CN105463625A

CN105463625A - 一种由细菌细胞制得的细菌纤维材料及其应用

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Publication number: CN105463625A
Application number: CN201410437185.2A
Authority: CN
Inventors: 陈国强; 王颖; 赵亮; 谭丹; 吴弘; 张星辰; 蒋笑然
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN105463625B

Abstract

本发明涉及材料领域，具体涉及一种改变细菌形态而获得的细菌纤维，还涉及一种通过遗传分子操作而产生细菌纤维的重组细菌细胞，本发明还进一步涉及应用细菌纤维进行纺纱的方法及获得的纺织物。本发明所提供的细菌纤维与现有的天然纤维相比，具有生产周期短、劳动成本和生产成本低的优点；与人工纤维相比，细菌纤维具有天然纤维的环保、可降解等优点；此外，细菌纤维为超细纤维，作为纺织材料具有1)光泽柔和、柔软；2)超高密、质轻；3)防水透湿性好、具有良好的排汗、导湿作用；4)保暖性、耐磨性好；5)具有高清洁能力和去污能力等优点。

Description

一种由细菌细胞制得的细菌纤维材料及其应用

技术领域

本发明涉及纺织领域，具体涉及一种由细菌细胞制得的细菌纤维材料及其应用。

背景技术

纤维是天然或人工合成的细丝状物质。除了作为纺织材料应用于纺织工业外，纤维还可以在医药、建筑、工业等领域发挥作用，例如用甲壳素纤维制备医用纺织品、应用纤维技术和混凝土技术结合制备提高土建工程质量的钢纤维。

根据来源不同，纤维通常分为天然纤维和人工纤维。天然纤维是自然界存在的，可以直接取得纤维，根据其来源分成植物纤维、动物纤维和矿物纤维三类。植物纤维是由植物的种籽、果实、茎、叶等处得到的纤维，包括如棉、木棉、亚麻、苎麻、黄麻、竹纤维等。动物纤维是由动物的毛或昆虫的腺分泌物中得到的纤维。从动物毛发得到的纤维有羊毛、兔毛、骆驼毛、山羊毛、牦牛绒等；从动物腺分泌物得到的纤维有蚕丝等。矿物纤维是从纤维状结构的矿物岩石中获得的纤维，主要组成物质为各种氧化物，其主要来源为各类石棉，如温石棉，青石棉等。天然纤维作为存在时间最长的纤维，在日常生活和工业生产中均有广泛的应用,但由于其原料主要来源于动植物,生产周期长,并受自然条件的限制,生产成本较高，难以满足日益增长的生活、生产需要。

人工纤维是经过化学处理加工而制成的纤维。可分为人造纤维、合成纤维和无机纤维。人造纤维是用含有天然纤维或蛋白纤维的物质，如木材、甘蔗、芦苇、大豆蛋白质纤维等及其他失去纺织加工价值的纤维原料，经过化学加工后制成的纺织纤维，主要用于纺织的人造纤维有：黏胶纤维、醋酸纤维、铜氨纤维。合成纤维是从一些本身并不含有纤维素或蛋白质的物质如石油、煤、天然气、石灰石或农副产品，先合成单位，再用化学合成与机械加工的方法制成纤维，如聚酯纤维(涤纶)、聚酰胺纤维(锦纶或尼龙)、聚乙烯醇纤维(维纶)、聚丙烯腈纤维(腈纶)、聚丙烯纤维(丙纶)、聚氯乙烯纤维(氯纶)等。无机纤维是以天然无机物或含碳高聚物纤维为原料，经人工抽丝或直接碳化制成，包括玻璃纤维、金属纤维和碳纤维。与天然纤维相比，人工纤维生产成本低、产量高，但人工纤维也存在着对石油等不可再生资源依赖性较强、生产过程会造成环境污染，以及不可降解等问题。

作为自然界存在最多的一种原核生物，细菌在人类的生产和生活中已经得到了广泛的应用，例如应用细菌制造食物、应用细菌制造抗生素、应用细菌进行废水处理，但现在尚无将细菌本身作为纤维应用于纺织业或其他工业的先例。

发明内容

有鉴于此，本发明目的为针对现有天然纤维和人工纤维的缺点，提供一种生产周期短、成本低的纤维，即细菌纤维。

第一方面，本发明提供一种由细菌生长所形成的纤维丝材料。

进一步的，本发明所述的细菌纤维，其长度不小于50μm，例如不小于100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，甚至不小于2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm，特别是不小于11mm、12mm、13mm、14mm、15mm或20mm。

本发明所述的细菌纤维，其强度可以不小于1×10⁷N/m²，例如不小于2×10⁷N/m²、3×10⁷N/m²、4×10⁷N/m²、5×10⁷N/m²、6×10⁷N/m²、7×10⁷N/m²、8×10⁷N/m²、9×10⁷N/m²，甚至不小于1×10⁸N/m²。

本发明所述的细菌纤维，其直径可以不大于15μm，例如不大于14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。

第二方面，本发明提供一种用于产生上述细菌纤维的重组细菌细胞。

与出发细菌相比，所述重组细菌细胞经遗传修饰使得其能够生长至增加的长度，所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

本领域技术人员可以理解可以通过任何已知的途径获得所述重组细菌细胞，包括但不限于以下两种途径：

1、所述重组细菌细胞的细胞分裂被降低或被抑制。

本领域技术人员可以理解可以通过如下途径应用基因重组手段实现细胞分裂被抑制：

1)所述重组细菌细胞中细胞分裂基因的表达水平被抑制。

其中在所述重组细菌细胞中可以为细胞分裂基因被敲除，也可以为细胞分裂基因的表达量被抑制，包括通过控制所述细胞分裂基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物。

所述细胞分裂基因选自以下一种或更多种：damX，ftsA，ftsB，ftsE，ftsI，ftsL，ftsN，ftsQ，ftsW，ftsK，ftsZ，zipA，zapA，zapB，zapC和zapD。

在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中ftsZ基因的表达量被降低。

2)所述重组细菌细胞中细胞分裂抑制基因的表达水平提高。

其中在所述重组细菌细胞中可以为一种或多种细胞分裂抑制基因过量表达。

所述细胞分裂抑制基因选自以下一种或更多种：yneA、sulA、slmA、minC、minD、dicB。在一个实施方案中，sulA、minC或minD基因中至少一种过量表达。

在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中sulA基因过量表达。

在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中minC和minD基因过量表达。

在另一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中sulA、minC和minD基因过量表达。

2、所述重组细菌细胞的细胞分离被抑制。

本领域技术人员可以理解可以通过细胞分离基因的表达被抑制等基因重组手段实现所述重组细菌细胞的细胞分离被抑制。

在一个实施方案中，所述细胞分离基因的表达量被抑制，包括通过控制所述细胞分离基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物。

在另一个实施方案中所述细胞分离基因的表达量被抑制，包括通过控制所述细胞分离基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物，进一步的还可以包括其他的细胞分离基因被敲除。

在另一个实施方案中所述重组细菌细胞的一种或更多种细胞分离基因被敲除。

所述细胞分离基因包括细胞壁合成抑制基因，所述细胞壁合成抑制基因进一步包括肽聚糖合成抑制基因，所述肽聚糖合成抑制基因进一步包括肽聚糖水解酶基因。

所述肽聚糖水解酶基因选自以下的一种或更多种：sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS。

在一个实施方案中，下列基因中的至少一种被敲除：sigD、lytE、lytC、lytD，cwlS的表达被抑制。

在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中sigD、lytE、lytC基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中sigD、lytE、lytD基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

在另一个优选的实施方案中，sigD、lytE基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

在一个实施方案中，所述重组细菌细胞中sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS基因中的一种或更多种被敲除。

与出发细菌相比，所述重组细菌细胞还可经遗传修饰使得其具有增加的强度，所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

本领域技术人员可以理解可以通过任何已知的途径获得，包括但不限于如下四种途径：

1、所述重组细菌细胞形成厚度增加的细胞细胞壁。

本领域技术人员可以理解可以通过所述重组细菌细胞的细胞壁合成基因的表达水平提高，应用基因重组手段形成厚度增加的细胞细胞壁。

所述重组细菌细胞的一种或更多种细胞壁合成基因过量表达。

所述细胞壁合成基因包括肽聚糖合成基因。所述肽聚糖合成基因选自以下的一种或更多种：yqfP，csbB，yluB，yacM，yacN，yabH，murA，murB，murC，murD，murE，murF，murG，mraY、ddl和pbpC。

在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞为大肠杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW过量表达。

在另一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞为枯草芽孢杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,murD,murE,murF,murG,mraY,ddl过量表达。

2、所述重组细菌细胞能形成增加的细胞内容物。

可以通过如下途径应用基因重组手段形成增加的细胞内容物：所述重组细菌细胞的细胞内容物合成基因的表达水平提高。所述重组细菌细胞中一种或多种细胞内容物合成基因过量表达。在一个实施方案中，所述细胞内容物包括聚羟基脂肪酸酯。在一个优选的实施方案中，所述重组细菌细胞中phaCAB基因过量表达。

3、其中所述重组细菌细胞的细胞壁具有展示蛋白。

本发明中所述细菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或蓝细菌。其中，所述革兰氏阳性菌包括但不限于芽孢杆菌，在一个优选的实施方案中，为枯草芽孢杆菌。所述革兰氏阴性菌包括但不限于大肠杆菌或盐单胞菌。

第三方面，本发明提供一种制造细菌纤维的方法，该方法包括培养细菌细胞，和获得所述细菌纤维。

所述细菌细胞可以为上述的重组细菌细胞。

其中，所述细菌细胞的长度不小于50μm，例如不小于100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，甚至不小于2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm，特别是不小于11mm、12mm、13mm、14mm、15mm或20mm。可通过如下两种途径实现对所述细菌细胞的长度要求：

1、所述细菌细胞被给予其长度增加后不小于50μm的机械力，其中所述机械力为拉伸应力。其中所述拉伸应力可以直接给予细菌细胞体，也可以为基底拉伸应力。

2、所述细菌细胞在生长介质上延伸生长。

进一步的，所述细菌细胞的强度不小于1×10⁷N/m²，例如不小于2×10⁷N/m²、3×10⁷N/m²、4×10⁷N/m²、5×10⁷N/m²、6×10⁷N/m²、7×10⁷N/m²、8×10⁷N/m²、9×10⁷N/m²，甚至不小于1×10⁸N/m²。可通过如下两种途径实现对所述细菌细胞的强度要求：

1、获得混合细菌细胞：

具体的，所述制造细菌纤维的方法包括共培养细菌细胞的步骤，以获得混合细菌细胞。所述共培养细菌细胞可以为共培养同种细菌细胞，也可以为培养不同种细菌细胞，例如共培养革兰氏阳性菌细胞与革兰氏阴性菌细胞，或共培养革兰氏阳性菌细胞与蓝细菌细胞，或共培养革兰氏阴性菌细胞与蓝细菌细胞。

2、所述细菌细胞被粘合。

更进一步的，所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌的培养温度为28-45℃，培养pH值为5-9，诱导时期为对数期前期、诱导培养时间为培养0-24小时后，所述细菌在发酵罐中培养。

第四方面，本发明提供一种细菌纤维用于纺织的用途，其中所述细菌纤维为由上述细菌纤维或由所述的方法制备而得的细菌纤维。

第五方面，本发明提供一种纺织方法，其中包括如下步骤：

获得上述细菌纤维；

将细菌纤维纺为纱线；和

任选地将上述纱线或纤维织为织物。

第六方面，本发明提供一种织物，其由上述的细菌纤维或由所述的方法制备的细菌纤维制备而得。

本发明具有如下有益效果，但值得注意的是，所述有益效果并不一定全部具备，可能具备其中一项或几项。

1、与现有的天然纤维相比，细菌纤维可采用发酵培养的方式生产，具有生产周期短、劳动成本和成本低的优点；

2、与人工纤维相比，细菌纤维具有天然纤维的环保、可降解等优点；

3、细菌纤维为超细纤维，如果作为纺织材料具有1)光泽柔和、柔软；2)超高密、质轻；3)防水透湿性好、具有良好的排汗、导湿作用4)保暖性、耐磨性好；5)具有高清洁能力和去污能力等优点。

附图说明

图1示实施例1中E.coliJKD7-1(PKD3)分别在42℃(a)和30℃(b)在静置培养条件下培养24h形态图；

图2示实施例2中大肠杆菌细菌纤维产生示意图；

图3示实施例2中pet28asulA质粒结构示意图；

图4示实施例2中p15a质粒结构示意图；

图5示实施例2中p15asulA质粒结构示意图；

图6示实施例2中大肠杆菌40×10光学显微镜观察形态图，a为野生型大肠杆菌形态图；b图为过表达细胞分裂抑制基因sulA后大肠杆菌形态图；

图7示实施例2中大肠杆菌扫描电镜观察形态图，a为野生型大肠杆菌形态图；b为过表达细胞分裂抑制基因sulA后大肠杆菌形态图；

图8示实施例3中p15a-araminCD质粒结构示意图；

图9示实施例3过表达minCD后大肠杆菌光学显微镜观察形态图，a为培养2h后结果图；b为诱导表达2h后结果图；c为诱导表达36h后结果图；d为培养48h后结果图；

图10示实施例4中细胞分裂抑制基因minCD在盐单胞菌中过表达载体的构建过程图；

图11示实施例4中minCD过表达的重组TD菌株(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)在60LB培养基中静置培养的扫描电镜图，培养12h后，加2mMIPTG或者不加IPTG培养24h后观察，a为静置培养不加IPTG结果图，2000×；b为静置培养不加IPTG结果图，5000×；c为静置培养加2mMIPTG结果图，2000×；d为静置培养加2mMIPTG结果图，5000×；

图12示实施例4中minCD过表达的重组TD菌株(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)在60MMG培养基中振荡培养的扫描电镜图，培养6h后2mMIPTG诱导，振荡培养48h结束时仍观察到大面积的菌体纤长化，放大倍数分别为2000×和5000×；

图13示实施例5中枯草芽孢杆菌细菌纤维产生示意图；

图14示实施例5中枯草芽孢杆菌光学显微镜形态图，a为枯草芽孢杆菌出发菌形态图；b-g为敲除不同肽聚糖水解酶相关基因后长的枯草芽孢杆菌形态图(b图为敲除sigD后细菌Bacillussubtilis168ΔSigD；c图为敲除lytE后细菌Bacillussubtilis168ΔlytE；d图为敲除lytF后细菌Bacillussubtilis168ΔlytF)，均为在37℃，200rpm条件下接种培养4小时后用相差显微镜拍摄；

图15示实施例5中敲除lytE和sigD两个肽聚糖水解酶相关基因前后枯草芽孢杆菌形态图，a为野生型枯草芽孢杆菌形态图，40X相差显微镜观察下；b、c为lytE和sigD双敲除的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytE在培养5小时后的变长呈纤维状的菌体形态图，10X相差显微镜观察下拍摄；

图16示实施例5中分别或同时敲除细菌肽聚糖水解酶相关基因后枯草芽孢杆菌的形态图，a为敲除sigD和lytE的枯草芽孢杆菌形态图，左右基因型分别为野生型和ΔSigDΔlytE双敲型；b为敲除sigD、lytE和lytC的枯草芽孢杆菌形态图，左右基因型分别为ΔSigDΔlytEΔlytC三基因敲除型和野生型；c为敲除sigD、lytE和lytD的枯草芽孢杆菌形态图，左边两个基因型为ΔSigDΔlytEΔlytD三基因敲除型，右边为野生型；d为敲除cwlS对菌体形态的影响图，从左到右为168wildtype,ΔSigDΔlytEΔcwlS，ΔSigDΔlytEΔlytCΔcwlS，ΔSigDΔlytEΔlytDΔcwlS；

图17示实施例5中28根基因型为168ΔsigDΔlytE的单根纤维化菌体被随机挑选出来测量得到的载荷-位移曲线，其中横轴表示纤维延伸距离，纵轴表示纤维承载的力学强度，右图表示28根不同纤维的长度；

图18示实施例5中从基因型为168ΔsigDΔlytEΔlytD的菌株中随机挑选出两根多根菌体纤维缠绕在一起的纤维，通过循环加载测量得到的载荷-位移曲线；

图19示实施例5不同枯草芽孢杆菌在FM4-64染料处理后在543nm激发光下的荧光图，使用Nikon显微镜40倍镜下拍摄(a图为野生型枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168；b图为敲除sigD后的枯草芽孢杆菌；c图为敲除lytE后的枯草芽孢杆菌)；

图20示实施例6中重组质粒pET28a结构示意图；

图21示实施例8中重组质粒pDG148结构示意图；

图22示实施例9中在枯草芽孢杆菌168中转入并表达phaCAB来生产PHA，枯草芽孢杆菌使用bodipy485/505进行染色，置于荧光显微镜下用红色荧光进行照射并观察。

具体实施方式

本发明涉及以下实施方案：

1、一种由细菌生长所形成的纤维丝材料。

2、根据项1所述的细菌纤维，其长度不小于50μm。

3、一种重组细菌细胞，其用于产生项1或2所述的细菌纤维。

4、根据项3所述的重组细菌细胞，其中与出发细菌相比，所述重组细菌细胞被遗传修饰使得其能够生长至增加的长度，所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

5、根据项4所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞分裂被抑制。

6、根据项5所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中细胞分裂基因的表达被抑制。

7、根据项6所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或更多种细胞分裂基因的表达量被抑制，包括通过控制所述细胞分裂基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物。

8、根据项6所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或更多种细胞分裂基因被敲除。

9、根据项6所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分裂基因选自以下一种或更多种：damX，ftsA，ftsB，ftsE，ftsI，ftsL，ftsN，ftsQ，ftsW，ftsK，ftsZ，zipA，zapA，zapB，zapC和zapD。

10、根据项9所述的重组细菌细胞，其中ftsZ基因的表达量被抑制。

11、根据项5所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中细胞分裂抑制基因的表达水平提高。

12、根据项11所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或多种细胞分裂抑制基因过量表达。

13、根据项11所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分裂抑制基因选自以下一种或更多种：yneA，sulA、slmA、minC、minD、dicB。

14、根据项12所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中下列基因中至少一种过量表达：sulA，minC，minD基因。

15、根据项14所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中sulA基因过量表达。

16、根据项14所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中minC和minD基因过量表达。

17、根据项14所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中sulA、minC和minD基因过量表达。

18、根据项4所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞分离被抑制。

19、根据项18所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞分离基因的表达被抑制。

20、根据项19所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分离基因的表达量抑制，包括通过控制所述细胞分离基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物。

21、根据项20所述的重组细菌细胞，其中还有其他的细胞分离基因被敲除。

22、根据项19所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的一种或更多种细胞分离基因被敲除。

23、根据项19所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分离基因包括细胞壁合成抑制基因。

24、根据项23所述的重组细菌细胞，其中所述细胞壁合成抑制基因包括肽聚糖合成抑制基因。

25、根据项24所述的重组细菌细胞，其中所述肽聚糖合成抑制基因包括肽聚糖水解酶基因。

26、根据项25所述的重组细菌细胞，其中所述肽聚糖水解酶基因选自以下的一种或更多种：sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS。

27、根据项21所述的重组细菌细胞，其中下列基因中至少一种被敲除：sigD、lytE、lytC、lytD，cwlS的表达被抑制。

28、根据项27所述的重组细菌细胞，其中sigD、lytE、lytC基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

29、根据项27所述的重组细菌细胞，其中sigD、lytE、lytD基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

30、根据项27所述的重组细菌细胞，其中sigD、lytE基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

31、根据项22所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS基因中的一种或更多种被敲除。

32、根据项3所述的重组细菌细胞，其中与出发细菌相比，所述重组细菌细胞被遗传修饰使得其具有增加的强度，所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

33、根据项32所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞形成厚度增加的细胞细胞壁。

34、根据项33所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞壁合成基因的表达水平提高。

35、根据项34所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的一种或更多种细胞壁合成基因过量表达。

36、根据项34所述的重组细菌细胞，其中所述细胞壁合成基因包括肽聚糖合成基因。

37、根据项36所述的重组细菌细胞，其中所述肽聚糖合成基因选自以下的一种或更多种：yqfP，csbB，yluB，yacM，yacN，yabH，murA，murB，murC，murD，murE，murF，murG，mraY，ddl和pbpC。

38、根据项35所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞为大肠杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW过量表达。

39、根据项35所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞为枯草芽孢杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,murD,murE,murF,murG,mraY,ddl过量表达。

40、根据项32所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞形成增加的细胞内容物。

41、根据项40所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞内容物合成基因的表达水平提高。

42、根据项41所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或多种细胞内容物合成基因过量表达。

43、根据项40所述的重组细菌细胞，其中所述细胞内容物包括聚羟基脂肪酸酯。

44、根据项43所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中phaCAB基因过量表达。

45、根据项43所述的重组细菌细胞，其中所述聚羟基脂肪酸酯熔融后与细胞壁交联。

46、根据项32所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞壁具有展示蛋白。

47、根据项3～46任一项所述的重组细菌细胞，其中所述细菌为革兰氏阳性菌。

48、根据项47所述的重组细菌细胞，其中所述细菌为芽孢杆菌。

49、根据项48所述的重组细菌细胞，其中所述细菌为枯草芽孢杆菌。

50、根据项3～46任一项所述的重组细菌细胞，其中所述细菌为革兰氏阴性菌。

51、根据项50所述的重组细菌细胞，其中所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。

52、根据项50所述的重组细菌细胞，其中所述革兰氏阴性菌为盐单胞菌。

53、根据项3～46任一项所述的重组细菌细胞，其中所述细菌为蓝细菌。

54、一种制造细菌纤维的方法，其包括培养细菌细胞，和获得所述细菌纤维。

55、根据项54所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞为项3～46任一项所述的重组细菌细胞。

56、根据项54所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞的长度不小于50μm。

57、根据项56所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞被给予其长度增加后不小于50μm的机械力。

58、根据项57所述的制造细菌纤维的方法，其中所述机械力为拉伸应力。

59、根据项58所述的制造细菌纤维的方法，其中所述拉伸应力直接给予细菌细胞体。

60、根据项58所述的制造细菌纤维的方法，其中所述拉伸应力为基底拉伸应力。

61、根据项56所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞在生长介质上延伸生长。

62、根据项54所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞的强度不小于1×10⁷N/m²。

63、根据项62所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞为混合细菌细胞。

64、根据项63所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞为共培养细菌细胞。

65、根据项64所述的制造细菌纤维的方法，其中所述制造细菌纤维的方法包括共培养同种细菌细胞的步骤。

66、根据项64所述的制造细菌纤维的方法，其中所述制造细菌纤维的方法包括共培养革兰氏阳性菌细胞与革兰氏阴性菌细胞的步骤。

67、根据项64所述的制造细菌纤维的方法，其中所述制造细菌纤维的方法包括共培养革兰氏阳性菌细胞与蓝细菌细胞。

68、根据项64所述的制造细菌纤维的方法，其中所述制造细菌纤维的方法包括共培养革兰氏阴性菌细胞与蓝细菌细胞的步骤。

69、根据项62所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞被粘合。

70、根据项54所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞的培养温度为28-45℃，培养pH值为5-9，诱导时期为对数期前期、诱导培养时间为培养0-24小时后。

71、根据项54所述的制造细菌纤维的方法，其中将所述细菌细胞在发酵罐中培养。

72、一种细菌纤维用于纺织的用途，其中所述细菌纤维为由项1或2所述的细菌纤维或由项54-71中任一项的所述方法制备而得的细菌纤维。

73、一种纺织方法，其中包括如下步骤：

获得项1或2所述的细菌纤维或由项54-71中任一项的方法制备而得的细菌纤维；

将细菌纤维纺为纱线；和

任选地将上述纱线或纤维织为织物。

74、一种织物，其由项1或2所述的细菌纤维或由项54-71中任一项的方法制备而得的细菌纤维制备而得。

如本文中所使用的，以下专业名词可用于权利要求和说明书的解释。

细菌染色体指一条环状双螺旋DNA长链，按一定构型反复回旋成松散网状的结构，附着在横隔中介体或细胞膜上，是细菌的主要遗传物质，也称核质。

细胞分裂是生物体生长和繁殖的基础，通常由一个母细胞产生两个或若干子细胞。细菌的细胞分裂一般是简单的一分为二，其分裂活动包括两个方面：1)细胞DNA的复制和分配；2)胞质分裂。

细胞分裂基因是指细菌体内促进细胞分裂的基因，编码上述参与细胞分裂的蛋白。

细胞分裂抑制基因指细菌体内编码细胞分裂抑制因子的基因。所述细胞分裂抑制基因包括但不限于yneA，sulA、slmA、minCD、dicB。

细胞分离即指母细胞形成隔后纵裂为二个子细胞的过程。

细胞分离基因指细菌体内对细胞分离起正向调节的基因。

基因表达是指细胞将储存在DNA中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子，该过程受到内外信号的精确调控。

基因表达被抑制：即指通过基因重组手段，使目标基因在宿主细胞中的表达被抑制的技术。对表达的这种抑制可以是抑制基因的表达，可以包含DNA水平、RNA水平或蛋白水平的抑制，包括但不限于如下方式：1)缺失基因表达所需的全部或部分启动子区域；2)缺失基因的编码区域；3)通过控制目的基因的调控序列抑制基因的表达，例如启动子被抑制，从而不能编码蛋白质或编码少量蛋白质；4)编码活性降低或失活的蛋白质；

基因敲除指通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶片段，从而达到基因敲除的目的。基因敲除主要包括下列技术：1)构建重组载体；2)重组DNA转入受体细胞中；3)中靶阳性细胞的筛选。

基因的过量表达指通过基因重组手段使目标基因在宿主细胞中过量表达的技术，包括但不限于如下方式：1、用诱导所述目的基因更强表达水平的启动子替代基因的天然启动子。这样的启动子是本领域的技术人员能确定可以使用的启动子。2、通过下述方式向宿主细胞中导入多个拷贝的目的基因：1)导入携带和表达所述目的基因的表达载体。2)向宿主细胞的染色体中导入基因的额外拷贝。3、增加信使RNA的稳定性。4、除去调节元件或使用具有更高活性的等位基因。上述各种方式是本领域技术人员已知的，并且可以组合应用。

重组细菌细胞指经遗传修饰以表达或过表达内源多核苷酸，或表达异源性多核苷酸(例如包含在载体中的那些)，或在内源基因的表达上有变化。“变化”的意思是基因的表达、或RNA分子水平或编码一种或多种多肽或多肽亚基的等效RNA分子水平、或一种或多种多肽或多肽亚基的活性被上调或下调，使得基因表达、RNA水平或多肽活性大于或小于在没有该变化时所观察到的。重组细菌细胞应理解为不仅仅指具体的重组细菌，还指这种细菌的子代或潜在子代。

遗传修饰指在细菌细胞中引入或诱导的任何遗传变化。

出发细菌描述指未经遗传修饰的细菌细胞，出发细菌细胞可以起到连续遗传修饰事件的参照细胞的作用。

载体指表达载体，为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明的目的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

调控序列(controlsequence)为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达必需的或有利的所有成分。各种调节序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调节序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。调节序列至少包括启动子和转录和翻译的终止信号。调节序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调节序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

位于细菌细胞质内，呈颗粒状或泡囊状的构造称为内含物。细菌中常见的内含物包括但不限于：聚β-羟丁酸(PHB)或聚羟链烷酸(PHA)，藻青素或藻青蛋白(蓝细菌等)，异染粒(迂回螺菌、棒杆菌和分枝杆菌等)，糖原(大肠杆菌和芽孢杆菌等)；硫粒(紫硫细菌和丝硫细菌等)；磁小体；羧酶体。

本发明所述的“培养”、“生长”和“发酵”可互换使用，表示细菌在包含的适当生长培养基中的生长。

本发明所述的细菌指一类细胞细短、结构简单、种类繁多、主要以二分裂繁殖和水生性较强的单细胞原核微生物，值得注意的是，放线菌(Actinomycete)在形态上分化为菌丝和孢子，在培养特征上与真菌相似。然而，用近代分子生物学手段研究结果表明，放线菌是属于一类具有分支状菌丝体的细菌，现对其归属有争议，因此本发明所述的细菌中不包括放线菌。

纤维长度是指纤维在不受外力影响下，伸直时测得的两端间距离，计量单位为毫米(mm)。

本发明中的纤维强度是指纤维拉断时所能承受的最大负荷。本发明中的纤维强度具体指每平方毫米粗细的纤维或其他织物所能承受的最大负荷。

用纺织纤维加工制成的具有一定线密度和强度的、连续的细长束状物，称为纱线，纺纱过程就是讲各种纺织纤维，通过纤维的松解与集合而纺成纱线，以供织造使用，因采用的纤维种类不同，其生产设备与工艺流程也有所不同。

织物，是由纺织纤维和纱线制成的、柔软而具有一定力学性质和厚度的制品，即通常所说的纺织品。常规概念中的织物是一种柔性平面薄状物质，其大都由纱线织、编、结或纤维固结而成。按生产方式不同，可广义地分为纱线类、带类、绳类、机织物、针织物、编织物和非织造布等。

以下的实施方案是对本发明的最佳实施方案的说明。

可以用来制造纺织制品(例如纱、线、绳带、机织物、针织物、非织造布等)的纤维称为纺织纤维，纺织纤维必须具备一定的物理和化学性质，以满足顺利进行纺织加工和使用中各方面的要求，所述的物理和化学性质中最重要的有如下几个方面：1、长度：纤维长度是指纤维在不受外力影响下，伸直时测得的两端间距离，计量单位为毫米(mm)。纤维长度是确定纺纱设备和纺纱工艺参数的依据，也是决定纱线质量的重要因素，因此纤维长度是衡量纤维品质的重要指标。过于短，整齐度差的纤维，在纺纱过程中易形成粗、细节，甚至滑脱，使纱线解体，且成纱能力低，毛羽多，所以纺织纤维一般希望长度较长，长度整齐度较高。2、线密度和线密度均匀度：纤维越细，线密度均匀度越高，可纺得的纱线越细，且均匀度越好。3、强度和模量：模量即引起单位应变所需的应力，它反映材料的刚柔性，在纺织加工及穿着使用过程中，纤维受到多种外力的反复作用，故必须具备一定的强度和适当的模量。

如表1所示，与现有的天然纤维相比，细菌天然直径较小，在线密度方面具有较大优势，而如果要将细菌细胞应用于纺织，必须提高细菌细胞的长度及强度这两种性能。

表1不同纤维和菌体纤维的直径比较

所以，第一方面，本发明提供一种由细菌生长所形成的纤维丝材料。

进一步的，所述细菌纤维，其长度不小于50μm，例如不小于100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，甚至不小于2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm，特别是不小于11mm、12mm、13mm、14mm、15mm或20mm。

在一个实施方案中，其强度可以不小于1×10⁷N/m²，例如不小于2×10⁷N/m²、3×10⁷N/m²、4×10⁷N/m²、5×10⁷N/m²、6×10⁷N/m²、7×10⁷N/m²、8×10⁷N/m²、9×10⁷N/m²，甚至不小于1×10⁸N/m²。

在一个实施方案中，所述细菌纤维的直径可以不大于15μm，例如不大于14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm或1μm。本领域技术人员可以理解对细菌细胞进行遗传修饰后，其直径可能有所变化并超出上述范围。

与真核细胞相比，细菌长度较短，例如通常球菌直径为(0.2-1.25μm)，杆菌长为(0.3-8μm)，宽为(0.2-1.25μm)，螺杆菌的宽乘以轴长为(0.3-1μm)乘以(1-5μm)，因此本发明首先提供一种与出发细菌相比被遗传修饰使得其能够生长至增加的长度的重组细菌细胞，优选地所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

所述重组细菌细胞可通过两种方式获得：

1、所述重组细菌细胞的细胞分裂被降低或被抑制；2、所述重组细菌细胞的细胞分离被降低或被抑制。

第1种途径中，通过抑制细胞分裂，细菌细胞可以正常进行细胞DNA的复制,但不能进行胞质分裂，只纵向延伸而不分裂，从而得到长度增加的重组细菌细胞。

在本发明的一个实施方案中，细胞分裂被抑制通过如下方式实现：细胞分裂基因的表达被抑制。

细菌在进行分裂活动之前，首先要由一些蛋白在分裂位点组装成一个环状的分裂复合体，并由此促成分裂隔膜的形成，进而引发细胞分裂事件的发生。细菌细胞分裂过程的顺利完成需要如FtsZ蛋白，FtsA蛋白，FtsL蛋白，FtsI蛋白，FtsQ蛋白，FtsN蛋白，FtsW蛋白，FtsK蛋白和ZipA蛋白等蛋白的参与和调控。细胞分裂基因是指细菌体内促进细胞分裂的基因，编码上述参与细胞分裂的蛋白。通过降低被抑制细胞分裂基因的表达，可以阻止细菌细胞分裂过程的正常完成，从而抑制细胞分裂。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明所述的细胞分裂基因表达被抑制通过如下方式实现：所述细胞分裂基因的表达量被抑制，例如包括通过控制所述细胞分裂基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物。

在本发明的另一个具体实施方案中，本发明所述的细胞分裂基因表达被抑制通过如下方式实现：所述细胞分裂基因被敲除。

本领域技术人员可以理解所述细胞分裂基因选自以下一种或更多种：damX，ftsA，ftsB，ftsE，ftsI，ftsL，ftsN，ftsQ，ftsW，ftsK，ftsZ，zipA，zapA，zapB，zapC和zapD。

FtsZ蛋白是最早出现在分裂位点的蛋白，而且在细胞分裂过程中承担着主要作用：第一，作为胞内的一种钢性结构而存在,并为质膜的收缩提供能量；第二，作为胞内其它分裂相关蛋白的组装支架,即为其它分裂蛋白在分裂位点处的聚集提供结合位点。因此,在细胞分裂过程中,FtsZ蛋白的直接参与以及FtsZ环的适时形成对于细胞的正常分裂活动都是至关重要的。FtsZ蛋白是ftsZ基因的表达产物。在大肠杆菌中细胞分裂基因如ftsZ一般是对于细胞存活是必需的，因此通过抑制细胞分裂基因的表达来获得长度增加的细菌细胞及细菌纤维。因此，在本发明的一个优选实施方案中，ftsZ基因的表达量被抑制。

在本发明的另一个实施方案中，细胞分裂被抑制通过如下方式实现：细胞分裂抑制基因的表达水平提高。

细胞分裂抑制基因即指细菌体内编码细胞分裂抑制因子的基因。如上所述，FtsZ是参与细胞分裂的重要蛋白，参与细胞分裂起始结构FtsZ分裂环的形成。FtsZ蛋白在细菌内存在很多抑制因子，如Min家族蛋白、SulA蛋白和SlmA蛋白等。通过提高细胞分裂抑制基因的表达水平可以抑制细胞分裂起始结构FtsZ分裂环的形成，从而抑制细胞分裂。

所述细胞分裂抑制基因选自以下一种或更多种：yneA，sulA、slmA、minC、minD、dicB。

例如，SulA是存在于细菌细胞内，参与SOS反应的蛋白，能阻止细胞在DNA损伤后的进一步分裂。SulA蛋白通过阻止FtsZ装配形成细胞分裂环(Zring)而抑制细胞分裂。MinCD中起抑制作用的是MinC蛋白，在胞内的主要作用是抑制FtsZ的多聚化，从而抑制FtsZ分裂环的形成。MinD的作用是将MinC锚定于膜上，并激活其活性。SulA蛋白是sulA基因的表达产物。因此过表达sulA和/或minCD基因后，细胞可以正常进行DNA的复制但不能进行细胞质的分离，从而得到变长呈纤维状的细菌。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组细菌细胞中一种或多种细胞分裂抑制基因过量表达。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组细菌细胞中sulA、minC或minD基因中至少一种过量表达。

第2种途径中，通过抑制细胞分离，细菌细胞只完成DNA的复制和分配并在细胞中部形成隔，但不纵裂为二个子细胞，从而随着细胞不断分裂获得长度增加的链状结构的细菌细胞。

在本发明的一个实施方案中，细胞分离被抑制通过如下方式实现：细胞分离基因的表达被抑制。

所述细胞分离基因包括细胞壁合成抑制基因。优选的，所述细胞壁合成抑制基因包括肽聚糖合成抑制基因。优选的，所述肽聚糖合成抑制基因为肽聚糖水解酶基因。

优选的，所述肽聚糖水解酶基选自以下一种或更多种sigD、lytE(cwlF)、lytF(yhdD，cwlE)、lytC(cwlB)、lytD(cwlG)、lytG、cwlS(YojL)。

cwlS蛋白是一种在结构上与lytE、lytF十分类似的蛋白，其在对数期后期和稳定期表达，因此敲除cwlS基因应该能够显著地增长菌体纤维长度，同时稳定纤维状态。但cwlS基因敲除后的枯草芽孢杆菌状态极不稳定，无法完全敲除，因此可对所得已敲除细胞分离基因的重组枯草芽孢杆菌进行cwlS基因的抑制表达，在一个实施方案中，下列基因中的至少一种被敲除：sigD、lytE、lytC、lytD，cwlS的表达被抑制。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组细菌细胞中sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS基因中的一种或更多种被敲除。lytE(cwlF)，lytF(cwlE)，lytC(cwlB)，lytD(cwlG)，lytG和cwlS是许多革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌的肽聚糖水解酶相关基因，sigD是许多肽聚糖水解酶基因的调控因子，通过单独或同时敲除这几个基因可以使细菌生长过程不能正常分离，得到链状结构的长纤维状细菌，最长可达到厘米级形成可见的絮状细菌纤维丝。

纤维强度是指纤维拉断时所能承受的最大负荷以g、cN表示。对棉纤维而言，强度与纤维成熟度有着密切的关系，强度高的纤维成纱后的强度也高。如陆地棉纤维拉力通常为4～11克，海岛棉为4～7克。化学纤维的强力和伸长可在加工过程中控制。除拉伸断裂特性外，纤维在外力作用下的变形回复能力，也影响纺织品的尺寸稳定性和使用寿命。如果仅形成长度增加的纤长丝状纤维，所得到的细菌纤维强度不高，不能达到纤维材料的强度要求。因此本发明还提供一种与出发细菌相比被遗传修饰使得其具有增加的强度的重组细菌细胞，优选地所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

所述重组细菌细胞可通过如下4种方式获得：

1、所述重组细菌细胞形成厚度增加的细胞细胞壁。

细菌纤维中，细菌细胞壁为细胞强度的支撑，也是细菌细胞强度受限的直接原因。通过增加细胞壁的厚度，可以增加细菌细胞的强度。因此，通过细胞壁合成基因的表达水平升高，可以促进细菌细胞壁的合成，从而增加细胞壁的厚度，增加细菌细胞的强度。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细菌细胞形成厚度增加的细胞细胞壁通过如下方式实现：所述重组细菌细胞的细胞壁合成基因的表达水平提高。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组细菌细胞的一种或更多种细胞壁合成基因过量表达。

细菌细胞壁的主要构成成分是肽聚糖，革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，约由15-50层肽聚糖片组成，厚约15～80mm，肽聚糖含量在革兰氏阳性菌成分中占约90％。革兰氏阴性菌中肽聚糖层较薄，厚约1～2mm，肽聚糖含量在革兰氏阴性菌成分中占约10％。因此，肽聚糖合成基因为细胞壁合成基因中重要的一类，通过细胞肽聚糖合成基因表达水平的升高，可以促进肽聚糖含量的增加，增加细胞壁肽聚糖层厚度，可以增加细胞壁的厚度，从而增加细胞强度。因此，在一个优选的实施方案中，所述细胞壁合成基因包括肽聚糖合成基因。

所述肽聚糖合成基因选自以下的一种或更多种：yqfP，csbB，yluB，yacM，yacN，yabH，murA，murB，murC，murD，murE，murF，murG，mraY、ddl和pbpC。其中部分基因功能列于表2中。

表2肽聚糖合成相关基因(E.coli和B.subtilis)

在本发明的另一个具体实施方案中，所述重组细菌细胞的一种或更多种肽聚糖合成基因过量表达。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组细菌细胞为大肠杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY和ftsW过量表达。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述重组细菌细胞为枯草芽孢杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,murD,murE,murF,murG,mraY和ddl过量表达。

2、所述重组细菌细胞能形成增加的细胞内容物。

通过增加细菌体内内含物的含量，可达到“填充”细菌体的作用，从而提高细菌强度。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细菌细胞形成增加的细胞内容物通过如下方式实现：所述重组细菌细胞的细胞内容物合成基因的表达水平提高。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组细菌细胞中一种或多种细胞内容物合成基因过量表达。

聚羟基脂肪酸酯(PHA，polyhydroxyalkanoates)，是近20多年迅速发展起来的生物高分子材料，是很多细菌合成的一种细胞内聚酯，是一种天然的高分子生物材料。

在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞内容物包括聚羟基脂肪酸酯。phaCAB基因为聚羟基脂肪酸酯合成过程中的编码基因。在本发明的一个优选实施方案中，所述重组细菌细胞中phaCAB基因过量表达。

PHA在细菌体内是颗粒状累积的，不溶于水，表面被蛋白包裹。高温加热可以使PHA处于熔融状态，从而交联细胞壁，得到细胞壁强度增强的细菌菌株。因此在本发明的一个优选实施方案中，所述聚羟基脂肪酸酯熔融后与细胞壁交联。

PHA的结构变化几乎是无限的，不仅侧链的R可以有许多变化，主链单体链长m目前已发现可以至少从1到3变化。另一方面，不同的单体还可以形成不同的共聚物，包括二元共聚物如3-羟基丁酸(HB)和3-羟基己酸(HHx)的共聚酯PHBHHx,三元共聚物如3-羟基丁酸(HB)，3-羟基戊酸(HV)和3-羟基己酸(HHx)的共聚酯PHBVHHx。同时，单体在共聚物中比例的变化也带来共聚物性能的许多变化。根据单体的种类，可将PHA分为同聚物(homopolymer)和共聚物(copolymer)两类：前者只有一种单体，如PHB、PHV等；后者含有两种或两种以上的单体，如PHBHHx为以3HB和3HV为单体的聚羟基丁酸羟基戊酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，简称PHBV]等。

不同结构的PHA是在与其单体结构相关的底物培养中获得的，这使得合成多种不同结构的PHA成为可能。3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯(P3HB4HB)是一种特殊的短链PHA，改变其单体3HB和4HB比例，可以使P3HB4HB具有从非常硬的高度结晶体到软的弹性体等一系列不同的材料学性质，从而得到细胞壁强度可调的细菌菌株。

在本发明的一个优选实施方案中，所述聚羟基脂肪酸酯为共聚物聚羟基脂肪酸酯，通过共聚物聚羟基脂肪酸酯中单体类型变化和/或不同单体比例变化实现细菌细胞强度的变化。

3、重组细菌细胞的细胞壁具有展示蛋白

细胞表面展示技术(surfacedisplay)是一种新的基因操作技术，即将异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入宿主细胞表面，使表达的多肽以融合蛋白形式展现在细胞表面，保持相对独立的空间结构和生物活性。通过在细菌细胞壁表面产生展示蛋白，使细菌之间的展示蛋白之间发生作用，从而可以增加细菌细胞的强度。

在本发明的一个实施方案中，通过细胞细胞壁表面的展示蛋白来实现细胞壁厚度的增加。可通过细胞表面展示技术获得所述的展示蛋白。

4、重组细菌细胞的细胞壁致密度增加

通过所述重组细菌细胞的细胞壁致密度增加来实现细胞壁厚度的增加。

如上所述，细菌细胞壁的主要组成为肽聚糖，通过使细菌细胞壁的肽聚糖层结构致密，可以增加细胞壁的强度。

在本发明的一个实施方案中，所述重组细菌细胞的肽聚糖合成基因的表达水平提高。

在肽聚糖合成过程中，盘尼西林结合蛋白(penicillin-bindingprotein，PBP)家族参与最后两步的关键反应。PBP一般具有两个功能，即糖基转移酶活性(glycosyltransferase)，负责单个糖基链的延伸；转肽酶活性(transpeptidase)，负责糖基链之间通过转肽作用的交联过程。其中PBP家族中的PBP5参与肽聚糖糖基链之间的交联作用。因此通过PBP基因家族尤其PBP5的过量表达，增加细胞壁致密度，从而增加细胞强度。

在一个优选的实施方案中，所述肽聚糖合成基因选自PBP基因家族。更优选的，所述肽聚糖合成基因为pbp5。

本发明所述的细菌细胞可以是上述通过基因重组手段获得的重组细菌细胞。本发明所述的细菌细胞也可以是通过外部作用而不改变细胞遗传特性达到细菌纤维长度或强度要求的细菌细胞。

具体的说，本发明公开了通过基因克隆手段获得的遗传性状改变的细菌，其可应用于制备细菌纤维。本发明通过基因克隆的技术手段获得遗传性状改变的重组细菌细胞，其中所述基因克隆的技术手段涉及的各种基因工程实验技术均按照分子克隆实验指南，第3版，科学出版社(2008)，等多种标准实验手册进行，这些文献的内容也引入本发明的说明书中。具体获得所述遗传性状改变的重组细菌细胞基因克隆的技术手段如下：

1、用于克隆的DNA材料的选择，及DNA分子的克隆或分离；

用于基因克隆的DNA材料的来源，主要是从特定组织提取的染色体基因组DNA或者是由mRNA反转录成的cDNA拷贝。目的DNA分子的克隆或分离的技术是本领域人员所公知的，例如，可通过使用本领域常见的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，从而实现从基因组DNA克隆本发明的目的DNA分子。也可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。

2、外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；

调控序列可以是合适的启动子序列，启动子序列含有介导目的基因的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与合适的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。

条件必需基因(conditionallyessentialgene)可以作为非抗生素选择性标记。条件必需基因的实例是本领域公知的。例如抗生素选择性标记赋予对抗生素的抗性，所述抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤。

3、将人工重组的DNA分子导入其可以正常复制的宿主细胞的程序；

在谈及将DNA分子插入到细胞中时，“导入”是指“转染”或者“转化”或者“转导”，包括将核酸序列整合到原核细胞中，其中所述核酸序列可以被并入到细胞染色体中转变为自主复制子，或者短暂地表达(例如，转染的mRNA)。转化(或转导，或转染)可以通过包括化学转化(例如乙酸锂转化)、电穿孔、显微注射、基因枪(或粒子轰击介导的传递)或土壤杆菌介导的转化在内的许多方法中的任意一种来完成。

本发明所述的宿主细胞或细胞包括任何细菌细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的。

4、获得了重组子分子的转化体克隆的选择或筛选。

转化体克隆的选择，其基本含义是指通过某种外来附加压力(或因素)的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种办法。即通过如上所述的选择性标记进行选择。

筛选则是指通过某种特定的方法，例如核酸杂交以及免疫测定等，从被分析的细菌群体或基因文库中，鉴定出真正具有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。

在本发明的一个实施方案中，所述细菌细胞为上述与出发细菌相比被遗传修饰使得其生长至增加的长度或具有增加的强度的重组细菌细胞。

除了通过基因重组的方式改变细菌细胞本身的遗传特性，以增加细菌细胞的长度和强度外，本领域技术人员可以理解还可通过在细菌细胞培养中加以物理或化学作用的方法，增加细菌细胞的长度和强度。

在本发明的另一个实施方案中，所述制备细菌纤维的方法中，所述细菌纤维，其长度不小于50μm，例如不小于100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm或1000μm，甚至不小于2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm，特别是不小于11mm、12mm、13mm、14mm、15mm或20mm。

现有细胞力学的研究中已发现，细胞在一定范围力学作用下会发生相应的形态和功能改变，这是机体对力学刺激的响应过程，例如，在周期性的拉伸应力的作用下，细胞会明显变长并垂直于拉伸方向重新排列。因此，在细菌细胞培养过程中，通过对其细胞体进行给予机械力，可以使细胞体在机械力作用下变长。所述的机械力优选为拉伸应力。本发明所述的拉伸应力可以为直接给予细胞体的，例如应用可拉伸细胞体的钩状设施等。本发明所述的拉伸应力也可以为基底拉伸应力。基底拉伸应力指利用细胞在培养时的贴壁性，周期性地拉伸培养有细胞的可延伸基底，使细胞受到适当的周期性拉伸力作用，细胞变长且垂直于拉伸方向重新排列，细胞所受牵引力减小。本发明所述的基底拉伸按基底形状主要分为矩形基底拉伸和圆形基底拉伸两类。可使用马达驱动的活塞-联动装置拉伸矩形基底，使附着其上的细胞受到不同大小、不同周期的拉伸力。圆形基底拉伸可通过对基底膜底面施加流体/气体压力引起基底形变，通过控制形变量大小来控制细胞受力大小。基底拉伸应力可通过基底拉伸装置实现精确控制。所述的基底拉伸装置包括但不限于使用马达驱动的活塞-联动装置，Petriperm弹力膜培养皿等。

在本发明的一个具体实施方案中，所述细菌细胞被给予其长度增加后不小于50μm的机械力。

在本发明的一个优选实施方案中，其中所述机械力为拉伸应力。其中所述拉伸应力可以直接给予细菌细胞体，也可以为基底拉伸应力。

因为在细菌培养过程中，如果在培养液中悬浮培养，而不是在介质表面进行生长，得到的多个细菌一般呈团状，如果在细胞培养容器中给予细胞生长可贴附的介质，细胞可在介质表面延伸生长。因此，在本发明的另一个具体实施方案中，所述细菌细胞在生长介质上延伸生长。本发明所述的细胞贴壁生长的基质可以是市售可获得的或自制的任何细菌细胞可粘附于表面生长的基质。

本发明的另一个实施方案中，所述制备细菌纤维的方法中，所述细菌纤维，其强度不小于1×10⁷N/m²，例如不小于2×10⁷N/m²、3×10⁷N/m²、4×10⁷N/m²、5×10⁷N/m²、6×10⁷N/m²、7×10⁷N/m²、8×10⁷N/m²、9×10⁷N/m²，甚至不小于1×10⁸N/m²。

细菌纤维作为超细纤维，单根纤维的直径较小，如果将细菌纤维共同培养，在培养过程中互相缠绕，形成纤维簇，成为获得混合细菌细胞形成的纤维，则其机械性能必然要优于单根纤维，例如强度会增加。

因此，在本发明的一个具体实施方案中，所述细菌细胞为混合细菌细胞。

共同培养细菌细胞可以为同种类的细菌细胞，也可以为不同种类的细菌细胞。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述细菌细胞为共培养细菌细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，所述细菌细胞为共培养同种细菌细胞。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述细菌细胞为共培养革兰氏阳性菌细胞与革兰氏阴性菌细胞。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述细菌细胞为共培养革兰氏阳性菌细胞与蓝细菌细胞。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述细菌细胞为共培养革兰氏阴性菌细胞与蓝细菌细胞。

再例如，在细胞培养过程中通过用粘合剂粘合细胞，也可以形成成簇的混合细菌细胞。因此在本发明的一个优选实施方案中，所述细菌细胞被粘合。

要将细菌细胞应用于工业生产必须通过细菌细胞的大规模培养获得高密度的细菌细胞。本领域技术人员可以通过对培养基成分、培养方式、发酵条件等各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺，实现细菌细胞的高密度培养。所述的发酵条件至少包括培养基成分、培养温度、培养液溶氧量、转速、培养pH值、补料的添加、代谢物的控制等。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。对于重组细菌细胞而言，还需要对其表达系统的表达进行优化。发酵前应探索诱导外源基因高表达的最适条件，以使重组细菌细胞既能高密度生长又能高效率表达外源目的蛋白。要实现外源基因的高表达而又不过多地影响宿主菌的生存，就必须优化诱导时期、诱导培养时间、诱导剂浓度等参数。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明所述的一种制备细菌纤维的方法，培养温度为28-45℃，培养pH值为5-9，诱导时期为对数期前期、诱导培养时间为培养0-24小时后。

此外，要保证细菌细胞的高密度生长，提供其生长所需营养物质的培养基成分和浓度的选择是关键的因素。首先，需选取易被重组细菌细胞利用的营养物质，本发明中用于培养的培养基可以使常规用于细菌培养、或重组细菌培养的众所周知的培养基。即，其可以是包含碳源、氮源、无机离子，以及所需的其他有机组分的通常的培养基。

本发明中用于培养的容器可以为常见的用于细菌培养的容器，例如可以是试管、摇瓶、发酵罐等。优选使用全自动发酵罐系统，发酵参数由计算机程序控制，则会大大完善高密度发酵工艺。因为程序化控制会使发酵参数自动达到最佳状态，而且参数的改变比手动要温和、平稳，这些都对重组细菌的生长繁殖极为有利。

在本发明的一个优选方案中，所述的一种制备细菌纤维的方法中将所述细菌在发酵罐中培养。

第四方面，本发明提供一种细菌纤维用于纺织的用途，其中所述细菌纤维为由上述第一方面所述的细菌纤维或由第三方面所述的方法制备而得的细菌纤维。

第五方面，本发明提供一种纺织方法，其中包括如下步骤：

获得上述第一方面所述的细菌纤维或由第三方面所述的方法制备而得的细菌纤维；

将细菌纤维纺为纱线；和

任选地将上述纱线或纤维织为织物。

细菌纤维用于纺纱的方法可以为现有常用纺纱工艺，例如，包括纤维原料的初步加工、纤维原料与混合、开松与除杂、梳理、牵伸、纱条不匀与匀整、加捻、卷绕成形的等步骤的方法。

第六方面，本发明提供一种织物，其由上述第一方面所述的细菌纤维或由第三方面所述的方法制备的细菌纤维制备而得。

在本发明的说明书中，使用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、盐单胞菌等菌种中对应基因的命名来鉴别基因和蛋白。然而，且除非单独说明，根据本发明这些命名的使用具有更加广泛的含意，并涵盖其它细菌细胞中所有的相应基因和蛋白。

使用GenBank给出的用于已知基因的参照，本领域技术人员能够确定其它细菌菌株中的等同基因。即可通过与来源于其它微生物的基因进行序列比对，并设计简并探针克隆另一种生物中相应基因而确定的共同序列来有利地进行的。这些分子生物学常规方法对于本领域技术人员是公知的，并记载于例如分子克隆实验指南，第3版，科学出版社(2008)等。

鉴定同源序列及其同源性百分比的手段对于本领域技术人员是公知的，并包括特别是BLAST程序，可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/用该网站所示的缺省参数来使用。可使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)用这些网站所示的缺省参数来发掘(例如比对)获得的序列。

本发明中所述所有基因的序列都可通过GenBank基因序列号从GenBank数据库获得，GenBank数据库是1982年由美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立并维护的综合性序列数据库。表3中为本发明中不同菌种中所涉及的基因对应的GenBank基因序列号。

表3基因Genebank序列号表

现有技术人员可应用现有已知的任何电镜观察方法观察细菌形态，例如本发明中进行扫描电镜观察的具体方法如下：1、电镜样品准备：细菌在培养基中培养或诱导培养一定时间后收集500L菌体，5000rpm，离心2分钟，用戊二醛固定2小时；PBS洗两次，每次10分钟；梯度乙醇脱水：50％、70％、80％、90％每个梯度3-5分钟，100％乙醇脱水3次，每次3-5分钟；叔丁醇：乙醇＝1：1处理10分钟；纯叔丁醇处理10分钟；最后用叔丁醇覆盖菌体，放-20℃冷冻20分钟以上，然后冷冻干燥成粉末状。得到冰干的菌体。2、将上述菌体用牙签沾取合适的量粘在导电胶上，表面喷金60秒，进行扫描电镜观察。

现有技术人员可应用现有已知的任何荧光成像方法观察细菌形态，例如本发明中荧光成像观察的具体方法如下：荧光成像使用Nikon80i显微镜，带有120金属卤素灯。FM4-64使用C-FLHYQ异硫氰酸荧光素滤膜，发射波长532nm到587nm之间，吸收波长大于590nm。图片由PhotomerricsCoolsnapHQ2camera在黑白背景下假色下用Metamorphimages软件拍摄。在细菌膜染中，0.5ml的OD值为0.5的细菌培养物被收获后离心去掉上清，在1.0ml的T-Basebuffer(15mM(NH4)2SO4,80mMK2HPO4,44mMKH2PO4,3.4mMsodiumcitrate,3.0mMmgSO46H2O)中重悬起来，细菌然后再使用500μlT-Basebuffer清洗两次，然后溶解在5μg/mlFM4-64的50μlT-Basebuffer中，室温中保温10分钟，取3μl置于显微镜载玻片上并盖上盖玻片置于荧光显微镜下进行观察。

现有技术人员可应用现有已知的任何测定细菌细胞长度的方法进行细菌长度的测定，例如本发明中进行细菌细胞长度测定的方法如下：将得到细菌细胞在光学显微镜下观察后，每种细菌随机选取三个视野，每个视野选取30个细菌进行长度测量，将三个视野一共90个细菌的长度进行平均值计算，得到细菌的平均长度。长度测量为显微软件测量，即应用奥林巴斯显微镜上的观测软件cellsensstandard对菌体纤维进行拍照，在不同的放大倍数下，拍照的图片具有不同的标尺，使用cellsensstandard软件上的测量功能，使用折线来描绘图片上的菌体纤维，在相应标尺下软件会自动统计出相应菌体纤维的长度。

现有技术人员可应用现有已知的任何测定细菌强度的方法进行细菌强度的测定，例如本发明中进行细菌强度测定的方法如下：将细菌纤维的培养溶液置于-80℃冰箱30分钟，然后置于冰干机中过夜，以形成干枯的菌体纤维。取一块干净的载玻片，在中心处滴一滴水，将上述纤维取一小块置于载玻片上的水滴中，并用镊子将纤维均匀分散在水中，置于普通光学显微镜下观察，使用精密机械操作臂伸入水溶液中，在显微镜的观察下进行纤维分离操作。机械操作臂由左右两个直径很细的长针构成，可进行nm到cm级的空间位置变化，通过操作这两个机械臂可以在水溶液中挑取长度在μm到mm级的菌体纤维，挑取的纤维会由一个机械臂移动到测量力学性能的仪器上，通常情况下菌体纤维一端附着在机械臂上，另一端悬空，让悬空的一端附着在一个竖直面上，由于纤维表面的水的张力作用，这种附着很容易进行。附着后调动机械臂让纤维和竖直面呈90°直角，然后向外移动机械臂直到纤维断裂为止，整个过程传感器可记录机械臂移动的距离即纤维的拉伸长度，以及机械臂的承载力大小，通过这两个数据计算纤维性能中的其他数据。

本发明中细胞壁含量的定量分析可通过以下方法实施，但并不局限于以下方法：1)重组菌/表达菌经离心、超声破碎、离心后可得到粗提取的细胞壁；2)使用溶菌酶处理细胞壁，使细胞壁水解成N-乙酰胞壁酸(MurNAc)和N-乙酰葡糖胺(GlcNac)二聚体；3)使用N-乙酰葡糖胺酶(N-acetylglucosaminidase)和糖基转移酶(lytictransglycosylase)使细胞壁水解成MurNAc和GlcNac单体，然后使用高效液相色谱(HPLC)对产物进行定量分析，从而确定细胞壁的增加量。

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂均购自MBIFermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

实施例1通过抑制细胞分裂基因ftsZ的表达获得长度增加的细菌细胞及细菌纤维

一、获得基因组上ftsZ基因被敲除并在质粒上回补的重组大肠杆菌。

应用PKD3质粒通过记载在如下文献中(KDaiandJLutkenhaus，ftsZisanessentialcelldivisiongeneinEscherichiacoli.J.Bacteriol.1991,173(11):3500.)中的方法可获得回补ftsZ的辅助PKD3质粒，从而获得大肠杆菌基因组ftsZ敲除系统：E.coliJKD7-1(PKD3)(公众可从清华大学获得)。回补ftsZ的辅助PKD3质粒为温敏型复制子质粒，42℃条件下不能进行复制。因此可以应用该系统在42℃培养来得到细胞分裂基因表达受限的细菌。

二、获得长度增加的细菌细胞及细菌纤维

将步骤一获得的E.coliJKD7-1(PKD3)分别在42℃和30℃温度条件下，LB培养基中静置培养，培养24h后，分别取两种温度条件下的细菌进行光学显微镜观察，在4010倍显微镜下观察到的细菌形态如图1所示。在42℃培养条件下，细菌细胞内的ftsZ回补质粒PKD3逐渐丢失，不能满足细菌分裂所需的FtsZ的量，从而使细菌变长呈纤维状，得到长度增加的细菌细胞。

实施例2通过sulA基因在大肠杆菌EscherichiacoliTrans1T1中的过量表达获得长度增加的重组细菌细胞及细菌纤维

图2为大肠杆菌细菌纤维产生示意图，具体步骤如下：

一、获得重组大肠杆菌细胞

1、包含sulA基因的载体的构建

提取大肠杆菌Trans1T1(EscherichiacoliTrans1T1)(购买于北京全式金生物技术有限公司)的基因组做为模板，以sulAF和sulAR为引物，应用pfu酶通过PCR扩增目的基因sulA。得到的PCR产物经测序证实为目的基因sulA。将上述得到的目的基因sulA片段通过酶切连接插入到载体pet28a(购买自addgene)中，得到质粒pet28asulA(图3)。

以Pet28aarasulAF和Pet28aarasulAR为引物，以ptkRED(Site-specificchromosomalintegrationoflargesyntheticconstructs."NucleicAcidsRes38(6):e92.)做为模板，应用Q5超保真2XMasterMix通过PCR扩增阿拉伯糖启动子。将扩增获得的阿拉伯糖启动子片段通过酶切连接插入到pet28asulA中，得到pet28aarasulA重组载体。将得到的pet28aarasulA重组载体通过酶切得到相应的sulA基因和阿拉伯糖启动子片段，将所述片段与载体p15a(载体图谱参见图4，公众可从清华大学获得，SEQIDNO:80)连接得到包含sulA基因和阿拉伯糖启动子片段的重组载体p15a。引物序列参见表4。

表4sulA基因过量表达载体构建使用引物

引物名称	SEQ ID NO:	引物序列
			sulAF	1	CTAAAGGATCCATGTACACTTCAGGCTATGC
sulAR	2	CTCCCAAGCTTTTTAATGATACAAATTAGAGTGAAT
			Pet28aarasulAF	3	CCCGGAAGATCTTACGATACGGGAGGGCTTAC3
Pet28aarasulAR	4	GGCCTAGCTAGCGATCAGACCGATACCTGCTTC

2、获得重组大肠杆菌细胞

将步骤1得到的重组载体p15a通过化学转化转入大肠杆菌Trans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒并测序，证实获得含有sulA基因和阿拉伯糖启动子片段的重组大肠杆菌细胞p15asulA(图5)。

二、获得细菌纤维

1、培养重组大肠杆菌细胞获得细菌纤维

在LB培养基中培养步骤一获得的重组大肠杆菌E.coliTrans1T1(p15asulA)与出发菌E.coliTrans1T1，培养2小时后加入0.2％阿拉伯糖诱导sulA基因表达，培养2小时、6小时、8小时后分别在光学显微镜下观察(图6)并测定细菌长度。

2、细菌纤维长度测定

获得细菌纤维的具体长度变化请参照表5。

表5sulA基因过量表达的大肠细菌的长度变化

	原始长度	培养2h长度	培养6h长度	培养8h长度
					重组大肠杆菌1	1.4μm	～5.6μm	～79μm	～189μm
重组大肠杆菌2	1.1μm	～4.3μm	～83μm	～269μm
					重组大肠杆菌3	1.9μm	～6.2μm	～91μm	～231μm
出发菌	1.1μm	～1.3μm	～1.5μm	～1.4μm

由表4可见，诱导后随培养时间的增加，大肠杆菌长度逐渐增加。培养8h后，长度最大为269μm，约为出发菌的200倍。

3、细菌纤维扫描电镜观察

对得到的出发菌和重组细菌纤维进行扫描电镜前处理，以进行扫描电镜观察。出发菌和重组大肠杆菌E.coliTrans1T1(p15asulA)形成的细菌纤维扫描电镜观察结果如图7所示。从图中看出，细菌呈现纤维状，比原始出发菌长度增加了百倍以上。

实施例3通过minCD基因在大肠杆菌E.coliJM109中的过量表达获得长度增加的重组大肠杆菌细胞及细菌纤维

一、获得重组大肠杆菌细胞

1、表达载体p15a-araminCD的构建

提取大肠杆菌E.coliJM109(购买于北京全式金生物技术有限公司)的基因组做为模板，PCR扩增目的基因minCD。应用采用gibson试剂盒构建载体，引物序列参见表6。获得minCD的表达载体p15a-araminCD，该质粒在阿拉伯糖启动子的诱导下调控minCD基因的表达，质粒结构图如图8所示。

表6minCD基因过量表达载体构建使用引物

引物名称	SEQ ID NO:	引物序列
			p15a+cat-F	5	TACAACTTATATCGTATGGGG
p15a+cat-R	6	CTTATTATCACTTATTCAGGCG
			AR A-F	7	CTGAATAAGTGATAATAAGTTATGACAACTTGACGGC
ARA-R	8	TCAATTAGCACAGTAGAGAGTTGCGATAAAAAG
			MINCD-F	9	CTCTACTGTGCTAATTGAGTAAGGCCAG
MINCD-R	10	CCATACGATATAAGTTGTATTATCCTCCGAACAAGCG

2、获得重组E.coliJM109细胞

将上述步骤1所得表达载体转化入E.coliJM109，获得重组E.coliJM109细胞。

二、获得细菌纤维

通过阿拉伯糖诱导，可以过表达minCD，通过光学显微镜进行实时观测，结果如图9所示，过表达minCD可以获得纤维化细菌纤维丝，诱导最长时纤维丝的平均长度可以达到50-100um左右。

实施例4通过minCD基因在盐单胞菌TD中的过量表达获得长度增加的重组盐单胞菌及细菌纤维

一、获得重组盐单胞菌细胞

1、表达载体pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD的构建

利用在盐单胞菌TD菌株中建立的IPTG诱导的LacIq-Ptrc启动子，构建过表达细胞分裂抑制因子MinCD的表达载体。载体具体构建过程如图10所示。

以TD01野生型基因组为模板，扩增minCD基因；以pSEVA434为模板，扩增LacIq-Ptrc片段；通过SOEPCR的方式得到融合产物后用XbaI，SacI酶切并连接入用同样酶切的pSEVA341载体(TheStandardEuropeanVectorArchitecture(SEVA):acoherentplatformfortheanalysisanddeploymentofcomplexprokaryoticphenotypes.Nucleicacidsresearch41,75(2013).)，然后电转化至E.coliS17-1中；其中minCD基因和LacIq-Ptrc片段的扩增引物如表7所示。

表7细胞分裂抑制因子MinCD过表达载体构建使用的引物

引物名称	SEQ ID NO:	引物序列
			trcF	11	ATCGTCTAGATTAATTAATTGACACCATCG
trcR	12	CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGTACATTATACGAGCCGGATGAT
			MinF	13	TACTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATGAGCCTCAACGCCAATAGT
MinR	14	ATCGGAGCTCTCATCGCCGACCACCCCCGAACA

注：下划线表示SOEPCR的互补重叠区，也是26bp的eSD序列。加粗表示酶切位点。

2、获得重组盐单胞菌TD

将上述步骤1获得的表达质粒接合转化入盐单胞菌TD中，得到盐单胞菌TD重组菌株HalomonasTD(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)。

将过表达MinCD的重组菌株TD(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)阳性单克隆在光学显微镜下镜检，发现为纤维丝状菌体，并相互交织成网状。

二、过表达minCD的重组菌株TD(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)在60LB培养基中静置培养获得细菌纤维

在60LB培养基中培养重组菌株TD(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)，12h后加入2mMIPTG，对照组不加IPTG，静置，37℃培养，在3h、8h、12h和24h分别取样镜检。24h的样品取1ml离心收集后进行扫描电镜观察。

3h和8h镜检基本观察不到纤维丝状的菌体，12h时加入IPTG诱导组已经开始出现变长的菌体。扫描电镜观察结果参见图11。24h后菌体纤维化已经非常明显，不加IPTG已经出现纤维化菌体，呈现较长的长杆状，说明该诱导系统存在一定程度的minCD本底表达；加入IPTG后，菌体纤维化程度较强，出现了上百微米的长丝状菌丝，相互缠绕形成网状结构，其间包裹着长杆状小菌体。由此可见诱导MinCD蛋白表达可有效地抑制细胞分裂，促进细菌纤长化，细菌停止二分裂而不断延伸，最终成为长达上百微米的菌丝。具体数据参见表8。

表8过表达minCD的重组菌株TD静止培养长度变化

三、过表达minCD的重组菌株TD(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)在60MMG培养基中振荡培养获得细菌纤维

在成分更加简单的60MMG培养基中培养重组菌株TD

(pSEVA341-LacIq-Ptrc-MinCD)，6h加入2mMIPTG，37℃振荡培养，扫描电镜观察结果参见图12，48h后同样能观察到大面积的纤维丝状菌,出现长达上百微米的菌丝，相互缠绕成网状结构。具体数据参见表9

表9过表达minCD的重组菌株TD振荡培养长度变化

单位(μm)	原始长度	培养6h长度(加IPTG前)	培养24h长度	培养48h长度
					重组盐单胞菌1	0.95	1.22	42.01	94.37
重组盐单胞菌2	1.06	2.04	39.22	88.56
					重组盐单胞菌3	1.11	1.59	51.75	87.26
出发菌	0.86	1.03	1.10	1.05

实施例5通过敲除肽聚糖水解酶基因获得长度增加的重组枯草芽孢杆菌细胞及细菌纤维

图13为枯草芽孢杆菌细菌纤维产生示意图，具体步骤如下：

一、构建枯草芽孢杆菌基因组细胞分离基因SigD，lytE，lytF，lytC，lytD敲除所需质粒

质粒载体pCU(由天津大学化工学院陈涛副教授实验室馈赠，公众可从清华大学获得)，是一种不能在枯草芽孢杆菌中复制的质粒，当载体上有同源片段时pCU质粒会通过同源片段重组整合到染色体上。应用NEB公司的Q5酶PCR扩增目的基因片段，得到的片段使用Omega胶回收试剂盒回收。质粒的构建采用NEB公司购买的GibsonMasterMix体系，取PCR纯化后的DNA片段，测出其浓度后按照相同摩尔比的比例进行混合，并保证总的摩尔数在0.02pmol～0.5pmol之间，并加入ddH₂O将体积补齐至5μl，然后加入5μl的Gibsonmastermix,置于50℃反应1h，然后进行电转化或者化学转化。获得克隆进行PCR鉴定，鉴定正确后进行测序。

以枯草芽孢杆菌基因组为模板，枯草芽孢杆菌基因组上sigD的上下游序列被克隆下连入pCU上，为pCU-sigD，lytE上下游片段及spe抗性基因被克隆并按照lytE上游片段、spe、lytE下游片段的顺序连入pCU载体，为pCU-lytE-spe质粒，lytF上下游片段及Cm抗性基因被克隆并按照lytF上游片段、Cm抗性、lytF下游片段的顺序进行构建，为pCU-lytF-Cm质粒。lytC、lytD、lytG上下游片段分别与Em抗性基因被克隆并按照上游、Em、下游的顺序连入pCU载体，分别为pCU-lytC-Em，pCU-lytD-Em，pCU-lytG-Em。cwlS基因的部分序列被克隆并构建到pDG148载体spacpromoter序列之后，lacI序列之前，将spac、cwlS、lacI这一序列克隆并连入pCU载体，并将pCU上的Cm抗性替换为Kan抗性，称之为pCU-spac-cwlS-Kan质粒。表10为敲除细胞分离基因载体构建所使用的引物。

表10敲除细胞分离基因载体构建使用的引物

二、枯草芽孢杆菌基因组细胞分离相关基因SigD，lytE，lytF，lytC，lytD的敲除及重组枯草芽孢杆菌的获得

基因敲除采用有痕敲除和无痕敲除两种方法。有痕敲除为构建带有上下1000bp左右同源臂的抗性基因的质粒，将质粒转化入枯草芽孢杆菌进行双交换并在相应抗性平板上生长，长出来的克隆相应基因处会被抗性予以替代，替代后的克隆通过PCR和抗性进行验证。无痕敲除需要构建含有待敲除基因上下游约1kb同源臂的带有抗性且不能在枯草芽孢杆菌中复制的质粒上，将这个质粒转入枯草芽孢杆菌中，在相应抗性平板上筛选出来的克隆就是同源臂中上游同源臂或下游同源进行重组整合到基因组中的克隆。然后挑取克隆置于LB培养基中，37℃200rpm培养6～24h，然后取少于100μl菌液涂布在五氟尿嘧啶培养基上。在LB培养过程中在少量菌体中，整合到基因组上的质粒会发生重组，当重组发生在和第一次重组一样的同源臂时，会产生野生型菌株，当重组发生在和第一次重组不一样的同源臂时，丢掉的质粒会将待敲除的基因带离染色体，产生敲除型菌株。因此在五氟尿嘧啶培养基上生长的克隆既有野生型也有敲除型菌株，如果待敲除的基因对菌体生长不会产生影响，那么理论上野生型和敲除型会各占一半的比例。通过PCR和测序来进行鉴定野生型和敲除型，并通过抗性负筛进行确认。

通过上述方法，对枯草芽孢杆菌基因组上与细胞分离相关的基因进行分别或同时敲除，得到了重组枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168ΔSigD，Bacillussubtilis168ΔlytE，Bacillussubtilis168ΔlytF,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytE,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔlytC,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔlytD,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔcwlS,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔlytCΔcwlS,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔlytDΔcwlS。

三、获得细菌纤维及长度测定

如步骤一、步骤二获得一系列枯草芽孢杆菌细胞分离相关基因分别或同时敲除的重组枯草芽孢杆菌，在LB培养基中培养后可以形成细菌纤维。

在37℃、转速200rpm的培养条件下培养5小时之后可以显示不同基因敲除对菌体长度的影响，以菌体长度作为衡量标准，在每一个培养时刻，每种基因型菌株被随机挑选100至200根菌体进行纤维测量，取平均值作为每个培养时刻每种基因型菌株的长度。其中SigD对菌体影响最为明显，其次是lytE，lytF效果更弱。长度增加比较结果可参见表11，光学显微镜观察图可参见图14，由结果可见，对长度影响较明显的是sigD、lytE、lytF这三个基因，并且其影响效力是按照sigD、lytE、lytF递减的。

表11细胞分离基因敲除的枯草芽孢杆菌的长度变化

单位(μm)	培养3h	培养4h	培养5h	培养6h	培养7h
						Bacillus subtilis168ΔsigD	132.43	110.74	69.24	16.32	11.65
Bacillus subtilis168ΔlytE	80.50	45.20	24.78	9.44	7.32
						Bacillus subtilis 168ΔlytF	18.31	38.75	25.15	24.13	13.72
对照菌株Bacillus subtilis 168	10.48	11.89	8.28	9.12	4.81

选择对长度影响最大的两个基因SigD和lytE做双基因敲除，sigD、lytE的双基因敲除效果参见图15，在培养5小时之后可以明显见到长度在数毫米的菌丝，很多菌丝会相互缠绕形成直径较大的菌丝并聚集成团，肉眼可见，具体参见图16a。在10倍相差显微镜下可以看到菌丝相互缠绕形成较粗的纤维，长度约为0.5mm以上，而野生型菌株则为均匀地分布在培养基中的游离的菌株。

在双基因的基础之上进一步对肽聚糖水解酶基因进行敲除，得到ΔSigDΔlytEΔlytD和ΔSigDΔlytEΔlytC三基因敲除型菌株，表型如图16b和c所示，在37℃、转速200rpm的培养条件下培养5小时之后可以在肉眼下可以明显的看到培养基中分布着长度在数毫米到一厘米的大团菌丝，与ΔSigDΔlytE的双基因敲除型相比，三基因敲除型的细菌细胞，纤维化效应、纤维化程度、长度、对震荡的抵抗力均较强。

对上述步骤二所得重组枯草芽孢杆菌进行cwlS基因的抑制表达，得到Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔcwlS,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔlytCΔcwlS,Bacillussubtilis168ΔSigDΔlytEΔlytDΔcwlS，其形成的细菌纤维的形态如图16d示。其中，ΔSigDΔlytEΔcwlS和ΔSigDΔlytEΔlytCΔcwlS菌体形成稳定的菌丝纤维，长度接近一厘米，肉眼可见，并且剧烈摇动培养瓶菌丝也不会断裂。

四、细菌纤维的力学性质测量

枯草芽孢杆菌细菌纤维长度最长能达到接近一厘米(例如168ΔsigDΔlytEΔlytD)，三基因敲除中的菌体纤维通常会有很多根缠绕成束形成很长的线性纤维，而在单基因或双基因敲除中菌体纤维通常是以单根菌体存在。因此选取双基因敲除株测量单根纤维的力学性质，选取168ΔsigDΔlytEΔlytD三基因敲除株测量多根缠绕成束的纤维的力学性质。28根双基因单根纤维被随机挑选出并进行测量，2根三基因成束纤维被随机挑选出并进行测量。

力学性质、载荷-位移曲线如图17、18和表12、表12所示

表12被挑选出细菌纤维测量后的力学性质

表13基因型为168ΔsigDΔlytE的细菌纤维的力学性质

性能参数	伸长率(％)	弹性模量(N/m²)	断裂强度(N/m²)
				菌体纤维	2.34	1.25×10⁹	2.1×10⁷

从图表中可以看出，菌体纤维直径不到0.5μm，长度最长接近1cm；单根纤维力学强度在μN量级，多根缠绕成束的纤维力学强度在mN量级。

五、细菌纤维的染色观察

对不同基因型的枯草芽孢杆菌用膜染染料FM4-64进行染色观察，染色后可以在荧光显微镜下的相应激发光下清楚地看到细胞的膜边际。实验结果如图19所示，可以看到出发菌枯草芽孢杆菌野生型中都是游离的单个菌体，而在ΔSigD和ΔlytE等基因敲除型中，菌体都呈现链状结构(chainphenotype)并呈现纤维状。

实施例6在大肠杆菌中过表达十种细胞壁合成相关基因(murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW)得到强度增加的重组细菌细胞及细菌纤维

在出发菌E.coli中通过在基因簇前插入强启动子gltA启动子，使细菌同时过表达十种细胞壁合成相关基因(murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW)。

一、获得FRT-gltA融合片段

以质粒pCOD为模板，分别带有39bp的同源臂的gltA-f和gltA-r为引物扩增gltA启动子。使用引物FRT-f和FRT-r，以质粒pKD13为模板扩增含有FRT位点以及Kana抗性的序列。再通过SOE-PCR，使用引物FRT-f和gltA-r，以如上两种PCR产物为模板，扩增FRT-gltA融合片段。

引物如下：

表14大肠杆菌过表达九种细胞壁合成基因载体构建使用的引物1

注：下划线部分为基因组上的同源序列。

二、(murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW)重组菌株的获得

根据Wanner一步敲除法(One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts)，将能表达重组酶的pKD46RecA质粒转入Trans10感受态(购买于北京全式金生物技术有限公司)中，于氨苄抗性的LB平板上涂布培养于30℃。挑取单克隆，使用氨苄抗性的LB培养基30℃培养至OD600＝0.05～0.1，加入阿拉伯糖(终浓度约为0.75％)诱导，OD600＝0.2～0.3后将细菌放入37℃培养至OD600＝0.4～0.6，制备获得电转感受态。

将上述SOE-PCR所获得的片段FRT-gltA(>100ng)转化入上述电转感受态中，电击后，37℃复苏1h，于卡纳抗性的LB固体培养基上涂布培养于37℃。次日，挑选单克隆，使用引物Up-f和Km-783r鉴定基因组已整合入目的基因片段的单菌落。挑取正确的单菌落于卡纳抗性的20mLLB液体培养基中培养至OD600＝0.6后，制成电转感受态(方法如上所述)。将质粒pCP20(Datsenko,K.,A.,Wanner,B.L.,2000.One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA,97,6640-5，公众可从清华大学获得)转入感受态中，涂布于氯霉素抗性的LB固体培养基上，30℃培养。挑取单菌落，30℃培养。提质粒进行验证。取少量菌液涂布于无抗的LB固体培养基上，42度培养24小时；

挑取单克隆，同时点无抗性平板，Amp负筛，Cm负筛。

将获得的单克隆使用引物Up-f和Down-r进行PCR验证，将PCR产物进行测序。测序结果表明，gltA启动子已成功插入到基因簇(murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW)前。获得目的重组大肠杆菌。

三、murA,murB,murC,pbpC重组质粒的构建

通过Gibson同源重组的方法，在pET28a质粒上引入gltA启动子以及murA,murB,murC,pbpC四种基因。每三个基因共用一个启动子，每两个基因之间含有一个RBS(核糖体识别位点)。

pET28a部分通过PCR获得，使用引物28a-f和28a-r。片段gltA、murA、murB、murC、pbpC分别使用表15中相应引物进行扩增。通过Gibson同源重组的方法，将pET28a以及gltA、murA、murB、murC、pbpC组装在一起(图20为重组pET28a质粒示意图)。

表15大肠杆菌过表达九种细胞壁合成基因载体构建使用的引物2

注：下划线部分为基因组上的同源序列。

四、(murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW)过表达重组菌株的获得

将步骤三得到的重组pET28a质粒通过化学转化转入大肠杆菌E.coliTop10中，得到转化子，提取转化子的质粒并测序，证实获得murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW过量表达的重组大肠杆菌细胞。

实施例7在过表达十种细胞壁合成相关基因(murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW)的重组细菌细胞中过表达细菌分裂抑制基因sulA得到长度、强度增加的细菌细胞及细菌纤维丝

将实施例6中所述最终获得的重组细菌制作成电转感受态(在20mLLB培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6,冰上预冷20min，离心弃上清。使用预冷的无菌水1mL洗一次。再使用预冷的10％无菌甘油洗涤两次，最后加入约50μl预冷的10％无菌甘油，制成电转感受态)。将重组质粒p15asulA(图5，质粒构建过程及转化过程如实施例2所述)转入上述重组细菌感受态中，获得长度、强度增加的细菌细胞。

实施例8在枯草芽孢杆菌B.subtilis中过表达九种细胞壁合成相关基因(murA,murB,murC,murD,murE,murF,murG,mraY,ddl)得到强度增加的细菌纤维丝

提取枯草芽孢杆菌B.subtilis(购买于北京全式金生物技术有限公司)的基因组做为模板，以表16所示的序列作为引物PCR扩增目的基因。

表16枯草芽孢杆菌过表达细胞壁合成基因载体构建使用的引物

注：含有下划线的部分为与pDG148质粒上的同源序列。

将获得PCR片段与酶切(SalI/SphI)后的pDG148经过GibsionAssembly连接后(片段和载体用量均为0.1pM)，通过电转感受态Trans5α转化。挑取单菌落，鉴定、测序后获得重组目的质粒(图21)。

将重组质粒转入实施例7中获得的重组枯草芽孢杆菌，所获得的枯草芽孢杆菌应用pDG148质粒通过spac启动子同时过表达九种细胞壁合成相关基因(murA,murB,murC,murD,murE,murF,murG,mraY,ddl)。每三个基因共用一个启动子，每两个基因之间含有一个RBS(核糖体识别位点)。从而获得细胞壁增厚的细菌纤维，与没有增厚细胞壁的细菌纤维相比，强度提高80％。

实施例9通过增加细胞内容物得到强度增加的重组细菌细胞及细菌纤维

将合成PHA的基因phaCAB转入到枯草芽孢杆菌中后使用bodipy485/505(购自Lifeoftechnology)进行染色并置于荧光显微镜下观察，可以看到满视野的绿色荧光，这说明菌体内积累了大量的PHA(参见图22)。

染色过程如下：

1、将枯草芽孢杆菌培养液置于冰上冰浴十分钟，4℃离心1000g离心5分钟；

2、离心后弃掉上清，用1ml的冰浴后的TSEbuffer重悬菌体，并静置10分钟；

3、4℃3000g离心5分钟；

4、弃掉上清用1ml冰浴的DDW重悬菌体；

5、加入5μl的浓度为1μg/μl的BODIPY，震荡混匀。在黑暗中静置5分钟；

6、在4℃3000g下离心5分钟并去掉上清液；

7、连续两次重复6步骤利用冰浴后的DDW对菌体进行清洗；

8、置于IX83荧光倒置显微镜下进行观察。说明表达合成PHA的基因在枯草芽孢杆菌中也适用，在纤维化的菌体内表达PHA可能会在一定程度上改变纤维的力学性能。

实施例10通过革兰氏阴性菌细胞与革兰氏阴性菌细胞共培养制备强度增加的细菌纤维的方法

重组细菌细胞得到长度增加的细菌纤维丝可能存在节点而影响纤维强度，通过将这两种细菌纤维混合培养，可以得到两种纤维相互缠绕的混合细菌细胞形成的纤维，该种细菌纤维相对于单一的革兰氏阳性或阴性细菌纤维而言，具有更高的强度，更加适用于工业应用。

实施例11通过革兰氏阳性菌细胞与蓝细菌细胞共培养制备强度增加的细菌纤维的方法

重组细菌细胞得到长度增加的细菌纤维丝可能存在节点而影响纤维强度。通过将蓝细菌纤维丝和革兰氏阳性菌细菌纤维丝如枯草芽孢杆菌纤维丝混合培养，相互缠绕得到的混合细菌细胞形成的纤维可以解决单一的细菌纤维丝因节点而强度较低的问题。

将两种细菌纤维丝缠绕形成的混合细菌纤维丝从培养液中分离并检测强度，可发现该混合细菌细胞形成的纤维丝强度远远大于单独的蓝细菌纤维丝或革兰氏阳性菌纤维丝。

实施例12通过革兰氏阴性菌细胞与蓝细菌细胞共培养制备强度增加的细菌纤维的方法

重组细菌细胞得到长度增加的细菌纤维丝，纤维丝化的革兰氏阴性菌的细菌长度相对于野生型提高了几百倍，而蓝细菌纤维丝通过抑制细菌分裂呈链状其长度可以提高几百甚至几千倍。这两种细菌纤维丝的结合可以得到混合细菌细胞形成的纤维，不但具有细菌纤维丝细长、易生产的特点，而且强度相对于这两种菌形成的单一细菌纤维丝提高了80％。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种由细菌生长所形成的纤维丝材料。

2.根据权利要求1所述的细菌纤维，其长度不小于50μm。

3.一种重组细菌细胞，其用于产生权利要求1或2所述的细菌纤维。

4.根据权利要求3所述的重组细菌细胞，其中与出发细菌相比，所述重组细菌细胞被遗传修饰使得其能够生长至增加的长度，所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

5.根据权利要求4所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞分裂被抑制。

6.根据权利要求5所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中细胞分裂基因的表达被抑制。

7.根据权利要求6所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或更多种细胞分裂基因的表达量被抑制，包括通过控制所述细胞分裂基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物，和/或所述重组细菌细胞中一种或更多种细胞分裂基因被敲除。

8.根据权利要求6所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分裂基因选自以下一种或更多种：damX，ftsA，ftsB，ftsE，ftsI，ftsL，ftsN，ftsQ，ftsW，ftsK，ftsZ，zipA，zapA，zapB，zapC和zapD。

9.根据权利要求8所述的重组细菌细胞，其中ftsZ基因的表达量被抑制。

10.根据权利要求5所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中细胞分裂抑制基因的表达水平提高。

11.根据权利要求10所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或多种细胞分裂抑制基因过量表达。

12.根据权利要求10所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分裂抑制基因选自以下一种或更多种：yneA，sulA、slmA、minC、minD、dicB。

13.根据权利要求11所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中下列基因中至少一种过量表达：sulA，minC，minD基因。

14.根据权利要求13所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中sulA基因过量表达。

15.根据权利要求13所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中minC和minD基因过量表达。

16.根据权利要求13所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中sulA、minC和minD基因过量表达。

17.根据权利要求4所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞分离被抑制。

18.根据权利要求17所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞分离基因的表达被抑制。

19.根据权利要求18所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或更多种细胞分裂基因的表达量被抑制，包括通过控制所述细胞分裂基因的调控序列使得所述重组细菌细胞表达更少量的基因产物或不表达基因产物，和/或所述重组细菌细胞中一种或更多种细胞分裂基因被敲除。

20.根据权利要求18所述的重组细菌细胞，其中所述细胞分离基因包括肽聚糖水解酶基因。

21.根据权利要求20所述的重组细菌细胞，其中所述肽聚糖水解酶基因选自以下的一种或更多种：sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS。

22.根据权利要求18所述的重组细菌细胞，其中下列基因中至少一种被敲除：sigD、lytE、lytC、lytD，cwlS的表达被抑制。

23.根据权利要求22所述的重组细菌细胞，其中sigD、lytE、lytC基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

24.根据权利要求22所述的重组细菌细胞，其中sigD、lytE、lytD基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

25.根据权利要求22所述的重组细菌细胞，其中sigD、lytE基因被敲除，cwlS的表达被抑制。

26.根据权利要求18所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的sigD、lytE、lytF、lytC、lytD、lytG、cwlS基因中的一种或更多种被敲除。

27.根据权利要求3所述的重组细菌细胞，其中与出发细菌相比，所述重组细菌细胞被遗传修饰使得其具有增加的强度，所述遗传修饰发生在细菌染色体和/或质粒上。

28.根据权利要求27所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞形成厚度增加的细胞壁。

29.根据权利要求28所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞壁合成基因的表达水平提高。

30.根据权利要求29所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的一种或更多种细胞壁合成基因过量表达。

31.根据权利要求29所述的重组细菌细胞，其中所述细胞壁合成基因包括肽聚糖合成基因。

32.根据权利要求31所述的重组细菌细胞，其中所述肽聚糖合成基因选自以下的一种或更多种：yqfP，csbB，yluB，yacM，yacN，yabH，murA，murB，murC，murD，murE，murF，murG，mraY，ddl和pbpC。

33.根据权利要求30所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞为大肠杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,pbpC,murD,murE,murF,murG,mraY,ftsW过量表达。

34.根据权利要求30所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞为枯草芽孢杆菌，所述重组细菌细胞中murA,murB,murC,murD,murE,murF,murG,mraY,ddl过量表达。

35.根据权利要求27所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞形成增加的细胞内容物。

36.根据权利要求35所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞的细胞内容物合成基因的表达水平提高。

37.根据权利要求36所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中一种或多种细胞内容物合成基因过量表达。

38.根据权利要求35所述的重组细菌细胞，其中所述细胞内容物包括聚羟基脂肪酸酯。

39.根据权利要求38所述的重组细菌细胞，其中所述重组细菌细胞中phaCAB基因过量表达。

40.根据权利要求3～39任一项所述的重组细菌细胞，其中所述细菌为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或蓝细菌。

41.一种制造细菌纤维的方法，其包括培养细菌细胞，和获得所述细菌纤维。

42.根据权利要求41所述的制造细菌纤维的方法，其中所述细菌细胞为权利要求3～39任一项所述的重组细菌细胞。

43.根据权利要求41所述的制造细菌纤维的方法，其中包括如下步骤：共培养细菌细胞，获得混合细菌细胞形成的纤维。

44.一种细菌纤维用于纺织的用途，其中所述细菌纤维为由权利要求1或2所述的细菌纤维或由权利要求41所述的方法制备而得的细菌纤维。

45.一种纺织方法，其中包括如下步骤：

获得权利要求1或2所述的细菌纤维或由权利要求41所述的方法制备而得的细菌纤维；

将细菌纤维纺为纱线；和

任选地将上述纱线或纤维织为织物。

46.一种织物，其由权利要求1或2所述的细菌纤维或由权利要求41所述的方法制备而得的细菌纤维制备。