KR20220031670A - 발효 방법에서 재조합 단백질 방출용 박테리아 균주 - Google Patents
발효 방법에서 재조합 단백질 방출용 박테리아 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 야생형 숙주 세포에 비해, 강한 세포 용해의 발생 없이 증가된 수율로 배양 배지 내로 재조합 단백질을 방출하는 박테리아 균주를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 암호화하는 추가의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는, 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 박테리아 균주에 관한 것이다.
Description
본 발명은 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 추가의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는, 기능성 프로모터의 제어 하의 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 단백질 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 플라스미드 및 본 발명에 따른 박테리아 균주를 사용하여 재조합 단백질을 발효 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질은 포유류 세포 배양과 비교하여, 짧은 세대 시간 및 간단한 취급성으로 인해 박테리아에서 비용-효율적으로 생산할 수 있다. 광범위하게 연구된 유전학 및 생리학으로 인해, 그람 음성 장내세균 이.콜라이(Escherichia coli)는 현재 재조합 단백질 생산에 가장 일반적으로 사용되는 유기체이다. 특히, 매력적인 것은 표적 단백질이 높은 수율과 정확한 폴딩으로 발효 배지로 직접 방출되는 E. coli에서 재조합 단백질을 생산하는 방법인데, 이는 복잡한 세포 파괴 및 단백질 폴딩 과정을 피하기 때문이다.
배양 배지 내로 재조합 단백질의 방출하는 다양한 E. coli 균주가 문헌에 개시되어 있다. 이들은 외막에 영구적인 결함이 있어 주변 세포질 단백질을 배양 배지로 부분적으로 배출하는 E. coli의 돌연변이이다. 이는 비특이적 메커니즘이다. 이러한 "누출" 돌연변이체의 예는 Tol-Pal 복합체에 결함이 있는 균주, 예를 들어 tol- 및 pal-결실 돌연변이체이다. tol- 및 pal-결실 돌연변이체는 세포-내인성 주변 세포질 단백질을 배양 배지로 방출하는 것으로 알려져 있다. 이러한 균주는 EDTA, 다양한 세제 및 항생제에 극도로 민감하며 성장 결함을 나타낸다(Clavel et al. 1998, Mol. Microbiol. 29, 페이지 359-367; Chen et al. 2014, Microb. Biotechnol. 7, 페이지 360-370). 따라서, 높은 세포 밀도에서 비교적 장기간에 걸쳐 배양하는 데에는 제한적으로만 적합하다.
이러한 이유로, 영구적인 결함 없이 배양 배지로 단백질을 방출할 수 있는 균주를 사용하는 것이 바람직하다. 생산 공정의 특정 시점에서 재조합 단백질의 유도성 방출은 박테리아 세포 외피와 관련하여 필수적인 안정성 인자인 펩티도글리칸 층의 약화에 의해 성취될 수 있다.
펩티도글리칸 또는 뮤레인 층은 그람양성 및 그람음성 박테리아의 세포외피에 존재하는 가교결합된 거대분자로서, 세포막에 강도를 부여한다. 펩티도글리칸은 선형 사슬로 골격을 형성하는 N-아세틸글루코사민과 N-아세틸뮤라믹산의 상호 연결된 분자 가닥으로 이루어진다. 인접한 가닥의 N-아세틸뮤라믹산 잔기는 올리고펩타이드를 통해 서로 연결되어 있다(Silhavy et al. 2010, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(5)).
펩티도글리칸 가수분해효소는 펩티도글리칸 층에서 공유 결합을 절단할 수 있는 효소 그룹이다(Vollmer, FEMS Microbiol Rev. 32, 2008, 페이지 259-286). 펩티도글리칸 가수분해효소는 절단되는 결합 유형에 따라 상이한 여러 부류로 나누어 진다. 라이소자임을 포함하는 글리코시다제(N-아세틸글루코사미니다제, 용해성 트랜스글리코실라제)는 N-아세틸뮤라믹산 및 N-아세틸글루코사민 단위로 구성된 펩티도글리칸 골격의 글리코시드 결합을 절단한다. 아미다제(N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다제)는 펩티도글리칸 골격의 N-아세틸뮤라민산과 펩타이드 가교의 L-알라닌 사이의 아미드 결합을 절단한다. 대조적으로, 펩티다제(카르복시펩티다제 및 엔도펩티다제)는 펩타이드 가교 내에서 펩타이드 결합을 절단한다.
선행 기술에서 펩티도글리칸 가수분해효소를 사용하는 알려진 예로, 세포를 파괴하기 위해 박테리아 배양물을 수확한 후 세포에 리소자임을 첨가하는 것이 있다(Pierce et al. 1997, J Biotechnol 58, 페이지 1-11).
예를 들어, 특허 문헌 CN 104762285 B에서, 리소자임과 펩티도글리칸 결합 도메인의 융합인 ClyN은 유도 가능한 방식으로 생산되고 이에 따라 재조합적으로 생산된 세포질 녹색 형광 단백질(GFP)은 세포에서 배양 배지로 방출된다.
추가로 알려진 원리는 재조합 단백질 생산을 위한 벡터 및 T4 파지 유래의 리소자임 생산을 위한 벡터로 E. coli 를 공동-형질전환 하여, 예를 들어 세포질 β-글루쿠로니다제(Morita et al. 2001, Biotechnol. Prog. 17, 페이지 573-576) 또는 항-CD18 항체 단편 또는 IGF-I(EP 1 124 941)와 같은 재조합 단백질을 방출하는 것이다.
리소자임의 생산은 세포의 용해로 이어지며, 이는 이러한 접근법이 재조합 단백질의 방출이 숙주 세포 단백질 및 DNA와 같은 다른 세포내 성분들의 방출을 동반한다는 주요 단점을 갖는다는 것을 의미한다. 이는 배양 상청액을 오염시키며, 특히 증가된 점도로 인해 후처리가 어려워지는 결과를 낳는다.
이 불리한 효과는 ClyN에 의한 GFP 방출에 대해 기술하는 CN 104762285 B에 설명되어 있는데, 상기 문헌에서 ClyN 생성의 유도 후 살아있는 세포 수가 ClyN 생성의 유도가 없는 배양과 비교하여 0.2%로 떨어진다. 세포 용해로 인해, ClyN을 발현하는 E. coli 배양물의 광학 밀도는 약 30분 이내에 ClyN 생산 시작 전 값의 약 2/3로 떨어진다. 5시간 후, ClyN을 발현하는 배양물의 광학 밀도는 ClyN 생성이 없는 비교 배양물의 광학 밀도의 약 20%일 뿐이다. Morita et al.에 따르면, T4-파지 리소자임으로 인한 β-글루쿠로니다제의 방출은 배양물의 현저히 낮은 광학 밀도와 관련이 있다.
동일한 불리한 효과가 항-CD18 항체 단편의 방출에 대해 기술하는 EP 1 124 941에 보고되어 있으며, 상기 문헌에서 T4-파지 리소자임의 과잉생산은 세포 밀도를 최대값의 30%까지 감소시켰다. T4-파지 리소자임에 의한 IGF-I의 방출의 경우에도, 마찬가지로 용해에 의한 세포 밀도의 급격한 감소가 관찰되었고, 현미경 분석에서는 소수의 온전한 세포만이 나타났다.
본 발명의 목적은 야생형 숙주 세포에 비해, 강한 세포 용해의 발생 없이 증가된 수율로 배양 배지 내로 재조합 단백질을 방출하는 박테리아 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적은 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 암호화하는 추가의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는, 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 박테리아 균주에 의해 달성된다.
박테리아 균주는 바람직하게는, 박테리아 균주가 그람-음성 박테리아, 특히 바람직하게는 Enterobacteriaceae 속의 박테리아 균주, 특히 바람직하게는 Escherichia coli 종의 균주임을 특징으로 한다.
야생형 유전자는 진화에 의해 자연적으로 발생하여 야생형 박테리아 게놈에 존재하게 된 유전자의 형태를 말한다.
상기 유전자는 신호 서열에 대한 아미노산 서열을 포함하는 전체 단백질의 아미노산 서열을 포함하면서 번역 후 변형을 갖지 않는 전구체 단백질을 발현한다.
"성숙 단백질"이라는 용어는 신호 서열이 제거된 전체 단백질의 아미노산 서열을 포함하면서 임의의 번역후 변형이 존재하는 단백질을 지칭한다. 이러한 번역후 변형은, 예를 들어 멤브레인 앵커를 사용한 변형이다.
본 발명의 맥락에서, "전장 단백질"이라는 용어는 성숙 단백질을 의미한다.
본 발명에 따르면, 박테리아 균주에 포함된 추가적 오픈 리딩 프레임(OFR)은 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 가수분해효소 중 하나인 펩티도글리칸 펩티다제를 인코딩한다. 다음에서, "펩티도글리칸 펩티다제"라는 용어는 성숙한 형태로, 즉 신호 펩타이드가 절단된 후, 상기 추가적 ORF에 의해 발현되는 추가 단백질을 항상 의미하며, 박테리아 야생형 게놈에 존재하는 유전자에 의해 코딩되어 발현되는 단백질이 아니다. E. coli 에서 펩티도글리칸 펩티다제를 암호화하는 유전자의 예로는 spr, ydhO, yebA, dacA, dacC, dacD, yfeW, pbpG, mepA, dacB, ampH 및 ldcA가 있다.
1. 바람직한 실시양태에서, 추가의 ORF에 의해 코딩되는 펩티도글리칸 펩티다제는 Spr(Uniprot entry P0AFV4), YdhO(Uniprot entry P76190), YebA(Uniprot entry P0AFS9), MepA(Uniprot entry P0C0T5), DacB(Uniprot entry P24228) 또는 PBP 7(Uniprot entry P0AFI5)과 같은 펩타이드 측쇄의 D-알라닌과 메조-디아미노피멜산 사이의 결합을 절단하는 야생형 전장 단백질로서, 특정 데이터베이스 엔트리에서 공지된 아미노산 서열을 갖는다.
2. 대안적으로 바람직한 실시양태에서, 추가의 ORF에 의해 코딩되는 펩티도글리칸 펩티다제는 상응하는 야생형 전장 단백질의 아미노산 서열에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 70%의 서열 상동성을 갖는 야생형 전장 단백질의 돌연변이 형태이다.
3. 추가의 바람직한 실시양태에서, 추가의 ORF에 의해 코딩되는 펩티도글리칸 펩티다제는 야생형 전장 단백질의 단편이다.
4. 추가의 바람직한 실시양태에서, 추가의 ORF에 의해 코딩되는 펩티도글리칸 펩티다제는 야생형 전장 단백질의 상응하는 단편 단백질의 아미노산 서열에 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 70%의 서열 상동성을 갖는 야생형 단백질의 돌연변이 버전이다.
여기서, 상기 모든 1-4의 경우에서, 추가의 ORF에 의해 코딩되고 펩티도글리칸 펩티다제로 선택된 단백질은 펩티도글리칸 펩티다제 활성을 갖는다. 이러한 활성을 어떻게 검출하는지에 대한 방법은 하기 문헌으로부터 당업자에게 공지되어 있다(Gonzalez-Leiza et al. 2011, J Bacteriol 193, 페이지 6887-94).
예를 들어, 2번 및 4번에 기재된 바와 같은 아미노산 수준에서의 돌연변이는 펩티도글리칸 펩티다제의 야생형 전장 단백질 또는 이의 단편과 비교하여 치환, 결실 및/또는 삽입일 수 있다.
펩티도글리칸 펩티다제의 예는 박테리아 펩티도글리칸 층의 펩타이드 가교에서 D-알라닌과 메조-디아미노피멜산 사이의 결합을 절단하는 Spr 및 YdhO이고(Singh et al. 2012, Mol. Microbiol. 86, 페이지 1036-1051), 따라서 기존 펩티도글리칸 네트워크에 새로운 가닥을 통합하여 세포 성장을 가능하게 한다.
E. coli 의 spr 유전자는 188개의 아미노산(Uniprot P0AFV4)을 갖는 Spr 단백질을 암호화하며, 아미노산 1-26은 세포질(cytosol)에서 주변 세포질(periplasm)로의 수송을 위한 신호 서열을 형성한다. 성숙 Spr 단백질에서, 신호 서열은 단백질 분해로 절단되고, 추가로 성숙 단백질의 위치 1(전체 서열의 위치 27)에 있는 시스테인 잔기는 멤브레인 앵커로 변형되는데, 이를 통해 Spr 단백질이 외막에서 고정된다. 따라서 성숙 Spr 단백질은 162개의 아미노산으로 구성되며, 본 발명의 맥락에서 Spr 전장 단백질로 지칭된다.
ydhO 유전자는 271개의 아미노산을 갖는 YdhO 단백질을 인코딩한다(Uniprot P76190). 아미노산 1-27은 주변세포질 방출 신호 펩타이드로 예상된다. 따라서, 성숙 YdhO 단백질은 244개의 아미노산으로 구성되고 본 발명의 맥락에서 YdhO 전장 단백질로 지칭된다.
Spr 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 4에 명시되어 있고, YdhO 전구체 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열번호 6에 명시되어 있다. Spr 전구체 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 5에 명시되어 있고, 아미노산 1-26이 신호 서열을 형성하고 아미노산 27-188이 성숙 Spr 단백질(Spr 전장 단백질과 동일시 됨)을 형성한다. YdhO 전구체 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 명시되어 있으며, 아미노산 1-27은 신호 서열을 형성하고 아미노산 28-271은 성숙 YdhO 단백질을 형성한다(YdhO 전장 단백질과 동일시 됨).
바람직하게는, 펩티도글리칸 펩티다제는 (i) Spr, (ii) YdhO 또는 (iii) Spr 및 YdhO 이다. 상기 Spr 및 YdhO 는 데이터베이스 서열에 각각 명시된 야생형 전장 단백질로서, 야생형 전장 단백질의 아미노산 서열에 30% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 야생형 전장 단백질의 돌연변이된 형태, 야생형 전장 단백질의 단편, 또는 야생형 전장 단백질의 단편의 아미노산 서열에 30% 이상, 바람직하게는 적어도 70%이상의 서열 동일성을 갖는 야생형 전장 단백질의 단편의 돌연변이된 버전이고, 여기서 선택된 단백질은 뮤레인 DD-엔도펩티다제 활성을 갖는다. 특히 바람직하게는, Spr은 서열번호 5의 아미노산 27-188로 명시된 서열이고, YdhO는 서열번호 7에서 아미노산 28-271로 명시된 서열이다.
펩티도글리칸 펩티다제가 Spr인 바람직한 구현예에서, Spr 단백질은 외막과 상호작용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 DNA 서열은 바람직하게는 E.coli(Escherichia coli) 기원의 DNA 서열이다 .
오픈 리딩 프레임(ORF)은 시작 코돈과 종료 코돈 사이에 있으면서 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 영역을 나타낸다. ORF는 코딩 영역이라고도 한다.
ORF는 비코딩 영역으로 둘러싸여 있다. 유전자는 생물학적으로 활성인 RNA를 생산하기 위한 모든 기본 정보를 포함하는 DNA 부분을 말한다. 유전자는 단일 가닥 RNA 사본이 전사에 의해 생성되는 DNA 부분과 이 복제 과정의 조절에 관여하는 발현 신호를 포함한다. 발현 신호는 예를 들어, 적어도 프로모터, 전사 개시 부위, 번역 개시 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 또한, 터미네이터 및 하나 이상의 오퍼레이터가 발현 신호로 가능하다.
기능성 프로모터의 경우, 상기 프로모터의 조절하에 있는 ORF는 RNA로 전사된다.
모노시스트론(Monocistronic)은 하나의 오픈 리딩 프레임만을 포함하는 메신저 RNA(mRNA)를 나타낸다.
오페론은 다중 ORF, 프로모터 및 가능하게는 추가 발현 신호를 포함하는 DNA의 기능적 단위이다.
박테리아 균주는 (1) 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 인코딩하는 하나의 ORF, (2) 동일한 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 인코딩하는 다중 ORF 또는 (3) 각 경우에 상이한 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 인코딩하는 다중 ORF를 함유할 수 있다. 두 번째 가능성은, 예를 들어 재조합 단백질의 발현 및 수율을 증가시키는 데 사용되는 반면, 세 번째 가능성은 특히 다중 폴리펩타이드(서브유닛)로 구성된 단백질의 발현에 사용된다. 한 가지 예는 세포질 밖으로 수송된 후 후속적으로 조립되는 항체 단편의 발현이다.
이러한 ORF 각각은 개별 유전자 내에 존재할 수 있다. 다중 ORF가 오페론으로 조직되는 것, 즉 공통 발현 신호에 의해 조절되는 것도 가능하다.
재조합 단백질이 다중 폴리펩타이드 사슬(서브유닛)로 구성되는 경우, 각각 신호 펩타이드에 연결된 개별 펩타이드 사슬(서브유닛)의 ORF는 오페론으로 조직화되는 것이 바람직하다.
나아가, 각 오페론은 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 인코딩하는 하나의 ORF를 포함할 수 있다.
시그널 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 암호화하는 ORF는 모노시스트론 메신저 RNA로 전사되는 것이 바람직하다. 이는 펩티도글리칸 펩티다제가 별도의 유전자에 의해 발현된다는 것을 의미한다. 펩티도글리칸 펩티다제가 Spr 또는 YdhO인 바람직한 구현예에서, 상응하는 유전자는 spr 유전자 또는 ydhO 유전자로 지칭된다.
신호 펩타이드(들) 및 재조합 단백질(들) 및 신호 펩타이드(들) 및 펩티도글리칸 펩티다제(들)를 코딩하는 ORF(들)는 염색체로 또는 플라스미드에 의해 발현될 수 있다. 별개의 유전자의 경우, 복제 기점 및 선택 마커와 관련하여 서로 호환되는 별개의 플라스미드에 의해 발현될 수도 있다. ORF는 바람직하게는 플라스미드-인코딩된다.
펩티도글리칸 펩티다제를 암호화하는 본 발명에 따른 ORF의 DNA 서열의 오리진은 상응하는 펩티도글리칸 펩티다제가 재조합 단백질의 생산에 사용되는 박테리아 균주에서 기능하는 한, 즉, 뮤레인 DD-엔도펩티다제 활성을 갖는 한(위 참조), 재조합 단백질의 생산에 사용되는 박테리아 균주에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 펩티도글리칸 펩티다제 단백질을 코딩하는 ORF의 서열은 재조합 단백질의 생산에도 사용되는 동일한 유기체로부터 유래하는 DNA 서열이다.
본 발명의 맥락에서 단수로 사용되는 용어 "신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 인코딩하는 ORF" 및 "재조합 단백질"은 또한 각각 하나의 신호 펩타이드에 의해 인도되는 다중 ORF 및/또는 다중의 상이한 재조합 단백질을 의미할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 3개의 상이한 재조합 단백질, 특히 바람직하게는 1개의 재조합 단백질 또는 2개의 상이한 재조합 단백질이 관련된다. 박테리아에서 재조합 단백질의 클로닝 및 발현은 선행 기술에 기재된 바와 같이 달성된다. 재조합 단백질은, 예를 들어 주변 세포질로의 수송을 위한 신호 서열을 갖는다.
재조합 단백질은 야생형 세균 게놈이 자연적으로 전혀 발현하지 않거나 상이한 양으로 발현되는 단백질이다. 박테리아는 재조합 단백질의 생산을 위한 것이며, 상기 단백질은 본 발명에 따라 배양 배지로 방출된다.
발효 방법에서 본 발명에 따른 박테리아 균주의 사용은 상기 박테리아 균주가 재조합 단백질과 함께 추가 단백질로서 펩티도글리칸 펩티다제를 발현한다는 것에 이점이 있다. 용어 "추가(적)"은 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 추가의 또는 "추가적인" 오픈 리딩 프레임이 박테리아 균주의 야생형 유전자에 추가로 존재한다는 사실을 지칭한다. 펩티도글리칸 펩티다제를 인코딩하는 이러한 추가 오픈 리딩 프레임은 바람직하게는 플라스미드에 위치한다.
신호 서열로 인해, 펩티도글리칸 펩티다제는 주변 세포질에 위치하여 펩타이드 교차-결합의 절단 결과로 펩티도글리칸 층의 불안정화를 초래한다. 박테리아의 세포 외피의 불안정화에도 불구하고, 증가된 세포 용해는 관찰되지 않았으며, 실험에서, 재조합 단백질 및 펩티도글리칸 펩티다제를 발현하는 박테리아 균주의 세포 건조 중량은 재조합 단백질만을 발현하는 박테리아 균주와 비교하여 동일하게 유지되었다. 박테리아의 세포 외피의 불안정화의 결과로, 재조합 단백질은 세포의 주변세포질로부터 방출될 수 있고 증가된 수율로 배양 상청액으로부터 분리될 수 있다. 이러한 방식으로, 박테리아 세포의 실질적인 사멸의 발생 없이 선행 기술에 비해 배양 상청액에서 증가된 생성물 수율을 달성하는 것이 가능하다.
증가된 수율은, 재조합 단백질에 대한 동일한 유전자를 함유하는 야생형 박테리아 균주를 사용한 선행 기술에 따라 생산될 수 있는 것과 비교시, 본 발명에 따른 박테리아 균주를 사용하여, 재조합 단백질의 양이 바람직하게는 적어도 110%, 특히 바람직하게는 적어도 150%, 특히 바람직하게는 적어도 200%로 배양 배지로 방출됨을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 된다. 이는 배양 배지 내로 방출되는 재조합 단백질의 수율이 펩티도글리칸 펩티다제의 과잉 생산이 없는 해당 박테리아 균주로 달성될 수 있는 수율보다 바람직하게는 적어도 1.1배, 특히 바람직하게는 적어도 1.5배, 특히 바람직하게는 적어도 2배 높다는 것을 의미한다.
본 발명에서는, 재조합 단백질의 예로 CGTase를 사용하였다. 실시예 1에서 CGTase 수율을 비교하면, W3110/pCGT-Spr 박테리아 균주를 사용할 때 U/ml 단위로 측정한 CGTase 수율이 W3110/pCGT 박테리아 균주에 비해 거의 10배 증가함을 알 수 있다(표 1 참조). 세포 건조 중량(CDW)이나 살아있는 세포 수는 Spr 단백질의 추가 생산의 결과로 대조군에 비해 전혀 감소되지 않았다.
균주 W3110/pCGT-YdhO는 W3110/pCGT 박테리아 균주를 함유하는 대조군 배치와 비교하여, 세포 건조 중량에 실질적으로 영향을 주지 않고 균주 W3110/pCGT-Spr과 거의 동일한 CGTase 수율을 달성했다(표 2 참조).
재조합 단백질로서 Fab 항체 단편의 생산에 대해서는, CD154 Fab 단편의 경우, 실시예 2는 또한 균주 W3110/pJF118ut-CD154와 비교하여, 펩티도글리칸 펩티다제 Spr을 발현하는 균주 W3110/pJF118ut-CD154-Spr을 사용하여 재조합 단백질의 실질적으로 더 높은 수율이 달성될 수 있음을 확인하고 있는데, 이 경우 200배 더 높았다(표 3 참조). 동시에, 세포 건조 중량은 약간만 감소했다(표 4 참조).
OD600 은 600nm에서 분광 광도계로 측정된 세포 배양의 광학 밀도를 나타내며, 단위 부피당 세포의 양(세포 농도, 세포 밀도)의 척도이며, 이는 차례로 세포 분열 활동의 척도 및 세포 용해의 척도, 및 세포 밀도 감소를 유발하는 세포 용해의 척도이다.
CN 104762285 B는 도 2에서 대조적으로, OD600 값, 즉 세포 밀도가 ClyN의 발현 유도 후에 실질적으로 떨어지는 것을 보여주는데, 이는 강력한 세포 용해를 암시한다.
강한 세포 용해는 숙주 세포 단백질의 방출로 이어지기 때문에, 재조합 단백질은 숙주 세포 단백질로 오염된다. 또한, DNA의 방출은 배양 배지의 점도를 증가시켜 추가 워크업을 더 어렵게 만든다. 본 발명에 따른 박테리아 균주는 증가된 세포 용해 속도를 나타내지 않기 때문에, 재조합 단백질의 생산을 위한 상기 균주의 사용은 재조합 단백질이 숙주 세포 단백질로 오염되지 않는다는 것을 의미한다. 이는 실시예 1에서 배양 상청액의 단백질 함량을 SDS-PAGE로 분석한 결과 확인되었으며(도 5), 이는 숙주 세포 단백질에 의한 재조합 단백질의 심각한 오염이 본 발명에 따른 박테리아 균주가 사용되었을 때에는 발생하지 않았음을 보여준다. 추가로 발현된 펩티도글리칸 펩티다제 역시 증가된 방출을 나타내지 않았다.
재조합 단백질을 배양 배지로 방출하기 위해서는, 재조합 단백질과 전구체 펩티도글리칸 펩티다제 모두가 세포질에서 단백질 생합성 후 주변 세포질로 수송되어야 한다. 주변 세포질로의 수송을 위해, 재조합 단백질의 코딩 DNA 서열의 5' 말단과 펩티도글리칸 펩티다제의 코딩 DNA 서열의 5' 말단을 단백질 수송을 위한 신호 서열의 3' 말단과 프레임 내 연결하는 것이 필요하다. 원칙적으로, 사용된 박테리아 균주에서 Sec 또는 Tat 장치의 도움으로 표적 단백질의 전위를 허용하는 모든 신호 서열이 이러한 목적에 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들어 하기 유전자의 신호 서열을 포함하는 다양한 신호 서열이 선행 기술에 기재되어 있다: phoA, ompA, pelB, ompF, ompT, lamB, malE, 포도상구균 단백질 A, StII 및 기타(Choi and Lee 2004, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64, 625-635페이지). 재조합 단백질의 경우, 본 발명에 따라 바람직한 것은 E. coli의 phoA 유전자 또는 ompA 유전자의 신호 서열, 또는 Klebsiella pneumoniae M5a1 의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(α-CGTase)에 대한 신호 서열, 또는 US 2008/0076157에 서열번호 1 및 3으로 개시된 것들로부터 유도된 신호 서열이 있다. 펩티도글리칸 펩티다제는 바람직하게는 문제의 단백질에 고유한 신호 서열을 그 전구체 형태로 보유한다. 펩티도글리칸 펩티다제가 Spr 또는 YdhO인 바람직한 구현예에서, 문제의 펩티도글리칸 펩티다제의 전구체 형태는 각각 서열번호 5 및 7에 명시된 서열이다. 재조합 단백질 및 펩티도글리칸 펩티다제는 바람직하게는 상이한 신호 서열을 보유하고, 이 2개의 신호 서열은 단백질 수송을 초래한다.
펩티도글리칸 펩티다제 및 재조합 단백질을 코딩하는 ORF의 발현은 하나의 프로모터, 2개의 동일한 프로모터, 또는 2개의 상이한 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 펩티도글리칸 펩티다제 및 재조합 단백질에 대한 ORF는 2개의 상이한 프로모터의 제어 하에 있는 것이 바람직하다.
펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 DNA 분절은 먼저 프라이머로서 올리고뉴클레오티드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 DNA 주형을 사용하여, 예를 들어 E. coli 로부터 분리된 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있으며, 그 다음 각각의 경우에 신호 펩타이드의 서열을 포함하고 유사한 방식으로 생성된 DNA 분자와 연결된, 일반적인 분자 생물학 기술을 사용하여 증폭될 수 있으며, 이로써 프레임 내 융합이 형성된다. 대안적으로, 유전자 합성을 통해 전체 DNA 분자를 생산하는 것도 가능하다. 문제의 신호 서열 및 성숙 단백질에 대한 코딩 서열로 이루어진 상기 DNA 분자는, 이후 벡터, 예를 들어 플라스미드 내로 도입되거나 공지된 방법에 의해 박테리아 균주의 염색체 내로 직접 통합될 수 있다. 바람직하게는, DNA 분자는 예를 들어, pJF118EH, pKK223-3, pUC18, pBR322, pACYC184, pASK-IBA3 또는 pET와 같은 공지된 발현 벡터의 유도체와 같은 플라스미드 내로 도입된다. 플라스미드는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 박테리아 세포 내로 도입된다(형질전환).
사용된 플라스미드는 선택 마커를 보유할 수 있다. 선택 마커로서 적합한 것은, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 카나마이신 등과 같은 항생제에 대한 내성을 코딩하는 유전자이다. 바람직하게는, 플라스미드는 그 발현으로 테트라사이클린 내성을 매개하는 유전자를 포함한다. 더 나아가, 선택 마커로서 적합한 것은 플라스미드를 함유하는 해당 박테리아 균주에서 결실된 필수 유전자를 코딩하는 영양요구성 마커이다. 2개의 플라스미드가 세포 내로 형질전환되는 경우, 2개의 상이한 항생제 내성, 1개의 항생제 내성 및 1개의 영양요구성 마커, 또는 2개의 상이한 영양요구성 마커를 사용하여 두 플라스미드 모두의 존재를 선택하는 것이 바람직하다.
프로모터로서 적합한 것은, 예를 들어 GAPDH 프로모터와 같은 구성적 프로모터(constitutive promoters), 또는 예를 들어 lac, tac, trc, 람다 PL, ara, cumate 또는 tet 프로모터와 같은 유도성 프로모터, 또는 이로부터 유래된 서열과 같은 당업자에게 알려진 모든 프로모터이다. 재조합 단백질을 코딩하는 ORF 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF는 프로모터에 의해 오페론으로서 제어되거나 상이한 프로모터들의 제어 하에 있을 수 있다. 바람직하게는, 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현을 제어하는 기능성 프로모터는 유도성 프로모터이다.
바람직하게는, 재조합 단백질을 코딩하는 ORF 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF는 상이한 유도성 프로모터들에 의해 제어된다. 특히, 바람직하게는, 재조합 단백질은 tac 프로모터의 제어 하에 발현되고 펩티도글리칸 펩티다제는 ara(아라비노스) 프로모터의 제어 하에 발현된다.
바람직하게는, 재조합 단백질은 이종 단백질이다. 이종 단백질은 프로테옴에 속하지 않는, 즉 박테리아 균주, 바람직하게는 E. coli K12 균주의 단백질의 전체 천연 세트에 속하지 않는 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 사용된 박테리아 균주, 예를 들어 E. coli K12 균주에서 자연적으로 발생하는 모든 단백질은 공지된 게놈 서열로부터 유래될 수 있다(예를 들어, E. coli K12에 대한 Genbank 기탁 번호 NC_000913으로부터).
이종 단백질로서 특히 바람직한 것은 하나 이상의 이황화 결합을 함유하는 진핵 단백질이다. 기능적 형태로 이량체 또는 다량체로 존재하는 진핵 단백질이 특히 바람직하다.
가장 중요한 이종 단백질 부류는 항체 및 이의 단편, 사이토카인, 성장 인자, 단백질 키나제, 단백질 호르몬, 리포칼린, 안티칼린, 효소, 결합 단백질 및 분자 스캐폴드 및 이로부터 유래된 단백질을 포함한다. 상기 단백질 클래스의 예는, 특히 중쇄 항체 및 이의 단편(예: 나노바디), 단일쇄 항체, 인터페론, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 인터루킨 수용체 길항제, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 백혈병 억제제, 줄기세포 성장인자, 종양괴사인자, 성장호르몬, 인슐린-유사 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판-유래 성장인자, 변형성장인자, 간세포성장인자, 골형성인자, 신경성장인자, 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경교 세포주-유래 신경영양 인자, 혈관신생 억제제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 혈액 응고 인자, 트립신 억제제, 엘라스타제 억제제, 보체 성분, 저산소증-유발 스트레스 단백질, 원발암성 생성물, 전사 인자, 바이러스-구성 단백질, 프로인슐린, 프로우로키나제, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 뉴로트로핀, 단백질 C, 글루코세레브로시다제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 레닌, 리소자임, P450, 프로키모신, 리포코르틴, 렙틴, 혈청 알부민, 스트렙토키나제, 테넥테플라제, CNTF 및 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제가 있다.
분자 스캐폴드에서 유래된 단백질의 예는, 특히 에비바디(CTLA-4에서 유래), 아피바디(S. 아우레우스의 단백질 A ), 아비머(인간 A 도메인 패밀리), 트랜스바디(트랜스페린의), DARPin(안키린 반복 단백질의), 애드넥틴(피브로넥틴 III의), 펩타이드 압타머(티오레독신의), 마이크로바디(미세단백질의), 아필린(유비퀴틴의), α-크리스탈린, 카리브도톡신, 테트라넥틴, RAS-결합 단백질 AF-6의 PDZ 도메인, 단백질 억제제의 쿠니츠-형 도메인이 있다.
본 발명의 맥락에서, 사용 가능성이 있는 선택 마커는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 아닌 것으로 여겨진다. 선택마커(selection marker)라는 용어는 "관심유전자", 즉, 실제로 원하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 표지자로 변형생물체에 도입되어, 성공적인 유전자 변형을 갖는 개체를 식별할 수 있도록 하는 유전자를 말한다. 일반적으로 사용되는 선택 마커는 항생제 내성 또는 영양요구성이다. 마커 유전자는 특정 조건에서 세포 또는 유기체에 생존 이점을 제공하며, 예를 들어 세포의 마커 유전자로서 암피실린 내성 유전자에 의한 β-락타마제의 발현으로 암피실린 함유 배지에서 생존하게 된다. 대조적으로, 재조합 단백질은 박테리아 균주의 도움으로 생산되고 특정 배양 기간 후에 분리된다.
본 발명은 추가로 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 플라스미드로서, 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩티드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명에 따른 박테리아 균주에 대해 언급된 바람직하고 특히 바람직한 특징은 또한 본 발명에 따른 플라스미드에 언급된 상기 특징에 적용되며, 본 발명에 따른 박테리아 균주에 대해 언급된 바람직하고 특히 바람직한 구현예도 또한 상기 플라스미드에서 각각 바람직하거나 또는 특히 바람직하다. 박테리아 균주에 존재하고, 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하며, 재조합 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 언급된 "추가" ORF에 대해 언급된 모든 바람직한 특징은 또한 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF 및 재조합 단백질을 코딩하는 유전자에 적용될 수 있다.
유사하게, 상기 언급된 정의 및 바람직한 구현예들은 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF 및 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 ORF에 적용된다.
예를 들어, 하나 이상의 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 하나 이상의 ORF는 하나의 오페론 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF는 개별 유전자에 존재할 수 있다. 이는 펩티도글리칸 펩티다제와 재조합 단백질이 서로 독립적으로 발현될 수 있음을 의미한다. 재조합 단백질(들)의 프로모터(들)가 펩티도글리칸 펩티다제의 프로모터와 상이하고 다르게 유도가능한 특히 바람직한 경우에는, 플라스미드는 박테리아를 상기 플라스미드로 형질전환시, 서로 독립적으로 단백질의 발현을 위한 최적의 시점을 선택하는 것이 가능하다는 특별한 이점을 갖는다.
바람직하게는, 플라스미드는 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 DNA가 유전자 spr 및 ydhO의 군으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 한다. 상기 주어진 정의가 적용된다. 이 바람직한 구체예에서, 펩티도글리칸 펩티다제의 DNA 서열은 서열번호 4 및/또는 6이다. 즉, 플라스미드는 Spr 및/또는 YdhO 전구체 단백질을 인코딩한다. 즉, 플라스미드는 각각의 성숙 단백질의 아미노산 서열 및 각각의 신호 펩타이드를 인코딩한다. 특히 바람직하게는, 플라스미드는 펩티도글리칸 펩티다제가 서열번호 4인 것을 특징으로 한다. 대안적인 바람직한 예로서, 플라스미드는 펩티도글리칸 펩티다제가 서열번호 6인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 플라스미드는 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현을 제어하는 기능성 프로모터가 유도성 프로모터인 것을 특징으로 한다.
유도성 프로모터의 예 및 바람직한 실시양태에 대해서는, 위에서 언급한 것이 적용된다.
당업자에게 공지된 방법을 사용하여 본 발명에 따른 플라스미드를 박테리아 균주에 도입하고 상기 플라스미드에 의한 재조합 단백질 및 펩티도글리칸 펩티다제를 발현하는 것은 박테리아 균주의 세포로부터 재조합 단백질의 방출이 개선되고 또한 증가된 수율로 분리될 수 있다는 이점을 갖는다.
재조합 단백질과 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF의 염색체 통합과 비교하여, 플라스미드 사용의 이점은 박테리아 균주의 플라스미드-함유 세포가 선택성 이점을 가지며, 표준 방법에 의해 선택될 수 있다는 것이다.
더욱이, 플라스미드가 박테리아 균주의 세포에서 높은 카피수로 존재할 수 있다는 것이 특히 유리하다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 박테리아 균주를 발효 배지에서 배양하고, 발효 배지를 발효 후에 세포로부터 제거하며, 재조합 단백질을 발효 배지로부터 단리하는 것을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 발효적 생산 방법을 제공한다.
염색체 통합에 의해, 또는 1 또는 2개의 발현 플라스미드로 형질전환된 박테리아 균주의 세포는 진탕 플라스크 또는 생물반응기(발효기)에서 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 배양된다.
발효 배지(성장 배지, 배양 배지)로서의 가능성은 원칙적으로 박테리아를 배양하기 위해 당업자에게 공지된 모든 일반적인 배지이다. 이와 관련하여, 예를 들어 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 당밀 또는 옥수수 침지액(corn steep liquor)과 같은 특정 비율의 복합 성분이 첨가된 복합 배지 또는 최소 염 배지를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 세포 성장을 향상시키는 비타민, 염, 아미노산 및 미량 원소와 같은 추가 성분을 배지에 첨가하는 것도 가능하다.
발효는, 바람직하게는 통상적인 생물반응기, 예를 들어, 교반 탱크, 기포 칼럼 발효기 또는 에어리프트 발효기에서 수행된다. 교반 탱크 발효기가 특히 바람직하다.
발효는, 예를 들어 영양 공급, 산소 분압, 배양의 pH 및 온도와 같은 다양한 매개변수의 지속적인 모니터링 및 정밀한 제어와 함께 성장 배지에서 단백질 생산 균주의 세포를 배양하는 것을 포함한다. 배양 기간은 바람직하게는 24-65시간이다.
발효에 사용되는 1차 탄소원은, 원칙적으로 세포에서 사용할 수 있는 모든 당, 당 알코올 또는 유기산 또는 이들의 염일 수 있다. 이와 관련하여, 글루코오스, 락토스, 아라비노스 또는 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하다. 글루코오스 및 아라비노스가 특히 바람직하다. 여러 다른 탄소원을 함께 공급하는 것도 가능한다. 동시에, 탄소원은 발효 시작 시 발효 배지에서 처음에 완전히 충전될 수 있거나, 또는 탄소원은 초기에 아무 것도 충전되지 않거나 일부만 충전되고 발효 과정에 걸쳐 공급될 수 있다. 이와 관련하여 탄소원의 일부가 초기에 충전되고 일부가 공급되는 실시양태가 특히 바람직하다. 특히 바람직하게는, 탄소원 글루코오스는 초기에 10~30g/l의 농도로 충전되고, 발효 과정에서 농도가 5g/l 미만으로 떨어졌을 때 공급을 시작하며, 그 농도가 5g/l 미만으로 유지되도록 조작된다.
재조합 단백질 및/또는 펩티도글리칸 펩티다제의 발현이 유도성 프로모터에 의해 제어되는 경우, 그 발현은 발효 배치에 프로모터-대응 인듀서(inducer)를 첨가함으로써 유도된다. 인듀서로서 적합한 것은, 예를 들어 아라비노스, 락토스, IPTG, 테트라사이클린 또는 쿠메이트이다. 인듀서는 발효 중 원하는 시점에 단일 또는 다중 용량으로 계량되어 투입될 수 있다. 대안적으로, 인듀서는 연속적으로 추가될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 단백질의 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도되고 펩티도글리칸 펩티다제의 발현은 아라비노스의 첨가에 의해 유도된다. 특히 바람직하게는, IPTG는 단일 용량으로 계량투입된다. 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 유도는 바람직하게는 글루코오스 농도가 5g/l 미만으로 떨어진 시점에 글루코오스 및 아라비노스의 혼합물이 공급되거나, 아라비노스가 단일 용량으로 계량투입되도록 구성된다.
펩티도글리칸 펩티다제의 발현은, 바람직하게는 세포 분열이 거의 없거나 더 이상 없는 배양기, 즉 성장 곡선의 정체기 직전 또는 시작 시에 유도된다. 이 시점은 약간의 상승만을 나타내거나 더 이상 상승을 전혀 나타내지 않는 세포 밀도에 의해 결정되며, 이 세포 밀도는 OD600 값 또는 CDW 값(아래 참조)으로 결정된다.
바람직하게는, 발효기의 배지는 접종 전에 교반되고 멸균된 압축 공기가 살포되며; 이와 관련하여, 산소 함량은 100% 포화로 보정되고 발효 동안 O2 포화에 대한 목표 값이 선택되며, 이는 이 값의 10% 내지 70%, 바람직하게는 20% 내지 60%, 특히 바람직하게는 30%이다. O2 포화도가 목표값 아래로 떨어지면 O2 포화도를 목표 값으로 되돌리기 위해 조절 캐스케이드가 시작되며 가스 공급 및 교반 속도를 조정할 수 있다.
배양물의 pH는 바람직하게는 pH 6 내지 pH 8이다. 바람직하게는, pH는 6.5 내지 7.5로 설정되고; 특히 바람직하게는, 배양물의 pH는 6.8 내지 7.2로 유지된다.
배양물의 온도는 바람직하게는 15℃ 내지 45℃이다. 20℃ 내지 40℃의 온도 범위가 바람직하고, 25℃ 내지 35℃의 온도 범위가 특히 바람직하며, 30℃의 온도가 매우 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 발효 배지는 발효 후 세포로부터 제거되고, 재조합 단백질은 발효 배지로부터 단리된다. 이는 선행 기술에 공지된 바와 같은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 통상적으로, 세포는 제1 단계에서 원심분리 또는 여과와 같은 분리 방법에 의해 배양 배지로 방출된 재조합 단백질로부터 제거된다. 그 다음, 재조합 단백질은, 예를 들어 한외여과에 의해 농축될 수 있다.
펩티도글리칸 펩티다제의 발현은 배양 상청액으로의 재조합 단백질의 방출을 향상시킨다. 향상된 방출의 결과로, 재조합 단백질은 증가된 수율로 분리될 수 있다.
"증가된 수율"이라는 용어에 대해서는, 상기 정의가 적용된다.
박테리아 균주, 바람직하게는 E. coli 에서 펩티도글리칸 펩티다제의 공동발현의 도움으로, Fab 항체 단편을 세포외적으로 생산하는 것도 가능하다. 이 경우, 박테리아 세포는 항체의 도메인 VL 및 CL을 포함하는 경쇄 및 도메인 VH 및 CH1을 포함하는 중쇄의 상응하는 단편을 동시에 합성한 후 주변 세포질로 이를 분비해야 한다. 세포질 외부에서, 두 개의 사슬이 조립되어 기능성 Fab 단편을 형성한다. 해당 ORF는 다른 유전자에 있을 수 있다. 경쇄 및 중쇄의 항체 단편을 코딩하는 ORF는 오페론으로 조직화되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 펩티도글리칸 펩티다제의 동시 생산의 결과로서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 증가된 농도로 발효 배지 내로 방출된다.
본 방법은 긴 배양 기간이 필요한 재조합 단백질 생산 및 > 40g/l의 높은 세포 밀도에서의 발효에 적합하다는 주요 이점이 있다. 그 결과, 복잡한 진핵생물 단백질도 재조합 단백질로 생산할 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 발효 배지를 제거한 후 발효 배지로부터 재조합 단백질을 정제하는 것을 특징으로 한다.
재조합 단백질은 침전 또는 크로마토그래피와 같은 표준 방법을 통해 추가로 정제할 수 있다. 친화성 크로마토그래피와 같은 방법이 특히 선호되는데, 이는 단백질의 정확하게 폴딩된 기본 형태를 활용한다.
바람직하게는, 상기 방법은 펩티도글리칸 펩티다제의 발현이 유도되는 것을 특징으로 한다. 이는 펩티도글리칸 펩티다제의 발현만 또는 재조합 단백질의 발현과 펩티도글리칸 펩티다제의 발현이 유도됨을 의미한다. 이는 이 바람직한 실시양태에서, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현이 어떠한 경우에도 유도성 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 대조적으로, 재조합 단백질의 발현은 구성적 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 바람직하게는, 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 ORF 및 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF 모두가 유도성 프로모터, 특히 바람직하게는 상이한 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 따라서, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 및 재조합 단백질의 발현은 바람직하게는 유도가능하다.
재조합 단백질 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 유전자의 프로모터는 바람직하게는 서로 독립적으로 유도될 수 있기 때문에, 재조합 단백질의 발현 및 펩티도글리칸 펩티다제의 발현을 위한 최적의 시점을 서로 독립적으로 선택하는 것이 가능하다.
유도성 프로모터를 사용함으로써, 원하는 발효 시점에 해당 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현은 재조합 단백질의 발현 유도 후에 유도된다. 특히 바람직하게는, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현은 재조합 단백질의 발현 유도 후 적어도 1시간, 특히 바람직하게는 적어도 2시간, 더욱 특히 바람직하게는 15 내지 40시간, 특별히 바람직하게는 20, 27 또는 38시간 후에 유도된다.
재조합 단백질 및 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 유도는 배양 배지에 인듀서를 첨가함으로써 촉발되며, 사용된 유전자에 따라 인듀서를 선택해야 한다. 펩티도글리칸 펩티다제가 아라비노스(ara) 프로모터의 제어 하에 있는 바람직한 실시양태에서, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현은 배양물에 인듀서 아라비노스를 첨가함으로써 유도된다. 재조합 유전자가 tac 프로모터를 함유하는 바람직한 구체예에서, 재조합 단백질의 발현은 인듀서 락토오스 또는 락토오스 유사체 IPTG를 배양물에 첨가함으로써 유도된다.
본 발명에 따르면, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 유도 및 세포의 추가 배양 후에도, 균주의 세포 밀도는 추가적인 펩티도글리칸 펩티다제를 발현하지 않는 박테리아 균주에 필적한다. 특히, 세포 용해로 인한 세포 건조 중량의 강한 감소는 일어나지 않는다.
본 발명은 박테리아 균주 세포의 강한 용해의 발생 없이 재조합 단백질이 배양 배지로 방출된다는 이점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 상응하는 긴 배양 기간을 갖는 복합 진핵 단백질의 생산 및 > 40g/l의 높은 세포 밀도에서의 발효 모두에 적합하다는 점에서 구별된다.
긴 배양 기간은 배양 시간이 24시간 이상, 바람직하게는 48시간 이상, 특히 바람직하게는 65시간 이상임을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 상대적으로 낮은(또는 단지 약간 증가된 또는 강하지 않은) 세포 용해는, 추가 펩티도글리칸 펩티다제를 생산하지 않는 야생형 박테리아 균주와 비교하여 펩티도글리칸 펩티다제 발현 유도 후 바람직하게는 7-17시간의 배양 기간의 경우 결정되는 박테리아 균주의 배양물의 CDW 값, OD600 값 또는 살아있는 세포 수에 대한 값의 감소가 거의 없거나 전혀 없음을 의미한다. 펩티도글리칸 펩티다제를 발현하는 박테리아 균주는, Morita et al. (2001, 상기 참조) 및 T4-파지 리소자임 또는 ClyN 단백질을 발현하는 세포에 대한 특허 문헌 CN 104762285 및 EP 1 124 941에서 기술된 바와 같이, 특히, 세포 용해가 크게 증가된 펩티도글리칸 글리코시다아제를 발현하는 균주의 배양에 대해 큰 이점이 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 추가 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 유도 후 5 내지 24시간에, 세포 건조 중량이 동일한 시점에서 추가적인 펩티도글리칸 펩티다제를 발현하지 않는 박테리아 균주에 대한 발효 방법으로부터 수득한 세포 배양물의 세포 건조 중량과 20% 이하 차이가 나는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발효 방법으로부터의 세포 배양은 추가의 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 유도 후 5 내지 24시간, 특히 바람직하게는 7시간 또는 17시간에, 세포 건조 중량이, 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 ORF를 함유하지 않는다는 점만이 본 발명에 따른 박테리아 균주와 다를 뿐인 박테리아 균주가 배양되는 발효 방법에서 수득한 세포 배양물의 세포 건조 중량에 비해 동일한 시점에서 20% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하로 더 낮다. 세포 건조 중량은 세포 밀도, 따라서 용해되지 않은 세포의 척도로 사용된다. 세포 건조 중량은 여과 또는 원심분리, 바람직하게는 원심분리에 의해 정의된 양의 배양물을 분리하고, 후속적으로 건조하고 무게를 달아 측정한다.
도 1은 플라스미드 pCGT-Spr의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 2는 플라스미드 pCGT-YdhO의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 pJF118ut-CD154의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pJF118ut-CD154-Spr의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 5는 실시예 1에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE에 의한 배양 상청액의 분석을 보여준다. 샘플은 다음과 같이 지정된다:
S: SeeBlue Prestained Protein Standard,
1: 65시간 후 W3110/pCGT의 상청액,
2: 65시간 후 아라비노스를 첨가하지 않은 W3110/pCGT-Spr의 상청액,
3: 65시간 후 아라비노스를 첨가한 W3110/pCGT-Spr의 상청액.
도면에 사용된 약어는 다음 기능을 코딩하는 DNA 영역을 나타낸다.
tac p/o: tac 프로모터/오퍼레이터
pBAD p/o: 아라비노스 프로모터/오퍼레이터
bla: β-락타마제 유전자(암피실린 내성)
TcR: 테트라사이클린 내성
lacTq: tac 프로모터의 억제자
cgt-SP: CGTase의 신호 펩타이드
CGTase: 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제
ColE1: 복제의 오리진
phoA-SP: phoA 신호 펩타이드
AFA-SP: CGTase의 신호 펩타이드 유도체
rrnB 터미네이터: rrnB 유전자의 터미네이터 영역
trpA 터미네이터: trpA 유전자의 터미네이터 영역
Spr: Spr 펩티도글리칸 펩티다제
Spr-SP: Spr의 신호 펩타이드
YdhO: YdhO 펩티도글리칸 펩티다제
HisTag: 히스티딘 태그
경쇄: 도메인 VL 및 CL을 포함하는 항체 단편
중쇄: 도메인 VH 및 CH1을 포함하는 항체 단편
BamHI/MauBI/EcoRI: 해당 제한 엔도뉴클레아제의 제한 부위
도 2는 플라스미드 pCGT-YdhO의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 pJF118ut-CD154의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pJF118ut-CD154-Spr의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 5는 실시예 1에 기술된 바와 같이 SDS-PAGE에 의한 배양 상청액의 분석을 보여준다. 샘플은 다음과 같이 지정된다:
S: SeeBlue Prestained Protein Standard,
1: 65시간 후 W3110/pCGT의 상청액,
2: 65시간 후 아라비노스를 첨가하지 않은 W3110/pCGT-Spr의 상청액,
3: 65시간 후 아라비노스를 첨가한 W3110/pCGT-Spr의 상청액.
도면에 사용된 약어는 다음 기능을 코딩하는 DNA 영역을 나타낸다.
tac p/o: tac 프로모터/오퍼레이터
pBAD p/o: 아라비노스 프로모터/오퍼레이터
bla: β-락타마제 유전자(암피실린 내성)
TcR: 테트라사이클린 내성
lacTq: tac 프로모터의 억제자
cgt-SP: CGTase의 신호 펩타이드
CGTase: 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제
ColE1: 복제의 오리진
phoA-SP: phoA 신호 펩타이드
AFA-SP: CGTase의 신호 펩타이드 유도체
rrnB 터미네이터: rrnB 유전자의 터미네이터 영역
trpA 터미네이터: trpA 유전자의 터미네이터 영역
Spr: Spr 펩티도글리칸 펩티다제
Spr-SP: Spr의 신호 펩타이드
YdhO: YdhO 펩티도글리칸 펩티다제
HisTag: 히스티딘 태그
경쇄: 도메인 VL 및 CL을 포함하는 항체 단편
중쇄: 도메인 VH 및 CH1을 포함하는 항체 단편
BamHI/MauBI/EcoRI: 해당 제한 엔도뉴클레아제의 제한 부위
실시예
본 발명은 예시적인 실시예를 참조하여 이하에서 더 상세하게 설명되나, 이에 제한되지 아니한다.
중합효소연쇄반응(PCR), 유전자 합성, DNA의 분리 및 정제, 제한효소와 리가아제에 의한 DNA의 변형, 형질전환 등의 분자생물학적 방법은 문헌에 설명되어 있거나 각 제조업체에서 권장되는, 해당 기술 분야의 기술자 모두 알려진 방식으로 진행되었다.
플라스미드에 대한 설명:
pCGT:
플라스미드 pCGT의 생산은 US 2008/0254511 A1의 실시예 4에 기재되어 있고, 플라스미드 지도는 US 2008/0254511 A1의 도 4에 명시되어 있다.
본질적으로, 플라스미드는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자뿐만 아니라, 특히 천연 CGTase 신호 서열을 포함하는 Klebsiella pneumoniae M5a1의 cyclodextrin glycosyltransferase(CGTase)의 구조 유전자를 포함한다. CGTase 유전자의 발현은 tac 프로모터의 제어 하에 있다.
pCGT-Spr:
pCGT-Spr(플라스미드 지도는 도 1 참조)을 얻기 위해 Eurofins Genomics에 의한 유전자 합성을 통해 DNA 단편을 생성했다. 상기 DNA 단편 xI(서열번호 1로 명시됨)는 다음을 포함한다:
- 아라비노스 프로모터(pBAD 프로모터) 및 오퍼레이터 O1 및 I2+I1 및 CAP 결합 부위를 포함하는 GenBank 항목 X81837.1의 뉴클레오티드 1136-1304(서열번호 1의 뉴클레오티드 10-178),
- Shine-Dalgarno 서열(서열번호 1의 뉴클레오티드 203-208) 및
- i 및 ii의 융합을 코딩하는 뉴클레오티드 단편
i. E. coli K12의 Spr 단백질 (서열번호 1의 뉴클레오티드 216-782) 및
ii. E. coli로부터의 trpA 유전자의 터미네이터 (서열번호1의 뉴클레오티드 812-837).
상기 DNA 단편 xI는 제한효소 MauBI를 사용하여 절단되고 동일한 제한효소를 사용하여 절단된 발현 벡터 pCGT와 연결하였다. 복제는 비방향성(undirected) 방식으로 수행되었다. 그러나, 제한효소 BamHI의 제한 패턴과 시퀀싱을 통해 수행된 검증으로, CGTase를 코딩하는 유전자와 동일한 판독 방향으로 DNA 단편이 삽입된 플라스미드로 작업을 수행하였다. 상기 플라스미드는 pCGT-Spr로 지칭되고 Spr 단백질을 인코딩한다.
pCGT
-
YdhO
:
pCGT-YdhO(플라스미드 지도는 도 2 참조)를 얻기 위해 Eurofins Genomics에서 유전자 합성을 통해 DNA 단편을 생성했다. 상기 DNA 단편 xII(서열번호 2로 명시됨)는 다음을 포함한다:
- 아라비노스 프로모터(pBAD 프로모터) 및 오퍼레이터 O1 및 I2+I1 및 CAP 결합 부위를 포함하는 GenBank 항목 X81837.1의 뉴클레오티드 1136-1304(서열번호 2의 뉴클레오티드 10-178),
- Shine-Dalgarno 서열(서열번호 2의 뉴클레오티드 203-208) 및
- i 및 ii의 융합을 코딩하는 뉴클레오티드 단편
i. E. coli K12의 YdhO 단백질 (서열번호 2의 뉴클레오티드 216-1028) 및
ii. E. coli로부터의 trpA 유전자의 터미네이터 (서열번호 2의 뉴클레오티드 1064-1089).
상기 DNA 단편 xII를 제한효소 MauBI를 사용하여 절단하고 동일한 제한효소를 사용하여 절단된 발현 벡터 pCGT와 연결하였다. 복제는 비방향성 방식으로 수행되었다. 그러나, 제한효소 BamHI의 제한 패턴과 시퀀싱을 통해 수행된 검증으로, CGTase를 코딩하는 유전자와 동일한 판독 방향으로 DNA 단편이 삽입된 플라스미드로 작업을 수행하였다. 상기 플라스미드는 pCGT-YdhO로 지칭되고, YdhO 단백질을 인코딩한다.
pJF118ut-CD154:
US 2008/076157 A에 기술된 플라스미드 pJF118ut는 인간화 모노클로날 항-CD154 항체 5c8의 Fab 단편 유전자의 클로닝 및 발현을 위한 출발 벡터로 사용되었고, 그 서열은 Karpusas et al. 2001년 (Structure 9, 321-329페이지)에 공개되어 있다. pJF118ut는 공지된 발현 벡터 pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)의 유도체이며, DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH(Braunschweig)에 기탁번호 DSM 18596으로 기탁되었다.
pJF118ut-CD154(플라스미드 지도는 도 3 참조)를 얻기 위해 eurofins Genomics에 의한 유전자 합성을 통해 DNA 단편을 생성했다. 상기 DNA 단편 xIII(서열번호 3에 명시됨)은 다음으로 구성된 융합을 포함하였다:
i. US 2008/076157에 개시된 서열번호 2 하의 신호 서열로서, 클렙시엘라 뉴모니아 M5a1 의 CGTase의 신호 서열로부터 유래된 신호 서열 (서열번호 3의 뉴클레오티드 25-114), 및
ii. 인간화 모노클로날 항-CD154 항체 5c8의 Fab 단편의 중쇄(VH-CH1 도메인)에 대한 판독 프레임으로서, Karpusas et al. 2001에 도 3으로 공개된 서열의 아미노산 1-221을 인코딩하는 서열(서열번호 3의 뉴클레오티드 115-777),
iii. phoA 신호 서열(서열번호 3의 뉴클레오티드 800-862),
iv. 인간화 모노클로날 항-CD154 항체 5c8의 Fab 단편의 경쇄(VL-CL 도메인)에 대한 판독 프레임으로서, Karpusas et al. 2001의 도 3으로 공개된 서열(서열번호 3의 뉴클레오티드 863-1516), 및
v. 4개 아미노산 길이의 링커 및 헥사히스티딘 태그를 인코딩하는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 1517-1546.
상기 DNA 단편 xIII는 제한 효소 EcoRI 및 PdmI를 사용하여 절단되었고, EcoRI 및 SmaI를 사용하여 절단된 발현 벡터 pJF118ut와 연결되었다. Fab 단편의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자의 발현이 tac 프로모터의 제어하에 있는 생성된 플라스미드를 pJF118ut-CD154로 명명하였다.
pJF118ut-CD154-Spr:
아라비노스 프로모터의 제어 하에 있고 trpA 터미네이터가 측면에 있는 Spr을 인코딩하는 DNA 단편 xI는 pCGT-Spr에 대해 상기 설명한 바와 같이, MauBI 제한 부위를 통해 플라스미드 pJF118ut-CD154에 삽입되었다. 복제는 비방향성 방식으로 수행되었다. 그러나, DNA 단편 xI가 CD154를 인코딩하는 DNA 단편 xIII와 반대 판독 방향으로 삽입된 플라스미드로 작업을 수행했으며, 이는 제한 효소 BamHI의 제한 패턴 및 시퀀싱을 통해 검증되었다. 상기 플라스미드를 pJF118ut-CD154-Spr로 언급하였다(플라스미드 지도는 도 4 참조).
실시예 1: 교반 탱크 발효기에서 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 발효 생산
Klebsiella pneumoniae M5a1로부터 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)를 생산하기 위해, E. coli 균주 W3110(ATCC 27325)을 플라스미드 pCGT, pCGT-Spr 및 pCGT-YdhO로 일반적인 방법(예: TSS 형질전환)으로 형질전환했다. 플라스미드 함유 세포에 대한 선택은 테트라사이클린(20 mg/l)을 사용하여 수행되었다. E.coli 균주 는 W3110/pCGT, W3110/pCGT-Spr 및 W3110/pCGT-YdhO로 지정되었다.
a)
CGTase 생산을 교반 탱크 발효기에서 수행하였다.
1.2 l의 발효 배지(1.5g/l KH2PO4; 5g/l (NH4)2SO4; 0.5g/l MgSO4 × 7H2O; 0.225g/l CaCl2 × 2H2O, 0.075g/l FeSO4 × 7H2O; 1g/l Na3 구연산염 × 2 H2O; 0.5g/l NaCl; 1ml/l 미량 원소 용액(0.15g/l Na2 MoO4 × 2H2O, 2.5g/l Na3BO3 , 0.7g/l CoCl2 × 6H2O, 0.25g/l CuSO4 × 5H2O, 1.6g/l MnCl2 × 4H2O, 0.3g/l ZnSO4 × 7H2O); 5mg/l 비타민 B1; 3g/l 파이톤 펩톤(BD 211906); 1.5g/l 효모 추출물(Oxoid LP0021); 10g/l 글루코오스; 20mg/l 테트라사이클린)로 채워진 발효기를, 1ml/l 미량 원소 용액(0.15g/l Na2MoO4 × 2H2O; 2.5g/l Na3BO3 ; 0.7g/l CoCl2 × 6H2O; 0.25g/l CuSO4 × 5H2O; 1.6g/l MnCl2 × 4H2O; 0.3g/l ZnSO4 × 7H2O), 3g/l 글루코오스, 0.55g/l CaCl2 및 20mg/l 테트라사이클린을 추가로 함유하는 LB 배지(5g/l 효모 추출물(Oxoid LP0021), 10g/l 트립톤(Oxoid LP0042), 5g/l NaCl)에서 배양한 W3110/pCGT 또는 W3110/pCGT-Spr의 예비 배양물로 0.1 OD600까지 쉐이크 플라스크에서 7시간동안 접종하였다. 이로써 발효가 시작되었다(시점 0, 발효 개시). 발효 동안, 온도는 30℃로 설정되었고 pH는 NH4OH 또는H3PO4를 계량투입하여 7.0 값으로 일정하게 유지하였다. 글루코오스 농도가 5g/l 미만이 되도록 노력하며, 발효 동안 글루코오스를 계량투입했다. CGTase의 발현은 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 21시간 후(대수 성장 단계의 끝에서) 0.15mM으로 첨가하여 유도되었다. Spr의 생산을 위해, 아라비노스 프로모터의 기본 발현을 사용했는데, 이는 발효 과정에서 소량의 Spr 단백질 형성으로 이어진다. 아라비노스 프로모터가 인듀서 없이도 표적 단백질의 낮은 생산을 허용한다는 사실은 선행 기술에 기재되어 있다(Malachowska and Olszewski, Microb Cell Fact (2018) 17:40).
접종 전에 발효기의 배지를 400rpm으로 교반하고 멸균 필터를 통해 멸균된 압축 공기 1.67vvm(분당 배양 배지 부피당 공기 부피)로 살포했다. 이러한 시작 조건에서, 광학 산소 센서(VisiFerm DO225, Hamilton)를 접종 전에 100% 포화로 보정하였다. 발효 중 O2 포화도에 대한 목표값은 이 값의 30%로 설정하였다. O2 포화도는 발효 중 산소 센서를 통해 측정되었으며, 발효기 제어 DCU(디지털 제어 장치, Sartorius Stedim)에 의해 캡처되었다. O2 포화도가 목표값 아래로 떨어진 후, O2 포화도를 목표값으로 되돌리기 위해 소프트웨어 제어 하에 교반 속도를 최대 1500 rpm까지 지속적으로 증가시켰다.
발효 65시간 후, 샘플을 수집하고 원심분리에 의해 발효 배지에서 세포를 제거하고, 발효 상청액의 CGTase 함량을 다음 효소 분석에 의해 결정했다:
분석 버퍼: 5mM Tris HCl 완충액, 5mM CaCl2 × 2H2O, pH 6.5
기질 용액: 분석 완충액 중 10% 전분 용액(Merck No. 1.01252), pH 6.5.
분석 믹스: 기질 용액 0.2ml + 원심분리(5분, 12,000rpm)된 배양 상청액 0.2ml
반응 온도: 40℃
효소 분석:
* 기질 용액 및 원심분리 배양 상청액의 온도 사전 조정함(40℃에서 약 5분)
* 기질 용액과 원심분리된 배양 상청액을 빠르게 혼합하여 분석 혼합물을 준비하고, 원심분리된 배양 상청액을 필요에 따라 분석 완충액으로 희석하여 후속 HPLC 분석에서 0.9-1.5g/l CD의 값이 결정되도록 함.
* 40℃에서 3분 동안 배양함
* 0.6ml의 메탄올을 첨가하고 급속 혼합(whirl mixer)하여 효소 반응을 정지시킴.
* 얼음 위에서 혼합물 냉각함(약 5분)
* 원심분리(5분, 12,000rpm)하고 투명한 상청액을 파이펫팅함.
* HPLC에 의해 생성된 CD의 양을 분석함: Nucleodur 100-3 NH2-RP 컬럼(150mm × 4.6mm, Macherey-Nagel) 및 물 중 64% 아세토니트릴(v/v)이 있는 Agilent HP 1100 HPLC 시스템에서 2.1 ml/min의 유속에서 이동상으로 분석을 수행했다. RI 검출기(1260 Infinity RI, Agilent)를 통해 검출하고 피크 면적 및 α-CD 표준(Cavamax W6-8 Pharma, Wacker Chemie AG)을 기준으로 정량화를 수행했다.
효소 활성 계산: A = G*V1*V2/(t*MG) [U/ml]
A = 활성,
G = CD 함량(mg/l)
V1 = 분석 믹스의 희석 인자
V2 = 분석에 사용하기 전 배양 상청액의 희석 인자;
희석되지 않았다면, V2 = 1
t = 반응 시간(분)
MG = 분자량(g/mol)(MGCD = 973g/mol)
1단위(U) 1μmol/l 제품(CD)/분
표 1은 각각 달성된 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제 수율을 나타낸다.
| 균주 | CGTase(U/ml) |
| W3110/pCGT | 31 |
| W3110/pCGT-Spr | 295 |
Spr의 생산에 의한 CGTase의 방출이 증가된 세포 용해에 기인하는지 여부를 조사하기 위해, 배양물의 세포 건조 중량 및 살아있는 세포 수(LCC)를 발효 말기에 결정하였다. 살아있는 세포 수를 결정하기 위해, 배양 샘플들을 1 ml의 최종 부피에서 LB 배지로 108 배 희석하고 희석액 100㎕로 20 mg/l 테트라사이클린을 함유하는 LB 한천 플레이트에 각 경우에 플레이팅했다. 성장한 콜로니를 계수하고 희석 인자를 고려하여 출발 배양물의 살아있는 세포 수를 계산하였는데, W3110/pCGT의 경우 50·10 9 , W3110/pCGT-Spr 의 경우 39·10 9 로 계산되었다. 세포 건조 중량을 결정하기 위해, 1 ml의 발효기 배양물을 함유하는 샘플들을 반응 용기로 옮겼고, 이 용기의 빈 중량은 사전에 결정되었다. 원심분리(5분, 12,000rpm) 후, 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 인큐베이터에서 건조했다(60℃에서 48시간 이상). 그 후, 건조된 세포 펠릿이 들어 있는 용기의 무게를 측정하고 건조된 세포 펠릿이 들어 있는 용기의 중량과 빈 용기의 중량의 차이로부터 세포 건조 중량(CDW)을 계산했다. 세포 건조 중량은 W3110/pCGT의 경우 45g/l, W3110/pCGT-Spr의 경우 55g/l였다.
강한 세포 용해는 숙주 세포 단백질의 방출로 이어진다. 이는 SDS-PAGE에 의한 배양 상청액의 단백질 함량 분석에 의해 배제되었다(도 5, 샘플 1 및 2). 발효 65시간 후, 샘플을 수집하고 원심분리에 의해 발효 배지에서 세포를 제거하였다. 무세포 상청액을 물로 1:10 희석하고, 그 중 4㎕를 1ml/l NuPAGE 항산화제(Invitrogen, Carlsbad, USA, cat. No. NP0005) 및 5% 디티오에리트리톨을 함유하는 2× Tris-Glycine SDS 샘플 완충액(Invitrogen, Carlsbad, USA, 카탈로그 번호 LC2676) 4㎕와 혼합하고, 열(thermal) 블록에서 99℃에서 5분 동안 끓였다. 샘플을 10,000rpm에서 20초 동안 원심분리하고 각 경우에 2㎕를 12% NuPAGE Bis-Tris Gel(1.0mm Х 15웰, Invitrogen, Carlsbad, USA, 카탈로그 번호 NP0343)에 로딩하고, 95V에서 3시간 동안 1× MOPS 버퍼(NuPAGE MOPS SDS Running Buffer(20×), Invitrogen, Carlsbad, USA, 카탈로그 번호 NP0001, 물로 1×로 희석)에서 전기영동으로 분해했다. 로딩된 표준은 See Blue Prestained(Invitrogen, Carlsbad, USA; 카탈로그 번호 100006636)였다. 단백질을 실온에서 1시간 동안 Instant Blue(Coomassie-based staining solution for protein gels, Expedeon Ltd., Cambridge, UK, cat. No. ISB1L)로 염색한 다음, 실온에서 하룻밤 동안 물로 탈색시켰다. CGTase 단백질에 대한 밴드 외에 다른 단백질과의 약간의 오염만이 겔에서 식별될 수 있었다. 특히, 과잉생산된 Spr 단백질(18kDa)의 방출 증가는 볼 수 없었다.
b)
나아가, CGTase를 전술한 바와 같이 균주 W3110/pCGT-Spr 및 W3110/pCGT-YdhO를 사용하여 생산하였다. YdhO의 생산은 순수한 글루코오스 공급을 10:1의 글루코오스:아라비노스 비율에서 3g/l*h의 글루코오스/아라비노스 혼합물의 일정한 공급으로 전환함으로써 발효 시작 48시간 후에 유도되었다. Spr의 생산은 1g/l의 최종 농도가 달성되도록 배양물에 아라비노스를 한 번 첨가함으로써 발효 시작 59시간 후에 유도되었다. 발효 시작 65시간 후에 수거하였다.
표 2는 이와 같이 이루어진 CGTase 수율을 보여준다.
| 균주 | CGTase(U/ml) |
| W3110/pCGT-Spr | 1130 |
| W3110/pCGT-YdhO | 1187 |
전술한 바와 같이, 세포 건조 중량은 배양 65시간 후에 결정되었다. 수득된 값은 W3110/pCGT-Spr의 경우 50g/l 및 W3110/pCGT-YdhO의 경우 41g/l였다.
W3110/pCGT-Spr의 배양 상청액을 SDS-PAGE로 분석한 결과 CGTase의 방출 외에 E. coli-내인성 단백질의 방출이 감지되지 않는 것으로 나타났다(도 5, 샘플 3).
실시예 2: Fab 항체 단편의 발효 생산
CD154 Fab 단편의 생산을 위해, E. coli 균주 W3110을 일반적인 방법(예: TSS 형질전환)에 의해 플라스미드 pJF118ut-CD154 및 pJF118ut-CD154-Spr로 형질전환시켰다. 플라스미드-함유 세포에 대한 선택은 테트라사이클린(20 mg/l)을 사용하여 수행하였다. E. coli 균주 는 W3110/pJF118ut-CD154 및 W3110/pJF118ut-CD154-Spr로 지정되었다. 상기 E. coli 균주는, 실시예 1에서 E.coli pCGT 균주 의 발효에 대해 기재된 바와 같이, 교반 탱크 발효기에서 발효되었다 . 단, 실시예 1과 대조적으로, CD154 Fab 생산은 발효 시작 26시간 후 0.15mM IPTG에 의해 유도되었고, Spr 생산은 순수한 글루코오스 공급을 41시간 후에 2:1의 글루코오스:아라비노스 비율에서 3g/l*h의 글루코오스-아라비노스 혼합물의 일정한 공급으로 전환함으로써 유도되었다.
48시간 후, 샘플을 수집하고, 원심분리에 의해 배양 배지에서 세포를 제거하고, 상청액을 분석하여 배양 배지로 방출된 CD154 Fab 단편을 결정하였다.
CD154 Fab 단편을 당업자에게 공지된 샌드위치 ELISA 검정을 통해 정량화하였다. 이는 고정된 항-인간 IgG(Fd) 항체(The Binding Site, 제품 번호 PC075)를 캐쳐(catcher)로 사용하고 퍼옥시다제-접합 염소 항-인간 카파 경쇄 항체(Sigma, 제품 번호 A 7164)를 검출 항체로 사용하는 것을 포함한다. 퍼옥시다제에 의한 발색 기질 Dako TMB+(Dako # S1599)의 전환 및 450 nm에서의 관련 흡수 변화에 의해 정량화를 완료하였다. ELISA는 Fab 단편 "Human Fab/Kappa"(Bethyl Laboratories, 제품 번호: P80-115)를 사용하여 보정되었다.
| 균주 | 상청액의 CD154 항체 단편(mg/l) |
| W3110/pJF118ut-CD154 | 5 |
| W3110/pJF118ut-CD154-Spr | 1045 |
세포 성장에 대한 Spr 발현의 영향을 조사하기 위해, 48시간 후 발효 종료 시 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양물의 세포 건조 중량을 결정하였다. 결과를 표 4에 나타냈다.
| 균주 | CDW(g/l) |
| W3110/pJF118ut-CD154 | 48 |
| W3110/pJF118ut-CD154-Spr | 43 |
SEQUENCE LISTING
<110> Wacker Chemie AG
Koch, Johanna
Kujau, Marian
<120> Bacterial strain for releasing a recombinant protein in
a fermentation method
<130> Co11816
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNS-Fragment xI
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(879)
<400> 1
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatggt caaatctcaa ccgattttga 240
gatatatctt gcgcgggatt cccgcgattg cagtagcggt tctgctttct gcatgtagtg 300
caaataacac cgcaaagaat atgcatcctg agacacgtgc agtgggtagt gaaacatcat 360
cactgcaagc ttctcaggat gaatttgaaa acctggttcg taatgtcgac gtaaaatcgc 420
gaattatgga tcagtatgct gactggaaag gcgtacgtta tcgtctgggc ggcagcacta 480
aaaaaggtat cgattgttct ggtttcgtac agcgtacatt ccgtgagcaa tttggcttag 540
aacttccgcg ttcgacttac gaacagcagg aaatgggtaa atctgtttcc cgcagtaatt 600
tgcgtacggg tgatttagtt ctgttccgtg ccggttcaac gggacgccat gtcggtattt 660
atatcggcaa caatcagttt gtccatgctt ccaccagcag tggtgttatt atttccagca 720
tgaatgaacc gtactggaag aagcgttaca acgaagcacg ccgggttctc agccgcagct 780
aagaattgca agctggccga cgcgtcccac agccgccagt tccgctggcg gcattttaac 840
tttctttaat gaagccggaa aaatcccgcg cgcgaaggc 879
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNS-Fragment xII
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1131)
<400> 2
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatggc gcggataaac cgtatttcga 240
tcacgctctg tgctttactt tttaccaccc tgcctttaac gcctatggcc catgcttcaa 300
agcaagccag ggagagttct gctaccactc atatcaccaa aaaagcagat aaaaagaaaa 360
gcacggcaac caccaaaaag acccagaaaa cagcgaaaaa agccgccagt aaaagtacga 420
ccaaaagcaa aaccgcttct tccgttaaaa aatcttccat taccgcttct aaaaacgcca 480
aaactcgcag caaacacgcc gtcaataaaa cggcctcagc cagctttacc gaaaagtgta 540
ccaaacgtaa gggctataaa tcgcattgtg tgaaagtcaa aaatgccgcg tcaggaactc 600
ttgccgacgc gcacaaagcg aaggtgcaaa aagctacgaa agtggcaatg aataaactga 660
tgcagcaaat tggtaagcca tatcgttggg gtggcagctc accgcgtacc ggttttgatt 720
gcagcggcct ggtttattac gcttataaag atttggtgaa aattcgtatt ccgcgtacgg 780
cgaatgaaat gtatcacctg cgtgatgcag cgccaatcga acgtagtgaa ctgaaaaacg 840
gcgacctggt ctttttccgt actcagggac gcggcacagc cgatcatgtc ggcgtgtatg 900
tcggcaacgg caaatttatt cagtcaccgc gcacaggtca ggaaattcaa atcacttctc 960
tcagtgaaga ctactggcag cgccactatg ttggcgctcg tcgggtaatg accccaaaaa 1020
cacttcgcta agaattgcaa gctggccgac gcgctctccc acagccgcca gttccgctgg 1080
cggcatttta actttcttta atgaagccgg aaaaatcccg cgcgcgaagg c 1131
<210> 3
<211> 1599
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNS-Fragment xIII
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1599)
<400> 3
acagaattct aaggaggaaa ttatatgaaa agaaaccgtt tttttaatac ctcggctgct 60
attgccattt cgattgcatt acagatcttt tttccgtccg cttccgcttt cgctcaggtt 120
cagctggtgc agagcggtgc cgaagttgtt aaaccgggtg caagcgttaa actgagctgt 180
aaagcaagcg gctatatttt taccagctat tatatgtatt gggtgaaaca ggcaccgggt 240
cagggtctgg aatggattgg tgaaattaat ccgagcaatg gcgataccaa ttttaatgaa 300
aaatttaaaa gcaaagccac cctgaccgtt gataaaagcg caagcaccgc atatatggaa 360
ctgagcagcc tgcgtagcga agataccgca gtttattatt gtacccgtag tgatggtcgc 420
aatgatatgg atagctgggg tcagggcacc ctggtcaccg ttagcagcgc aagcaccaaa 480
ggtccgagcg tttttccgct ggcaccgagc agcaaaagca ccagcggtgg caccgcagca 540
ctgggttgtc tggttaaaga ttattttccg gaaccggtta cagttagctg gaatagcggt 600
gcactgacca gtggtgttca tacctttccg gcagttctgc aaagcagcgg tctgtatagc 660
ctgagcagcg ttgttaccgt tccgagcagt agcctgggca cccagaccta tatttgtaat 720
gttaatcata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag ttgaaccgaa aagctgctaa 780
taaccatgga gaaaataaag tgaaacaaag cactattgca ctggcactct taccgttact 840
cttcacccct gttaccaaag ccgatattgt gctcacccag agtccggcaa ccctgagcgt 900
tagtccgggt gaacgtgcaa ccattagctg tcgtgcaagc cagcgtgtta gcagcagcac 960
ctatagctat atgcattggt atcagcagaa accgggtcag cctccgaaac tgctgattaa 1020
atatgcaagc aatctggaaa gcggtgttcc ggcacgtttt agcggtagcg gtagtggcac 1080
cgattttacc ctgaccatta gcagcgttga accggaagat tttgccacct attattgtca 1140
gcatagctgg gaaattcctc cgacctttgg tggtggcacc aaactcgaga ttaaacgtac 1200
cgttgcagca ccgagcgtgt ttatctttcc gcctagtgat gaacagctga aaagcggcac 1260
cgcaagcgtt gtttgtctgc tgaataactt ttatccgcgt gaagcaaaag ttcagtggaa 1320
agttgataat gcactgcaaa gcggtaatag ccaagaaagc gttaccgaac aggatagcaa 1380
agatagcacc tatagcctgt caagcaccct gaccctgagc aaagcagatt atgaaaaaca 1440
caaagtgtat gcctgcgaag ttacccatca gggtctgagc agtccggtta caaaaagttt 1500
taatcgtggt gaatgtagct cttctgccca tcaccaccat caccattaat aagcttctag 1560
aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcgac 1599
<210> 4
<211> 564
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(564)
<223> coding for the Spr precursor protein
<400> 4
atggtcaaat ctcaaccgat tttgagatat atcttgcgcg ggattcccgc gattgcagta 60
gcggttctgc tttctgcatg tagtgcaaat aacaccgcaa agaatatgca tcctgagaca 120
cgtgcagtgg gtagtgaaac atcatcactg caagcttctc aggatgaatt tgaaaacctg 180
gttcgtaatg tcgacgtaaa atcgcgaatt atggatcagt atgctgactg gaaaggcgta 240
cgttatcgtc tgggcggcag cactaaaaaa ggtatcgatt gttctggttt cgtacagcgt 300
acattccgtg agcaatttgg cttagaactt ccgcgttcga cttacgaaca gcaggaaatg 360
ggtaaatctg tttcccgcag taatttgcgt acgggtgatt tagttctgtt ccgtgccggt 420
tcaacgggac gccatgtcgg tatttatatc ggcaacaatc agtttgtcca tgcttccacc 480
agcagtggtg ttattatttc cagcatgaat gaaccgtact ggaagaagcg ttacaacgaa 540
gcacgccggg ttctcagccg cagc 564
<210> 5
<211> 188
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(188)
<223> amino acid sequence of Spr precursor protein
<400> 5
Met Val Lys Ser Gln Pro Ile Leu Arg Tyr Ile Leu Arg Gly Ile Pro
1 5 10 15
Ala Ile Ala Val Ala Val Leu Leu Ser Ala Cys Ser Ala Asn Asn Thr
20 25 30
Ala Lys Asn Met His Pro Glu Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu Thr Ser
35 40 45
Ser Leu Gln Ala Ser Gln Asp Glu Phe Glu Asn Leu Val Arg Asn Val
50 55 60
Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Asp Gln Tyr Ala Asp Trp Lys Gly Val
65 70 75 80
Arg Tyr Arg Leu Gly Gly Ser Thr Lys Lys Gly Ile Asp Cys Ser Gly
85 90 95
Phe Val Gln Arg Thr Phe Arg Glu Gln Phe Gly Leu Glu Leu Pro Arg
100 105 110
Ser Thr Tyr Glu Gln Gln Glu Met Gly Lys Ser Val Ser Arg Ser Asn
115 120 125
Leu Arg Thr Gly Asp Leu Val Leu Phe Arg Ala Gly Ser Thr Gly Arg
130 135 140
His Val Gly Ile Tyr Ile Gly Asn Asn Gln Phe Val His Ala Ser Thr
145 150 155 160
Ser Ser Gly Val Ile Ile Ser Ser Met Asn Glu Pro Tyr Trp Lys Lys
165 170 175
Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser Arg Ser
180 185
<210> 6
<211> 813
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(813)
<223> DNA coding for the Ydho precursor protein
<400> 6
atggcgcgga taaaccgtat ttcgatcacg ctctgtgctt tactttttac caccctgcct 60
ttaacgccta tggcccatgc ttcaaagcaa gccagggaga gttctgctac cactcatatc 120
accaaaaaag cagataaaaa gaaaagcacg gcaaccacca aaaagaccca gaaaacagcg 180
aaaaaagccg ccagtaaaag tacgaccaaa agcaaaaccg cttcttccgt taaaaaatct 240
tccattaccg cttctaaaaa cgccaaaact cgcagcaaac acgccgtcaa taaaacggcc 300
tcagccagct ttaccgaaaa gtgtaccaaa cgtaagggct ataaatcgca ttgtgtgaaa 360
gtcaaaaatg ccgcgtcagg aactcttgcc gacgcgcaca aagcgaaggt gcaaaaagct 420
acgaaagtgg caatgaataa actgatgcag caaattggta agccatatcg ttggggtggc 480
agctcaccgc gtaccggttt tgattgcagc ggcctggttt attacgctta taaagatttg 540
gtgaaaattc gtattccgcg tacggcgaat gaaatgtatc acctgcgtga tgcagcgcca 600
atcgaacgta gtgaactgaa aaacggcgac ctggtctttt tccgtactca gggacgcggc 660
acagccgatc atgtcggcgt gtatgtcggc aacggcaaat ttattcagtc accgcgcaca 720
ggtcaggaaa ttcaaatcac ttctctcagt gaagactact ggcagcgcca ctatgttggc 780
gctcgtcggg taatgacccc aaaaacactt cgc 813
<210> 7
<211> 271
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(271)
<223> Amino acid sequence of the Ydho precursor protein
<400> 7
Met Ala Arg Ile Asn Arg Ile Ser Ile Thr Leu Cys Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Leu Pro Leu Thr Pro Met Ala His Ala Ser Lys Gln Ala Arg
20 25 30
Glu Ser Ser Ala Thr Thr His Ile Thr Lys Lys Ala Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Ser Thr Ala Thr Thr Lys Lys Thr Gln Lys Thr Ala Lys Lys Ala Ala
50 55 60
Ser Lys Ser Thr Thr Lys Ser Lys Thr Ala Ser Ser Val Lys Lys Ser
65 70 75 80
Ser Ile Thr Ala Ser Lys Asn Ala Lys Thr Arg Ser Lys His Ala Val
85 90 95
Asn Lys Thr Ala Ser Ala Ser Phe Thr Glu Lys Cys Thr Lys Arg Lys
100 105 110
Gly Tyr Lys Ser His Cys Val Lys Val Lys Asn Ala Ala Ser Gly Thr
115 120 125
Leu Ala Asp Ala His Lys Ala Lys Val Gln Lys Ala Thr Lys Val Ala
130 135 140
Met Asn Lys Leu Met Gln Gln Ile Gly Lys Pro Tyr Arg Trp Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ser Pro Arg Thr Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu Val Tyr Tyr Ala
165 170 175
Tyr Lys Asp Leu Val Lys Ile Arg Ile Pro Arg Thr Ala Asn Glu Met
180 185 190
Tyr His Leu Arg Asp Ala Ala Pro Ile Glu Arg Ser Glu Leu Lys Asn
195 200 205
Gly Asp Leu Val Phe Phe Arg Thr Gln Gly Arg Gly Thr Ala Asp His
210 215 220
Val Gly Val Tyr Val Gly Asn Gly Lys Phe Ile Gln Ser Pro Arg Thr
225 230 235 240
Gly Gln Glu Ile Gln Ile Thr Ser Leu Ser Glu Asp Tyr Trp Gln Arg
245 250 255
His Tyr Val Gly Ala Arg Arg Val Met Thr Pro Lys Thr Leu Arg
260 265 270
Claims (15)
- 기능성 프로모터의 제어 하에서 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 박테리아 균주에 있어서,
상기 박테리아 균주는 기능성 프로모터의 제어 하의 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 추가적인 오픈 리딩 프레임을 함유하는 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주. - 제1항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 그람-음성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아 균주가 E. coli 종의 균주인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주 .
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티도글리칸 펩티다제가 (i) Spr, (ii) YdhO 또는 (iii) Spr 및 YdhO인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Spr이 서열번호 5의 아미노산 27-188에 의해 특정된 서열인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, YdhO가 서열번호 7의 아미노산 28-271에 의해 특정된 서열인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현을 제어하는 기능성 프로모터가 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질이 이종 단백질인 것을 특징으로 하는, 박테리아 균주.
- 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 재조합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 플라스미드에 있어서,
상기 플라스미드가 추가적으로
- 기능성 프로모터의 제어 하에 신호 펩타이드 및 펩티도글리칸 펩티다제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는, 플라스미드. - 제9항에 있어서, 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 DNA가 유전자 spr 및 ydhO 의 군으로부터 선택된 유전자인 것을 특징으로 하는, 플라스미드.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 펩티도글리칸 펩티다제를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 발현을 조절하는 기능성 프로모터가 유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는, 플라스미드.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 균주를 발효 배지에서 배양하고,
발효 후 상기 발효 배지를 세포로부터 제거하며,
상기 발효 배지로부터 재조합 단백질을 분리하는 것
을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 발효 생산 방법. - 제12항에 있어서, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현이 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 펩티도글리칸 펩티다제의 발현이 재조합 단백질의 발현 유도 후에 유도되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 펩티도글리칸 펩티다제의 발현 유도 후 5 내지 24시간에, 발효 배지 제거 후 세포 건조 중량이, 동일한 시점에서 추가 펩티도글리칸 펩티다제를 발현하지 않는 박테리아 균주에 대한 발효 방법으로부터 수득한 세포 배양물의 세포 건조 중량에 비해 20 이하로 차이가 나는 것을 특징으로 하는, 방법.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2019/071006 WO2021023367A1 (de) | 2019-08-05 | 2019-08-05 | Bakterienstamm zur freisetzung eines rekombinanten proteins in einem fermentationsverfahren |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220031670A true KR20220031670A (ko) | 2022-03-11 |
Family
ID=67902484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227003939A KR20220031670A (ko) | 2019-08-05 | 2019-08-05 | 발효 방법에서 재조합 단백질 방출용 박테리아 균주 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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