度通常但并非必然小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥。以上针对多核苷酸的描述同等地和完全地适用于寡核苷酸。
本文所用的“多肽”泛指来自任意细胞来源的具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白质。“异源”多肽是对所利用的宿主细胞而言为外来的那些多肽，如通过大肠杆菌产生的人蛋白质。虽然异源多肽可以是原核的或真核的，但优选它是原核的，更优选哺乳动物的，最优选人的。优选地，它是重组产生的多肽或重组多肽。“异源”多态是对所利用的宿主细胞而言为外来的那些多肽，如通过大肠杆菌产生的人蛋白质。虽然异源多肽可以是原核的或真核的，但优选它是原核的，更优选哺乳动物的，最优选人的。优选地，它是重组产生的多肽或重组多肽。
哺乳动物多肽的实例包括诸如以下的分子：例如，肾素；生长激素，包括人生长激素、牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；血小板生成素；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其变体，如RETEVASETM和TNKASETM；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；结合ErbB2胞外结构域中的区域(例如，从ErbB2的约残基22至约残基584(包含)的区域中的任意一个或多个残基)的抗一个或多个ErbB2结构域的抗体，如2C4(WO 01/00245；杂交瘤ATCC HB-12697)；脑啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如脑衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF；心肌营养蛋白(心肌肥大因子)，如心肌营养蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；抗HER-2抗体；Apo2配体；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；抗体；及任意上列多肽的片段。
在一些实施方案中，本文的多肽包括：人血清白蛋白(HSA)；2C4；组织因子；抗组织因子；抗CD20；抗HER-2；调蛋白；抗IgE；抗CD11a；抗CD18；VEGF和受体及其抗体，如rhuFabV2和AVASTINTM；生长激素及其变体，如hGH；生长激素受体；生长激素释放蛋白(GHRP)；LIV-1(EP 1,263,780)；TRAIL；肿瘤坏死因子(TNF)及其抗体；TNF受体和相关抗体；TNF受体-IgG；TNF受体相关因子(TRAF)及其抑制剂；因子VIII；因子VIII B结构域；干扰素，如干扰素-γ；转化生长因子(TGF)，如TGF-β；抗TGF，如抗TGF-β；激活蛋白；抑制蛋白；抗激活蛋白；抗抑制素；组织型纤溶酶原激活物及其变体，如t-PA、RETEPLASETM和TNK酶；抗Fas抗体；Apo-2配体；Apo-2配体抑制剂；Apo-2受体；Apo-3；凋亡因子；Ced-4；DcR3；死亡受体和激动抗体(DR4、DR5)；淋巴毒素(LT)；催乳素；催乳素受体；SOB蛋白；WISP(wnt诱导分泌蛋白)；神经毒素-3(NT-3)；神经生长因子(NGF)和抗NGF；DNA酶；肝炎抗原；单纯疱疹抗原；瘦蛋白；胰岛素样生长因子(IGF)，如IGF-1和IGF-2，及其结合蛋白和受体，如IGFBP-1-IGFBP-6；胰岛素；成纤维细胞生长因子(FGF)，如FGF-17；Toll蛋白；TIE配体；CD40和抗CD40；免疫黏附素；枯草蛋白酶；肝细胞生长因子(HGF)；血小板生成素(TPO)；白介素，如IL-2、IL-12、IL-17、IL-22、IL-8、IL-9，及其抗体；及前列腺特异性癌抗原(PSCA)。
尤其优选的多肽是重组多肽，在一些实施方案中是抗体，其包括单克隆抗体和人源化抗体。这类抗体可以是全长抗体或抗体片段。在一些实施方案中，这些抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗c-met、抗IgE、抗CD18、抗VEGF、抗组织因子、2C4、抗Her-2、抗CD20、抗CD40或抗CD11a抗体。涵盖在多肽的定义之内的抗体片段在一些实施方案中包含轻链，在一些实施方案中包含κ轻链。这类示例性片段包括例如Fab、Fab′、F(ab′)2或F(ab′)2-亮氨酸拉链(LZ)融合和单臂抗体。
蛋白质“表达”指将基因中所编码的信息转化为信使RNA(mRNA)，然后转化为蛋白质。
“免疫缀合物”(可互换地称为“抗体-药物缀合”或“ADC”)指与一种或多种细胞毒剂缀合的抗体，该细胞毒剂如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射性缀合物)。
“阻断”抗体或抗体“拮抗剂”是抑制或降低它所结合的抗原的生物学活性的抗体。在一些实施方案中，阻断抗体或拮抗抗体完全抑制抗原的生物学活性。
本文所用的“激动抗体”是模拟目的多肽(例如HGF)的至少一种功能活性的抗体。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指内在的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可表示为解离常数(Kd)。希望地，Kd为1x 10-7、1x 10-8、5x 10-8、1x 10-9、3x 10-9、5x 10-9、或甚至1x 10-10或更强。亲和力可以通过本领域公知的方法来测量，包括本文中所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并趋于保持结合更长时间。多种测量结合亲和力的方法为本领域已知，其中任何一种都可以用于本发明的目的。下文描述具体的说明性实施方案。在一个实施方案中，通过用以下测定所述的Fab形式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量本发明的“Kd”或“Kd值”，该以下测定通过在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(125I)-标记抗原平衡Fab，然后用抗-Fab抗体包被的平板捕获结合的抗原，来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen等,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881)。为了确定用于测定的条件，用含5μg/ml捕获抗-Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)过夜包被微量滴定板(Dynex)，然后用含2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS在室温(约23℃)封闭2至5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目的Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等,(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后过夜孵育目的Fab；但是，孵育可以持续更长时期(例如65小时)，以确保达到平衡。然后，将混合物转移至捕获平板进行室温孵育(例如孵育1小时)。然后去除溶液，用含0.1％吐温-20的PBS洗涤平板8次。平板干燥后，加入150μl/孔的闪烁体(MicroScint-20；Packard)，在Topcountγ计数器(Packard)上计数平板10分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每种Fab的浓度用于竞争结合测定。根据另一实施方案，用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，在25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用表面等离振子共振测定来测量Kd或Kd值。简言之，按照厂家说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIAcore,Inc.)。用10mM醋酸钠pH 4.8将抗原稀释为5μg/ml(～0.2μM)，然后按5μl/分钟的流速注入，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺，以封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃下注入两倍系列稀释于含0.05％吐温-20的PBS(PBST)中的Fab(0.78nM至500nM)。在一些实施方案中，将以下修改用于表面等离振子共振测定法：将抗体固定至CM5生物传感芯片，以达到约400RU，对于动力学测量，按约30μl/分钟的流速在25℃下注入两倍系列稀释于PBST中的靶蛋白。通过同时拟合结合和解离传感图，用简单的1:1Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen,Y.等,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过106M-1S-1，则可以通过使用萦光淬灭技术来测定结合速率，如在分光计，如装配停流的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，该技术在浓度递增的抗原存在下测量含20nM抗抗原的抗体(Fab形式)的PBS pH7.2在25℃下的萦光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低。
本发明的“结合速率”或“kon”也可以用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片，在25℃下使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，用相同的表面等离振子共振技术测定。简言之，按照厂家说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5,BIAcore,Inc.)。用10mM醋酸钠pH 4.8将抗原稀释为5μg/ml(～0.2μM)，然后按5μl/分钟的流速注入，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺，以封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃下注入两倍系列稀释于含0.05％吐温-20的PBS(PBST)中的Fab(0.78nM至500nM)。在一些实施方案中，将以下修改用于表面等离振子共振测定法：将抗体固定至CM5生物传感芯片，以达到约400RU，对于动力学测量，按约30μl/分钟的流速在25℃下注入两倍系列稀释于PBST中的靶蛋白。通过同时拟合结合和解离传感图，用简单的1:1Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Softwareversion3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值koff/kon。参见例如Chen,Y.等,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。但是，如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过106M-1S-1，则优选通过使用萦光淬灭技术来测定结合速率，如在分光计，如装配停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，该技术在浓度递增的抗原存在下测量含20nM抗抗原的抗体(Fab形式)的PBS pH7.2在25℃下的萦光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的提高或降低。
“裸抗体”是未与异源分子(如细胞毒性部分或放射性标记)缀合的抗体。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体是这样的抗体，其具有一种
为了筛选结合目的抗体所结合的抗原上的表位的抗体，可以进行常规交叉阻断测定，如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow和David Lane编辑(1988)中所述的交叉阻断测定。
为了增加包含本发明的氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期，可以按例如美国专利5,739,277中所述将挽救受体结合表位附着于抗体(尤其是抗体片段)。例如，可以将编码挽救受体结合表位的核酸分子符合读框地连接至编码本发明的多肽序列的核酸，使得通过该改造的核酸分子表达的融合蛋白质包含挽救受体结合表位和本发明的多肽序列。本文所用的术语“挽救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区的负责增加IgG分子的体内血清半衰期的表位(例如，Ghetie等,Ann.Rev.Immunol.18:739-766(2000),表1)。在其Fc区中具有取代且血清半衰期增加的抗体还描述于WO00/42072；WO 02/060919；Shields等,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Hinton,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004)中。在另一实施方案中，也可以例如通过附着其他多肽序列来增加血清半衰期。例如，用于本发明方法的抗体或其他多肽可以附着于血清白蛋白或血清白蛋白的结合FcRn受体的部分或血清白蛋白结合肽，使得血清白蛋白结合抗体或多肽，例如，这类多肽序列公开于WO01/45746中。在一个优选实施方案中，待附着的血清白蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:48)。在另一实施方案中，通过这些方法增加Fab的半衰期。对于血清白蛋白结合肽序列，还参见Dennis等J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)。
“片段”指多肽或核酸分子的部分，优选地，其包含参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。片段可以包含10、20、30、40、50、60、70、80、90、or 100、200、300、400、500、600或更多个核苷酸，或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、190、200个氨基酸或更多。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望得到的抗原结合活性。
“抗体片段”指除完整抗体以外，包含完整抗体的结合该完整抗体所结合的抗原的部分的分子。抗体片段的实例包括但不限于Fv；Fab；Fab'；Fab’-SH；F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及从抗体片段形成的多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定中使参考抗体与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，反之，参考抗体在竞争测定中使该抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。本文提供示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体指这样的抗体，其中部分重链和/或轻链源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同的来源或物种。
抗体的“种类”指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要的抗体种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文用术语“Fc区”来定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号按照EU编号系统，也称为EU指数，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“构架”或“FR”指高变区(HVR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由4个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常按以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有基本类似于天然抗体结构的结构或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或源自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表一系列人免疫球蛋白VL或VH构架序列中最常出现的氨基酸残基的构架。通常，该系列人免疫球蛋白VL或VH序列来自可变结构域序列亚组。通常，该序列亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如Kabat等,上文中的κI亚组。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如Kabat等,上文中的III亚组。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，而全部或基本上全部FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以可选地包含至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已进行了人源化的抗体。
本文所用的术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构确定的环(“高变环”)和/或包含抗原接触残基(“抗原接触残基”)的区域中的每一个。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文的示例性HVR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))处的高变环；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3),31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))处的CDR；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996))处的抗原接触残基；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中按照Kabat等,上文编号。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，且明确涵盖具有多表位特异性的抗体。这类多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中该VHVL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单位结合不同的表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv；双抗体；双特异性双抗体和三抗体；共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合一个或多个相同或不同靶标上的两个或多个不同表位的能力。“单特异性”指仅结合一种表位的能力。根据一个实施方案，该多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。
术语“单臂抗体”指包含以下的抗体：(1)通过肽键连接至含有CH2结构域、CH3结构域或CH2-CH3结构域的多肽的可变结构域；及(2)第二CH2、CH3或CH2-CH3结构域，其中可变结构域未通过肽键连接至含有该第二CH2、CH3或CH2-CH3结构域的多肽。在一个实施方案中，该单臂抗体包含3条多肽：(1)含有可变结构域(例如VH)、CH1、CH2和CH3的第一多肽；(2)含有可变结构域(例如VL)和CL结构域的第二多肽；及(3)含有CH2和CH3结构域的第三多肽。在一个实施方案中，该第三多肽不包含可变结构域。在另一实施方案中，该单臂抗体具有部分铰链区，该部分铰链区包含形成连接恒定重链的二硫键的两个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，该单臂抗体的可变结构域形成抗原结合区。在另一实施方案中，该单臂抗体的可变结构域是单可变结构域，其中每个单可变结构域是抗原结合区。
本文中提到的“杵入臼”或“KnH”技术指通过在它们相互作用的界面上，在一条多肽中引入凸起(杵)，在另一条多肽中引入凹陷(臼)，来指导两条多肽在体外或体内配对在一起的技术。例如，已在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面引入KnH(例如US2007/0178552；WO96/027011；WO 98/050431；Zhu等(1997)Protein Science 6:781-788)。这尤其用于在制备多特异性抗体期间驱动两条不同的重链配对在一起。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与各Fc区连接的单可变结构域，或进一步包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同的重链可变结构域。KnH技术还可以用来使两个不同的受体胞外域或包含不同靶标识别序列的任意其他多肽序列(例如，包括亲和体、肽体和其他Fc融合)配对在一起。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和剩余的“Fc”片段(反映其易结晶的能力的命名)。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原的两个二硫键连接的Fab片段。Fab’片段与Fab片段的不同在于，在CH1结构域的羧基端具有几个附加的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有自由巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其他化学偶联。
本文所用的术语“免疫黏附素”指将异源蛋白质(“黏附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相组合的分子。在结构上，免疫黏附素包含具有希望得到的结合特异性的氨基酸序列(该氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合部位(即与抗体的恒定区相比是“异源的”))和免疫球蛋白恒定结构域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)。示例性黏附素序列包括含有与目的蛋白质结合的受体或配体的部分的相邻氨基酸序列。黏附素序列还可以是结合目的蛋白质但不是受体或配体序列的序列(例如肽体中的黏附素序列)。这类多肽序列可以通过包括噬菌体展示技术和高通量分选方法的多种方法来选择或鉴定。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以获自任意免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
抗体或半抗体背景中的“铰链区”一般定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。可以通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同的位置上来将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列对齐。
Fc区的“下铰链区”通常定义为刚好处在铰链区C端的残基序列，即Fc区的残基233至239。在本发明之前，通常将FcγR结合归因于IgG Fc区的下铰链区中的氨基酸残基。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG约残基231延伸至约残基340。CH2结构域的独特性在于它未与另一结构域紧密配对。相反，两个N连接的分枝糖链插入在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测糖类可以提供结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这类效应子功能一般需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，且可以用例如本文定义中公开的多种测定来评估。
“天然序列Fc区”包含与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如从约一个至约十个氨基酸取代，且优选从约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，最优选与之具有至少约90％同源性，更优选与之具有至少约95％同源性。
本文所用的“Fc复合物”指相互作用在一起的Fc区的两个CH2结构域和/或相互作用在一起的Fc区的两个CH3结构域，其中该CH2结构域和/或该CH3结构域通过不是肽键的键和/或力(例如范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)相互作用。
本文所用的“Fc成分”指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。
本文所用的“Fc CH成分”或“FcCH”指包含Fc区的CH2结构域、CH3结构域或CH2和CH3结构域的多肽。
本文所用的“抗体突变体”或“抗体变体”指抗体的氨基酸序列变体，其中修饰了物种依赖性抗体的一个或多个氨基酸残基。这类突变体必然与物种依赖性抗体具有小于100％的序列同一性或相似性。在一个实施方案中，该抗体突变体将具有与物种依赖性抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％和最优选至少90％氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。就此序列而言的同一性或相似性在本文中定义为，对齐序列并根据需要引入缺口来达到最大百分比序列同一性之后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即来自基于共同侧链特性的同一组的氨基酸残基，参见下文)的氨基酸残基的百分比。在一些实施方案中，N端、C端或内部延伸、缺失或插入可变结构域外侧的抗体序列没有一个应解释为影响序列同一性或相似性。
“障碍”或“疾病”是可从用本发明的物质/分子或方法治疗受益的任意病症。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易感所讨论的障碍的那些病理学病症。本文要治疗的障碍的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；癌、胚细胞瘤和肉瘤。
“处理”指治疗性处理和预防性或防止性措施二者。需要处理的那些包括已经患有良性、癌前或非转移性肿瘤的那些，以及其中有待预防癌症的发生或复发的那些。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中治疗或预防疾病或障碍的治疗剂的量。在癌症的情况下，治疗剂的治疗有效量可以减少癌细胞的数目；减小原发肿瘤大小；抑制(即在某种程度上减慢和优选阻止)癌细胞浸润入外周器官；抑制(即在某种程度上减慢和优选阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与该障碍相关的一种或多种症状。在药物可以阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以是细胞抑制剂和/或细胞毒剂。对于癌症治疗，可以例如通过评估存活期、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量体内功效。
本文的“自身免疫病”是源自个体自身组织并针对个体自身组织的非恶性疾病或障碍。本文的自身免疫病明确排除恶性或癌性疾病或病症，其尤其包括B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、多毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自身免疫疾病或障碍的实例包括但不限于：炎症反应，如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(例如遗传过敏性皮炎)；全身性硬皮病和硬化；炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关反应；呼吸窘迫综合征(包括成人型呼吸窘迫综合征；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；变应性病症，如湿疹和哮喘，及其他涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症；动脉粥样硬化；白细胞黏附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化；Reynaud综合征；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；Sjorgen综合征；幼年型糖尿病；通常见于结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中的与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和延迟超敏反应相关的免疫反应；恶性贫血(Addison病)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性障碍；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或Coombs阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜病；抗磷脂综合征；变应性神经炎；Graves病；Lambert-Eaton肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺病；Reiter病；stiff-man综合征；Behcet病；巨细胞动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常表征为细胞生长失调的生理病症。此定义包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指不是浸润性或转移性的，且分类为0、I或II期癌症的癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤(包括成神经管细胞瘤和成视网膜细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施万细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这类癌症更具体的实例包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤、以及头颈癌和多发性骨髓瘤。
术语“癌前的”指通常限于癌症或发展为癌症的病症或生长。“癌前”生长将具有表征为异常细胞周期调控、增殖或分化的细胞，其可以通过细胞周期调控、细胞增殖或分化的标记来测定。
“发育异常”指组织、器官或细胞的任何异常生长或发育。优选地，发育异常为高级或癌前。
“转移”指癌症从其原发部位扩散至身体其他地方。癌细胞可以从原发肿瘤逸出，渗透进入淋巴管和血管，通过血流循环，并在身体中其他地方的正常组织中的远端病灶中生长(转移)。转移可以是局部或远端转移。转移是顺次的过程，肿瘤细胞偶然从原发肿瘤脱离，通过血流移动，并在远端部位停下。在新部位处，细胞建立血液供应，并可以生长形成威胁生命的实体。
肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径都调节此行为，远端部位中肿瘤细胞和宿主细胞之间的相互作用也显著。
“非转移的”指良性或保留在原发部位而未渗透进入淋巴管或血管系统或渗透至原发部位之外的组织的癌症。通常，非转移性癌症是任意癌症，其是0、I或II期癌症，偶尔是III期癌症。
“原发性肿瘤”或“原发性癌症”指最初的癌症，而不是定位在该个体身体中的另一组织、器官或位置中的转移病灶。
“良性肿瘤”或“良性癌症”指定位在原部位且不具有浸润、浸入或转移至远端部位的能力的肿瘤。
“肿瘤负担”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的大小或癌症的量。肿瘤负担也称为肿瘤负荷。
“肿瘤数目”指肿瘤的数目。
“个体”指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、羊或猫。优选地，该个体是人。
术语“抗癌治疗”指用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括但不限于：例如，化疗剂；生长抑制剂；细胞毒剂；用于放射治疗的药物；抗血管发生剂；凋亡剂；抗微管蛋白剂；其他治疗癌症的药物；抗CD20抗体；血小板衍生生长因子抑制剂(例如GleevecTM(甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate)))；COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))；干扰素；细胞因子；结合一种或多种以下靶标的拮抗剂(例如中和抗体)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2；及其他生物活性剂和有机化学剂等。本发明还包括其组合。
本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞的功能和/或导致细胞的破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素，或其片段。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括：烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；乙撑亚胺(ethylenimine)和methylamelamine，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚胺嗪(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和trimethylolomelamine；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是番荔枝内酯(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)；苔藓虫素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；cryptophycin(尤其是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、cholophosphamide、磷雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosurea)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和ranimnustine；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1和加利车霉素ω1(参见例如Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；二膦酸盐，如氯膦酸二钠(clodronate)；esperamicin；以及新制癌菌素色基和相关色蛋白烯二炔类抗生素色基)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、chromomycinis、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
Figure GDA0001334422310000471
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、派来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、氨甲喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟脲苷(doxifluridine)、依诺他宾(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸曲他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素(anti-adrenal)，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羟吡咔唑(elliptiniumacetate)；埃坡霉素(epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)，如美登素(maytansine)和美坦西醇(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure GDA0001334422310000481
多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；脱乙酰长春花碱(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，例如
Figure GDA0001334422310000482
紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、紫杉醇的无Cremophor的清蛋白改造纳米颗粒制剂ABRAXANETM(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和
Figure GDA0001334422310000483
doxetaxel(
Figure GDA0001334422310000484
-Poulenc Rorer,Antony,法国)；chloranbucil；
Figure GDA0001334422310000485
吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春花新碱(vincristine)；
Figure GDA0001334422310000486
长春烯碱(vinorelbine)；二羟蒽二酮(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；xeloda；伊班磷酸(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和leucovorin的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醛，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；combretastatin；VELCADE硼替佐米(bortezomib)；REVLIMID来那度胺(lenalidomide)；leucovorin(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如埃罗替尼(erlotinib)(TarcevaTM))和VEGF-A抑制剂；及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。
此定义还包括发挥作用来调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
Figure GDA0001334422310000491
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifine)；抑制芳香酶(其调节肾上腺中的雌激素产生)的芳香酶抑制剂，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、
Figure GDA0001334422310000492
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、
Figure GDA0001334422310000493
依西美坦(exemestane)、formestanie、法倔唑(fadrozole)、
Figure GDA0001334422310000494
伏氯唑(vorozole)、
Figure GDA0001334422310000495
来曲唑(letrozole)和
Figure GDA0001334422310000496
阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)、以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环胞嘧啶核苷类似物)；反义寡核苷酸，尤其是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因(例如PKC-α、Raf和H-Ras)表达的那些；核酶，如VEGF表达抑制剂(例如
Figure GDA0001334422310000497
核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，如基因治疗疫苗，例如，
Figure GDA0001334422310000498
疫苗、
Figure GDA0001334422310000499
疫苗和
Figure GDA00013344223100004910
疫苗，
Figure GDA00013344223100004911
rIL-2；
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拓扑异构酶1抑制剂；
Figure GDA00013344223100004913
rmRH；长春烯碱(vinorelbine)和Esperamicins(参见美国专利号4,675,187)；及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。
本申请中所用的术语“前体药物”指药物活性物质的前体或衍生形式，与亲本药物相比，其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，且能够通过酶激活或转化为更具活性的亲本形式。参见例如Wilman,“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransactions,14,375-382页,615th Meeting Belfast(1986)；及Stella等,“Prodrugs:AChemical Approach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery,Borchardt等,(编辑),247-267页,Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于：包含磷酸的前体药物、包含硫代磷酸的前体药物、包含硫酸的前体药物、包含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的药物、糖基化的前体药物、包含β-内酰胺的前体药物、包含可选地取代的苯氧乙酰胺的前体药物或包含可选地取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶及可以转化为更具活性的细胞毒性游离药物的其他5-氟胞嘧啶前体药物。可以衍生为用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上文所述的那些化疗剂。
“放射治疗”指用定向γ射线或β射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制其正常执行功能的能力或彻底破坏细胞。应理解，本领域存在确定处理的剂量和持续时间的许多已知方式。典型的处理作为一次性施用提供，典型的剂量在每天10至200单位(戈瑞)的范围内。
“生物活性”或“功能性”多肽(如异源多肽)是能够在结构、调节、生物化学或生物物理事件中发挥其一种或多种天然活性的多肽。
“生物活性”或“功能性”抗体是能够在结构、调节、生物化学或生物物理事件中发挥其一种或多种天然活性的抗体。例如，生物活性抗体可以具有特异性结合抗原的能力，且该结合可以转而引出或改变细胞或分子事件，如信号转导或酶活性。生物活性抗体还可以阻断受体的配体激活或作为激动抗体发挥作用。抗体发挥其一种或多种天然活性的能力取决于几个因素，包括多肽链的正确折叠和组装。
本发明的组合物及使用本发明的组合物的方法
本文提供使用适合用于例如产生异源多肽(例如抗体，例如全长抗体)的方法的信号肽和变体信号肽的方法。用于表征信号肽的方法为本领域已知。在一个方案中，信号肽通常由三个不同区域组成：包含1或2个带正电荷的氨基酸残基的N端区、通常称为H区(也称为H结构域)的疏水核心区和信号肽酶识别的C端区。在一些实施方案中，H区长度约为10-16个残基。信号肽的疏水性可以用Eisenberg量表计算。参见Eisenberg,D.等,J Mol Biol(1984)179:125-142。简言之，为每个氨基酸指定归一化的共有疏水性值(参见Eisenberg,等上文的表I(126页))。通过加和信号肽的每个氨基酸的共有疏水性值来计算总和疏水性(也称为总疏水性)(或者，例如，为了计算H区的总疏水性值，将H区中每个氨基酸的共有疏水性值加和)。平均疏水性用以下公式计算：平均疏水性＝总(总和)疏水性/氨基酸数。在一些实施方案中，计算整个信号肽的平均疏水性。在一些实施方案中，计算H区(也称为H结构域)的平均疏水性。
信号肽序列的突变可以用本领域已知的方法进行。用于以这种方式遗传修饰DNA的技术已综述于Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson编辑,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中，且包括例如定位诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。用于诱变的其他方法包括QuickChange定位诱变和重叠延伸PCR。
在另一方面，提供具有比DsbA信号肽高的平均疏水性(例如，H区的平均疏水性，或整个信号肽的平均疏水性)的信号肽的用途，例如，用于本发明的任意方法，例如，制备异源多肽(例如抗体)，从细胞分泌异源多肽，制备可溶性异源多肽，分泌可溶性异源多肽至周质，制备成熟异源多肽，分泌成熟异源多肽至周质，易位异源多肽，优化异源多肽的分泌。具有比DsbA高的平均疏水性的示例性信号肽包括：FlgI、NikA、AsmA、TolB、YraI、FecB、CemH、TreA、FocC、TraU、SfmL、TorT、SfmC。
在一些实施方案中，第一信号肽的平均疏水性高于约0.5。在一些实施方案中，第一信号肽的平均疏水性高于约0.6。在一些实施方案中，第一信号肽的平均疏水性高于约0.7。在一些实施方案中，第一信号肽的平均疏水性高于约0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7或更高。在一些实施方案中，第二信号肽的平均疏水性高于约0.6。在一些实施方案中，第二信号肽的平均疏水性高于约0.7。在一些实施方案中，第二信号肽的平均疏水性高于约0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.7或更高。在一些实施方案中，第一和第二信号肽的平均疏水性相似(例如大致等同)。在一些事上，第一和第二信号肽的平均疏水性不同。
DsbA和STII信号肽为本领域公知。DsbA和STII信号肽的序列显示在表7和8中。DsbA和STII N端区、H区和C端区的序列显示在表7和8中。
用于表征异源多肽的产生和分泌的方法为本领域已知，本文中描述和示例了一些方法。例如，培养含有编码与异源蛋白质(例如抗体)有效连接的变体信号肽的一个或多个表达载体的宿主菌株，并提取多肽。可溶性级分通过非还原SDS-PAGE电泳分开后进行Western印迹分析，以确定所产生的全长异源蛋白质的水平。如本领域公知，例如通过对分离自Western凝胶上的条带的蛋白质进行Edman测序，并将分离的多肽表征为具有或缺乏信号肽，可以确定成熟多肽和前体多肽的存在或缺乏或水平。全长抗体(或例如其他异源多体蛋白质)的产生可以通过在变性条件下运行Western印迹来确定。异源多肽(例如抗体)的活性可以用本领域公知的常规功能测定来测定。例如，结合活性可以用ELISA、Biacore和本领域公知的其他方法测试。其他功能可以根据具体异源多肽的需要用本领域公知的测定来测试。
翻译起始区(TIR)是蛋白质的总体翻译水平的主要决定因素。TIR包括编码信号序列的多核苷酸，且从Shine-Delgarno序列的刚好上游延伸至起始密码子下游大约20个核苷酸。此多核苷酸序列的修饰(在一些实施方案中，编码信号肽的序列的前约2至约14、约4至12、约6个密码子内的修饰)可以改变翻译起始的效率，从而调节下游蛋白质的翻译水平。TIR具有不同的翻译强度。在一些实施方案中，第一和第二翻译起始区(例如与第一和第二异源多肽有效连接)(在一些实施方案中，例如与第三异源多肽有效连接的第三翻译起始区)提供大致相等的翻译强度。在一些实施方案中，相对翻译强度约为1或2。在一些实施方案中，相对翻译强度约为1。在一些实施方案中，相对翻译强度约为2。在一些实施方案中，相对翻译强度为1和/或2。在一些实施方案中，相对翻译强度约为3或约为4。在一些实施方案中，相对翻译强度选自1、2、3、4、5或更多(如6或7或更多)中的一个或多个。在一些实施方案中，第一和第二TIR的相对翻译强度约为1。在一些实施方案中，第一和第二TIR的相对翻译强度(也称为TIR强度)约为2。在一些实施方案中，第一、第二和第三TIR的相对翻译强度约为1。在一些实施方案中，第一、第二和第三TIR的相对翻译强度约为2。在一些实施方案中，相对翻译强度为约2、约3、约4、约5、约6、约7或更多，如约8、约9或更多。在一些实施方案中，相对翻译强度在1和3之间、2和4之间、3和5之间、4和6之间、5和7之间或6和8之间。在一些实施方案中，相对翻译强度在2和5之间、3和7之间、或4和8之间。在一些实施方案中，第一和/或第二信号肽的相对翻译强度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、或约8。在一些实施方案中，第一信号肽的相对翻译强度为约5，第二信号序列的相对翻译强度为约8。在一些实施方案中，第一和第二TIR的相对翻译强度大致等同。在一些实施方案中，第一和第二TIR的相对翻译强度不同。
在一些实施方案中，编码信号肽(如变体信号肽)的多核苷酸将在具有适合用于表达目的基因的元件的载体中提供。在一些实施方案中，该载体包含信号序列5’的启动子，信号序列3’的用于插入目的基因或报道基因的限制酶识别位点，及用于选择和/或维持用所产生的质粒转化的细菌的选择标记，如药物抗性标记。本文中进一步讨论和示例质粒载体。适合用于原核宿主的启动子为本领域已知，一些在本文中示例和描述。
可以使用可以某种方式定量的任意报道基因。因此，例如，可以定量碱性磷酸酶产生作为phoA基因产物分泌水品的测量。其他实例包括例如β-内酰胺酶基因。
多肽的分泌水平可以例如通过目的多肽的功能测定(如果可用)、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)或通过PAGE和目的多肽正确分子量的显示来测定。用于测定分泌多肽的水平的方法为本领域公知，一些在本文中示例。
多肽
示例性异源多肽包括跨膜分子(例如受体，如受体酪氨酸激酶)或配体，如生长因子。示例性异源多肽包括诸如以下的分子：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和von Willebrands因子；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(regulated onactivation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGFβ；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如HER2、HER3或HER4受体；及任意上列多肽的片段。
明确考虑免疫黏附素作为本发明的异源多肽。
抗体
抗体或异源多体多肽或多肽或免疫黏附素的示例性靶标包括但不限于以下列表：
BMPI、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGFI(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNAI、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNBI、IFNG、IFNWI、FELI、FELI(EPSELON)、FELI(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSFIO(TRAIL)、TNFSF1I(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILIR1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILIORA、ILIORB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIFI、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN、THPO、CCLI(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-la)、CCL4(MIP-lb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLH(eotaxin)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-ld)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)、CCL25(TECK)、CCL26(eotaxin-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDFI)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(lymphotactin)、XCL2(SCM-lb)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TERI/CKR-LI)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLI(VSHKI)、CCRL2(L-CCR)、XCRI(GPR5/CCXCRI)、CMKLRI、CMKORI(RDCI)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCRIO)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCPIO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCCIO(CIO)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDFIA、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREMI、TREM2、VHL、ABCFI、ACVRI、ACVRIB、ACVR2、ACVR2B、ACVRLI、AD0RA2A、Aggrecan、AGR2、AICDA、AIFI、AIGI、AKAPI、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPTI、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOCI、AR、AZGPI(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、BAD、BAFF(BLys)、BAGI、BAH、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRI(MDR15)、BMPI、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPRIA、BMPRIB、BMPR2、BPAGI(网蛋白)、BRCAI、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANTI、CASP1、CASP4、CAVI、CCBP2(D6/JAB61)、CCLI(1-309)、CCLII(eotaxin)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MlP-ld)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MTP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/eotaxin-2)、CCL25(TECK)、CCL26(eotaxin-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MTP-la)、CCL4(MDP-lb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNAI、CCNA2、CCNDI、CCNEI、CCNE2、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TERI/CKR-LI)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLI(VSHKI)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CDIC、CD20、CD200、CD22、CD24、CD28、CD3、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CDHI(E-钙黏着蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKNIA(p21Wapl/Cipl)、CDKNIB(p27Kipl)、CDKNIC、CDKN2A(P16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CERI、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(密蛋白-7)、CLN3、CLU(簇蛋白)、CMKLRI、CMKORI(RDCI)、CNRI、COL18A1、COLIAI、COL4A3、COL6A1、CR2、CRP、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTNNBI(b-联蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYDI)、CX3CR1(V28)、CXCLI(GROI)、CXCL10(IP-10)、CXCLII(l-TAC/IP-9)、CXCL12(SDFI)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2、(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYCI、CYSLTRI、DAB2IP、DES、DKFZp451J01 18、DNCLI、DPP4、E2F1、ECGFI、EDGI、EFNAI、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、EN01、EN02、EN03、EPHB4、EPO、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、ESRI、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCERIA、FCER2、FCGR3A、FGF、FGFI(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FELI(EPSILON)、FILI(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRTI(纤连蛋白)、FLTI、FOS、FOSLI(FRA-I)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEBI、GAGECI、GALNAC4S-6ST、GAT A3、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNASI、GNRHI、GPR2(CCRIO)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCCIO(CIO)、GRP、GSN(绒毛蛋白)、GSTPI、HAVCR2、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIFIA、HDPI、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOXI、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNAI、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNγ、DFNWI、IGBPI、IGFI、IGFIR、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-I、IL10、MORA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL-12、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、IL1A、IL1B、ILIF10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1HYI、IL1Rl、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、EL7、EL7R、EL8、IL8RA、DL8RB、IL8RB、DL9、DL9R、DLK、INHA、INHBA；INSL3、INSL4、IRAKI、ERAK2、ITGAI、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整联蛋白)、JAGI、JAKI、JAK3、JUN、K6HF、KAN、KDR、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLKIO、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)、LAMAS、LEP(瘦蛋白)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIBI、中期因子、MEF、MIP-2、MKI67、(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(metallothionectin-lll)、MTSSI、MUCI(黏蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、neurocan、NFKBI、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEI(NM23A)、N0X5、NPPB、NROBI、NR0B2、NRIDI、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRPI、NRP2、NT5E、NTN4、ODZI、OPRDI、P2RX7、PAP、PARTI、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PDGFA、PDGFB、PECAMI、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、phosphacan、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCI、PPBP(CXCL7)、PPID、PRI、PRKCQ、PRKDI、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGSI、RGS13、RGS3、RNFIIO(ZNF144)、ROB02、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(mammaglobin2)、SCGB2A2(mamnnaglobin 1)、SCYEI(内皮单核细胞激活细胞因子)、SDF2、SERPINAI、SERPINA3、SERP1NB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINEI(PAI-I)、SERPDMF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPPI、SPRRIB(Sprl)、ST6GAL1、STABI、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCPIO、TDGFI、TEK、TGFA、TGFBI、TGFBIII、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBRI、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBSI(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TMP3、组织因子、TLRIO、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAEP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFIIA、TNFRSFIA、TNFRSFIB、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSFIO(TRAIL)、TNFSFI 1(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TOP2A(拓扑异构酶Ea)、TP53、TPMI、TPM2、TRADD、TRAFI、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TREMI、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGF、VEGFB、VEGFC、多能聚糖、VHL C5、VLA-4、XCLI(lymphotactin)、XCL2(SCM-lb)、XCRI(GPR5/CCXCRI)、YYI和ZFPM2.
在一些实施方案中，靶标包括：CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD34、CD64、CD200；ErbB受体家族成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子，如LFA-1、Mad、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、包括其α或β亚基的α4/β7整联蛋白和αv/β7整联蛋白(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα；白介素，如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL17A/F、IL-18、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白C等；低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体；及选自以下的至少一种靶标：1)β-分泌酶(BACE1或BACE2)、2)α-分泌酶、3)γ-分泌酶、4)tau-分泌酶、5)淀粉状前体蛋白(APP)、6)死亡受体6(DR6)、7)淀粉状β肽、8)α-突触核蛋白、9)帕金蛋白、10)亨廷顿蛋白、11)p75NTR和12)胱天蛋白酶-6
应理解，抗体(例如多特异性抗体，例如双特异性抗体)可以结合至少两种靶分子，例如至少两种选自以下的靶分子：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-18、IL-13和IL-9、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-5和IL-4、IL-13和IL-1β、IL-13和IL-25、IL-13和TARC、IL-13和MDC、IL-13和MEF、IL-13和TGF-β、IL-13和LHR激动剂、IL-12和TWEAK、IL-13和CL25、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和ADAM8、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CD3和CD19、CD138和CD20、CD138和CD40、CD19和CD20、CD20和CD3、CD38和CD138、CD38和CD20、CD38和CD40、CD40和CD20、CD-8和IL-6、CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β、TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNFa和IL-12p40、VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3、EGFR(HERI)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R、TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGMA、CTLA-4和BTN02、IGF1和IGF2、IGF1/2和Erb2B、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-I和CTLA-4及RGM A和RGM B。
在一些实施方案中，靶标是抗VEGF、抗c-met、抗IgE、抗CD11、抗CD18、抗CD40、抗组织因子(TF)、抗HER2和抗TrkC抗体。还考虑抗非肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原)的抗体。本发明所涵盖的其他示例性抗体靶标包括：CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD46；ErbB受体家族成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子，如LFA-1、Mad、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、包括其α或β亚基的α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，如VEGF；组织因子(TF)；TGF-β；α干扰素(αIFN)；白介素，如IL-8；IgE；血型抗原Apo2；死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。本发明明确考虑双特异性抗体。
在一个实施方案中，抗体(例如用于本文方法的抗体)可以单独或组合并入以下1-6章节中所述的任意特征：
1.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段、单臂抗体、及下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。scFv片段的综述参见例如Pluckthün,inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；及美国专利号5,571,894和5,587,458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论参见美国专利号US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体还描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
单臂抗体(即重链可变结构域和轻链可变结构域形成单条抗原结合臂)公开于例如WO2005/063816；Martens等,Clin Cancer Res(2006),12:6144中。对于需要拮抗功能的病理学病症，在抗体的二价产生不希望的激动效应时，单臂抗体(即包含单条抗原结合臂的抗体)的单价特性产生和/或确保抗体与靶分子结合时的拮抗功能。此外，与具有相似/基本相同的抗原结合特征的Fab形式相比，包含Fc区的单臂抗体表征为较优的药代动力学特征(如体内半衰期增强和/或清除率降低)，从而克服了使用常规单价Fab抗体的主要缺点。用于制备单臂抗体的技术包括但不限于“杵入臼”改造(参见例如美国专利号5,731,168)。Onartuzumab是单臂抗体的实例。
可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生的多种技术来制备抗体片段。
2.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔、或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“种类转换”抗体，其中种类或亚类已从亲本抗体的种类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体来降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体还将可选地包含至少部分人恒定区。在一些实施方案中，用来自非人抗体(例如从其衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并进一步描述于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)；及Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：用“最适”法选择的构架区(参见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源自具体亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列的构架区(参见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
3.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般地描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已修饰为响应抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代内源免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外，或随机整合入动物的染色体。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已失活。用于从转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和US 6,150,584；描述
Figure GDA0001334422310000641
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure GDA0001334422310000643
技术的美国专利号7,041,870；描述
Figure GDA0001334422310000642
技术的美国专利申请公开号2007/0061900。可以例如通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰来自这类动物所产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括描述于例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术)还描述于Vollmers和Brandlein,Histology andHistopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findingsin Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
还可以通过分离选自人衍生噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这类可变结构域序列与希望的人恒定结构域组合。下文描述用于从抗体文库选择人抗体的技术。
4.文库衍生的抗体
可以针对具有一种或多种希望得到的活性的抗体筛选组合文库来分离本发明的抗体。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并针对具有希望得到的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方法。这类方法综述于例如Hoogenboom等in Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等,编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并进一步描述于例如McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,in Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo,编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机组合，然后按Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述针对抗原结合噬菌体筛选该文库。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫来源的文库提供抗免疫原的高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。备选地，可以按Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述克隆(例如从人)首次用于实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最后，还可以按Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，通过以下来合成制备首次用于实验的文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，用包含随机序列的PCR引物来编码高变的CDR3区，并实现体外重排。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括例如美国专利号5,750,373及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
本文将从人抗体文库分离的抗体或抗体片段视为人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同部位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，该结合特异性之一针对c-met，另一种针对任意其他抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以与c-met的两个不同表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位至表达c-met的细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段制备。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)；WO 93/08829；及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))和“杵入臼”改造(参见例如美国专利号5,731,168)。还可以通过以下来制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程静电引导作用(WO 2009/089004A1)；交联两种或多种抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；按例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还可以包括含有与c-met以及另一不同抗原(如EGFR)结合的抗原结合部位的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域已知。通常，双特异性抗体的重组产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。1993年5月13日公开的WO 93/08829中及Traunecker等,EMBO J.,10:3655(1991)中公开了类似的方法。
根据不同和更优选的方法，将具有希望得到的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。该融合优选是与包含至少部分铰合部、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。优选使包含轻链结合所必需的部位的第一重链恒定区(CH1)存在于至少融合之一中。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果希望)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入适宜的宿主生物。在不等比例的三种多肽链用于构建可提供最佳产率的实施方案中，这提供了调整三种多肽片段的相互比例的极大灵活性。但是，在以等比例表达至少两种多肽链产生高产率时或该比例没有具体意义时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在此方法的优选实施方案中，该双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此不对称结构便于从不想要的免疫球蛋白链组合分离希望得到的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链仅存在于该双特异性分子的一半中提供了容易的分离方式。此方法公开于WO94/04690中。产生双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methods inEnzymology 121:210(1986)。
根据另一种方法，可以改造一对抗体分子间的界面来最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少一部分CH3结构域。在此方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)(杵或凸起)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生大小与该一个或多个大的侧链相同或相似的补偿“凹陷”(臼)。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不想要的终产物(如同二聚体)的机制。本文中进一步描述杵和臼。
6.抗体变体
在某些实施方案中，考虑本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体的氨基酸序列缺失残基和/或在抗体的氨基酸序列内插入残基和/或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终构建体，只要最终构建体具有希望得到的特征，例如抗原结合。
在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。进行取代诱变的目的位点包括HVR和FR。可以在目的抗体中引入氨基酸取代，并针对希望得到的活性(例如保留/改善抗原结合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC)筛选产物。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)，和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽融合。
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以提高或降低该抗体的糖基化程度。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现抗体糖基化位点的加入或缺失。
在抗体包含Fc区时，可以改变附着于其上的糖类。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行本发明的抗体中的寡糖的修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有(直接或间接)附着于Fc区的缺乏岩藻糖的糖类结构的抗体变体。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。相对于通过例如WO 2008/077546中所述的MALDI-TOF质谱法测量的附着于Asn 297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，通过计算Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖的量。Asn297指定位在Fc区中的约297位(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；但是，由于抗体中小的序列变异，Asn297也可以定位在297位上游或下游约±3个氨基酸，即在294位和300位之间。这类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.,Ltd)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L；及WO 2004/056312A1,Adams等，尤其是在实施例11处)和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
还提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号6,602,684(Umana等.)；US 2005/0123546(Umana等)中。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施方案中，可以在本文提供的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得它成为其中抗体的体内半衰期很重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用所希望得到的候选者。
效应子功能减少的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括具有残基265和297至丙氨酸的取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了某些具有改善或减少的FcR结合的抗体变体(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如Fc区298、333和/或334位(残基的EU编号)的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述，在Fc区中进行改变，该改变导致改变(即改善或减少)的C1q结合和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。
具有增加的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等)中，新生儿Fc受体负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，该取代改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一个或多个处具有取代的那些，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及WO94/29351。
在某些实施方案中，可以希望产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基取代抗体的一个或多个残基。在具体实施方案中，取代的残基存在于抗体的可接近部位。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性巯基放置在抗体的可接近部位，并可以用于将抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分，以产生本文进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸取代以下残基中的任意一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以按例如美国专利号7,521,541中所述产生。
杵入臼
杵入臼作为产生多特异性抗体和/或单臂抗体和/或免疫黏附素的方法的用途为本领域公知。参见1998年3月24日授权、归属于Genentech的美国专利号5,731,168；2009年7月16日公开、归属于Amgen的PCT公开号WO2009089004；及2009年7月16日公开、归属于NovoNordisk A/S的美国专利公开号20090182127。还参见Marvin和Zhu,Acta PharmacologicaSincia(2005)26(6):649-658及Kontermann(2005)Acta Pharacol.Sin.,26:1-9。本文提供简要的讨论。
“凸起”指至少一个氨基酸侧链，其从第一多肽的界面凸出来，因此可定位在邻近界面(即第二多肽的界面)中的互补凹陷内来稳定该异源多体，从而例如偏向异源多体形成而不是同源多体形成。该凸起可以存在于原始界面上或可以合成引入(例如通过改变编码该界面的核酸)。通常，改变编码第一多肽的界面的核酸来编码凸起。为此，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸取代编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，该输入氨基酸残基具有比该原始氨基酸残基大的侧链体积。应理解，可以存在一个以上原始残基和对应的输入残基。取代的原始残基的数目的上限是第一多肽的界面中的残基的总数。下表中显示多种氨基残基的侧链体积。
表B
氨基酸残基的特性
氨基酸 单字母缩写 质量<sup>a</sup>(道尔顿) 体积<sup>b</sup>(埃<sup>3</sup>) 可接近表面积<sup>c</sup>(埃<sup>2</sup>)
丙氨酸(Ala) A 71.08 88.6 115
精氨酸(Arg) R 156.20 173.4 225
天冬酰胺(Asn) N 114.11 117.7 160
天冬氨酸(Asp) D 115.09 111.1 150
半胱氨酸(Cys) C 103.14 108.5 135
谷氨酰胺(Gln) Q 128.14 143.9 180
谷氨酸(Glu) E 129.12 138.4 190
甘氨酸(Gly) G 57.06 60.1 75
组氨酸(His) H 137.15 153.2 195
异亮氨酸(Ile) I 113.17 166.7 175
亮氨酸(Leu) L 113.17 166.7 170
赖氨酸(Lys) K 128.18 168.6 200
甲硫氨酸(Met) M 131.21 162.9 185
苯丙氨酸(Phe) F 147.18 189.9 210
脯氨酸(Pro) P 97.12 122.7 145
丝氨酸(Ser) S 87.08 89.0 115
苏氨酸(Thr) T 101.11 116.1 140
色氨酸(Trp) W 186.21 227.8 255
酪氨酸(Tyr) Y 163.18 193.6 230
缬氨酸(Val) V 99.14 140.0 155
a氨基酸分子量减去水的分子量。来自Handbook of Chemistry and Physics,第43版Cleveland,Chemical Rubber Publishing Co.,1961的值。
b来自A.A.Zamyatnin,Prog.Biophys.Mol.Biol.24:107-123,1972的值。
c来自C.Chothia,J.Mol.Biol.105:1-14,1975的值。可接近表面积在此参考文献的图6-20中定义。
优选的用于形成凸起的输入残基一般是天然存在的氨基酸残基，且优选选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成凸起的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。CH3结构域中用于形成凸起的示例性氨基酸取代非限制性地包括T366W取代。
“凹陷”指至少一个氨基酸侧链，其从第二多肽的界面缩回，从而容纳第一多肽的邻近界面上对应的凸起。凹陷可以存在于原始界面中，或者可以合成引入(例如通过改变编码界面的核酸)。通常，改变编码第二多肽的界面的核酸来编码凹陷。为此，用编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA取代编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸，该输入氨基酸残基具有比该原始氨基酸残基小的侧链体积。应理解，可以存在一个以上原始残基和对应的输入残基。取代的原始残基的数目的上限是第二多肽的界面中的残基的总数。上文表B中显示多种氨基残基的侧链体积。优选的用于形成凹陷的输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成凹陷的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。CH3结构域中用于产生凹陷的示例性氨基酸取代非限制性地包括T366S、L368A和Y407A取代。
“原始”氨基酸残基是用“输入”残基取代的氨基酸残基，该输入残基可以具有比该原始残基小或大的侧链体积。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。“天然存在的”氨基酸残基是由遗传密码编码并在上文表B中列出的那些残基。“非天然存在的”氨基酸残基意指这样的残基，其不由遗传密码编码，但其能够在多肽链中共价结合邻近的一个或多个氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸及其他氨基酸残基类似物，如描述于例如Ellman等,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等Science 244:182(1989)和Ellman等,上文的方法。简言之，这涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化阻抑型tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。本发明的方法涉及取代至少一个原始残基，但可以取代一个以上的原始残基。通常，取代的原始氨基酸残基将不超过第一或第二多肽的界面中的总残基。通常，取代的原始残基是“埋藏的”。“埋藏的”意指溶剂基本上不可接近该残基。通常，输入残基不是半胱氨酸，以防止可能的氧化或二硫键的错配。
凸起“可定位”在凹陷中意指凸起和凹陷各自在第一多肽和第二多肽的界面上的空间定位及凸起和凹陷的大小是这样，使得凸起可以定位在凹陷中而不显著扰乱第一和第二多肽在界面上的正常结合。由于诸如Tyr、Phe和Trp的凸起通常不从界面的轴垂直延伸，且具有优选的构象，凸起与对应的凹陷的对齐依赖于根据三维结构(如通过X射线晶体分析法或核磁共振(NMR)获得的那些)模拟凸起/凹陷对。这可以用本领域广泛接受的技术来达到。
“原始或模板核酸”意指编码目的多肽的核酸，其可以“改变”(即遗传改造或突变)为编码凸起或凹陷。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含之前已进行了改变的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸意指通过插入、缺失或取代至少一个编码目的氨基酸残基的密码子来突变原始核酸。通常，用编码输入残基的密码子取代编码原始残基的密码子。用于以这种方式遗传修饰DNA的技术综述于Mutagenesis:a Practical Approach,M.J.McPherson编辑,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中，且包括例如定位诱变、盒诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。通过突变原始/模板核酸，从而相应地改变了该原始/模板核酸编码的原始/模板多肽。
可以通过合成手段，例如通过重组技术、体外肽合成、之前描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术，通过肽的酶偶联或化学偶联，或这些技术的某种组合，来将凸起或凹陷“引入”第一或第二多肽的界面。因此，“引入的”凸起或凹陷是“非天然存在的”或“非天然的”，其意指它不存在于自然界中或原始多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
通常，用于形成凸起的输入氨基酸残基具有数目相对小的“旋转异构体”(例如约3-6)。“旋转异构体”是氨基酸侧链在能量上有利的构象。多种氨基酸残基的旋转异构体的数目综述于Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中。
在一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面上相遇/相互作用。在其中第一和第二Fc多肽在界面上相遇的一些实施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含凸起(也称为“杵”)，该凸起可定位在第一Fc多肽(序列)的界面中的凹陷(也称为“臼”)内。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凹陷，或已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凸起，或编码二者。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凹陷，并已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凸起。在一个实施方案中，第二Fc多肽的界面包含凸起，该凸起可定位在第一Fc多肽的界面中的凹陷内，其中已分别在第一和第二Fc多肽的界面中引入凹陷或凸起或二者。在其中第一和第二Fc多肽在界面上相遇的一些实施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含凸起，该凸起可定位在第二Fc多肽(序列)的界面中的凹陷内。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凹陷，或已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凸起，或编码二者。在一个实施方案中，已从模板/原始多肽改变第二Fc多肽以编码凹陷，并已从模板/原始多肽改变第一Fc多肽以编码凸起。在一个实施方案中，第一Fc多肽的界面包含凸起，该凸起可定位在第二Fc多肽的界面中的凹陷内，其中已分别在第一和第二Fc多肽的界面中引入凸起或凹陷或二者。
在一个实施方案中，凸起和凹陷各包含天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，通过用具有比原始残基大的侧链体积的输入残基取代来自模板/原始多肽的界面的原始残基来产生包含凸起的Fc多肽。在一个实施方案中，通过包括这样的步骤的方法来产生包含凸起的Fc多肽，在该步骤中，用编码具有比原始残基大的侧链体积的输入残基的多核苷酸取代编码来自该多肽的界面的原始残基的多核苷酸。在一个实施方案中，该原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，该原始残基是T366。在一个实施方案中，该输入残基是精氨酸(R)。在一个实施方案中，该输入残基是苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，该输入残基是酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，该输入残基是色氨酸(W)。在一个实施方案中，该输入残基是R、F、Y或W。在一个实施方案中，通过取代模板/原始多肽中的两个或多个残基来产生凸起。在一个实施方案中，含有凸起的Fc多肽包含用色氨酸取代336位苏氨酸，按照Kabat等的EU编号方案(688-696页in Sequences of proteins of immunological interest,第5版,1卷(1991；NIH,Bethesda,MD))的氨基酸编号。
在一些实施方案中，通过用具有比原始残基小的侧链体积的输入残基取代模板/原始多肽的界面中的原始残基来产生包含凹陷的Fc多肽。例如，通过包括这样的步骤的方法来产生包含凹陷的Fc多肽，在该步骤中，用编码具有比原始残基小的侧链体积的输入残基的多核苷酸取代编码来自该多肽的界面的原始残基的多核苷酸。在一个实施方案中，该原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，该原始残基是亮氨酸。在一个实施方案中，该原始残基是酪氨酸。在一个实施方案中，该输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，该输入残基是丙氨酸(A)。在一个实施方案中，该输入残基是丝氨酸(S)。在一个实施方案中，该输入残基是苏氨酸(T)。在一个实施方案中，该输入残基是缬氨酸(V)。可以通过取代模板/原始多肽的一个或多个原始残基来产生凹陷。例如，在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的两个或多个原始氨基酸的取代。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的两个或多个输入残基。在一些实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸的两个或多个原始氨基酸的取代，且其中用选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸的输入残基取代该原始残基。在一些实施方案中，所取代的原始氨基酸是T366、L368和/或Y407。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含用丝氨酸取代366位苏氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含用丙氨酸取代368位亮氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含用缬氨酸取代407位酪氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在一个实施方案中，含有凹陷的Fc多肽包含选自T366S、L368A和Y407V的两个或多个氨基酸取代，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。在这些抗体片段的一些实施方案中，含有凸起的Fc多肽包含用色氨酸取代366位苏氨酸，按照Kabat等上文的EU编号方案的氨基酸编号。
在一个实施方案中，该抗体包含WO2005/063816中所述的构成“杵”和“臼”的Fc突变。例如，臼突变可以是Fc多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一个或多个，杵突变可以是T366W。
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以包含本领域已知且易于得到的附加非蛋白质部分。适合用于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯比咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、propropylene glycol同聚物、prolypropylene oxide/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛可以在制备中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，且可以分枝或不分枝。附着于抗体的聚合物的数目可以不同，且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据包括但不限于抗体要改善的具体特性或功能、抗体衍生物是否将在确定的条件下用于治疗等的考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型。
在另一实施方案中，提供抗体和可通过暴露于照射来选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，该非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。照射可以具有任意波长，且包括但不限于这样的波长，该波长不损害普通细胞，但加热非蛋白质部分至杀死靠近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度。
在一个实施方案中，该药物是包含与一种或多种细胞毒剂缀合的抗体(如c-met抗体)的免疫缀合物，该细胞毒剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素、或其片段)或放射性同位素。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，该药物包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0425235B1)；auristatin，如monomethylauristatin药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀；棘孢霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素，如柔红霉素或阿霉素(参见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利号6,630,579)；氨甲喋呤；脱乙酰长春花碱；紫杉烷，如紫杉萜、紫杉醇、larotaxel、tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯；及CC1065。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。
在另一实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合形成放射性缀合物的本文所述抗体。可用多种放射性同位素来产生放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。在放射性缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以用多种双功能蛋白质偶联剂来产生抗体和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或包含二硫化物的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)的市售交联剂(例如来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)制备的这类缀合物。
载体、宿主细胞和重组方法
为了重组产生异源多肽(例如抗体)，分离编码它的核酸，并插入可复制载体用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。编码多肽(例如抗体)的DNA易于用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。许多载体可用。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞具有原核来源。应理解，任意同种型的恒定区都可以用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，且这类恒定区可以从任何人或动物物种获得。
a.用原核宿主细胞产生抗体
i.载体构建
编码本发明的多肽(例如抗体)的多肽成分的多核苷酸序列可以用标准重组技术获得。可以从产生抗体的细胞(如杂交瘤细胞)分离和测序希望得到的多核苷酸序列。备选地，可以用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，即可以将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源多肽的重组载体。本领域可得和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适宜载体的选择将主要取决于待插入载体的核酸的大小及待用该载体转化的具体宿主细胞。取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者)及其与它所驻留的具体宿主细胞的相容性，每个载体包含多种成分。载体成分通常包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。
通常，将包含源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常用源自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，从而提供容易的手段用于鉴定转化细胞。pBR322、其衍生物、或其他微生物质粒或噬菌体还可以包含或修饰为包含用于表达内源蛋白质的微生物可以使用的启动子。用于表达具体抗体的pBR322衍生物的实例详细描述于Carter等的美国专利号5,648,237中。
此外，含有与宿主生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主结合的转化载体。例如，诸如λGEM.TM.-11的噬菌体可以用于制备可以用来转化诸如大肠杆菌LE392的易感宿主细胞的重组载体。
本发明的表达载体可以包含编码多肽成分中的每一种的两个或多个启动子-顺反子对。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5’)的非翻译调节序列。原核启动子通常分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是响应培养条件的变化(例如营养物的存在或缺乏或温度的变化)而起始处于其控制下的顺反子的提高水平的转录的启动子。
多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子为本领域公知。可以通过经限制酶消化从来源DNA去除启动子并将该分离的启动子插入本发明的载体来将所选择的启动子有效连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。天然启动子序列和许多异源启动子都可以用来指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许所表达的靶基因更多的转录和更高的产率。
适合用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，如tac或trc启动子。但是，在细菌中具有功能的其他启动子(如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适宜的。它们的核苷酸序列已公开，从而使得技术人员能够用接头或衔接子提供所需的任意限制位点来将它们有效连接至编码靶轻链和重链的基因的顺反子(Siebenlist等,(1980)Cell 20:269)。
翻译起始区(TIR)是蛋白质总体翻译水平的主要决定因素。TIR包括编码信号序列的多核苷酸，且从Shine-Delgarno序列的刚好上游延伸至起始密码子下游约20个核苷酸。通常，载体将包含TIR，TIR和变体TIR为本领域已知，且用于产生TIR的方法为本领域已知。可以产生一系列具有不同翻译强度的核酸序列变体，从而提供方便的手段来针对许多不同多肽的最佳分泌调节此因素。与这些变体融合的报道基因(如PhoA)的使用提供了定量不同翻译起始区的相对翻译强度的方法。变体或突变体TIR可以在质粒载体背景中提供，从而提供可插入目的基因并测量其表达的一套质粒，以便为成熟多肽的最大表达确定翻译强度的最适范围。变体TIR公开于USP 8,241,901中。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子包含指导所表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列成分。通常，该信号序列可以是载体的成分，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的部分。选择用于本发明的目的的信号序列应是该宿主细胞识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，用选自例如本发明的信号肽的原核信号序列取代该信号序列。此外，载体可以包含选自碱性磷酸酶、青霉素酶、Lpp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的信号序列。
在一方面，一个或多个多核苷酸(例如表达载体)共同编码抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链，分开的多核苷酸编码抗体的重链。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗体的轻链和重链。在一些实施方案中，一个或多个多核苷酸(例如表达载体)共同编码单臂抗体。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码(a)单臂抗体的轻链和重链及(b)Fc多肽。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码单臂抗体的轻链和重链，分开的多核苷酸编码Fc多肽。在一个实施方案中，分开的多核苷酸分别编码单臂抗体的轻链成分、单臂抗体的重链成分和Fc多肽。单臂抗体的产生描述于例如WO2005063816中。
适合用于表达本发明的抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌)、肠细菌、假单胞菌属物种(Pseudomonas species)(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，用大肠杆菌作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,第2卷(Washington,D.C.:AmericanSociety for Microbiology,1987),1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生菌株，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)，及菌株63C1、66F8和64B4。诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)的其他菌株及其衍生菌株也是适宜的。这些实例是说明性的而不是限制性的。用于构建任意上述细菌的具有确定基因型的衍生菌株的方法为本领域已知，并描述于例如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)中。通常有必要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，在用诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410的众所周知的质粒来提供复制子时，可以适宜地用大肠杆菌、沙雷氏菌属(Serratia)或沙门氏菌属(Salmonella)物种作为宿主。通常，宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，且可以希望将附加的蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
ii.抗体产生
用上述表达载体转化宿主细胞，并培养在根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望得到的序列的基因的需要改进的常规营养培养基中。
转化意指将DNA引入原核宿主，使得该DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所使用的宿主细胞，用适于这类细胞的标准技术进行转化。利用氯化钙的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一转化方法利用聚乙二醇/DMSO。所使用另一技术是电穿孔。
将用来产生本发明的多肽的原核细胞培养在本领域已知且适合用于培养所选择的宿主细胞的培养基中。适宜的培养基的实例包括加入了必要的营养补充物的Luria培养基(LB)。在一些实施方案中，该培养基还包含根据表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许含有该表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中加入氨苄青霉素。
除碳、氮和无机磷酸来源外，还可以按适当的浓度包含单独引入或作为与另一补充物或培养基(如复合氮源)的混合物引入的任意必要补充物。可选地，该培养基可以包含选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的一种或多种还原剂。
在适宜的温度下培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌生长，例如，优选的温度范围从约20℃至约39℃，更优选从约25℃至约37℃，甚至更优选在约30℃。主要取决于宿主生物，培养基的pH可以是从约5至约9的范围内的任意pH。对于大肠杆菌，pH优选从约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合用于激活该启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，将转化的宿主细胞培养在磷酸盐限制培养基中进行诱导。优选地，该磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons等,J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)或WO2002/061090中所述的培养基。如本领域已知，根据所利用的载体构建体，可以使用多种其他诱导物。
在一个实施方案中，所表达的本发明的多肽分泌进入宿主细胞的周质，并从宿主细胞的周质回收。蛋白质回收通常涉及一般通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的手段破裂微生物。一旦破裂细胞，即可以通过离心或过滤来去除细胞碎片或整个细胞。可以例如通过亲和树脂层析来进一步纯化蛋白质。备选地，蛋白质可以转运入培养基，并从其中分离。可以从培养物去除细胞，过滤并浓缩培养物上清用于所产生的蛋白质的进一步纯化。可以用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定的公知方法来进一步分离和鉴定所表达的多肽。
在本发明的一个实施方案中，通过发酵方法来进行抗体的大量产生。多种大规模补料分批发酵方法可用于产生重组蛋白质。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐用搅拌桨来分布氧气和营养物，尤其是葡萄糖(优选的碳/能量来源)。小规模发酵一般指体积容量不超过约100升，且可以在约1升至约100升的范围内的发酵罐中的发酵。
在发酵方法中，通常将细胞在适宜条件下培养至希望得到的密度(例如约180-220的OD550，细胞在该阶段处于早平台期)后起始蛋白质表达的诱导。如本领域已知和本文所述，根据所利用的载体构建体，可以使用多种诱导物。细胞可以在诱导前培养更短的时期。通常诱导细胞约12-50小时，但也可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明的多肽的产率和质量，可以改变多种发酵条件。例如，为了改善所分泌的抗体多肽的正确组装和折叠，可以用过量表达诸如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有分子侣伴活性的肽酰脯氨酰顺反异构酶)的分子侣伴蛋白质的附加载体来共转化宿主原核细胞。已证明分子侣伴蛋白质便于细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和溶解。Chen等(1999)J.Biol.Chem.274:19601-19605；Georgiou等,美国专利号6,083,715；Georgiou等,美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。在一些实施方案中，在细菌宿主细胞中表达(例如过量表达)DsbA和C。在一些实施方案中，在细菌宿主细胞中表达(例如过量表达)DsbA、DsbC和FkpA。
为了最小化所表达的异源蛋白质(尤其是蛋白酶解敏感的那些)的蛋白酶解，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株来在编码已知的细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中产生一个或多个遗传突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可用，并描述于例如Joly等,(1998),上文；Georgiou等,美国专利号5,264,365；Georgiou等,美国专利号5,508,192；Hara等,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中。
在一个实施方案中，将蛋白水解酶缺陷并用过量表达一种或多种分子侣伴蛋白质和/或FkpA的质粒转化的大肠杆菌菌株用作本发明的表达系统中的宿主细胞。
iii.抗体纯化
可以利用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是适宜的纯化方法的示例：免疫亲和或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石上或诸如DEAE的阳离子交换树脂上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一方面，用固定在固相上的蛋白A来进行本发明的抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是以高亲和力结合抗体Fc区的来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。固定蛋白A的固相优选是含有玻璃或硅石表面的柱，更优选可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，在防止污染物非特异性附着的尝试中用诸如甘油的试剂包被柱。
作为纯化的第一步，将源自上述细胞培养物的制备物上样至固定了蛋白A的固相上，以允许目的抗体与蛋白A特异性结合。然后洗涤固相来去除非特异性结合于固相的污染物。最后，通过洗脱来从固相回收目的抗体。
本发明还提供免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合”或“ADC”)，其包含与例如细胞毒剂缀合的本文所述任意抗体，该细胞毒剂如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射性缀合物)。
用途
异源多肽可以例如用于纯化、检测和靶向它所识别的具体多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法二者。
在一方面，本发明的抗体可以用于定性和定量测量生物样品中的具体抗原的免疫测定。用于检测抗原-抗体结合的常规方法包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组化。许多方法可以使用结合于用于检测目的的抗体的标记。用于抗体的标记是不干扰其与抗体的结合的任何可检测功能性。许多标记是已知的，包括放射性同位素32P、32S、14C、125I、3H和131I，萦光团如稀土螯合物或萦光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记，稳定自由基、成像放射性核素(如锝)等。
可用常规方法来使这些标记共价结合至异源多肽。例如，诸如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双-亚胺、双-重氮化联苯胺等的偶联剂可以用于用上述萦光标记、化学发光标记和酶标记标记抗体。参见例如美国专利号3,940,475(萦光测定)和美国专利号3,645,090(酶)；Hunter等,Nature,144:945(1962)；David等,Biochemistry,13:1014-1021(1974)；Pain等,J.Immunol.Methods,40:219-230(1981)；及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407-412(1982)。本文优选的标记是酶，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。对免疫测定技术领域的普通技术人员而言，这种标记(包括酶)与抗体多肽的缀合是标准操作方法。参见例如Methods in Enzymology,J.J.Langone和H.Van Vunakis编辑,73卷(Academic Press,New York,New York,1981),147-166页中的O'Sullivan等“Methods for the Preparationof Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay”。这类成键方法适合用于本发明的异源多肽。
作为标记异源多肽之外的另一种选择，可以通过竞争免疫测定来测定生物流体中的抗原，该竞争免疫测定利用可检测物质标记的竞争抗原标准品和未标记的异源多肽。在此测定中，组合生物样品、标记的抗原标准品和异源多肽，并测定结合于未标记的异源多肽的标记抗原标准品的量。生物样品中所测试的抗原的量与结合于异源多肽的标记抗原标准品的量成反比。
在一方面，异源多肽(如抗体)尤其用于在体外或体内检测和分析具体表面抗原的表达。如之前所讨论，通常，无糖基化的抗体不发挥效应子功能(即ADCC或CDC活性)。因此，在该抗体结合细胞表面抗原时，它将不起始不希望的细胞毒性事件。该表面抗原可以是特定细胞或组织类型所特有的，因此可作为该细胞或组织类型的标志。优选地，该表面抗原标志在特定细胞或组织类型的多种分化阶段差异表达。抗这种表面抗原的抗体因此可以用于筛选表达该标志的细胞或组织群体。例如，该抗体可以用于筛选和分离干细胞，如胚胎干细胞、造血干细胞和间充质干细胞。该抗体也可以用于检测表达肿瘤相关表面抗原(如c-met、HER2、HER3或HER4受体)的肿瘤细胞。
抗体或其他异源多肽可以用作亲和纯化剂。在此方法中，用本领域公知的方法将多肽固定在固相(如Sephadex树脂或滤纸)上。使固定的多肽与含有待纯化抗原的样品接触，然后用适宜的溶剂洗涤支持物，该溶剂将实质性去除样品中除待纯化抗原之外的所有物质，待纯化的抗原结合于固定的多肽。最后，用另一适宜的溶剂(如甘氨酸缓冲液pH 5.0)洗涤支持物，该溶剂将从多肽释放抗原。
在一方面，本发明提供用本发明的方法产生的异源多肽在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病(如癌症、肿瘤、细胞增生性障碍和/或免疫(如自身免疫)障碍)的药物中的用途。异源多肽可以属于本文所述的任意形式，包括抗体、抗体片段、多肽(例如寡肽)、或其组合。在一些实施方案中，该抗原是人蛋白质分子，该个体是人个体。
该多肽可以用于诊断、治疗、抑制或预防与一种或多种抗原分子的异常表达和/或活性相关的疾病、障碍或病症，其包括但不限于：恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑及其他腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的障碍；及炎性、血管发生性和免疫性障碍。
在某些实施方案中，对个体施用蛋白质(例如抗体)。在某些实施方案中，对个体施用含有抗体的免疫缀合物。优选地，细胞内化该免疫缀合物和/或与之结合的抗原。
异源多肽可以单独或与其他组合物组合用于治疗。例如，异源多肽可以与抗体、一种或多种化疗剂(包括化疗剂的混合物)、一种或多种其他细胞毒剂、一种或多种抗血管发生剂、细胞因子和/或一种或多种生长抑制剂共同施用。在异源多肽抑制肿瘤生长时，尤其可以希望将该异源多肽与一种或多种也抑制肿瘤生长的其他治疗剂组合。备选地或此外，患者可以接受联合的放射治疗(例如外束照射或放射性标记药物(如抗体)治疗)。上文指出的这类联合治疗包括组合施用(其中两种或多种药物包含在相同的或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，抗体的施用可以发生在施用一种或多种辅助治疗之前和/或之后。
通过任意适宜的手段来施用异源多肽(和可选的辅助治疗剂)，其包括胃肠外、皮下、腹腔内、肺内和鼻内，如果希望进行局部处理，则可以病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下施用。此外，尤其是用递减的抗体剂量，适宜地通过脉冲输注施用抗体。优选地，部分取决于施用是短暂的还是长期的，通过注射，最优选静脉内或皮下注射来给药。
将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用异源多肽。此背景中考虑的因素包括待治疗的具体障碍、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的病因、递送活性剂的部位、施用方法、施用日程及医疗从业者已知的其他因素。无需但可选地用目前用于预防或治疗所讨论的障碍的一种或多种活性剂配制抗体。这类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的抗体的量、障碍或处理的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以相同的剂量和用此前所用的给药途径施用，或者此前所用剂量的1％至99％。
对于疾病的预防或治疗，抗体(在单独使用或与其他药物如化疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重度和过程、为了预防性还是治疗性目的而施用抗体、之前的治疗、患者的临床病史和对抗体的反应、及主治医师的判断。在一次或一系列的治疗中适宜地对患者施用抗体。取决于疾病的类型和严重度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体是例如通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来对患者施用的初始候选剂量。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗持续至出现希望的疾病症状抑制。抗体的优选剂量将在从约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。可以施用最初较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定容易地监测此治疗的进展。
制品
在本发明的另一实施方案中，提供包含用于治疗上述障碍的材料的制品。制品包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳对治疗病症有效的组合物，且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗所选择的病症，如癌症。此外，制品可以包含：(a)组合物包含在其中的第一容器，其中该组合物抗体；和(b)组合物包含在其中的第二容器，其中该组合物包含其他细胞毒性剂。本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含指示该第一和第二抗体组合物可以用来治疗癌症的包装说明书。备选地或此外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包含商业和用户角度希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。
以下实施例仅旨在说明本发明的实施，并非以限制的方式提供。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确以其整体引入作为参考。
实施例
材料和方法
菌株和质粒。用于本研究的菌株和质粒在表1中列出。为了构建仅表达重链的表达载体，用SpeI和NsiI(New England Biolabs)消化全长抗体表达载体。将产生的含有信号肽序列和重链序列的片段克隆入pBR322衍生的克隆载体的SpeI和NsiI位点，该克隆载体含有截短的轻链片段(122-237)、与重链序列融合的phoA启动子和λt0转录终止子。用ακLc抗体探测的Western印迹分析确认，轻链未随仅表达重链的表达载体表达。为了构建用于翻译强度测量的PhoA报道质粒，通过常规PCR或剪接重叠延伸(SOE)PCR使目的信号肽变体与phoA基因融合。将产生的片段克隆入pPhoA51[1]的SpeI和NotI(New England Biolabs)位点。通过QuickChange定位诱变试剂盒(Stratagene)引入信号肽序列中的位点特异性突变。
表1.用于本研究的菌株和质粒。
Figure GDA0001334422310000921
Figure GDA0001334422310000931
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细菌生长。按所示在37℃或在30℃在带挡板的摇瓶中在Lauria-Bertani(LB)或完全C.R.A.P.培养基(Simmons等,Journal of immunological methods,2002)中培养细菌。按以下浓度加入抗生素：羧苄青霉素50μg/ml、四环素20μg/ml。为了诱导蛋白质表达，在5mL补充20μL/mL四环素和5mM磷酸钠、pH 7的LB中接种含有全长抗体表达载体或仅表达重链的表达载体的宿主菌株64B4，并在30℃过夜震荡孵育。将0.5ml过夜培养物接种入25mL完全C.R.A.P.磷酸盐限制培养基[2]，并在30℃震荡培养细菌24小时。在550nm测量终点培养物的光密度。收集细菌样品进行Western印迹分析或N端测序分析。
翻译强度测量。通过修改自之前的出版物[1,3]的碱性磷酸酶测定来测定信号肽变体的翻译强度。将含有PhoA报道载体的菌株27C7接种入5mL选择性LB，并在30℃过夜震荡培养。将过夜培养物100倍稀释入5mL选择性LB，并再在30℃震荡孵育4小时。将细菌归一化至600nm波长下的1OD，并沉淀下来。沉淀立即悬浮在1mL严格AP培养基(Simmons等,NatureBiotechnology,1996)中，并在-20℃过夜保存。第二天，融化细菌，并与20μL甲苯在37℃震荡孵育至少1小时。然后将40μL各样品加入1mL含有1mM硝基苯基磷酸二钠盐六水合物(PNPP,Sigma-Aldrich)的1M Tris-HCL、pH 8，并在室温孵育1小时。然后加入100μL 1M磷酸钠、pH 6.5终止反应。立即将200μL各样品转入96孔板的孔中，并通过酶标仪(MolecularTechnologies)测量OD410。通过从各样品的A410减去27C7/pBR322(空载体)的A410，然后除以27C7/pPhoA86的A410，计算相对翻译强度。pPhoA86的相对TIR强度定义为1。
抗体提取和Western印迹分析。收集来自摇瓶培养物的终点样品。为了测量总重链水平，将细菌归一化至550nm下的1OD，并通过16,000xg和4℃离心3分钟来收集。将沉淀重悬在200μL含0.2M二硫苏糖醇(DTT,Sigma)的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液中，并在95℃加热5分钟，以破坏二硫键和变性蛋白质。
为了从细菌提取可溶性蛋白质，将全细胞液稀释入冷的裂解缓冲液(10mM Tris、pH 6.8、5mM EDTA、0.2mg/mL溶菌酶和5mM碘乙酸)至最终OD550为3，并在冰上孵育10分钟。然后通过10x 1秒脉冲超声处理样品两次，16,000xg和4℃离心15分钟。小心地收集上清。将100μL上清与100μL N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液或N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液混合，并在95℃煮5分钟。
按[4,5]所述提取周质蛋白质。简言之，通过3,000xg和4℃离心20分钟来收集10OD550的细胞。将沉淀轻轻重悬在1mL含1片蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的冷TBS缓冲液(200mM Tris、pH8.0、0.5mM蔗糖、1mM EDTA)中。冰上孵育样品30分钟，16,000xg和4℃离心30分钟。小心地收集上清。将100μL上清与100μL含0.2M DTT的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液混合，并在95℃加热5分钟。
将含或不含DTT的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液中的蛋白质样品上样在Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Life Technologies)上，并通过电泳分开。为确保上样等量的总蛋白质，用考马斯蓝染色具有1OD裂解物的凝胶。通过iBlot半干转移(Life Technologies)或通过使用CAPS缓冲液(10mM N-环己基-3-氨基丙磺酸、3％甲醇、pH 11)的湿转移(Biorad)将未染色凝胶中的蛋白质转移至纤维素酶(Biorad)。用HRP缀合的山羊抗人Fc二抗(Pierce)探测含重链的种类。用HRP缀合的山羊抗人kLc抗体(Bethyl Laboratories)探测含轻链的种类。通过增强化学发光(GE Healthcare)检测免疫印迹上的靶蛋白质。重链N端的Edman测序。将来自摇瓶培养物的终点样品归一化至1OD550，并通过16,000xg离心3分钟来收集。将沉淀重悬在200μL含0.2M DTT的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸缓冲液中，并在95℃加热5分钟。通过在8％或10％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Life Technologies)上电泳来分开蛋白质。还上样来自含有空pBR322载体的64B4的1OD550或4OD550细胞裂解物作为对照。电泳后，通过CAPS缓冲液中的湿转移(Biorad)将蛋白质转移至PVDF膜。切出膜上～49kDa处的重链条带，并用Applied Biosystems Procise Sequencer Model 494HT通过Edman测序分析。根据峰强度估计成熟重链与前体的比值。对于半定量，通过序列分析程序SEQX针对未校正的苯硫乙内酰脲氨基酸标准品计算各氨基酸的皮摩尔值(Henzel等,Journal of Chromatography,1987)。用平均10个循环产生重复产率图来计算线性回归，主要和次要序列的初始产率定义为所作曲线的y截距。将重链加工效率计算为分泌重链的百分比(成熟重链的初始产率/(前体的初始产率+成熟重链的初始产率))。
透射电镜术(TEM)。来自摇瓶培养物的终点样品首先在改进的Karnovsky固定剂(含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸钠缓冲液ph7.2)中固定，然后在1％水性四氧化锇(EM Sciences,Hatfield,PA)后固定1小时，然后在0.5％醋酸双氧铀中40℃过夜孵育。然后通过系列乙醇浓度(50％、70％、90％、100％)及随后的氧化丙烯(每个步骤15分钟)对样品进行脱水，并包埋在Eponate 12(Ted Pella,Redding,CA)中。用Ultracut切片机(Leica)切割超薄切片(80nm)，用0.2％柠檬酸铅染色，并在120kV下在JEOL JEM-1400透射电镜(TEM)中检查。用GATAN Ultrascan 1000CCD相机获取电子图像。
免疫金电镜术(immunoEM)。在免疫金EM实验中，制备样品进行冷冻切片。对于冷冻切片，在含4％多聚甲醛、0.1％戊二醛的磷酸盐缓冲液(0.1M；pH 7.2)中固定细胞，在PBS中洗涤几次，包埋在12％明胶中，并在2.3M蔗糖中4℃过夜浸润。然后将样品固定在冷冻切片室(用液氮提供)中冷冻的用于冷冻超薄切片术的针上。用配有冷冻切片室的超薄切片机(Ultracut；Leica)用金刚钻刀(Diatome)在-80℃制备超薄切片(100nm)。用一滴2.3M蔗糖将融化的冷冻切片转移至Formvar和碳包被的EM网(Nickel)，免疫染色(参见下文)，并用含0.5％醋酸双氧铀的2％甲基纤维素针对EM在RT复染1分钟。对于免疫金标记：在封闭剂(Aurion Inc)中封闭网格上融化的冷冻切片30分钟，与HRP缀合的山羊抗人Fc抗体(Pierce)室温孵育45分钟，然后与山羊抗HRP金缀合抗体(Jackson ImmunoResearch)孵育30分钟。然后按上文所述复染切片。在120kV下在JEOL JEM-1400透射电镜(TEM)中显示和检查免疫金标记的切片。用GATAN Ultrascan 1000CCD相机获取电子图像。
结果和讨论
抗体(例如全长抗体)在大肠杆菌中的产生可以通过使抗体重链和轻链从胞质分泌至周质来达到[2]。该分泌由与重链和轻链的N端融合的大肠杆菌信号肽介导。周质中的氧化环境和酶便于重链和轻链组装为抗体。用周质分泌作为高水平产生异源蛋白质(例如抗体)的手段可以受限于几个常遇到的问题。第一，目的蛋白质(例如抗体)的分泌效率可以很低。第二，前体在许多情况下不完整地加工为成熟蛋白质。第三，过量表达的异源蛋白质常不正确地折叠，聚集为不可溶的内含体，或被大肠杆菌蛋白酶酶解。第四，抗体是由两种不同多肽(重链(HC)和轻链(LC))组成的复杂多体蛋白质，必须使这两种不同多肽输出进入周质，正确折叠，并形成适当的二硫键。此蛋白质折叠和分泌的复杂性增加了在大肠杆菌中制备抗体的挑战。
虽然已显示TIR优化对产生更有效的蛋白质分泌有用，但未显示其他方法惯常地改善大肠杆菌中的异源蛋白质分泌。例如，已显示信号蛋白质的优化减少了重组环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)分泌进入周质间隙。Jonet等,J Mol Microbiol Biotechnol(2012)；22:48-58。
信号肽的两个方面影响周质中的蛋白质累积：翻译强度和易位效率。翻译起始区(TIR)是蛋白质总体翻译水平的主要决定因素。TIR包括编码信号序列的多核苷酸，且从Shine-Delgarno序列的刚好上游延伸至起始密码子下游约20个核苷酸。此多核苷酸序列的修饰可以改变翻译起始的效率，从而调节下游蛋白质的翻译水平。检查突变信号肽序列的作用的先前研究通常不控制由核酸序列改变引起的对TIR强度的潜在影响；但是，在我们之前的研究中，检查了用不同信号肽来驱动全长抗体产生，同时控制TIR强度。在约1的相对TIR强度下，DsbA信号肽与重链融合通常产生比STII、MalE或PhoA信号肽的融合更高的全长抗体产生水平(各研究中轻链信号肽为STII)(图1A)。在本研究中，我们假定DsbA信号肽比所测试的其他信号肽更疏水，且我们证明，信号肽的疏水性对重链向周质易位和全长抗体产生很重要。
信号肽影响抗体重链的周质累积和加工。我们检查了信号肽变体对周质中的重链累积的影响。在所有变体中，相对TIR强度为～1，以控制信号肽疏水性变化对转录强度的可能的影响。先前的研究通常未控制修饰信号肽的翻译强度。如果不像本研究中一样小心地控制，信号肽疏水性的调节可能可以改变TIR的翻译强度(例如，通过TIR多核苷酸序列中的改变)。TIR翻译强度的改变可能影响分泌效率和蛋白质产生水平。
使抗体5D5重链的N端与各具有相似翻译水平(表3)的STII信号肽(bSTII1)、DsbA信号肽(bDsbA1)、MalE信号肽(bMalE1)或PhoA信号肽(bPhoA1)融合。在每种情况下，使抗体5D5轻链与相同的STII信号肽(mSTII1)融合。在摇瓶培养物中通过磷酸盐限制来诱导重链和轻链二者的表达。通过渗透压休克和离心来分离周质蛋白质提取物。上清的Western印迹分析显示，使用DsbaA信号肽产生比使用STII、MalE或PhoA信号肽显著更高的可溶性周质重链水平(图1B)。由于bMalE1和bPhoA1的TIR强度高于bSTII1和bDsbA1的TIR强度，为了排除更高的TIR可以导致低效率分泌的可能性，我们改造了两种附加的信号肽mMalE1和mPhoA1，其TIR强度略低于bSTII1和bDsbA1的TIR强度(表3)。mMalE1和mPhoA1与重链融合都产生比bDsbA1显著更低的全长5D5和可溶性周质重链(图1C)。
为了确定信号肽对重链从胞质分泌至周质的影响，我们监测了成熟重链和前体重链的存在。胞质中或内膜中的未分泌周质蛋白质将保留信号肽序列。在易位至周质的过程中，肽酶切割信号肽[6,7]。因此，释放至周质的成熟蛋白质将不含信号肽。前体和成熟重链之间的分子量差异仅为1-2kDa，这难以在SDS-PAGE上分辨。因此，进行了N端蛋白质测序来在前体和成熟重链之间进行区分。来自全细胞样品的还原重链在SDS-PAGE上作为单一条带迁移。将SDS-PAGE中的蛋白质转移至PVDF膜。从PVDF膜切下重链条带，并进行Edman测序。在重链与STII、MalE或PhoA信号肽融合时，检测到匹配前体或成熟重链二者的序列(表4)，表明一些重链保留在胞质中或在内膜中。在重链与DsbA信号肽融合时，匹配前体的序列非常少或检测不到。我们用峰强度估计了成熟重链与前体重链的比值，并用初始产率半定量了分泌重链的百分比。两种方法都显示，在与DsbA信号肽融合时，大多数所测序的肽对应于成熟重链(表4)，表明重链有效地分泌至周质间隙(表4)。因此，DsbA信号肽介导比STII、MalE或PhoA信号肽更有效的重链加工(从重链前体至成熟重链)。
我们还进行了免疫金电镜术(immunoEM)来直接显示重链在与不同信号肽融合时的细胞定位。对从摇瓶培养物收集的细菌进行冷冻切片，用αFc-HRP抗体、然后用αHRP-18nm金颗粒二抗探测，并在透射电镜(TEM)下分析。对于表达STII轻链和STII重链的细菌，周质中可见非常少的免疫金信号。大多数金标记在胞质侧观察到，表明重链主要困在胞质中(图2A)。相反，对于表达STII轻链和DsbA重链的细菌，金标记主要在周质侧检测到(图2B)。概括起来，这些结果证明，在相似的翻译水平下，使用DsbA信号肽产生比使用另外三种信号肽更有效的重链易位和更多的重链在周质中的累积。
信号肽的疏水性对抗体重链分泌至周质和在周质中累积很重要。为了探究为什么DsbA信号肽在重链分泌中更有效的机制，我们将DsbA信号肽的氨基酸序列与STII、MalE和PhoA信号肽进行了比较。虽然一级序列存在多样性，但信号肽主要由三个不同区域组成：包含1或2个带正电荷的氨基酸残基的N端区、通常称为H区的疏水核心区和信号肽酶识别的C端区[8]。DsbA信号肽的H区和全长序列都比STII、MalE和PhoA信号肽更疏水(表2)。我们想知道信号肽的疏水性是否在抗体重链向周质易位中发挥重要作用。
通过定位诱变调变DsbA和STII信号肽的疏水性。在DsbA信号肽中将亮氨酸11(L11)取代为丝氨酸(S)降低了DsbA信号肽的总体和平均疏水性(表7和表2)。产生了DsbA信号肽中的亮氨酸11至异亮氨酸(I)的突变作为对照。在STII信号肽序列中，将丝氨酸11突变为亮氨酸或异亮氨酸来提高疏水性(表7和表2)。突变的信号肽各与成熟PhoA蛋白质融合进行TIR强度测量。使具有与STII信号肽TIR1或DsbA信号肽TIR1(表3)相似的TIR强度的疏水性信号肽变体与抗体5D5重链融合。为了排除由于轻链可能与重链相互作用和/或竞争同一分泌机器而产生的可能的影响，我们设计了仅表达重链而不表达轻链的质粒。
通过周质提取物的Western印迹分析监测了信号肽疏水性变体对重链在周质中的累积的影响(图3B)。在缺乏轻链表达的情况下，使用DsbA信号肽比使用STII信号肽产生更多的周质中的可溶性重链。通过L11S突变降低DsbA信号肽的疏水性强烈降低可溶性重链的周质水平，而DsbA信号肽L11I对照的使用未显示重链水平的大的变化(图3A)。另一方面，提高STII信号肽的疏水性提高了周质中可溶性重链的水平(图3A)。
为了进一步确认信号肽疏水性对5D5重链分泌的影响，我们产生了具有一系列不同疏水性的附加信号肽变体(表2；表8)，并使它们与5D5重链融合。在ST11信号序列中，将丝氨酸11突变为提高总体和平均疏水性的丙氨酸(A)、仅轻微提高疏水性的酪氨酸(Y)、或降低STII疏水性的谷氨酰胺(Q)。我们还通过产生Ala6(A6)至亮氨酸、丙氨酸10(A10)至亮氨酸和丝氨酸11(S11至亮氨酸的三重突变来产生了高度疏水的STII信号肽(STII A6L,A10L,S11L)。在DsbA序列中，将亮氨酸11突变为丙氨酸(A)或谷氨酰胺(Q)来降低总体和平均疏水性。所有信号肽变体都具有与STII信号肽TIR1或DsbA信号肽TIR1相似的TIR强度(表3)。
通过上述N端测序来测定缺乏轻链的情况下5D5重链分泌至周质的效率(表5)。使用DsbA信号肽导致大多数重链是成熟重链，存在非常少的前体重链，表明DsbA信号肽介导的5D5重链分泌是有效的。针对对照DsbA L11I变体观察到了相似的结果。通过L11A、L11S或L11Q降低DsbA信号肽的疏水性降低了分泌效率，因为检测到了比成熟5D5重链多的前体。另一方面，用非定量Edman测序显示STII和STII S11Q都不介导有效的5D5重链分泌，而STIIS11L改善分泌。半定量Edman测序显示STII和STII S11Y介导低效的5D5重链分泌；但是，STII S11Q突变提高分泌的5D5重链的百分比。通过S11A或S11L突变提高STII信号肽疏水性提高了分泌效率。此外，S11L单残基突变足以实现有效的5D5重链分泌，因为具有相似翻译强度的高度疏水的STII信号肽信号变体(STII A6L、A10L、S11L)未进一步提高分泌效率。概括起来，调变信号肽疏水性同时控制TIR强度极大地影响5D5重链分泌至周质的效率。
在轻链与重链共表达时观察到了相似的结果。在抗体5D5轻链与STII信号肽(mSTII1)融合时，DsbA L11S信号肽的使用导致比使用DsbA或DsbA L11I信号肽显著更少的周质中的水溶性重链。类似地，使用STII S11L或STII S11I信号肽介导比STII信号肽更多的可溶性重链累积在周质中(图3B)。概括起来，调变信号肽疏水性显著改变了5D5重链在周质中的累积。通过单个氨基酸改变提高疏水性显著提高了可溶性重链的周质水平，而降低疏水性具有相反的作用。
我们进一步通过N端测序分析了信号肽疏水性对重链加工的影响(表4)。在每种情况下，使5D5轻链与STII信号肽(mSTII1)融合。在使重链与DsbA和DsbA L11I信号肽融合时，通过N端测序检测到了主要的成熟重链信号和非常少的前体信号。使用基于峰强度的估计，对于使用DsbA信号肽的构建体，成熟重链与前体重链的比值为超过10:1。DsbA信号肽中的L11S突变使成熟/前体比值降低至1:3，因为检测到比成熟重链信号更多的前体重链信号。STII信号肽产生比前体信号少的成熟重链信号，成熟/前体比值为1:3。通过S11L或S11I突变提高STII信号肽疏水性产生比前体重链多的成熟重链(3:1和4:1)。使用来自Edman测序的初始产率的半定量确认了信号肽疏水性对5D5重链分泌的影响。使用DsbA信号肽产生～86％分泌重链；L11S突变使分泌重链的百分比降低至39％。STII介导39％分泌重链；S11L和S11I突变使重链分泌提高至超过60％。概括起来，信号肽的疏水性对抗体重链加工和分泌至周质很重要。
来自SfmC的高度疏水信号肽的研究也支持信号肽疏水性对5D5分泌的影响。SfmC是预测的定位在周质中的菌毛蛋白蛋白质。SfmC的分泌依赖于共翻译分泌途径中的信号识别颗粒(SRP)(Huber等,J Bacteriol.2005.2983-2991；Zhou等,2014.PLOS One)。SfmC的信号肽比DsbA或STII的信号肽更疏水(表3)。我们产生了SfmC信号肽的TIR1和TIR2变体，并使它们各与5D5重链融合。两种变体都介导非常有效的5D5重链分泌(100％分泌重链)。
信号肽疏水性对全长抗体水平的影响。我们随后分析了信号肽疏水性对全长抗体产生的影响。收集来自表达5D5重链和轻链的宿主细胞的裂解物，通过非还原SDS-PAGE电泳后进行Western印迹来分析完全组装的抗体5D5的水平。在每种情况下，使5D5轻链与STII信号肽(使用mSTII1核酸序列)融合。与用DsbA或DsbA L11I信号肽与重链融合相比，DsbAL11S信号肽与重链融合导致全长5D5水平显著降低(图4A)。另一方面，与使用STII信号肽相比，STII信号肽中的S11L和L11I突变都提高全长5D5抗体水平(图4B)。因此，提高信号肽的疏水性促进了全长5D5抗体的产生。
我们想知道信号肽疏水性的影响是否适用于其他抗体重链。为此，我们将STII、STII S11L、DsbA或DsbA L11S TIR1信号肽与mAb1或mAb2的重链融合，并用Edman测序测量缺乏轻链的情况下重链的分泌效率(表6)。对于两种抗体重链，DsbA比STII介导更多的分泌重链。通过L11S突变降低DsbA的疏水性降低了分泌重链的百分比，通过S11L突变提高STII的疏水性显示相反的作用。
我们进一步测试了信号肽疏水性对另外两种单克隆抗体mab 1和mab2的全长抗体产生的影响(图7)。Mab 1和mab 2各为全长IgG1抗体。在两种情况下，使轻链与mSTII1融合，使重链与具有相似TIR强度的STII、DsbA、STII S11L或DsbA L11S融合。按之前所述测定全长抗体水平、周质可溶性重链水平和总重链水平。对于mAb 1，STII或DsbA信号肽与重链融合产生相似的全长抗体和周质可溶性重链水平；但是，使用疏水性降低的DsbA L11S信号肽变体显著降低了全长mAb1和周质可溶性重链水平，表明信号肽疏水性对mAb1产生和分泌入周质而言仍是重要的因素。对于mAb2，使用STII信号肽产生比使用DsbA信号肽更少的全长抗体和更少的周质可溶性重链。通过S11L突变提高STII信号肽疏水性导致全长mAb2以及周质可溶性重链累积的增加，而通过L11S突变降低DsbA信号肽的疏水性具有相反的作用。因此，信号肽疏水性对mAb2产生和分泌入大肠杆菌周质很重要。
调变信号肽疏水性改变了内含体的细胞定位。大肠杆菌中过量表达的重组蛋白质常包含在胞质中或周质中的称为内含体的大的不溶性聚集体中。包含目的蛋白质的内含体的形成常与低水平的可溶性靶蛋白质相关。此外，胞质中的内含体形成表明蛋白质分泌至周质的低效率。使用透射电镜术(TEM)，我们主要在表达与mSTII1融合的轻链和与STII、MalE或PhoA信号肽融合的重链的宿主细胞的胞质中观察到内含体(图5)，表明这些细胞中低效的蛋白质分泌。相反，对于表达STII-LC和DsbA-HC的宿主细胞，内含体不常观察到，且大部分定位在周质中(图5)，表明有效的蛋白质分泌。有趣的是，使用STII S11L信号肽(具有提高的疏水性)显示类似于DsbA信号肽表型的表型：内含体大多定位在周质侧(图5)。使用DsbA L11S信号肽(具有降低的疏水性)导致主要在胞质中观察到内含体(图5)。总结起来，调变信号肽疏水性改变了内含体的细胞定位。
信号肽C端结构域中的突变不改变全长抗体产生。信号肽的C端区对肽酶切割信号肽至关重要。先前的研究显示，此区域通常在切割位点中的-1和-3位处偏好具有小的侧链的氨基酸残基[6]。STII和DsbA信号肽都在-1和-3位具有小的残基(Ala)(图3A)。但是，在DsbA序列中的-2位处，存在小的残基丝氨酸，而在STII序列中的同一位置处，存在大的残基(Tyr(Y))。图6显示，切割位点中的-2氨基酸位置中侧链大小的改变不影响抗体5D5产生。STII信号肽中Tyr22至Ser的突变不改变5D5水平。类似地，DsbA信号肽中Ser18至Tyr的突变对5D5水平无影响。因此，-2氨基酸位置中的侧链庞大不影响周质中的5D5水平。
表2：信号肽变体的氨基酸序列
Figure GDA0001334422310001051
Figure GDA0001334422310001061
下划线＝氨基酸序列中的突变
总疏水性(sum hydro)基于Eisenberg等开发的归一化共有量表[20]计算
平均疏水性＝信号序列的总疏水性除以氨基酸残基数
总疏水性(H)＝H区的总疏水性
平均疏水性(H)＝H区的平均疏水性
表3.信号肽变体的DNA序列和相对TIR强度
Figure GDA0001334422310001062
Figure GDA0001334422310001071
Figure GDA0001334422310001081
黑体＝BssHII、MluI或XbaI限制位点
下划线＝产生来改变氨基酸序列的突变
表4.与5D5轻链共表达的5D5重链的分泌
Figure GDA0001334422310001082
*估计的成熟/前体比值基于峰强度的粗略估计。
**分泌HC％通过材料和方法章节中所述的成熟重链和前体的初始产率的半定量来测定。
表5.缺乏5D5轻链情况下5D5重链的分泌
Figure GDA0001334422310001083
Figure GDA0001334422310001091
*分泌HC％通过材料和方法章节中所述的成熟重链和前体的初始产率的半定量来测定。
表6.缺乏轻链的情况下mAb1重链和mAb2重链的分泌
用于重链的信号肽 负荷重链 分泌HC％*
bSTII1 mAb1 HC 35
bSTII1 S11L密码子2 mAb1 HC 78
bDsbA1 mAb1 HC 86
bDsbA1 L11S mAb1 HC 12
bSTII1 mAb2 HC 17
bSTII1 S11L密码子2 mAb2 HC 77
bDsbA1 mAb2 HC 89
bDsbA1 L11S mAb2 HC 71
*分泌HC％通过材料和方法章节中所述的成熟重链和前体的初始产率的半定量来测定。
表7.DsbA信号序列、STII信号序列和具有改变的疏水性的变体信号序列的氨基酸序列。N端区以黑体、H区以斜体、C端区以常规字体标记。突变残基下划线。
信号肽 氨基酸序列 SEQ ID NO:
DsbA MKKIWLALAGLVLAFSASA 47
DsbA L11I MKKIWLALAG<u>I</u>VLAFSASA 49
DsbA L11S MKKIWLALAG<u>S</u>VLAFSASA 50
STII MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA 51
STII S11L MKKNIAFLLA<u>L</u>MFVFSIATNAYA 52
STII S11I MKKNIAFLLA<u>I</u>MFVFSIATNAYA 53
表8.DsbA信号序列、STII信号序列、具有改变的疏水性的变体信号序列和SfmC信号序列的氨基酸序列。N端区以黑体、H区以斜体、C端区以常规字体标记。突变残基下划线。
信号肽 氨基酸序列 SEQ ID NO:
DsbA MKKIWLALAGLVLAFSASA 54
DsbA L11A MKKIWLALAG<u>A</u>VLAFSASA 55
Dsba L11Q MKKIWLALAG<u>Q</u>VLAFSASA 56
STII MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA 57
STII S11A MKKNIAFLLA<u>A</u>MFVFSIATNAYA 58
STII S11Q MKKNIAFLLA<u>Q</u>MFVFSIATNAYA 59
STII S11Y MKKNIAFLLA<u>Y</u>MFVFSIATNAYA 60
STII A6L,A10L,S11L MKKNI<u>L</u>FLL<u>LL</u>MFVFSIATNAYA 61
SfmC MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA 62
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虽然已为了理解的清晰性的目的，以说明和实例的方式较为详细地描述了前述发明，但该描述和实例不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地以其整体引入作为参考。
Figure IDA0001113606130000011
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Claims (41)

1.提高包含抗体重链和/或抗体轻链的抗体从大肠杆菌宿主细胞的分泌的方法，其包括培养大肠杆菌宿主细胞，该大肠杆菌宿主细胞包含：(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的第一多核苷酸；和(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的第二多核苷酸，其中第一和第二信号肽选自：序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31和33所示的变体信号肽，
由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体。
2.权利要求1的方法，其中宿主细胞中的多核苷酸进一步包含启动子。
3.权利要求2的方法，其中启动子是选自phoA、tac、lpp、lac-lpp、lac、ara和T7启动子的原核启动子。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中大肠杆菌宿主细胞属于缺乏内源蛋白酶活性的菌株。
5.权利要求4的方法，其中大肠杆菌的基因型缺乏degP和prc基因并且携带突变spr基因。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中宿主细胞进一步包含编码选自DsbA、DsbC、DsbG和FkpA的至少一种原核多肽的多核苷酸。
7.权利要求6的方法，其中所述多核苷酸编码DsbA和DsbC。
8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法还包括从宿主细胞培养物回收抗体。
9.权利要求1-3中任一项的方法，其中抗体是单克隆抗体。
10.权利要求9的方法，其中单克隆抗体是嵌合抗体、亲和力成熟抗体、双特异性抗体、人源化抗体或人抗体。
11.序列SEQ ID NO:13或15所示的变体DsbA信号肽。
12.序列SEQ ID NO:8、11、31或33所示的变体STII信号肽。
13.权利要求11或12的变体信号肽，其与异源多肽融合。
14.权利要求13的变体信号肽，其中异源多肽选自抗体重链、抗体轻链、抗体轻链和重链、多体多肽或免疫黏附素。
15.多核苷酸序列，其编码权利要求11或12的变体信号肽。
16.权利要求15的多核苷酸序列，其与编码异源多肽的多核苷酸有效连接，由此在宿主细胞中表达异源多肽时，异源多肽折叠并组装形成具有生物学活性的异源多肽。
17.权利要求16的多核苷酸，其中宿主细胞是原核宿主细胞。
18.权利要求17的多核苷酸，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
19.编码抗体的多核苷酸，所述多核苷酸包含(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的编码第一信号肽的多核苷酸和(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的编码第二信号肽的多核苷酸，由此在宿主细胞中表达抗体时，重链和轻链折叠并组装形成具有生物学活性的抗体，其中第一和第二信号肽是选自序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31和33的变体信号肽。
20.权利要求19的多核苷酸，其中编码抗体的多核苷酸进一步包含(3)与编码Fc多肽的多核苷酸有效连接的编码第三信号肽的多肽。
21.权利要求20的多核苷酸，其中第三信号肽是选自序列SEQ ID NO:8、11、13、15、31、33和42的变体信号肽。
22.权利要求16-21中任一项的多核苷酸，其进一步包含与异源多肽有效连接的启动子。
23.权利要求22的多核苷酸，其中启动子是选自phoA、tac、lpp、lac-lpp、lac、ara、trp和T7启动子的原核启动子。
24.权利要求23的多核苷酸，其中所述启动子是phoA启动子。
25.权利要求16-21中任一项的多核苷酸，其进一步包含：(a)第一启动子，其中第一启动子与轻链有效连接；和(b)第二启动子，其中第二启动子与重链有效连接。
26.权利要求25的多核苷酸，其中第一和第二启动子都是phoA启动子。
27.权利要求25或26的多核苷酸，其进一步包含：(c)第三启动子，其中第三启动子与Fc多肽有效连接。
28.权利要求27的多核苷酸，其中第三启动子都是phoA启动子。
29.权利要求16-18中任一项的多核苷酸，其中异源多肽是蛋白酶、免疫黏附素、受体胞外域、异源多体蛋白质或抗体。
30.权利要求19的多核苷酸，其中抗体是单克隆抗体。
31.权利要求30的多核苷酸，其中单克隆抗体是嵌合抗体、双特异性抗体、人源化抗体、抗体片段、单臂抗体片段或人抗体。
32.载体，其包含权利要求16-31中任一项的多核苷酸。
33.组合物，其包含权利要求16-31中任一项的多核苷酸。
34.宿主细胞，其包含权利要求16-31中任一项的多核苷酸。
35.权利要求34的宿主细胞，其中宿主细胞是原核细胞。
36.权利要求34-35中任一项的宿主细胞，其中宿主细胞进一步包含编码原核分子侣伴蛋白质的多核苷酸。
37.权利要求36的宿主细胞，其中宿主细胞过量表达原核分子侣伴蛋白质。
38.制备异源多肽的方法，所述方法包括培养权利要求34-37中任一项的宿主细胞，使得核酸表达，由此在宿主细胞中表达所述多核苷酸时，异源多肽折叠形成具有生物学活性的异源多肽。
39.从细胞分泌异源多肽的方法，所述方法包括培养权利要求34-37中任一项的宿主细胞，使得核酸表达，并分泌异源多肽。
40.从细胞易位异源多肽的方法，所述方法包括培养权利要求34-37中任一项的宿主细胞，使得核酸表达，并易位异源多肽。
41.权利要求38-40中任一项的方法，其中所述异源多肽是抗体重链和/或轻链。
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