JP7259131B2 - 発酵法で組換えタンパク質を放出する細菌株 - Google Patents

Description

本発明は、機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む細菌株に関するものであって、細菌株が機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードする追加のオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする。本発明は、さらに、組換えタンパク質及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするプラスミド、及び本発明による細菌株を用いた組換えタンパク質の発酵産生方法に関する。

組換えタンパク質は、哺乳類の細胞培養と比較して世代時間が短く、取り扱いが簡単であるため、細菌内でコスト効率よく産生することができる。広範に研究されている遺伝学及び生理学のおかげで、グラム陰性腸内細菌である大腸菌は現在、組換えタンパク質の産生に最も一般的に使用されている生命体である。特に魅力的なのは、標的タンパク質が発酵培地に高収量で正確に折りたたまれて直接放出される、大腸菌内での組換えタンパク質の産生方法である。何故ならばこれは複雑な細胞破壊及びタンパク質の折りたたみ過程を回避するからである。

組換えタンパク質の培地への放出を達成する様々な大腸菌株が文献に開示されている。これらは、外膜に永久的な欠失を持ち、そのためペリプラズムタンパク質を培地中に部分的に放出する大腸菌の突然変異体である。これは非特異的な機構である。このような「漏出性」突然変異体の例は、Ｔｏｌ－Ｐａｌ複合体に欠失を持つ株、例えば、ｔｏｌ－及びｐａｌ－欠失突然変異体である。ｔｏｌ－及びｐａｌ－欠失突然変異体は細胞－内因性ペリプラズムタンパク質を培地中に放出することが知られている。このような株は、ＥＤＴＡ、様々な界面活性剤及び抗生物質に対して極めて感受性が高く、増殖欠陥を示す（Ｃｌａｖｅｌら １９９８、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９、３５９～３６７頁、Ｃｈｅｎら ２０１４、Ｍｉｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７、３６０～３７０頁）。したがって、これらは、高細胞密度で比較的長期間にわたって培養するには、あまり適していない。

このため、永久的な欠失を持たずに培地中にタンパク質を放出できる菌株を用いることが好ましい。産生過程の特定の時点における組換えタンパク質の誘導性放出は、細菌細胞外皮に関して必須の安定性因子であるペプチドグリカン層を弱めることによって達成することができる。

ペプチドグリカン又はムレイン層は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の細胞外皮に生じ、それに強さを与える架橋高分子である。ペプチドグリカンは、直鎖として骨格を形成する、Ｎ－アセチルグルコサミンとＮ－アセチルムラミン酸の連結分子のストランドからなる。隣接するストランドのＮ－アセチルムラミン酸残基は、オリゴペプチドを介して互いに連結している（Ｓｉｌｈａｖｙら ２０１０、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｂｉｏｌ．２（５））。

ペプチドグリカン加水分解酵素はペプチドグリカン層の共有結合を切断できる酵素群である（Ｖｏｌｌｍｅｒ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．３２、２００８、２５９～２８６頁）。ペプチドグリカン加水分解酵素は、切断される結合の種類によって異なるクラスに分けられる。リゾチームも含むグリコシダーゼ（Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、溶菌性トランスグリコシラーゼ）は、Ｎ－アセチルムラミン酸単位及びＮ－アセチルグルコサミン単位から構成されるペプチドグリカン主鎖のグリコシド結合を切断する。アミダーゼ（Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）は、ペプチドグリカン骨格のＮ－アセチルムラミン酸とペプチド架橋のＬ－アラニンとの間のアミド結合を切断する。対照的にペプチダーゼ（カルボキシペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼ）はペプチド架橋内のペプチド結合を切断する。

先行技術におけるペプチドグリカン加水分解酵素の使用の既知の例は、細胞を破壊するために細菌培養物を採取した後の細胞へのリゾチームの添加である（Ｐｉｅｒｃｅら １９９７、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５８、１～１１頁）。

例えば、特許文献ＣＮ１０４７６２２８５Ｂ号では、リゾチームとペプチドグリカン結合ドメインの融合体であるＣｌｙＮが誘導的な方法で産生され、組換え的に産生された細胞質緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が細胞から培地中に放出される。

さらに既知の原理は、例えば、細胞質β－グルクロニダーゼ（Ｍｏｒｉｔａら ２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７、５７３～５７６頁）又は抗ＣＤ１８抗体断片若しくはＩＧＦ－Ｉ（ＥＰ１１２４９４１号）のような組換えタンパク質を放出するために、組換えタンパク質を産生するためのベクター及びＴ４ファージからリゾチームを産生するためのベクターを用いた大腸菌の同時形質転換である。

リゾチームの産生は細胞の溶解をもたらす。このことは、これらのアプローチには組換えタンパク質の放出が宿主細胞タンパク質及びＤＮＡなどの他の細胞内成分の放出を伴うという大きな欠点があることを意味する。これは培養上清を汚染し、この結果、特に粘度が上昇するため、後処理が困難となる。

この不利な効果は、ＣｌｙＮによるＧＦＰの放出についてＣＮ１０４７６２２８５Ｂ号に記載されており、この場合、ＣｌｙＮ産生誘導後の生細胞数は、ＣｌｙＮ産生を誘導しない培養と比較して０．２％に低下する。細胞溶解のために、ＣｌｙＮを発現する大腸菌培養の光学濃度は、ＣｌｙＮ産生の開始前の値の約３分の２低下する。これは３０分以内である。５時間後、ＣｌｙＮを発現する培養の光学濃度は、ＣｌｙＮ産生のない比較培養の光学濃度の約２０％に過ぎない。ＭｏｒｉｔａらのＴ４ファージリゾチームによるβ－グルクロニダーゼの放出は、培養の光学濃度が有意に低いことと関連している。

同じ不利な効果が、抗ＣＤ１８抗体断片の放出についてＥＰ１１２４９４１号で報告されており、ここでは、Ｔ４－ファージリゾチームの過剰産生が、最大値の３０％まで細胞密度の減少を導いた。Ｔ４－ファージリゾチームによるＩＧＦ－Ｉの放出の場合、溶解による細胞密度の急激な減少が同様に観察され、顕微鏡解析では無傷の細胞はわずかであることが明らかになった。

中国特許第１０４７６２２８５号明細書 欧州特許第１１２４９４１号明細書

Ｃｌａｖｅｌら １９９８、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９、３５９～３６７頁 Ｃｈｅｎら ２０１４、Ｍｉｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７、３６０～３７０頁 Ｓｉｌｈａｖｙら ２０１０、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｂｉｏｌ．２（５） Ｖｏｌｌｍｅｒ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．３２、２００８、２５９～２８６頁 Ｐｉｅｒｃｅら １９９７、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５８、１～１１頁 Ｍｏｒｉｔａら ２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１７、５７３～５７６頁

本発明の目的は、野生型宿主細胞と比較して、強い細胞溶解の発生なしに、収量を増加させて組換えタンパク質を培地中に放出する細菌株を提供することである。

この目的は、機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む細菌株であって、機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードする追加のオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする細菌株によって達成される。

細菌株は、好ましくは、細菌株がグラム陰性細菌、特に好ましくは腸内細菌属の細菌株、特に好ましくは大腸菌種の株であることを特徴とする。

野生型遺伝子とは、進化によって自然に生じ、野生型細菌ゲノムに存在する遺伝子の形態を指す。

遺伝子は前駆体タンパク質を発現し、これはシグナル配列に対するアミノ酸配列を含むタンパク質全体のアミノ酸配列を含み、翻訳後修飾を持たない。

「成熟タンパク質」という用語は、シグナル配列を除去し、かつ任意の翻訳後修飾が存在するタンパク質全体のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。このような翻訳後修飾は、例えば、膜アンカーによる修飾である。

本発明の文脈において、完全長タンパク質という用語は成熟タンパク質を指す。

本発明によれば、細菌株に含まれる追加のオープンリーディングフレームは、シグナルペプチド及びペプチドグリカン加水分解酵素の１つであるペプチドグリカンペプチダーゼをコードする。以下において、「ペプチドグリカンペプチダーゼ」という用語は、常に、その成熟型、すなわち、シグナルペプチドが切り離された後に、前記追加のＯＲＦによって発現される追加のタンパク質を意味し、細菌野生型ゲノムに存在し、かつ発現される遺伝子によってコードされるタンパク質を意味しない。大腸菌のペプチドグリカンペプチダーゼをコードする遺伝子の例は、ｓｐｒ、ｙｄｈＯ、ｙｅｂＡ、ｄａｃＡ、ｄａｃＣ、ｄａｃＤ、ｙｆｅＷ、ｐｂｐＧ、ｍｅｐＡ、ｄａｃＢ、ａｍｐＨ及びｌｄｃＡである。

１. 好ましい実施形態では、追加のＯＲＦによってコードされるペプチドグリカンペプチダーゼは、指定されたデータベースエントリーから既知のアミノ酸配列を有する、Ｓｐｒ（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０ＡＦＶ４）、ＹｄｈＯ（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ７６１９０）、ＹｅｂＡ（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０ＡＦＳ９）、ＭｅｐＡ（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０Ｃ０Ｔ５）、ＤａｃＢ（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ２４２２８）又はＰＢＰ７（ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０ＡＦＩ５）などのペプチド側鎖のＤ－アラニンとメソ－ジアミノピメリン酸との間の結合を切断する野生型完全長タンパク質であり、
２. 代替的に好ましい実施形態では、追加のＯＲＦによってコードされるペプチドグリカンペプチダーゼは、対応する野生型完全長タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する野生型完全長タンパク質の変異型であり、
３． 追加のＯＲＦによってコードされるペプチドグリカンペプチダーゼは、野生型完全長タンパク質の断片であり、
４． さらに好ましい実施形態では、追加のＯＲＦによってコードされるペプチドグリカンペプチダーゼは、野生型完全長タンパク質の対応する断片のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する野生型タンパク質の断片の変異型であり、
ここで、１～４の全ての場合において、追加のＯＲＦによってコードされ、ペプチドグリカンペプチダーゼとして選択されるタンパク質は、ペプチドグリカンペプチダーゼ活性を有する。この活性をどのように検出できるかについての方法は、文献から当業者に知られている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｌｅｉｚａら ２０１１、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９３、６８８７～９４頁）。

例えば、項目２及び項目４の下で記載されたアミノ酸レベルでの突然変異は、ペプチドグリカンペプチダーゼの野生型完全長タンパク質又はその断片と比較して、置換、欠失及び／又は挿入であり得る。

ペプチドグリカンペプチダーゼの例は、Ｓｐｒ及びＹｄｈＯであり、これは、細菌のペプチドグリカン層のペプチド架橋におけるＤ－アラニンとメソ－ジアミノピメリン酸との間の結合を切断し（Ｓｉｎｇｈら、２０１２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８６、１０３６～１０５１頁）、したがって、既存のペプチドグリカンネットワークへの新しいストランドの取り込み、ひいては細胞成長を可能にする。

大腸菌由来のｓｐｒ遺伝子は、１８８個のアミノ酸を有するＳｐｒタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０ＡＦＶ４）をコードし、アミノ酸１～２６は細胞質ゾルからペリプラズムへ輸送するためのシグナル配列を形成する。成熟Ｓｐｒタンパク質では、シグナル配列がタンパク質分解的に切り離され、さらに成熟タンパク質の１位（全配列の２７位）のシステイン残基が膜アンカーで修飾され、それを介してＳｐｒタンパク質が外膜に固定される。したがって、成熟Ｓｐｒタンパク質は１６２個のアミノ酸からなり、本発明の文脈ではＳｐｒ完全長タンパク質と呼ばれる。

ｙｄｈＯ遺伝子は２７１個のアミノ酸を有するＹｄｈＯタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ７６１９０）をコードする。アミノ酸１～２７はペリプラズム排出シグナルペプチドであると予測される。したがって、成熟ＹｄｈＯタンパク質は２４４個のアミノ酸からなり、本発明の文脈において、ＹｄｈＯ完全長タンパク質と呼ばれる。

Ｓｐｒ前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号４に特定されており、ＹｄｈＯ前駆体タンパク質をコードするＤＮＡ配列は配列番号６に特定されている。Ｓｐｒ前駆体タンパク質のアミノ酸配列は配列番号５に特定されており、アミノ酸１～２６はシグナル配列を形成し、アミノ酸２７～１８８は成熟Ｓｐｒタンパク質（Ｓｐｒ完全長タンパク質と等しい）を形成する。ＹｄｈＯ前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７に特定されており、アミノ酸１～２７はシグナル配列を形成し、アミノ酸２８～２７１は成熟ＹｄｈＯタンパク質（ＹｄｈＯ完全長タンパク質と等しい）を形成する。

好ましくは、ペプチドグリカンペプチダーゼは、（ｉ）Ｓｐｒ、（ｉｉ）ＹｄｈＯ又は（ｉｉｉ）Ｓｐｒ及びＹｄｈＯである。前記Ｓｐｒ及びＹｄｈＯは、データベース配列においてそれぞれ特定される野生型完全長タンパク質、野生型完全長タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する野生型完全長タンパク質の突然変異型、野生型完全長タンパク質の断片、又は野生型完全長タンパク質の断片のアミノ酸配列に対し少なくとも３０％、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する野生型完全長タンパク質の断片の突然変異型であり、ここで選択されるタンパク質はムレインＤＤ－エンドペプチダーゼ活性を有する。特に好ましくは、Ｓｐｒが配列番号５のアミノ酸２７～１８８によって特定される配列であり、ＹｄｈＯは配列番号７のアミノ酸２８～２７１によって特定される配列である。

ペプチドグリカンペプチダーゼがＳｐｒである好ましい実施形態では、Ｓｐｒタンパク質が外膜と相互作用することが特に好ましい。

本発明によるペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＤＮＡ配列は、好ましくは大腸菌に由来するＤＮＡ配列である。

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンと終止コドンとの間にあり、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのその領域を指す。ＯＲＦはコード領域とも呼ばれる。

ＯＲＦは非コード領域に囲まれる。遺伝子は、生物学的に活性なＲＮＡを産生するためのすべての基本情報を含むＤＮＡ断片を指す。遺伝子には、転写によってそれから一本鎖ＲＮＡの複製が作られるＤＮＡ断片と、この複製方法の調節にかかわる発現シグナルが含まれる。発現シグナルは、例えば、少なくともプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位及びリボソーム結合部位を含む。さらに、ターミネーターと１つ以上のオペレーターが発現シグナルとして可能である。

機能性プロモーターの場合、前記プロモーターの調節下にあるＯＲＦはＲＮＡに転写される。

モノシストロン性とは、１つのオープンリーディングフレームのみを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を指す。

オペロンは、複数のＯＲＦ、プロモーター、及び場合によってはさらなる発現シグナルを含むＤＮＡの機能単位である。

細菌株は、（１）シグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードする１つのＯＲＦ、（２）同一のシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードする複数のＯＲＦ、又は（３）それぞれの場合に異なるシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードする複数のＯＲＦを含むことができる。第２の可能性は、例えば、組換えタンパク質の発現及び収量を増加させるために用いられ、第３の可能性は、複数のポリペプチド（サブユニット）から構成されるタンパク質の発現において特に用いられる。１つの例は、抗体断片の発現であり、これはその後、細胞質から輸送された後に集められる。

これらのＯＲＦの各々は別々の遺伝子にあり得る。複数のＯＲＦがオペロンで組織化されること、すなわち共通の発現シグナルによって調節されることも可能である。

組換えタンパク質が複数のポリペプチド鎖（サブユニット）から構成される場合には、それぞれシグナルペプチドに連結された個々のペプチド鎖（サブユニット）のＯＲＦがオペロン内で組織化されることが好ましい。

各オペロンはまた、シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードする１つのＯＲＦを含むことができる。

シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦは、モノシストロン性メッセンジャーＲＮＡとして転写されることが好ましい。これはペプチドグリカンペプチダーゼがそれ自身の別々の遺伝子によって発現されることを意味する。ペプチドグリカンペプチダーゼがＳｐｒ又はＹｄｈＯである好ましい実施形態では、対応する遺伝子はｓｐｒ遺伝子又はｙｄｈＯ遺伝子と呼ばれる。

シグナルペプチド（複数可）及び組換えタンパク質（複数可）、並びにシグナルペプチド（複数可）及びペプチドグリカンペプチダーゼ（複数可）をコードするＯＲＦ（複数可）は、染色体上又はプラスミドによって発現させることができる。別々の遺伝子の場合には、それらは複製起点及び選択マーカーに関して、互いに適合する別々のプラスミドによって発現させることもできる。ＯＲＦはプラスミドにコードされることが好ましい。

ペプチドグリカンペプチダーゼをコードする本発明によるＯＲＦのＤＮＡ配列の起点は、対応するペプチドグリカンペプチダーゼが組換えタンパク質の産生のために使用される細菌株において機能的である、すなわち、ムレインＤＤ－エンドペプチダーゼ活性を有する（上述参照）限り、組換えタンパク質の産生のために使用される細菌株に限定されない。好ましくは、ペプチドグリカンペプチダーゼタンパク質をコードするＯＲＦの配列は、組換えタンパク質の産生にも使用される同じ生命体に由来するＤＮＡ配列である。

本発明の文脈において単数形で使用される「シグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードする１つの／そのＯＲＦ」及び「１つの／その組換えタンパク質」という用語は、それぞれシグナルペプチドによって導かれる複数のＯＲＦ及び／又は複数の異なる組換えタンパク質を意味することもできる。好ましくは、１～３種類の異なる組換えタンパク質、特に好ましくは１種類の組換えタンパク質又は２種類の異なる組換えタンパク質が関与する。細菌内での組換えタンパク質のクローニング及び発現は、先行技術に記載されているように達成される。組換えタンパク質は、例えば、ペリプラズムに輸送するためのシグナル配列を有する。

組換えタンパク質は、野生型細菌ゲノムが自然には全く発現しないか、又は異なる量で発現するタンパク質である。細菌は、本発明によれば、組換えタンパク質の産生に役立ち、該タンパク質は培地中に放出される。

発酵法における本発明の細菌株の使用は、該細菌株が、組換えタンパク質と共に付加的タンパク質としてペプチドグリカンペプチダーゼを発現するという利点を有する。「追加の」という用語は、ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするさらなる又は「追加の」オープンリーディングフレームが、細菌株中の野生型遺伝子に加えて存在するという事実を指す。ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするこの追加のオープンリーディングフレームは、プラスミド上に位置することが好ましい。

そのシグナル配列のために、ペプチドグリカンペプチダーゼはペリプラズムに局在し、ペプチド架橋の切断の結果としてペプチドグリカン層の不安定化をもたらす。細菌の細胞外皮の不安定化にもかかわらず、細胞溶解の増加は観察されず、実験では、組換えタンパク質とペプチドグリカンペプチダーゼを発現する細菌株の細胞乾燥重量は、組換えタンパク質のみを発現する細菌株と比較して同じままであった。細菌の細胞外被が不安定化した結果、組換えタンパク質が細胞のペリプラズムから放出され、収量を増加させて培養上清から単離できる。このようにして、細菌細胞の大幅な死滅の発生なしに、先行技術と比較して、培養上清において生成物収量の増加を達成することが可能である。

収量の増加は、本発明による細菌株を使用して、組換えタンパク質について同じ遺伝子を含む野生型細菌株を用いて先行技術に従って産生できるものと比較して、好ましくは少なくとも１１０％、特に好ましくは少なくとも１５０％、特に好ましくは少なくとも２００％の量の組換えタンパク質が培地中に放出されることを意味すると理解すべきである。このことは、培地中に放出される組換えタンパク質の収量が、ペプチドグリカンペプチダーゼの過剰生産を持たない対応する細菌株で達成できる収量の少なくとも１．１倍、特に好ましくは少なくとも１．５倍、特に好ましくは少なくとも２倍であることを意味する。

本発明では、ＣＧＴａｓｅを組換えタンパク質の例として用いた。実施例１におけるＣＧＴａｓｅ収量の比較から、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ細菌株を用いた場合にＵ／ｍｌで測定されるＣＧＴａｓｅの収量は、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ細菌株と比較してほぼ１０倍増加することが示される（表１参照）。Ｓｐｒタンパク質の追加産生の結果、対照株と比較して細胞乾燥重量（ＣＤＷ）も生細胞数も減少しなかった。

Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－ＹｄｈＯ株は、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ細菌株を含む対照バッチと比較して、細胞乾燥重量に実質的な影響を及ぼすことなく、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ株とほぼ同じＣＧＴａｓｅ収量を達成した（表２参照）。

また、組換えタンパク質としてのＦａｂ抗体断片、この場合ＣＤ１５４ Ｆａｂ断片の産生に関しては、実施例２では、ペプチドグリカンペプチダーゼＳｐｒを発現するＷ３１１０／ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４－Ｓｐｒ株を用いて、Ｗ３１１０／ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４株と比較して組換えタンパク質のかなり高い、この場合２００倍高い収量を達成することができることが確認された（表３）。同時に、細胞乾燥重量はわずかに減少したのみであった（表４）。

ＯＤ_６００とは、６００ｎｍの分光光度計を用いて測定した細胞培養物の光学濃度を指し、体積単位当たりの細胞量（細胞濃度、細胞密度）の尺度である。これは、次に細胞分裂活性の尺度及び細胞溶解の尺度であり、細胞溶解は細胞密度の減少につながる。

ＣＮ１０４７６２２８５Ｂ号は、図２とは対照的に、ＯＤ６００値、すなわち細胞密度が、激しい細胞溶解を暗示するＣｌｙＮの発現の誘導後に実質的に低下することを示す。

激しい細胞溶解は宿主細胞タンパク質の放出につながるので、組換えタンパク質は宿主細胞タンパク質で汚染される。さらに、ＤＮＡが放出されると培地中の粘度が上昇し、さらなる後処理がより困難になる。本発明による細菌株は、細胞溶解速度の上昇を示さないので、組換えタンパク質の産生のための該株の使用は、組換えタンパク質が宿主細胞タンパク質で汚染されないことを意味する。このことは、実施例１（図５）におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥによる培養上清のタンパク質含有量の分析によって確認され、この分析は、本発明による細菌株を用いた場合に、宿主細胞タンパク質による組換えタンパク質の重度の汚染が生じなかったことを示す。さらに発現したペプチドグリカンペプチダーゼは、放出の増加も示さなかった。

組換えタンパク質の培地中への放出を達成するためには、組換えタンパク質及び前駆体ペプチドグリカンペプチダーゼの両方が、細胞質ゾルでのタンパク質生合成後にペリプラズムに輸送される必要がある。ペリプラズムへの輸送には、組換えタンパク質のコードＤＮＡ配列の５’末端と、ペプチドグリカンペプチダーゼのコードＤＮＡ配列の５’末端をフレームでタンパク質排出用のシグナル配列の３’末端と連結する必要がある。この目的に適しているのは、原理的には、使用した細菌株中でＳｅｃ又はＴａｔ装置を用いて、標的タンパク質の転座を可能にする全てのシグナル配列である。様々なシグナル配列が先行技術に記載されており、例えば、以下の遺伝子のシグナル配列が記載されている。すなわち、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、ブドウ球菌タンパク質Ａ、ＳｔＩＩ及びその他（Ｃｈｏｉ及びＬｅｅ ２００４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４、６２５～６３５頁）。組換えタンパク質に関して本発明に従って好ましいのは、大腸菌のｐｈｏＡ遺伝子又はｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列、又は肺炎桿菌Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（α－ＣＧＴａｓｅ）のシグナル配列、又は配列番号１及び３としてＵＳ２００８／００７６１５７号に開示されているそれらに由来するシグナル配列である。ペプチドグリカンペプチダーゼは、好ましくは、その前駆体形態中に、問題のタンパク質を原産とするシグナル配列を持つ。ペプチドグリカンペプチダーゼがＳｐｒ又はＹｄｈＯである好ましい実施形態では、問題のペプチドグリカンペプチダーゼの前駆体形態は、それぞれ配列番号５及び７に特定された配列である。組換えタンパク質及びペプチドグリカンペプチダーゼは、好ましくは、異なるシグナル配列、すなわちタンパク質排出をもたらす２つのシグナル配列を有する。

ペプチドグリカンペプチダーゼ及び組換えタンパク質をコードするＯＲＦの発現は、１つのプロモーター、２つの同一のプロモーター、又は２つの異なるプロモーターによって制御することができる。ペプチドグリカンペプチダーゼ及び組換えタンパク質のＯＲＦは、２つの異なるプロモーターの制御下にあることが好ましい。

ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＤＮＡセグメントは、まず、プライマーとしてオリゴヌクレオチド、及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＤＮＡ鋳型、例えば大腸菌から単離されたゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ法によって増幅することができ、次いで、通常の分子生物学的技術を使用して、いずれの場合もシグナルペプチドの配列を含むＤＮＡ分子と連結され、フレーム内融合が形成されるように類似の様式で生成される。あるいは、遺伝子合成によってＤＮＡ分子全体を作ることも可能である。次いで、問題のシグナル配列及び成熟タンパク質のコード配列からなる前記ＤＮＡ分子を、ベクター、例えば、プラスミドに導入するか、又は既知の方法によって細菌株の染色体に直接組み込むことができる。好ましくは、ＤＮＡ分子は、例えば、ｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫ２２３－３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ－ＩＢＡｐ３又はｐＥＴのような既知の発現ベクターの誘導体のようなプラスミドに導入される。当業者によって知られている方法（形質転換）を用いて、プラスミドを細菌細胞に導入する。

使用するプラスミドは選択マーカーを有することができる。選択マーカーとして適切なのは、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はその他のような抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。好ましくは、プラスミドは遺伝子を含み、その発現がテトラサイクリン耐性を媒介する。さらに、選択マーカーとして適切なのは、プラスミドを含む問題の細菌株において欠失している必須遺伝子をコードする栄養要求性マーカーである。もし２つのプラスミドが細胞内に形質転換される場合、２つの異なる抗生物質耐性、１つの抗生物質耐性及び１つの栄養要求性マーカー、又は２つの異なる栄養要求性マーカーを用いて、両方のプラスミドの存在を選択することが好ましい。

プロモーターとして適切なものは、例えば、ＧＡＰＤＨプロモーターなどの構成的プロモーター、又はｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ラムダＰＬ、ａｒａ、ｃｕｍａｔｅ又はｔｅｔプロモーターなどの誘導性プロモーター又はそれらから誘導される配列のような、当業者に知られた全てのプロモーターである。組換えタンパク質をコードするＯＲＦとペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦは、プロモーターによってオペロンとして制御することも、異なるプロモーターの制御下にあることもできる。好ましくは、ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするオープンリーディングフレームの発現を制御する機能性プロモーターは、誘導性プロモーターである。

好ましくは、組換えタンパク質をコードするＯＲＦ及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦは、異なる誘導性プロモーターによって制御される。特に好ましくは、組換えタンパク質をｔａｃプロモーターの制御下で発現させ、ペプチドグリカンペプチダーゼをａｒａ（アラビノース）プロモーターの制御下で発現させる。

好ましくは、組換えタンパク質は異種タンパク質である。異種タンパク質は、細菌株、好ましくは大腸菌Ｋ１２株のプロテオーム、すなわちタンパク質の全天然組に属さないタンパク質を意味すると理解すべきである。例えば、大腸菌Ｋ１２株において用いられる細菌株において自然に存在する全てのタンパク質は、既知のゲノム配列から誘導することができる（例えば、大腸菌Ｋ１２についてはアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３の下でＧｅｎｂａｎｋエントリーから）。

異種タンパク質として特に好ましいのは、１つ以上のジスルフィド結合を含む真核生物タンパク質である。特に好ましいのは、その機能型で二量体又は多量体として存在する真核生物のタンパク質である。

最も重要な異種タンパク質クラスは、抗体及びその断片、サイトカイン、成長因子、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホルモン、リポカリン、アンチカリン、酵素、結合タンパク質並びにそれに由来する分子足場及びタンパク質を含む。前記タンパク質クラスの例は、とりわけ、重鎖抗体及びその断片（例、ナノボディ）、一本鎖抗体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、白血病阻害剤、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、肝細胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、血管新生阻害剤、組織プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、トリプシン阻害剤、エラスターゼ阻害剤、補体成分、低酸素誘導ストレスタンパク質、がん原遺伝子性産物、転写因子、ウイルス構成タンパク質、プロインスリン、プロウロキナーゼ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ニューロトロフィン、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキサイドディスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、リポコルチン、レプチン（ｒｅｐｔｉｎ）、血清アルブミン、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、ＣＮＴＦ及びシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼである。

分子足場に由来するタンパク質の例は、特に、エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｙ）（ＣＴＬＡ－４に由来）、アフィボディ（黄色ブドウ球菌のタンパク質Ａ）、アビマー（ヒトＡドメインファミリーの）、トランスボディ（トランスフェリンの）、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンキリン反復タンパク質の）、アドネクチン（フィブロネクチンＩＩＩの）、ペプチドアプタマー（チオレドキシンの）、ミクロボディ（微小タンパク質の）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（ユビキチンの）、α－クリスタリン、カリブドトキシン、テトラネクチン、ＲＡＳ結合タンパク質ＡＦ－６のＰＤＺドメイン、タンパク質阻害剤のクニッツ型ドメインである。

本発明の文脈において、使用される可能性のある選択マーカーは、組換えタンパク質をコードする遺伝子であるとは考えられない。「選択マーカー」という用語は、成功した遺伝子修飾を有する個体を識別することができるように、「目的の遺伝子」、すなわち、実際に所望され、組換えタンパク質をコードする遺伝子とともに、マーカーとして修飾された生命体に導入される遺伝子を指す。一般に使用される選択マーカーは、抗生物質耐性又は栄養要求性である。マーカーの遺伝子は、ある条件下での生存優位性を細胞又は生命体に提供し、この例は、細胞のマーカー遺伝子としてのアンピシリン耐性遺伝子によるβ－ラクタマーゼの発現が、アンピシリン含有培地中での生存を可能にすることである。対照的に、組換えタンパク質は細菌株を用いて産生され、ある培養期間後に単離される。

本発明は、さらに、機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むプラスミドを提供し、該プラスミドは、さらに、機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする。

本発明による細菌株について言及される好ましい及び特に好ましい特徴は、本発明によるプラスミドにおいて言及される特徴にも当てはまり、ここで、本発明による細菌株について言及される好ましい及び特に好ましい実施形態は、プラスミドにおいてもそれぞれ好ましいか、又は特に好ましい。細菌株に存在し、シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードする遺伝子について言及されている「追加の」ＯＲＦについて言及され、組換えタンパク質をコードする遺伝子について言及されている全ての好ましい特徴は、シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするこのＯＲＦ及び組換えタンパク質をコードする遺伝子にも当てはまる。

同様に、上記の定義及び好ましい実施形態は、シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦ、及びシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードするＯＲＦに当てはまる。

例えば、１つ以上のシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードする１つ以上のＯＲＦは、１つのオペロンにあり得る。好ましくは、シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦは、別個の遺伝子にある。これは、ペプチドグリカンペプチダーゼ及び組換えタンパク質が互いに独立して発現できることを意味する。組換えタンパク質（複数可）のプロモーター（複数可）が、ペプチドグリカンペプチダーゼのプロモーターとは異なり、かつ異なる誘導性である特に好ましい場合には、プラスミドは、該プラスミドによる細菌の形質転換の際に、互いに独立してタンパク質の発現のための最適な時点を選択することが可能であるという特別な利点を有する。

好ましくは、プラスミドは、ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＤＮＡがｓｐｒ及びｙｄｈＯ遺伝子群から選択される遺伝子であることを特徴とする。上記の定義が適用される。この好ましい実施態様において、ペプチドグリカンペプチダーゼのＤＮＡ配列は、配列番号４及び／又は６であり、すなわち、プラスミドはＳｐｒ及び／又はＹｄｈＯ前駆体タンパク質をコードする、すなわち、プラスミドは、それぞれの成熟タンパク質及びそれぞれのシグナルペプチドのアミノ酸配列をコードする。特に好ましくは、プラスミドは、ペプチドグリカンペプチダーゼが配列番号４であることを特徴とする。別の選択として、プラスミドは、ペプチドグリカンペプチダーゼが配列番号６であることを特徴とする。

好ましくは、プラスミドは、シグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするオープンリーディングフレームの発現を制御する機能性プロモーターが誘導性プロモーターであることを特徴とする。

誘導性プロモーターの例及び好ましい実施形態については、上述したものが当てはまる。

当業者に知られた方法を用いて細菌株に本発明によるプラスミドを導入し、該プラスミドにより組換えタンパク質及びペプチドグリカンペプチダーゼを発現させると、細菌株の細胞からの組換えタンパク質の放出が改善され、収量を増加させて組換えタンパク質を単離できるという利点がある。

組換えタンパク質及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦの染色体組込みと比較すると、プラスミドを使用する利点は、細菌株のプラスミド保有細胞が選択の利点を有し、標準的な方法によって選択できることである。

さらに、プラスミドが細菌株の細胞内に高い複製数で存在できることは特に有利である。

本発明はさらに、本発明による細菌株を発酵培地で培養し、発酵後に発酵培地を細胞から取り出し、発酵培地から組換えタンパク質を単離することを特徴とする、組換えタンパク質の発酵産生方法を提供する。

染色体組込みによって、又は１つ又は２つの発現プラスミドを用いて形質転換された細菌株の細胞は、振盪フラスコ又はバイオリアクター（発酵器）内で当業者に知られた通常の方法によって培養される。

発酵培地（増殖培地、培地）としての可能性は、原則として、細菌を培養するために当業者に知られている全ての通常の培地である。この関連では、例えば、ペプトン、トリプトン、酵母エキス、糖蜜又はコーンスティープリカーなどの特定の割合の複合成分を添加した複合培地又は最小塩培地を用いることが可能である。さらに、細胞増殖を改善するビタミン、塩、アミノ酸及び微量元素のようなさらなる成分を培地に添加することが可能である。

発酵は、通常のバイオリアクター、例えば、撹拌槽、気泡カラム発酵槽又はエアリフト発酵槽で行うことが好ましい。撹拌槽発酵槽が特に好ましい。

発酵は、例えば、栄養飼料、酸素分圧、ｐＨ及び培養物の温度のような様々なパラメータの継続的な監視及び正確な制御を用いて増殖培地において、タンパク質産生株の細胞を培養することを含む。培養期間は２４～６５時間が好ましい。

発酵に使用される主要炭素源は、原則として、細胞によって利用可能な全ての糖、糖アルコール又は有機酸又はその塩であり得る。これに関連して、グルコース、ラクトース、アラビノース又はグリセロールを使用することが好ましい。グルコース及びアラビノースが特に好ましい。また、複数の異なる炭素源を組み合わせて給餌することも可能である。同時に、発酵開始時には最初に炭素源を発酵培地中に完全に加えることができる。あるいは、開始時には炭素源を全く加えないか、あるいは炭素源の一部だけを最初に加えて、発酵の過程にわたって炭素源を供給する。この関連において特に好ましいのは、炭素源の一部を最初に加え、一部を供給する１つの実施形態である。特に好ましくは、炭素源グルコースを最初１０～３０ｇ／ｌの濃度で加え、発酵の過程で濃度が５ｇ／ｌ未満に低下したときに供給が開始され、濃度が５ｇ／ｌ未満に保たれるように構成される。

組換えタンパク質及び／又はペプチドグリカンペプチダーゼの発現が誘導性プロモーターによって制御される場合、その発現は、発酵バッチへのプロモーター対応誘導物質の添加によって誘導される。誘導物質として適切なものは、例えば、アラビノース、ラクトース、ＩＰＴＧ、テトラサイクリン又はｃｕｍａｔｅである。誘導物質は、発酵中の任意の所望の時点において、単回又は反復投与として計量供給することができる。あるいは、誘導物質を連続的に加えることもできる。好ましくは、組換えタンパク質の発現はＩＰＴＧの添加によって誘導され、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現はアラビノースの添加によって誘導される。特に好ましくは、ＩＰＴＧは単回投与として計量供給される。ペプチドグリカンペプチダーゼの発現の誘導は、好ましくは、グルコース濃度が５ｇ／ｌ未満に低下した後の時点でグルコース及びアラビノースの混合物が供給されるように、又はアラビノースが単回用量として計量供給されるように構成される。

ペプチドグリカンペプチダーゼの発現は、細胞分裂がわずか数回からそれ以上ない培養相、すなわち成長曲線の定常期の直前又は開始時に誘導されることが好ましい。この時点は、わずかな上昇のみを示すか、又はまったく上昇を示さなくなった細胞密度によって決定され、この細胞密度はＯＤ_６００値又はＣＤＷ値（後述参照）として決定される。

好ましくは、発酵槽中の培地を接種前に撹拌し、滅菌圧縮空気でスパージする。これとの関連において、酸素含有率を１００％飽和に校正し、発酵中のＯ_２飽和の目標値を選択し、これは１０％～７０％の間、好ましくは２０％～６０％の間であり、特に好ましくはこの値の３０％である。Ｏ_２飽和度が目標値を下回った後、Ｏ_２飽和度を目標値に戻すために調節カスケードが始まり、ガス供給及び撹拌速度を調節することが可能となる。

培養物のｐＨはｐＨ６～ｐＨ８の間が好ましい。好ましくは、ｐＨは６．５～７．５の間に設定され、特に好ましくは、培養物のｐＨは６．８～７．２の間に保持される。

培養物の温度は１５～４５℃の間が好ましい。２０～４０℃の間の温度範囲が好ましく、２５～３５℃の温度範囲が特に好ましく、３０℃の温度に非常に特に好ましい。

本発明によれば、発酵培地は発酵後に細胞から取り出され、組換えタンパク質は発酵培地から単離される。これは、先行技術で知られているように、慣用の方法によって行うことができる。慣例的には、細胞は、第一段階において、遠心分離又は濾過のような分離方法によって、培地中に放出された組換えタンパク質から取り出される。その後、組換えタンパク質は、例えば、限外濾過によって濃縮され得る。

ペプチドグリカンペプチダーゼの発現は、培養上清中への組換えタンパク質の放出を改善する。放出が改善された結果、収量を増加させて組換えタンパク質を単離することができる。

「収量増加」という用語については、上記の定義を適用する。

細菌株、好ましくは大腸菌におけるペプチドグリカンペプチダーゼの同時発現を用いて、細胞外でＦａｂ抗体断片を作製することも可能である。この場合、細菌細胞は、抗体のドメインＶＬ及びＣＬを含む軽鎖と、ドメインＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖の対応する断片を同時に合成し、ペリプラズムにそれらを分泌しなければならない。その後、細胞質の外側でこれら２本の鎖が集まって機能性Ｆａｂ断片が形成される。対応するＯＲＦは異なる遺伝子に存在する可能性がある。軽鎖及び重鎖の抗体断片をコードするＯＲＦは、オペロン内で組織化されることが好ましい。本発明によるペプチドグリカンペプチダーゼの同時産生の結果として、抗体の重鎖及び軽鎖は、高濃度で発酵培地中に放出される。

この方法には、長い培養期間を必要とする組換えタンパク質の産生及び＞４０ｇ／ｌの高い細胞密度での発酵に適しているという大きな利点がある。その結果、組換えタンパク質として複雑な真核生物タンパク質を産生することが可能になる。

好ましくは、この方法は、組換えタンパク質が、発酵培地の取り出し後に発酵培地から精製されることを特徴とする。

組換えタンパク質は、沈殿又はクロマトグラフィーのような標準的な方法によりさらに精製することができる。ここでは、タンパク質の既に正しく折りたたまれた野生型のコンホメーションを利用するアフィニティークロマトグラフィーのような方法が特に好ましい。

好ましくは、この方法は、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現が誘導されることを特徴とする。これは、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現のみ、又は組換えタンパク質の発現及びペプチドグリカンペプチダーゼの発現のいずれかが誘導されることを意味する。これは、この好ましい実施形態において、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現が、いずれの場合にも誘導性プロモーターの制御下にあることを意味する。対照的に、組換えタンパク質の発現は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にあり得る。好ましくは、シグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードするＯＲＦ、及びシグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦの両方は、誘導性プロモーター、特に好ましくは異なる誘導性プロモーターの制御下にある。したがって、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現及び組換えタンパク質の発現は、好ましくは誘導性である。

組換えタンパク質及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードする遺伝子のプロモーターは、互いに独立して誘導され得ることが好ましいので、組換えタンパク質の発現及びペプチドグリカンペプチダーゼの発現のための最適な時点を互いに独立して選択することが可能である。

誘導性プロモーターを用いることにより、発酵の任意の所望の時点で対応するタンパク質の発現を誘導することが可能である。好ましくは、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現は、組換えタンパク質の発現の誘導後に誘導される。特に好ましくは、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現は、組換えタンパク質の発現の誘導の少なくとも１時間、特に好ましくは少なくとも２時間、さらに特に好ましくは１５～４０時間、特に好ましくは２０、２７又は３８時間後に誘導される。

誘導物質を培地に添加することにより、組換えタンパク質及びペプチドグリカンペプチダーゼの発現の誘導が引き起こされるが、使用する遺伝子に従って誘導物質を選択することが必要である。ペプチドグリカンペプチダーゼがアラビノース（ａｒａ）プロモーターの制御下にある好ましい実施形態では、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現は、培養物への誘導物質アラビノースの添加によって誘導される。組換え遺伝子がｔａｃプロモーターを含む好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現は、培養物への誘導物質ラクトース又はラクトース類似体ＩＰＴＧの添加によって誘導される。

本発明によれば、ペプチドグリカンペプチダーゼの発現を誘導し、細胞をさらに培養した後でも、株の細胞密度は、追加のペプチドグリカンペプチダーゼを発現しない細菌株と同等である。特に、細胞溶解による細胞乾燥重量の大幅な減少は起こらない。

本発明は、組換えタンパク質が、細菌株の細胞の大幅な溶解の発生なしに、培地中に放出されるという利点を有する。したがって、本発明による方法は、対応して長い培養期間を有する複雑な真核生物タンパク質を産生するのに適していること、及び＞４０ｇ／ｌという高い細胞密度での発酵に適していることによって区別される。

長い培養期間とは、培養時間が少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間、特に好ましくは少なくとも６５時間であることを意味する。

本発明の文脈において、比較的低い（又はわずかに増加した、又は強くない）細胞溶解は、追加のペプチドグリカンペプチダーゼを産生しない野生型細菌株と比較して、ＣＤＷ値、ＯＤ_６００値又はペプチドグリカンペプチダーゼの発現の誘導後に好ましくは７～１７時間の培養期間の場合に測定される細菌株の培養の生細胞数についての値にわずか乃至全く減少がないことを意味する。ペプチドグリカンペプチダーゼを発現する細菌株は、特に、Ｍｏｒｉｔａら（２００１、前述参照）が示したように、細胞溶解が大きく増加したペプチドグリカングリコシダーゼを発現する細菌株の培養、及び特許文献ＣＮ１０４７６２２８５号及びＥＰ１１２４９４１号においてはＴ４－ファージリゾチーム又はＣｌｙＮタンパク質を発現する細胞について大きな利点を有する。

好ましくは、この方法は、追加のペプチドグリカンペプチダーゼの発現の誘導の５～２４時間後に、細胞乾燥重量が、追加のペプチドグリカンペプチダーゼを発現しない細菌株の発酵法からの同じ時点での細胞培養物の細胞乾燥重量と、２０％以下異なることを特徴とする。好ましくは、本発明による発酵法からの細胞培養は、追加のペプチドグリカンペプチダーゼの発現を誘導した後５～２４時間、特に好ましくは７時間又は１７時間後に、ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするＯＲＦを含まないという点でのみ本発明による細菌株と異なる細菌株が培養されることのみが本発明による方法とは異なる発酵法から同じ時点での細胞培養物の細胞乾燥重量よりも、２０％以下、特に好ましくは１５％以下、特に好ましくは１０％以下の細胞乾燥重量を有することを特徴とする。細胞乾燥重量は、細胞密度、ひいては非溶解細胞の尺度として役立つ。細胞乾燥重量は、規定量の培養物を濾過又は遠心分離、好ましくは遠心分離により単離し、その後乾燥して秤量することにより測定される。

プラスミドｐＣＧＴ－Ｓｐｒのプラスミドマップを示す。 プラスミドｐＣＧＴ－ＹｄｈＯのプラスミドマップを示す。 プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４のプラスミドマップを示す。 遺伝子ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４－Ｓｐｒのプラスミドマップを示す。 実施例１に記載されているように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる培養上清の分析を示す。試料は以下のように指定される。すなわち、Ｓ：ＳｅｅＢｌｕｅ染色済タンパク質標準、１：６５時間後のＷ３１１０／ｐＣＧＴからの上清、２：６５時間後のアラビノース無添加のＷ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒからの上清、３：６５時間後のアラビノース添加のＷ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒからの上清。

図中で用いられている略語は、以下の機能をコードするＤＮＡ領域を表している。
ｔａｃ ｐ／ｏ：ｔａｃプロモーター／オペレーター
ｐＢＡＤ ｐ／ｏ：アラビノースプロモーター／オペレーター
ｂｌａ：β－ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）
ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性
ｌａｃＩｑ：ｔａｃプロモーターのリプレッサー
ｃｇｔ－ＳＰ：ＣＧＴａｓｅのシグナルペプチド
ＣＧＴａｓｅ：シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ
ＣｏｌＥ１：複製起点
ｐｈｏＡ－ＳＰ：ｐｈｏＡシグナルペプチド
ＡＦＡ－ＳＰ：ＣＧＴａｓｅのシグナルペプチドの誘導体
ｒｒｎＢターミネーター：ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域
ｔｒｐＡターミネーター：ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター領域
Ｓｐｒ：Ｓｐｒペプチドグリカンペプチダーゼ
Ｓｐｒ－ＳＰ：Ｓｐｒのシグナルペプチド
ＹｄｈＯ：ＹｄｈＯペプチドグリカンペプチダーゼ
ＨｉｓＴａｇ：ヒスチジンタグ
軽鎖：ドメインＶＬ及びＣＬを含む抗体断片
重鎖：ドメインＶＨ及びＣＨ１を含む抗体断片
ＢａｍＨＩ／ＭａｕＢＩ／ＥｃｏＲＩ：対応する制限エンドヌクレアーゼの制限部位

以下で例示的な実施形態を参照して、それらによって制限されることなく、本発明をより詳細に説明する。

用いられたすべての分子生物学的方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素及びリガーゼによるＤＮＡの修飾、形質転換などは、文献に記載されているか、又はそれぞれの製造業者によって推奨されている、当業者に知られている方法で実施した。

＜プラスミドの説明＞
＜ｐＣＧＴ＞
プラスミドｐＣＧＴの作製はＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号の実施例４に記載されており、プラスミドマップはＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号の図４に明記されている。

本質的に、プラスミドは、テトラサイクリンに対する耐性のための遺伝子だけでなく、特に、天然のＣＧＴａｓｅシグナル配列を含む肺炎桿菌Ｍ５ａ１由来のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）の構造遺伝子も含む。ＣＧＴａｓｅ遺伝子の発現はｔａｃプロモーターの制御下にある。

＜ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ＞
ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ（プラスミドマップについては図１参照）を得るために、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる遺伝子合成によりＤＮＡ断片を作製した。前記ＤＮＡ断片ｘＩ（配列番号１に明記）は以下を含んでいた。
－ アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤプロモーター）及びオペレーターＯ１及びＩ２＋Ｉ１及びＣＡＰ結合部位（配列番号１のヌクレオチド１０～１７８）を含むＧｅｎＢａｎｋエントリーＸ８１８３７．１由来のヌクレオチド１１３６～１３０４、
－ Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（配列番号１のヌクレオチド２０３～２０８）及び
－ 以下の融合体をコードするヌクレオチド断片
ｉ 大腸菌Ｋ１２由来のＳｐｒタンパク質（配列番号１のヌクレオチド２１６～７８２）及び
ｉｉ 大腸菌由来のｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター（配列番号１のヌクレオチド８１２～８３７）。

前記ＤＮＡ断片ｘＩを、制限酵素ＭａｕＢＩを用いて切断し、同じ制限酵素を用いて切断した発現ベクターｐＣＧＴで連結した。クローニングを無向方法で行った。しかし、ＤＮＡ断片を、ＣＧＴａｓｅをコードする遺伝子と同じ読取り方向に挿入したプラスミドを用いて作業を行い、制限酵素ＢａｍＨＩの制限パターン及び配列決定により検証を行った。前記プラスミドをｐＣＧＴ－Ｓｐｒと呼び、これはＳｐｒタンパク質をコードする。

＜ｐＣＧＴ－ＹｄｈＯ＞
ｐＣＧＴ－ＹｄｈＯ（プラスミドマップについては図２参照）を得るために、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる遺伝子合成によりＤＮＡ断片を作製した。前記ＤＮＡ断片ｘＩＩ（配列番号２に明記）は以下を含んでいた。
－ アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤプロモーター）及びオペレーターＯ１及びＩ２＋Ｉ１及びＣＡＰ結合部位（配列番号２のヌクレオチド１０～１７８）を含むＧｅｎＢａｎｋエントリーＸ８１８３７．１由来のヌクレオチド１１３６～１３０４、
－ Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（配列番号２のヌクレオチド２０３～２０８）及び
－ 以下の融合体をコードするヌクレオチド断片
ｉ 大腸菌Ｋ１２由来のＹｄｈＯタンパク質（配列番号２のヌクレオチド２１６～１０２８）及び
ｉｉ 大腸菌由来のｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター（配列番号２のヌクレオチド１０６４～１０８９）。

前記ＤＮＡ断片ｘＩＩを、制限酵素ＭａｕＢＩを用いて切断し、同じ制限酵素を用いて切断した発現ベクターｐＣＧＴで連結した。クローニングを無向方法で行った。しかし、ＤＮＡ断片を、ＣＧＴａｓｅをコードする遺伝子と同じ読取り方向に挿入したプラスミドを用いて作業を行い、制限酵素ＢａｍＨＩの制限パターン及び配列決定により検証を行った。前記プラスミドをｐＣＧＴ－ＹｄｈＯと呼び、これはＹｄｈＯタンパク質をコードする。

＜ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４＞
ＵＳ２００８／０７６１５７Ａ号に記載されているプラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ１５４抗体５ｃ８（その配列は、Ｋａｒｐｕｓａｓら ２００１（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９、３２１～３２９頁）に公開されている。）のＦａｂ断片の遺伝子のクローニングと発現の開始ベクターとして使用した。ｐＪＦ１１８ｕｔは、既知の発現ベクターｐＫＫ２２３－３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の誘導体であり、ＤＳＭ １８５９６の番号でＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ （Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。

ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４（プラスミドマップについては図３参照）を得るために、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによる遺伝子合成によりＤＮＡ断片を作製した。前記ＤＮＡ断片ｘＩＩＩ（配列番号３に明記）は、以下からなる融合体を含んでいた。
ｉ 米国２００８／０７６１５７号において、配列番号２の下に開示され、かつ、肺炎桿菌Ｍ５ａ１のＣＧＴａｓｅのシグナル配列に由来するシグナル配列（配列番号３のヌクレオチド２５～１１４）及び
ｉｉ 図３にＫａｒｐｕｓａｓら ２００１において公開されている配列（配列番号３のヌクレオチド１１５～７７７）のアミノ酸１～２２１をコードする、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ１５４抗体５ｃ８のＦａｂ断片の重鎖（Ｖ_Ｈ～Ｃ_Ｈ１ドメイン）のリーディングフレーム、
ｉｉｉ ｐｈｏＡシグナル配列（配列番号３のヌクレオチド８００～８６２）、
ｉｖ 図３にＫａｒｐｕｓａｓら ２００１において公開されているヒト化モノクローナル抗ＣＤ１５４抗体５ｃ８のＦａｂ断片の軽鎖（Ｖ_Ｌ～Ｃ_Ｌドメイン）のリーディングフレーム（配列番号３のヌクレオチド８６３～１５１６）、
ｖ 長さが４つのアミノ酸のリンカー及びヘキサヒスチジンタグをコードする配列番号３のヌクレオチド１５１７～１５４６。

前記ＤＮＡ断片ｘＩＩＩを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｄｍＩを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩを用いて切断したベクターｐＪＦ１１８ｕｔで連結した。Ｆａｂ断片の重鎖と軽鎖の遺伝子の発現がｔａｃプロモーターの制御下にあったその結果得られたプラスミドをｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４と指定した。

＜ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４－Ｓｐｒ＞
プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４には、アラビノースプロモーターの制御下でＳｐｒをコードし、ｐＣＧＴ－Ｓｐｒについて前述したｔｒｐＡターミネーターが側面に位置するＤＮＡ断片ｘＩを、ＭａｕＢＩ制限サイトにより挿入した。クローニングを無向方法で行った。しかし、ＣＤ１５４をコードするＤＮＡ断片ｘＩＩＩと反対の読取り方向にＤＮＡ断片ｘＩを挿入したプラスミドを用いて作業を行い、制限酵素ＢａｍＨＩの制限パターン及び配列決定により検証を行った。前記プラスミドをｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４－Ｓｐｒと呼んだ（遺伝子マップについては図４参照）。

［実施例１：撹拌槽発酵槽におけるシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）の発酵産生］
肺炎桿菌Ｍ５ａ１からのシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）の産生のために、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）を、通常の方法（例えば、ＴＳＳ形質転換）によりプラスミドｐＣＧＴ、ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ及びｐＣＧＴ－ＹｄｈＯで形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、テトラサイクリン（２０ｍｇ／ｌ）を用いて行った。前記大腸菌株をＷ３１１０／ｐＣＧＴ、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ及びＷ３１１０／ｐＣＧＴ－ＹｄｈＯと指定した。

ａ）
撹拌槽発酵槽でＣＧＴａｓｅ産生を行った。

１．２ｌの発酵培地（１．５ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４、５ｇ／ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．２２５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、０．０７５ｇ／ｌのＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ｌのＮａ_３クエン酸塩×２Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ_２ＭｏＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、２．５ｇ／ｌのＮａ_３ＢＯ_３、０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ）、５ｍｇ／ｌのビタミンＢ１、３ｇ／ｌのフィトンペプトン（ＢＤ２１１９０６）、１．５ｇ／ｌの酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ ＬＰ００２１）、１０ｇ／ｌのグルコース、２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）を充填した発酵槽に、ＬＢ培地（５ｇ／ｌの酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ ＬＰ００２１）、１０ｇ／ｌのトリプトン（Ｏｘｏｉｄ ＬＰ００４２）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）、さらに１ｍｌ／ｌの微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌのＮａ_２ＭｏＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、２．５ｇ／ｌのＮａ_３ＢＯ_３、０．７ｇ／ｌのＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、０．２５ｇ／ｌのＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／ｌのＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ／ｌのＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ）、３ｇ／ｌのグルコース、０．５５ｇ／ｌのＣａＣｌ_２及び２０ｍｇ／ｌのテトラサイクリンで培養したＷ３１１０／ｐＣＧＴ又はＷ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒの予備培養物を、７時間振盪フラスコ中で０．１ＯＤ_６００まで接種した。それにより発酵を開始した（０時点、発酵開始）。発酵中、３０℃の温度を設定し、ＮＨ_４ＯＨ又はＨ_３ＰＯ_４を計量供給することにより、ｐＨを７．０の値に一定に保った。グルコースは発酵にわたって計量供給し、＜５ｇ／ｌのグルコース濃度を目指した。２１時間後（対数増殖期終了時）にイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１５ｍＭまで添加して、ＣＧＴａｓｅの発現を誘導した。Ｓｐｒの生産にはアラビノースプロモーターの基礎発現を使用し、発酵過程で少量のＳｐｒタンパク質の産生を導いた。アラビノースプロモーターが誘導物質の非存在下でも標的タンパク質の低産生を可能にするという事実が先行技術（Ｍａｌａｃｈｏｗｓｋａ及びＯｌｓｚｅｗｓｋｉ、Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ（２０１８）１７：４０）に記載されている。

接種前に、発酵槽中の培地を４００ｒｐｍで撹拌し、滅菌フィルターにより滅菌圧縮空気１．６７ｖｖｍ（１分間当たりの培地の体積当たりの空気の体積）でスパージした。これらの開始条件下で、光学式酸素センサー（ＶｉｓｉＦｅｒｍ ＤＯ２２５、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を接種前に飽和度１００％に校正した。発酵中のＯ_２飽和度の目標値をこの値の３０％に設定した。Ｏ_２飽和度を、発酵中に酸素センサーにより測定し、発酵槽制御ＤＣＵ（デジタル制御ユニット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）により捕捉した。Ｏ_２飽和度が目標値を下回った後、Ｏ_２飽和度を目標値に戻すために、撹拌速度をソフトウェア制御下で最大１５００ｒｐｍまで連続的に上昇させた。

６５時間の発酵後、試料を採取し、遠心分離により発酵培地から細胞を取り出し、以下の酵素アッセイにより、発酵上清中のＣＧＴａｓｅ含有量を測定した。
アッセイ緩衝液：５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭ ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、ｐＨ６．５
基質溶液：アッセイ緩衝液に溶かした１０％でんぷん溶液Ｍｅｒｃｋ Ｎｏ．１．０１２５２）、ｐＨ６．５
アッセイ混合液：基質溶液０．２ｍｌ＋遠心分離した（５分、１２０００ｒｐｍ）培養上清０．２ｍｌ
反応温度：４０℃

酵素アッセイ
＊ 基質溶液及び遠心分離した培養上清の温度の予備調整（４０℃で約５分）
＊ 基質溶液及び遠心分離した培養上清を速やかに混合（渦巻きミキサー）してアッセイ混合液を調製する。遠心分離した培養上清は、必要ならばアッセイ緩衝液で希釈し、その後のＨＰＬＣ分析で０．９～１．５ｇ／ｌのＣＤ値が測定されるようにする、
＊ ４０℃で３分間インキュベート
＊ メタノール０．６ｍｌ添加、迅速混合（渦巻ミキサー）による酵素反応の停止
＊ 氷上での混合液の冷却（約５分）
＊ 遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）し、透明な上清をピペットオフする
＊ ＨＰＬＣによるＣＤ産生量の分析：この分析は、Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ １００－３ ＮＨ２－ＲＰカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を有するＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ １１００ ＨＰＬＣシステムと移動相としての６４％アセトニトリル水溶液（ｖ／ｖ）を用いて、流速２．１ｍｌ／分で行った。検出はＲＩ検出器（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＲＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行い、ピーク面積及びα－ＣＤ標準物質（Ｃａｖａｍａｘ Ｗ６－８ Ｐｈａｒｍａ、Ｗａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ）に基づいて定量を行った。

酵素活性の計算：Ａ＝Ｇ＊Ｖ１＊Ｖ２／（ｔ＊ＭＧ）［Ｕ／ｍｌ］
Ａ＝活性、
Ｇ＝ＣＤ含有量（ｍｇ／ｌ）
Ｖ１＝アッセイ混合液における希釈倍率
Ｖ２＝アッセイに用いる前の培養上清の希釈倍率、希釈しない場合：Ｖ２＝１
ｔ＝反応時間（分）
ＭＧ＝分子量（ｇ／ｍｏｌ）（ＭＧ_ＣＤ＝９７３ｇ／ｍｏｌ）
１単位（Ｕ）、推定１μｍｏｌ／ｌ製品（ＣＤ）／分

表１は、それぞれ達成されたシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼの収量を示す。

Ｓｐｒ産生によるＣＧＴａｓｅの放出が細胞溶解の増加に起因するかどうかを調べるために、培養物の細胞乾燥重量及び生細胞数（ＬＣＣ）を発酵終了時に測定した。生細胞数を測定するために、培養物の試料をＬＢ培地で１ｍｌの最終容量まで１０^８倍希釈し、希釈物の１００μｌをいずれの場合も２０ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上に堆積させた。増殖したコロニーを計数し、希釈倍率を考慮に入れて、出発培養物の生菌数をＷ３１１０／ｐＣＧＴについては５０・１０^９、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒについては３９・１０^９で算出した。細胞乾燥重量を測定するために、１ｍｌの発酵槽培養物を含有する試料を反応容器（その空重量を予め測定した）に移した。遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）後、上清を取り出し、細胞ペレットをインキュベーター中で乾燥させた（６０℃で≧４８時間）。その後、乾燥した細胞ペレットを含む容器の重量を測定し、乾燥した細胞ペレットを含む容器の重量と空の容器の重量との相違から細胞乾燥重量（ＣＤＷ）を算出した。細胞乾燥重量はＷ３１１０／ｐＣＧＴでは４５ｇ／ｌ，Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒでは５５ｇ／ｌであった。

強い細胞溶解は宿主細胞タンパク質の放出をもたらす。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて培養上清のタンパク質含有量を分析した結果、このことは否定された（図５、試料１及び２）。６５時間の発酵後、試料を採取し、細胞を遠心分離により発酵培地から取り出した。無細胞上清を水で１：１０に希釈し、その４μｌを１ｍｌ／ｌのＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド、ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００５）及び５％ジチオエリトリトールを含有する４μｌの２ｘ Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド、ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ２６７６）と混合し、９９℃で、５分間熱ブロック中で煮沸した。試料を１００００ｒｐｍで２０秒間遠心分離し、いずれの場合も２μｌを１２％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ×１５ウェル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド、ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０３４３）に入れ、タンパク質を１ｘＭＯＰＳ緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｘ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド、ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＰ０００１、水で１×に希釈）中で、９５Ｖで３時間電気泳動により分離した。適用された標準物質はＳｅｅ Ｂｌｕｅ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド、ｃａｔ．Ｎｏ．１００００６６３６）であった。タンパク質を室温で１時間Ｉｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅ（タンパク質ゲル用Ｃｏｏｍａｓｓｉｅベースの染色液、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ Ｌｔｄ．，英国ケンブリッジ、ｃａｔ．Ｎｏ．ＩＳＢ１Ｌ）で染色した後、室温で、一夜水中で脱染した。ＣＧＴａｓｅタンパク質のバンドの他に、ゲル中で他のタンパク質によるわずかな汚染しか確認できない。特に、過剰に産生されたＳｐｒタンパク質（１８ｋＤａ）の放出増加は見られない。

ｂ）
また、上記のように、ＣＧＴａｓｅの産生を、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒ株及びＷ３１１０／ｐＣＧＴ－ＹｄｈＯ株を用いて行った。ＹｄｈＯの産生は、純グルコース供給流をグルコース：アラビノース比１０：１の３ｇ／ｌ＊ｈのグルコース／アラビノース混合液の一定供給流に切り替えることにより、発酵開始４８時間後に誘導した。Ｓｐｒの産生は、最終濃度が１ｇ／ｌになるようにアラビノースを培養物に単回添加することにより、発酵開始５９時間後に誘導した。採取は発酵開始６５時間後に行った。

表２は、このようにして達成されたＣＧＴａｓｅの収量を示す。

上記のように、培養６５時間後に細胞乾燥重量を測定した。得られた値はＷ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒでは５０ｇ／ｌ、Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－ＹｄｈＯでは４１ｇ／ｌであった。

Ｗ３１１０／ｐＣＧＴ－Ｓｐｒからの培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、ＣＧＴａｓｅの放出の他に、大腸菌内在性タンパク質の感知できる放出が認められないことが示された（図５、試料３）。

［実施例２：Ｆａｂ抗体断片の発酵産生］
ＣＤ１５４ Ｆａｂ断片の産生については、通常の方法（例えば、ＴＳＳ形質転換）により、大腸菌株Ｗ３１１０をプラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４及びｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４－Ｓｐｒで形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、テトラサイクリン（２０ｍｇ／ｌ）を用いて行った。大腸菌株をＷ３１１０／ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４、Ｗ３１１０／ｐＪＦ１１８ｕｔ－ＣＤ１５４－Ｓｐｒと指定した。実施例１の大腸菌ｐＣＧＴ株の発酵について記載されているように、前記大腸菌株を撹拌槽発酵槽内で発酵させた。実施例１とは対照的に、ＣＤ１５４ Ｆａｂ産生を発酵開始２６時間後に０．１５ｍＭ ＩＰＴＧにより誘導し、４１時間後に純グルコース供給流をグルコース：アラビノース比２：１の３ｇ／ｌ＊ｈのグルコース／アラビノース混合液の一定供給流に切り替えることにより、Ｓｐｒ産生を誘導した。

４８時間後、試料を採取し、遠心分離により培地から細胞を取り出し、上清を分析して、培地中に放出されたＣＤ１５４ Ｆａｂ断片を決定した。

ＣＤ１５４ Ｆａｂ断片を、当業者に知られたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより定量化した。これには、固定化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｄ）抗体（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、製品番号ＰＣ０７５）をキャッチャーとして、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ａ ７１６４）を検出抗体として用いることが含まれた。ペルオキシダーゼによる発色基質Ｄａｋｏ ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ ＃ Ｓ１５９９）の変換とそれに伴う４５０ｎｍでの吸収変化により定量化を行った。ＥＬＩＳＡは、Ｆａｂ断片「Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ／Ｋａｐｐａ」（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号：Ｐ８０－１１５）を用いて校正した。

Ｓｐｒの発現が細胞増殖に及ぼす影響を調べるために、培養物の細胞乾燥重量を、４８時間後の発酵終了時に実施例１に記載したように測定した。結果を表４にまとめた。

Claims (10)

1. 組換えタンパク質の発酵産生方法であって、
   機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及び組換えタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む細菌株が、機能性プロモーターの制御下でシグナルペプチド及びペプチドグリカンペプチダーゼをコードする追加のオープンリーディングフレームを含むことを特徴とし、
   ペプチドグリカンペプチダーゼが、（ｉ）Ｓｐｒ、（ｉｉ）ＹｄｈＯ又は（ｉｉｉ）Ｓｐｒ及びＹｄｈＯであって、
   発酵培地で培養され、発酵培地は、発酵後、細胞から取り出され、組換えタンパク質が該発酵培地から単離され、
   組換えタンパク質は、細胞のペリプラズムから放出され、培地中に放出される組換えタンパク質の収量が、ペプチドグリカンペプチダーゼの過剰生産を持たない対応する細菌株で達成できる収量の少なくとも１．１倍である、方法。
2. 前記細菌株がグラム陰性細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えタンパク質の発酵産生方法。
3. 前記細菌株が大腸菌種の株であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質の発酵産生方法。
4. Ｓｐｒが、配列番号５のアミノ酸２７～１８８によって特定される配列であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の発酵産生方法。
5. ＹｄｈＯが、配列番号７のアミノ酸２８～２７１によって特定される配列であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の発酵産生方法。
6. ペプチドグリカンペプチダーゼをコードするオープンリーディングフレームの発現を制御する機能性プロモーターが、誘導性プロモーターであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の発酵産生方法。
7. 組換えタンパク質が異種タンパク質であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の発酵産生方法。
8. ペプチドグリカンペプチダーゼの発現が誘導されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. ペプチドグリカンペプチダーゼの発現が、組換えタンパク質の発現の誘導後に誘導されることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 追加のペプチドグリカンペプチダーゼの発現の誘導の５～２４時間後に、発酵培地を取り出した後の細胞乾燥重量が、追加のペプチドグリカンペプチダーゼを発現しない細菌株の発酵法からの同じ時点の細胞培養物の細胞乾燥重量と、２０％以下異なることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

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