JP4153911B2 - ジペプチジルペプチダーゼivの立体構造 - Google Patents
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Description
〔1〕 X線結晶構造解析により、その3次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有してなる、ジペプチジルペプチダーゼIVの結晶、
〔2〕 ジペプチジルペプチダーゼIVが、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼIVにおける膜外に存在する領域からなる可溶性ポリペプチドである、前記〔1〕記載の結晶、
〔3〕 ジペプチジルペプチダーゼIVが、配列番号:2に示されるアミノ酸配列において、膜貫通領域が除去され、かつ所望により、C末端側又はN末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、前記〔1〕又は〔2〕記載の結晶、
〔4〕 結晶の空間群がP212121であり、単位格子の格子定数が|a|=118.0±5.0Å、|b|=125.9±5.0Å、|c|=136.8±5.0Åであり、かつα=β=γ=90°の斜方晶系である、前記〔1〕〜〔3〕いずれか1項に記載の結晶、
〔5〕 図4に示される構造座標を有してなる、前記〔1〕〜〔4〕いずれか1項に記載の結晶、
〔6〕 タンパク質のゆらぎを介して、図4に示される構造座標とは異なる構造座標を有してなる、前記〔1〕〜〔4〕いずれか1項に記載の結晶、
〔7〕 図4に示される構造座標からなる、ジペプチジルペプチダーゼIVの3次元構造座標、
〔8〕 タンパク質のゆらぎを介して、図4に示される構造座標とは異なる構造座標からなる、ジペプチジルペプチダーゼIVの3次元構造座標、
〔9〕 タンパク質のゆらぎが、分子振動又は温度により生じ、かつ生体内でジペプチジルペプチダーゼIVの活性を呈する状態である、前記〔8〕記載の3次元構造座標、
〔10〕 ジペプチジルペプチダーゼIVが、ヒトの全長型ジペプチジルペプチダーゼIVにおける膜外に存在する領域からなる可溶性ポリペプチドである、前記〔7〕〜〔9〕いずれか1項に記載の3次元構造座標、
〔11〕 ジペプチジルペプチダーゼIVが、配列番号:2に示されるアミノ酸配列において、膜貫通部位の領域が除去され、かつ所望により、C末端側又はN末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、前記〔7〕〜〔10〕いずれか1項に記載の3次元構造座標、
〔12〕 下記(a)〜(d):
(a)配列番号:2に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域;
(b)配列番号:2に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域;
(c)配列番号:2に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基群と
により特徴づけられる領域;並びに
(d)配列番号:2に示されるアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部のアミノ酸残基と
により特徴づけられる領域;
からなる群より選択された領域の3次元構造座標を含有してなる、ジペプチジルペプチダーゼIVと該ジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬との結合又は相互作用に関与するジペプチジルペプチダーゼIV中の領域の3次元構造座標、
〔13〕 物理化学的性質が、立体構造における形状の特徴、疎水性、電荷及びpKからなる群より選ばれた性質である、前記〔12〕記載の3次元構造座標、
〔14〕 前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標の全部及び/又は一部に基づき、配列番号:2に示されるアミノ酸配列からなるジペプチジルペプチダーゼIVのホモログタンパク質の電子密度図を精密化して、3次元構造座標を得ることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼIVのホモログタンパク質の3次元構造座標の取得方法、
〔15〕 前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標の全部及び/又は一部を用いて、3次元構造座標を得ることを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼIVと該ジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬との複合体の結晶の3次元構造座標の取得方法、
〔16〕 前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標の全部及び/又は一部と、ジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬の立体配置とに基づき、ファーマコフォーを同定することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬のファーマコフォーを同定する方法、
〔17〕 前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標の全部及び/又は一部に基づき、ジペプチジルペプチダーゼIVに作用しうる化合物を設計、同定、評価又は検索することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法、
〔18〕 (i)前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標の全部及び/又は一部とジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬の立体配置とに基づき、作用薬との結合又は相互作用の標的となるジペプチジルペプチダーゼIV中の領域を同定するステップ、
(ii)前記領域において、候補化合物中の存在原子又は原子団との間で、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用及び疎水性相互作用からなる群より選ばれた少なくとも1種の分子間相互作用を生じうる原子又は原子団を同定するステップ、並びに
(iii)前記ステップ(i)及び/又は(ii) の情報に基づき、化合物を設計するステップ、
を含む、前記〔17〕記載のジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬の設計、同定、評価又は検索方法、
〔19〕 ジペプチジルペプチダーゼIVと、設計、同定、評価又は検索された候補化合物との間の相互作用を検出し、相互作用が検出された場合に、該相互作用の程度を指標として、該候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼIVに結合しうる化合物であることを同定するステップ
をさらに含む、前記〔18〕記載の方法、
〔20〕 ジペプチジルペプチダーゼIVと、設計、同定、評価又は検索された候補化合物とを接触させ、ついで、ジペプチジルペプチダーゼIVの活性を測定し、該活性が増加又は減少している場合、該増加又は減少の程度を指標として、該設計、同定、評価又は検索された候補化合物が、ジペプチジルペプチダーゼIVの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物であることを同定するステップ
をさらに含む、前記〔18〕又は〔19〕記載の方法、
〔21〕 前記〔17〕〜〔20〕いずれか1項に記載の方法によって得られる、ジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬、
〔22〕 前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標の全部及び/又は一部が記録されてなる、前記〔7〕〜〔13〕いずれか1項に記載の3次元構造座標を使用するためのプログラム及びその媒体、
〔23〕 ジペプチジルペプチダーゼIVに結合しうる化合物又はジペプチジルペプチダーゼIVの活性に対する亢進作用又は阻害作用を有する化合物を同定、検索、評価又は設計するための手段を備えてなる、前記〔22〕記載のプログラム及びその媒体、並びに
〔24〕 分子の3次元グラフィック表示を表示する手段をさらに備えてなる、前記〔23〕記載のプログラム及びその媒体、
に関する。
(1)結晶の単位胞中の分子が、高い規則性で繰返した状態であること、すなわち、高分解能の回折を与えること、
(2)形及び大きさが適当であること;例えば、少なくとも1辺が約0.2〜約0.5mmに成長した結晶であって、好ましくは3辺とも同様に成長した角型の結晶又は幅、厚みが約0.2mm以上の針状結晶等が望ましい、
(3)化学的安定性、力学的安定性、物理学的安定性を有すること、
等をいう。かかる用語は、比較的分子量の大きなポリペプチドであるジペプチジルペプチダーゼIVの場合、3Å以下、好ましくは2.8Å以下、より好ましくは2.6Å以下の分解能を得るに十分な性状を意味する。
1.タンパク質の実効濃度を上昇させること:
すなわち、タンパク質溶液に、塩、ポリエチレングリコール、有機溶媒等の沈殿剤を添加すること;タンパク質溶液中における溶媒量を蒸発等により減少させること等
2.タンパク質分子の間の反発力を減少させるか、あるいは引力を増大させること
すなわち、タンパク質溶液にアルコール等の有機溶媒を添加すること;タンパク質溶液の水素イオン濃度(pH)又は温度を変化させること等
の操作によって行なわれうる。
により行なわれうる。ここで、前記混合物は、密閉容器内で放置される。
全長型ジペプチジルペプチダーゼIVをコードする核酸(DNA又はRNA)としては、例えば、配列番号:1の核酸配列のヒトの核酸を含有した核酸が挙げられるが、これに限定されず、自然発生的な変異体、人為的に改変された変異体、異種生物に由来するホモログ及びオルソログ等が挙げられる。
なお、本明細書においては、前記分子間相互作用を介して相互作用する作用薬の原子又は原子団及びジペプチジルペプチダーゼIVの側鎖の原子又は原子団を「ファーマコフォー」という。
(a)配列番号:2のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域,、
(b)配列番号:2のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該Ser630、Asp708及びHis740のそれぞれの近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域、
(c)配列番号:2のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域、並びに
(d)配列番号:2のアミノ酸配列におけるSer630、Asp708及びHis740のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群と、
図4に示される構造座標又は該構造座標により規定される3次元構造モデルにおいて、該アミノ酸残基群の近傍に位置するアミノ酸残基群のアミノ酸のそれぞれに生理的に同等な物理化学的性質を維持しうるアミノ酸から構成されたアミノ酸残基群の全部又はその一部と
により特徴づけられる領域、
からなる群より選択された領域の3次元構造座標を含む、ジペプチジルペプチダーゼIVとその作用薬との結合又は相互作用に関与するジペプチジルペプチダーゼIV中の領域の3次元構造座標も含まれる。
I グリシン、アラニン;
II バリン、イソロイシン、ロイシン;
III アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;
IV セリン、スレオニン;
V リジン、アルギニン;
VI フェニルアラニン、チロシン;
のいずれかのグループにおいて、同じグループに属する他のアミノ酸の残基に置換されてもよい。
等により、ジペプチジルペプチダーゼIVと該ジペプチジルペプチダーゼIVの作用薬との結合又は相互作用に関与する標的となる領域・部位が同定されうる。
(i) 本発明の3次元構造座標の全部及び/又は一部とジペプチジルペプチダーゼIVに対する作用薬の立体配置とに基づき、該作用薬との結合又は相互作用の標的となるジペプチジルペプチダーゼIV中の領域を同定するステップ、
(ii) 前記領域において、候補化合物中の存在原子又は原子団との間で、共有結合、イオン性相互作用、イオン−双極子間相互作用、双極子−双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、静電気相互作用及び疎水性相互作用からなる群より選ばれた少なくとも1種の分子間相互作用を生じうる対応の原子又は原子団を同定するステップ、並びに
(iii) 前記ステップ(i)及び/又は(ii) の情報に基づき、化合物を設計するステップ、
を含む方法が挙げられる。
1 化合物中のカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基等の陰性電荷を帯びやすい基が、ジペプチジルペプチダーゼIV中のリジン、アルギニン、ヒスチジン等の正電荷を有するアミノ酸残基に相互作用すること;
2 化合物中のアミノ基、イミノ基、グアニジル基等の正電荷を帯びやすい基が、ジペプチジルペプチダーゼIV中のグルタミン酸、アスパラギン酸といった負電荷を持つアミノ酸残基に相互作用すること;
3 化合物中の脂肪族基、芳香族基等の疎水性の官能基が、ジペプチジルペプチダーゼIV中のアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン等の疎水性のアミノ酸残基と相互作用すること;
4 水酸基、アミド基等の水素結合に関与する基が、主鎖や側鎖部分と水素結合ができるようにすること;
5 化合物中のカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基等の負電荷を帯びやすい基又は原子が、主鎖や側鎖部分の正電荷を帯びた原子に相互作用すること;
6 化合物中のアミノ基、イミノ基、グアニジル基等の正電荷を帯びやすい基又は原子が、主鎖や側鎖部分の負電荷を帯びた原子に相互作用すること;
7 直鎖状部分を環状化する等により、化合物の3次元構造の自由度を低下させること
等を考慮すればよい。例えば、前記誘導体は、ジペプチジルペプチダーゼIVのアミノ酸残基において、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖の近傍に、候補化合物の負電荷を持つ原子が配置され、ジペプチジルペプチダーゼIVのアミノ酸残基においてグルタミン酸、アスパラギン酸等の負電荷を有するアミノ酸残基の側鎖の近傍に、候補化合物の正電荷を有する原子が配置されるように設計し、合成すればよい。また、化合物とジペプチジルペプチダーゼIVとの間に疎水性相互作用を形成しうる部分には、疎水性相互作用形成に好適な基を導入して誘導体を設計し、合成すればよい。また、化合物とジペプチジルペプチダーゼIVとの間に水素結合を形成しうる部分には、水素結合形成に好適な基を導入して誘導体を設計し、合成すればよい。前記設計において、ファンデルワールス相互作用ができるだけ大きく、かつ各原子間で立体的な障害が生じないことが望ましい。さらには、化合物の変化により新たな空隙部分ができないようにし、既に空隙部分が存在する領域においては、その空隙部分をできるだけ充填するようにすることが望ましい。
(1)可溶性ヒトジペプチジルペプチダーゼIV(shDPPIV) cDNAのクローニング
細胞株Caco−2〔アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection;ATCC)供給〕を、20重量% 不活化ウシ胎仔血清(インビトロジェン社製;56℃、30分のインキュベーションで不活化させたもの)と1重量% 非必須アミノ酸(インビトロジェン社製)とを含むダルベッコ改変イーグル培地(インビトロジェン社製)を用いて、5体積% CO2存在下37℃で培養した。
プラスミドpUshDPPIVを、制限酵素により消化して、shDPPIV遺伝子をコードするDNA断片を得、得られた断片を、pAcGP67B(BD ファーミンジェン社製)上に挿入して、バキュロウイルストランスファーベクターpAcGP67B−shDPPIVを構築した。
(1)昆虫細胞におけるshDPPIVの発現
Sf21細胞は、無血清培地EX−CELL 400(JRH バイオサイエンシーズ社製) とTフラスコとを用い、Tn5細胞(インビトロジェン社供給)は、無血清培地EX−CELL 401(JRH バイオサイエンシーズ社製)とTフラスコとを用いて、それぞれ28℃で培養した。細胞の増殖が、70% コンフルエントに達した時点で、古い培地を除去し、それぞれ、225cm2フラスコ1個当たり40mlの新鮮な培地を添加した。ついで、3回増幅後のウイルスストック溶液1.5ml〔Multiplicity of infection(MOI)が約2である〕を細胞に添加することにより感染させ、28℃で4日間インキュベーションした。感染4日後の培養上清を回収し、−20℃で保存した。かかる培養上清を、以下のshDPPIVタンパク質の精製に用いた。
shDPPIVの精製における各ステップにおいて、DPPIVの活性は、1.5mMの基質〔ペプチド研究所製、Gly−Pro−パラニトロアニリド(pNA)〕、71mM Gly−NaOH(pH8.7)と、DPPIVとを含む反応混合液 0.1mlをインキュベートし、遊離したpNAを検出することにより測定した。なお、反応混合液は、37℃で10分間インキュベートした。インキュベーションの間、405nmの吸光度をモニターした。
前記(2)で得られたshDPPIV精製標品(9ml)を、ミリポア社製、商品名:セントリコン10により、タンパク質濃度が10mg/mlとなるまで濃縮した。
shDPPIVの結晶化は、蒸気拡散法の1つであるシッティングドロップ法により行なった。
(1)X線回折
前記実施例2で得られた結晶を、クライオプロテクティング緩衝液〔組成:0.18M グリシン−NaOH(pH9.5)、19重量% PEG4000、0.18M 酢酸ナトリウム、15% グリセロール〕に浸した後、直ちに窒素気流(100K)下に入れ、急速冷凍した。
電子密度図を導き出すために、重原子同型置換法を行なった。すなわち、塩化水銀を飽和になるまで溶かした結晶化溶液に、前記実施例2で得られた結晶を3日間及び4日間浸漬することにより、結晶中に水銀原子を含む異なる2種類の同型置換体結晶を得た。X線回折強度データの収集は、前記自然型結晶と同様にして行なった。
QUANTA(アクセルリス社製)を用いて、電子密度図上にジペプチジルペプチターゼIVのアミノ酸残基に相当する部位を同定し、分子モデルの構築を行なった。
Claims (4)
- X線結晶構造解析により、その3次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有してなる、ジペプチジルペプチダーゼIVの結晶であって、該ジペプチジルペプチダーゼIVが、配列番号:2のアミノ酸配列において、膜貫通領域が除去されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、結晶の空間群がP 2 1 2 1 2 1 であり、単位格子の格子定数が|a|=118.0±5.0Å、|b|=125.9±5.0Å、|c|=136.8±5.0Åであり、かつα=β=γ=90°の斜方晶系である、結晶。
- X線結晶構造解析により、その3次元構造を側鎖のレベルまで解析しうる分解能を得るに十分な性状を有してなる、ジペプチジルペプチダーゼIVの結晶であって、該ジペプチジルペプチダーゼIVが、配列番号:2のアミノ酸配列において、膜貫通領域が除去され、かつ、C末端側又はN末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、結晶の空間群がP 2 1 2 1 2 1 であり、単位格子の格子定数が|a|=118.0±5.0Å、|b|=125.9±5.0Å、|c|=136.8±5.0Åであり、かつα=β=γ=90°の斜方晶系である、結晶。
- 該ジペプチジルペプチダーゼIVが、配列番号:2のアミノ酸配列において、膜貫通領域が除去され、かつ、C末端側にタグペプチドが付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項2記載の結晶。
- 図4に示される構造座標を有してなる、請求項1〜3いずれか1項に記載の結晶。
Applications Claiming Priority (2)
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