JP2003502036A - カスパーゼ−８の結晶、モデルおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 カスパーゼ−８／インヒビター複合体を結晶化し、組換えヒト・カスパーゼ−８の三次元ｘ−線結晶構造を原子分解能（１.２Å）で解明し、基質結合ポケットを同定した。このｘ−線結晶構造は他の分子または分子複合体の構造を解明し、カスパーゼ−８活性のモジュレーターをデザインするのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 カスパーゼは、炎症およびアポトーシスにおいて重要な細胞内役割を果たして
いる関連システイン・プロテアーゼのファミリーに属する。最近では１ダース以
上の数が確認されているこのタンパク質ファミリーのメンバーは、共通する種々
の特徴を共有しているが、システイン・プロテアーゼのパパイン・スーパーファ
ミリーに構造的には無関係である。それらは、すべて、ペプチド結合を攻撃する
ための求核原子として保存システイン残基を利用し、切断部位は全てペプチド基
質のＰ１ポジションにアスパラギン酸を示す。カスパーゼの触媒ドメインはおよ
そ３０ｋＤａの質量を有し、２のポリペプチド鎖、すなわち、活性部位システイ
ンを含む１７-２０ｋＤａのＮ−末端（α−サブユニット）フラグメント、およ
び該活性部位の形成に寄与する１０−１２ｋＤａのＣ−末端（β−サブユニット
）を含む。これらの鎖は、一本鎖チモーゲン前駆体の内部切断によって生じ、α
βヘテロダイマーで強固に会合する。これらのコンポーネント・ポリペプチドに
生じるタンパク質加水分解プロセシングは、自触媒作用か、または同様な特異性
の他のカスパーゼまたは酵素（例えば、グランザイムＢ）によって媒介される。
αβ二量体タンパク質は会合して、触媒活性に必要なようであるα_２β_２ヘテロ
テトラマーをさらに形成する。酵素／リガンド複合体の三次元構造が、カスパー
ゼ−１（インターロイキン変換酵素；ＩＣＥ）(Walkerら, Cell 78: 343−352(1
994)；Wilsonら, Nature 370: 270-275 (1994)）およびカスパーゼ−３（ＣＰＰ
３２、apopain, Yama）(Rotondaら, Nat. Struct. Biol. 3: 619-625 (1996); M
ittlら, J. Biol. Chem. 272: 6539-6547 (1997))の両方について２.３ないし２
.５Åの分解能で報告されている。

【０００２】 全てのタンパク質加水分解酵素と同様に、カスパーゼは不活性な前駆体または
プロ酵素として存在する。カスパーゼのＮ−末端プロドメインの長さは、如何に
活性化が調節されるかに依存してかなり変化する。本発明者らの関心は、アポト
ーシスに関与するこれらのカスパーゼ、基本的にはカスパーゼ−８およびその天
然基質のうちの１、カスパーゼ−３に焦点があてられている。カスパーゼ−３お
よびカスパーゼ−８の触媒領域は、長さ、活性部位システインの位置、および活
性化に必要なプロセシングのパターンに関して非常によく対応する。これら２の
間の顕著な差異は、カスパーゼ−８におけるＮ−末端プロドメインのより長い長
さであり、その領域には２の細胞死−エフェクター・ドメイン（ＤＥＤ）が含ま
れる。活性化した細胞死−開始シグナリング複合体（ＤＩＳＣ）の免疫沈降実験
は、カスパーゼ−８が活性化受容体複合体のコンポーネントであることを示して
いる。プロカスパーゼ−８のＤＥＤとＦＡＤＤおよびＴＲＡＤＤの細胞死ドメイ
ン（ＤＤ）との間の配列ホモロジーのため、細胞死ドメインタンパク質はＴＮＦ
およびＦａｓ受容体と結合し（Medemaら, EMBO J. 16: 2794-2804 (1997)）、Ｄ
ＥＤは活性化受容体へのプロカスパーゼ−８の結合または補充を生じると考えら
れる。したがって、プロカスパーゼ−８は、活性化ＤＩＳＣのコンポーネントと
して、ＴＮＦ−αのごとき種々のエフェクターによって誘導されるシグナル伝達
の直接ラインに位置する。ＦａｓリガンドまたはＴＮＦ−αによるＦａｓまたは
ＴＮＦ受容体の活性化は、プロカスパーゼ−８の自触媒活性化を生じる。ついで
、活性化したカスパーゼ−８は、カスパーゼ−３の様な他の下流カスパーゼを活
性化すると考えられ、カスパーゼ−３はより短いプロセグメントを有し、その細
胞内濃度はその自触媒プロセシングおよび活性化を支持するのに充分に高くはな
い。それ故に、カスパーゼ−８は“上流”カスパーゼと命名されており、Ｆａｓ
またはＴＮＦ媒介アポトーシス・カスケードの頂部に位置すると考えられる。お
そらくありそうなその役割は、カスパーゼ−３のごとき下流カスパーゼを活性化
するためのプライム・ムーバーとして、すなわち機能がプログラム細胞死におい
て重要な細胞タンパク質を破壊することであるアポトーシスの“実行者”として
作用することである。

【０００３】 そのＦａｓまたはＴＮＦ媒介アポトーシスにおける開始役割のため、カスパー
ゼ−８は種々の疾患で起こる望ましくない細胞死の遮断におけるもっともらしい
標的である。この活性を選択的に阻害するであろう薬剤は重要な臨床適用を効果
的に見出し、薬剤デザインに向けての１の道はよく明らかにされた酵素／インヒ
ビター複合体の三次元構造を介することである。

【０００４】 発明の概要 タンパク質の構造知見は、体内におけるタンパク質の作用のメカニズムを研究
する手段を提供する。本発明の目的は、カスパーゼ−８の三次元構造の情報を提
供すること、および、さらにカスパーゼ−８または変化した触媒活性を有するカ
スパーゼ−８突然変異体の活性を特異的に阻害するか、さもなければそれに影響
を及ぼす小分子の合理的薬剤デザインを可能とすることにある。例えば、コンピ
ュータ・モデルは、種々の受容体分子に対するカスパーゼタンパク質の結合を予
想し得る。かかる結合が実際に起きていることを発見すれば、化学者は、タンパ
ク質構造の知見によってカスパーゼ−８のその受容体に対する機能的な結合を模
倣する化学基をデザインおよび合成することができ、それは合理的薬剤デザイン
として知られるようになってきている。

【０００５】 カスパーゼ−８／インヒビター複合体を結晶化し、組換えヒト・カスパーゼ−
８の三次元ｘ−線結晶構造を原子分解能（１.２Å）で解明した。基質結合ポケ
ットを同定し、その構造座標を図１０に掲載する。かくして、本発明は、カスパ
ーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む
分子または分子複合体を提供する。基質結合ポケットには、約２.０Å未満の、
図１０による構造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８
、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、
Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐ
ｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原子からの二乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差
を有する点のセットによって規定される骨格原子が含まれる。分子または分子複
合体内のこれらの骨格原子のポジションは、好ましくは実質的にいずれの二乗平
均平方根偏差をともなわず、図１０による構造座標によって表される。基質結合
ポケットは、さらに、約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表され
るカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓ
ｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ
４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の非水
素側鎖原子からの二乗平均平方根偏差を有する点のセットによって規定し得る。
別法として、基質結合ポケットは、約２.０Å未満の、図１０による構造座標に
よって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ
２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４
１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ
４２０の骨格原子を特徴付ける原子間距離からの二乗平均平方根偏差を有する原
子間距離によって特徴付けられる骨格原子を含んで規定し得；あるいは、約１０
Åの半径を有する球形内に位置し、かつ、残基３６０のアルファ炭素原子を表す
座標上に中心化された図１０による構造座標によって表されるカスパーゼ−８ア
ミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を有する点のセットによって規定さ
れる骨格原子を含んで規定し得る。また、カスパーゼ−８分子または分子複合体
に構造的に相同な分子または分子複合体も提供する。

【０００６】 高い質のカスパーゼ−８のｘ−線結晶構造は、リガンドと酵素サブサイトとの
間の詳細な相互作用を評価する、および、最適化された結合特性を有するインヒ
ビターを開発する重要な基礎として作用する。したがって、１の態様において、
本発明は、Ｘ−線結晶学によって決定した、および、図１０に示す構造座標によ
って表されるカスパーゼ−８の三次元構造に関する。さらに、本発明は、カスパ
ーゼ−８のモデルおよびカスパーゼ−８のモデルがそれに保存されたコンピュー
タ読み出し可能形態に関する。また、カスパーゼ−８の三次元構造およびモデル
を用いる方法も含む。例えば、カスパーゼ−８の構造座標を用いて、カスパーゼ
−８相同体の結晶構造、ならびにカスパーゼ−８、カスパーゼ−８の突然変異体
および共複合体または構造的に関連するタンパク質の他の結晶形を解明し得る。
構造座標は、タンパク質のカスパーゼ・ファミリーの他のメンバー、または他の
構造的に関連するタンパク質の構造をモデリングする出発点としても作用し得る
。“合理的薬剤デザイン”におけるカスパーゼ−８の構造座標の使用も意図して
いる。詳細には、本発明は、カスパーゼ−８の基質結合ポケットの少なくとも一
部分を規定する複数のカスパーゼ−８アミノ酸の骨格原子を表す図１０による構
造座標から導き、かつ、約２.０Å未満の、その構造座標からの二乗平均平方根
偏差を有する選抜した点を含む点のスケーラブルな三次元配置を提供する。好ま
しくは、カスパーゼ−８の基質結合ポケットには、アミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓ
ｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ
３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４
１５およびＴｒｐ４２０が含まれ、点のスケーラブルな三次元配置には、カスパ
ーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１
、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、
Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原子を表
す図１０による構造座標から導いた選抜した点が含まれる。より好ましくは、選
抜した点はカスパーゼ−８の少なくとも５０の隣接する骨格原子を表し、該構造
座標から約２.０Å未満の二乗平均平方根偏差を有する。さらに、本発明は、図
１０による構造座標によって表されるカスパーゼ−８の分子または分子複合体に
構造的に相同である分子または分子複合体の少なくとも一部分の構造座標から導
いた選抜した点を含む点のスケーラブルな三次元配置を含み、ここに該選抜した
点は該構造的に相同な分子または分子複合体の構造座標から約２.０Å未満の二
乗平均平方根偏差を有する。有利には、請求項８の点のスケーラブルな三次元配
置を、物理モデル、コンピュータ描写像、ホログラフィー像または立体図として
表示する。

【０００７】 本発明は、機器読み出し可能なデータをコードするデータ保存材料を含む機器
読み出し可能なデータ保存媒体をも提供し、それは、該データを用いる命令をプ
ログラムした機器を用いる場合に、本発明のいずれかの分子または分子複合体、
またはそれらの一部分のグラフィック三次元描写を表示することができる。

【０００８】 さらに、本発明は、知られていない構造の分子または分子複合体についての構
造情報を得るためのコンピュータ支援方法も提供する。その方法では分子置換の
技術を利用し： 分子または分子複合体を結晶化し； 結晶化した分子または分子複合体からｘ−線回折パターンを創製し；ついで、 図１０に掲載する構造座標の少なくとも一部分を該ｘ−線回折パターンにあて
はめて、構造が知られていない分子または分子複合体の少なくとも一部分の三次
元電子密度地図を作成することを含む。

【０００９】 また、カスパーゼ−８ホモログをホモロジーモデリングするコンピュータ支援
方法も提供する。カスパーゼ−８ホモログのアミノ酸配列をカスパーゼ−８のア
ミノ酸配列（配列番号：１）と整列させてアミノ酸アライメントを得、ついでそ
れを用いてカスパーゼ−８ホモログの配列を図１０に掲載する構造座標セットか
ら導いたカスパーゼ−８のモデルに取込ませて、カスパーゼ−８ホモログの予備
モデルを得る。その予備モデルをエネルギー最小化に付してエネルギー最小化モ
デルを得、および、立体化学束縛を破るエネルギー最小化モデルの領域を再モデ
リングしてカスパーゼ−８ホモログの最終モデルを得る。

【００１０】 カスパーゼ−８の分子または分子複合体の結晶の結晶構造を解明する方法も提
供し、ここに結晶は三方晶空間群Ｐ３_１２１によって特徴付けられ、ａ＝ｂ＝６
２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４ű３.０Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝
１２０°の単位胞寸法を有する。

【００１１】 その方法には、 結晶からｘ−線回折パターンを創製し、 回折データを収集し、ついで、 データを解析してカスパーゼ−８の分子または分子複合体の構造座標を創製す
ることが含まれる。

【００１２】 さらに、本発明は、カスパーゼ−８活性のモジュレーターを同定するためのコ
ンピュータ支援方法も提供する。１の具体例において、該方法には： カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部
分を含む分子または分子複合体の構造座標のセットをコンピュータ・モデリング
・アプリケーションに供給し； 化学基の構造座標のセットをコンピュータ・モデリング・アプリケーションに
供給し；ついで、 該化学基が基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予想
されるか否かを決定することが含まれ、ここに該分子または分子複合体への該分
子の結合がカスパーゼ−８活性の潜在的調節の指標であることを特徴とする。

【００１３】 もう１の具体例において、該方法には： カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部
分を含む分子または分子複合体の構造座標のセットをコンピュータ・モデリング
・アプリケーションに供給し； 化学基の構造座標のセットをコンピュータ・モデリング・アプリケーションに
供給し； 該化学基と該分子または分子複合体の基質結合ポケットとの間の潜在的な結合
相互作用を評価し； 該化学基を構造的に修飾して、修飾化学基の構造座標のセットを得；ついで、 該化学基が基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予想
されるか否かを決定することが含まれ、ここに該分子または分子複合体への結合
がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とする。

【００１４】 化学基の構造座標のセットは、化学フラグメント・ライブラリーから得ること
ができ、いずれかの方法を複数回数行って化学基のライブラリーをスクリーニン
グし得る。

【００１５】 本発明は、カスパーゼ−８活性のモジュレーターのデ・ノボな（de novo）デ
ザインをも提供する。この方法には： カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部
分を含む分子または分子複合体の構造座標のセットをコンピュータ・モデリング
・アプリケーションに供給し； 構造座標のセットによって表される化学基をコンピュータ操作で構築し；つい
で、 該化学基が基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予想
されるか否かを決定することが含まれ、ここに該分子または分子複合体への結合
がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とする。 この方法には、所望により、潜在的なモジュレーターをアッセイして、それが
カスパーゼ−８活性を調節する否かを決定することも含まれ得る。本発明の方法
を用いて同定したカスパーゼ−８活性のモジュレーターは、好ましくはカスパー
ゼ−８活性のインヒビターである。

【００１６】 好ましくは、化学基が基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合する
ことが予想されるか否かを決定することには、該化学基と基質結合ポケットとの
間のフィッティング操作を行い、つづいて該フィッティング操作の結果をコンピ
ュータ操作で解析して該化学基と基質結合ポケットとの間の会合を定量化するこ
とが含まれる。

【００１７】 また、本発明は、化学基を化学的または酵素的に合成してカスパーゼ−８活性
のモジュレーターを得ることを含むカスパーゼ−８活性のモジュレーターの作製
方法も提供し、ここに該化学基は本明細書中に記載するコンピュータ支援プロセ
スの間にデザインまたは同定される。

【００１８】 さらに、本発明が、本発明の方法のいずれかの具体例により同定またはデザイ
ンしたカスパーゼ−８活性のモジュレーター、ならびにかかるカスパーゼ−８活
性のモジュレーターを含む組成物も包含することは理解されるにちがいない。本
明細書中で同定またはデザインするカスパーゼ−８活性のモジュレーター、また
はその医薬上許容される塩、ならびに医薬上許容し得る担体を含む医薬組成物も
本発明に包含される。

【００１９】 さらに、本発明は、異常なカスパーゼ−８活性を伴うかまたはそれと関連する
損傷または疾患を患う患者の治療方法も提供する。該方法には、請求項２１、２
２または２５のいずれかに記載の方法に従って同定またはデザインしたカスパー
ゼ−８活性のモジュレーターまたはその医薬上許容される塩および医薬上許容し
得る担体を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することが含まれる。該組成物
は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、卒中、ガン、脊
髄損傷、心血管疾患および神経疾患に用い得る。

【００２０】 もう１の態様において、本発明は、結晶化形態のカスパーゼ-８およびカスパ
ーゼ-８結晶を調製する方法に関する。Ｘ−線回折方法によってタンパク質の三
次元構造を決定するのに十分な品質のカスパーゼ−８の好ましい結晶を提供する
。かかる結晶を得ることは、事実、非常に意外な結果である。本願までは、カス
パーゼ−８の構造を決定するのに十分な品質の結晶を得ることが達成不可能であ
ったことはタンパク質結晶技術分野でよく知られていた。

【００２１】 したがって、本発明は、ハンギング・ドロップ蒸気拡散およびシッティング・
ドロップ蒸気拡散によって沈澱化剤溶液から結晶を成長させることを含むカスパ
ーゼ−８分子を結晶化する方法を提供する。沈澱化剤溶液には、約２ないし約５
ｍｇ／ｍｌの精製カスパーゼ−８、緩衝液および塩が含まれ、約７ないし約８の
ｐＨに緩衝化されている。カスパーゼ−８／リガンド複合体は、沈澱化剤溶液に
カスパーゼ−８活性のモジュレーターのごときリガンドを含ませることによって
成長させ得る。該モジュレーターは好ましくはカスパーゼ−８活性のインヒビタ
ーであり、より好ましくはそれはペプチドまたはペプチド模倣化合物であって、
カスパーゼ−８に共有結合している。結晶化したカスパーゼ−８、および結晶化
したカスパーゼ−８／リガンド複合体も本発明に含まれる。 結晶カスパーゼ−８または小分子リガンドと複合体形成した結晶カスパーゼ−
８を含む組成物も提供する。

【００２２】 発明の詳細な説明 本願全体を通して以下の略号を用いる： Ａ＝Ａｌａ＝アラニン Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン

【００２３】 本明細書中に記載するカスパーゼ−８構造は結晶学的に解明された三番目のカ
スパーゼであり、炎症と関連する酵素であるカスパーゼ−１ならびにアポトーシ
スの下流実行者であるカスパーゼ−３のものと比較し得る。図１は、これら３種
のタンパク質についての構造的に整列した二次構造エレメントを示し、図３はそ
れらの重ね合わせた三次構造を示す。カスパーゼ−８構造の高分解は、酵素機構
および基質の結合に関する幾つかの問題を明らかにすることも助けている。

【００２４】 現在のカスパーゼ文献においては、アミノ酸の番号付けはプロ酵素におけるそ
れらのポジションに基づいていることもあり、該プロ酵素はそれらのプロセグメ
ントの長さにおいて劇的に異なるため、このことは触媒ドメインにおける残基の
番号付けにおける相異に通じる。３のカスパーゼにおける構造的に等価なアミノ
酸の本発明者らの比較において、本発明者らは、対応するプロ酵素におけるそれ
らのポジションに従って残基を番号付けするこの約束に従う。カスパーゼ-８の
２のサブユニットはｐ１８およびｐ１１サブユニットという。本明細書中で用い
る番号付けの約束を図１ならびにプロカスパーゼ８、３および１のα−およびβ
−サブユニットの以下の概略的表示にも示す（Cohen, Biochem. J. 326: 1-16 (
1997)）：

【００２５】

【化１】

【００２６】 カスパーゼ−８の活性部位システインはポジション３６０に存在し、以下の残
基が基質結合に関与するか、さもなければ酵素の活性に寄与すると考えられる：
Ｒ２５８、Ｄ２５９、Ｒ２６０、Ｎ２６１、Ｈ３１７、Ｑ３５８、Ｙ３６５、Ｖ
４１０、Ｓ４１１、Ｙ４１２、Ｒ４１３、Ｐ４１５、Ｗ４２０。

【００２７】 別段指摘しない限り、本明細書中で用いる“カスパーゼ−８”なる語句が野生
型カスパーゼ−８、好ましくはヒト野生型カスパーゼ−８、ならびにカスパーゼ
−８アイソフォーム、カスパーゼ−８突然変異体およびカスパーゼ−８融合タン
パク質（例えば、ヒスチジン−タグド・カスパーゼ−８）を含むことが意図され
ることは理解されるべきである。“突然変異体”カスパーゼ−８は、そのアミノ
酸配列が１またはそれを超える選抜したアミノ酸の欠失、挿入または好ましくは
置換によって図１に示す野生型カスパーゼ−８配列（配列番号：１）とは異なる
ポリペプチドである。カスパーゼ−８突然変異体の例は、配列番号：１中のポジ
ション３６０のシステインがアラニンで置き換わったカスパーゼ−８突然変異体
Ｃ３６０Ａである。

【００２８】 結晶形（群）および製法 本発明の１の具体例は、カスパーゼ−８結晶（結晶カスパーゼ−８）を提供す
る。所望により、該結晶には、さらに、カスパーゼ−８と会合する低分子量化合
物が含まれていてもよい。好ましくは、該低分子量化合物は、カスパーゼ−８活
性の不可逆的インヒビターのごときインヒビターであり、その場合にはカスパー
ゼ−８／インヒビター複合体を生じる。本明細書中で相互交換可能に用いる“複
合体”、“分子複合体”および“共複合体”なる語句が、カスパーゼ−８と、基
質、基質アナログ、モジュレーター、インヒビターなどのごとき小分子リガンド
との共有または非共有複合体をいうことは理解されなければならない。プロテア
ーゼの阻害は、当該技術分野で知られているアッセイによって容易に決定し得；
代表的なアッセイは実施例４において本明細書中で説明している。該インヒビタ
ーは、好ましくはペプチドまたはペプチド模倣化合物である。“ペプチド模倣”
化合物とは、ペプチドを機能的および／または構造的に模倣するが、ペプチドを
特徴付ける１またはそれを超えるペプチド結合を欠いている化合物である。した
がって、ペプチド模倣化合物は、典型的にプロテアーゼの基質として作用せず、
アナログ・ペプチドと比較して、より長期間イン・ビボ（in vivo)で活性である
ようである。別段指摘しない限り、インヒビター・ペプチドまたはインヒビター
分子の文脈で本明細書中で用いる場合の“ペプチド”なる語には、ペプチドおよ
びペプチド模倣化合物が含まれる。

【００２９】 不可逆的システインプロテアーゼ・インヒビターは、典型的には、必ずしもそ
うとは限らないが、活性部位カスパーゼ−８システイン（Ｃ３６０）のチオール
基と反応して共有結合を生じることができる官能基によって特徴付けられる。し
たがって、好ましい具体例において、該結晶には、カスパーゼ−８の活性部位シ
ステイン（Ｃ３６０）に共有結合する低分子量化合物が含まれる。通常、この官
能基はペプチド・インヒビターのＰ_１アミノ酸に位置する。カスパーゼ−８の基
質のアミノ酸残基は、基質の切断結合からＮ−末端に向かって伸長するものにつ
き、Ｐ_１、Ｐ_２、他と命名される。同様にして、Ｐ１'、Ｐ２'、ほかと命名され
る残基は、基質の切断結合からＣ−末端に向かって伸長する。特に好ましい不可
逆的インヒビターは、テトラペプチドＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐの誘導体
、例えば、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈ（本明細書中においては
Ａｃ−ＩＥＴＤ−Ｈともいう）（配列番号：４）である。配列番号：４中のアミ
ノ酸は、左から右に、基質Ｐ_４ないしＰ_１アミノ酸という（すなわち、Ｎ−末端
Ｉｌｅから出発すれば、ＩｌｅがＰ_４、ＧｌｕがＰ_３、ＴｈｒがＰ_２であってＡ
ｓｐがＰ_１である）。

【００３０】 結晶化プロセスは、典型的に、カスパーゼ−８の単離および精製で開始する。
カスパーゼ−８は、それがその天然環境から取り出された場合、組換え技術を用
いて作製された場合、または化学的もしくは酵素的に合成された場合に“単離さ
れる”。“精製（した）”カスパーゼ−８は、いずれの他の生体分子および会合
した細胞産物または他の不純物を実質的に含まない。好ましくは、精製した組換
えカスパーゼ−８を結晶化に用いる。必要または望ましい場合には、例えば、好
適な低分子量化合物を添加してカスパーゼ−８と低分子量化合物との複合体を形
成させることによって、該酵素を不活性化する。ついで、該酵素または酵素複合
体を、好適な沈澱化剤を用い、かつ、好ましくは蒸発拡散技術によって溶液から
結晶化させる。結晶化緩衝液は、カスパーゼ−８複合体溶液と“リザーバー緩衝
液”とを、好ましくは１：１の比で、該結晶化緩衝液が該リザーバー緩衝液より
も結晶形成に必要な低濃度の沈澱化剤を有するように混合することによって調製
する。結晶を形成させるためには、結晶化緩衝液とリザーバー緩衝液との間の拡
散を介して沈澱化剤の濃度を平衡させることによって、結晶化緩衝液中の沈澱化
剤の濃度を上昇させる。結晶化緩衝液中では、カスパーゼ−８は約２ないし約５
ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。拡散は“ハンギング・ドロップ”または“シッティ
ング・ドロップ”を介して蒸気勾配に沿って生じる。例えば、“シッティング・
ドロップ”法においては、タンパク質を含有する結晶化緩衝液の１：１混合物を
、リザーバー緩衝液のより大きなプールに設置される微小ブリッジに置く。該微
小ブリッジは該タンパク質がリザーバー緩衝液中に希釈することを防ぐ。該結晶
は、典型的には、１.４Ｍのクエン酸ナトリウム、０.１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７
.９の緩衝液中で４℃に維持した場合、３ないし４週間安定である。

【００３１】 カスパーゼ−８結晶の形成は、以下のパラメータに依存する：ｐＨ、塩の存在
、添加剤の存在、温度、タンパク質濃度、および沈澱化剤。結晶化緩衝液のｐＨ
は、好ましくは約ｐＨ７.０ないし約ｐＨ８.０である。緩衝液の濃度／タイプは
比較的重要ではなく、かなり変化させ得る。好適な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、Ｍ
ＥＳ、トリス、クエン酸、酢酸およびリン酸が含まれる。幾つかの有用な塩およ
び添加物には、塩化物、硫酸化物、およびエタノールのごとき幾つかの低分子量
有機溶媒が含まれる。好適な沈澱化剤には、約１００ないし約２０,０００、好
ましくは約２,０００ないし約８,０００の分子量を有するポリエチレングリコー
ルのような水混和性有機溶媒；ならびに硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
クエン酸アンモニウムまたは酒石酸アンモニウムのごとき塩が含まれる。

【００３２】 結晶化する前に、カスパーゼ−８は前記した低分子量化合物と平衡化させ得る
。該低分子化合物は、共有的または非共有的に結合し得、カスパーゼ−８を安定
化し得る。好ましくは低分子量化合物はカスパーゼ−８活性を阻害する。

【００３３】 特に好ましい結晶は、ａ＝ｂ＝６２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４ű３.０
Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝１２０°の単位胞寸法を有する三方晶空間群
Ｐ３_１２１に属し、好ましくは１の（ｐ１８／ｐ１１）ヘテロアダイマーおよび
１のインヒビター分子を非対称単位で有する。さらに、本発明は、同一の空間群
およびａ＝ｂ＝６２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４ű３.０Å、α＝９０°、
β＝９０°、γ＝１２０°の胞寸法を有することによって特徴付けられるカスパ
ーゼ−８複合体を含む。

【００３４】 Ｘ−線結晶学分析 出願人らは、高分解能ｘ−線結晶学を用いてカスパーゼ−８／インヒビター複
合体の三次元構造を解明した。好ましくは、結晶化した酵素または酵素／リガン
ド複合体は三方晶空間群Ｐ３_１２１を有する。結晶の単位胞は、好ましくはａ＝
ｂ＝６２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４ű３.０Å、α＝９０°、β＝９０°
、γ＝１２０°の寸法を有する。結晶化した酵素または酵素／リガンド複合体は
、好ましくは、非対称単位の１の（ｐ１８／ｐ１１）ヘテロダイマー（または、
共複合体の場合においては、１のヘテロダイマーおよび１のインヒビター分子）
を有するヘテロテトラマーである。

【００３５】 カスパーゼ−８の各構成アミノ酸は、図１０に掲載する構造座標のセットによ
って規定される。“構造座標”なる語句は、結晶形のカスパーゼ−８複合体の原
子（散乱中心）によるｘ−線の単色光の回折で得られたパターンに関係付けた数
学式から導き出されたデカルト座標をいう。その回折データを用いて、結晶の繰
返し単位の電子密度地図を算出する。ついで、その電子密度地図を用いて、カス
パーゼ−８のタンパク質またはタンパク質／リガンド複合体の個々の原子のポジ
ションを確立する。

【００３６】 構造座標の僅かな変化は、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８／リガンドの
構造座標を数学的に操作することによって生じ得る。例えば、図１０に掲載する
構造座標は、構造座標の結晶学的置換、構造座標の分割、構造座標のセットへの
整数の加減、構造座標の変換または前記のいずれかの組合せによって操作し得る
であろう。別法として、アミノ酸の突然変異、付加、置換および／もしくは欠失
、または結晶を作るいずれかのコンポーネントにおける他の変化に起因する結晶
構造中の修飾も、構造座標の変化を与える得るであろう。個々の座標のかかる僅
かな変化は、全体的な形状に対してほとんど影響を有しないであろう。かかる変
化が元の座標と比較して許容し得る標準誤差の範囲内である場合には、得られる
三次元形状は構造的に等価であると考える。構造等価は、より詳細に後記する。

【００３７】 前記に定義したカスパーゼ−８またはカスパーゼ−８／リガンド複合体の個々
の構造座標の僅かな変化が、基質結合ポケットと会合し得るであろうリガンドの
性質を顕著に変化するとは予想されないことは注意すべきである。したがって、
例えば、カスパーゼ−８の基質結合ポケットに結合したリガンドは、その構造座
標が許容し得る誤差の範囲内に入る構造を規定するもう１の基質結合ポケットに
結合することも予想されよう。

【００３８】 基質結合ポケット、活性部位、および他の構造的特徴 本願出願人らの発明は、カスパーゼ−８の基質結合ポケットの形状および構造
についての詳細な情報を初めて提供する。 結合ポケットは、薬剤発見のごとき分野で顕著に有用なものである。天然のリ
ガンドまたは基質とそれらの対応する受容体または酵素の結合ポケットとの会合
は、活動の多くの生物学的メカニズムの基礎である。同様にして、多くの薬剤は
、受容体および酵素の結合ポケットとの会合を介してそれらの生物学的作用を発
揮する。かかる会合は、結合ポケットのすべてまたはいずれかの部分で起こり得
る。かかる会合の理解は、標的とのより好ましい会合、およびしたがって改善し
た生物作用を有する薬剤のデザインに導くことを助ける。したがって、この情報
は、より詳細に後記で論じるごとく、カスパーゼ−８様の結合ポケットの潜在的
なインヒビターをデザインするのに価値を有する。

【００３９】 本明細書中で用いる“結合ポケット”なる語句は、その形状の結果として、も
う１の化学基または化合物と好都合に会合する分子または分子複合体の領域をい
う。カスパーゼ−８の基質結合ポケットは、図１０の構造座標から決定した、結
合した基質またはインヒビターの１またはそれを超える構成原子の好ましくは約
３.５Å以内、より好ましくは約５.０Å以内、最も好ましくは約７.０Å以内に
その骨格原子が位置するアミノ酸を含む。好ましくは、カスパーゼ−８の基質結
合ポケットには、アミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ
２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４
１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０が含まれ
る。カスパーゼ−８の他のアイソフォーム中のアミノ酸の番号付けがヒト・カス
パーゼ−８のものと異なり得ることは、当業者に容易に明らかであろう。別法と
して、基質結合ポケットは、残基３６０のアルファ炭素原子を表す座標に中心化
された球形内にその骨格原子が位置するアミノ酸を含んで定義され、該球形は約
１０Åの半径、好ましくは約１５Åの半径を有する。カスパーゼ−８の基質結合
ポケットを規定するもう１の方法は、ペアをなす原子間距離による。したがって
、カスパーゼ−８の基質結合ポケットには、アミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５
９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｓｅｒ４１１
、Ｔｙｒ４１２およびＡｒｇ４１３；より好ましくは、Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２
５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６
５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５
およびＴｒｐ４２０が含まれ、ここに構成原子は図１０に掲載する構造座標から
容易に決定可能な対をなす原子間距離に従って空間中に位置決定される。

【００４０】 カスパーゼ−８の基質結合ポケットは、Ａｒｇ４１３、Ａｒｇ２６０、Ｇｌｎ
３５８およびＨｉｓ３１７がＳ１結合部位を含み；Ｖａｌ４１０、Ｔｙｒ４１２
およびＹＴｙｒ３６５がＳ２結合部位を含み；Ａｒｇ４１３、Ａｒｇ２５８、Ｐ
ｒｏ４１５およびＡｓｎ２６１がＳ３結合部位を含み；かつ、Ｔｒｐ４２０およ
びＴｙｒ４１２がＳ４部位を含むように、テトラペプチド（Ｎ−末端−Ｐ４−Ｐ
３−Ｐ２−Ｐ１−Ｃ−末端）を結合することができる。

【００４１】 本明細書中で定義するカスパーゼ−８の基質結合ポケットのアミノ酸構成物な
らびにその選抜した構成原子は、図１０に掲載する構造座標に従って三次元で位
置決定される。１の態様において、カスパーゼ−８の基質結合ポケットの構造座
標には、かく同定した構成アミノ酸中のすべての原子の構造座標が含まれ；もう
１の態様において、カスパーゼ−８の基質結合ポケットの構造座標には、構成原
子の骨格原子の構造座標のみが含まれる。

【００４２】 “カスパーゼ−８様の結合ポケット”なる語句は、共通のリガンドに結合する
と予想されるカスパーゼ−８の基質結合ポケットの少なくとも一部分にその形状
が十分に類似する分子または分子複合体の一部分をいう。構造的に等価な結合ポ
ケットは、最大約２.０Å、好ましくは最大約１.５Åの、カスパーゼ−８の基質
結合ポケットを作るアミノ酸の骨格原子の構造座標からの二乗平均平方根偏差に
よって規定される。この計算をいかにして得るかは後記する。 “〜と会合する”なる語句は、リガンドもしくは基質のごとき化学基または化
合物、またはそれらの一部分とカスパーゼ−８分子またはその一部分との間の近
接する状態をいう。会合は非共有となり得、ここに並置は水素結合、ファンデル
ワールス力、または静電相互作用によってエネルギー的に有利であり、あるいは
それは共有ともなり得る。

【００４３】 かくして、本発明は、前記した構造座標のセットによって規定される、カスパ
ーゼ−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットを含む
分子または分子複合体を提供する。 カスパーゼ−８の非対称単位はｐ１８／ｐ１１ヘテロダイマーを含む（図２）
。全体的なトポロジーはカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３のものに類似する
が、ｐ１８およびｐ１１のサブユニットはほぼ２８Å×３７Å×４８Åのサイズ
のコンパクトな円筒形にホールディングする。該タンパク質は、５の平行ストラ
ンド（β１、残基２３１−２４１；β２、２７８−２８５；β３、３０８−３１
６；β４、３５１−３５８；β５、３９７−４０４）および１の逆平行ストラン
ド（β６、残基４６２−４６７）を有する中央の６のストランドのβ−シートを
有する典型的なα／βフォールディング・モチーフを有する。これらの構造エレ
メントを、カスパーゼ−８について図１に規定する。逆平行ストランドは、結晶
２回軸に対して垂直かつ近接して、シートの端部に位置する。また、図１で同定
されるのは、６のα−ヘリックス（α１’、大きなループ１内の残基２４４−２
５０；α１、残基２６１−２７６；α２、２８９−３０２；α３、３３２−３４
１；α４、４１９−４３５；およびα５、４３８−４５２）であり、３は主要な
β−シートの一方の側に存在し、２は他の側に存在する。ヘリックスのターン（
α１’、残基２４４−２５０）が存在し、それはｐ１８サブユニットの結合ポケ
ット領域に沿って生じるループ１の一部分である。また、ポケットの基礎を形成
する主要なβ−シートの頂部には、ループ３（残基３１７−３２０）およびルー
プ４（残基４０８−４１５）からの寄与の作り上げられた２本ストランドの逆平
行シートも存在する。ヘテロダイマーにおいては、ｐ１１サブユニットの第１の
セグメント（残基３８５−３９６）およびｐ１８の最後のセグメント（残基３６
３−３７４）は逆平行様式でコンパクト構造から伸長し、他のヘテロダイマーと
の結晶学的２−フォールドを横切って相互作用する。

【００４４】 活性部位付近のループ領域には、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３およびカス
パーゼ−８の中で認められる多くの相違点が存在し；それらを構造的に図３に示
し、図１にアミノ酸配列によって示す。カスパーゼ−３と比較した場合に、カス
パーゼ−８はβ−ストランド１とα−ヘリックスとの間のループ１と命名する７
残基の挿入を有する。カスパーゼ−１と比較すると、このループはいっそう大き
く（１０残基）、カスパーゼ−８におけるこの大きなサイズのループは構造オー
バレイにおいて明らかに見られる。この挿入には、螺旋セグメントα'１が含ま
れ、これはカスパーゼ−１またはカスパーゼ−３のいずれにも観察されていない
。カスパーゼ−１においては、ループ３はカスパーゼ−３および８におけるより
も６残基長く、これは再び図３においていっそう明らかにわかる。ループ４は全
ての３のカスパーゼにおいて同じ長さであって、これはこの領域のフォールドと
一致して見られる。ループ５は、カスパーゼ３と８との間で中間の長さである。
すべての３のカスパーゼは異なるコンフォメーションを採り得、これらの相異は
Ｓ_４ポケットの特異性を担う重要性を有する。

【００４５】 ２のｐ１８／ｐ１１ヘテロダイマーは、結晶学２回軸の周りにテトラマーを形
成する（図３）。これは、ダイマー当りのβ−シートの６のストランドを、β−
シートの中間に垂直な２回軸で１２の鎖に伸長させる。伸長したβ−シートに加
えて、２回軸付近には他の相互作用が存在し、それは基質−結合領域に影響する
。１のヘテロダイマーの残基Ｌｙｓ−３６７ないしＡｓｐ−３７４は２−フォー
ルド関係分子まで伸長して、残基Ｔｈｒ−３９０ないしＡｓｐ−３９５との相互
作用を形成する。

【００４６】 ２の結晶形のカスパーゼ−１および２の結晶形のカスパーゼ−３の結晶構造は
、カスパーゼ−８に見出される相互作用と同様なテトラマー相互作用を示す。構
造研究および突然変異研究は、このテトラマーおよびダイマー／ダイマー界面が
生物活性に必要であることを示している。おそらく、ヘテロテトラマーの形成は
、隣接する三次元構造を修飾して、触媒および基質結合部位の活性化を生じる。
２のダイマー間の溶媒が近づき得る界面の概算面積は、カスパーゼ−８では２１
００Åである。疎水性および親水性の両方の相互作用とも、強力なダイマー−ダ
イマー界面を形成するのに重要である。この界面には、関与する主鎖および側鎖
の原子との２３の（または、ダイマー当り１２の）水素結合が含まれる（図５）
。１７×１５×１１Åの深いキャビティーが結晶学２回軸に存在する（図５Ａ）
。このキャビティーはカスパーゼ−３（図５Ｂ）およびカスパーゼ−１における
ものよりも大きい（各々、１７×７×１１Åおよび９×５×１１Å）（Mittlら,
J. Biol. Chem. 272:6539-6547 (1997)）。このキャビティーには、明らかに同
定可能な酸化ジチオスライトール分子（１,２−ジチアン−４,５−ジオール）（
図５Ｃ）およびその対称関連対が存在する。これらのジチアン−ジオール分子は
、〜１３Åによって分離し、Ｐ_１−Ｐ_４基質結合ポケットからほぼ１９Åである
。もう１のジチアン−ジオール分子は、タンパク質の表面のいずれか他に位置す
る。他のデータ・セットの調査は、これらのジチアン−ジオール分子が常にカス
パーゼ−８の結晶中に存在するとは限らないが、ジチオスライトールの濃度およ
び結晶の年齢に依存することを示す。中央キャビティーに結合するリガンドが酵
素のその触媒活性に影響し得、さらなる作業をキャビティーに結合するリガンド
の作用を研究するように計画することは可能である。

【００４７】 図６は、カスパーゼ−８へのインヒビター、すなわちアセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌ
ｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−アルデヒドの水素結合の模式図である。図７Ａは、タンパ
ク質の静電気的表面およびカスパーゼ−８に結合したインヒビターの電子密度地
図の質を示している。インヒビターは、伸長したコンホメーションで、かつ、ア
ルデヒドで結合して、Ｃｙｓ−３６０のＳγに対するチオヘミアセタール結合を
形成している（図７Ｂ）。カスパーゼ−８においては、多くの他のプロテアーゼ
と同様に、インヒビターの主鎖は、結合ポケットに並ぶ残基（４１１−４１３）
に関して逆平行である。Ｐ_１−Ｐ_３残基は、β−シート型の水素結合ネットワー
クを形成する。活性部位システイン（Ｃｙｓ−３６０）は、２−フォールド関係
ヘテロダイマー中のｐ１１単位のＮ−末端部分（図２）と相互作用するｐ１８の
長いＣ−末端セグメント（図１）上に属する。インヒビターのアセチル末端は、
ループ４付近に位置する。

【００４８】 Ｐ_１のＡｓｐのカルボキシル基は、Ａｒｇ−４１３およびＡｒｇ−２６０と塩
架橋を形成し、水素はカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３において見出される
ものに類似するパターンでＧｌｎ−３５８に結合する。すべてのこれらの残基は
保存されている。Ｐ_１のα−カルボニルは回転して、再混成（ｓｐ^２からｓｐ^３ ）してヒドロキシルとなり、Ｈｉｓ−３１７のイミダゾール基と水素結合を形成
する（図７Ｂ）。Mittlら（J. Biol. Chem. 272: 6539-6547 (1997）は、ＣＥＤ
３／ＩＣＥ−様プロテアーゼが、パパインおよび大部分の他のシステイン・プロ
テアーゼにおいて見られるような古典的（Ｃｙｓ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ）トライアド
よりも触媒性Ｃｙｓ／Ｈｉｓダイアドを有することを示唆した。Wilsonら（Natu
re 370： 270−275（1994））もカスパーゼ−１についてＣｙｓ／Ｈｉｓ触媒性
ダイアドを提唱しているが、彼らは、ヒスチジンのイミダゾールの塩基性に影響
し得る、推定第３コンポーネント、Ｐｒｏ−１７７の骨格カルボニル酸素の可能
性のある関与を示している。事実、Rotondaら（Nat. Struct. Biol. 3: 619-625
(1996）)は、カスパーゼ−３中の同一カルボニルの酸素の存在を後に引き合い
に出し、今回は触媒イミダゾール環との相互作用における空間的に等価なＴｈｒ
−６２から。この骨格カルボニル酸素が触媒トライアドの第３のメンバーとして
の役割を果たし得るという事実を提供したものはいない。本発明者らのカスパー
ゼ−８の高分解構造に基づくと、カスパーゼ−１におけるＰｒｏ−１７７および
カスパーゼ−３におけるＴｈｒ−６２に等価なＡｒｇ−２５８のカルボニル酸素
とＨｉｓ−３１７のＮ_εとの間に明らかな相互作用が存在する。したがって、本
発明者らは、このポジションにおけるアミノ酸の性質にかかわりなく、カルボニ
ル酸素がカスパーゼにおける触媒トライアドのメンバーとして作用し得るであろ
うと推論する。チオヘミアセタールＣの四面体性質は、明らかに１.２Å分解能
地図において明白である。これは、カスパーゼ−１およびカスパーゼ−３のアル
デヒド・インヒビターモデルについてモデリングされたものと同一のコンホメー
ションである（Rotondaら, Nat. Struct. Biol. 3: 619-625 (1996)）が、カル
ボニル酸素が“オキシアニオン”ポケットに伸長するメチルケトン・インヒビタ
ーについてモデリングされたものとは異なる。他のカスパーゼ構造は〜２.５Å
分解能データで決定されたため、この領域のコンホメーションの異なる解釈に関
しては幾つかの不明確な点が存在する。高分解能の本発明者らのデータは、チオ
ヘミアセタールＯＨ基とＨｉｓ−３１７のＮ_δとの間の相互作用を明白に確立す
る。カスパーゼ−３／Ａｃ−ＤＶＡＤ−フルオロメチルケトン構造（Mittlら, J
. Biol. Chem. 272: 6539-6547）の場合においては、カルボニル酸素は推定に基
づく“オキシアニオン・ホール”に直接的に向いて、これらの酵素の高度に保存
された領域（各々、カスパーゼ８、３および１中のＧｌｙ残基；残基３５０、１
２２および２３８、図１）中のペプチドＮＨ基と水素結合を形成する。本発明者
らは、この場合においては実際そうであるように、チオヘミアセタールが非−遷
移状態コンホメーションで結合し得るという初期の解釈に同意するであろう。

【００４９】 Ｐ_２におけるＴｈｒ側鎖のＣ_γは、Ｖａｌ−４１０およびＴｙｒ−４１２（カ
スパーゼ−３におけるＴｙｒ−２０４およびＴｒｐ−２０６）の側鎖によって形
成される疎水性ポケット中に位置する。Ｏ_γは水分子によって取囲まれており、
そのうちの１はＴｙｒ−３６５のＯ_ηに架橋を形成する。

【００５０】 Ｐ_３のＧｌｕは、Ａｒｇ−４１３、Ａｒｇ−２５８、Ｐｒｏ−４１５およびＡ
ｓｎ−２６１によって規定される裂け目中に位置する。これらの残基との全ての
相互作用は、Ａｒｇ−４１３に対するものを除いて、溶媒分子を介して媒介され
る。残基は両方のＰ_３ＧｌｕおよびＰ_１Ａｓｐ側鎖に塩架橋を形成する。これら
の塩架橋に加えて、Ａｒｇ−４１３は、その主鎖原子とペプチド・インヒビター
主鎖との間に水素結合相互作用を形成する非常に重要な残基である。カスパーゼ
−８においては、Ｓ_３ポケット中のＧｌｕの優先はＡｒｇ−２５８およびＡｓｎ
−２６１の近接によって高められる。例えば、Ａｒｇ−２５８はカスパーゼ−３
のＴｈｒ−６２に一致し、Ａｓｎ−２５８はＳｅｒ−６５に一致する。

【００５１】 異なるカスパーゼの特異性を比較すると、Ｓ_４ポケットのサイズおよび性質が
選択性において特に重要であることを示唆している（Thornberryら, J. Biol. C
hem. 272: 17907-17911 (1997)）。カスパーゼ−３はＰ_４においてＡｓｐを優先
し、一方カスパーゼ−１およびカスパーゼ−８は疎水性基を優先する。カスパー
ゼ−８においては、アセチル水素は水架橋を介してＰ_３Ｇｌｕのカルボキシルに
結合している。Ｓ_４ポケットは、水素結合に関与するものが離れて運動して非極
性基を順応するカスパーゼ−３のものとは異なる。芳香族基Ｔｒｐ−４２０およ
びＴｙｒ−４１２の面は、疎水性Ｓ_４ポケットを形成する。それはかなりオープ
ンであって、さらなる官能基が側鎖上で置換され得る。

【００５２】 三次元配置 その基質結合ポケットのごときカスパーゼ−８／基質複合体またはその一部分
について図１０に掲載した構造座標は、空間中の点のユニークな配置を規定する
。当業者は、タンパク質もしくはタンパク質／リガンド複合体またはそれらの一
部分についての構造座標のセットが相対的な点のセットを規定し、それがついで
三次元の配置を規定することを理解する。同様または同一の配置は、全く異なる
座標のセットによって画定され得るが、但し、座標間の距離および角度は実質的
に同一のままである。

【００５３】 かくして、本発明は、図１０に示すカスパーゼ−８の分子または分子複合体の
少なくとも一部分の構造座標から導かれる点の三次元配置、ならびに後記する構
造的に等価な配置を包含する。好ましくは、三次元配置には、カスパーゼ−８の
基質結合ポケットを規定する複数のアミノ酸の位置を表す構造座標から導いた点
が含まれる。１の具体例において、三次元配置には、カスパーゼ−８の基質結合
ポケットを規定する複数のアミノ酸、好ましくはＡｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、
Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖ
ａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５および
Ｔｒｐ４２０、の骨格原子の位置を表す構造座標から導かれる点が含まれ；もう
１の具体例において、三次元配置には、カスパーゼ−８の基質結合ポケットを規
定する複数のアミノ酸の側鎖および骨格原子（水素以外の）の位置を表す構造座
標から導かれた点が含まれる。なおもう１の具体例において、三次元配置には、
ヒト・カスパーゼ−８のアミノ酸配列（配列番号：１）中で隣接する少なくとも
５０のアミノ酸の骨格原子の位置を表す構造座標から導かれた点が含まれる。な
おもう１の具体例において、三次元配置には、カスパーゼ−８のアミノ酸配列（
配列番号：１）中で隣接する少なくとも５０のアミノ酸の側鎖原子および骨格原
子の位置を表す構造座標から導かれた点が含まれる。

【００５４】 同様に、本発明は、カスパーゼ−８に構造的に相同な分子または分子複合体か
ら導かれた点の三次元配置、ならびに構造的に等価な配置も包含する。構造的に
相同な分子または分子複合体は後記に定義する。有利には、構造的に相同な分子
は、本発明の方法によるカスパーゼ−８／リガンド複合体の構造座標（図１０）
を用いて同定し得る。

【００５５】 本発明による構造座標から導かれた空間中の点の配置は、例えば、ホログラフ
ィー像、立体図、モデルまたはコンピュータ描写像として視覚化し得、かくして
、本発明はかかる像、図またはモデルも包含する。

【００５６】 構造的に等価な結晶構造 種々のコンピュータ解析を用いて、分子またはその結合ポケット部分が、その
三次元構造によって規定して、カスパーゼ−８またはその基質結合ポケットの全
体もしくは一部分に対して“構造的に等価”であるか否かを決定し得る。かかる
解析は、ＱＵＡＮＴＡ（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）バージ
ョン４.１のMolecular Similarityアプリケーションのごとき最新のソフトウェ
ア・アプリケーションで、添付されている使用者案内書に記載されているごとく
行い得る。

【００５７】 Molecular Similarityアプリケーションにより、異なる構造、同一構造の異な
るコンホメーション、および同一構造の異なる部分の間の比較ができる。構造を
比較するためにMolecular Similarityにおいて用いる工程は４段階に分けられる
：（１）比較すべき構造をロードし；（２）これらの構造における原子等価（at
om equivalence）を規定し；（３）フィッティング操作を行い；ついで（４）結
果を解析する。

【００５８】 各構造は名称によって同定する。１の構造を標的（すなわち、固定構造）と同
定し；残りの全ての構造は作業構造（すなわち、運動構造）である。ＱＵＡＮＴ
Ａ内の原子等価はユーザーの入力によって定義されるため、本発明の目的につい
て、等価原子は比較する２の構造の間の全ての保存残基についてのタンパク質骨
格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）として定義する。この目的につき、保存残基は
同一の原子間連結性を有する原子のセットとして定義する。厳密なフィッティン
グ操作のみを考える。

【００５９】 厳密なフィッティング法を用いる場合、作業構造を移行および回転させて、標
的構造と最適フィットを得る。フィッティング操作は、等価原子の特定の対にわ
たるフィットの二乗平均平方根差が絶対的な最小値となるように、運動する構造
にあてはめる最適な移行および回転を計算するアルゴリズムを用いる。オングス
トロームで得られるこの数字はＱＵＡＮＴＡによって報告される。

【００６０】 本発明の目的につき、図１０に掲載した参照構造座標によって記載される適当
な骨格原子に重ねる場合、約２.０Å未満、好ましくは約１.５Å未満の保存残基
骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の二乗平均平方根偏差を有するいずれの分子また
は分子複合体またはそれらの結合ポケット、あるいはそれらのいずれかの部分を
、参照分子に対して“構造的に等価”であると考える。すなわち、２の分子のこ
れらの部分の結晶構造は、許容し得る誤差の範囲内で実質的に同一である。特に
好ましい構造的に等価な分子または分子複合体は、これらのアミノ酸の保存骨格
原子から約２.０Å以下の図１０の構造座標の全セット±二乗平均平方根偏差に
よって規定されるものである。より好ましくは、該二乗平均平方根偏差は約１.
５Å未満であり、最も好ましくは約１.０Å未満である。

【００６１】 “二乗平均平方根偏差”なる語句は、平均値からの偏差の二乗の相加平均の平
方根を意味する。それは、傾向または目標からの偏差または変量を表す方法であ
る。本発明の目的につき、“二乗平均平方根偏差”は、本明細書中に記載するカ
スパーゼ−８の構造座標によって規定されるごとき、その基質結合ポケットのご
ときカスパーゼ−８の骨格またはその一部分からのタンパク質の骨格における変
量を規定する。

【００６２】 コンピュータおよび機器読み出し可能な保存媒体 カスパーゼ−８もしくはカスパーゼ−８／リガンド複合体の全体もしくは一部
分、または１のその基質結合ポケットについての、後記に定義する構造的に相同
な分子についての、あるいは前記定義のこれらの分子または分子複合体のいずれ
かの構造等価についての構造座標の分子または複合体の三次元グラフィック表示
への変換は、市販のソフトウェアを利用するコンピュータ支援方法の使用を介し
て簡便に行い得る。

【００６３】 かくして、本発明は、さらに、機器読み出し可能なデータをコードされたデー
タ貯蔵材料を含む機器読み出し可能な保存媒体を提供し、これは、該データを用
いるための命令をプログラムされた機器を用いる場合に、前記した本発明のいず
れかの分子または分子複合体のグラフィック三次元描写を表示し得る。好ましい
具体例において、機器読み出し可能なデータ保存媒体には、機器読み出し可能な
データをコードしたデータ保存材料が含まれ、これは、該データを用いるための
命令をプログラムした機器を用いた場合、前記に定義したカスパーゼ−８の基質
結合ポケットまたはカスパーゼ−８様の結合ポケットの全体またはいずれかの一
部分を含む分子または分子複合体のグラフィック三次元像を表示することができ
る。もう１の好ましい具体例において、機器読み出し可能なデータ保存媒体は、
図１０に掲載する全アミノ酸の構造座標±約２.０Å以下、好ましくは約１.５Å
以下の該アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差によって規定される分子
または分子複合体のグラフィック三次元像を表示することができる。

【００６４】 別の具体例において、該機器読み出し可能なデータ保存媒体には、図１０に掲
載する構造座標のフーリエ変換を含む第１のセットの機器読み出し可能なデータ
をコードしたデータ保存材料が含まれ、これは、該データを用いる命令をプログ
ラムした機器を用いる場合に、分子または分子複合体のｘ−線回折パターンを含
む第２のセットの機器読み出し可能なデータと合して、第２の機器読み出し可能
なデータに対応する構造座標の少なくとも一部分を決定し得る。

【００６５】 本発明は、さらに、すべて慣用的な双方向システムバスによって相互接続され
る、中央演算処理ユニット（“ＣＰＵ”）、例えばＲＡＭ（ランダムアクセスメ
モリー）または“コア”メモリーとなり得るワーキングメモリー、（１またはそ
れを超えるディスク・ドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブのごとき）大量記憶
メモリー、１またはそれを超える陰極線管（“ＣＲＴ”）ディスプレイ端末、１
またはそれを超えるキーボード、１またはそれを超える入力ライン、ならびに１
またはそれを超える出力ラインを含むシステムを含み、また、本発明のコンピュ
ータ支援方法は、有利にはこのシステムを利用する。本発明の機器読み出し可能
なデータは、例えば電話線または専用データ線によって接続される１またはそれ
を超えるモデムの使用を介するような種々の方法で入力し得る。別法としてまた
はさらに、入力ハードウェアにはＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブ
が含まれ得る。ディスプレイ端末との連結において、キーボードを入力デバイス
としても使用し得る。出力ハードウェアには、本明細書中に記載するＱＵＡＮＴ
Ａのごときプログラムを用いて、カスパーゼ−８分子または基質結合ポケットの
ごときその一部分のグラフィック描写を表示するＣＲＴディスプレイ端末が含ま
れ得る。出力ハードウェアには、ハードコピー出力を作成し得るようにプリンタ
ー、またはディスク・ドライブを含んで後に使用するためのシステム出力を保存
し得る。

【００６６】 操作において、ＣＰＵは、種々の入力および出力デバイスの使用を対応させ、
大量保存からのデータアクセスならびにワーキングメモリーへのおよびそれから
のアクセスを対応させ、かつ、データ処理工程のシークエンスを決定する。多数
のプログラムを用いて、本発明の機器読み出し可能なデータを処理し得る。かか
るプログラムを、本明細書中に記載するごとき薬剤発見の計算方法に参照して論
じる。ハードウェア・システムのコンポーネントに対する特定の参照は、以下の
データ保存媒体の説明全体を通して適当に含まれる。

【００６７】 機器読み出し可能なデータまたは一連の命令をコードした機器読み出し可能な
データ保存媒体は、例えば、磁気データ保存媒体、光学的に読み出し可能なデー
タ保存媒体、または光磁気データ保存媒体とし得る。磁気データ保存媒体の例に
は、好適な基板を有し、その磁気の極性または向きを磁気的に変化させ得る磁気
ドメインを含む片面または両面をコートする、従来のフロッピー（登録商標）デ ィスクまたはハードディスクが含まれる。該磁気媒体には、所望により、ディス クドライブまたは他のデータ保存デバイスのスピンドルを受ける開口部が含まれ ていてもよい。媒体コーティングの磁気ドメインは、システムにより実行するた めに、本明細書中に記載するごとき機器読み出し可能なデータをコードするよう に極性化または向き決定される。

【００６８】 機器読み出し可能なデータまたは一連の命令をコードした光学的に読み出し可
能なデータ保存媒体の例には、慣用的なコンパクト・ディスク・リードオンリー
メモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、または光学的に読み出し可能であって光磁気的に書
き込み可能である光磁気ディスクのごとき再書き込み可能な媒体が含まれる。光
学的に読み出し可能な媒体には、典型的に、好適な基板および該基板の少なくと
も片面上のコーティングが含まれる。よく知られているＣＤ−ＲＯＭの場合にお
いては、コーティングは反射的であって、複数のピットが刻まれていて機器読み
出し可能なデータまたは命令をコードしている。ピットの配列はコーティング表
面からレーザー光が反射することによって読み出される。好ましくは実質的に透
明である保護コーティングは、反射コーティングの最上面に配されている。よく
知られている光磁気ディスクの場合においては、コーティングはピットを有しな
いが、レーザーによるごとく、特定の温度を超えて加熱された場合にその磁気ド
メインの極性または向きを磁気的に変化させ得る複数の磁気ドメインを有する。
ドメインの向きは、コーティングから反射したレーザー光の偏光を測定すること
により読み出し得る。ドメインの配列が前記したデータをコードする。

【００６９】 構造的に相同な分子、分子複合体、および結晶構造 図１０に掲載する構造座標を用いて、もう１の結晶化分子または分子複合体に
ついての構造情報を得るのを助け得る。“分子複合体”とは、化学基または化合
物と共有結合または非共有結合したタンパク質を意味する。本発明の方法により
、カスパーゼ−８の構造的特徴と同様な１またはそれを超える構造的特徴を含む
分子または分子複合体の三次元構造の少なくとも一部分を決定することができる
。本明細書中にて、これらの分子はカスパーゼ−８に“構造的に相同である”と
いう。同様な構造的特徴には、例えば、アミノ酸同一の領域、保存活性部位また
は結合部位モチーフ、および同様に配置された二次構造エレメント（例えば、α
ヘリックスおよびβシート）が含まれ得る。所望により、構造的ホモロジーは、
それでもなお各配列中のアミノ酸はそれらの適当な順序で残らなければならない
が、２のアミノ酸配列の残基を整列させてそれらの配列の長さに沿った同一アミ
ノ酸の数；同一アミノ酸の数を最適化するためのアライメントを作成することに
おいていずれかまたは両方の配列を許容するギャップを最適化することによって
決定する。好ましくは、Tatusovaら,FEMS Microbiol. Lett. 174：247−250（19
99）によって記載され、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで入手可
能なＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのBlastpプログラム、バージョン２.０.９を
用いて、２のアミノ酸配列を比較する。好ましくは、マトリクス＝BLOSUM62;オ
ープンギャップペナルティ値＝１１、伸長ギャップペナルティ値＝１、ギャップ
ｘ ドロップオフ値＝５０、期待数閾値＝１０、ワードサイズ＝３およびフィル
ターＯＮを含む全ＢＬＡＳＴ２検索パラメータについてのデフォルト値を用いる
。ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いる２のアミノ酸配列の比較において、構造
的類似性を“同一性”という。好ましくは、構造的に相同である分子は、カスパ
ーゼ−８のアミノ酸配列（配列番号：１）と少なくとも６５％同一性を共有する
アミノ酸を有するタンパク質である。より好ましくは、カスパーゼ−８に構造的
に相同であるタンパク質には、カスパーゼ−８の類似部分と少なくとも８０％の
アミノ酸配列同一性を共有する少なくとも５０アミノ酸の少なくとも１の隣接す
るストレッチが含まれる。構造的に相同な分子または分子複合体に関する構造情
報を生成する方法はよく知られており、例えば、分子置換技術が含まれる。

【００７０】 したがって、もう１の具体例において、本発明は、 （ａ）知られていない構造の分子または分子複合体を結晶化させ； （ｂ）該結晶化した分子または分子複合体からｘ−線回折パターンを生成し；
ついで、 （ｃ）図１０に掲載する構造座標の少なくとも一部分をｘ−線回折パターンに
あてはめてその構造が知られていない分子または分子複合体の三次元電子密度地
図を作成する工程を含む、分子置換を利用して、その構造が知られていない分子
または分子複合体についての構造情報を得る方法を提供する。

【００７１】 分子置換を用いることによって、本発明により提供され（かつ図１０に掲載す
る）カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８／リガンド複合体の構造座標の全てま
たは一部分を用いて、その構造が知られていない結晶化した分子または分子複合
体の構造を、かかる情報を最初から決定する試行よりもより迅速かつ効率的に決
定し得る。

【００７２】 分子置換は、知られていない構造について位相の正確な推定を提供する。位相
は直接決定することができない結晶構造を解明するために用いる式中のファクタ
ーである。分子置換以外の方法によって位相について正確な値を得ることは、近
似および精密化の反復サイクルを含む時間のかかるプロセスであり、結晶構造の
解明を大幅に妨げる。しかしながら、少なくとも構造的に相同な部分を含むタン
パク質の結晶構造が解明されている場合には、知られている構造からの位相が知
られていない構造の位相の満足のゆく推定を提供する。

【００７３】 かくして、この方法には、その構造か知られていない分子または分子複合体の
結晶の観察されたｘ−線回折パターンを最大限に考慮するように、知られていな
い分子または分子複合体の結晶の単位胞内に図１０によるカスパーゼ−８または
カスパーゼ−８／リガンド複合体の関連する部分を方向付けるかまたは位置決定
することによって、その構造座標が知られていない分子または分子複合体の予備
的モデルを作製することが含まれる。ついで、このモデルから位相を計算し、観
察されたｘ−線回折パターン振幅と合して、その座標が知られていない構造の電
子密度地図を作成する。ついで、これをいずれかのよく知られているモデル構築
および構造精密化技術にかけて、知られていない結晶化した分子または分子複合
体の最終的な正確な構造を得ることができる（E. Lattman, "Use of the Rotati
on and Translation Functions" in Meth. Enzymol., 115, pp. 55-77 (1985);
M. G. Rossman編, "The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Ser.
, No. 13, Gordon & Breach, New York (1972)）。

【００７４】 カスパーゼ−８の一部分に十分に構造的に相同であるいずれかの結晶化した分
子または分子複合体の一部分についての構造情報は、この方法によって分解し得
る。前記したカスパーゼ−８と１またはそれを超える構造特徴を共有する分子に
加えて、カスパーゼ−８と同一の触媒活性、基質特異性またはリガンド結合活性
のごとき同様の生物活性を有する分子も、カスパーゼ−８に十分に構造的に相同
であり得、カスパーゼ−８の構造座標を使用してその結晶構造を解明し得る。

【００７５】 好ましい具体例において、分子置換の方法を利用して分子または分子複合体に
ついての構造情報を得、ここに該分子または分子複合体は少なくとも１のカスパ
ーゼ−８のサブユニットまたはホモログを含む。カスパーゼ−８の“サブユニッ
ト”とは、Ｎ−末端もしくはＣ−末端、またはその両方で切頭されているカスパ
ーゼ−８分子である。本発明の文脈において、カスパーゼ−８の“ホモログ”と
は、カスパーゼ−８のアミノ酸配列に関する１またはそれを超えるアミノ酸の置
換、欠失、付加または転位を含むが、天然のコンホメーションにフォールドした
場合にはカスパーゼ−８の三次元構造の少なくとも一部分を示すかまたは示すこ
とが妥当に予想されるタンパク質である。例えば、構造的に相同な分子は、ルー
プまたはドメインのごとき１またはそれを超える隣接または非隣接アミノ酸の欠
失または付加を含み得る。好ましいカスパーゼ−８ホモログには、Ａｒｇ２５８
の側鎖ではなくて骨格カルボニルがカスパーゼ−８の活性部位が形成するのを助
けることが発見されているため、天然アルギニン２５８以外のアミノ酸を含み得
る。構造的に相同な分子には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド
化ならびに炭水化物または脂質基、補因子などの結合を含む側鎖修飾、骨格修飾
ならびにＮ−およびＣ−末端修飾を含む１またはそれを超える構成アミノ酸で化
学的または酵素的に誘導化されている“修飾”カスパーゼ−８も含まれる。

【００７６】 カスパーゼ−８の重原子誘導体は、カスパーゼ−８ホモログとしても含まれる
。“重原子誘導体”なる語句は、カスパーゼ-８の結晶を化学的に修飾すること
によって作製されたカスパーゼ-８の誘導体をいう。実際には、結晶を通って拡
散してタンパク質の表面に結合し得る重金属原子塩または有機金属化合物、例え
ば塩化鉛、チオリンゴ酸金、チメロサールまたは酢酸ウラシルを含有する溶液に
結晶を浸漬する。結合した重金属原子（群）の位置（群）は、浸漬した結晶のｘ
−線回折分析によって決定し得る。ついで、この情報を用いて、タンパク質の三
次元構造を構築するために用いる位相情報を生成する（T. L. BlundellおよびN.
L. Johnson, Protein Crystallography, Academic Press (1976)）。

【００７７】 カスパーゼ−８は１を超える結晶形で結晶化し得ると予想したため、本発明の
より提供されるカスパーゼ−８の構造座標は、カスパーゼ−８またはカスパーゼ
−８／基質複合体の他の結晶形を解明するのに特に有用である。

【００７８】 本発明により提供されるカスパーゼ−８の構造座標は、カスパーゼ−８突然変
異体の構造を解明するのに特に有用である。突然変異体は、例えば、オリゴヌク
レオチド部位特異的突然変異によってそのコーディング配列で予め改変されてい
るカスパーゼ−８のｃＤＮＡを発現させることによって調製し得る。

【００７９】 図１０のカスパーゼ−８の構造座標は、種々の化学基と共複合体形成するカス
パーゼ−８、カスパーゼ−８突然変異体またはカスパーゼ−８ホモログの結晶の
構造を解明するためにも特に有用である。このアプローチにより、候補カスパー
ゼ−８インヒビターおよびカスパーゼ−８を含む化学基間の相互作用に最適な部
位を決定することができる。分子の種々の結合部位内の修飾するための潜在的な
部位をも同定し得る。この情報は、例えば、カスパーゼ−８と化学基との間の高
い疎水性相互作用のような最も効率のよい結合相互作用を決定するさらなるツー
ルを提供する。例えば、異なるタイプの溶媒に曝した結晶から収集した高分解能
ｘ−線回折データにより、各タイプの溶媒分子がどこに存在するかを決定し得る
。ついで、これらの部位に強固に結合する小分子をデザインおよび合成して、そ
のカスパーゼ−８阻害活性につきアッセイし得る。

【００８０】 前記に言及したすべての複合体は、よく知られているｘ−線回折技術を用いて
調べることができ、Ｘ−ＰＬＯＲ（Yale University, C1992, Molecular Simula
tions, Inc.によって配布；例えば、BlundellおよびJohnson,前掲；Meth. Enzym
ol., Vol. 114および115, H. W. Wyckoffら編, Academic Press (1985)を参照さ
れたい）のごときコンピュータ・ソフトウェアを用いて約０.２０以下のＲ値に
１.５−３.０Å分解能ｘ−線データに対して精密化し得る。したがって、この情
報を用いて、知られているカスパーゼ−８インヒビターを最適化することができ
、かつ、より重要なことには、新たなカスパーゼ−８インヒビターをデザインし
得る。

【００８１】 本発明は、本発明の方法を用いて決定したカスパーゼ−８に構造的に相同な分
子または分子複合体の構造座標によって規定される点のセットによって規定され
るユニークな三次元配置、構造的に等価な配置、およびかかる構造座標のセット
を含む磁気保存媒体をも含む。 さらに、本発明は、本発明の方法を用いて同定した構造的に相同な分子を含む
。

【００８２】 ホモロジー・モデリング ホモロジー・モデリングを用いれば、カスパーゼ−８ホモログのコンピュータ
モデルを、ホモログを結晶化することなく構築または精密化し得る。最初に、カ
スパーゼ−８ホモログの予備モデルを、カスパーゼ−８との配列アライメント、
二次構造予想、構造ライブラリーのスクリーニング、またはそれらの技術のいず
れかの組み合わせによって作製する。コンピュータ・ソフトウェアを用いて、配
列アライメントおよび二次構造予想を実行し得る。構造矛盾、例えば挿入および
欠失のまわりの構造フラグメント、は目的の長さであって好適なコンホメーショ
ンを有するペプチドについて構造ライブラリーをスクリーニングすることによっ
てモデリングし得る。側鎖コンホメーションの予想については、側鎖ロタマー・
ライブラリーを利用し得る。カスパーゼ−８ホモログが結晶化されている場合に
は、最終的なホモロジー・モデルを用いて、前記した分子置換によってホモログ
の結晶構造を解明し得る。つぎに、予備的なモデルをエネルギー最小化に付して
、エネルギー最小化モデルを得る。エネルギー最小化モデルには、立体化学束縛
が妨害された領域を含むことができ、その場合においてはかかる領域を再モデリ
ングして最終ホモロジーモデルを得る。ホモロジーモデルは分子置換の結果に従
って位置決定し、分子動力学計算を含むさらなる精密化に付す。

【００８３】 合理的薬剤デザイン コンピュータ操作技術を用いて、カスパーゼ−８と会合することができる化学
基または構造的に相同な分子をスクリーニングし、同定し、選抜し、およびデザ
インし得る。カスパーゼ−８についての構造座標の知見により、カスパーゼ−８
の基質結合部位のコンホメーションに相補的な形状を有する合成分子および／ま
たは他の分子のデザインおよび／または同定が許容される。詳細には、コンピュ
ータ操作技術を用いて、カスパーゼ−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−
８様の基質結合ポケットと会合する、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴ
ニストのごとき化学基を同定またはデザインし得る。インヒビターは、カスパー
ゼ−８の活性部位の全てまたは一部分に結合し得、競合的、非競合的または競合
し得ないインヒビターとなり得；あるいは２のモノマー間の界面に結合すること
によって二量体化を妨害し得る。生物活性について同定およびスクリーニングし
たら、このインヒビターを治療的または予防的に用いてカスパーゼ−８活性を遮
断し、したがって細胞死を阻害し得る。カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様
の結合ポケットに結合するリガンドのアナログに関する構造−活性データも、コ
ンピュータ操作で得ることができる。 本明細書中で用いる“化学基”なる語句は、化学化合物、２またはそれを超え
る化学化合物の複合体、およびかかる化合物または複合体のフラグメントをいう
。カスパーゼ−８と会合することが決定された化学基は、潜在的な薬剤候補であ
る。

【００８４】 したがって、本明細書中で同定した、カスパーゼ−８もしくは構造的に相同な
分子またはそれらの一部分の構造のグラフィック三次元描写を表示することがで
きる機器−読み出し可能な保存媒体に保存されたデータは、薬剤発見に有利に用
い得る。化学基の構造座標を用いて、カスパーゼ−８または構造的に相同な分子
の三次元像にコンピュータ操作でフィットし得る三次元像を作成する。ついで、
磁気保存媒体中のデータによってコードされる三次元分子構造を、化学基と会合
し得るその能力についてコンピュータ操作で評価し得る。該データによってコー
ドされる分子構造をコンピュータ・スクリーン上のグラフィック三次元描写で表
示すると、化学基との潜在的な会合についてタンパク質構造を視覚的に調べるこ
ともできる。

【００８５】 薬剤デザインの方法の１の具体例には、カスパーゼ−８または構造的に相同な
分子と、特にカスパーゼ−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−８様の基質
結合ポケットと、知られている化学基との潜在的な会合を評価することが含まれ
る。したがって、薬剤デザインの方法には、前記したいずれかの分子または分子
複合体と会合する選抜した化学基の潜在性をコンピュータ操作で評価することが
含まれる。この方法には、（ａ）コンピュータ操作手段を用いて、選抜した化学
基と分子または分子複合体の基質結合ポケットとの間のフィッティング操作を行
い；ついで、（ｂ）該フィッティング操作の結果を解析して該化学基と該基質結
合ポケットとの間の会合を定量化する工程が含まれる。

【００８６】 もう１の具体例において、薬剤デザインの方法には、カスパーゼ−８、そのホ
モログ、またはそれらの一部分と会合する化学基のコンピュータ支援デザインが
含まれる。化学基は、一度に１のフラグメントのようにステップ−ワイズ様式で
デザインし得、または全体もしくは“デ・ノボ（de novo）”としてもデザイン
し得る。

【００８７】 価値ある薬剤候補となるためには、該方法に従って同定またはデザインした化
学基がカスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の結合ポケットの少なくとも一部
分と構造的に会合して、それがカスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の結合ポ
ケットと会合することを許容するコンホメーションを立体的またはエネルギー的
に予想し得なければならない。この会合に重要な非共有分子相互作用には、水素
結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および静電相互作用が含
まれる。コンホメーションで考慮すべき事項には、結合ポケットに対する化学基
の全体的な三次元構造および向き、ならびにカスパーゼ−８様の結合ポケットま
たはそのホモログと直接相互作用する基の種々の官能基間の間隔が含まれる。

【００８８】 所望により、カスパーゼ−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−８様の基
質結合ポケットに対する化学基の潜在的な結合は、該化学基の実際の合成および
試験の前に、コンピュータ・モデリング技術を用いて解析する。これらのコンピ
ュータ操作実験がそれとカスパーゼ−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−
８様の結合ポケットとの間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合には、
該基の試験は不要である。しかしながら、コンピュータ・モデリングが強力な相
互作用を示す場合には、その分子を合成し、カスパーゼ−８の基質結合ポケット
またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットに結合するその能力について試験し
得る。化合物が実際に結合してカスパーゼ−８の活性を実際に阻害するかを決定
する結合アッセイも行うことができ、これは当該技術分野でよく知られている；
例えば、本明細書中の実施例ＩＶを参照されたい。

【００８９】 当業者であれば、幾つかの方法のうちの１を用いて、カスパーゼ−８またはカ
スパーゼ−８様の結合ポケットと会合する能力について化学基またはフラグメン
トをスクリーニングし得る。このプロセスは、例えば、図１０中のカスパーゼ−
８構造座標または機器読み出し可能な保存媒体から創製される同様な形状を規定
する他の座標に基づくコンピュータ・スクリーン上でのカスパーゼ−８またはカ
スパーゼ−８様の結合ポケットの視覚的調査によって開始し得る。ついで、選抜
したフラグメントまたは化学基を、結合ポケット内に、種々の向きで位置決定し
、またはドッキングし得る。ドッキングは、ＱＵＡＮＴＡおよびＳＹＢＹＬのご
ときソフトウェアにつづく、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのごとき標準的な分
子機構力場とエネルギー最小化および分子動力学を用いて行い得る。

【００９０】 専門のコンピュータ・プログラムも、フラグメントまたは化学基を選抜するプ
ロセスにおいて支援し得る。その例には、ＧＲＩＤ(P. J. Goodford, J. Med. C
hem. 28: 849-857 (1985); Oxford University, Oxford , UKから入手可能)；Ｍ
ＣＳＳ（A. Mirankerら,Proteins: Struct. Funct. Gen., 11:29-34 (1991)；Mo
lecular Simulations, San Diego, CAから入手可能）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（D. S
. Goodsellら, Proteins: Struct. Funct. Genet. 8: 195-202 (1990)；Scripps
Research Institute, La Jolla, CAから入手可能）；およびＤＯＣＫ（I. D. K
untzら, J. Mol. Biol. 161: 269-288 (1982)；University of California, San
Francisco, CAから入手可能）が含まれる。

【００９１】 好適な化学基またはフラグメントを選抜したら、それは単一の化合物または複
合体にアセンブルし得る。アセンブリーは、カスパーゼ−８の構造座標に関して
、コンピュータ・スクリーンに表示された三次元像で互いに対するフラグメント
の関係を視覚的に調べることによって先に行い得る。これにつづいて、ＱＵＡＮ
ＴＡまたはＳＹＢＹＬ（Tripos Associates, St. Louis, MO）のごときソフトウ
ェアを用いて手動のモデル構築を行うであろう。

【００９２】 個々の化学基またはフラグメントを関係付けることにおいて当業者を支援する
のに有用なプログラムには、限定されるものではないが、ＣＡＶＥＡＴ（P. A.
Bartlettら, in "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problem
s", Special Publ., Royal Chem. Soc., 78: 182-196 (1989); G. Lauriら, J.
Comput. Aided Mol. Des. 8: 51-66 (1994)）；University of California, Ber
keley, CAから入手可能）；ＩＳＩＳ（MDL Information Systems, San Leandro,
CAから入手可能；Y. C. Martin, J. Med. Chem. 35:2145-2154 (1992)で概説；
およびＨＯＯＫ(M. B. Eisenら, Proteins: Struc., Funct., Genet. 19: 199-2
21 (1994)；Molecular Simulations, San Diego, CAから入手可能）のごとき３
Ｄデータベース・システムが含まれる。

【００９３】 カスパーゼ−８インヒビターは、空の結合部位を用いて、または所望により知
られているインヒビター（群）の幾つかの部分（群）を含めて“デ・ノボで”デ
ザインし得る。限定されるものではないが、ＬＵＤＩ（H.-J. Bohm, J. Comp. A
id. Molec. Design. 6: 61-78 (1992)；Molecular Simulations Inc., San Dieg
o, CAから入手可能）；ＬＥＧＥＮＤ（Y. Nishibataら, Tetrahedron, 47:8985
(1991)；Molecular Simulations Inc., San Diego, CAから入手可能）；LeapFro
g（Tripos Associates, St. Louis, MOから入手可能）；およびＳＰＲＯＵＴ(V.
Gilletら, J. Comput. Aided Mol. Design 7: 127-153 (1993)；University of
Leeds, UKから入手可能）を含む多くのデ・ノボ−リガンドデザイン法が存在す
る。

【００９４】 化合物を上記方法によってデザインするかまたは選抜したら、基がカスパーゼ
−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットに結合し得
る効率を、コンピュータ操作評価によって試験および最適化し得る。例えば、有
効なインヒビターは、好ましくは、その結合と遊離状態との間のエネルギーにお
ける比較的小さい差（すなわち、結合の小さい変形エネルギー）を示さなければ
ならない。したがって、最も効率的なインヒビターは、好ましくは、約１０ｋｃ
ａｌ／ｍｏｌｅ以下；より好ましくは７ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以下の結合の変形エ
ネルギーでデザインすべきである。カスパーゼ−８インヒビターは、全結合エネ
ルギーにおいて同様である１を超えるコンホメーションで結合ポケットと相互作
用し得る。これらの場合において、結合の変形エネルギーは、遊離基のエネルギ
ーとインヒビターがタンパク質に結合する場合に観察されるコンホメーションの
平均エネルギーとの間の差と考える。

【００９５】 カスパーゼ−８の基質結合ポケットまたはカスパーゼ−８様の結合ポケットに
結合するとしてデザインまたは選抜した基は、さらに、好ましくはその結合状態
で標的酵素および取囲む水分子との反発性の静電相互作用を欠くように、コンピ
ュータ操作で最適化し得る。かかる非相補的な静電相互作用には、反発性の電荷
−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子の相互作用が含まれる。

【００９６】 特定のコンピュータ・ソフトウェアを当該技術分野で入手して、化合物の変形
エネルギーおよび静電相互作用を評価し得る。かかる用途に設計されたプログラ
ムの例には：Gaussian 94, revision C（M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pitts
burgh, PA C1995）；ＡＭＢＥＲ, version 4.1 (P. A. Kollman, University of
California at San Francisco, C 1995)；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Molec
ular Simulations, Inc., San Diego, CA C 1995）；Insight II/Discover (Mol
ecular Simulations, Inc., San Diego, CA C 1995); DelPhi（Molecular Simul
ations, Inc., San Diego, CA C 1995)；およびＡＭＳＯＬ（Quantum Chemistry
Program Exchange, Indiana University）が含まれる。これらのプログラムは
、例えば、"IMPACT"グラフィックスとIndigo²のごときSilicon Graphicsワーク
ステーションを用いて実行し得る。他のハードウェア・システムおよびソフトウ
ェア・パッケージは当業者に知られているであろう。

【００９７】 本発明により包含されるもう１のアプローチは、カスパーゼ−８またはカスパ
ーゼ−８様の基質結合ポケットに、全体または一部分で結合し得る化学基または
化合物につき小分子データベースをコンピュータ操作でスクリーニングすること
である。このスクリーニングにおいては、結合部位に対するかかる基のフィッテ
ィングの質を、形状相補性または推定相互作用エネルギーにいずれかによって判
断し得る（E. C. Mengら, J. Comp. Chem. 13: 505-524 (1992)）。

【００９８】 本発明は、カスパーゼ−８に対してまたはそれと結合する基質または他の化合
物の化学反応において短い寿命の反応中間体に異性化し得る化学基の開発も許容
する。他の分子とのその相互作用の間にカスパーゼ−８における構造変化の時間
依存的な解析を行う。カスパーゼ−８の反応中間体も、カスパーゼ−８との共複
合体における反応産物から推定し得る。かかる情報は、知られているカスパーゼ
−８インヒビターの改良アナログをデザインし、または、カスパーゼ−８および
インヒビター共複合体の反応中間体に基づく新規なクラスのインヒビターをデザ
インするのに有用である。これは、高い特性と安定性の両方を有するカスパーゼ
−８インヒビターをデザインするための新規なルートを提供する。

【００９９】 合理的薬剤デザインのなおもう１のアプローチには、種々の異なる官能基を含
む分子で本発明のカスパーゼ−８結晶を探索して、候補カスパーゼ−８インヒビ
ターと該タンパク質との間の相互作用の最適な部位を決定することが含まれる。
他の分子に浸漬したかまたはそれを用いて共結晶化させた結晶から収集した高分
解能ｘ−線回折データは、どの各タイプの溶媒分子が離れないかの決定を許容す
る。ついで、これらの部位に強固に結合する分子をさらに修飾および合成し、そ
れらのヘルペス・プロテアーゼインヒビター活性について試験し得る[J. Travis
, Science, 262: 1374 (1993)]。

【０１００】 関連するアプローチにおいて、反復薬剤デザインを用いてカスパーゼ−８活性
のインヒビターを同定する。反復薬剤デザインは、タンパク質／化合物複合体の
連続的なセットの三次元構造を決定および評価することにより、タンパク質と化
合物との間の会合を最適化する方法である。反復薬剤デザインにおいては、一連
のタンパク質／化合物複合体の結晶を得、ついで各複合体の三次元構造を解明す
る。かかるアプローチは、各複合体のタンパク質と化合物との間の会合の洞察を
提供する。これは、阻害活性で化合物を選抜し、この新たなタンパク質／化合物
複合体の結晶を得、該複合体の三次元構造を解明し、ついで新たなタンパク質／
化合物複合体と以前に解明されたタンパク質／化合物複合体との間で会合を比較
することによって行う。化合物における変化がいかにしてタンパク質／化合物会
合に影響したかを観察することによって、これらの会合を最適化し得る。

【０１０１】 リガンドおよびインヒビター 本発明に包含されるのは、例えば前記の合理的薬剤デザインの方法で同定した
ような、結合部位と直接会合することによってカスパーゼ−８またはそのホモロ
グの活性を調節、および好ましくは阻害する化合物である。かかる化合物の治療
用途も描かれる。１の具体例において、インヒビター化合物はペプチドまたはペ
プチド模倣化合物であり、好ましくは少なくとも３のアミノ酸を含むものである
。特に好ましい具体例において、カスパーゼ−８活性のインヒビターは、少なく
とも４のアミノ酸を含むペプチドまたはペプチド模倣化合物であり、ここにＰ４
ポジションのアミノ酸は疎水性アミノ酸である。より好ましくは、ペプチドまた
はペプチド模倣インヒビターのＰ３および／またはＰ１ポジションのアミノ酸は
、マイナス荷電アミノ酸である。ポジションＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４は、好
ましくは、各々、カスパーゼ−８結合部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４と会合す
る。ペプチドおよびペプチド模倣インヒビターは、所望により、Ｎ−およびＣ−
末端の１または両方で誘導化し得る。例えば、インヒビターは、Ｎ−末端でアセ
チル基および／またはＣ−末端でアルデヒド、フルオロメチルケトンなどで誘導
化し得る。

【０１０２】 医薬組成物 本発明の医薬組成物は、本発明により同定したカスパーゼ−８活性のインヒビ
ターまたはその医薬上許容される塩、および医薬上許容し得る担体、アジュバン
トまたはビヒクルを含む。“医薬上許容し得る担体”なる用語は、組成物の他の
成分と混和性であってその受容者に有害でない意味において“許容し得る”担体
（群）をいう。所望により、製剤のｐＨは、医薬上許容し得る酸、塩基または緩
衝液で調節して、製剤化した化合物またはそのデリバリー形態の安定性を向上さ
せる。

【０１０３】 かかる医薬組成物の製法および使用方法も本発明に包含される。本発明の医薬
組成物は、経口的、非経口的、吸引スプレーによって、局所的、直腸的、鼻腔内
的、口内的、膣内的または移植容器を介して投与し得る。経口投与または注射に
よる投与が好ましい。本明細書中で用いる非経口なる語句には、皮下、皮内、静
脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、包膜内、障害内および頭蓋内の注射ま
たは点滴技術が含まれる。

【０１０４】 約０.０１ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０.５ないし約７
５ｍｇ／ｋｇ体重／日のカスパーゼ−８インヒビターの用量レベルが、パーキン
ソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、卒中、癌、脊髄損傷、心血管
疾患および神経疾患のごとき異常なカスパーゼ−８活性と関連付けられる疾患を
予防および治療するのに有用であると予想される。典型的に、本発明の医薬組成
物は、１日当り約１ないし約５回投与し、あるいは別法として、連続点滴として
投与するであろう。かかる投与は、慢性または急性の治療として用い得る。担体
材料と合して単一投与量形を生成し得る活性成分の量は、治療する宿主および投
与の特定のモードに依存して変化するであろう。典型的な調製物は約５％ないし
約９５％の有効化合物（ｗ／ｗ）を含有するであろう。好ましくは、かかる調製
物は約２０％ないし約８０％の有効化合物を含有する。

【０１０５】 実施例 本発明を以下の実施例によって説明する。特定の例、材料、量および手法が本
明細書中に記載する発明の範囲および趣旨と一致して広く解釈すべきであること
は理解されるべきである。

【０１０６】 実施例１：遺伝子構築およびタンパク質発現 プロカスパーゼ−８構築用の遺伝子を、標準的なプロトコールを用いて、ベク
ターｐＱＥ３０（Qiagen）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化
し、イー・コリ（E.coli)中で増殖および発現させるためのＭ１５（ｐＲＥＰ４
）細胞（Qiagen）に形質転換した。細胞培養物は、１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス中で増殖させた
。Ａ_５５０＝０.７ないし０.８にて、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加することによっ
て発現を誘導した。３０分後に細胞を集め、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８.０、１
ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁し、−７０℃にて凍結させた。封入体の存在を光学顕
微鏡によって決定した。超音波処理によって細胞を破砕し、低速遠心（Sorvall
SS34；3000rpm，30分間）によって可溶性タンパク質および細胞残渣から封入体
を分離した。

【０１０７】 実施例２：リフォールディング・プロトコール プロカスパーゼ−８を収容しているイー・コリ封入体を１ｍＭのＥＤＴＡを含
有する１０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８.０に再懸濁し、同緩衝液で洗浄し、最
後に１０７４×ｇの遠心によって収集した。ついで、封入体を５ｍＭのＤＴＴを
含有する６Ｍの塩化グアニジウム、０.１Ｍのトリス、ｐＨ８.０に溶解し、遠心
によって不溶性材料を除去した。

【０１０８】 ６Ｍの塩化グアニジウム中のプロカスパーゼ−８の溶液（２−３ｍｇタンパク
質／ｍｌ）を等体積の氷酢酸で処理し、つづいて５０％酢酸に対して透析した。
この溶液を９倍体積の水に迅速に添加して、５％酢酸中のタンパク質の透明な溶
液を作成した。この溶液を９倍体積の５ｍＭのＤＴＴを含有する１.０Ｍのトリ
ス緩衝液、ｐＨ８に添加することによってｐＨを迅速に８.０とした。これによ
り、中性ｐＨのプロカスパーゼ−８の透明溶液が生じた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、
３３ｋＤａの質量に相当する単一バンドを示した。

【０１０９】 タンパク質の溶液は、Amicon攪拌セルコンセントレイター中の限外濾過によっ
て濃縮した。この濃縮工程はすべての３３ｋＤａのプロカスパーゼ−８の活性化
カスパーゼの特徴であるｐ１８およびｐ１１種への自触媒プロセシングに通じる
。活性化カスパーゼ−８の配列解析および質量分析は、ｐ１８サブユニットがＳ
ｅｒ−２１１で開始してＡｓｐ−３７４まで伸長する一方、ｐ１１サブユニット
はＬｅｕ−２８５で開始してＣ−末端Ａｓｐ−４７９まで続くことを確立した（
図１）。

【０１１０】 実施例３：分析方法 タンパク質定量は、Beckman Model 6300 ion-exchange instrumentを用いるア
ミノ酸分析によって得た。タンパク質シークエンシングは、Perkin Elmer／Appl
ied Biosystems Procise^TM Sequencerを用いて行った。主要なプロカスパーゼ・
プロセシングフラグメントおよび中間体の質量は、Micromass Quattro II ＭＳ
上のエレクトロスプレイ・イオン化およびPerseptive Biosystems Voyager Elit
e飛行時間型ＭＳ上のＭＡＬＤＩイオン化で決定した。ドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、Novex１６％のト
リス−グリシンまたは１０％の（ＭＥＳランニング緩衝液を用いる）NuPage Bis
−トリス・プレキャスト・ミニゲルおよびNovex Xcell IIミニ−セル装置を用い
て行った。

【０１１１】 実施例４：カスパーゼ−８のアッセイ カスパーゼ−８調製物の酵素活性は、発色性基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ（配
列番号：５）またはＡｃ−ＩＥＴＤ−ｐＮＡ（配列番号：６）（California Pep
tide Research, Inc.）を用いてモニターした。パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ
）の動力学放出は、ｐＨ７.５０および３７℃に維持した反応における４０５ｎ
ｍで分光測定的に追跡した。自触媒的にプロセシングされたカスパーゼ−８調製
物（実施例２）は、発色性カスパーゼ−８（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ｐＮＡ）（配列番
号：５）またはカスパーゼ−３（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ）（配列番号：６）基
質を容易に切断したが、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）基質Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣ
（配列番号：７）に向けては何ら測定可能な活性を示さなかった。最適基質Ａｃ
−ＩＥＴＤ−ｐＮＡ（配列番号：６）については、Ｋｍ＝６６±５μＭ、Ｖｍａ
ｘ＝８.４３±０.１８μｍｏｌ／分／ｍｇであった。

【０１１２】 実施例５：カスパーゼ−８／リガンド複合体の調製 ２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８.０中のカスパーゼ−８の８.
４ｍｇ／ｍｌ溶液の２.５ｍｌ（０.７μｍｏｌ）体積に、ＤＭＳＯ中のペプチド
・インヒビターＡｃ−ＩＥＴＤ−Ｈ（配列番号：４）の１０ｍＭのストック溶液
１４０μｌ（１.４μｍｏｌ、２倍モル過剰）を添加した。Ａｃ−ＩＥＴＤ−ア
ルデヒド（配列番号：４）は、活性部位Ｃｙｓ３６０を共有的に修飾する基質模
倣体である（ＩＣ_５０＝５０ｎＭ）。その溶液を氷上で３０分間攪拌した。

【０１１３】 実施例６：結晶化およびデータ収集 カスパーゼ−８：Ａｃ−ＩＥＴＤ複合体は、McPhersonの方法（Preparation a
nd Analysis of Protein Crystals, McPherson, A編, pp. 94-97, Kreiger Publ
ishing Co., Malabar, FL (1989)）に従ってハンギング・ドロップおよびシッテ
ィング・ドロップ蒸気拡散によって結晶化させた。タンパク質−インヒビター溶
液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８.０、１００ｍＭのＤＴＴ中の８.４ｍｇ／ｍｌ）
の３滴（３μｌ）を等体積のリザーバー緩衝液（１.４Ｍのクエン酸ナトリウム
、０.１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８.０）と混合し、４℃にてインキュベートした。
結晶の平均サイズは０.２０×０.３０×０.４０ｍｍであった。データを測定す
る直前にその結晶をナイロン・ループ上に載せ、窒素蒸気中で直接凍結させた。
第１のデータセットにおいては、Ｘ−線回折データは、Bruker Dual Hi-Star二
次元検出システムを備えた回転アノードＣｕ Ｋα源（５０ｋＶ、１００ｍＡ）
を用いて測定した。２.０７Åに設定した１００％完全なデータを用いて、初期
再構築ステージの間に構造を解明および精密化した。第２のデータセットは、１
.０３Åの波長およびBruker Mosaic CCD二次元検出システムを用いて、Advanced
Photon Source （Argonne National Laboratory, Argonne, IL）ＩＭＣＡ−Ｃ
ＡＴビーム線ＩＤ−１７にて測定した。両方の結晶についてのデータの収集およ
びプロセシングは、ＳＭＡＲＴおよひＳＡＩＮＴソフトウェア（ＳＭＡＲＴソフ
トウェア参考マニュアルおよびＳＡＩＮＴソフトウェア参考マニュアル；Bruker
Analytical X−ray Systems, Madison, WI (1998)）を用いて行った。データ収
集統計を図８に掲載する。

【０１１４】 実施例７：構造の解明および精密化 構造はBruker Dual Hi-Star systemからの回折データ（データセットＩ）を用
いてＣＣＰ４プログラム組中のプログラム・スイート中のプログラムAMoRe（Col
laborative Computational Project No. 4, "The CCP4 Suite:programs for pro
tein crystallography", Acta crystallogr. D 50: 760-763 (1994); Nazava, A
cta Crystallogr.A 50: 157-163 (1994)）を用いた分離置換によって解明した。
カスパーゼ−３（Brookhaven Data Bank中の1CP3）構造に基づく切頭ｐ１０／ｐ
２０ポリ−アラニン検索モデル（Mittlら, J. Biol. Chem., 272: 6539-6547(19
97)）を用いた。ピークは、２５Åの収束半径を有する分解レンジ８−４.０Åに
おいて、回転角α＝８.１８、β＝６２.２１およびγ＝１５０.０８（ピーク高
＝７σ）を有するのクロス−回転関数(cross-rotation function)に見出された
。分解能８−３Åで前記角度に従って回転させた検索モデルで計算した二次元並
進関数は、溶液に、並進ａ＝０.２４７９、ｂ＝０.５１９５およびｃ＝０.１９
４７（相関係数＝１９.８％、Ｒ_Ｆ＝０.５１９）を与えた。初期精密化はデータ
セットＩおよびＰＲＯＦＦＴ（Finzel, J. Appl. Crystallogr. 20: 53-55 (198
7)）を用いて行った。高分解能精密化は、シンクロトロン放射データセットＩＩ
を用いて行った。構造は、グラフィック端末上の手動介在（ＣＨＡＩＮ；Sackら
, J. Mol. Graphics 6: 224-225 (1998)およびＬＯＲＥ（Finzel, Acta Crystal
logr. D 51: 450-457 (1995)）とＳＨＥＬＸＬ９７（Sheldrickら, Methods Enz
ymol. 277: 319-343 (1997)）を用いる拘束最小二乗法の交互のラウンド（alter
nating round）によって精密化した。Ｒ_Ｆは、１０−１.２Åの分解能の間の２
σ_Ｆを超える全データについて０.１４７に収束した。３４０の水分子、インヒ
ビターおよび２のジチアン−ジオール分子を最終モデルに含めた。非溶媒原子に
ついての水素パラメータはモデルに含めたが、精密化しなかった。結合の長さお
よび角度についての二乗平均平方根偏差は、各々０.０２４Åおよび２.１４Åで
ある。全ての残基を割当てられ得なかった。電子密度が非常に弱すぎたたためで
ある。ｐ１８およびｐ１１ダイマーにおいては、不規則のために、各々、１２お
よび４のＮ−末端残基を位置決定し得なかった。最終精密化およびＰＲＯＣＨＥ
ＣＫ（Laskowskiら, J. Appl. Crystallogr. 26: 283-291 (1993)）統計は、図
９に含める。

【０１１５】 カスパーゼ−８：Ａｃ−ＩＥＴＤ−アルデヒド複合体（受入れコード１ＱＴＮ
）の原子座標および構造因子は、Rutgers Universityに位置するRCSB Protein D
ata Bank（PDB^R）（http://www.csb.org/pdb/）に１９９９年６月２８日に寄託
し、２０００年９月１５日に公共的に放出される予定である。

【０１１６】 本明細書中で引用したすべての特許、仮特許出願を含む特許出願、および公開
公報、ならびに電子的に入手可能な材料（例えば、GenbBankのアミノ酸およびヌ
クレオチドの配列の提出物；RCSBおよびBrookhaven Protein Data Bankの原子座
標提出物）は、出典明示して本明細書の一部とみなす。前記した詳細な説明およ
び実施例は明白な理解のみのために提供したものである。そこから不必要な限定
が理解されるべきでない。本発明は、示しおよび記載した正確な詳細に限定され
るものではなく；多くの変形は当業者に明らかであって、請求の範囲によって定
義される本発明の範囲内に包含されることを意図する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、示す空間的に整列させたα−ヘリックスおよびβ−シート
二次構造エレメントを含むカスパーゼ−８（配列番号：１）、カスパーゼ−３（
配列番号：２）およびカスパーゼ−１（配列番号：３）のアミノ酸配列を示す。
サブユニットの末端およびループ（Ｌ）領域のアライメントは包含していない。
ｐ１８（カスパーゼ−８のα−サブユニット）の最初の１２残基およびｐ１１（
カスパーゼ−８の場合はβ−サブユニット）の最初の４残基は混乱している。垂
直の矢印は、下記のごとき切断部位を示す：カスパーゼ−８中のα−サブユニッ
トの最初のＤ２１０↓Ｓ２１１および最後のＤ３７５↓Ｓ３７６。切断部位Ｄ３
８４↓Ｌ３８５は、カスパーゼ−８にβ−サブユニットを生成する。

【図２】 図２は、明るい影で示すｐ１８サブユニットおよび暗い影で示すｐ
１１サブユニットを有するヘテロダイマーの標識した模式図である。β−ストラ
ンドは矢印であり；α−ヘリックスはコイルである。サブユニットのＮおよびＣ
末端を標識している。Ａｃ−ＩＥＴＤ−Ｈ（配列番号：４）インヒビターはボー
ルおよびスティック・モデルで示している。

【図３】 図３は、明るい影で示すカスパーゼ−８、中度の影で示すカスパー
ゼ−３および暗い影のカスパーゼ−１の重ね合わせた構造の骨格図である。２群
の関連するカスパーゼ−８ダイマーは、白色の帯として示す。基質結合ポケット
を取囲むタンパク質のストランドおよび結合サブサイトのおおよその位置を示す
。向きは図２のものと同様である。

【図４】 図４は、ダイマー−ダイマー界面に沿ったヘテロダイマー間の水素
結合接触の表を示す。アスタリスクは対称−関連分子を示す。

【図５】 図５は、ＧＲＡＳＰ（Nichollsら, J. Appl. Cryst. 24: 946-950
(1991)）により作製し、２回軸を下方に見る（Ａ）カスパーゼ−８および（Ｂ）
カスパーゼ−３の分子表面を示す。表面は２回軸にほぼ平行して示している。中
央のキャビティーは黒色で描かれている。テトラペプチド・インヒビターおよび
ジチアン−ジオール分子は、スティック・モデルとして示している。（Ｃ）カス
パーゼ−８の中央キャビティー中に位置するジチアン−ジオール分子の電子密度
の拡大図である。

【図６】 図６は、Ａｃ−ＩＥＴＤ−カスパーゼ−８複合体中の水素結合図の
模式図を示す。リガンドはチオヘミアセタール結合を介して活性部位の求核性Ｃ
ｙｓ−３６０に共有結合している。水素結合は破線によって表している。

【図７】 図７は、以下のものを示す：（Ａ）タンパク質の静電的表面につい
てのAmberパラメータ（Weinerら, J. Comp. Chem. 7: 230-252 (1986)）を用い
た基質結合ポケットの電子密度。（Ｂ）触媒トライアド領域の電子密度。

【図８】 図８は、データ収集およびプロセシング・パラメータの概要を示す
。

【図９】 図９は、Ａｃ−ＩＥＴＤ−カスパーゼ−８複合体の精密化統計を示
す。

【図１０】 図１０は、Ａｃ−ＩＥＴＤ−カスパーゼ−８複合体の結晶からＸ
−線回折によって導いたＡｃ−ＩＥＴＤ−カスパーゼ−８複合体の原子構造座標
を列挙している。 “原子のタイプ”とは、その座標を測定した元素をいう。列の最初の文字が元
素を規定する。 “Ｘ，Ｙ，Ｚ”は測定した元素の原子ポジションを結晶学的に規定する。 “Ｂ”は、その原子中心の周りの原子の運動を測定する熱因子である。 “Ｏｃｃ”は、その中で各原子が座標によって特定されるポジションを占める
分子の断片を示す占有率である。“１”の値は、結晶の全分子の中で各原子が同
一のコンホメーション、すなわち同一のポジションを有することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/14 Ａ６１Ｐ 25/16 25/16 25/28 25/28 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/54 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 キース・ディ・ウェイテンポー アメリカ合衆国98239ワシントン州クープ ビル、サウス・シークレスト・レイン1604 番 (72)発明者 ケネス・エイ・コープリンガー アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ ー、バーニング・ツリー・ロード5326番 (72)発明者 アナ・エム・マイルドナー アメリカ合衆国49008ミシガン州カラマズ ー、パイン・ブラフ3324番 (72)発明者 ロバート・エル・ハイリクソン アメリカ合衆国49080ミシガン州プレイン ウェル、サウス・レイク・ドスター・ドラ イブ81番 (72)発明者 アルフレド・ジー・トマセッリ アメリカ合衆国49009ミシガン州カラマズ ー、カッティサーク・ドライブ2503番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA06 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC04 DD07 FF17C LL01 LL03 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA08 BA16 CA62 DC02 DC32 NA14 ZA012 ZA152 ZA162 ZA362 ZB262

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表される
   カスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ
   ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４
   １１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原
   子からの二乗平均平方根（ＲＭＳ）偏差を有する点のセットによって規定される
   骨格原子を含むカスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少
   なくとも一部分を含む分子または分子複合体。
2. 【請求項２】 さらに、基質結合ポケットが、約２.０Å未満の、図１０に
   よる構造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ
   ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３
   ６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１
   ５およびＴｒｐ４２０の非水素側鎖原子からの二乗平均平方根偏差を有する点の
   セットによって規定される請求項１記載の分子または分子複合体。
3. 【請求項３】 カスパーゼ−８の分子または分子複合体に構造的に相同であ
   る請求項１記載の分子または分子複合体。
4. 【請求項４】 基質結合ポケットが、図１０による構造座標によって表され
   るカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓ
   ｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ
   ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格
   原子を表す点のセットによって規定される骨格原子を含む請求項１記載の分子ま
   たは分子複合体。
5. 【請求項５】 約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表される
   カスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ
   ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４
   １１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原
   子を特徴付ける原子間距離からの二乗平均平方根偏差を有する原子間距離によっ
   て特徴付けられる骨格原子を含むカスパーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質
   結合ポケットの少なくとも一部分を含む分子または分子複合体。
6. 【請求項６】 約２.０Å未満の、約１０Åの半径を有する球形内に位置し
   、かつ、残基３６０のアルファ炭素原子を表す座標上に中心化された図１０によ
   る構造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸の骨格原子からの二乗平
   均平方根偏差を有する点のセットによって規定される骨格原子を含むカスパーゼ
   −８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む分子
   または分子複合体。
7. 【請求項７】 カスパーゼ−８の基質結合ポケットの少なくとも一部分を規
   定する複数のカスパーゼ−８のアミノ酸の骨格原子を表す図１０による構造座標
   から導かれ、かつ、約２.０Å未満の該構造座標からの二乗平均平方根偏差を有
   する選抜した点を含む点のスケーラブルな三次元配置。
8. 【請求項８】 カスパーゼ−８の基質結合ポケットが、アミノ酸Ａｒｇ２５
   ８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８
   、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、
   Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０を含む請求項７記載の点のスケーラブルな三次
   元配置。
9. 【請求項９】 選抜した点が、カスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａ
   ｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙ
   ｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ
   ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原子を表す図１０による構造座標によって規定
   される請求項７記載の点のスケーラブルな三次元配置。
10. 【請求項１０】 さらに、カスパーゼ−８の少なくとも５０の隣接する骨格
    原子を表す図１０による構造座標から導かれ、かつ、約２.０Å未満の該構造座
    標からの二乗平均平方根偏差を有する選抜した点を含む請求項７記載の点のスケ
    ーラブルな三次元配置。
11. 【請求項１１】 物理モデル、コンピュータ描写像、ホログラフ像または立
    体図として表示された請求項７記載の点のスケーラブルな三次元配置。
12. 【請求項１２】 図１０による構造座標によって表されるカスパーゼ−８の
    分子または分子複合体に構造的に相同である分子または分子複合体の少なくとも
    一部分の構造座標から導かれた選抜した点を含み、ここに該選抜した点が約２.
    ０Å未満の、該構造的に相同な分子または分子複合体の構造座標からの二乗平均
    平方根偏差を有することを特徴とする点のスケーラブルな三次元配置。
13. 【請求項１３】 物理モデル、コンピュータ描写像、ホログラフ像または立
    体図として表示された請求項１２記載の点のスケーラブルな三次元配置。
14. 【請求項１４】 機器読み出し可能なデータを用いる命令をプログラムされ
    た機器を用いた場合に、 （ｉ）約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表されるカスパーゼ
    −８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈ
    ｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙ
    ｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原子からの二
    乗平均平方根偏差を有する点のセットによって規定される骨格原子を含むカスパ
    ーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む分子または分子複合体
    ； （ｉｉ）約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表されるカスパー
    ゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、
    Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２およびＡｒｇ４１３
    の骨格原子および非水素側鎖原子からの二乗平均平方根偏差を有する点のセット
    によって規定される骨格原子を含むカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少な
    くとも一部分を含む分子または分子複合体； （ｉｉｉ）約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表されるカスパ
    ーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１
    、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、
    Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原子を特
    徴付ける原子間距離からの二乗平均平方根偏差を有する原子間距離によって特徴
    付けられる骨格原子を含むカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一
    部分を含む分子または分子複合体； （ｉｖ）約２.０Å未満の、図１０による構造座標によって表されるカスパー
    ゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、
    Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔ
    ｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨格原子からの
    二乗平均平方根偏差を有する点のセットによって規定される骨格原子を含むカス
    パーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む分子または分子複合
    体に構造的に相同である分子または分子複合体；または、 （ｖ） 約２.０Å未満の、約１０Åの半径を有する球形内に位置し、かつ、
    残基３６０のアルファ炭素原子を表す座標上に中心化された図１０による構造座
    標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根
    偏差を有する点のセットによって規定される骨格原子を含むカスパーゼ−８様の
    基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む分子または分子複合体 のグラフィック三次元描写を表示することができる機器読み出し可能なデータを
    コードしたデータ保存材料を含む機器読み出し可能なデータ保存媒体。
15. 【請求項１５】 カスパーゼ−８の基質結合ポケットを含むカスパーゼ−８
    分子の少なくとも一部分の少なくとも骨格原子を表す図１０に示す構造座標をコ
    ードするデータ保存材料を含む機器読み出し可能なデータ保存媒体。
16. 【請求項１６】 データ保存材料が、少なくともアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａ
    ｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙ
    ｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ
    ４１５およびＴｒｐ４２０の少なくとも骨格原子を表す図１０に示す原子座標を
    コードする請求項１５記載の機器読み出し可能なデータ保存媒体。
17. 【請求項１７】 第１のセットの機器読み出し可能なデータを用いるための
    命令をプログラムした機器を用いて、第２のセットの機器読み出し可能なデータ
    と結合した場合に、該第２のセットの機器読み出し可能なデータに対応する構造
    座標の少なくとも一部分を決定し得る該第１のセットの機器読み出し可能なデー
    タをコードしたデータ保存材料を含み、ここに該第１のセットのデータが図１０
    によるカスパーゼ−８の構造座標の少なくとも一部分のフーリエ変換を含み；か
    つ、該第２のセットのデータが知られていない構造の分子または分子複合体のｘ
    −線回折パターンを含むことを特徴とする機器読み出し可能なデータ保存媒体。
18. 【請求項１８】 分子または分子複合体を結晶化し； 該結晶化した分子または分子複合体からｘ−線回折パターンを創製し； 図１０に掲載する構造座標の少なくとも一部分を該ｘ−線回折パターンにあて
    はめて構造が知られていない分子または分子複合体の少なくとも一部分の三次元
    電子密度地図を作成することからなる、分子置換の技術を用いて知られていない
    構造の分子または分子複合体についての構造情報を得るためのコンピュータ支援
    方法。
19. 【請求項１９】 知られていない構造の分子または分子複合体がカスパーゼ
    −８の分子または分子複合体に構造的に相同である請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 カスパーゼ−８ホモログのアミノ酸配列とカスパーゼ−８
    のアミノ酸配列（配列番号：１）とを整列させてアミノ酸アライメントを得； 該アミノ酸アライメントを利用してカスパーゼ−８ホモログの配列を図１０に
    掲載する構造座標から導いたカスパーゼ−８のモデルに取込ませて、カスパーゼ
    −８ホモログの予備モデルを得； 該予備モデルをエネルギー最小化に付してエネルギー最小化モデルを得； 立体化学束縛を破る（violate）エネルギー最小化モデルの領域を再モデリン
    グしてカスパーゼ−８ホモログの最終モデルを得ることからなるカスパーゼ−８
    ホモログをホモロジーモデリングするためのコンピュータ支援方法。
21. 【請求項２１】 コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、カスパ
    ーゼ−８またはカスパーゼ様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む分子
    または分子複合体の構造座標のセットを供給し； コンピュータ・モデリング・アプリケーションを化学基の構造座標のセットに
    供給し；ついで、 化学基が該基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予想
    されるか否かを決定することからなり、ここに該分子または分子複合体への結合
    がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とするカスパーゼ
    −８活性のモジュレータを同定するためのコンピュータ支援方法。
22. 【請求項２２】 コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、カスパ
    ーゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む
    分子または分子複合体の構造座標のセットを供給し； コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、化学基の構造座標のセット
    を供給し； 該化学基と該分子または分子複合体の基質結合ポケットとの間の潜在的な結合
    相互作用を評価し； 該化学基を構造的に修飾して、修飾した化学基の構造座標のセットを得；つい
    で、 該化学基が該基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予
    想されるか否かを決定することからなり、ここに該分子または分子複合体への結
    合がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とするカスパー
    ゼ−８活性のモジュレーターをデザインするためのコンピュータ支援方法。
23. 【請求項２３】 化学基の構造座標のセットを化学フラグメント・ライブラ
    リーから得る請求項２２記載の方法。
24. 【請求項２４】 化学基のライブラリーをスクリーニングすることを複数回
    行う請求項２１または２２記載の方法。
25. 【請求項２５】 コンピュータ・モデリング・アプリケーションにカスパー
    ゼ−８またはカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含む分
    子または分子複合体の構造座標のセットを供給し； 構造座標のセットによって表される化学基をコンピュータ操作で構築し；つい
    で、 該化学基が該基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予
    想されるか否かを決定することからなり、ここに該分子または分子複合体への結
    合がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とするデ・ノボ
    （de novo）なカスパーゼ−８活性のモジュレーターをデザインするためのコン
    ピュータ支援方法。
26. 【請求項２６】 モジュレーターがカスパーゼ−８活性のインヒビターであ
    る請求項２１、２２または２５いずれか１項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 さらに、潜在的なモジュレーターを供給または合成し、つ
    いで、該潜在的なモジュレーターをアッセイしてそれがカスパーゼ−８活性をモ
    ジュレートするか否かを決定することからなる請求項２１、２２または２５いず
    れか１項記載の方法。
28. 【請求項２８】 基質結合ポケットが、約２.０Å未満の、図１０による構
    造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９
    、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、
    Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およ
    びＴｒｐ４２０の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を有する三次元のスケーラ
    ブルな点のセットによって規定される請求項２１、２２または２５のいずれか１
    項に記載の方法。
29. 【請求項２９】 さらに、基質結合ポケットが、約２.０Å未満の、図１０
    による構造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓ
    ｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ
    ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４
    １５およびＴｒｐ４２０の非水素側鎖原子からの二乗平均平方根偏差を有する三
    次元のスケーラブルな点のセットによって規定される請求項２８記載の方法。
30. 【請求項３０】 基質結合ポケットが、図１０による構造座標によって表さ
    れるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９、Ａｒｇ２６０、Ａ
    ｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、Ｖａｌ４１０、Ｓｅ
    ｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およびＴｒｐ４２０の骨
    格原子を表す三次元のスケーラブルな点のセットによって規定される請求項２８
    記載の方法。
31. 【請求項３１】 基質結合ポケットが、約２.０Å未満の、図１０による構
    造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸Ａｒｇ２５８、Ａｓｐ２５９
    、Ａｒｇ２６０、Ａｓｎ２６１、Ｈｉｓ３１７、Ｇｌｎ３５８、Ｔｙｒ３６５、
    Ｖａｌ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｔｙｒ４１２、Ａｒｇ４１３、Ｐｒｏ４１５およ
    びＴｒｐ４２０の骨格原子を特徴付ける原子間距離からの二乗平均平方根偏差を
    有する一対の距離によって特徴付けられる三次元のスケーラブルな点のセットに
    よって規定される請求項２１、２２または２５いずれか１項に記載の方法。
32. 【請求項３２】 基質結合ポケットが、約２.０Å未満の、約１０Åの半径
    を有する球形内に位置し、かつ、残基３６０のアルファ炭素原子を表す座標上に
    中心化された図１０による構造座標によって表されるカスパーゼ−８のアミノ酸
    の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を有するスケーラブルな点のセットによっ
    て規定される請求項２１、２２または２５いずれか１項に記載の方法。
33. 【請求項３３】 決定する工程が、化学基と基質結合ポケットとの間のフィ
    ッティング操作を行い、つづいて該フィッティング操作の結果をコンピュータ操
    作で解析して該化学基と該基質結合ポケットとの間の会合を定量化することから
    なる請求項２１、２２または２５いずれか１項に記載の方法。
34. 【請求項３４】 さらに、化学基を化学的または酵素的に合成して、カスパ
    ーゼ−８活性のモジュレーターを得ることを含む請求項２１、２２または２５い
    ずれか１項に記載の方法。
35. 【請求項３５】 カスパーゼ−８活性のモジュレーターが、カスパーゼ−８
    活性のインヒビターである請求項３４記載の方法。
36. 【請求項３６】 コンピュータ・モデリング・アプリケーションに分子また
    は分子複合体の構造座標のセットを供給することを含むコンピュータ支援プロセ
    スの間に同定された化学基を化学的または酵素的に合成してカスパーゼ−８活性
    のモジュレーターを得、ここに該分子または分子複合体はカスパーゼ−８または
    カスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含み； コンピュータ・モデリング・アプリケーションに該化学基の構造座標のセット
    を供給し；ついで、 該化学基が該基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予
    想されるか否かを決定することを含み、ここに該分子または分子複合体への結合
    がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とするカスパーゼ
    −８活性のモジュレーターを作製するための方法。
37. 【請求項３７】 コンピュータ・モデリング・アプリケーションに分子また
    は分子複合体の構造座標のセットを供給することを含むコンピュータ支援プロセ
    スの間にデザインした化学基を化学的または酵素的に合成してカスパーゼ−８活
    性のモジュレーターを得、ここに該分子または分子複合体はカスパーゼ−８また
    はカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含み； コンピュータ・モデリング・アプリケーションに該化学基の構造座標のセット
    を供給し； 該化学基と該分子または分子複合体の基質結合ポケットとの間の潜在的な結合
    相互作用を評価し； 該化学基を構造的に修飾して修飾した化学基の構造座標のセットを得；ついで
    、 該化学基が該基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予
    想されるか否かを決定することからなり、ここに該分子または分子複合体への結
    合がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とするカスパー
    ゼ−８活性のモジュレーターを作製するための方法。
38. 【請求項３８】 コンピュータ・モデリング・アプリケーションに分子また
    は分子複合体の構造座標のセットを供給することを含むコンピュータ支援プロセ
    スの間にデザインした化学基を化学的または酵素的に合成してカスパーゼ−８活
    性のモジュレーターを得、ここに該分子または分子複合体はカスパーゼ−８また
    はカスパーゼ−８様の基質結合ポケットの少なくとも一部分を含み； 構造座標のセットによって表される化学基をコンピュータ操作で構築し；つい
    で、 該化学基が該基質結合ポケットで該分子または分子複合体に結合することが予
    想されるか否かを決定することからなり、ここに該分子または分子複合体への結
    合がカスパーゼ−８活性の潜在的な調節の指標であることを特徴とするカスパー
    ゼ−８活性のモジュレーターを作製するための方法。
39. 【請求項３９】 請求項２１、２２、２５、３６、３７または３８いずれか
    １項に記載の方法により同定またはデザインしたカスパーゼ−８活性のモジュレ
    ーター。
40. 【請求項４０】 請求項２１、２２、２５、３６、３７または３８いずれか
    １項に記載の方法により同定またはデザインしたカスパーゼ−８活性のモジュレ
    ーターを含む組成物。
41. 【請求項４１】 請求項２１、２２、２５、３６、３７または３８いずれか
    １項に記載の方法により同定またはデザインしたカスパーゼ−８活性のモジュレ
    ーターまたはその医薬上許容される塩、および医薬上許容し得る担体を含む医薬
    組成物。
42. 【請求項４２】 請求項２１、２２または２５いずれか１項に記載の方法に
    より同定またはデザインしたカスパーゼ−８活性のモジュレーターまたはその医
    薬上許容される塩、および医薬上許容し得る担体を含む有効量の医薬組成物を患
    者に投与することからなる、異常なカスパーゼ−８活性を伴うかまたはそれに関
    連する損傷または疾患を患う患者を治療するための方法。
43. 【請求項４３】 損傷または疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ハ
    ンチントン舞踏病、卒中、癌、脊髄損傷、心血管疾患および神経疾患よりなる群
    から選択される請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 約７ないし約８のｐＨに緩衝化した沈澱化剤溶液からハン
    ギング・ドロップ蒸気拡散またはシッティング・ドロップ蒸気拡散によって結晶
    を成長させることからなり、ここに該沈澱化剤溶液が約２ないし約５ｍｇ／ｍｌ
    の精製したカスパーゼ−８、緩衝液および塩を含むことを特徴とするカスパーゼ
    −８分子を結晶化させる方法。
45. 【請求項４５】 約７ないし約８のｐＨに緩衝化した沈澱化剤溶液からハン
    ギング・ドロップ蒸気拡散またはシッティング・ドロップ蒸気拡散によって結晶
    を成長させることからなり、ここに該沈澱化剤溶液が約２ないし約５ｍｇ／ｍｌ
    の精製したカスパーゼ−８、カスパーゼ−８活性のモジュレーター、緩衝液およ
    び塩を含むことを特徴とするカスパーゼ−８／モジュレーター複合体を結晶化さ
    せる方法。
46. 【請求項４６】 モジュレーターがカスパーゼ−８活性のインヒビターであ
    る請求項４５記載の方法。
47. 【請求項４７】 インヒビターがペプチドまたはペプチド模倣化合物である
    請求項４５記載の方法。
48. 【請求項４８】 インヒビターがアセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓ
    ｐ−Ｈである請求項４５記載の方法。
49. 【請求項４９】 インヒビターがカスパーゼ−８に共有結合する請求項４５
    記載の方法。
50. 【請求項５０】 塩が、サルフェート（sulfate）、クロリド、シトレート
    （citrate）およびタルトラート（tartrate）よりなる群から選択される少なく
    とも１のアニオンを含む請求項４５記載の方法。
51. 【請求項５１】 さらに、沈澱化剤溶液が約２０００ないし約８０００の分
    子量を有するポリエチレングリコールを含む請求項４５記載の方法。
52. 【請求項５２】 結晶カスパーゼ−８。
53. 【請求項５３】 小分子リガンドと複合体形成した結晶カスパーゼ−８。
54. 【請求項５４】 小分子リガンドが基質結合ポケットに結合するペプチドま
    たはペプチド模倣化合物である請求項５３記載の結晶カスパーゼ−８。
55. 【請求項５５】 小分子リガンドがアセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａ
    ｓｐ−Ｈである請求項５３記載の結晶カスパーゼ−８。
56. 【請求項５６】 三方晶空間群Ｐ３_１２１によって特徴付けられる結晶カス
    パーゼ−８。
57. 【請求項５７】 さらに、ａ＝ｂ＝６２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４Å
    ±３.０Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝１２０°の単位胞寸法を有すること
    によって特徴付けられる請求項５６記載の結晶カスパーゼ−８。
58. 【請求項５８】 三方晶空間群Ｐ３_１２１によって特徴付けられ、かつ、非
    対称単位で１（ｐ１８／ｐ１１）のヘテロダイマーおよび１のインヒビター分子
    とａ＝ｂ＝６２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４ű３.０Å、α＝９０°、β＝
    ９０°、γ＝１２０°の単位胞寸法を有するアセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
    −Ａｓｐ−Ｈと複合体形成した結晶カスパーゼ−８化合物。
59. 【請求項５９】 カスパーゼ−８のアミノ酸配列が図１に表される、結晶カ
    スパーゼ−８、または小分子リガンドと複合体形成した結晶カスパーゼ−８。
60. 【請求項６０】 結晶カスパーゼ−８または小分子リガンドと複合体形成し
    た結晶カスパーゼ−８を含む組成物。
61. 【請求項６１】 カスパーゼ−８の分子または分子複合体の結晶からｘ−線
    回折パターンを創製し、 回折データを収集し、ついで、 該データを解析して、カスパーゼ−８の分子または分子複合体の構造座標を作
    成することからなる、三方晶空間群Ｐ３_１２１によって特徴付けられ、かつ、ａ
    ＝ｂ＝６２.４ű３.０Å、ｃ＝１２９.４ű３.０Å、α＝９０°、β＝９０
    °、γ＝１２０°の単位胞寸法を有するカスパーゼ−８の分子または分子複合体
    の結晶の結晶構造を解明する方法。
62. 【請求項６２】 カスパーゼ−８のアミノ酸配列が図１に表される請求項６
    １記載の方法。
63. 【請求項６３】 組換えプロカスパーゼ−８をイー・コリ（E.coli)で発現
    させてプロカスパーゼ−８を含む封入体を得； 該封入体とカオトロープ剤および還元剤とを接触させて還元されたプロカスパ
    ーゼ−８を含む混合物を得； 該混合物を酸性化し；ついで、 プロカスパーゼ−８からαおよびβサブユニットを含む活性化カスパーゼ−８
    への自触媒プロセシングを起こすように該混合物を濃縮することからなるカスパ
    ーゼ−８の調製方法。
64. 【請求項６４】 カオトロープ剤が塩化グアニジウムである請求項６３記載
    の方法。
65. 【請求項６５】 還元剤がジチオスライトールである請求項６３記載の方法
    。
66. 【請求項６６】 混合物を氷酢酸で酸性化する請求項６３記載の方法。