CN114829578A - 用于在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细菌菌株，包含在功能启动子控制下编码信号肽和重组蛋白的开放阅读框，其特征在于该细菌菌株含有在功能启动子的控制下编码信号肽和肽聚糖肽酶的另外的开放阅读框。本发明还涉及一种编码重组蛋白和肽聚糖肽酶的质粒，以及使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有在功能启动子控制下编码信号肽和重组蛋白的开放阅读框的细菌菌株，其特征在于，该细菌菌株含有在功能启动子控制下编码信号肽和肽聚糖肽酶的额外开放阅读框。本发明还涉及编码重组蛋白和肽聚糖肽酶的质粒以及使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白的方法。
背景技术
与哺乳动物细胞培养物相比，重组蛋白在细菌中的生产，因为生成时间短且操作简单，因此更具成本有效性。由于其广泛研究的遗传学和生理学，革兰氏阴性肠细菌大肠杆菌(Escherichia coli)是目前最常用于生产重组蛋白的生物。特别有吸引力的是大肠杆菌中的重组蛋白生产方法，其中目标蛋白以高产率和正确折叠方式直接释放到发酵培养基中，因为这避免了复杂的细胞破坏和蛋白折叠过程。
文献中公开了一系列能够将重组蛋白释放到培养基中的大肠杆菌菌株。这些是大肠杆菌的突变体，其外膜具有永久性缺陷，因此会将部分周质蛋白排放到培养基中。这是非特异性的机制。这种“泄漏”型突变体的实例是在Tol-Pal复合物中具有缺陷的细菌菌株，例如，tol和pal缺失突变体。已知tol和pal缺失突变体会将细胞内源的周质蛋白排放到培养基中。此类菌株对EDTA、各种去污剂和抗生素极为敏感，并表现出生长缺陷(Clavel etal.1998,Mol.Microbiol.29,pages 359-367；Chen et al.2014,Microb.Biotechnol.7,pages 360-370)。因此，它们仅有限适用于高细胞密度和相对较长时间的培养。
出于这个原因，优先使用可以将蛋白释放到培养基中而没有永久性缺陷的菌株。重组蛋白在生产过程中的特定时间点的诱导释放可以通过削弱肽聚糖层而实现，其是细菌细胞包膜的重要稳定因素。
肽聚糖或胞壁质层是一种交联大分子，其存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性细菌的细胞包膜中并赋予其强度。肽聚糖由构成直链主链的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸互连分子链组成。相邻链的N-乙酰胞壁酸残基通过寡肽相互连接(Silhavy et al.2010,ColdSpring Harb.Perspect.Biol.2(5))。
肽聚糖水解酶是一组可以切割肽聚糖层中的共价键的酶(Vollmer,FEMSMicrobiol Rev.32,2008,pages 259-286)。肽聚糖水解酶根据切割的键类型而分为不同类别。糖苷酶(N-乙酰葡糖胺苷酶，切割性转糖基酶)，也包括溶菌酶，会切割由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺单元组成的肽聚糖骨架的糖苷键。酰胺酶(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)会切割肽聚糖骨架的N-乙酰胞壁酸和肽交联的L-丙氨酸之间的酰胺键。相反，肽酶(羧肽酶和内肽酶)会切割肽交联内的肽键。
在现有技术中使用肽聚糖水解酶的已知实例是在收获细菌培养物后向细胞添加溶菌酶以破坏所述细胞(Pierce et al.1997,J Biotechnol 58,pages 1-11)。
例如，在专利文件CN 104762285 B中，溶菌酶和肽聚糖结合域的融合体ClyN以诱导方式产生，而重组生产的细胞质绿色荧光蛋白(GFP)因而从所述细胞释放到培养基中。
另一已知的原理是将大肠杆菌与用于生产重组蛋白的载体和用于从T4噬菌体生产溶菌酶的载体共转化以释放重组蛋白，例如细胞质β-葡萄糖醛酸酶(Morita etal.2001,Biotechnol.Prog.17,pages 573-576)或抗-CD18抗体片段或IGF-I(EP 1 124941)。
溶菌酶的产生会导致细胞裂解，这意味着这些方法具有的主要缺点是重组蛋白的释放伴随着其他细胞内组分的释放，如宿主细胞蛋白和DNA。这会污染培养物上清液，其后果，特别是因为粘度增加，导致处理困难。
CN 104762285 B中描述了通过ClyN释放GFP的这种不利影响，其中与无诱导ClyN生产的培养物相比，诱导ClyN生产后的活细胞计数下降到0.2％。由于细胞裂解，表达ClyN的大肠杆菌培养物的光密度下降了ClyN生产开始前30分钟内的值的约三分之二。5小时后，表达ClyN的培养物的光密度仅为无ClyN生产的对照培养物的光密度的约20％。Morita等人的T4-噬菌体溶菌酶导致β-葡萄糖醛酸酶的释放，与培养物的显著较低光密度有关。
EP 1 124 941中报道了抗CD18抗体片段释放的相同不利影响，其中T4-噬菌体溶菌酶的过量生产导致了细胞密度降低至最大值的30％。在由于T4-噬菌体溶菌酶而释放IGF-I的情况下，同样观察到由于裂解导致的细胞密度急剧下降，而显微镜分析仅显示出少数完整细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌菌株，与野生型宿主细胞相比，该细菌菌株以增加的产量将重组蛋白释放到培养基中而不会发生强细胞裂解。
该目的通过含有在功能启动子控制下编码信号肽和重组蛋白的开放阅读框的细菌菌株实现，其特征在于该细菌菌株含有在功能启动子控制下编码信号肽和肽聚糖肽酶的额外开放阅读框。
该细菌菌株优选特征在于，所述细菌菌株是革兰氏阴性菌，特别优选肠杆菌属的细菌菌株，尤其优选大肠杆菌种的菌株。
野生型基因是指通过进化自然产生并存在于野生型细菌基因组中的基因形式。
该基因表达前体蛋白，其包含整个蛋白的氨基酸序列，包括信号序列氨基酸序列，而不带有翻译后修饰。
术语成熟蛋白是指包含去除信号序列并且其中存在任何翻译后修饰的完整蛋白的氨基酸序列。这种翻译后修饰是例如使用膜锚的修饰。
在本发明的上下文中，术语全长蛋白是指成熟蛋白。
根据本发明，细菌菌株中包含的额外开放阅读框会编码信号肽和肽聚糖肽酶，肽聚糖肽酶是肽聚糖水解酶之一。在下文中，术语“肽聚糖肽酶”总是指由以其成熟形式，即在信号肽被切割掉之后，所述额外ORF表达的额外蛋白，而不是由存在于细菌野生型基因组中的基因编码并表达的蛋白。在大肠杆菌中编码肽聚糖肽酶的基因的实例有spr、ydhO、yebA、dacA、dacC、dacD、yfeW、pbpG、mepA、dacB、ampH和ldcA。
1.在优选的实施方式中，由额外的ORF编码的肽聚糖肽酶是野生型全长蛋白，其切割D-丙氨酸和肽侧链的内消旋二氨基庚二酸之间的键，如Spr(Uniprot条目P0AFV4)、YdhO(Uniprot条目P76190)、YebA(Uniprot条目P0AFS9)、MepA(Uniprot条目P0C0T5)、DacB(Uniprot条目P24228)或PBP 7(Uniprot条目P0AFI5)，具有由指定数据库条目已知的氨基酸序列，
2.在可替换的优选实施方式中，由额外ORF编码的肽聚糖肽酶是与相应野生型全长蛋白的氨基酸序列具有至少30％，优选至少70％的序列同一性的野生型全长蛋白突变形式，
3.在进一步优选的实施方式中，由额外ORF编码的肽聚糖肽酶是野生型全长蛋白的片段，
4.在进一步优选的实施方式中，由额外ORF编码的肽聚糖肽酶是与野生型全长蛋白的相应片段的氨基酸序列具有至少30％，优选至少70％的序列同一性的野生型蛋白片段的突变形式，
其中，在所有情况1-4中，由额外ORF编码并选择为肽聚糖肽酶的蛋白具有肽聚糖肽酶活性。本领域技术人员根据文献(Gonzalez-Leiza et al.2011,J Bacteriol 193,pages 6887-94)知晓如何检测这种活性的方法。
与肽聚糖肽酶的野生型全长蛋白或其片段相比，例如在第2点和第4点下的氨基酸水平的突变可以是取代、缺失和/或插入。
肽聚糖肽酶的实例是Spr和YdhO，其切割细菌肽聚糖层肽交联中的D-丙氨酸和内消旋二氨基庚二酸之间的键(Singh et al.2012,Mol.Microbiol.86,pages 1036-1051)，从而允许将新链并入现有的肽聚糖网络中，而由此生长细胞。
大肠杆菌的spr基因编码具有188个氨基酸的Spr蛋白(Uniprot P0AFV4)，其中氨基酸1-26构成从细胞质转运到周质的信号序列。在成熟Spr蛋白中，信号序列被蛋白水解切割掉，并且此外，成熟蛋白第1位(总序列的第27位)的半胱氨酸残基被膜锚修饰，Spr蛋白通过该膜锚而被锚定于外膜中。成熟Spr蛋白因此由162个氨基酸组成并且在本发明的上下文中被称为Spr全长蛋白。
ydhO基因编码具有271个氨基酸的YdhO蛋白(Uniprot P76190)。氨基酸1-27被预测为周质输出信号肽。成熟YdhO蛋白因此由244个氨基酸组成并且在本发明的上下文中被称为YdhO全长蛋白。
编码Spr前体蛋白的DNA序列指定于SEQ ID No.4中，而编码YdhO前体蛋白的DNA序列则指定于SEQ ID No.6中。Spr前体蛋白的氨基酸序列指定于SEQ ID No.5中，而氨基酸1-26构成信号序列，并且氨基酸27-188构成成熟Spr蛋白(等同于Spr全长蛋白)。YdhO前体蛋白的氨基酸序列指定于SEQ ID No.7中，而氨基酸1-27构成信号序列，并且氨基酸28-271构成成熟YdhO蛋白(等同于YdhO全长蛋白)。
优选地，肽聚糖肽酶是(i)Spr、(ii)YdhO或(iii)Spr和YdhO。Spr和YdhO是分别指定于数据库序列中的野生型全长蛋白，是与野生型全长蛋白的氨基酸序列具有至少30％，优选至少70％的序列同一性的野生型全长蛋白的突变形式，野生型全长蛋白的片段，或与野生型全长蛋白片段的氨基酸序列具有至少30％，优选至少70％的序列同一性的野生型全长蛋白片段的突变版，其中选择的蛋白具有胞壁质DD-内肽酶活性。特别优选地，Spr是由SEQ ID No.5中的27-188位氨基酸指定的序列，而YdhO是由SEQ ID No.7中的28-271位氨基酸指定的序列。
在肽聚糖肽酶是Spr的优选实施方式中，特别优选Spr蛋白与外膜相互作用。
编码根据本发明的肽聚糖肽酶的DNA序列优选是源自大肠杆菌的DNA序列。
开放阅读框(ORF)是指DNA或RNA的起始密码子和终止密码子之间的区域，并编码蛋白的氨基酸序列。ORF也称为编码区。
ORF被非编码区包围。基因是指包含产生生物活性RNA的所有基本信息的DNA片段。基因包含由其通过转录产生单链RNA拷贝的DNA片段和参与该复制过程调节的表达信号。表达信号至少包括，例如，启动子、转录起始位点、翻译起始位点和核糖体结合位点。此外，终止子和一个或多个操作子有可能作为表达信号。
在功能性启动子的情况下，在启动子调控下的ORF被转录成RNA。
单顺反子是指仅包含一个开放阅读框的信使RNA(mRNA)。
操纵子是包含多个ORF、启动子和可能的其他表达信号的DNA功能单元。
在每种情况下，细菌菌株可以包含(1)一个编码信号肽和重组蛋白的ORF，(2)编码相同信号肽和重组蛋白的多个ORF，或(3)编码不同信号肽和重组蛋白的多个ORF。每当第二种可能例如用于提高重组蛋白的表达和产量时，则第3种可能特别适用于由多个多肽(亚基)组成的蛋白的表达。一个实例是在转运出细胞质后随即被组装的抗体片段的表达。
这些ORF各自可以位于单独的基因中；也有可能多个ORF组织于操纵子中，即受共同表达信号调控。
如果重组蛋白由多条多肽链(亚基)组成，则优选每条都连接到信号肽的各肽链(亚基)的ORF组织于操纵子中。
此外，每个操纵子可以包含一个编码信号肽和肽聚糖肽酶的ORF。
优选将编码信号肽和肽聚糖肽酶的ORF转录为单顺反子信使RNA。这意味着肽聚糖肽酶由其自身的单独基因表达。在肽聚糖肽酶是Spr或YdhO的优选实施方式中，相应基因被称为spr基因或ydhO基因。
编码信号肽和重组蛋白的ORF以及信号肽和肽聚糖肽酶可以染色体表达或通过质粒表达。在单独基因的情况下，它们也可以通过在复制起点和选择标记方面彼此相容的单独质粒进行表达。多个ORF优选是质粒编码的。
编码肽聚糖肽酶的根据本发明的ORF的DNA序列的来源并不限于用于生产重组蛋白的细菌菌株，只要相应肽聚糖肽酶在用于生产重组蛋白的细菌菌株中是功能性的即可，即具有胞壁质DD-内肽酶活性(见上文)。优选地，编码肽聚糖肽酶蛋白的ORF的序列是源自也用于生产重组蛋白的相同生物体的DNA序列。
在本发明的上下文中以单数形式使用的术语“编码信号肽和重组蛋白的一个/该ORF”和“一个/该重组蛋白”，也可以是指多个ORF和/或多个不同重组蛋白，各自由信号肽引导。优选涉及1-3种不同重组蛋白，特别优选1种重组蛋白或2种不同重组蛋白。重组蛋白在细菌中的克隆和表达按照现有技术进行实现。例如，重组蛋白具有用于转运到周质中的信号序列。
重组蛋白是野生型细菌基因组天然完全不表达或以不同量表达的蛋白。细菌用于生产重组蛋白，根据本发明，蛋白被释放到培养基中。
根据本发明的细菌菌株在发酵方法中的用途的优点在于，所述细菌菌株与重组蛋白一起表达作为额外蛋白的肽聚糖肽酶。术语“额外的”是指除了细菌菌株中的野生型基因之外还存在编码肽聚糖肽酶的进一步的或“额外的”开放阅读框的事实。这种编码肽聚糖肽酶的额外开放阅读框优选位于质粒上。
由于其信号序列，肽聚糖肽酶位于周质中，并且由于肽交联的裂解导致肽聚糖层不稳定。尽管细菌的细胞包膜不稳定，但未观察到细胞裂解增加，并且在实验中，与仅表达重组蛋白的细菌菌株相比，表达重组蛋白和肽聚糖肽酶的细菌菌株的细胞干重保持不变。由于细菌细胞包膜不稳定，重组蛋白可以从细胞周质中释放出来，并且可以从培养物上清液中以增加的产量分离。按照这种方式，与现有技术相比，有可能在培养上清液中获得增加的产物产量，而不会发生细菌细胞的大量死亡。
增加的产量应该理解为是指，与根据现有技术使用含有相同重组蛋白基因的野生型细菌菌株可以生产的产量相比，使用根据本发明的细菌菌株，优选至少110％，特别优选至少150％而尤其优选至少200％的重组蛋白量被释放到培养基中。这意味着释放到培养基中的重组蛋白的产量优选是用无肽聚糖肽酶超量生产的相应细菌菌株可以达到的产量的至少1.1倍，特别优选至少1.5倍，而尤其优选至少2倍。
在本发明中，CGT酶用作重组蛋白的实例。实施例1中CGT酶产量的比较表明，与W3110/pCGT细菌菌株相比，使用W3110/pCGT-Spr细菌菌株时以U/mL测量的CGT酶产量增加了近10倍(见表1)。与对照菌株相比，由于Spr蛋白的额外产生，细胞干重(CDW)和活细胞计数均未减少。
与包含W3110/pCGT细菌菌株的对照批次相比，菌株W3110/pCGT-YdhO实现了与菌株W3110/pCGT-Spr(见表2)几乎相同的CGT酶产量，而没有显著影响细胞干重。
为了生产作为重组蛋白的Fab抗体片段，在这种情况下是CD154 Fab片段，实施例2还证实，与菌株W3110/pJF118ut-CD154相比，使用表达肽聚糖肽酶Spr的菌株W3110/pJF118ut-CD154-Spr可以实现显著更高的重组蛋白产量，在这种情况下，要高200倍(表3)。同时，细胞干重仅略微下降(表4)。
OD600是指在600nm分光光度计的辅助下测定的细胞培养物的光密度，并且是每单位体积的细胞数量(细胞浓度、细胞密度)的量度，它由此是细胞分裂活性的度量和细胞裂解的度量，而细胞裂解会导致细胞密度降低。
CN 104762285 B在图2中对比表明，OD600值，即细胞密度，在诱导ClyN表达后会显著下降，这意味着强烈的细胞裂解。
由于强烈细胞裂解会导致宿主细胞蛋白的释放，重组蛋白会被宿主细胞蛋白污染。此外，DNA的释放会导致培养基粘度增加，这使得进一步的处理变得更加困难。由于根据本发明的细菌菌株并未表现出细胞裂解速率增大，使用细菌菌株生产重组蛋白意味着重组蛋白不会被宿主细胞蛋白污染。这通过实施例1中借助于SDS-PAGE对培养物上清液的蛋白含量的分析而证实(图5)，这表明当使用根据本发明的细菌菌株时不会发生宿主细胞蛋白对重组蛋白的严重污染。额外表达的肽聚糖肽酶也没有表现出释放增加。
为了实现重组蛋白向培养基中的释放，需要重组蛋白和前体肽聚糖肽酶在细胞溶质中进行蛋白生物合成后转运到周质中。为了转运到周质中，需要将重组蛋白的编码DNA序列的5'端和肽聚糖肽酶的编码DNA序列的5'端与蛋白出口的信号序列的3'端在框内连接。原则上，适用于该目的的是所有允许在使用的细菌菌株中借助于Sec或Tat装置使靶蛋白易位的信号序列。现有技术中描述了各种信号序列，例如，以下基因的信号序列：phoA、ompA、pelB、ompF、ompT、lamB、malE、葡萄球菌蛋白A、StII等(Choi and Lee 2004,Appl.Microbiol.Biotechnol.64,pages 625-635)。根据本发明，重组蛋白优选的是大肠杆菌的phoA基因或ompA基因的信号序列或在US 2008/0076157中公开为SEQ ID No.1和3的来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)M5a1的环糊精糖基转移酶(α-CGT酶)的信号序列或由其衍生的信号序列。肽聚糖肽酶优选在其前体形式中带有所讨论的蛋白天然的信号序列。在肽聚糖肽酶是Spr或YdhO的优选实施方式中，所讨论的肽聚糖肽酶的前体形式分别是SEQ ID No.5和7中指定的序列。重组蛋白和肽聚糖肽酶优选带有不同的信号序列，这两种信号序列会导致蛋白输出。
编码肽聚糖肽酶和重组蛋白的ORF的表达可以由一个启动子、两个相同启动子或两个不同启动子控制。优选肽聚糖肽酶和重组蛋白的ORF处于两种不同启动子的控制之下。
编码肽聚糖肽酶的DNA片段可以首先通过PCR，使用寡核苷酸作为引物和编码肽聚糖肽酶的DNA模板，例如从大肠杆菌中分离的基因组DNA进行扩增，然后使用常见的分子生物学技术，在每种情况下与包含信号肽的序列并以类似方式产生的DNA分子连接，使得形成框内融合。可替换地，也可以通过基因合成产生整个DNA分子。然后可以将由所讨论的信号序列和成熟蛋白的编码序列组成的DNA分子引入载体，例如质粒中，或通过已知方法直接整合到细菌菌株的染色体中。优选将DNA分子引入质粒，例如已知的表达载体的衍生物，如pJF118EH、pKK223-3、pUC18、pBR322、pACYC184、pASK-IBA3或pET中。质粒使用本领域技术人员已知的方法引入细菌细胞中(转化)。
使用的质粒可以带有选择标记。适合作为选择标记的是编码抗生素(如，例如，氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等)抗性的基因。优选质粒含有其表达介导四环素抗性的基因。此外，适合作为选择标记的是编码所讨论的含质粒细菌菌株中缺失的必需基因的营养缺陷型标记。如果将两个质粒转化到细胞中，则优先使用两种不同的抗生素抗性、一种抗生素抗性和一种营养缺陷型标记或两种不同营养缺陷型标记选择两种质粒的存在。
适合作为启动子的是本领域技术人员已知的所有启动子，如组成型启动子，例如GAPDH启动子，或诱导型启动子，例如lac、tac、trc、λPL、ara、cumate或tet启动子或由其衍生的序列。编码重组蛋白的ORF和编码肽聚糖肽酶的ORF可以作为操纵子受启动子控制，或可以处于不同启动子控制之下。优选的是，控制编码肽聚糖肽酶的开放阅读框表达的功能性启动子是诱导型启动子。
优选的是，编码重组蛋白的ORF和编码肽聚糖肽酶的ORF受不同的诱导型启动子控制。特别优选的是，重组蛋白在tac启动子的控制下表达，而肽聚糖肽酶在ara(阿拉伯糖)启动子的控制下表达。
优选的是，重组蛋白是异源蛋白。异源蛋白应该理解为是指不属于细菌菌株，优选大肠杆菌K12细菌菌株的蛋白组的蛋白，即整个天然蛋白组的蛋白。在使用的细菌菌株中，例如，在大肠杆菌K12菌株中天然存在的所有蛋白，可以源自已知的基因组序列(例如，来自大肠杆菌K12的登录号NC_000913下的Genbank条目)。
特别优选的异源蛋白是含有一个或多个二硫醚键的真核蛋白。特别优选的是真核蛋白，其功能形式以二聚体或多聚体形式存在。
最重要的异源蛋白类别包括抗体及其片段、细胞因子、生长因子、蛋白激酶、蛋白激素、脂质运载蛋白(lipocalins)、抗凝蛋白(anticalins)、酶、结合蛋白和分子支架以及由其衍生的蛋白。所述蛋白类别的实例尤其是重链抗体及其片段(例如，纳米抗体)、单链抗体、干扰素、白介素、白介素受体、白介素受体拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、白血病抑制剂、干细胞生长因子、肿瘤坏死因子、生长激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生因子、神经生长因子、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞系衍生神经营养因子、血管生成抑制剂、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子、胰蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、补体组分、缺氧诱导应激蛋白、原癌生产物、转录因子、病毒组成型蛋白、胰岛素原、尿激酶原、促红细胞生成素、血小板生成素、神经营养因子、蛋白C、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、肾素、溶菌酶、P450、凝乳酶原、脂皮质素、Reptin、血清白蛋白、链激酶、替奈普酶、CNTF和环糊精糖基转移酶。
源自分子支架的蛋白的实例尤其是evibodies(源自CTLA-4)、亲和体(金黄色葡萄球菌的蛋白A)、avimers(人A结构域家族的)、转体(转铁蛋白的)、DARPins(锚蛋白重复蛋白的)、粘附蛋白(纤连蛋白III的)、肽适配体(硫氧还蛋白的)、微体(微蛋白的)、亲和蛋白(泛素的)、α-晶状体蛋白、卡律布德蝎毒素(charybdotoxin)、四连蛋白、RAS结合蛋白AF-6的PDZ结构域、蛋白抑制剂的Kunitz型结构域。
在本发明的上下文中，可以使用的选择标记并未当成是编码重组蛋白的基因。术语选择标记是指作为标记与“所关注的基因”一起引入改性生物体的基因，即实际期望的并编码重组蛋白的基因，以能够识别具有成功的基因改造的各个体。常用的选择标记是抗生素抗性或营养缺陷。标记基因为细胞或生物体提供某些条件下的生存优势，实例是作为细胞的标记基因通过氨苄青霉素抗性基因表达β-内酰胺酶，允许在含氨苄青霉素的培养基中存活。相比之下，重组蛋白是在细菌菌株的辅助下产生，并在一定的培养期后分离。
本发明还提供了一种含有在功能启动子控制下编码信号肽和重组蛋白的开放阅读框的质粒，其特征在于，所述质粒还含有在功能性启动子控制下编码信号肽和肽聚糖肽酶的开放阅读框。
对于根据本发明的细菌菌株提及的优选和特别优选的特征也适用于根据本发明的质粒中提及的特征，其中对于根据本发明的细菌菌株提及的优选和特别优选的实施方式在质粒中也分别是优选或特别优选的。对于存在于细菌菌株中并编码信号肽和肽聚糖肽酶的“额外”ORF提及的以及对于编码重组蛋白的基因提及的所有优选特征也适用于编码信号肽和肽聚糖肽酶的该ORF和编码重组蛋白的基因。
类似的是，上述定义和优选实施方式适用于编码信号肽和肽聚糖肽酶的ORF以及编码信号肽和重组蛋白的ORF。
例如，编码一种或多种信号肽和重组蛋白的一种或多种ORF可以处于一个操纵子中。优选的是，编码信号肽和肽聚糖肽酶的ORF处于单独的基因中。这意味着该肽聚糖肽酶和重组蛋白可以相互独立地表达。在重组蛋白的启动子与肽聚糖肽酶的启动子不同并且可以不同地诱导的特别优选的情况下，质粒具有特殊优势，即在用所述质粒转化细菌时，可以选择相互独立的蛋白表达的最佳时间点。
优选的是，该质粒的特征在于编码肽聚糖肽酶的DNA是选自基因spr和ydhO的组中的基因。上面给出的定义都适用。在该优选实施方式中，肽聚糖肽酶的DNA序列是SEQ IDNo.4和/或6，即该质粒会编码Spr和/或YdhO前体蛋白，即该质粒会编码各自的成熟蛋白和各自的信号肽的氨基酸序列。特别优选的是，该质粒的特征在于肽聚糖肽酶是SEQ IDNo.4。作为替代优选，该质粒的特征在于肽聚糖肽酶是SEQ ID No.6。
优选的是，该质粒的特征在于控制编码信号肽和肽聚糖肽酶的开放阅读框表达的功能启动子是诱导型启动子。
对于诱导型启动子的实例和优选的实施方式，上文陈述的都适用。
使用本领域技术人员已知的方法将根据本发明的质粒引入细菌菌株中以及通过所述质粒表达重组蛋白和肽聚糖肽酶的优点在于，重组蛋白从细菌菌株的细胞中释放得到改进，并且它们可以以增加的产量被分离。
与编码重组蛋白的ORF和肽聚糖肽酶的染色体整合相比，使用质粒的优点在于细菌菌株的质粒携带细胞具有选择优势，并可以通过标准方法选择。
此外，特别有利的是质粒可以以高拷贝数存在于细菌菌株的细胞中。
本发明还提供了一种用于发酵生产重组蛋白方法，其特征在于，将根据本发明的细菌菌株在发酵培养基中培养，发酵后从细胞中去除发酵培养基，并且从发酵培养基中分离出重组蛋白。
通过染色体整合或用一种或两种表达质粒转化的细菌菌株的细胞通过本领域技术人员已知的常规方法培养于摇瓶或生物反应器(发酵罐)中。
作为发酵培养基(生长培养基、培养基)的可能性原则上是本领域技术人员已知的用于细菌培养的所有常用培养基。就此而言，可以使用复合培养基或最低盐培养基，其中添加特定比例的复合组分，例如蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、糖蜜或玉米浆。此外，可以向培养基中添加其他组分，如维生素、盐、氨基酸和微量元素，以改善细胞生长。
发酵优选在常规生物反应器中进行，例如，搅拌罐、鼓泡塔发酵罐或气升发酵罐。特别优选搅拌罐发酵罐。
发酵包括在生长培养基中培养蛋白生产菌株的细胞，同时对各种参数，例如营养物进料、氧分压、培养物pH和温度，进行持续监测和精确控制。培养期优选为24-65小时。
用于发酵的主要碳源原则上可以是细胞可利用的所有糖、糖醇或有机酸或其盐。在这方面中，优选使用葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖或甘油。特别优选的是葡萄糖和阿拉伯糖。多种不同碳源的组合进料也是可能的。同时，在发酵开始时可以将碳源全量加入发酵培养基中，也可以在开始时不加入或仅加入一部分碳源，并随后在发酵过程内加入碳源。在这一点上特别优选的是首先加入一部分碳源并进料一部分的实施方式。特别优选的是，碳源葡萄糖最初以10-30g/L的浓度加入，并且当在发酵过程中浓度下降到小于5g/L时开始进料，并配置为使得该浓度保持于5g/L以下。
如果重组蛋白和/或肽聚糖肽酶的表达受诱导型启动子控制，则通过向发酵批次添加启动子对应的诱导剂而诱导表达。适合作为诱导剂的是，例如，阿拉伯糖、乳糖、IPTG、四环素或cumate。该诱导剂可以在发酵过程中的任何所需时间点以单剂量或多剂量计量加入。可替换地，该诱导剂可以连续添加。优选重组蛋白表达通过添加IPTG诱导，而肽聚糖肽酶表达通过添加阿拉伯糖诱导。特别优选的是，IPTG作为单剂量计量加入。肽聚糖肽酶表达的诱导优选配置为在葡萄糖浓度下降至低于5g/L之后的时间点进料葡萄糖和阿拉伯糖的混合物，或将阿拉伯糖作为单剂量计量加入。
肽聚糖肽酶的表达优选在其中只有少数细胞分裂或不再有细胞分裂的培养阶段中，即恰好在生长曲线的稳定期之前或开始时诱导。该时间点由细胞密度仅表现出少许升高或根本不再表现出升高确定，该细胞密度测定为OD600值或CDW值(见下文)。
优选发酵罐中的培养基在接种前搅拌并用灭菌压缩空气鼓泡；在这点上，氧含量校准为100％饱和度，并选择发酵期间氧饱和度的目标值，其为10％-70％，优选20％-60％，特别优选30％。O2饱和度低于目标值后，调节级联启动，以使O2饱和度回到目标值，可以调节供气和搅拌速度。
培养物的pH值优选为pH 6-pH 8。优选将该pH设置于6.5-7.5；特别优选该培养物pH保持于6.8-7.2。
培养温度优选为15-45℃。优选的是20-40℃的温度范围，特别优选的是25-35℃的温度范围，而非常特别优选的是30℃的温度。
根据本发明，发酵后从细胞中去除发酵培养基，并从该发酵培养基中分离出重组蛋白。这可以通过现有技术中已知的常规方法完成。通常，在第一步中，细胞通过分离方法如离心或过滤从释放到培养基中的重组蛋白中去除。然后，例如，通过超滤，可以浓缩重组蛋白。
肽聚糖肽酶的表达改进了重组蛋白向培养物上清液中的释放。由于释放改进，重组蛋白可以以增加的产量分离出来。
对于术语“增加的产量”，上述定义适用。
借助于肽聚糖肽酶在细菌菌株中，优选在大肠杆菌中的共表达，还可以在细胞外产生Fab抗体片段。在这种情况下，细菌细胞必须同时合成该抗体的轻链(包括结构域VL和CL)和重链(包括结构域VH和CH1)的相应片段，然后将它们分泌到周质中。在细胞质外，该两条链组装形成功能性Fab片段。相应的ORF可以位于不同的基因中。优选的是，编码轻链和重链抗体片段的ORF被组织于操纵子中。由于根据本发明的肽聚糖肽酶同时产生，则该抗体的重链和轻链以增加的浓度释放到发酵培养基中。
该方法具有的主要优点在于，其适用于生产需要长培养时间的重组蛋白，并且适合在>40g/L的高细胞密度下发酵。因此，可以生产作为重组蛋白的复杂真核蛋白。
优选该方法的特征在于，在去除发酵培养基之后从发酵培养基中纯化出重组蛋白。
重组蛋白可以通过标准方法如沉淀或色谱法进一步纯化。本文中特别优选的是如亲和层析法的方法，其利用蛋白的已经正确折叠的天然构象。
优选该方法的特征在于诱导肽聚糖肽酶的表达。这意味着仅诱导肽聚糖肽酶的表达，或者诱导重组蛋白的表达和肽聚糖肽酶的表达。这意味着，在该优选实施方式中，肽聚糖肽酶的表达在任何情况下都处于诱导型启动子的控制之下。相比之下，重组蛋白的表达可以在组成型或诱导型启动子的控制下。优选的是，编码信号肽和重组蛋白的ORF以及编码信号肽和肽聚糖肽酶的ORF在诱导型启动子、特别优选不同的诱导型启动子的控制之下。因此，肽聚糖肽酶的表达和重组蛋白的表达优选是可诱导的。
由于编码重组蛋白和肽聚糖肽酶的基因的启动子可以优选彼此独立地诱导，因此可以彼此独立地选择重组蛋白的表达和肽聚糖肽酶的表达的最佳时间点。
通过使用诱导型启动子，可以在发酵的任何所需时间点诱导相应蛋白的表达。优选在诱导重组蛋白的表达之后诱导肽聚糖肽酶的表达。特别优选在重组蛋白的表达诱导后至少1小时，特别优选至少2小时，进一步特别优选15-40小时，尤其优选20、27或38小时诱导肽聚糖肽酶的表达。
重组蛋白表达和肽聚糖肽酶表达的诱导通过向培养基中添加诱导剂而引发，因此必须选择与使用的基因相符的诱导剂。在肽聚糖肽酶受阿拉伯糖(ara)启动子控制的优选实施方式中，肽聚糖肽酶的表达通过向培养物中添加诱导剂阿拉伯糖进行诱导。在重组基因含有tac启动子的优选实施方式中，重组蛋白的表达通过向培养物中加入诱导剂乳糖或乳糖类似物IPTG进行诱导。
根据本发明，即使在诱导肽聚糖肽酶的表达并进一步培养细胞之后，菌株的细胞密度与不表达额外肽聚糖肽酶的细菌菌株相当。具体地，不会发生由于细胞裂解导致的细胞干重的强烈下降。
本发明具有的优点是重组蛋白被释放到培养基中，而不会发生细菌菌株细胞的强烈裂解。因此，根据本发明的方法的特征在于，既适用于生产具有相应长培养期的复杂真核蛋白，又适用于在＞40g/L的高细胞密度下进行发酵。
长培养时间是指培养时间至少为24小时，优选至少48小时，特别优选至少65小时。
在本发明的上下文中，相对低(或仅略微增加或不强)的细胞裂解是指CDW值、OD600值或活细胞计数值仅略微或绝对没有降低。与不产生额外肽聚糖肽酶的野生型细菌菌株相比，在诱导肽聚糖肽酶表达后优选7-17小时培养期的情况下测定细菌菌株培养物的OD600值或活细胞计数值。表达肽聚糖肽酶的细菌菌株，特别是对于其细胞裂解强烈增加的表达肽聚糖糖苷酶的细菌菌株的培养，具有很大的优势，如Morita et al.(2001参见上文)和专利文件CN 104762285和EP 1 124 941中对于细胞表达T4-噬菌体溶菌酶或ClyN蛋白中所示。
优选该方法的特征在于，在诱导额外肽聚糖肽酶表达后5-24小时，细胞干重与不表达额外肽聚糖肽酶的细菌菌株的发酵方法的细胞培养物在同一时间点的细胞干重相差不超过20％。优选根据本发明的发酵方法的细胞培养物的特征在于，在诱导额外肽聚糖肽酶表达后5-24小时，特别优选7小时或17小时，其具有的细胞干重比来自与根据本发明的方法仅区别在于不包含编码肽聚糖肽酶的ORF的发酵方法的细胞培养物在同一时间点的细胞干重低不超过20％，特别优选不超过15％，特别优选不超过10％。细胞干重用作细胞密度的量度，因此是未裂解细胞的量度。通过过滤或离心，优选离心，分离出所确定量的培养物，然后干燥并称重，测定出细胞干重。
附图说明
图1显示了质粒pCGT-Spr的质粒图。
图2显示了质粒pCGT-YdhO的质粒图。
图3显示了质粒pJF118ut-CD154的质粒图。
图4显示了质粒pJF118ut-CD154-Spr的质粒图。
图5显示了通过SDS-PAGE对培养物上清液进行的分析，如实施例1中描述的。样品指定如下：S：SeeBlue预染蛋白标准品，1：65小时后的W3110/pCGT的上清液，2：65小时后未添加阿拉伯糖的W3110/pCGT-Spr的上清液，3：65小时后添加阿拉伯糖的W3110/pCGT-Spr的上清液。
图中使用的缩写代表编码以下功能的DNA区域：
tac p/o： tac启动子/操纵子
pBAD p/o： 阿拉伯糖启动子/操纵子
bla： β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)
TcR： 四环素抗性
lacIq： tac启动子的阻遏子
cgt-SP： CGT酶的信号肽
CGT酶： 环糊精糖基转移酶
ColE1： 复制起点
phoA-SP： phoA信号肽
AFA-SP： CGT酶信号肽的衍生物
rrnB终止子： rrnB基因的终止子区域
trpA终止子： trpA基因的终止子区域
Spr： Spr肽聚糖肽酶
Spr-SP： Spr的信号肽
YdhO： YdhO肽聚糖肽酶
HisTag： 组氨酸标记
轻链： 包含域VL和CL的抗体片段
重链： 包含域VH和CH1的抗体片段
BamHI/MauBI/EcoRI：相应限制性内切酶的限制性位点
具体实施方式
实施例
下面参考示例性实施方式更详细地描述本发明，但本发明并不限于此。
所使用的所有分子生物学方法，如聚合酶链反应(PCR)、基因合成、DNA分离和纯化、限制性内切酶和连接酶的DNA修饰、转化等，均以本领域技术人员已知的、文献中描述的或由各自厂商推荐的方式进行。
质粒的描述：
pCGT：
质粒pCGT的生产描述于US 2008/0254511 A1的实施例4中，而质粒图详细说明于US 2008/0254511 A1的图4中。
本质上，该质粒不仅包含四环素抗性基因，还包含来自肺炎克雷伯菌M5a1的环糊精糖基转移酶(CGT酶)的结构基因，包括天然CGT酶信号序列。CGT酶基因的表达受tac启动子的控制。
pCGT-Spr：
为了获得pCGT-Spr(质粒图参见图1)，通过Eurofins Genomics的基因合成法产生DNA片段。DNA片段xI(指定于SEQ ID No.1中)包含：
-来自基因库(GenBank)条目X81837.1的核苷酸1136-1304，包含阿拉伯糖启动子(pBAD启动子)以及操纵子O1和I2+I1和CAP结合位点(SEQ ID No.1的核苷酸10-178)，
-Shine-Dalgarno序列(SEQ ID No.1的核苷酸203-208)和
-编码以下的融合体的核苷酸片段
i大肠杆菌K12的Spr蛋白(SEQ ID No.1的核苷酸216-782)和
ii大肠杆菌trpA基因的终止子(SEQ ID No.1的核苷酸812-837)。
使用限制酶MauBI切割所述DNA片段xI并与使用相同限制酶切割的表达载体pCGT连接。克隆是以无引导的方式完成；然而完成工作所用的质粒中的DNA片段以与编码CGT酶的基因相同的阅读方向插入，通过限制酶BamHI的限制模式和测序进行验证。质粒称为pCGT-Spr并编码Spr蛋白。
pCGT-YdhO：
为了获得pCGT-YdhO(质粒图参见图2)，通过Eurofins Genomics的基因合成法产生DNA片段。DNA片段xII(指定于SEQ ID No.2中)包含：
-基因库(GenBank)条目X81837.1的核苷酸1136-1304，包含阿拉伯糖启动子(pBAD启动子)以及操纵子O1和I2+I1和CAP结合位点(SEQ ID No.2的核苷酸10-178)，
-Shine-Dalgarno序列(SEQ ID No.2的核苷酸203-208)和
-编码以下融合体的核苷酸片段
i大肠杆菌K12的YdhO蛋白(SEQ ID No.2的核苷酸216-1028)和
ii大肠杆菌trpA基因的终止子(SEQ ID No.2的核苷酸1064-1089)。
DNA片段xII使用限制酶MauBI切割并与使用相同限制酶切割的表达载体pCGT连接。该克隆以无引导的方式完成；然而完成工作所使用的质粒中的DNA片段以与编码CGT酶的基因相同的阅读方向插入，通过限制酶BamHI的限制模式并测序进行验证。质粒称为pCGT-YdhO，并编码YdhO蛋白。
pJF118ut-CD154：
以US 2008/076157 A中描述的质粒pJF118ut作为起始载体用于克隆并表达人源化单克隆抗CD154抗体5c8的Fab片段的基因，其序列发表于Karpusas et al.2001(Structure 9,pages 321–329)中。pJF118ut是已知的表达载体pKK223-3(AmershamPharmacia Biotech)的衍生物，并保藏于DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ-German Collection of Microorganisms)(Braunschweig)，编号为DSM 18596。
为了获得pJF118ut-CD154(质粒图参见图3)，通过Eurofins Genomics的基因合成法产生DNA片段。DNA片段xIII(指定于SEQ ID No.3中)包含由以下组成的融合体：
i公开于US 2008/076157中在SEQ ID No.2下并源自肺炎克雷伯菌M5a1的CGT酶的信号序列(SEQ ID No.3的核苷酸25-114)的信号序列，和
ii人源化单克隆抗-CD154抗体5c8的Fab片段重链(VH-CH1结构域)的阅读框，编码Karpusas等人2001年图3中的发表的序列的氨基酸1-221(SEQ ID No.3的核苷酸115-777)，
iii phoA信号序列(SEQ ID No.3的核苷酸800-862)，
iv人源化单克隆抗CD154抗体5c8的Fab片段轻链(VL-CL结构域)的阅读框，如Karpusas et al.2001年图3中发表的(SEQ ID No.3的核苷酸863-1516)，和
v SEQ ID No.3的核苷酸1517-1546，编码4个氨基酸长度的连接子和六组氨酸标记。
使用限制酶EcoRI和PdmI切割DNA片段xIII，并与已使用EcoRI和SmaI切割的表达载体pJF118ut连接。得到的质粒命名为pJF118ut-CD154，其中Fab片段的重链和轻链基因的表达受tac启动子的控制。
pJF118ut-CD154-Spr：
在阿拉伯糖启动子的控制下编码Spr并且侧接trpA终止子的DNA片段xI，如上文对pCGT-Spr，通过MauBI限制性位点插入质粒pJF118ut-CD154中。该克隆以无指导方式完成；然而，工作完成所采用的质粒中的DNA片段xI以与编码CD154的DNA片段xIII相反的读取方向插入，通过限制酶BamHI的限制模式并测序进行验证。质粒称为pJF118ut-CD154-Spr(质粒图参见图4)。
实施例1：在搅拌的发酵罐中发酵生产环糊精糖基转移酶(CGT酶)
为了由肺炎克雷伯菌M5a1生产环糊精糖基转移酶(CGT酶)，将大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27325)通过常用方法(例如，TSS转化)采用质粒pCGT、pCGT-Spr和pCGT-YdhO转化。通过四环素(20mg/L)选择含质粒细胞。该大肠杆菌菌株被命名为W3110/pCGT、W3110/pCGT-Spr和W3110/pCGT-YdhO。
a)CGT酶生产在搅拌的发酵罐中进行。
发酵罐中装有1.2升发酵培养基(1.5g/L KH2PO4；5g/L(NH4)2SO4；0.5g/L MgSO4·7H2O；0.225g/L CaCl2·2H2O，0.075g/L FeSO4·7H2O；1g/L柠檬酸三钠·2H2O；0.5g/LNaCl；1mL/L微量元素溶液(0.15g/LNa2MoO4·2H2O；2.5g/L Na3BO3；0.7g/L CoCl2·6H2O；0.25g/LCuSO4·5H2O；1.6g/L MnCl2·4H2O；0.3g/L ZnSO4·7H2O)；5mg/L维生素B1；3g/L植物蛋白胨(BD 211906)；1.5g/L酵母提取物(Oxoid LP0021)；10g/L葡萄糖；20mg/L四环素)用已经在LB培养基(5g/L酵母提取物(Oxoid LP0021)、10g/L胰蛋白胨(Oxoid LP0042)、5g/L NaCl)中培养过的另外含有1ml/L微量元素溶液(0.15g/L Na2MoO4·2H2O；2.5g/LNa3BO3；0.7g/L CoCl2·6H2O；0.25g/L CuSO4·5H2O；1.6g/L MnCl2·4H2O；0.3g/L ZnSO4·7H2O)、3g/L葡萄糖、0.55g/L CaCl2和20mg/L四环素的W3110/pCGT或W3110/pCGT-Spr的初级培养物在摇瓶中接种7小时至0.1OD600。发酵由此开始(时间点0，发酵开始)。在发酵期间，将温度设定为30℃，并通过计量加入NH4OH或H3PO4将pH值保持于7.0的恒定值。在发酵过程中计量加入葡萄糖，争取达到<5g/L的葡萄糖浓度。CGT酶的表达通过在21小时后(在对数生长期结束时)添加异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至0.15mM而诱导。对于Spr的生产，使用阿拉伯糖启动子的基础表达，这会导致在发酵过程中形成少量的Spr蛋白。阿拉伯糖启动子即使在不存在诱导剂的情况下也允许靶蛋白的低量生产的事实已经描述于现有技术中(Malachowska and Olszewski,Microb Cell Fact(2018)17:40)。
在接种之前，发酵罐中的培养基以400rpm搅拌，并用1.67vvm(空气体积/培养基体积/分钟)经由无菌过滤器灭菌的压缩空气进行鼓泡。在这些起始条件下，在接种前将光学氧传感器(VisiFerm DO225，Hamilton)校准到100％饱和度。发酵期间的O2饱和度目标值设置为该值的30％。在发酵期间通过氧传感器测量O2饱和度，并由发酵罐控制DCU(数字控制单元，Sartorius Stedim)采集。在O2饱和度低于目标值后，在软件控制下不断增大搅拌速度至最大1500rpm，以使O2饱和度回到目标值。
发酵65小时后，收集样品，通过离心从发酵培养基中去除细胞，发酵上清液中的CGT酶含量通过以下酶分析测定法测定：
测试缓冲液：5mM Tris HCl缓冲液，5mM CaCl2·2H2O，pH 6.5
底物溶液：测定缓冲液中的10％淀粉溶液(Merck编号1.01252)，pH 6.5
测试混合物：0.2mL底物溶液+0.2mL离心(5分钟，12000rpm)的培养上清液
反应温度：40℃
酶测试：
*预先调整底物溶液和离心的培养上清液的温度(40℃，约5分钟)
*通过快速混合(涡旋混合器)底物溶液和离心的培养上清液制备测试混合物，必要时用测试缓冲液稀释离心的培养上清液，以便在随后的HPLC分析中确定0.9-1.5g/L CD的值；
*在40℃下培养3分钟
*通过加入0.6mL甲醇并快速混合(涡旋混合器)而停止酶反应
*在冰上冷却混合物(约5分钟)
*离心(5分钟，12 000rpm)并移去澄清上清液
*通过HPLC分析产生的CD量：在配备Nucleodur 100-3NH2-RP柱(150mm×4.6mm，Macherey-Nagel)和64％乙腈水溶液作为流动相的Agilent HP 1100HPLC系统上以2.1mL/min的流速进行分析。通过RI检测器(1260Infinity RI，Agilent)完成检测，并根据峰面积和α-CD标准物(Cavamax W6-8 Pharma，Wacker Chemie AG)进行定量。
酶活性计算：A＝G*V1*V2/(t*MG)[U/mL]
A＝活性，
G＝CD含量，以mg/L计
V1＝测试混合物中的稀释因子
V2＝用于测试前的培养上清液的稀释系数；如果未稀释，则：V2＝1
t＝反应时间，以min计
MG＝以g/mol为单位的分子量(MGCD＝973g/mol)
表1显示了分别达到的环糊精糖基转移酶产量。
表1：培养65小时后发酵上清液中的CGT酶产量
| 菌株 | CGT酶(U/mL) |
| W3110/pCGT | 31 |
| W3110/pCGT-Spr | 295 |
为了检查通过Spr生产而释放CGT酶是否可以归因于细胞裂解增加，在发酵结束时测定培养物的细胞干重和活细胞计数(LCC)。为确定活细胞计数，培养物样品用LB培养基稀释108倍，终体积为1mL，且每种情况下将100μL稀释液涂覆于含有20mg/L四环素的LB琼脂平板上。对生长的菌落进行计数，并考虑稀释因子，W3110/pCGT的起始培养物活细胞计数为50×109，而W3110/pCGT-Spr为39×109。为了测定细胞干重，将含有1mL发酵罐培养物的样品转移到反应容器中，其空重已预先测定。离心(5分钟，12000rpm)后，去除上清液，而细胞颗粒在培养箱中干燥(60℃，≥48小时)。此后，称出装有干燥细胞颗粒的容器，并根据含有干细胞颗粒的容器的重量与空容器的重量之间的差计算出细胞干重(CDW)。W3110/pCGT的细胞干重为45g/L，W3110/pCGT-Spr的细胞干重为55g/L。
强细胞裂解会导致宿主细胞蛋白的释放。这通过SDS-PAGE分析培养物上清液的蛋白含量而排除(图5，样品1和2)。发酵65小时后，收集样品并通过离心将细胞从发酵培养基中除去。无细胞上清液用水1:10稀释，其中的4μL与4μL含有1mL/L NuPAGE抗氧化剂(Invitrogen、Carlsbad、USA、商品号NP0005)和5％二硫赤藓糖醇并在加热块中99℃下煮沸5分钟的2×Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，USA，商品号LC2676)混合。将样品以10000rpm离心20s，并在每种情况下将2μL上样于12％NuPAGE Bis-Tris Gel(1.0mm×15孔，Invitrogen，Carlsbad，USA，商品号NP0343)上，而蛋白通过在1×MOPS缓冲液(NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(20×)，Invitrogen，Carlsbad，USA，商品号NP0001；用水稀释至1×)中在95V下电泳3小时进行解析。上样的标准品是See Blue Prestained(Invitrogen，Carlsbad，USA；商品号100006636)。蛋白用Instant Blue(用于蛋白凝胶的考马斯(Coomassie)类染色溶液，Expedeon Ltd.，Cambridge，UK，商品号ISB1L)在室温下染色1小时，并随后在室温下水中脱色过夜。除了CGT酶蛋白的色带外，凝胶中只能识别出其他蛋白的轻微污染。具体而言，没有观察到过生产的Spr蛋白(18kDa)的增量释放。
b)
此外，如上描述的，采用菌株W3110/pCGT-Spr和W3110/pCGT-YdhO进行CGT酶生产。在发酵开始48小时后，通过将纯葡萄糖进料转为3g/L*h的10:1葡萄糖/阿拉伯糖比率的葡萄糖/阿拉伯糖混合物恒定进料，诱导YdhO生产。在发酵开始后59小时，通过向培养物中单次添加阿拉伯糖诱导Spr生产，从而达到1g/L的最终浓度。发酵开始后65小时进行收获。
表2显示了由此获得的CGT酶产量。
表2：培养65小时后发酵上清液中的CGT酶产量。
| 菌株 | CGT酶(U/mL) |
| W3110/pCGT-Spr | 1130 |
| W3110/pCGT-YdhO | 1187 |
如上描述的，在培养65小时后测定细胞干重。获得W3110/pCGT-Spr的50g/L值和W3110/pCGT-YdhO的41g/L值。
W3110/pCGT-Spr培养上清液通过SDS-PAGE进行分析，并且表明，除了CGT酶的释放外，没有明显的大肠杆菌内源蛋白释放(图5，样品3)。
实施例2：Fab抗体片段的发酵生产
为了生产CD154 Fab片段，将大肠杆菌细菌菌株W3110通过常用方法(例如，TSS转化)用质粒pJF118ut-CD154和pJF118ut-CD154-Spr进行转化。通过四环素(20mg/L)选择含质粒细胞。大肠杆菌菌株被命名为W3110/pJF118ut-CD154和W3110/pJF118ut-CD154-Spr。该大肠杆菌菌株在搅拌罐发酵罐中发酵，如实施例1中对大肠杆菌pCGT菌株的发酵。相对于实施例1，CD154 Fab生产在发酵开始26小时后通过0.15mM IPTG进行诱导，而Spr通过在41小时后将纯葡萄糖进料转换为3g/L·h的2:1葡萄糖/阿拉伯糖比率的葡萄糖-阿拉伯糖混合物恒定进料而诱导生产。
48小时后，收集样品，通过离心从培养基中去除细胞，并分析上清液而确定释放到培养基中的CD154 Fab片段。
CD154 Fab片段通过本领域技术人员已知的夹心ELISA分析测试法进行定量。这涉及使用固定化抗人IgG(Fd)抗体(结合位点，产品编号PC075)作为捕获剂和使用过氧化物酶偶联山羊抗人κ轻链抗体(Sigma，产品编号A 7164)作为检测抗体。通过由过氧化物酶对生色底物Dako TMB+(Dako#S1599)的转化以及450nm的相关吸收变化而完成定量。ELISA使用Fab片段“人Fab/κ”(Bethyl Laboratories，产品编号：P80-115)进行校准。
表3：48小时后培养上清液中CD154抗体片段的产量。
| 菌株 | 上清液中的CD154抗体片段(mg/L) |
| W3110/pJF118ut-CD154 | 5 |
| W3110/pJF118ut-CD154-Spr | 1045 |
为了检查Spr的表达对细胞生长的影响，在48小时后发酵结束时如实施例1中进行培养物细胞干重测定。结果汇总于表4中。
表4：48小时后发酵罐中产CD154的菌株的细胞干重(CDW)。
| 菌株 | CDW(g/L) |
| W3110/pJF118ut-CD154 | 48 |
| W3110/pJF118ut-CD154-Spr | 43 |
。
序列表
<110> 瓦克化学股份公司
约翰娜·科赫
玛丽安·库若
<120> 用于在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株
<130> Co11816
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xI
<220>
<221> 杂项特征
<222> (1)..(879)
<400> 1
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatggt caaatctcaa ccgattttga 240
gatatatctt gcgcgggatt cccgcgattg cagtagcggt tctgctttct gcatgtagtg 300
caaataacac cgcaaagaat atgcatcctg agacacgtgc agtgggtagt gaaacatcat 360
cactgcaagc ttctcaggat gaatttgaaa acctggttcg taatgtcgac gtaaaatcgc 420
gaattatgga tcagtatgct gactggaaag gcgtacgtta tcgtctgggc ggcagcacta 480
aaaaaggtat cgattgttct ggtttcgtac agcgtacatt ccgtgagcaa tttggcttag 540
aacttccgcg ttcgacttac gaacagcagg aaatgggtaa atctgtttcc cgcagtaatt 600
tgcgtacggg tgatttagtt ctgttccgtg ccggttcaac gggacgccat gtcggtattt 660
atatcggcaa caatcagttt gtccatgctt ccaccagcag tggtgttatt atttccagca 720
tgaatgaacc gtactggaag aagcgttaca acgaagcacg ccgggttctc agccgcagct 780
aagaattgca agctggccga cgcgtcccac agccgccagt tccgctggcg gcattttaac 840
tttctttaat gaagccggaa aaatcccgcg cgcgaaggc 879
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xII
<220>
<221> 杂项特征
<222> (1)..(1131)
<400> 2
caattcgcgc gcgtaacaaa agtgtctata atcacggcag aaaagtccac attgattatt 60
tgcacggcgt cacactttgc tatgccatag catttttatc cataagatta gcggatccta 120
cctgacgctt tttatcgcaa ctctctactg tttctccata cccgtttttt tgggctagaa 180
ataattttgt ttaagaattc taaggaggaa attatatggc gcggataaac cgtatttcga 240
tcacgctctg tgctttactt tttaccaccc tgcctttaac gcctatggcc catgcttcaa 300
agcaagccag ggagagttct gctaccactc atatcaccaa aaaagcagat aaaaagaaaa 360
gcacggcaac caccaaaaag acccagaaaa cagcgaaaaa agccgccagt aaaagtacga 420
ccaaaagcaa aaccgcttct tccgttaaaa aatcttccat taccgcttct aaaaacgcca 480
aaactcgcag caaacacgcc gtcaataaaa cggcctcagc cagctttacc gaaaagtgta 540
ccaaacgtaa gggctataaa tcgcattgtg tgaaagtcaa aaatgccgcg tcaggaactc 600
ttgccgacgc gcacaaagcg aaggtgcaaa aagctacgaa agtggcaatg aataaactga 660
tgcagcaaat tggtaagcca tatcgttggg gtggcagctc accgcgtacc ggttttgatt 720
gcagcggcct ggtttattac gcttataaag atttggtgaa aattcgtatt ccgcgtacgg 780
cgaatgaaat gtatcacctg cgtgatgcag cgccaatcga acgtagtgaa ctgaaaaacg 840
gcgacctggt ctttttccgt actcagggac gcggcacagc cgatcatgtc ggcgtgtatg 900
tcggcaacgg caaatttatt cagtcaccgc gcacaggtca ggaaattcaa atcacttctc 960
tcagtgaaga ctactggcag cgccactatg ttggcgctcg tcgggtaatg accccaaaaa 1020
cacttcgcta agaattgcaa gctggccgac gcgctctccc acagccgcca gttccgctgg 1080
cggcatttta actttcttta atgaagccgg aaaaatcccg cgcgcgaagg c 1131
<210> 3
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNS-片段 xIII
<220>
<221> 杂项特征
<222> (1)..(1599)
<400> 3
acagaattct aaggaggaaa ttatatgaaa agaaaccgtt tttttaatac ctcggctgct 60
attgccattt cgattgcatt acagatcttt tttccgtccg cttccgcttt cgctcaggtt 120
cagctggtgc agagcggtgc cgaagttgtt aaaccgggtg caagcgttaa actgagctgt 180
aaagcaagcg gctatatttt taccagctat tatatgtatt gggtgaaaca ggcaccgggt 240
cagggtctgg aatggattgg tgaaattaat ccgagcaatg gcgataccaa ttttaatgaa 300
aaatttaaaa gcaaagccac cctgaccgtt gataaaagcg caagcaccgc atatatggaa 360
ctgagcagcc tgcgtagcga agataccgca gtttattatt gtacccgtag tgatggtcgc 420
aatgatatgg atagctgggg tcagggcacc ctggtcaccg ttagcagcgc aagcaccaaa 480
ggtccgagcg tttttccgct ggcaccgagc agcaaaagca ccagcggtgg caccgcagca 540
ctgggttgtc tggttaaaga ttattttccg gaaccggtta cagttagctg gaatagcggt 600
gcactgacca gtggtgttca tacctttccg gcagttctgc aaagcagcgg tctgtatagc 660
ctgagcagcg ttgttaccgt tccgagcagt agcctgggca cccagaccta tatttgtaat 720
gttaatcata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag ttgaaccgaa aagctgctaa 780
taaccatgga gaaaataaag tgaaacaaag cactattgca ctggcactct taccgttact 840
cttcacccct gttaccaaag ccgatattgt gctcacccag agtccggcaa ccctgagcgt 900
tagtccgggt gaacgtgcaa ccattagctg tcgtgcaagc cagcgtgtta gcagcagcac 960
ctatagctat atgcattggt atcagcagaa accgggtcag cctccgaaac tgctgattaa 1020
atatgcaagc aatctggaaa gcggtgttcc ggcacgtttt agcggtagcg gtagtggcac 1080
cgattttacc ctgaccatta gcagcgttga accggaagat tttgccacct attattgtca 1140
gcatagctgg gaaattcctc cgacctttgg tggtggcacc aaactcgaga ttaaacgtac 1200
cgttgcagca ccgagcgtgt ttatctttcc gcctagtgat gaacagctga aaagcggcac 1260
cgcaagcgtt gtttgtctgc tgaataactt ttatccgcgt gaagcaaaag ttcagtggaa 1320
agttgataat gcactgcaaa gcggtaatag ccaagaaagc gttaccgaac aggatagcaa 1380
agatagcacc tatagcctgt caagcaccct gaccctgagc aaagcagatt atgaaaaaca 1440
caaagtgtat gcctgcgaag ttacccatca gggtctgagc agtccggtta caaaaagttt 1500
taatcgtggt gaatgtagct cttctgccca tcaccaccat caccattaat aagcttctag 1560
aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcgac 1599
<210> 4
<211> 564
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 杂项特征
<222> (1)..(564)
<223> Spr前体蛋白的编码
<400> 4
atggtcaaat ctcaaccgat tttgagatat atcttgcgcg ggattcccgc gattgcagta 60
gcggttctgc tttctgcatg tagtgcaaat aacaccgcaa agaatatgca tcctgagaca 120
cgtgcagtgg gtagtgaaac atcatcactg caagcttctc aggatgaatt tgaaaacctg 180
gttcgtaatg tcgacgtaaa atcgcgaatt atggatcagt atgctgactg gaaaggcgta 240
cgttatcgtc tgggcggcag cactaaaaaa ggtatcgatt gttctggttt cgtacagcgt 300
acattccgtg agcaatttgg cttagaactt ccgcgttcga cttacgaaca gcaggaaatg 360
ggtaaatctg tttcccgcag taatttgcgt acgggtgatt tagttctgtt ccgtgccggt 420
tcaacgggac gccatgtcgg tatttatatc ggcaacaatc agtttgtcca tgcttccacc 480
agcagtggtg ttattatttc cagcatgaat gaaccgtact ggaagaagcg ttacaacgaa 540
gcacgccggg ttctcagccg cagc 564
<210> 5
<211> 188
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(188)
<223> Spr前体蛋白的氨基酸序列
<400> 5
Met Val Lys Ser Gln Pro Ile Leu Arg Tyr Ile Leu Arg Gly Ile Pro
1 5 10 15
Ala Ile Ala Val Ala Val Leu Leu Ser Ala Cys Ser Ala Asn Asn Thr
20 25 30
Ala Lys Asn Met His Pro Glu Thr Arg Ala Val Gly Ser Glu Thr Ser
35 40 45
Ser Leu Gln Ala Ser Gln Asp Glu Phe Glu Asn Leu Val Arg Asn Val
50 55 60
Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Asp Gln Tyr Ala Asp Trp Lys Gly Val
65 70 75 80
Arg Tyr Arg Leu Gly Gly Ser Thr Lys Lys Gly Ile Asp Cys Ser Gly
85 90 95
Phe Val Gln Arg Thr Phe Arg Glu Gln Phe Gly Leu Glu Leu Pro Arg
100 105 110
Ser Thr Tyr Glu Gln Gln Glu Met Gly Lys Ser Val Ser Arg Ser Asn
115 120 125
Leu Arg Thr Gly Asp Leu Val Leu Phe Arg Ala Gly Ser Thr Gly Arg
130 135 140
His Val Gly Ile Tyr Ile Gly Asn Asn Gln Phe Val His Ala Ser Thr
145 150 155 160
Ser Ser Gly Val Ile Ile Ser Ser Met Asn Glu Pro Tyr Trp Lys Lys
165 170 175
Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser Arg Ser
180 185
<210> 6
<211> 813
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 杂项特征
<222> (1)..(813)
<223> 编码Ydho前体蛋白的DNA
<400> 6
atggcgcgga taaaccgtat ttcgatcacg ctctgtgctt tactttttac caccctgcct 60
ttaacgccta tggcccatgc ttcaaagcaa gccagggaga gttctgctac cactcatatc 120
accaaaaaag cagataaaaa gaaaagcacg gcaaccacca aaaagaccca gaaaacagcg 180
aaaaaagccg ccagtaaaag tacgaccaaa agcaaaaccg cttcttccgt taaaaaatct 240
tccattaccg cttctaaaaa cgccaaaact cgcagcaaac acgccgtcaa taaaacggcc 300
tcagccagct ttaccgaaaa gtgtaccaaa cgtaagggct ataaatcgca ttgtgtgaaa 360
gtcaaaaatg ccgcgtcagg aactcttgcc gacgcgcaca aagcgaaggt gcaaaaagct 420
acgaaagtgg caatgaataa actgatgcag caaattggta agccatatcg ttggggtggc 480
agctcaccgc gtaccggttt tgattgcagc ggcctggttt attacgctta taaagatttg 540
gtgaaaattc gtattccgcg tacggcgaat gaaatgtatc acctgcgtga tgcagcgcca 600
atcgaacgta gtgaactgaa aaacggcgac ctggtctttt tccgtactca gggacgcggc 660
acagccgatc atgtcggcgt gtatgtcggc aacggcaaat ttattcagtc accgcgcaca 720
ggtcaggaaa ttcaaatcac ttctctcagt gaagactact ggcagcgcca ctatgttggc 780
gctcgtcggg taatgacccc aaaaacactt cgc 813
<210> 7
<211> 271
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(271)
<223> Ydho前体蛋白的氨基酸序列
<400> 7
Met Ala Arg Ile Asn Arg Ile Ser Ile Thr Leu Cys Ala Leu Leu Phe
1 5 10 15
Thr Thr Leu Pro Leu Thr Pro Met Ala His Ala Ser Lys Gln Ala Arg
20 25 30
Glu Ser Ser Ala Thr Thr His Ile Thr Lys Lys Ala Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Ser Thr Ala Thr Thr Lys Lys Thr Gln Lys Thr Ala Lys Lys Ala Ala
50 55 60
Ser Lys Ser Thr Thr Lys Ser Lys Thr Ala Ser Ser Val Lys Lys Ser
65 70 75 80
Ser Ile Thr Ala Ser Lys Asn Ala Lys Thr Arg Ser Lys His Ala Val
85 90 95
Asn Lys Thr Ala Ser Ala Ser Phe Thr Glu Lys Cys Thr Lys Arg Lys
100 105 110
Gly Tyr Lys Ser His Cys Val Lys Val Lys Asn Ala Ala Ser Gly Thr
115 120 125
Leu Ala Asp Ala His Lys Ala Lys Val Gln Lys Ala Thr Lys Val Ala
130 135 140
Met Asn Lys Leu Met Gln Gln Ile Gly Lys Pro Tyr Arg Trp Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ser Pro Arg Thr Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu Val Tyr Tyr Ala
165 170 175
Tyr Lys Asp Leu Val Lys Ile Arg Ile Pro Arg Thr Ala Asn Glu Met
180 185 190
Tyr His Leu Arg Asp Ala Ala Pro Ile Glu Arg Ser Glu Leu Lys Asn
195 200 205
Gly Asp Leu Val Phe Phe Arg Thr Gln Gly Arg Gly Thr Ala Asp His
210 215 220
Val Gly Val Tyr Val Gly Asn Gly Lys Phe Ile Gln Ser Pro Arg Thr
225 230 235 240
Gly Gln Glu Ile Gln Ile Thr Ser Leu Ser Glu Asp Tyr Trp Gln Arg
245 250 255
His Tyr Val Gly Ala Arg Arg Val Met Thr Pro Lys Thr Leu Arg
260 265 270
Claims (15)
1.一种细菌菌株，包含在功能启动子控制下编码信号肽和重组蛋白的开放阅读框，
其特征在于，所述细菌菌株包含在功能启动子控制下编码信号肽和肽聚糖肽酶的另外的开放阅读框。
2.根据权利要求1所述的细菌菌株，其特征在于，所述细菌菌株是革兰氏阴性细菌。
3.根据权利要求1和2中一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于，所述细菌菌株是大肠杆菌(Escherichia coli)种的菌株。
4.根据权利要求1至3中一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于，所述肽聚糖肽酶是(i)Spr、(ii)YdhO或(iii)Spr和YdhO。
5.根据权利要求1至4中一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于，Spr是由SEQ IDNo.5中的氨基酸27-188所指定的序列。
6.根据权利要求1至4中一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于，YdhO是由SEQ IDNo.7中的氨基酸28-271所指定的序列。
7.根据权利要求1至6中一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于，控制编码所述肽聚糖肽酶的所述开放阅读框表达的所述功能启动子是诱导型启动子。
8.根据权利要求1至7中一项或多项所述的细菌菌株，其特征在于，所述重组蛋白是异源蛋白。
9.一种质粒，包含
-在功能启动子控制下编码信号肽和重组蛋白的开放阅读框，
其特征在于，所述质粒另外
-包含在功能启动子控制下编码信号肽和肽聚糖肽酶的开放阅读框。
10.根据权利要求9所述的质粒，其特征在于，编码所述肽聚糖肽酶的DNA是选自基因spr和ydhO的组中的基因。
11.根据权利要求9和10中一项或多项所述的质粒，其特征在于，控制编码所述肽聚糖肽酶的所述开放阅读框表达的所述功能启动子是诱导型启动子。
12.一种用于发酵生产重组蛋白的方法，其特征在于，将权利要求1至8中任一项所述的细菌菌株在发酵培养基中培养，在发酵后从细胞中去除所述发酵培养基，并从所述发酵培养基分离出重组蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述肽聚糖肽酶的表达是诱导的。
14.根据权利要求12和13中一项或多项所述的方法，其特征在于，在诱导所述重组蛋白的表达之后诱导所述肽聚糖肽酶的表达。
15.根据权利要求12至14中一项或多项所述的方法，其特征在于，在诱导另外的肽聚糖肽酶表达后5至24小时，去除所述发酵培养基后的细胞干重与并未表达另外的肽聚糖肽酶的细菌菌株的发酵方法在同一时间点的细胞培养物的细胞干重相差不大于20％。
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|---|---|---|---|
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