JP2004337001A - 新規なセリンプロテアーゼｍｐ４９３ - Google Patents

Abstract

【課題】癌浸潤、腎疾患、肺疾患等に広く関与する遺伝子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的な評価方法の提供。
【解決手段】ヒト由来の特定な２種類の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるセリンプロテアーゼ、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質或いはその部分モデル構造を利用した該蛋白質の活性調節化合物の評価方法、該ＤＮＡに対するアンチセンス核酸、該蛋白質に対する特異抗体。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、各種癌・腫瘍、各種肺疾患、喘息、アレルギー、気管支炎、肺気腫、ウイルス性疾患、ショック、多臓器不全、膵炎、各種腎炎などの疾患に関わる膜貫通型新規セリンプロテアーゼ、該セリンプロテアーゼをコードするＤＮＡならびに組換えベクター、該ベクターを用いた形質転換体、該セリンプロテアーゼに対する特異抗体、該セリンプロテアーゼの発現を抑制するアンチセンス核酸、及び該セリンプロテアーゼまたはそれをコードするＤＮＡを用いた診断薬、阻害剤、医薬品などのスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セリンプロテアーゼは、触媒部位に活性に必須なＳｅｒ残基をもつ一群のプロテアーゼである。この活性部位にあるＳｅｒ残基は、求核性が大きく活性化されている。この求核性は、Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒからなる３種類の触媒基によって維持されている。
【０００３】
セリンプロテアーゼは、４つのタイプに大きく分類される。すなわち、キモトリプシン型、スブチリシン型、セリンカルボキシペプチダーゼ型、サイトメガロウイルスプロテアーゼ型である。キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼはアミノ酸配列上の相同性が高い。ただし、特異性ポケット（Ｓ１ポケット）などの基質結合ポケットの構造に差異がみられるため、その機能は異なる。スブチリシン型とセリンカルボキシ型は、一次配列、三次構造共に異なるが、活性３残基の配置が同じである。一方、サイトメガロウイルスプロテアーゼ型のものも同様の活性３残基の配置を有するが、Ａｓｐ残基がＨｉｓ残基に置換している。
【０００４】
セリンプロテアーゼは、前駆タンパク質の処理から細胞内分解までの多様な細胞プロセスに関わる。高等動物では、食物の消化、血液凝固・線溶、補体活性化、ホルモン産生、排卵と受精、食作用、細胞増殖、発生・分化、老化、癌転移など極めて多くの生体反応に関与していることがわかっている（Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｈ． Ｓｃｉｅｎｃｅ．， ２２４， ｐｐ．３５０−３５７， （１９８４）） 。そのため、これまで多くの研究者から注目されてきているが、これはセリンプロテアーゼが癌、アレルギーをはじめ、各種悪性疾患の病因・病態進行に深く関わっているためである。
【０００５】
癌細胞に発現し重要な生理機能を担うプロテアーゼがメタロプロテアーゼ群を中心に多数存在することは、よく知られている。一方、セリンプロテアーゼに関しては、その機構や関わりがはっきりとは特定されていないのが現状であるが、プラスミンやトロンビンがマトリクスメタロプロテアーゼ群を活性化したり、ムリンマクロファージエラスターゼの分泌を促進したりすること、また、ＰＡＲ−Ｉ活性化ペプチドがムリンマクロファージエラスターゼの遊離を誘導することが知られている。更にメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）は、トリプシンによって活性化され（Ｄｕｎｃａｎ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５８，ＰＰ．３７−４３，（１９９８））、癌浸潤などに関与する。その他、近年、前立腺に特異的に発現する膜結合型のセリンプロテアーゼが、前立腺癌細胞におけるｃＤＮＡマイクロアレー技術によって選抜されてクローニングされた。ＴＭＰＲＳＳ２と命名されたこのセリンプロテアーゼは、これまで、細胞外マトリクスや基底膜構成成分の分解やＩＶ型コラゲナーゼの活性化などを介して癌浸潤などに関わるとされてきたセリンプロテアーゼ群とは異なり、アンドロゲンなどによって制御されうる機構で癌化に関与する可能性が示されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９，ＰＰ．４１８０−４１８４，（１９９９））。しかしながら、まだ確かな知見は得られていないのが現状である。
【０００６】
この種の膜結合型のセリンプロテアーゼ自体、その機能の詳細があまり知られていないが、１９９８年に見出された蛋白質であるヘプシンは、肝臓ならびに肝細胞ガンでの発現が高いことが報告されている。このヘプシンをコードする遺伝子を欠いたノックアウトマウスも作成されており、第８因子のＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎが認められるために血液凝固の面で注目されていること、ｈｅｐａｔｏｍａで血中レベルが上昇することなどから、ヘプシンの腫瘍マーカーとしての示唆がされている。
【０００７】
従来、肺の各種疾患、例えば肺気腫、肺繊維症、喘息、アレルギー、外来性微生物、カビ、及びウイルス等による疾患は、好中球エラスターゼ、キマーゼ、βトリプターゼといったセリンプロテアーゼとの関係が示唆されてきている。βトリプターゼは、喘息患者、鼻炎患者のアレルギー性炎症部位で産生され、キニノーゲンからのキニン生成や補体Ｃ３からＣ３ａ生成を触媒する基質特異性を有する。そのため、抗原に暴露された喘息患者の咳の発生や、気道収縮への関与が指摘されている。また、プロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）のリガンドであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で繊維芽細胞の増殖やコラーゲン産生を増強することから、喘息や肺繊維症の新たな治療薬として注目されている。その他、肺に発現しているトリプターゼクララ（Ｈ． Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ． ２６７， ｐｐ．１３５７３−１３５７９ （１９９２）； Ｍ． Ｔａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， Ｖｏｌ． ６６， ｐｐ．７２１１−７２１６（１９９２））は、インフルエンザウイルスの外膜蛋白質を限定分解するために、結果として細胞膜の融合活性を発揮させ、感染を引き起こし得ることが示唆されている。
【０００８】
膵臓に発現するセリンプロテアーゼとして、消化酵素のトリプシンがあげられる。トリプシンはウシ、ブタ、ヒト、ウサギなど各種動物の膵臓に由来することが知られ、膵液中に含まれる蛋白質分解作用を有する酵素の名称として使用され、膵臓のａｃｉｎｏｕｓ ｃｅｌｌで不活性型のトリプシノーゲンとして作られるエンドペプチダーゼ群の酵素であることがわかっている。トリプシンは、トリプシノーゲンから自己触媒的にエンテロキナーゼ、モルドキナーゼ、カテプシンＢによって活性化をうけてトリプシンとなる。その性質や構造については研究され、ペプチド、アミド、エステルの類をＬ−ＡｒｇまたはＬ−Ｌｙｓのカルボキシル基側のペプチド結合を優先的に加水分解する作用を有している。純化された酵素は血液凝固、血圧低下、抗炎症作用などが認められて臨床に利用されている。また、その一方で膵炎などの疾患標的として知られている。トリプシン様の基質特異性を有する酵素の開発及びトリプシン様プロテアーゼの開発および、トリプシン様の活性を有して膵炎などの疾患の標的となるセリンプロテアーゼの単離が切望されている。
腎（臓）の糸球体の炎症性疾患として腎炎があり、微小変化群管内増殖性腎炎、半月体形性腎炎、糸球体硬化症、メサンギウム増殖性腎炎、膜性腎症、膜性増殖性腎炎、末期硬化性腎炎、ＩｇＡ腎炎などが知られている。腎炎の治療には、副腎皮質ホルモン（ステロイド剤）、免疫抑制剤、抗凝固剤、抗血小板剤、利尿剤などが用いられている。近年、糸球体腎炎患者において、膜結合型セリンプロテアーゼであるファクターＩが欠損しているケースが報告されている。ファクターＩは、補体系のＣ４ｂ／Ｃ３ｂを不活性化させる酵素であり、その関連が注目されている（Ｓａｄａｌｌａｈ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．， ３３， ｐｐ．１１５３−７，（１９９９））。また、トリプシン型セリンプロテアーゼの一種であるトロンビンは、ヘキソキナーゼ活性を制御しメサンギウム細胞における腎障害に関与することも報告されている（Ｒｏｂｅｙ ＲＢ ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．， ５７， ｐｐ．２３０８−１８（２０００））。更に、セリンプロテアーゼの阻害剤である内在性のインヒビターであるメグシン（Ｍｅｇｓｉｎ）は、ＩｇＡ腎炎を始め多種多様の腎炎において発現しており、これからも腎障害にある種のセリンプロテアーゼが関与することが推測されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景から、上記疾患に関与するヒト由来新規セリンプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子を見出すこと、そして該蛋白質を生産し、該蛋白質の活性を調節する物質を効率的にスクリーニングする方法、活性調節剤、特異的抗体、あるいはアンチセンス核酸の開発が切望されている。
【００１０】
本発明は、癌・腫瘍細胞や、肺、膵臓、腎臓、胎盤組織における各種疾患に関与する新規なセリンプロテアーゼ、及びそれをコードするＤＮＡを提供することにある。さらに、本発明は当該ＤＮＡを用いた当該プロテアーゼの生産方法、当該セリンプロテアーゼの活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト胃印環細胞癌株から単離された新規な遺伝子（ｍｐ４９３とする）、当該遺伝子にコードされる膜結合型の新規セリンプロテアーゼ蛋白質（ＭＰ４９３とする）に関する。また、当該遺伝子を用いて形質転換した宿主細胞、該形質転換細胞を用いた組換ＭＰ４９３の生産方法を提供する。さらに、空間座標化したＭＰ４９３の部分構造モデルを利用した、ＭＰ４９３に対するプロテアーゼ活性調節剤の評価方法を提供する。
【００１２】
（核酸）
本発明は、ＭＰ４９３（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ｍｐ４９３を提供する。該遺伝子は胃印環癌細胞から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。また、本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
【００１３】
ｍｐ４９３の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。
【００１４】
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
【００１５】
配列番号１または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質がセリンプロテアーゼ活性を保持する範囲内において、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１または４に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼをコードするＤＮＡであれば、配列番号１または４に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
【００１６】
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１または４に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するものであれば許容範囲内である。また、ハイブリダイズする程度としては、通常の条件下、例えばＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１または４に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
【００１７】
本発明のＤＮＡを有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡに加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。
【００１８】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
【００１９】
（蛋白質ＭＰ４９３）
ｍｐ４９３にコードされる蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＭＰ４９３である。ＭＰ４９３はセリンプロテアーゼにおいて保存される触媒残基、Ａｓｐ３０４、Ｓｅｒ４００、Ｈｉｓ２５７ を有する。また後述するように、その３次元構造をモデリングし解析したところ、基質のＰ１部位に塩基性の残基（Ｌ−Ａｓｐ， Ｌ−Ｌｙｓ）を有する基質を好んで切断するセリンプロテアーゼであることが判明した。また、組み換え細胞において発現し、精製したＭＰ４９３は、確かに予想された合成基質を水解し、モデル構造の妥当性とセリンプロテアーゼ活性を有することがこれにより実証された。相同性解析の結果、ＭＰ４９３はＴＭＰＲＳＳ２、Ｆａｃｔｏｒ Ｉ 、トリプシン、 ヘプシン、βトリプターゼと一次構造上約６０％の相同性が認められた。またモチーフ解析の結果からは、ＭＰ４９３にはＬＤＬレセプタードメイン、スカベンジャーレセプターシステインリッチドメイン、膜貫通領域が認められた。以上の事実より、ＭＰ４９３は膜貫通型構造を有するセリンプロテアーゼであると判断される。
【００２０】
ＭＰ４９３が胃印環癌細胞で発現していること、セリンプロテアーゼドメインや膜貫通ドメインなど種々のモチーフが存在すること、アミノ酸配列および核酸配列上の相同性、特に前立腺癌細胞で特異的に発現される膜貫通型セリンプロテアーゼのＴＭＰＲＳＳ２と６１％の相同性を有していることなどから、ＭＰ４９３はＴＭＰＲＳＳ２と同様、アンドロゲンなどによって制御される癌化に関与する蛋白質であると判断された。
【００２１】
また、ＭＰ４９３は、肺気腫や肺繊維症などの肺の各種疾患に関与するとされるβトリプターゼ、あるいは糸球体腎炎の発症に関与するとされる膜貫通型セリンプロテアーゼｆａｃｔｏｒＩなどとも近い構造を有している。加えて、遺伝子ｍｐ４９３の生体における発現分布を各種臓器由来のｃＤＮＡライブラリーを用いて確認したところ、該遺伝子は肺、膵臓、腎臓、胎盤で発現していることが確認された。
【００２２】
従って、ＭＰ４９３はこれら各種疾患の発症とも密接に関与しているものと推察される。特にセリンプロテアーゼ活性による標的蛋白質の加水分解がこれらの疾患の発症において意義をもつと想定されることから、ＭＰ４９３を特異的に阻害し得る化合物は医薬としての有用性を持つと期待される。また、ＭＰ４９３を用いた同プロテアーゼ活性の阻害剤の探索は、医薬開発において重要な意義を有すると期待される。
【００２３】
なお、セリンプロテアーゼ活性を有する限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／若しくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。また、配列番号５に示すアミノ酸配列からなる蛋白質は、ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインであり、セリンプロテアーゼ活性を有する。配列番号５に示すアミノ酸配列からなる蛋白質は、ＭＰ４９３に比して遺伝子工学的に生産が容易であり、該蛋白質の活性調節物質のスクリーニング等に供するのに好適である。また、配列番号５に示すアミノ酸配列の情報から、実施例６に示すようにコンピューター上での活性阻害化合物のスクリーニングを行うことが可能である。このセリンプロテアーゼ活性を有する限り、配列番号５に示す蛋白質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
【００２４】
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においてはセリンプロテアーゼ活性、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
【００２５】
従って、配列番号２または５に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、その変異が本発明の本質的機能であるセリンプロテアーゼ活性を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
【００２６】
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多形等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質がセリンプロテアーゼ活性を保持する限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内である。
【００２７】
（抗体）
本発明はさらにＭＰ４９３または配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、上記蛋白質全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）_２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体であってもよい。これらの抗体は、ＭＰ４９３の研究的あるいは臨床的な検出、ＭＰ４９３によってもたらされ得る疾患の臨床治療等に有用である。
【００２８】
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＭＰ４９３生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＭＰ４９３をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｍｐ４９３の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または３に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に被翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
【００２９】
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＭＰ４９３の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
【００３０】
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
【００３１】
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
【００３２】
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用した翻訳段階の阻害活性、あるいは５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域、５’翻訳領域を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを用いたレポーター遺伝子の発現量などを測定して、評価することができる。
【００３３】
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるＭＰ４９３の発現を抑制することができるので、ＭＰ４９３が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
【００３４】
（空間座標化されたＭＰ４９３の基質結合部位を利用した化合物のスクリーニング方法）
本発明は、ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインを基に導かれる空間座標化された基質結合部位を利用した、ＭＰ４９３の活性調節作用を有する化合物のスクリーニング方法も提供する。
【００３５】
ＭＰ４９３は、配列番号２に示した２１７番目〜４５３番目のアミノ酸残基に相当する部分に、セリンプロテアーゼの特徴的ドメインを有している。本発明における基質結合部位の空間座標は、この部分配列を基に適当な蛋白質モデリングプログラムを用いて立体構造化されるセリンプロテアーゼドメインから導かれるものである。本発明において空間座標とは、実質的には化学構造を構成する分子（原子）間の各距離によって定まる空間配置を意味する。この空間配置をコンピューター上で情報として処理する場合には、相対的な配置をある座標系における特定座標として数値情報化する（座標化という）が、これはコンピューター処理を行うにあたり便宜上必要な処理であって、空間座標の本質は、先に示した通り各分子（原子）間相互の距離によって定まる配置であって、コンピューター処理時に一時的に特定される座標値ではないと理解されるべきである。
【００３６】
一般的に、プロテアーゼにより切断を受ける基質アミノ酸配列において、切断により新たに生じるＣ末端のアミノ酸残基をＰ１と呼び、その残基からＮ末端側に伸張する残基をＰ２、Ｐ３、Ｐ４、・・・と呼ぶ。また、Ｐ１の結合するプロテアーゼ側の部位をＳ１と、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、・・・の結合する部位をそれぞれＳ２、Ｓ３、Ｓ４、・・・と呼ぶ。
【００３７】
通常、キモトリプシン型セリンプロテアーゼは、キモトリプシンの立体構造と対応させた配列番号が付与される。この番号を一般にキモトリプシン番号と呼ぶ。キモトリプシン番号を使用することで、配列と立体構造の対応が可能となる。
【００３８】
本明細書内に記載されるＳ１、Ｓ２、Ｓ４を、以下に定義する。
【００３９】
Ｓ１：３９４〜４００、４１８〜４２５、４２９〜４３３番（キモトリプシン番号１８９〜１９５、２１３〜２２１、２２４〜２２８番）の残基で形成される。
【００４０】
Ｓ２：２５７、３０１、４１９、４２０番（キモトリプシン番号５７、９９、２１４、２１５番）の残基で形成される。
【００４１】
Ｓ４：２９９〜３０１、３７８、４２０番（キモトリプシン番号９７〜９９、１７５、２１５番）の残基で形成される。
【００４２】
ＭＰ４９３の基質結合部位の立体構造をヒトトリプシン並びにＴＭＰＲＳＳ２の基質結合部位の立体構造と比較した結果、以下のことが判明した。ＭＰ４９３は、Ｓ１ポケットの構造がトリプシン及びＴＭＰＲＳＳ２と一致しているが、Ｓ２ポケットとＳ４ポケットを形成している３０１番目のアミノ酸残基（キモトリプシン番号で９９番残基）は、ＴＭＰＲＳＳ２ではＬｙｓになっている（トリプシンではＬｅｕ）のに対し、ＭＰ４９３ではＬｅｕである。また、Ｓ４ポケットを形成している３００番目、３７８番目、４２０番目のアミノ酸残基（キモトリプシン番号で９８番、１７５番、２１５番残基）が、ＴＭＰＲＳＳ２ではＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、トリプシンではＴｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐになっているのに対し、ＭＰ４９３ではＡｒｇ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅである。従って、ＭＰ４９３は、ＴＭＰＲＳＳ２やトリプシンと同じくＰ１部位（Ｓ１ポケット結合部位）にＬｙｓ、Ａｒｇを持つトリプシン型基質を切断するが、その他のＳ２、Ｓ４サブサイトにおいてＴＭＰＲＳＳ２と、またＳ４サブサイトにおいてトリプシン、ＴＭＰＲＳＳ２と異なる基質特異性を示すと考えられる。この事は、Ｓ２、Ｓ４のサブサイトを標的とすることで、ＭＰ４９３を選択的に阻害する化合物を分子設計することが可能となることを意味する。
【００４３】
本発明であるＭＰ４９３の基質結合部位を用いた化合物のスクリーニング方法は、上記のＭＰ４９３の基質結合部位の空間座標と任意の化合物の立体構造を表す空間座標とをコンピューター上で適合させ、その結合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該化合物のＭＰ４９３に対する結合能を評価する方法である。その際、ＭＰ４９３の基質結合部位を構成するアミノ酸残基の中から、本来の基質ではないセリンプロテアーゼに対する低分子阻害剤と接触し得る残基、すなわち標的結合サイトを特定し、このサイトとの結合状態に着目することが有利である。
【００４４】
ＭＰ４９３に結合するであろう阻害剤の結合標的サイトを構築するアミノ酸残基は、ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインのモデル構造の座標化に使用した公知のセリンプロテアーゼに関する鋳型構造の中から、低分子阻害剤との複合体結晶構造（ＰＤＢコード：１ＥＫＢ， １Ａ０Ｌ， １ＧＣＴ， １ＢＲＵ， １Ａ０Ｊ， ２ＴＢＳ， １ＦＸＹ， １ＤＡＮ）を参考にして、２５７（Ｈｉｓ）， ３０１（Ｌｅｕ）， ３０４（Ａｓｐ）， ３７８（Ｉｌｅ）， ３８６（Ａｌａ）， ３８７（Ｇｌｙ）， ３９４（Ａｓｐ）， ３９５（Ｓｅｒ）， ３９６（Ｃｙｓ）， ３９７（Ｇｌｎ）， ３９８（Ｇｌｙ）， ３９９（Ａｓｐ）， ４００（Ｓｅｒ）， ４１８（Ｔｈｒ）， ４１９（Ｓｅｒ）， ４２０（Ｐｈｅ）， ４２１（Ｇｌｙ）， ４２２（Ｉｌｅ）， ４２３（Ｇｌｙ）， ４２４（Ｃｙｓ）， ４２９（Ｌｙｓ）， ４３０（Ｐｒｏ）， ４３１（Ｇｌｙ）， ４３２（Ｖａｌ）， ４３３（Ｔｙｒ）番と推定される。なお、これらの残基は使用する公知の鋳型構造などにより一部において異同が生じ得る。従って、ＭＰ４９３の標的結合サイトは上記残基によってのみ限定して構成されるものではなく、推定手段によって一部の構成アミノ酸残基が変動することがあっても、依然として本発明であるスクリーニング方法の実施は可能である。
【００４５】
以上のように、本発明のスクリーニング方法は、ＭＰ４９３の基質結合部位（好ましくは推定標的結合サイト）の空間座標と、Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、 Ｃｏｎｃｏｒｄ（Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）などの適当なプログラムを用いて得られる所望の化合物の立体構造を表す空間座標とを、分子ドッキングパッケージＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）等の適当なプログラムを利用してコンピューター上で重ねあわせ、その結合状態をＤＯＣＫに含まれるスコアリング関数等を指標として数値化することで、該化合物の結合能を評価することで行われる。
【００４６】
以上の方法は、蛋白質ＭＰ４９３の発現・精製を待たずして阻害剤の探索を開始できるため、創薬開発の効率化を推進することが可能となる。すなわち、ＭＰ４９３の標的結合領域の性質、形状に適合する空間座標配置を予測し、これを埋めることの可能な構造を有する化合物を計算により選択することで、多数の化合物からＭＰ４９３に特異的な活性制御物質を効率的に選択することが可能となる。
【００４７】
（薬理作用団モデル）
本発明は更に、前述のコンピューターを用いたスクリーニング方法や実験的スクリーニング方法で得られたＭＰ４９３活性調節作用を示す化合物を基に、これら化合物に共通して存在する薬理作用団を有する、ＭＰ４９３活性調節剤を提供する。
【００４８】
薬理作用団とは、標的蛋白質に結合するために必要とされる、化合物上の物理化学的特徴である。薬理作用団は、ＭＰ４９３活性調節作用を示す化合物に共通する構造上の特徴を特性球として表し、特性球間の相対距離を決定することで定義することができるし、特定の官能基間の相対距離を決定することで定義することも可能である。その他、当業者が通常用い得る手法を任意に使用して薬理作用団を定義可能であり、前述の方法に限定されるものではない。
【００４９】
また、化合物により蛋白質に結合する部位が異なると、全ての化合物に共通する物理化学的性質が存在しない場合がある。この場合は、化合物を適切にクラスタリングした後、各クラスター内で共通する物理化学的性質を決定する必要がある。
【００５０】
本明細書中では、便宜的に薬理作用団を特性球の集合として特性球の性質と相対距離または座標で定義するが、異なる定義方法であっても実質的に同一の薬理作用団を表すものであれば、本発明に含まれるものと解されるべきである。実質的に同一の薬理作用団とは、同一の化合物データベースに対して薬理作用団に当てはまる化合物を検索したとき、同一の化合物がヒットとして得られるものと考えることが出来る。
【００５１】
特性球は、疎水性、帯電性、水素結合を形成し得る能力、などの種々の理化学的性質を保持した空間的領域を意味する。例えば、薬理作用団構築プログラムであるＣａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）においては、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（さらに、Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｌｉｐｉｄを分類することもできる）」、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｄｏｎｏｒ」、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ（さらに、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ＡｒｏｍａｔｉｃとＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ａｌｉｐｈａｔｉｃを分類することもできる）」、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｈａｒｇｅ」、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ」、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｈａｒｇｅ」、「Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ」、「Ｒｉｎｇ Ａｒｏｍａｔｉｃ」の８種類の特性球が示されているが、該プログラムのユーザーが新たな定義を加えることも可能であり、上記の構成要素以外を利用することも可能である。本発明では、疎水性領域、水素結合受容体、陽イオン領域、環状芳香族性領域、等を物理化学的性質として規定し、これら該物理化学的性質を有するÅ半径の球状の領域として、特性球を表している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ４．５， １９９９）。
【００５２】
換言すれば、本発明のＭＰ４９３活性調節剤は、ＭＰ４９３に特有の基質結合部位に選択的に適合可能な、一定の物理化学的性質を有する特性球相互の空間座標を満足させる化学構造で表される化合物として規定される。
【００５３】
この特性球相互の空間配置とは、特性球相互の相対的な空間配置（相対距離）を意味するものである。特許請求の範囲では、特性球の配置を特定のＸＹＺ座標値を利用して表しているが、これは、一の座標値を与えることにより各特性球間の相対距離が比較的単純な幾何学的計算によって一義的に定まることから、記載の便宜上特定の座標を利用しているに過ぎない。従ってかかる座標値は、各特性球間の相対距離を算出する根拠以外には限定的な意義は有しない。換言すれば、特定球の空間配置は各球相互の相対距離で特定されるものであり、特許請求の範囲ではこの相対距離を計算で導くに足る根拠として用いるための一の座標値を示しているのである。
【００５４】
従って、特性球間の相対距離が変化しない限り、特許請求の範囲に記載される座標値とは異なる任意のＸＹＺ座標、すなわち回転・並進が施された座標系での座標値を基にその相対距離が算出される場合でも、その相対距離を満足させる薬理作用団を有する化合物は、依然として本発明そのものに他ならないのである。
【００５５】
なお、この空間配置をコンピューター上で情報として処理する場合には、相対的な配置をある座標系における特定座標として数値情報化する（座標化という）場合もあるが、これはコンピューター処理を行うにあたり便宜上必要な処理であって、空間座標の本質は各特性球間相互の距離をもって定められる相対位置であって、コンピューター処理時に一時的に特定される座標値ではないのは、先に述べた通りである。
【００５６】
本発明であるＭＰ４９３活性制御物質は、表１乃至表３のそれぞれで示されるＸＹＺ座標系上の一の座標に配置された場合の特性球のうち、少なくとも任意の３点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作用団を有する化合物である。
【００５７】
【表１】

【００５８】
【表２】

【００５９】
【表３】

【００６０】
上記各表において、Ｒはベクトルの開始点と、Ｔはベクトルの終点とそれぞれ定義される。水素結合受容体領域は、水素結合受容体原子から（水素結合受容体原子に存在する）非共有電子対への位置・方向をＲからＴへのベクトルとして定義したものである。また、環状芳香属性領域における環の平面は、ＲからＴへのベクトルを垂線としてもつ平面として定義される。また、各表に示される特性球の配置をグラフィクス化したものを、それぞれ図５、図６、図７に示す。
【００６１】
各表の座標から導かれる特性球の空間配置は、実際にＭＰ４９３の活性調節作用を示した化合物の構造の類似性によって３つにクラスター分けし、各クラスターに属する化合物の立体構造に共通の構造的特徴を、適当なプログラム、例えば前述のＣａｔａｌｙｓｔを用いて導いたものである。従って、薬理作用団を導くために使用する具体的な化合物の選択とデータ数、これらの結合能の判定基準などを変化させることによって、導かれる薬理作用団にも多少の変化は生じ得るのであるが、本願発明はこれらの変化も実質的に含んでいると解されるべきである。
【００６２】
さらに、表１乃至表３に示す特性球の座標値は、各薬理作用団を決定した際に用いた化合物とＭＰ４９３構造との複合体モデルに基づき同一の座標系に重ねあわせをしたものである。また、これらの特性球は、化合物がＭＰ４９３に対して結合する際に好適な部位を示していると考えられるため、表１乃至表３に示す全ての特性球をまとめて、ＭＰ４９３活性調節化合物の薬理作用団と考えることが可能である。この表１から３に示される全ての特性球の配置をグラフィクス化したものを、図８に示す。
【００６３】
表１から表３に規定される全ての特性球のうち、少なくとも任意の３点以上の特性球の相対配置を満足させる化合物もまた、ＭＰ４９３の活性調節作用を発揮するものと期待される。また、表１から表３に規定される全ての特性球をＭＰ４９３構造との複合体モデルに基づき同一の座標系に重ねあわせた際に、相似する性質を持つ特性球同士が近傍に存在する場合は同一の群として分類し、同じ群に属する特性球を同時に２個以上使わないことにより、化合物の効率的な検索が可能となる。なお、本発明は、先に示した４種（表１の薬理作用団、表２の薬理作用団、表３の薬理作用団および表１〜表３の全ての特性球からなる薬理作用団）の薬理作用団をコンピューター上で使用するために数値情報化したデータ、及び該データを記録した記録媒体をも提供するものである。
【００６４】
（薬理作用団を用いたＭＰ４９３活性調節作用を有する化合物の検索方法）
本発明である薬理作用団を用いた検索方法とは、先に示した４種（表１の薬理作用団、表２の薬理作用団、表３の薬理作用団および表１〜３の全ての特性球からなる薬理作用団）の薬理作用団の情報とある化合物の立体構造の空間配置とを比較し、該化合物が薬理作用団の性質を満足させるものであるかどうかを計算により決定する方法である。この方法は、コンピュータースクリーニングをさらに効率的に実行することができる。すなわち、本発明により得られる薬理作用団モデルは、それのみを利用して大規模な化合物データベースをスクリーニングすることができる。また、座標化されたＭＰ４９３の基質結合部位上での重ね合わせにより決定される薬理作用団モデルは、ＭＰ４９３の標的結合領域に対して結合する化合物をＤＯＣＫ等を用いてコンピュータースクリーニングする際に有効なフィルターとして使用することができるし、各薬理作用団に対して適合するフラグメントを配置した後に各フラグメントを適当な官能基で結合させて化合物を構築するＤｅ Ｎｏｖｏ設計的使用も可能である。
【００６５】
以上の方法によれば、ＭＰ４９３の活性制御物質、特に阻害剤をコンピューター上で効率的にスクリーニングできるので、実際にＭＰ４９３を発現することなくＭＰ４９３の阻害剤を選別することが可能になる。また、コンピューター上でスクリーニングし選別した化合物を、更に本発明の蛋白質又は該蛋白質を発現する形質転換細胞を用いた生化学的アッセイに供することにより、より効果的にＭＰ４９３の阻害剤を選別することが可能になる。これにより、ＭＰ４９３が関わる疾患の予防薬・治療薬を著しく短い期間で医療現場に提供することを可能とする手法である。
【００６６】
【発明の実施の形態】
（核酸）
遺伝子ｍｐ４９３は、胃印環癌細胞から単離同定することができる。本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを^３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
【００６７】
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
【００６８】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、胃印環癌細胞、肺、腎臓、膵臓等においてその発現変化が確認されていることから、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、癌、肺、腎、膵疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
【００６９】
本発明のＤＮＡは、ＭＰ４９３を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量をｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患の診断を行うことも可能である。
【００７０】
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断することができる。
【００７１】
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、本発明の蛋白質の発現または活性が損なわれていることによる疾患の遺伝子治療にも使用する事ができる。
【００７２】
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＭＰ４９３の生産方法、あるいはｍｐ４９３の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
【００７３】
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｍｐ４９３をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｍｐ４９３の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いた蛋白質ＭＰ４９３の生産において好適に用いられる他、遺伝子ｍｐ４９３の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
【００７４】
例えば、任意の被験物質と遺伝子ｍｐ４９３を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ｍｐ４９３の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
【００７５】
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせてマウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を調製することが出来る。かかるトランスジェニック動物を用いても、上記の形質転換細胞と同様の探索あるいは評価を行うことができる。特に本発明である遺伝子ｍｐ４９３あるいは蛋白質ＭＰ４９３は癌発症あるいは肺疾患、腎疾患や膵疾患に関連することから、上述の形質転換細胞あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、癌、肺、腎あるいは膵疾患に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
【００７６】
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
【００７７】
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
【００７８】
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、天然に発現している各種臓器から調製することができるが、ペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ型、パーキンエルマージャパン（株）製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
【００７９】
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
【００８０】
組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
【００８１】
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換体の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換体の培養については各種の成書（たとえは、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年、参照）があるので、それらを参考にして行うことができる。
【００８２】
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
【００８３】
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヒキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
【００８４】
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（ １９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
【００８５】
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、セリンプロテアーゼとして機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用したり、該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
【００８６】
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
【００８７】
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それか抗体の作製に使用しうる精製度のものであれはいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
【００８８】
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
【００８９】
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れは良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
【００９０】
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の牌細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。
【００９１】
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏＫｅおよびＢｅＲＮＡｌｄ Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成したり、ｍｐ４９３を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばパーキンエルマージャパン（株）製、３９４型）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
【００９２】
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被検物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、遺伝子ｍｐ４９３もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明の核酸、特にアンチセンス核酸を医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
【００９３】
本発明の核酸あるいはアンチセンス核酸は、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
【００９４】
本発明の核酸あるいはアンチセンス核酸は、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
【００９５】
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、または該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞を用いることを特徴とする、本発明の蛋白質の機能を調節する物質をスクリーニング方法に関する。より具体的には、（１）候補物質の存在下／非存在下におけるＭＰ４９３のセリンプロテアーゼ活性を評価する方法、（２）候補物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例５に示す系において、被験物質存在下／非存在下におけるＭＰ４９３の基質切断活性を測定すればよい。（２）の例としては、公知の手法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用した翻訳段階の阻害活性、あるいはｍｐ４９３遺伝子の５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域、５’翻訳領域を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを用いたレポーター遺伝子の発現量などを、候補物質の存在下／非存在下で測定して評価することができる。
【００９６】
候補物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
【００９７】
（座標化されたＭＰ４９３の基質結合部位を利用するスクリーニング法）
以下には複数のプログラムが記載されているが、これらは実施方法を明確にするための一例であり、同等の機能を持つプログラムを代替として使用することも可能である。
【００９８】
ＭＰ４９３のアミノ酸配列と公知のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列情報とを比較する段階、ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインを構成する部分配列を特定する段階、既に立体構造が決定されている公知のセリンプロテアーゼの構造情報を鋳型として該ドメインを座標化する段階、基質結合部位を構成しているアミノ酸残基を特定する段階、それぞれに必要とされる情報やプログラムは、一般に開放されているデータベースあるいは市販化されている各種プログラムを用いて行うことができる。ドメインの特定に必要な公知の蛋白質情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＰＤＢデータベースなど、公開データベースから入手可能である。また、アミノ酸配列比較には、ＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．， ３６， ｐｐ．２９０−３００ （１９９３）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ｐｐ．４０３−１０（１９９０））、マルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ， Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ， Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２， ｐｐ．４６７３−４６８０（１９９４））、その他入手可能ないずれのプログラムを用いてもよい。ドメイン検索には、モチーフデータベースであるＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）、またはＰｆａｍ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／； Ｅ．Ｌ．Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ， Ｓ．Ｒ． Ｅｄｄｙ， ａｎｄ Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ．，２８， ｐｐ．４０５−４２０（１９９７））などが利用可能であり、検索プログラムとしては、隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるＨＭＭＥＲ （Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｓ． Ｅｄｄｙ， Ａ． Ｋｒｏｇｈ， Ｇ． Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， 重み行列を用いた膜貫通予測プログラムｔｍａｐ （Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｂ， Ａｒｇｏｓ Ｐ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２３７， ｐｐ．１８２−９２ （１９９４））等が挙げられる。これらのデータベースあるいはプログラムはその性質上内容が改良され、あるいは将来的に新たなプログラム等が開発されることもあり得るが、本発明の実施に必要な機能を有している限り利用可能であり、上記の例に限定されるものではない。
【００９９】
セリンプロテアーゼドメイン情報から、基質結合部位を構成するアミノ酸残基を特定し空間配置を特定するには、公知のセリンプロテアーゼの立体構造情報、ならびに該公知のプロテアーゼと特異的セリンプロテアーゼ阻害剤との複合体の立体構造情報、ならびにこれらをコンピューター上で比較処理するプログラムなどが必要となる。実験的に決定された立体構造情報は、ＰＤＢデータベース（Ｈ． Ｍ． Ｂｅｒｍａｎ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．２８， ｐｐ．２３５−２４２ （２０００）， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）などの公開データベースから入手可能である。また、蛋白質モデリングプログラムとしては、ＦＡＭＳ（Ｏｇａｔａ， Ｋ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． Ｍｏｄｅｌ．， Ｖｏｌ．１８， ｐｐ．２５８−２７２ （２０００））、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、蛋白質構造評価プログラムとしては、Ｐｒｏｆｉｌｅｓ−３Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、グラフィックス表示プログラムとしては、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、Ｓｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）等を使用することが可能である。
ＭＰ４９３に対する活性調節作用の有無を確認しようとする化合物は、公知、新規いずれであっても差し支えなく、その構造、由来、物性等にも特に制限はないが、将来的に医薬開発を行う上では低分子化合物であることが好ましく、例えばＡｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＡＣＤ） （ＭＤＬ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ， ＣＡ）に登録されている化合物情報は有益である。
【０１００】
この様な低分子化合物の立体構造を座標化するプログラムとしてはＣｏｎｃｏｒｄ、あるいはＣｏｎｖｅｒｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）等が利用可能である。この様にして座標化したＭＰ４９３と低分子化合物との結合は、分子ドッキングパッケージＤＯＣＫ 等を使用して自動的に行わせることも可能であるし、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ等の分子表示ソフトウエアを用いて対話的に行うことも可能である。その際、これらのプログラムを用いて結合状態を評価する際の指標としては、結合体全体の自由エネルギー計算値、経験的スコアリング関数などを任意に選んで使用することができる。この指標により、結合の良否を客観的に評価することが可能となる。
【０１０１】
（薬理作用団の抽出とこれを用いたスクリーニング）
ＭＰ４９３活性調節作用を示す化合物からの薬理作用団の決定、及び、決定した薬理作用団と化合物の立体構造との比較にはＣａｔａｌｙｓｔ、Ｕｎｉｔｙ（Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ． Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）等のプログラムを使用することが可能である。この際、化合物のクラスタリングが必要であれば、Ｄａｙｌｉｇｈｔ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｖｉｅｊｏ， ＣＡ）等のプログラムを使用することが可能である。
【０１０２】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
【０１０３】
実施例１ 遺伝子ｍｐ４９３のクローニング
（１）オリゴキャップ法による完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト胃印環細胞癌株であるＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−１０３）よりＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２^ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．）に従い、オリゴｄＴセルロースを用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製した。次に５−１０μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを、１００ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む緩衝液中で、１．２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＢＡＰと略する）（ＴａＫａＲａ）と３７℃で４０分間反応させ、キャップ構造を持たないポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの脱リン酸化を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出し、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをエタノール沈殿として回収した。回収したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で２０ＵのＴｏｂａｃｃｏ ａｃｉｄ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＴＡＰと略する）（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ， Ｇｅｎｅ ｖｏｌ．１３８， １７１−１７４）にて３７℃で４５分間処理し、キャップ構造の除去を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出して、エタノール沈殿を行い、ＢＡＰ−ＴＡＰ処理済ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを回収した。
【０１０４】
この回収したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ２−４μｇを０．４μｇ の５’オリゴマー（５’−ＡＧＣ ＡＵＣ ＧＡＧ ＵＣＧ ＧＣＣ ＵＵＧ ＵＵＧ ＧＣＣ ＵＡＣ ＵＧＧ−３’）とライゲーション反応を行った。この反応は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＡＴＰ、２５％のＰＥＧ８０００及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で、２５０ＵのＲＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて２０℃で３−１６時間行った。その後、未反応のオリゴマーを除去してｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、２−４μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを１０ｐｍｏｌのｄＴアダプタープライマー（５’−ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ−３’）と混合し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮＡｓｅ Ｈ⁻ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添付の緩衝液中で４２℃、１時間反応させた。
【０１０５】
鋳型のＲＮＡを除去するために１５ｍＭのＮａＯＨを用いて６５℃で１時間反応させた後に、ｃＤＮＡの増幅操作を行った。１μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）^＋ＲＮＡより合成されたｃＤＮＡを１６ｐｍｏｌのセンスプライマー１（５’−ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマー１（５’−ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＡ ＴＧＴ−３’）と混合し、ＸＬ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて増幅した。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１０分間のサイクルを５−１０回行った。ＰＣＲ産物をフェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿として回収した。その後、回収物をＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて１０００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分離し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに挿入した。尚、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３のＤｒａＩＩＩサイトは非対称性となっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩサイトとなっているため、挿入したｃＤＮＡ断片は一方向性に挿入されている。
【０１０６】
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解析
（１）の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーより、ＰＩ−１００ロボット（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドを調製し、各クローンの塩基配列を確認し、データベース化した。塩基配列決定は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＲ．Ｏ．Ｂ． ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い添付のプロトコールに従ってシークエンス反応を行い、ＡＬＦ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行った。
【０１０７】
（１）に記載の方法で取得したプラスミドＣ−ＫＡＴ００７８６には、配列番号２で表される４５３個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される１３５９塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレームを含む配列番号３で表わされる２４１８塩基対の塩基配列からなるｃＤＮＡが含まれていた。プラスミドＣ−ＫＡＴ００７８６は、国際微生物寄託機関である経済産業省技術総合研究所生命工学工業技術研究所に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１４１として寄託されている。
【０１０８】
相同性の検索にはＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．， ３６， ｐｐ．２９０−３００ （１９９３）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５， ｐｐ．４０３−１０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索した。
【０１０９】
ＭＰ４９３完全長ｃＤＮＡ配列は問い合わせとする配列の順方向、逆方向すべての読み枠を翻訳して相同性検索をおこなうｂｌａｓｔｘプログラムを用いてＧｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対し相同性検索を実施した。この方法により有為な相同性のみられたアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＡＡＦ９７８６７， ＡＡＦ６４１８６， ＮＰ＿００５６４７， ＮＰ＿０５６５９０）と、対応するＭＰ４９３完全長ｃＤＮＡ配列のコドンの読み枠から翻訳される蛋白質配列の推定をおこなった。
【０１１０】
続いてこの推定された蛋白質配列を問い合わせ配列としてＧｅｎｂａｎｋ蛋白質データベースに対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。開始コドンのメチオニンを１番として、５２から４４８番目の４０９残基にわたりヒト膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＮＰ＿００５６４７）との相同性が５８％、７２から４４７番目の３８３残基にわたりマウスセリンプロテアーゼ ＴＭＰＲＳＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＡＡＦ９７８６７）との相同性が６１％、７２から４４７番目の３８３残基にわたりマウスのプラズマ膜貫通型蛋白質Ｘ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＦ６４１８６）との相同性が６０％、７２から４４７番目の３８３残基にわたりマウス膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＮＰ＿０５６５９０）との相同性が５９％みられた。
【０１１１】
ＭＰ４９３塩基配列と上記４塩基配列をＦａｓｔａ（Ｗ．Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｄ．Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ．， ＰＮＡＳ．， ８５， ｐｐ．２４４４−２４４８ （１９８８））プログラムを用いて相同性検索を実施した結果、ヒト膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＮＰ＿００５６４７）と１１７０塩基において５６％の同一性、マウスセリンプロテアーゼ ＴＭＰＲＳＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＡＡＦ９７８６７）と７９１塩基において５７％の同一性、マウスのプラズマ膜貫通型蛋白質Ｘ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＦ６４１８６）と７９１塩基において５７％の同一性、マウス膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＮＰ＿０５６５９０）と７９１塩基において５７％の同一性がみられた。
【０１１２】
さらに推定された蛋白質配列と相同性検索から得られた近縁関係にあるセリンプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＡＡＦ９７８６７， ＡＡＦ６４１８６， ＮＰ＿００５６４７， ＮＰ＿０５６５９０）をマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ， Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ， Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２， ｐｐ．４６７３−４６８０（１９９４））を用いて多重整列した結果を図１に示す。またセリンプロテアーゼドメインにおいて有為な相同性のみられたヒト配列（ＴＭＰＲＳＳ２；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｏ０１５３９３；Ｆａｃｔｏｒ Ｉ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ０５１５６；トリプシンＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ０７４７７，Ｐ０７４７８； ヘプシン ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ０５９８１；βトリプターゼ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ２０２３１ ）においてＣｌｕｓｔａｌＷを用い、多重整列を行った結果を図２に示す。
【０１１３】
モチーフデータベースであるＰＲＯＳＩＴＥデータベース （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）を用いて、推定される蛋白質配列の機能について、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースに対しパターン検索した結果、２２１番目のアスパラギンが糖鎖結合部位であるモチーフがみられた。
【０１１４】
更にＬＤＬ−受容体クラスＡ （ＬＤＬＲＡ）ドメインシグニチャー［ＰＲＯＳＩＴＥ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＳ０１２０９］ （８５−１０７）がみられた。さらに、セリンプロテアーゼであるトリプシンの活性中心のヒスチジン残基に見られるモチーフ［ＰＲＯＳＩＴＥ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＳ００１３４］が２５３から２５８番目のアミノ酸残基に見られ、同じくトリプシンの活性中心のセリン残基に見られるモチーフ［ＰＲＯＳＩＴＥ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＳ００１３５］が３９４から４０５番目のアミノ酸残基にみられた。
【０１１５】
ＰＲＯＳＩＴＥプロファイル検索からは、７２から１０８番目のアミノ酸残基にＬＤＬレセプタークラスＡのドメインのプロファイル［ＰＲＯＳＩＴＥ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＳ５００６８］が見られた。
【０１１６】
隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるＨＭＭＥＲ （Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｓ． Ｅｄｄｙ， Ａ． Ｋｒｏｇｈ， Ｇ． Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， （１９９８））を用いてタンパク質ドメインデータベースであるＰｆａｍ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／； Ｅ．Ｌ．Ｌ． Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ， Ｓ．Ｒ． Ｅｄｄｙ， ａｎｄ Ｒ． Ｄｕｒｂｉｎ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ．，２８， ｐｐ．４０５−４２０（１９９７））に検索を実施した結果、有為な相同性のあるドメインとしてアミノ酸番号７１から１０９番目にＬＤＬ−受容体ドメインクラスＡ ［Ｐｆａｍ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＦ０００５７］、アミノ酸番号１１０から２０５番目にスカベンジャー受容体Ｃｙｓリッチドメイン［Ｐｆａｍ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＰＦ００５３０］、アミノ酸番号２１７から４４３番目にセリンプロテアーゼであるトリプシンドメイン［Ｐｆａｍ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ： ＰＦ０００８９］が見出された。
【０１１７】
重み行列を用いた膜貫通予測プログラムｔｍａｐ （Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｂ， Ａｒｇｏｓ Ｐ ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２３７， ｐｐ．１８２−９２ （１９９４））により膜貫通ヘリックスの予測をおこなったところ、４１番目から６９番目のアミノ酸残基の２９残基において膜貫通領域が予測された。ＭＰ４９３と他のセリンプロテアーゼのドメイン構造概念図を図３に示す。
【０１１８】
実施例２ ＰＣＲ法による各種臓器における発現解析
遺伝子ｍｐ４９３の各種臓器における発現を調べるために、市販のｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ＭＴＣ ＰａｎｅｌＩ及びＩＩ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型にＰＣＲを行った。すなわち、ＭＰ４９３の３’非翻訳領域に特異的なセンスプライマー２（５’−ＧＡＴ ＴＣＣ ＡＧＣＡＣＡ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＡ−３’）及びアンチセンスプライマー２（５’−ＧＧＣ ＣＴＴ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＣＣ−３’）を用い、ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により９４℃で２分間反応した後に、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られたサンプルについてアガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ断片の増幅の有無を調べた。その結果、肺、膵臓、腎臓、胎盤で遺伝子ｍｐ４９３の発現が確認された。
【０１１９】
実施例３ 哺乳動物細胞での発現
（１）発現プラスミドｐＭ５００１の構築
ＭＰ４９３を哺乳動物細胞で発現させるためのプラスミドを以下の方法で作製した。
【０１２０】
センスプライマー３（５’−ＡＣＡ ＧＡＧ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＣＣ−３’）及びアンチセンスプライマー３（５’−ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＴＡＧ ＧＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＣＡＴ −３’）を設計し、オリゴキャップ法で作製したＣ−ＫＡＴ００７８６プラスミドを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて回収した。また、オリゴキャップ法で作製したｍｐ４９３プラスミドをＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化し、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次にｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−） Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にて約５．５ｋｂのＤＮＡ断片をベクターとして回収した。このベクター断片に先に回収した２種のＤＮＡ断片を定法によりライゲーションし、ＪＭ１０９ コンピテント細胞（ＴａＫａＲＡ）を形質転換し、目的のプラスミド（ｐＭ５００１）を得た。
【０１２１】
（２）ＣＯＳ−１細胞を用いたＭＰ４９３の発現確認
発現プラスミドｐＭ５００１を下記の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、蛋白質の発現を行った。すなわち３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度でＣＯＳ−１細胞を６ウェルプレートに植え込み、５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で１昼夜培養した。翌日、 １ウェルあたり６μｌのＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）と１μｇのｐＭ５００１とを添付プロトコールに従い混合し、ＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ_２、３７℃の条件下でさらに７２時間培養した後に、上清を除去し、ＰＢＳ⁻で細胞を洗浄し、１００μｌ／ｗｅｌｌ のＥｌｅｃｔｒｏＰｕｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（２倍濃度）（第一化学薬品）で細胞を溶解させた。次にその溶解液１０μｌを５−２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、Ｐａｌｌ ＦｌｕｏｒｏＴｒａｎｓ Ｗ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に蛋白を転写し、ウェスタンブロッティングを行った。尚、一次抗体にはＰｅｎｔａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を、二次抗体にはＨＲＰ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ）を用いた。またＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりケミルミ検出を行った。その結果、約５５ｋＤａの蛋白質の発現が確認できた。
【０１２２】
（３）発現プラスミドｐＭ５００２の構築
ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインを蛋白質として得るために、マウスＩｇ ｋａｐｐａ鎖シグナルペプチドのＣ端側にエンテロキナーゼ認識部位（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）が続き、その直後にＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメイン、ミックエピトープ（ｍｙｃ ｅｐｉｔｏｐｅ）、ヒスチジンタグが続くキメラ蛋白質を発現させるためのプラスミドを以下の方法で構築した。
【０１２３】
センスプライマー４（５’−ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＴＡ ＣＧＣ ＧＴＴ ＧＡＣ ＡＴＴ−３’）及びアンチセンスプライマー４（５’−ＣＴＴ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＧＡ ＡＣＣ ＴＧＧ ＡＡＣ−３’）を設計し、マウスＩｇ ｋａｐｐａ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃのシグナルペプチドを持つ発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ２ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。またセンスプライマー５（５’−ＡＴＣ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＴＣＣ−３’）とアンチセンスプライマー５（５’−ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＴＡ ＧＧＴ ＣＴＣ ＴＣＴ−３’）を設計し、オリゴキャップ法で作製したＣ−ＫＡＴ００７８６プラスミドを鋳型として同様にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＭＥＧＡＬＡＢＥＬキット（ＴａＫａＲａ）を用いて５’末端をリン酸化した後に、前者のＰＣＲ産物はＳｐｅＩで、後者のＰＣＲ産物はＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて共に約０．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＳｅｃＴａｇ２ ＡをＳｐｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて約４．３ｋｂのＤＮＡ断片をベクターとして回収した。このベクター断片と先の２種のＤＮＡ断片とを定法に従ってライゲーションし（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、ＪＭ１０９コンピテント細胞へ形質転換した。得られたコロニーをＰＣＲで解析を行い、目的のプラスミドｐＭ５００２を得た。
【０１２４】
（４）ＣＯＳ−１細胞を用いたセリンプロテアーゼドメインの発現および精製
発現プラスミドｐＭ５００２を下記の方法でＣＯＳ−１細胞に導入し、蛋白質の発現を行った。
【０１２５】
ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌを上記プラスミドＤＮＡ１２．５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で７２時間培養した後に、培養上清を回収した。回収した培養上清は、ペプスタチン、ロイペプチン、ＥＤＴＡを１０μＭとなるようにそれぞれ添加したＰＢＳ−に対して、一昼夜透析を行った。これを、市販のニッケルカラムＰｒｏＢｏｎｄにてヒスチジンタグアフィニティカラムクロマトグラフィーを行った。平衡化は、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．８で十分に行い、その後、透析後の培養上清をニッケルカラムにアプライした。多くの培養上清中の蛋白質は素通りし、十分に洗浄後、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ４．０ でグラージェント溶出した。続いて溶出画分を市販のエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｕｔｕｒｅ ｋｉｔ；Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と２０℃で終夜反応させ、活性型と考えられるＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインを得た。同サンプルは、上記アフィニティカラムに供し、素通りした画分をＰＢＳ−に透析後、濃縮し活性型ＭＰ４９３精製標品とした。本標品は銀染色にて、分子量約３０Ｋの位置にバンドを示した。
【０１２６】
活性型ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメイン精製標品から、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２， １３０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液ｐＨ ７．５に０〜１μｇ／ｍｌ濃度の最終標品を調製し、最終基質濃度 ４ｍＭとなるようにＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（３０５７，蛋白質研究奨励会）を添加した。３７℃で３０−６０分、反応を実施した後、５０％ 酢酸で反応を停止後、その基質特異性をＯＤ４０５ｎｍの吸収で検討、解析した。その結果、本発明のセリンプロテアーゼドメインはトリプシン型の基質を効率よく切断した。
【０１２７】
実施例４ 大腸菌におけるＭＰ４９３の発現
（１）発現プラスミドｐＭ５００３の構築
大腸菌を宿主としたＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメイン分泌発現プラスミドを以下の方法で構築した。
センスプライマー６（５’−ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＡＴ ＣＡＴ ＴＧＧ ＧＡＧ ＣＴＧ−３’）とアンチセンスプライマー６（５’−ＴＴＴ ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＣＧ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＣＡ ＴＣＡ ＴＣＡ ＴＣＡ ＣＣＣ ＧＡＧ ＣＣＴ Ｔ−３’）を用い、ｐＭ７８１（特開平６−３１５３８６）を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。また、センスプライマー７（５’−ＡＡＧ ＧＣＴ ＣＧＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＡ ＡＧＡ ＴＣＧ ＴＧＧ ＧＴＧ ＧＡＡ Ａ−３’）とアンチセンスプライマー７（５’−ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＴＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＧ−３’）を用い、ｐＭ５００２を鋳型に同様にＰＣＲ反応を行った。
【０１２８】
得られたＰＣＲ産物をそれぞれアガロースゲル電気泳動により回収した後に、これら断片の混合物を鋳型として、センスプライマー６とアンチセンスプライマー８（５’−ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＧＴＣ ＧＡＧ ＧＣ−３’）を用いてさらにＰＣＲ反応を行った。その後、ＰＣＲ産物をフェノール：、クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿でＤＮＡ断片を回収した。ＭＥＧＡＬＡＢＥＬキット（ＴａＫａＲａ）を用いて５’末端をリン酸化した後に、次にＨｉｎｄＩＩＩにてこのＤＮＡ断片を消化し、アガロースゲル電気泳動にて約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＭ７８１をＢａｍＨＩで消化後、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）で末端を平滑化した。その後、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化し約３．３ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて回収し、ベクターとした。このベクター断片と先のＤＮＡ断片を定法に従いライゲーションし、ＪＭ１０９コンピテント細胞を形質転換した。得られたコロニーをＰＣＲで解析を行い、目的のプラスミド（ｐＭ５００３）を得た。
【０１２９】
（２）大腸菌でのＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインの分泌、発現
Ｈａｎａｈａｎの方法に従い（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ．著、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ． Ｃｏｌｉ、Ｉｎ： ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｖｏｌ． １， Ｇｌｏｖｅｒ， Ｄ． Ｍ． （ｅｄ．）， １０９−１３６頁、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、１９８５年）、大腸菌ＪＥ５５０５を形質転換し、ＪＥ５５０５（ｐＭ５００３） を作製した。この組換え株を５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロース５ｍｌにて３７℃で終夜培養後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びカザミノ酸２％を含むＭ９ＣＡ培地５０倍量に、この培養液を植菌し、３７℃にて約１時間培養した。培地に終濃度１０μｇ／ｍｌの３β−インドールアクリル酸（和光純薬工業）を添加し、３０℃でさらに１８時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離し、上清を回収した。回収した培養上清は、ペプスタチン、ロイペプチン、ＥＤＴＡを１０μＭとなるようにそれぞれ添加したＰＢＳ−に対して、４８ｈｒ透析を行った。透析交換は、１日あたり３回実施した。次に、市販のニッケルカラムＰｒｏＢｏｎｄにてヒスチジンタグアフィニティカラムクロマトグラフィーを行った。平衡化は、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．８で十分に行い、その後、透析後の培養上清をニッケルカラムにアプライした。多くの培養上清中の蛋白質は、素通りし、十分に洗浄後、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ４．０ でグラージェント溶出した。次に、平衡化バッファーにて、透析を一昼夜行い、平衡化したカラムに対して、リクロマトした。溶出画分を市販のエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｕｔｕｒｅ ｋｉｔ；Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と２０℃で終夜反応させ、活性型と考えられるＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインを得た。同サンプルは、上記アフィニティカラムに供し、素通りした画分をＰＢＳ−に透析後、濃縮し活性型ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメイン精製標品とした。本標品は銀染色にて、分子量約３０Ｋの位置にバンドを示した。次に、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２， １３０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ ７．５に、０〜１μｇ／ｍｌの濃度に最終標品を調製し、最終基質濃度４ｍＭとなるようにＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（３０５７，蛋白質研究奨励会）を添加した。３７℃で３０−６０分反応を実施した後、５０％ 酢酸で反応を停止後、その基質特異性をＯＤ４０５ｎｍの吸収で検討解析した。その結果、大腸菌内で発現されるセリンプロテアーゼドメインは、トリプシン型の基質を効率よく切断した。
【０１３０】
（３）大腸菌発現プラスミドｐＭ５００４の構築
大腸菌を宿主として、ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインを細胞内で発現させる発現プラスミドを以下の方法で構築した。
【０１３１】
センスプライマー６とアンチセンスプライマー９（５’−ＡＣＧ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＣＧ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＡＣＣ ＣＴＴ Ｔ−３’）を用い、ｐＭ７８１を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。また、センスプライマー８（５’−ＡＡＡ ＧＧＧ ＴＡＴ ＡＡＡ ＡＴＡ ＡＡＡ ＴＧＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＡＣＧ ＡＴＡ ＡＧＡ ＴＣＧ Ｔ−３’）とアンチセンスプライマー７を用い、ｐＭ５００２を鋳型に同様にＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により回収した後に、これら断片の混合物を鋳型として、センスプライマー６とアンチセンスプライマー８を用いてさらにＰＣＲ反応を行った。その後ＰＣＲ産物をフェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿でＤＮＡ断片を回収した。ＭＥＧＡＬＡＢＥＬキット（ＴａＫａＲａ）を用いて５’末端をリン酸化した後に、次にＨｉｎｄＩＩＩにてこのＤＮＡ断片を消化し、約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＭ７８１をＢａｍＨＩで消化後、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）で末端を平滑化した。その後、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化し約３．３ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて回収し、ベクターとした。このベクター断片と先のＤＮＡ断片を定法に従いライゲーションし、ＪＭ１０９コンピテント細胞を形質転換した。得られたコロニーをＰＣＲで解析し、目的のプラスミド（ｐＭ５００４）を持つ形質転換株（ＪＭ１０９（ｐＭ５００４））を得た。
（４）大腸菌（細胞内）での発現
組換え株ＪＭ１０９（ｐＭ５００４）を５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ−ブロース５ｍｌにて３７℃で終夜培養後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有Ｌ−ブロース５０倍量に、この培養液を植菌し、３７℃にて約１時間培養した。培地に終濃度１０μｇ／ｍｌの３β−インドールアクリル酸（和光純薬工業）を添加し、３０℃でさらに１８時間培養した。得られた培養混合物を遠心分離し、大腸菌を集菌した。集菌した大腸菌は、ペプスタチン、ロイペプチン、ＥＤＴＡを１０μＭとなるようにそれぞれ添加したＰＢＳ−に対して懸濁後、超音波処理による菌体破砕を実施し、可溶性画分、不溶性画分に遠心分離によって分けた。その後、凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の可溶化を２０ｍＭリン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ＋８Ｍ 尿素 ｐＨ７．８を用いて実施した。次に、市販のニッケルカラムＰｒｏＢｏｎｄにてヒスチジンタグアフィニティカラムクロマトグラフィーを行った。平衡化は、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭ ＮａＣｌ ＋ ８Ｍ 尿素、ｐＨ７．８で十分に行い、その後、凝集体を可溶化した上記サンプルをニッケルカラムにアプライした。多くの培養上清中の蛋白質は素通りし、十分に洗浄後、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ ＋８Ｍ 尿素 ｐＨ４．０ でグラージェント溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて、混入蛋白質のない画分を選別し、２０ｍＭ リン酸バッファー＋５００ｍＭＮａＣｌ ＋８Ｍ 尿素 ｐＨ７．８で０．２ｍｇ／ｍｌ （ＯＤ２８０換算 ＯＤ１＝１ｍｇ／ｍｌ）となるように調製した。次に、１０倍量の外液バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＬｉＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＧＳＳＧ、１ｍＭＧＳＳＨ、ｐＨ８．０）に対して終夜透析を行い、ついで半量づつ１日３回交換するという作業を２日間実施した。最終透析倍率６４０倍ＰＢＳ− １００倍量に対して透析、遠心後、フィルトレーションを実施した。この標品を、市販のエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｕｔｕｒｅ ｋｉｔ；Ｎｏｖａｇｅｎ社製）と２０℃で終夜反応させ、活性型と考えられるＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインを得た。同サンプルを上記アフィニティカラムに８Ｍ 尿素を除いたｂｕｆｆｅｒ条件下で供し、素通りした画分をＰＢＳ−に透析後、濃縮し、活性型ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメイン精製標品とした。本標品は銀染色にて、分子量約３０Ｋの位置にバンドを示した。大量のＭＰ４９３調製に適した精製系であった。次に、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２， １３０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液 ｐＨ ７．５に、０〜１μｇ／ｍｌの濃度に最終標品を調製し、最終基質濃度４ｍＭとなるようにＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（３０５７，蛋白質研究奨励会）を添加した。３７℃で３０−６０分反応を実施した後、５０％ 酢酸で反応を停止後、その基質特異性をＯＤ４０５ｎｍの吸収で検討解析した。その結果、リフォルディングさせたＭＰ４９３はトリプシン型の基質を効率よく切断した。
【０１３２】
実施例５ 実験によるスクリーニング系の確立と基質特異性・阻害スペクトラム測定
組換え体として調製したＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインの阻害剤スペクトラムを検討した。１０ｍＭ ＣａＣｌ_２， １３０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液 ｐＨ ７．５にて、０〜１μｇ／ｍｌの濃度に調製した。この際、プロテアーゼ阻害剤として知られるＥ−６４、ロイペプチン、ＥＤＴＡ、ペプスタチン、ＰＭＳＦを１μＭとなるようにバッファー中に溶解した。次に最終基質濃度 ４ｍＭとなるようにＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（３０５７，蛋白質研究奨励会）を調製し、３７℃で３０−６０分反応を実施した。５０％ 酢酸で反応を停止後、その基質特異性をＯＤ４０５ｎｍの吸収で検討、解析した。
【０１３３】
その結果、阻害剤を含まない試料のＯＤ４０５ｎｍ吸収に比較して、ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインは明らかにセリンプロテアーゼの阻害剤であるＰＭＳＦによってその水解活性が強く阻害された。これにより、ＭＰ４９３は、その一次配列および立体構造から予測された結果どおりにセリンプロテアーゼの機能を有することが確認された。
【０１３４】
次に、組換え体として製造、精製したＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインを１０ｍＭ ＣａＣｌ_２， １３０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．１％ ＢＳＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液 ｐＨ ７．５にて、０〜１μｇ／ｍｌの濃度に調製した。次に最終基質濃度 ４ｍＭとなるように、ヒト喀痰由来エラスターゼ（ＳＥ５６３，Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が切断する基質としてＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｎａ．０．７Ｈ２Ｏ（ＳＰ−０４−１４１０１Ａ，コスモバイオ） を、またヒト・ファクター Ｘａ（エンザイム・リサーチ）が切断する基質としてＳ−２２２２（第一化学薬品） を、ヒト・トロンビン（Ｔ−６７５９，ＳＩＧＵＭＡ）が切断する基質としてはＳ−２２３８（第一化学薬品）を、更にトリプシンの基質としてＢｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（３０５７，蛋白質研究奨励会）を、ブタ膵エラスターゼ（Ｅ−１２５０ＳＩＧＵＭＡ）が切断する基質としてＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ（３０７１，ペプチド研）を、キモトリプシンが切断する基質としてＢｚ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ（ペプチド研）を、カリクレインが切断する基質としてＳ−２３０２（第一化学薬品）を、プラスミンが切断する基質としてＳ−２２５１（第一化学薬品）をそれぞれ調製し、ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインを添加後３７℃で３０−６０分反応を実施した。５０％ 酢酸で反応を停止後、その基質特異性をＯＤ４０５ｎｍの吸収で検討解析したところ、トリプシンの基質をもっとも迅速確実に切断することが判明した。一方で、ブタ膵エラスターゼ（Ｅ−１２５０ＳＩＧＵＭＡ）が切断する基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡに対しては切断活性が弱かった。この結果はＭＰ４９３の予測立体構造から推測される基質特異性と全く同じであり、合成基質に関してはトリプシンが好んで切断するＰ１部位に塩基性のアミノ酸残基を特に有する基質を好んで切断する傾向があることを示している。すなわち、ＭＰ４９３は、膜結合型の新規のトリプシン型セリンプロテアーゼであることが、実験的に証明された。
【０１３５】
実施例６ 化合物のＭＰ４９３に対する活性調節作用の評価方法
（１）ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインの空間座標化
ＭＰ４９３の２１７番〜４５３番のアミノ酸残基に相当する配列情報を下に、全自動モデリングシステムＦＡＭＳ（Ｏｇａｔａ， Ｋ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． Ｍｏｄｅｌ．， Ｖｏｌ．１８， ｐｐ．２５８−２７２ （２０００））を用いて、ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインのモデル構造を空間座標として構築した。このとき、ＦＡＭＳが主鎖構造の構築に用いる立体構造データベースとして、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ （ＰＤＢ）（Ｈ． Ｍ． Ｂｅｒｍａｎ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ．２８， ｐｐ．２３５−２４２ （２０００）， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）の２０００年８月３１日リリースからＷｅｂでのＣｕｌｌｅｄ ＰＤＢ Ｌｉｓｔｓサービス（Ｒｏｌａｎｄ Ｌ． Ｄｕｎｂｒａｃｋ， Ｊｒ． ｅｔ． ａｌ．， ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｃｃｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｌａｂｓ／ ｄｕｎｂｒａｃｋ／ｃｕｌｌｅｄｐｄｂ．ｈｔｍｌ）を利用して、１）５０アミノ酸残基以上、２）解像度８Å以下、３）ＮＭＲ構造を含む、４）Ｃαのみの構造を含まない、の条件で９０％以上の相同配列をクラスタリングし、配列冗長性を除いたデータセット（３７０３構造）を作成して使用した。また、側鎖構造の構築に用いるデータベースは、ＦＡＭＳオリジナルのものを使用した。この結果、２１７〜４４３番目のアミノ酸残基部分の空間座標を得た。
【０１３６】
モデル構造の空間座標を決定した後、さらに分子設計支援ソフトウエアパッケージＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｄｉｅｇｏ， ＣＡ）のモジュールであるＰｒｏｆｉｌｅｓ−３Ｄ等の蛋白質立体構造評価プログラムを用いて、構築された座標に理論上の問題がないことを検証した。このモデル構造を図４に示す。
【０１３７】
（２）ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインモデル構造の解析
ＴＭＰＲＳＳ２のセリンプロテアーゼドメインのモデル構造を（１）の方法に則り構築した後、ＭＰ４９３のセリンプロテアーゼドメインの構造と比較した。また、ＭＰ４９３の活性中心近傍の残基はトリプシンと相同性が高いため、ＰＤＢに登録されているヒトトリプシン（ＰＤＢコード：１ＴＲＮ）とＭＰ４９３モデル構造との比較を行った。
【０１３８】
ＭＰ４９３と、ＴＭＰＲＳＳ２及びトリプシン構造との重ね合わせをＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＨｏｍｏｌｏｇｙモジュールを使用して行った後、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩを使用してその構造を観察した。その結果、Ｓ１ポケット構造は全ての構造で良く一致していたが、Ｓ２ポケットとＳ４ポケットを形成している３０１番目のアミノ酸残基（キモトリプシン番号で９９番残基）が、ＴＭＰＲＳＳ２ではＬｙｓ（トリプシンではＬｅｕ）であるのに対してＭＰ４９３ではＬｅｕであった。またＳ４ポケットを形成している３００番、３７８番、４２０番目のアミノ酸残基（キモトリプシン番号で９８番、１７５番、２１５番残基）が、ＴＭＰＲＳＳ２ではＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ（トリプシンではＴｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ）であるのに対してＭＰ４９３ではＡｇｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅであった。
【０１３９】
（３）化合物の評価
化合物データは、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ （ＡＣＤ） バージョン１９９９．２ （ＭＤＬ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ， ＣＡ）に登録されている化合物を使用した。
【０１４０】
セリンプロテアーゼ阻害剤との複合体結晶構造（ＰＤＢコード：１ＥＫＢ， １Ａ０Ｌ， １ＧＣＴ， １ＢＲＵ， １Ａ０Ｊ， ２ＴＢＳ， １ＦＸＹ， １ＤＡＮ）を参考にし、ＭＰ４９３の阻害剤の結合標的サイトを構築するアミノ酸残基を推定した。該当する残基は、２５７（Ｈｉｓ）， ３０１（Ｌｅｕ）， ３０４（Ａｓｐ）， ３７８（Ｉｌｅ）， ３８６（Ａｌａ）， ３８７（Ｇｌｙ）， ３９４（Ａｓｐ）， ３９５（Ｓｅｒ）， ３９６（Ｃｙｓ）， ３９７（Ｇｌｎ）， ３９８（Ｇｌｙ）， ３９９（Ａｓｐ）， ４００（Ｓｅｒ）， ４１８（Ｔｈｒ）， ４１９（Ｓｅｒ）， ４２０（Ｐｈｅ）， ４２１（Ｇｌｙ）， ４２２（Ｉｌｅ）， ４２３（Ｇｌｙ）， ４２４（Ｃｙｓ）， ４２９（Ｌｙｓ）， ４３０（Ｐｒｏ）， ４３１（Ｇｌｙ）， ４３２（Ｖａｌ）， ４３３（Ｔｙｒ）番であった。分子ドッキングパッケージＤＯＣＫバージョン４．０．１を用いてマニュアルに従い、バーチャルスクリーニングを実施した。このとき、ＤＯＣＫのｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｅａｒｃｈ機能を使用し、ｅｎｅｒｇｙ ｇｒｉｄを使用して、最もスコアの高いコンホメーションと結合様式の組み合わせをその化合物の結合様式とした。
【０１４１】
ドッキング終了後、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩを用いて、スコア上位２０００化合物の中から、我々が予め活性ポケットと推測した部位に形状相補性が良好な状態で結合している２３７化合物を抽出した後、適当と考えられた３０化合物のＭＰ４９３酵素阻害活性を実施例５に示した手法を用いて測定した。この結果、４化合物にＭＰ４９３酵素阻害活性が認められた。同様の手法により、他の化合物データベースからもＭＰ４９３阻害活性を示す２６化合物を得た。
【０１４２】
実施例７ ＭＰ４９３阻害物質の３次元薬理作用団の特定とこれを用いたスクリーニング
（１）３次元薬理作用団の特定
Ｄａｙｌｉｇｈｔクラスタリングパッケージバージョン４．５１のＪａｒｖｉｓ−Ｐａｔｒｉｃｋ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ法を使用し、実施例６でＭＰ４９３阻害活性を示した化合物を用いて非階層型クラスタリングを行い、３つのクラスターと７つのシングルトンに分類した。得られた３クラスターにおいて最もＭＰ４９３阻害活性が強い化合物をクラスターの代表化合物とし、各クラスターの代表化合物とＭＰ４９３の結合様式を、ＤＯＣＫを用いたフレキシブルドッキングにより探索した。評価グリッドはｅｎｅｒｇｙ ｇｒｉｄを使用した。その後、各化合物の最もスコアの高い結合様式を初期構造として、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いた分子力学計算による構造最適化をＭＰ４９３構造をフィクス（Ｆｉｘ）して行い、ＭＰ４９３と代表化合物の複合体モデル構造を得た。
【０１４３】
次に、クラスターごとに、代表化合物は上記で得られた複合体モデル構造の結合コンホメーションを用い、代表以外の化合物はＣａｔａｌｙｓｔリリース４．５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）のＣａｔＣｏｎｆを使用してＢｅｓｔ法により最大２５５コンホメーションを発生させた後、ＣａｔａｌｙｓｔのＨｉｐＨｏｐを使用し、常法によりクラスター内の全ての化合物に共通して存在する薬理作用団を抽出した。
【０１４４】
さらに、各クラスターの薬理作用団を、そのクラスターの代表化合物とＭＰ４９３複合体モデル構造に重ね合わせて、全てのクラスターの薬理作用団をＭＰ４９３構造にマッピングした。
【０１４５】
（２）薬理作用団を使用したスクリーニング
ＣａｔａｌｙｓｔのＣａｔＳｅａｒｃｈを使用し、表１から表３に示した全ての特性球の内、３つ以上の点を同時に満たす化合物をＡＣＤ化合物から検索した。得られた化合物は、実施例６で示した方法に則ってクラスタリングを行い、２０化合物のＭＰ４９３阻害活性を実施例５に示した手法を用いて測定したところ、８化合物が１０μｇ／ｍＬの濃度で５０％以上の阻害を示した。
【０１４６】
また、実施例６におけるＤＯＣＫを用いたバーチャルスクリーニングでドッキング状態が良好だった化合物を対象に、表１から表３に示した全ての特性球の内、３つ以上の点を同時に満たす化合物を抽出した。得られた化合物は、実施例６で示した方法に則ってクラスタリングを行い、２０化合物のＭＰ４９３阻害活性を測定したところ、１３化合物が１０μ／ｍＬの濃度で５０％以上の阻害を示した。
【０１４７】
試験例 ＭＰ４９３活性調節剤の薬学的効果の評価方法
癌細胞浸潤に対する薬効評価
癌細胞浸潤に対する薬効測定は、ボイデンチャンバーを用いた磯合、熊谷の方法（がんの浸潤・転移研究マニュアル、磯合、熊谷、１２５頁−１３１頁、金芳堂、１９９５年）に準じ、マウス黒色腫由来Ｂ１６Ｆ１０細胞の浸潤能に対する被検薬の阻害効果を調べることによって実施できる。
【０１４８】
ボイデンチャンバー内の直径８μＭの細孔を有するフィルターをマトリゲルでコートし、チャンバー上室にＢ１６Ｆ１０細胞２×１０^５ 個および被検薬を添加する。対照には、被検薬の代わりに０．１％ウシ胎児血清アルブミン−ダルベッコ変法イーグル培養液（以下、ＢＳＡ−ＤＭＥＭと略す）を添加する。チャンバー下室にはケモアトラクタントとしてフィブロネクチンを含む培養液をいれる。一晩培養し、マトリゲルを浸潤しフィルター下面に移動したＢ１６Ｆ１０細胞の数をＭＴＴ比色定量法にて測定し、対照の０．１％ＢＳＡ−ＤＭＥＭ添加と比較することで、ＭＰ４９３制御物質の癌浸潤抑制効果を測定できる。
【０１４９】
癌の肺転移抑制に対する薬効評価
藤猪、済木の方法（がんの浸潤・転移研究マニュアル、藤猪、済木、７頁−１１頁、金芳堂、１９９５年）に準じ実施する。６週令の雄性ＢＤＦ１マウスに、マウス黒色腫由来Ｂ１６Ｆ１０細胞１×１０^５ 個を尾静脈内注射することにより移植する。ドーズを振った適当量のＭＰ４９３制御物質、はＢ１６Ｆ１０細胞と共に尾静脈内注射する。検体をその後２日間投与し、細胞移植より１５日後にマウスを屠殺し、肺の癌コロニー数（即ち、転移結節数）を数え対照のリン酸緩衝生理食塩水投与群と比較することで、ＭＰ４９３阻害物質の癌細胞の肺転移抑制作用を評価できる。
【０１５０】
肺障害に対する薬効評価
マウスあるいはラットにエンドトキシンを腹腔内投与あるいは静脈内投与することによりＡＲＤＳモデルを作成する。ＭＰ４９３活性制御物質は、エンドトキシン投与直前あるいは数時間後に静脈内投与、腹腔内投与、あるいは経口投与する。エンドトキシン投与１８時間後に肺を摘出し、その湿乾重量比および肺組織中漏出色素量または肺組織に浸潤したリンパ球数を測定することで、ＭＰ４９３活性調節剤の肺障害に対する効果を評価することができる。
【０１５１】
（４）腎障害に対する薬効評価
体重１８０ｇ〜２２０ｇのＳＤラット（７〜８週例）をペントバルビタールを腹腔内投与することにより麻酔し、背位固定した後開腹する。左腎動脈上、中、下枝３本のうち上下枝２本を結紮する。さらに１週間後に右腎を摘出し、５／６腎摘ラットを作成する。ＭＰ４９３活性調節物質は、術後より０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与する。該物質は飼料に混ぜて投与してもよい。腎摘より２週間毎に採尿し、尿中蛋白質濃度および尿中尿素濃度を測定する、または病理学的観察を行って糸球体硬化指数および間質繊維化比率を測定することで、ＭＰ４９３活性調節剤の腎障害に対する効果を評価することができる。
【０１５２】
また、体重１８０ｇ〜２２０ｇのＳＤラット（７〜８週例）に糸球体基底膜ウサギ抗血清を静脈内投与し、その翌日にウサギγ−グロブリンをフロイント完全アジュバントと乳化し、両後肢足跡皮内に注射する。投与後１９日目に採尿し、尿蛋白質濃度および尿中尿素濃度を測定する、または病理学的観察を行って糸球体病変を観察することで、ＭＰ４９３活性調節剤の腎障害に対する効果を評価することができる。
【０１５３】
【発明の効果】
ＭＰ４９３が優位に発現する組織におけるセリンプロテアーゼ関連疾患、特に各種癌、各種肺疾患、喘息、アレルギー、気管支炎、肺気腫、ウイルス性疾患、ショック、多臓器不全、膵炎、各種腎炎などに関する疾患の診断・研究・予防及び治療において利用できる。
【０１５４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＭＰ４９３とアミノ酸配列上の相同性の高い他の蛋白質とのアライメント結果を示す。図中、左端の表示はＭＰ４９３を除き、蛋白質をＰＤＢアクセッション番号で示したものであり、ＡＡＦ９７８６７はＴＭＰＲＳＳ２を、ＡＡＦ６４１８６は、マウスのプラズマ膜貫通型蛋白質Ｘを、ＮＰ００５６４７はヒト膜貫通型セリンプロテアーゼ２を、ＮＰ０５６５９０はマウス膜貫通型セリンプロテアーゼ２を、それぞれ示す。
【図２】図２は、公知のセリンプロテアーゼとのアライメント結果を示す。図中、ＴＭＳ２は 膜貫通型セリンプロテアーゼ２を、ＨＥＰＳはヘプシンを、ＴＲＰ１はトリプシン１を、ＴＲＰ２はトリプシン２をＴＲＹＢはβトリプターゼを、ＣＦＡＩはファクターＩを、それぞれ示す。
【図３】図３は、公知のセリンプロテアーゼとのドメイン構造の相関図を示す。
【図４】図４は、ＭＰ４９３セリンプロテアーゼドメインのモデル構造を示す。
【図５】図５は、表１に示される特性球の配置を有する薬理作用団を示す。
【図６】図６は、表２に示される特性球の配置を有する薬理作用団を示す。
【図７】図７は、表３に示される特性球の配置を有する薬理作用団を示す。
【図８】図８は、表１〜表３に示される全ての特性球の配置を有する薬理作用団を示す。

Claims (18)

1. 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号：１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
2. 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号：４のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつセリンプロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
3. 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
4. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリンプロテアーゼ活性を有する蛋白質。
5. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセリンプロテアーゼ活性を有する蛋白質。
6. 請求項１または請求項２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
7. 請求項６に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
8. 請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
9. 核酸配列が、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡの核酸の全部または一部に相補する配列である、請求項８に記載のアンチセンス核酸。
10. 請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
11. 請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と候補物質とを接触させ、該蛋白質のセリンプロテアーゼ活性の変化を検出することを特徴とする、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
12. 請求項６に記載の組換えベクターまたは請求項７に記載の形質転換細胞と候補物質とを接触させ、請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
13. 請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質に対する活性調節作用を示す化合物の検索方法であって、
    （１）該蛋白質のプロテアーゼドメインにおける基質結合部位を構成するアミノ酸残基の配置を空間座標化する段階、
    （２）化合物の立体構造を空間座標化する段階、
    （１）及び（２）の空間座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階
    を含むことを特徴とする、該蛋白質に対する活性調節作用を示す化合物の検索方法。
14. ＸＹＺ座標系上の下記座標に配置された特性球のうち少なくとも任意の３点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作用団を有する、請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質の活性調節剤；
    特性球１；Ｘ座標７．７９、Ｙ座標１３．５５、Ｚ座標１５．２５に中心を有する半径１．７Åの第１の疎水性領域、
    特性球２；Ｘ座標３．９２、Ｙ座標１１．４２、Ｚ座標１１．５８に中心を有する半径１．７Åの第２の疎水性領域、
    特性球３；Ｘ座標３．６８、Ｙ座標１０．６３、Ｚ座標１５．３６に中心を有する半径１．７Åの水素結合受容体領域Ｒを開始点とし、Ｘ座標２．７４、Ｙ座標８．１５、Ｚ座標１６．８２に中心を有する半径２．３Åの水素結合受容体領域Ｔを終点とするベクトルで、水素結合受容体原子から（水素結合受容体原子に存在する）非共有電子対への位置・方向が定義される水素結合受容体領域、
    特性球４；Ｘ座標４．３６、Ｙ座標１０．２６、Ｚ座標８．４７に中心を有する半径１．７Åの陽イオン性領域。
15. ＸＹＺ座標系上の下記座標に配置された特性球のうち少なくとも任意の３点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作用団を有する、請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質の活性調節剤；
    特性球１；Ｘ座標１３．２５、Ｙ座標１６．８２、Ｚ座標１１．４８に中心を有する半径１．７Åの第１の疎水性領域、
    特性球２；Ｘ座標７．００、Ｙ座標７．０７、Ｚ座標７．６６に中心を有する半径１．７Åの第２の疎水性領域、
    特性球３；Ｘ座標５．２６、Ｙ座標１７．１９、Ｚ座標９．４６に中心を有する半径１．７Åの水素結合受容体領域Ｒを開始点とし、Ｘ座標３．９３、Ｙ座標１６．７１、Ｚ座標６．８０に中心を有する半径２．３Åの水素結合受容体領域Ｔを終点とするベクトルで、水素結合受容体原子から（水素結合受容体原子に存在する）非共有電子対への位置・方向が定義される水素結合受容体領域、
    特性球４；Ｘ座標５．１５、Ｙ座標９．５３、Ｚ座標８．５５に中心を有する半径１．７Åの第１の環状芳香族性領域Ｒを開始点とし、Ｘ座標２．８０、Ｙ座標７．６９、Ｚ座標８．８０に中心を有する半径１．７Åの第２の環状芳香族性領域Ｔを終点とするベクトルを垂線として環平面が定義される環状芳香族性領域。
16. ＸＹＺ座標系上の下記座標に配置された特性球のうち少なくとも任意の３点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作用団を有する、請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質の活性調節剤；
    特性球１；Ｘ座標１２．０２、Ｙ座標１６．５６、Ｚ座標１３．３１に中心を有する半径１．７Åの第１の疎水性領域、
    特性球２；Ｘ座標７．３４、Ｙ座標１４．９２、Ｚ座標１６．７３に中心を有する半径１．７Åの第２の疎水性領域、
    特性球３；Ｘ座標３．９０、Ｙ座標１１．２３、Ｚ座標１０．８９に中心を有する半径１．７Åの第３の疎水性領域、
    特性球４；Ｘ座標３．９６、Ｙ座標１０．４４、Ｚ座標７．４６に中心を有する半径１．７Åの陽イオン性領域。
17. 請求項１４乃至請求項１６に記載の全ての特性球のうち、任意の３点の特性球の相対配置を満足させる薬理作用団を有する請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質の活性調節剤。
18. 下記段階；
    （１）化合物の立体構造を空間座標化する段階、
    （２）該空間座標と請求項１４乃至請求項１７に記載された各薬理作用団を規定する特性球の空間座標とを対比させる段階、
    （３）（１）の空間座標が該薬理作用団における少なくとも３点以上の特性球の相対配置を満足させることを確認する段階、
    を含む、請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の蛋白質に対する活性調節作用を示す化合物を検索もしくは設計する方法。

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