BR112021011771A2 - Rna que codifica uma proteína - Google Patents

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Justin Antony SELVARAJ
Hervé SCHAFFHAUSER
Friedrich Metzger
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Versameb Ag
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Abstract

rna que codifica uma proteína. a presente invenção se refere a um mrna compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal e uma unidade de transcrição, um vetor de expressão ou um vetor de terapia gênica compreendendo um ácido nucleico que codifica uma proteína e um peptídeo sinal. também é revelada na presente invenção uma composição terapêutica compreendendo o referido mrna, unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica e o uso da composição terapêutica no tratamento de uma doença ou condição.

Description

RNA QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA Campo da invenção
[001] A presente invenção se refere a um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[002] A presente invenção se refere adicionalmente a um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase. A presente invenção também se refere a uma unidade de transcrição ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
A presente invenção também se refere a uma unidade de transcrição ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). A presente invenção também se refere a uma composição terapêutica e a um kit compreendendo o mRNA e/ou a unidade de transcrição ou vetor de expressão.
A presente invenção também se refere a um mRNA, a uma unidade de transcrição ou vetor de expressão, a uma composição terapêutica e/ou um kit para uso como medicamento, em particular a um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) IGF1; e ii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) para uso como medicamento.
A presente invenção também se refere a um mRNA e a uma composição terapêutica do mesmo para uso em um método de tratamento de lesão musculoesquelética.
Antecedentes da invenção
[003] Diferentes tentativas foram feitas no passado para aumentar o rendimento da expressão e secreção de uma proteína codificada, em particular pelo uso de sistemas de expressão melhorados, ambos in vitro e/ou in vivo. Os métodos para aumentar a expressão e secreção geralmente descritas no estado da técnica baseiam-se convencionalmente no uso de cassetes ou vetores de expressão contendo promotores específicos e elementos de regulação correspondentes. Como esses cassetes ou vetores de expressão são tipicamente limitados a sistemas celulares específicos, esses sistemas de expressão devem ser adaptados para uso em diferentes sistemas celulares. Tais cassetes ou vetores de expressão adaptados são então normalmente transfectados nas células e tipicamente tratados na dependência da linhagem celular específica. Portanto, dá-se preferência principalmente àquelas moléculas de ácido nucleico como o mRNA, que são capazes de expressar as proteínas codificadas em uma célula alvo por sistemas inerentes à célula, independentemente de promotores e elementos de regulação que são específicos para determinados tipos de células. Neste contexto, pode-se distinguir entre elementos estabilizadores de mRNA e elementos que aumentam a eficiência de tradução do mRNA. Por exemplo, o documento WO 02/098443 descreve mRNAs que são estabilizados na forma geral e otimizados para tradução em suas regiões de codificação. O documento WO 02/098443 revela adicionalmente um método para determinar modificações de sequência. O documento WO 02/098443 descreve adicionalmente possibilidades para substituir nucleotídeos de adenina e uracila em sequências de mRNA a fim de aumentar o teor de guanina/citosina (G/C) das sequências. Neste contexto, o documento WO 02/098443 menciona genericamente sequências como uma sequência de base para tais modificações, em que o mRNA modificado codifica para pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo biologicamente ativo, que é traduzido no paciente a ser tratado, por exemplo, de nenhuma forma ou inadequadamente ou com falhas. Em uma abordagem adicional para aumentar a expressão de uma proteína codificada, o pedido WO 2007/036366 descreve o efeito positivo de sequências poli(A) longas (particularmente maiores que 120 pb) e a combinação de pelo menos duas regiões 3 'não traduzidas do gene da globina na estabilidade do mRNA e atividade translacional. Apesar de todo o progresso no estado da técnica, a expressão eficiente e, em particular, a secreção eficiente de uma proteína codificada em sistemas, células ou organismos livres de células (expressão recombinante) ainda é um problema desafiador. Sumário da invenção
[004] A presente invenção fornece um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[005] A presente invenção fornece adicionalmente um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase, em particular, a presente invenção fornece um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas.
[006] A presente invenção fornece adicionalmente uma unidade de transcrição ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[007] A presente invenção fornece adicionalmente uma unidade de transcrição ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase. A presente invenção fornece adicionalmente uma unidade de transcrição ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas;
proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas. A presente invenção fornece adicionalmente uma composição terapêutica compreendendo o mRNA e/ou a unidade de transcrição ou vetor de expressão mencionado acima. A presente invenção fornece adicionalmente um kit compreendendo o mRNA, a unidade de transcrição ou vetor de expressão e/ou a composição terapêutica mencionada acima, e instruções, opcionalmente um mapa de vetor, opcionalmente uma célula hospedeira, opcionalmente um meio de cultivo para o cultivo de uma célula hospedeira e/ou opcionalmente um meio de seleção para selecionar e cultivar uma célula hospedeira transfectada. A presente invenção fornece adicionalmente o mRNA, a unidade de transcrição ou vetor de expressão, a composição terapêutica ou o kit mencionado acima para uso como medicamento. A presente invenção fornece adicionalmente um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) IGF1; e ii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) para uso como medicamento. A presente invenção fornece adicionalmente um mRNA ou uma composição terapêutica contendo mRNA para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético.
[008] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N- terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, fornece secreção mais eficiente da proteína por células transfectadas com este mRNA em comparação com a secreção da proteína por células transfectadas com um mRNA que codifica a proteína e seu peptídeo sinal homólogo natural.
Em particular, os presentes inventores descobriram surpreendentemente que um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal de BDNF heterólogo à referida proteína, fornece uma secreção mais eficiente da proteína por células transfectadas com este RNAm do que o peptídeo sinal homólogo natural da proteína.
A quantidade de proteína secretada é até seis vezes maior quando comparada com o mRNA compreendendo a mesma proteína e o peptídeo sinal homólogo natural da proteína.
Esta descoberta inesperada é muito útil para liberar e expressar eficazmente o mRNA que codifica uma proteína desejada em uma célula, e para obter maiores quantidades de proteína secretada do que com o peptídeo sinal homólogo natural da proteína.
As maiores quantidades de proteína secretada obtidas com a mesma quantidade de mRNA fornecida pela presente invenção são extremamente úteis para diminuir a dose terapêutica que precisa ser aplicada localmente em um tecido, aumentando assim sua janela de segurança contra potenciais efeitos colaterais relacionados ao mRNA.
Além disso, isso torna a aplicação mais acessível a formulações para entrega controlada e revestimentos de dispositivos. Além disso, reduz o risco de imunogenicidade relacionado ao mRNA e torna a aplicação mais acessível para tecidos onde volumes limitados podem ser injetados ou para tecidos anteriormente inacessíveis. Os presentes inventores também descobriram que é possível liberar e expressar eficazmente mRNA, em particular mRNA que codifica IGF-1 humano para músculos esqueléticos, permitindo assim a expressão do polipeptídeo desejado nos músculos esqueléticos para fornecer um benefício funcional relevante para o músculo. O mRNA está preferencialmente presente em uma composição líquida, preferencialmente na forma nua. Esta composição líquida pode ser liberada diretamente aos músculos esqueléticos, por exemplo, por injeção, e não há necessidade de quaisquer vetores de transferência de genes ou carreadores para o mRNA ou métodos para intensificar a transferência para o tecido, como eletrotransferência ou ultrassom. Além disso, a injeção de mRNA em músculos esqueléticos lesados mostrou acelerar o processo de recuperação e resultar em um aumento da função dos músculos esqueléticos. Surpreendentemente, os animais tratados com o mRNA que codifica o IGF-1 atingiram níveis funcionais na faixa saudável em 16 dias. Em contraste, os animais de controle tratados com veículo nem mesmo alcançaram a recuperação funcional completa no dia 28. Breve descrição das figuras
[009] A Figura 1 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.1. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO 1) de IGF1 otimizado por códon humano contendo seus domínios pré-, pró- e de codificação. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhada, o domínio de codificação IGF-I é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA do domínio pré-, pró- e de codificação de IGF1 humano (SEQ ID NO:2), em que a uridina é N1-
Metilpseudouridina. Os pré e pró-domínios são clivados após a secreção.
[010] A Figura 2 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.2. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO 3) de IGF1 otimizado por códon humano contendo o pré-domínio de IGF2 e os pró-domínios de codificação e de IGF1. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhado, o domínio de codificação de IGF1 é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA de domínios pré- de IGF2 e pró- e de codificação de IGF1 (SEQ ID NO:4), em que a uridina é N1-Metilpseudouridina. Os domínios pré e pró-são clivados após a secreção.
[011] A Figura 3 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.3. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO:5) de IGF1 otimizado por códon humano contendo o pré-domínio de ALB e os domínios pró- e de codificação de IGF1. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhado, o domínio de codificação de IGF1 é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA de domínios pré- de ALB e pró- e de codificação de IGF1 (SEQ ID NO:6), em que a uridina é N1-Metilpseudouridina. Os domínios pré e pró-são clivados após a secreção.
[012] A Figura 4 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.4. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO:7) de IGF1 otimizado por códon humano contendo o pré-domínio de BDNF e os domínios pro- e de codificação de IGF1. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhado, o domínio de codificação de IGF1 é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA de domínios pré- de BDNF e pró- e de codificação de IGF1 (SEQ ID NO:8), em que a uridina é N1-Metilpseudouridina. Os domínios pré e pró-são clivados após a secreção.
[013] A Figura 5 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.5. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO:9) de IGF1 otimizado por códon humano contendo o pré-domínio de CXCL12 e os domínios pró- e de codificação de IGF1. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhado, o domínio de codificação de IGF1 é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA de domínios pré- de CXCL12 e pró- e de codificação de IGF1 (SEQ ID NO:10), em que a uridina é N1-Metilpseudouridina. Os domínios pré e pró-são clivados após a secreção.
[014] A Figura 6 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.6. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO:11) de IGF1 otimizado por códon humano contendo o pré-domínio do peptídeo de sinalização sintético 1 e os domínios pró- e de codificação de IGF1. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhado, o domínio de codificação de IGF1 é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA de domínios pré- de peptídeo de sinalização sintético 1 e pró- e de codificação de IGF1 (SEQ ID NO:12), em que a uridina é N1-Metilpseudouridina. Os pré e pró-domínios são clivados após a secreção.
[015] A Figura 7 mostra a sequência de DNA e RNA de Cpd.7. (A) mostra a sequência de DNA (SEQ ID NO:13) de IGF1 otimizado por códon humano contendo o pré-domínio do peptídeo de sinalização sintético 2 e os domínios pró- e de codificação de IGF1. A sequência para o pré-domínio (peptídeo de sinalização) é indicada em itálico, a sequência para o pró-domínio é sublinhado, o domínio de codificação de IGF1 é indicado em negrito e o códon de parada em negrito. (B) ilustra a sequência de RNA de domínios pré- de peptídeo de sinalização sintético 2 e pró- e de codificação de IGF1 (SEQ ID NO:14), em que a uridina é N1-Metilpseudouridina. Os pré e pró-domínios são clivados após a secreção.
[016] A Figura 8 mostra a sequência de DNA do vetor pVAX.A120 com a inserção de Cpd.1 marcado em negrito (SEQ ID NO:15). As ORFs de Cpd.1 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[017] A Figura 9 mostra a sequência de DNA do vetor pMA-T com a inserção de Cpd.2 marcado em negrito (SEQ ID NO:16). As ORFs de Cpd.2 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[018] A Figura 10 mostra a sequência de DNA do vetor pMA-T com a inserção de Cpd.3 marcado em negrito (SEQ ID NO:17). As ORFs de Cpd.3 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[019] A Figura 11 mostra a sequência de DNA do vetor pMA-T com a inserção de Cpd.4 marcado em negrito (SEQ ID NO:18). As ORFs de Cpd.4 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[020] A Figura 12 mostra a sequência de DNA do vetor pMA-T com a inserção de Cpd.5 marcado em negrito (SEQ ID NO:19). As ORFs de Cpd.5 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[021] A Figura 13 mostra a sequência de DNA do vetor pMA-RQ com Cpd.6 marcado em negrito (SEQ ID NO:20). As ORFs de Cpd.6 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[022] A Figura 14 mostra a sequência de DNA do vetor pMA-RQ com Cpd.7 marcado em negrito (SEQ ID NO:21). As ORFs de Cpd.7 foram digeridas de seu plasmídeo original e subclonadas no vetor.
[023] A Figura 15 mostra as sequências de iniciador direto (SEQ ID NO:22) e reverso (SEQ ID NO: 23) usadas para amplificar os plasmídeos pMA-T e pMA- RQ para o IVT de mRNAs.
[024] A Figura 16 mostra os nomes dos genes, números Uniprot, DNA otimizados por códons e sequências de aminoácidos e vetores dos peptídeos sinais de Cpd. 1-Cpd.7(SEQ ID Nos: 24-37). Observe que os peptídeos sinais de Cpd.6 e Cpd.7 são peptídeos sintéticos e não correspondem a sequências de proteínas conhecidas nos bancos de dados públicos.
[025] A Figura 17 mostra a indução da secreção de IGF1 de células renais embrionárias humanas (HEK293T) por transfecção de mRNA com Cpd.1-Cpd.7. As células HEK293T foram transfectadas com cada 2 µg de Cp.1-Cpd.7 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente maior do que o Cpd.1 (3,3 vezes). Os dados representam médias ± erro padrão da média de 4 repetições. A significância (***, <0,001) foi avaliada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett.
[026] A Figura 18 mostra a dependência da concentração da indução da secreção de IGF1 em células HEK293T após a transfecção de mRNA com Cpd.1 ou Cpd.4. As células foram transfectadas com Cpd.1 ou Cpd.4 em diferentes concentrações (0, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6 ou 2 µg) e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células usando um ELISA específico. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente mais potente (EC50 0,134 µg) do que o Cpd.1 (EC50 0,889 µg). Os dados representam médias ± erro padrão da média de 2 repetições. A significância (***, <0,001) foi avaliada por ANOVA de duas vias das duas curvas.
[027] A Figura 19 mostra a indução da secreção de IGF1 de células do músculo esquelético de camundongo (C2C12) por transfecção de mRNA com Cpd.1-Cpd.7. As células C2C12 foram transfectadas com cada 2 µg de Cp.1-Cpd.7 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente maior do que o Cpd.1 (6,1 vezes). Os dados representam médias ± erro padrão da média de 4 repetições. A significância (***, <0,001) foi avaliada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett.
[028] A Figura 20 mostra a indução da secreção de IGF1 a partir de células de músculo esquelético humano (HSkMC) por transfecção de mRNA com Cpd.1 e Cpd.4. As células HSkMC foram transfectadas com cada 2 µg de Cp.1 ou Cpd.4 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente maior do que o Cpd.1 (3,1 vezes). Os dados representam médias ± erro padrão da média de 3 repetições. A significância (**, p <0,01) foi avaliada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett.
[029] A Figura 21 mostra recuperação funcional do músculo tibial anterior (TA) após lesão por notexina. Após a lesão por notexina via injeção intramuscular (dia 0), dois tratamentos de mRNA de IGF-I (Cpd. 4 (1 µg)) foram aplicados por injeção intramuscular no dia 1 e 4 (vide pontas da seta). O grupo de controle recebeu solução de veículo. A função muscular foi avaliada no dia 1, 4, 7, 10, 14, 21 e 28 pós-lesão. Os dados representam as médias ± erro padrão da média (SEM) de 5 camundongos por grupo e ponto de tempo. Os asteriscos indicam diferença significativa do Cpd. 4 grupos tratados do grupo de controle (p <0,05) como avaliado pelo teste t de Student.
[030] A Figura 22 mostra a indução da secreção de IGF1 de células renais embrionárias humanas (HEK293T) por transfecção de mRNA com Cpd.1 como controle e Cpd.8-Cpd.26. As células HEK293T foram transfectadas com 0,3 µg de Cpd.1 e Cpd.8-Cpd.26 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IGF1 foi normalizada contra o Cpd.1. Secreção de IGF1. Cpds. 8, 9, 10, 11, 12 e 13 mostraram uma secreção reduzida de IGF1 enquanto os Cpds. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25 e 26 induziram a secreção de IGF1 maior do que o Cpd.1 (até 2,6 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 2- 11 repetições por Cpd. A significância (*, p <0,05; **, p <0,001; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.1.
[031] A Figura 23 mostra a indução da secreção de IGF1 de células hepáticas humanas (HepG2) por transfecção de mRNA com Cpd.1 como controle e Cpd.4- Cpd.26. As células HepG2 foram transfectadas com 0,3 µg de Cp.1 e Cpd.4- Cpd.26 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IGF1 foi normalizada contra o Cpd.1. Cpds. 8, 9 e 12 mostraram uma secreção reduzida de IGF1 enquanto os Cpds. 4, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 induziram a secreção de IGF1 maior do que Cpd.1 (até 8,3 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 2-4 réplicas por Cpd. A significância (**, p <0,01; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.1.
[032] A Figura 24 mostra a indução da secreção de IGF1 de células neuronais humanas (IMR32) por transfecção de mRNA com Cpd.1 como controle e Cpd.4-Cpd.24. As células IMR32 foram transfectadas com 0,3 µg de Cp.1 e Cpd.4-Cpd.24 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IGF1 foi normalizada contra o Cpd.1. Cpds. 4, 14, 15, 16, 17, 20, 22, 23 e 24 induziram secreção de IGF1 maior do que Cpd.1 (até 2,6 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 2-6 repetições por Cpd. A significância (*, p
<0,05; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.1.
[033] A Figura 25 mostra a indução da secreção de IGF1 de condrócitos primários humanos por transfecção de mRNA com Cpd.1 como controle e Cpd.4- Cpd.25. Os condrócitos foram transfectados com cada 0,6 µg de Cp.1 e Cpd.4- Cpd.25, e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IGF1 foi normalizada contra o Cpd.1. Cpds. 4, 14, 15, 16, 20, 21, 22, 24 e 25 induziram secreção de IGF1 maior do que Cpd.1 (até 1,9 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 1-2 repetições por Cpd. A significância (*, p <0,05; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.1.
[034] A Figura 26 mostra a indução da secreção de IGF1 motoneurônios primários de rato tipo selvagem (A) ou SOD1GS93A (B) por transfecção de mRNA com Cpd.1 como controle e Cpd.4-Cpd.17. Motoneurônios primários de rato tipo selvagem foram transfectados com cada 0,3 µg de Cp.1, Cpd.4, Cpd. 14 e Cpd.17 e os motoneurônios primários SOD1GS93A de rato foram transfectados com cada 0,3 µg de Cp.1, Cpd. 14 e Cpd.17, e o IGF1 secretado foi medido após 48 horas no sobrenadante da cultura de células usando um ELISA específico. A secreção de IGF1 foi normalizada contra o Cpd.1. Cpds. 4, 14 e 17 induziram a secreção de IGF1 maior do que Cpd.1 (até 4,3 vezes no tipo selvagem ou 9,3 vezes no SOD1S93A). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 2 repetições por Cpd. A significância foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.1 e não revelou nenhuma diferença estatística.
[035] A Figura 27 mostra a indução da secreção de EPO a partir de células renais embrionárias humanas (HEK293T, A), células hepáticas humanas (HepG2,
B) e células de carcinoma de pulmão humano (A549, C) por transfecção de mRNA com Cpd.27, Cpd.28 ou Cpd.29. As células foram transfectadas com cada 0,3-0,9 µg Cp.27, Cpd.28 ou Cpd.29, e a EPO secretada foi medida após 24 horas no sobrenadante da cultura de células usando um ELISA específico. A secreção de EPO foi normalizada contra o Cpd.27. Cpds. 28 e 29 induziram a secreção de EPO maior do que Cpd.27 em todos os três tipos de células analisados (até 1,8 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 3-8 repetições por Cpd. A significância (*, p <0,05; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.27.
[036] A Figura 28 mostra a indução da secreção de INS de células renais embrionárias humanas (HEK293T) por transfecção de mRNA com Cpd.30, Cpd.31 ou Cpd.32. As células foram transfectadas com cada 0,6 µg Cp.30, Cpd.31 ou Cpd.32, e a INS secretada foi medida após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de INS foi normalizada contra o Cpd.30. Cpds. 31 e 32 induziram a secreção de INS maior do que Cpd.30 (até 3,9 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 3-5 repetições por Cpd. A significância (*, p <0,05; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.30.
[037] A Figura 29 mostra a indução da secreção de IL4 a partir de células renais embrionárias humanas (HEK293T, A), células hepáticas humanas (HepG2, B), monócitos humanos (THP-1, C) e células de carcinoma de pulmão humano (A549, D) por transfecção de mRNA com Cpd.33, Cpd.34 ou Cpd.35. As células foram transfectadas com 0,5-0,6 µg de Cp.33, Cpd.34 ou Cpd.35 e a IL4 secretada foi medida após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IL4 foi normalizada contra o Cpd.33. Cpds. 34 e 35 induziram a secreção de IL4 maior do que Cpd.33 em todos os três tipos de células analisados (até 2,2 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 3-8 repetições por Cpd. A significância (*, p <0,05; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.33.
[038] A Figura 30 mostra a indução da secreção de IL10 a partir de células renais embrionárias humanas (HEK293T, A), células hepáticas humanas (HepG2, B) ou monócitos humanos (THP-1, C) por transfecção de mRNA com Cpd.36, Cpd.37 ou Cpd.38. As células foram transfectadas com 0,3-0,6 µg de Cp.36, Cpd.37 ou Cpd.38 e a IL10 secretada foi medida após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IL10 foi normalizada contra o Cpd.36. Cpds. 37 e 38 induziram a secreção de IL10 maior do que Cpd.36 em todos os três tipos de células analisados (até 2,2 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 4-8 réplicas por Cpd. A significância (**, p <0,01; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd individual. em comparação com o Cpd.36.
[039] A Figura 31 mostra a indução da secreção de IGF-1 de células hepáticas humanas (HepG2, A) e células de condrócitos primários humanos (B) por transfecção de mRNA com Cpd.39. As células foram transfectadas com cada 0,3-0,6 µg com Cp.39 e o IGF1 secretado foi medido após 24 horas no sobrenadante da cultura de células utilizando um ELISA específico. A secreção de IGF1 foi normalizada contra o Cpd.1. Cpds. 39 induziu secreção de IGF1 maior do que Cpd.1 em todos os dois tipos de células analisados (até 1,4 vezes). Os dados representam as médias ± erro padrão da média de 4-7 repetições. A significância (**, p <0,01; ***, <0,001) foi avaliada pelo teste t de Student de um Cpd.1 individual em comparação com o Cpd.39. Descrição detalhada da invenção
[040] O termo "RNA", como usado na presente invenção, inclui RNA que codifica para uma sequência de aminoácidos, bem como RNA que não codifica para uma sequência de aminoácidos. Normalmente, o RNA como usado na presente invenção é um RNA codificador, isto é, um RNA que codifica uma sequência de aminoácidos. Tais moléculas de RNA também são chamadas de mRNA (RNA mensageiro) e são moléculas de RNA de fita simples. Assim, o termo "RNA", como usado na presente invenção, refere-se preferencialmente a mRNA. O RNA pode ser feito por metodologia química e sintética e enzimática conhecida por um técnico no assunto, ou pelo uso de tecnologia recombinante, ou pode ser isolado de fontes naturais, ou por uma combinação das mesmas. O RNA pode compreender opcionalmente, modificações de nucleosídeos não naturais e de ocorrência natural, como, por exemplo, N1-Metilpseudouridina também referida na presente invenção como metilpseudouridina.
[041] O termo "mRNA" (isto é, RNA mensageiro), como usado na presente invenção, refere-se a polímeros que são constituídos por blocos de construção de fosfato de nucleosídeo principalmente com adenosina, citidina, uridina e guanosina como nucleosídeos e que contêm uma região de codificação que codifica uma proteína. No contexto da presente invenção, mRNA deve ser entendido como significando qualquer molécula de polirribonucleotídeo que, se entrar na célula, seja adequada para a expressão de uma proteína ou fragmento da mesma isto é traduzível em uma proteína ou fragmento da mesma. O mRNA da presente invenção compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal deve ser entendido como significando uma molécula de polirribonucleotídeo que, se entrar na célula, é adequada para induzir a expressão e secreção da referida proteína ou fragmento da mesma. O mRNA da presente invenção é uma molécula de ácido nucleico artificial, isto é, um mRNA artificial. Uma molécula de ácido nucleico artificial, por exemplo, um mRNA artificial pode ser tipicamente entendida como uma molécula de ácido nucleico, que não ocorre naturalmente, como um mRNA recombinante. Um mRNA recombinante é o mRNA preferido da presente invenção.
O mRNA contém uma sequência de ribonucleotídeos que codifica uma proteína ou fragmento da mesma cuja função na célula ou na vizinhança da célula é normalmente necessária ou benéfica, em particular no contexto da cura de lesões do músculo esquelético.
O mRNA pode conter a sequência da proteína completa ou uma variante funcional da mesma.
Assim, a sequência de ácidos nucleicos do mRNA para a proteína completa normalmente compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína.
O mRNA da presente invenção compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal.
A sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína pode opcionalmente compreender o pró-domínio de uma proteína, que normalmente está localizado no terminal N da proteína.
A proteína e o peptídeo sinal são normalmente codificados pela sequência de ácidos nucleicos do mRNA da presente invenção na seguinte ordem de 5 'para 3': i) o peptídeo sinal e ii) a proteína, isto é, o último nucleosídeo da região de codificação do peptídeo sinal é seguido pelo primeiro nucleosídeo da região de codificação da proteína ou no caso de uma proteína compreendendo um pró-domínio pelo primeiro nucleosídeo da região de codificação da forma de pró-proteína da proteína.
A sequência de ribonucleotídeos pode codificar uma proteína que atua como um fator, indutor, regulador, estimulador ou enzima, ou um fragmento funcional do mesmo, onde está proteína é normalmente aquela cuja função é necessária a fim de remediar um distúrbio, em particular uma lesão do músculo esquelético.
Aqui, por variante funcional é entendido como significando um fragmento que na célula pode assumir a função da proteína cuja função na célula é necessária.
Além disso, o mRNA também pode ter outras regiões funcionais e/ou regiões não codificantes 3 'ou 5'. As regiões não codificantes 3'e/ou 5' podem ser as regiões flanqueando naturalmente a sequência de que codifica a proteína ou sequências artificiais que contribuem para a estabilização do RNA como, por exemplo, um cap da extremidade 5 'e/ou uma cauda poliA da extremidade 3. Os técnicos no assunto podem determinar as sequências adequadas para isso em cada caso por meio de experimentos de rotina. O mRNA ou o DNA usado para transcrever o mRNA pode ser otimizado por códon. Preferencialmente, o DNA usado na presente invenção para transcrever o mRNA da presente invenção e o mRNA da presente invenção são otimizados por códon. Em geral, a otimização de códons se refere a um processo de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos para expressão em uma célula hospedeira de interesse, substituindo pelo menos um códon (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais códons) de uma sequência nativa com códons que são mais frequentemente ou mais frequentemente usados nos genes dessa célula hospedeira, mantendo a sequência de aminoácidos nativa. As tabelas de uso de códons estão prontamente disponíveis, por exemplo, no "Codon Usage Database", e essas tabelas podem ser adaptadas de inúmeras maneiras. Algoritmos de computador para a otimização de códons de uma sequência particular para expressão em uma célula hospedeira particular também estão disponíveis, como Gene Forge® (Aptagen, PA) e GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA) que é o preferido.
[042] O termo "RNA nu", como usado na presente invenção, refere-se a um RNA que não é complexado com qualquer tipo de outro composto, em particular proteínas, peptídeos, polímeros, como polímeros catiônicos, lipídeos, lipossomas, vetores virais ou semelhantes. Assim, "RNA nu" significa que o RNA está presente, por exemplo, em uma composição líquida em uma forma livre e não complexada sendo molecularmente disperso em solução. Por exemplo, não se prevê que o "RNA nu" seja complexado com um sistema carreador de lipídeo e/ou polímero (por exemplo, nanopartículas de lipídeo e micela)/reagente de transfecção como, por exemplo, DreamFect ™ Gold ou PEI (ramificado). Portanto, uma composição compreendendo o mRNA, como a composição terapêutica da invenção, não contém, por exemplo, um lipídeo e/ou reagente de transfecção do sistema carreador de polímero como, por exemplo, DreamFect ™ Gold ou PEI (ramificado).
[043] Os termos "sequência de ácidos nucleicos", "sequência nucleotídica" e "sequência de ácidos nucleotídicos" são usados na presente invenção indistintamente e têm o significado idêntico na presente invenção e referem-se preferencialmente a DNA ou RNA. Os termos "sequência de ácidos nucleicos", "sequência nucleotídica" e "sequência de ácido nucleotídico" são preferencialmente usados como sinônimos do termo "sequência polinucleotídica". Preferencialmente, uma sequência de ácidos nucleicos é um polímero compreendendo ou consistindo em monômeros nucleotídicos, que estão covalentemente ligados entre si por ligações fosfodiésteres de uma cadeia principal de açúcar/fosfato. O termo "sequência de ácidos nucleicos" também abrange sequências de ácidos nucleicos modificadas, tais como DNA ou RNA modificados por base, modificados por açúcar ou modificados por cadeia principal etc.
[044] O termo "fase de leitura aberta", como usado na presente invenção, refere-se a uma sequência de vários tripletos nucleotídicos, que podem ser traduzidos em um peptídeo ou proteína. Uma fase de leitura aberta (ORF) contém preferencialmente um códon de início, isto é, uma combinação de três nucleotídeos subsequentes que codificam normalmente para o aminoácido metionina (ATG), em sua extremidade 5'e uma região subsequente, que normalmente exibe um comprimento que é um múltiplo de 3 nucleotídeos. Uma ORF é preferencialmente terminada por um códon de parada (por exemplo, TAA,
TAG, TGA). Tipicamente, este é o único códon de parada da fase de leitura aberta. Assim, uma fase de leitura aberta no contexto da presente invenção é preferencialmente uma sequência de ácidos nucleicos, consistindo em um número de nucleotídeos que podem ser divididos por três, que começa com um códon de início (por exemplo, ATG) e que preferencialmente termina com um códon de parada (por exemplo, TAA, TGA ou TAG). A fase de leitura aberta pode ser isolada ou pode ser incorporada em uma sequência de ácidos nucleicos mais longa, por exemplo, em um vetor ou um mRNA. Uma fase de leitura aberta também pode ser denominada "região de codificação (proteína)" ou, preferencialmente "sequência de codificação".
[045] O termo "peptídeo sinal" também referido na presente invenção como peptídeo de sinalização, pré-domínio, sequência sinal, sinal de alvejamento, sinal de localização, sequência de localização, peptídeo trânsito, sequência líder ou peptídeo líder é um peptídeo curto (normalmente 16-40 aminoácidos de comprimento) presentes no terminal N de proteínas recentemente sintetizadas que são destinadas à via secretora. O peptídeo sinal da presente invenção é preferencialmente 10-50, mais preferencialmente 11-45, ainda mais preferencialmente 12-45, mais preferencialmente 13-45, em particular 14-45, mais particularmente 15-45, ainda mais particularmente 16-40 aminoácidos de comprimento. Um peptídeo sinal de acordo com a invenção está situado da extremidade N-terminal da proteína de interesse ou da extremidade N-terminal da forma pró-proteína da proteína de interesse. Usando um peptídeo sinal de acordo com a invenção, a proteína de interesse pode ser secretada em uma quantidade pelo menos igual a, preferencialmente em uma quantidade maior do que a quantidade da referida proteína secretada usando seu peptídeo sinal natural (homólogo). Um peptídeo sinal de acordo com a invenção é normalmente de origem eucariótica, por exemplo, o peptídeo sinal de uma proteína eucariótica, preferencialmente de origem de mamífero, por exemplo, o peptídeo sinal de uma proteína de mamífero, mais preferencialmente de origem humana, por exemplo, o peptídeo sinal de uma proteína de mamífero. Em algumas modalidades, o peptídeo sinal heterólogo e/ou o peptídeo sinal homólogo a ser modificado é o peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína eucariótica, preferencialmente o peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína de mamífero, mais preferencialmente o peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína humana.
[046] O termo "proteína", como usado na presente invenção, refere-se a moléculas tipicamente compreendendo um ou mais peptídeos ou polipeptídeos. Um peptídeo ou polipeptídeo é tipicamente uma cadeia de resíduos de aminoácidos, ligados por ligações peptídicas. Um peptídeo normalmente compreende entre 2 e 50 resíduos de aminoácidos. Um polipeptídeo normalmente compreende mais de 50 resíduos de aminoácidos. Uma proteína é tipicamente dobrada em uma forma tridimensional, que pode ser necessária para que a proteína exerça sua função biológica. O termo "proteína", como usado na presente invenção, inclui um fragmento de uma proteína e proteínas de fusão. Preferencialmente, a proteína é de mamífero, mais preferencialmente de origem humana, isto é, é uma proteína humana. Preferencialmente, a proteína é uma proteína que é normalmente secretada por uma célula, isto é, uma proteína que é secretada por uma célula na natureza. As proteínas como referidas na presente invenção são normalmente selecionadas a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima;
metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas.
[047] As carboxipeptidases são proteínas que são enzimas proteases que hidrolisam (clivam) uma ligação peptídica da extremidade carbóxi-terminal (C- terminal) de uma proteína; citocinas são proteínas que são secretadas e atuam localmente ou sistemicamente como moduladores da sinalização de células-alvo por meio de receptores em suas superfícies, frequentemente envolvidos em reações imunológicas; ligantes e transportadores extracelulares são proteínas que são secretadas e agem por meio da ligação a outras proteínas ou levando outras proteínas ou outros moléculas para exercer uma determinada função biológica; proteínas da matriz extracelular são uma coleção de proteínas secretado pelas células de suporte que fornecem suporte estrutural e bioquímico às células vizinhas; glicosidases são enzimas envolvidas na quebra de carboidratos complexos, como amido e glicogênio em seus monômeros; glicosiltransferases são enzimas que estabelecem ligações glicosídicas naturais; fatores de crescimento são proteínas secretadas capazes de estimular o crescimento celular, proliferação, cura e diferenciação celular atuando localmente ou sistemicamente como moduladores da sinalização de células-alvo via receptores em suas superfícies, frequentemente envolvidos em reações tróficas e sinalização de sobrevivência ou homeostase celular; as proteínas de ligação ao fator de crescimento são proteínas secretadas que se ligam a fatores de crescimento e, portanto, modulam sua atividade biológica; as proteínas de ligação à heparina são proteínas secretadas que interagem com a heparina para modular sua função biológica, frequentemente em conjunto com outra ligação a um fator de crescimento ou hormônio; hormônios são membros de uma classe de moléculas de sinalização produzidas por glândulas em organismos multicelulares que são secretadas e transportadas pelo sistema circulatório para alvejar órgãos distantes para regular a fisiologia e o comportamento por meio da ligação a receptores específicos em suas células-alvo; as hidrolases são uma classe de enzimas que catalisam bioquimicamente a clivagem das moléculas ao utilizar água para quebrar as ligações químicas, resultando na divisão de uma molécula maior em moléculas menores; as imunoglobulinas são grandes proteínas secretadas em forma de Y, produzidas principalmente por células plasmáticas que são usadas pelo sistema imunológico para neutralizar patógenos, tais como bactérias e vírus patogênicos; isomerases são uma classe geral de enzimas que convertem uma molécula de um isômero para outro, facilitando assim os rearranjos intramoleculares nos quais as ligações são quebradas e formadas; quinases são enzimas que catalisam a transferência de grupos fosfato de moléculas doadoras de fosfato de alta energia para substratos específicos; liases são enzimas catalisando a quebra de várias ligações químicas por outros meios que não a hidrólise e a oxidação, frequentemente formando uma nova ligação dupla ou uma nova estrutura de anel; inibidores de metaloenzima inibidores celulares das metaloproteinases matriz (MMPs); metalloproteinases são enzimas proteases cujo mecanismo catalítico envolve um íon metálico; as proteínas do leite são proteínas secretadas no leite; proteínas neuroativas são proteínas secretadas que agem localmente ou via distâncias para apoiar a função neuronal, sobrevivência e fisiologia; proteases (também chamadas de peptidases ou proteinases) são enzimas que realizam proteólise por hidrólise de ligações peptídicas; inibidores de protease são proteínas que inibem a função de proteases; as proteínas fosfatases são enzimas que removem grupos fosfato de resíduos de aminoácidos fosforilados de sua proteína substrato; esterases são enzimas que dividem os ésteres em um ácido e um álcool em uma reação química com água em um resíduo de aminoácido; as transferases são uma classe de enzimas que catalisam a transferência de grupos funcionais específicos (por exemplo, um grupo metil ou glicosil) de uma molécula (chamada de doador) para outra (chamada de aceitador); proteínas vasoativas são proteínas secretadas que afetam biologicamente a função dos vasos sanguíneos. Carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas, como referido na presente invenção, podem ser encontradas no banco de dados Uniprot.
[048] O termo "fragmento" ou "fragmento de uma sequência" que tem o significado idêntico na presente invenção é uma porção mais curta de uma sequência de comprimento total de, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico como DNA ou RNA ou uma proteína. Consequentemente, um fragmento, tipicamente, compreende ou consiste em uma sequência que é idêntica ao trecho correspondente dentro da sequência de comprimento total. Um fragmento preferido de uma sequência no contexto da presente invenção compreende ou consiste em um trecho contínuo de entidades, tais como nucleotídeos ou aminoácidos correspondendo a um trecho contínuo de entidades na molécula da qual o fragmento é derivado, que representa pelo menos 5%, normalmente pelo menos 20%, preferencialmente pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 60%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, e mais preferencialmente pelo menos 80%
da molécula total (isto é, comprimento total), da qual o fragmento é derivado.
[049] O termo "peptídeo sinal heterólogo à referida proteína", como usado na presente invenção, refere-se a um peptídeo sinal de ocorrência natural que é diferente do peptídeo sinal de ocorrência natural da proteína, isto é, o peptídeo sinal não é derivado do mesmo gene da proteína. Normalmente, um peptídeo sinal heterólogo a uma dada proteína é um peptídeo sinal de outra proteína, que não está relacionado com a proteína dada, isto é, que tem uma sequência de aminoácidos que difere do peptídeo sinal da proteína dada, por exemplo, que tem uma sequência de aminoácidos que difere do peptídeo sinal da proteína dada em mais de 50%, preferencialmente em mais de 60%, mais preferencialmente em mais de 70%, ainda mais preferencialmente em mais de 80%, mais preferencialmente em mais de 90%, em particular em mais de 95%. Preferencialmente, um peptídeo sinal heterólogo a uma dada proteína tem uma identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal de ocorrência natural (homólogo) da proteína dada de menos de 95%, preferencialmente menos de 90%, mais preferencialmente menos de 80%, ainda mais preferencialmente menos de 70%, mais preferencialmente menos de 60%, em particular menos de 50%. Embora as sequências heterólogas possam ser derivadas do mesmo organismo, elas naturalmente (na natureza) não ocorrem na mesma molécula de ácido nucleico, como no mesmo mRNA. O peptídeo sinal heterólogo a uma proteína e a proteína para a qual o peptídeo sinal é heterólogo podem ser da mesma origem ou diferente e são normalmente da mesma origem, preferencialmente de origem eucariótica, mais preferencialmente de origem eucariótica do mesmo organismo eucariótico, ainda mais preferencialmente de origem de mamífero, em particular de origem de mamífero do mesmo organismo de mamífero, mais particularmente de origem humana. No Exemplo 1 é revelado um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal BDNF humano e o IGF1 humano, isto é, um peptídeo sinal heterólogo a uma proteína em que o peptídeo sinal e a proteína são da mesma origem, nomeadamente de origem humana.
[050] O termo "peptídeo sinal homólogo à referida proteína", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína. Um peptídeo sinal homólogo para uma proteína é o peptídeo sinal codificado pelo gene da proteína como ocorre na natureza. Um peptídeo sinal homólogo a uma proteína é normalmente de origem eucariótica, por exemplo, o peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína eucariótica, preferencialmente de origem de mamífero, por exemplo, o peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína de mamífero, mais preferencialmente de origem humana, por exemplo, o peptídeo sinal de ocorrência natural de uma proteína humana.
[051] O termo "sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza", como usado na presente invenção, refere-se a uma sequência de aminoácidos que ocorre na natureza e que não é idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer peptídeo sinal que ocorre na natureza. A sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, como referido na presente invenção, está preferencialmente entre 10-50, mais preferencialmente 11-45, ainda mais preferencialmente 12-45, o mais preferencialmente 13-45, em particular 14-45, mais particularmente 15-45, ainda mais particularmente 16-40 aminoácidos de comprimento. Preferencialmente, a sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza da presente invenção é de origem eucariótica e não é idêntica a qualquer peptídeo sinal de origem eucariótica, mais preferencialmente é de origem de mamífero e não é idêntica a qualquer peptídeo sinal de origem de mamífero,
mais preferencialmente é de origem humana e não é idêntico a qualquer peptídeo sinal de origem humana que ocorre na natureza. Uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza é normalmente uma sequência de aminoácidos da sequência de codificação de uma proteína. Uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza de acordo com a presente invenção é normalmente de origem eucariótica, preferencialmente de origem de mamífero, mais preferencialmente de origem humana.
[052] O termo "ocorrência natural", "natural" e "na natureza", como usado na presente invenção, tem o significado equivalente.
[053] O termo "aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal", como usado na presente invenção, refere-se aos primeiros nove aminoácidos da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal. Analogamente, o termo "aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal", como usado na presente invenção, refere-se aos primeiros sete aminoácidos da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal” e o termo "aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal ", como usado na presente invenção, refere-se aos primeiros cinco aminoácidos da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos de um sinal peptídeo.
[054] O termo "sequência de aminoácidos modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido", como usado na presente invenção, refere-se a uma sequência de aminoácidos que inclui uma substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um aminoácido dentro da sequência de aminoácidos. O termo "peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido", como usado na presente invenção refere-se a uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal de ocorrência natural heterólogo a uma proteína que inclui um aminoácido substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um aminoácido dentro de sua sequência de aminoácidos de ocorrência natural.
O termo "peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido", como usado na presente invenção refere-se a um peptídeo sinal homólogo de ocorrência natural a uma proteína que inclui uma substituição de aminoácido, inserção e/ou deleção de pelo menos um aminoácido dentro de sua sequência de aminoácidos de ocorrência natural.
O termo "a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido" refere-se a uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que inclui uma substituição de aminoácido, inserção e/ou deleção de pelo menos um aminoácido dentro de sua sequência de aminoácidos de ocorrência natural.
Por "substituição de aminoácido" ou "substituição" na presente invenção, entende-se a substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de proteína parental por outro aminoácido.
Por exemplo, a substituição R34K refere-se a um polipeptídeo, no qual a arginina na posição 34 é substituída por uma lisina.
Para o exemplo anterior, 34K indica a substituição da posição 34 por uma lisina.
Para os fins da presente invenção, várias substituições são tipicamente separadas por uma barra.
Por exemplo, R34K/L78V refere-se a uma variante dupla compreendendo as substituições R34K e L38V.
Por "inserção de aminoácido" ou "inserção", como usado na presente invenção, entende-se a adição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de proteína parental.
Por exemplo, a inserção -34 designa uma inserção na posição 34. Por "deleção de aminoácido" ou "deleção", como usado na presente invenção, entende-se a remoção de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de proteína parental. Por exemplo, R34- designa a deleção de arginina na posição 34.
[055] Preferencialmente, o aminoácido deletado é um aminoácido com uma pontuação hidrofóbica menor que -0,8, preferencialmente menor que 1,9. Preferencialmente, o aminoácido substituto é um aminoácido com uma pontuação hidrofóbica que é maior que à pontuação hidrofóbica do aminoácido substituído, mais preferencialmente o aminoácido substituto é um aminoácido com uma pontuação hidrofóbica de 2,8 e maior, mais preferencialmente com uma pontuação hidrofóbica de 3,8 e maior. Preferencialmente, o aminoácido inserido é um aminoácido com uma pontuação hidrofóbica de 2,8 e maior mais preferencialmente com uma pontuação hidrofóbica de 3,8 e maior.
[056] Normalmente entre 1 e 15, preferencialmente entre 1 e 11 aminoácidos, mais preferencialmente entre 1 e 10 aminoácidos, ainda mais preferencialmente entre 1 e 9 aminoácidos, em particular entre 1 e 8 aminoácidos, mais particularmente entre 1 e 7 aminoácidos, ainda mais particularmente entre 1 e 6 aminoácidos, em particular preferencialmente entre 1 e 5 aminoácidos, de maneira mais particularmente preferencial entre 1 e 4 aminoácidos, de maneira ainda mais particularmente preferencial entre 1 e 2 aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos são inseridos, deletados e/ou substituído. Normalmente entre 1 e 15, preferencialmente entre 1 e 11 aminoácidos, mais preferencialmente entre 1 e 10 aminoácidos, ainda mais preferencialmente entre 1 e 9 aminoácidos, em particular entre 1 e 8 aminoácidos, mais particularmente entre 1 e 7 aminoácidos, ainda mais particularmente entre 1 e 6 aminoácidos, de maneira particularmente preferencial entre 1 e 5 aminoácidos, de maneira mais particularmente preferencial entre 1 e 4 aminoácidos, de maneira ainda mais particularmente preferencial entre 1 e 2 aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos são inseridos, deletados e/ou substituído normalmente dentro dos aminoácidos 1- 11, preferencialmente dentro dos aminoácidos 1-10, mais preferencialmente dentro dos aminoácidos 1-9, ainda mais preferencialmente dentro dos aminoácidos 1-8, em particular dentro dos aminoácidos 1-7, mais particularmente dentro dos aminoácidos 1-6, ainda mais particularmente dentro dos aminoácidos 1-5, de maneira particularmente preferencial dentro dos aminoácidos 1-4, de maneira mais particularmente preferencial dentro dos aminoácidos 1-3, de maneira ainda mais particularmente preferencial dentro dos aminoácidos 1-2 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[057] Preferencialmente, a sequência de aminoácidos é opcionalmente modificada por deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[058] Preferencialmente, a pontuação hidrofóbica média dos primeiros nove aminoácidos da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal modificado é aumentada em 1,0 unidade ou acima em comparação com o peptídeo sinal sem modificação.
[059] O termo "fator de crescimento semelhante à insulina 1", "fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1)" ou "IGF1", como usado na presente invenção, normalmente se refere à sequência natural da proteína de IGF1 sem o peptídeo de sinalização e pode compreender o pró-peptídeo e/ou o peptídeo-E e preferencialmente refere-se à sequência natural da proteína de IGF1 sem o peptídeo de sinalização e sem o peptídeo-E. O termo "fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1)", como usado na presente invenção, refere-se à sequência natural de IGF1 humano (pró-IGF1, que é referido na base de dados Uniprot como UniProtKB - P05019 e na base de dados Genbank como NM_000618.4, NM_001111285.2 e NM_001111283.2, ou um fragmento do mesmo. A sequência de DNA natural que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 pode ser otimizada por códon.
A sequência natural de IGF1 humano compreende ou consiste no peptídeo de sinalização humano com 21 aminoácidos (nucleotídeos 1-63), o pró-peptídeo humano (também chamado de pró-domínio) com 27 aminoácidos (nucleotídeos 64-144), o IGF1 humano maduro possuindo 70 aminoácidos (nucleotídeos 145-354) e o domínio C-terminal de IGF1 humano que é o denominado peptídeo E (ou domínio E). O domínio C-terminal de IGF1 humano (denominado peptídeo E ou domínio E) compreende o domínio Ea-, Eb- ou Ec que são gerados por eventos de splicing alternativo.
O domínio Ea compreende ou consiste em 35 aminoácidos (105 nucleotídeos), o domínio Eb compreende ou consiste em 77 aminoácidos (231 nucleotídeos) e o domínio Ec compreende ou consiste em 40 aminoácidos (120 nucleotídeos) (vide, por exemplo, Wallis M (2009) New insulin- like growth factor (IGF)-precursor sequences from mammalian genomes: the molecular evolution of IGFs and associated peptides in primates.
Growth Horm IGF Res 19 (1): 12-23. doi: 10,1016/j.ghir.2008.05.001). O termo "fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF)", como usado na presente invenção, normalmente se refere à sequência natural da proteína de IGF1 humano sem o peptídeo de sinalização e pode compreender o pró-peptídeo e/ou o peptídeo-E e preferencialmente refere-se ao natural sequência da proteína de IGF1 humano sem o peptídeo de sinalização e sem o peptídeo E.
O termo "fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF)", como usado na presente invenção, normalmente compreende o de IGF1 humano maduro.
O termo "proteína madura" refere-se à proteína sintetizada no retículo endoplasmático e secretada através do aparelho de Golgi em uma célula que expressa e secreta a proteína.
O termo "IGF1 maduro" refere-se à proteína sintetizada no retículo endoplasmático e secretada via o aparelho de Golgi em uma célula expressando e secretando IGF1. O termo "IGFI humano maduro"
refere-se à proteína sintetizada no retículo endoplasmático e secretada através do aparelho de Golgi em uma célula humana que expressa e secreta IGF1 humano e normalmente contém os aminoácidos codificados pela sequência nucleotídica como mostrado na SEQ ID NO: 39.
[060] O termo "insulina" ou "INS", como usado na presente invenção, normalmente se refere à sequência natural de insulina sem o peptídeo de sinalização. O termo "insulina humana" ou "INS humana", como usado na presente invenção, refere-se à sequência natural da insulina humana que é referida na base de dados Uniprot como UniProtKB - P01308 e na base de dados Genbank como NM_000207.2, NM_001185097.1, NM_001185098.1 e NM_001291897.1, ou um fragmento dos mesmos. A sequência de DNA natural que codifica a insulina humana pode otimizada por códon. A sequência natural da insulina humana compreende ou consiste no peptídeo de sinalização humana com 24 aminoácidos (nucleotídeos 1-72), a cadeia B da insulina humana com 30 aminoácidos (nucleotídeos 73-163), o pró-peptídeo da insulina humana (também chamado de conexão peptídeo; C-peptídeo) com 31 aminoácidos (nucleotídeos 64-144) e o domínio C-terminal da cadeia A da insulina humana compreende ou consiste em 21 aminoácidos (nucleotídeos 64-144). O termo "insulina humana", como usado na presente invenção, normalmente compreende a insulina humana sem o peptídeo de sinalização.
[061] O termo "Eritropoietina", "EPO" ou "Epo", como usado na presente invenção, normalmente se refere à sequência natural da EPO sem o peptídeo de sinalização. O termo "Eritropoietina humana", "EPO humana" ou "Epo humana", como usado na presente invenção, refere-se à sequência natural da eritropoietina humana que é referida na base de dados Uniprot como UniProtKB - P01588 e na base de dados Genbank como NM_000799.2, ou um fragmento dos mesmos. A sequência de DNA natural que codifica a eritropoietina humana pode ser otimizada por códon. A sequência natural da eritropoietina humana compreende ou consiste no peptídeo de sinalização humano com 27 aminoácidos (nucleotídeos 1-81), a cadeia de codificação Epo humana com 166 aminoácidos (nucleotídeos 82-579). O termo "eritropoietina humana", como usado na presente invenção, normalmente compreende a EPO humana sem o peptídeo de sinalização.
[062] O termo "Interleucina-4" ou "IL4", como usado na presente invenção, normalmente se refere à sequência natural de IL4 sem o peptídeo de sinalização. O termo "interleucina-4 humana" ou "IL4 humana", como usado na presente invenção, refere-se à sequência natural de IL4 humana que é referida na base de dados Uniprot como UniProtKB - P05112 e na base de dados Genbank como NM_000589.3 e NM_172348.2 ou um fragmento dos mesmos. A sequência de DNA natural que codifica IL4 humana pode ser otimizada por códon. A sequência natural de IL4 humana compreende ou consiste no peptídeo de sinalização humana com 24 aminoácidos (nucleotídeos 1-72), a cadeia de codificação de IL4 humana tendo 129 aminoácidos (nucleotídeos 73-387). O termo "IL4 humana", como usado na presente invenção, normalmente compreende a IL4 humana sem o peptídeo de sinalização.
[063] O termo "Interleucina-10" ou "IL10" como usado na presente invenção normalmente se refere à sequência natural de IL10 sem o peptídeo de sinalização. O termo "Interleucina-10 humana" ou "IL10 humana", como usado na presente invenção, refere-se à sequência natural de humano IL10 que é referido na base de dados Uniprot como UniProtKB - P22301 e na base de dados Genbank como NM_000572.2 ou um fragmento do mesmo. A sequência de DNA natural que codifica IL10 humana pode ser códon-otimizada. A sequência natural de IL10 humana compreende ou consiste no peptídeo de sinalização humana com 18 aminoácidos (nucleotídeos 1-54), a cadeia de codificação de IL10 humana tendo 160 aminoácidos (nucleotídeos 55-534). O termo "IL10 humana", como usado na presente invenção, normalmente compreende a IL10 humana sem o peptídeo de sinalização.
[064] O termo "peptídeo sinal do fator de crescimento de Insulina 1 (IGF1)" ou "peptídeo sinal de IGF1", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de IGF1 que é referido no banco de dados Uniprot como P05019 e no banco de dados Genbank como NM_000618.4, NM_001111284.1 e NM_001111285.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 24 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 25.
[065] O termo "peptídeo sinal do fator de crescimento de Insulina 2 (IGF2)" ou "peptídeo sinal de IGF2", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de IGF2 que é referido no banco de dados Uniprot como P01344 e no banco de dados Genbank como NM_000612.5, NM_001007139.5, NM_001127598.2, NM_001291861.2 e NM_001291862.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 26 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 27.
[066] O termo "peptídeo sinal da albumina sérica (ALB)" ou "peptídeo sinal de ALB", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de ALB que é referido no banco de dados Uniprot como P02768 e no banco de dados Genbank como NM_000477.6 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 29.
[067] O termo "fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)" ou "peptídeo sinal de BDNF", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de BDNF que é referido na base de dados Uniprot como
P23560 e na base de dados Genbank como NM_001143805.1, NM_170731.4, NM_170734.3, NM_001143810.1 e NM_001143809.1 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 31.
[068] O termo "peptídeo sinal de fator-1 derivado de células do estroma (CXCL12)" ou "peptídeo sinal de CXCL12", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de CXCL12 que é referido no banco de dados Uniprot como P48061 e no banco de dados Genbank como NM_000609.6, NM_001033886.2, NM_001178134.1, NM_001277990.1 e NM_199168.3 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 32 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 33.
[069] O termo "peptídeo sinal de peptídeo de sinalização sintético 1 (seq1 sintético)" ou "peptídeo sinal de seq1 sintético", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal sintético 1 e tem a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 34 e/ou é codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 35.
[070] O termo "peptídeo sinal de peptídeo de sinalização sintético 2 (seq2 sintético)" ou "peptídeo sinal de seq1 sintético", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal sintético 1 e tem a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 36 e/ou é codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 37.
[071] O termo "peptídeo sinal da proteína 2 de ligação beta do fator de transformação latente (LTBP2)" ou "peptídeo sinal de LTBP2", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de LTBP2 que é referido no banco de dados Uniprot como Q14767 e na base de dados Genbank como
NM_000428.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 42.
[072] O termo "peptídeo sinal da subunidade ácida lábil do complexo de proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à Insulina (IGFALS)" ou "peptídeo sinal de IGFALS", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de IGFALS que é referido no banco de dados Uniprot como P35858 e no banco de dados Genbank como NM_001146006.1 e NM_004970.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 46 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 47.
[073] O termo "peptídeo sinal de Insulina (INS)" ou "peptídeo sinal de INS", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de INS, que é referido no banco de dados Uniprot como P1308 e no banco de dados Genbank como NM_001185097.1, NM_000207.2, NM_001185098.1 e NM_001291897.1 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 51 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 52. O termo "peptídeo sinal da Eritropoietina (Epo)" ou "peptídeo sinal da Epo", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural da Epo que é referido no banco de dados Uniprot como P01588 e no banco de dados Genbank como NM_000799.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 56 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 57.
[074] O termo "peptídeo sinal do fator estimulador de colônia de Granulócitos (CSF3)" ou "peptídeo sinal de CSF3", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de CSF3 que é referido no banco de dados Uniprot como P09919 e no banco de dados Genbank como NM_000759.3, NM_001178147.1, NM_172219.2 e NM_172220.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 61 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 62.
[075] O termo "peptídeo sinal do fator de crescimento do nervo Beta (NGF)" ou "peptídeo sinal de NGF", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de NGF que é referido na base de dados Uniprot como P01138 e na base de dados Genbank como NM_002506.2 e XM_006710663.3 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 66 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 67.
[076] O termo "peptídeo sinal da Interleucina-4 (IL4)" ou "peptídeo sinal de IL4", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de IL4 que é referido na base de dados Uniprot como P05112 e na base de dados Genbank como NM_000589.3 e NM_172348.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 77 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 78.
[077] O termo "peptídeo sinal da Interleucina-10 (IL10)" ou "peptídeo sinal de IL10", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de IL10 que é referido na base de dados Uniprot como P22301 e na base de dados Genbank como NM_000572.2 e tem de preferência a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 82 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 83.
[078] O termo "peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5)" ou "peptídeo sinal de FGF5", como usado na presente invenção, refere- se ao peptídeo sinal natural de FGF5 que é referido na base de dados Uniprot como P12034 e na base de dados Genbank como NM_004464.3 e NM_033143.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 87 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 88 ou SEQ ID NO: 183.
[079] O termo "peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2)" ou "peptídeo sinal de FHR2", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de FHR2 que é referido no banco de dados Uniprot como P36980 e no Genbank banco de dados como NM_001312672.1 e NM_005666.3 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 92 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 93.
[080] O termo "peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à Insulina (IBP5)" ou "peptídeo sinal de IBP5", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de IBP5 que é referido na base de dados Uniprot como P24593 e na base de dados Genbank como NM_001312672.1 e NM_000599.3 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 97 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 98.
[081] O termo "peptídeo sinal do Neurotrophin-3 (NTF3)" ou "peptídeo sinal do NTF3", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural do NTF3 que é referido na base de dados Uniprot como P20783 e na base de dados Genbank como NM_002527.4, XM_011520963.2 e NM_001102654.1 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 102 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 103.
[082] O termo "peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículos (PATE2)" ou "peptídeo sinal da PATE2", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal natural de PATE2 que é referido na base de dados Uniprot como Q6UY27 e na base de dados Genbank como NM_212555.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 107 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 108.
[083] O termo "peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3)" ou "peptídeo sinal de SOD3", como usado na presente invenção, refere- se ao peptídeo sinal natural de SOD3 que é referido no banco de dados Uniprot como P08294 e no banco de dados Genbank como NM_003102.2 e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 112 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 113.
[084] O termo "sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R)" ou "sequência de codificação de GL-R", como usado na presente invenção, refere-se à cadeia de codificação de GL-R que é uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza e é referido na base de dados Uniprot como P47871 e na base de dados Genbank como NM_000160.4 e XM_006722277.1 e tem de preferência a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 117 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 118.
[085] O termo "peptídeo sinal do fator de crescimento de Insulina 1 (IGF1) modificado", "peptídeo sinal modificado de IGF1" ou "peptídeo sinal de IGF1- modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de IGF1 em que o peptídeo sinal natural de IGF1 que é referido no banco de dados Uniprot como P05019 e no banco de dados Genbank como NM_000618.4, NM_001111284.1 e NM_001111285.2 é modificado pelas substituições G2L / S5L / T9L / Q10L e deleções K3- e C15- e tem de preferência o sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 122 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 123.
[086] O termo "peptídeo sinal do fator de crescimento de Insulina 2 (IGF2) modificado", "peptídeo sinal modificado de IGF2" ou "peptídeo sinal de IGF2- modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de IGF2 em que o peptídeo sinal natural de IGF2 é referido no banco de dados Uniprot como P01344 e no banco de dados Genbank como NM_000612.5, NM_001007139.5, NM_001127598.2, NM_001291861.2 e NM_001291862.2 é modificado pelas substituições G2L/G6L/K7L/S8L e deleções P4-, M5-, I23- e A24- e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 127 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 128.
[087] O termo "peptídeo sinal de fator-1 derivado de células do estroma (CXCL12) modificado", "peptídeo sinal modificado de CXCL12" ou "peptídeo sinal de CXCL12-Modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de CXCL12 em que o peptídeo sinal natural de CXCL12 é referido no banco de dados Uniprot como P48061 e no banco de dados Genbank como NM_000609.6, NM_001033886.2, NM_001178134.1, NM_001277990.1 e NM_199168.3 é modificado pelas deleções N3- e K5- e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 132 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 133.
[088] O termo "peptídeo sinal da Interleucina-4 (IL4) Modificado", "peptídeo sinal modificado de IL4" ou "peptídeo sinal de IL4-Modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de IL4 em que o peptídeo sinal natural de IL4 é referido na base de dados Uniprot como
P05112 e na base de dados Genbank como NM_000589.3 e NM_172348.2 é modificado pelas deleções G2-, T4-, S5- e Q6- e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 166 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 167.
[089] O termo "peptídeo sinal da Interleucina-10 (IL10) Modificado", "peptídeo sinal modificado de IL10" ou "peptídeo sinal de IL10-Modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de IL10 em que o peptídeo sinal natural de IL10 é referido na base de dados Uniprot como P22301 e na base de dados Genbank como NM_000572.2 é modificado pelas substituições H2V/S3L/S4L e S8L e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 174 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 175.
[090] O termo "peptídeo sinal modificado de Insulina (INS) ", "peptídeo sinal modificado de INS" ou "peptídeo sinal de INS-Modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de INS em que o peptídeo sinal natural de INS é referido na base de dados Uniprot como P1308 e na base de dados Genbank como NM_001185097.1, NM_000207.2, NM_001185098.1 e NM_001291897.1 é modificado pelas deleções M5- e R6- e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 147 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 148 ou SEQ ID NO: 182.
[091] O termo "peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) Modificado", "peptídeo sinal modificado de BDNF" ou "peptídeo sinal de BDNF-Modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de BDNF em que o peptídeo sinal natural de BDNF é referido na base de dados Uniprot como P23560 e na base de dados Genbank como
NM_001143805.1, NM_170731.4, NM_170734.3, NM_001143810.1 e NM_001143809.1 é modificado pelas substituições T2L/T7L e S11L e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 137 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 138.
[092] O termo "peptídeo sinal da Eritropoietina (Epo) modificado", "peptídeo sinal modificado de Epo" ou "peptídeo sinal de Epo-Modificado", como usado na presente invenção, refere-se ao peptídeo sinal modificado de Epo em que o peptídeo sinal natural de Epo é referido na base de dados Uniprot como P01588 e na base de dados Genbank como NM_000799.2 é modificado pelas substituições G2L/P7L/W9L e as deleções H4-, E5- e W11- e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 152 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 153.
[093] O termo "fator de crescimento de Insulina 1 (IGF1) pró-domínio modificado", "IGF1 pró-domínio modificado" ou "IGF1-PróModificado", como usado na presente invenção, refere-se ao pró-peptídeo de IGF1 que é uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural não tem a função de um peptídeo sinal na natureza que é referido no banco de dados Uniprot como P05019 e no banco de dados Genbank como NM_000618.4, NM_001111284.1 e NM_001111285.2 e que é modificado pela deleção de dez resíduos de aminoácidos (VKMHTMSSSH) flanqueando 22-31 da extremidade N-terminal do pró-peptídeo e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 142 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 143.
[094] O termo "fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) pró domínio modificado", "ALPI pró domínio modificado" ALPI-Modificado "ou" ALPI-Pró-
Modificado ", como usado na presente invenção, refere-se ao pró-peptídeo de ALPI que ocorre naturalmente da sequência de aminoácidos que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza que é referido na base de dados Uniprot como P09923 e na base de dados Genbank como NM_001631.4 e que é modificada pelas substituições A504L/A505L/S511L/G517L/T518L e deleções H506-, P507-, A509-, A510- e P513- e tem preferencialmente a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 189 e/ou é preferencialmente codificado pela sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 190.
[095] O termo "o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo de IGF1 e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o IGF1 maduro e não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E de IGF1", como usado na presente invenção, refere- se normalmente a um mRNA que compreende uma sequência nucleotídica que codifica o pró-peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1 humano tendo 27 aminoácidos e uma sequência nucleotídica que codifica o IGF1 humano maduro com 70 aminoácidos e que não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo E (também denominado domínio E) de IGF1 humano, isto é, não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um domínio Ea- , Eb- ou Ec. A sequência nucleotídica que codifica o pró-peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1 humano com 27 aminoácidos e a sequência nucleotídica que codifica o IGF1 humano maduro com 70 aminoácidos pode ser otimizada por códon.
[096] O termo "vetor" ou "vetor de expressão", como usado na presente invenção, refere-se a construtos de ocorrência natural ou gerados sinteticamente para absorção, proliferação, expressão ou transmissão de ácidos nucleicos em uma célula, por exemplo, plasmídeos, minicírculos, fagemídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais/mini- cromossomos, bacteriófagos, vírus como baculovírus, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado, vírus herpes simplex, bacteriófagos. Os vetores podem se integrar ao genoma da célula hospedeira ou permanecer como construtos de replicação autônoma dentro da célula hospedeira. Os métodos usados para construir vetores são bem conhecidos por um técnico no assunto e descritos em várias publicações. Em particular, técnicas para construir vetores adequados, incluindo uma descrição dos componentes funcionais e reguladores, tais como promotores, intensificadores, sinais de terminação e poliadenilação, marcadores de seleção, origens de replicação e sinais de splicing, são conhecidos pelo técnico no assunto. Os vetores de expressão eucarióticos irão tipicamente conter também sequências procarióticas que facilitam a propagação do vetor em bactérias, tais como uma origem de replicação e genes de resistência a antibióticos para seleção em bactérias que podem ser removidos antes da transfecção de células eucarióticas. Uma variedade de vetores de expressão eucarióticos, contendo um sítio de clonagem no qual um polinucleotídeo pode ser operacionalmente ligado, são bem conhecidos no estado da técnica e alguns estão disponíveis comercialmente em empresas como Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.; Invitrogen, Carlsbad, Califórnia; Promega, Madison, Wis. ou Invivogen, San Diego, Califórnia.
[097] O termo "vetor de terapia gênica", como usado na presente invenção, refere-se a qualquer vetor que está sendo usado para liberar uma sequência de ácidos nucleicos, por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um gene nas células. Os vetores de terapia gênica e métodos de liberação de genes são bem conhecidos no estado da técnica. Exemplos não limitativos desses métodos incluem sistemas de liberação de vetor viral, incluindo vírus de DNA e RNA, que têm genomas epissomais ou integrados após a liberação à célula, sistemas de liberação de vetor não viral incluindo plasmídeos de DNA,
ácido nucleico nu e ácido nucleico complexado com um veículo de liberação, sistema de transposon (para liberação e integração nos genomas hospedeiro; Moriarity, et al. (2013) Nucleic Acids Res 41 (8), e92, Aronovich, et al., (2011) Hum. Mol. Genet. 20 (R1), R14-R20), transferência de DNA mediada por retrovírus (por exemplo, Vírus da Leucemia de Camundongo Moloney, vírus da necrose do baço, retrovírus como o Vírus do Sarcoma de Rous, Vírus de Sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da leucemia do macaco gibão, vírus da imunodeficiência humana, adenovírus, Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo, e vírus do tumor mamário; vide, por exemplo, Kay et al. (1993) Science 262, 117- 119, Anderson (1992) Science 256, 808-813), e transferência de DNA mediada por vírus de DNA incluindo adenovírus, vírus do herpes, parvovírus e vírus adeno- associado (por exemplo, Ali et al. (1994) Gene Therapy 1, 367-384). Os vetores virais também incluem, mas não estão limitados a vírus adeno-associado, vírus adenovirais, lentivírus, retrovirais e vetores de vírus da herpes simplex. Os vetores capazes de integração no genoma do hospedeiro incluem, mas não estão limitados a retrovírus ou lentivírus.
[098] O termo "unidade de transcrição", "unidade de expressão" ou "cassete de expressão", como usado na presente invenção, refere-se a uma região dentro de um vetor, construto ou sequência polinucleotídica que contém um ou mais genes a serem transcritos, em que os genes contidos no segmento estão operacionalmente ligados um para o outro. Eles são transcritos a partir de um único promotor e a transcrição é terminada por pelo menos um sinal de poliadenilação. Como resultado, os diferentes genes estão pelo menos ligados transcricionalmente. Mais de uma proteína ou produto pode ser transcrito e expresso a partir de cada unidade de transcrição (unidade de transcrição multicistrônica). Cada unidade de transcrição compreenderá os elementos reguladores necessários para a transcrição e tradução de qualquer uma das sequências selecionadas que estão contidas na unidade e cada unidade de transcrição pode conter os mesmos ou diferentes elementos reguladores. Por exemplo, cada unidade de transcrição pode conter o mesmo terminador. O elemento IRES ou intrões podem ser usados para a ligação funcional dos genes dentro de uma unidade de transcrição. Um vetor ou sequência polinucleotídica pode conter mais de uma unidade de transcrição.
[099] O termo "lesão do músculo esquelético", como usado na presente invenção, refere-se a quaisquer lesões e rupturas do músculo esquelético, preferencialmente rupturas do músculo esquelético, induzidas por contrações musculares excêntricas, alongamentos e sobrecarga muscular. Em princípio, qualquer músculo esquelético pode ser afetado por tal lesão ou ruptura. Preferencialmente, as lesões do músculo esquelético são lesões e rupturas do músculo esquelético, em que os músculos esqueléticos são selecionados a partir dos grupos de músculos da cabeça, pescoço, o tórax, as costas, o abdômen, a pélvis, os braços, as pernas e o quadril.
[100] Mais preferencialmente, as lesões do músculo esquelético são lesões e rupturas em que os músculos esqueléticos são selecionados a partir do grupo que consiste em plantar, temporal, papilar, peitoral maior, tibial posterior, tibial anterior, gastrocnêmio, coracobraquial, diafragma, palmar longo, reto do abdome, esfíncter anal externo, esfíncter anal interno, subescapular, bíceps, tríceps, quadríceps, panturrilha, virilha, isquiotibiais, deltoide redondo maior, manguito rotador supraespinhal, manguito rotador infraespinhal, manguito rotador redondo menor, manguito rotador subescapular, reto femoral, reto do abdome, oblíquo externo do abdome, masseter, trapézio, latíssimo, peitoral, eretor da espinha, iliocostal, longissimus, espinhal, latíssimo do dorso, transverso-espinhal, semiespinhal do dorso, semiespinhal do cérvix, semiespinhal da cabeça, multífido, rotatores, interespinhais, esplênio da cabeça,
esplênio do cérvix, intercostais, subcostais, transverso do tórax, levantadores, costelas, serrátil posteriores menores, serrátil posteriores superiores, transverso do abdome, reto do abdome, piramidal, cremaster, músculo quadrado lombar, oblíquo externo, oblíquo interno.
[101] Ainda mais preferencialmente, as lesões do músculo esquelético são lesões e rupturas em que os músculos esqueléticos são selecionados a partir do grupo que consiste em plantar, temporal, papilar, peitoral maior, tibial posterior, tibial anterior, gastrocnêmio, coracobraquial, diafragma, palmar longo, reto do abdome, esfíncter anal externo, esfíncter anal interno, subescapular, bíceps, tríceps, quadríceps, panturrilha, virilha, isquiotibiais, deltoide, redondo maior, manguito rotador supraespinhal, manguito rotador infraespinhal, manguito rotador redondo menor, manguito rotador subescapular, reto femoral, reto do abdome, obliquo externo do abdome, masseter, trapézio, latíssimo, peitoral.
[102] Preferencialmente, quaisquer lesões e rupturas do músculo esquelético, preferencialmente rupturas do músculo esquelético, induzidas por contração muscular excêntrica, alongamento ou sobrecarga muscular, são tratadas pelo método da presente invenção.
[103] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase;
ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[104] Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase ou um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína que é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referido proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza ou uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza que é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[105] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[106] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[107] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[108] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[109] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[110] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[111] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase.
[112] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[113] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[114] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[115] Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase ou um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína que é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza ou uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza que é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[116] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[117] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[118] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[119] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[120] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[121] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[122] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase.
[123] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[124] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, em que o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[125] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[126] Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase ou um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína que é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza ou uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza que é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[127] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[128] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[129] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[130] Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[131] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[132] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[133] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase.
[134] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[135] Em uma modalidade adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3, em que o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[136] Em uma modalidade preferencial, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[137] Em uma modalidade preferencial adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[138] Em uma modalidade preferencial adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[139] Em uma modalidade preferencial adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[140] Em uma modalidade preferencial adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase.
[141] Em uma modalidade preferencial adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[142] Em uma modalidade preferencial adicional, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da referida sequência de aminoácidos tem uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[143] Em uma modalidade o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase;
ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a modificação por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido é feita dentro dos aminoácidos 1-11, preferencialmente dentro dos aminoácidos 1-10, mais preferencialmente dentro dos aminoácidos 1-9, ainda mais preferencialmente dentro os aminoácidos 1-8, em particular dentro dos aminoácidos 1-7, mais particularmente dentro dos aminoácidos 1-6, ainda mais particularmente dentro dos aminoácidos 1-5, particular preferencialmente dentro dos aminoácidos 1-4, de maneira mais particularmente preferencial dentro dos aminoácidos 1-3, de maneira ainda mais particularmente preferencial dentro dos aminoácidos 1-2 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[144] O termo “pontuação hidrofóbica” ou “pontuação de hidrofobicidade” é usado como sinônimo do termo “pontuação de hidropatia” na presente invenção e se refere ao grau de hidrofobicidade de um aminoácido calculado de acordo com a escala Kyte-Doolittle (Kyte J., Doolittle RF; J. Mol. Biol. 157:105- 132(1982)). As pontuações hidrofóbicas de aminoácidos de acordo com a escala Kyte-Doolittle são as seguintes: Aminoácido Código de Uma Letra Pontuação Hidrofóbica Isoleucina I 4,5 Valina V 4,2
Leucina L 3,8 Fenilalanina F 2,8 Cisteína C 2,5 Metionina M 1,9 Alanina A 1,8 Glicina G -0,4 Treonina T -0,7 Serina S -0,8 Triptofano W -0,9 Tirosina Y -1,3 Prolina P -1,6 Histidina H -3,2 Ácido glutâmico E -3,5 Glutamina Q -3,5 Ácido aspártico D -3,5 Asparagina N -3,5 Lisina K -3,9 Arginina R -4,5
[145] A “pontuação hidrofóbica média” de uma sequência de aminoácidos, por exemplo, a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal é calculada ao adicionar a pontuação hidrofóbica de acordo com a escala de Kyte- Doolittle de cada um dos aminoácidos da sequência de aminoácidos, por exemplo, a pontuação hidrofóbica de cada um dos nove aminoácidos dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal, dividido pelo número de aminoácidos, por exemplo, dividido por nove.
[146] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média igual ou superior a 2,05, preferencialmente igual ou superior a 2,1, mais preferencialmente igual a ou superior a 2,15, ainda mais preferencialmente igual ou superior a 2,2, em particular igual ou superior a 2,25, mais particularmente igual ou superior a 2,3, ainda mais particularmente igual ou superior a 2,35. Em uma outra modalidade, os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média entre 2,05 e 4,5, preferencialmente entre 2,1 e 4,5, mais preferencialmente entre 2,15 e 4,5, ainda mais preferencialmente entre 2,2 e 4,5, em particular entre 2,25 e 4,5, mais particularmente entre 2,3 e 4,5, ainda mais particularmente entre 2,35 e 4,5. Em uma outra modalidade, os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média entre 2,05 e 4,0, preferencialmente entre 2,1 e 4,0, mais preferencialmente entre 2,15 e 4,0, ainda mais preferencialmente entre 2,2 e 4,0, em particular entre 2,25 e 4,0, mais particularmente entre 2,3 e 4,0, ainda mais particularmente entre 2,35 e 4,0.
[147] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal está pelo menos 1,0 unidade abaixo, preferencialmente pelo menos 1,1 unidades abaixo, mais preferencialmente pelo menos 1,2 unidades abaixo, ainda mais preferencialmente pelo menos 1,3 unidades abaixo, em particular entre 1,0 e 4 unidades abaixo, mais particularmente entre 1,1 e 4 unidades abaixo, ainda mais particularmente entre 1,2 e 4 unidades abaixo, o mais particularmente entre 1,3 e 4 unidades abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-
terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[148] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-9, os aminoácidos 2-10, os aminoácidos 3-11, os aminoácidos 4-12 e os aminoácidos 5-13 da extremidade N-terminal do amino sequência de ácido do peptídeo sinal, tem cada uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,6, mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,7, ainda mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,8, muito mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,9, em particular uma pontuação hidrofóbica média entre 1,5 e 4,5, mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,6 e 4,5, ainda mais particularmente ainda mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,7 e 4,5, muito mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,8 e 4,5, o mais particular uma pontuação hidrofóbica média entre 1,9 e 4,5.
[149] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 8-16 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é pelo menos igual ou menor, preferencialmente pelo menos 0,4 unidades menores, mais preferencialmente entre 0,4 e 2,0 unidades menores à pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3-11 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[150] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 18 e 40 aminoácidos de comprimento e em que a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 10-18 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é de pelo menos 0,5 unidades, preferencialmente entre 0,5 e 3,0 unidades, abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3-11 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[151] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é de pelo menos 1,5 unidades, preferencialmente entre 1,5 e 3,5 unidades, abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3-11 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[152] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média de quaisquer 9 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal não excede 4,1.
[153] Em uma modalidade da presente invenção, os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreendem pelo menos um aminoácido com pontuação de hidrofobicidade negativa, preferencialmente os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em G, Q, N, T, S, R, K, H, D, E, P, Y e W.
[154] Em uma modalidade da presente invenção, o segundo aminoácido dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L, V e I.
[155] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o segundo aminoácido dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em A, L, S, T, V e W.
[156] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma polaridade média de 6,1 ou menor, preferencialmente uma polaridade média menor que 6,1, mais preferencialmente uma polaridade média menor que 4, ainda mais preferencialmente uma polaridade média menor que 2, em particular uma polaridade média entre 6,1 e 0, mais particularmente uma polaridade média entre 4 e 0, ainda mais particularmente uma polaridade média entre 2 e 0, o mais particularmente uma polaridade média entre 1 e 0,2.
[157] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma polaridade média de 6,1 ou menor, preferencialmente uma polaridade média menor que 6,1, mais preferencialmente uma polaridade média menor que 4, ainda mais preferencialmente uma polaridade média menor que 2, em particular uma polaridade média entre 6,1 e 0, mais particularmente uma polaridade média entre 4 e 0, ainda mais particularmente uma polaridade média entre 2 e 0, o mais particularmente uma polaridade média entre 1 e 0,2.
[158] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma polaridade média de 6,1 ou menor, preferencialmente uma polaridade média menor que 6,1, mais preferencialmente uma polaridade média menor que 4, ainda mais preferencialmente uma polaridade média menor que 2, em particular uma polaridade média entre 6,1 e 0, mais particularmente uma polaridade média entre 4 e 0, ainda mais particularmente uma polaridade média entre 2 e 0, o mais particularmente uma polaridade média entre 1,1 e 0,2.
[159] A polaridade é calculada de acordo com o índice de Polaridade de Zimmerman (Zimmerman JM, Eliezer N., Simha R.; J. Theor. Biol. 21:170- 201(1968)). A "polaridade média" de uma sequência de aminoácidos, por exemplo, a polaridade média dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal é calculada somando-se o valor de polaridade calculado de acordo com o índice de Polaridade de
Zimmerman de cada um dos aminoácidos da sequência de aminoácidos, por exemplo, a polaridade média de cada um dos nove aminoácidos dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal, dividido pelo número de aminoácidos, por exemplo, dividido por nove. A polaridade dos aminoácidos de acordo com o índice de Polaridade de Zimmerman é a seguinte: Aminoácido Código de Uma Letra Polaridade Isoleucina I 0,13 Valina V 0,13 Leucina L 0,13 Fenilalanina F 0,35 Cisteína C 1,48 Metionina M 1,43 Alanina A 0 Glicina G 0 Treonina T 1,66 Serina S 1,67 Triptofano W 2,1 Tirosina Y 1,61 Prolina P 1,58 Histidina H 51,6 Ácido glutâmico E 49,9 Glutamina Q 3,53 Ácido aspártico D 49,7 Asparagina N 3,38 Lisina K 49,5 Arginina R 52
[160] A pontuação hidrofóbica média acima mencionada ou polaridade média de uma sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal da presente invenção pode ser calculada usando o banco de dados online disponível publicamente ProtScale (http://www.expasy.org/tools/protscale.html) referido em Gasteiger E. et al. (Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005).pp. 571-607) com a seleção de Hidrofobicidade de escala Kyte & Doolittle (“Hphob. /Kyte & Doolittle”) ou polaridade de Zimmerman (“Polaridade/Zimmerman”) e configurações correspondentes a um tamanho de janela específico (por exemplo, tamanho de janela de 9 aminoácidos) de um peptídeo sinal, com o valor de peso relativo de borda de janela definido como 100 %, e sem normalização de escala. Os respectivos dados de valor numérico podem ser recuperados ao abrir o link em ‘Formato numérico (detalhado)’ na página de resultados.
[161] Em uma modalidade da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,7. Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,7 e o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 14 e 40 aminoácidos de comprimento.
[162] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média igual ou superior a 1,6, preferencialmente igual ou superior a
1,7, mais preferencialmente igual ou superior a 1,75, ainda mais preferencialmente igual ou superior a 1,8, em particular igual ou superior a 2,0, mais particularmente igual ou superior a 2,1, ainda mais particularmente igual ou superior a 2,2. Em uma outra modalidade, os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média entre 1,6 e 4,5, preferencialmente entre 1,7 e 4,5, mais preferencialmente entre 1,75 e 4,5, ainda mais preferencialmente entre 1,8 e 4,5, em particular entre 2,0 e 4,5, mais particularmente entre 2,1 e 4,5, ainda mais particularmente entre 2,2 e 4,5. Em uma outra modalidade, os aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média entre 1,6 e 4,0, preferencialmente entre 1,7 e 4,0, mais preferencialmente entre 1,75 e 4,0, ainda mais preferencialmente entre 1,8 e 4,0, em particular entre 2,0 e 4,0, mais particularmente entre 2,1 e 4,0, ainda mais particularmente entre 2,2 e 4,0.
[163] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos últimos sete aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é igual ou abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal, preferencialmente pelo menos 0,06 unidades abaixo, mais preferencialmente pelo menos 1,0 unidade abaixo, ainda mais preferencialmente pelo menos 1,1 unidades abaixo, em particular pelo menos 1,2 unidades abaixo, mais particularmente entre 1,0 e 4 unidades abaixo, ainda mais particularmente entre 1,0 e 4 unidades abaixo, o mais particularmente entre 1,2 e 4 unidades abaixo.
[164] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-7, os aminoácidos 2-8, os aminoácidos 3-9, os aminoácidos 4-10 e os aminoácidos 5- 11 da extremidade N-terminal do amino sequência de ácido do peptídeo sinal,
tem cada uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,4, preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5, mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,6. ainda mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,7, muito mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,75, em particular uma pontuação hidrofóbica média entre 1,4 e 4,5, mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,5 e 4,5, ainda mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,6 e 4,5, muito mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,7 e 4,5, o mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,75 e 4,5.
[165] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos últimos sete aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é de pelo menos 1,0 unidades, preferencialmente entre 1,0 e 3,6 unidades, abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[166] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média de quaisquer 7 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal não excede 4,1.
[167] Em uma modalidade da presente invenção, os últimos sete aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreendem pelo menos um aminoácido com pontuação de hidrofobicidade negativa, preferencialmente os últimos sete aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em G, Q, N, T, S, R, K, H, D, E, P, Y e W.
[168] Em uma modalidade da presente invenção, o segundo aminoácido dos aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L, V e I.
[169] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o segundo aminoácido dos aminoácidos 1-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em A, L, S, T, V e W.
[170] Em uma modalidade da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3 unidades. Em uma modalidade, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,3 e o peptídeo sinal compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos com entre 12 e 40 aminoácidos de comprimento.
[171] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média igual ou superior a 1,0, preferencialmente igual ou superior a 1,1, mais preferencialmente igual a ou superior a 1,2, ainda mais preferencialmente igual ou superior a 1,25, em particular igual ou superior a 1,3, mais particularmente igual ou superior a 1,35, ainda mais particularmente igual ou superior a 1,38. Em uma outra modalidade, os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média entre 1 e 4,5, preferencialmente entre 1,1 e 4,5, mais preferencialmente entre 1,2 e 4,5, ainda mais preferencialmente entre 1,25 e
4,5, em particular entre 1,3 e 4,5, mais particularmente entre 1,35 e 4,5, ainda mais particularmente entre 1,38 e 4,5. Em uma outra modalidade, os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos têm uma pontuação hidrofóbica média entre 1,0 e 4,0, preferencialmente entre 1,1 e 4,0, mais preferencialmente entre 1,2 e 4,0, ainda mais preferencialmente entre 1,25 e 4,0, em particular entre 1,3 e 4,0, mais particularmente entre 1,35 e 4,0, ainda mais particularmente entre 1,38 e 4,0.
[172] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos últimos cinco aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é pelo menos 0,2 unidades abaixo, preferencialmente pelo menos 0,24 unidades abaixo, mais preferencialmente pelo menos 1,0 unidade abaixo, ainda mais preferencialmente pelo menos 1,2 unidades abaixo, em particular entre 0,2 e 4 unidades abaixo, mais particularmente entre 0,24 e 4 unidades abaixo, ainda mais particularmente entre 1,0 e 4 unidades abaixo, o mais particularmente entre 1,2 e 4 unidades abaixo a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1-5 da extremidade N- terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[173] Em uma modalidade da presente invenção, os aminoácidos 1-5, os aminoácidos 2-6, os aminoácidos 3-7, os aminoácidos 4-8 e os aminoácidos 5-9 da extremidade N-terminal do amino sequência de ácido do peptídeo sinal, tem cada uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,0, preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,15, mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,2. ainda mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,21, muito mais preferencialmente uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,23, em particular uma pontuação hidrofóbica média entre 1,0 e 4,5, mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,15 e 4,5, ainda mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,2 e 4,5, muito mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,21 e 4,5, o mais particularmente uma pontuação hidrofóbica média entre 1,23 e 4,5.
[174] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média dos últimos cinco aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal está pelo menos 1,2 unidades, preferencialmente entre 1,2 e 3,0 unidades, mais preferencialmente entre 1,2 e 4,3 unidades abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3-7 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
[175] Em uma modalidade da presente invenção, a pontuação hidrofóbica média de quaisquer 5 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal não excede 4,2, preferencialmente não excede 4,3.
[176] Em uma modalidade da presente invenção, os cinco e nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreendem pelo menos um aminoácido com pontuação de hidrofobicidade negativa, preferencialmente os últimos cinco aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreende um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em G, Q, N, T, S, R, K, H, D, E, P, Y e W.
[177] Em uma modalidade da presente invenção, o segundo aminoácido dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L, V e I.
[178] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o segundo aminoácido dos aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em A, L, S, T, V e W.
[179] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de menos de 50% do número dos aminoácidos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal heterólogo à referida proteína.
[180] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal heterólogo à referida proteína sem modificação por um, preferencialmente por dois, mais preferencialmente por três, ainda mais preferencialmente por quatro, o mais preferencialmente por cinco, em particular por seis, mais particularmente por sete, ainda mais particularmente por oito, o mais particularmente por nove ou dez aminoácidos.
[181] Em uma modalidade, o peptídeo sinal modificado tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal heterólogo à referida proteína sem modificação entre 1-2 aminoácidos, preferencialmente entre 1-3 aminoácidos, mais preferencialmente por entre 1- 4 aminoácidos, ainda mais preferencialmente entre 1-5 aminoácidos, o mais preferencialmente entre 1-6 aminoácidos, em particular entre 1-7 aminoácidos, mais particularmente entre 1-10 aminoácidos, ainda mais particularmente entre 1-12 aminoácidos, o mais particularmente entre 1-15 aminoácidos.
[182] Em uma modalidade, o peptídeo sinal modificado tem uma identidade de sequência entre 95% e 50%, preferencialmente entre 95% e 60%, mais preferencialmente entre 95% e 70%, ainda mais preferencialmente entre 95% e 80%, o mais preferencialmente entre 95% e 90% para a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal heterólogo à referida proteína sem modificação.
[183] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que o peptídeo sinal modificado tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal de ocorrência natural (homólogo) da referida proteína, por pelo menos um, preferencialmente por pelo menos dois, mais preferencialmente por pelo menos três, ainda mais preferencialmente por pelo menos quatro, o mais preferencialmente por pelo menos cinco, em particular por pelo menos seis, mais particularmente por pelo menos sete, ainda mais particularmente por pelo menos oito, o mais particularmente por pelo menos nove ou dez aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo sinal modificado heterólogo à referida proteína tem uma identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal de ocorrência natural (homólogo) da referida proteína de menos de 95%, preferencialmente de menos de 90%, mais preferencialmente de menos de 80%, ainda mais preferencialmente menos de 70%, o mais preferencialmente menos de 60%, em particular menos de 50%.
[184] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal homólogo à referida proteína sem modificação tem uma pontuação hidrofóbica média de 2 e abaixo, preferencialmente menor que 2.
[185] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de menos de 50% do número dos aminoácidos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal homólogo à referida proteína.
[186] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o sinal modificado peptídeo homólogo à referida proteína difere da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal homólogo à referida proteína sem modificação por um, preferencialmente por dois, mais preferencialmente por três, ainda mais preferencialmente por quatro, o mais preferencialmente por cinco, em particular por seis, mais particularmente por sete, ainda mais particularmente por oito a 12, o mais particularmente por nove a quinze aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína difere da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal homólogo à referida proteína sem modificação entre 1-2 aminoácidos, preferencialmente entre 1-3 aminoácidos, mais preferencialmente entre 1-4 aminoácidos, ainda mais preferencialmente entre 1-5 aminoácidos, o mais preferencialmente entre 1-6 aminoácidos, em particular entre 1-7 aminoácidos, mais particularmente entre 1-1-10 aminoácidos, ainda mais particularmente entre 1-12 aminoácidos, o mais particularmente entre 1-15 aminoácidos.
[187] Em uma modalidade, o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína tem uma identidade de sequência menos de 95%, preferencialmente menos de 90%, mais preferencialmente menos de 80%, ainda mais preferencialmente menos de 70%, o mais preferencialmente menos de 60%, em particular de menos de 50% para a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal homólogo à referida proteína sem modificação.
[188] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de menos de 50% do número de aminoácidos da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de ocorrência natural.
[189] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada difere da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de ocorrência natural sem modificação por um, preferencialmente por dois, mais preferencialmente por três, ainda mais preferencialmente por quatro, o mais preferencialmente por cinco, em particular por seis, mais particularmente por sete, ainda mais particularmente por oito a doze, o mais particularmente por nove a quinze aminoácidos.
[190] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada difere da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de ocorrência natural sem modificação entre 1-2 aminoácidos, preferencialmente entre 1-3 aminoácidos, mais preferencialmente entre 1-4 aminoácidos, ainda mais preferencialmente entre 1-5 aminoácidos, o mais preferencialmente entre 1-6 aminoácidos, em particular entre 1-7 aminoácidos, mais particularmente entre 1-1-10 aminoácidos, ainda mais particularmente por entre 1-12 aminoácidos, o mais particularmente entre 1-15 aminoácidos.
[191] Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada tem uma identidade de sequência menos de 95%, preferencialmente menos de 90%, mais preferencialmente menos de 80%, ainda mais preferencialmente menos de 70%, o mais preferencialmente menos de 60%, em particular de menos de 50% para a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de ocorrência natural sem modificação.
[192] Em uma modalidade da presente invenção, a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal de ocorrência natural em mais de 50%, preferencialmente em mais de 60%, mais preferencialmente em mais de 70%, ainda mais preferencialmente em mais de 80%, o mais preferencialmente em mais de 90%, em particular em mais de 95%, em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza tem uma identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de um sinal de ocorrência natural de menos de 100%, preferencialmente menos de 95%, mais preferencialmente de menos de 90%, ainda mais preferencialmente de menos de 80%, o mais preferencialmente menos de 70%, em particular menos de 60%, mais particularmente menos de 50%.
[193] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3), o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5), o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5), o peptídeo sinal da próstata e proteína expressa de testículo 2 (PATE2), o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3), e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) ou é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12), o peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2), o peptídeo sinal de insulina (INS) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
[194] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), como mostrado em SEQ ID NO:30, o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3) como mostrado na SEQ ID NO:102, o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) como mostrado na SEQ ID NO:87, o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5) como mostrado na SEQ ID NO:97, o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2) como mostrado na SEQ ID NO:107, o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3) como mostrado na SEQ ID NO:112 e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) como mostrado na SEQ ID NO:92 ou é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo modificado para a referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal modificado de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12) como mostrado na SEQ ID NO:132, o peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2) como mostrado em SEQ ID NO:127, o peptídeo sinal modificado de insulina (INS) como mostrado em SEQ ID NO:147, e o peptídeo sinal modificado do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)
como mostrado em SEQ ID NO:137.
[195] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3), o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5), o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5), o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2), o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3), e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2). Preferencialmente, o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO: 30, o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3) como mostrado na SEQ ID NO:102, o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) como mostrado na SEQ ID NO:87, o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante a insulina (IBP5) como mostrado na SEQ ID NO:97, o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2) como mostrado na SEQ ID NO:107, o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3) como mostrado na SEQ ID NO:112, e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) como mostrado na SEQ ID NO:92.
[196] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12), o peptídeo sinal de fator de crescimento de insulina 2 (IGF2), o peptídeo sinal de insulina (INS) e o peptídeo sinal de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
[197] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal modificado de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C- X-C (CXCL12) como mostrado na SEQ ID NO:132, o peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2) como mostrado na SEQ ID NO:127, o peptídeo sinal modificado de insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:147, e o peptídeo sinal modificado do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:137.
[198] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e IGF1, o peptídeo sinal de insulina e INS, o peptídeo sinal da eritropoietina (EPO) e EPO, o peptídeo sinal de interleucina 4 (IL-4) e IL-4, e o peptídeo sinal de interleucina 10 (IL-10) e IL-
10.
[199] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal homólogo à referida proteína modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:122, o peptídeo sinal modificado de insulina como mostrado na SEQ ID NO:147, o peptídeo sinal modificado da eritropoietina
(EPO) como mostrado na SEQ ID NO:152, o peptídeo sinal modificado da interleucina 4 (IL-4) como mostrado em SEQ ID NO:166, e o peptídeo sinal modificado de interleucina 10 (IL-10) como mostrado em SEQ ID NO:174.
[200] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é selecionada a partir do grupo que consiste no pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R) e o pró-peptídeo de fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI).
[201] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R), iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência é o pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) ou iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró- peptídeo da fosfatase alcalina do tipo intestinal (ALPI).
[202] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R)
[203] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró- peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[204] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró- peptídeo da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI).
[205] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) como mostrado na SEQ ID NO:117, iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada é o pró-peptídeo modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), como mostrado na SEQ ID NO:142 ou iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada A sequência de aminoácidos é o pró-peptídeo modificado da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) como mostrado na SEQ ID NO:189.
[206] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) como mostrado em SEQ ID NO:117.
[207] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada é o pró-peptídeo modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:142.
[208] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada é o pró-peptídeo modificado de fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) como mostrado em SEQ ID NO:189.
[209] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e em que a quantidade da proteína secretada usando o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é mais alta que a quantidade da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína. Preferencialmente, a quantidade da proteína secretada usando o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é mais alta que, preferencialmente pelo menos 1,4 vezes mais alta que a quantidade, da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína.
[210] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e em que a quantidade da proteína secretada usando o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína é mais alta que a quantidade da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína sem modificação. Preferencialmente, a quantidade da proteína secretada usando o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína é mais alta que, preferencialmente pelo menos 1,4 vezes mais alta que a quantidade, da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal não modificado homólogo à referida proteína.
[211] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e em que a quantidade da proteína secretada usando a sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza é mais alta que a quantidade da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína. Preferencialmente, a quantidade da proteína secretada utilizando a sequência de aminoácidos de ocorrência natural opcionalmente modificada é mais alta que, preferencialmente pelo menos 1,4 vezes mais alta que a quantidade da referida proteína secretada utilizando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína.
[212] Em uma modalidade da presente invenção, em que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma tiorredoxina, mais particularmente em que a proteína não seja um fator de viabilidade do cone derivado do bastonete.
[213] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é selecionado a partir de i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína e a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina-4 (IL-4) e interleucina- 10 (IL-10). i) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é IGF1. ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10); iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-
R) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[214] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína e a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10).
[215] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína e a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado em SEQ ID NO:188, insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:185, eritropoietina (EPO) como mostrado na SEQ ID NO:184, interleucina-4 (IL-4) como mostrado na SEQ ID NO:186 e interleucina-10 (IL-10) como mostrado na SEQ ID NO:187.
[216] Em uma modalidade da presente invenção o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é IGF1.
[217] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é IGF1 como mostrado em SEQ ID NO:188.
[218] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10).
[219] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é selecionado a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado em SEQ ID NO:188 insulina (INS) como mostrado em SEQ ID NO:185, eritropoietina (EPO) como mostrado em SEQ ID NO:184, interleucina-4 (IL-4) como mostrado na SEQ ID NO:186 e interleucina-10 (IL-10) como mostrado na SEQ ID NO: 187.
[220] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[221] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró- peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[222] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró- peptídeo da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[223] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), como mostrado na SEQ ID NO:188.
[224] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada é o pró-peptídeo modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:188.
[225] Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural modificada é o pró-peptídeo modificado da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) e a proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:188.
[226] Em uma modalidade preferencial da presente invenção o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3), o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblasto 5 (FGF5), o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5), o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2), o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3), e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2), com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12), o peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2), o peptídeo sinal de insulina (INS) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), o peptídeo sinal de insulina (INS), o peptídeo sinal da eritropoietina (EPO), o peptídeo sinal da interleucina 4 (IL-4) e o peptídeo sinal da interleucina 10 (IL-10); iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R); iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-protídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-protídeo da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI).
[227] Em uma modalidade preferencial da presente invenção o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3), o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblasto 5 (FGF5), o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5), o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2), o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3), e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios;
i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12), o peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2), o peptídeo sinal de insulina (INS) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e IGF1, o peptídeo sinal de insulina e INS, o peptídeo sinal da eritropoietina (EPO) e EPO, o peptídeo sinal da interleucina 4 (IL-4) e IL-4, o peptídeo sinal de interleucina 10 (IL-10) e IL-10; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que o peptídeo sinal é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R) e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; e hormônios, e é preferencialmente um fator de crescimento; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios e é preferencialmente um fator de crescimento; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios, e é preferencialmente um fator de crescimento.
[228] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3), o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblasto 5 (FGF5), o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5), o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2), o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3), e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina 4 (IL-4) e interleucina 10 (IL-10); i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12), o peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2), o peptídeo sinal de insulina (INS) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e a referida proteína é fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e IGF1, o peptídeo sinal de insulina e INS, o peptídeo sinal da eritropoietina (EPO) e EPO, o peptídeo sinal da interleucina 4 (IL-4) e IL-4, o peptídeo sinal de interleucina 10 (IL-10) e IL-10; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[229] Em uma modalidade preferencial da presente invenção o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e IGF1, insulina, EPO ou IL-10, o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3) e IGF1, o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) e IGF1 ou IL4, o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5) e IGF1, o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículo (PATE2) e IGF1, o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3) e IGF1, e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) e IGF1; i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12) e IGF1, o peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2) e IGF1, o peptídeo sinal de insulina (INS) e IGF1, e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e IGF1; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína e a proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e IGF1, o peptídeo sinal de insulina e INS, o peptídeo sinal da eritropoietina (EPO) e EPO, o peptídeo sinal da interleucina 4 (IL-4) e IL-4, o peptídeo sinal de interleucina 10 (IL-10) e
IL-10; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1); e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é o pró-peptídeo da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1).
[230] Em uma modalidade preferencial da presente invenção o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:30, o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3) como mostrado na SEQ ID NO:102, o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) como mostrado na SEQ ID NO:87, o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5) como mostrado na SEQ ID NO:97, o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículos (PATE2)
como mostrado na SEQ ID NO:107, o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3) como mostrado na SEQ ID NO:112, e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) como mostrado na SEQ ID NO:92, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12) como mostrado em SEQ ID NO:132, o peptídeo sinal de fator de crescimento de insulina 2 (IGF2) como mostrado em SEQ ID NO:127, o peptídeo sinal de insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:147, e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:137, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:122, o peptídeo sinal modificado de insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:147, o peptídeo sinal modificado da eritropoietina (EPO) como mostrado na SEQ ID NO:152, o peptídeo sinal modificado da interleucina 4 (IL-4) como mostrado na SEQ ID NO:166, e o peptídeo sinal modificado da interleucina 10 (IL-10) como mostrado na SEQ ID NO:174; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) como mostrado em SEQ ID NO:117; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos é o pró- peptídeo modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:142; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos é o pró- peptídeo modificado da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) como mostrado na SEQ ID NO:189.
[231] Em uma modalidade preferencial da presente invenção o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:30, o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3) como mostrado na SEQ ID NO:102, o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) como mostrado na SEQ ID NO:87, o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5) como mostrado na SEQ ID NO:97, o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículos (PATE2) como mostrado na SEQ ID NO:107, o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3) como mostrado na SEQ ID NO:112, e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) como mostrado na
SEQ ID NO:92 e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios; i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo modificado para a referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal modificado de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12) como mostrado na SEQ ID NO:132, o peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2) como mostrado na SEQ ID NO:127, o peptídeo sinal modificado de insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:147, e o peptídeo sinal modificado do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:137 e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir de o grupo que consiste no peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:122 e IGF1 como mostrado na SEQ ID NO:188, o peptídeo sinal modificado de insulina como mostrado na SEQ ID NO:147 e insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:185, o peptídeo sinal modificado da eritropoietina (EPO) como mostrado na SEQ ID NO:152 e EPO como mostrado na SEQ ID NO:184, o peptídeo sinal modificado da interleucina 4 (IL-4) como mostrado em SEQ ID NO:166 e IL-4 como mostrado em SEQ ID NO:186, o peptídeo sinal modificado de interleucina 10 (IL-10) como mostrado em SEQ ID NO:174 e IL-10 como mostrado em SEQ ID NO:187; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) como mostrado em SEQ ID NO:117 e referido a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; e hormônios, e é preferencialmente um fator de crescimento; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos é o pró- peptídeo modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:142 e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; e hormônios, e é preferencialmente um fator de crescimento; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos é o pró- peptídeo modificado da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) como mostrado na SEQ ID NO:189 e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; e hormônios, e é preferencialmente um fator de crescimento.
[232] Em uma modalidade preferencial da presente invenção o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:30, o peptídeo sinal de neurotrofina-3 (NTF-3) como mostrado na
SEQ ID NO:102, o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) como mostrado na SEQ ID NO:87, o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5) como mostrado na SEQ ID NO:97, o peptídeo sinal da proteína 2 expressa da próstata e testículos (PATE2) como mostrado na SEQ ID NO:107, o peptídeo sinal da superóxido dismutase extracelular (SOD3) como mostrado na SEQ ID NO:112, e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator H do complemento (FHR2) como mostrado na SEQ ID NO:92 e a referida proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), como mostrado na SEQ ID NO:188, insulina como mostrado na SEQ ID NO:185, eritropoietina (EPO) como mostrado em SEQ ID NO:184, interleucina 4 (IL-4) como mostrado em SEQ ID NO:186, e interleucina 10 (IL-10) como mostrado em SEQ ID NO:187; i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo modificado para a referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal modificado de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12) como mostrado na SEQ ID NO:132, o peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 2 (IGF2) como mostrado na SEQ ID NO:127, o peptídeo sinal modificado de insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:147, e o peptídeo sinal modificado do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO:137 e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:188; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir de o grupo que consiste no peptídeo sinal modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:122 e IGF1 como mostrado na SEQ ID NO:188, o peptídeo sinal modificado de insulina como mostrado na SEQ ID NO:147 e insulina (INS) como mostrado na SEQ ID NO:185, o peptídeo sinal modificado da eritropoietina (EPO) como mostrado na SEQ ID NO:152 e EPO como mostrado na SEQ ID NO:184, o peptídeo sinal modificado da interleucina 4 (IL-4) como mostrado em SEQ ID NO:166 e IL-4 como mostrado em SEQ ID NO:186, o peptídeo sinal modificado de interleucina 10 (IL-10) como mostrado em SEQ ID NO:174 e IL-10 como mostrado em SEQ ID NO:187; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL- R) como mostrado em SEQ ID NO:117 e a referida proteína é fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado em SEQ ID NO:188; iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos é o pró- peptídeo modificado do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:142 e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:188, e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos é o pró- peptídeo modificado da fosfatase alcalina de tipo intestinal (ALPI) como mostrado na SEQ ID NO:189 e a referida proteína é o fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) como mostrado na SEQ ID NO:188.
[233] Em uma modalidade preferencial particular da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste na sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:8, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:105, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:90, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:100, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:110, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:115, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:95, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:135, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:130, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:150, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:140, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:125, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:161, a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:155, a sequência de mRNA como mostrado na SEQ ID NO:169, a sequência de mRNA como mostrado na SEQ ID NO:177, a sequência de mRNA como mostrado na SEQ ID NO:120, a sequência de mRNA como mostrado na SEQ ID NO:145 e a sequência de mRNA como mostrado em SEQ ID NO:192.
[234] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um mRNA que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase, em particular, um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas.
[235] Em uma modalidade da presente invenção a proteína é uma proteína terapêutica. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a proteína é de origem humana, isto é, é uma proteína humana. Em uma modalidade preferencial adicional da presente invenção a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases e proteínas vasoativas todos de origem humana. Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, a proteína da presente invenção é uma proteína humana selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases humanas;
citocinas humanas; ligantes extracelulares humanos e transportadores; proteínas da matriz extracelular humana; glucosidases humanas; glicosiltransferases humanas; fatores de crescimento humano; proteínas de ligação ao fator de crescimento humano; proteínas de ligação à heparina humana; hormônios humanos; hidrolases humanas; imunoglobulinas humanas; isomerases humanas; quinases humanas; liases humanas; inibidores de metaloenzima humana; metaloproteases humanas; proteínas do leite humano; proteínas neuroativas humanas; proteases humanas; inibidores de protease humana; fosfatases de proteínas humanas; esterases humanas; transferases humanas; e proteínas vasoativas humanas.
[236] Em uma modalidade, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases, em que as carboxipeptidases são selecionadas a partir do grupo que consiste em ACE, ACE2, CNDP1, CPA1, CPA2, CPA4, CPA5, CPA6, CPB1, CPB2, CPE, CPN1, CPQ, CPXM1, CPZ e SCPEP1; citocinas em que as citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34,
IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1 e XCL2; ligantes e transportadores extracelulares, em que os ligantes e transportadores extracelulares são selecionados a partir do grupo que consiste em APCS, CHI3L1, CHI3L2, CLEC3B, DMBT1, DMKN, EDDM3A, EDDM3B, EFNA4, EMC10, ENAM, EPYC, ERVH48-1, F13B, FCN1, FCN2, GLDN, GPLD1, HEG1, ITFG1, KAZALD1, KCP, LACRT, LEG1, METRN, NOTCH2NL, NPNT, OLFM1, OLFML3, PRB2, PSAP, PSAPL1, PSG1, PSG6, PSG9, PTX3, PTX4, RBP4, RNASE10, RNASE12, RNASE13, RNASE9, RSPRY1, RTBDN, S100A12, S100A13, S100A7, S100A8, SAA2, SAA4, SCG1, SCG2, SCG3, SCGB1C1, SCGB1C2, SCGB1D1, SCGB1D2, SCGB1D4, SCGB2B2, SCGB3A2, SCGN, SCRG1, SCUBE1, SCUBE2, SCUBE3, SDCBP, SELENOP, SFTA2, SFTA3, SFTPA1, SFTPA2, SFTPC, SFTPD, SHBG, SLURP2, SMOC1, SMOC2, SMR3A, SMR3B, SNCA, SPATA20, SPATA6, SOGA1, SPARC, SPARCL1, SPATA20, SPATA6, SRPX2, SSC4D, STX1A, SUSD4, SVBP, TCN1, TCN2, TCTN1, TF, TULP3, TFF2, TFF3, THSD7A, TINAG, TINAGL1, TMEFF2, TMEM25 e VWC2L; proteínas da matriz extracelular, em que as proteínas da matriz extracelular são selecionadas a partir do grupo que consiste em ABI3BP, AGRN, CCBE1, CHL1, COL15A1, COL19A1, COLEC11, DMBT1, DRAXIN, EDIL3, ELN, EMID1, EMILIN1, EMILIN2, EMILIN3, EPDR1, FBLN1, FBLN2, FBLN5, FLRT1, FLRT2, FLRT3, FREM1, GLDN, IBSP, KERA, KIAA0100, KIRREL3, KRT10, LAMB2, MGP, RPTN, SBSPON, SDC1, SDC4, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SIGLEC1, SIGLEC10, SIGLEC6, SLIT1, SLIT2, SLIT3, SLITRK1, SNED1, SNORC, SPACA3, SPACA7, SPON1, SPON2, STATH, SVEP1, TECTA, TECTB, TNC, TNN, TNR e TNXB; glucosidases, em que as glucosidases são selecionadas a partir do grupo que consiste em AMY1A, AMY1B, AMY1C, AMY2A, AMY2B, CEMIP, CHIA, CHIT1, FUCA2, GLB1L, GLB1L2, HPSE, HYAL1, HYAL3, KL, LYG1, LYG2, LYZL1, LYZL2, MAN2B2, SMPD1, SMPDL3B, SPACA5 e SPACA5B; glicosiltransferases, em que as glicosiltransferases são selecionadas a partir do grupo que consiste em ART5, B4GALT1, EXTL2, GALNT1, GALNT2, GLT1D1, MGAT4A, ST3GAL1, ST3GAL2, ST3GAL3, ST3GAL4, ST6GAL1 e XYLT1; fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD e WISP3; proteínas de ligação ao fator de crescimento, em que as proteínas de ligação ao fator de crescimento são selecionadas a partir do grupo que consiste em CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1 e WIF1; proteínas de ligação à heparina, em que as proteínas de ligação à heparina são selecionadas a partir do grupo que consiste em ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1 e VTN; hormônios, em que os hormônios são selecionados a partir do grupo que consiste em ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2,
CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B e VIP; hidrolases, em que as hidrolases são selecionadas a partir do grupo que consiste em AADACL2, ABHD15, ACP7, ACPP, ADA2, ADAMTSL1, AOAH, ARSF, ARSI, ARSJ, ARSK, BTD, CHI3L2, ENPP1, ENPP2, ENPP3, ENPP5, ENTPD5, ENTPD6, GBP1, GGH, GPLD1, HPSE, LIPC, LIPF, LIPG, LIPH, LIPI, LIPK, LIPM, LIPN, LPL, PGLYRP2, PLA1A, PLA2G10, PLA2G12A, PLA2G1B, PLA2G2A, PLA2G2D, PLA2G2E, PLA2G2F, PLA2G3, PLA2G5, PLA2G7, PNLIP, PNLIPRP2, PNLIPRP3, PON1, PON3, PPT1, SMPDL3A, THEM6, THSD1 e THSD4; imunoglobulinas, em que as imunoglobulinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em IGSF10, IGKV1-12, IGKV1-16, IGKV1-33, IGKV1-6, IGKV1D-12, IGKV1D-39, IGKV1D-8, IGKV2-30, IGKV2D-30, IGKV3-11, IGKV3D-20, IGKV5-2, IGLC1, IGLC2 e IGLC3; isomerases, em que as isomerases são selecionadas a partir do grupo que consiste em NAXE, PPIA e PTGDS; quinases, em que as quinases são selecionadas a partir do grupo que consiste em ADCK1, ADPGK, FAM20C, ICOS e PKDCC; liases, em que as liases são selecionadas a partir do grupo que consiste em PM20D1, PAM e CA6; inibidores de metaloenzima, em que os inibidores de metaloenzima são selecionados a partir do grupo que consiste em FETUB, SPOCK3, TIMP2, TIMP3, TIMP4, WFIKKN1 e WFIKKN2; metaloproteases, em que as metaloproteases são selecionadas a partir do grupo que consiste em ADAM12, ADAM28, ADAM9, ADAMDEC1, ADAMTS1, ADAMTS10, ADAMTS12, ADAMTS13, ADAMTS14, ADAMTS15, ADAMTS16, ADAMTS17, ADAMTS18, ADAMTS19, ADAMTS2, ADAMTS20, ADAMTS3, ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS6, ADAMTS7,
ADAMTS8, ADAMTS9, CLCA1, CLCA2, CLCA4, IDE, MEP1B, MMEL1, MMP1, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP16, MMP17, MMP19, MMP2, MMP20, MMP21, MMP24, MMP25, MMP26, MMP28, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, PAPPA, PAPPA2, TLL1 e TLL2; proteínas do leite, em que as proteínas do leite são selecionadas a partir do grupo que consiste em CSN1S1, CSN2, CSN3 e LALBA; proteínas neuroativas, em que as proteínas neuroativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1 e TAC3; proteases, em que as proteases são selecionadas a partir do grupo que consiste em ADAMTS6, C1R, C1RL, C2, CASP4, CELA1, CELA2A, CELA2B, CFB, CFD, CFI, CMA1, CORIN, CTRB1, CTRB2, CTSB, CTSD, DHH, F10, F11, F12, F2, F3, F7, F8, F9, FAP, FURIN, GZMA, GZMK, GZMM, HABP2, HGFAC, HTRA3, HTRA4, IHH, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLKB1, MASP1, MASP2, MST1L, NAPSA, OVCH1, OVCH2, PCSK2, PCSK5, PCSK6, PCSK9, PGA3, PGA4, PGA5, PGC, PLAT, PLAU, PLG, PROC, PRSS1, PRSS12, PRSS2, PRSS22, PRSS23, PRSS27, PRSS29P, PRSS3, PRSS33, PRSS36, PRSS38, PRSS3P2, PRSS42, PRSS44, PRSS47, PRSS48, PRSS53, PRSS57, PRSS58, PRSS8, PRTN3, RELN, REN, TMPRSS11D, TMPRSS11E, TMPRSS2, TPSAB1, TPSB2, and TPSD1; inibidores de protease, em que os inibidores de protease são selecionados a partir do grupo que consiste em A2M, A2ML1, AMBP, ANOS1, COL28A1, COL6A3, COL7A1, CPAMD8, CST1, CST2, CST3, CST4, CST5, CST6, CST7, CST8, CST9, CST9L, CST9LP1, CSTL1, EPPIN, GPC3, HMSD, ITIH1, ITIH2, ITIH3, ITIH4, ITIH5, ITIH6, KNG1, OPRPN, OVOS1, OVOS2, PAPLN, PI15, PI16, PI3, PZP, R3HDML, SERPINA1, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13P, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA7, SERPINA9, SERPINB2, SERPINB5, SERPINC1, SERPINE1, SERPINE2, SERPINE3, SERPINF2, SERPING1, SERPINI1, SERPINI2, SPINK1, SPINK13, SPINK14, SPINK2, SPINK4, SPINK5, SPINK6, SPINK7,
SPINK8, SPINK9, SPINT1, SPINT3, SPINT4, SPOCK1, SPOCK2, SPP2, SSPO, TFPI, TFPI2, WFDC1, WFDC10A, WFDC13, WFDC2, WFDC3, WFDC5, WFDC6,e WFDC8; proteínas fosfatases, em que as proteínas fosfatases são selecionadas a partir do grupo que consiste em ACP7, ACPP, PTEN e PTPRZ1; esterases, em que as esterases, são selecionadas a partir do grupo que consiste em BCHE, CEL, CES4A, CES5A, NOTUM e SIAE; transferases, em que as transferases são selecionadas a partir do grupo que consiste em METTL24, FKRP, CHSY1, CHST9 e B3GAT1; e proteínas vasoativas, em que as proteínas vasoativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3 e NTS.
[237] Em uma modalidade preferencial, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; proteínas neuroativas; e proteínas vasoativas.
[238] Em uma modalidade mais preferencial, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas em que as citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16,
IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1 e XCL2; fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD e WISP3; proteínas de ligação ao fator de crescimento, em que as proteínas de ligação ao fator de crescimento são selecionadas a partir do grupo que consiste em CHRD, CYR61, ESM1, FGFBP1, FGFBP2, FGFBP3, HTRA1, GHBP, IGFALS, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IGFBP7, LTBP1, LTBP2, LTBP3, LTBP4, SOSTDC1, NOG, TWSG1 e WIF1; proteínas de ligação à heparina, em que as proteínas de ligação à heparina são selecionadas a partir do grupo que consiste em ADA2, ADAMTSL5, ANGPTL3, APOB, APOE, APOH, COL5A1, COMP, CTGF, FBLN7, FN1, FSTL1, HRG, LAMC2, LIPC, LIPG, LIPH, LIPI, LPL, PCOLCE2, POSTN, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, SAA1, SLIT2, SOST, THBS1 e VTN; hormônios, em que os hormônios são selecionados a partir do grupo que consiste em ADCYAP1,
ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG, TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B e VIP; proteínas neuroativas, em que as proteínas neuroativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1 e TAC3; e proteínas vasoativas, em que as proteínas vasoativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em AGGF1, AGT, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL4, ANGPTL6, EDN1, EDN2, EDN3 e NTS.
[239] Em uma modalidade ainda mais preferencial, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; hormônios; e proteínas neuroativas.
[240] Em uma modalidade particular da presente invenção, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas em que as citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em BMP1, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, C1QTNF4, CCL1, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL4, CCL4L, CCL4L2, CCL5, CCL7, CCL8, CD40LG, CER1, CKLF, CLCF1, CNTF, CSF1, CSF2, CSF3, CTF1, CX3CL1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL8, CXCL9, DKK1, DKK2, DKK3, DKK4, EDA, EBI3, FAM3B, FAM3C, FASLG, FLT3LG, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF9, GPI, GREM1, GREM2, GRN, IFNA1, IFNA13, IFNA10,
IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNL4, IFNW1, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL15, IL16, IL17A, IL17B, IL17C, IL17D, IL17F, IL18, IL19, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL20, IL21, IL22, IL23A, IL24, IL25, IL26, IL27, IL3, IL31, IL32, IL33, IL34, IL36A, IL36B, IL36G, IL36RN, IL37, IL4, IL5, IL6, IL7, IL9, LEFTY1, LEFTY2, LIF, LTA, MIF, MSTN, NAMPT, NODAL, OSM, PF4, PF4V1, SCGB3A1, SECTM1, SLURP1, SPP1, THNSL2, THPO, TNF, TNFSF10, TNFSF11, TNFSF12, TNFSF13, TNFSF13B, TNFSF14, TNFSF15, TSLP, VSTM1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1 e XCL2; fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD e WISP3; hormônios, em que os hormônios são selecionados a partir do grupo que consiste em ADCYAP1, ADIPOQ, ADM, ADM2, ANGPTL8, APELA, APLN, AVP, C1QTNF12, C1QTNF9, CALCA, CALCB, CCK, CGA, CGB1, CGB2, CGB3, CGB5, CGB8, COPA, CORT, CRH, CSH1, CSH2, CSHL1, ENHO, EPO, ERFE, FBN1, FNDC5, FSHB, GAL, GAST, GCG, GH, GH1, GH2, GHRH, GHRL, GIP, GNRH1, GNRH2, GPHA2, GPHB5, IAPP, INS, INSL3, INSL4, INSL5, INSL6, LHB, METRNL, MLN, NPPA, NPPB, NPPC, OSTN, OXT, PMCH, PPY, PRL, PRLH, PTH, PTHLH, PYY, RETN, RETNLB, RLN1, RLN2, RLN3, SCT, SPX, SST, STC1, STC2, TG,
TOR2A, TRH, TSHB, TTR, UCN, UCN2, UCN3, UTS2, UTS2B e VIP; e proteínas neuroativas, em que as proteínas neuroativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em CARTPT, NMS, NMU, NPB, NPFF, NPS, NPVF, NPW, NPY, PCSK1N, PDYN, PENK, PNOC, POMC, PROK2, PTH2, PYY2, PYY3, QRFP, TAC1 e TAC3.
[241] Em outra modalidade particular da presente invenção, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas em que as citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em BMP-2, BMP-4, CNTF, MSTN, IFNG, IL6, SPP1; fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em EGF, FGF1, GDNF, IGF1, IGF2, NTF3, TGFB1; hormônios, em que os hormônios são selecionados a partir do grupo que consiste em EPO, FBN1, GH, GHRH, OSTN, UCN; e proteínas neuroativas, em que as proteínas neuroativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em NPFF, NPY, PNOC, POMC.
[242] Em outra modalidade particular da presente invenção, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas em que as citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em BMP-2, BMP-4, CNTF, MSTN, IFNG, IL4, IL6, IL10, SPP1; fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em EGF, FGF1, GDNF, IGF1, IGF2, NTF3, TGFB1; hormônios, em que os hormônios são selecionados a partir do grupo que consiste em EPO, FBN1, GH, GHRH, OSTN, UCN, INS; e proteínas neuroativas, em que as proteínas neuroativas são selecionadas a partir do grupo que consiste em NPFF, NPY, PNOC, POMC.
[243] Em uma modalidade mais particular da presente invenção, a proteína selecionada a partir do grupo constituído por fatores de crescimento. Em uma modalidade ainda mais particular da presente invenção, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em AMH, ARTN, BDNF, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1, EGF, EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, HGF, IGF1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, INS, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1, PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD e WISP3.
[244] Em outra modalidade ainda mais particular da presente invenção, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fatores de crescimento, em que os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em EGF, FGF1, GDNF, IGF1, IGF2, NTF3, TGFB1. O mais particularmente, a proteína é IGF1, preferencialmente IGF1 humano.
[245] Em uma modalidade ainda muito mais particular da presente invenção, a proteína selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; e hormônios, em que preferencialmente as citocinas são selecionadas a partir do grupo que consiste em BMP-2, BMP-4, CNTF, MSTN, IFNG, IL4, IL6, IL10, SPP1; os fatores de crescimento são selecionados a partir do grupo que consiste em EGF, FGF1, GDNF, IGF1, IGF2, NTF3, TGFB1; e os hormônios são selecionados a partir do grupo que consiste em EPO, FBN1, GH, GHRH, OSTN, UCN, INS. O mais particularmente, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina-4 (IL-4) e interleucina-10 (IL-10).
[246] Em uma modalidade da presente invenção o mRNA é um mRNA nu. Em uma modalidade preferencial, o mRNA compreende um análogo de CAP antirreverso, como m7G (5’)G, m7GpppG cap, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) e/ou uma cauda poliA na extremidade 3’, em particular, a fim de melhorar a tradução. O mRNA pode ter regiões adicionais que promovem a tradução conhecida do técnico no assunto.
[247] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o mRNA contém uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados. Em uma modalidade mais preferencial, em tal mRNA modificado 1 a 100%, preferencialmente 10 a 100%, mais preferencialmente 50 a 100%, ainda mais preferencialmente 90 a 100%, o mais preferencialmente 100% dos nucleotídeos de uridina são modificados. Os nucleotídeos contendo adenosina, guanosina e citidina podem ser não modificados ou parcialmente modificados e estão preferencialmente presentes na forma não modificada. Preferencialmente, o teor dos nucleotídeos de uridina modificados no mRNA está na faixa de 5 a 25%. Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, os nucleotídeos de uridina modificados são N1-Metilpseudouridinas. Em uma modalidade mais particularmente preferencial da presente invenção, o mRNA contém uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados, em que tal mRNA modificado 1 a 100%, preferencialmente 10 a 100%, mais preferencialmente 50 a 100%, ainda mais preferencialmente 90 a 100%, o mais preferencialmente 100% dos nucleotídeos de uridina são N1- Metilpseudouridinas.
[248] Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção o mRNA é um mRNA que é otimizado por códon e contém uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados. Em uma modalidade mais preferencial, em tal mRNA modificado 1 a 100%, preferencialmente 10 a 100%, mais preferencialmente 50 a 100%, ainda mais preferencialmente 90 a 100%, mais preferencialmente 100% dos nucleotídeos de uridina são modificados. Os nucleotídeos contendo adenosina, guanosina e citidina podem ser não modificados ou parcialmente modificados e estão preferencialmente presentes na forma não modificada. Preferencialmente, o teor dos nucleotídeos de uridina modificados no mRNA está na faixa de 5 a 25%. Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, os nucleotídeos de uridina modificados são N1-Metilpseudouridinas. Em uma modalidade mais particularmente preferencial da presente invenção, o RNA é mRNA que contém uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados, em que em tal mRNA modificado 1 a 100%, preferencialmente 10 a 100%, mais preferencialmente 50 a 100%, ainda mais preferencialmente 90 a 100%, mais preferencialmente 100% dos nucleotídeos de uridina são N1- Metilpseudouridinas.
[249] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) como proteína, mais preferencialmente o mRNA é mRNA nu compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) como proteína. Nesta modalidade preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o IGF-1 humano maduro.
[250] Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo de IGF1, preferencialmente o pró-peptídeo de IGF1 humano, e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína madura de IGF1, preferencialmente a proteína madura de IGF1 humano, e não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E de IGF1, preferencialmente não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E humano de IGF1.
[251] Em uma modalidade mais preferencial adicional da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo de IGF1, preferencialmente o pró-peptídeo de IGF1 humano, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína madura de IGF1, preferencialmente a proteína madura de IGF1 humano. Preferencialmente, o mRNA não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E de IGF1, mais preferencialmente não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E humano de IGF1. Em uma modalidade mais preferencial adicional da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo de IGF1, preferencialmente o pró-peptídeo de IGF1 humano, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína madura de IGF1, preferencialmente a proteína madura de IGF1 humano e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Preferencialmente, o mRNA não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E de IGF1, mais preferencialmente não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E humano de IGF1.
[252] Em uma modalidade ainda mais preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácido nucleotídeo que codifica o pró- peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1, preferencialmente de IGF1 humano com 27 aminoácidos e uma sequência de nucleotídeo que codifica o IGF1 maduro, preferencialmente o IGF1 humano maduro possuindo 70 aminoácidos, e preferencialmente não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo E de IGF1, preferencialmente não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E humano de IGF1.
[253] Em outra modalidade ainda mais preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácido nucleotídeo que codifica o pró-
peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1, preferencialmente de IGF1 humano com 27 aminoácidos, uma sequência nucleotídica que codifica o IGF1 maduro, preferencialmente o IGF1 humano maduro possuindo 70 aminoácidos e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Preferencialmente, o mRNA não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo E de IGF1, mais preferencialmente não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E humano de IGF1.
[254] Em uma modalidade preferencial particular da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró- peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1 humano com 27 aminoácidos e uma sequência de ácido nucleotídeo que codifica o IGF1 humano maduro com 70 aminoácidos e preferencialmente não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo E (também chamado de domínio E) de IGF1 humano, em que a sequência nucleotídica que codifica o pró- peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1 humano com 27 aminoácidos e a sequência nucleotídica que codifica o IGF1 humano maduro com 70 aminoácidos e a sequência nucleotídica que codifica os E-peptídeos são referidos na base de dados Uniprot como UniProtKB - P05019 e na base de dados Genbank como NM_000618.4, NM_001111285.2 e NM_001111283.2, respectivamente.
[255] Em uma modalidade preferencial ainda mais particular da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1 humano tendo 27 aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 38 e uma sequência de ácido nucleotídeo que codifica o IGF1 humano maduro possuindo 70 aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 39, e preferencialmente não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo E (também chamado de domínio E) de IGF1 humano.
[256] Em uma modalidade preferencial ainda mais particular da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo (também chamado de pró-domínio) de IGF1 humano tendo 27 aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 38, uma sequência de ácido nucleotídeo que codifica o IGF1 humano maduro possuindo 70 aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 39 e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente, uma sequência de ácido nucleotídeo que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) como mostrado na SEQ ID NO: 30. Preferencialmente, o mRNA não compreende uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo E (também chamado de domínio E) de IGF1 humano.
[257] Em uma modalidade preferencial particular da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende uma sequência de ácidos nucleicos como mostrado na SEQ ID NO: 8.
[258] Em uma modalidade preferencial adicional da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende uma sequência de ácidos nucleicos transcrita a partir na sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 7. Preferencialmente, a sequência de ácidos nucleicos é transcrita a partir da sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 7 in vitro.
[259] Em uma modalidade preferencial mais particular da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende uma sequência de ácidos nucleicos como mostrado na SEQ ID NO: 8 em que preferencialmente 1 a 100%, mais preferencialmente 50 a 100%, ainda mais preferencialmente 90 a 100%, mais preferencialmente 100% dos nucleotídeos de uridina são N1-Metilpseudouridinas.
[260] Em uma modalidade preferencial mais particular adicional da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende uma sequência de ácidos nucleicos transcrita de a sequência de DNA como mostrada na SEQ ID NO: 7, em que preferencialmente 1 a 100%, mais preferencialmente 50 a 100%, ainda mais preferencialmente 90 a 100%, mais preferencialmente 100% dos nucleotídeos de uridina são N1- Metilpseudouridinas. Nesta modalidade, a sequência nucleotídica é preferencialmente transcrita a partir da sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 7 in vitro, enquanto como nucleotídeos de uridina apenas N1- Metilpseudouridina-5'-trifosfato (N1-Metilpseudo-UTP), ou seja, 100% N1- Metilpseudo-UTP é usado para a transcrição da sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 7.
[261] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é o peptídeo sinal do BDNF humano, mais preferencialmente o peptídeo sinal como mostrado na SEQ ID NO: 31, em particular o peptídeo sinal do BDNF humano codificado pela sequência de ácidos nucleicos como mostrado na SEQ ID NO: 30.
[262] Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica na seguinte ordem de 5’ a 3’: i) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); ii) opcionalmente, um pró-domínio da proteína; e iii) a proteína madura.
[263] Em uma modalidade ainda mais preferencial da presente invenção, o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica na seguinte ordem de 5’ a 3’: i) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); ii) opcionalmente, um pró-domínio de IGF humano; e iii) o IGF humano maduro.
[264] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) substitui o peptídeo sinal natural da proteína.
[265] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma unidade de transcrição, um vetor de expressão ou um vetor de terapia gênica compreendendo um ácido nucleico que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
[266] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma unidade de transcrição, um vetor de expressão ou um vetor de terapia gênica compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase, preferencialmente não uma tioredoxina, mais preferencialmente não é um fator de viabilidade do cone derivado do bastonete. Com relação ao peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e da proteína, o mesmo que foi estabelecido na presente invenção se aplica em outro local.
[267] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma unidade de transcrição, um vetor de expressão ou um vetor de terapia gênica compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobulinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas. Com relação ao peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e da proteína, o mesmo que foi estabelecido na presente invenção se aplica em outro local.
[268] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição terapêutica compreendendo o mRNA e/ou a unidade de transcrição, o vetor de expressão ou o vetor de terapia gênica como descrito acima. Com relação ao peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e da proteína, o mesmo que foi estabelecido na presente invenção se aplica em outro local. Normalmente, o mRNA da presente invenção é fornecido como composição terapêutica, que é preferencialmente uma composição líquida. Uma composição líquida é qualquer composição na qual o mRNA está presente em solução em um líquido. Em uma modalidade da presente invenção, o mRNA é dissolvido em água ou numa solução aquosa tamponada ou não tamponada. A solução é preferencialmente uma solução aquosa. Assim, o líquido pode ser água, preferencialmente água estéril, mais preferencialmente "água para injeção" (WFI) ou qualquer outra solução aquosa tamponada ou não tamponada. Em uma modalidade da presente invenção, a composição líquida é uma solução não tamponada, preferencialmente uma solução salina, mais preferencialmente uma solução salina de um sal farmaceuticamente aceitável, ainda mais preferencialmente uma solução de NaCl, isto é, soro fisiológico. Preferencialmente, a solução salina é isotônica e ainda mais preferencialmente apresenta um valor de pH fisiológico. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a solução na qual o mRNA está contido é uma solução tamponada. Preferencialmente, tal solução é isotônica ao sangue. Em princípio, pode-se utilizar qualquer tampão que tampone de maneira eficaz na gama fisiológica, em particular na gama de pH 3,0 a 10,5 e mais preferencialmente pH 4,0 a 9,0. Os tampões preferenciais são acetato, fosfato, solução salina tamponada com fosfato (PBS), carbonato, lactato e tampões citrato ou solução de Ringer, preferencialmente solução salina tamponada com fosfato (PBS). Assim, numa modalidade mais preferencial da presente invenção, a solução na qual o mRNA está contido é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[269] A concentração do mRNA na composição terapêutica não é particularmente crucial e pode ser ajustada conforme necessário. Preferencialmente, a concentração encontra-se na faixa de 0,05 a 20,0 μg/μl, mais preferencialmente na faixa de 0,1 a 10,0 μg/μl, ainda mais preferencialmente na faixa de 0,2 a 5 μg/l, em particular na faixa de 0,4 a 2,0 μg/μl, mais particularmente na faixa de 0,6 a 1,5 μg/μl, ainda mais particularmente na faixa de 0,80 a 1,20 μg/μl. Particularmente preferencial é um intervalo de 0,01 μg a 0,1 g, preferencialmente de 0,1 μg a 0,01 g, mais preferencialmente de 0,5 μg a 1 mg, ainda mais preferencialmente de 0,5 μg a 10 μg.
[270] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um kit compreendendo o mRNA e/ou a unidade de transcrição, o vetor de expressão ou o vetor de terapia gênica ou a composição terapêutica como descrito acima, e instruções, opcionalmente um mapa de vetor, opcionalmente uma célula hospedeira, opcionalmente, um meio de cultivo para o cultivo de uma célula hospedeira e/ou opcionalmente um meio de seleção para selecionar e cultivar uma célula hospedeira transfectada. O kit da invenção pode ser fornecido em (ou na forma de) um kit de conteúdo. O kit pode compreender ainda um ou mais dos componentes da composição terapêutica da invenção, por exemplo, em um ou mais recipientes separados. Por exemplo, o kit pode compreender o mRNA (por exemplo, na forma seca), um solubilizante e solução aquosa (tamponada ou não tamponada), por exemplo, em um, dois ou três (ou mais) recipientes separados, respectivamente. O kit também pode incluir o manual de instruções ou o folheto de instruções.
[271] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o mRNA, a unidade de transcrição, o vetor de expressão ou o vetor de terapia gênica, a composição terapêutica ou o kit conforme descrito acima para uso como um medicamento. A respeito do peptídeo sinal, por exemplo, o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e da proteína, o mesmo que foi estabelecido na presente invenção se aplica em outro local.
[272] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um mRNA ou uma composição terapêutica compreendendo ou contendo mRNA para uso em um método de tratamento de lesão musculoesquelética. A presente invenção também fornece o uso de um mRNA ou uma composição terapêutica compreendendo ou contendo mRNA para a fabricação de um medicamento para o tratamento de lesão do músculo esquelético em um indivíduo. A presente invenção fornece também um método de tratamento de uma lesão do músculo esquelético em um indivíduo, cujo método compreende a administração ao indivíduo de um mRNA ou uma composição terapêutica compreendendo ou contendo mRNA.
[273] Lesões do músculo esquelético tais como rupturas musculares, são uma das lesões mais comuns que ocorrem nos esportes, com frequência variando de 10 a 55% de todas as lesões sofridas. Lesões musculares podem ser causadas por contrações musculares excêntricas, alongamentos e sobrecarga muscular. Mais de 90% de todas as lesões esportivas são causadas por contrações musculares excêntricas, alongamentos ou sobrecarga muscular. A lesão do músculo esquelético ocorre quando um músculo é submetido a uma força compressiva pesada e repentina, como um golpe direto. Nas rupturas musculares, o músculo é submetido a uma força de tração excessiva e excêntrica levando ao esforço excessivo das miofibras e, consequentemente, à sua ruptura próximo à junção miotendinosa (JMT). As rupturas musculares são uma das queixas mais comuns tratadas pelos médicos e são responsáveis pela maioria de todas as lesões relacionadas ao esporte.
As lesões do complexo muscular dos isquiotibiais (CMH) geralmente afetam os atletas que participam de esportes que forçam a rápida aceleração e desaceleração durante a corrida e exigem contração muscular excêntrica.
Lesões leves podem ser facilmente tratadas com tratamento conservador, e a lesão mais devastadora é a ruptura total dos músculos isquiotibiais.
As rupturas dos músculos isquiotibiais são tratadas de maneira conservadora ou cirúrgica, dependendo de como são classificadas.
Existem rupturas leves, moderadas ou graves.
Embora as rupturas leves a moderadas possam ser tratadas de forma conservadora, as rupturas graves são uma indicação clara para o tratamento cirúrgico.
O tratamento conservador é ditado pela apresentação clínica e começa imediatamente com crioterapia, bandagem compressiva, imobilização e medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais antes da bandagem elástica e fisioterapia assim que o paciente estiver confortável.
O ultrassom terapêutico é amplamente discutido como uma opção terapêutica, mas nenhum efeito significativo no resultado final da regeneração foi encontrado.
Dentro de 2 semanas, deve haver uma redução nítida da dor para que a fisioterapia possa ser aumentada para incluir exercícios ativos, conforme mencionado acima.
Entretanto, é reconhecido no campo que a intervenção cirúrgica não é isenta de riscos, e os candidatos devem ser cuidadosamente selecionados (Järvinen TA, Järvinen TL, Kääriäinen M, Aärimaa V, Vaittinen S, Kalimo H, Järvinen M (2007) Muscle injuries: optimising recovery.
Best Pract Res Clin Rheumatol 21 (2): 317-331. DOI: 10.1016/j.berh.2006.12.004; Horst K, Dienstknecht T, Sellei RM, Pape HC (2014) Partial rupture of the hamstring muscle complex: a literature review on treatment options.. Eur J Orthop Surg Traumatol 24 (3): 285-9. DOI: 10.1007/s00590-013-1315-x). As opções terapêuticas atuais oferecem pouco além dos próprios processos de cura do corpo e, de fato, é possível que os anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) prejudiquem o processo de cura. Sem terapias farmacêuticas eficazes disponíveis hoje, a necessidade médica não atendida é alta. Em particular, existe uma necessidade de fornecer métodos eficazes para o tratamento da lesão do músculo esquelético que acelere o processo de recuperação e resulte num aumento da função do músculo lesionado.
[274] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o mRNA para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético é o mRNA que codifica um fator de crescimento, preferencialmente mRNA que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1). O mRNA que codifica o fator de crescimento compreende geralmente uma sequência nucleica que codifica um peptídeo de sinalização, opcionalmente, uma sequência nucleica que codifica o pró-peptídeo do fator de crescimento e uma sequência nucleica que codifica o fator de crescimento maduro. O mRNA que codifica IGF1 humano compreende preferencialmente uma sequência nucleica que codifica um peptídeo de sinalização, opcionalmente uma sequência nucleica que codifica o pró-peptídeo de IGF1 humano e uma sequência nucleica que codifica o IGF1 humano maduro, ainda mais preferencialmente uma sequência nucleica que codifica um peptídeo de sinalização, uma sequência nucleica que codifica o pró- peptídeo de IGF1 humano e uma sequência nucleica que codifica o IGF1 humano maduro e, não compreende uma sequência nucleica que codifica um peptídeo E de IGF1 humano. O peptídeo de sinalização compreendido pelo mRNA que codifica um fator de crescimento pode ser um peptídeo de sinalização homólogo ao fator de crescimento, isto é, o peptídeo de sinalização do fator de crescimento ou pode ser um peptídeo de sinalização heterólogo ao fator de crescimento e é preferencialmente um peptídeo de sinalização heterólogo ao crescimento fator,
mais preferencialmente o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), em particular o peptídeo sinal do BDNF humano. O peptídeo de sinalização compreendido pelo mRNA que codifica IGF1 humano pode ser um peptídeo de sinalização homólogo ao IGF1 humano, ou seja, o peptídeo de sinalização de IGF1 humano ou pode ser um peptídeo de sinalização heterólogo a IGF1 humano e é preferencialmente um peptídeo de sinalização heterólogo a IGF1 humano, mais preferencialmente o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), em particular o peptídeo sinal do BDNF humano.
[275] Assim, em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, o mRNA para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético é o mRNA que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1), que compreende uma sequência nucleica que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em particular o peptídeo sinal do BDNF humano, opcionalmente uma sequência nucleica que codifica o pró- peptídeo do IGF1 humano e uma sequência nucleica que codifica o IGF-1 humano maduro. Em uma modalidade ainda mais preferencial da presente invenção, o mRNA para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético é o mRNA que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1), que compreende uma sequência nucleica que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro humano (BDNF) em particular o peptídeo sinal de BDNF humano, opcionalmente uma sequência nucleica que codifica o pró-peptídeo de IGF1 humano e uma sequência que codifica o IGF-1 humano maduro e não compreende uma sequência nucleica que codifica um peptídeo E de IGF1 humano.
[276] Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) IGF1, preferencialmente IGF1 humano; e ii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente o peptídeo sinal do BDNF humano, para uso em um método para tratar lesão do músculo esquelético.
[277] A presente invenção fornece também o uso de um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) IGF1, preferencialmente IGF1 humano; e ii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente o peptídeo sinal do BDNF humano, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de lesão do músculo esquelético em um indivíduo.
[278] A presente invenção fornece também um método de tratamento de uma lesão do músculo esquelético em um indivíduo, cujo método compreende a administração ao indivíduo de um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) IGF1, preferencialmente IGF1 humano; e ii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente o peptídeo sinal do BDNF humano.
[279] Preferencialmente, a presente invenção fornece um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) o IGF1 maduro, preferencialmente o IGF1 humano maduro; ii) opcionalmente, o pró-domínio de IGF1, preferencialmente de IGF1 humano; iii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente o peptídeo sinal do BDNF humano, para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético.
[280] A presente invenção fornece também o uso de um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) o IGF1 maduro, preferencialmente o IGF1 humano maduro; ii) opcionalmente, o pró-domínio de IGF1, preferencialmente de IGF1 humano; iii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente o peptídeo sinal do BDNF humano, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de lesão do músculo esquelético em um indivíduo.
[281] A presente invenção fornece também um método de tratamento de uma lesão do músculo esquelético em um indivíduo, cujo método compreende a administração ao indivíduo de um mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica i) o IGF1 maduro, preferencialmente o IGF1 humano maduro; ii) opcionalmente, o pró-domínio de IGF1, preferencialmente de IGF1 humano; iii) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), preferencialmente o peptídeo sinal do BDNF humano.
[282] No que diz respeito ao mRNA que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético, o mesmo que foi estabelecido na presente invenção se aplica em outro local. Em uma modalidade preferencial particular da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende uma sequência de ácidos nucleicos como mostrado na SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade preferencial adicional da presente invenção, o mRNA compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1) e o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende uma sequência de ácidos nucleicos transcrita a partir da sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 7. Preferencialmente, a sequência de ácidos nucleicos é transcrita a partir da sequência de DNA como mostrado na SEQ ID NO: 7 in vitro.
[283] O mRNA e/ou a composição terapêutica podem ser aplicados a células e tecidos, por exemplo, músculos esqueléticos por meios conhecidos pelos técnicos no assunto, preferencialmente por injeção, mais preferencialmente por injeção intramuscular, tipicamente usando uma seringa com uma agulha. Em princípio, qualquer seringa comercialmente disponível em combinação com uma agulha pode ser usada para este propósito. As agulhas hipodérmicas são preferenciais. O diâmetro de uma agulha é indicado pelo calibre da agulha (G; de acordo com o calibre de agulha de Stub). Tipicamente, as agulhas para uso médico na faixa de 7 G (a maior) a 33 G (a menor) podem ser usadas.
[284] Em algumas modalidades, o mRNA e/ou a composição terapêutica pode ser entregue a uma célula por meio de transferência direta de DNA (Wolff et al. (1990) Science (Ciências) 247, 1465-1468). O mRNA e/ou a composição terapêutica podem ser entregues às células após leve ruptura mecânica da membrana celular, permeabilizando temporariamente as células. Tal ruptura mecânica leve da membrana pode ser realizada forçando suavemente as células através de uma pequena abertura (Sharei et al. PLOS ONE (2015) 10 (4), e0118803). Em outra modalidade, o mRNA e/ou a composição terapêutica pode ser entregue a uma célula por meio de transferência de DNA mediada por lipossoma (por exemplo, Gao & Huang (1991) Biochem. Ciophys. Res. Comm. 179, 280-285, Crystal (1995) Nature Med. 1, 15-17, Caplen et al. (1995) Nature Med.
3, 39-46). O termo "lipossoma" pode abranger uma variedade de veículos lipídicos simples e multilamelares formados pela geração de bicamadas lipídicas fechadas ou agregados. O mRNA pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossoma, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossoma, ligado a um lipossoma por meio de uma molécula de ligação que está associada ao lipossoma e ao oligonucleotídeo, aprisionado num lipossoma ou complexado com um lipossoma.
[285] Em uma modalidade da presente invenção, o RNA ou a composição terapêutica é administrado diretamente no músculo esquelético (preferencialmente por injeção) na forma de um agente terapêutico, isto é, uma composição líquida em que o RNA está contido como RNA nu. No que diz respeito à forma de administração e às características da composição e do RNA nela contido, o mesmo que foi estabelecido na presente invenção se aplica em outro local. Em uma modalidade preferencial, a composição líquida e o mRNA, respectivamente, da presente invenção devem ser administrados diretamente no músculo esquelético. Neste contexto, a forma mais preferencial de administração é a injeção, isto é, injeção intramuscular.
[286] É, em princípio, previsto no contexto da invenção administrar o mRNA e a composição terapêutica, respectivamente, o mais cedo possível, isto é, na fase mais precoce possível da lesão do músculo esquelético. Por exemplo, esta fase é uma vez (a) o(s) primeiro(s) sintoma(s) foi/foram observado(s) (por exemplo, dor). Entretanto, qualquer momento possível após o diagnóstico é possível e notável e, portanto, previsto de acordo com a invenção. Por exemplo, no caso de haver uma intervenção cirúrgica (por exemplo, em seguida de uma ruptura muscular), o mRNA e a composição terapêutica, respectivamente, podem ser administrados já durante, mas pelo menos logo após, a intervenção cirúrgica.
[287] Em uma modalidade, o mRNA e a composição terapêutica, respectivamente, devem ser administrados durante ou mesmo antes da fase inflamatória e proliferativa inicial, respectivamente, da regeneração do músculo esquelético. Por exemplo, a administração pode ser durante o dia 0 ao dia 10, preferencialmente durante o dia 0 ao dia 7, após a lesão. Mais especificamente, a administração pode ser no dia 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 após a lesão. Preferencialmente, a administração é no dia 1 e ainda mais preferencialmente no dia 0 após a lesão. Em uma modalidade preferencial, a composição terapêutica deve ser administrada antes da fase inflamatória que se segue à referida lesão do músculo esquelético. Particularmente preferencial é a administração no dia 1 após a lesão, que é repetida no dia 4 após a lesão.
[288] A administração do mRNA e da composição terapêutica, respectivamente, de acordo com a invenção pode, por exemplo, dependendo do curso da lesão a ser tratada, ser repetida pelo menos uma vez, mas preferencialmente várias vezes (por exemplo, 3 a 5 vezes). A administração repetida pode ser após 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dias, preferencialmente após o dia 2, 3, 4, 5, 6, 7, mais preferencialmente após o dia 3, 4 ou 5. A administração repetida pode ser de a cada poucas semanas (por exemplo, a cada 1, 2, 3 ou 4 semanas) até a cada poucos dias (por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias), preferencialmente a cada 2 ou 3 dias.
[289] O mRNA ou a composição terapêutica da invenção podem ser administrados a um paciente em uma dose adequada. O regime de dosagem pode ser determinado pelo médico assistente, por exemplo, com base em fatores clínicos. Como é bem conhecido no estado da técnica, dosagens para qualquer indivíduo dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, sexo, tempo e via de administração, saúde geral e outros fármacos sendo administrados simultaneamente.
Entretanto, o especialista/médico assistente está prontamente em posição de (a) deduzir concentração(ões) e/ou dosagens (terapeuticamente) eficaz(es) da(s) substância(s) ativa(s) a ser/serem administrada(s), por exemplo, in vivo ou ex vivo. As amostras correspondentes podem ser retiradas, por exemplo, do músculo esquelético (por exemplo, por uma sonda adequada) e os compostos ativos (RNA nu) podem ser detectados e as suas concentrações correspondentes podem ser determinadas nas referidas amostras, por exemplo, por HPLC.
[290] Uma dose típica de substâncias ativas (por exemplo, mRNA) pode estar, por exemplo, na faixa de 1 ng a vários gramas, preferencialmente na faixa de 0,1 μg a 1 g, preferencialmente na faixa de 1 μg a 0,1 g, mais preferencialmente na faixa de 10 μg a 1 mg, ainda mais preferencialmente na faixa de 15 μg a 0,5 mg e mais preferencialmente na faixa de 20 μg a 100 μg. Particularmente preferencial é um intervalo de 0,01 μg a 0,1 g, preferencialmente de 0,1 μg a 0,01 g, mais preferencialmente de 0,5 μg a 1 mg, ainda mais preferencialmente de 0,5 μg a 10 μg. Isso se aplica particularmente a um paciente humano. Aplicado à terapia de (m)RNA, a dosagem de um (m)RNA para expressão deve corresponder a esta faixa; entretanto, doses abaixo ou acima deste intervalo exemplar também são, em princípio, previstas, especialmente considerando os fatores acima mencionados. Geralmente, o regime de administração regular da composição terapêutica deve estar na faixa de 0,1 μg a 10 mg unidades, preferencialmente na faixa de 1 μg a 1 mg unidades, mais preferencialmente na faixa de 10 μg a 0,1 mg unidades por quilograma de peso corporal por dia. Novamente, isso é particularmente aplicado a um paciente humano. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica. As dosagens podem variar, mas uma dosagem preferencial para administração por injeção de (m)RNAs como constituintes da composição líquida da presente invenção é de aproximadamente 105 a 1015 cópias da molécula de (m)RNA por injeção. Novamente, isso se aplica particularmente a um paciente humano.
[291] Em particular, a composição terapêutica da invenção é concebida para ser administrada a um paciente, preferencialmente a um paciente humano/um ser humano. Entretanto, as lesões do músculo esquelético descritas na presente invenção também podem ser tratadas (ou prevenidas) em um indivíduo/paciente animal não humano como, por exemplo, um animal de estimação (por exemplo, cão, gato, coelho, rato e camundongo), gado (por exemplo, vaca, porco, ovelha), um cavalo (por exemplo, um cavalo de corrida) ou pônei, um camelo (por exemplo, um camelo de corrida) ou um pássaro (por exemplo, galinha, peru, papagaio).
[292] Em particular, a composição terapêutica que compreende mRNA é terapeuticamente ativa no processo de cura de uma lesão, um distúrbio e/ou uma doença, como por exemplo, lesão do músculo esquelético.
[293] Em uma modalidade preferencial mais particular da presente invenção, o mRNA que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1) para uso como um medicamento compreende uma sequência de ácidos nucleicos transcrita a partir da sequência de DNA de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade preferencial ainda mais particularmente da presente invenção, o mRNA que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1) para uso como um medicamento compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8.
[294] Qualquer uma das composições terapêuticas da invenção pode ser fornecida juntamente com um manual de instruções ou folheto de instruções. O manual/folheto de instruções pode compreender orientação para o especialista/médico assistente sobre como tratar (ou prevenir) uma doença ou distúrbio como descrito na presente invenção (lesão do músculo esquelético) de acordo com a invenção. Em particular, o manual/folheto de instruções pode compreender orientação quanto ao modo descrito na presente invenção de entrega/administração e regime de entrega/administração, respectivamente (por exemplo, via de entrega/administração, regime de dosagem, tempo de entrega/administração, frequência de entrega/administração). Em particular, o manual/folheto de instruções pode compreender a instrução de que o mRNA, respectivamente, deve ser injetado e/ou é preparado para injeção no músculo esquelético. O manual/folheto de instruções pode ainda compreender a instrução de que o mRNA, respectivamente, é preparado para administração durante a fase inflamatória que segue a lesão do músculo esquelético. Em princípio, o que foi dito na presente invenção em outro local com respeito ao modo de entrega/administração e regime de entrega/administração, respectivamente, pode ser compreendido como respectivas instruções no manual/folheto de instruções. Exemplos Exemplo 1
MÉTODOS E MATERIAIS Clonagem de IGF1 e troca de peptídeos de sinalização
[295] O IGF1 é um polipeptídeo de 70 aminoácidos sintetizado no retículo endoplasmático e secretado através do aparelho de Golgi para atuar como fator de crescimento extracelular de forma auto e parácrina. Para assegurar a expressão e secreção adequadas de IGF1 induzido por mRNA para fora da célula transfectada, a sequência de mRNA incluiu a pré-pró-sequência N-terminal natural de IGF1 humano (pré-pró-IGF1). Esta sequência consistiu na sequência que codifica o pré-domínio (peptídeo de sinalização) do IGF1 humano com 21 aminoácidos (nucleotídeos 1-63) e a sequência que codifica o pró-domínio humano com 27 aminoácidos (nucleotídeos 64-144). Além disso, o construto continha a sequência que codifica a sequência de codificação completa do IGF1 humano maduro com 70 aminoácidos (nucleotídeos 145-354). Em Cpd.2-7, o pré-domínio (peptídeo de sinalização, nucleotídeo 1-63) foi trocado pelos respectivos pré-domínios de IGF2, ALB, BDNF, CXCL12 ou os peptídeos de sinalização sintéticos 1 ou 2. Nenhum domínio E do terminal C foi adicionado ao construto.
Em resumo, o vetor de clonagem continha uma cópia do DNA pré- pro-IGF1 humano sem informação do peptídeo E e foi definido como Cpd.1, enquanto Cpds.2-7 continha pré-domínios alternativos (peptídeos de sinalização). A Figura 1 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificado por seu domínio pré-, pró e de codificação.
A Figura 2 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificado pelo pré-domínio de IGF2 e seu domínio pró e de codificação.
A Figura 3 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificado pelo pré-domínio ALB e seu domínio pró e de codificação.
A Figura 4 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificado pelo pré-domínio BDNF e seu domínio pró e de codificação.
A Figura 5 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificado pelo pré-domínio de CXCL12 e seu domínio pró e de codificação.
A Figura 6 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificada pelo pré-domínio do peptídeo 1 de sinalização sintético e seu domínio pró e de codificação.
A Figura 7 ilustra a sequência de DNA e RNA de IGF1 codificada pelo pré-domínio do peptídeo 2 de sinalização sintético e seu domínio pró e de codificação.
A Figura 8 ilustra o vetor pVAX.A120 (www.thermofisher.com) com o Cpd.1 de inserção.
A Figura 9 ilustra o vetor pMA-T (www.thermofisher.com) com Cpd.2 de inserção.
A Figura 10 ilustra o vetor pMA-T com Cpd.3 de inserção.
A Figura 11 ilustra o vetor pMA-T com Cpd.4 de inserção.
A Figura 12 ilustra o vetor pMA- T com Cpd.5 de inserção.
A Figura 13 ilustra o vetor pMA-RQ (www.thermofisher.com) com Cpd.6 de inserção.
A Figura 14 ilustra o vetor pMA-RQ (www.thermofisher.com) com Cpd.6 de inserção.
A Figura 15 mostra os iniciadores que foram utilizados para amplificar as Cpd.2-7. A Figura 16 resume as identidades dos diferentes pré-domínios, indicando o nome do gene, o número Uniprot, o DNA e a sequência de aminoácidos dos pré-domínios e vetores. Para as Cpd.6 e Cpd.7, nenhum nome de gene existe, pois eram pré- domínios artificiais. A otimização de códon das sequências de DNA e mRNA de Cpds.1-7 foi feita usando GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA).
[296] O quadro de leitura aberta das sequências de DNA pré-pro-IGF1 foi sintetizado a partir de GeneArt (www.thermofisher.com, ThermoFischer, MA) com sítios de restrição BamHI e EcoRI e foi subclonado no vetor pVAX1.A120 usando as mesmas enzimas de restrição. A sequência de DNA de todo o vetor é fornecida na Figura 8. A orientação das inserções clonadas e sequências de bases foi confirmada por sequenciamento de Sanger de vários clones. O clone bem- sucedido foi selecionado como modelo para a produção in vitro de mRNA de transcrição (IVT). Para as variantes de pré-domínio alternativas Cpd.2-Cpd.7, os vetores pMA-T (Figuras 9-12) e pMA-RQ (Figuras 13-14) foram usados como modelos para o IVT. Todas as reações IVT resultaram em mRNAs com caudas polyA120 idênticas. Troca de peptídeos de sinalização em Cpd.8 à Cpd.39 de mRNA
[297] Nas Cpd.8-26 e Cpd.39, o pré-domínio (peptídeo de sinalização, nucleotídeo 1-63) de IGF1 (isto é, Cpd.1) foi trocado pelos respectivos pré- domínios de LTBP2 (Cpd. 8; Uniprot ID: Q14767), IGFALS (Cpd. 9; ID Uniprot: P35858), INS (Cpd. 10; Uniprot ID: P01308), ), Epo (Cpd. 11; Uniprot ID: P01588), CSF3 (Cpd. 12; Uniprot ID: P09919), NGF (Cpd. 13; Uniprot ID: P01138), FGF5 (Cpd. 14; Uniprot ID: P12034), FHR2 (Cpd. 15; Uniprot ID: P36980), IBP5 (Cpd. 16; Uniprot ID: P24593), NTF3 (Cpd. 17; Uniprot ID: P20783), PATE2 (Cpd. 18; Uniprot ID: Q6UY27), SOD3 (Cpd. 19; Uniprot ID: P08294), parte da sequência de codificação de GLR (Cpd. 20; Uniprot ID: P47871), sequência de pré-domínio modificado de IGF1 (Cpd. 21; Uniprot ID: P05019), sequência de pré-domínio modificado de IGF2 (Cpd. 22; Uniprot ID: P01344), sequência de pré-domínio modificado de CXCL12 (Cpd. 23; Uniprot ID: P48061), sequência de pré-domínio modificado de BDNF (Cpd. 24; Uniprot ID: P23560), sequência de pró-domínio modificado de IGF1 (Cpd. 25; Uniprot ID: P05019), sequência de pró-domínio modificado de ALPI (Cpd. 39; Uniprot ID: P09923) e sequência de pré-domínio modificado de INS (Cpd. 26; Uniprot ID: P01308). Como similar à Cpd. 1, todos os compostos especificados acima estavam sem E-peptídeo. A otimização de códon das sequências de DNA e mRNA das Cpds.8-26 e Cpd. 39 foi feita usando GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA).
[298] O Cpd.27 consistiu na sequência que codifica o pré-domínio (peptídeo de sinalização) da eritropoietina humana (Epo; Uniprot ID: P01588) com 27 aminoácidos (nucleotídeos 1-81) e a sequência que codifica a cadeia de codificação para eritropoietina humana com 166 aminoácidos (nucleotídeos 82- 498). Nas Cpd.28 e Cpd.29, o pré-domínio (peptídeo de sinalização, nucleotídeo 1-81) de Epo foi trocado pela sequência de pré-domínio modificado de Epo (Uniprot ID: P01588) e sequência de pré-domínio de BDNF (Uniprot ID: P23560). A otimização de códon das sequências de DNA e mRNA de Cpds.27-29 foi feita usando GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA).
[299] O Cpd.30 consistiu na sequência que codifica o pré-domínio (peptídeo de sinalização) da insulina humana (INS; Uniprot ID: P01308) com 24 aminoácidos (nucleotídeos 1-72), e a sequência que codifica o domínio da cadeia B com 30 aminoácidos (nucleotídeos 73-162), e a sequência que codifica o domínio do peptídeo de conexão (peptídeo C) com 31 aminoácidos (nucleotídeos 163-255) e a sequência que codifica o domínio da cadeia A com 21 aminoácidos (nucleotídeos 256-330). Nas Cpd.31 e Cpd.32, o pré-domínio (peptídeo de sinalização, nucleotídeo 1-72) de INS foi trocado pela sequência de pré-domínio modificado de INS (Uniprot ID: P01308) e sequência de pré-domínio de BDNF (Uniprot ID: P23560). Otimização de códon das sequências de DNA e mRNA dos Cpds. 30-32 foi feita usando GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA).
[300] O Cpd.33 consistiu na sequência que codifica o pré-domínio (peptídeo de sinalização) da interleucina 4 humana (IL-4; Uniprot ID: P05112) com 24 aminoácidos (nucleotídeos 1-72), e a sequência que codifica o domínio da cadeia de codificação com 129 aminoácidos (nucleotídeos 73-387). Nas Cpd.34 e Cpd.35, o pré-domínio (peptídeo de sinalização, nucleotídeo 1-72) de IL-4 foi trocado pela sequência de pré-domínio modificado de IL-4 (Uniprot ID: P05112) e sequência de pré-domínio de FGF5 (Uniprot ID: P01308). A otimização de códon das sequências de DNA e mRNA de Cpds.33-35 foi feita usando GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA).
[301] O Cpd.36 consistiu na sequência que codifica o pré-domínio (peptídeo de sinalização) da interleucina 10 humana (IL-10; Uniprot ID: P22301) com 24 aminoácidos (nucleotídeos 1-54), e a sequência que codifica o domínio da cadeia de codificação com 160 aminoácidos (nucleotídeos 55-534). Nas Cpd.37 e Cpd.38, o pré-domínio (peptídeo de sinalização, nucleotídeo 1-54) de IL-10 foi trocado pela sequência de pré-domínio modificado de IL-10 (Uniprot ID: P22301) e sequência de pré-domínio de BDNF (Uniprot ID: P23560). Otimização de códon das sequências de DNA e mRNA dos Cpds. 36-38 foi feita usando GeneOptimizer® (ThermoFischer, MA).
[302] A sequência de aminoácidos e a sequência de DNA dos peptídeos sinal das Cpd. 1-39 e sequência de RNA e sequência de DNA e vetor da respectivas Cpd. 1- 39 são ilustrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Sequência de aminoácidos e sequência de DNA de peptídeos sinal das Cpd. 1-39 e sequência de RNA e sequência de DNA e vetor das Cpd. 1-39 Cpd Peptídeo Proteín Seq. Seq. Seq. Seq. Seq. nº de a SP AA SP DNA RNA DNA de Vetor sinalizaçã DNA de de vetor o (SP) Cpd. Cpd. de Cpd.
SEQ ID pVAX.A SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 15/ 1 IGF1 IGF1 120/p NO: 25 NO: 24 NO: 1 NO: 2 SEQ ID MA-T NO: 40
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 2 IGF2 IGF1 pMA-T NO: 27 NO: 26 NO: 3 NO: 4 NO: 16
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 3 ALB IGF1 pMA-T NO: 29 NO: 28 NO: 5 NO: 6 NO: 17
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 4 BDNF IGF1 pMA-T NO: 31 NO: 30 NO: 7 NO: 8 NO: 18
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 5 CXCL12 IGF1 pMA-T NO: 33 NO: 32 NO: 9 NO: 10 NO: 19 Seq 1 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID PMA- 6 IGF1 sintética NO: 35 NO: 34 NO: 11 NO: 12 NO: 20 RQ Seq 2 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID PMA- 7 IGF1 sintética NO: 37 NO: 36 NO: 13 NO: 14 NO: 21 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID PMA- 8 LTBP2 IGF1 NO: 41 NO: 42 NO: 43 NO: 44 NO: 45 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID PMA- 9 IGFALS IGF1 NO: 46 NO: 47 NO: 48 NO: 49 NO: 50 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID PMA- 10 INS IGF1 NO: 51 NO: 52 NO: 53 NO: 54 NO: 55 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 11 EPO IGF1 NO: 56 NO: 57 NO: 58 NO: 59 NO: 60 RQ
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 12 CSF3 IGF1 NO: 61 NO: 62 NO: 63 NO: 64 NO: 65 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 13 NGF IGF1 NO: 66 NO: 67 NO: 68 NO: 69 NO: 70 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 30 INS Insulina NO: 51 NO: 52 NO: 71 NO: 72 NO: 73 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 27 EPO EPO NO: 56 NO: 57 NO: 74 NO: 75 NO: 76 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 33 IL4 IL4 NO: 77 NO: 78 NO: 79 NO: 80 NO: 81 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 36 IL10 IL10 NO: 81 NO: 83 NO: 84 NO: 85 NO: 86 RQ SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 14 FGF5 IGF1 NO: 87 NO: 88 NO: 89 NO: 90 NO: 91 RQ
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 15 FHR2 IGF1 pMA-T NO: 92 NO: 93 NO: 94 NO: 95 NO: 96
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 16 IBP5 IGF1 NO: NO: 97 NO: 98 NO: 99 NO: 101 RQ 100
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 17 NTF3 IGF1 NO: NO: NO: NO: NO: 106 RQ 102 103 104 105
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
SEQ ID 18 PATE2 IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T NO: 111 107 108 109 110 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 19 SOD3 IGF1 NO: NO: NO: NO: NO: 116 RQ
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
SEQ ID 20 GLR IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T NO: 121 117 118 119 120
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 21 IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T o por IGF1 NO: 126 122 123 124 125
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 22 IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T o por IGF2 NO: 131 127 128 129 130 Modificad SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
SEQ ID 23 o por IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T NO: 136 CXCL12 132 133 134 135 Modificad SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
SEQ ID 24 o por IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T NO: 141 BDNF 137 138 139 140 Modificad SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
SEQ ID 25 o por IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T NO: 146 IGF1-Pro 142 143 144 145
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 26 IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T o por INS NO: 151 147 148 149 150
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 28 EPO NO: NO: NO: NO: pMA-T o por Epo NO: 156 152 153 154 155 SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 29 BDNF EPO NO: 30 NO: 31 NO: NO: NO: 159 RQ
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 31 INS NO: NO: NO: NO: pMA-T o por INS NO: 162 147 182 160 161
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 32 BDNF INS NO: NO: NO: 30 NO: 31 NO: 165 RQ 163 164
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 34 IL4 NO: NO: NO: NO: pMA-T o por IL4 NO: 170 166 167 168 169
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 35 FGF5 IL4 NO: NO: NO: NO: 87 NO: 173 RQ 183 171 172
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID Modificad SEQ ID 37 IL10 NO: NO: NO: NO: pMA-T o por IL10 NO: 178 174 175 176 177
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID pMA- 38 BDNF IL10 NO: NO: NO: 30 NO: 31 NO: 181 RQ 179 180 Modificad SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
SEQ ID 39 o por IGF1 NO: NO: NO: NO: pMA-T NO: 193 ALPI-Pro 189 190 191 192 Transcrição in vitro (IVT) de mRNA de Cpd.1 à Cpd.7
[303] O vetor pVAX.A120 contendo Cpd.1 (SEQ ID No. 15) também possuía um promotor T7 e uma cauda poli-A de comprimento de 120 pb, e o vetor foi linearizado a jusante da cauda poli-A com enzima XhoI antes da produção de mRNA usando transcrição in vitro (IVT). Para os vetores pMA-T e pMA-RQ, um par de iniciadores homólogos (SEQI ID Nos: 22 e 23) foi utilizado para a produção de IVT-mRNA com base em PCR (Figura 15). O iniciador reverso continha 120 pb de poli-A para incluir uma cauda poli-A no mRNA maduro. Os plasmídeos linearizados e os amplicons de PCR foram usados como modelos para IVT realizada pela T7 RNA polimerase no kit MEGAscript T7 (www.ambion.com). Todos os mRNAs foram produzidos com um análogo de CAP antirreverso (ARCA; [m7G(5')G]) na extremidade 5' e quimicamente modificados com 100% N1- metilpseudo-UTP (www.trilink.com). Os mRNAs transcritos in vitro foram purificados usando o kit MEGAclear (www.ambion.com) e analisados quanto à qualidade e concentração usando o kit RNA 6000 Nano em um Agilent 2100 Bioanalyzer (www.agilent.com). Transcrição in vitro (IVT) de Cpd.1 e Cpd.8 a Cpd.39 de mRNA
[304] Para os vetores pMA-T e pMA-RQ que codificam Cpd. 1 (SEQ ID No. 40; antes da subclonagem no vetor pVAX.A120) e Cpd. 8 a Cpd.39, um par de iniciadores homólogos (SEQI ID Nos: 22 e 23) foi utilizado para a produção de IVT-mRNA com base em PCR (Figura 15). O iniciador reverso continha 120 pb de poli-A para incluir uma cauda poli-A no mRNA maduro. Os amplicons de PCR foram usados como modelos para IVT realizada pela T7 RNA polimerase no kit MEGAscript T7 (www.ambion.com). Todos os mRNAs foram produzidos com um análogo de CAP antirreverso (ARCA; [m7G(5')G]) na extremidade 5' e quimicamente modificados com 100% N1-metilpseudo-UTP (www.trilink.com). Os mRNAs transcritos in vitro foram purificados usando o kit MEGAclear (www.ambion.com) e analisados quanto à qualidade e concentração usando eletroforese em gel de agarose de RNA. Transfecção in vitro de células HEK293T, C2C12 e HepG2
[305] As células de rim embrionário humano 293 (HEK293T; ATCC, CRL- 1573, Rockville, MD, EUA) foram mantidas em meio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM, www.biochrom.com) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) e mistura de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (882087, Biozym, Oldendorf, Alemanha). As células foram semeadas em 7.000-20.000 células/poço em uma placa de cultura de 96 poços e incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 por 24 horas antes da transfecção. As células foram cultivadas em meio de crescimento DMEM contendo 10% de FBS sem antibióticos para atingir a confluência <60% antes da transfecção.
[306] A linha celular de hepatoma humano HepG2 (Cat # 85011430, ECACC UK) foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de bezerro e mistura de penicilina-estreptomicina-anfotericina B (882087, Biozym, Oldendorf, Alemanha) a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As células HepG2 foram subcultivadas a cada 2 e a cada 5 dias em uma proporção de divisão de 1:2 e 1:4, respectivamente. As células foram plaqueadas a uma densidade de 20.000-40.000 células/poço 24 horas antes da transfecção em uma placa de microtitulação de 96 poços. As células foram cultivadas em meio de crescimento DMEM contendo 10% de FBS sem antibióticos para atingir 30-40% de confluência antes da transfecção.
[307] A linha celular de mioblasto de camundongo C2C12 (ATCC, CRL-1772, Rockville, MD, EUA) foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal de bezerro e mistura de penicilina- estreptomicina-anfotericina B (882087, Biozym, Oldendorf, Alemanha ) a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As células C2C12 foram subcultivadas a cada 2 e a cada 5 dias em uma proporção de divisão de 1:2 e 1:4, respectivamente. As células foram plaqueadas a uma densidade de 20.000 células/poço 24 horas antes da transfecção em uma placa de microtitulação de 96 poços. As células foram cultivadas em meio de crescimento DMEM contendo 2% de FBS sem antibióticos para atingir 80-90% de confluência antes da transfecção.
[308] Depois disso, as células foram transfectadas com diferentes variantes de mRNA a 0,3 μg usando Lipofectamine 2000 (www.invitrogen.com) seguindo as instruções do fabricante. Os 100 µl de DMEM foram removidos e substituídos por 50 µl de Opti-MEM e 50 µl de mRNA e complexo Lipofectamine 2000 em Opti-MEM (www.thermofisher.com). Após 5 horas, o meio foi substituído por meio fresco e as placas foram incubadas 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Transfecção in vitro de células HSkMC
[309] As células HSkMC foram semeadas em uma densidade de 40.000 células por 96 poços em uma placa de microtitulação em meio de crescimento SkM (PromoCell, Heidelberg, Alemanha). As células foram cultivadas por 1 dia em uma atmosfera umidificada em incubadora a 37°C e 5% de CO2 a uma confluência de> 90%. No dia da transfecção, as células foram tratadas com diferentes variantes de mRNA (Cpd.1 ou 4) a 2 µg usando Lipofectamin 2000 (www.invitrogen.com). Portanto, 100 µl de meio foram removidos e 1 µl de Lipofectamin/poço adicionado junto com 2 µg de mRNA/poço em meio OPTIMEM (www.thermofisher.com). As células foram então incubadas em uma atmosfera umidificada a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas. Transfecção in vitro de células IMR32
[310] 24 horas antes da transfecção, células IMR32 de neuroblastoma humano caucasiano (Cat # 86041809, ECACC, UK) foram semeadas a uma densidade de 60.000 células por poço em uma placa de microtitulação BRAND 96 pré-revestida (Cat # 782082) em Meio mínimo essencial de Eagle (EMEM, Bioconcept Cat # 1-31S01-I, www.bioconcept.ch) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), L-Glutamina (2 mM) e aminoácidos não essenciais (NEAA, 1x). As células foram mantidas durante a noite a 37°C em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2. As células foram transfectadas com 0,3 µg de construtos de mRNA usando JetMessenger (www.polyplus-transfection.com) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, o complexo mRNA/JetMessenger foi formado pela mistura de 0,25 µl de reagente JetMessenger por 0,1 µg de construto de mRNA. Após incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, o complexo JetMessenger foi adicionado como 10 µl e 5 horas após o meio de transfecção/mRNA/JetMessenger foi removido dos poços e substituído por 100 µl de meio de crescimento fresco e as placas foram incubadas 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Transfecção in vitro de células A549
[311] A linha de células de carcinoma pulmonar humano (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça cat # 6012804) foi mantida em meio de alta glicose de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, Buchs Suíça cat # D0822) suplementado com 10% de FBS (Thermofischer, Basileia, Suíça cat # 10500-064). 24 horas antes da transfecção, as células A549 foram semeadas a uma densidade de 10.000 células/poço em um meio de crescimento regular. Depois disso, as células foram transfectadas com diferentes mRNAs (0,3-0,6 µg) usando Lipofectamine 2000 (www.invitrogen.com) seguindo as instruções do fabricante. 100 µl de DMEM foram removidos. 50 µl de Opti-MEM (www.thermofisher.com) foram adicionados a cada poço seguido por 50 µl de mRNA e complexo Lipofectamine 2000 em Opti-MEM. Após 5 horas de incubação, o meio foi substituído por meio de crescimento fresco e as placas foram incubadas 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Transfecção in vitro de células THP-1
[312] Linha celular de leucemia de monócito humano THP-1 (Sigma-Aldrich, Buchs Suíça, Cat. # 88081201) foi mantida em meio de crescimento (RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% e glutamina 2 mM. As células foram semeadas em
30.000 células THP-1 em uma placa de cultura de células de 96 poços 72h antes da transfecção e ativadas com 50 nM de 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA) (Sigma-Aldrich, Buchs Suíça, Cat. # P8139) diluído em meio de crescimento. As células foram transfectadas com (300-600 ng/poço) de mRNA usando Lipofectamine 2000 (www.thermofisher.com) 100 µl de DMEM foram removidos. 50 µl de Opti-MEM (www.thermofisher.com) foram adicionados a cada poço seguido por 50 µl de mRNA e complexo Lipofectamine 2000 em Opti- MEM. Após 5 horas, o meio foi substituído por meio de crescimento fresco suplementado com PMA 50 nM e as placas foram incubadas 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Neurônios da medula espinhal primária de rato
[313] Ratas Wistar do tipo selvagem (Janvier labs, França) ou ratas SOD1G93A Sprague Dawley (Taconic Bioscience) grávidas com 14 dias de gestação foram sacrificadas usando anestesia profunda com CO2 e deslocamento cervical. Os fetos foram retirados do útero e imediatamente colocados em meio Leibovitz gelado suplementado com penicilina 2% (10.000 U/mL) e solução de estreptomicina (10 mg/mL) (PS) e albumina sérica bovina 1% (BSA). As medulas espinhais foram dissecadas e tratadas durante 20 minutos a 37°C com 0,05% de tripsina-0,02% de EDTA. A dissociação foi interrompida pela adição de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 4,5 g/l de glicose, 0,5 mg/mL de DNAase I e II e 10% de soro fetal de bezerro (FCS). As células foram dissociadas mecanicamente por três passagens forçadas através da ponta de uma pipeta de 10 mL. Além disso, as células foram centrifugadas a 515g durante 10 minutos a 4°C. O sedimento resultante foi ressuspenso em um meio de cultura definido que consiste em meio neurobasal contendo uma solução a 2% de suplemento B27, 2 mmol/l de glutamina, 2% de solução de PS e 10 ng/ml de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). As células foram semeadas em
20.000 células por poço em uma placa pré-revestida com 96 poços de poli-D- lisina e cultivadas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. O meio foi substituído a cada dois dias. Após 11-12 dias em cultura, as construções de mRNA (0,3 µg) foram transfectadas usando JetMessenger (www.polyplus- transfection.com) seguindo as instruções do fabricante. Transfecção in vitro de condrócitos humanos diferenciados.
[314] Condrócitos da cartilagem articular humana (Sigma/Cell Applications, Buchs, Suíça Cat. # 402-05A) foram mantidos em meio de crescimento de condrócitos (Sigma Aldrich, Buchs, Suíça Cat # 411-500). As células incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. As células foram diferenciadas pelo cultivo por um mínimo de 3 semanas em grânulos de alginato em meio de diferenciação (Sigma Aldrich, Buchs, Suíça Cat. # A411D-250). Para a preparação de esferas de Alginato, 1 ml de solução de Alginato estéril a 1,2% (Alginato a 1,2% Sigma Aldrich, Buchs Suíça Cat. # A-2033 em 0,9% NaCl) foram usados por 4 x 106 condrócitos. As células foram ressuspensas no volume adequado de solução de Alginato a 1,2% e distribuídas gota a gota através de uma agulha de calibre 22 em solução de CaCl 100 mM2 em uma placa de cultura de células não tratada de 6 poços. Após 15 minutos, as contas de polimerização foram lavadas 5 vezes com NaCl a 0,9% e 2 vezes com meio de diferenciação. Pérolas de condrócitos/alginato foram incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 para diferenciação por no mínimo 3 semanas com troca de meio a cada dois dias. 24 horas antes da transfecção, condrócitos diferenciados foram liberados das esferas de Alginato por lavagem 2x com NaCl a 0,9% e incubação por cerca de 5 minutos em tampão de dissolução de Alginato (Citrato de sódio 55 mM, NaCl 150 mM, EDTA 30 mM pH 6,8). As células são lavadas 2x com NaCl a 0,9%. 30.000 células por poço foram semeadas em 100 µl de meio de crescimento em uma placa TPP de 96 poços (Sigma Aldrich, Buchs, Suíça Cat. # 92096) e cultivadas durante a noite. As células foram transfectadas com 0,6 µg de construto de mRNA usando JetMessenger (www.polyplus- transfection.com) seguindo as instruções do fabricante. O complexo mRNA/JetMessenger foi adicionado como 10 µL em quadruplicado. O complexo mRNA/JetMessenger foi formado misturando 0,25 µl de reagente JetMessenger por 0,1 µg de construto de mRNA e incubando durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após 5 horas de pós-transfecção, o complexo de transfecção (meio/mRNA/JetMessenger) foi removido dos poços e substituído por 100 µl de meio de crescimento. As células foram incubadas por 24 horas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Análise do nível de proteína em sobrenadantes de cultura de células
[315] Em 24 horas após a transfecção, os sobrenadantes das células transfectadas foram coletados, congelados e armazenados a 20°C até a análise quantitativa de IGF1 (Cat. # E20, Mediagnost, Reutlingen, Alemanha), eritropoietina (EPO; Cat. # BMS2035, ThermoFisher, Basileia, Suíça), insulina (INS, Cat. # RAB0327, Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça), interleucina 4 (IL-4, Cat. # 88- 7046-22, ThermoFisher, Basileia, Suíça) e interleucina 10 (IL-10, Cat. # KIT 10947 Sino Biological, China), por ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Os sobrenadantes celulares foram analisados após diluição com o respectivo tampão ELISA. Análise de dados
[316] Para a estimativa dos níveis de proteínas (IGF1, EPO, INS, IL-4, IL-10) no padrão ou na amostra, o valor médio de absorbância do branco foi subtraído da absorbância média dos padrões ou amostras. Uma curva padrão foi gerada e plotada usando uma regressão não linear de quatro parâmetros de acordo com o protocolo do fabricante. Para determinar a concentração de proteínas (IGF1,
EPO, INS, IL-4, IL-10) em cada amostra, a concentração das diferentes proteínas foi interpolada a partir da curva padrão. A concentração final de proteína da amostra foi calculada pela multiplicação com o fator de diluição. Todos os cálculos foram feitos no GraphPad Prism 8 (San Diego, EUA). Para a expressão da dobra de aumento em comparação com o construto de peptídeo de sinalização endógena, o nível de proteína produzida pelo construto individual foi dividido pelo nível de proteína gerada pelo construto de peptídeo de sinalização endógena na mesma concentração.
RESULTADOS Clonagem de IGF1
[317] A clonagem bem-sucedida de todas as inserções em pVAX.A120 foi confirmada por sequenciamento de Sanger. Todos os clones testados resultaram na orientação correta da inserção de IGF1 com 100% de precisão na sequência. Os clones positivos foram selecionados para a produção de mRNA de IVT. Hidrofobicidade média e polaridade dos Cpds.1-39
[318] Hidrofobicidade média dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-9, para os aminoácidos 1-7 e para os aminoácidos 1-5 da extremidade N-terminal e para os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal e a polaridade média dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal são mostradas na tabela 2-5 abaixo. Tabela 2: Hidrofobicidade e polaridade médias dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-18 da extremidade N-terminal e os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal e polaridade média dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-9 da extremidade N- terminal do peptídeo sinal Cpd Pontuaç . nº ão de hidrofo bicidade aminoá aminoá aminoác aminoáci aminoáci aminoáci aminoáci cidos 2- cidos 3- idos 1-9 dos 4-12 dos 5-13 dos 6-14 dos 7-15 10 11 1 0,614 0,114 0,071 0,129 0,029 0,543 0,1 2 0,344 0,556 1,067 0,989 1,589 1,3 1,656 3 1,211 1,422 2,167 2,689 2,533 2,522 2,122 5 1,878 2,133 2,944 3,211 4,067 3,522 3,256 6 1,989 2,2 2,711 3,011 3,022 2,944 2,367 7 0,278 0,489 1,344 1,644 1,922 2,222 2,644 8 -1,867 -2,256 -1,8 -2,122 -1,422 -0,922 -0,989 9 0,433 0,644 0,644 0,644 1,567 2,422 2,889 10 1,111 1,322 1,544 1,322 1,844 2,056 2,756 11 0,089 0,3 0,244 0,2 0,978 1,789 1,422 12 -0,344 -0,344 -0,978 -0,511 -0,122 -0,122 0,378 13 1,767 1,478 1,767 1,867 1,867 2,056 2,156 30 1,111 1,322 1,544 1,322 1,844 2,056 2,756 27 0,089 0,3 0,244 0,2 0,978 1,789 1,422 33 0,7 0,311 0,778 0,667 1,056 1,567 2,378 36 1,278 1,489 2,311 2,822 3,333 3,056 2,589 4 2,39 2,68 2,67 2,02 1,91 1,56 1,41 14 2,46 2,56 2,96 2,44 2,18 2,29 2,37 15 2,72 3,01 3,02 2,10 2,18 1,62 1,62 16 2,96 3,17 3,12 2,90 2,68 2,61 2,61 17 2,49 2,70 2,99 2,34 2,34 1,53 1,63
18 2,56 2,81 2,70 2,66 2,66 2,62 2,02 19 2,57 2,78 2,78 2,78 2,56 2,09 2,01 20 2,678 2,667 2,744 3,211 2,967 2,5 2,5 21 3,067 3,278 3,167 2,233 2,089 1,978 1,833 22 3,5 3,711 3,711 3,133 3,022 3,022 2,8 23 3,589 3,844 4,067 3,522 3,256 3,211 3,022 34 2,167 2,378 2,378 2,156 2,011 2,389 2,522 37 3,122 3,333 3,333 3,333 3,333 3,056 2,589 31 2,244 2,233 2,456 2,456 2,756 2,756 2,233 24 3,389 3,678 3,678 3,033 2,922 2,567 2,422 28 3,267 3,478 3,478 2,922 3,067 3,067 2,778 25 2,544 2,756 2,256 2,256 2,322 1,811 1,522 38 2,39 2,68 2,67 2,02 1,91 1,56 1,41 29 2,39 2,68 2,67 2,02 1,91 1,56 1,41 32 2,39 2,68 2,67 2,02 1,91 1,56 1,41 35 2,46 2,56 2,96 2,44 2,18 2,29 2,37 26 2,244 2,233 2,456 2,456 2,756 2,756 2,233 39 3,411 3,622 3,622 3,622 3,578 3,578 3,578 Tabela 3: Hidrofobicidade e polaridade médias dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-18 da extremidade N-terminal e os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal e polaridade média dos Cpds.1- 39 para os aminoácidos 1-9 da extremidade N- terminal do peptídeo sinal (continuação) Pontuação Cpd. nº de Polaridade últimos aminoácido aminoácido aminoácido nove aminoácido s 8-16 s 9-17 s 10-18 aminoácido s 1-9 s 1 -0,086 0,5 1 1 7,79 2 2,511 2,8 2,9 2,3 6,352 3 1,822 1,767 1,256 1,256 6,344 5 3,211 3,022 3,022 1,144 6,107 6 1,822 1,867 1,2 1,144 0,824 7 2,1 1,878 1,211 0,7 12,178 8 -1,578 -1,256 -1,267 1,356 23,538 9 2,844 2,322 2,589 0,2 11,466 10 2,756 2,233 2,367 0,133 6,548 11 2,022 2,244 2,256 1,711 12,024 12 0,378 0,889 1,489 -0,311 1,272 13 2,733 1,922 1,622 1,622 0,949 30 2,756 2,233 2,367 0,133 6,548 27 2,022 2,244 2,256 1,711 12,024 33 2,156 2,011 2,389 0,622 1,14 36 2,633 1,856 1,778 1,778 6,621 4 1,70 1,06 0,79 0,79 0,783 14 2,37 1,86 1,63 1,11 0,641 15 1,62 1,08 0,61 0,61 0,664 16 2,10 1,50 1,28 -0,04 0,43 17 1,67 0,78 0,42 0,42 0,659 18 1,46 1,40 1,43 -0,67 0,454
19 2,01 1,34 1,12 1,12 0,731 20 1,989 1,356 1,356 -0,378 0,231 21 1,622 1,511 1,511 0,656 0,436 22 2,9 2,678 2,122 1,833 0,419 23 3,022 2,467 1,656 1,144 0,26 34 1,711 1,711 1,867 0,622 0,646 37 2,633 1,856 1,778 1,778 0,56 31 2,367 1,767 0,956 0,133 0,64 24 2,211 1,567 1,3 1,3 0,443 28 2,778 2,178 2,178 1,711 0,41 25 1,3 0,944 0,722 0,722 0,599 38 1,70 1,06 0,79 0,79 0,783 29 1,70 1,06 0,79 0,79 0,783 32 1,70 1,06 0,79 0,79 0,783 35 2,37 1,86 1,63 1,11 0,641 26 2,367 1,767 0,956 0,133 0,64 39 3,111 2,889 2,6 1,556 0,26 Tabela 4: Hidrofobicidade e polaridade médias dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-13 da extremidade N-terminal e os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal e polaridade média dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-7 da extremidade N- terminal do peptídeo sinal Pontuação de Pontuação de Hidrofobicidade Cpd.
Polaridade nº amino amino amino amino amino amino amino últimos aminoácidos ácidos ácidos ácidos ácidos ácidos ácidos ácidos nove 1-7
1-7 2-8 3-9 4-10 5-11 6-12 7-13 amino ácidos 1 0,614 0,114 0,071 0,129 0,029 0,543 0,1 1 7,79 2 0,286 -0,1 0,229 0,129 0,957 1,229 1,829 2,157 7,724 3 1,129 0,743 1,843 2,514 2,314 2,957 2,957 0,671 7,9 5 1,271 1,6 2,643 2,986 4,086 4086 4,029 1,029 7,814 6 1,614 1,886 2,343 3,014 3,729 3,629 2,886 0,029 0,991 7 -0,586 -0,314 0,586 1,257 1,957 2,343 3,243 0,043 15,589 8 -1,643 -2,557 -2,029 -2,029 -1,443 -1,986 -1,171 0,943 22,596 9 -0,243 0,029 0,029 0,029 0,929 2,029 2,629 -1,057 14,723 10 1,114 1,386 0,9 0,9 1,571 1,557 2,743 -0,243 8,174 11 -0,014 -0,029 -0,1 -0,157 0,171 1,214 1,4 1,886 15,16 12 -0,1 -0,486 -0,971 -0,643 -0,971 -0,686 -0,314 0,171 1,171 13 1,086 1,357 2,114 1,743 1,457 1,457 2,186 1,929 1,183 30 1114 1386 0,9 09 1,571 1557 2743 -0,243 8,174 27 -0,014 -0,029 -0,1 -0,157 0,171 1,214 1,4 1,886 15,16 33 0,586 0,857 0,686 -0,086 0,557 1,071 1,971 0,186 1,221 36 0,929 1,014 1,829 2,486 3,2 3,486 3,486 1,143 8,09 4 2,2 2,2 2,9 2,9 2,243 1,657 1,514 0,486 0,784 14 2,071 2,343 3 2,857 3,371 2,857 1,857 2 0,787 15 2,314 2,686 3,357 3,457 2,8 1,557 2,314 0,257 0,817 16 2,714 2,986 2,929 2,929 2,929 3,286 3,286 -0,571 0,516 17 2,157 2,529 3,043 2,943 2,657 2,071 2,8 -0,257 0,779 18 3,443 3,114 2,471 2,471 2,329 2,471 2,471 -0,3 0,347 19 2,4 2,486 2,486 2,771 2,771 2,486 2,386 0,357 0,71 20 2,643 2,629 2,629 2,943 3,329 3,329 2,729 -0,971 0,279
21 2,857 3,129 3,129 3,029 2,886 1,786 1,6 1 0,523 22 3,357 3,629 3,686 3,586 3,586 2,943 2,8 2,057 0,501 23 3,471 3,8 4,086 4,086 4,029 3,329 2,986 1,029 0,297 34 1,986 2,114 1,971 1,971 1,971 2,457 3,043 0,186 0,73 37 3,3 3,386 3,143 3,143 3,2 3,486 3,486 1,143 0,297 31 1,8 2,071 2,357 2,071 2,743 2,743 2,457 -0,243 0,786 24 3,486 3,486 3,543 3,543 3,543 2,957 2,814 0,486 0,347 28 3,114 3,386 3,386 3,329 3,514 2,857 3,143 1,886 0,49 25 2,371 2,457 2,457 2,6 2,686 2,543 2,186 0,486 0,54 38 2,2 2,2 2,9 2,9 2,243 1,657 1,514 0,486 0,784 29 2,2 2,2 2,9 2,9 2,243 1,657 1,514 0,486 0,784 32 2,2 2,2 2,9 2,9 2,243 1,657 1,514 0,486 0,784 35 2,071 2,343 3 2,857 3,371 2,857 1,857 2 0,787 26 1,8 2,071 2,357 2,071 2,743 2,743 2,457 -0,243 0,786 39 3,586 3,857 3,571 3,571 3,514 3,514 3,514 1,686 0,316 Tabela 5: Hidrofobicidade e polaridade médias dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-9 da extremidade N-terminal e os últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal e polaridade média dos Cpds.1-39 para os aminoácidos 1-5 da extremidade N- terminal do peptídeo sinal Pontuação Pontuação de Hidrofobicidade de Polaridade Cpd. nº últimos aminoáci aminoáci aminoáci aminoáci aminoáci aminoácido nove dos 1-5 dos 2-6 dos 3-7 dos 4-8 dos 5-9 s 1-5 aminoáci dos 1 0,26 -0,28 0,56 1,02 -0,02 0,34 10,546 2 1,26 0,8 0,1 -0,96 -0,26 2,1 0,914 3 0,12 0,3 1,98 2 1,92 -0,38 10,964 5 0,1 0,56 2,1 2,58 4,12 0,32 10,888 6 0,46 0,98 1,96 2,9 3,62 -0,18 1,336 7 -0,82 -2,1 -0,5 0,44 1,14 -0,66 11,398 8 -1,88 -3,04 -1,78 -2,36 -1,62 -0,08 21,734 9 -0,18 -0,64 -1,08 -1,08 0,18 -1,08 20,612 10 1,7 0,42 0,82 0,82 0,68 0,06 1,018 11 -0,2 -0,08 -0,32 -0,8 -0,34 1,96 20,612 12 0,7 0,18 -0,88 -0,96 -0,96 -0,88 0,602 13 1,92 1,28 1,3 1,68 1,82 1,38 1,002 30 1,7 0,42 0,82 0,82 0,68 0,06 1,018 27 -0,2 -0,08 -0,32 -0,8 -0,34 1,96 20,612 33 0,76 0,32 0,52 0,52 0,34 0,02 0,978 36 -0,22 0,16 1,56 2,22 2,88 0,08 11,274 4 2,46 2,84 2,84 2,32 2,4 0,38 0,74 14 1,38 1,76 2,68 2,68 3,6 1,14 1,05 15 2,56 2,02 3,04 3,18 3,18 0,36 0,784 16 2,6 2,58 2,58 2,58 2,58 -0,9 0,696 17 2,44 1,8 2,8 2,8 2,6 -0,86 0,742 18 3,3 3,68 3,68 2,76 1,86 -0,54 0,434 19 3,02 3,14 2,22 2,36 2,36 -0,22 0,364 20 2,18 2,56 2,56 3 3,4 -0,42 0,338 21 3,56 3,94 2,86 2,72 2,72 0,34 0,39
22 3,56 3,94 3,56 3,42 3,5 1,76 0,39 23 3,26 3,72 4,12 4,12 4,04 0,32 0,364 34 2,34 1,64 1,64 1,44 1,24 -0,02 0,68 37 3,1 3,48 3,4 3,14 2,88 0,08 0,364 31 2,08 2,46 1,78 1,78 2,72 0,06 0,758 24 3,36 3,74 3,74 3,22 3,3 0,38 0,434 28 3,24 3,22 3,22 3,14 3,4 1,96 0,66 25 2,2 2,18 2,18 2,12 3,14 0,26 0,73 38 2,46 2,84 2,84 2,32 2,4 0,38 0,74 29 2,46 2,84 2,84 2,32 2,4 0,38 0,74 32 2,46 2,84 2,84 2,32 2,4 0,38 0,74 35 1,38 1,76 2,68 2,68 3,6 1,14 1,05 26 2,08 2,46 1,78 1,78 2,72 0,06 0,758 39 3,5 3,88 3,88 3,88 3,4 0,6 0,39 Transcrição in vitro de mRNA
[319] O plasmídeo IGF1_pVAX.A120 foi linearizado com XhoI e mRNA para IGF1 (Cpd.1) foi produzido usando o sistema IVT. De maneira similar, os mRNAs para IGF1 com pré-domínios alterados (peptídeos de sinalização, Cpd.2-Cpd.7 codificados nos vetores pMA-T e pMA-RQ (Figura-16) foram produzidos no intervalo de 50-200 µg para experimentos de transfecção in vitro usando IVT baseado em PCR. Da mesma forma, para Cpd.1 (SEQ ID No. 40) e Cpd. 8-26 codificado em vetores pMA-T e pMA-RQ, mRNAs para IGF1 com peptídeos de sinalização alterados foram produzidos na faixa de 50-200 µg para experimentos de transfecção in vitro usando IVT baseado em PCR. Além do mRNA para IGF1, os mRNAs da eritropoietina (EPO, Cpd. 27-29), insulina (INS, Cpd. 30-32), interleucina 4 (IL4, Cpd. 33-35) e interleucina 10 (IL10, Cpd. 36-38) com peptídeo de sinalização endógeno ou alterado foram produzidos a 50-200 µg para experimentos de transfecções in vitro. Transfecção in vitro de células HEK293T para teste de secreção de IGF1
[320] Após 24 horas de incubação de células HEK293T com Cpd.1-Cpd.7 mRNAs, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 17). O Cpd.1 foi capaz de induzir a secreção de IGF1 até 50 ng/ml. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente maior do que o Cpd.1 (3,3 vezes, 0,001). Para avaliar a dependência da concentração de Cpd.1 e Cpd.4, diferentes concentrações de Cpd.1 e Cpd.4 (0,02-2 µg/poço) foram testadas quanto à sua indução de secreção de IGF1 no sobrenadante (Figura 18). O Cpd.1 revelou um EC50 de 0,89 µg e para Cpd.4 e EC50 de 0,13 µg, indicando que o Cpd.4 foi 6,8 vezes mais potente na indução da secreção de IGF1 a partir de células HEK293T. Tomados em conjunto, os dados das Figuras 17 e 18 demonstram que o Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 em células HEK293T mais fortes e potentes do que o Cpd.1, sugerindo que este peptídeo de sinalização facilita a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de células C2C12 para teste de secreção de IGF1
[321] Após 24 horas de incubação de células C2C12 com Cpd.1-Cpd.7 mRNAs, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 19). O Cpd.1 foi capaz de induzir a secreção de IGF1 até 60 ng/ml. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente maior do que o Cpd.1 (6,1 vezes, 0,001). Os dados demonstram que o Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 em células C2C12 mais forte do que o Cpd.1, sugerindo que este peptídeo de sinalização facilita a saída celular do IGF1 produzido também neste tipo de célula. Transfecção in vitro de células HSkMC para teste de secreção de IGF1
[322] Após 24 horas de incubação de células HSkMC com Cpd.1 ou Cpd.4 mRNAs, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 20). O Cpd.1 foi capaz de induzir a secreção de IGF1 até 30 ng/ml. O Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 significativamente maior do que o Cpd.1 (3,1 vezes, p <0,05). Os dados demonstram que o Cpd.4 induziu a secreção de IGF1 em células HSkMC primárias mais forte do que o Cpd.1, sugerindo que este peptídeo de sinalização facilita a saída celular do IGF1 produzido também neste tipo de célula. Transfecção in vitro de mRNAs adicionais em células HEK293T para teste de secreção de IGF1
[323] Em outro conjunto de testes, os Cpd.8-Cpd.26 foram analisados quanto ao seu potencial para modular a secreção de IGF1 de células HEK293T. Após 24 horas de incubação com Cpd.1 como controle e Cpd.8-Cpd.26 como mRNAs de teste, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 22). A resposta do Cpd.1 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.1. Considerando que Cpd.8, Cpd.9, Cpd.10, Cpd.11, Cpd.12 e Cpd13 mostraram uma redução da secreção de IGF1, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.17, Cpd.18, Cpd.19, Cpd.20, Cpd.21, Cpd.23, Cpd.24, Cpd.25 e Cpd.26 foram capazes de induzir a secreção de IGF1 significativamente maior até 2,6 vezes em comparação com o Cpd.1. Desse modo, Cpd.15 e Cpd.21 mostraram indução semelhante ao Cpd.4 (vide Figura 17). Tomados em conjunto, os dados demonstram que Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.17, Cpd.18, Cpd.19, Cpd.20, Cpd.21, Cpd.23, Cpd.24, Cpd.25 e o Cpd.26 induziram a secreção de IGF1 em células HEK293T mais fortes e potentes do que o Cpd.1, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de células HepG2 para teste de secreção de IGF1
[324] Após 24 horas de incubação de células HepG2 com Cpd.1 como controle e Cpd.4-Cpd.26 como mRNAs de teste, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 23). A resposta do Cpd.1 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.1. Considerando que Cpd.8, Cpd.9 e Cpd.12 mostraram uma redução da secreção de IGF1, Cpd.4, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.17, Cpd.18, Cpd.19, Cpd. 20, Cpd.21, Cpd.22, Cpd.23, Cpd.24, Cpd.25 e Cpd.26 foram capazes de induzir a secreção de IGF1 significativamente maior até 8,3 vezes em comparação com o Cpd.1. Tomados em conjunto, os dados demonstram que Cpd.4, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.17, Cpd.18, Cpd.19, Cpd.20, Cpd.21, Cpd.22, Cpd.23, Cpd.24, Cpd.25 e Cpd.26 induziram a secreção de IGF1 em células HepG2 mais forte do que Cpd.1, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de células neuronais IMR32 para teste de secreção de IGF1
[325] Após 24 horas de incubação de células neuronais IMR324 com Cpd.1 como controle e Cpd.4-Cpd.24 como mRNAs de teste, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 24). A resposta do Cpd.1 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.1. Os Cpd.4, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.17, Cpd.20, Cpd.22, Cpd.23 e Cpd.24 foram capazes de induzir a secreção de IGF1 significativamente maior até 2,6 vezes em comparação com Cpd.1. Tomados em conjunto, os dados demonstram que Cpd.4, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.17, Cpd.20, Cpd.22, Cpd.23 e Cpd.24 induziram a secreção de IGF1 em células neuronais IMR32 mais forte do que o Cpd.1, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de condrócitos humanos para teste de secreção de IGF1
[326] Após 24 horas de incubação de condrócitos com Cpd.1 como controle e Cpd.4-Cpd.25 como mRNAs de teste, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 25). A resposta do Cpd.1 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.1. Os Cpd.4, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.20, Cpd.21, Cpd.22, Cpd.24 e Cpd.25 foram capazes de induzir a secreção de IGF1 significativamente maior até 1,9 vezes em comparação com Cpd.1. Tomados em conjunto, os dados demonstram que Cpd.4, Cpd.14, Cpd.15, Cpd.16, Cpd.20, Cpd.21, Cpd.22, Cpd.24 e Cpd.25 induziram a secreção de IGF1 em condrócitos mais forte do que o Cpd.1, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de motoneurônios de rato para teste de secreção de IGF1
[327] Após 48 horas de incubação de motoneurônios de rato ou SOD1 transgênica de ratoG93A (Figura 26B) com Cpd.1 como controle e Cpd.4, Cpd.14 e Cpd.17 para o tipo selvagem (Figura 26A) ou Cpd.14 e Cpd.17 para SOD1 transgênicoG93A (Figura 26B) como mRNAs de teste, os níveis de IGF1 secretados foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 26 A e B). A resposta do Cpd.1 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.1. Os Cpd.4, Cpd.14 e Cpd.17 foram capazes de induzir a secreção de IGF1 até 4,3 vezes no tipo selvagem ou 9,3 vezes no SOD1G transgênicoS93A em comparação com o Cpd.1. Tomados em conjunto, os dados demonstram que o Cpd.4, Cpd.14 e Cpd.17 induziram a secreção de IGF1 em motoneurônios mais forte do que o Cpd.1, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de células HEK293T, HepG2 e A549 para teste de secreção de EPO
[328] Após 24 horas de incubação de células HEK293T, HepG2 ou A549 com
Cpd.27 como controle e Cpd.28 e Cpd.29 como mRNAs de teste, os níveis de eritropoietina secretada (EPO) foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 27). A resposta do Cpd.27 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.27. O Cpd.28 foi capaz de induzir a secreção de EPO até 1,8 vezes em comparação com o Cpd.27 em células HEK293T (Figura 27A), células HepG2 (Figura 27B) e células A549 (Figura 27C), o Cpd.29 induziu a secreção de EPO até 1,4 em comparação com Cpd.27 em células HEK293T (Figura 27A) e células HepG2 (Figura 27B). Tomados em conjunto, os dados demonstram que o Cpd.28 e o Cpd.29 induziram a secreção de EPO mais forte do que o Cpd.27, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular da EPO produzida nesses tipos de células. Transfecção in vitro de células HEK293T para teste de secreção de INS
[329] Após 24 horas de incubação de células HEK293T com Cpd.30 como controle e Cpd.31 e Cpd.32 como mRNAs de teste, os níveis de insulina secretada (INS) foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 28). A resposta do Cpd.30 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.30. Os Cpd.31 e Cpd.32 foram capazes de induzir a secreção de INS em até 3,9 vezes em comparação com o Cpd.30 em células HEK293T. Tomados em conjunto, os dados demonstram que o Cpd.31 e o Cpd.32 induziram a secreção de INS mais forte do que o Cpd.30, sugerindo que esses peptídeos de sinalização facilitam a saída celular do INS produzido neste tipo de célula. Transfecção in vitro de células HEK293T, HepG2, THP-1 e A549 para teste de secreção de IL4
[330] Após 24 horas de incubação de células HEK293T, HepG2, THP-1 ou A549 com Cpd.33 como controle e Cpd.34 e Cpd.35 como mRNAs de teste, os níveis de interleucina 4 secretada (IL4) foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 29). A resposta do Cpd.33 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.33. O Cpd.34 foi capaz de induzir a secreção de IL4 em até 2,2 vezes em comparação com o Cpd.33 em células HEK293T (Figura 29A), células HepG2 (Figura 29B), células THP-1 (Figura 29C) e células A549 (Figura 29D), O Cpd.35 induziu a secreção de IL4 até 1,3 vezes em comparação com o Cpd.33 em células HepG2 (Figura 29B) e células THP-1 (Figura 29C), respectivamente. Tomados em conjunto, os dados demonstram que o Cpd.34 e o Cpd.35 induziram a secreção de IL4 mais forte do que o Cpd.33, sugerindo que estes peptídeos de sinalização facilitam a saída celular da IL4 produzida nestes tipos de células. Transfecção in vitro de células HEK293T, HepG2 e THP-1 para teste de secreção de IL10
[331] Após 24 horas de incubação de células HEK293T, HepG2 ou THP-1 com Cpd.36 como controle e Cpd.37 e Cpd.38 como mRNAs de teste, os níveis de interleucina 10 secretada (IL10) foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 30). A resposta do Cpd.36 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.36. O Cpd.37 foi capaz de induzir a secreção de IL10 em até 2,2 vezes em comparação com o Cpd.36 em células HEK293T (Figura 30A), células HepG2 (Figura 30B) e células THP-1 (Figura 30C), a secreção de IL10 induzida pelo Cpd.38 1.4 vezes em comparação com Cpd.36 em células THP-1 (Figura 30C). Tomados em conjunto, os dados demonstram que o Cpd.37 e o Cpd.38 induziram a secreção de IL10 mais forte do que o Cpd.36, sugerindo que estes peptídeos de sinalização facilitam a saída celular da IL10 produzida nestes tipos de células. Transfecção in vitro de Cpd.39 em HepG2 e células de condrócitos primários humanos para teste de secreção de IGF1
[332] Após 24 horas de incubação de HepG2 ou condrócitos com Cpd.1 como controle e Cpd.39 como mRNAs de teste, os níveis de IGF1 secretado foram avaliados nos sobrenadantes das culturas de células (Figura 31). A resposta do Cpd.1 foi normalizada para 1 e os dados expressos como alteração da dobra do Cpd.1. O Cpd.39 foi capaz de induzir a secreção de IGF1 significativamente maior até 1,4 vezes em comparação com o Cpd.1 em HepG2 (Figura 31A) e condrócitos primários humanos (Figura 31B). Tomados em conjunto, os dados demonstram que o Cpd.39 induziu a secreção de IGF1 mais forte do que o Cpd.1, sugerindo que este peptídeo de sinalização facilita a saída celular do IGF1 produzido neste tipo de célula. Exemplo 2
[333] Para testar a eficácia do mRNA de IGF-I aplicado localmente em um modelo de camundongo de lesão do músculo esquelético, camundongos C57BL6/J machos de 8 a 10 semanas de idade foram submetidos a lesão miotóxica induzida por notexina no tibial anterior (TA) no dia 0. No dia 1 após a lesão, veículo ou 1 µg mRNA (Cpd.4) foram aplicados por meio de injeção intramuscular no músculo lesionado e repetidos no dia 4 após a lesão. A função muscular no TA foi medida nos dias 1, 4, 7, 10, 14, 21 e 28 pós-lesão. Um subconjunto de músculos TA contralaterais também foi avaliado ao longo do estudo para avaliar os níveis de controle saudáveis da função do músculo TA.
MÉTODOS E MATERIAIS Clonagem de IGF-1 e transcrição in vitro de mRNA para IGF-1
[334] Clonagem de IGF-1 e a transcrição in vitro do mRNA para IGF-1 foi realizada conforme descrito no exemplo 1. DNA otimizado por códon de Cpd. 4 (Figura 4) foi usado para ser clonado no vetor pMA-T para fornecer o construto como mostrado na Figura 11. Este construto foi usado para produzir mRNA transcrito in vitro usado para tratamento de mRNA. Lesão por Notexina
[335] A notexina (Latoxan, Valence, França) foi preparada em uma concentração de 0,4 μg em 40 μl de solução salina para cada camundongo. A anestesia no camundongo foi induzida em uma câmara (~4-5% de isoflurano, para efeito) e mantida através do cone do nariz (~2-3% de isoflurano, para efeito). O camundongo foi então mantido em uma mesa cirúrgica aquecida (37°C). A pele sobre a barriga média do músculo TA foi preparada com creme depilatório (Nair Hair Remover por 45 segundos, seguido por 3 vezes com água) e posteriormente preparada com três esfoliantes alternados de betadine e álcool a 70% para evitar a propagação de bactérias da pele para dentro do tecido mole. Usando uma seringa de tuberculina, 0,04 ml de Notexina preparado foi injetado por via intramuscular na barriga do TA direito. Os animais não sofreram dor observável durante o procedimento e tratamento contra dor apropriado foi administrado subsequentemente (buprenorfina 0,05-0,1 mg/kg a cada 12h por 48h após a injeção). A primeira dose do analgésico foi administrada no momento da indução anestésica para garantir a presença do analgésico na recuperação. Após as primeiras 48h, o animal foi examinado pelo menos duas vezes por semana para garantir a cicatrização adequada e o retorno da marcha normal. Tratamento de mRNA
[336] Os camundongos foram atribuídos aleatoriamente ao mRNA ou ao tratamento com veículo. Os camundongos foram anestesiados usando isoflurano como descrito acima, e ao músculo TA lesado foi administrado uma injeção intramuscular de mRNA ou tratamento com veículo no meio do músculo. Avaliação da função TA in vivo
[337] O desempenho muscular foi medido in vivo com um sistema de alavanca muscular 305C (Aurora Scientific Inc., Aurora, Canadá) nos dias 1, 4, 7, 10, 14, 21 e 28 pós-lesão. A anestesia no camundongo foi realizada conforme descrito acima, e o camundongo foi colocado em uma mesa controlada termostaticamente. O joelho foi isolado por meio de um pino pressionado contra a cabeça da tíbia e o pé firmemente fixado a uma platina no eixo do motor. Para o grupo de músculos dorsiflexores, as contrações foram provocadas por estimulação elétrica percutânea do nervo fibular. O torque de contração isométrico ideal foi determinado aumentando a corrente com um mínimo de 30s entre cada contração para evitar fadiga. Uma série de estímulos foi então realizada com frequência crescente de estimulação (pulso de 0,2 ms, duração do treino de 500 ms): 1, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 Hz, seguido por uma estimulação final em 1 Hz. A força isométrica de pico máxima foi representada graficamente. Análise de dados
[338] Os dados foram agrupados e médias e erros padrão calculados. A análise estatística foi realizada usando GraphPad Prism 8 (San Diego, EUA). As comparações foram feitas usando um teste t de Student.
RESULTADOS
[339] O exemplo 2 mostra que em um modelo de camundongo de lesão do músculo TA induzida por uma toxina (notexina), o tratamento intramuscular de mRNA de IGF-I logo após a lesão muscular nos dias 1 e 4 resultou em uma recuperação acelerada e completa da função muscular (Figura 21). Animais tratados com 1 µg de Cpd. 4 alcançaram níveis funcionais na faixa saudável em 16 dias. Em contraste, os animais de controle tratados com veículo e camundongos tratados com doses mais baixas nem mesmo alcançaram a recuperação funcional completa no dia 28. Os dados, portanto, indicam que o tratamento com IGF-I mRNA pode acelerar a cicatrização após lesão muscular e pode potencialmente prevenir um comprometimento crônico ao recuperar totalmente a função muscular. Desse modo, surpreendentemente, são necessárias apenas duas doses logo após a lesão.

Claims (54)

REIVINDICAÇÕES
1. mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
2. mRNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma polaridade média de 6,1 ou menor.
3. mRNA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a pontuação hidrofóbica média dos últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é pelo menos 1,0 unidade abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
4. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos 1 a 9, os aminoácidos 2 a 10, os aminoácidos 3 a 11, os aminoácidos 4 a 12 e os aminoácidos 5 a 13 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm, cada um, uma pontuação hidrofóbica média superior a 1,5.
5. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 8 a 16 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é igual ou menor à pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3 a 11 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
6. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal compreende uma sequência de aminoácidos entre 18 e 40 aminoácidos de comprimento e em que a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 10 a 18 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal está pelo menos 0,5 unidades abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3 a 11 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
7. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a pontuação hidrofóbica média dos últimos nove aminoácidos da extremidade C-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal está pelo menos 1,5 unidades abaixo da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 3 a 11 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal.
8. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a pontuação hidrofóbica média de quaisquer 9 aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal não excede 4,1.
9. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os últimos nove aminoácidos da extremidade C-
terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal compreendem pelo menos um aminoácido com pontuação de hidrofobicidade negativa.
10. mRNA de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um aminoácido com pontuação de hidrofobicidade negativa é selecionado a partir do grupo que consiste em G, Q, N, T, S, R, K, H, D, E, P, Y e W.
11. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o segundo aminoácido dos aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L, V e I.
12. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o segundo aminoácido dos aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em A, L, S, T, V e W.
13. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína está pelo menos 1,0 unidades acima da pontuação hidrofóbica média dos aminoácidos 1 a 9 da extremidade N- terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal sem modificação.
14. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 2 a 13, caracterizado pelo fato de que a pontuação hidrofóbica é calculada de acordo com a escala Kyte-Doolittle e a polaridade é calculada de acordo com o índice de polaridade de Zimmerman.
15. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), o peptídeo sinal de neurotrofina 3 (NTF-3), o peptídeo sinal do fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5), o peptídeo sinal da proteína 5 de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina (IBP5), o peptídeo sinal da proteína 2 expressa na próstata e testículos (PATE2), o peptídeo sinal da dismutase superóxida extracelular (SOD3), e o peptídeo sinal da proteína 2 relacionada ao fator de complemento H (FHR2).
16. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal de Ligante 12 de Quimiocina de Motivo C-X-C (CXCL12), o peptídeo sinal de fator de crescimento de insulina 2 (IGF2), o peptídeo sinal de insulina (INS), e o peptídeo sinal de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
17. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína e a referida proteína são selecionados a partir do grupo que consiste no peptídeo sinal do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1) e IGF1, o peptídeo sinal de insulina e INS, o peptídeo sinal de eritropoietina (EPO) e EPO, o peptídeo sinal de interleucina 4 (IL-4) e IL-4, e o peptídeo sinal de interleucina 10 (IL-10) e IL-10.
18. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é selecionada a partir do grupo que consiste no pró-peptídeo do fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), a sequência de codificação do receptor de glucagon (GL-R) e o pró-peptídeo de fosfatase alcalina do tipo intestinal (ALPI).
19. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e em que a quantidade da proteína secretada usando o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é maior do que a quantidade da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína.
20. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e em que a quantidade da proteína secretada usando o peptídeo sinal modificado homólogo à referida proteína é maior do que a quantidade da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína sem modificação.
21. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18,
caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e em que a quantidade da proteína secretada usando a sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza é maior do que a quantidade da referida proteína secretada usando o peptídeo sinal homólogo à referida proteína.
22. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de menos de 50% do número de aminoácidos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal heterólogo à referida proteína.
23. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de menos de 50% do número de aminoácidos da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal homólogo à referida proteína.
24. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de menos de 50% do número de aminoácidos da sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos de ocorrência natural.
25. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas, fatores de crescimento e hormônios.
26. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína e a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de insulina 1 (IGF1), insulina (INS), eritropoietina (EPO), interleucina 4 (IL-4) e interleucina 10 (IL-10).
27. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é IGF1.
28. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido e a proteína é IGF1.
29. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 7 a 28, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal compreende uma sequência de aminoácidos com entre 16 e 40 aminoácidos de comprimento.
30. Unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica caracterizado(a) pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína e um peptídeo sinal, em que os aminoácidos 1 a 9 da extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos do peptídeo sinal têm uma pontuação hidrofóbica média superior a 2, em que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é opcionalmente modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido, com a condição de que a referida proteína não seja uma oxidorredutase; ii) um peptídeo sinal homólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal homólogo à referida proteína é modificado por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido; e iii) uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural que não tem a função de um peptídeo sinal na natureza, em que a sequência de aminoácidos de ocorrência natural é opcionalmente modificada por inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um aminoácido.
31. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o mRNA definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e/ou a unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica definido(a) na reivindicação 30.
32. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o mRNA definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e/ou a unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica definido(a) na reivindicação 30 e/ou a composição terapêutica definida na reivindicação 31 e instruções, opcionalmente um mapa de vetor, opcionalmente uma célula hospedeira, opcionalmente um meio de cultivo para o cultivo de uma célula hospedeira e/ou opcionalmente um meio de seleção para selecionar e cultivar uma célula hospedeira transfectada.
33. mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica: i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase.
34. mRNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica: i) uma proteína; e ii) um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas de matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima; metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas.
35. mRNA de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em citocinas; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; proteínas neuroativas; e proteínas vasoativas.
36. mRNA de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a proteína é um fator de crescimento.
37. mRNA de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o fator de crescimento é selecionado a partir do grupo que consiste em AMH, ARTN, BTC, CDNF, CFC1, CFC1B, CHRDL1, CHRDL2, CLEC11A, CNMD, EFEMP1,
EGFL6, EGFL7, EGFL8, EPGN, EREG, EYS, FGF1, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FRZB, GDNF, GFER, GKN1, HBEGF, IGF1, IGF2, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, KITLG, MANF, MDK, MIA, NGF, NOV, NRG1, NRG2, NRG3, NRG4, NRTN, NTF3, NTF4, OGN, PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD, PGF, PROK1 PSPN, PTN, SDF1, SDF2, SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4, SFRP5, TDGF1, TFF1, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, THBS4, TIMP1, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD3 e WISP3.
38. mRNA de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a proteína é IGF1.
39. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 38, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) compreende a sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 31.
40. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 39, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína e a sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) heterólogo à referida proteína são ligadas operativamente.
41. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 40, caracterizado pelo fato de que o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica na seguinte ordem de 5’-3': i) o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); ii) opcionalmente, um pró-domínio da proteína; e iii) a proteína madura; em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), a sequência de ácidos nucleicos opcional que codifica o pró-domínio da proteína e a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína madura são ligadas operativamente.
42. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 41, caracterizado pelo fato de que o mRNA compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo de IGF1, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o IGF1 maduro e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e não compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo E de IGF1.
43. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 42, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) substitui o peptídeo sinal natural da proteína.
44. Unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica, caracterizado(a) pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína não é uma oxidorredutase.
45. Unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica, caracterizado(a) pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína e um peptídeo sinal heterólogo à referida proteína, em que o peptídeo sinal heterólogo à referida proteína é o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e em que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em carboxipeptidases; citocinas; ligantes e transportadores extracelulares; proteínas da matriz extracelular; glucosidases; glicosiltransferases; fatores de crescimento; proteínas de ligação ao fator de crescimento; proteínas de ligação à heparina; hormônios; hidrolases; imunoglobinas; isomerases; quinases; liases; inibidores de metaloenzima;
metaloproteases; proteínas do leite; proteínas neuroativas; proteases; inibidores de protease; proteínas fosfatases; esterases; transferases; e proteínas vasoativas.
46. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o mRNA definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 43 e/ou a unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica definido(a) na reivindicação 44 ou 45.
47. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o mRNA definido em qualquer uma das reivindicações 33 a 43, ou a unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica definido(a) na reivindicação 44 ou 45, e/ou a composição terapêutica definida na reivindicação 46 e instruções, opcionalmente um mapa de vetor, opcionalmente uma célula hospedeira, opcionalmente um meio de cultivo para o cultivo de uma célula hospedeira e/ou opcionalmente um meio de seleção para selecionar e cultivar uma célula hospedeira transfectada.
48. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28 ou 33 a 43, unidade de transcrição, vetor de expressão ou vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 30 ou 44 a 45, a composição terapêutica de acordo com a reivindicação 31 ou 46, ou o kit de acordo com a reivindicação 32 ou 47, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.
49. mRNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29 ou 38 ou 42, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método para tratar lesão musculoesquelética.
50. mRNA, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de lesão do músculo esquelético.
51. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende mRNA para uso em um método de tratamento de lesão musculoesquelética.
52. mRNA ou composição para uso de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizado(a) pelo fato de que o mRNA é mRNA que codifica o fator de crescimento semelhante à insulina humana 1 (IGF1).
53. mRNA ou composição para uso de acordo com a reivindicação 52, caracterizado(a) pelo fato de que o mRNA que codifica IGF1 humano compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo sinal, opcionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o pró-peptídeo de IGF1 humano e uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o IGF1 humano maduro.
54. mRNA ou composição para uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado(a) pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos que codifica o peptídeo sinal codifica o peptídeo sinal do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
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