JP2008156311A

JP2008156311A - Ｂｒｄ２ブロモドメイン結合剤

Info

Publication number: JP2008156311A
Application number: JP2006349392A
Authority: JP
Inventors: Takashi Umehara; 崇史梅原; Akiko Tanaka; 昭子田仲; Kazuhito Sato; 万仁佐藤; Shigeyuki Yokoyama; 茂之横山
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2006-12-26
Publication date: 2008-07-10

Abstract

【課題】ＢＲＤ２の機能解析、特にブロモドメインを介した転写活性能やウィルス感染・増殖に対する影響等を解析するために有効な物質、及び、該物質を用いたＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法の提供。
【解決手段】ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメイン（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ）のうち、Ｎ末側のブロモドメインと結合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤、１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオンを有効成分とすることを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤、及び、該ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を用いることを特徴とするＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質ＢＲＤ２のブロモドメイン（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ）と結合する、ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤、及び、該結合剤を用いたＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法に関する。

ＢＥＴ（ＢｒｏｍｏｄｏｍａｉｎｓａｎｄＥｘｔｒａＴｅｒｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎ）ファミリータンパク質は、ブロモドメインにおいてアセチル化された染色体タンパク質ヒストン（Ｈｉｓｔｏｎｅ）を認識することにより、転写活性化因子として機能することが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。ブロモドメインは、ＢＥＴファミリー以外にも、ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ等の様々な染色体結合因子に存在しており、近年、ブロモドメインの遺伝的変異による転写機能不全が癌化の原因となるという報告もなされている（例えば、非特許文献２参照。）。

ＢＥＴファミリータンパク質の１つであるＢＲＤ２は、タンデム配列の２つのブロモドメインと、Ｃ末に１つのＥＴドメインを有するタンパク質である。ＢＲＤ２は、元々ヒトＭＨＣ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓ IIの制御に関与する新規遺伝子として同定されたものであり、初めはＲＩＮＧ３（ＲｅａｌｌｙＩｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇＮｅｗＧｅｎｅ−３）と名付けられたが、その後、ＢＲＤ２（Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２）と新たに命名されたものである（例えば、非特許文献３参照。）。哺乳培養細胞にＢＲＤ２のみを単独で発現させても、転写活性はあまり変化しないが、ＢＲＤ２と活性型Ｒａｓとを共発現した場合に、転写活性が顕著に増大することから、ＢＲＤ２は、Ｒａｓシグナリングにおいて転写活性化因子として機能すると考えられている（例えば、非特許文献４参照。）。

また、近年、ＢＲＤ２はカポジ肉腫関連ヘルペスウィルス（ＫＳＨＶ）のＬＡＮＡ−１タンパク質と結合することが判明した（例えば、非特許文献５及び６参照。）。ＬＡＮＡ−１は潜伏感染状態で発現している数少ないウィルス遺伝子の一つであり、潜伏感染維持に極めて重要な多機能因子である。他のブロモドメインファミリーに属するタンパク質には、パピローマウィルスのタンパク質と相互作用し、哺乳類細胞内を伝播するための核内レセプターとして働くことが明らかになってきているものもある（例えば、非特許文献７参照。）。従って、ＢＲＤ２は、ヘルペスウィルス等の細胞内伝播において重要な役割を果たしている可能性がある。

ＢＲＤ２のブロモドメインは、アセチル化されたヒストンのうち、ヒストンＨ４の１２番目のリジンがアセチル化されたもの（以下、Ｋ１２Ａｃとする）を特異的に認識することが知られている（例えば、非特許文献８参照。）。他の多くのブロモドメイン含有染色体結合因子が、有糸分裂期には染色体から脱離する（例えば、非特許文献９参照。）にも関わらず、ＢＲＤ２のブロモドメインは、有糸分裂期間中にも強固に染色体に結合しているという特徴を有する（例えば、非特許文献８及び１０参照。）。ＢＲＤ２のブロモドメインの該特徴から、ＢＲＤ２が、エピジェネティックな転写制御や、ウィルスが細胞分裂後の娘細胞へ継承される機構において、重要な役割を果たしていることが推察される。

すなわち、ブロモドメインを介したＢＲＤ２の機能解析、特に、転写活性能やヘルペスウィルス等との結合能等の解析は、転写機構、癌化機構、及びウィルス等の細胞内伝播機構等のさらなる解明に役立つことが期待される。しかしながら、ＢＲＤ２のブロモドメインの機能については、ヒストンＨ４のＫ１２Ａｃを特異的に認識することは分かっているものの、転写、細胞周期、及びウィルス細胞内伝播等における具体的な役割については、ほとんど明らかにされていない。

通常、タンパク質の機能解析の方法として、例えば、（１）解析対象であるタンパク質やその変異体等を、細胞用発現ベクター等を用いて、培養細胞内に過剰発現することによる影響を観察することが行われている。また、（２）ＲＮＡ干渉等により解析対象のタンパク質の発現を抑制することによる影響を観察することも行われている。その他、（３）抗体等の解析対象のタンパク質と結合する物質のインジェクション等により、細胞内に発現している解析対象のタンパク質を捕捉することによる影響を観察することも行われている。
Ladurner et al.（２００３）Molecular cell １１（２）：ｐ３６５〜３７６ Panagopoulos et al.（２００１）Human molecular genetics １０（４）：ｐ３９５〜４０４ Okamoto et al.（１９９１）Human immunology ３２（３）：ｐ２２１〜２２８ Denis et al.（２０００）Cell growth & differentiation : the molecular biology journal of the American Association for Cancer Research １１（８）：ｐ４１７〜４２４ Platt et al.（１９９９）Journal of Virology ７３（１２）：ｐ９７８９〜９７９５ Viejo-BorBolla et al.（２００３）Journal of Virology ７９（２１）：ｐ１３６１８〜１３６２９ You et al.（２００４）Cell １１７（３）：ｐ３４９〜３６０ Kanno et al.（２００４）Molecular cell １３（１）：ｐ３３〜４３ Kruhlak et al.（２００１）The Journal of biological chemistry ２７６（４１）：ｐ３８３０７〜３８３１９ Dey et al.（２００３）Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America １００（１５）：ｐ８７５８〜８７６３

しかしながら、上記（１）の方法では、解析に用いる全ての培養細胞に、目的の発現ベクターをトランスフェクションできるわけではないため、解析効率が劣ることがある。また、細胞用発現ベクターを細胞内にトランスフェクションするための試薬は一般的に高価であり、経済的にも好ましくない。
一方、上記（２）の方法では、解析対象のタンパク質の発現が全体的に抑制されてしまうため、ある特定の機能のみを阻害した影響を観察することはできない。例えば、ヒストンＨ４と結合していないＢＲＤ２の機能はそのままの状態で、アセチル化したヒストンＨ４との結合のみを阻害した影響を観察したい場合には、該（２）の方法は不適切である。
また、上記（３）の方法では、一つ一つの細胞にインジェクションしなくてはならないため、非常に作業が煩雑となる。

本発明は、ＢＲＤ２の機能解析、特にブロモドメインを介した転写活性能やウィルス感染・増殖に対する影響等を解析するための有効な物質、及び、該物質を用いたＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメインのうち、Ｎ末側のブロモドメインの結晶構造解析を行って、ＢＲＤ２ブロモドメインの立体構造情報を明らかにし、該立体構造情報に基づきＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を選択することにより、ＢＲＤ２の機能解析に有用であることを見出し、本発明を完成させた。特に、結晶構造解析により明らかになったＢＲＤ２のＮ末側のブロモドメインにあるヒストンＨ４のＫ１２Ａｃ認識ポケットと結合する低分子化合物であれば、細胞内に導入することにより、簡便に、ＢＲＤ２とヒストンＨ４のＫ１２Ａｃとの結合のみを阻害することができるため、より生理的な条件で、ＢＲＤ２の転写機構やウィルス等の細胞内伝播機構等におけるＢＲＤ２の機能解析を行うことができることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメインのうち、Ｎ末側のブロモドメインと結合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ＢＲＤ２がヒトタンパク質ＢＲＤ２であることを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインとの結合において、アセチル化されたヒストンＨ４と競合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインの、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットと結合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオン（１−［２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌｔｈｉｏ）ｅｔｈｙｌ］−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｔｈｉｏｎｅ）を有効成分とすることを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメインのうち、Ｎ末側のブロモドメインと結合することを特徴とする、前記有効成分を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ＢＲＤ２がヒトタンパク質ＢＲＤ２であることを特徴とする、前記有効成分を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインとの結合において、アセチル化されたヒストンＨ４と競合することを特徴とする、前記有効成分を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインの、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットと結合することを特徴とする、前記有効成分を有するＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を用いることを特徴とする、ＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法を提供するものである。

本発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤は、簡便に、アセチル化したヒストンＨ４との結合のみを阻害することができるため、ブロモドメインを介したＢＲＤ２の機能解析に非常に有用であるばかりではなく、より効果的な抗癌剤やウィルス感染・増殖阻害剤の開発に役立つことが期待できる。
また、本発明のＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法は、簡便に、ＢＲＤ２がヒストンＨ４のＫ１２Ａｃと結合することによる影響が観察し得るため、ＢＲＤ２依存の転写機構の解明に有用である。

本発明のＢＲＤ２は、特に限定されるものではないが、哺乳動物由来のＢＲＤ２が好ましく、ヒト由来のＢＲＤ２がより好ましい。ＢＲＤ２のアミノ酸配列は公知であり、公知のデータベースより配列情報を入手することが可能である。例えば、ヒトＢＲＤ２は、
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、アクセッション番号ＮＰ＿００５０９５．１としてＮＣＢＩＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。マウスＢＲＤ２はアクセッション番号Ｑ７ＪＪ１３としてＮＣＢＩＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。ラットＢＲＤ２はアクセッション番号Ｑ６ＭＧＡ９としてＮＣＢＩＰｒｏｔｅｉｎＤＢに登録されている。

本発明のＢＲＤ２のブロモドメインは、ＢＲＤ２に存在するブロモドメインのアミノ酸配列からなるペプチドである。該ペプチドは、ブロモドメインとして公知のアミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、アミノ酸配列情報からブロモドメインと推定されるアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。ここで、アミノ酸配列情報から推定されるドメインとは、例えば、タンパク質モチーフデータベースＰＦＡＭ（ｖｅｒｓｉｏｎ７．１）に含まれる配列プロファイルと相同性が検出される（例えばＥ−ｖａｌｕｅが０．１以下である）アミノ酸配列である。

本発明のＢＲＤ２のブロモドメインは、天然のペプチドであってもよく、遺伝子組換え技術を利用した組換えペプチドであってもよい。天然のペプチドは、例えば、マウス等の組織をホモジナイズして得た可溶性成分から、常法により、分離・精製することができる。遺伝子組換え技術を利用した組換えペプチドは、例えば、本発明のＢＲＤ２のブロモドメインペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入した発現用ベクターを用いて形質転換した細胞の培養液から、常法により、分離・精製することができる。

また、ブロモドメインの機能を阻害しない限り、天然のアミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、付加等がなされたアミノ酸配列からなるブロモドメインであってもよい。ここで、本発明におけるブロモドメインの機能とは、アセチル化されたヒストンＨ４との結合能をいう。通常、一次配列上の僅かな差異を有しているペプチドであっても、生体内において、天然のＢＲＤ２と同様の働きをなし得る場合があるためである。例えば、ＢＲＤ２のブロモドメインが、遺伝子組換え技術を利用した組換えペプチドである場合に、精製を簡便にするため、通常用いられているタグやプロテアーゼ切断部位等を付加したものであってもよい。

本発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤は、ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメインのうち、Ｎ末側のブロモドメイン（以下、ブロモドメインＢＤ１とする）と結合することを特徴とするものである。該ブロモドメインＢＤ１とは、ヒトＢＲＤ２では、例えば、配列番号１のアミノ酸配列のうち、７４〜１９４残基の領域をいう。

ＢＲＤ２のブロモドメインとの結合において、アセチル化されたヒストンＨ４と競合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤であることが好ましい。ＢＲＤ２ブロモドメインとアセチル化されたヒストンＨ４との結合を効果的に阻害することができるためである。特に、ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１の、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットと結合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤であることが好ましい。該アセチル化リジン認識ポケットと結合する結合剤であれば、アセチル化されたヒストンＨ４との結合以外のＢＲＤ２の機能に与える影響を最大限抑え得ると推察されるためである。

ここで、ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１の、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットは、ブロモドメインＢＤ１のタンパク質の分子表面に存在する、周囲を残基で囲まれている空洞のような凹領域であり、ヒストンＨ４のＫ１２Ａｃを認識する領域である。具体的には、例えば、ヒトＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１においては、配列番号１に示すアミノ酸配列の、Ｔｒｐ９７、Ｐｒｏ９８、Ｇｌｎ１０１、Ｐｒｏ１０２、Ｖａｌ０３、Ａｓｐ１０４、Ｌｙｓ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ｌｅｕ１１０、Ｔｙｒ１５５、Ａｓｎ１５６、Ａｓｐ１６０、Ｉｌｅ１６２、Ｍｅｔ１６５の残基からアセチル化リジン結合ポケットが形成されている。上記のアセチル化リジン認識ポケットを形成する残基は、本願発明者らによる結晶構造解析により明らかにされたものである（Nakamura et al.（２００６）The Journal of biological chemistry Manuscript Ｍ５９７１２００参照）。なお、該結晶構造解析により明らかにされた原子座標等の構造情報は、プロテイン・データ・バンク（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ、ＰＤＢ)に、ＰＤＢコードＩＤ：１Ｘ０Ｊとして登録されている。

本願発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤は、目的物質に結合する物質を得るために通常用いられている方法によって得ることができる。該方法として、例えば、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッド法、構造情報を用いたｉｎｓｉｌｉｃｏスクリーニング法等がある。特異性に優れた結合剤をより効率よく得ることができるため、構造情報を用いたｉｎｓｉｌｉｃｏスクリーニング法が好ましい。

上記方法により得られたＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤の、ＢＲＤ２ブロモドメイン結合能は、通常、２つの物質の結合性を確認するために用いられる方法によって確認することができる。該確認方法として、例えば、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法や、表面プラズモン共鳴原理（ＳＰＲ）を用いた方法等がある。検出のための標識を用いることなく、分子間の相互作用をリアルタイムに測定できること、及び、解離定数（Ｋ_Ｄ）等をも求めることができることから、ＳＰＲを用いた方法が好ましい。

また、上記方法により得られたＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤の、ＢＲＤ２ブロモドメイン結合能、及び、ＢＲＤ２依存の転写阻害能は、培養細胞を用いた実験によっても確認することができる。例えば、得られたＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を培養液に添加する等により、培養細胞の転写活性へ及ぼす効果を確認することができる。なお、培養細胞の転写活性の測定は、常法により行うことができる。

例えば、以下の方法により、本願発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を得ることができる。まず、ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１の構造情報を用いて、ｉｎｓｉｌｉｃｏスクリーニングを行うことにより、アセチル化リジン認識ポケットと結合する候補化合物を得る。その後、得られた上位化合物とＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１の結合を、ＳＰＲを用いた方法により確認する。該方法について、以下に詳述する。

１．ｉｎｓｉｌｉｃｏスクリーニング
（１）データベースの最適化
低分子化合物データベースの対象データベースとしては、ＣＭＣ(ＭＤＬ社)、ＣＳＤ（Cambridge Crystallographic Data Centre）、ＬＩＧＡＮＤ（ＫＥＧＧ）、ＭＤＤＲ（ＭＤＬ社)、ＣＣ（Maybridge社）、ＨＴＳ(Maybridge社)、ＮＣＩ(ＭＤＬ社)、ＳＰＥＣＳ（ＳＰＥＣＳ社)から提供されている低分子化合物カタログデータベースを用いた。
１エントリーに複数分子を含むものは１分子毎に分割した上で、重複を除いたライブラリーをスクリーニングの母集団として用いた。このデータベースには１，００１，９３５分子が含まれていた。

次に、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓＲｕｌｅｏｆ５に基づき、上記低分子化合物データベースについてのターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞込み条件は以下の通りである。
１．分子量１００以上５００以下。
２．計算LogP値(o/w)５以下（ＸＬＯＧ−１アルゴリズム使用）。
３．水素結合アクセプター原子数（低分子化合物に含まれるＮとＯの数）１０以下。
４．水素結合ドナー原子数（低分子化合物に含まれるＮＨとＯＨの数）５以下。
更に、ドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１．回転可能な単結合数が２１以上のもの。
２．ラジカルを含むもの。
３．Ｈ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｓ、Ｐ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ以外の元素を含むもの。
以上の絞りこみ後の分子数は６２８，４０２となった。

（２）結合部位の予測
ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１のアセチル化リジン認識ポケットの立体構造情報に基づき、結合部位を予測する。具体的には、アセチル化リジン認識ポケットを形成するアミノ酸残基、すなわち、ＰＤＢＩＤ：１Ｘ０ＪのＴｒｐ２５、Ｐｒｏ２６、Ｇｌｎ２９、Ｐｒｏ３０、Ｖａｌ３１、Ａｓｐ３２、Ｌｙｓ３５、Ｌｅｕ３６、Ｌｅｕ３８、Ｔｙｒ８３、Ａｓｎ８４、Ａｓｐ８８、Ｉｌｅ９０、Ｍｅｔ９３（それぞれ、配列番号１に示すアミノ酸配列の、Ｔｒｐ９７、Ｐｒｏ９８、Ｇｌｎ１０１、Ｐｒｏ１０２、Ｖａｌ０３、Ａｓｐ１０４、Ｌｙｓ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ｌｅｕ１１０、Ｔｙｒ１５５、Ａｓｎ１５６、Ａｓｐ１６０、Ｉｌｅ１６２、Ｍｅｔ１６５に相当する）の原子座標情報を用いた。ＳＰＨＧＥＮにより生成したスフィア(クラスター#1)のうち、ＭＯＥのＡＳＦ第１、３、７位の結合部位を表すダミー原子との中心間距離が４．５オングストローム以内にあるものを選択した。なお、使用したソフトについては、デフォルトのパラメーターを用いている。

（３）１次スクリーニング
Ｄｏｃｋ４．０を用いて、結合サイトについて、先に最適化を行った低分子化合物ライブラリー全体に対してドッキングを行った。このとき、Ｄｏｃｋのｅｎｅｒｇｙｓｃｏｒｅに基づいて低分子化合物をランク付けした。

（４）２次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位１０，０００個について、ＡｕｔｏＤｏｃｋ３．０．５を用いて、詳細なドッキングを行った。その後、ドッキングの際に使用したスフィアから４オングストローム以内にある化合物に絞込み、更に計算が異常終了した分子を除去した結果、最終的に９，９３５個についてドッキング構造を得た。
得られた化合物のうち、△Ｇ（結合自由エネルギー変化）＝−１０．５１、Ｋ_Ｄ＝約２０ｎＭ以下を化合物選定の基準とし、この基準値より高い結合性を有する化合物１，０００個を得た。

（５）目視確認
上記の１，０００化合物から、水溶性、毒性等を考慮して目視により構造上適切な３８化合物を選択し、ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤候補化合物とした。

得られたＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤候補化合物と、ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１の結合を、後記実施例１記載の方法により確認し、最終的には、２種類のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を得た。該２種類のうちの１つが、１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオン（ＣＡＳ登録番号：４３３２４９−３２−２、化学式：Ｃ１７Ｈ１６Ｎ４Ｓ２）であり、化１に示す化学構造を有する。

このようにして得られた１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオンは、ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１と結合し、特にヒトタンパク質ＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１と結合するという機能を有する。また、ＢＲＤ２のブロモドメインとの結合において、アセチル化されたヒストンＨ４と競合するという機能を有する。さらに、ＢＲＤ２のブロモドメインの、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットと結合するという機能を有する。

本発明のＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法は、本発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を用いるものであれば、特に限定されるものではない。本発明のＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法により、ＢＲＤ２とアセチル化されたヒストン、すなわちヒストンＨ４のＫ１２Ａｃとの結合のみを阻害することができるため、簡便かつ効率よく、ＢＲＤ２依存の転写が阻害され、転写機構の解明に寄与することができる。
例えば、培養細胞を用いた通常の実験系において、該培養細胞の培養液にＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を添加することにより、該培養細胞内におけるＢＲＤ２依存の転写を阻害することができる。なお、本発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤は、低分子化合物であるため、タンパク質等の高分子のＢＲＤ２ブロモドメイン結合化合物と異なり、培養液中や組織液中に添加するだけで、簡便に細胞内まで移行することができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

本発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤である１−［２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌｔｈｉｏ）ｅｔｈｙｌ］−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−２−ｔｈｉｏｎｅ（以下、結合剤１と略記する）とＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１（以下、ＢＲＤ２−ＢＤ１と略記する）との結合を、ＳＰＲを用いた方法により解析した。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて測定した。

１．ＢＲＤ２−ＢＤ１の調製
配列番号１に示すアミノ酸配列の７４〜１９４残基のＮ末端側に、配列番号２に示す４０アミノ酸からなるペプチドを付加したペプチドを、無細胞タンパク質合成系により常法に基づき発現させた。該発現したペプチドを、ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて精製・溶出後、ＴＥＶプロテアーゼを用いてＮ末端のタグを切断した。切断処理後、Ｎ末端に７アミノ酸残基の切れ残り配列が付加されているＢＲＤ２−ＢＤ１ペプチド、すなわち、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドが得られた。

２．ＢＲＤ２−ＢＤ１のセンサーチップへの固定
上記切断処理後に得られたＢＲＤ２−ＢＤ１ペプチドを、ＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）に、Ｂｉａｃｏｒｅ社推奨の標準プロトコールに従って、アミンカップリング法により固定した。
具体的には、１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて、ＢＲＤ２−ＢＤ１ペプチドが最終濃度５０μｇ／ｍＬになるように固定化溶液を調製した。その後、アミンカップリング反応：７分、固定化：７分、エタノールアミンによる未反応チップの不活性化：７分のプログラムで、ＢＲＤ２−ＢＤ１ペプチドのセンサーチップへの固定を行った。結合実験の比較対象として、１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）のみを用いた固定化処理を行い、それぞれの結合実験の共鳴値ｒｅｓｏｎａｎｃｅｕｎｉｔ（以下ＲＵ）の補正化に用いた。
ＢＲＤ２−ＢＤ１ペプチドの固定化直後のＲＵ変化量は９，８４７ＲＵであった。ＢＲＤ２−ＢＤ１の分子量が１４，９１６、結合剤１の分子量が３４０．５として、化合物の理論的な結合最大量は２２５ＲＵと算出された。

最終濃度が２０ｍＭとなるように調製した結合剤１のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液を、ＨＢＳ−ＥＰｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いて希釈し、常法に基づきＢｉａｃｏｒｅ３０００を用いてＢＲＤ２−ＢＤ１と結合剤１の結合・解離実験を行った。
具体的には、結合剤１の濃度が０〜８０μＭの範囲で、低濃度から順に、流速１０μＬ／分、結合６０秒、解離６０秒、平衡化１２０秒、の条件で結合測定を行った。なお、解離はＨＢＳ−ＥＰｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒを用いた共鳴値の計時変化観察により行った。それぞれの測定における最大結合値の結果を表１に示す。測定は２回行った。

図１は、８０μＭでの平均結合量を１００％として、各濃度での平均結合量の比を示したものである。横軸は、測定に用いた結合剤１の濃度（Ｍ）の対数値である。
表２は、測定の結果得られた結合値から求めた結合定数を示したものである。解離定数（Ｋ_Ｄ値）は、結合剤１の濃度が１．２５〜２０μＭの範囲で、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）のｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅａｆｆｉｎｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓにより算出した。ＥＣ_５０は、結合剤１の濃度が１．２５〜８０μＭの範囲で、図１に示す結果に基づき算出した。以上の結果から、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いた測定では、ＢＲＤ２−ＢＤ１と結合剤１が結合することが明らかであり、その解離定数はおよそ６．９μＭであることが判明した。

非特許文献４記載の方法に準拠してルシフェラーゼアッセイを行い、結合剤１によるＢＲＤ２依存の転写阻害を確認した。但し、非特許文献４記載の方法では、サイクリンＥプロモーター等のＤＮＡ配列をレポーター遺伝子に挿入しているが、本実施例ではＳＶ４０のプロモーターを用いた。ＢＲＤ２は、プロモーターのＤＮＡ配列を直接認識するＤＮＡ結合タンパク質性の転写活性化因子ではなく、ＤＮＡと複合体化しているヒストンの活性化状態（すなわち、ヒストンＨ４のＫ１２Ａｃ）を認識して転写活性化に働く因子であるため、ＳＶ４０のような強力な転写活性化プロモーターでも同様に機能すると考えられるためである。

ヒトＢＲＤ２全長遺伝子を含有するｈＢＲＤ２プラスミドと、Ｒａｓの活性化型遺伝子を含有するＲａｓＶ１２プラスミドと、リポーター遺伝子を含有するｐＧＬ４．１３−ルシフェラーゼリポータープラスミドを、トランスフェクションした培養細胞の転写活性化の度合いを、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことにより検出した。
具体的には、１２穴細胞培養用プレートにヒト培養細胞のＨｅＬａ細胞に、０．２μｇのｈＢＲＤ２プラスミドと、０．１μｇのＲａｓＶ１２プラスミドと、０．０５μｇのｐＧＬ４．１３−ルシフェラーゼリポータープラスミドの混合プラスミドを、１．５μＬのＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、製造者により推奨される方法に基づきトランスフェクションを行った。コントロールとして、ｈＢＲＤ２プラスミドのみを含有しない混合プラスミドを用いてトランスフェクションを行った。

トランスフェクションから５時間経過後、最終濃度がそれぞれ０、５、１０μＭとなるように結合剤１を細胞培養液に添加し、３０℃、５％ＣＯ_２条件下で２０時間培養した。培養終了後、細胞培養液を全て吸引除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２〜３回細胞を洗浄した後、４００μＬのＧｌｏｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加してライセートを調整した。チューブに１０μＬの該ライセートと５０μＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＩＩを添加し、２、３回懸濁後、ルシフェラーゼ活性を定量した。測定時間は１０秒とした。サンプルは全て４回独立して調製を行った。

図２は、測定結果の平均・標準偏差を示したものである。縦軸はルシフェラーゼの比活性を表している。また、横軸の数値は添加した結合剤１の最終濃度（μＭ）を、＋と−はｈＢＲＤ２プラスミドのトランスフェクションの有無を、それぞれ表している。

以上の結果から、行った測定系では、ＢＲＤ２が６〜７倍の転写活性化能を持つこと、及び、該測定系に対して結合剤１を添加することにより、５〜１０μＭの濃度で２〜３倍にまで転写が抑制されることがわかった。したがって、結合剤１が、ＢＲＤ２依存の転写を阻害することが明らかである。

本発明のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤及びＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法は、ブロモドメインを介したＢＲＤ２の機能解析に利用が可能であるばかりではなく、より効果的な抗癌剤やウィルス感染・増殖阻害剤の開発の分野での利用が期待される。

実施例１における、１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオンとＢＲＤ２のブロモドメインＢＤ１との結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を用いて解析した結果を示したものである。縦軸は、８０μＭでの平均結合量を１００％として、各濃度での平均結合量の比を示したものである。横軸は、測定に用いた結合剤１の濃度（Ｍ）の対数値である。実施例２における、ＢＲＤ２による転写活性化に対する１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオンの阻害効果の測定結果を、ルシフェラーゼ比活性を用いて示したものである。縦軸はルシフェラーゼの比活性を表している。また、横軸の数値は添加した結合剤１の最終濃度（μＭ）を、＋と−はｈＢＲＤ２プラスミドのトランスフェクションの有無を、それぞれ表している。

Claims

ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメイン（ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ）のうち、Ｎ末側のブロモドメインと結合することを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
前記ＢＲＤ２がヒトタンパク質ＢＲＤ２であることを特徴とする請求項１記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインとの結合において、アセチル化されたヒストンＨ４と競合することを特徴とする請求項１又は２記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインの、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットと結合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
１−［２−（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イルチオ）エチル］−１，３−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−チオンを有効成分とすることを特徴とするＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
ＢＲＤ２のタンデム配列された２つのブロモドメインのうち、Ｎ末側のブロモドメインと結合することを特徴とする請求項５記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
前記ＢＲＤ２がヒトタンパク質ＢＲＤ２であることを特徴とする請求項５又は６記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインとの結合において、アセチル化されたヒストンＨ４と競合することを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
前記ＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤が、ＢＲＤ２のブロモドメインの、ヒストンＨ４のアセチル化リジン認識ポケットと結合することを特徴とする請求項５〜８のいずれか記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤。
請求項１〜８のいずれか記載のＢＲＤ２ブロモドメイン結合剤を用いることを特徴とするＢＲＤ２依存の転写を阻害する方法。