CN1549821A - 进行抗体表达和装配的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在宿主细胞系统，例如原核和真核的表达系统中，表达并产生重组抗体的方法和组合物。本发明具体涉及分时分别表达抗体轻链和重链的重组系统。抗体产物，包括抗体片段，可用于生物学研究、诊断以及医学治疗的各个方面。

Description

进行抗体表达和装配的系统
技术领域
本发明主要涉及分子生物学和蛋白质技术领域。更具体地，本发明涉及重组制备的抗体及其用途。
背景技术
近年来，抗体作为各种疾病的诊断和治疗制剂的前景越来越令人鼓舞。很多研究和临床应用要求大量的功能性抗体或抗体片段，因此需要成倍增长、但又经济的抗体制备系统。特别有用的是，利用从诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等原核细胞，到酵母、植物、昆虫细胞以及哺乳动物细胞等各种表达宿主，通过重组方法制备抗体Kipriyanov and Little(1999)Mol.Biotech.12：173-201。
与其它抗体制备系统相比，细菌，尤其是大肠杆菌有很多独特的优点。所用原料(即细菌细胞)价格便宜且易于培养，因此产物的成本降低。原核宿主的生长速度比哺乳动物细胞等快得多，能够对遗传操作更快地进行分析。代时短和易于按比例扩增也使细菌发酵成为大量生产蛋白的一种更具吸引力的方式。很多细菌物种，包括大肠杆菌，它们的遗传结构和生物学活性都已经研究得很透彻，而且目前已经能够提供广泛多种合适的载体，因此目标抗体的表达更为方便。与真核生物相比，生产工艺涉及的步骤较少，包括对重组基因的操作，宿主中多拷贝的稳定转化，产物的表达诱导和鉴定。Pluckthun and Pack(1997)Immunotech 3：83-105。此外，大肠杆菌特有随机进入细胞的途径。由于质粒转化或噬菌体转染的强大效力，大肠杆菌可以用于构建多种类型抗体变体的噬菌体文库，这对于功能性基因组研究尤其重要。
有多种方法已经用于在细菌中制备重组抗体。与其它异源蛋白相似，从细菌获得抗体分子的方式包括，使表达在细胞质中的包涵体重新折叠(refolding)，或先进行表达然后分泌到细菌周质中。分泌还是重新折叠，对此的选择通常受数种条件影响。分泌一般是更快和更常用的抗体制备策略。Kipriyanov and Little(1999)，出处同上。
Opper等的美国专利6,008,023描述了一种大肠杆菌胞质表达系统，其中抗体片段(如，Fab)与在定向肿瘤治疗中使用的酶融合。Zemel-Dreasen等(1984)Gene 27：315-322报道了一种抗体轻链在大肠杆菌中的分泌和加工。Lo等的PCT申请WO 93/07896报道了缺乏CH2重链区的四聚体抗体在大肠杆菌中的制备。编码其中的轻链和缺乏CH2之重链的基因被构建到相同的表达载体中，受单个启动子的控制。
抗体在原核系统中的表达可以在不同的规模进行。摇瓶培养(2-5升水平)通常产生不到5mg/l的产物。Carter等(1992)Bio/Technology 10：12-16开发了一种高细胞密度发酵系统，它可以高水平表达(高达2g/l)抗体片段。Carter等获得的Fab’的g/l滴度主要是由于更精确控制发酵罐的环境所产生的较高细胞密度，而不是由于简单的摇动烧瓶。该系统包含一种双顺反子性质的操纵子，其设计目的是共表达轻链和重链片段。这种双顺反子性质的操纵子受单个大肠杆菌phoA启动子的控制，该启动子可通过磷酸盐饥饿条件来诱导。每一抗体链的前面是大肠杆菌热稳定肠毒素II(stII)信号序列，它用于指导向周质空间中进行的分泌。Carter等(1992)所描述的这种系统将在下文中进一步讨论。
关于在大肠杆菌中制备抗体的综述，参见Pluckthun and Pack(1997)Immunotech 3：83-105；Pluckthun等(1996)，ANTIBODY ENGINEERING：APRACTICAL APPROACH，pp 203-252(Oxford Press)；Pluckthun(1994)，HANDBOOK OF EXP PHARMCOL VOL 3：THE PHARMCOL OF MONOCLONALANTIBODIES，pp269-315(M.Rosenberg和G.P.Moore编；Springer-Verlag，Berlin)。
很多生物学测定(如X-射线晶体成像)和临床应用(如蛋白治疗)需要大量抗体。因此，需要一种高产的简单系统用于制备正确装配的可溶性功能抗体。
发明概述
本发明提供在宿主细胞，如原核细胞或真核细胞中，重组制备功能性抗体或抗体片段的新方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供了在诸如原核细胞等宿主细胞中分时分别(temporally separating)表达抗体轻链和重链，从而提高装配好的功能性抗体分子的产量的方法。具体地，所述方法包括用两种不同的翻译单元转化宿主细胞，所述不同的翻译单元分别编码轻链和重链；培养所述细胞，所用的培养条件适合于依次表达轻链和重链；将轻链和重链装配成功能性抗体或其片段。在一个优选方面，轻链和重链的分时分别表达，通过利用分别控制轻链和重链的两种不同启动子来实现，其中所述不同启动子在不同条件下活化。例如，可将编码轻链和重链的DNA插入单个质粒载体，但分别在两种翻译单元中，这两种翻译单元各自受互不相同的启动子控制。其中一种启动子(例如，第一种启动子)可以是组成型或诱导型，而另一种启动子(例如第二种启动子)为诱导型。如此一来，当在适合于活化一种启动子(例如第一种启动子)的条件下，培养已经用所述载体转化的宿主细胞时，仅一种链(例如轻链)被表达。然后，使第一种链(例如轻链)表达所需的时间段以后，将培养条件改变为适合于活化另一种启动子(例如，第二种启动子)，并因此诱导第二种链(例如，重链)表达。在一个优选实施方案中，首先表达轻链，然后表达重链。在另一实施方案中，首先表达重链，然后表达轻链。
本发明还提供用于在原核或真核宿主细胞中制备装配好的功能性抗体或其片段的重组载体，所述载体包含第一种启动子和第二种启动子，所述第一种启动子位于第一种翻译单元之前，所述第一种翻译单元编码与轻链可操作相连的分泌信号；所述第二种启动子位于第二种翻译单元之前，所述第二种翻译单元编码与重链可操作相连的分泌信号。第一种和第二种启动子在不同条件下被诱导。
很多原核和真核种类都可以用作本发明抗体表达的宿主。优选地，原核宿主为革兰氏阴性细菌。更优选地，所述宿主为大肠杆菌。在一个方面中，所述宿主细胞是经过遗传改造的适合于大量产生异源蛋白的大肠杆菌菌株。例如，所述宿主细胞可以是含有蛋白酶等位基因突变体，和或dsb基因的额外拷贝的大肠杆菌。很多已知的组成型或诱导型启动子都适用于本发明，只要它们可以与另一种启动子有效地联合应用。
本发明的方法和组合物可用于大量制备广泛多种已经装配好的抗体分子，包括完整抗体或抗体片段如Fab，Fab’，F(ab’)2，F(ab’)2-亮氨酸拉链融合体，Fv和dsFv。更有甚者，本发明的抗体分子可以是人的抗体分子，嵌合抗体分子，人源化抗体分子或亲和成熟的抗体分子。所述抗体可以是特异于任何合适的抗原，优选那些生物学重要的多肽。可以将抗体片段与二聚体化结构域，如亮氨酸拉链结构域融合。
本发明还涉及本文所述方法所制备的抗体的各种诊断和治疗应用。在一个治疗应用中，经重组制备的抗体或其片段在一种治疗中与另一种治疗剂联合使用。
附图说明
图1示抗CD18 F(ab’)2(-亮氨酸拉链)质粒pS1130(单启动子)和pxCD18-7T3(双-启动子)的构建。
图2描述双-启动子构建体pxCD18-7T3中插入的核苷酸序列。
图3示构建体pxCD18-7T3之中的两种翻译单元所编码的氨基酸序列。N-末端STII分泌信号序列用下划线标出。
图4比较了用单启动子系统(pS1130/59A7)和双启动子系统(pxCD18-7T3/59A7)装配的F(ab’)2的产量。
图5描述了使用单启动子表达系统(pS1130)表达抗-CD18的表达图谱。
图6描述了使用双启动子表达系统(pxCD18-7T3)表达抗-CD18的表达图谱。
图7比较了单启动子系统(pS1130)和双启动子系统(pxCD18-7T3)的重链总产量和装配效率。装配效率代表了重链合成的最初10个小时期间，装配到F(ab’)2中的重链级分。
图8示抗-组织因子IgG1质粒paTF130(PhoA/PhoA启动子)和pxTF-7T3FL(PhoA/TacII-启动子)。
图9示PhoA/TacII-启动子构建体pxTF-7T3FL中插入的核酸序列。
图10示构建体pxTF-7T3FL之中的两种翻译单元所编码的氨基酸序列。N-末端STII分泌信号序列用下划线标出。
图11A和11B是还原条件(11A)或非还原条件(11B)下进行western印迹的结果，比较了用相同启动子系统(PhoA/PhoA)和双启动子系统(PhoA/TacII)进行的抗-组织因子IgG1的表达。
优选实施方案
本发明的主要实施方案基于以下意外发现：宿主细胞系统(如大肠杆菌发酵系统)中正确装配的可溶性抗体的产量，可通过分时分别诱导轻链和重链表达而大大提高。通过利用新的重组系统(其中一种链，如轻链，先表达，然后再诱导第二种链，如重链，表达)，相较于轻链和重链同时表达的参照系统，装配好的抗体的滴度增加约两倍。
传统上，抗体利用双顺反子载体在诸如大肠杆菌等宿主细胞中制备，在所述载体中，编码轻链和重链的基因受单个启动子的控制。在适合于活化该启动子的条件下进行培养后，轻链和重链基因同时表达。例如，Carter等(1992)Bio/Technology 10：163-167描述了轻链和重链片段的一种双顺反子性质的操纵子，它受单个大肠杆菌phoA启动子的控制，可以通过磷酸盐饥饿条件来诱导。每一抗体链之前是大肠杆菌热稳定肠毒素II(stII)信号序列，用于指导向周质空间分泌。当用这种载体制备某些抗体时，尤其是当轻链和重链的表达水平都较高时，相当多的单个链分子发生聚集，无法再装配成可溶性功能抗体。双顺反子载体(具有用于控制轻链和重链表达的单个启动子)中的聚集问题将在后文的实施例中进一步阐述。
在不受任何具体理论限制的前提下，聚集的问题可以至少部分归因于单个链在上述条件下进行折叠的有限能力。抗体的各个链在表达、分泌以及装配成功能性抗体的过程中表现不一。例如，一条链(如轻链)在单独分泌到宿主细胞的周质空间之后有可能明显保持可溶性，另一条链(如重链)则在分泌之后很大程度上聚集并且不溶，除非它以装配好的抗体复合物的形式存在。故，可溶性较强的链较早地表达，有利于可溶性较弱的链的折叠以及随后这两条链的装配。另外，宿主细胞通过其分泌体系转移已经表达的多肽的能力有限。在某些情况下，分泌能力的限制可能被扩大，例如，同时表达多个多肽时，或者由具有较强翻译强度的载体表达出大量的前体蛋白时，或者表达出较大分子量的蛋白时，或者上述情况的任意组合。结果，分泌出的是成熟程度较低的蛋白，它们被用于装配抗体复合物。
在不限于任何机制的情况下，本发明提供了一种新的(原核或真核)系统，它可用于以显著较高的产量生产装配好的可溶性功能抗体分子。利用本发明的双启动子表达载体，可以首先合成一条链。表达了一定量的第一条链之后，可以诱导出对变化的培养条件发生应答的第二种启动子控制下的第二条链表达。然后将新表达的第二条链与此前制备的第一条链复合，形成可溶性抗体或其片段。这样一来，通过操控两条链的表达时间，可以指导更多的表达出的抗体链掺入可溶性抗体复合物，从而增加总产量。
本发明的分时表达系统主要通过制备抗体及其片段来举例说明，但应理解，本文所述方法可以应用于，需要产生多个蛋白单元/链、而且中间产物或者最终蛋白复合物需要将上述各个单元/链正确装配才能具有功能的任何系统中。所述方法尤其可以用于制备包含免疫球蛋白样结构域的蛋白复合物，例如，抗体，T-细胞受体，I类和II类MHC分子，整联蛋白，CD8和CD28分子，及其相关片段，衍生物，变体和融合蛋白。
抗体
术语“抗体”是指最广义上的抗体，包括单克隆抗体，多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体(如双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们显示所需生物学活性即可。天然抗体包含四条多肽链，两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)通过二硫键相互连接。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，该恒定区的天然形式包含三个结构域，CH1，CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可以进一步分为多个超变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插着相对保守的区，称为框架区(FR)。VH和VL每一个由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端依次为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
任何脊椎动物的抗体轻链，根据它们的恒定区氨基酸序列，都可以被分配为两种截然不同的型别(κ和λ)中的一种。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分为不同的类。有五大类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，它们中的一些还可以进一步分为亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgA-1，IgA-2等。与不同类免疫球蛋白相对应的重链恒定区结构域分别称为α，δ，ε，γ，和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是已知的，可参见Abbas等Cellular and Mol.Immunology，第4版(2000)。
抗体可以是相对更大的融合分子的一部分，这时，该抗体或抗体的一部分可以与一或多个另外的蛋白或肽以共价或非共价方式结合而形成融合分子。这种融合蛋白的实例包括，用链霉亲和素核心区制备四聚体scFv分子(Kipriyanov等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)，用半胱氨酸残基、标记肽以及C-末端多组氨酸标签制备二价的生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。
本发明涉及单克隆抗体。本文中术语“单克隆抗体”是指，来自基本上同质的抗体群的抗体，即除了可能少量存在的天然突变以外，该抗体群中的各个抗体均相同。单克隆抗体具有高度特异性，直接针对单个抗原。而且，与主要包括针对不同决定簇(表位)的多个不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体直接针对抗原上的单个表位。
本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，以及这些抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性，所述嵌合抗体中，重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但所述链的剩余部分与源自另一个物种或属于另一类或亚类的抗体的相应序列相同或同源(美国专利4,816,567；和Morrison等，美国国家科学院院刊，81：6851-6855(1984))。
“功能性”或“生物活性”抗体是在结构、调节、生物化学或生物物理学事件中能够发挥其一或多种天然活性的抗体。例如，功能性抗体可能具有特异性结合抗原的能力，而这种结合能激发或改变细胞事件或分子事件，如信号传递或酶活性。功能性抗体还可能阻断受体的配体活化过程或者作为激动剂抗体发挥作用。抗体能否发挥其一或多种天然活性取决于多种因素，包括多肽链的正确折叠和装配。本文中，由所公开的方法制备的功能性抗体主要是异四聚体，它们有两条相同的L链和两条相同的H链通过多个二硫键相连并正确折叠。本发明一些方面涉及阻断抗体，抗体拮抗剂和/或抗体激动剂。“阻断”抗体或抗体“拮抗剂”是指，抑制或降低与其结合的抗原的生物学活性者。这种阻断可通过，例如干扰以下事件而发生：配体与受体结合，形成受体复合物，受体复合物中酪氨酸激酶受体的酪氨酸激酶活性和/或酪氨酸激酶残基在受体中的磷酸化或通过受体发生的磷酸化。例如，VEGF拮抗剂抗体与VEGF结合并抑制VEGF诱导血管内皮细胞增生的能力。优选的阻断抗体或拮抗剂抗体彻底抑制抗原的生物学活性。
“抗体激动剂”是指，结合并激活诸如受体等抗原的抗体。一般而言，激动剂抗体与该受体的天然激动剂配体相比，受体激活能力至少在质上相似(并且可能在量上基本相似)。
抗体特异性
本发明可以应用于具有任何合适的抗原结合特异性的抗体或抗体片段。优选地，本发明的抗体特异于作为生物学上重要多肽的抗原。更优选地，本发明的抗体可以用于治疗或诊断哺乳动物的疾病。本发明所得抗体或抗体片段特别可用于作为治疗剂，如阻断抗体，抗体激动剂或抗体偶联物。治疗性抗体的非限制性实例包括，抗-VEGF，抗-IgE，抗-CD11，抗-CD18，抗-组织因子，以及抗-TrkC抗体。对抗非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原)的抗体也包括在本发明范围内。
术语“抗原”在本领域众所周知，包括具有免疫原性的物质(即免疫原)以及诱导免疫不应答或无能的物质(即无能原(anergen))。当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(如受体)或配体，如生长因子。抗原实例包括以下分子：肾素；生长因子，包括人生长因子和牛生长因子；生长激素释放因子；甲状旁腺素；甲状腺刺激素；脂蛋白；α-l-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；前胰岛素；卵泡刺激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，组织因子(TF)，和von Willebrands因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房利钠因子(atrial naturietic factor)；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(调节激活，通常由T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠绒毛膜促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；粘着素(adderssin)；调节蛋白；整联蛋白，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如HER2、HER3或HER4受体；以及上述任何多肽的片段。
本发明抗体的优选抗原包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD34和CD46；ErbB受体家族的成员，例如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，例如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β3整联蛋白、以及包括其α或β亚单位的αv/β3整联蛋白；生长因子如VEGF，组织因子(TF)，和TGF-β；α干扰素(α-IFN)；白细胞介素，例如IL-8；IgE；血型(bloodgroup)抗原Apo2，死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。本文中最优选的目标为VEGF，TF，CD19，CD20，CD40，TGF-β，CD11a，CD18，Apo2和C24。
可溶性抗原或其片段(可选与其它分子偶联的形式)，可用作免疫原来制备抗体。对于跨膜分子，如受体，其片段(例如受体的细胞外结构域)可以用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可以用作免疫原。此类细胞可以源自天然来源(例如癌症细胞系)，或者可以是通过重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其它抗原和它们的形式对本领域技术人员是显而易见的。
本发明的抗体可以具有单特异性，双特异性，三特异性，或更多特异性。多特异性抗体可以特异于单个分子上的不同表位，或者可以特异于不同分子上的表位。设计和制备多特异性抗体的方法是本领域已知的，例如，Millstein等(1983)Nature 305：537-539；Kostelny等(1992)J.Immunol.148：1547-1553；WO 93/17715。
抗体片段
本发明涉及抗体或抗体片段的原核或真核制备。多种形式的抗体片段是本领域已知的，并且包括在本文中。“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留了结合抗原的能力。本发明抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，它具有VL，CL，VH和CH1区；(ii)Fab’片段，它是在CH1区的C末端具有一或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，它具有VH和CH1区；(iv)Fd’片段，它具有VH和CH1区，并且在CH1区的C末端具有一或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，具有抗体单臂的VL和VH区；(vi)dAb片段(Ward等，Nature 341，544-546(1989))，由VH区组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)2片段，一种二价片段，包括两个通过二硫桥在铰链区相连的Fab’片段；(ix)单链抗体分子(如单链Fv；scFv)(Bird等，Science 242：423-426(1988)；Huston等，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“二价抗体(diabodie)”，它在同一条多肽链上包含与轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)(参见，如，EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，它包含一对串联的Fd节段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；美国专利5,641,870)。
本发明还涉及经过修饰而增加了稳定性和/或用于制备多价抗体复合物的抗体片段。对众多医学应用而言，抗体片段必须有足够的对抗变性或蛋白裂解条件的稳定性，而且理想的抗体片段应该能以高亲和力结合靶抗原。目前已开发出多种技术和材料来提供稳定的和或多价的抗体片段。本发明的抗体片段可以与二聚体化结构域融合。在一优选实施方案中，本发明的抗体片段通过与二聚体化结构域(如亮氨酸拉链)结合而二聚体化。
“亮氨酸拉链”是在多种真核转录因子中发现的一种蛋白二聚体化基序，它使两个DNA-结合区适当并列，以便能结合转录增强子序列。亮氨酸拉链的二聚体化通过形成短的平行卷曲螺旋而发生，并且一对α-螺旋彼此缠绕，形成超螺旋。Zhu等(2000)J.Mol.Biol.300：1377-1387。将这些卷曲螺旋结构称为“亮氨酸拉链”，是由于它们在每7个位置中优选一个亮氨酸，这种结构也已用于其它蛋白(包括抗体)的二聚化设计中。Hu等(1990)Science 250：1400-1403；Blondel and Bedouelle(1991)Protein Eng.4：457。已有数种亮氨酸拉链被鉴定为对二聚体和四聚体形式的抗体构建体特别有用。
Pluckthun and Pack(1997)Immunotech.3：83-105；Kostelny等(1992)J.Immunol.148：1547-1553。
抗体变体
本发明还涉及抗体或其片段的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过在抗体核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备。所述修饰包括，例如，抗体的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需特性。可以在形成所述抗体的氨基酸序列时，在其序列中引入氨基酸变化。
一种鉴别抗体中处于诱变优选位置的特定残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells(1989)，Science，244：1081-1085所述的“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如arg，asp，his，lys，和glu)，并用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置，通过在取代位点引入进一步的变体或其它变体，或者引入能提供取代位点的进一步的变体或其它变体，而改进。故，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身的性质不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的进行，在靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的抗体的预期活性。
氨基酸序列插入包括，氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包含100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括，带有N-末端甲硫氨酰残基的抗体，或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括，使抗体的N-或C-末端与酶(例如，针对ADEPT的酶)或能增加该抗体的血清半寿期的多肽进行融合。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使抗体分子中至少一个氨基酸残基被另一种不同的残基取代。最有兴趣进行取代诱变的位点包括超变区，也可以改变FR。保守取代见表1的“优选取代”栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”  栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。
表1
 原始残基 取代举例 优选取代
 Ala(A) val；leu；ile val
 Arg(R) lys；gln；asn lys
 Asn(N) gln；his；asp，lys；arg gln
 Asp(D) glu；asn glu
 Cys(C) ser；ala  ser
 Gln(Q) asn；glu  asn
 Glu(E) asp；gln  asp
 Gly(G) ala  ala
 His(H) asn；gln；lys；arg  arg
 Ile(I) leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸  leu
 Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe  ile
 Lys(K) arg；gln；asn  arg
 Met(M) leu；phe；ile  leu
 Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr  tyr
 Pro(P) ala  ala
 Ser(S) thr；cys  cys
 Thr(T) ser  ser
 Trp(W) tyr；phe  tyr
 Tyr(Y) trp；phe；thr；ser  phe
 Val(V) ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸  leu
抗体的生物学特性的实质性修改可通过选择性取代来完成，所选的取代应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子的靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小，这几方面有显著不同的效应。天然残基根据共有的侧链特性可分为：
(1)疏水性：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸异亮氨酸
(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸
(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸
(4)碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸
(5)影响侧链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸
(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。
与维持抗体正确构象无关的任何半胱氨酸残基也可被取代，通常被丝氨酸取代，以提高该分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反，可在抗体中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性。
取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人的抗体)超变区的一或多个残基。通常，最终选出的用于进一步开发的变体相对于其亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法涉及利用噬菌体展示技术进行亲和力成熟。简单地说，使超变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物融合形成的融合体。然后筛选经噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的超变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的超变区残基。或者，或另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗原与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及其邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有优势特性的抗体以便进一步开发。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子，可通过本领域已知的各种方法制备。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早先制备的抗体变体或未变异的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一或多个氨基酸修饰，从而制备Fc区变体。所述Fc区变体可包含人Fc区序列(如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的Fc区)，其中在一或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(如取代)。
在一个实施方案中，所述Fc区变体可以表现经过改变而全新的Fc受体(FcRn)结合亲和力。这种改变的Fc区可以在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：238，252，253，254，255，256，265，272，286，288，303，305，307，309，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，386，388，400，413，415，424，433，434，435，436，439或447，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。与FcRn的结合降低的那些Fc区变体在Fc区的下列任何一或多个位置包含氨基酸修饰：252，253，254，255，288，309，386，388，400，415，433，435，436，439或447，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。或者，上述Fc区变体可表现出与FcRn的结合增加，并在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。
与FcγR的结合降低的那些Fc区变体，在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：238，239，248，249，252，254，265，268，269，270，272，278，289，292，293，294，295，296，298，301，303，322，324，327，329，333，335，338，340，373，376，382，388，389，414，416，419，434，435，437，438或439，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。
例如，与FcγRI的结合降低的那些Fc区变体，在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：238，265，269，270，327或329，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。
Fc区变体可能表现出与FcγRII的结合降低，并在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：238，265，269，270，292，294，295，298，303，324，327，329，333，335，338，373，376，414，416，419，435，438或439，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。
Fc区变体可能表现出与FcγRIII的结合降低，并在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：238，239，248，249，252，254，265，268，269，270，272，278，289，293，294，295，296，301，303，322，327，329，338，340，373，376，382，388，389，416，434，435或437，其中的Fc区残基编号采用的是Kabat中的EU指数。
具有改变(即改进或消除)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的那些变体可参见WO99/51642。这些变体可能在Fc区的任何一或多个下述氨基酸位置包含氨基酸修饰：270，322，326，327，329，331，333或334。关于Fc区变体，还可参见Duncan & Winter Nature 322：738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；以及WO94/29351。
人抗体，人源化抗体或亲和力成熟的抗体
“人抗体”具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或它是利用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的。人抗体的这种定义特别排出了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本发明既涉及人抗体，也涉及人源化抗体。“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在多数情况下，人源化抗体是下述人免疫球蛋白(受体(recipient)抗体)，其中受体的超变区残基被非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供体(donor)抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力(capacity)的超变区的残基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。这些修饰旨在进一步强化抗体的功能。一般情况下，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变区的全部，其中所有或基本上所有超变环对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分。详见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见以下综述及其中引用的参考文献：Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
“亲和力成熟的”抗体在其一或多个CDR中有一或多个变化，从而导致该抗体针对抗原的亲和力比不具有那些变化的亲本抗体增强。优选的亲和力成熟抗体对靶抗原的亲和力在纳摩尔水平或者甚至是皮摩尔水平。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知的方法来制备。Marks等Bio/Technology10：779-783(1992)描述了通过VH和VL区重排(shuffling)实现亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变可参见：Barbas等Proc Nat.Acad.Sci，USA91：3809-3813(1994)；Schier等Gene 169：147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins等，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
使非人抗体人源化的各种方法为本领域已知。例如，人源化过程可以基本如Winter及其同事(Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)所述，用超变区序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中超变区残基以及可能有一部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
选择可用于制备人源化抗体的人类可变区(重链和轻链)，对降低抗原性非常重要。根据所谓“最适应(best-fit)”方法，针对已知人类可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变区序列。将与啮齿类的序列最相似的人类序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等(1987)J. Mol.Biol.196：901。另一种方法采用人类轻链或重链特定亚型的所有抗体的共有序列衍生特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta等(1993)J.Immunol.，151：2623。
更重要的是，将抗体人源化后仍保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基，通过这种方法，可从受体和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，超变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
抗体衍生物
本发明的抗体和抗体变体，可以通过进一步修饰，而包含本领域已知并且容易得到的其它非蛋白性质的组分。衍生化尤其可用于改进或恢复所述抗体或其片段的生物学特性。例如，对抗体片段进行PEG修饰可以改变稳定性，体内循环半寿期，结合亲和力，溶解度以及对蛋白裂解的抗性。
优选适合于抗体衍生化的组分为水溶性聚合物。水溶性聚合物分子的非限制性实例包括但不限于：聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(同型聚合物或随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇同型聚合物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物(prolypropylene oxide/ethylene oxide co-polymer)，聚氧乙烯化多元醇(如甘油)，聚乙烯醇，及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在生产中有利。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或非分支的。与抗体结合的聚合物数量可以不等，当有不止一个聚合物结合时，它们可以是相同或不同的分子。一般而言，衍生化所用聚合物的数量和类型可以根据以下因素来决定，所述因素包括但不限于：待改进的抗体的具体特性或功能，抗体衍生物是否用于治疗特定疾病。
一般而言，由本文所述原核表达系统产生的抗体或抗体片段未经糖基化，并且其Fc区缺乏可以检测到的效应子活性。在一些情况中，可能希望至少部分地恢复天然抗体的一或多种效应子功能。因此，本发明涉及将适当的组分与非糖基化抗体Fc区中鉴定出的位点结合，从而恢复效应子功能的方法。用于此目的的优选组分是PEG，也可以采用其它碳水化合物聚合物。PEG化可以通过本领域已知的任何PEG化反应来进行。参见，例如，EP 0401384；EP 0154316；WO 98/48837。在一个实施方案中，首先用半胱氨酸残基取代所述抗体上鉴定出的位置(如抗体或抗体变体通常被糖基化的位置，或者抗体表面的位置)上的残基。优选用半胱氨酸取代下列一或多个位置上的残基：297，298，299，264，265和239(编号按照Kabat中的EU指数)。表达后，这种半胱氨酸取代型抗体变体可以有各种形式的PEG(或预合成的碳水化合物)与游离半胱氨酸残基进行化学连接。
抗体制备
载体构建
本文中术语“载体”是指能转运与它相连的另一种核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，它是指一种环状双链DNA环，其中连接了其它DNA节段。另一类载体是病毒载体，其中已将其它DNA节段连接到病毒基因组中。某些载体能在其所导入的宿主细胞中进行自我复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体，以及哺乳动物附加体载体)。其它载体(如，哺乳动物非-附加体载体)可以通过引入宿主细胞而整合到宿主细胞的基因组中，然后随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导与其可操作相连的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“重组载体”)。一般情况下，重组DNA技术中应用的表达载体常常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。
本文中术语“翻译单元”是指一种遗传元件，它包含编码多肽链及其邻接的控制区的核苷酸序列。“邻接的控制区”包括，例如，翻译起始区(下文称TIR)和终止区。
本文中“翻译起始区”或TIR是指，使目的基因的有效翻译起始的核酸区。一般情况下，具体翻译单元内部的TIR涵盖核糖体结合位点(RBS)以及RBS的5’和3’侧序列。RBS最起码包含Shine-Dalgarno区和起始密码子(AUG)。因此，TIR还包括需要翻译的核酸序列的至少一部分。优选TIR包括编码分泌信号肽的序列，它位于翻译单元内部的轻链或重链编码序列之前。TIR变体在TIR区内部包含改变TIR效力(如下文定义的其翻译强度)的序列变异(尤其是取代)。优选本发明的TIR变体在位于翻译单元内部轻链或重链编码序列之前的信号序列的最初约2-约14个密码子，优选约4-12个密码子，更优选约6个密码子内部包含序列取代。
本文中术语“翻译强度”是指，在对照系统中分泌多肽的度量值，在所述系统中，一或多个TIR变体被用于指导多肽分泌，并且结果与野生型TIR或一些其它对照在相同培养和试验条件下进行比较。在不受任何一种理论限制的前题下，本文中的“翻译强度”包括，例如，mRNA稳定性、核糖体与核糖体结合位点结合的效力、以及跨膜转运模式，的度量值。
“分泌信号序列”或“分泌信号肽”是指一种短的氨基酸序列，它可用于指导新合成的目的蛋白跨过细胞膜，例如原核细胞的内膜或内膜加外膜。这样以来，在例如原核细胞中，目的蛋白如轻链或重链多肽被分泌到原核宿主细胞的周质中或者被分泌到培养基中。分泌信号序列可以是该宿主细胞的内源序列，或者可以是外源序列，包括需要表达的多肽的天然信号序列。分泌信号序列通常位于多肽的N-末端，并且通常在所述多肽的生物合成和从细胞质分泌这两个过程之间被酶解除去。因此，分泌信号序列一般不会出现在最终的蛋白产物中。
本文中术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)是指已经发生遗传改变的细胞，或者是指能通过引入外源多核苷酸(如重组质粒或载体)而发生遗传改变的细胞。应理解，所述术语不仅是指具体的主体细胞，还指这类细胞的后代细胞。在成功传代中由于突变或环境影响而可能发生某些修饰，故事实上所述后代可能并不完全等同于亲代细胞，但它们仍包括在本文所述“宿主细胞”的范畴内。
编码本发明抗体分子的轻链和重链的DNA序列可以用标准的重组DNA技术获得。所需DNA序列可以从抗体生成细胞如杂交瘤细胞中分离并测序。或者，可以用核苷酸合成仪或PCR技术合成该DNA。一旦获得了编码轻链和重链的DNA，就可以将它们插入能在原核或真核宿主中复制、表达并分泌外源多核苷酸的重组载体中。为了本发明的目的可以采用现有的以及本领域已知的多种载体。对适当载体的选择取决于需要插入的核酸的大小，以及希望用该载体转化的具体宿主细胞。
一般用包含来源于宿主细胞相容性物种的复制子和控制序列的重组载体作为亲代载体，来构建本发明的具体载体。载体通常携有复制起点和标记序列作为基本组成，所述标记序列能在经过转化的细胞中提供表型选择。复制起点是能使载体在一或多个选定的宿主细胞内复制的核酸序列。一般在克隆载体中，该序列是能使载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，它包括复制起点或自我复制序列。这样的序列对于各种细菌、酵母和病毒而言是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌。
表达载体和克隆载体可包含筛选基因，也称为可筛选标记。典型的筛选基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素等的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物质，例如为芽孢杆菌提供编码D-丙氨酸消旋酶的基因。筛选方案的一个实例是利用药物阻滞宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生能赋予药物抗性的蛋白，从而在筛选过程中存活。适合于转化大肠杆菌的质粒载体的实例是pBR322。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并因此提供了鉴定转化细胞的简单方法。pBR322的衍生物或其它微生物质粒或噬菌体也可以用作亲代载体。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例详见Carter等的美国专利5,648,237。
除此之外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体也可以作为转化载体与它们的宿主一起使用。例如，象λGEM.TM.-11这样的噬菌体可以用于制备那些能用于转化易感宿主细胞(如大肠杆菌LE392)的重组载体。
根据一个实施方案，本发明的重组载体至少包含两个翻译单元，一个用于轻链表达，另一个用于重链表达。而且，用于轻链和重链的这两个翻译单元受不同启动子控制。启动子是位于编码序列起点的上游(5′)、并控制编码序列表达的非翻译序列(通常约100-1000bp)。这类启动子一般分为两类：诱导型和组成型。诱导型启动子是指，当培养条件发生一些改变，例如存在或缺乏某种营养，或者改变温度或pH时，应答这样的改变而使受其控制的DNA的转录水平升高的那些启动子。
为了本发明的目的，可以用组成型或诱导型启动子作为第一种启动子来控制第一条链的及时表达，并用诱导型启动子作为第二种启动子来控制随后第二条链的表达。在一个优选实施方案中，所述第一种启动子和第二种启动子都是受到严格(tight)调节的诱导型启动子。由各种潜在的宿主细胞识别的非常多种启动子是本领域已知的。选定的启动子序列可以通过限制酶消化从源头DNA分离并插入本发明的载体中。另一种方法是合成所选定的启动子。天然启动子序列和多种异源启动子都可以用于指导靶基因的扩增和/或表达。但优选异源启动子，因为它们与天然靶多肽的启动子相比，通常能进行更强的转录，并且靶基因的表达量更高。
适合于在原核宿主中应用的启动子包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac或trc启动子。然而，其它已知能在细菌中发挥作用的启动子(例如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是适合的。它们的核苷酸序列已经被公开，因此本领域技术人员可以用能提供任何所需的限制酶位点的接头或衔接子，将它们与编码靶轻链和重链的翻译单元连起来(Siebenlist等(1980)Cell 20：269)。更优选用于本发明的启动子是PhoA启动子和TacII启动子。能在真核宿主细胞中发挥作用的启动子是本领域已知的，例如美国专利6,331,415中描述的那些。这类启动子的实例可包括从多瘤病毒、腺病毒2型或猴病毒40(SV40)衍生的那些。
本发明重组载体的每一翻译单元包含插入基因充分表达所必需的附加非翻译序列。重组载体的这类必需序列是本领域已知的，包括，例如，位于起始密码子5’侧的Shine-Dalgarno区和位于翻译单元3’末端的转录终止子(如，λto)。
重组载体的每一翻译单元还包含能指导所表达的多肽链跨膜分泌的分泌序列组分。一般情况下，分泌信号序列可以是载体的组成部分，或者可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为本发明目的而选定的分泌信号序列应该是可以由宿主细胞识别并加工(即通过信号肽酶裂解)的信号序列。对于不能识别并加工所述异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp，或热稳定肠毒素II(STII)前导区，LamB，PhoE，PelB，OmpA或MBP的原核信号序列替换所述天然信号序列。在本发明一个优选实施方案中，表达系统的两个翻译单元中用到的信号序列都是STII信号序列或其变体。优选编码这类信号序列的DNA与编码轻链或重链的DNA的5’-连接，并且位于同一阅读框内，以便形成融合多肽。一旦从宿主细胞的细胞质中分泌出来，信号肽序列就从成熟多肽上被酶解下来。
在本发明一些方面中，轻链和重链除了表达时间不同以外，表达量之比也受到调节，目的是使最终分泌出的正确装配的抗体或其片段产量最大。所述调节是通过同时调节本发明重组载体中轻链和重链的翻译强度来实现的。一种调节翻译强度的技术由Simmons等的美国专利5,840,523公开。简言之，该方法利用了翻译单元内部翻译起始区(TIR)的变体。对于一种给定的TIR，可以在一定翻译强度范围内生成一系列氨基酸或核酸序列变体，从而能方便地调整该因子，使特定链的表达达到所需水平。TIR变体可以通过导致密码子改变从而改变氨基酸序列的常规诱变技术来制备，但优选在核苷酸序列中产生静默改变(如下述)。TIR中的改变包括，例如，Shine-Dalgarno序列的数目或间隔(spacing)的改变，以及信号序列中的改变。产生突变型信号序列的一种优选方法是，在编码序列的最开始处生成一种不改变该信号序列的氨基酸序列(即为静默改变)的“密码子库”。这可以通过改变每一密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，一些氨基酸，如亮氨酸，丝氨酸，和精氨酸有多个可以在生成上述库时增加复杂性的第一和第二位置。这种诱变方法详见Yansura等(1992)METHODS：A Companion to Methods inEnzymol.4：151-158。
优选生成一套载体，使其具有对应于每一翻译单元的TIR强度。这种限定使得能够在各种TIR强度组合下比较每条链的表达水平以及抗体产物的产量。TIR强度可以按照Simmons等的美国专利5,840,523的详细描述定量报告基因的表达水平来确定。为了本发明的目的，载体中一对具体的TIR的翻译强度组合可以表示为(N-轻链，M-重链)，其中N是轻链的相对TIR强度，M是重链的相对TIR强度。例如，(7-轻链，3-重链)是指，载体在轻链表达方面的相对TIR强度约为7，在重链表达方面的相对TIR强度约为3。根据翻译强度的比较，选出所需的各个TIR，组合在本发明的表达载体构建体中。
含有一或多个上述组分的合适载体利用标准连接技术和或本领域已知的其它分子克隆技术构建。将分离的质粒或DNA片段切割，裁剪(tailor)，并重新连接成能产生所需质粒的形式。
为了分析证实所构建的质粒中的正确序列，用连接混合物转化大肠杆菌菌株，通过氨苄青霉素或四环素抗性选出成功转化体。从转化体制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析，和/或通过Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467或Messing等(1981)Nucleic Acids Res.9：309所述方法，或Maxam等(1980)Methods in Enzymology 65：499所述方法测序。可以采用多种市售自动测序仪测定质粒的序列。例如，ABI PRISM3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA)是一种自动毛细电泳测序仪，它能分析荧光标记的DNA片段。该仪器附带的测序化学指南(Sequencing Chemistry Guide)中介绍了样品的制备。
适合于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。有用的细菌的实例包括埃希氏菌(如大肠杆菌)，芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)，肠细菌，假单胞菌(如铜绿假单胞菌)，鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)，克雷伯氏菌，变形菌(Proteus)，志贺氏菌，根瘤菌(Rhizobia)，透明颤菌(Vitreoscilla)，或副球菌(Paracoccus)。优选使用革兰氏阴性细胞。更优选使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。
很多大肠杆菌菌株都适于作为本文所述的表达宿主或作为亲代宿主以便从中产生改良的表达宿主。本领域已知并且可得到的大肠杆菌菌株包括，但不限于，大肠杆菌W3110(ATCC 27，325)，大肠杆菌294(ATCC 31，446)，大肠杆菌B，大肠杆菌1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌RV308(ATCC31，608)。也可以使用上述任何细菌的突变细胞。当然，必需根据细菌细胞中复制子的复制能力来选择合适的细菌。例如，用众所周知的质粒如pBR322，pBR325，pACYC177，或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌，沙雷氏菌或沙门氏菌适合用作宿主。优选地，宿主细胞应分泌最少量的蛋白裂解酶，且最好是在细胞培养物中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
合适的真核宿主细胞也是本领域已知的。例如，宿主细胞包括酵母，VERO，HeLa，CHO，W138，BHK，COS-7和MDCK细胞。
宿主细胞的转化和培养
宿主细胞用上述重组载体转化或转染(术语“转化”和“转染”在本文中可以互换使用)，并在改进型传统营养培养基上培养，所述培养基经改进已适于诱导启动子、筛选转化体或扩增编码所需序列的基因。
转化是指，将DNA引入原核宿主以使DNA能够作为染色体外元件或以染色体整合体的形式复制。根据所用的宿主细胞，用适合于所述细胞的标准技术进行转化。利用氯化钙进行钙处理的方法常用于包含坚固的细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法使用聚乙二醇/DMSO。还有一种技术是电穿孔。转染是指由宿主细胞摄取表达载体，而不论事实上是否表达了任何编码序列。多种转染方法是本领域普通技术人员已知的，例如，Ca PO4沉淀和电穿孔。成功的转染一般是在宿主细胞中出现关于该载体操作的任何征兆时可以予以识别。
用于制备本发明多肽的原核细胞在本领域已知的适于培养所选宿主细胞的培养基中培养。合适的培养基的实例包括添加了必需的营养添加物的luria broth(LB)。在一个优选实施方案中，培养基还包含一种选择制剂，它是基于表达载体的构建而选出的，可以选择性允许含有该表达载体的原核细胞生长。例如，在培养基中添加氨苄青霉素，使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。除了碳源，氮源，和无机磷酸盐源以外，还可以包括适当浓度的任何必需添加物，它们可以单独加入，或者与另一种添加物或培养基组合成混合物再加入，如复合氮源。还可选在培养基中包含一或多种还原剂，所述还原剂选自谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，硫代乙醇酸，二硫赤藓醇和二硫苏糖醇。
原核宿主细胞在适当温度中培养。例如，大肠杆菌优选在约20℃-约39℃，更优选约25℃-约37℃，甚至更优选约30℃生长。培养基的pH可以是在约5-约9的范围内的任何pH，这主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选约6.8-约7.4，更优选约7.0。
用于制备本发明抗体的真核宿主细胞可以在本领域已知的各种培养基中培养。例如，市售培养基如Ham’s F10(Sigma)，基本必需培养基((MEM)Sigma)，RPMI-1640(Signma)，和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)都适于培养哺乳动物真核宿主细胞。此外，Ham and Wallace，Meth.Enz.，58：44(1979)，Barnes and Sato，Anal.Biochem.，102：255(1980)，U.S.4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；U.S.Pat.Re.30,985；或U.S.5,122,469(所有文献都全文引入本文作为参考)所述的培养基也可以用作宿主细胞培养基。任何上述培养基可以根据需要添加激素和/或其它生长因子(如胰岛素，运铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸腺嘧啶)，抗生素(如GentamycinTM)，痕量元素(定义为通常以微摩尔水平的终浓度出现的化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需添加物。培养条件，如温度，pH等，都是前面在选定的表达宿主上用到的那些，并且对本领域技术人员而言也是显而易见的。
轻链和重链的分时分别表达
一旦宿主细胞生长到一定密度，就改变培养条件以便促进蛋白合成。根据本发明，轻链和重链在合成期间的不同时间点被诱导。在一个方面中，利用上述双-启动子载体实现轻链和重链的分时分别表达。当本发明双-启动子载体中使用的是诱导型启动子时，在适于活化该启动子的条件下诱导蛋白表达。在一个优选实施方案中，两个启动子都是诱导型的。更优选所述双启动子分别为phoA和TacII。例如，可以制备一种载体，其中用phoA启动子控制轻链转录，用TacII启动子控制重链转录。在诱导的第一阶段中，被所述phoA/TacII双启动子载体转化的原核宿主细胞，通过在磷酸盐限制培养基中培养来诱导phoA启动子并表达轻链。待轻链表达持续了所需的时间以后，向培养基中加入足量IPTG来诱导TacII启动子并产生重链。
在一个方面中，本发明的抗体或抗体片段可以在细菌宿主细胞的细胞质中表达。有多种方法可用于改进可溶性功能抗体或抗体片段在大肠杆菌细胞质中的产生。例如，已发现trxB基因缺陷型大肠杆菌菌株能促进在细胞质中形成二硫键，因此它可用于促进能正确形成二硫键的功能性抗体分子在细胞质中的表达。Proba等(1995)Gene 159：203-207。可以制备抗体片段的变体，以便替换半胱氨酸残基，使VH和VL中都不必形成二硫键，这种抗体片段变体(有时称为“内体(intrabodies)”)因此可以在不利于有效形成二硫桥的还原环境(如细菌细胞质)中产生。Proba等(1998)J.Mol.Biol.275：245-253。
当分泌信号序列用于本发明的载体中时，所表达的轻链和重链多肽被分泌到宿主细胞的周质中，并且从该周质中回收。蛋白回收通常涉及微生物的破环，一般是通过诸如渗透休克，超声波降解或裂解等手段实现。一旦细胞被破环，细胞碎片或整个细胞可以通过离心或过滤除去。蛋白可以进一步纯化，例如，通过亲和树脂层析纯化。或者，可以将蛋白转运到培养基中，从那里分离出来。可以将细胞与培养物分开，将培养上清过滤并浓缩，以便进一步纯化出蛋白产物。表达的多肽可以用常见方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析，进行进一步分离和鉴定。
在本发明的一个方面，所述抗体通过发酵方法进行大规模制备。目前有多种可用于制备重组蛋白的大规模补料分批发酵方法。大规模发酵的容量至少为1000升，优选约1,000-100,000升。这些发酵罐使用叶轮式搅拌器或其它合适的手段来分散氧气和营养，尤其是葡萄糖(这是优选的碳源/能源)。小规模发酵通常是指在不超过近100升容积的发酵罐内进行发酵，所述容积可以在约1升-约100升范围内不等。
在一种发酵过程中，通常在细胞于适当条件中生长至所需密度，例如OD550约180-270以后，开始诱导蛋白表达。可以根据本发明所采用的载体构建体选用多种诱导剂，这是本领域已知的并且在上文中已经描述。细胞在诱导之前可以进行短时间的生长。通常将细胞诱导约12-50小时，也可以采用更长或更短的诱导时间。
为了改进本发明抗体分子的产量和质量，可以对各种发酵条件进行调整。例如，为了改进所分泌的抗体多肽的正确装配和折叠，可以用过表达侣伴蛋白(chaperone)的其它载体共转化原核宿主细胞，所述侣伴蛋白如Dsb蛋白(DsbA，DsbB，DsbC，DsbD和或DsbG)或FkpA(一种具有侣伴蛋白活性的肽酰脯氨酰顺，反-异构酶)。侣伴蛋白已被证实能促进细菌宿主细胞中产生的异源蛋白的正确折叠并增加溶解度。Chen等(1999)J Bio Chem274：19601-19605；Georgiou等，美国专利6,083，715；Georgiou等，美国专利6,027,888；Bothmann and Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm and Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等(2001)Mol.Microbiol.39：199-210。充分的二硫键键合对于具有两条重链和两条轻链的全长二价抗体的形成和折叠特别重要。
为了将所表达的异源蛋白(尤其对蛋白裂解很敏感的那些)在诸如原核宿主细胞中的蛋白裂解降至最低，一些具有蛋白裂解酶缺陷的宿主菌株可用于本发明。例如，可以修饰原核宿主细胞，使编码已知的细菌蛋白酶或其组合的基因中出现基因突变，所述酶例如蛋白酶III，OmpT，DegP，Tsp，蛋白酶I，蛋白酶Mi，蛋白酶V，蛋白酶VI。目前已经有一些蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株，可参见，例如Joly等(1998)，出处同上；Georgiou等，美国专利5,264,365；Georgiou等，美国专利5,508,192；Hara等(1996)Microbial DrugResistance 2：63-72。
抗体纯化
从宿主细胞制备的抗体组合物优选经历至少一个纯化步骤。合适的纯化步骤的实例包括，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析，和亲和层析，优选亲和层析。具体蛋白是否适于作为亲和配体取决于该抗体上任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。例如，蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13。有人建议将蛋白G用于所有的小鼠同种型和人γ3。Guss等(1986)EMBO J.5：15671575。与亲和配体结合的基质最常用的是琼脂糖，但也可利用其它基质。具有机械稳定性的基质如孔径受到控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比琼脂糖允许更快的流速且耗时更短。当抗体包括CH3区时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)有利于纯化。还可以根据需要回收的抗体来选择其它蛋白纯化技术，例如离子交换柱分级分离，乙醇沉淀，反向HPLC，硅层析，肝素SEPHAROSETM层析，阳离子或阴离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)层析，层析聚焦，SDS-PAGE，以及硫酸铵沉淀。
在优选实施方案中，本发明制备的抗体经过进一步纯化，获得实质上更均一的制剂，以备进一步的分析和应用。例如，可以采用美国专利5,641,870中所述的疏水相互作用层析(HIC)，尤其是低pH HIC(LPHIC)进行进一步纯化。具体地，LPHIC提供了一种将正确折叠且二硫键键合的抗体与不想要的污染物(如，不正确结合的轻链和重链片段)分开的途径。
活性分析
本发明抗体的物理/化学特性和生物学功能可以通过本领域已知的各种试验来确定。在本发明一个方面中，重要的是将在本发明双-启动子系统中制备的抗体与在其它表达系统(如不同表达载体设计或不同宿主细胞系统)中制备的类似抗体进行比较。具体地，可以将本发明双-启动子载体表达并装配好的抗体复合物的量与由各种多顺反子载体表达的抗体的量进行比较。定量蛋白的方法是本领域已知的。例如，从表达的蛋白取样，在考马斯兰染色SDS-PAGE的上比较它们的量化强度。或者，可以通过，例如，western印迹凝胶分析来检测所需的具体的带(如，装配好的抗体的带)。
已经纯化的抗体还可通过一系列分析进一步进行鉴定，这些分析包括，但不限于，N-末端测序，氨基酸分析，非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)，质谱分析，离子交换层析以及木瓜蛋白酶消化。
在本发明的某些实施方案中，分析了所制备的抗体的生物学活性。优选地，检测本发明抗体的抗原结合活性。本领域已知并且可以用于本文的抗原结合试验包括，但不限于，利用下列技术进行的任何直接或竞争性结合试验：例如，western印迹，放射免疫分析，ELISA(酶联免疫吸附试验)，“夹心”免疫分析，免疫沉淀试验，荧光免疫分析，以及蛋白A免疫分析。下文实施例章节中提供了抗原结合试验的一个实例。
抗体的用途
本发明的抗体可用于，例如，纯化，检测，和靶向它所识别的特异性多肽，包括针对各种疾病的体外和体内诊断，预防或治疗方法。
“疾病”是指可从所述抗体的治疗中获益的任何情况。这包括慢性和急性疾病或病症，包括使哺乳动物对所述疾病易感的那些病理状况。这些需要治疗的疾病的非限定实例包括，良性和恶性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮细胞、间质和囊胚腔的疾病；炎性、血管原性和免疫性疾病。
本文中“自身免疫病”是一种源自个体自身组织并且直接针对个体自身组织的非恶性疾病。本文中自身免疫病特别排除了恶性疾病或癌性疾病，尤其排除了B细胞淋巴瘤，急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞(Hairy cell)白血病和慢性成髓细胞性白血病。自身免疫病实例包括，但不限于，炎性应答如炎性皮肤疾病包括牛皮癣和皮炎(如过敏性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠疾病有关的应答(如克罗恩氏(Crohn’s)病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘破综合征；ARDS)；皮炎；脑脊膜炎；脑炎；色素膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性疾病如湿疹和哮喘，以及涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的其它疾病；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺氏(Reynaud’s)综合征；自身免疫性甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjorgen’s)综合征；幼年型糖尿病(juvenile onset diabetes)；常见于结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中的，涉及细胞因子和T淋巴细胞所介导的急性和迟发型超敏反应的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏(Addison’s)病)；与白细胞渗出有关的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病变；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症；或库姆斯氏(Combs)阳性贫血)；重症肌肌无力；抗原抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯氏(Graves’s)综合征；兰-伊氏(Lambert-Eaton)肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病；赖特尔氏(Reiter’s)病；全身肌强直(stiff-man)综合征；贝切特氏(Behcet)病；巨细胞性动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经炎；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
术语“癌症”和“癌的”是指或是描述哺乳动物中，以不受调节的细胞生长为典型特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌的更具体的实例包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，肺鳞状上皮癌，腹膜癌，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胃肠癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝细胞瘤(hepatoma)，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌(liver cancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepatic crcinoma)，以及各种头、颈部癌。
本文中“治疗”是指，在改变待治个体或细胞的自然过程的尝试中进行的临床干预，它可以是为了预防而实施，或者可以在临床病理过程中实施。治疗希望达到的效果包括，阻止疾病的发生或复发，缓解症状，消除疾病的任何直接或间接病理学结果，防止转移，降低疾病进展的速度，改善或减轻病情，以及消退或改进预后。
“有效量”是指，在所需剂量和时间内，能获得所需治疗或预防结果的量。抗体的“治疗有效量”可以根据多种因素而变化，例如疾病状态，个体的年龄、性别、和体重，抗体在所述个体中激发所需反应的能力。治疗有效量也可以是指，抗体的任何毒性或有害效应不及治疗有益效应的量。“预防有效量”是指，在所需剂量和时间内，能获得所需预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病发生之前或疾病的较早期应用于受试者，因此，预防有效量比治疗有效量少。
在一个方面，本发明抗体可用于免疫分析中定性和定量测定生物样品中的特异性抗原。检测抗原-抗体结合的常规方法包括，例如，酶联免疫吸附试验(ELISA)，放射免疫分析(RIA)或免疫组织化学。多种方法可以用标记物结合抗体以便进行检测。用于抗体的标记物可以是任何可以进行检测且不干扰其与抗体结合的功能体。已知有多种标记物，包括放射性同位素32P，32S，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，单磺酰基，伞形酮，萤光素酶(如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶，美国专利4,737,456)，萤光素，2，3-二氢二氮杂萘二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶)，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，生物素/亲和素，spin标记，噬菌体标记，稳定的自由基，用于成像的放射性核素(如Technecium)等。
目前已有使这些标记与抗体多肽共价结合的常规方法。例如，可以用下述偶联剂使抗体带上上述荧光标记，化学发光标记，和酶标记：如二醛，碳二亚胺，二马来酰亚胺，双-亚胺酸酯(bis-imidate)，双-重氮化联苯胺(bis-diazotized benzidine)等。参见，例如，美国专利3,940,475(荧光测量)和美国专利3,645,090(酶)；Hunter等Nature 144：945(1962)；David等Biochemistry 13：1014-1021(1974)；Pain等J.Immunol.Methods 40：219-230(1981)；Nygren Histochem.and Cytochem 30：407-412(1982)。本文优选的标记是酶，如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。将这样的标记物(包括酶)与抗体多肽偶联是本领域免疫分析的标准操作。参见，例如，O′Sullivan等，“Methodsfor the Preparation of Enzyme-抗体 Conjugates for Use in EnzymeImmunoassay”，Methods in Enzymology，ed.J.J.Langone and H.Van Vunakis，Vol.73(Academic Press，New York，N.Y.，1981)，pp.147-166。这种键合方法适用于本发明的抗体多肽。
除了标记抗体以外，还可以通过竞争性免疫分析来检测生物液体中的抗原，所述分析利用了经可检测的物质标记的竞争性抗原标准品和未经标记的抗体。在该分析中，将生物样品，标记的抗原标准品和抗体混合，测定标记的抗原标准品与未经标记的抗体结合的量。生物样品中所测抗原的量，与结合在抗体上的带标记的抗原标准品的量，成反比。
在一个方面，本发明的抗体特别可用于体外或体内检测特异性表面抗原的表达并勾画其表达图谱。表面抗原可以特异于具体的细胞或组织类型，从而作为该细胞或组织类型的标志。优选地，表面抗原标志在特定细胞或组织类型的各种分化阶段有不同的表达。对抗这类表面抗原的抗体因此可用于从细胞或组织群体中筛选出表达该标志的那些。例如，本发明的抗体可用于筛选和分离干细胞，如胚胎干细胞，造血干细胞，和间质干细胞。本发明的抗体还可用于检测表达肿瘤相关表面抗原(如HER2，HER3或HER4受体)的肿瘤细胞。
本发明的抗体可用作亲和纯化制剂。在该方法中，用本领域已知方法将抗体固定在固相(Sephadex树脂或滤纸)上。使固相化抗体与含有待纯化的抗原的样品接触，然后用适当溶剂淋洗支持物，以便将该样品中除了与固相抗体结合的待纯化抗原以外的几乎所有其它物质除去。最后，用另一种适当溶剂淋洗该支持物，例如甘氨酸缓冲液，pH5.0，以便使抗原从抗体上释放。
本发明抗体可用作拮抗剂以便在体外和体内部分或完全封闭特异性抗原活性。此外，至少有一部分本发明抗体可以中和其它物种来源的抗原活性。因此，本发明抗体可以，例如，在含有该抗原的细胞培养物中，在人类受试者中，或在具有与本发明抗体发生交叉反应的抗原的其它哺乳动物受试者(如黑猩猩，狒狒，狨，食蟹猴(cynomolgus)和猕猴(rhesus)，猪或小鼠)中，抑制特异性抗原活性。
在另一实施方案中，本发明抗体可以在抑制患病受试者体内有害抗原的方法中应用，该方法包括对该受试者施用本发明的抗体，从而抑制该受试者中该抗原的活性。优选该抗原是人的蛋白分子，而该受试者是人类受试者。或者，所述受试者可以是表达能与本发明抗体结合的抗原的哺乳动物。所述受试者还可以是引入了所述抗原的哺乳动物(如，通过给药该抗原或通过表达抗原转基因而引入)。本发明的抗体可以为了治疗目的而给予人类受试者。此外，本发明的抗体可以对表达能与所述抗体交叉反应的抗原的非人哺乳动物(如，灵长类，猪或小鼠)施用，以便实现兽医目的，或作为人类疾病的动物模型。如果是作为动物模型，所述模型可用于评估本发明抗体的治疗效力(如，测定给制剂量和时间安排)。具有治疗意义的本发明阻断抗体包括但不限于，抗-VEGF，抗-IgE，抗-CD11和抗-组织因子抗体。本发明的阻断抗体可用于诊断、治疗、抑制或预防与一或多种抗原分子的异常表达和或活性相关的疾病，所述疾病包括但不限于：恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮细胞、间质和囊胚腔的疾病；炎性、血管原性和免疫性疾病。
在一个方面，本发明的阻断抗体特异于配体抗原，并通过阻断或干扰该配体抗原所参与的配体-受体相互作用而抑制该抗原的活性，从而抑制相应的信号途径和其它分子或细胞事件。本发明的特征还在于受体特异性抗体，它不必阻止配体结合，但能干扰受体活化，从而抑制通常由配体结合所启动的任何应答。本发明还涉及，优选地结合或排他性结合配体-受体复合物的抗体。本发明的抗体还可以作为具体抗原受体的激动剂，以加强、促进或活化由配体介导的受体活化的全部或部分活性。
在一些实施方案中，可以制备并应用免疫偶联物，它包含与细胞毒制剂偶联的抗体。优选所述免疫偶联物和/或与它结合的抗原被细胞内化(internalize)，导致在杀伤与它结合的靶细胞时增加免疫偶联物的治疗效果。在优选实施方案中，细胞毒制剂在靶细胞中靶向或干扰核酸。
本文中术语“细胞毒制剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性核素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，和Lu的放射性同位素)，化疗剂，毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”是在癌症治疗中使用的化学化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)；环磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(azirdine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶(ethyleneimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenins(特别是bullatacin和bullatacinone)；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；cryptophycins(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；海兔毒素(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloricde)；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如enediyne抗生素(如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素θI1，参见例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；esperamicin；以及新制癌菌素生色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白enediyne抗生素生色团)，阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代-阿霉素，氰基吗啉代-阿霉素，2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类，如二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱(maytan sinoids)(包括美登素和柄型菌素)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；rhizoxin；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素A，蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxoids，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂，包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制剂，如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。
本文还涉及抗体与一或多种小分子毒素，如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢霉烯(trichothene)、CC1065的偶联物。
在本发明的一个优选实施方案中，使抗体与一或多个美登素分子偶联(如每个抗体分子与约1-10个美登素分子偶联)。美登素可转化成May-SS-Me，然后还原成May-SH3，并与经修饰的抗体反应(Chari等CancerResearch 52：127-131(1992))产生美登木素生物碱(maytansinoid)-抗体免疫偶联物。
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素家族的抗生素能在亚pM浓度水平产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素结构类似物包括，但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG以及θI 1(Hinman等Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode等Cancer Research 58：2925-2928(1998))。也参见美国专利5,714,586；5,712,374；5,264,586；和5,773,001。
可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明还涉及抗体与具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)偶联形成的免疫偶联物。
多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，以及Lu的放射性同位素。
抗体与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫醇(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯(dimethyladipimidate HCl)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等Science 238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等Cancer Research 52：127-131(1992))。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来获得含有抗体与细胞毒制剂的融合蛋白。
在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉抗生物素蛋白)偶联，将该抗体-受体偶联物给予患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
本发明的抗体可以在治疗中单独使用，或者与其它组合物联合使用。例如，所述抗体可以与另一抗体、化疗剂(包括化疗剂的混合物)、其它细胞毒制剂、抗-血管生成剂、细胞因子和/或生长抑制剂共同给药。当所述抗体抑制肿瘤生长时，可能特别希望将该抗体与一或多种也能抑制肿瘤生长的其它治疗剂联合。例如，在转移性乳腺癌的治疗中，阻断VEGF活性的抗-VEGF抗体可以与抗-ErbB抗体(如HERCEPTIN抗-HER2抗体)联合。或者，或另外，患者可接受联合放射治疗(如外部光束照射或用带有放射活性标记的制剂如抗体进行治疗)。上述这种联合治疗包括联合给药和分隔给药，在联合给药中，两种或多种制剂包含在同一配制剂或不同配制剂中；在分隔给药中，抗体可在给予辅助治疗之前和/或之后给药。
抗体(和辅助治疗剂)可用任何适当方式给药，包括非肠道、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，如果需要局部治疗，可以在损伤内给药。非肠道输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。另外，抗体适宜经脉冲输注给药，特别是使用递减剂量的抗体时。优选经注射给药，最优选经静脉或皮下注射给药，它们部分取决于给药是短暂还是长期(慢性)的。
可以根据良好医疗实践，配制、成剂并给药本发明的抗体组合物。这其中要考虑的因素包括：接受治疗的具体病症、接受治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病因、制剂释放的部位、给药方法、给药时程表，以及医疗实践者所熟知的其它因素。抗体并不必需，但可选择，与一或多种目前用于预防或治疗所述疾病的制剂配制在一起。所述其它制剂的有效量，取决于该配制剂中抗体的含量、病症或治疗的类型，以及上述讨论的其它因素。这些制剂一般使用其此前所用相同剂量和相同给药途径，或者使用此前所用剂量的约1～99％。
在疾病的预防或治疗中，所述抗体(单独应用，或者与其它制剂如化疗剂联合应用时)的合适剂量取决于需要治疗的疾病类型，抗体类型，疾病的严重程度和病程，给予抗体的目的是预防还是治疗，在先的治疗，患者的临床病史以及对该抗体的反应，主治医师的判断。所述抗体优选在一次治疗中或者在一系列治疗中给予患者。根据疾病的类型和严重程度，抗体的起始剂量可以是，通过一或多次给药，或者通过连续输注，给予约1μg/kg-15mg/kg(如0.1mg/kg-10mg/kg)。通常每日剂量为约1μg/kg-100mg/kg或更多，取决于上述因素。当在数天内或更长时间段内多次给药时，根据具体情况，可以将治疗一直持续到出现所需的抑制疾病的状态为止。所述抗体的优选剂量为约0.05mg/kg-约10mg/kg。故，可以给予患者一或多剂，每剂约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)。这样的剂量可以间歇给予，例如每周或每三周(例如，使患者接受约2-20个剂量的抗体，例如约6个剂量的抗体)。可以采用较高起始装载剂量，接着是一或多个较低剂量。剂量方案的一个实例包括，起始装载剂量为约4mg/kg，接着是每周维持剂量约2mg/kg的抗体。其它剂量方案也是有效的。所述治疗的进展可以很容易地通过常规技术和试验进行监控。
药物配制剂
本发明抗体的治疗性配制剂，可以通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s PharmaceuticalSciences第16版Osol，A.编(1980))混合而制备，然后以含水剂，冻干剂或其它经干燥的配制剂形式保存。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受体无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐，组氨酸及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述配制剂还可根据所治疗的具体情况而包含一种以上活性成分，优选具有互补活性但相互无负面影响的那些。这些分子以对所需目的有效的量在组合中适当地存在。
活性成分也可容纳在微胶囊中，或容纳在胶体性质的药物运送系统(如脂质体，白蛋白小球体，微乳剂，纳米颗粒及纳米胶囊)中，或者容纳在大乳剂(macroemulsions)中，所述微胶囊可以通过诸如凝聚(coacervation)技术或界面聚合作用来制备，例子分别有羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(异丁烯酸甲酯)微胶囊。这些技术见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版Osol，A.编(1980)。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
也可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。尽管聚合物如乙烯-乙酸乙酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化的抗体长时间停留在体内时，它们会由于暴露在37℃潮湿环境中而变性或凝聚，从而导致生物活性损失，且免疫原性可能会改变。可以根据相关机理来设计稳定化的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂和开发特异性聚合物基质组合物，来达到稳定化。
制品
本发明另一实施方案是一种制品，其包含可用于治疗上述疾病的材料。所述制品包括一个容器和位于该容器表面的或与该容器相连的标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器内可以含有一种能有效治疗所述疾病的组合物，并可具有无菌存取口(例如该容器可以是静脉点滴袋(intravenous solution bag)或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。所述组合物中至少一种活性制剂是本发明的抗体。标签或包装插页将指明，所述组合物是用于治疗特定疾病，如癌症。所述制品可包含第一个容器，其中容纳含有抗体的组合物；以及(b)第二个容器，其中容纳含有另一种细胞毒制剂的组合物。本发明这一实施方案中的制品还可进一步包含一种包装插页，它指示所述第一种和第二种抗体组合物可以用于治疗癌症。或者或另外，所述制品还可进一步包含第二个(或第三个)容器，其中容纳可药用缓冲液，如用于注射的抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。还可包括具有商业需要以及符合用户需要的材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针头，和注射器。
以下实施例旨在举例说明本发明的实践，并非限制本发明。本文引用的所有专利和科学文献都全文引用作为参考。
实施例
实施例1.制备CD18抗体片段
材料和方法
质粒构建
对照质粒pS1130经设计可以以双顺反子形式表达抗-CD18F(ab’)2，并且该质粒是基于Carter等(1992)Bio/Technology 10：163-167所述的载体。所述设计将轻链和带有C-末端亮氨酸拉链的重链片段的转录置于单个phoA启动子的控制下。转录终止于重链-亮氨酸拉链编码序列下游的λt0转录终止子(Scholtissek and Grosse(1987)Nucleic Acids Res.15(7)：3185)。每一条链的前面是热稳定肠毒素II信号序列(STII)，它指导所述多肽分泌到周质中(Lee等(1983)Infect.Immun.42：264-268；Picken等(1983)Infect.Immun.42：269-275)。亮氨酸拉链与重链片段的C-末端相连，从而促进两条Fab’臂的二聚体化。
含有两种不同翻译单元的双-启动子质粒pxCD18-7T3可以使轻链和重链分时分别转录。在pS1130中，轻链仍然受phoA启动子控制。但是在pxCD18-7T3中，轻链编码序列之后是λt0转录终止子。该终止子下游添加了TacII启动子，以便控制重链片段/C-末端亮氨酸拉链的转录(DeBoer，等(1983)Proc.Natl.Acad Sci.USA 80：21-25)。该编码序列之后跟着第二个λt0转录终止子。用STII信号序列的静默密码子变异体指导所述两条链的转录(Simmons and Yansura(1996)Nature Biotechnology 14：629-634)。
单启动子对照质粒与双启动子质粒的比较见图1。pxCD18-7T3的表达盒序列见图2(SEQ ID NO：3)，两种翻译单元的氨基酸序列见图3(SEQ IDNO：4)。
发酵
用于发酵的宿主菌株是大肠杆菌W3110的衍生物，命名为59A7。59A7的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC2degP41(ΔpstI-Kanr)IN(rrnD-rrnE)1 ilvG2096(Valr)Δprc prc-suppressor。将59A7宿主细胞用pS1130或pxCD18-7T3质粒转化，选出成功的转化体，进行培养。在双-启动子质粒的情况下，使另一种质粒pMS421与pxCD18-7T3共转化。所述另一种质粒，pMS421，是一种基于pSC101的质粒，它提供lacIq来改进TacII启动子的控制，它还赋予对壮观霉素和链霉素的抗性。
对每一次10-升发酵而言，将单个小瓶解冻，其中含有1.5ml培养物的10-15％DMSO溶液，将其加入含有500ml LB培养基的1L摇瓶中，所述培养基中添加了0.5ml四环素溶液(5mg/ml)和2.5ml1M磷酸钠溶液。将该种子培养物于30℃培养将近16小时，然后用于接种10-升发酵罐。
发酵罐最初用将近6.5升培养基开始发酵，所述培养基中包含约4.4g葡萄糖，100ml 1M硫酸镁，10ml痕量元素溶液(100ml氢氯酸，27g六水氯化铁，8g七水硫酸锌，7g六水氯化钴，7g钼酸二氢钠，8g五水硫酸铜，2g硼酸，5g一水硫酸锰，终体积1升)，20ml四环素溶液(5mg/ml，于乙醇中)，10ml Fermax Adjuvant 27(或一些等效消泡剂)，1袋HCD盐(37.5g硫酸铵，19.5g磷酸氢二钾，9.75g二水磷酸二氢钠，7.5g二水柠檬酸钠，11.3g磷酸二氢钾)，以及200g NZ Amine A(一种蛋白水解物)。发酵在30℃进行，通以10slpm气流，pH控制在7.0±0.2(有些情况中偶尔超出该范围)。改变发酵罐的背压(back pressure)和搅拌速率，以便控制发酵罐中的氧转移率，并因此控制细胞呼吸率。
从摇瓶中取出含有细胞的培养基，接种发酵罐，然后进行培养，按照计算机的运算向发酵罐中补加浓缩的葡萄糖溶液，直至培养物达到较高细胞密度。另外还根据pH控制的需要向发酵罐中补加氢氧化铵(58％溶液)和硫酸(24％溶液)。在有些情况中还补加消泡剂来控制泡沫。当培养物达到将近40 OD550的细胞密度时，向发酵罐中加入100ml 1M硫酸镁。另外，当培养物达到将近20 OD550的细胞密度时，开始以2.5ml/min的速度向发酵罐中补加浓缩盐(由将近10g硫酸铵，26g磷酸氢二钾，13g二水磷酸二氢钠，2g二水柠檬酸钠和15g磷酸二氢钾，在1L水中构成)，并且一直持续，直到将近1250ml被加入发酵液中。发酵通常持续72-80小时。
在发酵期间，一旦达到为该发酵预设的溶解氧浓度，就根据溶解氧探针信号补加浓缩的葡萄糖溶液，以便将溶解氧浓度控制在预设值。结果，在这种控制方案中，对发酵罐操作参数(如搅拌速率或背压，其影响发酵中的氧转移能力)的控制相对应地控制了细胞的氧摄取速率或代谢速率。
用质谱仪监控发酵所排出的气体的组成，从而能计算发酵中氧摄取和二氧化碳排放(evolution)的速率。
当培养物达到近220OD550的细胞密度时，将搅拌速率从最初的1000rpm经过近12个小时而降低到近725rpm。在pxCD18-7T3系统(其中用TacII启动子控制重链表达)的发酵中，在培养物达到220OD550细胞密度的近12个小时之后，加入50ml 200mM IPTG来诱导重链合成。
产物分析
为了评估发酵中产生的抗体片段的量，使用了多种蛋白分析试验。为了确定已装配好的抗-CD18 F(ab’)2-亮氨酸拉链复合物的量，使用了蛋白G分析。Derrich and Wigley(1992)Nature 359：752-4。为了制备该分析中用到的样品，首先对完整发酵液进行超声处理，用50mM硫酸镁将其稀释2.4X。加入聚1，2-亚乙基亚胺(PEI)至终浓度为0.1％。保温20分钟之后，将样品在微量离心机中以近14,000xg离心近20分钟。然后将上清用磷酸盐缓冲液稀释2X，用HP1090或HP1100 HPLC系统将稀释液装载到蛋白G柱(PorosG/M柱)上。进行7分钟的分析，期间，首先将柱用10mM PO4/300mM NaCl(pH8)平衡。然后注入样品，将柱用平衡缓冲液淋洗将近5.5分钟(2.1×30mm的柱使用将近3ml缓冲液)，然后用30mM PO4/150mM NaCl/0.01％TFA(pH1.9)进行洗脱。
为了证实蛋白G结果确实代表装配好的F(ab’)2复合物，还通过多个层析步骤对产物进行纯化，所述步骤包括离子交换，以及在用固相胃蛋白酶除去亮氨酸拉链部分之后再进行一步额外的离子交换和苯基sepharose HIC柱层析。纯化的产物通过多种常规方法进行鉴定，如阳离子交换试验，毛细区带电泳非凝胶筛分试验，以及SDS-PAGE凝胶电泳。
为了评估发酵中产生的轻链和重链的总量，使用了另一种反相HPLC试验。用于该试验的样品按照上文蛋白G试验中所述来制备。将可溶性裂解物样品稀释在6M胍-HCl，50mM TRIS，pH9中(通常100μl样品用650μl胍溶液稀释)。然后加入50μl 2M二硫苏糖醇(刚解冻的)。加入200μl乙腈并滤过0.2μm滤膜，然后装载HPLC。
在反相方法中，使用Hewlett-PackardTM 1100 HPLC以及PerseptivePorosTM R-1反相柱。分析中，将该柱加热至60-80℃，监控278nm处的紫外吸收。该柱用包含0.1％三氟乙酸的28％乙腈-水溶液平衡。然后取25μl样品上柱，用20分钟内从28％到38％乙腈的线性梯度洗脱，然后用17分钟在95％乙腈中再生并在28％乙腈中再平衡。轻链和重链的相关峰通过与标准进行比较来鉴定，并用质谱分析予以证实。空白发酵使用了相同的宿主、但所用的质粒不合重链和轻链序列，用类似的方式制备它的样品，通过分析确定适于所述分析物的基线。峰面积用Hewlett-PackardTM 1100软件进行积分，将标准值插入空白发酵样品中，制得校准曲线，以便定量样品中各种链的相对含量。
不溶性裂解物样品也进行类似的分析，方法是，从细胞裂解物获得不溶性沉淀，将其重新悬浮在950μl 6M胍/HCl，50mM TRIS，pH 9+50μl 2M二硫苏糖醇中。进行超声处理(5-10个脉冲)，这一般是为了使沉淀重新溶解，然后取100μl重新悬浮的沉淀，在650μl胍溶液+50μl 2M二硫苏糖醇+200mM乙腈中稀释。然后该样品按照与可溶性裂解物样品相同的方法进行过滤和分析。
结论
用pS1130单启动子系统或pxCD18-7T3双-启动子系统进行了一系列抗-CD18 F(ab’)2发酵。用方法和材料章节中描述的蛋白分析试验测量和计算已装配好的抗-CD18 F(ab’)2复合物的产量。如图4(柱代表发酵产量，g/L)所示，在59A7菌株中采用phoA-tac双-启动子载体，使已装配好的F(ab’)2的产量从鉴定出的最佳pS1130/59A7转化体的近2.5g/L增加到4.6±0.5g/L，增幅近2倍。
为了进一步举例说明双-启动子系统的改进特性，建立了在单启动子系统(pS1130/59A7)和双-启动子系统(pxCD18-7T3/59A7)情况下，完整重链、可溶性轻链以及已装配好的F(ab’)2复合物的表达图谱，结果分别见图5和6。很明显，在首先表达轻链并将其分泌至周质空间、随后在一段延长的时间段内产生重链的双-启动子系统中，在诱导了重链表达之后几乎立刻开始F(ab’)2装配(图6)；但在单启动子系统中，轻链和重链诱导之后的起始F(ab’)2装配相对较弱(图5)。在不受任何具体理论限制的前提下，这些结果提示，F(ab’)2装配是低效率的，直到周质中积累了显著量的可溶性轻链时，效率才提高。
进一步比较所述两个系统的装配效力，将其定义为F(ab’)2复合物中的重链与所合成的重链总量的比例。如图7所示，双-启动子系统比传统的单启动子系统更有效地进行装配，尤其是在重链合成的起始阶段(前10个小时)。对两个系统中的重链表达水平进行比较，结果显示，双-启动子系统的应用还增加了所合成的重链的总量，参见图7。
上述结果表明，通过使轻链和重链分时分别合成，可以显著增加装配好的抗-CD18 F(ab’)2的产量。这一新系统以及这些发现在表达并装配多个蛋白单位的其它系统中有着广泛的应用。
实施例2.制备抗-组织因子IgGl
该实施例描述了在大肠杆菌系统中制备全长抗体的继续努力。当采用强TIR’s同时共表达轻链和全长重链时，表达并积累了显著量的前体多肽，导致成熟轻链和重链的量较小，且正确装配的全长抗体的量较小。该实施例显示，前体的积累可以通过轻链和重链的分时分别表达来克服。将每条链置于不同启动子控制下，可以通过在不同时间点表达不同的链，而解除对分泌的阻断。这种方法比同时表达更容许应用较强的TIR’s，这可能导致每条链以更高水平分泌。这种能使每条链的表达水平提高的表达构建方式，有利于增加正确装配的全长抗体的产量。
材料和方法
质粒构建
对照质粒paTF130的表达盒，从5’-3’依次包含：(1)phoA启动子(Kikuchi等，Nucleic Acids Res.9(21)：5671-5678(1981))；(2)trp Shine-Dalgarno(Yanofsky等，Nucleic Acids Res.9：6647-6668(1981))；(3)STII信号序列的TIR变异体(TIR相对强度～7)(Simmons and Yansura，Nature Biotechnology14：629-634(1996))；(4)抗-组织因子轻链编码序列；(5)λt0终止子(Scholtissekand Grosse，Nucleic Acids Res.15：3185(1987))；(6)第二个phoA启动子；(7)第二个trp Shine-Dalgarno；(8)STII信号序列的第二种静默密码子变异体(TIR相对强度～3)；(9)抗-组织因子全长重链的编码序列；和(10)第二个λt0终止子。将该表达盒克隆到大肠杆菌质粒pBR322的框架中。Sutcliffe(1978)ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.43：77-90。通过将每一基因置于其自身phoA启动子的控制下，实现了该质粒中轻链和重链的分别转录；但是，由于两个phoA启动子在相同条件下被诱导，使两种链同时表达。
另一种方案是，设计pxTF-7T3FL载体，以便能利用两个不同(而不是两个相同)的启动子分时分别表达各个链。在该质粒中，轻链仍受phoA启动子控制。但采用tacII启动子(DeBoer，et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：21-25(1983))控制重链的转录。正如本领域所知，phoA和tacII启动子在完全不同的条件下被诱导。paTF130与pxTF-7T3FL的比较见图8。pxTF-7T3FL的核酸序列及其编码的多肽序列分别见图9和图10。
表达诱导，样品制备和分析
在每种构建体的相同规模表达中，采用大肠杆菌菌株33D3作为宿主细胞，它具有基因型(W3110 kanR fhuA(tonA)ptr3 phoA E15 lacIq lacL8ompT(nmpc-fepE)deg P)。转化后，选出转化体，挑取并接种到补加了羧苄青霉素(50ug/ml)的5ml Luria-Bertani培养基中，在培养轮(wheel)中30℃过夜。将每份培养物稀释(1∶50)至C.R.A.P.磷酸盐-限制型培养基(3.57g(NIH4)2SO4，0.71g柠檬酸钠-2H2O，1.07g KCl，5.36g酵母提取物(certified)，5.36g HycaseSF-Sheffield，用KOH将pH调整到7.3，用SQ H2O使qs至872ml，高压灭菌；冷却至55℃，添加110ml 1M MOPS pH 7.3，11ml 50％葡萄糖，7ml 1M MgSO4)。然后向诱导培养物中加入50ug/ml羧苄青霉素，除非特别指明，所有摇瓶诱导都在2ml体积中进行。
在诱导培养基中进行接种之后，根据每种样品所采用的启动子以及启动子诱导所需的时间来改变条件。paTF130是一种用phoA启动子控制轻链和重链基因的转录的载体，对它的诱导是在30℃振荡～24小时，期间培养基中不进行任何添加。该样品中的磷酸盐充分耗竭导致控制轻链和重链转录的phoA启动子被同时诱导。pxTF-7T3FL是用phoA启动子控制轻链表达而用tacII启动子控制重链表达的启动子，对它的诱导首先在与paTF130相同的培养条件下进行。30℃振荡～16小时后，添加磷酸钾缓冲液(pH 7.4)至终浓度1mM。近45分钟后，向培养基中添加IPTG至终浓度1mM，以便诱导tacII启动子。在30℃振荡条件下继续诱导～8小时。paTF130系统代表了轻链和重链的转录同时被诱导的情况。另一方面，将pxTF-7T3FL系统在设计用于分时分别表达每条链的情况下进行培养，所述分别表达是首先诱导控制轻链转录的phoA启动子，然后诱导控制重链转录的tacII启动子。
从诱导过的培养物制备非还原型全细胞裂解物，方法如下：(1)将1OD600-ml沉淀物在微量试管中离心；(2)将每份沉淀重新悬浮在90ul TE(10mM Tris pH 7.6，1mM EDTA)中；(3)向每份样品中添加10ul 100mM碘乙酸(Sigma I-2512)以封闭任何游离半胱氨酸并阻止二硫键重排(disulfideshuffing)；(4)向每份样品中添加20ul 10％SDS。将样品涡旋，加热到约90℃持续～3分钟，然后再涡旋。待样品冷却到室温后，加入～750ul丙酮使蛋白沉淀。将样品涡旋，在室温中静置约15分钟。将每份样品在微量离心管中离心5分钟后，吸出上清，将每份蛋白沉淀重悬在50ul dH20+50ul 2XNOVEX样品缓冲液中。然后在约90℃将样品加热～3-5分钟，充分涡旋，并冷却到室温。最后离心5分钟，将上清转移到干净试管中。
还原型样品采用类似于上述非还原型样品的步骤来制备，不同的是在步骤(2)的细胞重悬液中添加10ul 1M DTT，并省略步骤(3)中添加IAA(碘乙酸)的步骤。将蛋白沉淀重悬在2X样品缓冲液+dH2O之时，还添加浓度为100mM的还原剂。
制备好以后，每份样品取5ul装载至带有10个孔的1.0mm NOVEX预制型12％Tris-Glycine SDS-PAG中，在～120伏特电泳1.5-2小时。用所得凝胶进行免疫印迹分析。
在免疫印迹分析中，将SDS-PAGE凝胶电印迹至硝酸纤维素膜(NOVEX)上。然后用1X NET(150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris pH 7.4，0.05％Triton X-100)+0.5％明胶中室温中将膜封闭30分钟-1小时。在封闭步骤之后，将非还原型样品的膜置于1X NET+0.5％明胶+抗-Fab抗体(过氧化物酶-偶联型山羊IgG级分，对抗人IgG Fab；CAPPEL’55223)中，将还原型样品的膜置于1X NET+0.5％明胶+抗-Fab抗体+抗-Fc抗体(Jackson ImmunoResearch Labs#109-035-008)中。将抗-Fab抗体根据其含量(lot)稀释到1∶50,000-1∶1,000,000不等，将抗-Fc抗体稀释到1∶1,000,000。将膜在所述抗体溶液中室温摇动过夜。次日早晨，将膜在1X NET+0.5％明胶中洗涤最少3×10分钟，然后在TBS(20mM Tris pH 7.5，500mM NaCl)中洗涤1×15分钟。被抗体结合的蛋白带通过用Amersham Pharmacia Biotech ECL检测并将膜在X-线胶片上曝光来观察。
结果
构建了用于制备抗-组织因子IgGl的质粒paTF130和pxTF-7T3FL，将它们转化到33D3菌株中，如前文所述进行诱导。然后制备非还原型和还原型全细胞裂解样品，并通过免疫印迹进行分析。结果见图11A和图11B。通过利用TIR’s(7轻链，3重链)，控制这些基因的多个启动子被同时诱导，导致分泌受阻，用paTF130的还原型样品证实了这一点(图11A)。重链和轻链前体的积累在该泳道中非常明显。极少量成熟轻链和成熟重链被检测出，大部分蛋白以前体形式积累。但是，一旦重链和轻链被分时分别表达(如在pxTF-7T3FL中那样)，则可积累显著量的成熟轻链(图11A)。尽管在该样品中仍能检测到少量轻链前体，但这一水平看来并不对轻链或重链的分泌造成任何问题。此外，分时表达导致成熟重链的有效分泌，分泌水平显著高于用paTF130获得的水平，并且没有关于前体积累的迹象。
有效分泌与全长抗体装配的相关性用非还原样品来显示(图11B)。两种样品中都检测到全长抗体；但含量相差很大。如箭头所示，在paTF130样品中仅检测到微弱的全长带。这条带在pxTF-7T3FL样品中变得非常明显。
实施例3.制备抗-组织因子F(ab’)2
在该实施例中，用单启动子质粒pCYC56作对照。pCYC56结构类似于pS1130，不同的是其插入序列编码抗-组织因子抗体的轻链和重链片段。构建双启动子质粒pxTF-7T3，它与实施例1的双启动子质粒pxCD18-7T3相似，用它实现抗-组织因子轻链和重链的分时分别表达。将质粒pMS421的lacI序列插入pxTF-7T3中，产生新的双启动子pJVG3IL。lacI的加入消除了与pMS421进行共表达的需要。
这些发酵中所用的宿主菌株是大肠杆菌W3110的衍生物，命名为60H4。60H4的完整基因型为：W3110 ΔfhuAΔmanA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 deoC2 degP41(ΔpstI-Kanr)IN(rrnD-rrnE)1 ilvG2096(Valr)Δprc prc-suppressor。将60H4宿主细胞用pCYC56，pJVG3IL，或者pxTF-7T3与pMS421的组合来转化，选出成功的转化体，进行培养。
用类似于实施例1中抗-CD18 F(ab’)2的条件进行发酵，原则上区别在于，发酵耗时从近72小时到114小时不等，当培养物达到OD550 220后，用IPTG将重链诱导近4-12小时。
也采用抗-CD18 F(ab’)2的蛋白G实验分析抗-组织因子F(ab’)2产物，不同的是，采用抗-组织因子F(ab’)2标准品制备标准曲线。
用上述启动子系统进行了一系列抗-组织因子F(ab’)2发酵。装配好的抗-组织因子F(ab’)2复合物的产量从单启动子系统的1g/L增加到双启动子系统的2.6±0.3g/L(n＝13)，所用质粒为pJVG3IL。
上述结果表明，通过将轻链和重链分时分别合成，可以使装配好的抗-组织因子F(ab’)2的产量显著增加。
尽管上文描述了具体实施方式，但应理解本发明不限于此。本领域普通技术人员可以中不违背本发明总体精神的前提下对所公开的实施方案进行各种改动。所有这些改动都包括在本发明的范围内。

Claims (57)

1.一种在宿主细胞中制备功能性抗体或其片段的方法，所述宿主细胞被两种不同的翻译单元转化，所述翻译单元分别编码所述抗体或其片段的轻链和重链，所述方法包括以下步骤：a)培养所述宿主细胞，所用的培养条件适合于依次表达所述轻链和重链，从而分时分别产生所述轻链和重链；和b)使所述轻链和重链装配，形成功能性抗体或其片段。
2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞为原核细胞，每种翻译单元还包含编码原核分泌信号或其变体的核苷酸序列，该序列与所述轻链或重链的N’-末端可操作相连。
3.权利要求2的方法，其中所述两种不同翻译单元受不同启动子的控制。
4.权利要求3的方法，其中所述两种不同翻译单元位于单个重组载体上。
5.权利要求2的方法，其中所述分泌信号选自STII，OmpA，PhoE，LamB，MBP或PhoA。
6.权利要求5的方法，其中所述分泌信号是STII。
7.权利要求3的方法，其中每种翻译单元的启动子选自phoA，TacI，TacII，lpp，lac-lpp，lac，ara，trp，trc或T7启动子。
8.权利要求7的方法，其中一种启动子是phoA启动子，另一种启动子是TacII启动子。
9.权利要求1的方法，其中所述抗体片段选自Fab，Fab’，F(ab’)2，F(ab’)2-亮氨酸拉链，Fv或dsFv。
10.权利要求1的方法，其中所述抗体特异于选自VEGF，IgE，CD11，CD18或组织因子(TF)的抗原。
11.权利要求10的方法，其中所述抗体是抗-CD18抗体或抗-TF抗体。
12.权利要求1的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
13.权利要求1的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
14.权利要求1的方法，其中所述抗体是人的抗体。
15.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞是来自大肠杆菌菌株的原核细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述大肠杆菌菌株经过遗传改造，能过度表达至少一种选自DsbA，DsbC，DsbG或FkpA的侣伴蛋白。
17.权利要求15的方法，其中所述大肠杆菌菌株有内源性蛋白酶活性缺陷。
18.权利要求15的方法，其中所述大肠杆菌菌株的基因型包含Δprcprc-suppressor。
19.权利要求1的方法，其中所述抗体的重链为全长链。
20.权利要求19的方法，其中所述轻链首先表达，所述全长重链随后表达。
21.一种依次表达抗体或其片段的轻链和重链的系统，它包含被重组载体转化的宿主细胞，所述载体包含分别编码所述轻链和重链的两种不同翻译单元，每种翻译单元与一种不同的启动子相连，其中在适当的条件下，所述两种翻译单元是分时分别活化的，使得轻链和重链被依次表达。
22.权利要求21的系统，其中所述宿主细胞是原核细胞，所述每种翻译单元还包含编码原核分泌信号的核苷酸序列，该序列与编码所述轻链或重链的核酸的5’-末端可操作相连。
23.权利要求22的系统，其中所述分泌信号选自STII，OmpA，PhoE，LamB，MBP或PhoA。
24.权利要求23的系统，其中所述分泌信号为STII。
25.权利要求24的系统，其中在两种翻译单元中分别使用两种STII变体，来提供约7份轻链，3份重链的翻译强度组合。
26.权利要求21的系统，其中所述每种翻译单元与不同的诱导型启动子可操作相连。
27.权利要求26的系统，其中所述诱导型启动子选自phoA，TacI，TacII，lpp，lac-lpp，lac，ara，trp，trc或T7启动子。
28.权利要求27的系统，其中一种启动子是phoA启动子，另一种启动子是TacII启动子。
29.权利要求21的系统，其中所述抗体片段选自Fab，Fab’，F(ab’)2，F(ab’)2-亮氨酸拉链，Fv或dsFv。
30.权利要求21的系统，其中所述抗体特异于选自VEGF，IgE，CD11，CD18或组织因子(TF)的抗原。
31.权利要求30的系统，其中所述抗体是抗-CD18抗体或抗-TF抗体。
32.权利要求21的系统，其中所述抗体是嵌合抗体。
33.权利要求21的系统，其中所述抗体是人源化抗体。
34.权利要求21的系统，其中所述抗体是人的抗体。
35.权利要求21或22的系统，其中所述宿主细胞是来自大肠杆菌菌株的原核细胞。
36.权利要求35的系统，其中所述大肠杆菌菌株经过遗传改造，能过度表达至少一种选自DsbA，DsbC，DsbG或FkpA的侣伴蛋白。
37.权利要求35的系统，其中所述大肠杆菌菌株有内源性蛋白酶活性缺陷。
38.权利要求37的系统，其中所述大肠杆菌菌株的基因型包含Δprcprc-suppressor。
39.权利要求21的系统，其中所述抗体的重链为全长链。
40.权利要求39的系统，其中所述轻链首先表达，所述全长重链随后表达。
41.一种用于在宿主细胞中制备功能性抗体或其片段的重组载体，所述载体包含：a)第一种启动子，它位于第一种编码分泌信号的翻译单元之前，所述第一种分泌信号与轻链可操作相连，和b)第二种启动子，它位于第二种编码分泌信号的翻译单元之前，所述第二种分泌信号与重链可操作相连，所述第一种启动子和第二种启动子在不同条件下被诱导。
42.权利要求41的重组载体，其中所述第一种和第二种启动子选自phoA，TacI，TacII，lpp，lac-lpp，lac，ara，trp，trc或T7启动子。
43.权利要求42的重组载体，其中所述第一种启动子是phoA启动子，所述第二种启动子是TacII启动子。
44.权利要求41的重组载体，其中所述分泌信号选自STII，OmpA，PhoE，LamB，MBP或PhoA。
45.权利要求44的重组载体，其中所述分泌信号是STII。
46.权利要求41的重组载体，其中所述抗体片段选自Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv或dsFv。
47.权利要求46的重组载体，其中所述抗体片段与一种二聚体化结构域融合。
48.权利要求41的重组载体，其中所述抗体特异于选自VEGF，IgE，CD11，CD18或组织因子(TF)的抗原。
49.权利要求48的重组载体，其中所述抗体是抗-CD18抗体。
50.权利要求49的重组载体，其中所述抗体是抗-CD18 F(ab’)2-亮氨酸拉链融合体。
51.权利要求50的重组载体，其中所述抗体具有SEQ ID NO：1所示轻链。
52.权利要求50的重组载体，其中所述抗体具有SEQ ID NO：2所示重链。
53.权利要求50的重组载体，它是包含SEQ ID NO：3所示核酸序列的pxCD18-7T3载体。
54.权利要求48的重组载体，其中所述抗体是抗-TF抗体。
55.权利要求54的重组载体，所述抗体具有SEQ ID NO：4所示轻链。
56.权利要求54的重组载体，所述抗体具有SEQ ID NO：5所示重链。
57.权利要求54的重组载体，它是包含SEQ ID NO：6所示核酸序列的pxTF-7T3FL载体。
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