JP2004173695A

JP2004173695A - Ｄｐｐ−ｉｖの結晶構造およびその使用方法

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Publication number: JP2004173695A
Application number: JP2003393339A
Authority: JP
Inventors: Michael Hennig; ヘニッグミッシェル; Brend Michael Loeffler; ミッシェルレフラーベルント; Ralph Thoma; トーマラルフ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2004-06-24
Also published as: US20070015269A1; US20070100561A1

Abstract

【課題】DPP-IVの細胞外ドメインの結晶およびその結晶構造情報の獲得によりDPP-IV活性阻害因子の同定および/または設計における問題の解決策を提供すること、そしてこのような結晶を調製する方法、ならびに構造に基づく薬物設計によりこれらの結晶を使用してDPP-IV阻害因子を同定および/または設計する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明は、ジペプチジルペプチダーゼDPP-IVの結晶から得た結晶構造情報、このような結晶を調製する方法、ならびにDPP-IV活性の阻害因子を同定および/または設計するためのそれらの使用に関する。本発明のさらなる対象は、DPP-IV活性の阻害因子化合物を同定および/または設計するための方法、これらの方法によって同定されたDPP-IV活性の阻害因子化合物、ならびにI型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌を含む疾患を治療および/または予防するための薬学的組成物におけるそれらの使用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼDPP-IVの結晶から得た結晶構造情報、このような結晶を調製する方法、ならびにDPP-IV活性の阻害因子を同定および/または設計するためのそれらの使用に関する。本発明のさらなる対象は、DPP-IV活性の阻害因子化合物を同定および/または設計するための方法、これらの方法によって同定されたDPP-IV活性の阻害因子化合物、ならびにI型糖尿病、II型糖尿病、IGT、および肥満症を含む疾患を治療および/または予防するための薬学的組成物におけるそれらの使用である。

ジペプチジルペプチド（DPP-IV；T細胞活性化抗原CD26またはアデノシン結合タンパク質）は、多機能性II型細胞表面糖タンパク質である。このタンパク質は、種々の細胞型、特に腸、肝臓、前立腺組織、黄体、および腎臓尿細管の異なる上皮細胞（非特許文献１；非特許文献２）上に、同様にTヘルパーリンパ球などの白血球サブセット（非特許文献３）およびマクロファージ（非特許文献４）上に広範に発現し、可溶性形態が血漿および尿に存在すると報告されている（非特許文献５）。ヒトDPP-IVは、6個のアミノ酸の短い細胞質テール、22個のアミノ酸疎水性膜貫通領域、および10個の潜在的なグリコシル化部位を有する738個のアミノ酸細胞外ドメインを有する（非特許文献６）。

DPP-IVは、細胞外酵素アデノシンデアミナーゼ（ADA）の局在化のための膜固定機能（非特許文献７）、コラーゲンおよびフィブロネクチンへの結合による細胞基質接着への関与（非特許文献８）、HIVエンベロープタンパク質gp120のコレセプターとしての作用（非特許文献９）、ならびにT細胞活性化および増殖時の共刺激機能（非特許文献１０）（タンパク質チロシンホスファターゼ（CD45）との相互作用（非特許文献１１）により）を含む多数の生物学的過程に関与する。

DPP-IV（EC3.4.14.5）は、好ましくはポリペプチドのN末端からXプロリンまたはXアラニンを切断するプロリン後ジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有し（非特許文献１２）、プロピルオリゴペプチダーゼファミリー（プロリル結合を加水分解することができる異型セリンプロテアーゼ群）に属する（非特許文献１３）。DPP-IVは、その触媒三残基（Ser-Asp-His）の方向が新規であり（非特許文献１４）、古典的セリンプロテアーゼで見出されるもの（His-Asp-Ser）とは逆方向である。第2の位置にProを含むN末端ペプチドの切断は、ペプチド分解の律速段階である。DPP-IVの天然の基質には、いくつかのケモカイン、サイトカイン、神経ペプチド、循環ホルモン、および生物活性ペプチドが含まれる（非特許文献１５）。広範な基質からは、ペプチドホルモン代謝およびアミノ酸輸送における重要な調節上の役割が示唆される（非特許文献１６）。その生理学的関連性は、Hinkeらによって調査された（非特許文献１７）。

DPP-IVがGLP-1の95％を上回る分解を担うという所見により、II型糖尿病治療のための酵素阻害への関心が高まった。ラットおよびヒトでの実験により、特異的DPP-IV阻害はC_max、T_1/2、および総循環GLP-1を増加させ、且つ血漿グルコースを減少させるという証拠が得られている。耐糖能障害（IGT）、II型糖尿病、およびスルホニル尿素治療に応答した続発性効力低下（secondary failure）を有する患者は、GLP1ペプチドレベルの増加により恩典を受けることが示されている。さらに、GLP-1はそのグルカゴン抑止（static）効果によりI型糖尿病において有効である。より最近の調査では、満腹に対する有益な効果を有し、且つ肥満症治療に関与し得る程の胃内容排出の遅延が示されている。したがって、DPP-IVを阻害し、GLP-1受容体を同時に活性化してGLP-1を機能的に保護することには、抗糖尿病薬研究において相乗効果の可能性がある（非特許文献１８）。DPP-IVの選択的且つ経口投与可能な小分子阻害因子が発見されており、現在臨床試験段階である（非特許文献１９；非特許文献２０）。

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本発明においては、DPP-IVの細胞外ドメインの結晶およびその結晶構造情報の獲得によりDPP-IV活性阻害因子の同定および/または設計における問題の解決策を提供すること、そしてこのような結晶を調製する方法、ならびに構造に基づく薬物設計によりこれらの結晶を使用してDPP-IV阻害因子を同定および/または設計する方法を提供することを課題とする。

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼDPP-IVの結晶性調製物から得た結晶構造情報、このような結晶を調製する方法、ならびにDPP-IV活性阻害因子を同定および/または設計するためのそれらの使用に関する。本発明のさらなる対象は、DPP-IV活性の阻害因子化合物を同定および/または設計するための方法、これらの方法によって同定されたDPP-IV活性の阻害因子化合物、ならびにI型糖尿病、II型糖尿病、肥満症、および癌を含む疾患を治療および/または予防するための薬学的組成物におけるそれらの使用である。

本発明に係る結晶においては、（１）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る結晶においては、（２）非対称単位中にP2₁2₁2₁の斜方晶系空間群および1つのDPP-IVホモ二量体を有することを特徴とする、上記(1)記載の結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る結晶においては、（３）aが63Å〜70Åであり、
bが66Å〜70Åであり、
cが416Å〜424Åである寸法の単位格子を有し、かつ
P2₁2₁2₁対称である、
上記(1)または(2)記載の結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る結晶においては、（４）表4の原子構造座標によって特徴付けられる、上記(1)〜(3)のいずれか一項記載の結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る共結晶においては、（５）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインと、その活性部位に結合したリガンドとの共結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る共結晶においては、（６）非対称単位中にP2₁2₁2₁の斜方晶系空間群および1つのDPP-IVホモ二量体を有することを特徴とする、上記(5)記載の共結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る共結晶においては、（７）aが63Å〜70Åであり、
bが66Å〜70Åであり、
cが416Å〜424Åである寸法の単位格子を有し、かつ
P2₁2₁2₁対称である、
上記(6)記載の共結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る共結晶においては、（８）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインと、アロステリック結合部位に結合したリガンドとの共結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る共結晶においては、（９）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインとHgCl₂との共結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１０）（a）濃度7mg/ml〜22mg/mlの哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの緩衝化水溶液（pH7〜8.5）を供給する段階；および
（b）PEGの平均分子量が1,000〜20,000である、10％〜30％のPEG、10％〜20％のグリセロールを含む緩衝化リザーバ溶液を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させる段階
を含む、哺乳動物DPP-IVの結晶化方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１１）段階（a）の哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをピキア・パストリス中で産生させた後脱グリコシル化する、上記(10)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１２）（a）濃度7mg/ml〜22mg/mlの哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの緩衝化水溶液（pH7〜8.5）を供給する段階；
（b）モル過剰の活性部位を哺乳動物DPP-IV水溶液に添加する段階；および
（c）PEGの平均分子量が1,000〜20,000である、10％〜30％のPEG、10％〜20％のグリセロールを含む緩衝化リザーバ溶液を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させる段階
を含む、哺乳動物DPP-IVと活性部位リガンドとの共結晶化方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１３）段階（a）の哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをピキア・パストリス中で産生させた後脱グリコシル化する、上記(12)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る結晶においては、（１４）上記(10)〜(13)記載の方法によって作製された結晶であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１５）（a）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインを結晶化する段階；および
（b）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをX線回折によって分析して、結晶化された哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造を決定し、それにより結晶化された哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造が3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能で決定される段階
を含む、3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能で、結晶化した哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造を決定する方法であることを特徴とする。

また、本発明に係るデータ記憶媒体においては、（１６）データ使用のための命令をプログラミングされた機械を使用した場合に、配列番号：2のアミノ酸を含む哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの少なくとも一部を含む分子または分子複合体の三次元画像を表示する、機械読取可能なデータでコード化されたデータ記憶材料を含む、機械読取可能なデータ記憶媒体（細胞外ドメインは、表4に列挙した構造座標によって示されるアミノ酸の骨格原子を示す点から約1.5Å未満の二乗平均平方根偏差を有する一組の点によって定義されるリガンド結合活性部位を含む）であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１７）（a）1.5Å未満のアミノ酸の骨格原子由来の二乗平均平方根偏差を有する、表4に列挙した構造座標を用いてDPP-IVの三次元モデルを作成する段階；および
（b）該三次元モデルを用いてDPP-IVと相互作用する化合物を設計または選択する段階
を含む、DPP-IVと相互作用する化合物を同定する方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１８）（c）同定された化合物を得る段階；および
（d）得られた化合物をDPP-IVに接触させて、DPP-IV活性に対する化合物の効果を決定する段階
をさらに含む、上記(17)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（１９）化合物をDPP-IVの活性部位と相互作用させる、上記(17)または(18)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（２０）化合物をDPP-IVのアロステリック結合部位と相互作用させる、上記(17)または(18)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（２１）化合物がDPP-IV活性の阻害因子である、上記(17)または(20)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（２２）コンピュータ支援の方法である、上記(17)〜(21)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る化合物においては、（２３）上記(17)〜(22)のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物であることを特徴とする。

また、本発明に係る薬学的組成物においては、（２４）上記(23)記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物であることを特徴とする。

また、本発明に係る化合物においては、（２５）特にI型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌の治療のための治療的活性物質として使用される、上記(23)記載の化合物であることを特徴とする。

また、本発明に係る単離核酸配列においては、（２６）配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDPP-IVの可溶性細胞外ドメインをコードする、単離核酸配列であることを特徴とする。

また、本発明に係る核酸構築物においては、（２７）発現ベクターおよび上記(26)記載の核酸配列を含む、核酸構築物であることを特徴とする。

また、本発明に係る宿主細胞においては、（２８）上記(27)記載の核酸構築物で形質転換された、宿主細胞であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（２９）宿主細胞によるDPP-IVの可溶性細胞外ドメインの発現を可能にする条件下で上記(28)記載の宿主細胞を培養する段階を含む、DPP-IVの可溶性細胞外ドメインの作製方法であることを特徴とする。

また、本発明に係る方法においては、（３０）宿主細胞がピキア・パストリスである、上記(29)記載の方法であることを特徴とする。

また、本発明に係るポリペプチドにおいては、（３１）配列番号：2のDPP-IVの可溶性細胞外ドメインを含む、ポリペプチドであることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（３２）I型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌の治療薬を製造するための、上記(23)記載の化合物の使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る使用においては、（３３）DPP-IV活性の阻害因子を同定および/または設計するための、上記(1)〜(9)のいずれか一項記載の結晶または共結晶の使用であることを特徴とする。

また、本発明に係る結晶、方法、化合物、組成物、および使用においては、（３４）特に添付の実施例を参照して、本明細書に実質的に記載された、新規の結晶、方法、化合物、組成物、および使用であることを特徴とする。

したがって、本発明においては、DPP-IVの細胞外ドメインの結晶およびその結晶構造情報の獲得により、DPP-IV活性阻害因子を同定および/または設計する際の問題が解決され、そしてこのような結晶を調製する方法、ならびに構造に基づく薬物設計によりこれらの結晶を使用してDPP-IV阻害因子を同定および/または設計する方法が提供された。

本発明は、活性部位中で結合したリガンドを含むまたは含まない哺乳動物DPP-IVの結晶に関し、ここで結晶は、原子分解能での三次元X線回折の決定を十分可能にするような質および大きさである。本発明はまた、哺乳動物DPP-IVの産生および結晶化の方法に関する。哺乳動物DPP-IVの結晶およびその結晶構造に由来する情報を用いて、哺乳動物DPP-IVの分析および修飾を行うことができ、かつDPP-IVと相互作用する化合物を同定することができる。

1つの局面において、本発明は、好ましくは非対称単位中にP2₁2₁2₁対称性斜方晶系空間群および1つのDPP-IVホモ二量体を有する、哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの結晶を提供する。好ましくは、結晶は、寸法a、b、およびc（aは63Å〜67Åであり、bは66Å〜70Åであり、cは416Å〜424Åであり、かつα=β=γ=90°）を有する単位格子を含む。好ましくは、結晶は、表4に列挙した原子構造座標に示す空間関係で配置された原子を含む。好ましくは、結晶は、天然タンパク質のGly31〜Pro766のアミノ酸配列を含むDPP-IV、および、活性部位の形成に必要な全アミノ酸を含むより短いその変種を含む。好ましくは、結晶は、配列番号：2に記載のDPP-IV、および、活性部位の形成に必要な全アミノ酸を含むより短いその変種を含む。

本発明の結晶は、アポ結晶および共結晶を含む。本発明のアポ結晶は、結合活性部位またはアロステリックリガンドを含まずに形成された哺乳動物DPP-IVの結晶を指す。共結晶は、一般に、活性部位またはアロステリック部位に結合したリガンドを有するDPP-IVを含む。「活性部位」とは、一般に、酵素によって触媒された酵素反応が起こる部位を指す。活性部位リガンドは、哺乳動物DPP-IVの活性部位に特異的に結合する任意の化合物を指す。

好ましくは、本発明の共結晶は、非対称単位中にP2₁2₁2₁の斜方晶系空間群（空間群番号19）および1つのDPP-IVホモ二量体を有することを特徴とする。

より好ましくは、共結晶は、aが63Å〜67Åであり、bが66Å〜70Åであり、cが416Å〜424Åである寸法の単位格子を有し、かつα=β=γ=90°およびP2₁2₁2₁対称である。

本発明の共結晶は、一般に、ポリペプチドの活性部位またはアロステリック結合部位で1つまたは複数の化合物と会合した結晶DPP-IVポリペプチドを含む。会合は、共有結合的であっても非共有結合的であってもよい。

本発明のDPP-IV（ジペプチジルペプチダーゼ（DPP-IV）；T細胞活性化抗原CD26またはアデノシン結合タンパク質）は、哺乳動物DPP-IVであり得る。好ましくは、本発明のDPP-IVは、ヒトDPP-IVである。より好ましくは、本発明のDPP-IVは、DPP-IVの細胞外ドメインである。DPP-IVの可溶性細胞外ドメインが、さらにより好ましい。より好ましくは、ヒトDPP-IVは、天然タンパク質のGly31〜Pro766のアミノ酸配列、および、活性部位の形成に必要な全アミノ酸を含むより短いその変種を含む。好ましくは、DPP-IVは、配列番号：2に記載のアミノ酸配列および活性部位の形成に必要な全アミノ酸を含むより短いその変種を含む。

本発明のDPP-IV結晶は自然状態で存在するDPP-IV（すなわち、天然DPP-IV）に制限されないことが理解されねばならない。実際、本発明の結晶は、天然DPP-IVの変異体を含む。天然DPP-IVの変異体は、天然DPP-IVドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基における異なるアミノ酸残基との置換によって、または天然ポリペプチド内のもしくは天然ポリペプチドのN末端かC末端におけるアミノ酸残基の付加もしくは欠失によって得られ、かつ、該変異体が由来する天然DPP-IVと実質的に同一の三次元構造を有する。

実質的に同一の三次元構造を有するとは、DPP-IVのα炭素原子の少なくとも50％が重ね合わせ中に含まれる場合に天然DPP-IVの原子構造座標と重ね合わせたときに、約1.5Å未満のまたはこれに等しい二乗平均平方根偏差を有する、アポ結晶または共結晶由来の一組の原子構造座標を有することを意味する。

ポリペプチドをコードするcDNA中に都合のよいクローニング部位を供給するために、天然DPP-IVドメインに対してアミノ酸残基を置換、欠失、および/または付加して、ポリペプチドなどの精製を補助することが特に有利または便利である場合がある。天然DPP-IVの三次元構造を実質的に変化させないこのような置換、欠失、および/または付加は、当業者に明らかであると考えられる。

本明細書中で意図される変異体はDPP-IV活性を示す必要がないことが理解されるべきである。実際、DPP-IVのペプチダーゼ活性を妨害するがドメインの三次元構造を顕著に変化させないようなアミノ酸の置換、付加、または欠失が、本発明で特に意図されている。このような結晶性ポリペプチドまたはここから得られた原子構造座標を用いて、天然ドメインに結合する化合物を同定することができる。これらの化合物は、活性または天然ドメインに影響を与え得る。

本発明の誘導体結晶は、一般に、1つまたは複数の重金属元素と共有結合的に会合した結晶性DPP-IVポリペプチドを含む。ポリペプチドは、天然型または変異型のDPP-IVに対応し得る。誘導結晶を供給するために有用な重金属原子には例示的に金および水銀が含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、メチオニンのセレノメチオニンへの置換などの1つまたは複数のアミノ酸に重金属元素が組み込まれているタンパク質から、誘導結晶を形成することができる。

したがって、本発明の好ましい態様において、共結晶は、哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインとHgCl₂との共結晶である。

本明細書に記載された天然型および変異型のDPP-IVポリペプチドを、天然の供給源から単離することができ、または分子生物学分野の当業者に周知の方法によって産生することができる。使用される発現ベクターは、天然型または変異型のDPP-IVポリペプチドのコード配列および適切な転写および/または翻訳調節シグナルを含み得る。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら、1989、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、NY；およびAusubelら、1989、「現代の分子生物学プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYに記載された技術を参照のこと。

種々の宿主発現ベクター系を用いて、DPP-IVコード配列を発現させることができる。これらには、DPP-IVコード配列を含む、組換えバクテリオファージDNA発現ベクター、プラスミドDNA発現ベクター、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌；DPP-IVコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；DPP-IVコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；DPP-IVコード配列を含む、組換えウイルス発現系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））に感染させたもしくは組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系などの微生物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの系の発現エレメントの強度および特異性は変化する。使用した宿主/ベクター系に依存して、バクテリオファージμのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの構成性および誘導性のプロモーターを含む任意の数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントを使用することができ；昆虫細胞系にクローニングする場合、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用することができ；植物細胞系にクローニングする場合、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、RUBISCOの小サブユニットのプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、CaMVの35S RNAプロモーター、TMVコートタンパク質プロモーター）を使用することができ；哺乳動物細胞系にクローニングする場合、哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を使用することができ；DPP-IVコード配列のコピーを複数含む細胞株を作製する場合、適切な選択マーカーとともにSV40、BPV、およびEBVに基づくベクターを使用することができる。

本発明の好ましい態様において、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDPP-IVの可溶性細胞外ドメインをコードする単離核酸配列が提供される。

さらに、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDPP-IVの可溶性細胞外ドメインをコードする単離核酸配列を含む発現ベクターが提供される。好ましくは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において分泌されるべきタンパク質の発現に対する発現ベクターが提供される。さらに、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞が得られる。好ましくは、宿主細胞は、ピキア・パストリスである。

本発明のさらなる局面は、宿主細胞によるDPP-IVの可溶性細胞外ドメインの発現を可能にする条件下で、発現ベクターとともに宿主細胞を培養する段階を含む、DPP-IVの可溶性細胞外ドメインの産生方法に関する。好ましくは、宿主細胞は、ピキア・パストリスである。本発明はまた、この方法によって産生されたDPP-IVの可溶性細胞外ドメインを提供する。

さらに本発明は、配列番号：2に記載されたDPP-IVの可溶性細胞外ドメインを含むポリペプチドに関する。

本発明のアポ結晶、誘導結晶、および共結晶を、バッチ、液体架橋、透析、蒸気拡散、および懸滴法を含む、タンパク質結晶学分野で周知の技術によって得ることができる（例えば、McPherson、1982、「タンパク質結晶の調製および分析（Preparation and Analysis of Protein Crystals）、John Wiley、NY；McPherson、1990、Eur.J.Biochem.、189：1〜23；Webber、1991、Adv.Protein Chem.、41：1〜36；「核酸およびタンパク質の結晶化（Crystallization of Nucleic Acid and Proteins）」、Arnaud DucruixおよびRichard Giege編、Oxford University Press；「タンパク質結晶化技術、ストラテジー、および様式（Protein Crystallization Techniques, Strategies, and Tips）」、Terese Bergfors編、International University Line、1999」を参照のこと）。一般に、タンパク質を沈殿させるのに必要な濃度よりもわずかに低い濃度の沈殿物を含む水性緩衝液中に、実質的に純粋なDPP-IVポリペプチドを配置することによって、本発明のアポ結晶または共結晶を成長させる。次いで、結晶化条件とするために蒸発の制御によって溶液から水を除去して、結晶成長が停止するまでこの条件を維持する。

好ましくは、
（a）濃度7mg/ml〜22mg/mlの哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの緩衝化水溶液（pH7〜8.5）を供給する段階；および
（b）PEGの平均分子量が1,000〜20,000である、10％〜30％のPEG、10％〜20％のグリセロールを含む緩衝化リザーバ溶液を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させる段階
を含む、哺乳動物DPP-IVの結晶化方法によって結晶を産生する。より好ましくは、本方法の段階（a）の哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインを、酵母ピキア・パストリス（P.pastoris）中で産生させ、その後脱グリコシル化する。脱グリコシル化のために、エンドグリコシダーゼFまたはPNGaseを含む異なる酵素を使用することができる。

好ましくは、
（a）濃度7mg/ml〜22mg/mlの哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの緩衝化水溶液（pH7〜8.5）を供給する段階；
（b）モル過剰の活性部位リガンドを哺乳動物DPP-IV水溶液に添加する段階；および
（c）PEGの平均分子量が1,000〜20,000である、10％〜30％のPEG、10％〜20％のグリセロールを含む緩衝化リザーバ溶液を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させる段階
を含む、哺乳動物DPP-IVと活性部位リガンドとの共結晶化方法によって共結晶を産生する。より好ましくは、本方法の段階（a）の哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインを、ピキア・パストリス中で産生させ、その後脱グリコシル化する。

本発明のさらなる局面は、本発明のDPP-IVの結晶化方法または共結晶化方法によって産生された結晶に関する。

データ収集前に、結晶を凍結させることができる。

冷却窒素ガス流が短期間遮断されるようなアニーリングによって凍結結晶のモザイク状の拡散を減少させることができる場合があり、これにより凍結結晶を瞬間的に解凍し、その後窒素ガス流で再凍結させることができる。

Swiss light source（SLS）、Villigen Switzerlandのシンクロトロンビームライン×06において、典型的には2.7Åの範囲に及ぶ回折データを凍結結晶から収集した。最適条件下で、2.1Åの範囲に及ぶデータを記録した。好ましくは、3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能でデータを収集する。より好ましくは、2.7Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能でデータを収集する。

X線結晶学分野の当業者に公知の手順にしたがって、重金属原子塩を含む母液中にアポ結晶または共結晶を浸漬することによって、本発明の誘導結晶を得ることができる。

本発明の共結晶を、活性部位に結合するリガンドを含む母液へのアポ結晶の浸漬によって得ることができ、または活性部位またはアロステリック部位に結合する1つまたは複数のリガンドの存在下でのDPP-IVポリペプチドの同時結晶化によって得ることができる。好ましくは、緩やかに加水分解可能でありかつ共有結合を形成する活性部位DPP-IVリガンドを含む共結晶が形成される。このような活性部位リガンドの一つの例はジプロチンAである。

本発明のさらなる態様において、
（a）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインを結晶化する段階；および
（b）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをX線回折によって分析して、結晶化された哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造を決定し、それにより結晶化された哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造が約3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能で決定される段階
を含む、3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能で、結晶化した哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造を決定する方法が提供される。

本発明はさらに、データ使用のための命令をプログラミングされた機械を使用した場合に、配列番号：2のアミノ酸を含む哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの少なくとも一部を含む分子または分子複合体の三次元画像を表示する、機械読取可能なデータでコード化されたデータ記憶材料を含む、機械読取可能なデータ記憶媒体（細胞外ドメインは、表4に列挙した構造座標によって示されるアミノ酸の骨格原子を示す点から約1.5Å未満の二乗平均平方根偏差を有する一組の点によって定義されるリガンド結合活性部位を含む）に関する。

本発明の結晶、および特にそれから得られる原子構造座標は、広範な用途を有する。例えば、本明細書に記載された結晶および構造座標は、新規治療薬の開発アプローチとしてのDPP-IVと相互作用する化合物の同定のために特に有用である。前記化合物の薬学的組成物を開発することができ、かつ前記化合物は、IGT、I型糖尿病、II型糖尿病、肥満症、および癌の治療のための前記化合物を含む薬物の製造のために有用であり得る。

したがって本発明はまた、DPP-IV活性の阻害因子の同定および/または設計のための、本発明の結晶または共結晶の使用に関する。

さらに本発明は、
（a）1.5Å未満のアミノ酸の骨格原子由来の二乗平均平方根偏差である、表4に列挙した構造座標を用いて、DPP-IVの三次元モデルを作成する段階；および
（b）該三次元モデルを用いて、DPP-IVと相互作用する化合物を設計または選択する段階
を含む、DPP-IVと相互作用する化合物を同定する方法に関する。

別の局面において本方法は、
（c）同定された化合物を得る段階；および
（d）得られた化合物をDPP-IVに接触させて、DPP-IV活性に対する化合物の効果を決定する段階
をさらに含む。

これらの方法における化合物は、DPP-IVの活性部位と相互作用する化合物、またはDPP-IVのアロステリック部位と相互作用する化合物であり得る。DPP-IVの活性部位と相互作用する化合物が好ましい。本発明の方法の段階（d）においてDPP-IV活性に対する阻害効果を示す化合物が、さらにより好ましい。

本発明のさらなる局面において、DPP-IVと相互作用する化合物の同定方法とは、コンピュータ支援の方法である。好ましくは、化合物が分子または分子複合体に結合または干渉するかどうかの判定には、化合物と、結合部位または分子もしくは分子複合体の基質結合表面との間の適合操作を実施し、その後、適合操作の結果をコンピュータで分析して化合物と結合部位との間の会合またはこれらの干渉を定量する段階が含まれる。本発明は任意で、化合物ライブラリーをスクリーニングする段階をさらに含む。本発明は任意で、化合物を供給または合成し、その後化合物をアッセイして、哺乳動物DPP-IV活性との相互作用およびこの活性の効果を判定する段階をさらに含む。

本発明はまた、DPP-IVと相互作用する化合物を同定するための本方法によって同定された化合物に関する。

本明細書に記載された構造座標を、さらなる天然型または変異型のDPP-IVの結晶構造およびこのようなDPP-IVと活性部位阻害因子または結合アクチベーターとの共結晶の構造の決定における、位相調整モデルとして使用することができる。構造座標およびここから得た三次元構造モデルも同様に、天然型または変異型のDPP-IVの溶液に基づく構造（NMRによって得られた構造など）の解明を補助するために使用することができる。したがって、本発明の結晶および原子構造座標により、DPP-IVまたは他のプロリルオリゴペプチダーゼの構造および機能の解明のための便利な手段が得られる。

明確化および考察のために、特定のDPP-IVの例示的なアポ結晶および共結晶を参照することにより、本発明の結晶を記載する。当業者は、本明細書に記載された原理が、（DPP-IVを含むが、これらに限定されるわけではない）任意の哺乳動物DPP-IVの結晶に一般的に適用可能であることを認識するであろう。

グルカゴン様ペプチド1（GLP1）レベルの上昇は、ヒトにおける血漿グルコースの減少に有利である。DPP-IVは95％を上回るGLP-1分解の原因であるという所見により、II型糖尿病治療のためのこの酵素の阻害における関心が高まった。ラットおよびヒトにおける実験により、特異的DPP-IV阻害は、C_max、T_1/2、および全身循環（total circulating）GLP-1を増加させ、且つ血漿グルコースを減少させるという証拠が得られている。耐糖能障害（IGT）、II型糖尿病、および、スルホニル尿素治療に応答した続発性効力低下（secondary failure）を有する患者は、GLP1ペプチドレベルの増加により恩典を受けることが示されている。さらに、GLP-1はグルカゴン抑止効果を有するため、I型糖尿病患者において有効である。より最近の調査では胃内容排出の遅延が示されており、これは、満腹に対して恩典的な効果を有し、且つ肥満症治療に関与し得る。したがって、DPP-IVの阻害およびGLP-1受容体の随伴性活性化による機能的GLP-1の保護は、抗糖尿病薬研究における相乗効果的潜在能力を有し得る（Holst,J.J.＆Deacon,C.F.、1998、「II型糖尿病治療薬としてのジペプチジルペプチダーゼIV活性の阻害（Inhibition of the activity of dipeptidyl-peptidase IV as a treatment for type 2 diabetes.）」、Diabetes、47、1663〜1670）。DPP-IVの選択的且つ経口的に利用可能な小分子阻害因子が発見されており、現在は臨床試験段階である。

したがって、本発明のさらなる局面において、DPP-IV活性に対する効果を有するとして本発明の方法によって同定された化合物または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が得られる。

本明細書中で使用される「薬学的に許容される」という用語は、正常な医学的判断の範囲内で、妥当な利益/リスク比と釣り合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を持たないヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適切である、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。

本明細書中で使用される「薬学的に許容される塩」とは、親化合物が酸性または塩基性のその塩の作製によって修飾される、開示された化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩、および、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ性塩または有機塩などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。薬学的に許容される塩には、従来の無毒の塩または、例えば無毒の無機酸または有機酸から形成された親化合物の第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の無毒の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸由来の塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモイン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、およびイセチオン酸などの有機酸から調製した塩が含まれる。

本発明の薬学的に許容される塩を、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、水中または有機溶媒中またはこれら2つの混合物中で遊離酸型または遊離塩基型のこれらの化合物と化学量論的な量の適切な塩基または酸との反応によって、このような塩を調製することができる。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性溶媒が好ましい。適切な塩の一覧は、「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第17版、Mack Publishing Company、Easton、PA、1985、1418頁（その開示は参照として本明細書に組み入れられる）において見出される。

「安定な化合物」および「安定な構造」とは、有用な精製度まで反応混合物から単離すること、および有効な治療薬へと製剤化することに十分耐えられるような、強固な化合物を示す。

さらに、治療的活性物質として使用するため、特にI型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌を治療するためのDPP-IV活性に対する効果を有すると本発明の方法によって同定された化合物が得られる。

本発明のさらなる局面は、I型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌の治療薬を製造するためのDPP-IV活性に対する効果を有すると本発明の方法によって同定された化合物の使用に関する。

以上まで本発明を概説してきたが、これは、例示のみを目的として本明細書に含まれかつ特記しない限り制限を意図したものではない特定の実施例を、添付の図面と併せて参照することにより、さらに詳しく理解されるであろう。

実施例で言及している市販の試薬を、特記しない限り製造者の説明書に従って使用した。

DNA操作および配列分析
DNAプローブの調製、制限エンドヌクレアーゼによる消化、DNAライゲーション、および大腸菌株の形質転換を、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.＆Maniatis,T.、1989、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYに記載のように行った。DNA配列決定のために、ABI PRISM ビッグダイターミネーターサイクルシークエンシングレディー反応キット（BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit）およびABI PRISM310遺伝子分析器を使用した。Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を用い、T3サーモサイクラー（Thermocycler）（Whatman Biometra）でPCRを行った。

ピキア・パストリスでの組換えヒトsDPP-IVの産生および精製
DPP-IVの細胞外ドメイン（残基31〜766）（sDPP-IV）を、cDNAおよびオリゴヌクレオチド

（太字はEcoRI部位）および

（太字はKpnI部位）を使用したPCRによって増幅させた。2つの新規の制限部位を用いて、増幅したDNAフラグメント（配列番号：1）をpPICZα-Aベクター（Invitrogen）にクローン化して、タンパク質分泌のためのα整合因子（α-mating factor）シグナル配列と融合させた。EcoRIの使用により、アミノ酸グルタミンおよびフェニルアラニンがsDPP-IVのN末端に付加された。配列をシークエンシングによって確認した。pPICZα-sDPP-IVをSacIで線状化し、ピキア・パストリスGS115株中にエレクトロポレーションによって形質転換し、得られたクローンの表現型を販売業者Invitrogenが推奨するようにして確認した。

表現型MutSの8個の形質転換体を、DPP-IVの発現についてスクリーニングした。コロニーを、ゼオシン（100μg/ml）を含む30℃のYPD培地（1％酵母抽出物、2％ペプトン、2％グルコース）中でOD₆₀₀が8〜10になるまで成長させた。細胞を遠心分離によって回収し、YP培地+2％メタノール中に再懸濁した。同量のメタノールを24時間ごとに添加した。48時間後、各クローンの培地を活性について試験した（以下を参照のこと）。次いで、Dale,G.E.、D'Arcy,B.、Yuvaniyama,C.、Wipf,B.、Oefner,C.＆D'Arcy,A.、2000、「ピキア・パストリス中で発現したヒト神経エンドペプチダーゼの細胞外ドメインの精製および結晶化（Purification and crystallization of the extracellular domain of human neutral endopeptidase (neprilysin) expressed in Pichia pastoris）」、Acta Crystallogr.、D56、894〜897に記載のように体積あたり最も高い活性を有する形質転換細胞株を使用した大量培養によってsDPP-IVを産生させた。

選択した形質転換ピキア・パストリス細胞株について回収したsDPP-IV上清10リットルをろ過し、30kDAろ過モジュール（AGT Technology corporation）を使用した交差流限外濾過（skannette）によって180mlまで濃縮した。濃縮物を、50mM Tris-HCl（pH7.8）および100mM NaCl（S緩衝液）で平衡化したSephacryl 200XK50/100サイズ排除カラム（5×95cm、Pharmacia）を通過させた。回収した画分を、SDS-PAGEで活性についてスクリーニングした。sDPP-IVを含む画分を、50mM Tris-HCl（pH7.9）に対して透析した。タンパク質溶液を、50mM Tris-HCl（pH7.9）で平衡化したFractogel-TMAEカラム（2.6×13cm、Merck）にロードし、2カラム体積の同緩衝液で洗浄し、直線勾配が0〜200mMの500ml NaClで溶出した。sDPP-IVを含む画分を、20mM酢酸ナトリウム（pH4.8）に対して透析した。タンパク質溶液を、同緩衝液で平衡化したFractogel-COO^-カラム（1×12cm、Merck）にロードし、2カラム体積の同緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を、直線勾配が50〜500Mの200ml NaClで溶出した。溶出プロフィールは、250mM NaClで主要なピークを示した。最後のゲル濾過カラムへのロード前に酵素的に脱グリコシル化したsDPP-IV（sDPPIV_deglycos）の調製を行った。0.1％ EndoF1-GSTをプールしたDPP-IVの画分に添加し、21℃で20時間インキュベートした。濃縮タンパク質溶液を、S緩衝液で平衡化したBiosecサイズ排除カラム（1.6×60cm、Merck）にロードした。画分は、SDS-PAGEによって分析し、95％超の純度が示された。N末端シークエンシングでは、α整合因子を切断するSTE13シグナルペプチドによってタンパク質が有効にプロセシングされていることが示された。2倍量を超えるADA（Sigma Type IV、ウシ腸粘膜由来）を添加し、Biosecサイズ排除カラムを使用して精製することにより、sDPPIV_deglycos：ADA複合体の調製を行った。

ヒトジペプチジルペプチダーゼIVの可溶性細胞外ドメイン（sDPP-IV；残基31〜766）を、酵母ピキア・パストリス中で発現させた。総活性から評価したところ、1mg/lの低レベルでタンパク質が分泌した。第1の精製段階として、濃縮タンパク質は、サイズ排除カラムを通過させ、酵母-ペプトン培地由来の夾雑ペプチドの主な画分を除去した。陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィーならびに第2のサイズ排除クロマトグラフィーによる連続クロマトグラフィーを用いて得たタンパク質は、SDS-PAGEで判断したところ純度95％であった。純粋なタンパク質の収率は、0.3mg/l成長培地であった。DPP-IV阻害因子の速度パラメータおよび阻害定数はヒト血清から精製した酵素について報告されているが、精製タンパク質は本質的にそれと同一のDPP-IV阻害因子の速度パラメータおよび阻害定数を示す（表1および表2）。

分析方法
sDPP-IVの精製後に、10〜20％トリシンSDSポリアクリルアミドグラジエントゲル（Lammli、U.K.、1970、「バクテリオファージT4の頭部構築時の構造タンパク質の切断（Cleavage of structual proteins during assembly of the head of bacteriophage T4）」、Nature、227、680〜685）での電気泳動を行った。タンパク質濃度を、Bradford（Bradford,M.M.、1976「タンパク質-色素の結合原理を使用したμg単位のタンパク質の迅速且つ感度の高い定量方法（A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding）」、Anal.Biochem.、72、248〜254）にしたがうか、またはの280nmにおいて計算された分子吸光係数193'920M^-1cm^-1（A₂₈₀ ^0.1％=2.27cm²/mg；Pace,C.N.、Vajdos,F.、Fee,L.、Grimsley,G.＆Gray,T.、1995、「タンパク質の分子吸光係数の測定および予想の仕方（How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein）」、Protein Sci.、4、2411〜2423）を使用した吸光光度法によって純粋なタンパク質の濃度を決定した。S緩衝液で平衡化したSuperdex 200 12HR10/30カラム（Pharmacia）でゲル濾過クロマトグラフィー分析を行った。溶出液を、溶出ピークの分子量および分散度を決定するminiDAWN多角レーザー光散乱検出器（Wyatt）および屈折率検出器（Shodex）を用いてモニターした（Wyatt,P.J.、1993、「高分子の光散乱および絶対的特徴づけ（Light scattering and the absolute characterisation of macromolecules）」、Analytica.Chimica Acta、272、1〜40）。sDPP-IV_deglycosについては20℃で9000rpm、sDPP-IV_deglycos：ADA複合体については7000rpmで、ベックマン（Beckman）分析用遠心分離器（Optima XL Aモデル）において沈降平衡を行った。タンパク質の初期濃度は、S緩衝液中で0.22〜0.25mg/mlであった。吸収を、280nmで追跡した。sDPP-IVの推定部分比体積（0.729cm³/g）およびADA（0.735cm³/g）を用いて、分子量を決定した。

変性条件下（0.3％ SDSを含む50mM Tris（pH8.0））でEllman（Ellman,G.L.、1959、「組織スルフヒドリル基（Tissue sulfhydryl groups）、Arch.Biochem.Biophys.、82、70〜77」）に記載の手順に従って、遊離スルフヒドリル基を決定した。

熱安定性測定
種々の温度でのインキュベーション後におこる不可逆的な活性の喪失を、sDPP-IVの熱安定性の操作基準として使用した。不可逆的な熱不活化の動態を、100mM NaClを含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）中、最終濃度20μg/mlのタンパク質で、SternerらのSterner,R.、Kleemann,G.R.、Szadkowski,H.、Lustig,A.、Hennig,M.＆Kirschner,K.、1996、「サーモトーガ・マリティマ由来のホスホリボシルアントラニレート異性体は非常に安定且つ活性なホモ二量体である（Phosphoribosyl anthranilate isomerase from Thermotoga maritima is an extremely stable and active homodimer）」、Protein Sci.、5、2000〜2008に記載のように行った。残存活性を、25℃での酵素触媒反応の初速度の記録によって決定し（以下を参照のこと）、得られた平均値をインキュベーション温度に対してプロットした。

ビアコア（Biacore）
DPP-IVを、標準的なアミド結合化学を使用したCM5表面プラズモン共鳴センサー（Biocore）にて固定した。このセンサー型上の有機アドレイヤーは、カルボキシメチル化デキストラン（分子量：約100kDA）からなる。カルボジイミド/N-ヒドロキシスクシニミド溶液を用いたカルボン酸基の活性化後、表面を、約100μg/mlのタンパク質を含む酢酸緩衝液（10mM、pH4.5）を含むDPP-IV溶液（80μl）と接触させた。固定量は、約10000RUのセンサー応答に対応していた。2つのフローセル表面を、タンパク質で修飾した。ベースラインドリフト（おそらく緩徐な二量体の解離によっておこる）を抑制するために、一方のセルのタンパク質は、カルボジイミド/N-ヒドロキシスクシニミド溶液との短時間の接触によって架橋させた。架橋タンパク質を使用して決定される結合定数が非架橋タンパク質を用いて決定される結合定数と類似していたため、この処理はタンパク質活性に影響を与えなかった。Hepes緩衝液（0.01M Hepes（pH7.4）、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ポリソルベート20（v/v））を、ランニング緩衝液として使用した。ジプロチンAを、この緩衝液に直接溶解した。NVP-DPP728を、最初にDMSO中に溶解し、その後ランニング緩衝液で希釈した。最終阻害因子溶液は、0.1％未満のDMSOを含んでいた。固定タンパク質表面を流速10μl/分または30μl/分で種々の濃度の阻害因子溶液と接触させて結合実験を行った。阻害因子との各接触後、タンパク質表面は、ランニング緩衝液により排他的に洗浄して再生させた。

活性アッセイ
活性アッセイ法は、基質Ala-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンと比較した産物の蛍光の増加に基づく（Calbiochem、Smith,R.E.、Reynolds,C.J.＆Elder,E.A.、1992、「ジペプチジルペプチダーゼIVを特に参照したプロテアーゼ基質の進化（The evolution of proteinase substrates with special reference to dipeptidylpeptidase IV）」、Histochem.J.、24、637〜647）。20mMのストック溶液を含む10％DMFを、使用するまで-20℃で保存する。精製後、最終基質濃度50μMで使用し、速度パラメータの決定のために、これをアッセイにおいては1.5μMから500μMの間で変化させた。DPP-IV活性アッセイを、96ウェルプレート中、全アッセイ体積100μlにて行った。アッセイ緩衝液は、0.1mg/ml BSAを含むS緩衝液からなる。発光分光計LS50B（Perkin Elmer）にて励起波長400nmおよび発光波長505nmで蛍光を検出する。初速度定数を、最良適合線形回帰によって計算する。

結晶化および構造決定
結晶化試験のために、sDPP-IV_deglycosを、約10mg/mlに濃縮した。蒸気拡散方法を用いて、階乗減少スクリーニングを行った。20〜25％PEG 3350、200mM MgCl₂、Tris（pH8.5）、および15％グリセロールを用いて結晶を得た。結晶を液体窒素中で瞬間冷凍し、非対称単位あたり約65Å、68Å、および420Åの細胞寸法の斜方晶系空間群P2₁2₁2₁および1つの二量体を示す。これらは、シンクロトロン照射を用いて最高分解能2.3Åに回折し、幾分高いモザイク性を示す（0.5〜1.2°）。結晶化前の1mMジプロチンAの添加により、複合体を結晶にする。0.1mM HgCl₂を使用した結晶化により水銀誘導体を産生した。

シンクロトロン照射（Swiss light source、SLS Villigen、SwitzerlandおよびID14、ESRF Grenoble、France）および組織内の施設（重原子誘導体の調査、結晶の質の評価）を用いてデータを収集し、DENZOを用いて処理した（Otwinowski,Z.、1993、「振幅データ減少プログラム（Oscillation data reduction program）」、Proceedings of the CCP4 Study Weekend；Data Collection and Processing（Wawyey,L.、Isaacs,N.＆Bailey,S.編）、56〜62頁、SERC Daresbury Laboratory、UK）。データ収集統計の詳細を表3に示す。使用した全プログラムは、表示したもの以外、CCP4スイートの一部である（CCP4、Collaborative Computational Project Number4、1994、「CCP4スイート：タンパク質結晶学用プログラム（The CCP4 suite：programs for protein crystallography）」、Acta Crystallogr.D.、760〜763）。水銀誘導体の多波長異常分散（MAD）によって構造を決定した。サブユニットあたりの1つの主要な水銀結合部位（Cys551、活性部位付近に位置する2つの遊離SH基、Cys301およびCys551のうちの1つ）を、ピーク波長データから計算した差分Pattersonマップの調査によって同定し、その後SHARPを用いて精密化した（De la Fortelle,E.＆Bricogne,G.、1997、「多数の同一構造の置換および多波長異常分散のための最大の重元素パラメータ精密化の可能性（Maximum likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphus replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods）」、Methods Enzymol.、276、472〜494）。二折りたたみ非結晶軸の位置付けを、この水銀部位およびプログラムfind2foldsを用いて行った（Dunten,P.＆Hennig,M.、2002、「非結晶学的対称エレメントの位置付け：プログラムFind2Folds（Locating non-crystallographic symmetry elements：The program Find2Folds）」、Acta Crystallogr.、A58、C76）。さらなる分析により、より低い精度でサブユニットあたり別の部位（Cys301）および約2.4Åの距離で2つの位置が分岐している部位が明らかとなった。実質的に、DMで実施した溶媒領域平滑化法およびヒストグラム適合法を組み合わせた二要素平均化の適用によって位相が改良された。2.6Å分解能での初期電子密度を容易に解釈可能であり、約90％のポリペプチド鎖を構築することができる。分子モデルを、2.3Åデータに対して精密化した。その後の手動再構築およびREFMACの精密化サイクルにより、残基Ser39〜Pro766のポリペプチド鎖の完全な高分子構造が得られた（Murshudov,G.N.、Vagin,A.A.、Lebedev,A.、Wilson,K.S.＆Dodson,E.J.、1999、「FFTを使用した高分子の有効な異方性精密化（Efficient anisotropic refinement of macromolecular structures using FFT）」、Acta Crystallogr.、D 55、247〜255）で。精密化構造の詳細を表3に示す。座標は、タンパク質データバンク（Protein Data Bank、PDB）に寄託した。

全構造
ヒトDPP-IVの構造を、水銀誘導体を使用した多波長異常分散（MAD）によって解明し（表3を参照のこと）、その後2.1Å分解能でR因子を21.5％に精密化した。現在のモデルは、発現したタンパク質外部ドメインのアミノ酸配列Ser39からPro766までの全残基からなる。

DPP-IVホモ二量体は、非対称単位中に存在する（図3）。種々の条件下での溶液中でも二量体形成が認められ、活性に必要である。各サブユニットは、2つのドメイン（触媒三残基（Ser630、Asp708、His740）を含むα/β加水分解酵素が折りたたまれた触媒ドメイン、および8個のブレード状βプロペラ折りたたみ（βプロペラドメイン）を含むドメイン）から作製されている（図3）。二次構造の割り当てを、図1、図2、および図3に示す。この酵素クラスの唯一公知の他の結晶構造は、Fulopによって決定されたプロリルオリゴペプチド（POP）である（Fulop,V.、Bocskei,Z.＆Polgar,L.、1998、「プロリルオリゴペプチダーゼ：異常なβプロペラドメインはタンパク質分解を制御する（Prolyl oligopeptidase：an unusual beta-propeller domain regulates proteolysis）」、Cell、94、161〜170；pdbエントリー1qfm）。POPはまた、α/β加水分解酵素およびβプロペラドメインを有するが単量体であり、βプロペラは7個の反復のみからなる（図6）。

触媒ドメイン
残基Gln508からPro766までの触媒ドメインを構築し、これはα/β加水分解酵素折りたたみとして公知の12個のヘリックスに隣接した中心の8本鎖の平行βシートを含む。POPとの21％の配列同一性は、有意な構造相同性（図1および図2）、およびその第1のターン上の触媒Ser630を保有する中心αヘリックスの重ね合わせ（superposition）を示し、POPの対応構造により、238残基について2.5Åの二乗平方根偏差が得られる。触媒ドメインは、POP中の対応する76残基領域よりも有意に短いN末端の15残基リンカーによってβプロペラに接続されている。しかし、DPP-IVを欠く残基は、二量体の第2のサブユニットの触媒ドメインのC末端部分によって構造的および機能的に置換される。

βプロペラドメイン
βプロペラドメインを、Lys56からAsn497までの残基によって形成する。その後のN末端残基Ser39〜Leu55は、表面と触媒ドメインの第1の残基とに極めて接近して小αヘリックス（α1^*、図1および図2）を有するループ構造を形成する。βプロペラドメインは、4本鎖の逆平行βシートモチーフの8個の折りたたみ反復からなる（ブレード、図4、図5、および図6）。ブレードは、直径約13Åの溶媒充填トンネルを形成するように環状に整列している。

DPP-IV中のβプロペラドメインは、共有のβシートモチーフ（分子「ベルクロ」と記載）を形成しない（Fulop,V.＆Jones,D.T.、1999、「βプロペラ：構造的硬直性および機能多様性（Beta propellers：structural rigidity and functional diversity）」、Curr.Opin.Struct.Biol.、9、715〜721；Paoli,M.、2001、「多様性によってプロペラ化されたタンパク質折りたたみ（Protein folds propelled by diversity）」、Prog.Biophys.Mol.Biol.、76、103〜130）が、ブレードは規則正しく整列しており（β1/1〜β7/4またはβ8/4）（図4）、閉じていない環系を形成している。

DPP-IVは、さらなる二次構造エレメントによる規則正しいβプロペラ折りたたみから逸脱している。逆平行βシートは、鎖1と2との間のブレード2中に挿入されている。ターンの先端は、ブレード4の第1の鎖と第2の鎖との間に挿入されたαヘリックス（残基Trp154〜Thr199）のC末端ターンに存在するGlu205との塩橋を形成する残基Arg125を保有する。Arg125、Glu205、および隣接するGlu204は、基質結合部位の大部分を形成し、主に基質特異性を担う。残基Asp230〜Asn263によって形成された逆平行βシートモチーフは、ブレード4の鎖3と鎖4との間に挿入されている（図5）。この構造エレメントは、二量体境界面の大部分を形成する（以下を参照のこと）。

プロペラのN末端βシートがより短い鎖を有し、且ついくらか傾いているのに対して、第1および第2のβシートに連結したループはより長く、高温因子を示し、且つプロペラ構造の硬直性を減少させることができる。この位置での環状ドメインの安定性の減少を、Ile63、Leu69、Ile76、Phe89、Leu90、Phe95、Phe98、Ile107、Ile114、Tyr135、Leu137、およびLeu142からなる疎水性クラスターの伸長およびArg61とAsp104との間の塩橋、およびArg61とTyr105との間での主鎖NHの水素結合によって補正することができる。この歪みにより、ブレード1とブレード2との間の位置でプロペラの高さが減少する（図5）。

DPP-IV分子の2つのドメインの間はα/β加水分解酵素ドメイン由来の残基によって充填されないため、触媒部位に接近できるような直径約15Åの裂け目が形成される（図7）。したがって本発明者らは、DPP-IVが、基質および生成物に対し、活性部位、ドメイン間の裂け目、およびβプロペラを貫くトンネルに接近する、および離れるための2つの独立した方法を有することを提案する。開いた裂け目により、ペプチドおよび部分的に折りたたまれたタンパク質が活性部位に接近することが可能である。より狭いトンネルは、切断したジペプチドのための出口であり得る（図7）。POPの結晶構造は、2ドメイン間の裂け目は存在せず、βプロペラを貫くトンネルは、DPP-IVの約13Åと比較して約4Åであり、より狭いことが示される（図4および図6）。この構造の相違は、DPP-IVがPOPと比較してさらにより巨大な基質を保有できるという所見によって支持される。約80残基長までのペプチドがDPP-IVの良好な基質であるようである。より大きなタンパク質を、その三次構造に依存して切断することもできる。POPは、最大サイズで約30残基の基質しか加水分解しないことが報告されている（Polgar,L.、1992、「プロピルオリゴペプチダーゼの異常な二次特異性および荷電基質へのその2つの形態の異なる反応性（Unusual secondary specificity of prolyl oligopeptidase and the different reactivities of its two forms toward charged substrates）」、Biochemistry、31、7729〜7735）。POP中のβプロペラトンネルの直径が有意に小さいため、DPP-IVの構造からは、より開かれた活性な酵素が示されると考えられる。

βプロペラモチーフは、7個のさらなるタンパク質に見出されているが、配列相同性はまったく示されないか低い配列相同性しか示されない可能性がある（Polgar,L.、1992、「プロピルオリゴペプチダーゼの異常な二次特異性および荷電基質へのその2つの形態の異なる反応性（Unusual secondary specificity of prolyl oligopeptidase and the different reactivities of its two forms toward charged substrates）」、Biochemistry、31、7729〜7735）。相同構造についてのPDBの調査により、クラスリン（7ブレード、ter Haar,E.、Musacchio,A.、Harrison,S.C.＆Kirchhausen,T.、1998、「クラスリンの原子構造：βプロペラ末端ドメインはαジグザグリンカーに連結している（Atomic structure of clasthrin：a beta propeller terminal domain joins an alpha zigzag linker）」、Cell 95、563〜573）、メチルアミンデヒドロゲナーゼ（7ブレード、Chen,L.、Doi,M.、Durley,R.C.、Christoserdov,A.Y.、Lidstrom,M.E.、Davidson,V.L.＆Mathews,F.S.、1998、「1.75Å分解能でのパラコッカス・デニトリフィカンス由来のメチルアミンデヒドロゲナーゼの精密化結晶構造（Refined crystal structure of methylamine dehydrogenase from Paracoccus denitrificans at 1.75Å resolution）」、J.Mol.Biol.、276、131〜149）、および亜硝酸レダクターゼ（8ブレード、Nurizzo,D.、Cutruzzola,F.、Arese,M.、Bourgeois,D.、Brunori,M.、Cambillau,C.＆Tegoni,M.、1998、「緑膿菌由来の亜硝酸レダクターゼの還元およびNO結合時に起こる立体配座の変化（Conformational changes occurring upon reduction and NO binding in nitrite reductase from Pseudomonas aeruginosa）」、Biochemistry、37、13987〜13966）で最良の結果が得られたが、DPP-IV関連機能を予測できなかった。

活性部位
触媒三残基（Ser630、Asp708、His740）は、2つのドメインの境界面の大きな空洞中に存在する。Ser630は、α/β型の加水分解酵素に特徴的な求核エルボと呼ばれるβ鎖5とヘリックスCとの間の非常に鋭いターンの先端で見出される（Ollis,D.L.、Cheah,E.、Cygler,M.、Dijkstra,B.、Frolow,F.、Franken,S.M.、Harel,M.、Remington,S.J.、Silman,I.、Schrag,J.ら、1992、「α/β加水分解酵素の折りたたみ（The alpha/beta hydrolase fold）、Protein Eng.、5、197〜211」）。セリンの水酸基は、十分に溶媒に曝露され、一方の側面上のHis740の触媒イミダゾール基に水素結合しており（2.6Å）、他方の側面上の基質に接近可能である。His740は、β鎖8とヘリックスFとの間のループの中央で見出される。イミダゾール環のNεから2.75Åの距離では、Asp708の酸素原子の1つがHis740と水素結合し、触媒三残基を完成させる（図8）。Asp708のカルボン酸基の他の酸素原子は、2つの主鎖NH基（Val711およびAsn710）に配位している。したがって、三残基の位置および幾何学的配置は、古典的なセリンペプチダーゼとは「左右像」が反対のα/β加水分解酵素において見出されるものに非常に類似している。

四面体中間体の負電化のオキシアニオンを、Tyr631の主鎖NH基およびTyr547の水酸基によって安定化する（図8）。さらに、この構造は、2つのGly628およびGly632によって正確な位置に触媒残基Ser630が運ばれるよう、鋭いターンを形成するのに重要であることを示す。これは、DPP-IVに対する変異誘発研究に基づき、配列Gly₆₂₈-X-Ser₆₃₀-Tyr₆₃₁-Gly₆₃₂がDPP-IV活性に不可欠であることを示す（Ogata,S.、Misumi,Y.、Tsuji,E.、Takami,N.、Oda,K.＆Ikehara,Y.、1992、「親和性標識および部位特異的変異誘発によるジペプチジルペプチダーゼ中の活性部位残基の同定（Identification of the active site residues in dipeptidyl peptidase IV by affinity labeling and site-directed mutagenesis）」、Biochemistry、31、2582〜2587）、。

基質結合
DPP-IVの基質結合部位を、阻害因子ジプロチンA（Ile-Pro-Ile）によって示す。これは、Ile-Pro-4-ニトロアニリドよりも10少ないk_cat/KM因子で緩やかに加水分解可能な基質である（Rahfeld,J.、Schierhorn,M.、Hartrodt,B.、Neubert,K.＆Heins,J.、1991、「ジプロチンA（Ile-Pro-Ile）およびジプロチンB（Val-Pro-Leu）はジペプチジルペプチダーゼIVの阻害因子または基質であるか（Are diprotin A (Ile-Pro-Ile) and diprotin B (Val-Pro-Leu) inhibitors or substrates of dipeptidyl peptidase IV?）」、Biochem.Biophys.Acta、1076、314〜316）。電子密度図の調査により、両サブユニットにおいて酵素のSer630に共有結合したリガンドが示される。N末端Ile残基（P2）およびPro残基（P1）は十分に定義されており、基質結合部位との相互作用について詳細に分析することができる（Schechterの注釈（Schechter,I.＆Berger,A.、1968、「プロテアーゼ3の活性部位におけるパパインの活性部位のマッピング；パパインの特異的ペプチド阻害因子（Mapping the active site of papain；specific peptide inhibitors of papain）」、Biochem.Biophys.Res.Commun.、32、898〜902）による）。C末端Ile（PI'）についてあまり十分に定義されていない電子密度が見出されたが、サブユニットBではリガンドのこの部分の立体配座も認められる（図8）。触媒His740の側鎖Nεは、P1'のNH基から水素結合距離（2.90Å）およびSer630側鎖のOγ（2.74Å）で存在する。

DPP-IVは、オリゴペプチドおよびタンパク質をN末端から加水分解し、第2の残基がプロリン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、ピペコリン酸、またはアラニンである場合、ジペプチド単位を切断する。Fischerらが推定するように（Fischer,G.、Heins,J.＆Barth,A.、1983、「位置P1と位置P2との間のペプチド結合周囲の立体配座は、いくつかのプロリン特異的プロテアーゼの触媒活性に重要である（The conformation around the peptide bound between the P1- and P2-positions is important for catalytic activity of some proline-specific proteases）」、Biochim.Biophys.Acta、742、452〜462）、両方のサブユニットでは、ジプロチンAの位置P1中のプロリンはトランス形であり、活性部位のポケットに最適に適合する。S1ポケットは、Val711、Val656、Tyr662、Tyr666、Tyr659、およびTyr631によって形成され、アラニンよりもさらに好適なプロリンによって充填された十分に定義さている疎水性ポケットを形成する。Glyもまた受け入れられるが、K_cat/K_M値が非常に低い（Brandt,W.、Lehmann,T.、Thondorf,I.、Born,I.、Schutkowski,M.、Rahfeld,J.U.、Neubert,K.＆Barth,A.、1995、「分子磁場分析および分子モデリングシミュレーションによって予想されるジペプチジルペプチダーゼIVの活性部位モデル（A model of the active site of dipeptidyl peptidase IV predicted by comparative molecular field analysis and molecular modelling simulations）」、Int.J.Pept.Protein Res.、46、494〜507）。全ての他の天然に存在するアミノ酸残基は位置P1を占めることができない。いずれかの側鎖はかさ高すぎるか親水性が高すぎる。残基P2およびP1'点は、溶媒に向いておらず、タンパク質との相互作用しない。これにより、これらの位置で基質中に受け入れられるアミノ酸の多様性の高さが説明される。

基質結合および触媒には、基質のN末端が不可欠であり、保護されずにプロトン化されなければならない（Brandt,W.、Ludwig,O.、Thonodorf,I.＆Barth,A.、1996、「ジペプチジルペプチダーゼIV（DPIV）によって示される新規のセリンプロテアーゼ触媒機構-実験結果によって支持されるPM3の半経験的熱力学的研究結果（A new mechanism in serine proteases catalysis exhibited by dipeptidyl peptidase IV (DPIV) - Results of PM3 semiempirical thermodynamic studies supported by experimental results）」、Eur.J.Biochem.、236、109〜114）。ジプロチンA複合体は、末端-NH₃ ⁺基がGlu205およびGle206の炭酸塩との強力な相互作用によって非常に正確な位置に保持されることを示す（図8）。第3のグルタミンGlu204は、Arg125、His126、およびSer127の骨格NHならびにSer127の水酸基との水素結合網によってこの基質認識部位を安定化する。グルタミン酸残基の重要性を、DPP-IV活性を根絶する1つの点変異によって確認する（Abbott,C.A.、McCaughan,G.W.＆Gorrell,M.D.、1999、「ジペプチジルペプチダーゼIVの予想されるβプロペラドメイン中の2つの高度に保存されたグルタミン酸残基は酵素活性に必要である（Two highly conserved glutamic acid residues in the predicted beta propeller domain of dipeputidyl peptidase IV are required for its enzyme activity）」、FEBS Lett.、458、278〜284）。二重Gluモチーフは、DPP-IV様遺伝子ファミリー（Asp-Trp-X-Tyr-Glu-Glu-Glu-X）中に高度に保存されたらせんセグメント（図1および図2中のα2^*、さらに図4、図5、図6も参照のこと）の末端に存在する。ヘリックスは、βプロペラドメインの規則正しいβシート構造から逸脱している（図1および図2、ならびに図4）。ジプロチンAと複合体形成したエクソペプチダーゼDPP-IVおよびオクタペプチドと複合体形成したエンドペプチダーゼPOPの活性部位の重ね合わせ（superposition）は、明らかに異なる（Fulop,V.、Szeltner,Z.、Renner,V.＆Polgar,L.、2001、「プロリルオリゴペプチダーゼ基質/阻害因子複合体の構造：触媒ヒスチジン残基の滴定のための阻害因子結合の使用（Structures of prolyl oligopeptidase substrate/inhibitor complexes. Use of inhibitor binding for titration of the catalytic histidine residue）」、J.Biol.Chem.、276、1262〜1266）。POPのオクタペプチド基質は、DPP-IV中の二重Gluモチーフと同時に起こり、このさらなる構造エレメント機能は基質選択に非常に重要である。したがって、二重Gluモチーフは基質のN末端の認識部位であり、ジペプチド切断を制限し、S1ポケットによりプロリン残基およびアラニン残基が至適に結合して高度に特異的なペプチダーゼが得られる。

ジプロチンAによる阻害様式
結合した阻害因子の電子密度の調査により、Ser630への共有結合および切断しやすいペプチドの前部カルボニル基のC原子のsp³気道が示される。したがって、四面体中間体は、Tyr547の側鎖の水酸基（2.80Å）およびTyr631の主鎖アミン（3.38Å）への水素結合によって安定化されたオキシアニオンを有する基質ジプロチンAとの複合体構造が認められる（図8）。セリンプロテアーゼの非常に高い触媒能力はこの遷移状態の優先される結合に由来するので、四面体中間体は十分に定義されているが、寿命の短い高エネルギー状態およびその蓄積は、速度障壁の結果であるに違いない。

活性部位構造の調査により、ジプロチンAに特異的であり、この基質の競合的阻害を導くことができるいくつかのさらなる特徴が明らかとされうる。第1に、2つの疎水性イソロイシン側鎖は近接して同一の方向に向くので、この疎水性相互作用は、反応進行に不適切な立体配座でトリペプチドを安定化することができる。第2に、塩橋および水素結合の巨大なネットワークは、複合体を安定化する。このネットワークは、トリペプチドのN末端と相互作用するGlu205/206のカルボキシル基を含むが、Glu205はArg125と別の塩橋を作製し、次いでこれはトリペプチドのC末端カルボキシル基と相互作用する（図8）。この相互作用はトリペプチド基質のみに存在し、遊離基の保護によって認められる中間体を安定化できることが明らかである。

二量体化
結晶構造および超遠心分析により、分子量169kDaで非結晶に折りたたみ対称の脱グリコシル化sDPP-IVの二量体のオリゴマー化が示される（図3）。各サブユニットの6％または1837Å²の全溶媒接触表面積が、二量体の境界面に埋没する（プログラムXSAE、Broger,C.、私信）。この境界面は、βプロペラドメインの第4のブレードの鎖2と鎖3との間のループ中、2つの過剰なβ鎖（β1^*およびβ2^*）によって主に構築されている（図4および図5）。α/β加水分解酵素とヘリックスαE、β鎖β8、およびヘリックスαFとがさらに相互作用し、これは主に疎水性相互作用である。活性部位は、この二量体境界面と非常に接近しており（図3）、触媒三残基由来のHis740はαFおよびβ7に連結したループ中に存在する（図1および図2）。したがって、二量体境界面の破壊はまた、触媒活性に強い影響を与え、活性には二量体化が必要である。

DPP-IVの安定性
細胞表面タンパク質として、DPP-IVは非常に安定である。したがって、組換えsDPP-IVは、タンパク質濃度および高熱安定性を示すグリコシル化の程度から独立した不可逆的熱不活性化実験において71℃で5分間の半減期を示す。ヒト精漿DPP-IVから精製したタンパク質を用いた非折りたたみ実験では、8Mまでの尿素で天然の立体配座が保持された（Lamberir,A.M.、Diaz Pereira,J.F.、Chacon,P.、Vermeulen,G.、Heremans,K.、Devreese,B.、Van Beeuman,J.、De Meester,I.＆Scharpe,S.、1997、「ヒト精漿由来のジペプチジルペプチダーゼIV（CD26）の生理化学的調査からのDPPIV/CD26ドメイン構造の予想（A prediction of DPPIV/CD26 domain structure from a physico-chemical investigation of dipeptidyl peptidase IV (CD26) from human seminal plasma）」、Biochim.Biophys.Acta、1340、215〜2）。

結晶構造では、この安定性に寄与し得るいくつかの因子が示される。第1に、拡大した疎水性界面を有する二量体としての構造の組織化は、いくつかの他のタンパク質で示される分子を安定化する（Thoma,R.、Hennig,M.、Sterner,R.＆Kirschner,K.、2000、「サーモトーガ・マリティマから二量体ホスホリボシルアントラニレート異性体の変異によって作製された単量体の構造および機能（Structure and function of mutationally generated monomers of dimeric phosphoribosylanthranilate isomerase from Thermotoga maritima）」、Structure Fold.Des.、8、265〜276）。第2に、現在、X線構造によって確認されるのは、変性条件下のSH滴定実験により認められる5個のジスルフィド結合および2個の遊離スルフヒドリル基である。βプロペラ中の全ジスルフィド架橋は、ブレード中の異なる鎖に連結するか、ループ（Cys444/Cys447；Cys385/Cys394、Cys454/Cys472、Cys328/Cys339）を安定化する。α/β加水分解酵素ドメイン（Cys649/Cys762）中に1つのジスルフィド結合が見出され、C末端ヘリックスαFはα/β加水分解酵素ドメインのコアに共有結合する。

グリコシル化
ピキア・パストリスで過剰発現したsDPP-IVは、多角レーザー光散乱検出器にてオンラインで分析したゲル濾過分析における溶出ピークにわたり分子量を減少させる。対照的に、第1のN-アセチルグルコサミン残基（GlcNAc）のオリゴマンノースに結合したアスパラギンの特異的切断により、EndoFグリコシダーゼで脱グリコシル化したsDPP-IVは、全ピーク範囲にわたり均一な分子量を示す。これにより、SDS-PAGEで評価したところ20kDaの分子量が減少する。グリコシル化sDPP-IVのX線回折に適切な結晶のみが認められ、構造分析により、サブユニットA中の位置N85、N150、N229、およびN281で解釈可能な電子密度を有する4個のGlcNAcが示される。サブユニットBでは、N85、N150、およびN229は視覚可能であるが、N281では電子密度が認められず、N92ではさらなる部位を同定することができる。N85のGlcNAcは、両サブユニットにおける結晶接触に関与する。

ヒトで発現したDPP-IVは、ピキア・パストリスと比較してより複雑なグリコシル化型を有し（Cremata,J.、Montensino,R.、Quintero,O.＆Garcia,R.、1998、「異種タンパク質のグリコシル化プロファイリング（Glycosylation Profiling of Heterologous Proteins）」、Pichia Protocols、Higgins,D.R.＆Gregg,J.M.編、第103巻、95〜106頁、Humana Press：Totowa、NewJersey）、末端シアル酸を含むが、これは、本明細書に記載された正確な折りたたみを必要とする。

ADAとの相互作用
アデノシンデアミナーゼ（ADA、EC3.5.4.4）は全哺乳動物組織で発現する41kDaのタンパク質であり、アデノシンおよび2'-デオキシアデノシンのイノシンおよび2'-デオキシイノシンへの脱アミド化をそれぞれ触媒する。アデノシンの細胞外濃度調節および免疫応答の調節において重要である。ADAは、一般にT細胞活性化および自己免疫障害（慢性間接リウマチなど）の病因ならびに免疫不全疾患（SCIDまたはAIDSなど）の機構に関与する。可溶性細胞外ADAの結合は、高等哺乳動物のDPP-IV分子に固有の性質であり、マウスおよびラットDPP-IVでは認められない（Iwaki-Egawa,S.、Watanabe,Y.＆Fujimoto,Y.、1997、「CD26/ジペプチジルペプチダーゼIVはラット細胞でアデノシンデアミナーゼ結合タンパク質として作用しない（CD26/dipeptidyl peptidase IV does not work as an adenosine deaminase-binding protein in rat cells）」、Cell Immunol.、178、180〜186）。超遠心分離分析を用いて、分子量252kDaのADA分子とsDPP-IVサブユニットとの1：1複合体が認められた。表面プラズモン共鳴（Biacore）測定では、強力な相互作用を表す非常に低い解離速度（K_off=8.75^*10^-5s^-1、K_on=2.98^*10⁴Ｍ^-1s^-1）でのウシ由来ADAに対する結合定数3.15±2nMが示される。

変異誘発研究（Abbott,C.A.、McCaughan,G.W.、Levy,M.T.、Church,W.B.＆Gorrell,M.D.、1999、「アデノシンデアミナーゼによるヒトジペプチジルペプチダーゼIVおよびリガンド結合を示す抗体への結合は、予想されたβプロペラドメイン上の重複した不連続部位を含む（Binding to human dipeptidyl peptidase IV by adenosine deaminase and antibodies that inhibit ligand binding involves overlapping, discontinuous sites on a predicted beta propeller domain）」、Eur.J.Biochem.、266、798〜810；Dong,R.P.、Tachibana,K.、Hegen,M.、Munakata,Y.、Cho,D.、Schlossman,S.F.＆Morimoto,C.、1997、「CD26上のアデノシンデアミナーゼ結合ドメインの決定およびT細胞活性化に対するその免疫調整効果（Determination of adenosine deaminase binding domain in CD26 and its immunoregulatory effect on T cell activation）」、J.Immunol.、159、6070〜6076）により、DPP-IV中の2つの重要な領域（Leu₃₄₀-Val₃₄₁-Ala₃₄₂-Arg₃₄₃（β5/4から開始）およびLeu294（α4、ブレード4の末端））およびあまり重要でない領域Glu₃₃₂-Ser₃₃₃-Ser₃₃₄-Gly₃₃₅-Arg₃₃₆（ループ領域、β5/3の末端）（全てβプロペラドメインの表面に存在する（図1および図2））を同定した。ラットDPP-IVで見出されたアミノ酸の変異により、ADAに対する結合親和性が減少する。これらの残基は、ADA結合とDPP-IV活性が無関係であることを確認する活性部位（図3）から非常に離れて存在する結合部位を形成する（表1；De Meester,I.、Vanham,G.、Kestens,L.、Vanhoof,G.、Bosmans,E.、Gigase,P.＆Scharpe,S.、1994、「CD26を介したリンパ球へのアデノシンデアミナーゼの結合（Binding of adenosine deaminase to the lymphocyte surface via CD26）」、Eur.J.Immunol.、24、566〜570）。DPP-IVの機能は、適切な触媒へのADAの局在化および配向であると結論付けた。N末端が膜と接近していなければならず、且つADA結合は細胞表面から離れて配向している分子の反対の部位に存在するため、この構造は、細胞表面での方向付けおよび局在化を示す（図3）。さらに、おそらく免疫組織の個体発生に重要な役割を果たすADAのA1アデノシン受容体と相互作用するのに十分な空間が存在する（Ciruela,F.、Saura,C.、Canela,E.I.、Mallol,J.、Lluis,C.＆Franco,R.、1996、「アデノシンデアミナーゼは、細胞表面アデノシン受容体との相互作用によってリガンド誘導シグナル伝達に影響を与える（Adenosine deaminase affects ligand-induced signaling by interacting with cell surface adenosine receptors）」、FEBS Lett.、380、219〜223）。また、この見解により、DPP-IV、ADA、およびA1-アデノシンの結合を介した細胞-細胞相互作用のための結合を提案する仮説が支持される。

生物学的意図
2.1Å分解能でのDPP-IVの結晶構造により、分子全体の立体配座を促進させる二量体境界面を広げたV型の二量体分子が明らかとなる。DPP-IVの膜結合および安定性は、酵素の機能性を破壊することなく局在化させるために、ADAのような他のタンパク質の結合に使用される。

ジプロチンAとの複合体の分析では、プロリン特異的エクソペプチダーゼの特異性および活性についての重要な構造の特徴が示される。二重Gluモチーフの負電荷により、ペプチドのN末端が活性部位に誘導され、正確な切断位置に基質が固定される。このモチーフと触媒Ser630との間の距離はジペプチド切断を制限し、S1ポケットはプロリンのみを選択するか、または親和性の低さを伴ってアラニンを側鎖としうる。

ジプロチンAの低い折り返し率を、P2およびP1'位での2つのIle残基の疎水性相互作用およびジプロチンAの負電荷C末端を含む広範な塩橋クラスターによって説明することができる。この構造情報は、新規の特異的阻害因子設計を補助する。

活性部位は、2つの入り口によって非常に近づきやすく、このことはペプチドがほとんどサイズ制限なくDPP-IVによって切断されうることを説明するものである。βプロペラドメインのトンネルによる活性部位への第2の接近では、切断したジペプチドを放出できる程の十分な大きさがある。この構造整列によって触媒折り返しは確実に改良され、トンネルがより狭く活性部位へのさらなる接近がみられないPOPの結晶構造とは大いに異なる。

DPP-IVのほとんどの特定の特徴（すなわち、二量体化、2つの入り口を介した基質接近の調節、基質（二重Gluモチーフ）の認識、およびADAのような他のタンパク質とのβプロペラドメインの相互作用）は、重要な役割を果たす。したがって、DPP-IVは、βプロペラの折りたたみを異なる機能性に対して適応するように調整することができる優れた例である。

（表１） DPP-IVの酵素速度定数

^*ラインウィーバー・バーク（Lineweaver-Burk）プロット；100mM NaCl、0.1mg/ml BSA、および0.5％ジメチルホルムアミドを含む50mM Tris/HCl（pH7.8）緩衝液；温度25℃を使用して分析した。

（表２） DPP-IV阻害因子のK_IおよびK_D

⁺ビアコア（biacore）；0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ポリソルベート20（v/v）を含む0.01M Hepes（pH7.4）緩衝液）を使用して測定した。
⁺⁺温度25℃；アッセイ緩衝液（表1を参照）中；グリコシル化sDPP-IV。
^*Hughes,T.E.、Mone,M.D.、Russell,M.E.、Weldon,S.C.＆Villhauer,E.B.、1999、「NVP-DPP728（1-[[[2-[(5-シアノピリジン-2-イル)アミノ]エチル]アミノ]アセチル]-2-シアノ-(S)-ピロリジン）：ジペプチジルペプチダーゼIVの低結合阻害因子（NVP-DPP728 (1-[[[2-[(5-cyanopyridin-2-yl)amino]ethyl]amino]acetyl]-2-cyano-(S)-pyrrolidine) a slow-binding inhibitor of dipeptidylpeputidase IV）」、Biochemistry 38、11597〜11603。

（表３）結晶学的データおよび精密化統計

^aMarresearch画像プレート検出器（直径345nm、ピクセルサイズ100μm）
^*括弧内の値は、最も高い分解能瓶の統計である。

式中、I_i(h)および＜I(h)＞は回折強度hのithおよび平均測定値である。

式中、｜F_obs｜および｜F_calc｜はそれぞれ作業（R_cryst）および試験（R_fee）に適用した回折hについての観察および計算した構造因子の大きさである。
^e非水素原子のみ。
^frmsd：平均由来の二乗平均平方根偏差。

表4では、DPP-IV結晶由来のX線回折に由来するDPP-IVの原子構造座標を列挙する。
（表４）ヒトDPP-IVの構造座標

列2は構造中の原子数を列挙する。
列3は、座標を測定したエレメントを列挙する。列中の最初の文字は、エレメントを定義する。
列4はアミノ酸型を列挙する。
列5は構造中のアミノ酸数を列挙する。
列6〜8は、それぞれX、Y、およびZの結晶軸を列挙する。結晶軸は、測定したエレメントの原子に値を定義する。
列9は、各原子が座標によって特定された位置を占める分子画分をいう居在係数を列挙する。値「1」は、各原子が結晶中の全分子で同一の立体配座（すなわち、同一の位置）を有することを示す。
列10は、原子の中心の周囲の原子の移動を測定した温度要因「B」を列挙する。

DPP-IVおよびPOPの配列アラインメントを示す図である。ヒト（hDPP-IV）およびラット（rDPP-IV、異なる残基のみを示す）由来のDPP-IVのアミノ酸配列アラインメントを示す。βプロペラドメインの構造ホモロジーを欠くので、ブタ由来のPOPのアラインメントを、α/β加水分解酵素ドメインのみの構造の重ね合わせ（superposition）を用いて行った。上部の線はDPP-IVの二次構造のさらなる情報（黄色の矢印および赤色のバー）、可視電子密度を含むグリコシル化部位（Y）、潜在的なグリコシル化部位（赤色で印をつけた）、ジスルフィド結合（関与するシステイン間の緑色の線）を示し、および矢印はクローン化細胞外ドメインの開始を示す。膜貫通部分の配列を薄い灰色、二量体形成に関与するβプロペラ部分の配列を灰色、アデノシンデアミナーゼ結合に関与する残基を緑色、触媒中間体のオキシアニオンの安定化に関与するチロシンを青色、および触媒残基を桃色で強調する。 DPP-IVおよびPOPの配列アラインメントを示す図であり、図1の続きである。二折りたたみ軸に対して垂直なDPP-IV全構造を示すリボン図である。ドメインを、サブユニットAのα/β加水分解酵素およびβプロペラドメインについて暗緑色および薄緑で着色し、他のサブユニットについて紺青色/淡青色でそれぞれ着色した。分子の全体の寸法は約125×80×60Å³である。活性部位を球および棒で示した触媒残基ならびにADA結合に重要な変異誘発データによって同定された残基によって強調する。提案した細胞表面上の位置を、膜の略図によって示す。この図をMolscript（Kraulis,P.J.、1991、「MOLSCRIPT：タンパク質構造の詳細なプロットおよび概略的プロットの両方を作成するためのプログラム（MOLSCRIPT：A program to produce both detailed and schematic plots of protein structures）」、J.Applied Crystallogr.、24、946〜950）を用いて作成し、Raster3D（Merrit,E.A.＆Bacon,D.J.、1997、「Raster3D：写真のようにリアルな分子グラフィックス（Raster3D：photorealistic molecular graphics）」、Methods Enzymol.、277、505〜524）に供した。 DPP-IVおよびPOPのβプロペラドメインのリボン図である。DPP-IVでは4個の逆並行β鎖またはブレード（ブレードに1〜8の番号をつけている）からなる構造モチーフが8回リピートすることを示す。さらなる以下の二次構造エレメントをマゼンタで着色した：基質結合に関与するターンの頂点にArg125を含むブレード2のエクステンションである逆並行βシート（図1および図2のβ2/2aおよびβ2/2b）。基質認識および特異性に寄与するC末端グルタミン酸豊富なループ（Glu204/205/206）を有するαヘリックス（図1および図2のα2^*）。二量体境界面の一部を形成する逆方向βシート（図1および図2のβ1^*およびβ2^*）。後者の構造エレメントは、ブレード4のエクステンションである。 DPP-IVおよびPOPのβプロペラドメインのリボン図である。90°回転させたDPP-IVのβプロペラドメインを示す。 DPP-IVおよびPOPのβプロペラドメインのリボン図である。POPがブレードを含み、βプロペラ構造と顕著に逸脱していないことを示す。ブレードは1〜7と番号付ける。活性部位への接近を示し、活性部位表面（原子型に基づいて着色した）を有するDPP-IVサブユニットの略図である。基質結合部位の炭素を白色に着色した基質ジプロチンAを示す。矢印は、基質が十分に接近可能に活性部位に侵入し、活性部位の裂け目を開き、触媒反応を受けたジペプチド産物が、βプロペラによって形成された狭いトンネルを介して活性部位の空洞に置かれたままとなり得ることを示す。ジプロチンAを含むDPP-IVの活性部位（Ile-Pro-Ile）を示す図である。基質ジプロチンAは、活性部位Ser630に共有結合した四面体中間体としてトラップされている。破線は、水素結合を示す。タンパク質結合を紺青色で示し、リガンドおよび活性部位Ser630を淡青色で示す。MOLOC（Gerber,P.R.、1992、「ペプチド構造：小単位として全残基と連携したペプチドおよびタンパク質の力場（Peptide mechanics：a force field for peptides and proteins working with entire residues as small unites）」、Biopolymers、32、1003〜1017）で描画した。挿入図は、2.5σ（緑色）および4σ（黄色）で輪郭を示したオミット電子密度（リガンドおよびSer630は計算から省略された。）を示す。

符号の説明

１〜８：ブレード

Claims

哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの結晶。
非対称単位中にP2₁2₁2₁の斜方晶系空間群および1つのDPP-IVホモ二量体を有することを特徴とする、請求項1記載の結晶。
aが63Å〜70Åであり、
bが66Å〜70Åであり、
cが416Å〜424Åである寸法の単位格子を有し、かつ
P2₁2₁2₁対称である、
請求項1または2記載の結晶。
表4の原子構造座標によって特徴付けられる、請求項1〜3のいずれか一項記載の結晶。
哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインと、その活性部位に結合したリガンドとの共結晶。
非対称単位中にP2₁2₁2₁の斜方晶系空間群および1つのDPP-IVホモ二量体を有することを特徴とする、請求項5記載の共結晶。
aが63Å〜70Åであり、
bが66Å〜70Åであり、
cが416Å〜424Åである寸法の単位格子を有し、かつ
P2₁2₁2₁対称である、
請求項6記載の共結晶。
哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインと、アロステリック結合部位に結合したリガンドとの共結晶。
哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインとHgCl₂との共結晶。
（a）濃度7mg/ml〜22mg/mlの哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの緩衝化水溶液（pH7〜8.5）を供給する段階；および
（b）PEGの平均分子量が1,000〜20,000である、10％〜30％のPEG、10％〜20％のグリセロールを含む緩衝化リザーバ溶液を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させる段階
を含む、哺乳動物DPP-IVの結晶化方法。
段階（a）の哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをピキア・パストリス中で産生させた後脱グリコシル化する、請求項10記載の方法。
（a）濃度7mg/ml〜22mg/mlの哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの緩衝化水溶液（pH7〜8.5）を供給する段階；
（b）モル過剰の活性部位を哺乳動物DPP-IV水溶液に添加する段階；および
（c）PEGの平均分子量が1,000〜20,000である、10％〜30％のPEG、10％〜20％のグリセロールを含む緩衝化リザーバ溶液を用いた蒸気拡散によって結晶を成長させる段階
を含む、哺乳動物DPP-IVと活性部位リガンドとの共結晶化方法。
段階（a）の哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをピキア・パストリス中で産生させた後脱グリコシル化する、請求項12記載の方法。
請求項10〜13記載の方法によって作製された結晶。
（a）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインを結晶化する段階；および
（b）哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインをX線回折によって分析して、結晶化された哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造を決定し、それにより結晶化された哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造が3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能で決定される段階
を含む、3.5Å〜2.1Åまたはそれ以下の分解能で、結晶化した哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの三次元構造を決定する方法。
データ使用のための命令をプログラミングされた機械を使用した場合に、配列番号：2のアミノ酸を含む哺乳動物DPP-IV細胞外ドメインの少なくとも一部を含む分子または分子複合体の三次元画像を表示する、機械読取可能なデータでコード化されたデータ記憶材料を含む、機械読取可能なデータ記憶媒体（細胞外ドメインは、表4に列挙した構造座標によって示されるアミノ酸の骨格原子を示す点から約1.5Å未満の二乗平均平方根偏差を有する一組の点によって定義されるリガンド結合活性部位を含む）。
（a）1.5Å未満のアミノ酸の骨格原子由来の二乗平均平方根偏差を有する、表4に列挙した構造座標を用いてDPP-IVの三次元モデルを作成する段階；および
（b）該三次元モデルを用いてDPP-IVと相互作用する化合物を設計または選択する段階
を含む、DPP-IVと相互作用する化合物を同定する方法。
（c）同定された化合物を得る段階；および
（d）得られた化合物をDPP-IVに接触させて、DPP-IV活性に対する化合物の効果を決定する段階
をさらに含む、請求項17記載の方法。
化合物をDPP-IVの活性部位と相互作用させる、請求項17または18記載の方法。
化合物をDPP-IVのアロステリック結合部位と相互作用させる、請求項17または18記載の方法。
化合物がDPP-IV活性の阻害因子である、請求項17または20記載の方法。
コンピュータ支援の方法である、請求項17〜21のいずれか一項記載の方法。
請求項17〜22のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。
請求項23記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
特にI型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌の治療のための治療的活性物質として使用される、請求項23記載の化合物。
配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDPP-IVの可溶性細胞外ドメインをコードする、単離核酸配列。
発現ベクターおよび請求項26記載の核酸配列を含む、核酸構築物。
請求項27記載の核酸構築物で形質転換された、宿主細胞。
宿主細胞によるDPP-IVの可溶性細胞外ドメインの発現を可能にする条件下で請求項28記載の宿主細胞を培養する段階を含む、DPP-IVの可溶性細胞外ドメインの作製方法。
宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項29記載の方法。
配列番号：2のDPP-IVの可溶性細胞外ドメインを含む、ポリペプチド。
I型糖尿病、II型糖尿病、IGT、肥満症、および癌の治療薬を製造するための、請求項23記載の化合物の使用。
DPP-IV活性の阻害因子を同定および/または設計するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の結晶または共結晶の使用。