CN112638415A - 用于成像的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用于确定患有疾病或病况的个体中的免疫检查点配体(如PD‑L1或PD‑L1样配体)的分布和表达水平的方法、成像剂和试剂盒。还提供了抗PD‑L1抗体药剂。

Description

用于成像的组合物和方法
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以ASCII文本文件后续提交的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：792572000240SEQLIST.TXT，记录日期：2018年7月23日，大小：62KB)。
发明领域
本发明涉及对免疫检查点配体进行成像的抗体、成像剂和方法。
发明背景
程序性死亡(PD)网络涉及至少五个相互作用的分子：PD-1(程序性细胞死亡1)、两个PD-1配体(PD-L1和PD-L2)以及PD-L1的两个抑制性受体(PD-1和CD80)。PD途径的关键功能在调节炎症对感染的响应中周围组织的T细胞活性以及对自身免疫的限制方面，似乎被肿瘤细胞和慢性病毒感染期间的病毒所劫持。PD-L1在多种组织起源的许多新分离的人肿瘤中过表达(Dong等Nature Medicine 2002；8:793-800；Romano等Journal forImmunotherapy of Cancer 2015；3:15；Hirano等Cancer Research 2005；65:1089-1096)。PD-L1的表达与某些类型的人类癌症的进展和不良预后相关(Wang等European journal ofsurgical oncology:the journal of the European Society of Surgical Oncologyand the British Association of Surgical Oncology 2015；41:450-456；Cierna等Annals of oncology:official journal of the European Society for MedicalOncology/ESMO 2016；27:300-305；Gandini等Critical reviews in oncology/hematology 2016；100:88-98；Thierauf等Melanoma research 2015；25:503-509；Taube等Clinical cancer research:an official journal of the American Association forCancer Research 2014；20:5064-5074)。在慢性病毒感染期间，PD-L1在许多组织中持续表达，而PD-1在病毒特异性CTL中被上调(Yao等Trends in molecular medicine 2006；12:244-246)。肿瘤或病毒诱导的PD-L1可以利用多种机制促进对宿主免疫监视的逃避，包括T细胞无能、凋亡、耗竭、IL-10产生、DC抑制以及Treg诱导和表达(Zou等Nature reviewsImmunology 2008；8:467-477)。
使用免疫组织化学(IHC)确定的PD-L1表达水平，已作为PD-1/PD-L1定向治疗的临床试验中针对多种癌症类型的预测性生物标志物进行了评估，所述癌症类型包括黑素瘤、肾细胞癌(RCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性结直肠癌(mCRC)和转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。由IHC确定的PD-L1水平较高的患者，似乎对PD-1/PD-L1定向治疗具有更好的反应。但是，PD-L1阴性的黑素瘤患者仍然可以获得对抗PD-1/PD-L1疗法的持久响应，而PD-L1阴性的NSCLC患者的响应率却很低。
由IHC在人肿瘤样本中检测PD-L1的准确性受多种因素困扰。已经使用了多种用于IHC检测的PD-L1抗体，包括28-8、22C3、5H1，MIH1和405.9A11。此外，在该领域正开发多种专有的伴随诊断方法，如VentanaSP142和Ventana SP263测定。这些测定的比较性能特征尚不清楚。除了在肿瘤微环境中的异质PD-L1表达的现有问题外，还缺乏对IHC在肿瘤样本中染色的“阳性”PD-L1的明确定义。基于染色的肿瘤细胞百分比，阳性结果的截止点范围可为>1％至>50％。此外，针对IHC检测抗体，PD-L1具有有限的结合位点，因为它仅包含两个小的亲水区域，这使得通常用于福尔马林固定、石蜡包埋样本(FFPE)的免疫组织化学方法更为低效。由于在PD-L1上缺乏结合位点，因此，相比治疗性PD-L1抗体，IHC抗体通常在结构上唯一的位点与PD-L1结合。
此外，PD-L1仅在细胞膜上通过动态IFNγ表达或通过组成型癌基因激活来表达时才具有生物学活性。相比炎症驱动的PD-L1表达，癌基因驱动的PD-L1表达代表组织病理学和生物学上不同的实体。尽管后者主要发生在IFNγ介导的免疫攻击部位，但癌基因驱动的PD-L1表达是组成性和扩散性的。IFNγ诱导的PD-L1表达代表动态生物标志物，并存在于活跃的炎症部位，以及活检样品代表了在空间和时间上肿瘤免疫微环境的快照。肿瘤代谢微环境中的其他因素(包括缺氧)可导致PD-L1上调，并且取决于通过HIF1a的信号传导。较小的肿瘤活检可错过相关的肿瘤-免疫界面，或者可在生物学上相关的PD-L1过表达已经发生后进行活检。PD-L1本身在两个潜在的临床相关的免疫突触中表达—肿瘤/T细胞界面，以及APC/T细胞界面。对于肿瘤/T细胞界面，肿瘤/免疫界面的活检捕获是IHC检测黑素瘤中PD-L1的关键决定因素。在评估转移性黑素瘤患者的PD-L1表达的研究中，有96％的PD-L1-过表达的黑素瘤有淋巴细胞浸润(TIL)，而其余4％的PD-L1过表达缺乏TIL，可能代表癌基因驱动的PD-L1表达。此外，22％的PD-L1阴性样品与TIL相关，表明了肿瘤免疫干扰的替代机制
大多数PD-L1表达发生在肿瘤界面上，免疫细胞分泌IFNγ，导致了反直觉的假设，即PD-L1的过表达可以是TIL成功杀死肿瘤的最初保护性反应，它会随时间逐渐地被选入免疫抑制性肿瘤环境。此外，针对PD-L1检测的合适活检部位的选择仍然是个谜。尽管可能最容易获得FFPE预处理的主要肿瘤样品，但这些样品可能无法反映当前在给定患者中存在的总体免疫状态，尤其是如果已进行了临时治疗。在活检病变中缺乏PD-L1表达可能无法反映全身免疫学状况，并且可能无法在依赖于PD-L1信号传导的疾病的其他部位捕获治疗的有益效果。综上所述，对准确的替代性PD-L1检测药剂和方法存在未满足的需求。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开专利申请的公开内容，包括PCT申请号PCT/CN2018/089672，均通过引用以其整体由此并入本文。
发明概述
本申请提供了抗体药剂、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、培养基、试剂盒，确定个体中免疫检查点分布的方法，诊断个体的方法，以及使用所述抗体药剂治疗个体的方法。
本申请一个方面提供了包含抗体部分的抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
在根据上述任一种抗体药剂的一些实施方案中，VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和/或VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在根据上述任一种抗体药剂的一些实施方案中，VH包含与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列；和VL包含与SEQ IDNO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
本申请的一个方面提供了包含抗体部分的抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含VH和VL的抗PD-L1抗体竞争地、特异性结合PD-L1，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在根据上述任一种抗体药剂的一些实施方案中，所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
在根据上述任一种抗体药剂的一些实施方案中，所述抗体部分具有选自下组的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
在根据上述任一种抗体药剂的一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在根据上述任一种抗体药剂的一些实施方案中，所述抗体药剂还包含第一缀合部分，其中所述第一缀合部分能够在体内与第二缀合部分缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分包含点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：反式-环辛烯(TCO)-四嗪(Tz)对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
本申请的一个方面提供了多核苷酸，其编码根据上述任一种抗体药剂的抗体药剂的抗体部分。
本申请的一个方面提供了核酸构建体，其包含根据上述任一种多核苷酸的多核苷酸，任选地还包含与所述多核苷酸可操作连接的启动子。
本申请的一个方面提供了载体，其包含根据上述任一种核酸构建体的核酸构建体。
本申请的一个方面提供了宿主细胞，其包含：根据上述任一种多核苷酸的多核苷酸，根据上述任一种核酸构建体的核酸构建体，或根据上述任一种载体的载体。
本申请的一个方面提供了培养基，其包含：根据上述任一种抗体药剂的抗体药剂的抗体部分，根据上述任一种多核苷酸中多核苷酸，根据上述任一种核酸构建体的核酸构建体，根据上述任一种载体的载体，或根据上述任一种宿主细胞的宿主细胞。
本申请的一个方面提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：TCO-Tz对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体药剂的有效量为约0.1mg/kg至约100mg/kg。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述放射性核素的有效量为约10uCi至500uCi。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时进行成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述方法还包括基于由所述成像剂从所述个体的目标组织中发出的信号，确定所述组织中所述免疫检查点配体的表达水平。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，在约10分钟至约7天内从所述个体清除所述成像剂。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体药剂在血清中的半衰期为约10分钟至约8天。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体之间的结合的KD为约9x10-10M至约1x10-8M。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分的分子量不超过约400kDa。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物的免疫检查点配体交叉反应。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH是稳定的。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1或PD-L1样配体。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和b)VL包含：含有SEQID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，基于免疫组织化学(IHC)测定，所述目标组织为免疫检查点配体阴性。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述目标组织具有低的免疫检查点配体表达水平。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述目标组织仅在免疫细胞浸润时表达所述免疫检查点配体。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述方法还包括在一段时间内对所述个体进行成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述放射性核素化合物包含螯合所述放射性核素的螯合化合物。
在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像或正电子发射断层扫描(PET)成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述抗体药剂是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述放射性核素化合物是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
本申请一个方面提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：使用根据上述任一种方法的方法确定所述个体中免疫检查点配体的分布；以及如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。
本申请的一个方面提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：使用根据上述任一种方法的方法诊断所述个体；以及如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体的治疗剂。
本申请的一个方面提供了试剂盒，其包括：包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体；以及包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分能够在体内彼此缀合。
本申请的一个方面提供了计算机系统，所述计算机系统包括：输入单元，其接收来自用户的请求以确定个体中免疫检查点配体的分布；一个或多个可操作地连接到所述输入单元的计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程以：接收包含在个体中在目标组织的成像剂的信号的一组数据，其中所述成像剂是在以下步骤后通过第一缀合部分和第二缀合部分的缀合在体内产生的：将有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂施用于所述个体，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体，以及随后将有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物施用于所述个体；以可读方式呈现数据或生成数据分析。
附图说明
图1A和1B显示了抗hPD-L1单克隆抗体5B7与hPD-L1蛋白的结合亲和力。图1A显示的直方图展示了在不同浓度下抗hPD-L1单克隆抗体5B7与hPD-L1蛋白的结合亲和力。图1B显示了各自浓度下的平均荧光强度。
图2A和2B显示了抗hPD-L1单克隆抗体与表达hPD-L1蛋白或mPD-L1蛋白的CHO细胞的结合亲和力。
图3显示了与亲本小鼠抗体相比，人源化抗hPD-L1抗体与PD-L1的结合亲和力。
图4显示了与亲本小鼠抗体相比，人源化抗体的结合亲和力和动力学特征。
图5显示了scFv-HuFc(Wt)和scFv-HuFc(Mt)的结构设计示意图。
图6显示了在减少和未减少条件下，scFv-HuFc(Wt)和scFv-HuFc(Mt)的SDS-PAGE结果。
图7显示的直方图展示了与亲本抗体相比，scFv-HuFc(Wt)和scFv-HuFc(Mt)与PD-L1的结合亲和力。
图8显示了scFv-HuFc融合蛋白的结合亲和力和动力学特征。
图9显示了在静脉注射抗hPD-L1 scFv-HuFc融合蛋白scFv-hFcWt和scFv-hFcMt后，抗hPD-L1抗体和hIgG的血清效价。
图10显示了在100℃ DOTA-(PEG)10-Tz的标记率。1区(Rgn1，3.5-29.5nm)代表68Ga-DOTA-Tz。2区(Rgn2，64.2-84.1nm)代表68Ga。
图11显示了在100℃ 2μL DOTA-(PEG)10-Tz的标记率。1区(Rgn1，1.7-26nm)代表68Ga-DOTA-Tz。2区(Rgn2，50.3-64.2nm)代表68Ga。
图12显示了在68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-230B处理下，检测到的对MC-38细胞或MC38-B7H1细胞的68Ga-Tz放射性。
图13显示了在68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-220处理下，检测到的对MC-38细胞或MC38-B7H1细胞的68Ga-Tz放射性。
图14显示了如实施例6IA中所述，通过注射MC38-PD-L1细胞诱导的肿瘤的体内成像。具体而言，通过尾静脉用TCO-FMU-220注射小鼠。3小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠进行成像。
图15显示了如实施例6IB中所述，通过注射MC38-PD-L1细胞诱导的肿瘤的体内成像。具体而言，通过尾静脉用TCO-FMU-220注射小鼠。24小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠进行成像。
图16显示了如实施例6IC中所述，通过注射MC38-PD-L1细胞诱导的体内肿瘤成像。具体而言，通过尾静脉用TCO-FMU-220注射小鼠。48小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠进行成像。
图17显示了如实施例6IIA中所述，通过注射MC38-PD-L1细胞诱导的体内肿瘤成像。具体而言，通过尾静脉用TCO-FMU-230B注射小鼠。3小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠进行成像。
图18显示了如实施例6IIB中所述，通过注射MC38-PD-L1细胞诱导的肿瘤的体内成像。具体而言，通过尾静脉用TCO-FMU-230B注射小鼠。24小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠进行成像。
图19显示了如实施例6IIC中所述，通过注射MC38-PD-L1细胞诱导的肿瘤的体内成像。具体而言，通过尾静脉用TCO-FMU-230B注射小鼠。48小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠进行成像。
发明详述
本申请在一个方面提供了用于检测个体的免疫检查点的方法，以及组合物、试剂盒、计算机系统以及用于此类方法的制品。本文所述的方法涉及：a)包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂的用途，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体，如PD-L1或PD-L1样配体；以及b)包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物的用途，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分可以在体内彼此缀合，以提供靶向的成像剂。
本文所述方法提供的优势在于可以通过用与目标免疫检查点结合的抗体药剂预先靶向个体，并随后施用放射性核素化合物，以避免不想要的临床并发症。所述抗体药剂和放射性核素化合物各自包含一个缀合部分，其可以在体内特异性彼此缀合(例如，通过点击化学)，以提供一种成像剂。例如，所述第一缀合部分为反式环辛烯(TCO)，所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或者所述第一缀合部分为Tz，所述第二缀合部分为Tz。
在一些实施方案中，将所述抗体部分工程化，以提高热稳定性。在一些实施方案中，所述抗体部分具有相对较高的分子量(例如高于在抗体/放射性核苷酸缀合物中使用的scFv的分子量)。在一些实施方案中，所述放射性核苷酸是短寿命的。因此，本申请公开的主题在涉及施用抗体/放射性核苷酸缀合物方法的现有成像方法，所述成像方法不适用于大的抗体部分和短寿命的放射性核苷酸。
因此，本申请一个方面提供了确定免疫检查点配体(如PD-L1或PD-L1样配体)在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；(b)随后向所述个体施用包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。
本申请另一个方面提供了包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体(如PD-L1或PD-L样配体)，并且其中所述缀合部分可以在体内与第二缀合部分缀合。
本申请另一个方面提供了抗PD-L1抗体药剂，其包含：含有SEQ ID NO:1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的VH，以及含有SEQ ID NO:3的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3的VL。
本申请另一个方面提供了标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分，并且其中所述缀合部分可以在体内与第一缀合部分缀合。
本申请另一个方面提供了如本文所述的一种多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞和培养基。
还提供了组合物、试剂盒和制品，其包含本文所述的抗体药剂(如抗PD-L1抗体药剂)和/或标签化合物(例如，放射性核素化合物)及其制备方法，以及诊断或治疗患有疾病或病况(如癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病)的个体的方法。
I.定义
如本文所用，“免疫系统检查点”或“免疫检查点”是指在免疫系统中通常起维持自身耐受性或调节生理性免疫应答的持续时间和幅度的抑制性途径的作用以尽量减少附带组织损伤。刺激性检查点分子是刺激或正向调节免疫系统的分子，如蛋白质。抑制性检查点分子是抑制或负向调节免疫系统的分子，如蛋白质。免疫系统检查点分子包括但不限于：细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1蛋白(PD-1)、PD-L1、PD-L2、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、B7-1、B7-H3、B7-H4、T细胞膜蛋白3(TIM3)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、含V结构域免疫球蛋白(Ig)的T细胞活化抑制剂(VISTA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和A2A腺苷受体(A2aR)。
“免疫检查点受体”是在免疫细胞(如T细胞)上表达的免疫检查点分子。
如本文所用，术语“免疫检查点配体”是指免疫检查点受体特异性识别的天然存在的或非天然存在的配体。天然存在的免疫检查点配体是可由病变组织(如肿瘤细胞、感染细胞或发炎组织)表达的免疫检查点分子，其可以调节表达免疫检查点受体的免疫细胞，所述免疫检查点受体特异性识别所述免疫检查点配体。非天然存在的免疫检查点配体包括合成的和重组的分子，如免疫检查点受体的治疗性抑制剂、配体和抗体。非天然存在的免疫检查点配体可以引入个体中，例如通过施用于个人。免疫检查点配体可通过刺激刺激性检查点受体的活性或抑制通路中抑制性检查点受体的活性来抑制免疫检查点。示例性天然存在的免疫检查点配体包括但不限于：PD-L1、PD-L2、B7-H3(也称为CD276)、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。“PD-L1样配体”是指PD-1的天然存在的或非天然存在的配体。
术语“抗体”以其最广泛的意义使用，并涵盖多种抗体结构，包括但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们表现出所希望的抗原结合活性。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR，包括：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR，包括：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界，可以由Kabat、Chothia或Al-Lazikani的约定(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)定义或鉴定。重链或轻链的三个CDR插入在称为框架区(FR)的侧翼延伸之间，所述框架区是比CDR更高度保守的，并且形成一个支架以支撑高变环。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出多种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将其分类别。抗体的五个主要类别或同种型分别是：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要的抗体类别分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(Ig4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双链抗体(ds双链抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双链抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体，或与抗原结合但不包含完整的抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)结合的相同抗原结合。在一些实施方案中，所述抗原结合片段可包含一个或多个来自特定的人抗体的CDR，这些CDR从一种或多种不同的人抗体移植到框架区。
“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密且非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中产生了六个高变环(每个重链和轻链有3个环)，其为抗原结合提供了氨基酸残基，并赋予了抗体抗原结合特异性。但是，即使是单个可变结构域(或仅包含针对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)，也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接到单个多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，所述scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，使scFv能够形成所希望的结构以进行抗原结合。有关scFv的综述参见：Plückthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,269-315页(1994)。
术语“双链抗体”是指通常通过用VH和VL结构域之间的短接头(如约5至约10个残基)构建的scFv片段(参见前段)制备的小抗体片段，以实现V结构域的链间配对而不是链内配对，从而产生了双价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双链抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双链抗体更详细地描述于，例如：EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定的区已通过以下来描述：Kabat等,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等,美国卫生与人类服务部,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)，其中定义包括彼此相互比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义指代抗体或移植抗体或其变体的CDR，均应意在本文定义和使用的术语范围内。作为比较，在下表1中列出了包含由每个以上引用参考文献定义的CDR的氨基酸残基。CDR预测算法和界面是现有技术中已知的，包括例如，Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；以及Adolf-Bryfogle J.等,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。本段落中引用的参考文献的内容均通过引用以其整体并入本文以用于本发明，并可能在本文中包含在一个或多个权利要求中。
表1：CDR定义
Figure BDA0002914944290000141
1残基编号按照上述Kabat等的命名法
2残基编号按照上述Chothia等的命名法
3残基编号按照上述MacCallum等的命名法
4残基编号按照上述Lefranc等的命名法
5残基编号按照上述Honegger和Plückthun的命名法
表述“Kabat中的可变结构域残基编号”或“Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型，是指用于上述Kabat等中汇编的抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含更少或更多的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包括H2的残基52之后的单个氨基酸插入(按照Kabat，残基52a)和重链FR残基82之后的插入残基(例如按照Kabat，残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列的同源性区与“标准”Kabat编号序列进行比对，确定给定抗体的残基的Kabat编号。
除非本文另有说明，免疫球蛋白重链中的残基编号是上述Kabat等中EU索引的编号。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的CDR残基以外的可变结构域残基。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体，以及此类抗体的片段，只要它们表现出本发明所述的生物学活性(参见，美国专利号4,816,567；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
有关抗体或抗体部分的术语“半合成”意指，抗体或抗体部分具有一个或多个天然存在的序列，以及一个或多个非天然存在的(即，合成的)序列。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含源自非人抗体的最小序列。对于大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的高变区(HVR)的残基被来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种如具有所希望的抗体特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中找不到的残基。做出这些修饰以进一步完善抗体性能。一般而言，人源化抗体会基本上包含至少一个、通常两个可变结构域的所有域，其中所有或基本上所有的高变环都对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有FR都是人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还会包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于更多细节，参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“人抗体”是指具有与人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体，和/或已经使用本文公开的用于制备人抗体的任何技术制成的抗体。该人抗体的定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的多种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77页(1985)；Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。另参见，van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过以下制备人抗体：向经修饰的转基因动物施用所述抗原以产生对抗原刺激反应的这样的抗体，但其内源基因座已失能，例如，免疫的Xeno小鼠(关于XENOMOUSETM技术，参见例如，美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体，另参见例如，Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”或“同源性”被定义为，在比对序列后将任何保守取代视为序列同一性的一部分，候选序列中与被比较的多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域熟练技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在整个待比较序列的全长上达到最大比对所需的任何算法。但是，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE生成％氨基酸序列同一性(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004)。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较的序列的一个位置均被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子各自中的一个位置均被腺嘌呤占据时，则所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是由两个序列共享的匹配或同源位置数除以比较的位置数再乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配或同源，则所述两个序列为60％同源。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％同源性。一般而言，在将两个序列对齐时做出比较，以给予最大同源性。
术语“恒定区”是指相对于免疫球蛋白的另一部分(包含抗原结合位点的可变结构域)，具有更多保守氨基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)，以及轻链的CHL(或CL)结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可以根据其恒定结构域的氨基酸序列归类为两种明显不同的类型中的一种，分别称为κ和λ。
人IgG Fc区的“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)，通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
通常将“铰链区”定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列对齐。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“H2”结构域的“C2”)，通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域的唯一性在于，它与另一个结构域没有紧密配对。而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两条N连接的分支碳水化合物链。据推测，所述碳水化合物可提供域-域配对的取代，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称为“C2”或“H3”结构域)包括将残基C末端延伸至Fc区中的CH2结构域(即从约氨基酸残基341至抗体序列的C末端，通常在IgG的氨基酸残基446或447)。
本文的术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和可变Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，但通常将人IgG重链Fc区定义为从位置Cys226的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。可以去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统，残基447)，例如在抗体产生或纯化过程中，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸。因此，完整抗体的组成可包括去除了所有K447残基的抗体种群，没有去除K447残基的抗体种群，以及带有或没有K447残基的抗体混合物的抗体种群。适用于本文所述抗体的天然序列Fc区包括：人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体(γ受体)结合的抗体，其包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和替代性剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，其主要不同之处在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，M.
Figure BDA0002914944290000171
Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。有关FcR的综述参见：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；以及de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995))。其他FcR，包括那些在未来被确定的FcR，均由本文的术语“FcR”所涵盖。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体或抗体部分结合的抗原上特定的原子或氨基酸组。如果两个抗原或抗体部分表现出与抗原的竞争性结合，则它们可以结合抗原内相同的表位。
如本文所用，在等摩尔浓度的第一抗体部分存在下，当第一抗体部分抑制第二抗体部分的靶抗原结合至少约50％(如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中任一个)时，第一抗体部分与第二抗体部分“竞争”结合靶抗原，或反之亦然。在PCT公开号WO03/48731中描述了基于它们的交叉竞争“结合”抗体的高通量方法。
如本文所用，术语“特异性结合”，“特异性识别”和“对…具有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其为异源分子群(包括生物分子)存在下靶标存在的决定因素。例如，特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分，是相比与其它靶标的结合，以更大亲和力、亲合力，并且更容易和/或以更长持续时间结合该靶标的抗体或抗体部分。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫测定(RIA)测量的，抗体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合程度的约10％。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(KD)为：≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合在不同物种的蛋白中保守的蛋白表位。在一些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求仅有结合。抗体或抗原结合域的结合特异性，可以通过本领域已知的方法实验确定。此类方法包括但不限于：蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM测试和肽扫描。
“分离的”抗体(或构建体)是已经从其产生环境(例如天然或重组)的组分中鉴定、分离和/或回收的。优选地，分离的多肽与它的产生环境中的所有其他组分没有结合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子，是一种核酸分子，其是在产生它的环境中鉴定出至少一种与它通常相结合的杂质核酸分子并从中分离出来的。优选地，分离的核酸与所有与产生环境有关的组分没有结合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式，不同于自然界发现的形式或背景。因此，分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码编码本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括在通常包含核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外，或处在与其天然染色体位置不同的染色体位置。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，包括例如启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，则该核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该DNA可操作地连接至所述多肽的DNA。如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者，如果核糖体结合位点被定位从而促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。一般而言，“可操作地连接”意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的，以及在阅读阶段是连续的。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点进行连接来完成连接。如果不存在此类位点，则应按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合到其所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”、“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”、“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代的对象细胞及其后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并指引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“转化细胞”，其包括原始转化细胞及源自其的子代，而与传代次数无关。子代与亲本细胞中的核酸含量可以不完全相同，但可包含突变。在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体子代也包括在本文中。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是一种获得有益或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益或所希望的临床结果包括但不限于以下一个或多个结果：减轻由疾病引起的一种或多种症状，减少疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减慢疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，增加或改善生活质量，增加体重增长和/或延长生存期。还涵盖通过“治疗”来减少癌症的病理后果(诸如，例如，肿瘤体积)。本发明的方法考虑了这些治疗方面中任一个或多个。
术语“有效量”是指足以产生有益或所希望的结果的药剂的量。该术语还适用于通过本文所述的成像方法中任一种会提供图像以进行检测的剂量。具体剂量可根据以下一个或多个而变化：选择的特定药剂，随后的剂量方案，是否与其他化合物组合施用，施用时间，待成像的组织，以及在其中运载该试剂的身体递送系统。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于：人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是人。
应当理解，本文所述发明的实施方案包括“由...组成”和/或“基本上由...组成”的实施方案。
本文提及的“约”值或参数，包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，涉及“约X”的描述，包括“X”的描述。
如本文所用，提及“不是”值或参数，通常意指和表述“不是”该值或参数。例如，不是用于治疗X型癌症的方法，意指该方法用于治疗不是X型的癌症。
如本文所用，术语“约X-Y”的含义与“约X至约Y”相同。
如本文以及所附权利要求书中所用，除非上下文中另有明确规定，单数形式的“一个/种(a/an)”和/或“所述/该(the)”包括复数提及。
如本文所用，“缀合”是指两个缀合部分的特异性结合，其可以是共价的或非共价的结合。
II.成像方法
本申请一个方面提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布和/或表达水平的方法，其使用：(a)有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，以及(b)有效量的包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂。在一些实施方案中，该方法还包括用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。
在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；其中所述个体将被施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂。在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，所述个体已被施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；包括向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂。
在一些实施方案中，提供了确定PD-L1或PD-L1样配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合PD-L1或PD-L1样配体；(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定PD-L1或PD-L1样配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合PD-L1或PD-L1样配体；(b)随后向所述个体施用有效量的包含68Ga和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定PD-L1或PD-L1样配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合PD-L1或PD-L1样配体；(b)随后向所述个体施用有效量的包含68Ga和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3；(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3；(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂，其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3；(b)随后向所述个体施用有效量的包含68Ga和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂，其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且VH包含与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列；和VL包含与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列；(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素(如68Ga)和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂，其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分包含抗PD-L1 scFv，其包含SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素(如68Ga)和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂，其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO；以及(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物和/或所述抗体药剂包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时(例如，约2小时至约72小时，约3小时至约48小时)，施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)。在一些实施方案中，在以下时间施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)：在约1小时至约2小时，约2小时至约4小时，约4小时至约8小时，约8小时至约12小时，约12小时至约18小时，约18小时至约24小时，约24小时至约36小时，约36小时至约48小时，约48小时至约72小时，约72小时至约96小时。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、36、48、72或96小时内，施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后至少约1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、36、48、72或96小时，施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)。
本文所描述的抗体药剂和/或标签化合物(例如，放射性核素化合物)，可以通过多种途径施用于个体(如人)，包括例如：经静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透粘膜和透皮。
在一些实施方案中，所述抗体药剂的有效量为约0.1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，所述抗体药剂的有效量为约0.1mg/kg至约1mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg，约10mg/kg至约25mg/kg，约25mg/kg至约50mg/kg，约50mg/kg至约75mg/kg，约75mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，所述抗体药剂的有效量不少于约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg。在一些实施方案中，所述抗体药剂的有效量不超过约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg。
在一些实施方案中，所述放射性核素的有效量为约10uCi至约500uCi。在一些实施方案中，所述放射性核素的有效量是约10uCi至约25uCi，约25uCi至约50uCi，约50uCi至约75uCi，约75uCi至约100uCi，约100uCi至约125uCi，约125uCi至约150uCi，约150uCi至约175uCi，约175uCi至约200uCi，约200uCi至约250uCi，约250uCi至约300uCi，约300uCi至约350uCi，约350uCi至约400uCi，约400uCi至450uCi，约450uCi至约500uCi。在一些实施方案中，所述放射性核素的有效量不少于约10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500uCi。在一些实施方案中，所述放射性核素的有效量不超过10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500uCi。
在一些实施方案中，所述成像剂一旦形成，将在约10分钟至约7天内从所述个体清除。在一些实施方案中，在约1小时、3小时、6小时、12小时或24小时内清除所述成像剂。在一些实施方案中，在约2、3、4、5、6或7天内清除所述成像剂。
在一些实施方案中，在施用后约10分钟至约14天内，从所述个体清除所述抗体药剂。在一些实施方案中，在施用后约1小时、3小时、6小时、12小时或24小时内，从所述个体清除所述抗体药剂。在一些实施方案中，在施用后约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天内，清除所述抗体药剂。在一些实施方案中，在施用后至少约1小时、2小时、3小时、6小时、12小时或24小时，从所述个体清除所述抗体药剂。在一些实施方案中，在施用后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天，从所述个体清除所述抗体药剂。
在一些实施方案中，在施用后约10分钟至约7天内，从所述个体清除所述标签化合物。在一些实施方案中，在施用后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、21或24小时内，从所述个体清除所述标签化合物。在一些实施方案中，在约2、3、4、5、6或7天内，清除所述标签化合物。在一些实施方案中，在清除所述抗体药剂之前，清除所述标签化合物。在一些实施方案中，在清除所述抗体药剂之前至少约3、6、9、12、18小时，清除所述标签化合物。在一些实施方案中，在清除所述抗体药剂之前至少约1、2、3、4、5、6或7天，清除所述标签化合物。
在一些实施方案中，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素)后约30分钟至约1小时，约1小时至约2小时，约2小时至约3小时，约3小时至约4小时，约4小时至约6小时，约6小时至9小时，约9小时至约12小时，约12小时至约18小时，或约18小时至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素)后至少约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、9小时、12小时、18小时，进行成像。在一些实施方案中，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素)后30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、9小时、12小时、18小时内，进行成像。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述抗体药剂之前，向所述个体施用未与第一缀合部分连接的抗体部分
在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤。在一些实施方案中，所述个体患有恶性血液肿瘤。在一些实施方案中，所述个体患有传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物(例如人)。
本文所述方法可使用采用本领域公知的标记多肽进行成像的方法，以及任何此类已知方法。参见例如，Srivastava(编辑),Radiolabeled Monoclonal Antibodies forImaging and Therapy(Plenum Press 1988),Chase,"Medical Applications ofRadioisotopes,"in Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Gennaro等(编辑),624-652页(Mack Publishing Co.,1990),以及Brown,"Clinical Use of MonoclonalAntibodies,"in Biotechnology and Pharmacy227-49,Pezzuto等(编辑)(Chapman&Hall1993)。在一些实施方案中，非侵入性成像技术使用发射正电子的放射性核素(PET同位素)，例如能量约为511keV，如18F、68Ga、64Cu和124I。可以通过公知的PET扫描技术对此类放射性核素进行成像。另参见美国专利号6,953,567；9,884,131和国际专利申请公开号WO2016149188A1，以及Kim HY.等,(2018)PLoS ONE 13(3):e0192821，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，SPEC或PET成像与一种或多种其他非侵入性成像方法结合，这些方法可基于或不基于来自成像剂的信号。例如，PET可以与计算机断层扫描(CT)成像、磁共振成像(MRI)、化学发光成像或电化学发光成像结合。
本文所述的成像方法适用于检测低、中或高表达水平的免疫检查点配体。在一些实施方案中，所述成像方法提供了有关免疫检查点配体的表达水平和分布的动态信息。在一些实施方案中，在可能对其他检测方法如免疫组织化学(IHC)具有挑战性的情况下，所述成像方法能够检测免疫检查点配体。在一些实施方案中，例如，基于免疫组织化学(IHC)测定或其他测定，所述目标组织为免疫检查点配体阴性。可用于检测是否存在免疫检查点配体的分子测定，包括但不限于：基于聚合酶链反应(PCR)的测定，下一代测序(NGS)测定、杂交测定和ELISA。在一些实施方案中，所述目标组织具有低的免疫检查点配体表达水平。在一些实施方案中，所述目标组织仅在免疫细胞浸润时表达所述免疫检查点配体。
可以使用任何合适的剂量和施用途径向个体施用成像剂。施用途径是根据已知的和公认的方法，如以合适的方式通过单次或多次推注或输注一段时间，例如经皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内、关节内、肿瘤内或口服途径的注射或输注。确定适当的剂量或施用途径，应在普通技术人员的技能范围内。动物实验为确定人类诊断应用的有效剂量提供了可靠的指导。可以按照以下文献中建立的原则进行有效剂量的种间放大：Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等,编辑,Pergamon Press,NewYork 1989,42-46页。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述抗体药剂和/或所述标签化合物之前，在相同个体的目标组织中对所述成像剂进行成像。在一些实施方案中，所述方法还包括：将成像结果与在施用所述抗体药剂和/或所述标签化合物之前在相同个体或对照个体的目标组织中的相同成像剂的先前成像获得的结果进行比较。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂和/或所述标签化合物之前，约在100个小时内，例如约48小时、24小时、12小时、6个小时、2个小时或2个小时或立即，进行所述先前成像。在一些实施方案中，所述方法还包括，例如在本文所述的计算机系统中，分析两组结果。
诊断与治疗
本文所述方法可用于诊断，并作为伴随诊断方法来治疗与异常免疫反应相关的多种疾病和病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况与免疫缺陷有关。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
在一些实施方案中，提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；(b)随后向所述个体施用包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及(c)如果在目标组织中检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性，或者如果在目标组织中没有检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。
在一些实施方案中，提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；(b)随后向所述个体施用包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；以及(d)如果在目标组织中检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性，或者如果在目标组织中没有检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述抗体药剂。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述抗体药剂之前，向个体施用未与第一缀合部分连接的抗体部分。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定所述组织中免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括或还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自下组：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：664Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约8天(如约10分钟至约2小时，约1小时至约4小时，约4小时至约8小时，约8小时至约12小时，约12小时至约24小时，约24小时至约48小时，约2天至约5天，以及约5天至约8天中任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约400kDa(如不超过约350kDa、300kDa、250kDa、200kDa、150kDa)。在一些实施方案中，所述抗体部分至少为约80、100、150、200、250、300、350、400、450或500kDa。在一些实施方案中，所述抗体部分为约80-150、150-250、250-350、350-450，或大于450kDa。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体之间的结合对于免疫检查点配体具有KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自不同物种(例如，非人哺乳动物如小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH(例如，pH低于约6.5、6.0、5.5或5.0)是稳定的。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60℃、60-65℃或65-70℃中任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、双链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体时PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1 Fc)融合的scFv。
在一些实施方案中，提供了诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含抗PD-L1抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂；(b)随后向所述个体施用包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；以及(d)如果在目标组织中检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为PD-L1阳性，或者如果在目标组织中没有检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性；其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或含有最多约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或含有最多约5个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述抗体药剂。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述抗体药剂之前，向个体施用未与第一缀合部分连接的抗体部分。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括或还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1 Fc)融合的scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)使用任何本文所述的诊断方法诊断所述个体；和(b)如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体或其受体的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是免疫检查点配体或其受体的抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是特异性结合免疫检查点配体或其受体的放射性标记分子。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。
在一些实施方案中，提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向个体施用包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；(b)随后向所述个体施用包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；(d)如果在目标组织中检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性，或者如果在目标组织中没有检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性；以及(e)如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体或其受体的治疗剂(例如，所述免疫检查点配体或其受体的抑制剂，或特异性结合所述免疫检查点配体或其受体的放射性标记分子)。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定个体中所述组织中免疫检查点配体的表达水平。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述抗体药剂。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述抗体药剂之前，向个体施用未与第一缀合部分连接的抗体部分。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括或还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体选自下组：PD-L1、PD-L2、B7-H3、半乳凝素-9、CD80、CD86和ICOSL。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体部分在血清中的半衰期为约10分钟至约8天(如约10分钟至约2小时，约1小时至约4小时，约4小时至约8小时，约8小时至约12小时，约12小时至约24小时，约24小时至约48小时，约2天至约5天，以及约5天至约8天中任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分不超过约400kDa(如不超过约350kDa、300kDa、250kDa、200kDa、150kDa)。在一些实施方案中，所述抗体部分至少为80、100、150、200、250、300、350、400、450或500kDa。在一些实施方案中，所述抗体部分约为80-150、150-250、250-350、350-450，或大于450kDa。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体之间的结合对于免疫检查点配体具有KD为约9x10-10M至约1x10-8M(如约9×10-10至1×10-9，约1×10-9至2×10-9，约2×10-10至5×10-9，或约5×10-10至1×10-8)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或猴子)的免疫检查点配体交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH(例如，pH低于约6.5、6.0、5.5或5.0)是稳定的。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃(如约55-60℃、60-65℃或65-70℃中任一个)。在一些实施方案中，所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、双链抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2和VHH。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体时PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1 Fc)融合的scFv。
在一些实施方案中，提供了治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：(a)向所述个体施用包含抗PD-L1抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂；(b)随后向所述个体施用包含标签(例如，放射性核素)和第二缀合部分的标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像；(d)如果在目标组织中检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为PD-L1阳性，或者如果在目标组织中没有检测到成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性；以及(e)如果诊断出所述个体为PD-L1阳性，则向所述个体施用有效量的靶向PD-L1或PD-1(例如PD-L1或PD-1的抑制剂，如抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体，或特异性结合PD-L1或PD-1的放射标记分子)的治疗剂，其中所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或含有最多约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或含有最多约5个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述方法还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定所述组织中PD-L1的表达水平。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后立即施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述抗体药剂。在一些实施方案中，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用所述放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用所述抗体药剂之前，向个体施用未与第一缀合部分连接的抗体部分。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施例中，所述非侵入性成像技术包括或还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。在一些实施方案中，所述方法包括在一段时间内对所述个体进行成像。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述疾病或病况是癌症、感染、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段(如人IgG1 Fc)融合的scFv。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，所述个体患有癌症。所述癌症可包含非实体瘤(如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包含实体瘤。可使用本文所述方法诊断的示例性癌症包括但不限于：癌、胚细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶变、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。本文讨论的实体瘤或血液癌症包括但不限于：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肉瘤和癌如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌和黑素瘤。
根据美国联合癌症委员会(AJCC，American Joint Committee on Cancer)分期小组的要求，本文所述方法适用于所有时期(包括I、II、III、IV和IV期)的实体瘤或血液癌症。在一些实施方案中，所述实体瘤或血液癌症是：早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解期癌症。
在一些实施方案中，所述个体患有血液癌症。可以使用本文所述的方法诊断的示例性血液癌症包括但不限于：白血病、淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性非淋巴母细胞白血病(ANLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓样白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤。可以使用本文所述的方法诊断的示例性实体瘤，包括但不限于：结肠肿瘤、黑素瘤、肾脏肿瘤、卵巢肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤和胰腺肿瘤。
可以通过例如肿瘤消退、肿瘤重量或大小的缩小、进展时间、生存持续时间、无进展生存期、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白表达和/或活性来评价癌症治疗。可以采用确定治疗功效的方法，包括例如，通过放射性成像来测量响应。
在一些实施方案中，所述个体患有传染性疾病。所述感染可能是由病毒、细菌、原生动物或寄生虫引起的。示例性病原体包括但不限于：鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、无形体(Anaplasma)属、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、巴西钩虫(Ancylostoma braziliense)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、溶血隐秘杆菌(Arcanobacterium haemolyticum)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、曲霉(Aspergillus)属、星状病毒科(Astroviridae)、巴贝虫(Babesia)属、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、亨氏巴尔通体(Bartonella henselae)、BK病毒、人芽囊原虫(Blastocystis hominis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、疏螺旋体(Borrelia)属、疏螺旋体(Borrelia spp)、布鲁氏杆菌(Brucella)属、马来丝虫(Brugiamalayi)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和其他伯克霍尔德菌种、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、嵌杯病毒科(Caliciviridae)、弯曲杆菌(Campylobacter)属、白色念珠菌(Candida albicans)、念珠菌(Candida spp)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、CJD朊病毒、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、产气荚膜梭菌、梭菌(Clostridium spp)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、球孢子菌(Coccidioides spp)、冠状病毒、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、伯氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、克里米亚-刚果出血热病毒、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、隐孢子虫(Cryptosporidium)属、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、脆双核阿米巴(Dientamoebafragilis)、埃博拉病毒(EBOV)、棘球绦虫(Echinococcus)属、查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)、尤因埃立克体(Ehrlichia ewingii)、埃立克体(Ehrlichia)属、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、肠球菌(Enterococcus)属、肠病毒属、肠病毒、主要是柯萨奇A病毒和肠病毒71(E71)、表皮癣菌(Epidermophyton spp)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、O111和O157:H7、肝片吸虫(Fasciola hepatica)和大片吸虫(Fasciola gigantica)、FFI朊病毒、丝虫目(Filarioidea)总科、黄病毒(Flaviviruses)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、梭杆菌(Fusobacterium)属、白地霉(Geotrichum candidum)、肠贾第虫(Giardia intestinalis)、颚口线虫(Gnathostoma spp)、GSS朊病毒、瓜纳里多(Guanarito)病毒、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、亨尼帕病毒(Henipavirus)(Hendra virus Nipah virus,亨德拉病毒和尼帕病毒)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、人博卡病毒(HBoV)、人疱疹病毒6(HHV-6)和人疱疹病毒7(HHV-7)、人偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人副流感病毒(HPIV)、人T细胞白血病病毒1(HTLV-1)、日本脑炎病毒、JC病毒、胡宁(Junin)病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、金格杆菌(Kingella kingae)、肉芽肿杆菌(Klebsiella granulomatis)、克鲁(Kuru)朊病毒、拉沙热(Lassa)病毒、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、利什曼虫(Leishmania)属、细螺旋体(Leptospira)属、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、马秋博(Machupo)病毒、马拉色霉菌(Malassezia spp)、马尔堡(Marburg)病毒、麻疹病毒、横川后殖吸虫(Metagonimus yokagawai)、微孢子门(Microsporidia phylum)、传染性软疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和弥散性麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、福氏耐格原虫(Naegleria fowleri)、美洲板口线虫(Necator americanus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、星状诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、诺卡氏菌(Nocardia spp)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(流感)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、并殖吸虫(Paragonimus spp)、卫氏肺吸虫(Paragonimus westermani)、细小病毒B19、巴氏杆菌(Pasteurella)属、疟原虫(Plasmodium)属、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、鼻病毒、小蛛立克次氏体(Rickettsia akari)、立克次氏体(Rickettsia)属、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、裂谷热(RiftValley Fever)病毒、轮状病毒、风疹病毒、沙比亚(Sabia)病毒、沙门氏菌属、疥螨(Sarcoptes scabiei)、SARS冠状病毒、血吸虫(Schistosoma)属、志贺氏菌(Shigella)属、辛农布雷(Sin Nombre)病毒、汉坦病毒、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、葡萄球菌(Staphylococcus)属、葡萄球菌属、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、绦虫(Taenia)属、猪肉绦虫(Taenia solium)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、犬弓蛔虫(Toxocara canis)或猫弓蛔虫(Toxocara cati)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、旋毛虫(Trichinellaspiralis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛癣菌(Trichophyton spp)、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)、布鲁氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克鲁氏锥虫(Trypanosomacruzi)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、大天花病毒或小天花病毒、vCJD朊病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、霍乱弧菌、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、黄热病毒、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
在一些实施方案中，所述个体患有自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病，包括但不限于：白塞氏病(Behcet disease)、全身性红斑狼疮、多发性硬化(全身性硬皮病和进行性全身性硬皮病)、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎(结节性多动脉炎和显微镜下多血管炎)、主动脉炎综合征(高安动脉炎(Takayasu arteritis))、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、韦格纳肉芽肿、混合性结缔组织病、舍格伦综合征(Sjogren syndrome)、成年型Still病、变应性肉芽肿性脉管炎、过敏性脉管炎、科根综合征(Cogan's syndrome)、RS3PE、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛综合征、抗磷脂抗体综合征、嗜酸细胞性筋膜炎、与IgG4相关的疾病(例如，原发性硬化性胆管炎和自身免疫性胰腺炎)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化，主动脉炎综合征、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)、快速进行性肾小球肾炎、巨幼细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、格雷夫斯病(Graves'disease，甲状腺功能亢进症)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自身免疫性肾上腺功能不全、原发性甲状腺功能减退症、特发性阿狄森氏病(idiopathic Addison's disease，慢性肾上腺功能不全)、I型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、局部硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解、斑秃、白癜风、原田病、自身免疫性视神经病变、特发性无精子症、复发性流产和炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn's disease))。
在一些实施方案中，所述个体患有与异常免疫反应相关的代谢性疾病。示例性代谢性疾病，包括但不限于：炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮。
III.抗体药剂
本文还提供了包含特异性识别免疫检查点配体的抗体部分的抗体药剂，如PD-L1和PD-L1样配体。可以将此类抗体药剂和源自其的抗体部分并入上述方法和抗体药剂中。合适的抗体部分，包括但不限于：scFv、Fab、融合至Fc片段的scFv(本文也称为“scFv-Fc”)、融合至另一Fv片段的scFv(本文也称为“scFv-Fv”)。本文所述的抗体部分(包括抗PD-L1抗体药剂)可具有以下a)-h)部分所述特性中任一个或多个。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述scFv具有(从N末端到C末端)的构型：VL-L-VH或VH-L-VL，其中L是肽接头。在一些实施方案中，所述scFv是嵌合的、人的、部分人源化的、完全人源化的、或半合成的。
在一些实施方案中，所述scFv被工程化为具有增强的热稳定性。在一些实施方案中，所述scFv被工程化为具有约55-70℃的熔解温度，如约55-60℃中、60-65℃中或65-70℃中任一个。在一些实施方案中，所述scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。根据scFv的结构和顺序，通过在适当的位置将VH中的半胱氨酸和VL中的半胱氨酸工程化，可以将其他工程化的二硫键引入到scFv中。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含Fc片段。在一些实施方案中，所述抗体部分是与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述抗体部分包含通过肽接头与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含一个或多个突变以增加清除率或减少半衰期。例如，所述Fc片段可具有H310A和/或H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述Fc片段包含免疫球蛋白IgG重链恒定区，其含有铰链区(从Cys226开始)、IgG CH2结构域和CH3结构域。如本文所用，术语“铰链区”或“铰链序列”是指位于接头和CH2结构域之间的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含含有铰链区的Fc片段。在一些实施方案中，所述融合蛋白的Fc片段始于铰链区，并延伸至IgG重链的C末端。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含不含有铰链区域的Fc片段。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含Fc片段，其选自下组的Fc片段：来自IgG、IgA、IgD、IgD、IgE、IgM的Fc片段，及其组合和杂合物。在一些实施方案中，所述Fc片段源自人IgG。在一些实施方案中，所述Fc片段包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、或其组合、或杂合IgG的Fc区。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含IgG1的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含IgG4的CH2和CH3结构域。已知IgG4 Fc表现出比IgG1 Fc低的效应子活性，因此对于某些应用可以是理想的。在一些实施方案中，所述Fc片段源自小鼠免疫球蛋白。
在一些实施方案中，IgG CH2结构域始于Ala231。在一些实施方案中，CH3结构域始于Gly341。应该理解的是，人IgG的C末端Lys残基可以任选地不存在。还应该理解的是，本发明范围内考虑了不影响Fc所希望的结构和/或稳定性的Fc区的保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，每个Fc片段链都融合到相同的抗体部分上。在一些实施方案中，所述scFv-Fc包含两个相同的本文所述的scFv，其各自与Fc片段的一条链融合。在一些实施方案中，所述scFv-Fc是同源二聚体。
在一些实施方案中，所述scFv-Fc包含两个不同的scFv，其各自与Fc片段的一条链融合。在一些实施方案中，所述scFv-Fc是异源二聚体。所述scFv-Fc中不同多肽的异源二聚化可以通过本领域已知的方法来促进，包括但不限于，通过杵臼(knob-into-hole)技术进行异源二聚化。杵臼技术的结构和组装方法可参见例如，US5,821,333、US7,642,228、US2011/0287009和PCT/US2012/059810，其通过引用以其整体并入本文。这项技术的开发是通过以下步骤来实现的：在一个Fc的CH3结构域中将小的氨基酸残基替换为大的氨基酸残基来引入一个“杵”(或凸起)，以及在另一个Fc的CH3结构域中将一个或多个大的氨基酸残基替换为小的氨基酸残基来引入一个“臼”(或凹陷)。在一些实施方案中，所述融合蛋白中的Fc片段的一条链包含一个杵，而所述Fc片段的第二条链包含一个臼。
用于形成杵的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选为色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成杵的原始残基具有小的侧链体积，如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在CH3结构域中用于形成杵的示例性氨基酸取代，包括但不限于：T366W、T366Y或F405W取代。
用于形成臼的优选残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选地选自：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一个实施方案中，用于形成臼的原始残基具有大的侧链体积，如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。在CH3结构域中用于形成臼的示例性氨基酸取代，包括但不限于：T366S、L368A、F405A、Y407A、Y407T和Y407V取代。在某些实施方案中，所述杵包含T366W取代，以及所述臼包含T366S/L368A/Y407V取代。应该理解的是，本申请还考虑并涵盖了促进异源二聚化的现有技术中对已知Fc区的其他修饰。
考虑了其他scFv-Fc变体(包括分离的抗PD-L1 scFv-Fc的变体，例如全长抗PD-L1抗体变体)，其包含本文所述的任何变体(例如，Fc变体、效应子功能变体、糖基化变体、半胱氨酸工程化变体)或它们的组合。
a)抗体亲和力
所述抗体部分的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于：蛋白质印迹法、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIACORETM测试和肽扫描。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的KD为：约10-7M至约10-12M，约10-7M至约10-8M，约10-8M至约10-9M，约10-9M至约10-10M，约10-10M至约10-11M，约10-11M至约10-12M，约10-7M至约10-12M，约10-8M至约10-12M，约10-9M至约10-12M，约10-10M至约10-12M，约10-7M至约10-11M，约10-8M至约10-11M，约10-9M至约10-11M，约10-7M至约10-10M，约10-8M至约10-10M，或约10-7M至约10-9M。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的KD大于约以下任一个：10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是人类免疫检查点配体(例如，人PD-L1或PD-L1样配体)。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是食蟹猴免疫检查点配体(例如，食蟹猴PD-L1或PD-L1样配体)。在一些实施方案中，所述抗体部分特异性识别免疫检查点配体的胞外结构域中的表位，如SEQ ID NO:4的氨基酸19-238。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的Kon为：约103M-1s-1至约108M-1s-1，约103M-1s-1至约104M-1s-1，约104M-1s-1至约105M-1s-1，约105M-1s-1至约106M-1s-1，约106M-1s-1至约107M-1s-1，或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的Kon为：约103M-1s-1至约105M-1s-1，约104M-1s-1至约106M-1s-1，约105M-1s-1至约107M-1s-1，约106M-1s-1至约108M-1s-1，约104M-1s-1至约107M-1s-1，或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的Kon为：不超过103M-1s-1、104M-1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M-1s-1或108M-1s-1中任何一个。
在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的Koff为：约1s-1至约10-6s-1，约1s-1至约10-2s-1，约10-2s-1至约10-3s-1，约10- 3s-1至约10-4s-1，约10-4s-1至约10-5s-1，约10-5s-1至约10-6s-1，约1s-1至约10-5s-1，约10-2s-1至约10-6s-1，约10-3s-1至约10-6s-1，约10-4s-1至约10-6s-1，约10-2s-1至约10-5s-1，或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方案中，所述抗体部分与免疫检查点配体(例如，PD-L1或PD-L1样配体)之间的结合的Koff为：至少约1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中任何一个。
b)嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567中；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类发生了变化。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保持亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，以及FR(或其部分)源自人抗体序列。任选地，人源化抗体还会包括至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，所述HVR残基源自的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体的特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并进一步描述于例如，Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、US7,527,791、US6,982,321和US7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了针对FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区，包括但不限于：使用“最适合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；源自轻或重链可变区特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟的(体细胞突变的)框架区，或人类种系的框架区(参见例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及筛选框架区文库获得的框架区(参见例如，Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
c)人抗体
在一些实施方案中，所述抗体部分是人抗体(称为人结构域抗体或人DAb)。可以使用本领域已知的多种技术来产生人抗体。人抗体通常描述于，van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001),Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008),以及Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如，US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
可以通过向经过修饰的转基因动物施用免疫原来制备人抗体(例如人DAb)，以产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体以响应抗原刺激。此类动物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在这种转基因小鼠中，所述内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。有关从转基因动物中获取人抗体的方法综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。另参见例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0002914944290000481
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0002914944290000482
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0002914944290000483
技术的美国专利申请公开号2007/0061900。由此类动物产生的完整抗体的人可变区，可以被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区结合。
人抗体(例如人DAb)也可以通过基于杂交瘤的方法制成。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也描述于，Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括描述于以下文献中的那些方法，例如美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)，以及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)也描述于，Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
还可通过分离从人源噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体(例如，人DAb)。然后可以将这样的可变结构域序列与所希望的的人恒定结构域结合。下文描述了从抗体文库中选择人抗体的技术。
d)源于文库的抗体
可以通过筛选具有所希望的一种或多种活性的抗体的组合文库来分离抗体部分。例如，现有技术中已知多种方法用于生成噬菌体展示文库，以及筛选此类文库以获得具有所希望的结合特性的抗体。此类方法综述于例如，Hoogenboom等,Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等,编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)，以及还描述于例如，McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo,编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。已描述了构建单结构域抗体文库的方法，例如参见美国专利号7,371,849。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆了全部的VH和VL基因，并在噬菌体库中随机重组，可以针对抗原结合的噬菌体进行筛选，其描述于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常显示抗体片段，即scFv片段或Fab片段。来自免疫来源的文库为免疫原提供了高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以将原始库(
Figure BDA0002914944290000492
repertoire)(例如从人类)克隆出来，以将单一来源的抗体提供给多种非自身以及自身抗原而无需任何免疫，其描述于Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)。最后，还可以通过从干细胞中克隆未重排的V基因片段，并使用包含随机序列的PCR引物来合成原始文库，以对高度可变的CDR3区进行编码和实现体外重排，其描述于Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)。描述人抗体噬菌体文库的专利公开，包括例如：美国专利号5,750,373，以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
分离自人抗体文库的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
e)取代、插入、缺失和变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代性诱变的目标位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代显示于表2中“优选取代”的标题下。在表2中在“示例性取代”的标题下提供了“更多实质性变化”，并在下文提及氨基酸侧链类别时进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并筛选具有所希望的活性的产品，例如，保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表2：氨基酸取代
Figure BDA0002914944290000491
Figure BDA0002914944290000501
可根据常见的侧链特性对氨基酸进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代会需要将这些类别中一个类别的成员替换为另一个类别的成员。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体，相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的一些修饰(例如改善)(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)，和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是可以方便地生成的亲和力成熟的抗体，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，如本文所述的那些。简而言之，突变了一个或多个HVR残基，并在噬菌体上展示了抗体变体，并针对特定的生物学活性(例如结合亲和力)对其进行了筛选。
可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”中进行，即在体细胞成熟过程中以高频率进行突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)，并测试了所得变体的VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择的亲和力成熟，描述于例如，Hoogenboom等Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等,编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，容易出错的PCR、链改组或寡聚核苷酸定向诱变)中的任何，将多样性引入针对成熟所选择的可变基因中。然后创建一个二级文库。然后筛选文库以鉴定具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向的方法，其中随机分配了多个HVR残基(例如一次4-6个残基)。可以特异性鉴定涉及抗原结合的HVR残基，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模。具体地，CDR-H3和CDR-L3通常是靶向的。
在一些实施方案中，可在一个或多个HVR内发生取代、插入或缺失，只要这种改变不会大大降低抗体与抗原结合的能力。例如，可以在HVR中进行没有大大减少结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。此类改变可在HVR的“热点”或CDR之外。在上面提供的变体VHH序列的一些实施方案中，每个HVR都没有改变，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种可用于鉴定可被靶向以进行诱变的抗体残基或区的方法，称为“丙氨酸扫描诱变”，其描述于Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085。在该方法中，鉴定了残基或目标残基组(例如，带电荷残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)进行替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在氨基酸位置引入进一步的取代，以证明对初始取代的功能敏感性。或者，或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构可识别抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可作为候选取代被靶向或删除。可以筛选变体以确定它们是否包含所希望的的属性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有100个或更多残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。末端插入的实例包括带有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体，包括抗体的N或C末端与酶的融合物(例如用于ADEPT)，或增加抗体在血清中的半衰期的多肽。
f)糖基化变体
在一些实施方案中，所述抗体部分被改变以增加或减少所述构建体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列可以方便地在抗体上添加或缺失糖基化位点，从而创建或删除一个或多个糖基化位点。
如果抗体部分包含Fc区(例如scFv-Fc)，则可能改变与其附接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其通常通过N-连接到Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如，Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中与GlcNAc附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对所述抗体部分中的寡糖进行修改，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，所述抗体部分具有碳水化合物结构，其缺乏(直接或间接)与Fc区附接的岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖含量可为：1％至80％，1％至65％，5％至65％，或20％至40％。如通过MALDI-TOF质谱所测量的，相对于与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和，通过计算在Asn297处的糖链中岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量，这描述于例如WO2008/077546。Asn297是指位于Fc区约297位的天冬酰胺残基(EU编号的Fc区残基)；但是，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可能位于297位上游或下游的约±3个氨基酸处，即在294位至300位。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US2003/0157108(Presta，L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体有关的公开的实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系实例包括：蛋白岩藻糖基化不足的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1,Presta,L；以及WO2004/056312A1,Adams等,尤其是在实施例11)，以及敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
在一些实施方案中，所述抗体部分具有一分为二的寡糖，例如，其中通过GlcNAc将与所述抗体的Fc区附接的双触角寡糖一分为二。此类抗体变体可能减少了岩藻糖基化和/或改善了ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如，WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利号US6,602,684(Umana等)；以及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如，WO1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)。
g)Fc区变体
在一些实施方案中，可以在所述抗体部分的Fc区(例如scFv-Fc)中引入一个或多个氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位点含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在一些实施方案中，所述Fc片段具有一些但不是全部的效应子功能，这使其成为下述应用的理想候选者，其中抗体部分的体内半衰期很重要，但一些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害。可以在体外和/或体内进行细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/损失。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保所述抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞、NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcR的表达汇总于，Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)中第464页的表2。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例，描述于美国专利号US5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))，以及Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；US5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，也可以采用非放射性测定(参见例如，流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(Cell Technology,Inc.Mountain View,CA)；以及
Figure BDA0002914944290000531
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。可用于此类测定的效应细胞，包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者，或另外地，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在动物模型中，其诸如公开于Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)。还可以进行C1q结合测定，以确认所述抗体无法与C1q结合，并因此缺乏CDC活性。参见例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用现有技术中已知的方法，进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有减少的效应子功能的抗体，包括那些被取代了Fc区残基238、265、265、269、270、297、327和329中一个或多个的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中两个或更多个位置具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
描述了具有增强或减弱的与FcR结合的某些抗体变体(参见例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312，以及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，所述抗体部分包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，这些氨基酸取代改善了ADCC，例如，在Fc区的位置298、333和/或334的取代(EU编号的残基)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行了改变，其导致改变的(即改善或减弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，其描述于例如，美国专利号6,194,551、WO99/51642，以及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在一些实施方案中，所述抗体部分(例如，scFv-Fc)变体包含含有一个或多个氨基酸取代的Fc区变体，所述取代改变了半衰期和/或改变了与新生儿Fc受体的结合。具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)结合的抗体，负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))，其描述于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改变了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在一个或多个Fc区域残基具有取代的那些Fc变体，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
有关FC区域变体的其他实例，另参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
h)半胱氨酸工程化的抗体变体
在一些实施方案中，可期望产生半胱氨酸工程化的抗体部分，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体的实施方案中，所述取代的残基出现在所述抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代这些残基，由此将反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点，并可用于将抗体与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在一些实施方案中，以下残基中任一个或多个可以用半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照例如美国专利号7,521,541所述来生成半胱氨酸工程化的抗体部分。
i)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分可以进一步被修饰以包含现有技术中已知且容易获得的其他非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例，包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量的，也可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物数量可有所不同，如果附接有多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据考虑因素(包括但不限于：待改善的抗体的具体特性或功能，在确定的条件下该抗体衍生物是否会用于诊断，等)来确定用于衍生化的聚合物的数量和/或类型。
在一些实施方案中，可以进一步修饰抗体部分以包含一种或多种生物活性蛋白、多肽或其片段。本文中可互换使用的“生物活性的”或“生物学上活性的”意指在体内表现出生物活性以实现特定功能。例如，它可意味着与诸如蛋白质、DNA等特定生物分子的组合，然后促进或抑制了这种生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白或其片段包括作为活性药物施用于患者以预防或治疗疾病或病况的蛋白或多肽，和用于诊断目的的蛋白或多肽(如诊断测试或体外测定中使用的酶)，以及施用于患者以预防疾病的蛋白和多肽如疫苗。
IV.抗PD-L1抗体药剂
本申请一个方面提供了抗PD-L1抗体药剂，其包含抗PD-L1抗体部分或如第III部分所述的其任何变体。
在一些实施方案中，提供了一种抗PD-L1抗体药剂，其包含本文所述的抗PD-L1抗体部分中的任一种。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是全长抗体(例如，未附接缀合部分的全长抗体)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体药剂是一种抗体片段(例如未附接缀合部分的抗体片段)。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc片段(如IgG1 Fc片段)融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，提供了包含抗体部分的抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ IDNO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。
在一些实施方案中，提供了包含抗PD-L1 scFv的抗PD-L1抗体药剂，所述抗PD-L1scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv包含：SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，提供了包含抗体部分的抗PD-L1抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)在VH链区内分别含有CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中所述VH链区具有SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个所列的序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL链区内分别含有CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VL链区具有SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个所列的序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。
在一些实施方案中，提供了包含抗体部分的抗PD-L1抗体药剂(如分离的抗PD-L1抗体药剂)，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与抗PD-L1抗体其抗原结合片段竞争地、特异性结合PD-L1，其中所述抗PD-L1抗体其抗原结合片段包含VH和VL，其中：VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，提供了包含与Fc片段融合的抗PD-L1 scFv的抗PD-L1抗体药剂(如分离的抗PD-L1抗体药剂)，其中所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供了包含抗体部分的抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含VH和VL的抗PD-L1抗体竞争地、特异性结合PD-L1，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体药剂在血清中的半衰期为约10分钟至约8天。在一些实施方案中，所述抗体部分与所述免疫检查点配体之间的结合对于PD-L1具有KD为约9x10-10M至约1x10-8M。在一些实施方案中，所述抗体部分的分子量不超过约400kDa(如不超过约350kDa、300kDa、250kDa、200kDa、150kDa)。在一些实施方案中，所述抗体部分与来自非人哺乳动物的PD-L1交叉反应。在一些实施方案中，所述抗体部分是嵌合的、人源化的或完全人的。在一些实施方案中，所述抗体部分在酸性pH是稳定的。在一些实施方案中，所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃。在一些实施方案中，所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。考虑本文所述的双链抗体、三链抗体或四链抗体包括本文所述的任何抗体部分。在一些实施方案中，所述抗体部分具有选自下组以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。在一些实施方案中，所述Fc片段选自下组：IgG1 Fc片段、IgG2Fc片段、IgG3 Fc片段、IgG4 Fc片段、IgA Fc片段、IgM Fc片段、IgE Fc片段和IgD Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体药剂还包括本文所述的任何缀合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：TCO)-Tz对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
在一些实施方案中，提供了抗PD-L1抗体药剂(如分离的抗PD-L1抗体药剂)，其包含：a)含有与Fc片段融合的抗PD-L1 scFv的抗体部分，其中所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ IDNO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和2)能够在体内与第二缀合部分缀合的缀合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：反式-环辛烯(TCO)-四嗪(Tz)对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
在一些实施方案中，提供了一种抗PD-L1抗体药剂(如分离的抗PD-L1抗体药剂)，其包含：a)含有VH和VL的抗体部分，并且VH包含：SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；和2)能够在体内与第二缀合部分缀合的缀合部分。在一些实施方案中，所述缀合部分包含点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：反式-环辛烯(TCO)-四嗪(Tz)对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段具有H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含：SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的氨基酸序列。在一些实施方案中，
抗PD-L1抗体部分
本文所述的抗PD-L1抗体药剂包含与PD-L1特异性结合的抗体部分。考虑的抗PD-L1抗体部分包括，例如抗PD-L1 scFv、抗PD-L1 Fab、抗PD-L1 Fc融合蛋白(例如，与Fc融合的抗PD-L1 scFv)。本文所述的抗PD-L1抗体部分包括但不限于：人源化抗体、部分人源化抗体、完全人源化抗体、半合成抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体以及包含本文讨论的重链和/或轻链CDR的抗体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别PD-L1。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别人PD-L1。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别PD-L1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分特异性识别SEQ IDNO:49的氨基酸19-238的氨基酸序列内的表位。
SEQ ID NO:49人PD-L1序列
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含：i)重链可变结构域(VH)和ii)轻链可变结构域(VL)，并且VH包含：含有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HC-CDR3，或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中任一个)氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的LC-CDR3，或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个中任一个)氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO：43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO：41的氨基酸序列的HC-CDR1或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体，含有SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HC-CDR2或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体，以及含有SEQ ID NO：43的氨基酸序列的HC-CDR3或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的LC-CDR1或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体，含有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的LC-CDR2或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体，以及含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的LC-CDR3或包含最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个的任意)氨基酸取代的其变体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45和SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQID NO:1的氨基酸序列的VH中的1、2或3个CDR；以及VL包含：含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL中的1、2或3个CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含小鼠CDR和人FR序列。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ IDNO:15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9、11和13中任一个的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15、17和19中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:15具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:9的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:11的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ IDNO:13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含a)VH和b)VL，并且VH包含：SEQ ID NO:13的氨基酸序列；以及VL包含：SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
可以将重链和轻链可变结构域组合成多种成对的组合，以生成许多抗-nGPC3抗体部分。表3中提供了示例性的抗-nGPC3抗体。示例性的CDR、VH和VL序列是根据国际免疫遗传信息系统(INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION
Figure BDA0002914944290000661
(IMGT))来定界的。参见例如，Lefranc,MP等,Nucleic Acids Res.,43:D413-422(2015)，其公开的内容通过引用以其整体并入本文。那些熟练的技术人员会认识到，已知许多算法可用于预测抗体重链和轻链可变区中的CDR位置，而包含本文所述抗体的CDR的抗体药剂，但基于IMGT以外的预测算法，也在本发明的范围内。
表3：示例性的抗PD-L1抗体序列
Figure BDA0002914944290000671
Figure BDA0002914944290000681
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与本文所述的抗PD-L1抗体部分中任一种的第二抗PD-L1抗体部分竞争与靶标PD-L1结合。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与所述第二抗PD-L1抗体部分结合相同或基本相同的表位。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分与靶标PD-L1的结合抑制第二抗PD-L1抗体部分与PD-L1结合的至少约70％(如至少约75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中任一个)，或反之亦然。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分和第二抗PD-L1抗体部分相互竞争与靶标PD-L1结合，即每个抗PD-L1抗体部分与其他部分竞争与靶标PD-L1结合。
抗PD-L1 scFv
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分包含scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv具有(从N末端到C末端)的构型：VL-L-VH或VH-L-VL，其中L是肽接头。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv是嵌合的、人的、部分人源化的、完全人源化的或半合成的。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv被工程化而具有增强的热稳定性。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv被工程化而具有约55-70℃的熔解温度，如约55-60℃、60-65℃或65-70℃中任一个。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。基于所述scFv的结构和序列，通过在适当的位置对VH中的半胱氨酸和VL中的半胱氨酸进行工程化，可将其他工程化的二硫键引入抗PD-L1 scFv中。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含i)VH和ii)VL，并且VH包含：含有SEQ IDNO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个中任一个)氨基酸取代的其变体；以及VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR序列中含有最多约5个(如约1、2、3、4或5个中任一个)氨基酸取代的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv从N末端到C末端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv从N末端到C末端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，所述肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含一个或多个(如1、2、3或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含VH和VL，并且VH包含：SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体；以及VL包含：SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列，或与SEQID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv是人源化的。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv从N末端到C末端包含：VH、任选的肽接头和VL。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv从N末端到C末端包含：VL、任选的肽接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含肽接头，所述肽接头包含SEQ ID NO:47或48的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含一个或多个(如1、2、3，或更多个)工程化的二硫键。在一些实施方案中，所述抗PD-L1scFv在VH的第44位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第100位包含第二工程化的半胱氨酸残基；和/或在VH的第105位包含第一工程化的半胱氨酸残基，且在VL的第43位包含第二工程化的半胱氨酸残基；其中所述第一工程化的半胱氨酸残基和第二工程化的半胱氨酸残基形成二硫键，且其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37和39中任一个的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含His标记。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含与抗PD-L1 scFv部分的C末端融合的His标记。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv包含GGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:51)。表4显示了示例性的抗PD-L1scFv序列。
表4：示例性的抗PD-L1 scFv序列。
Figure BDA0002914944290000701
Figure BDA0002914944290000711
Figure BDA0002914944290000721
抗PD-L1 scFv-Fc
在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分是与Fc片段融合的根据本文所述抗PD-L1 scFv中任一种的抗PD-L1 scFv。在一些实施方案中，所述抗PD-L1抗体部分通过肽接头与Fc片段融合。抗PD-L1抗体部分可包含上文“抗体部分”部分中所述的任何Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段是人IgG1Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc片段包含一个或多个突变以增加清除率或减少半衰期。例如，所述Fc片段可具有H310A和/或H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
在一些实施方案中，所述Fc片段的每条链都与相同实体融合。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc包含两个相同的本文所述抗PD-L1 scFv，各自与Fc片段的一条链融合。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc是同源二聚体。在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc是异源二聚体。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1 scFv-Fc包含SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的其变体。表5中显示了示例性的抗PD-L1scFv-Fc序列。
表5：示例性的抗PD-L1 scFv序列。
Figure BDA0002914944290000722
Figure BDA0002914944290000731
PD-1
PD-1/PD-L1途径和抗PD免疫疗法
1992年首先从鼠科T细胞杂交瘤和经历经典细胞凋亡的造血祖细胞系中分离出编码程序性细胞死亡1(PD-1)的基因(Ishida Y,等The EMBO journal1992；11:3887-3895)。从结构上讲，作为CD28和CTLA4的同源物，PD-1是一种I型跨膜蛋白，并属于Ig超家族(Sharpe AH和Freeman GJ.Nature Reviews Immunology 2002；2:116-126)。通过使用不同小鼠模型的PD-1基因消融研究，显示了PD-1在负调节T细胞响应和维持外周耐受性中的关键作用。缺乏PD-1的小鼠在C57BL/6背景中发展为狼疮样自身免疫性疾病，原因是缺乏PD-1的T细胞针对同种异体抗原的增殖增强(Nishimura H等Immunity 1999；11:141-151)。在BALB/c中，但不是在免疫缺陷的BALB/c RAG2-/-背景中，PD-1敲除小鼠发展为扩张型心肌病，并因充血性心力衰竭而遭受猝死(Nishimura H等Science 2001；291:319-322)。后来鉴定了主要诱因之一是针对心脏特异性蛋白心脏肌钙蛋白I生成了高效价自身抗体(OkazakiT,等Nature medicine 2003；9:1477-1483)。在NOD(非肥胖糖尿病)的背景下，PD-1缺陷导致I型糖尿病早发，原因是胰岛特异性T细胞的加速增殖并浸润至胰岛中(Yantha J等Diabetes 2010；59:2588-2596)。总体而言，PD-1分子是一种涉及外周耐受的抑制性受体(Nishimura H,Honjo T.Trends in immunology 2001；22:265-268)。与CTLA-4不同，PD-1中基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)，而不是位于PD-1的胞质尾部的附近ITIM结构域，募集SHP-2磷酸酶并在TCR信号传导后逆转活化诱导的磷酸化(Ishida Y,等The EMBOjournal1992；11:3887-3895)。
几个研究对与PD-1相互作用的分子的发现做出了贡献。在1999年，B7同源物1(B7H1，后来的文献中也被称为程序性死亡配体-1[PD-L1])被鉴定为属于免疫球蛋白超家族的B7-CD28家族的290-氨基酸的I型跨膜糖蛋白，其在体外可作为人T细胞响应的负调节剂(Dong H等Nature medicine 1999；5:1365-1369)。一年后，显示PD-L1是PD-1的结合和功能的对应物(Freeman GJ等The Journal of experimental medicine 2000；192:1027-1034)。后来证明PD-L1缺陷型小鼠容易发生自身免疫疾病(Dong H等Immunity 2004；20:327-336)。值得注意的是，尽管PD-1和PD-L1的mRNA在许多细胞类型中均具有广谱表达，但它们都是可诱导的分子，因为它们的表达模式受转录后调控的严格控制。在静止的T细胞中未检测到PD-1蛋白，但在T细胞活化后24小时内细胞表面上发现了PD-1蛋白(Keir ME等Annual review of immunology 2008；26:677-704)。在正常生理条件下，PD-L1蛋白仅在周围组织中表达，如扁桃体、胎盘以及在肺和肝中的一小部分巨噬细胞样细胞(Dong H等Nature medicine 2002；8:793-800；Petroff MG等Placenta 2002；23Suppl A:S95-101)。PD-L1的外源性诱导主要是由促炎细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)介导的，这表明PD-1/PD-L1的相互作用在控制周围组织中炎症反应的方面起着重要的作用(Zou W,Chen L.Naturereviews Immunology 2008；8:467-477)。
除了PD-L1外，另外两个实验室独立地鉴定了另一个称为B7-DC(也称为PD-L2)的PD-1配体(Tseng SY等The Journal of experimental medicine 2001；193:839-846；Latchman Y,等Nature immunology 2001；2:261-268)。发现PD-L2在树突状细胞(DC)上有选择地表达，并且通过与PD-1的结合也负调节T细胞的响应。最近，还发现了PD-L2与排斥性导向分子家族成员b(RGMb)相互作用，该分子在肺巨噬细胞中高度富集，并可能需要诱导呼吸耐受(Xiao Y,等The Journal of experimental medicine 2014；211:943-959)。令人感兴趣的是，还发现PD-L1在活化的T细胞上具有另一种受体CD80来传递抑制信号，这也可能有助于在体内形成T细胞耐受性(Butte MJ等Immunity 2007；27:111-122；Park JJ等Blood2010；116:1291-1298)。目前，已知至少有5种相互作用分子参与了PD网络。因此，原始PD-1/PD-L1途径被重命名为更合适的“PD”途径。“针对PD-1的两种配体(PD-L1和PD-L2)和针对PD-L1的两种抑制性受体(PD-1和CD80)的存在，表明PD-1阻断或PD-L1阻断都不会完全破坏PD途径。完全废除PD抑制途径需要靶向两种分子的联合策略。
PD途径在调节对感染的炎性响应时外周组织中T细胞的活性并限制自身免疫的关键功能，似乎在慢性病毒感染期间被肿瘤细胞和病毒劫持。PD-L1在来自多种组织起源的许多新分离的人类肿瘤中被过表达(Dong等Nature Medicine 2002；8:793-800；Romano等Journal for Immunotherapy of Cancer2015；3:15；Hirano等Cancer Research 2005；65:1089-1096)。PD-L1的表达与某些类型的人类癌症的进展和不良预后相关(Wang等Europeanjournal of surgical oncology:the journal of the European Society of SurgicalOncology and the British Association of Surgical Oncology 2015；41:450-456；Cierna等Annals of oncology:official journal of the European Society forMedical Oncology/ESMO 2016；27:300-305；Gandini等Critical reviews in oncology/hematology 2016；100:88-98；Thierauf等Melanoma research 2015；25:503-509；Taube等Clinical cancer research:an official journal of the American Association forCancer Research 2014；20:5064-5074)。在慢性病毒感染期间，PD-L1在许多组织上持续表达，而PD-1在病毒特异性CTL中被上调(Yao等Trends in molecular medicine 2006；12:244-246)。肿瘤或病毒诱导的PD-L1可以利用多种机制来促进对宿主免疫监视的规避，包括T细胞无能、凋亡、耗竭、IL-10产生、DC抑制以及Treg诱导和扩增(Zou等Nature reviewsImmunology 2008；8:467-477)。
可以将PD途径介导的肿瘤免疫逃逸视为一种“适应性抵抗(adaptiveresistance)”模型(Chen等The Journal of clinical investigation 2015；125:3384-3391；Yao等European journal of immunology 2013；43:576-579)。具体而言，活化的肿瘤特异性T细胞到达肿瘤部位并成为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。识别同源抗原(cognateantigen)后，TIL产生IFN-γ，这在肿瘤微环境中的许多细胞类型中诱导PD-L1表达、包括DC、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和B淋巴细胞。与PD-1结合后，PD-L1向T细胞递送抑制信号，并向肿瘤细胞递送抗凋亡信号，导致T细胞功能障碍和肿瘤存活(Taube等Sciencetranslational medicine 2012；4:127ra137；Spranger等Science translationalmedicine 2013；5:200ra116)。该模型不仅受到基于IHC的观察的支持，即仅在与T细胞相邻的细胞中检测到细胞表面PD-L1表达，而且还得到了显示肿瘤部位中PD-L1表达与TIL存在密切相关的研究的支持(Gandini等Critical reviews in oncology/hematology 2016；100:88-98；Taube等Science translational medicine 2012；4:127ra137)，以及在小鼠肿瘤模型中证明IFN-γ是体内主要的PD-L1诱导剂(Dong等Nature medicine 2002；8:793-800)。PD途径介导的适应性抵抗假说支持以下观察，即甚至在强抗肿瘤免疫力下，大多数PD-L1+肿瘤也可以逃避免疫破坏。
根据“适应性抵抗”模型，将靶向PD途径的免疫疗法设计为阻断PD-1和PD-L1的相互作用，从而防止对抗肿瘤免疫的抵抗。即使PD-1的发现并没有导致其在抗肿瘤治疗中的应用，直到在肿瘤中发现了PD-L1的大量表达，才将PD途径与癌症治疗联系起来(Dong等Nature Medicine 1999；5:1365-1369)，目前，FDA已经批准了两种用于治疗人类癌症的PD-1单克隆抗体。这些是由Bristol-Myers Squibb(68)开发的
Figure BDA0002914944290000761
(也称为纳武单抗(nivolumab)、MDX-1106、BMS-936558和ONO-4538)，以及由默克公司(69)开发的
Figure BDA0002914944290000762
(也称为派姆单抗(Pembrolizumab)、兰利珠单抗(lambrolizumab)和MK-3475)。靶向PD-1或PD-L1的多种单克隆抗体正在接受涉及上千名患者的数百项临床试验的激烈评价。抗PD治疗生成了显著的临床效益，包括显著的肿瘤消退和生存率的实质性扩展。由于抗PD治疗通过在肿瘤部位的免疫调节来靶向肿瘤诱导的免疫缺陷，因此它可提供持久的功效、可耐受的毒性和广谱的癌症指征。抗PD免疫疗法的临床成功进一步验证了PD途径阻断作为一类独特的癌症疗法的有效性，该疗法不同于个性化或肿瘤类型特异的疗法。通过靶向已利用明确的免疫检查点途径来逃避免疫监视的肿瘤，抗PD免疫疗法已成为人类癌症(尤其是实体瘤)免疫疗法的中心平台。
PD-L1作为生物标志物在肿瘤部位的表达，以预测抗PD免疫疗法的功效
多种实体瘤在肿瘤内的对抗PD免疫疗法响应率与PD-L1表达水平之间呈正相关，包括黑素瘤、RCC、NSCLC、结直肠癌，以及几种恶性血液肿瘤如经典的霍奇金淋巴瘤。在黑素瘤临床试验中，通过IHC检测到的PD-L1过表达约占样本的45％至75％。在纳武单抗研究中，基于使用28-8抗体的5％截止值，45％的患者是PD-L1表达阳性。PD-L1阳性患者的响应率为44％，而PD-L1阴性患者的响应率为17％。接受纳武单抗治疗的PD-L1阳性黑素瘤患者的OS为21.1个月、PFS为9.1个月，而PD-L1阴性患者则分别为12.5个月和2个月。派姆单抗(Pembrolizumab)(抗PD-1)在使用IHC截止值为1％的晚期黑色素瘤中也进行了研究。PD-L1阳性患者(77％)的ORR为51％，而PD-L1阴性患者的ORR为6％。接受派姆单抗治疗的PD-L1阳性患者的PFS为12个月，且1年OS率为84％；而PD-L1阴性患者的PFS为3个月，且1年OS率为69％。
在NSCLC中也看到了类似的趋势，其中PD-L1阳性患者似乎优先受益于PD-1/PD-L1导向治疗。在难治性NSCLC的患者中研究了纳武单抗，并使用DAKO IHC测定进行PD-L1 IHC检测，截止值为5％。基于这些标准，将60％的患者归类为PD-L1阳性，PD-L1阳性患者的响应率为67％，而PD-L1阴性患者的响应率为0％。也已在NSCLC中研究了派姆单抗，并使用未报道的测定，针对PD-L1表达使用独特的50％IHC截止值。基于该截止值，25％的肿瘤为PD-L1阳性，在6个月时，PD-L1阳性患者具有67％免疫相关的ORR(irORR)、67％的PFS率和89％的OS率，相比之下PD-L1阴性患者具有0％的irORR，11％的PFS率和33％的OS率。还已在NSCLC中研究了MPDL3280A (一种抗PD-L1抗体)，使用具有0-3+分级的专有IHC平台(对>10％细胞为3+，对>5％细胞为2+，对<5％细胞为0-1)。具有3+的PD-L1表达得分的NSCLC患者的响应率为83％，相比之下具有2+或3+得分的患者为46％。具有1+/2+/3+PD-L1表达的患者的ORR为31％。
PD-L1 IHC作为一种预测性生物标志物，也已在涉及多种组织学的临床试验中进行了评估。纳武单抗I期研究包括患有黑素瘤、RCC、NSCLC、转移性结直肠癌(mCRC)和转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)的患者。使用5％的阈值通过5H1抗体检测到PD-L1，并且通过该标准，60％的肿瘤为阳性。PD-L1阳性肿瘤患者的响应率为36％，而PD-L1阴性肿瘤患者的ORR为0％。使用专有的PD-L1IHC平台，针对患有黑素瘤、RCC、NSCLC、mCRC和胃癌的患者研究了MPDL3280A。PD-L1阳性患者的响应率为39％，而PD-L1阴性患者的响应率为13％。
来自这些临床试验的数据似乎表明，根据IHC，PD-L1水平较高的患者似乎对PD-1/PD-L1导向治疗有优异的响应。然而，对于接受抗PD免疫疗法治疗的PD-L1阴性患者，有关其响应特性或生存结果却相对知之甚少。初步评价表明，选择患有黑素瘤的PD-L1阴性患者仍可对抗PD-1/PD-L1治疗获得持久的响应，而在PD-L1阴性的NSCLC患者中的响应则很少。如果该趋势在更大的试验中得到再现，则可能表示两种不同肿瘤类型之间免疫生物学的根本差异，或者可表示在不同组织类型中存在IHC的技术问题。在转移性膀胱尿路上皮癌的MPDL3280A的I期临床试验中，PD-L1阳性患者在12周时的ORR为52％，相比之下PD-L1阴性患者为11％。因此，PD-L1阴性患者反应的深度和持续时间仍有待观察。
V.制备方法和组合物(例如，多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、培养基)
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫检查点配体和/或标签化合物(例如，放射性核素化合物)的抗体药剂的方法，以及在制备所述靶向免疫检查点配体和/或标签化合物的抗体药剂的过程中产生的组合物，如多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、培养基。本文所述的抗体药剂和/或标签化合物(例如，放射性核素化合物)，可以通过以下一般性地描述并且在实施例中更具体地描述的众多方法来制备。
产生抗体药剂的方法
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫免疫检查点配体的抗体药剂的方法，其包括：使缀合部分与抗体部分接触，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)，由此提供所述抗体药剂。在一些实施方案中，所述缀合部分包含点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈(例如异氰化物)-四嗪对。在一些实施方案中，所述缀合部分是反式-环辛烯(TCO)或四嗪(Tz)。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物与抗体部分的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，所述缀合部分包含官能团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)。在一些实施方案中，所述缀合部分包含TCO。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子在所述缀合部分和抗体药剂之间。在一些实施方案中，所述间隔子是烷基间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子是PEG间隔子。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含约1-10、2-8、3-6个或约4个乙二醇单元。
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫免疫检查点配体的抗体药剂的方法，其包括：使本文所述PD-L1抗体部分与缀合部分接触，由此提供所述抗体药剂。在一些实施方案中，所述缀合部分包含点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈(例如异氰化物)-四嗪对。在一些实施方案中，所述缀合部分是反式-环辛烯(TCO)或四嗪(Tz)。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物与抗体部分的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，所述缀合部分包含官能团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)。在一些实施方案中，所述缀合部分包含TCO。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子在所述缀合部分和抗体药剂之间。在一些实施方案中，所述间隔子是烷基间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子是PEG间隔子。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含约1-10、2-8、3-6个或约4个乙二醇单元。
在一些实施方案中，提供了制备靶向免疫免疫检查点配体的抗体药剂的方法，其包括：使抗体部分(例如，scFv)与缀合部分接触，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ IDNO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；(b)使缀合部分与抗体部分接触以缀合，由此提供抗体药剂。在一些实施方案中，所述缀合部分包括点击化学对的成员。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈(例如异氰化物)-四嗪对。在一些实施方案中，所述缀合部分是反式-环辛烯(TCO)或四嗪(Tz)。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点配体是PD-L1样配体。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物与抗体部分的赖氨酸缀合。在一些实施方案中，所述缀合部分包含官能团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)。在一些实施方案中，所述缀合部分包含TCO。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子在所述缀合部分和抗体药剂之间。在一些实施方案中，所述间隔子是烷基间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子是PEG间隔子。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含约1-10、2-8、3-6个或约4个乙二醇单元。
制备标签化合物的方法
在一些实施方案中，提供了制备标签化合物的方法(例如，放射性核素化合物)，其包括：(a)将螯合化合物与本文所述缀合部分中任一个缀合以提供缀合部分缀合物；以及(b)使标签(例如，放射性核素)与所述缀合部分缀合物接触，由此提供标签化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述缀合部分可以通过点击化学在体内与第二缀合部分缀合。在一些实施方案中，所述缀合部分包含TCO或Tz。在一些实施方案中，所述缀合部分包含Tz。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子选自：烷基间隔子和PEG间隔子。在一些实施方案中，每个缀合部分(例如每个四嗪)与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个PEG间隔子连接。在一些实施方案中，每个缀合部分(例如每个四嗪)与约1-20、5-15、8-12或约10个PEG间隔子连接。
在一些实施方案中，提供了制备标签化合物(例如，放射性核素化合物)的方法，其包括：(a)使螯合化合物与标签(例如，放射性核素)接触；(b)使螯合标签(例如，放射性核素)的螯合化合物与本文所述缀合部分中任一种缀合，由此提供标签化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA、DOTA或其衍生物。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述缀合部分可以通过点击化学在体内与第二缀合部分缀合。在一些实施方案中，所述缀合部分包含TCO或Tz。在一些实施方案中，所述缀合部分包含Tz。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子选自：烷基间隔子和PEG间隔子。在一些实施方案中，每个缀合部分(例如，每个四嗪)与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个PEG间隔子连接。在一些实施方案中，每个缀合部分(例如，每个四嗪)与约1-20、5-15、8-12或约10个PEG间隔子连接。
在一些实施方案中，提供了制备放射性核素化合物的方法，其包括：a)(a)将螯合化合物与缀合部分缀合，以提供缀合部分缀合物，所述螯合化合物是DOTA，且其中所述缀合部分包含Tz；b)使68Ga与Tz部分缀合物接触，由此提供放射性核素化合物。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子选自：烷基间隔子和PEG间隔子。在一些实施方案中，每个缀合部分(例如，每个四嗪)与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个PEG间隔子连接。在一些实施方案中，每个缀合部分(例如，每个四嗪)与约1-20、5-15、8-12或约10个PEG间隔子连接。
标签化合物(例如，放射性核素化合物)
本申请的一个方面提供了标签化合物(例如，放射性核素化合物)，其包含标签(例如，放射性核素)和本文所述的缀合部分。本节中描述的标签化合物中任一种都可用于确定免疫检查点配体的分布和/或表达水平的方法，或本文所述的诊断或治疗方法。
在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物包含螯合放射性核素的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA。在一些实施方案中，所述缀合部分可在体内与第二缀合部分缀合。在一些实施方案中，所述缀合部分可以通过点击化学在体内与第二缀合部分缀合。在一些实施方案中，所述点击化学是基于逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)环加成反应，其中点击化学涉及应变烯烃与四嗪之间的偶联反应。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物的缀合部分包含或为反式-环辛烯(TCO)或四嗪(Tz)。在一些实施方案中，所述放射性核素化合物的缀合部分为Tz。所述Tz是6-甲基取代的四嗪(6-Me-四嗪)或6-氢取代的四嗪(6-H-四嗪)。在一些实施方案中，所述间隔子在所述缀合部分和标签之间。在一些实施方案中，所述间隔子是烷基间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子是PEG间隔子。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含约1-10、2-8、3-6个或约4个乙二醇单元。
放射性核素
本文所述的标签化合物包括标签。出于诊断目的，所述标签可以是放射性核素、放射造影剂、顺磁离子、金属、荧光标签、化学发光标签、超声造影剂和光敏剂。此类诊断标签是公知的，并且可以使用任何此类已知标签。
在一些实施方案中，所述标签化合物包含放射性核素。“放射性核素”通常被称为“放射性同位素(radioactive isotopes/radioisotopes)”。可与本文所述抗体部分连接的示例性放射性核素或稳定同位素，包括但不限于：110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr，或其他γ-、β-或正电子发射极。在一些实施方案中，所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45T。在一些实施方案中，所述放射性核素为68Ga。
使用的顺磁性离子可包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括：镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。不透射线的诊断剂可选自：化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。在本领域中已知各种各样的荧光标签，包括但不限于：荧光素异硫氰酸酯，若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺。使用的化学发光标签可包括：鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
放射免疫检测(RAID)在过去的35年中已成为临床上有用的领域。在这段时间里，已经进行了将近1000例使用RAID的临床试验，并且有一些明确和重要的发现。即使在早期研究中，这种技术检测被常规成像认为是“隐匿”病变的更大功能也得到了认可，并且无论抗体、肿瘤或放射性核素类型的研究都反复证实了这一技术。
许多放射性核素，如68Ga、99Tc、64Cu和18F，都是很好的成像剂选择。它们通常具有对安全成像而言理想的γ或β能量，并且价格便宜且易于获得，可以由发电机产生且无载流子。他们的半衰期短(少于6小时)容易使自己与抗体片段结合，以进行早期成像研究。
在一些实施方案中，所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)包含螯合标签(例如，放射性核素)的螯合化合物。在一些实施方案中，所述螯合化合物螯合放射性金属。在一些实施方案中，所述螯合化合物螯合金属18F。在一些实施方案中，所述螯合化合物是一种亲水性螯合化合物，其可以结合金属离子并有助于确保在体内的快速清除。可以根据其特定的金属结合性能选择合适的螯合化合物，并且通过已知的化学交联技术或通过使用具有侧链反应性基团的螯合剂(如双官能螯合化合物)的取代，仅采用常规实验就可以进行。
特别有用的金属螯合化合物组合，包括2-苄基-DTPA(二乙三胺五乙酸)及其单甲基和环己基类似物，在通常的能量范围60-4,000keV内与诊断同位素一起使用，如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99Tc、94Tc、11C、13N、15O、76Br，用于放射成像。当与非放射性金属(如锰、铁和钆)复合时，相同的螯合化合物可用于MRI。大环螯合化合物，如NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TETA(溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸)和NETA({4-[2-(双-羧甲基-氨基)-乙基]-7-羧甲基-[1,4,7]三唑烷-1-基}-乙酸)与多种诊断放射性金属(如镓、钇和铜)一起使用。通过根据目标金属量身定制环的尺寸，可以使这样的金属螯合复合物非常稳定。普通技术人员会理解，通过改变附接到大环结构(如NOTA)上的基团，对不同金属和/或放射性核素的结合特性和亲和力可以改变，因此，例如NOTA的这样的衍生物或类似物可以设计为结合本文讨论的任何金属或放射性核素。
DTPA和DOTA型螯合剂，其中所述配体包括硬碱螯合官能团如羧酸盐或胺基，对于螯合硬酸阳离子最有效，尤其是IIa组和IIIa组金属阳离子。可以通过根据目标金属量身定制环的尺寸来使这种金属螯合物非常稳定。其他环型螯合剂如大环聚醚对于稳定结合核素非常重要。卟啉螯合剂可与多种金属复合物一起使用。可以将一种以上类型的螯合剂与肽缀合以结合多种金属离子。螯合剂，如在美国专利号5,753,206中公开的那些，特别是硫代半卡巴腙基乙醛酰基半胱氨酸(Tscg-Cys)和硫代半卡巴嗪基-乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合剂，可有利地用于与软酸性阳离子Tc、Re、Bi结合，而其他过渡金属镧系元素和锕系元素则与软碱性配体紧密结合。其他硬酸性螯合剂如DOTA、TETA等可用于取代DTPA和/或TscgCys基团。
在一些实施方案中，所述螯合化合物包含可以与所述抗体部分缀合的官能团。在一些实施方案中，所述螯合化合物包含与所述抗体部分中的伯胺(-NH2)基团反应的官能团。伯胺存在于每个多肽链的N末端，并且在赖氨酸(Lys)氨基酸残基的侧链。可以与所述抗体部分的伯胺(如赖氨酸侧链)缀合的示例性官能团，包括但不限于：异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酰氯、醛类、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨基酯、碳二亚胺、酸酐和氟代苯基酯。这些官能团中的大多数通过酰化或烷基化与胺缀合。
在一些实施方案中，所述螯合化合物包含与所述抗体部分中的半胱氨酸侧链反应的官能团(即巯基)。示例性的巯基反应性基团，包括但不限于：卤代乙酰基、马来酰亚胺、环乙亚胺、丙烯酰基、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂。这些基团中的大多数通过烷基化(通常是硫醚键的形成)或二硫键交换(二硫键的形成)与巯基缀合。
在一些实施方案中，所述螯合化合物是NOTA，包括NOTA衍生物。在一些实施方案中，所述螯合化合物(例如，NOTA化合物)包含适合于与抗体部分缀合的官能团，例如通过氨基酸侧链，如赖氨酸和半胱氨酸。在一些实施方案中，所述成像剂包含与抗体部分缀合的NOTA。在一些实施方案中，所述NOTA化合物包含异硫氰酸酯(-SCN)基团。在一些实施方案中，所述NOTA化合物是p-SCN-Bn-NOTA。在一些实施方案中，所述螯合化合物包括与抗体部分中的赖氨酸残基缀合的NOTA，而NOTA与68Ga螯合。在一些实施方案中，首先将所述NOTA化合物用放射性金属如68Ga或18F-金属标记，然后与所述抗体部分缀合。
缀合部分
本申请的一个方面提供了可以整合到所述抗体药剂和/或标签化合物中的缀合部分。在一些实施方案中，整合到所述抗体药剂中的所述缀合部分(例如第一缀合部分)，能够在体内与整合到标签化合物(例如，放射性核素化合物)中的缀合部分(例如第二缀合部分)缀合。
在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分的缀合是非共价的。在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分的缀合是共价的。
在一些实施方案中，所述第一缀合部分和/或第二缀合部分各自包含与其他核酸互补的核酸。在一些实施方案中，所述核酸是DNA。在一些实施方案中，第一缀合部分和第二缀合部分通过DNA-DNA杂交彼此缀合。
在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分通过两个缀合部分之间的共价键缀合在一起。在一些实施方案中，所述第一缀合部分或第二缀合部分包含半胱氨酸残基、赖氨酸残基或酪氨酸残基。在一些实施方案中，基于半胱氨酸残基的结合(例如，通过二硫键)，所述第一缀合部分与第二缀合部分缀合。
在一些实施方案中，基于抗体-药物缀合，所述第一缀合部分与第二缀合部分缀合。
点击化学
在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分各包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。本文所述的点击化学对是两个化学部分，它们能够通过点击化学彼此完全反应。
在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈(例如异氰化物)-四嗪对。
在一些实施方案中，所述点击化学基于叠氮化物-炔烃惠斯更(Huisgen)环加成反应。在一些实施方案中，所述叠氮化物-炔烃惠斯更环加成反应是铜催化的。在一些实施方案中，所述叠氮化物-炔烃惠斯更环加成反应是无铜的。在一些实施方案中，所述缀合部分包含炔基的环状衍生物。在一些实施方案中，所述炔基的环状衍生物选自：环辛炔、二氟环辛炔和二苯并环辛炔。在一些实施方案中，所述点击化学是基于应变促进的叠氮化物的惠斯更环加成反应。在一些实施方案中，所述点击化学是基于应变烯烃的反应。
在一些实施方案中，所述点击化学基于施陶丁格-贝尔托西(Staudinger-Bertozzi)连接，其中所述点击化学涉及叠氮化物和磷化氢之间的偶联反应。
在一些实施方案中，所述点击化学基于逆电子需求的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)环加成反应，其中所述点击化学涉及在应变烯烃和四嗪之间的偶联反应。在一些实施方案中，所述缀合部分包含或为反式-环辛烯(TCO)或四嗪(Tz)。在一些实施方案中，所述第一缀合部分包含或为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分包含或为四嗪(Tz)。在一些实施方案中，所述第一缀合部分包含或为Tz，且所述第二缀合部分包含或为TCO。在一些实施方案中，所述Tz是6-甲基取代的四嗪(6-Me-四嗪)。在一些实施方案中，所述Tz是6-氢取代的四嗪(6-H-四嗪)。
在一些实施方案中，所述缀合部分(例如，四嗪)还包含间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子在所述缀合部分和抗体部分之间。在一些实施方案中，所述间隔子在所述缀合部分和标签之间。在一些实施方案中，所述间隔子是烷基间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子是PEG间隔子。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元。在一些实施方案中，所述PEG间隔子包含约1-20、5-15、8-12或约10个乙二醇单元。
抗体表达与产生
可以使用本领域中任何已知的方法制备本文所述的抗体部分，包括下文和实施例中描述的那些。
单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上均一的抗体群组中获得的，即包含该群组的单个抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)以外。因此，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以使用首先由Kohler等,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制成，或者可以由重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制成。在杂交瘤方法中，如上文所述，对小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠或美洲驼)进行了免疫以诱导淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生会特异性结合用于免疫的蛋白的抗体。或者，可以体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986)。对于骆驼中的免疫也可见实施例1。
免疫试剂通常会包括抗原蛋白或其融合变体。如果人类来源的细胞是所希望的，通常使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，如果非人哺乳动物来源的细胞是所希望的，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞。参见，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press(1986),59-103页。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将这样制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常会包括次黄嘌呤和氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们是阻止HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合，支持选定的抗体产生细胞稳定且高水平产生抗体，并对诸如HAT培养基敏感的细胞。在这些当中，优选的是鼠科骨髓瘤细胞系，如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些细胞系，这些肿瘤可获自美国加利福尼亚州圣迭戈市的Salk研究所细胞分布中心(Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)，以及SP-2细胞(及其衍生细胞，例如X63-Ag8-653)，这些细胞可获自美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va.USA)。还描述了人骨髓瘤和小鼠-人异型骨髓瘤细胞系以用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
针对所述抗原的单克隆抗体的产生，测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。优选地，通过免疫沉淀法或通过体外结合测定来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性，如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定。
可以针对所希望的抗原的单克隆抗体是否存在，测定杂交瘤细胞在其中培养的培养基。优选地，可以通过免疫沉淀法或通过体外结合测定来确定所述单克隆抗体的结合亲和力和特异性，如放射免疫测定(RIA)或酶联测定(ELISA)。这些技术和测定在现有技术中是已知的。例如，可以通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析来确定结合亲和力。
鉴定出杂交瘤细胞产生具有所希望的特异性、亲和力和/或活性的抗体后，可通过有限稀释程序将该克隆进行亚克隆，然后按标准方法(Goding，同上)生长。适用于此目的的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，所述杂交瘤细胞可作为肿瘤在哺乳动物体内生长。
由所述亚克隆分泌的单克隆抗体，通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和力层析，从培养基、腹水或血清中恰当地分离出来。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制成，例如美国专利号4,816,567中所述的方法，以及如上所述的方法。编码所述单克隆抗体的DNA，可使用常规方法进行分离和测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。分离后，可将DNA放入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或其他不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关在细菌中重组表达编码所述抗体的DNA的综述文章，包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)，以及Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，抗体可分离自使用McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术生成的抗体噬菌体文库。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体库分离鼠科和人抗体的方法。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建特大型噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))。因此，对于分离单克隆抗体，这些技术是传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选方案。
还可以通过例如用人重和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠科序列来修饰DNA(美国专利号4,816,567；Morrison,等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价结合到免疫球蛋白编码序列。通常将此类非免疫球蛋白多肽取代为抗体的恒定区，或将其取代为抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，所述嵌合二价抗体包含对一个抗原具有特异性的抗原结合位点和对一不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
本文所述的单克隆抗体可为单价的，其制备方法在现有技术中是公知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常在Fc区域的任何点截断重链，以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸残基取代或被缺失以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术实现消化抗体以产生其片段，尤其是Fab片段。
也可以使用合成蛋白化学中已知的方法，包括那些涉及交联剂的方法，在体外制备嵌合抗体或杂交抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例，包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚胺酸甲酯。
另外，关于单克隆抗体的产生参见实施例1。
编码抗体部分的核酸核酸分子(即多核苷酸)
本申请还提供了包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸编码本文所述的抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)的一条或多条链。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如抗PD-L1抗体部分)重链的多核苷酸和编码抗体部分轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸，而第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。在一些实施方案中，提供了编码scFv(例如抗PD-L1 scFv)的核酸分子。
在一些此类实施方案中，重链和轻链由一个核酸分子或两个独立的核酸分子表达为两个独立的多肽。在一些实施方案中，如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
在一些实施方案中，编码抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，所述前导序列在翻译时位于所述重链或轻链的N末端。如上文所述，前导序列可能是天然的重或轻链前导序列，或者可能是另一种异源前导序列。
可以使用本领域常规的重组DNA技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适合在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
载体
提供了包含编码本文所述抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)中任一种的重链和/或轻链的多核苷酸的载体。还提供了包含编码任意本文所述scFv(例如抗PD-L1 scFv)的多核苷酸的载体。这样的载体包括但不限于：DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，所述载体选自下组：载体、质粒、噬菌体、粘粒、S因子、逆转录因子、逆转录病毒、病毒、人工染色体(YAC、BAC或MAC)、微型染色体和染色体。
在一些实施方案中，载体包括编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述重链和轻链是从载体中表达为两个独立的多肽。在一些实施方案中，所述重链和轻链是作为单个多肽的一部分表达的，例如，当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，所述载体是表达载体。在一些实施方案中，含有编码本文所述多肽(或其活性衍生物或片段)的核酸序列的表达载体，与至少一个调控序列可操作地连接。许多表达载体都是可商购的，并且熟练的技术人员可以容易地制备其他合适的载体。“可操作地连接”是意图意指核苷酸序列以允许表达该核酸序列的方式与调节序列相连接。调节序列是本领域公认的，并被选择用于产生多肽或其活性衍生物或片段。因此，术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件，其描述于Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)。例如，可以使用天然调控序列或对生物体来说是天然的调控序列。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸，而第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体转染到具有相似量(如相似摩尔量或相似质量)的宿主细胞中。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体以5：1至1：5的摩尔比或质量比转染到宿主细胞中。在一些实施方案中，采用的编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1：1至1：5。在一些实施方案中，采用的编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1：2。
在一些实施方案中，选择了经优化以在CHO或CHO来源的细胞、或NSO细胞中表达多肽的载体。示例性的此类载体，描述于例如，Running Deer等,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
宿主细胞
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分(例如抗PD-L1抗体部分)可在原核细胞(如细菌细胞)中表达；或在真核细胞中如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。例如，可以根据本领域已知的方法进行这样的表达。可用于表达多肽的示例性真核细胞，包括但不限于：COS细胞，包括COS7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.
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细胞(Crucell)；以及NSO细胞。在一些实施方案中，可在酵母中表达本文所述的抗体部分(例如，抗PD-L1抗体部分)。参见例如，美国公开号US2006/0270045A1。在一些实施方案中，选择特定真核宿主细胞是基于其对抗体部分的重链和/或轻链进行所希望的翻译后修饰的能力。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽其具有高于293细胞产生的相同多肽的唾液酸化水平。
可通过任何方法将一种或多种核酸引入到所希望的宿主细胞中，包括但不限于：磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法，描述于例如，Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第三版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。可以根据任何合适的方法，将核酸瞬时或稳定地转染到所希望的宿主细胞中。
本发明还提供了包含本文所述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供了包含抗PD-L1抗体的宿主细胞。任何能够过表达异源DNA的宿主细胞都可用于分离编码目的抗体、多肽或蛋白的基因的目的。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例，包括但不限于：COS、HeLa和CHO细胞。另参见PCT公开号WO 87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞，包括原核生物(如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtillis))和酵母菌(如酿酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞。
在一些实施方案中，所述抗体部分是在无细胞系统中产生的。非限制性示例性无细胞系统，描述于例如，Sitaraman等,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)；Endo等,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)。
抗体部分的纯化
所述抗体部分(例如抗PD-L1抗体部分)可以通过任何适当的方法进行纯化。此类方法包括但不限于，亲和基质或疏水相互作用色谱法的使用。合适的亲和配体包括ROR1ECD和与抗体恒定区结合的配体。例如，可以将蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或抗体亲和柱用于结合恒定区，并纯化包含Fc片段的抗体部分。疏水性相互作用色谱，例如丁基或苯基色谱柱，也可适用于纯化某些多肽如抗体。离子交换色谱(例如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可能适用于纯化某些多肽如抗体。混合模式色谱法(例如，反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化一些多肽如抗体。在本领域中已知许多纯化多肽的方法。
多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞和培养基
多核苷酸
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的抗体药剂或抗体部分中任一种的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了使用本文所述方法中任一种所制备的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，所述RNA是mRNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18和20中任一个的核酸序列具有至少约80％(如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)的序列同一性的核酸序列。
核酸构建体
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何一种多核苷酸的核酸构建体。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的核酸构建体。
在一些实施方案中，所述核酸构建体还包含与所述多核苷酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述多核苷酸对应于一个基因，其中所述启动子是该基因的野生型启动子。
载体
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何核酸构建体的载体。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的载体。
在一些实施方案中，所述载体是表达载体。
在一些实施方案中，所述载体选自下组：质粒、噬菌体、粘粒、S因子、逆转录因子、逆转录病毒、病毒、人工染色体(例如，YAC、BAC或MAC)、微型染色体和染色体。
宿主细胞
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的载体。
在一些实施方案中，在发酵条件下，所述宿主细胞能够产生本文所述的任何抗体部分。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞。
培养基
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何抗体部分、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞的培养基。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何方法制备的培养基。
在一些实施方案中，所述培养基包含次黄嘌呤，氨基蝶呤和/或胸苷(例如HAT培养基)。在一些实施方案中，所述培养基不包含血清。在一些实施方案中，所述培养基包含血清。在一些实施方案中，所述培养基是D-MEM或RPMI-1640培养基。
VI.组合物、试剂盒和制品
本文中还提供了包含本文所述的抗体药剂(如抗PD-L1抗体药剂)和/或标签化合物(如放射性核素化合物)、编码所述抗体部分(如抗PD-L1抗体部分)的核酸、含有编码所述抗体部分的核酸的载体、或含有所述核酸或载体的宿主细胞中任一种的组合物(如制剂)。
本文所述的抗体药剂(如抗PD-L1抗体药剂)和/或标签化合物(如放射性核素化合物)的合适制剂，可以通过将所述抗体药剂(如抗PD-L1抗体药剂)和/或具有所希望的纯度的标签化合物(如放射性核素化合物)以及任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来获得(Remington's Pharmaceutical Sciences第16th版,Osol,A.编辑(1980))，其形式为冻干制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度对接受者无毒，并包含缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反荷离子如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801中描述了适合皮下施用的冻干制剂。可以使用适合的稀释剂将这些冻干制剂重构为高蛋白浓度，并且该重构制剂可以经皮下施用于本文中待成像、诊断或治疗的个体。
用于体内施用的制剂必须无菌。这可以通过例如无菌过滤膜的过滤来容易地完成。
还提供了包含本文所述抗体药剂(如抗PD-L1抗体药剂)和/或标签化合物(如，放射性核素化合物)中任一种的试剂盒。所述试剂盒可用于本文所述的任何成像、诊断和治疗方法。
在一些实施方案中，提供了包含特异性结合免疫检查点配体(例如PD-L1或PD-L1样配体)的抗体部分和缀合部分(例如TCO或Tz)的试剂盒。
在一些实施方案中，提供了包含含有标签(例如，放射性核素，例如68Ga)的标签化合物和缀合部分(例如TCO或T)的试剂盒。在一些实施方案中，所述缀合部分还包含螯合放射性核素的螯合剂(例如，NOTA、DOTA或其衍生物)。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含能够递送所述抗体药剂和/或标签化合物的装置。用于诸如非肠道递送应用的一类装置，是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。吸入装置也可用于某些应用。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于治疗疾病或病况的治疗剂，例如癌症、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。在一些实施方案中，所述治疗剂是免疫检查点配体或其受体的抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是特异性结合免疫检查点或其受体的放射性标记的分子。
本申请的试剂盒在合适的包装内。合适的包装，包括但不限于：小瓶、瓶子、罐子、柔性包装(例如，密封的聚脂薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其他组分如缓冲液和解释性信息。
因此，本申请还提供了制品。该制品可以包括容器以及在该容器上或与该容器结合的标签或包装插页。合适的容器包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、罐子、柔性包装等。一般而言，容器容纳有组合物，并可能具有无菌入口(例如，该容器可能是一个静脉输液袋或一个小瓶，其带有可通过皮下注射针刺穿的塞子)。所述标签或包装插页表明该组合物用于个体具体病况的成像、诊断或治疗。所述标签或包装插页还会包含用于将在该组合物施用于个体并用于对个体成像的说明。所述标签可表明重组和/或使用的方向。容纳该组合物的容器可为多种用途的小瓶，其允许重构制剂的重复施用(例如2-6次施用)。包装插页是指通常包含在诊断产品的商业包装中的说明，其中该说明包含有关使用此类诊断产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。此外，该制品还可包括第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可能还包括从商业和用户角度出发所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
所述试剂盒或制品可包括多个单位剂量的组合物和使用说明，并以足够存储和在药房使用的数量包装，例如，医院药房和配制复方的药房(compounding pharmacy)。
那些熟练的技术人员会认识到，在本发明的范围和精神内可以有几个实施方案。现在会参照以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实施例进一步示例说明了本发明，但是当然不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
VII.组合物的用途
本申请还提供了该组合物(例如本文所述的抗体药剂和/或标签化合物)用于本文所述的任何成像、诊断、治疗或其他方法的用途。
VIII.计算机系统
本申请还提供了用于促进本文所述的任何方法的计算机系统。在一些实施方案中，提供了一种计算机系统，其包括：输入单元，其接收来自用户的请求以确定个体中免疫检查点配体的分布；一个或多个可操作地连接到所述输入单元的计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：a)接收包含在个体的目标组织上的成像剂的信号的一组数据；b)以可读方式呈现数据或生成数据分析。
所述成像剂可以通过本文所述的任何方法产生。在一些实施方案中，所述成像剂是在以下步骤后通过第一缀合部分和第二缀合部分的缀合在体内产生的：i)将有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂施用到所述个体中，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体，和ii)随后将有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物施用于所述个体。本文考虑了所述抗体药剂和标签化合物可以是本文所述的任何抗体药剂和标签化合物。
在一些实施方案中，所述计算机系统还包括输出单元，用于向用户报告数据或分析。
本文所述的数据集可以代表任意数量的任何类型的文件，如文本文件、图像文件、音频/视频文件(如高清文件)等。所述文件可以是非压缩或压缩的。当未压缩文件时，可以先将其压缩，然后再转换为二进制字符串。例如，可以使用Lempel-Ziv-Markov链算法将文件压缩为LZMA文件(例如A.lzma)。在一些实施方案中，首先将两个或更多文件(例如，3、4、5、6个和更多个文件)组合在一起，例如，组合成一个TAR文件(例如A.tar)，并进一步将TAR文件压缩为LZMA文件(例如A.tar.lzma)。
在一些实施方案中，通过使用非侵入性成像技术对个体中的成像剂进行成像来获取数据集。在一些实施方案中，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)约30分钟至约24小时后，进行成像。例如，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)后约30分钟至约1小时，约1小时至约2小时，约2小时至约3小时，约3小时至约4小时，约4小时至约6小时，约6小时至约9小时，约9小时至约12小时，约12小时至约18小时，或约18小时至约24小时，进行成像。在一些实施方案中，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)后至少约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、9小时、12小时、18小时，进行成像。在一些实施方案中，在施用所述标签化合物(例如，放射性核素化合物)后30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、9小时、12小时、18小时内，进行成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，或正电子发射断层扫描(PET)成像。在一些实施方案中，所述非侵入性成像技术包括或还包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。
在一些实施方案中，所述分析包括将该数据集与第二数据集进行比较，所述第二数据集包含第二个体的第二目标组织中第二成像剂的信号。在一些实施方案中，涉及第二数据集的第二目标组织是与涉及第一数据集相同的目标组织。在一些实施方案中，所述第二个体与涉及第一数据集的个体是相同的个体。在一些实施方案中，通过使用本文所述的成像技术对第二个体进行成像来获得第二数据集。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂和/或标签化合物之前，对第二个体进行成像。在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂和/或标签化合物之前，约100小时内，例如，在约48小时、24小时、12小时、6小时或2个小时内，对第二个体进行成像。
在一些实施方案中，所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对成员，并通过点击化学彼此缀合。在一些实施方案中，所述点击化学对选自下组：TCO-Tz对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。在一些实施方案中，所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或者所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。
在一些实施方案中，在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述标签化合物。
在一些实施方案中，所述输出单元包括：文本输出；图像输出；音频输出；或其任何组合。
在一些实施方案中，所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
除非另有矛盾，其他地方描述的任何限制、特征、实施方案、定义、方法步骤、条件等也适用于该计算机系统。
示例性实施方案
实施方案1。包含抗体部分的抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
实施方案2。实施方案1所述的抗体药剂，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和/或b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方案3。实施方案1或2所述的抗体药剂，其中：a)VH包含与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列；和b)VL包含与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性的氨基酸序列。
实施方案4。实施方案3所述的抗体药剂，其中所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案5。包含抗体部分的抗体药剂，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含VH和VL的抗PD-L1抗体竞争地、特异性结合PD-L1，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和b)VL包含：含有SEQID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
实施方案6。实施方案1-5中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
实施方案7。实施方案1-6中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体部分具有选自下组以下的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
实施方案8。实施方案1-7中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。
实施方案9。实施方案8所述的抗体药剂，其中所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
实施方案10。实施方案1-9中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂还包含第一缀合部分，其中所述第一缀合部分能够与第二缀合部分在体内缀合。
实施方案11。实施方案10所述的抗体药剂，其中所述第一缀合部分包含点击化学对的成员。
实施方案12。实施方案11所述的抗体药剂，其中所述点击化学对选自下组：反式-环辛烯(TCO)-四嗪(Tz)对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
实施方案13。多核苷酸，其编码实施方案1-12中任一项所述的抗体药剂的抗体部分。
实施方案14。核酸构建体，其包含实施方案1所述的多核苷酸，任选地还包含与所述多核苷酸可操作连接的启动子。
实施方案15。载体，其包含根据实施方案14所述的核酸构建体。
实施方案16。宿主细胞，其包含：根据实施方案13所述的多核苷酸，实施方案14所述的核酸构建体，或实施方案15所述的载体。
实施方案17。培养基，其包含：根据实施方案1-9所述的抗体药剂的抗体部分，实施方案13所述的多核苷酸，实施方案14所述的核酸构建体，实施方案15所述的载体，或实施方案16所述的宿主细胞。
实施方案18。确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。
实施方案19。实施方案18所述的方法，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。
实施方案20。实施方案19所述的方法，其中所述点击化学对选自下组：TCO-Tz对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
实施方案21。实施方案19所述的方法，其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。
实施方案22。实施方案18-21中任一项所述的方法，其中在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。
实施方案23。实施方案18-22中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂的有效量为约0.1mg/kg至约100mg/kg。
实施方案24。实施方案18-23中任一项所述的方法，其中所述放射性核素的有效量为约10uCi至500uCi。
实施方案25。实施方案18-24中任一项所述的方法，其中在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时进行成像。
实施方案26。实施方案18-25中任一项所述的方法，还包括基于所述个体的目标组织中所述成像剂发出的信号，确定所述组织中所述免疫检查点配体的表达水平。
实施方案27。实施方案18-26中任一项所述的方法，其中在约10分钟至约7天内从所述个体清除所述成像剂。
实施方案28。实施方案18-27中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂在血清中的半衰期为约10分钟至约8天。
实施方案29。实施方案18-28中任一项所述的方法，其中所述抗体部分与所述免疫检查点配体之间的结合的KD为约9x10-10M至约1x10-8M。
实施方案30。实施方案18-29中任一项所述的方法，其中所述抗体部分的分子量不超过约400kDa。
实施方案31。实施方案18-30中任一项所述的方法，其中所述抗体部分与来自非人哺乳动物的免疫检查点配体交叉反应。
实施方案32。实施方案18-31中任一项所述的方法，其中所述抗体部分是人源化的。
实施方案33。实施方案18-32中任一项所述的方法，其中所述抗体部分在酸性pH是稳定的。
实施方案34。实施方案18-33中任一项所述的方法，其中所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃。
实施方案35。实施方案18-34中任一项所述的方法，其中所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
实施方案36。实施方案18-35中任一项所述的方法，其中所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。
实施方案37。实施方案36所述的方法，其中所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。
实施方案38。实施方案36或37所述的方法，其中所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
实施方案39。实施方案18-38中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点配体是PD-L1或PD-L1样配体。
实施方案40。实施方案18-39中任一项所述的方法，其中所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：a)VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和b)VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
实施方案41。实施方案18-40中任一项所述的方法，其中基于免疫组织化学(IHC)测定，所述目标组织为免疫检查点配体阴性。
实施方案42。实施方案18-41中任一项所述的方法，所述目标组织具有低的免疫检查点配体表达水平。
实施方案43。实施方案18-42中任一项所述的方法，其中所述目标组织仅在免疫细胞浸润时表达所述免疫检查点配体。
实施方案44。实施方案18-43中任一项所述的方法，还包括在一段时间内对所述个体进行成像。
实施方案45。实施方案18-44中任一项所述的方法，其中所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
实施方案46。实施方案45所述的方法，其中所述放射性核素是68Ga。
实施方案47。实施方案18-46中任一项所述的方法，其中所述放射性核素化合物包含螯合所述放射性核素的螯合化合物。
实施方案48。实施方案47所述的方法，其中所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。
实施方案49。实施方案18-48中任一项所述的方法，其中所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像或正电子发射断层扫描(PET)成像。
实施方案50。实施方案18-49中任一项所述的方法，其中所述非侵入性成像技术包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。
实施方案51。实施方案18-50中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
实施方案52。实施方案18-51中任一项所述的方法，其中所述放射性核素化合物是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
实施方案53。实施方案18-52中任一项所述的方法，其中所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
实施方案54。诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：使用实施方案18-53中任一项所述的方法确定所述个体中免疫检查点配体的分布；以及如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。
实施方案55。治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：使用实施方案54所述的方法诊断所述个体；以及如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体的治疗剂。
实施方案56。试剂盒，其包括：包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体；以及包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分能够在体内彼此缀合。
实施方案57。计算机系统，其包括：输入单元，其接收来自用户的请求以确定个体中免疫检查点配体的分布；一个或多个可操作地连接到所述输入单元的计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：接收包含在个体的目标组织上的成像剂的信号的一组数据，其中所述成像剂是在以下步骤后通过第一缀合部分和第二缀合部分的缀合在体内产生的：将有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂施用到所述个体中，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体，以及随后将有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物施用于所述个体；以可读方式呈现数据或生成数据分析。
实施例
以下实施例旨在纯粹作为本发明的示例，因此不应看作以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明仅以示例说明的方式而非以限制的方式提供。
实施例1：针对人PD-L1的单克隆抗体的制备和表征
免疫接种
将8-10周龄雌性PD-L1缺陷小鼠(H Dong等Immunity.2004Mar；20(3):327-36)在多个部位进行皮下免疫(s.c.)，使用200μl的乳剂，其包含100μg的hPD-L1mIg融合蛋白和完全弗氏佐剂(CFA)(Sigma-Aldrich)。每只动物均接受两次或三次乳剂加强，该乳剂包含以不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma-Aldrich)配制的相同浓度的hPD-L1mIg融合蛋白。每次免疫后两周从动物采集血样进行血清效价测试。在达到足够的效价后，通过腹膜内注射(i.p.)使动物接受PBS中60μg PD-L1mIg融合蛋白的加强注射。加强注射后5天，处死动物并无菌收获脾脏。
将整个脾脏离解为单细胞悬液。使用ACK缓冲液裂解红细胞。然后将脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(来自ATCC)以1：1的比例在50ml锥形离心管中混合。离心后，弃去上清液，并用50％聚乙二醇(Roche)诱导细胞融合。在HAT选择培养基中将融合细胞培养8-10天。使用ELISA分析上清液中内容物与hPD-1表达细胞结合的能力，并使用流式细胞分析进一步确认阳性克隆。使用限制性稀释技术对阳性杂交瘤进行5次亚克隆，以实现纯单克隆培养。
抗hPD-L1单克隆抗体的表征
抗hPD-L1单克隆抗体的结合特异性
通过流式细胞术(FACSVerse，BDBiosciences)，使用hPD-L1转染的CHO细胞(CHO/hPD-L1细胞)确定了抗hPD-L1 mAb的结合特异性。具体而言，将CHO/hPD-L1细胞与增加量的抗hPD-L1 mAb 5B7(0.06ng、0.125ng、0.25ng、0.5ng、1ng、2ng、4ng和100ng)一起在冰上孵育30分钟。在流式细胞分析之前，将细胞清洗并进一步与抗mIgG-APC(eBioscience)孵育。如图1A和1B所示，抗hPD-L1 mAb 5B7以剂量依赖性方式高特异性地与hPD-L1结合。
使用小鼠免疫球蛋白分型试剂盒(BDBiosciences)将单克隆抗体的同种型确定为IgG1κ。
物种交叉反应性
将用小鼠PD-L1(CHO/mPD-L1)转染的CHO细胞，用于评估抗hPD-L1mAb与小鼠PD-L1的物种交叉反应性。在流式细胞分析之前，将细胞与抗hPD-L1mAb一起孵育。图2A显示了抗hPD-L1 mAb与人PD-L1结合的特异性。如图2B所示，抗hPD-L1 mAb也与小鼠PD-L1结合。
产生抗hPD-L1抗体的杂交瘤细胞的测序
为了测序产生抗体的杂交瘤细胞，收集1×107杂交瘤细胞并用PBS洗涤。使用RNeasy小提试剂盒(Qiagen)从杂交瘤中提取mRNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成了RACE-Readyfirst-strand cDNA。逆转录后，以现成的cDNA为模板，通过试剂盒提供的5'通用引物(UPM)以及用小鼠IgG1重链可变区和轻链可变区序列设计的3'基因特异性引物(GSP1)，进行5'RACE PCR反应。通过凝胶电泳分析确定RACE产物。然后使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)，将PCR产物克隆到T载体中。转化后，通过测序分析验证质粒。使用VBASE2(worldwide wweb.vbase2.org)分析了重链可变区和轻链可变区的序列，并在表3中列出。
实施例2：抗hPD-L1抗体的人源化
抗hPD-L1抗体的人源化
基于来自抗hPD-L1杂交瘤细胞的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列，进行人源化。作为初始步骤，生成了包含亲本小鼠VH和VL序列的小鼠-人嵌合mAb、人IgG恒定区和人κ链。根据嵌合抗体的特征，设计并使用了3个VH和3个VL人源化序列，以生成9个人源化抗体。表3列出了嵌合和人源化抗hPD-L1抗体的VH和VL序列。
人源化抗hPD-L1抗体的表征
人源化抗hPD-L1抗体的结合活性
为了检查与亲本嵌合抗体相比，人源化抗体的结合活性，将CHO/hPD-L1细胞与经连续稀释的亲本嵌合抗体或人源化抗体一起孵育。采用流式细胞术分析了结合亲和力，结果显示与亲本嵌合抗体相比，一些人源化抗体与hPD-L1的结合亲和力较高；而与亲本嵌合抗体相比，其他人源化抗体与hPD-L1的结合亲和力类似或略低(图3)。
人源化抗hPD-L1抗体的结合亲和力和动力学
使用Biacore T200(GE Healthcare Life Science)，评估了人源化抗hPD-L1mAb和hPD-L1蛋白之间的结合亲和力和动力学。通过氨基偶联将hPD-L1mIg蛋白固定在传感器芯片CM5上。分别以1、2、4、8、16和32nM的浓度梯度注射亲本和人源化抗体。通过完全动力学分析确定结合动力学参数，包括缔合速率(Kon)、解离速率(Koff)和亲和常数(KD)。如表6所示，在亲本抗体和人源化抗体之间的缔合速率(Kon)没有显著差异。如表6和图4所示，解离速率(Koff)从最低到最高的抗体是：亲本(PA200)、H1+L2(H12)、H3+L2(H32)、H1+L1(H11)、H1+L3(H13)、H3+L1(H31)、H3+L3(H33)、H2+L2(H22)、H2+L1(H21)和H2+L3(H23)。如表6所示，亲和常数(KD)从最高到最低的抗体是：亲本、H1+L2、H3+L2、H3+L3、H3+L1、H2+L2、H1+L3、H1+L1、H2+L3和H2+L1。
表6：亲本抗体和人源化抗体的Kon、Koff和KD值
抗体 K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
抗PD-L1亲本 9.243E+5 1.180E-4 1.276E-10
抗PD-L1 HC1+LC1 8.686E+5 0.001200 1.381E-9
抗PD-L1 HC1+LC2 1.456E+6 8.114E-4 5.572E-10
抗PD-L1 HC1+LC3 1.100E+6 0.001430 1.301E-9
抗PD-L1 HC2+LC1 1.863E+6 0.004058 2.178E-9
抗PD-L1 HC2+LC2 2.049E+6 0.002515 1.227E-9
抗PD-L1 HC2+LC3 2.265E+6 0.004171 1.841E-9
抗PD-L1 HC3+LC1 1.250E+6 0.001464 1.171E-9
抗PD-L1 HC3+LC2 1.646E+6 0.001096 6.659E-10
抗PD-L1 HC3+LC3 1.461E+6 0.001465 1.003E-9
实施例3：抗hPD-L1 scFv-hFc抗体的制备和表征
scFv-hFc抗体的序列设计和合成
使用人源化抗hPD-L1抗体变体2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)生成scFv-hFc抗体。具体而言，所述重链和轻链由接头连接，其后是铰链序列(GACAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGCCCC,SEQ ID NO:50)和人免疫球蛋白IgG1 Fc部分(CH2-CH3区)。另外，将H310A(即从CAC到GCC)和H435Q(即从CAC到CAG)突变引入到CH2和CH3区中，以快速清除体内抗体(图5)。表5中显示了带有野生型CH2-CH3区(scFv-hFc Wt)和带有突变CH2-CH3区(scFv-hFc Mt)的scFv-hFc抗体的序列。
将scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt的DNA序列分别克隆到pcDNA3.3载体中，并用于瞬时转染ExPi293细胞。用蛋白G-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)纯化细胞培养上清液中的蛋白，以进行功能分析。
scFv-hFc抗体的表征
通过SDS-PAGE凝胶电穿孔，鉴定了抗hPD-L1 scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt抗体。如图所示6，在SDS-PAGE凝胶上已还原和未还原的条件下，均鉴定了scFv-hFc抗体。通过FACS检查，与亲本抗体相比，scFv-hFc抗体与hPD-L1的结合亲和力，其结果如图7所示。如柱状图所示，scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt均显示与亲本抗体相似的结合亲和力。与亲本抗体(抗PD-L1 IgG1)相比，scFv-hFc抗体(scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt)与hPD-L1的结合亲和力和动力学采用Fortebio Octet系统进行了进一步分析。参见图8。表7显示了抗PD-L1IgG1、抗PD-L1 IgG1-C52W(即具有IgG1 Fc区的C52W突变的抗PD-L1抗体)、scFv-hFc Mt和scFv-hFcWt的结合亲和力和动力学参数。
表7：抗hPD-L1 scFv-hFc和亲本对照抗体的结合动力学参数
样本 K<sub>D</sub>(M) K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>off</sub>(1/s) R<sup>2</sup>
抗PD-L1 IgG1 1.54E-11 1.77E+5 2.72E-5 0.9834
抗PD-L1 IgG1 C52W 3.40E-10 1.33E+5 4.53E-4 0.9732
抗PD-L1 scFv-hFc Wt 3.48E-10 6.98E+6 2.43E-4 0.97
抗PD-L1 scFv-hFc Mt 2.32E-10 1.66E+6 3.85E-4 0.9812
通过在体内注射scFv-hFc Wt和scFv-hFc Mt抗体，然后在注射后第1、2、3、4和6天测量scFv-Fc抗体和hIgH的血清效价，进行药代动力学研究。如图9A和9B所示，与scFv-hFcMt相比，scFv-hFc Wt显示抗体和hIgG的血清效价更高。
实施例4：68Ga-DOTA-Tz的标记
用0.1N HCl洗涤68Ga，得到3.8mCi/1mL68Ga。通过加入93μL 1.25M乙酸钠将pH值调整为4。测试了多种体积(0.5、2、5和15μL)的DOTA-(PEG)10-Tz(2mg/ml)，并将其添加到350μL68Ga中。将试剂在不同温度(25、37、60、80、100℃)下孵育10分钟。使用薄层色谱法(TLC)，采用0.1M柠檬酸钠作为分散溶液测量标记效率。
研究了温度对标记率的影响。分别在25℃、37℃、60℃、80℃或100℃的标记率为80％、80％、89％、99％和99％。图10显示了在100℃的代表性标记率。
还研究了多种体积的DOTA-(PEG)10-Tz对标记率的影响。在100℃使用0.5、2或5μL的DOTA-(PEG)10-Tz的标记率分别为97％、99％、100％。图11显示了在100℃2μL DOTA-(PEG)10-Tz的代表性标记率。
结论是100℃的孵育温度和2μL DOTA-(PEG)10-Tz是合适的标记条件。
实施例5：TCO与PD-L1 scFv-Fc的缀合
将体积为200μL的FMU-230B或FMU-220与250μL PBS缓冲液混合。然后将混合物装入Centricon管中，并以16000rpm的速度离心24分钟，然后将溶液浓缩至100μL的体积。加入体积为100μL的PBS，并将全部内容物转移到1.5mL离心管中。加入1μL NHS-(PEG)4-TCO(用6μLDMSO稀释)并混合，然后加入10μL 1M Na2CO3，并在37℃孵育60分钟。将内容物转移到装有200μL PBS的Centricon管中，并在16000rpm下离心24分钟。加入额外的350μL PBS，并在16000rpm下离心24分钟。添加体积为100μL的PBS，将内容物转移至1.5mL离心管中，并在4℃下储存。
当最初将FMU-230B或FMU-220与PBS缓冲液但不是其他缓冲液(如0.05M NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液)混合时，检测到TCO标记的FMU0220或FMU-230B与表达PD-L1(例如MC-38-B7H1)的细胞的结合。
68Ga-DOTA-Tz-TCO-PD-L1与MC-38-B7H1细胞的结合
将MC-38-B7H1和MC-38细胞在平板中以5x 105/ml的密度培养。第二天添加2μLTCO-PD-L1(含100μL TCO-FMU-220或TCO-FMU-230B的400μL PBS)，并在无血清的培养基中于37℃孵育1小时。然后加入1μL68Ga-Tz并孵育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤，并用200μL胰蛋白酶消化处理5分钟。将细胞悬浮于200μL PBS中，并用γ计数器对放射性进行定量。
在用68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-230B和68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-220处理的MC-38-B7H1细胞中，检测到68Ga-Tz放射性，但具有不同的特征。
在68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-230B处理下，检测到MC-38细胞的放射性很小(图12)，表明结合是由PD-L1特异性介导的。
在68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-220处理下，与MC-38细胞相比，还检测到MC-38-B7H1细胞上的明显更高的放射性，表明它们与PD-L1特异性结合(图13)。与68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-230B的结果比较时，观察到MC38-B7H1细胞上的放射性较低，而MC-38细胞上的放射性较高。这种降低的结合特异性可能是由于重复的FMU-220冻融引起的。
实施例6：68Ga-DOTA-Tz-TCO-PD-L1-ScFv-Fc的体内实时成像
胰蛋白酶消化后，培养并计数MC38-PD-L1细胞。将1×106个MC38-PD-L1细胞注入五只6-8周龄雌性小鼠的右腋窝中，并将1×106个MC38-PD-L1细胞注入到这些小鼠的左腋窝中。6天后，肿瘤直径达约0.5厘米，这时所述动物按如下所述接受TCO-FMU-220或TCO-FMU-230B。
I.68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-220的成像
A.预靶向3小时后
通过尾静脉用含50μL(约100μg)TCO-FMU-220的150μL PBS注射小鼠。3个小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠成像。可视化以下组织器官：膀胱、肾脏、肿瘤和心脏。在预靶向3小时后，右腋窝的肿瘤摄取量高。一些动物具有心脏成像并且在膀胱和/或肾脏中有相对高的摄取量。图14显示了60分钟和150分钟时的代表性图像。
B.预靶向24小时后
通过尾静脉用含50μL TCO-FMU-220的150μL PBS注射小鼠。24小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠成像。可视化以下组织器官：膀胱、肾脏、肿瘤和心脏。预靶向24小时后，右侧腋窝的肿瘤摄取量高。一些动物具有心脏成像并且在膀胱和/或肾脏中有相对高的摄取量。图15显示了60分钟和150分钟时的代表性图像。
C.预靶向48小时后
通过尾静脉用含150μL PBS中的50μL TCO-FMU-220的150μL PBS注射小鼠。然后48小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠成像。可视化以下组织器官：膀胱、肾脏、肿瘤和心脏。在预靶向48小时后，右侧腋窝的肿瘤摄取量高。一些动物具有心脏成像并在膀胱和/或肾脏中有相对高的摄取量。代表性图片显示60分钟时的摄取量高于150分钟时的摄取量。参见图16。
最终，可以在预靶向后的至少3-48小时内观察到TCO-FMU-220抗体的体内成像。一种合适的条件是将动物预靶向3-24小时，然后在68Ga-Tz注射后60分钟对动物成像。
II.68Ga-DOTA-Tz-TCO-FMU-230B的成像
A.预靶向3小时后
通过尾静脉用含50uL(约120ug)TCO-FMU-230B的150uL PBS注射小鼠。3小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠成像。可视化以下组织器官：膀胱、肾脏、肿瘤和心脏。代表性的图像如图17所示。在预靶向3个小时后，右腋窝的肿瘤摄取量更高(尤其是在动物#7中)。一些动物的心脏和肝脏有摄取(动物#8)。在一些动物中，膀胱的摄取量较高，其次是肾脏。动物#5和#6有药物渗漏。动物#6在60分钟时有淋巴结摄取。可以在150分钟的时间点清楚地看到肿瘤。
B.预靶向24小时后
通过尾静脉用含50uL TCO-FMU-230B的150uL PBS注射小鼠。24小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠成像。可视化以下组织器官：膀胱、肾脏、肿瘤和心脏。代表性图像如图18所示。预靶向24小时后，肿瘤摄取量高。一些动物具有心脏成像和高膀胱摄取，其次是肾脏。在60分钟时的成像比150分钟时的成像更为明显。由于小鼠#6死亡，没有图像。
C.预靶向48小时后
通过尾静脉用含50uL TCO-FMU-230B的150uL PBS注射小鼠。48小时后，将68Ga-Tz注入尾静脉。然后在注射后60分钟和150分钟对小鼠成像。可视化以下组织器官：膀胱、肾脏、肿瘤和心脏。代表性的图像如图19所示。预靶向48小时后，肿瘤的摄取量高。一些动物具有心脏成像，以及相对高的膀胱和肾脏摄取量。在60分钟时的成像比150分钟时的成像更为明显。由于小鼠#6死亡，没有图像。
最后，预靶向TCO-FMU-230B抗体3-48小时后，可以看到图像。一种合适的成像条件是将小鼠预靶向3-24小时，然后在注入68Ga-Tz后60分钟对小鼠成像。
总之，工程化了靶向人PD-L1的高亲和力、热稳定抗体和修饰的抗体样融合蛋白(scFv-Fc)，作为体内成像剂。它已成功与TCO缀合。通过标记68Ga-DOTA-Tz，TCO-PD-L1与表达PD-L1的细胞(例如MC-38-B7H1细胞)的结合可以通过体内实时成像来观察，并且PD-L1在个体中的分布可以成功地可视化。
序列表
<110> 大有华夏生物医药集团有限公司
<120> 用于成像的组合物和方法
<130> PD01251A
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<160> 51
<170> FastSEQ Windows版本4.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg cattggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
gtgcagctcg ccagtctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 3
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctctgggaga aagagtcact 60
ctcagttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120
gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc acatcgactt tagattctgg tgtcccaaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgctattt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgg 324
<210> 5
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 6
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg cattggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
gtgcagctcg ccagtctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagct 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccctctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcgga 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480
aacagcggcg ctctgaccag cggagtgcac accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtactccc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccctccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggaccc 720
agcgtgttcc tgttccctcc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg cacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcctc gggaggagca gtacaactcc 900
acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgctccca tcgagaagac catcagcaag 1020
gccaagggcc agccccggga gcctcaggtg tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg 1080
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gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
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<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc acatcgactt tagattctgg tgtcccaaaa 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tattctctca ccatcagcag ccttgagtct 240
gaagattttg cagactatta ctgtctacaa tatgctattt atccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 360
agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 600
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa 645
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gccccgaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccaa cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
gaggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccaa cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctca 357
<210> 15
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 16
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga tagagtcact 60
atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggtatca gcagaaaaaa 120
cgcctgatct acgccacatc gactttagat tctggtgtcc caagtaggtt cagtggcagt 180
gggtctggga cagattttac tctcaccatc agcagccttc agcctgaaga ttttgcaacc 240
tattactgtc tacaatatgc tatttatccg ctcacgttcg gtcaggggac caagctggag 300
atcaaacgg 309
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 18
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga tagagtcact 60
atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca 120
ggtaaggctc ctaaacgcct gatctacgcc acatcgactt tacagtctgg tgtcccaagt 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggacagat tatactctca ccatcagcag ccttcagcct 240
gaagattttg caacctatta ctgtctacaa tatgctattt atccgctcac gttcggtcag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgg 324
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 20
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga tagagtcact 60
atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa gctggtatca gcagaaacca 120
ggtaaggctc ctaaacgcct gatctacgcc acatcgactt tagattctgg tgtcccaagt 180
aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcagat tatactctca ccatcagcag ccttcagcct 240
gaagattttg caacctatta ctgtctacaa tatgctattt atccgctcac gttcggtcag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgg 324
<210> 21
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 22
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggc 360
agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc ggcgagggca gcaccaaggg cgacatccag 420
atgacccagt ctccatcctc cttatctgcc tctgtgggag atagagtcac tatcacttgt 480
cgggcaagtc aggaaattag tggttactta agctggcttc agcagaaacc aggtaaggct 540
cctaaacgcc tgatctacgc cacatcgact ttacagtctg gtgtcccaag taggttcagt 600
ggcagtaggt ctgggacaga ttatactctc accatcagca gccttcagcc tgaagatttt 660
gcaacctatt actgtctaca atatgctatt tatccgctca cgttcggtca ggggaccaag 720
ctggagatca aacgggacaa gacccacacc tgccctccct gccccgcccc cgagctgctg 780
ggcggaccca gcgtgttcct gttccctccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 840
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcctcg ggaggagcag 960
tacaactcca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgctcccat cgagaagacc 1080
atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag cctcaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 1140
gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 1260
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc 1320
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380
tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggataataa 1419
<210> 23
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Gln Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 24
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggc 360
agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc ggcgagggca gcaccaaggg cgacatccag 420
atgacccagt ctccatcctc cttatctgcc tctgtgggag atagagtcac tatcacttgt 480
cgggcaagtc aggaaattag tggttactta agctggcttc agcagaaacc aggtaaggct 540
cctaaacgcc tgatctacgc cacatcgact ttacagtctg gtgtcccaag taggttcagt 600
ggcagtaggt ctgggacaga ttatactctc accatcagca gccttcagcc tgaagatttt 660
gcaacctatt actgtctaca atatgctatt tatccgctca cgttcggtca ggggaccaag 720
ctggagatca aacgggacaa gacccacacc tgccctccct gccccgcccc cgagctgctg 780
ggcggaccca gcgtgttcct gttccctccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 840
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcctcg ggaggagcag 960
tacaactcca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tggcccagga ctggctgaac 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgctcccat cgagaagacc 1080
atcagcaagg ccaagggcca gccccgggag cctcaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 1140
gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 1260
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagtcc 1320
cggtggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccag 1380
tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggataataa 1419
<210> 25
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 26
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
caggttcagc tggtgcagtc tggggcagag gttaagaagc caggggcctc agtcaaggtg 60
tcctgcaagg cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gcctggagtg gatgggaagg attgatcctg cgaatgataa tactaaatat 180
gcccagaagt tccagggcag ggtcactata acagcagaca catccaccag cacagcctac 240
atggagctct ccagtctgag atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagagcgaag 300
aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggt 360
ggcggtggct ctggaggtgg tgggagcggt ggcggcggat ctgggggtgg cggaagcgac 420
atccagatga cccagtctcc atcctcctta tctgcctctg tgggagatag agtcactatc 480
acttgtcggg caagtcagga aattagtggt tacttaagct ggcttcagca gaaaccaggt 540
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accaagctgg agatcaaacg gggaggtggt gggtctcacc atcaccatca ccat 774
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<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
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Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
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Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
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Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln
180 185 190
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210 215 220
Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
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Leu Glu Ile Lys Arg
245
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<211> 768
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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aatttgttaa attactttga ctactggggc caaggcaccc ttgtcacagt ctcctcaggc 360
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
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Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 49
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
gacaagaccc acacctgccc tccctgcccc 30
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
1 5 10

Claims (57)

1.一种抗体药剂，其包含抗体部分，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a)所述VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和
b)所述VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
2.根据权利要求1所述的抗体药剂，其中：
a)所述VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和/或
b)所述VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的抗体药剂，其中：
a)所述VH包含与SEQ ID NO:1、5、9、11和13中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列；和
b)所述VL包含与SEQ ID NO:3、7、15、17和19中任一个的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体药剂，其中所述抗体部分包含与SEQ ID NO:21或23的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。
5.一种抗体药剂，其包含抗体部分，其中所述抗体部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含VH和VL的抗PD-L1抗体竞争地、特异性结合PD-L1，其中：
a)所述VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的HC-CDR1，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3；和
b)所述VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的LC-CDR1，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体部分具有选自下组的同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。
9.根据权利要求8所述的抗体药剂，其中所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体药剂，其中所述抗体药剂还包含第一缀合部分，其中所述第一缀合部分能够在体内与第二缀合部分缀合。
11.根据权利要求10所述的抗体药剂，其中所述第一缀合部分包含点击化学对的成员。
12.根据权利要求11所述的抗体药剂，其中所述点击化学对选自下组：反式-环辛烯(TCO)-四嗪(Tz)对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
13.一种多核苷酸，其编码权利要求1-12中任一项的抗体药剂的抗体部分。
14.一种核酸构建体，其包含权利要求1所述的多核苷酸，任选地还包含与所述多核苷酸可操作连接的启动子。
15.一种载体，其包含权利要求14所述的核酸构建体。
16.一种宿主细胞，其包含：权利要求13所述的多核苷酸，权利要求14所述的核酸构建体，或权利要求15所述的载体。
17.一种培养基，其包含：权利要求1-9所述的抗体药剂的抗体部分，权利要求13所述的多核苷酸，权利要求14所述的核酸构建体，权利要求15所述的载体，或权利要求16所述的宿主细胞。
18.一种确定免疫检查点配体在个体中的分布的方法，其包括：
(a)向所述个体施用有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体；
(b)随后向所述个体施用有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和所述第二缀合部分在体内彼此缀合以提供成像剂；以及
(c)用非侵入性成像技术对所述个体中的成像剂进行成像。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分各自包含点击化学对的成员，并通过点击化学彼此缀合。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述点击化学对选自下组：TCO-Tz对、叠氮化物-炔烃对、炔烃-硝酮对、烯烃-四唑对和异腈-四嗪对。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一缀合部分为反式-环辛烯(TCO)，且所述第二缀合部分为四嗪(Tz)；或所述第一缀合部分为Tz，且所述第二缀合部分为TCO。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中在施用所述抗体药剂后约1小时至约100小时，施用所述放射性核素化合物。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂的有效量为约0.1mg/kg至约100mg/kg。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述放射性核素的有效量为约10uCi至500uCi。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中在施用所述放射性核素化合物后约30分钟至约24小时进行成像。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，还包括基于由所述成像剂从所述个体的目标组织中发出的信号，确定所述组织中所述免疫检查点配体的表达水平。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中在约10分钟至约7天内从所述个体清除所述成像剂。
28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂在血清中的半衰期为约10分钟至约8天。
29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述抗体部分与所述免疫检查点配体之间的结合的KD为约9x10-10M至约1x10-8M。
30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述抗体部分的分子量不超过约400kDa。
31.根据权利要求18-30中任一项所述的方法，其中所述抗体部分与来自非人哺乳动物的免疫检查点配体交叉反应。
32.根据权利要求18-31中任一项所述的方法，其中所述抗体部分是人源化的。
33.根据权利要求18-32中任一项所述的方法，其中所述抗体部分在酸性pH是稳定的。
34.根据权利要求18-33中任一项所述的方法，其中所述抗体部分的熔解温度(Tm)为约55-70℃。
35.根据权利要求18-34中任一项所述的方法，其中所述抗体部分选自下组：单链Fv(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合物、scFv-Fc融合物、scFv-Fv融合物、双链抗体、三链抗体和四链抗体。
36.根据权利要求18-35中任一项所述的方法，其中所述抗体部分包含与Fc片段融合的scFv。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述Fc片段是人IgG1 Fc片段。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述Fc片段包含H310A和H435Q突变，其中氨基酸位置基于Kabat编号系统。
39.根据权利要求18-38中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点配体是PD-L1或PD-L1样配体。
40.根据权利要求18-39中任一项所述的方法，其中所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
a)所述VH包含：含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链互补决定区1(HC-CDR1)，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HC-CDR3，或在HC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体；和
b)所述VL包含：含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC-CDR1)，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的LC-CDR2，以及含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的LC-CDR3，或在LC-CDR中含有最多总数约5个氨基酸取代的其变体。
41.根据权利要求18-40中任一项所述的方法，其中基于免疫组织化学(IHC)测定，所述目标组织为免疫检查点配体阴性。
42.根据权利要求18-41中任一项所述的方法，所述目标组织具有低的免疫检查点配体的表达水平。
43.根据权利要求18-42中任一项所述的方法，其中所述目标组织仅在免疫细胞浸润时表达所述免疫检查点配体。
44.根据权利要求18-43中任一项所述的方法，还包括在一段时间内对所述个体进行成像。
45.根据权利要求18-44中任一项所述的方法，其中所述放射性核素选自下组：64Cu、18F、67Ga、68Ga、111In、177Lu、90Y、89Zr、61Cu、62Cu、67Cu、19F、66Ga、72Ga、44Sc、47Sc、86Y、88Y和45Ti。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述放射性核素是68Ga。
47.根据权利要求18-46中任一项所述的方法，其中所述放射性核素化合物包含螯合所述放射性核素的螯合化合物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述螯合化合物为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物。
49.根据权利要求18-48中任一项所述的方法，其中所述非侵入性成像技术包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像或正电子发射断层扫描(PET)成像。
50.根据权利要求18-49中任一项所述的方法，其中所述非侵入性成像技术包括计算机断层扫描成像、磁共振成像、化学发光成像或电化学发光成像。
51.根据权利要求18-50中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
52.根据权利要求18-51中任一项所述的方法，其中所述放射性核素化合物是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或口服施用的。
53.根据权利要求18-52中任一项所述的方法，其中所述个体患有实体瘤、恶性血液肿瘤、传染性疾病、自身免疫性疾病或代谢性疾病。
54.一种诊断患有疾病或病况的个体的方法，其包括：
(a)使用权利要求18-53中任一项所述的方法确定所述个体中免疫检查点配体的分布；和
(b)如果在目标组织中检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阳性；或者如果在目标组织中未检测到所述成像剂的信号，则将所述个体诊断为免疫检查点配体阴性。
55.一种治疗患有疾病或病况的个体的方法，其包括：
(a)使用权利要求54所述的方法诊断所述个体；和
(b)如果诊断出所述个体为免疫检查点配体阳性，则向所述个体施用有效量的靶向所述免疫检查点配体的治疗剂。
56.一种试剂盒，其包括：
(a)包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂，其中所述抗体部分特异性结合免疫检查点配体；和
(b)包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物，其中所述第一缀合部分和第二缀合部分能够在体内彼此缀合。
57.一种计算机系统，其包括：
输入单元，其接收来自用户的请求以确定个体中免疫检查点配体的分布；
一个或多个可操作地连接到所述输入单元的计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独或共同编程为：
a)接收包含在个体的目标组织上的成像剂的信号的一组数据，其中所述成像剂是在以下步骤后通过第一缀合部分和第二缀合部分的缀合在体内产生的：
i.将有效量的包含抗体部分和第一缀合部分的抗体药剂施用于所述个体，其中所述抗体部分特异性结合所述免疫检查点配体，和
ii.随后将有效量的包含放射性核素和第二缀合部分的放射性核素化合物施用于所述个体；
b)以可读方式呈现数据或生成数据分析。
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