CN117616041A - 抗-igfbp7构建体及其用途 - Google Patents

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CN117616041A CN202280034813.5A CN202280034813A CN117616041A CN 117616041 A CN117616041 A CN 117616041A CN 202280034813 A CN202280034813 A CN 202280034813A CN 117616041 A CN117616041 A CN 117616041A
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S·王
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Dangkang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请提供结合至IGFBP7的抗‑IGFBP7构建体(例如抗‑IGFBP7抗体)、编码所述抗‑IGFBP7的氨基酸序列的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、含有所述载体的宿主细胞、制备所述抗‑IGFBP7构建体的方法、含有所述抗‑IGFBP7构建体的药物组合物，以及使用所述抗‑IGFBP7构建体或组合物的方法。

Description

抗-IGFBP7构建体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月25日提交的美国临时申请US63/166,146的优先权，出于所有目的，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7抗体)及其用途。
以ASCII文本文件提交的序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：193852000540SEQLIST.TXT，记录日期：2022年3月24日，大小：56698字节)。
背景技术
IGFBP7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是人类中由IGFBP7基因编码的蛋白质。胰岛素样生长因子(IGF)是参与促进细胞生长和分裂并防止过早细胞凋亡的蛋白质。IGFBP7的主要功能是调节IGF于体液和组织中的可利用度，以及调节IGF与受体的结合。IGFBP7活跃于血管内膜中；其与IGF和IGF受体的相互作用对控制BRAF信号转导而言至关重要，所述BRAF信号转导参与引导细胞生长。这些过程已表明IGFBP7与细胞黏附和癌症相关。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
申请概述
下列申请概述仅为说明性的且无意以任何方式限制本申请。即，提供下列申请概述以介绍新颖分子的突出特点、有益效果和优点及其用途。因此，下列申请概述无意鉴别本申请要求保护的主题的基本特征，也无意用以确定本申请要求保护的主题的范围。
本申请一个方面中提供一种抗-IGFBP7构建体，其包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含：
1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
2)包含SEQ ID NO:2或112的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
3)包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
4)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
5)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
6)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
7)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
8)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
9)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
10)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
11)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
12)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；或
13)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
本申请在另一个方面中提供一种抗-IGFBP7构建体，其包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32-51中任一个的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQID NO:32-51中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-51中任一个具有至少约80％序列同一性的其变体。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述sdAb部分是骆驼科(camelid)的、嵌合的、人类的、部分人源化或完全人源化的。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述sdAb部分是VHH抗体。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体阻断CD93结合至IGFBP7。在一些实施方案中，所述CD93是人类CD93。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述IGFBP7是人类IGFBP7。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体还包含第二部分。在一些实施方案中，所述第二部分包含特异性识别抗原的抗体部分。在一些实施方案中，所述抗原是PD-L1。在一些实施方案中，所述抗体部分是全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体(minibody)、双抗体(diabody)或sdAb。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体还包含第二部分，所述第二部分包含半衰期延长部分。
在根据上述抗-IGFBP7构建体中任一个的一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是抗体-药物缀合物。
本申请在另一个方面中提供一种抗-IGFBP7构建体，其与上述抗-IGFBP7构建体中任一个的抗-IGFBP7构建体竞争特异性结合至IGFBP7。
本申请在另一个方面中提供一种药物组合物，其包含上述抗-IGFBP7构建体中任一个和药学上可接受的载体。
本申请在另一个方面中提供一种多核苷酸，其编码上述抗-IGFBP7构建体中任一个的多肽或其部分。
本申请在另一个方面中提供一种核酸构建体，其包含上述多核苷酸中任一个，且任选地还包含可操作地连接至所述多核苷酸的启动子。
本申请在另一个方面中提供一种载体，其包含上述核酸构建体中任一个。
本申请在另一个方面中提供一种经分离宿主细胞，其包含上述多核苷酸、核酸构建体或载体中任一个。
本申请在另一个方面中提供一种培养基，其包含上述抗-IGFBP7构建体、多核苷酸、核酸构建体、载体或宿主细胞中任一个的多肽。
本申请在另一个方面中提供一种产生抗-IGFBP7构建体的方法，其包括：a)在有效表达所述多肽的条件下培养上述经分离宿主细胞中任一个，以及b)从所述宿主细胞获得所述多肽。
本申请在另一个方面中提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的上述抗-IGFBP7构建体或药物组合物中任一个。在一些实施方案中，所述疾病或病症与异常血管结构相关联。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症包含CD93+内皮细胞。在一些实施方案中，所述癌症包含IGFBP7+血管。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于肿瘤缺氧。在一些实施方案中，所述癌症是局部晚期或转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症选自：淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤和胰脏癌。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是经肠胃外施用至所述个体内。在一些实施方案中，所述方法还包括施用第二疗法。在一些实施方案中，所述第二疗法选自：手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、激素疗法、靶向疗法、冷冻疗法(cryotherapy)、超声波疗法、光动力疗法和化学疗法。在一些实施方案中，所述第二疗法是免疫疗法。在一些实施方案中，所述免疫疗法包括施用免疫调节剂。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂包含抗-PD-L1抗体或抗-PD-1抗体。在一些实施方案中，所述个体是人类。
附图说明
图1显示在用人类IGFBP7免疫美洲鸵后，美洲鸵血清中的抗-人类IGFBP7抗体效价。
图2A-2B显示各种抗-IGFBP7纳米抗体对表达人类IGFBP7(hIGFBP7)的HEK293T细胞的结合。
图3A-3B显示各种抗-IGFBP7纳米抗体对表达小鼠IGFBP7(mIGFBP7)的HEK293T细胞的结合。
图4显示各种抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对表达人类IGFBP7(hIGFBP7)的HEK293T细胞的结合。
图5显示各种抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对表达小鼠IGFBP7(mIGFBP7)的CHO-K1细胞的结合。
图6显示各种抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对人类IGFBP7的结合亲和力。
图7显示各种抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对小鼠IGFBP7的结合亲和力。
图8显示两种抗-IGFBP7双特异性分子的示意图。
图9显示各种单特异性和双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对人类IGFBP7的结合亲和力。
图10显示各种单特异性和双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对小鼠IGFBP7的结合亲和力。
图11显示各种单特异性和双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对食蟹猴IGFBP7的结合亲和力。
图12A-12B显示各种单特异性和双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对细胞表面上显示的人类IGFBP7的结合。
图13显示各种双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对表达人类和小鼠IGFBP7的HEK293T细胞的结合。
图14显示在表达人类CD93的CHO细胞中由各种抗-IGFBP7纳米抗体阻断CD93与IGFBP7之间的相互作用的效应。
图15A-15C显示在表达人类CD93的CHO细胞中由各种抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体阻断CD93与IGFBP7之间的相互作用的效应。
图16显示在表达人类CD93的CHO细胞中由各种单特异性和双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体阻断CD93与IGFBP7之间的相互作用的效应。
图17A-17B显示相比对照，由各种抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体对HUVEC管形成的抑制。
图18显示抗-IGFBP7抗体通过Octet竞争的抗原表位聚类(epitope binning)。
申请详述
本申请提供特异性结合至IGFBP7的新颖抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)、制备所述抗-IGFBP7构建体的方法、使用所述构建体的方法(例如，治疗疾病或病症的方法)。
I.定义
术语“抗体”以其最广泛意义使用，且包含各种抗体结构，包括(但不限于)：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们显示所需的抗原结合活性即可。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
全长抗体包含两个重链和两个轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变域可分别称为“VH”和“VL”。两种链中的可变区通常含有三个高度可变环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR，包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可由Kabat、Chothia或Al-Lazikani(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat1987；Kabat 1991)的惯例定义或鉴别。重链或轻链的三个CDR插入称为框架区(FR)的侧翼延伸之间，所述框架区比所述CDR更高度保守，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但显示各种效应功能。抗体基于其重链的恒定区的氨基酸序列进行分类。抗体的五种主要类别或同型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要抗体类别分为子类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括(例如)双抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一或多个CDR的抗体一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体、纳米抗体、域抗体、二价域抗体，或结合至抗原但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段可结合至与亲代抗体或亲代抗体片段(例如，亲本scFv)结合的抗原相同的抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段可包含一或多个来自特定人类抗体的CDR，其接枝(grafted)至来自一或多个不同人类抗体的框架区。
术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单抗原结合多肽。所述sdAb单独可结合至抗原，而不与含有相应CDR的多肽配对。在一些情况下，sdAb是由骆驼科HCAb工程化而得到，且其重链可变域在本文中称为“VHH”。骆驼科sdAb是最小的已知抗原结合抗体片段之一(参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-8(1993)；Greenberg等人，Nature374:168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人，Nanomedicine(Lond),8:1013-26(2013))。
“Fv”是最小抗体片段，其含有完整抗原识别和结合位点。该片段由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区域的二聚体构成。由这些两个域的折迭产生六个高变环(各来自重链和轻链的3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基并赋予对所述抗体的抗原结合特异性。然而，即使单可变域(或仅包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单一多肽链内的VH和VL抗体域的抗体片段。在一些实施方案中，所述scFv多肽还包含在VH与VL域之间的多肽接头，其可使所述scFv形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Plückthun的ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指存在于重链和轻链多肽两者的可变区内的非连续抗原结合位点。这些特定区域已描述于：Kabat等人，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人，J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；和Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括彼此比较时氨基酸残基的重迭或子组。然而，应用任一定义来提及抗体或接枝抗体或其变体的CDR，旨在于如本文定义和使用的术语的范围内。作为比较，下文表1中所述为包含如由上文引用的参考文献中各自定义的CDR的氨基酸残基。本技术领域中已知CDR预测算法和界面，包括(例如)Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人，Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.等人，Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。此段中引用的参考文献的内容以全文引用的方式并入本文中，以用于本申请中且可能包括于本文的一或多个技术方案中。
表1：CDR定义
1残基编号遵循Kabat等人的命名法，同上
2残基编号遵循Chothia等人的命名法，同上
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法，同上
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法，同上
5残基编号遵循Honegger和Plückthun的命名法，同上
词语“如Kabat中的可变域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变化，是指用于Kabat等人(同上)中抗体汇编的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可含有更少或另外氨基酸，它们对应于所述可变域的FR或高变区(HVR)的缩短或插入其中。例如，重链可变域可包括在H2的残基52后的单氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)，以及在重链FR残基82后插入的残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。针对给定抗体，通过所述抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号的序列比对，可确定残基的Kabat编号。
除非本文另有指示，否则残基在免疫球蛋白重链中的编号是与如Kabat等人(同上)中的EU指数相同。“如Kabat中的EU指数”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的CDR残基外的那些可变-域残基。
非人类(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自所述接受者的高变区(HVR)的残基被来自具有所需抗体特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的高变区的残基置换。在一些情况下，所述人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基置换。此外，人源化抗体可包含不存在于所述接受者抗体中或所述供体抗体中的残基。作出这些修饰以进一步精修抗体性能。通常，所述人源化抗体将包含至少一个，以及通常两个可变域中的大体上所有，其中高变环中的所有或大体上所有对应于非人类免疫球蛋白的那些，以及FR的所有或大体上所有是人类免疫球蛋白序列的那些。所述人源化抗体任选地也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。其他细节参见，Jones等人，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人类抗体”是具有对应于由人类产生和/或已使用用于制造如本文公开的人类抗体的技术中任一个制得的抗体氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。人类抗体的此定义，明确排除包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可使用本技术领域中已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来产生。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。也可用于制备人类单克隆抗体的方法描述于：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。也参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人类抗体可通过如下来制备：将抗原施用于经修饰以响应该抗原激发而产生这些抗体但其内源性基因座已失能的转基因动物，例如，免疫的异种小鼠(xenomice)(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利US6,075,181和US6,150,584)。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，也参见例如，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
关于本文鉴别的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”，定义为在比对所述序列并考虑任何保守取代作为所述序列同一性的部分后，候选序列中与比较中的多肽氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对，可以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在比较中的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文目的，然而，氨基酸序列同一性％值是使用序列比较计算机程序MUSCLE产生(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004)。
“同源性”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列二者中的位置由相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，若两个蛋白质分子每个中的位置由赖氨酸占据，或若两个DNA分子每个中的位置由腺嘌呤占据时，则所述分子于所述位置处是同源性的。两个序列之间的同源性百分比是所述两个序列共享的匹配或同源性位置的数量除以比较位置的数量乘以100的函数。例如，若两个序列中10个位置中6个匹配或同源性，则所述两个序列是60％同源性的。举例来说，蛋白质序列SGTSTD和TGTSDA共享50％同源性。通常，当比对两个序列以产生最大同源性时，作出比较。
术语“恒定域”是指相对于免疫球蛋白的其他部分(含有抗原结合位点的可变域)具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。所述恒定域含有重链的CH1、CH2和CH3域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可基于其恒定域的氨基酸序列，分配至两种明显不同类型(称为卡帕(“κ”)和拉姆达(“λ”))中的一个。
“CH1域”(也称为“H1”域的“C1”)通常自约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”一般定义为对应于人类IgG1的Glu216至Pro230的IgG中的区域(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其他IgG同型的铰链区可通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置于相同位置中与IgG1序列比对。
人类IgG Fc区的“CH2域”(也称为“C2”域)通常自约氨基酸231延伸至约氨基酸340。所述CH2域的独特之处在于其不与另一域紧密配对。相反，两个N连接的分支碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2域之间。据推测，所述碳水化合物可为域-域配对提供替代物，且有助于稳定所述CH2域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3域”(也称为“C2”域)包含Fc区中残基C端至CH2域的延伸(即自约氨基酸残基341至抗体序列的C端，通常于IgG的氨基酸残基446或447处)。
本文的术语“Fc区”或“片段可结晶区”用以定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为自位置Cys226的氨基酸残基，或自Pro230，延伸至其羧基端。所述Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)例如，可在所述抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程化编码所述抗体的重链的核酸予以移除。因此，完整抗体的组合物可包含被移除所有K447残基的抗体群体、未移除K447残基的抗体群体，以及具有有和无所述K447残基的抗体的混合物的抗体群体。适用于本文描述的抗体中的天然序列Fc区，包括人类IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII、FcRN和FcγRIII子类，包括等位基因变体和这些受体的选择性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有不同之处主要在于其细胞质域的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA于其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB于其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。FcRN对抗体再循环至血液而言至关重要，其容许所述抗体的血清半衰期增加。关于FcR的综述，参见Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；和deHaas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR(包括那些未来待鉴别的)。
如本文所用，术语“抗原表位”是指抗体或抗体部分结合的抗原上的特异性原子或氨基酸组。如果两个抗体或抗体部分对所述抗原显示竞争性结合，则它们可结合抗原内的相同抗原表位。
如本文所用，当第一抗体或其片段在等摩尔浓度的所述第一抗体或其片段的存在下抑制第二抗体或其片段的靶抗原结合至少约50％(如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中任一个)时，所述第一抗体或其片段与第二抗体或其片段“竞争”结合至靶抗原，或反之亦然。一种用于基于抗体的交叉竞争来“聚类”抗体的高通量方法，描述于PCT公开WO03/48731中。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”和“对…具特异性”，是指可测量和可再现的相互作用，如标靶与抗体或抗体部分之间的结合，其决定所述标靶于异质分子(包括生物分子)群体中的存在。例如，特异性识别标靶(其可为抗原表位)的抗体或抗体部分，是以比其结合至其他标靶更大的亲和力、强结合性、更容易和/或更持久的方式结合至所述标靶的抗体或抗体部分。在一些实施方案中，抗体对无关标靶的结合程度小于所述抗体对所述标靶的结合的约10％，如(例如)通过放射免疫分析(RIA)所测量。在一些实施方案中，特异性结合标靶的抗体具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施方案中，抗体特异性结合在来自不同物种蛋白中的保守蛋白上的抗原表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括(但不要求)排他性结合。所述抗体或抗原结合域的结合特异性，可通过本技术领域中已知的方法以实验方式确定。这些方法包括(但不限于)：蛋白质印迹法、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BLI、SPR、BIACORETM测试和肽扫描。
“双特异性”或“多特异性”抗体可指结合至两种或更多种不同抗原的抗体，或结合至相同抗原的两个或更多个不同抗原表位的抗体。
“经分离的”抗体(或构建体)是已从其产生环境(例如，天然或重组)的组分鉴别、分离和/或回收的抗体(或构建体)。优选地，所述经分离的多肽不与来自其产生环境的所有其他组分结合。
编码本文描述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“经分离的”核酸分子，是自在产生其的环境中通常与其结合的至少一个污染核酸分子鉴别和分离的核酸分子。优选地，所述经分离的核酸不与所述产生环境相关联的所有组分结合。编码本文描述的多肽和抗体的经分离的核酸分子，是以除天然中发现其的形式或环境外的形式存在。因此，经分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码本文描述的多肽和抗体的核酸。经分离的核酸包括在通常含有该核酸分子的细胞中含有的所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外，或位于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
术语“控制序列”是指用于在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列建立功能关系时，即为“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA以参与该多肽的分泌的前蛋白的形式表达，则所述前序列或分泌前导序列的DNA是可操作连接至多肽的DNA；若启动子或增强子影响所述序列的转录，则所述启动子或增强子是可操作连接至编码序列；或若核糖体结合位点被定位以促进翻译，则所述核糖体结合位点是可操作连接至编码序列。通常，“可操作连接”意指连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情况下，是连续的且于阅读框中。然而，增强子不必为连续的。连接是通过于便利的限制位点处进行连接进行。若这些位点不存在，则合成的寡核苷酸衔接子或接头是根据常规实践来使用的。
如本文所用，术语“载体”是指可繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体，以及整合到将其引入其中的宿主细胞的基因组内的载体。某些载体可引导与其可操作连接的核酸的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“经转染”、或“经转化”、或“经转导”，是指一种将外源性核酸转移或引入宿主细胞内的方法。“经转染”、或“经转化”、或“经转导”的细胞是经外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，且是指已引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的子代，而不考虑传代的数量。子代在核酸含量上可与亲代细胞不完全相同，其可含有突变。本文包括如在初始转化的细胞中经筛选或选择的、具有相同功能或生物活性的突变体子代。
术语“免疫缀合物”包括提及治疗剂或可检测标记物对抗体(如本文描述的抗体部分)的共价连接。所述连接可为直接或透过接头(如肽接头)间接的。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是一种用于获得有利或所需结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的，有利或所需临床结果包括(但不限于)下列一种或多种：缓解由疾病产生的一或多种症状、减轻所述疾病的程度、稳定所述疾病(例如，预防或延迟所述疾病的恶化)、预防或延迟所述疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟所述疾病的复发、延迟或减缓所述疾病的进展、改善疾病状态、提供所述疾病的缓解(部分或完全)、减少治疗所述疾病所需的一或多种其他药物的剂量、延迟所述疾病的进展、增加或改善生活质量、促进重量增加，和/或延长存活。“治疗”也涵盖减少癌症的病理后果(如，例如，肿瘤体积)。本申请的方法考虑了治疗的这些方面中任一个或多个。
在癌症的内文中，术语“治疗”包括以下中任一个或所有：抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减轻整体肿瘤负荷和改善与所述疾病相关联的一或多种症状。
术语“抑制(inhibition/inhibit)”是指任何表型特性的减少或停止，或是指所述特性的发病率、程度或可能性的减少或停止。“减少”或“抑制”是指相比参考，降低、减少或阻止活性、功能和/或量。在一些实施方案中，“减少”或“抑制”意谓引起20％或更大的整体减少的能力。在另一实施方案中，“减少”或“抑制”意谓引起50％或更大的整体减少的能力。在又一实施方案中，“减少”或“抑制”意谓引起75％、85％、90％、95％或更大的整体减少的能力。
如本文所用，“参考”是指出于比较目的使用的任何样本、标准或水平。参考可获自健康和/或未患病样本。在一些实例中，参考可获自未治疗的样本。在一些实例中，参考是获自个体的未患病或未治疗的样本。在一些实例中，参考是获自一或多个健康个体，它们不为个体或患者。
如本文所用，“延迟疾病的发展”意谓延迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或推迟所述疾病(如癌症)的发展。取决于所述疾病的病史和/或治疗中的个体，该延迟可具有不同的时间长度。如对本领域技术人员而言显而易见，充分或显著的延迟可(实际上)涵盖预防，因为所述个体不发展所述疾病。例如，可延迟晚期癌症，如转移的发展。
如本文所用，“预防”包括针对可能易患疾病但尚未诊断患有所述疾病的个体中所述疾病的发生或复发提供预防。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当相比除目标条件或参数外的其他相同条件时，或相比另一条件，减少所述功能或活性。例如，相比在缺乏抑制所述肿瘤生长的抗体的情况下的肿瘤生长速率，所述抗体降低所述肿瘤的生长速率。
提及哺乳动物，术语“受试者”、“个体”和“病患”在本文中可互换使用，其包括(但不限于)：人类、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是人类。
药剂的“有效量”是指在必需的剂量和时长下有效实现所需治疗或预防结果的量。特定剂量可取决于以下一种或多种而变化：选定的特定药剂、待遵循的给药方案、是否与其他化合物组合施用、施用时序、待成像的组织和携载其的物理递送系统。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指一种制剂，其形式允许活性成分的生物活性有效，且其不含有对将施用所述制剂的个体具有不可接受的毒性的另外组分。这些制剂可为无菌的。
“药学上可接受的载体”是指无毒固体、半固体，或液体填充剂、稀释剂、囊封材料、制剂辅助剂，或本领域中通常与治疗剂一起使用的载体，所述治疗剂共同包含于用于对个体施用的“药物组合物”。药学上可接受的载体在采用的剂量和浓度下对接受者无毒，且可与所述制剂的其他成分兼容。所述药学上可接受的载体适用于采用的制剂。
“无菌”制剂是无菌的，或基本上不含活微生物及其孢子。
与一或多种其他治疗剂“组合”施用，包括以任何顺序同时(并行)和连续或循序施用。
如本文所用，术语“并行”是指两种或更多种治疗剂的施用，其中所述施用的至少部分在时间上重迭，或其中一种治疗剂的施用在相对于另一治疗剂的施用落于较短时间期内。例如，所述两种或更多种治疗剂是以不超过约60分钟，如不超过约30、15、10、5或1分钟中任一个的时间间隔施用。
如本文所用，术语“循序”是指两种或更多种治疗剂的施用，其中一或多种药剂的施用在一或多种其他药剂的施用中断后仍继续。例如，所述两种或更多种治疗剂的施用是以大于约15分钟，如约20、30、40、50或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周，或1个月或更久中任一个的时间间隔施用。
如本文所用，“与…联合”是指在另一治疗方式外施用一种治疗方式。因此，“与…联合”是指在对个体施用另一治疗方式之前、期间或之后施用一种治疗方式。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含有关这些治疗产品的适用症、用途、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或涉及使用的警告的信息。
“制品”是任何制造物(例如，包装或容器)或试剂盒，其包含至少一种试剂，例如，用于治疗疾病或病症(例如，癌症)的药剂，或用于特异性检测本文描述的生物标志物的探针。在一些实施方案中，所述制造物或试剂盒是作为用于进行本文描述的方法的单元促销、分发或销售。
应了解，本文描述的申请的实施方案包括“由实施方案构成”和/或“基本上由其构成”。
本文中提及“约”值或参数，包括(和描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，提及“非”值或参数，一般意谓并描述“除该值或参数外”。例如，该方法非用以治疗X型癌症，意谓所述方法用以治疗除X外的类型的癌症。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和随附权利要求书中使用，除非内文另有明确规定，否则单数形式“一”、“或”和“所述”包括复数个指示物。
II.抗-IGFBP7构建体
本申请提供包含特异性结合至如本文描述的IGFBP7的抗-IGFBP7抗体部分的抗-IGFBP7构建体。
IGFBP7
胰岛素样生长因子(IGF)-结合蛋白(IGFBP)7(也称为Mac25、IGFBP-rp1、肿瘤衍生的粘附因子(TAF)、前列环素刺激因子(PSF)和血管调节素(AGM))是属于IGFBP家族的分泌性细胞外基质(ECM)蛋白。参见Hwa等人，Endocr Rev.1999；20(6):761-87；Bach等人，Endocrinology.2018；159(2):570-8。IGFBP家族的成员在N端含有IGF结合(IB)域，其结合至IGF1，且有助于调节IGF1于血液中的生物可利用度。IGFBP7缺乏C端域，其发挥作用以稳定IGF1结合，因此其对IGF-1的亲和力显著低于对IGFBP1-6的亲和力。参见Oh等人，J BiolChem.1996；271(48):30322-5。发现IGFBP7在许多正常组织和癌细胞中表达；然而，IGFBP7在癌症中的精确作用是具有争议的。一方面，显示IGFBP7自癌细胞释放，且充当肿瘤抑制物以触发肿瘤细胞凋亡，并抑制血管生成(Wajapeyee等人，Cell.2008；132(3):363-74)；提出IGF1R作为受体，且IGFBP7结合阻断IGF-1与IGF1R之间的相互作用，以抑制肿瘤干样细胞的扩增和侵袭。参见Cao等人，Cancer Cell.2017；31(1):110-26；Evdokimova等人，SciSignal.2012；5(255):ra92。IGFBP7的施用抑制活体内肿瘤生长，以及IGFBP7-/-小鼠易患二乙基亚硝胺诱导的肝癌发生。参见Akiel等人，Cancer Res.2017；77(15):4014-25；Darr等人，Oncogene.2014；33(23):3024-32。另一方面，显示IGFBP7在癌症组织血管中的上调，且可促进血管生成(48、64)。参见Komiya等人，Cancer Med.2014；3(3):537-49；Pen等人，Oncogene.2008；27(54):6834-44。IGFBP7可由血管EC中的VEGF强烈诱导，且已报导血管生成中IGFBP7与VEGF之间的协同效应。参见Komiya等人，Cancer Med.2014；3(3):537-49；Hooper等人，Circ Res.2009；105(2):201-8。出于所有目，上文所列举的各参考文献以全文引用的方式并入本文中。
人类IGFBP7基因位于4q12，并编码多肽。所述多肽的一种同功型具有264个氨基酸残基(SEQ ID NO:111，其包括信号肽域(SEQ ID NO:111的残基1-26)、胰岛素结合域(IB域，SEQ ID NO:111的残基28-106)、卡扎尔样(Kazal-like)域(SEQ ID NO:111的残基105-158)，以及Ig样C2型域(SEQ ID NO:111的残基160-264))。
抗-IGFBP7抗体部分
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:33具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:2或112的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:2或112的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:2或112的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:46具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:47具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:34具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:49具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:50具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:51具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:37具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:38具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:39具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:40具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分：包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:41具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:42具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:43具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:44具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分与包含单域抗体(sdAb)部分的抗体或抗体片段竞争结合IGFBP7，其中所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，所述抗体部分是单域抗体(sdAb)部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含特异性识别IGFBP7的抗体部分，其中所述抗体部分包含单域抗体(sdAb)，所述sdAb包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含来源于单域抗体(sdAb)部分的人源化抗体部分，所述单域抗体(sdAb)部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，sdAb部分包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:45具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含：a)包含氨基酸序列INTYL(SEQ ID NO:52)的CDR1，b)包含氨基酸序列AITSGGSINYADSVKG(SEQ ID NO:12)的CDR2，以及c)包含氨基酸序列KAHPNPWGFDNDY(SEQ IDNO:13)的CDR3。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含：a)包含氨基酸序列AX1NGAM(SEQ ID NO:53)的CDR1，其中X1＝N或I，b)包含AITSGGSINYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)的CDR2，以及c)包含氨基酸序列KAHPNPWGFDNDY(SEQ ID NO:13)的CDR3。
在一些实施方案中，上述抗-IGFBP7 sdAb部分是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化或完全人源化的。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7 sdAb部分是VHH抗体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含或是抗-IGFBP7融合蛋白。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含或是多特异性抗-IGFBP7构建体(如双特异性抗体)。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含或是抗-IGFBP7免疫缀合物。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体阻断IGFBP7与CD93的结合。在一些实施方案中，所述CD93是人类CD93。在一些实施方案中，所述IGFBP7是人类IGFBP7。在一些实施方案中，IGFBP7与CD93的结合，在将抗-IGFBP7抗体与IGFBP7或表达IGFBP7的细胞预孵育后至少阻断约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体和IGFBP7的剂量比率为约1:10、1:6、1:3、1:1.5、1:1、4:3、2:1或5:1。在一些实施方案中，IGFBP7与CD93的结合，在以约50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.8μg/ml、0.6μg/ml或0.4μg/ml的浓度预孵育所述抗-IGFBP7抗体后至少阻断约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体阻断IGFBP7和MMRN2结合至CD93。在一些实施方案中，所述MMRN2是人类MMRN2。在一些实施方案中，所述IGFBP7是人类IGFBP7。在一些实施方案中，IGFBP7与MMRN2的结合，在将抗-IGFBP7抗体与IGFBP7或表达IGFBP7的细胞预孵育后至少阻断10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体不阻断IGFBP7与MMRN2的结合。
在一些实施方案中，IGFBP7是人类IGFBP7。在一些实施方案中，所述IGFBP7是小鼠IGFBP7。在一些实施方案中，所述IGFBP7是食蟹猴IGFBP7。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体部分结合至人类IGFBP7和食蟹猴IGFBP7两者。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7抗体部分结合至人类IGFBP7和小鼠IGFBP7两者。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7抗体部分不结合至食蟹猴IGFBP7和/或小鼠IGFBP7。
包含至少两个特异性识别IGFBP7的抗体部分的抗-IGFBP7构建体
本申请也提供包含两个或更多个抗体部分的抗-IGFBP7构建体，其中所述两个或更多个抗体部分中的至少两个特异性识别IGFBP7。
在一些实施方案中，至少两个抗体部分是不同的。在一些实施方案中，所述至少两个抗体部分结合至IGFBP7的两个不同抗原表位。在一些实施方案中，所述至少两个抗体部分结合至相同IGFBP7抗原表位。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括包含至少两个不同抗-IGFBP7抗体部分(例如，两个不同VHH域，例如，A1和D4)的四聚体融合蛋白。在一些实施方案中，所述两个不同抗-IGFBP7抗体部分结合至IGFBP7的两个不同抗原表位。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含Fc片段。
在一些实施方案中，至少两个抗体部分是相同的。
在一些实施方案中，至少两个抗体部分均为单域抗体部分(如本文描述的sdAb部分中任一个)。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:19的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:22的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3。
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在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7抗体构建体，其包含：a)包含第一单域抗体(sdAb)部分的第一抗-IGFBP7抗体部分，和b)包含第二sdAb部分的第二抗-IGFBP7抗体部分，其中所述第一sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3；其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3。
本文描述的两个抗体部分(例如，两个sdAb)可以通过容许两个部分的适当性质(例如，结合至IGFBP7)的任何方式融合在一起。在一些实施方案中，第一抗-IGFBP7抗体部分是融合至(例如，直接融合至)第二抗-IGFBP7抗体部分的N端。在一些实施方案中，所述第一抗-IGFBP7抗体部分是融合至(例如，直接融合至)所述第二抗-IGFBP7抗体部分的C端。在一些实施方案中，所述构建体包含Fc片段，所述Fc片段包含第一Fc域和第二Fc域，其中各Fc域包含CH2域和CH3域。在一些实施方案中，两个抗体部分均融合至两个Fc域的N端。参见例如图8。在一些实施方案中，两个抗体部分均融合至所述两个Fc域的C端。在一些实施方案中，所述第一抗-IGFBP7抗体部分融合至两个Fc域的N端，以及所述第二抗-IGFBP7抗体部分融合至两个Fc域的C端。在一些实施方案中，所述第一抗-IGFBP7抗体部分融合至两个Fc域的C端，以及所述第二抗-IGFBP7抗体部分融合至两个Fc域的N端。在一些实施方案中，所述第一或第二抗体部分经由接头(例如，GS接头)融合至所述Fc域中的一个或两个的C端。在一些实施方案中，所述第一或第二抗体部分是经由接头(例如，GS接头)融合至所述Fc域中的一个或两个的N端。在一些实施方案中，所述Fc域包含铰链区。在一些实施方案中，所述Fc域具有导致效应功能降低的突变。
在一些实施方案中，所述构建体包含第一多肽和第二多肽，其中两个多肽各包含a)第一单域抗体(sdAb)部分、b)第二sdAb部分和c)Fc域，其中两个Fc域形成Fc片段，其中所述第一sdAb包括：i)包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，其中所述第一sdAb经由其C端直接融合至所述第二sdAb的N端，以及其中所述第二sdAb经由其C端融合至两个Fc域的N端，任选地经由接头(例如，GS接头)。
在一些实施方案中，所述构建体包含第一多肽和第二多肽，其中两个多肽各包含a)第一单域抗体(sdAb)部分、b)第二sdAb部分和c)Fc域，其中两个Fc域形成Fc片段，其中所述第一sdAb包括：i)包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，其中所述第二sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，其中所述第一sdAb经由其C端融合至两个Fc域的N端，以及其中所述第二sdAb经由其N端融合至两个Fc域的C端，任选地经由接头(例如，GS接头)。
在一些实施方案中，第一或第二抗-IGFBP7抗体部分是来源于本章节描述的抗体部分中任一个的人源化抗体部分。
在一些实施方案中，第一或第二抗-IGFBP7抗体部分是与本章节描述的抗体部分中任一个竞争结合IGFBP7的抗原表位的抗体部分。
结合至第二药剂的多特异性抗-IGFBP7构建体
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含多特异性(例如，双特异性)抗-IGFBP7构建体，其包含：抗-IGFBP7抗体部分(例如，本文描述的抗-IGFBP7抗体部分中任一个)，以及特异性识别不同于IGFBP7的第二抗原的第二结合部分(如第二抗体部分)。在一些实施方案中，所述第二抗原是免疫检查点分子。在一些实施方案中，所述第二抗原是PD-1或PD-L1。在一些实施方案中，所述第二抗原是肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述第二抗原是血管生成剂。在一些实施方案中，所述血管生成剂是VEGF(例如，人类VEGF)。在一些实施方案中，所述血管生成剂是VEGF受体。在一些实施方案中，所述血管生成剂是VEGFR1(例如，人类VEGFR1)或其片段。在一些实施方案中，所述血管生成剂是VEGFR2(例如，人类VEGFR2)或其片段。
在一些实施方案中，第二结合部分是经由接头(如本文描述的接头中任一个)融合至抗-IGFBP7抗体部分。
在一些实施方案中，第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体、双抗体、纳米抗体或sdAb。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体是多特异性(例如，双特异性)抗-IGFBP7构建体，其包含：a)根据本文描述的抗-IGFBP7抗体部分中任一个的抗-IGFBP7抗体部分；b)特异性识别PD-L1(抗-PD-L1抗体部分，如本文描述的那些中任一个)或PD-1(抗-PD-1抗体部分，如本文描述的那些中任一个)的第二抗体部分。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体是多特异性(例如，双特异性)抗-IGFBP7构建体，其包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗-IGFBP7抗体部分中任一个)，其融合至所述抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体的重链中的至少一个或两者。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7抗体部分是融合至两个重链的N端。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7抗体部分是融合至两个重链的C端。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体是多特异性(例如，双特异性)抗-IGFBP7构建体，其包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至所述抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体的轻链中的至少一个或两者。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7抗体部分是融合至两个轻链的N端。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7抗体部分是融合至两个轻链的C端。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含：a)抗-PD-L1或抗-PD-1抗体部分，其包括包含两个重链和两个轻链的全长抗体，其中所述两个重链各包含重链可变区(VH)并且所述两个轻链各包含轻链可变区(VL)，b)抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，其包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7构建体，其包含：a)抗-IGFBP7抗体部分，和b)特异性识别VEGF(例如，人类VEGF)或VEGFR(例如，人类VEGFR1，例如，人类VEGFR2)的结合部分。在一些实施方案中，特异性识别VEGF或VEGFR的结合部分包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-IGFBP7 sdAb包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb经由接头或免疫球蛋白(如人类IgG)的恒定区融合至特异性识别VEGF或VEGFR的结合部分。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7构建体，其包含：a)抗-IGFBP7抗体部分，和b)特异性识别VEGF(例如，人类VEGF)或VEGFR(例如，人类VEGFR1，例如，人类VEGFR2)的结合部分。在一些实施方案中，特异性识别VEGF或VEGFR的结合部分包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-IGFBP7 sdAb包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb经由接头或免疫球蛋白(如人类IgG)的恒定区融合至特异性识别VEGF或VEGFR的结合部分。
在一些实施方案中，提供一种抗-IGFBP7构建体，其包含：a)抗-VEGF(例如，抗-人类VEGF)或抗-VEGFR(例如，抗-人类VEGFR1，例如，抗-人类VEGFR2)全长抗体，所述全长抗体包含两个重链和两个轻链，以及b)抗-IGFBP7单域抗体(sdAb)，其中抗-IGFBP7 sdAb融合至所述全长抗体的重链和/或轻链中的一个或两者。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb融合至所述全长抗体的两个重链的C端。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb融合至所述全长抗体的两个重链的N端。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7sdAb融合至所述全长抗体的两个轻链的C端。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb融合至所述全长抗体的两个轻链的N端。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述全长抗体特异性识别VEGF，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括：包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ IDNO:101的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包括：包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，所述全长抗体特异性识别VEGFR2，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包括：包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQID NO:106的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包括：包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7 sdAb经由接头(如上述接头中任一个)融合至所述全长抗体。
在一些实施方案中，第二结合(例如，第二抗体部分)和抗-IGFBP7抗体部分经由接头(如本文描述的接头中任一个)以容许所述结合部分的适当功能的任何可操作形式彼此融合。在一些实施方案中，所述接头是GS接头。在一些实施方案中，所述接头选自：SEQ IDNO:54-61。
示例性抗-PD-L1抗体部分
示例性抗-PD-L1抗体部分包括(但不限于)WO2019228514A1、WO2019227490A1和WO2020019232A1中描述的那些。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-L1抗体部分(如scFv)包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争结合PD-L1的抗原表位，其中所述VH-2包括：包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL-2包括：包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗-PD-L1部分包含：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:68、69或70所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:71、72或73所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-L1抗体部分(如scFv)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)所述VH包括：包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的HC-CDR3，或在所述HC-CDR中包含高达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；并且b)所述VL包括：包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的LC-CDR3，或在所述LC-CDR中包含多达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:68、69或70的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且VL包含SEQ ID NO:71、72或73的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列，或包含具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
示例性抗-PD-1抗体部分
示例性抗-PD-1抗体部分包括(但不限于)WO2018133842和WO2018133837中描述的那些。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-1抗体部分(如scFv)包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争结合PD-1的抗原表位，其中所述VH-2包括：包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL-2包括：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗-PD-1部分包含：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:92所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:93所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-1抗体部分(如scFv)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)所述VH包括：包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的HC-CDR3，或在所述HC-CDR中包含高达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；并且b)所述VL包括：包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的LC-CDR3，或在所述LC-CDR中包含多达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，第二抗体部分包含来源于鼠类抗体的人源化抗体部分，所述鼠类抗体包括包含SEQ ID NO:92所示氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:93所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-1抗体部分(如scFv)包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争结合PD-1的抗原表位，其中所述VH-2包括：包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL-2包括：包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗-PD-1部分包含：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:94所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:95所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-1抗体部分(如scFv)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)所述VH包括：包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的HC-CDR3，或在所述HC-CDR中包含高达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；并且b)所述VL包括：包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的LC-CDR3，或在所述LC-CDR中包含多达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗-PD-1抗体部分包含来源于鼠类抗体的人源化抗体部分，所述鼠类抗体包括：包含SEQ ID NO:94所示氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:95所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-1抗体部分(如scFv)包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争结合PD-1的抗原表位，其中所述VH-2包括：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL-2包括：包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗-PD-1部分包含：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:96所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:97所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的抗-PD-1抗体部分(如scFv)包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)所述VH包括：包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HC-CDR3，或在所述HC-CDR中包含高达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；并且b)所述VL包括：包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的LC-CDR3，或在所述LC-CDR中包含多达总计约5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
在一些实施方案中，第二抗体部分包含来源于鼠类抗体的人源化抗体部分，所述鼠类抗体包括：包含SEQ ID NO:96所示氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:97所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
特异性识别VEGF的示例性结合部分
特异性识别VEGF的示例性结合部分包括(但不限于)：安维汀(avastin)、雷莫芦单抗(ramucirumab)或VEGF-trap(阿柏西普(Aflibercept))，或其变体或功能部分。
在一些实施方案中，特异性识别多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的VEGF的结合部分是抗体部分(如scFv)，其包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包括：包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包括：包含SEQID NO:102的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，特异性识别多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的VEGF的结合部分是抗体部分(如scFv)，其包括包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体部分，其中所述VH包括：包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的HC-CDR1、包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的HC-CDR2和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的HC-CDR3，并且所述VL包括：包含SEQID NO:108的氨基酸序列的LC-CDR1、包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的LC-CDR2和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，特异性识别多特异性抗-IGFBP7构建体中所使用的VEGF的结合部分包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列。
抗-IGFBP7融合蛋白
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含抗-IGFBP7抗体部分(例如，抗-IGFBP7sdAb部分)和第二部分。
在一些实施方案中，所述第二部分是配体(例如，与另一分子相互作用的配体)。在一些实施方案中，所述第二部分是肽。在一些实施方案中，所述第二部分是细胞因子。
在一些实施方案中，所述第二部分包含半衰期延长部分。
在一些实施方案中，所述半衰期延长部分是白蛋白结合部分(例如，白蛋白结合抗体部分)。在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体部分和所述半衰期延长部分是经由接头(如“接头”章节中描述的接头的任一个)连接。
在一些实施方案中，所述半衰期延长部分是Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段选自：来自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM的Fc片段及其组合和杂合体。在一些实施方案中，所述Fc片段选自：来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段及其组合和杂合体。在一些实施方案中，所述Fc具有一或多个导致抗体部分在血清中的延长半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述Fc片段具有相较于相应的野生型Fc片段经降低的效应功能。在一些实施方案中，所述Fc片段具有相较于相应的野生型Fc片段经增强的效应功能。
在一些实施方案中，所述Fc片段来源于IgG2a(如小鼠IgG2a)。
在一些实施方案中，所述第二部分是脂质。在一些实施方案中，所述脂质缀合至抗-IGFBP7抗体部分(如抗-IGFBP7抗体)，且可结合至白蛋白，从而延长所述抗-IGFBP7抗体部分的半衰期。
在一些实施方案中，所述第二部分是白蛋白或白蛋白的一部分(例如，人类白蛋白，例如，人类血清白蛋白)。
抗-IGFBP7免疫缀合物
本申请也提供抗-IGFBP7免疫缀合物，其包含抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的IGFBP7抗体部分中任一个)和第二药剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是标记物。
在一些实施方案中，第二药剂是细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是生长抑制剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段)。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是放射性同型物(即，放射性缀合物)。
免疫缀合物容许将药物部分靶向递送至肿瘤，且在一些实施方案中，于其中细胞内累积，其中未缀合的药物的全身施用可对正常细胞导致不可接受的毒性水平(PolakisP.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
本文描述的免疫缀合物的产生，可参见(例如)US 9,562,099和US7,541,034，其以全文引用的方式并入本文中。
接头
在一些实施方案中，本文描述的抗-IGFBP7构建体包含一或多个介于两个部分(例如，上述多特异性构建体中的抗-IGFBP7抗体部分与半衰期延长部分，所述抗-IGFBP7抗体部分与第二结合部分)之间的接头。所述抗-IGFBP7构建体中所使用的接头的长度、柔性度和/或其他性质可对包括(但不限于)以下的性质有一定影响：一或多个特定抗原或抗原表位的亲和力、特异性或亲合性。例如，可选择较长的接头以确保两个相邻的域不在空间上彼此干扰。在一些实施方案中，接头(如肽接头)包含柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)使得所述相邻的域相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双联体可为合适的肽接头。在一些实施方案中，所述接头是非肽接头。在一些实施方案中，所述接头是肽接头。在一些实施方案中，所述接头是不可裂解的接头。在一些实施方案中，所述接头是可裂解接头。
其他接头考虑包括对所得化合物的物理或药物动力学性质(如溶解性、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少稳定且计划性降解)、刚性、柔性、免疫原性、抗体结合的调整、并入微胞或微脂体内的能力，以及诸如此类)的影响。
肽接头
肽接头可具有天然生成的序列或非天然生成的序列。例如，来源于仅重链的抗体的铰链区的序列可用作接头。参见，例如，WO1996/34103。
肽接头可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，所述肽接头的长度是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多个氨基酸中任一个。在一些实施方案中，所述肽接头的长度不超过约100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少氨基酸中任一个。在一些实施方案中，所述肽接头的长度是以下中任一个：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
此肽接头的基本技术特征在于，所述肽接头不包含任何聚合活性。肽接头(其包括缺乏二级结构的促进)的特性为本技术领域中已知，且描述于(例如)Dall’Acqua等人，(Biochem.(1998)37,9266-9273)、Cheadle等人，(Mol Immunol(1992)29,21-30)和Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。在“肽接头”的内文中特别优选的氨基酸是Gly。此外，也不促进任何二级结构的肽接头是优选的。域之间的彼此连接，可通过(例如)基因工程化提供。用于制备融合的和可操作连接的双特异性单链构建体并于哺乳动物细胞或细菌中表达其的方法，为本技术领域中熟知(例如WO 99/54440,Ausubel,Current Protocols inMolecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.1989和1994或Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。
肽接头可为稳定的接头，其不可由蛋白酶(尤其由基质金属蛋白酶(MMP))裂解。
接头也可为柔性接头。示例性柔性接头包括：甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO:54)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n(SEQ ID NO:55)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:56)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:57)和(GGGS)n(SEQ ID NO:58)，其中n是至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物，以及本技术领域中已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构性的，且因此可充当组分之间的中性系链。甘氨酸比甚至丙氨酸获取大得多的phi-psi空间，且其比具有较长侧链的残基受到的限制小得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11 173-142(1992))。本领域技术人员将了解抗体融合蛋白的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得所述接头可包括柔性接头部分和赋予较少柔性结构的一或多个部分，以提供所需抗体融合蛋白结构。
此外，示例性接头也包括诸如(GGGGS)n(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列，其中n是介于1-8的整数，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO:59；下文中称为“(G4S)3”或“GS3”)，或(GGGGS)6(SEQ ID NO:60；下文中称为“(G4S)6”或“GS6”)。在一些实施方案中，所述肽接头包含(GSTSGSGKPGSGEGS)n的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)，其中n是介于1-3的整数。
非肽接头
两个部分的偶合可通过将结合两个分子的任何化学反应来实现，只要两个组分保留它们各自活性，例如，分别结合至IGFBP7和抗-IGFBP7多特异性抗体中的第二药剂。此连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插入、协调结合和络合。在一些实施方案中，所述结合是共价结合。共价结合可通过现存侧链的直接缩合或通过并入外部桥接分子来实现。许多二价或多价连接剂可适用于本文中所述的偶合蛋白质分子。例如，代表性偶合剂可包括有机化合物，如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和己二胺。此列表无意穷举本技术领域中已知的各种类别偶合剂，而是更常见偶合剂的示例(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62:185-216(1982)；和Vitetta等人，Science 238:1098(1987))。
可应用于本申请中的接头，描述于文献(参见，例如，Ramakrishnan,S.等人，Cancer Res.44:201-208(1984)，描述了MBS(M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途)中。在一些实施方案中，本文使用的非肽接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem.Co.,Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem.Co.,Cat#21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(6[3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰胺]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)结合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.,Cat.#24510)。
上述接头含有具有不同属性的组分，因此可导致具有不同生理化学性质的双特异性抗体。例如，羧酸烷基酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。含有接头的NHS酯的可溶性比磺基-NHS酯更低。此外，接头SMPT含有空间位阻的双硫键，且可形成稳定性增加的抗体融合蛋白。双硫键的稳定性一般比其他连接更小，因为所述双硫键是活体外裂解，导致可用的抗体融合蛋白更少。具体地，磺基-NHS可增强碳二亚胺偶合的稳定性。当碳二亚胺偶合(如EDC)联合磺基-NHS一起使用时，形成比单独碳二亚胺偶合反应更耐水解的酯。
抗-IGFBP7抗体部分或构建体变体
a)抗体亲和力
抗-IGFBP7抗体部分的结合特异性，可通过本技术领域中已知的方法以实验方式确定。这些方法包括(但不限于)：蛋白质印迹法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BLI、SPR、BIACORETM测试和肽扫描。
在一些实施方案中，抗体部分与IGFBP7之间的结合的KD是约10-7M至约10-12M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M或约10-7M至约10-9M。在一些实施方案中，抗体部分与IGFBP7之间的结合的KD强于约10-7M、10- 8M、10-9M、10-10M、10-11M、或10-12M中任一个。在一些实施方案中，IGFBP7是人类IGFBP7。
在一些实施方案中，抗体部分与IGFBP7之间的结合的Kon是约103M-1s-1至约108M-1s-1、约103M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约105M-1s-1、约105M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，所述结合抗体部分与IGFBP7之间的Kon是约103M-1s-1至约105M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约106M-1s-1至约108M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，所述结合抗体部分与IGFBP7之间的Kon不超过约103M-1s-1、104M-1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M-1s-1或108M-1s-1中任一个。在一些实施方案中，所述IGFBP7是人类IGFBP7。
在一些实施方案中，结合抗体部分与IGFBP7之间的Koff是1s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-3s-1、约10-3s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-5s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1、或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方案中，所述结合抗体部分与IGFBP7之间的Koff是至少约1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中任一个。在一些实施方案中，所述IGFBP7是人类IGFBP7。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体部分或抗-IGFBP7构建体的结合亲和力高于(例如，具有更小的KD值)现存抗-IGFBP7抗体(例如，抗-人类IGFBP7抗体，例如，MM01)。
b)嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体部分是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述(例如)于美国专利US4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，来源于美洲鸵的可变区)和人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别切换”的抗体，其中所述类别或子类已自其亲代抗体发生变化。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体经人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲代非人类抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一或多个可变域，其中HVR，例如，CDR(或其部分)来源于非人类抗体，以及FR(或其部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如，HVR残基来源的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法的综述，参见(例如)Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，且进一步描述(例如)于Riechmann等人，Nature332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利US5,821,337、US7,527,791、US6,982,321和US7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重构”)；Dall’Acqua等人，Methods36:43-60(2005)(描述“FR混排”)；和Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR混排的“引导选择”方法)中。
可用于人源化的人类框架区包括(但不限于)：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人，J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定子组的人类抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)的框架区或人类生殖系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
应了解非人类源性抗体的人源化是常见且常规使用的技术。因此，应了解，序列表中公开的抗-IGFBP7抗体中的任何和所有的人源化形式，可用于临床前或临床环境中。在参考抗-IGFBP7抗体或其抗原结合区中任一个的人源化形式用于此临床前或临床环境中的情况下，则预期该人源化形式携载与初始非人源化形式相同或相似的生物活性和特性(profiles)。
c)人类抗体
在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体部分是人类抗体(称为人类域抗体或人类DAb)。人类抗体可使用本技术领域中已知的各种技术产生。人类抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)、Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)，以及Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)中。可产生完全人类单域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠为本技术领域中已知。参见，例如，US20090307787A1、美国专利US8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
人类抗体(例如，人类DAb)可通过对已经修饰以响应抗原激发而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。这些动物通常含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座，它们置换内源性免疫球蛋白基因座，或它们存在于染色体外或随机整合至所述动物的染色体内。在这些转基因小鼠中，所述内源性免疫球蛋白基因座一般已失去活性。关于用于自转基因动物获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见，例如，美国专利US6,075,181和US6,150,584，其描述XENOMOUSETM技术；美国专利US5,770,429，其描述技术；美国专利US7,041,870，其描述K-M />技术，以及美国专利申请公开US2007/0061900，其描述技术)。来自由这些动物产生的完整抗体的人类可变区，例如可通过与不同的人类恒定区组合加以进一步修饰。
人类抗体(例如人类DAb)也可通过基于杂交瘤的方法制造。用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系已经描述(参见例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人，J.Immunol.,147:86(1991))。由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体也描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。另外的方法包括描述于例如美国专利US7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人类-人类杂交瘤)中那些。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
人类抗体(例如人类DAb)也可通过分离选自源自人类的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列来产生。然后，这些可变域序列可与所需人类恒定域组合。下文描述用于从抗体文库选择人类抗体的技术。
d)源自文库的抗体
本文描述的抗-IGFBP7抗体部分可通过筛选组合库中具有所需活性的抗体来分离。例如，本技术领域中已知用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库中具有所需结合特性的抗体的多种方法。这些方法的综述，参见例如Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且进一步描述于例如McCafferty等人，Nature348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in MolecularBiology248:161-175(Lo编，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中。已描述用于构建单域抗体文库的方法，例如参见美国专利US7371849。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的全部基因通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并于噬菌体文库中随机重组，然后可针对抗原结合噬菌体进行筛选，其描述于如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常展示抗体片段，以scFv片段形式或以Fab片段形式。来自免疫源的文库为免疫原提供高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，如由Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)描述，可克隆(例如，来自人类的)初始全部基因，以提供针对范围广泛的非自身以及自身抗原的单一抗体源而无需任何免疫，其描述于Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)。最后，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述，初始文库也可通过如下来合成制备：从干细胞克隆非重排V基因片段，以及使用含有随机序列的PCR引物以编码高度可变CDR3区并进行活体外重排。描述人类抗体噬菌体文库的专利公开包括(例如)：美国专利US 5,750,373和美国专利公开US2005/0079574、U2005/0119455、U2005/0266000、U2007/0117126、U2007/0160598、U2007/0237764、U2007/0292936和U2009/0002360。
自人类抗体文库分离的抗体或抗体片段被视为本文的人类抗体或人类抗体片段。
e)取代、插入、缺失和变体
在一些实施方案中，本发明提供具有一或多个氨基酸取代的抗-IGFBP7抗体变体。用于取代性突变诱发的目标位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代显示于表2中的“优选取代”的标题下。更实质性的变化提供于表2中的“示例性取代”的标题下，且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸取代引入目标抗体内，并针对所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表2：氨基酸取代
氨基酸可根据共同侧链性质分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需将这些类别中一个的成员替换为另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲代抗体(例如，人源化或人类抗体)的一或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体，相对于亲代抗体在某些生物性质(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性、改善的溶解性)上具有改变(例如，改善)，和/或将已基本保留所述亲代抗体的某些生物性质。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可(例如)使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文描述的那些)来便利地产生。简而言之，一或多个HVR残基经突变，并且所述变体抗体展示于噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)筛选。
可于HVR中作出改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。可于HVR“热点”(即，由在体细胞成熟过程期间经受高频率突变的密码子编码的残基，参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中作出这些改变，其中测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过从二级文库构建和再选择的亲和力成熟，已描述(例如)于Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中任一个(例如，易错PCR、链混排或寡核苷酸引导的突变诱发)将多样性引入经选择用于成熟的可变基因内。然后产生二级文库。然后筛选所述文库以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一方法涉及HVR引导的方法，其中数个HVR残基(例如，同时4-6个残基)经随机化。参与抗原结合的HVR残基，(例如)可使用丙氨酸扫描突变诱发或建模来特异性鉴别。具体地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，取代、插入或缺失可于一或多个HVR内发生，只要这些改变不大幅减小抗体结合抗原的能力即可。例如，可于HVR中作出不大幅减小结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。这些改变可于HVR“热点”或CDR的外部。
如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085描述，一种适用于鉴别抗体中可成为突变诱发目标的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描突变诱发”。在此方法中，鉴别残基或目标残基组(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并经中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定所述抗体与抗原的相互作用是否受影响。可于氨基酸位置引入其他取代以证实对初始取代的功能敏感性。或者或另外，抗原-抗体复合物的结晶结构以鉴别所述抗体与抗原之间的接触点。这些接触残基和相邻残基可作为取代的候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽变化的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体，包括所述抗体的N或C端与增加所述抗体的血清半衰期的酶(例如，针对ADEPT)或多肽的融合。
f)糖基化变体
在一些实施方案中，改变抗-IGFBP7构建体以增加或降低所述构建体糖基化的程度。通过改变氨基酸序列使得产生或移除一或多个糖基化位点，可便利地进行抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗-IGFBP7构建体包含Fc区的情况下，可改变与其结合的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支链的双触角寡糖，其一般由N连接结合至Fc区的CH2域的Asn297。参见，例如，Wright等人，TIBTECH15:26-32(1997)。所述寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及结合至所述双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对抗体部分中寡糖进行修饰，以产生具有某些经改善的性质的抗体变体。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体具有缺乏结合(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此抗体中岩藻糖的量可为：1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。例如，如WO 2008/077546中描述，通过MALDI-TOF质谱法测量，岩藻糖的量是通过相对于结合至Asn 297的所有糖结构(例如，复合物、杂合体和高甘露糖结构)的总和，计算在Asn297处的糖链内岩藻糖的平均量来确定。Asn297是指位于所述Fc区内约位置297(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游的约±3个氨基酸，即，介于位置294与300之间。这些岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko KogyoCo.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“缺乏岩藻糖”的抗体变体相关的专利公开的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。可产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包括：缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请US2003/0157108 A1，Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其于实施例11)，以及基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体具有平分型寡糖，例如，其中结合至抗体的Fc区的双触角寡糖由GlcNAc平分。这些抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。这些抗体变体的实例描述(例如)于：WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利US6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)。本发明还提供了寡糖中有至少一个半乳糖残基结合至Fc区的抗体变体。这些抗体变体可具有改善的CDC功能。这些抗体变体描述(例如)于：WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)。
g)Fc区变体
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包含Fc片段。
术语“Fc区”、“Fc域”、“Fc片段”或“Fc”是指含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链C端非抗原结合区。所述术语包括天然Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，人类IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基端。然而，所述Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在，而不影响所述Fc区的结构或稳定性。除非本文另有规定，所述IgG或Fc区中氨基酸残基的编号是根据抗体的EU编号系统，也称为EU指数，如Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中描述。
在一些实施方案中，Fc片段来自选自下组的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合体。在一些实施方案中，所述Fc片段来自选自下组的免疫球蛋白：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体。
在一些实施方案中，相比相应的野生型Fc片段，Fc片段具有减少的效应功能(如由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的程度测量，如至少减少了约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的效应功能)。
在一些实施方案中，Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方案中，所述IgG1Fc片段包含L235A突变和/或G237A突变。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG2或IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含N297A突变。在一些实施方案中，所述Fc片段包含N297G突变。
在一些实施方案中，可将一或多个氨基酸修饰引入抗体部分的Fc区内，从而产生Fc区变体。所述Fc区变体可包含人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)。
在一些实施方案中，Fc片段具有一些但非所有效应功能，此使得所述Fc片段是所需的应用候选者，其中活体内抗体部分的半衰期是重要的，但某些效应功能(如补体和ADCC)是不必要或有害。可进行活体外和/或活体内细胞毒性分析，以确认CDC和/或ADCC活性的减小/消耗。例如，可进行Fc受体(FcR)结合分析，以确保所述抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页表2上。用以评估目标分子的ADCC活性的活体外分析的非限制性实例，描述于美国专利US5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性分析方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。适用于这些分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，目标分子的ADCC活性可例如于动物模型中(如公开于Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998))经活体内评估。也可进行C1q结合分析，以确认所述抗体无法结合C1q，且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC分析(参见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和活体内清除/半衰期测定，也可使用本技术领域中已知的方法(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应功能减少的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些抗体(美国专利US6,737,056)。此Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中两个或更多个具有取代的Fc突变体，包括将残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利US7,332,581)。在一些实施方案中，所述Fc片段包含N297A突变。在一些实施方案中，所述Fc片段包含N297G突变。
本发明描述了对FcR的结合经改善或减弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利US6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在一些实施方案中，Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方案中，所述IgG1Fc片段包含L235A突变和/或G237A突变。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG2或IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc片段。
在一些实施方案中，抗体部分包含具有一或多个改善ADCC的氨基酸取代(例如，于Fc区的位置298、333和/或334(残基EU编号)的取代)的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中作出改变，其导致经改变(即，经改善或经减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利US6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中描述。
在一些实施方案中，Fc片段于Thr250、Met252、Ser254、The256、Thr307、Glu 380、Met428、His433和/或Asn 434具有一或多个突变。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体包括变体Fc区，其包含一或多个改变半衰期和/或改变对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。半衰期增加和对新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994)))的结合改善的抗体，描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)。那些抗体包含其中具有一或多个改变所述Fc区对FcRn的结合的取代的Fc区。该Fc变体包括在Fc区残基中一个或多个处具有取代的那些变体，例如，Fc区残基434的取代(美国专利US7,371,826)。
也参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利US5,648,260；美国专利US5,624,821；美国专利US8,163,881；和WO 94/29351，涉及Fc区变体的其他实例。
h)经半胱氨酸工程化的抗体变体
在一些实施方案中，可取的是产生经半胱氨酸工程化的抗体部分，例如，“thioMAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，经取代的残基出现在所述抗体的可用位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，从而可将反应性巯基放置于所述抗体的可用位点处，且可用以将所述抗体缀合至其他部分(如药物部分或接头-药物部分)以产生免疫缀合物，如本文进一步描述。在一些实施方案中，下列残基中任一个或多个可经半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。经半胱氨酸工程化的抗体部分可如(例如)美国专利US7,521,541中所描述产生。
i)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文描述的抗-IGFBP7抗体部分或构建体可经进一步修饰，以包含本技术领域中已知且可容易获得的另外非蛋白质部分。适用于将所述抗体衍生化的部分包括(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括(但不限于)：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三氧环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，以及右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，以及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其于水中的稳定性而在制造中可具有优势。所述聚合物可具有任何分子量，且可为支链或无支链的。结合至所述抗体的聚合物的数量可变化，且若结合多于一种聚合物，则它们可为相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于包括(但不限于)以下的考虑确定：待改善的抗体的特定性质或功能、所述抗体衍生物是否将用于在指定条件下诊断等。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7抗体部分或构建体可经进一步修饰，以包含一或多种生物活性蛋白质、多肽或其片段。如本文可互换使用的，“生物活性”或“生物上活性”意指在体内显示生物活性以发挥特定功能。例如，其可意指与特定生物分子(如蛋白质、DNA等)组合，以及然后促进或抑制该生物分子的活性。在一些实施方案中，所述生物活性蛋白质或其片段包括作为活性药物物质施用于患者以预防或治疗疾病或病症的蛋白质和多肽，以及用于诊断目的的蛋白质和多肽，如用于诊断测试或活体外分析的酶，以及施用于患者以预防疾病的蛋白质和多肽(如疫苗)。
III.制备方法
在一些实施方案中，提供了一种制备特异性结合至IGFBP7的抗-IGFBP7构建体或抗体部分的方法，以及在制备所述抗-IGFBP7构建体或抗体部分期间产生的组合物，如多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞或培养基。本文描述的抗-IGFBP7构建体或抗体部分或组合物，可通过许多如下文且更具体而言实施例中大体上描述的方法制备。
抗体表达和产生
本文描述的抗-IGFBP7构建体或其部分(如抗-IGFBP7抗体部分，如抗-IGFBP7双特异性抗体)，可使用本技术领域中的任何已知方法(包括那些下文和实例中描述者)制备。
单域抗体(sdAb)
已描述制备sdAb的方法，参见，例如，Els Pardon等人，Nature Protocol,2014；9(3):674。可使用本技术领域中已知的方法获得sdAb(如VHH)，如通过免疫骆驼科物种(如骆驼或美洲鸵)并由此获得杂交瘤，或通过使用本技术领域中已知的分子生物学技术克隆单域抗体文库，以及用未选择文库的单个克隆通过ELISA进行后续选择或通过使用噬菌体展示进行后续选择。
针对sdAb的重组产生，将编码单域抗体的核酸分离，并插入可复制载体内用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。使用常规程序(例如，通过使用可特异性结合至编码所述抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，容易分离并测序编码所述单域抗体的DNA。许多载体是可用的。载体的选择部分地取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常哺乳动物)起源，包括那些下文描述的那些。
单克隆抗体
单克隆抗体或抗体部分可获自大体上同质抗体的群体，即，除可少量存在的可能天然生成的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，组成所述群体的单个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”指示所述抗体的特性不为离散抗体的混合物。例如，所述单克隆抗体可使用由Kohler等人，Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制造，或可通过重组DNA方法(美国专利US4,816,567)制造。在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物(如仓鼠或美洲鸵)如上文描述被免疫以诱导这样的淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白的抗体。或者，淋巴细胞可经活体外免疫。然后，用合适的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59至103页(Academic Press,1986)。针对美洲鸵中的免疫也参见实施例1。
免疫剂通常包括抗原蛋白或其融合变体。通常，若需人类起源的细胞，则需使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或若需非人类哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，用合适的融合剂(如聚乙二醇)使所述淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986)，第59至103页。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，具体为啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。由此制备的杂交瘤细胞系经接种并于合适的培养基中生长，所述培养基优选含有一或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若所述亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选定的产生抗体的细胞稳定高水平产生抗体，且对培养基(如HAT培养基)敏感的细胞。在这些中，优选鼠类骨髓瘤细胞系，如那些来源于可自美国加利福尼亚州圣迭戈索尔克研究所细胞分布中心获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，以及可自美国弗吉尼亚州马纳萨斯美国典型培养物保藏中心获得的SP-2细胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)。也已针对人类单克隆抗体的产生描述人类骨髓瘤和小鼠-人类杂骨髓瘤细胞系(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51至63页(MarcelDekker,Inc.,New York,1987))。
分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基，确定是否产生了直接针对抗原的单克隆抗体。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，是通过免疫沉淀或通过活体外结合分析(如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA))来确定的。
可分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基，确定是否存在直接针对所需抗原的单克隆抗体。优选地，所述单克隆抗体的结合亲和力和特异性，可通过免疫沉淀或通过活体外结合分析(如放射免疫分析(RIA)或酶联分析(ELISA))确定。这些技术和分析为本技术领域中已知。例如，结合亲和力可通过Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡乍得分析(Scatchard analysis)确定。
在鉴别了产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可将这些克隆通过限制稀释程序进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，同上)培养。适用于此目的的培养基，包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，所述杂交瘤细胞可作为肿瘤于哺乳动物中活体内生长。
由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，通过常规免疫球蛋白纯化程序例如蛋白G-琼脂糖凝胶、蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析术、凝胶电泳、透析或亲和力层析术，适当地自培养基、腹水或血清分离。
单克隆抗体也可通过重组DNA方法如美国专利US4,816,567中描述和如上文描述的那些来制备。使用常规程序(例如，通过使用可特异性结合至编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，容易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当该DNA的优选来源。一经分离，则可将所述DNA放置于表达载体内，然后将它们转染至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK细胞或骨髓瘤细胞(例如，NS0细胞)，以在这些重组宿主细胞中合成单克隆抗体。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(一般为哺乳动物)起源，包括下文描述的那些。关于编码所述抗体的DNA于细菌中的重组表达的文献综述，包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，抗体可从使用McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠类和人类抗体。后续出版物描述了通过链混排(Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和活体内重组作为一种用于构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nM范围)人类抗体。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的典型单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
DNA也可(例如)进行以下修饰：通过用人类重链和轻链恒定域的编码序列替代同源性鼠类序列(美国专利US4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。通常，这些非免疫球蛋白多肽被替换为抗体的恒定域，或它们被替换为抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生包含一个对抗原具有特异性的抗原结合位点和另一对不同抗原具有特异性的抗原结合位点的嵌合二价抗体。
本文描述的单克隆抗体可为单价的，其制备为本技术领域中熟知。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。所述重链一般于Fc区中的任何点经截短，以便于防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基可经另一氨基酸残基取代或经删除以便于防止交联。活体外方法也适用于制备单价抗体。可使用本技术领域中已知的常规技术完成抗体的消化，以产生其片段，具体地Fab片段。
嵌合或杂合体抗体也可使用合成蛋白质化学中已知的方法(包括那些涉及交联剂者)在活体外制备。例如，免疫毒素可使用双硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建。适用于此目的的试剂的实例，包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚胺酯。
在原核细胞中的重组产生
a)载体构建
编码本申请的抗体的聚核酸序列，可使用标准重组技术获得。所需聚核酸序列可从产生抗体的细胞(如杂交瘤细胞)分离并测序。或者，多核苷酸可使用核苷酸合成物或PCR技术合成。一经获得，即将编码多肽的序列插入可在原核宿主中复制并表达异源性多核苷酸的重组载体内。本技术领域中可用且已知的许多载体，可用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于待插入载体内的核酸的尺寸和待用载体转化的特定宿主细胞。各载体含有各种组分，取决于其功能(异源性多核苷酸的扩增或表达，或两者)且其与其驻留的特定宿主细胞的兼容性。载体组分一般包括(但不限于)：复制起点、选择标志物基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源性核酸插入和转录终止序列。
本发明提供一种表达系统，其中可调整经表达的多肽组分的定量比率，以将本申请的分泌和适当组装的抗体的产率最大化。该调整至少部分通过同时调整多肽组分的翻译强度来完成。一种用于调整翻译强度的技术，公开于Simmons等人，美国专利US5,840,523。其利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。针对给定TIR，可产生一系列具有一定范围翻译强度的氨基酸或核酸序列变体，从而提供便利的方式来调整此因子以获得特定链的所需表达水平。TIR变体可通过导致可改变氨基酸序列的密码子变化的常规突变诱发技术产生，尽管所述核酸序列中的沉默变化是优选的。所述TIR中的改变可包括(例如)夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列的数量或间隔的改变，连同信号序列的改变。一种用于产生突变体信号序列的方法是在编码序列的开始处产生“密码子库”，其不改变所述信号序列的氨基酸序列(即，所述变化是沉默的)。这可通过改变各密码子的第三核苷酸位置完成；另外，一些氨基酸(如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸)具有多个可增加制造所述库的复杂性的第一和第二位置。
优选地，产生一组载体，其中的各顺反子具有一定范围的TIR强度。该有限的组提供各链的表达水平的比较和在各种TIR强度组合下所需蛋白质产物的产率。如Simmons等人，美国专利US5,840,523中详细描述的，通过定量报告基因的表达水平可确定TIR强度。基于翻译强度比较，选择所需单个TIR以组合到本申请的表达载体构建体中。
b)原核宿主细胞
适用于表达本申请的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括：埃希氏菌(Escherichia，例如，大肠杆菌(E.coli))、杆菌(Bacilli，例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌种(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、黏质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏杆菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利US5,639,635)。其他菌株及其衍生物，如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)，也是合适的。这些实例是说明性而非限制性的。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，一般需要选择适当细菌。例如，当使用众所周知的质粒(如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)以供应所述复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌菌种可适当地用作宿主。
通常，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，并且另外的蛋白酶抑制剂可任选地并入细胞培养物中。
c)蛋白质产生
将宿主细胞用上述表达载体转化，并培养于任选地经改良的常规营养培养基中，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。转化是指将DNA引入原核宿主内，以使得所述DNA可作为染色体外组件或通过染色体整合物复制。取决于所使用的宿主细胞，使用适合这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理，一般用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法采用聚乙二醇/DMSO。所使用的又一技术是电穿孔。
用上述表达载体转化宿主细胞，并培养于任选地经改良的常规营养培养基中，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。转化是指将DNA引入原核宿主内，以使得所述DNA可作为染色体外组件或通过染色体整合物复制。取决于所使用的宿主细胞，使用适合这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理，一般用于含有大量细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法采用聚乙二醇/DMSO。所使用的又一技术是电穿孔。
将产生本申请的抗体的原核细胞培养在本技术领域中已知且适于培养选定的宿主细胞的培养基中。合适培养基的实例包括Luria液体培养基(LB)加必要的营养补充剂。在一些实施方案中，所述培养基也含有基于表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性允许含有所述表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄西林添加至培养基用于培养表达氨苄西林抗性基因的细胞。
d)蛋白质纯化
进一步纯化本文产生的构建体或其部分，以获得大体上同质的制剂用于进一步分析和使用。可采用本技术领域中已知的标准蛋白质纯化方法。下列程序是合适纯化程序的示例：免疫亲和力或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或阳离子交换树脂(如DEAE)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用(例如)Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一些实施方案中，使用固定于固相上的蛋白A进行包含本申请的Fc区的抗体的免疫亲和力纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的411(D细胞壁蛋白，其以高亲和力结合至抗体的Fc区)。Lindmark等人(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。用于固定蛋白A的固相优选是包含玻璃或二氧化硅表面的管柱，更优选受控的孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，所述管柱已涂布有试剂(如甘油)以尝试防止污染物的非特异性黏附。然后清洗所述固相以移除非特异性结合至所述固相的污染物。最后，通过洗脱从所述固相回收目标抗体。
在真核细胞中的重组产生
针对真核表达，载体组分一般包括(但不限于)下列中的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标志基因，以及增强子组件、启动子，以及转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主中的载体，也可为编码在成熟蛋白质或多肽的N端处具有特异性裂解位点的信号序列或其他多肽的插入物。所选择的异源性信号序列优选是由宿主细胞识别并处理(即，由信号肽酶裂解)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列和病毒分泌前导序列，例如，单纯疱疹gD信号。
这些前体区域的DNA在阅读框中连接至编码本申请的抗体的DNA。
b)复制起点
通常，哺乳动物表达载体无需复制起点组分(通常可仅使用SV40起点，因其含有早期启动子)。
c)选择基因组分
表达和克隆载体可含有选择基因，也称为可选择标志物。代表性选择基因编码以下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如，氨苄西林、新霉素、氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)补体营养缺陷型缺乏，或(c)供应复杂培养基无法提供的关键营养素，例如，编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
d)启动子组分
表达和克隆载体，通常含有由宿主生物体识别且可操作连接至编码所需多肽序列的核酸的启动子。实际上所有真核基因均具有位于在开始转录的位点上游大约25-30个碱基处的富含AT的区域。在许多基因的转录起点的上游70至80个碱基处发现的另一序列是，其中N可为任何核苷酸的CNCAAT区域。大多数真核生物的3'端是AATAAA序列，其可为对编码序列的3'端添加聚A尾的信号。所有这些序列均可插入真核表达载体内。
适用于与原核宿主一起使用的其他启动子，包括：phoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统，以及杂合体启动子(如tac启动子)。然而，其他已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统中的启动子，也将含有可操作连接至编码所述抗体的DNA的夏因-达尔加诺(S.D.)序列。
从哺乳动物宿主细胞中的载体进行多肽转录受到例如启动子的控制，所述启动子来自病毒基因组，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒且最优选猿猴病毒40(SV40))，来自异源性哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，前提条件为这些启动子可与宿主细胞系统兼容。
e)增强子组件组分
由高等真核生物转录编码本申请抗体的DNA，通常通过将增强子序列插入载体内来增加的。现已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括：复制起点近侧的SV40增强子(100-270bp)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点近侧上的多瘤增强子，以及腺病毒增强子。所述增强子可在多肽编码序列的5'或3'位置(但优选在所述启动子的5'位点)拼接于载体内。
f)转录终止组分
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类，或来自其他多细胞生物体的成核细胞)中所使用的表达载体，也将含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这些序列通常可获自真核或病毒DNA或cDNA的5'端和偶尔3'端非翻译区。这些区域含有在编码多肽的mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞，包括本文描述的高等真核生物细胞(包括脊椎动物宿主细胞)。将脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是：由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7、ATCCCRL 1651)；人类胚胎肾细胞系(经亚克隆以于悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/—DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞特利氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA、ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138、ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2、HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562、ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以产生抗体，并培养于任选地经适当改良的常规营养培养基中，以诱导启动子、选择转化体或扩增编号所需序列的基因。
h)培养宿主细胞
用以产生本申请抗体的宿主细胞，可培养于多种培养基中。市售培养基如哈姆(Ham's)F10(Sigma)、最小基本培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良型伊戈尔培养基(DMEM，Sigma)，适用于培养所述宿主细胞。所述培养基可任选地根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能源。任何其他必需的补充剂，也可以本领域技术人员已知的适当浓度包括于其中。培养条件(如温度、pH等)是那些先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的，且对本领域技术人员而言将显而易见。
在一些实施方案中，使用谷氨酰胺合成酶(GS)-CHO表达系统培养宿主细胞，和/或表达本文描述的抗-IGFBP7构建体或其部分。参见例如，Fan等人，J Biotechnol.2013Dec；168(4):652-8。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时，抗体可细胞内、细胞周质间隙中产生，或直接分泌至培养基内。若所述抗体是细胞内产生，则作为第一步骤，(例如)通过离心或超滤移除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992)描述一种用于分离分泌至大肠杆菌细胞周质间隙的抗体的程序。简而言之，使细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30min。细胞碎片可通过离心移除。在所述抗体经分泌至培养基内的情况下，来自这些表达系统的上清液一般首先使用市售蛋白质浓度过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩。蛋白酶抑制剂(如PMSF)可包括在前述任一步骤中以抑制蛋白质水解，且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
从细胞制备的蛋白质组合物，可使用以下技术纯化：例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、多模式层析、离子交换层析和亲和力层析，其中亲和力层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和力配体的适用性，取决于存在于所述抗体中的任何免疫球蛋白Fc域的物种和同型。蛋白A可用以纯化所述抗体，它们是基于含有1、2或4个重链的人类免疫球蛋白。推荐蛋白G用于所有小鼠同型和用于人类3。所述亲和力配体结合的基质最通常是琼脂糖，但其他基质也是可用的。相比可用琼脂糖实现的流动速率和处理时间，机械稳定的基质(如受控的孔玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯)容许更快的流动速率和更短的处理时间。在所述抗体包含CH3域的情况下，Bakerbond ABXTMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。用于蛋白质纯化的其他技术如超滤/透滤(UF/DF)、离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的SEPHAROSETM层析、疏水性树脂上的层析、混合模式树脂上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，也是可用的，取决于待回收的抗体。
在任何初步纯化步骤后，包含目标抗体和污染物的混合物，可使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下，进行低pH疏水性相互作用层析。离子交换也通常用于精制步骤。
人源化抗体
非人类抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)，它们含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自所述接受者的CDR的残基经来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人类物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔、骆驼或美洲鸵的CDR的残基置换。在一些情况下，所述人类免疫球蛋白的Fv框架残基经相应的非人类残基置换。人源化抗体也可包含接受者抗体中不存在，输入CDR或框架序列中也不存在的残基。通常，所述人源化抗体可包含至少一个，以及通常两个可变域中的大体上所有，其中所有或大体上所有CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，以及所有或大体上所有FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。在一些实施方案中，所述人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常人类免疫球蛋白的Fc)的至少一部分。参见，例如，Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
用于使非人类抗体人源化的方法为本技术领域中熟知。通常，人源化抗体具有引入其中的一或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter和同事、Jones等人，Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 239:1534-1536(1988)的方法，或通过用啮齿动物CDR或CDR序列替换人类抗体的相应序列进行。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利US4,816,567)，其中已由来自非人类物种的相应序列替换，大体上小于完整人类可变域。实际上，人源化抗体通常是这样的人类抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代。
用于制造人源化抗体的人类可变域(轻和重)的选择，对降低抗原性而言是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人类可变域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变域的序列。然后，接受最接近所述啮齿动物的人类序列作为所述人源化抗体的人类框架(FR)。Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)。另一方法使用来源于轻链或重链的特定亚组的所有人类抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于数个不同的人源化抗体。
更重要的是，应将抗体人源化和保持对抗原的高亲和力及其他有利的生物性质。为达此目的，根据一优选方法，通过一种使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念人源化产物的方法制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的，且为本领域技术人员熟悉。计算机程序可用以阐述并显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些显示的检查，允许分析所述残基在候选免疫球蛋白序列的功能运作中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，FR残基可从接受者和输入序列选择并组合，使得实现所需抗体特性(如对靶抗原的亲和力增加)。通常，CDR残基直接且实质上参与影响抗原结合。
在一些实施方案中，sdAb是经修饰(如人源化)而不减弱所述域对抗原的天然亲和力，并同时降低其关于异源性物种的免疫原性。例如，可确定美洲鸵抗体的抗体可变域(VHH)的氨基酸残基，以及(例如)框架区中的骆驼氨基酸中的一个或多个经如人类共有序列中存在的其人类对应物置换，而所述多肽未损失其典型特性，即，所述人源化不显著影响所得多肽的抗原结合能力。骆驼sdAb的人源化，需在单一多肽链中引入和突变诱发有限数量的氨基酸。这不同于scFv、Fab'、(Fab')2和IgG的人源化，其需在两个链(轻链和重链)中引入氨基酸变化，且保留两个链的组装。
人类抗体
作为人源化的一替代方案，可产生人类抗体。例如，现可能产生转基因动物(例如，小鼠)，所述动物一经免疫即可在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人类抗体的完整库。例如已描述，嵌合和生殖系突变体小鼠中抗体重链结合区(JH)基因的纯合缺失，导致内源性抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球蛋白基因微陈列转移至这些生殖系突变体小鼠内，将导致在抗原激发时产生人类抗体。
或者，可使用噬菌体展示技术，以从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因库在活体外鉴定人类抗体和抗体片段。McCafferty等人，Nature348:552-553(1990)；Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)。
人类抗体也可由活体外活化的B细胞(参见美国专利US5,567,610和US5,229,275)，或通过使用本技术领域中已知的各种技术，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)产生。
编码抗体部分的核酸分子
在一些实施方案中，提供编码本文描述的抗-IGFBP7构建体或抗体部分中任一个的多核苷酸。在一些实施方案中，提供使用如本文描述的方法中任一个制备的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码本文描述的抗-IGFBP7单域抗体(sdAb)部分中任一个的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列当经翻译时位于所述sdAb的N端。
在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，所述RNA是mRNA。
核酸分子可使用本技术领域中常规的重组DNA技术构建。在一些实施方案中，核酸分子是适用于在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
核酸构建体
在一些实施方案中，提供包含本文描述的多核苷酸中任一个的核酸构建体。在一些实施方案中，提供使用本文描述的任何方法制备的核酸构建体。
在一些实施方案中，核酸构建体还包含可操作连接至多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸对应于基因，其中所述启动子是所述基因的野生型启动子。
载体
在一些实施方案中，提供包含编码本文描述的抗体部分中任一个(例如，抗-IGFBP7抗体部分)或本文描述的核酸构建体的任何多核苷酸的载体。在一些实施方案中，提供使用本文描述的任何方法制备的载体。本发明也提供包含编码抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7 sdAb)、融合蛋白或本文描述的其他形式的构建体中任一个的多核苷酸的载体。这些载体包括(但不限于)：DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、反转录病毒载体等。
在一些实施方案中，选择经优化以使多肽于CHO或CHO源性细胞中，或于NSO细胞中表达的载体。示例性这些载体描述(例如)于Running Deer等人，Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。
宿主细胞
在一些实施方案中，提供包含本文描述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供使用本文描述的任何方法制备的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞可在发酵条件下产生本文描述的抗体部分中任一个。
在一些实施方案中，本文描述的抗体部分(例如，抗-IGFBP7抗体部分)可于原核细胞(如细菌细胞)中表达；或于真核细胞，如真菌细胞(如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。该表达可(例如)根据本技术领域中已知的程序进行。可用以表达多肽的示例性真核细胞，包括(但不限于)：COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞、FUT8 CHO细胞和CHO GS细胞(Sigma)；细胞(Crucell)；和NSO细胞。在一些实施方案中，本文描述的抗体部分(例如，抗-IGFBP7抗体部分)可于酵母中表达。参见，例如，美国专利公开US2006/0270045 A1。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞的选择是基于其对抗体部分或构建体进行所需翻译后修饰的能力。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生比293细胞中产生的相同多肽具有更高唾液酸化水平的多肽。
将一或多个核酸引入所需宿主细胞内，可通过任何方法完成，包括(但不限于)：磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述(例如)于，Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根据任何合适的方法，核酸可瞬时或稳定转染至所需宿主细胞中。
本申请也提供包含本文描述的多核苷酸或载体中任一个的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供包含抗-IGFBP7抗体的宿主细胞。能够过表达异源性DNA的任何宿主细胞，可用于分离编码目标抗体、多肽或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例，包括(但不限于)：COS、HeLa和CHO细胞。也参见PCT公开WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母(如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。
在一些实施方案中，抗体部分在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述(例如)于Sitaraman等人，Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人，Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。
培养基
在一些实施方案中，提供包含本文描述的任何抗体部分、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在一些实施方案中，提供使用本文描述的任何方法制备的培养基。
在一些实施方案中，培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷(例如，HAT培养基)。在一些实施方案中，所述培养基不包含血清。在一些实施方案中，所述培养基经化学定义。在一些实施方案中，所述培养基包含血清。在一些实施方案中，所述培养基是D-MEM或RPMI-1640培养基。
抗体部分的纯化
抗-IGFBP7构建体(例如，抗-IGFBP7单克隆抗体或多特异性抗体)，可通过任何合适的方法纯化。这些方法包括(但不限于)使用亲和力基质或疏水性相互作用层析。合适的亲和力配体包括ROR1 ECD和结合抗体恒定区的配体。例如，可使用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、抗体亲和力柱或超滤/透滤(UF/DF)，以结合恒定区和/或纯化包含Fc片段的抗-IGFBP7构建体。疏水性相互作用层析(例如，丁基或苯基柱)也可适用于纯化一些多肽(如抗体)。离子交换层析术(例如，离子交换层析术和/或阳离子交换层析术)也可适用于纯化一些多肽(如抗体)。混合模式层析(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水性相互作用/阴离子交换、亲水性相互作用/阳离子交换等)，也可适用于纯化一些多肽(如抗体)。纯化多肽的许多方法为本技术领域中已知。
V.治疗方法
本文也提供治疗个体中的疾病或病症的方法。所述方法包括将本文描述的抗-IGFBP7构建体施用至个体(例如，哺乳动物，如人类)内。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体(如本文描述的抗-IGFBP7构建体中任一个)。
在一些实施方案中，提供一种抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体(如本文描述的抗-IGFBP7构建体中任一个)。在一些实施方案中，所述个体患有癌症(如实体瘤)。在一些实施方案中，所述组织是癌症/肿瘤组织。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32-33和46-48中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:34和49-51中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:33和35-57中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:38和39中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32-33和46-48中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:34和49-51中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:35-37中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制个体的组织中的异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的抗-IGFBP7构建体，所述构建体包含融合至抗-PD-L1或抗-PD-1全长抗体的抗-IGFBP7抗体部分(如本文描述的抗体部分中任一个)，其中所述抗-IGFBP7抗体部分包含单域抗体(sdAb)部分，所述sdAb部分包括：包含SEQ ID NO:10或11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述sdAb部分包含SEQ ID NO:38和39中任一个的氨基酸序列，或其具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的变体。
在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请的表2中显示的“优选取代”。
疾病或病症
本文描述的方法适用于任何与异常血管结构相关联的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是年龄相关性黄斑变性(ARMD)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是皮肤牛皮廯。在一些实施方案中，所述疾病或病症是良性肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。
癌症
在一些实施方案中，本文描述的疾病或病症是癌症。可使用本文描述的方法中任一个治疗的癌症包括任何类型的癌症。待使用如本申请中描述的药剂治疗的癌症类型包括(但不限于)：癌、胚细胞瘤、肉瘤、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤，例如，肉瘤、癌和黑色素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
在各种实施方案中，所述癌症是早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症、缓解期癌症、复发性癌症、辅助治疗中的癌症、新辅助治疗中的癌症，或疗法大体上难治的癌症。
在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。
在一些实施方案中，所述癌症包含CD93+肿瘤内皮细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的内皮细胞是CD93阳性。在一些实施方案中，所述癌症包含比受试者中的正常组织多至少20％、40％、60％、80％或100％的CD93+内皮细胞。在一些实施方案中，所述癌症包含比未患有所述癌症的受试者或受试者组中的相应器官多至少20％、40％、60％、80％或100％的CD93+内皮细胞。
在一些实施方案中，所述癌症包含IGFBP7+血管。在一些实施方案中，所述癌症包含比受试者中的正常组织多至少20％、40％、60％、80％或100％的IGFBP7+血管。在一些实施方案中，所述癌症包含比未患有所述癌症的受试者或受试者组中的相应器官多至少20％、40％、60％、80％或100％的IGFBP7+血管。
在一些实施方案中，所述癌症(例如，实体瘤)的特征在于肿瘤缺氧。在一些实施方案中，所述癌症的特征在于至少约1％、2％、3％、4％或5％的哌莫硝唑阳性百分比(即，哌莫硝唑阳性面积除以总肿瘤面积)。
可通过本申请的方法治疗的癌症的实例，包括(但不限于)：肛门癌、星细胞瘤(例如，小脑和大脑)、基底细胞癌、膀胱癌、骨癌、(骨肉瘤和恶性纤维性组织细胞瘤)、脑肿瘤(例如，神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、小脑或大脑星细胞瘤(例如，星形细胞瘤、恶性神经胶质瘤、神经管胚细胞瘤和神经胶质母细胞瘤)、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌(例如，子宫癌)、食道癌、眼癌(例如，眼内黑色素瘤和视网膜胚细胞瘤)、胃(腹部)癌、胃肠道间质瘤(GIST)、头颈癌、肝细胞(肝)癌(例如，肝癌和肝细胞瘤)、肝癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、神经管胚细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常症候群、鼻咽癌、神经胚细胞瘤、卵巢癌、胰脏癌、甲状旁腺癌、腹膜癌、脑下垂体瘤、直肠癌、肾癌、肾孟和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、皮肤癌(例如，非黑色素瘤(例如，鳞状细胞癌)、黑色素瘤和梅克尔细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌和结节性硬化症。癌症的另外实例，可参见The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，§on Hematology and Oncology，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第20版，§on Hematologyand Oncology，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2018(ISBN 978-0-911-91042-1)(2018年默克手册因特网网站数字在线版)；和SEER Program Coding and Staging Manual2016，其各自出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
受试者
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(如人类)。
在一些实施方案中，受试者具有包括包含CD93+内皮细胞的异常血管的组织。在一些实施方案中，具有异常血管的组织中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的内皮细胞是CD93阳性。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含比所述受试者中的正常组织多至少20％、40％、60％、80％或100％的CD93+内皮细胞。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含比无所述异常血管的受试者或受试者组中的相应器官多至少20％、40％、60％、80％或100％的CD93+内皮细胞。
在一些实施方案中，受试者具有包括包含IGFBP7+血管的异常血管的组织。在一些实施方案中，所述组织包含比所述受试者中的正常组织多至少20％、40％、60％、80％或100％的IGFBP7+血管。在一些实施方案中，所述组织包含比无所述异常血管的受试者或受试者组中的相应器官多至少20％、40％、60％、80％或100％的IGFBP7+血管。
在一些实施方案中，基于异常血管结构选择用于治疗的受试者。在一些实施方案中，所述异常血管结构的特征在于CD93+内皮细胞(例如，通过测量CD93+CD31+细胞)。在一些实施方案中，具有异常血管的组织中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的内皮细胞是CD93阳性。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含比所述受试者中的正常组织多至少20％、40％、60％、80％或100％的CD93+内皮细胞。在一些实施方案中，具有异常血管的组织包含比无所述异常血管的受试者或受试者组中的相应器官多至少20％、40％、60％、80％或100％的CD93+内皮细胞。
在一些实施方案中，异常血管结构的特征在于IGFBP7+血管的异常水平。在一些实施方案中，组织包含比受试者中的正常组织多至少20％、40％、60％、80％或100％的IGFBP7+血管。在一些实施方案中，所述组织包含比无异常血管的受试者或受试者组中的相应器官多至少20％、40％、60％、80％或100％的IGFBP7+血管。
抗-IGFBP7构建体的给药和施用方法
施用至个体内以用于治疗如本文描述的疾病或病症的抗-IGFBP7构建体的给药方案(如特定剂量和频率)，可随特定抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体，如抗-IGFBP7融合蛋白)、施用模式和治疗中的疾病或病症的类型而变化。在一些实施方案中，所述类型的疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是有效产生客观响应(如部分响应或完全响应)的量。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是足以于个体中产生完全响应的量。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是足以于所述个体中产生部分响应的量。在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是足以在经所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)治疗的个体群体中，产生大于约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％中任一个的整体响应率的量。个体对本文描述的方法的治疗的响应可(例如)基于RECIST水平加以确定。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是足以延长个体的无进展存活期的量。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是足以延长所述个体的整体存活期的量。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是足以在经所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)治疗的个体群体中产生大于约50％、60％、70％、80％或90％中任一个的临床效益的量。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)单独或与第二、第三和/或第四药剂组合的有效量，是相较于治疗前相同受试者中的相应肿瘤尺寸、癌细胞数量或肿瘤生长速率或相较于未接受所述治疗(例如，接受安慰剂治疗)的其他受试者中的相应活性，足以减小肿瘤尺寸、减少癌细胞数量或降低肿瘤的生长速率至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中任一个的量。可使用标准方法以测量此效应的量级，如使用经纯化的酶的活体外分析、基于细胞的分析、动物模型或人类测试。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是低于诱导毒理效应(即，高于临床上可接受的毒性水平的效应)的水平，或当对个体施用组合物时处于可控制或耐受潜在副作用的水平的量。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是在相同给药方案后接近组合物的最大耐受剂量(MTD)的量。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，大于所述MTD的约80％、90％、95％,或98％中任一个。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是相较于未接受治疗的个体，减缓或抑制疾病或病症的进展(例如，至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％)的量。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自体免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病症是感染。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是相较于未接受治疗的个体，减少病症(例如，移植)的副作用(自体免疫性响应)(例如，至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％)的量。
在上文的方面中任一个的一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(如抗-IGFBP7单克隆或多特异性抗体)的有效量，是总体重的约0.001μg/kg至约100mg/kg范围，例如，约0.005μg/kg至约50mg/kg、约0.01μg/kg至约10mg/kg、或约0.01μg/kg至约1mg/kg。
抗-IGFBP7构建体可经由各种途径施用个体(如人类)，包括：(例如)静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、经口、吸入、膀胱内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、跨黏膜和透皮。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体在对所述个体施用时包括于药物组合物中。在一些实施方案中，可使用所述组合物的连续缓释制剂。在一些实施方案中，所述组合物是经静脉内施用。在一些实施方案中，所述组合物是经腹膜内施用。在一些实施方案中，所述组合物是经静脉内施用。在一些实施方案中，所述组合物是经腹膜内施用。在一些实施方案中，所述组合物是经肌内施用。在一些实施方案中，所述组合物是经皮下施用。在一些实施方案中，所述组合物是经静脉内施用。在一些实施方案中，所述组合物是经口施用。在一些实施方案中，所述组合物是经玻璃体内施用(例如，用于治疗年龄相关性黄斑变性(ARMD))。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体(例如，A1 mIgG2a-D4)是以一周至每两天约一次的频率施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(例如，A1 mIgG2a-D4)是以每三至四天约一次的频率施用。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体是双特异性IgG纳米抗体(例如，A1 mIgG2a-D4)。在一些实施方案中，所述双特异性IgG纳米抗体(例如，A1mIgG2a-D4)施用于人类的剂量，等同于将约0.3mg施用于小鼠。参见Nair等人，J Basic Clin Pharm.March 2016-May2016；7(2):27-31。在一些实施方案中，所述双特异性IgG纳米抗体(例如，A1 mIgG2a-D4)是以约75mg剂量对人类施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体(例如，A1 mIgG2a-D4)是以约45mg/m2或1.2mg/kg剂量对人类施用。
组合疗法
本申请也提供对个体施用抗-IGFBP7构建体以治疗疾病或病症(如癌症)的方法，其中所述方法还包括施用第二药剂或疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法是用于治疗所述疾病或病症的标准或常用药剂或疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含化学治疗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含手术。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含辐射疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含免疫疗法。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含细胞疗法(如包含免疫细胞(例如，CART细胞)的细胞疗法)。在一些实施方案中，所述第二药剂或疗法包含血管生成抑制剂。
在一些实施方案中，第二药剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，所述第二药剂是抗代谢剂。在一些实施方案中，所述抗代谢剂是5-FU。
在一些实施方案中，第二药剂是免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点调节剂是选自下组的免疫检查点蛋白的抑制剂：PD-L1、PD-L2、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、CD27、4-1BB、CD96、PVRIG和B7H4。在一些实施方案中，所述免疫检查点蛋白是PD-1。在一些实施方案中，所述第二药剂是抗-PD-1抗体或其片段。
在一些实施方案中，第二疗法是免疫疗法。在一些实施方案中，所述免疫疗法包括施用表达嵌合抗原受体的免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞(如CD4+T细胞或CD8+T细胞)。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体结合至肿瘤抗原。
在一些实施方案中，抗-IGFBP7构建体是与第二药剂或疗法同时施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是与所述第二药剂或疗法并行施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是与所述第二药剂或疗法循序施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是在所述第二药剂或疗法之前施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是在所述第二药剂或疗法之后施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是以与所述第二药剂或疗法相同的单位剂型施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是以不同于所述第二药剂或疗法的单位剂型施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是以与所述第二药剂或疗法相同的单位剂型施用。在一些实施方案中，所述抗-IGFBP7构建体是以不同于所述第二药剂或疗法的单位剂型施用。
VI.组合物、试剂盒和制品
本文也提供包含本文描述的抗-IGFBP7构建体或抗-IGFBP7抗体部分、编码所述抗体部分的核酸、包含编码所述抗体部分的核酸的载体，或包含所述核酸或载体的宿主细胞中任一个的组合物(如制剂)。
本文描述的抗-IGFBP7构建体的合适制剂，可通过将具有所需纯度的抗-IGFBP7构建体或抗-IGFBP7抗体部分与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编，(1980))，混合呈冻干制剂或水溶液的形式获得。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者无毒，且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。适合皮下施用的冻干制剂描述于WO97/04801中。这些冻干制剂可用合适的稀释剂重构至高蛋白质浓度，且所述经重构的制剂可对本文中待成像、诊断或治疗的个体皮下施用。
待用于活体内施用的制剂必须是无菌的。此容易通过(例如)透过无菌滤膜过滤进行。
本发明也提供包含本文描述的抗-IGFBP7构建体或抗-IGFBP7抗体部分中任一个的试剂盒。所述试剂盒可适用于调整本文描述的细胞组合物或治疗的方法中任一个。
在一些实施方案中，提供包含特异性结合至IGFBP7的抗-IGFBP7构建体的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含可将抗-IGFBP7构建体递送至个体内的装置。用于诸如肠胃外递送的应用的一种类型的装置，是用以将所述组合物注射至受试者体内的注射器。吸入装置也可用于某些应用。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于治疗疾病或病症(例如，癌症、传染病、自体免疫性疾病或移植)的治疗剂。
本申请的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括(但不限于)：小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供另外的组分，如缓冲液和解释性信息。
因此，本申请也提供制品。所述制品可包含容器和于所述容器上或与所述容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括小瓶(如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、柔性包装等。通常，所述容器容纳组合物，且可具有无菌进入端口(例如，所述容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。所述标签或包装插页指示所述组合物用于成像、诊断或治疗个体的特定病症。所述标签或包装插页将还包含用于对所述个体施用所述组合物和用于成像所述个体的说明书。所述标签可指示用于重构和/或使用的指导。容纳所述组合物的容器可为多用途小瓶，其容许重复施用(例如，2-6次施用)经重构的制剂。包装插页是指通常包括于诊断产品的商业包装中的说明书，它们含有有关涉及使用这些诊断产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另外，所述制品可还包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可还包括自商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、填充剂、针和注射器。
试剂盒或制品可包括多个单位剂量的组合物和使用说明书，以足以在药店(例如，医院药店和配制药店)中储存和使用的数量包装。
本领域技术人员将理解数个实施方案可能于本发明的范围和精神内。本发明现将更详细通过参考下列非限制性实施例描述。下列实施例进一步阐述本发明，但当然不应以任何方式解释为限制其范围。
示例性实施方案
实施方案1.一种抗-IGFBP7构建体，其包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含：
1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
2)包含SEQ ID NO:2或112的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
3)包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
4)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
5)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
6)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
7)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
8)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
9)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
10)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
11)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
12)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；或
13)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
实施方案2.一种抗-IGFBP7构建体，其包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32-51中任一个的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
实施方案3.如实施方案1或2的抗-IGFBP7构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ IDNO:32-51中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-51中任一个具有至少约80％序列同一性的其变体。
实施方案4.如实施方案1至3中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述sdAb部分是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化或完全人源化的。
实施方案5.如实施方案1至4中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述sdAb部分是VHH抗体。
实施方案6.如实施方案1至5中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中抗-IGFBP7构建体阻断CD93结合至IGFBP7。
实施方案7.如实施方案1至6中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述IGFBP7是人类IGFBP7。
实施方案8.如实施方案6或实施方案7的抗-IGFBP7构建体，其中所述CD93是人类CD93。
实施方案9.如实施方案1至8中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述抗-IGFBP7构建体还包含第二部分。
实施方案10.如实施方案9的抗-IGFBP7构建体，其中所述第二部分包含特异性识别抗原的抗体部分。
实施方案11.如实施方案10的抗-IGFBP7构建体，其中所述抗原是PD-L1或PD-1。
实施方案12.如实施方案10或11的抗-IGFBP7构建体，其中所述第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体、双抗体或sdAb。
实施方案13.如实施方案9的抗-IGFBP7构建体，其中所述第二部分包含半衰期延长部分。
实施方案14.如实施方案9的抗-IGFBP7构建体，其中所述构建体是抗体-药物缀合物。
实施方案15.一种抗-IGFBP7构建体，其与如实施方案1-14中任一项的抗-IGFBP7构建体竞争特异性结合至IGFBP7。
实施方案16.一种药物组合物，其包含如实施方案1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体和药学上可接受的载体。
实施方案17.一种多核苷酸，其编码如实施方案1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体或其部分。
实施方案18.一种核酸构建体，其包含如实施方案17的多核苷酸，任选地还包含与所述多核苷酸可操作地连接至的启动子。
实施方案19.一种载体，其包含如实施方案18的核酸构建体。
实施方案20.一种经分离宿主细胞，其包含如实施方案17的多核苷酸、如实施方案18的核酸构建体或如实施方案19的载体。
实施方案21.一种培养基，其包含如实施方案1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体的多肽、如实施方案17的多核苷酸、如实施方案18的核酸构建体、如实施方案19的载体或如实施方案20的宿主细胞。
实施方案22.一种产生抗-IGFBP7构建体的方法，其包括：
a)在有效表达多肽的条件下培养如实施方案20的经分离的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞获得所述多肽。
实施方案23.一种在个体中治疗疾病或病症(如癌症，如实体瘤)或抑制组织中异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的如实施方案1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体或如实施方案16的药物组合物。
实施方案24.如实施方案23的方法，其中所述疾病或病症与异常血管结构相关联。
实施方案25.如实施方案23或实施方案24的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
实施方案26.如实施方案25的方法，其中所述癌症是实体瘤。
实施方案27.如实施方案25或实施方案26的方法，其中所述癌症包含CD93+内皮细胞。
实施方案28.如实施方案25-27中任一项的方法，其中所述癌症包含IGFBP7+血管。
实施方案29.如实施方案25-28中任一项的方法，其中所述癌症的特征在于肿瘤缺氧。
实施方案30.如实施方案25-29中任一项的方法，其中所述癌症是局部晚期或转移性癌症。
实施方案31.如实施方案25-30中任一项的方法，其中所述癌症选自：淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤和胰脏癌。
实施方案32.如实施方案23-31中任一项的方法，其中所述抗-IGFBP7构建体是经肠胃外施用至所述个体内。
实施方案33.如实施方案23-32中任一项的方法，其中所述方法还包括施用第二疗法。
实施方案34.如实施方案33的方法，其中所述第二疗法选自：手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、激素疗法、靶向疗法、冷冻疗法、超声波疗法、光动力疗法和化学疗法。
实施方案35.如实施方案34的方法，其中所述第二疗法是免疫疗法。
实施方案36.如实施方案35的方法，其中所述免疫疗法包括施用免疫调节剂。
实施方案37.如实施方案36的方法，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
实施方案38.如实施方案37的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗-PD-L1抗体或抗-PD-1抗体。
实施方案39.如实施方案23-38中任一项的方法，其中所述个体是人类。
实施例
下文实施例旨在仅作为本申请的示例，且因此不应视为以任何方式限制本申请。下列实施例和详细描述仅作为阐述而非限制提供。
材料
生物素化人类IGFBP7是使用标准方案(EZ-LinkTM磺基-NHS-SS-生物素；ThermoFisher Scientific，目录编号21331)产生。
山羊抗美洲鸵IgG(H+L)二级抗体，HRP是获自Thermo Fisher Scientific，目录编号A16060。
抗M13二级抗体，HRP是获自GE，目录编号27-9421-01。
His标记的鼠类N端IGFBP728-106和人类N端IGFBP728-106-美洲鸵Fc，使用标准方案产生。
实施例1：免疫
根据表3中概述的方案，用人类IGFBP7(hIGFBP7)使一只美洲鸵免疫。在完成所述方案后，通过ELISA分析免疫响应。具体地，在第0天和第52天收集血清样本，并用人类IGFBP7(0.5μg/mL于PBS中)或吸附至96孔ELISA盘的阴性Fc蛋白培养。用山羊抗美洲鸵IgG(Bethyl A160-100；Montgomery,TX)检测结合的美洲鸵IgG。第52天的结果显示于图1中。
表3：免疫时间表
如图1中显示，在测试美洲鸵中，hIGFBP7于稀释至107倍的美洲鸵血清中，有效诱导抗-人类IGFBP7抗体产生。
实施例2：文库构建
使用从获自美洲鸵的外周血单核细胞(PBMC)提取的RNA作为用于RT-PCR的起始材料，以扩增编码基因片段的纳米抗体。将这些片段克隆至噬菌粒载体内。噬菌体根据标准方法制备，并在过滤器杀菌后储存于4℃下备用。
实施例3：选择
使用标准噬菌体展示方法对经构建的文库进行选择。使用生物素化人类IGFBP7(于溶液中，接着捕获于链霉亲和素珠上，接着清洗和胰蛋白酶洗脱)进行两轮选择。分析各选择输出的富集因子(例如，相对于对照，洗脱液中存在的噬菌体的数量)并铺板用于进一步分析。使用N端标记的人类IGFBP7-His进行第三轮选择。
采集菌落，于两个96深孔板(2mL体积)中培养。一个板培养用于测序，另一个板添加用于噬菌体表达的辅助噬菌体以进行ELISA测试。
实施例4：通过ELISA初步筛选对人类IGFBP7的结合
将来自噬菌体表达板的50μL溶液与hIGFBP7(0.5μg/mL于PBS中)或吸附至96孔ELISA板的阴性Fc蛋白一起培养。通过抗-M13二级抗体，HRP(GE，目录编号27-9421-01)检测噬菌体展示的重组抗体。
实施例5：序列分析
对96孔板进行序列分析，导致鉴别一组不同、独特的纳米抗体序列。
基于氨基酸序列同源性(具体地，CDR3的同源性)，将所有克隆分类成不同的家族或单个序列代表。参见，表4。据信相同家族的成员在本文描述的不同分析中具有相似行为，然而功能性质中的小差异是可能的。每个家族选择一或数个代表用于进一步表征。
表4：共有序列分析
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实施例6：大肠杆菌中的纳米抗体表达和纯化
使选定纳米抗体在培养体积30mL下在大肠杆菌中以His6标记的蛋白形式表达，且表达是在37℃下用自动诱导mTB培养基诱导48小时。在旋转细胞培养物后，用溶菌酶和10％CHAPS在室温下孵育细胞球团30分钟。以12000x g离心这些提取物，并以标准纯化方法将所述溶液装载至Ni-t柱。用150mM咪唑从所述管柱洗脱纳米抗体并后续将缓冲液交换至PBS。
实施例7：通过FACS测定抗-IGFBP7纳米抗体与hIGFBP7和mIGFBP7的结合
通过用TrypLE试剂(Thermos Fisher)孵育分离展示人类IGFBP7和小鼠IGFBP7的HEK293T细胞，TrypLE试剂孵育保留细胞表面上IGFBP7的完整性。然后所述细胞用抗-IGFBP7纳米抗体以10μg/ml在4℃下孵育30分钟。在通过FACS缓冲液清洗后，所述细胞用缀合有APC的抗-HIS抗体(Biolegend)在4℃下孵育30分钟。在通过FACS缓冲液清洗两次后，于NovoCyte流式细胞仪中获取样本，并通过NovoExpress软件分析。
结果显示于图2A至2B和3A至3B。
如图2A-2B所示，克隆A1、A3、A4、A7、A11、D4、F12和G2全部结合hIGFBP7。如图3A-3B所示，克隆A1、A4、A11、D4和G2全部结合mIGFBP7。
实施例8：纳米抗体Fc融合物的重组表达
将通过ELISA测得的结合至hIGFBP7和mIGFBP7两者的抗-IGFBP7纳米抗体(例如，A1、A4、A11和D4的VHH)与mIgG2a或mIgG1 Fc片段融合(即，纳米抗体Fc融合物)，然后经克隆并于Expi293细胞中表达。简而言之，小鼠IgG Fc-融合纳米抗体是使用人类优选的密码子(IDT)基因合成。然后将所述基因片段亚克隆至含有鼠类抗体信号序列和mIgG2a或mIgG1Fc片段的pcDNA3.4载体内。所述纳米抗体Fc-融合蛋白是通过使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)瞬时转染至Expi293细胞内产生。转染后五天，收集来自经转染的细胞的上清液，并使用蛋白G琼脂糖(GE)纯化。使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合的抗体，并用1X PBS(pH 7.4)透析过夜。于还原和非还原SDS-PAGE上分析经纯化的抗体，以确认纯度和尺寸。蛋白质浓度是通过A280于分光亮度计上测定。
通过荧光活化的细胞分选(FACS)进行纳米抗体Fc融合构建体的初始筛选结果显示于图4和5。如图4所示，经测试抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体全部结合至表达hIGFBP7的HEK293T细胞。图5显示，来源于A1、A4和D4的经测试抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体结合至表达mIGFBP7的CHO-K1细胞。
实施例9：通过生物层干涉术(BLI)分析测定抗-IGFBP7-mIgG2a Fc对人类、食蟹猕猴和小鼠IGFBP7的结合亲和力
抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体(例如，VHH-Fc融合构建体)的结合亲和力，是采用生物层干涉(BLI)使用Octet QKe(Fortebio)测定。使用EZ-LINK NHS-PEG4生物素(Thermo Fisher Scientific)，将人类、小鼠和食蟹猴IGFBP7生物素化。使用链霉亲和素生物传感器(ForteBio)装载生物素化IGFBP7蛋白(300秒以5μg/ml)。基线于1X动力学缓冲液(ForteBio)中稳定60秒，然后容许抗-IGFBP7 Fc-融合蛋白(连续稀释)与捕获的hIGFBP7或mIGFBP7结合300秒。然后使所述传感器于1X动力学缓冲液中解离600秒。在ForteBio数据分析HT 11.1软件上进行数据分析。
结果显示于图6和7。如显示，测试的纳米抗体Fc融合构建体结合至人类和小鼠IGFBP7。
通过BLI分析测定，也测试小鼠IgG双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体(如图8所示的示例性双特异性A1-D4 mIgG2a和A1 mIgG2a-D4)对人类、食蟹猕猴和小鼠IGFBP7的结合亲和力。结果显示于图9-11。如显示，相比单特异性A1-mIgG1、A1-mIgG2a和D4-mIgG2a，双特异性纳米抗体Fc融合构建体A1D4-mIgG2a和A1-mIgG2a-D4具有相似的对人类、食蟹猕猴和小鼠IGFBP7的结合亲和力。
实施例10：通过荧光活化的细胞分选(FACS)测定抗-IGFBP7-mIgG2aFc对锚定至HEK293T细胞的人类和小鼠IGFBP7的结合
制造表达具有接头和CD80跨膜域的人类或小鼠IGFBP7的HEK 293T细胞的稳定池，以评估溶液中结合至IGFBP7的抗-IGFBP7纳米抗体Fc-融合蛋白。hIGFBP7-HEK细胞或mIGFBP7-HEK细胞(每孔1x105个)，用抗-IGFBP7-mIgG2a Fc(75、150、300和600nM)在4℃下处理30分钟。在用FACS缓冲液清洗后，所述细胞用缀合有Alexa Fluor 488的抗-小鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)在4℃下孵育30分钟。在用FACS缓冲液清洗两次后，于NovoCyte流式细胞仪中获取样本，并通过NovoExpress软件分析。
结果显示于图12A-12B和图13。如图12A-12B所示，经测试的单特异性和双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体，在各种浓度下结合至锚定于HEK293T细胞表面的hIGFBP7。此外图13显示，与单克隆A1-mIgG2a相似，双特异性A1-mIgG2a-D4-1(即，A1D4-mIgG2a)和A1-mIgG2a-D4-2(即，A1-mIgG2a-D4)结合至表达hIGFBP7或表达mIGFBP7的HEK细胞。
实施例11：通过抗-IGFBP7-mIgG2a处理的表达人类CD93的CHO细胞中的IGFBP7/CD93阻断分析
先前实施例中产生的抗-IGFBP7纳米抗体和纳米抗体-Fc融合物(50μg/ml)，用His标记的人类IGFBP7重组蛋白(1μg/ml)在4℃下孵育30分钟。表达人类CD93的CHO细胞(每孔1x 105个)，用所述混合物在4℃下处理30分钟。然后所述细胞用FACS缓冲液清洗，并用抗-IGFBP7单克隆兔抗体(Sino Biological Inc，目录编号13100-R003)以1μg/ml在4℃下孵育30分钟。孵育后，所述细胞用FACS缓冲液清洗，并用缀合有PE的抗-兔IgG抗体(Biole55gend)在4℃下孵育30分钟。在用FACS缓冲液清洗两次后，分析所述样本并于NovoCyte Flow中获取资料。
示例性抗-IGFBP7纳米抗体的结果显示于图14。如显示，所有经测试纳米抗体均将CD93与IGFBP7之间的相互作用有效阻断至少50％。具体地，A3、A4、A7和A11几乎完全阻断CD93与IGFBP7之间的相互作用。
也测试实施例8中产生的小鼠IgG抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合物阻断IGFBP7与CD93之间相互作用的能力。结果显示于图15A-15C。如显示，A1-mIgG2a、A4-mIgG2a和D4-mIgG2a在各种浓度下有效阻断IGFBP7与CD93之间的相互作用。
也测试示例性双特异性抗-IGFBP7纳米抗体Fc融合构建体(图8)阻断IGFBP7与CD93之间相互作用的能力。结果显示于图16。如显示，双特异性抗体A1-mIgG2a-D4-1(即，A1D4-mIgG2a)和A1-mIgG2a-D4-2(即，A1-mIgG2a-D4)具有相似的阻断活性。
实施例12：HUVEC成管抑制分析
将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)，在补充有低血清生长补充剂(LSGS,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的培养基200中于37℃用5％ CO2培养。用50μL Geltrex还原的生长因子基膜基质(Thermo FisherScientific)涂覆96孔板，并在37℃下孵育30分钟。为研究抗-IGFBP7 mIgG2a融合蛋白对成管的影响，将2x 104个HUVEC细胞接种于经基质涂覆的板上，并在存在或缺乏经纯化融合蛋白的情况下在37℃以5％CO2孵育18小时。使用光学显微镜获得影像。
如图17A-17B中显示，相比mIgG同型对照，A1-mIgG2a、A4-mIgG2a、A11-mIgG2a和D4-mIgG2a在各种浓度下有效抑制HUVEC细胞的成管。
实施例13：通过Octet竞争的抗-IGFBP7抗体的抗原表位聚类分析
使用Octet QKe(ForteBio)测定抗-IGFBP7抗体抗原表位聚类。使用EZ-LINK NHS-PEG4生物素(Thermo Fisher Scientific)，将人类IGFBP7重组蛋白生物素化。使用链霉亲和素生物传感器尖头(ForteBio)捕获生物素化IGFBP7蛋白(300秒，以5μg/mL)。于1X动力学缓冲液(Fortebio)中稳定基线测量60秒，然后容许初级抗-IGFBP7抗体(10μg/mL)与捕获的蛋白质结合300秒。然后容许一组二级抗-IGFBP7抗体(10μg/mL)与抗原和初级抗体复合物再结合300秒。针对各结合事件记录信号，并于ForteBio数据分析HT 11.1软件上进行数据分析。
图18中经由Octect分析的抗-IGFBP7抗体的抗原表位聚类分析显示，A1、A4、A11和D4结合至IGFBP7上的不同抗原表位。
实施例14：抗-IGFBP7抗体于肿瘤模型中的活体内治疗效用
使用雌性C57BL/6J小鼠中的同基因型KPC胰脏癌模型，以评估上文讨论的抗-IGFBP7抗体的活体内治疗效用。
对七周龄雌性C57BL/6J小鼠的右后侧腹，皮下注射在具有1:1Matrigel的0.1mL无血清培养基中的KPC肿瘤细胞(2.0x 106)，用于发展肿瘤。当平均肿瘤尺寸实现约50mm3时，将荷瘤动物随机分为3个研究组，各组6或7只小鼠。包括的组是小鼠同型对照IgG2A、A1mIgG2a-D4(参见实施例9和图8)。所有组中的各动物在第0、3、7、10天，通过IP注射接受0.3mg/小鼠的各自药物。一周两次，测量并记录肿瘤体积(TV)和体重(BW)直至研究终点(第28天)，且将各动物安乐死，提取肿瘤，拍照并称重(TW)用于比较分析。进行使用盖塞尔-温室校正(Geisser-Greenhouse correction)的重复测量(RM)双向ANOVA和邓尼特多重比较测试(Dunnett’s multiple comparison test)，以比较在终点时的平均TV与同型对照的平均TV。进行克鲁斯卡尔-沃利斯测试(Kruskal-Wallis test)和邓尼特多重比较测试(Dunn’s multiple comparison test)，以比较在终点时的治疗组的平均TW与同型对照的平均TW。
如以下表5所示，相比用同型对照治疗的小鼠，经A1 mIgG2a-D4治疗的小鼠显示第3天至第14天肿瘤体积持续减小约40％至60％，这表明抗-IGFBP7抗体在抑制肿瘤生长中具有高有效性。此后，肿瘤抑制效应变得较不明显，可能因为A1 mIgG2a-D4在第10天其最后一次施用后被从循环中清除。
在整个研究过程中，所有组中动物的整体体重均是稳定的(数据未显示)，表明其对治疗的耐受性良好。
表5：同基因型KPC+C57BL/6J模型中两组的平均肿瘤体积
1开始治疗后的天数。第0天＝治疗开始当天
序列表
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序列表
<110> 当康生物技术有限责任公司
<120> 抗-IGFBP7构建体及其用途
<130> PG03370A
<140> 未分配
<141> 同此
<150> US 63/166,146
<151> 2021-03-25
<160> 116
<170> FastSEQ Windows 4.0版
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
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<220>
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<223> 合成构建体
<400> 14
Ile Asn Ala Met Ala
1 5
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Ser Leu Lys Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Asp Met Thr Asp Trp Gly Leu Val Ala Gly Gln Phe Asp Val
1 5 10
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Ile Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Ala Leu Thr Ser Gly Gly Ser Thr Met Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Arg Leu Ile Arg Thr Ile Asn Gly Val Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Leu Tyr Ala Ile Ala
1 5
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Cys Ile Ser Ala Thr His Gly Glu Asp Ile Val Ala Tyr Arg Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 22
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Gly Ala Thr Cys Gly Asp Leu Tyr Gly Arg Ser Trp Asp Gly Gly
1 5 10 15
Pro Val Asn Arg Pro Pro Gln Phe Gly Ser
20 25
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Ala Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ser Ile Ser Trp Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Thr Thr Tyr Phe Arg Gly Thr Tyr Asn Val Glu Ser Ala Phe Gly Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Ser Tyr Val Met Gly
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Ala Ile Pro Trp Asp Asp Asp Trp Thr Arg Tyr Glu Asp Phe Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Ser Thr Arg Pro Gly Ala Pro Tyr Val Tyr
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Thr Tyr Tyr Met Thr
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Ala Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gly Asp Tyr Tyr Glu Ser Thr Tyr Tyr Pro Arg Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ala Ile Asp Lys
20 25 30
Trp Gly Trp Tyr Arg Gln Val Ala Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val Ala
35 40 45
Trp Arg Tyr Ser Pro Val Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Ser Ser Arg Lys Arg Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys Ala Ala
85 90 95
Val Ile Ser Gly Ala Trp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 33
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Val Gln Leu Gln Glu Ser Glu Gly Gly Trp Ser Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ser Ser Asp Phe Asp Tyr Asp Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala
20 25 30
Met Thr Gly Asn Ala Asp Asp Ala Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val Ala
35 40 45
Trp Arg Tyr Ser Pro Val Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Ser Ser Arg Lys Arg Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys Ala Ala
85 90 95
Val Ile Ser Gly Ala Trp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 34
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg His Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Leu Thr Ala Ile Thr Trp Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Leu Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Lys Phe Ser Gln Val Ser Ala Phe Phe Ala Thr Val Ser
100 105 110
Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Asn Thr
20 25 30
Tyr Leu Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn Ile
85 90 95
Lys Ala His Pro Asn Pro Trp Gly Phe Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Ser Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn Ile Lys
85 90 95
Ala His Pro Asn Pro Trp Gly Phe Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Phe Thr Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Thr Arg Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn Ile Lys
85 90 95
Ala His Pro Asn Pro Trp Gly Phe Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Val Gln Leu Gln Glu Ser Glu Gly Gly Trp Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asp Phe Gly Tyr Asp Lys Met Ala Asn Ala Ile Asn Gly Ala
20 25 30
Met Thr Asp Asn Ala Asp Ala Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn Ile Lys
85 90 95
Ala His Pro Asn Pro Trp Gly Phe Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Ala Thr Ala Ser Ser
115
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Val Gln Leu Gln Glu Ser Glu Gly Gly Trp Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Asn Gly Ala
20 25 30
Met Thr Asp Asn Ala Asp Ala Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Asn Ile Lys
85 90 95
Ala His Pro Asn Pro Trp Gly Phe Asp Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Ser Phe Asn Ile Asn Ala
20 25 30
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
35 40 45
Ser Leu Lys Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Phe Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asp Ala Lys Asp Ser Ile Val Leu Gln
65 70 75 80
Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys Ala Ala
85 90 95
Asp Met Thr Asp Trp Gly Leu Val Ala Gly Gln Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala
20 25 30
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
35 40 45
Ala Leu Thr Ser Gly Gly Ser Thr Met Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Lys Met Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Arg Leu Ile Arg Thr Ile Asn Gly Val Asp Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Pro Gly Val Thr Leu Asp Leu Tyr Ala
20 25 30
Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
35 40 45
Cys Ile Ser Ala Thr His Gly Glu Asp Ile Val Ala Tyr Arg Glu Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Lys Thr Glu Asn Ala Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Thr Asp Gly Ala Thr Cys Gly Asp Leu Tyr Gly Arg Ser Trp
100 105 110
Asp Gly Gly Pro Val Asn Arg Pro Pro Gln Phe Gly Ser Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 43
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Pro Ala Gly Ser Ala Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ser Ile Ser Trp Thr Gly Ser Thr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Val Ser Ile Val Asn Ala Asn Asn Thr Met Leu Leu
65 70 75 80
Glu Met Lys Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Thr Tyr Phe Arg Gly Thr Tyr Asn Val Glu Ser Ala Phe Gly
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Lys Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Thr Ser Ser Tyr Val
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Val Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Pro Trp Asp Asp Asp Trp Thr Arg Tyr Glu Asp Phe Val Ser
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Arg Pro Gly Ala Pro Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Tyr
20 25 30
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser
35 40 45
Ala Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ile Gly Asp Tyr Tyr Glu Ser Thr Tyr Tyr Pro Arg Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ala Ile Asp
20 25 30
Lys Trp Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ser Trp Arg Tyr Ser Pro Val Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Val Ile Ser Gly Ala Trp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ala Ile Asp
20 25 30
Lys Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Arg Tyr Ser Pro Val Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Val Ile Ser Gly Ala Trp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Leu Phe Ala Ile Asp
20 25 30
Lys Trp Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ser Trp Arg Tyr Ser Pro Val Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Arg Cys Ala
85 90 95
Ala Val Ile Ser Gly Ala Trp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Ile Val Ser Ala Ile Thr Trp Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Lys Phe Ser Gln Val Ser Ala Phe Phe Ala Thr Val
100 105 110
Ser Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 50
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Lys Phe Ser Gln Val Ser Ala Phe Phe Ala Thr Val
100 105 110
Ser Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Thr Trp Ser Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Phe Ser Gln Val Ser Ala Phe Phe Ala Thr Val
100 105 110
Ser Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Ile Asn Thr Tyr Leu
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = N或I
<400> 53
Ala Xaa Asn Gly Ala Met
1 5
<210> 54
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 可以任何整数个的重复存在
<400> 54
Gly
1
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(16)
<223> 可存在或不存在
<400> 55
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(40)
<223> 可存在或不存在
<400> 56
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser
35 40
<210> 57
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(40)
<223> 可存在或不存在
<400> 57
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 58
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(32)
<223> 可存在或不存在
<400> 58
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 60
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(15)
<223> 可以任何高达3的整数个的重复存在
<400> 61
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Asp Thr Tyr Met Tyr
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 68
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 72
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 73
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr
1 5
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Phe Ser Phe
1 5 10
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Ala Ala Ser
1
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 81
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Ile Asn Pro Thr Thr Gly Tyr Thr
1 5
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Ala Arg Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Tyr
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu
1 5
<210> 84
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Ala Ala Lys
1
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Ile Thr Ile Gly Gly Gly Thr Thr
1 5
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Ala Arg His Arg Tyr Asp Tyr Phe Ala Met Asp Asn
1 5 10
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Glu Asn Val Asp Asn Tyr Gly Ile Asn Phe
1 5 10
<210> 90
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Val Ser Ser
1
<210> 91
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp
1 5
<210> 92
<211> 135
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 92
Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Lys Ala Asn Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr
85 90 95
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Ala Tyr Tyr Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 94
<211> 140
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 94
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Val Trp Val Ala
35 40 45
Tyr Ile Thr Ile Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys
50 55 60
Arg Leu Val Trp Val Ala Tyr Ile Thr Ile Gly Gly Gly Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Arg Tyr Asp Tyr Phe Ala Met Asp
115 120 125
Asn Trp Gly His Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 95
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 95
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Glu
1 5 10 15
His Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Asn Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asn Phe Met Asn Trp Phe Gln His Lys Pro Ala Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Val Ser Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Asp Val Pro Trp Thr Phe Ser Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 96
<211> 123
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 96
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Ser Gly Tyr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 97
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 97
Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Ile Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 98
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 98
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His
195 200
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 100
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 101
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 102
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Phe Thr Ser Ser Leu His Ser
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 104
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 105
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 106
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 107
Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 108
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 109
Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 110
Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro Thr
1 5
<210> 111
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 111
Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys
35 40 45
Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala
50 55 60
Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly
85 90 95
Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val
100 105 110
Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro
115 120 125
Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly
130 135 140
Glu Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro
145 150 155 160
Ser Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln
165 170 175
Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile
180 185 190
Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu
195 200 205
Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro
210 215 220
Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys
225 230 235 240
Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln
245 250 255
Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile
260 265 270
Pro Val Lys Lys Gly Glu Gly Ala Glu Leu
275 280
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 112
Gly Ser Leu Phe Ala Ile Asp Lys Trp Gly
1 5 10
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 113
Ala Ala Val Ile Ser Gly Ala Trp Tyr
1 5
<210> 114
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 114
Gly Arg Ser Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly
1 5 10
<210> 115
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 115
Ala Lys Phe Ser Gln Val Ser Ala Phe Phe Ala Thr Val Ser Glu Tyr
1 5 10 15
Glu Tyr
<210> 116
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 116
Ala Arg Lys Phe Ser Gln Val Ser Ala Phe Phe Ala Thr Val Ser Glu
1 5 10 15
Tyr Glu Tyr

Claims (39)

1.一种抗-IGFBP7构建体，其包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含：
1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
2)包含SEQ ID NO:2或112的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:4或113的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
3)包含SEQ ID NO:5或114的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:7、115或116的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
4)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
5)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
6)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
7)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
8)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
9)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
10)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
11)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；
12)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体；或
13)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR1、包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR3，或在这些CDR中包含多达5、4、3、2或1个氨基酸取代的其变体。
2.一种抗-IGFBP7构建体，其包括包含特异性识别IGFBP7的单域抗体(sdAb)部分的多肽，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32-51中任一个的氨基酸序列内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2的抗-IGFBP7构建体，其中所述sdAb部分包含SEQ ID NO:32-51中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:32-51中任一个具有至少约80％序列同一性的其变体。
4.如权利要求1-3中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述sdAb部分是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化或完全人源化的。
5.如权利要求1-4中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述sdAb部分是VHH抗体。
6.如权利要求1-5中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中抗-IGFBP7构建体阻断CD93结合至IGFBP7。
7.如权利要求1-6中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述IGFBP7是人类IGFBP7。
8.如权利要求6或7的抗-IGFBP7构建体，其中所述CD93是人类CD93。
9.如权利要求1-8中任一项的抗-IGFBP7构建体，其中所述抗-IGFBP7构建体还包含第二部分。
10.如权利要求9的抗-IGFBP7构建体，其中所述第二部分包含特异性识别抗原的抗体部分。
11.如权利要求10的抗-IGFBP7构建体，其中所述抗原是PD-L1或PD-1。
12.如权利要求10或11的抗-IGFBP7构建体，其中所述第二抗体部分是全长抗体、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗体、双抗体或sdAb。
13.如权利要求9的抗-IGFBP7构建体，其中所述第二部分包含半衰期延长部分。
14.如权利要求9的抗-IGFBP7构建体，其中所述构建体是抗体-药物缀合物。
15.一种抗-IGFBP7构建体，其与如权利要求1-14中任一项的抗-IGFBP7构建体竞争特异性结合至IGFBP7。
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体和药学上可接受的载体。
17.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体的多肽或其部分。
18.一种核酸构建体，其包含如权利要求17的多核苷酸，任选地还包含可操作地连接至所述多核苷酸的启动子。
19.一种载体，其包含如权利要求18的核酸构建体。
20.一种经分离的宿主细胞，其包含如权利要求17的多核苷酸、如权利要求18的核酸构建体或如权利要求19的载体。
21.一种培养基，其包含如权利要求1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体的多肽、如权利要求17的多核苷酸、如权利要求18的核酸构建体、如权利要求19的载体、或如权利要求20的宿主细胞。
22.一种产生抗-IGFBP7构建体的方法，其包括：
a)在有效表达多肽的条件下培养如权利要求20的经分离的宿主细胞；和
b)从所述宿主细胞获得所述多肽。
23.一种在个体中治疗疾病或病症或抑制组织中异常血管生长的方法，其包括对所述个体施用有效量的权利要求1-15中任一项的抗-IGFBP7构建体或权利要求16的药物组合物。
24.如权利要求23的方法，其中所述疾病或病症与异常血管结构相关联。
25.如权利要求23或24的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
26.如权利要求25的方法，其中所述癌症是实体瘤。
27.如权利要求25或26的方法，其中所述癌症包含CD93+内皮细胞。
28.如权利要求25-27中任一项的方法，其中所述癌症包含IGFBP7+血管。
29.如权利要求25-28中任一项的方法，其中所述癌症的特征在于肿瘤缺氧。
30.如权利要求25-29中任一项的方法，其中所述癌症是局部晚期或转移性癌症。
31.如权利要求25-30中任一项的方法，其中所述癌症选自：淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、前列腺癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤和胰脏癌。
32.如权利要求23-31中任一项的方法，其中所述抗-IGFBP7构建体是肠胃外施用至所述个体内。
33.如权利要求23-32中任一项的方法，其中所述方法还包括施用第二疗法。
34.如权利要求33的方法，其中所述第二疗法选自：手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、激素疗法、靶向疗法、冷冻疗法、超声波疗法、光动力疗法和化学疗法。
35.如权利要求34的方法，其中所述第二疗法是免疫疗法。
36.如权利要求35的方法，其中所述免疫疗法包括施用免疫调节剂。
37.如权利要求36的方法，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
38.如权利要求37的方法，其中所述免疫检查点抑制剂包含抗-PD-L1抗体或抗-PD-1抗体。
39.如权利要求23-38中任一项的方法，其中所述个体是人类。
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