JP5591445B2 - 異種タンパク質の製造方法、タンパク質の分泌方法並びに前記方法の実施のためのe.コリ菌株 - Google Patents
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Description
1. 可溶性タンパク質として細胞内産生;
2. 封入体("インクルージョンボディー")として細胞内産生;
3. ペリプラズムへの分泌。
1)分泌された標的タンパク質のN末端アミノ酸残基が、必ずしもメチオニンである必要はなく、産物の天然の開始アミノ酸と同一であってよいこと、
2)ペリプラズムもしくは発酵培地におけるプロテアーゼ活性が、細胞質中よりも明らかに低いこと、
3)場合により必要となるジスルフィド結合の形成が、酸化条件下で、かつペリプラズム性のシャペロンによって可能となること
である。
1. 細胞を分解せねばならないこと
2. 標的タンパク質を多くの宿主タンパク質から精製せねばならないこと
である。
a)産生系を用いて、同種のタンパク質又はまったく特定のタンパク質しか細胞外で十分に高い収率で製造できないこと、又は
b)系が原則的に種々のタンパク質の製造のために適している場合に、それによって今まで経済的観点から低い収率しか達成されなかったこと、又は
c)培養に引き続き、例えば標的タンパク質と融合相手との開裂のような更なる工程を行わねばならず、これは、後処理を費用のかかるものにすること、又は
d)タンパク質を発酵培地中に高い収率で分泌できる分泌菌株の作製が、費用のかかる突然変異誘発法及びスクリーニング法によってのみ可能であること
である。
E.コリ野生株W3110(米国微生物系統保存機関(ATCC):27325)のlpp欠失突然変異体をλ−レコンビナーゼを用いて作製するために、DatsenkoとWannerの方法(2000年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640−5)に従って実施した。その際、まずポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、プライマーとしてオリゴヌクレオチドlpp1(配列番号4)とlpp2(配列番号5)を使用し、かつ鋳型としてプラスミドpKD3(大腸菌ストックセンター(CGSC):7631)を使用して、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有し、かつlpp遺伝子の上流領域もしくは下流領域のそれぞれ50塩基対から隣接されている直鎖状DNA断片を作製した。菌株W3110を、まずプラスミドpKD46(CGSC:7739)で形質転換した。こうして得られたW3110 pKD46の、DatsenkoとWannerの指示に従って製造されたコンピテント細胞を、PCRにより作製された直鎖状のDNA断片で形質転換した。W3110の染色体中にlpp遺伝子の位置でクロラムフェニコール耐性カセットを組み込んだことに対する選択を、20mg/lのクロラムフェニコールを含有するLBアガープレート上で実施した。前記のようにして、lpp遺伝子がほぼ完全にクロラムフェニコール耐性遺伝子と交換された細胞が得られた。染色体中の正しい位置で組み込みが行われたことは、PCRによってオリゴヌクレオチドpykF(配列番号6)とynhG2(配列番号7)を使用し、かつ鋳型としてクロラムフェニコール耐性細胞の染色体DNAを使用して確認した。
菌株W3110の染色体中のlpp野生型遺伝子とlpp1アレルとの交換は、相同組み換えによって実施した。そのために、以下のように実施した:
遺伝子合成によって、lpp1アレルと、lpp野生型遺伝子の3′側にあるDNA領域の約200塩基対とを有するDNA分子(配列番号8)を製造した。更に、このDNA分子は、両末端に、それぞれ制限酵素BamHIのためのそれぞれ1つの切断部位を有する。そのlpp1アレルは、配列番号8の塩基8〜245を含む。lpp野生型遺伝子(配列番号1)との差異において、lpp1アレルは、lpp遺伝子の位置229に塩基置換(CからT)を有し、それは未処理のLppタンパク質において位置77のアルギニン残基のシステイン残基への交換をもたらす。遺伝子合成によって作製された配列番号8を有するDNA分子を、完全に制限酵素BamHIによって切断した。クローニングベクターpKO3(Link他著(1997年)、J.Bacteriol.179:6228−37;Harvard Medical School,Department of Genetics,200 Longwood Ave,Boston,MA 02115)を、まず同様に制限酵素BamHIによって切断した。前記のように直鎖化されたプラスミドを、後に該ベクターの再ライゲーションを回避するために、引き続きアルカリ性ホスファターゼで処理した。前記のようにして切断されたDNA分子を互いにライゲーションした。こうして作製されたプラスミドを、pKO3−lpp1と呼称した(図1)。菌株W3110を、CaCl2法によってプラスミドpKO3−lpp1で形質転換し、その際、アンピシリンを用いてプラスミド保有細胞について選択した。lpp野生型遺伝子とlpp1アレルとの引き続いての交換は、相同組み換えの機構を介して、Link他(1997)に記載される手順に従って行った。前記の交換が正確な塩基で染色体中の正しい位置で行われたことは、染色体のlpp領域を、PCRによってオリゴヌクレオチドpykF(配列番号6)とynhG2(配列番号7)を使用し、かつ誤認されたlpp1突然変異体の染色体DNAを鋳型として使用してまず増幅させ、そして引き続きそのPCR産物を同一のオリゴヌクレオチドと一緒に配列決定することによって調べた。
lpp1突然変異体と同様にlpp遺伝子中に1つの点突然変異のみを有するW3110の染色体lpp3突然変異体を作製する際に、実施例2と同様に実施したが、配列番号8を有するDNA断片の代わりに、同様に遺伝子合成によって製造された配列番号9を有するDNA分子を使用したことが異なる。このDNA分子は、lpp3アレル(塩基211〜447)と、lpp野生型遺伝子の5′側にあるDNA領域の約200塩基対とを有する。更に、このDNA分子は、両末端に、それぞれ制限酵素BamHIのためのそれぞれ1つの切断部位を有する。lpp3アレルは、配列番号1との差異において、lpp遺伝子の位置41に塩基置換(GからA)を有し、これは、まだ処理されていないLppタンパク質において位置14のグリシン残基のアスパラギン酸残基への交換をもたらす。それぞれBamHIで切断されたプラスミドpKO3と、lpp3アレルを有するDNA分子のDNA断片のライゲーションによって作製されたプラスミドpKO3−lpp3(図2)を、前記のように菌株W3110中に形質転換した。Link他による手順によって、最後に菌株W3110lpp3が得られた。菌株の調査は、実施例2に記載されるように実施した。
配列番号10を有し、クレブシエラ・ニューモニアエM5a1由来のシクロデキストリン−グリコシルトランスフェラーゼ(CGTアーゼ)遺伝子を有するDNA断片(Genbank番号M15264)を、遺伝子合成によって製造した。このDNA断片を、発現ベクターpJF118ut(図3)中にクローニングした。該ベクターは、DSMZ−ドイツ微生物細胞培養収集館(Braunschweig)で番号DSM18596として寄託されている。pJF118utは、公知の発現ベクターpKK223−3(Amersham Pharmacia Biotech)の誘導体であり、β−ラクタマーゼ遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子の他に、さらに同様にプラスミド上に存在するLacIq遺伝子産物によって再始動されかつ例えばD−ラクトースもしくはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)のようなインデューサーによってスイッチオンすることができるtacプロモーターをも有する。プラスミドpJF118utを、制限酵素EcoRIで完全に切断し、かつそれぞれ直鎖状DNA断片の5′末端で突出した塩基を、S1ヌクレアーゼで分解した。前記のようにして予備調製されたベクターDNA分子を、CGTアーゼを含むDNA断片(配列番号10)とT4−リガーゼを使用してライゲーションした。菌株DH5αを、ライゲーションバッチでCaCl2法に従って形質転換し、その際、アンピシリン(100mg/l)によってプラスミド保有細胞について選択した。アンピシリン耐性形質転換体から、再びプラスミドを単離し、そして制限分析によって調査した。前記のようにして作製された、CGTアーゼ遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pCGTと呼称した(図4)。
試験バッファー:5mMのトリス塩酸バッファー(>pH6.5)、5mMのCaSO4・2H2O
基質:試験バッファー(pH6.5)中の10%のNoredux溶液
試験バッチ:1mlの基質溶液+1mlの遠心分離され、場合により希釈された培養上清(5分、12000rpm)+3mlのメタノール
反応温度:40℃
・ 溶液を予熱する(約5分、40℃で)。
A=活性
G=CDの含有率(mg/l)=試験バッチ:単位表面×104/標準溶液(10mg/ml)/単位表面
V1=試験バッチにおける希釈係数(前記のように実施した場合:V1=5)
V2=試験で使用する前の培養上清の希釈係数;非希釈の場合:V2=1
t=反応時間(分)
MG=分子量(g/モル)(CD=973g/モル)
1ユニット=1マイクロモルの産物/分
更なる医薬品として関心が持たれる、E.コリのlpp突然変異体によって細胞外で製造できるタンパク質は、インターフェロンα2bである。インターフェロンα2b遺伝子のための発現ベクターの作製において、以下のように実施した:
配列番号11を有し、EP0220714号に記載されるCGTアーゼ−シグナル配列(配列番号3)とインターフェロンα2bのための遺伝子とからなる遺伝子融合物を有するDNA断片を、遺伝子合成によって製造した。このDNA断片を、制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターpJF118utとライゲーションした。このクローニングから得られた、インターフェロンα2b遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pIFN(図5)と呼称した。
1μlの上清を、サンプルバッファーと混合した(2×Tris SDS−サンプルバッファー(Invitrogen カタログ番号LC2676):0.125Mのトリス塩酸(pH6.8)、4%(w/v)のSDS、20%(v/v)のグリセリン、0.005%(v/v)のブロモフェノールブルー、5%のβ−メルカプトエタノール)。更に、定義された量のインターフェロンα2bを、スタンダードとして一緒に施与した。タンパク質の変性を、100℃に5分間加熱し、氷上で2分間冷却し、そして遠心分離することによって実施した。それらのタンパク質を、電気泳動によって、12%のNuPAGE(登録商標)Bis−Tris−Gel(Invitrogen カタログ番号NP0341)中で、1×MES含有ランニングバッファー(Invitrogen カタログ番号NP0002)を用いて分離させた(電気泳動パラメータ:200Vで40分間)。イムノブロットによる検出と定量化を、以下の仕様に従って実施した:
モジュール:Amersham:Hoefer TE 22 Mini Tank Transfer Unit、コード番号:80−6204−26。
Whatmanフィルタとニトロセルロースメンブレンを、適切な大きさに切断し、そして発泡物品(スポンジ)で転写バッファー(Invitrogen カタログ番号LC3675)に気泡なく染み込ませた。
転写条件:I=200mAの一定の電流、U=無制限、運転時間60分
25mlのプレハイブリダイゼーションバッファー中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で30分間振り動かす。
25mlのプレハイブリダイゼーションバッファー+0.15μg/ml(→3.75μg)の抗ヒトIFN抗体(Pepro Tech EC,Biozolを経由した カタログ番号:500−P32A)中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で90分間又は一晩振り動かす。
1×PBSと一緒に室温で10秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
1×PBSと一緒に室温で15分間2回振り動かし、バッファーを捨てる。
25mlのプレハイブリダイゼーションバッファー+25μl(1:1000)のヤギ抗ウサギIgGセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(HRP)(Southern Biotech、Biozolを経由した カタログ番号4050−05)中で該メンブレンをインキュベートする。
室温で60分間振り動かす。
1×PBSと一緒に室温で10秒間振り動かし、バッファーを捨てる。
1×PBSと一緒に室温で15分間2回振り動かし、バッファーを捨てる。
Lumi−Lightウェスタンブロッティング基質(Roche,カタログ番号2015200)を準備する:Lumi−Lightルミノール/エンハンサー溶液とLumi−Light安定ペルオキシド溶液とを1:1の比率で混合する:NCメンブレン当たり3ml。
プレハイブリダイゼーションバッファー:1×PBS中の5%脱脂粉乳
10×PBS:100mMのNaH2PO4、1.5MのNaCl、NaOHでpH7.5、0.5%のTriton100
1×PBS:10×PBSを完全脱塩水で1:10希釈したもの
定量的評価は、Biorad社製のGS−800 Calibrated Densitometerでイムノブロットをスキャンすることによって、Quantity One 1−D分析ソフト(Biorad)を用いて、施与されたスタンダードと比較することによって実施した。
E.コリのlpp突然変異体を用いて、機能的なFab抗体フラグメントを細胞外で製造することもできる。その際、該細胞は、ドメインVLとCLとを含む軽鎖の相応のフラグメント及びドメインVHとCH1とを含む重鎖の相応のフラグメントを同時に合成し、次いでペリプラズム中に分泌し、最後には発酵培地中に分泌せねばならない。細胞質の外で、その際、両方の鎖の機能的なFabフラグメントへの会合が行われる。
配列番号12を有するDNA断片(重鎖)を、遺伝子合成によって製造し、そして該DNA断片は、E.コリのompA遺伝子のシグナル配列と、Fabフラグメントの重鎖(VH−CH1)のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。この読み枠直後に6個のヒスチジンコドンが引き続き、従って融合タンパク質のC末端を形成している。このヒスチジンタグによって、後に完全に会合されたFabフラグメントの簡単な精製が親和性クロマトグラフィーによって可能となる。このDNA断片を、制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターpJF118utとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pHC−Anti−Lysozym(図6)と呼称した。
E.コリのlpp突然変異体を用いて、機能的な全長抗体を細胞外で製造することもできる。Fabフラグメントの製造と同様に、該細胞は、抗体の軽鎖と重鎖を同時に合成し、次いでペリプラズム中に分泌し、最後には発酵培地中に分泌せねばならない。次いで、細胞質の外で、両方の鎖の機能的な全長抗体への会合が行われる。
配列番号14を有するDNA断片(重鎖)を、遺伝子合成によって製造し、そして該DNA断片は、E.コリのompA遺伝子のシグナル配列と、抗αTF抗体の重鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このDNA断片を、まず制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターpJF118utとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pHC−Anti−TF(図8)と呼称した。
Claims (5)
- 真核生物のタンパク質をE.コリ菌株によって発酵培地中で製造するにあたり、lpp遺伝子中もしくはlpp遺伝子のプロモーター領域中に突然変異を有し、かつ真核生物のタンパク質をコードする遺伝子であってシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合されている遺伝子を有するE.コリ菌株を、5lより高い容量を有する発酵器中で発酵培地中で発酵させ、その際、該E.コリ菌株が、真核生物のタンパク質を発酵培地中に分泌し、そして該タンパク質を発酵培地から分離する製造方法において、
前記真核生物のタンパク質が100個より多くのアミノ酸からなり、かつ、抗体フラグメントであり、lpp遺伝子中の前記突然変異が、lpp遺伝子中もしくはlpp遺伝子のプロモーター領域中の1個以上のヌクレオチドの置換、欠失もしくは挿入であって、lpp遺伝子がもはや発現されないもしくは僅か少しだけ発現されることとなるもの、又はLppタンパク質の機能の低下を伴うLppタンパク質のアミノ酸配列の改変をもたらすものであり、
前記抗体フラグメントが、工業的規模で、1g/lより高い細胞外収率で製造されることを特徴とする方法。 - lpp遺伝子中の突然変異が、配列番号2の位置77のアルギニン残基のシステイン残基との交換をもたらすもの(lpp1突然変異体)であるか、又は配列番号2の位置14のグリシン残基のアスパラギン酸残基との交換をもたらすもの(lpp3突然変異体)であるか、又はlpp遺伝子自体におけるもしくはlpp遺伝子のプロモーター領域における少なくとも1個のヌクレオチドの欠失に基づき、細胞が、ペリプラズム性のタンパク質について高められた漏出性を有することとなるものであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- シグナルペプチドをコードするシグナル配列が、E.コリのphoA遺伝子もしくはompA遺伝子のシグナル配列をコードする遺伝子又は配列番号3を有するシグナル配列をコードする遺伝子の群から選択されることを特徴とする、請求項1又は2記載の方法。
- 発酵培地が、最少塩培地であることを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項記載の方法。
- 発酵を、24〜72時間の時間にわたって実施することを特徴とする、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。
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