JP2002513562A

JP2002513562A - 結晶化可能なｊｎｋ複合体

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Publication number: JP2002513562A
Application number: JP2000547209A
Authority: JP
Inventors: ジャオリンジー，; ヨング，; ウイリアムマークランド，; マイケルエス．ス，; ポールアール．カロン，; エドワードフォックス，; キースピー．ウィルソン，
Original assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-05-04
Filing date: 1999-05-04
Publication date: 2002-05-14
Also published as: WO1999057253A2; WO1999057253A3; EP1076692A2; AU3786899A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＪＮＫ３の活性部位結合ポケットを含む分子および分子複合体の対応する構造座標でコードされるデータ記憶媒体に関する。このようなデータ記憶材料を備えるコンピュータは、このような分子および分子複合体、またはそれらの構造的ホモログを、コンピュータ画面上の三次元画像表示として表示可能である。本発明はまた、同種タンパク質またはタンパク質複合体の構造を解析するための構造座標を使用する方法に関する。さらに、本発明は、ＪＮＫ３またはそのホモログに結合する化合物（阻害化合物を含む）をスクリーニングまたは設計するために構造座標を使用する方法に関する。本発明はまた、ＪＮＫ３の活性部位結合ポケットを含む分子もしくは分子複合体または活性部位結合ポケットの密接な構造的ホモログに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の技術分野）本発明は、ＪＮＫタンパク質、特にＪＮＫ３、およびアデノシン一リン酸の結
晶化可能な複合体に関する。本発明はまた、ＪＮＫ３の活性部位結合ポケットを
含む結晶化された分子および分子複合体の構造座標でコードされるデータ記憶媒
体に関する。このようなデータ記憶材料を含むコンピュータは、このような分子
および分子複合体、またはそれらの構造的ホモログを、コンピュータ画面上に三
次元画像表示として表示可能である。本発明はまた、同種タンパク質またはタン
パク質複合体の構造を解析するための構造座標を使用する方法に関する。さらに
、本発明は、ＪＮＫ３またはそのホモログに結合する化合物（阻害化合物を含む
）をスクリーニングまたは設計するために構造座標を使用する方法に関する。

【０００２】（発明の背景）哺乳動物細胞は、分裂促進物質活性化タンパク（ＭＡＰ）キナーゼファミリー
のメンバーによって媒介される、シグナル伝達カスケードを活性化することによ
って、細胞外刺激に応答する。このキナーゼファミリーは、細胞外シグナル調節
キナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、およびｃ−ＪｕｎＮ−末端キ
ナーゼ（ＪＮＫ）を含む。ＭＡＰキナーゼは、活性ループにおけるＴｈｒ−Ｘ−
Ｔｙｒセグメントでのスレオニンおよびチロシンの二重のリン酸化によって活性
化される、セリン／スレオニンキナーゼである。ＭＡＰキナーゼは、種々の基質
をリン酸化し、それらには転写因子が含まれ、この転写因子は、次には、遺伝子
の特定のセットの発現を調節して、従って刺激に対する特定の応答を媒介する。

【０００３】３つの異なる遺伝子Ｊｎｋ１、Ｊｎｋ２、Ｊｎｋ３が同定され、少なくとも１
０の異なるＪＮＫのスプライシングアイソフォームが哺乳動物細胞中に存在する
（Ｓ．Ｇｕｐｔａら、ＥＭＢＯＪ．、１５、２７６０−２７７０頁（１９９６
））。ＪＮＫキナーゼのメンバーは、プロ炎症性のサイトカイン腫瘍壊死因子α
およびインターロイキン１βならびに環境ストレス（例えば、アニソマイシン、
ＵＶ放射、低酸素、および浸透圧ショック）によって活性化される（Ａ．Ｍｉｎ
ｄｅｎら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、１
３３３、Ｆ８５−Ｆ１０４（１９９７））。ＭＡＰキナーゼのＪＮＫサブグルー
プの調節および機能。ＪＮＫの下流基質は、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｅｌｋ１
、ｐ５３、および細胞死ドメインタンパク質（ＤＥＮＮ）を含む（Ｙ．Ｚｈａｎ
ｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、２５８６−２５
９１頁（１９９８））。各々のＪＮＫアイソフォームは、これらの基質に異なる
アフィニティーで結合し、このことは、インビボにおける異なるＪＮＫの基質特
異性によるシグナル伝達経路の調節を示唆する（Ｓ．Ｇｕｐｔａら、１９９６）
。

【０００４】ＪＮＫ１およびＪＮＫ２は、種々の組織において広範に発現される。対照的に
、ＪＮＫ３は、脳において選択的に発現され、、そしてより低い程度では心臓お
よび精巣において発現される（Ｓ．Ｇｕｐｔａら、（１９９６）；Ａ．Ａ．Ｍｏ
ｈｉｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、１４、６７−７８頁（１９９５）；Ｊ．Ｈ．Ｍａｒｔ
ｉｎら、ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．３５、４７−５７
頁（１９９６））。成体ヒト脳において、ＪＮＫ３発現は、海馬のＣＡ１領域、
ＣＡ４領域、および鉤状回領域における、ならびに新皮質の第３層および第５層
における錐体ニューロンの亜集団に局在する（Ａ．Ａ．Ｍｏｈｉｔら、（１９９
５））。急性低酸素症の患者のＣＡ１ニューロンは、正常な患者の脳組織由来の
海馬ニューロンの、最小の拡散した細胞質染色と比較して、強力な核のＪＮＫ３
免疫反応性を示した（Ｙ．Ｚｈａｎｇら、（１９９８））。さらに、ＪＮＫ３は
、アルツハイマー病の脆弱なニューロンと免疫化学的に同時局在する（Ａ．Ａ．
Ｍｏｈｉｔら、（１９８５））。ＪＮＫ３遺伝子の破壊は、興奮毒性グルタミン
酸レセプターアゴニストであるカイニン酸に対するマウスの抵抗性を引き起こし
、これらには、発作活性、ＡＰ−１転写活性、および海馬ニューロンのアポトー
シスに対する影響が含まれ、このことは、ＪＮＫ３シグナル伝達経路が、グルタ
ミン酸神経毒性の病原性における重要な成分であることを示す（Ｄ．Ｄ．Ｙａｎ
ｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３８９、８６５−８７０頁（１９９７））。従って、ＪＮ
Ｋ３活性の選択的調節は、発作およびてんかんのような神経変性疾患のための治
療的介入を潜在的に提供し得る。

【０００５】種々のＪＮＫについての遺伝子が単離されてきており、そしてそのアミノ酸配
列が既知であるという事実にも関わらず、誰一人としてＪＮＫのいずれかのＸ線
結晶座標情報を記載していない。このような情報は、種々のＪＮＫの潜在的なイ
ンヒビター（これは、次には、治療的な有用性を有し得る）を同定および設計す
ることにおいて非常に有用である。

【０００６】（発明の要旨）出願人らは、初めて、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰとの複合体であるリン酸化されてい
ないＪＮＫ３を含む結晶化可能な組成物、および得られる結晶を提供することに
よってこの問題を解決した。その結晶は、２．３Åの分解能で分解された。この
結晶構造を解析することにより、出願人らは、ＪＮＫ３の鍵となる構造的な特色
、特にその基質結合部位の形状を決定することが可能となった。

【０００７】本発明はまた、ＪＮＫ３結合部位の構造座標を含む機械読みとり可能な記憶媒
体を提供する。これらのデータでコードされたこのような記憶媒体は、適切なソ
フトウェアを用いてプログラムされたコンピュータによって読みとられかつ利用
された場合に、このような結合部位もしくは類似の形状の相同な結合ポケットを
含む分子または分子複合体の三次元的画像表示を、コンピュータの画面または同
様の視覚化デバイス上に表示する。

【０００８】本発明はまた、上述の結合部位に結合する化合物、ならびにこのような方法に
よって産生される化合物を、設計、評価、および同定するための方法を提供する
。このような化合物は、ＪＮＫ３またはそのホモログの潜在的なインヒビターで
ある。

【０００９】本発明はまた、ＪＮＫ３、特にＪＮＫ１、ＪＮＫ２、および他のＪＮＫアイソ
フォームと少なくともいくつかの構造的に類似の特徴を含む、分子または分子複
合体の三次元構造の少なくとも一部を決定するための方法を提供する。このこと
は、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰとの複合体中のリン酸化されていないＪＮＫ３について
得られた、少なくともいくつかの構造的座標を用いることによって達成される。

【００１０】本発明はまた、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰとの複合体中のリン酸化されていないＪＮ
Ｋ３を結晶化するための方法を提供する。

【００１１】（発明の詳細な説明）以下の略号を、本願を通して使用する。

【００１２】

【化１】必要な場合、さらなる定義を本明細書中に示す。

【００１３】本明細書中に記載される発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な
説明を示す。

【００１４】１つの実施態様に従って、本発明は、アデノシン一リン酸と複合体化したリン
酸化されていないＪＮＫタンパク質を含む結晶化可能な組成物を提供する。本発
明の結晶化可能な複合体中のＪＮＫタンパク質は、それがＪＮＫ３またはＪＮＫ
３改変体（ＪＮＫ１またはＪＮＫ２に対した場合）である場合、Ｎ末端で切断さ
れなければならない。詳細には、ＪＮＫ３タンパク質は、ＪＮＫ１およびＪＮＫ
２タンパク質と比較した場合、約４０アミノ酸のＮ末端伸長を含む（ＪＮＫ１、
ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３タンパク質およびそれらのアイソフォームについての
ＧｅｎＢａｎｋ登録を参照のこと）。それらの４０アミノ酸は、本発明の結晶化
可能な組成物中のＪＮＫ３タンパク質から除去されなければならない。

【００１５】さらに、これらの結晶化可能な組成物中の任意のＪＮＫタンパク質は、好まし
くは、約２０アミノ酸のＣ末端切断を有する。本発明者らは、Ｃ末端切断が回折
質の結晶を得るのに必要であることを見出した。

【００１６】これらの組成物における第２の成分は、非加水分解性ＡＴＰアナログまたは自
殺基質である。本発明の結晶化可能な組成物において有用な非加水分解性ＡＴＰ
アナログとしては、ＡＭＰ−ＰＣＨ₂Ｐ、ＡＭＰ−ＰＳＰおよびＡＭＰ−ＰＮＰ
が挙げられる。自殺基質の例は、ＦＳＢＡである。好ましくは、本発明の結晶化
可能な組成物は、基質としてＡＭＰ−ＰＮＰを含む。第３の成分は、マグネシウ
ムイオンである。Ｍｇは、非加水分解性ＡＴＰアナログまたは自殺基質を、ＪＮ
Ｋタンパク質とのインキュベーションの前に、ＭｇＣｌ₂とインキュベートする
ことによって導入され得る。

【００１７】本発明者らはまた、この組成物の緩衝液条件が、結晶化に重要であることを決
定した。従って、本発明の結晶化可能な組成物はまた、約１０〜３０％ｖ／ｖ
の間のポリエチレングリコールモノメチルエーテル、約５〜２０％ｖ／ｖの間
のエチレングリコール、還元剤（例えば、約５〜５０ｍＭの間のβ−メルカプト
エタノール）、および約７．０〜７．５の間のｐＨを維持する緩衝液を含む。好
ましくは、この緩衝液は、ｐＨ７．０の１００ｍＭＨｅｐｅｓである。

【００１８】本発明はまた、ＭｇとのＪＮＫタンパク質複合体および非加水分解性ＡＴＰア
ナログまたは自殺基質の結晶に関する。これらの結晶は、標準的な結晶化プロト
コルにより上記の組成物から得られる。

【００１９】本発明はまた、ＪＮＫ含有結晶を作製する方法に関する。このような方法は、
以下の工程：ａ）上記のように、Ｍｇと複合体化されたＪＮＫタンパク質および非加水分解
性ＡＴＰアナログまたは自殺基質を含む結晶化可能な組成物を得る工程；ならび
にｂ）この組成物を、結晶化を促進する条件に供する工程、を包含する。

【００２０】上記の各実施態様において、ＪＫＮタンパク質が、ＪＮＫ３、そして特にＪＮ
Ｋ３α１であることが好ましい。

【００２１】上記のように、出願人は、ＪＮＫ３α１の三次元Ｘ線結晶構造を解析した。原
子座標データを図１に示す。

【００２２】ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ複合体もしくはその結合ポケットの１つまたは
それらのホモログについて生成された構造座標を使用するために、それらを三次
元形状に変換するのにしばしば時間が必要である。これは、構造座標のセットか
ら分子またはその部分の三次元構造を図示し得る市販のソフトウェアの使用によ
り達成される。

【００２３】結合ポケットはまた、本発明において結合部位と呼ばれ、薬物発見のような分
野において有意に有用である。天然のリガンドまたは基質と、それらの対応する
レセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合は、多くの生物学的作用機構の基
礎である。同様に、多くの薬物は、レセプターおよび酵素の結合ポケットとの会
合を通じて、その薬物の生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケ
ットの全てまたは任意の部分とで生じ得る。このような会合の理解は、薬物の標
的レセプターまたは酵素とのより好ましい会合、従って、改善された生物学的効
果を有する薬物の設計へと導くのを補助する。従って、この情報は、生物学的に
重要な標的の結合部位の強力なインヒビターを設計する際に価値がある。

【００２４】本明細書中で使用される場合、用語「結合ポケット」とは、その形状の結果と
して、別の化学的実体または化合物との好ましく会合する、分子または分子複合
体の領域をいう。

【００２５】用語「ＪＮＫ３様結合ポケット」とは、形状が共通のリガンドを結合するよう
にＪＮＫ３結合ポケットと十分類似している、分子または分子複合体の一部分を
いう。この形状の共通点は、１．５Å以下の、ＪＮＫ３中の結合ポケットを構成
するアミノ酸の骨格原子の構造座標（図１に示すように）から根二乗平均偏差に
より規定される。この計算を実行する方法は以下に記載される。

【００２６】ＪＮＫ３の「活性部位結合ポケット」または「活性部位」とは、ヌクレオチド
基質が結合するＪＮＫ３酵素表面上の面積をいう。ＭｇＡＭＰ−ＰＭＰとの複合
体におけるリン酸化されていないＪＮＫ３α１の結晶構造を解析する際、出願人
は、ＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、Ａｌ
ａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌ
ｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ
１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙｓ１
９１、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６およびＬｅｕ２０６が、Ｍｇ
ＡＭＰ−ＰＮＰの５Å以内であり、従って、相互作用するのに十分密接している
ことを決定した。従って、図１に示されるように、それらのアミノ酸の構造座標
によって規定される結合ポケット；または１．５Å以下の、それらのアミノ酸の
骨格原子の構造座標からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットは、本発明のＪ
ＮＫ３様結合ポケットと見なされる。

【００２７】出願人はまた、上に示されるＪＮＫ３アミノ酸に加え、Ｉｌｅ７７、Ｃｙｓ７
９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１
０４、Ａｒｇ１０７、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１４５、Ｌｅｕ１５
３、Ｃｙｓ１５４、Ａｐ１８９、Ｐｒｏ１９２、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９７、
Ｌｙｓ２０４およびＡｓｐ２０７は、結合されたＭｇＡＭＰ−ＰＮＰの８Å以内
であり、故にまた、その基質と相互作用するのに十分密接していることを決定し
た。従って、好ましい実施態様において、図１に示されるように、結合されたＭ
ｇＡＭＰ−ＰＮＰの８Å以内のアミノ酸の構造座標によって規定される結合ポケ
ット；または１．５Å以下の、それらのアミノ酸の骨格原子の構造座標からの根
二乗平均偏差を有する結合ポケットは、本発明の好ましいＪＮＫ３様結合ポケッ
トと見なされる。

【００２８】ＪＮＫの他のアイソフォームにおけるアミノ酸の番号付けが、ＪＮＫ３α１に
ついて示されるものとは異なり得ることは、当業者に容易に明らかである。ＪＮ
Ｋの他のアイソフォーム中の対応するアミノ酸は、アミノ酸配列の目視検査によ
るか、市販の相同性ソフトウェアプログラムを用いることによって、容易に同定
される。

【００２９】ＪＮＫ３α１のそれらの各アミノ酸は、図１に示される構造座標のセットによ
って規定される。用語「構造座標」とは、結晶形態のタンパク質もしくはタンパ
ク質−リガンド複合体の原子（散乱中心）によるＸ線の単色放射の回折において
、得られるパターンに関連した数式から導かれる直交座標をいう。回折データを
用いて、結晶の反復単位の電子密度マップを算出する。次いで、この電子密度マ
ップを用いて、酵素または酵素複合体の個々の原子の位置を確立する。

【００３０】当業者は、酵素または酵素複合体あるいはそれらの一部分についての構造座標
のセットが、三次元における形状を規定する点の相対セットであることを理解す
る。従って、全体的に異なる座標のセットが類似の形状または同一の形状を規定
し得ることが可能である。さらに、個々の座標におけるわずかな変化は、全体の
形状にほとんど影響を与えない。結合ポケットに関して、これらの変化は、それ
らのポケットと会合し得るリガンドの性質を有意に変化させるとは予期されない
。

【００３１】用語「と会合する」とは、化学的実体もしくは化合物またはそれらの一部分と
、タンパク質上の結合ポケットまたは結合部位との間の近接状態をいう。この会
合は、非共有結合であり得る（ここで、その近位は、好ましい水素結合またはフ
ァンデルワールス相互作用もしくは静電気的相互作用によってエネルギー的に片
寄っている）か、または共有結合であり得る。

【００３２】ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ構造座標の数学的操作のため、上記の座標にお
ける変化が生じ得る。例えば、図１に示される構造座標は、構造座標の結晶学的
順列、構造座標の分画化、構造座標のセットへの整数値の加算または減算、構造
座標の反転、あるいは上記の任意の組み合わせにより操作され得る。

【００３３】あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換および／または欠失に起因する結晶構
造における改変、あるいは結晶を構成する成分のいずれかにおける他の変化もま
た、構造座標の変化の原因であり得る。そのような改変が、もとの座標と比較し
て許容標準誤差内であるならば、得られた三次元の形状は、同じであるとみなす
。従って、例えば、ＪＮＫ３の活性部位結合ポケットに結合したリガンドはまた
、その構造座標が、許容誤差内である形状を規定する、別の結合ポケットに結合
すると予測される。

【００３４】従って、種々のコンピューター解析は、分子またはその結合ポケット部分が上
記のＪＮＫ３結合ポケットと十分類似しているか否かを決定する必要がある。そ
のような解析は、周知のソフトウェアアプリケーション（例えば、ＱＵＡＮＴＡ
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）ｖｅｒｓｉｏｎ４．１のＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｉｌａｒｉｔ
ｙアプリケーション）において、そして添付の使用者ガイドに記載されるように
実行され得る。

【００３５】ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションは、異なる構造
、同じ構造の異なる配座、および同じ構造の異なる部分の間の比較を可能にする
。構造を比較するためにＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｉｌａｒｉｔｙにおいて使
用される手順は、４つの工程に分けられる：１）比較すべき構造をロードする；
２）これらの構造における原子等価性を規定する；３）適合操作を実行する；な
らびに４）結果を解析する。

【００３６】各構造は、名称によって同定される。ある構造が標的として同定される（すな
わち、固定構造）；すべての残りの構造は作業構造（ｗｏｒｋｉｎｇｓｔｒｕ
ｃｒｅ）である（すなわち、可動構造（ｍｏｖｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅ））
。ＱＵＡＮＴＡ内の原子等価性は、使用者の入力により規定されるので、本発明
の目的については、本発明者らは、比較する２つの構造の間の全ての保存された
残基についてタンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、ＣおよびＯ）と等価な原子を規定
する。本発明者らはまた、強固に適合した（ｒｉｇｉｄｆｉｔｔｉｎｇ）操作
のみを考慮する。

【００３７】強固に適合した操作を用いる場合、作業構造は、標的構造との最適な適合を得
るために、翻訳および回転される。この適合操作は、可動構造に適用されるべき
最適翻訳および回転を、等価な原子の特定の対にわたる適合の根二乗平均差異が
絶対最小値であるように計算するアルゴリズムを使用する。その結果、この数は
、オングストロームで規定され、ＱＵＡＮＴＡにより報告される。

【００３８】本発明の目的のために、任意の分子または分子複合体、あるいはそれらの結合
ポケット（これは、図１に列挙された構造座標により記載された関連の骨格原子
で重ね合せた場合、１．５Å未満の保存された残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、
Ｏ）の根二乗平均偏差を有する）は、同一であると考えられる。より好ましくは
、根二乗平均偏差は、１．０Å未満である。

【００３９】用語「根二乗平均偏差」とは、平均からの偏差の二乗の平均の二乗根を意味す
る。傾向または対象からの偏差または変動を表す方法である。本発明の目的のた
めに、この「根二乗平均偏差」は、本明細書中に記載されるＪＮＫ３の構造座標
により規定されるようなＪＮＫ３またはそれらの結合ポケット部分の骨格からの
タンパク質の骨格における変動を規定する。

【００４０】従って、本発明の別の実施態様に従って、機械が読み取り可能なデータ記憶媒
体が提供される。これは、機械が読み取り可能なデータでコードされたデータ記
憶マテリアルを含む。このデータを用いるための説明書と共にプログラムされた
機械によって使用される場合、図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７８、Ｇｌ
ｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖａ
ｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６
、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、
Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙｓ１９１、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖ
ａｌ１９６およびＬｅｕ２０６の構造座標により規定される結合ポケットを含む
分子もしくは分子複合体、またはこの分子もしくは分子複合体のホモログ（ここ
でこのホモログは、１．５Å以下の、このアミノ酸骨格の原子からの根二乗平均
偏差を有する結合ポケットを含む）の三次元図面表示を提示する。

【００４１】好ましくは、機械読取り可能なデータは、このデータを用いるための指示でプ
ログラムされた機械により用いられる場合、図１に記載の、ＪＮＫ３アミノ酸Ｉ
ｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２，Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇ
ｌｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａ
ｌａ９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、
Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖ
ａｌ１４５、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓ
ｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ
１５５，Ａｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１
９４、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０
６およびＡｓｐ２０７の構造座標により規定される結合ポケットを含む分子また
は分子複合体、またはこの分子もしくは分子複合体のホモログの、３次元画像表
示を提示する。ここで、このホモログは、このアミノ酸の骨格原子から１．５Å
以下の根平均二乗偏差を有する結合ポケットを含む。

【００４２】なおより好ましいのは、図１の全てのアミノ酸の構造座標により規定される分
子もしくは分子複合体、またはこの分子もしくは分子複合体のホモログの、３次
元画像表示を提示し得る機械読取り可能なデータ記憶媒体である。ここでこのホ
モログは、図１のすべてのアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏
差を有する。

【００４３】別の実施態様に従って、機械読取り可能なデータ記憶媒体は、図１に記載の構
造座標のフーリエ変換を含む機械読取り可能なデータの第１のセットでコードさ
れるデータ記憶材料を備える。そしてこれは、このデータを用いるための命令で
プログラムされた機械を用いる場合、分子または分子複合体のＸ線回析パターン
を含む機械読取り可能なデータの第２セットと組み合わせられて、機械読取り可
能なデータの第２のセットに対応する構造座標の少なくとも一部を決定し得る。

【００４４】例えば、図１に記載の構造座標のフーリエ変換は、他のＪＮＫ（例えば、ＪＮ
Ｋ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ１、ＪＮＫ２またはＪＮＫ３のアイソフォーム）
の構造座標の少なくとも一部を決定するために用いられ得る。

【００４５】図６は、これらの実施態様の１つのバージョンを実証する。システム１０は、
中央演算処理装置（「ＣＰＵ」）２０、ワーキングメモリ２２（例えば、ＲＡＭ
（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得る）、大量記憶メモ
リ２４（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブ）、
１つ以上の陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１つ以上のキーボー
ド２８、１つ以上の入力ライン３０、および１つ以上の出力ライン４０を備える
コンピューター１１を含む。これらすべては、従来の双方向性システムバス５０
により相互接続されている。

【００４６】入力ライン３０によりコンピューター１１に連結された入力ハードウエア３６
は、種々の手段で実行され得る。本発明の機械読取り可能なデータは、電話線ま
たは専用のデータライン３４により接続されたモデム３２の使用を介して入力さ
れ得る。あるいは、またはさらに、この入力ハードウエア３６は、ＣＤ−ＲＯＭ
ドライブまたはディスクドライブ２４を備え得る。ディスプレイ端末２６と組み
合わせて、キーボード２８はまた、入力デバイスとして用いられ得る。

【００４７】出力ライン４０によりコンピューター１１に接続される出力ハードウエア４６
は、同様に、従来のデバイスにより実現され得る。例として、出力ハードウエア
４６は、本明細書において記載されるように、ＱＵＡＮＴＡのようなプログラム
を用いて、本発明の結合ポケットの画像表示を提示するために、ＣＲＴディスプ
レイ端末２６を備え得る。出力ハードウエアはまた、ハードコピー出力が作製さ
れ得るようにプリンター４２を、または後の使用のためにシステム出力を記憶す
るためにディスクドライブ２４を備え得る。

【００４８】演算において、ＣＰＵ２０は、種々の入力および出力デバイス３６、４６の使
用を調和し、大容量記憶装置２４からのデータアクセスならびにワーキングメモ
リ２２へのアクセスおよびワーキングメモリ２２からのアクセスを調和し、そし
てデータ処理工程の配列を決定する。多数のプログラムが、本発明の機械読取り
可能なデータを処理するために用いられ得る。このようなプログラムは、本明細
書において記載されるように薬物開発のコンピューター的な方法に関して考察さ
れる。ハードウエアシステム１０の構成要素に対する特定の言及は、データ記憶
媒体の以下の記載を通じて適切なように含まれる。

【００４９】別の実施態様に従って、本発明は、分子または分子複合体、あるいはこの分子
または分子複合体のホモログの、３次元提示を作製するためのコンピューターを
提供する。ここでこの分子または分子複合体は、図１に記載の、Ｉｌｅ７０、Ｇ
ｌｙ７１、Ｓｅｒ７２，Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖ
ａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４
６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１
、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙｓ１９１、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、
Ｖａｌ１９６およびＬｅｕ２０６により規定される結合ポケットを含む。ここで
、このホモログは、このアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差
を有する結合ポケットを含む。ここでこのコンピューターは、以下を備える：（ａ）機械読取り可能なデータでコードされるデータ記憶材料を含む機械読取
り可能なデータ記憶媒体であって、ここでこの機械読取り可能なデータは、ＪＮ
Ｋ３またはその部分の構造座標を含む、データ記憶媒体（ｂ）この機械読取り可能なデータを処理するための記憶命令のためのワーキ
ングメモリ；（ｃ）この機械読取り可能なデータをこの３次元表示に処理するために、この
ワーキングメモリおよびこの機械読取り可能なデータ記憶媒体に連結された中央
演算処理装置；および（ｄ）この３次元表示を受け取るための、この中央演算処理装置に連結された
出力ハードウエア。

【００５０】好ましくは、このコンピューターは、分子または分子複合体、あるいはこの分
子または分子複合体のホモログの３次元表示を作製する。ここでこの分子または
分子複合体は、図１に記載の、ＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅ
ｒ７２，Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａ
ｌ７８、Ｃｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌａ９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙ
ｓ９３、Ｌｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１１１
、Ｉｌｅ１２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１４５、Ｍｅｔ１４６、
Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａ
ｓｎ１５２、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１５５，Ａｓｐ１８９、Ｌｙ
ｓ１９１、Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ
１９６、Ｖａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６およびＡｓｐ２０７の構造
座標により規定される結合ポケットにより規定される結合ポケットを含む。ここ
で、このホモログは、このアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏
差を有する結合ポケットを含む。

【００５１】図７は、図６のシステム１０のようなシステムにより実行され得る機械読取り
可能なデータでコードされ得る磁性データ記憶媒体１００の断面を示す。媒体１
００は、適切な基板１０１（従来型であり得る）および適切なコーティング１０
２（従来型であり得る、片側または両側）を備える、従来のフロッピーディスケ
ットまたはハードディスクであり得る。これは、その極性または配向が磁気的に
変化され得る磁性ドメイン（可視でない）を備える。媒体１００はまた、ディス
クドライブまたは他のデータ記憶デバイス２４のスピンドルを受けるための開口
（示さず）を有し得る。

【００５２】媒体１００のコーティング１０２の磁性ドメインは、図６のシステム１０のよ
うなシステムによる遂行のために、従来型で、本明細書に記載されるデータのよ
うな機械読取り可能なデータであり得る様式でコードするように分極または配向
される。

【００５３】図８は、このような機械読取り可能なデータでまたコードされ得る光学的に解
読可能なデータ記憶媒体１１０の断面、または図６のシステム１０のようなシス
テムにより実行され得る命令のセットを示す。媒体１１０は、従来のコンパクト
ディスク読取り専用のメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）または、光学的に読取り可能なそ
して、光磁気的に書き込み可能な光磁気ディスクのような書き換え可能な媒体で
あり得る。媒体１００は、好ましくは、適切な基板１１１（これは、従来型であ
り得る）、および適切なコーティング１１２（これは従来型であり得、通常基板
１１１の片側である）を有する。

【００５４】ＣＤ−ＲＯＭの場合、周知のように、コーティング１１２は、反射性であり、
機械読取り可能なデータをコードするように複数のピット１１３で印加される。
ピットの配置は、コーティング１１２の表面のレーザー光を反射することにより
読み取られる。保護コーティング１１４（好ましくは、実質的に透明）は、コー
ティング１１２の最上層に提供される。

【００５５】光磁気ディスクの場合、周知のように、コーティング１１２は、ピット１１３
を有さないが、特定の温度を超えて（レーザーによって）加熱された場合に極性
または配向が磁気的に変化され得る磁性ドメインの極性を有する（示さず）。こ
のドメインの配向は、コーティング１１２から反射されるレーザー光の分極を測
定することにより読み取られ得る。このドメインの配列は上記のようにデータを
コードする。

【００５６】従って、本発明に従って、ＪＮＫ３およびその部分ならびにその構造的に類似
のホモログの３次元構造を表示し得るデータは、この構造の３次元画像表示を提
示し得る、機械読取り可能な記憶媒体に記憶される。

【００５７】ＪＮＫ３のＸ線座標データは、その座標をＪＮＫ３の３次元構造に変換するた
めのソフトウエアでプログラムされたコンピューターと組み合わせて用いられた
場合、薬物の発見のような種々の目的のために用いられ得る。

【００５８】例えば、このデータによりコードされる構造は、それが化学的実体と会合する
可能性についてコンピューター上で評価され得る。ＪＮＫ３と会合する化学的実
体は、ＪＮＫ３を阻害し得、そして潜在的な薬物候補である。あるいは、このデ
ータによりコードされる構造は、コンピュータースクリーン上で３次元画像表示
で表示され得る。これは、構造の視覚的な検査、および化学的実体とのこの構造
の会合の視覚的検査を可能にする。

【００５９】従って、別の実施態様に従って、本発明は、図１に記載の、ＪＮＫ３アミノ酸
Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２，Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、
Ｇｌｙ７６、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２
４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０
、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５，Ｌｙｓ１９１、Ｓｅｒ１９３、
Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６およびＬｅｕ２０６の構造座標により規定される結
合ポケットを含む分子または分子複合体、あるいはこの分子もしくは分子複合体
のホモログと会合する化学的実体の可能性を評価するための方法に関する。ここ
で、このホモログは、このアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏
差を有する結合ポケットを含む。

【００６０】この方法は、以下の工程を包含する：ａ）化学的実体と分子または分子複合体
の結合ポケットとの間の一致操作を実施するためにコンピューター上の手段を使
用する工程；ｂ）化学的実体と結合ポケットとの間の会合を定量するためこの一
致操作の結果を分析する工程；およびｃ）以前に記載されているように、ＣＲＴ
ディスプレイ端末、プリンターまたはディスクドライブのような適切な出力ハー
ドウエアに対して、この定量された会合を出力する工程。用語「化学的実体」は
、本明細書において用いる場合、化学的な化合物、少なくとも２つの化学的化合
物の複合体、およびこのような化合物または複合体のフラグメントをいう。

【００６１】好ましくは、この方法は、、図１に記載の、ＪＮＫ３アミノ酸のＩｌｅ７０、
Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２，Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、
Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌａ９１、
Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａｒｇ１０
７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１４５
、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、
Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１５５，Ａ
ｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｉｌ
ｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６およびＡ
ｓｐ２０７の構造座標により規定される結合ポケットを含む分子または分子複合
体、またはこの分子もしくは分子複合体のホモログに対して、化学的実体が会合
する可能性を評価する。ここで、このホモログは、このアミノ酸の骨格原子から
１．５Å以下の根平均二乗偏差を有する結合ポケットを含む。

【００６２】なおより好ましくは、この方法は、化学的実体が、図１に記載のような、全て
のＪＮＫ３アミノ酸（このアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏
差を有する）の構造座標により規定される分子または分子複合体またはこの分子
もしくは分子複合体のホモログと、会合する可能性を評価する。

【００６３】あるいは、ＪＮＫ３結合ポケットの構造座標は、ＪＮＫ３様結合ポケットを含
む分子の潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための方法におい
て利用され得る。この方法は、以下の工程を包含する：ａ．ＪＮＫ３様結合分子を含む分子の３次元構造を作製するための（図１に記
載のＩｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２，Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７
５、Ｇｌｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌｕ１
１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４
９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙｓ１９１
、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６、およびＬｅｕ２０６の原子座標
）±（１．５Å以下のこのアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差）を使用す
る工程；ｂ．この潜在的アゴニストまたはアンタゴニストを設計または選択するため、
この３次元構造を使用する工程；ｃ．このアゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程；およびｄ．この潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストがこの分子と相互作用する
能力を決定するために、このアゴニストまたはアンタゴニストを、この分子に接
触させる工程。

【００６４】より好ましいのは、（図１に記載のＩｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２，Ｇ
ｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃ
ｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌａ９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌ
ｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１
２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１４５、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４
７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２
、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１５５，Ａｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、
Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖ
ａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６およびＡｓｐ２０７の原子座標）±（
１．５Å以下のこのアミノ酸の骨格原子からの根平均二乗偏差）が、ＪＮＫ３様
結合ポケットを含む分子の３次元構造を作製するために用いられる場合である。

【００６５】最も好ましいのは、（図１に記載のＪＮＫ３の全てのアミノ酸の原子座標）±
（このアミノ酸の骨格原子から１．５Å以下の根平均二乗偏差）が、ＪＮＫ３様
結合ポケットを含む分子の３次元構造を作製するために用いられる場合である。

【００６６】最初の場合、本発明は、ＪＮＫ３様結合ポケットに結合し得る、化学的実体（
阻害的化合物を含む）を同定、選択および設計するための分子設計技術の使用を
可能にする。

【００６７】出願人の、ＪＮＫ３上の結合部位の解明は、全体または部分的に、ＪＮＫ３様
結合ポケットと相互作用し得る新しい化学的実体および化合物を設計するために
必要な情報を提供する。

【００６８】この節を通じて、ＪＮＫ３様結合ポケットに結合、会合またはそれを阻害する
実体の能力についての考察は、実体単独の特徴をいう。化合物がＪＮＫ３に結合
するか否かを決定するためのアッセイは、当該分野で周知であり、そして以下に
例示される。

【００６９】本発明によるＪＮＫ３様結合ポケットに結合またはこれを阻害する化合物の設
計は、一般に、２つの因子の考慮を含む。第１に、この実体は、ＪＮＫ３様結合
ポケットの部分または全てと物理的にそして構造的に会合し得なければならない
。この会合において重要な非共有的な分子の相互作用としては、水素結合、ファ
ンデルワールス相互作用、疎水性相互作用および静電相互作用が挙げられる。

【００７０】第２に、この実体は、ＪＮＫ３様結合ポケットと直接会合することを可能にす
るコンフォメーションを想定され得なければならない。この実体の特定の部分は
、直接これらの会合に参加しない。この実体のその部分は、この分子の全体的な
コンフォメーションになお影響し得る。次に、これは、効力に有意な影響を有し
得る。このようなコンフォメーションの要件は、３次元構造全体および結合ポケ
ットの部分の全体または部分に関する化学的実体の配向性、またはＪＮＫ３様結
合ポケットと直接相互作用するいくつかの化学的実体もしくはそのホモログを含
む実体の官能基の間の間隔を含む。

【００７１】ＪＮＫ３様結合ポケットに対する化学的実体の潜在的阻害効果または結合効果
は、コンピュータモデリング技術の使用によってその実際の合成および試験の前
に分析され得る。所定の実体の理論的構造が、所定の実体とＪＮＫ３様結合ポケ
ットとの間での不完全な相互作用および会合を示唆する場合、この実体の試験が
排除される。しかし、コンピュータモデリングが、強力な相互作用を示す場合、
この分子は、合成され、そしてＪＮＫ３様結合ポケットに結合するその能力につ
いて試験され得る。このことは、この分子が、実施例６に記載されるアッセイを
用いてＪＮＫ３を阻害する能力を試験することによって達成され得る。この様式
で、効力のない化合物の合成が回避され得る。

【００７２】ＪＮＫ３様結合ポケットの潜在的インヒビターは、化学的実体またはフラグメ
ントが、ＪＮＫ３様結合ポケットと会合する能力についてスクリーニングおよび
選択される一連の工程によってコンピュータによって評価され得る。

【００７３】当業者は、いくつかの方法のうちの１つを用いて、ＪＮＫ３様結合ポケットと
会合する能力について化学的実体またはフラグメントをスクリーニングし得る。
このプロセスは、例えば、図１におけるＪＮＫ３様構造の座標または機械が読み
取り可能な記録媒体から作製した類似の形態を規定する他の座標に基づくコンピ
ュータスクリーニングにおけるＪＮＫ３様結合ポケットの目視検査によって開始
し得る。次いで、選択されるフラグメントまたは化学的実体は、上記に規定した
ような結合ポケット内に種々の配向で、すなわち、ドッキングされて、配置され
得る。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを用
い、続いて標準的な分子力学力場を用いたエネルギーの最小化および分子動力学
（例えば、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲ）を用いて達成され得る。

【００７４】特化されたコンピュータプログラムはまた、フラグメントまたは化学的実体を
選択するプロセスを補助し得る。これらには以下が含まれる：１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ、「ＡＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ
ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＥｎｅｒｇｅｔｉｃ
ａｌｌｙＦａｖｏｒａｂｌｅＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓｏｎＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｌｙＩｍｐｏｒｔａｎｔＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ
．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，８４９−８５７頁（１９８５））。ＧＲＩＤは、
ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である
。２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら、「ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙＭａ
ｐｓｏｆＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅｓ：ＡＭｕｌｔｉｐｌｅＣｏｐｙ
ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＳｅａｒｃｈＭｅｔｈｏｄ．」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ
：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，１１，
２９−３４頁（１９９１））。ＭＣＳＳは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａ
ｔｉｏｎｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ＤｏｃｋｉｎｇｏｆＳｕｂｓｔｒａｔｅｓｔｏＰｒｏｔｅｉｎｓｂｙ
ＳｉｍｕｌａｔｅｄＡｎｎｅａｌｉｎｇ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２
頁（１９９０））。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、ＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら、「ＡＧｅｏｍｅｔｒｉｃＡｐｐｒｏ
ａｃｈｔｏＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−ＬｉｇａｎｄＩｎｔｅｒａｃｔ
ｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，２６９−２８８頁（１９８２）
）。ＤＯＣＫは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である。

【００７５】一旦適切な化学的実体またはフラグメントが選択されたら、これらは、単一の
化合物または複合体へとアセンブリされ得る。アセンブリに先だって、ＪＮＫ３
の構造座標に関してコンピュータスクリーニングにおいて提示された３次元画像
対するフラグメントの互いの関係についての目視検査が行なわれ得る。このこと
に続いて、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌ［ＴｒｉｐｏｓＡｓｓｏｃｉａｔｅ
ｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］のようなソフトウェアを用いる、手動によるモデ
ル構築が行なわれる。

【００７６】個々の化学的実体またはフラグメントに関連して当業者を助ける有用なプログ
ラムとしては、以下が挙げられる：１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：ＡＰｒｏ
ｇｒａｍｔｏＦａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒ
ｉｖｅｄＤｅｓｉｇｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙＡｃｔｉｖｅＭ
ｏｌｅｃｕｌｅｓ」，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｉｎＣ
ｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｂｌｅｍｓ」，Ｓｐｅ
ｃｉａｌＰｕｂ．，ＲｏｙａｌＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６
頁（１９８９）；Ｇ．ＬａｕｒｉおよびＰ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ、「ＣＡＶＥ
ＡＴ：ａＰｒｏｇｒａｍｔｏＦａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅＤｅｓｉｇ
ｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＭｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄ
ｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓ．，８，５１−６６頁（１９９４））。ＣＡＶＥＡＴは、
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ
から入手可能である。２．３Ｄデータベースシステム（例えば、ＩＳＩＳ（ＭＤＬＩｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎＬｅａｎｄｒｏ，ＣＡ））。この分野は、Ｙ
．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，「３ＤＤａｔａｂａｓｅＳｅａｒｃｈｉｎｇｉｎ
ＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２１４５−２１５
４頁（１９９２）において概説されている。３．ＨＯＯＫ（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎら、「ＨＯＯＫ：ＡＰｒｏｇｒａｍｆｏ
ｒＦｉｎｄｉｎｇＮｏｖｅｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕ
ｒｅｓｔｈａｔＳａｔｉｓｆｙｔｈｅＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＳｔ
ｅｒｉｃＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆａＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ
ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃ
ｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１頁（１９９４）。ＨＯＯＫは、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手
可能である。

【００７７】上記のように１回に１つのフラグメントまたは化学的実体について段階的な様
式でＪＮＫ３様結合ポケットのインヒビターを構築することを進める代わりに、
阻害性または他のＪＮＫ３結合化合物が、いずれかの空の結合部位を用いるか必
要に応じて既知のインヒビターのいくつかの部分を含んで、全体としてまたは「
デノボ」で設計され得る。以下を含む多くのデノボリガンド設計方法が実体する
：１．ＬＵＤＩ（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ、「ＴｈｅＣｏｍｐｕｔｅｒＰｒｏｇｒ
ａｍＬＵＤＩ：ＡＮｅｗＭｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅＤｅＮｏｖｏ
ＤｅｓｉｇｎｏｆＥｎｚｙｍｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐ
．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６，６１−７８頁（１９９２））。ＬＵ
ＤＩは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔ
ｅｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７
，８９８５頁（１９９１））。ＬＥＧＥＮＤは、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕ
ｌａｔｉｏｎｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから入
手可能である。３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（ＴｒｉｐｏｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯから入手可能）。４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら、「ＳＰＲＯＵＴ：ＡＰｒｏｇｒａｍ
ｆｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ
．ＡｉｄｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，７，１２７−１５３頁（１９９３））。
ＳＰＲＯＵＴは、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｅｅｄｓ，ＵＫから入手可能
である。

【００７８】他の分子モデリング技術はまた、本発明に従って用いられ得る［例えば、Ｎ．
Ｃ．Ｃｏｈｅｎら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｏｄｅｌｉｎｇＳｏｆｔｗａｒ
ｅａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，８８３−８９４頁（１９９０）を参照の
こと；Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａおよびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ、「ＴｈｅＵｓｅｏ
ｆＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＤｒｕｇＤｅｓ
ｉｇｎ」，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｓｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，２０２−２１０頁（１９９２）もまた参照のこと；Ｌ．Ｍ
．Ｂａｌｂｅｓら，「ＡＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆＭｏｄｅｒｎＭｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＣｏｍｐｕｔｅｒ−ＡｉｄｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ」
，ＲｅｖｉｅｗｓｉｎＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，
第５巻，Ｋ．Ｂ．ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ編，ＶＣＨ，Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ，３３７−３８０頁（１９９４）；Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，「Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅＦｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＢａｓｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇ
ｎ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，７７７−７８
１頁（１９９４）もまた参照のこと］。

【００７９】一旦、化合物が上記の方法によって設計または選択されたら、この実体がＪＮ
Ｋ３結合ポケットに結合し得る効率が試験され、そしてコンピュータ評価によっ
て最適化され得る。例えば、有効なＪＮＫ３結合ポケットインヒビターは、好ま
しくは、その結合状態と遊離状態との間での比較的小さなエネルギー差（すなわ
ち、小さな結合変形エネルギー）を実証しなければならない。従って、最も効率
的なＪＮＫ３結合ポケットインヒビターは、好ましくは、約１０ｋｃａｌ／モル
以下、より好ましくは７ｋｃａｌ／モル以下の結合変形エネルギーを有するよう
に設計されるべきである。ＪＮＫ３結合ポケットインヒビターは、全体的な結合
エネルギーが類似する、１より多くのコンホメーションにおいて結合ポケットと
相互作用し得る。これらの場合、結合変形エネルギーは、遊離の実体のエネルギ
ーと、このインヒビターがこのタンパク質に結合する場合に観察されるコンホメ
ーションの平均エネルギーとの間の差であるとされる。

【００８０】ＪＮＫ３結合ポケットに結合するように設計または選択される実体は、その結
合状態において、その実体が好ましくは、標的酵素との、および周囲の水分子と
の反発性静電相互作用を欠くようにコンピュータによってさらに最適化され得る
。このような非相補的静電相互作用としては、反発性電荷−電荷相互作用、双極
子−双極子相互作用、および電荷−双極子相互作用が挙げられる。

【００８１】特異的コンピュータソフトウェアは、化合物の変形エネルギーおよび静電相互
作用を評価するために、当該分野において利用可能である。このような用途のた
めに設計されたプログラムの例としては、以下が挙げられる：Ｇａｕｓｓｉａｎ
９４，改訂版Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉ
ｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ（著作権）１９９５）；ＡＭＢＥＲ，改訂版４．１（Ｐ
．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ
ａｔＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，（著作権）１９９５）；ＱＵＡＮＴＡ／Ｃ
ＨＡＲＭＭ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（著作権）１９９５）；ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ／Ｄｉｓｃｏ
ｖｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤ
ｉｅｇｏ，ＣＡ（著作権）１９９５）；ＤｅｌＰｈｉ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳ
ｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（著作権）１９９
５）；およびＡＭＳＯＬ（ＱｕａｎｔｕｍＣｈｅｍｉｓｔｒｙＰｒｏｇｒａ
ｍＥｘｃｈａｎｇｅ，ＩｎｄｉａｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらのプ
ログラムは、例えば、ＳｉｌｉｃｏｎＧｒａｐｈｉｃｓのワークステーション
（例えば、「ＩＭＰＡＣＴ」グラフィックスを有するＩｎｄｉｇｏ２）を用いて
実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは、当
業者に公知である。

【００８２】本発明によって可能になる別のアプローチは、全体として、または部分的にＪ
ＮＫ３結合ポケットに結合し得る、化学的実体または化合物についての低分子デ
ータベースのコンピュータスクリーニングである。このスクリーニングでは、こ
の結合部位へのこのような実体の適合の質が、形状の相補性または推定される相
互作用エネルギーのいずれかによって判断され得る［Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら、Ｊ．
Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１３，５０５−５２４頁（１９９２）］。

【００８３】別の実施態様によって、本発明は、上記の方法によって生成または同定される
ＪＮＫ３様結合ポケットと会合する化合物を提供する。

【００８４】図１に示す構造座標をまた用いて、別の結晶化分子または分子複合体について
の構造情報を得るのを助け得る。このことは、分子置換を含む任意の多数の周知
の技術によって達成され得る。

【００８５】それゆえ、別の実施態様では、本発明は、分子置換を利用して、その構造が途
である分子または分子複合体についての構造情報を得る方法を提供する。この方
法は、以下の工程を包含する：ａ）構造が未知の上記分子または分子複合体を結晶化する工程；ｂ）Ｘ線回折パターンを、上記結晶化分子または分子複合体から作成する工程
；およびｃ）図１に記載の構造座標の少なくとも一部を、Ｘ線回折パターンに適用して
、構造が未知である分子または分子複合体の３次元電子密度地図を作成する工程
。

【００８６】分子置換を用いることにより、本発明によって提供される（そして図１に示さ
れる）ようなＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ複合体の構造座標の全てまたは一部
を用いて、構造が未知である結晶化分子または分子複合体の構造を、最初からこ
のような情報を決定する試みよりも迅速かつ効率的に決定し得る。

【００８７】分子置換は、未知の構造の位相についての正確な推定を提供する。位相は、直
接決定できない結晶構造を解くために用いられる式の因子である。分子置換以外
の方法によってこの位相について正確な値を得ることは、近似および細分（ｒｅ
ｆｉｎｅｍｅｎｔ）のサイクルの繰り返しを含み、そして結晶構造の解析を大い
に妨げる、時間を要するプロセスである。しかし、少なくとも相同な部分を含む
タンパク質の結晶構造が解かれている場合、公知の構造からの位相は、未知の構
造についての満足な推定を提供する。

【００８８】従って、この方法は、構造が未知である分子または分子複合体の結晶の観察さ
れたＸ線回折パターンを説明するのに最良であるように未知の分子または分子複
合体の結晶の単位格子内で図１に従ってＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰの関連部
分を配向付けおよび配置することによって、構造座標が未知である構造または構
造複合体の予備モデルを作成する工程を包含する。次いで、位相が、このモデル
から算出され得、そして観察されたＸ線回折パターンの振幅と合わされて、座標
が未知である構造の電子密度地図が作成され得る。次いで、これは、任意の周知
のモデル構築技術および構造細分技術に供されて、未知の結晶化分子または分子
複合体の最終的な、正確な構造を提供し得る［Ｅ．Ｌａｔｔｍａｎ，「Ｕｓｅ
ｏｆｔｈｅＲｏｔａｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＦｕｎｃ
ｔｉｏｎｓ」，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１５，５５−７７頁（１９８５
）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編，「ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｐｌａ
ｃｅｍｅｎｔＭｅｔｈｏｄ」，Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．，第１３号
，Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｂｒｅａｃｈ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７２）］。

【００８９】ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ複合体の任意の部分に対して充分に相同である
任意の結晶化分子または分子複合体の任意の部分の構造は、この方法によって解
かれ得る。

【００９０】好ましい実施態様では、分子置換の方法を利用して、別のＪＮＫ（例えば、Ｊ
ＮＫ１、ＪＮＫ２）またはＪＮＫ１、ＪＮＫ２もしくはＪＮＫ３のアイソフォー
ム）についての構造情報が入手される。本発明によって提供されるようなＪＮＫ
３の構造座標は、ＪＮＫ３またはＪＮＫ３複合体の他のアイソフォームの構造を
解く際に特に有用である。

【００９１】さらに、本発明によって提供されるようなＪＮＫ３の構造座標は、天然に存在
するＪＮＫ３アイソフォームと比較してアミノ酸の置換、付加、および／または
欠失を有するＪＮＫ３タンパク質（総称して「ＪＮＫ３変異体」という）の構造
を解く際に有用である。これらのＪＮＫ３変異体は、必要に応じて、化学的実体
（例えば、加水分解可能でないＡＴＰアナログまたは自殺基質）との共複合体（
ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）において結晶化され得る。次いで、一連のこのような複
合体の結晶構造は、分子置換によって解かれ、そして野生型ＪＮＫ３の結晶構造
と比較され得る。従って、この酵素の種々の結合部位内での潜在的改変部位は、
同定され得る。この情報は、ＪＮＫ３と、化学的実体または化合物との間の、最
も効率的な結合相互作用（例えば、疎水性相互作用の増加）を決定するためのさ
らなる道具を提供する。

【００９２】構造座標はまた、種々の化学的実体と共複合体形成した、ＪＮＫ３またはＪＮ
Ｋ３ホモログの結晶の構造を解くのに特に有用である。このアプローチは、化学
的実体（候補ＪＮＫ３インヒビターを含む）とＪＮＫ３との間の相互作用につい
て最適な部位の決定を可能にする。例えば、種々の型の溶媒に曝露された結晶か
ら収集された高解像度Ｘ線回折データは、種々の型の溶媒分子が存在する位置の
決定を可能にする。次いで、これらの部位に強固に結合する低分子が設計され、
そして合成され、そしてそれらのＪＮＫ３阻害活性について試験され得る。

【００９３】上記で言及された全ての複合体は、周知のＸ線回折技術を用いて研究され得、
そしてコンピュータソフトウェア（例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ［ＹａｌｅＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ，（著作権）１９９２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．によって配布される；例えば、ＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ，前出；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１１４巻および第１１５巻，Ｈ
．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）を参照
のこと］）を用いて１．５〜３Åの解像度のＸ線データに対して、約０．２０以
下のＲ値になるまで細分され得る。従って、この情報を用いて、公知のＪＮＫ３
インヒビターを最適化し得、そしてより重要なことには、新たなＪＮＫ３インヒ
ビターを設計し得る。

【００９４】本発明がより充分に理解されるために、以下の実施例を示す。これらの例は、
例示の目的のためのみであり、そして如何なるようにも本発明の範囲を限定しな
いと解釈されるべきである。

【００９５】（実施例１）（ＪＮＫ３の発現および精製）問合せとして公開されたＪＮＫ３α１ｃＤＡＮ［Ｓ．Ｇｕｐｔａら（１９９
６）］を用いたＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索は、ヒトＪＮＫ３α１につ
いてのコード配列全体を含んでいるＥＳＴクローン（＃６３２５８８）を同定し
た。ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉに
おけるこのタンパク質の発現のためにＮｃｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位でｐＥ
Ｔ−１５Ｂ発現ベクターへのクローニングのためにｃＤＮＡに制限部位を導入し
た。発現された全長タンパク質（Ｍｅｔ１−Ｇｌｎ４２２）の溶解度が乏し
いことに起因して、Ｍｅｔ（開始）残基およびＧｌｙ残基が先行し、ＪＮＫ１タ
ンパク質およびＪＮＫ２タンパク質のＳｅｒ２［Ｓ．Ｇｕｐｔａら（１９９６
）］に対応する、４０位のＳｅｒ残基で始まるＮ末端短縮タンパク質（Ｓｅｒ
４０）を生成した。このＧｌｙ残基は、発現ベクターへのクローニングのための
ＮｃｏＩ部位を導入するために付加した。さらに、系統的なＣ末端短縮化をＰＣ
Ｒによって実施して、回折の質の結晶を生じた構築物を同定し得る。この構築物
は、デオキシオリゴヌクレオチド５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＧＣ
ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡ３’（下線を付した開始コドンを
有する正方向プライマー）および５’ＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＡ
ＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡ３’（下線を付した停止コドンを有
する逆方向プライマー）をプライマーとして用いるＰＣＲによって調製され、そ
してＤＮＡ配列決定によって確認された。この構築物は、Ｍｅｔ残基およびＧｌ
ｙ残基によって先行される、ＪＮＫ３α１のアミノ酸残基Ｓｅｒ４０−Ｇｌｕ４
０２をコードする。この構築物を、本明細書に記載される構造研究のために用い
た。コントロール実験は、短縮型ＪＮＫ３タンパク質が、上流のキナーゼＭＫＫ
７をインビトロで用いて活性化した場合にミエリン塩基性タンパク質に対して等
価なキナーゼ活性を有することを示した（公開されていない結果）。

【００９６】ＪＮＫ３発現構築物を用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１株（ＤＥ３
）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、３０℃で、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充
したＬＢにおいて、対数増殖期（ＯＤ６００、約０．８）までシェーカーフラス
コ中で増殖した。次いで、ＩＰＴＧを０．８ｍＭの最終濃度まで添加し、そして
細胞を、２時間後に遠心分離によって収集した。短縮型ＪＮＫ３タンパク質を含
むＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストを、１０容量／ｇ溶解緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ７．２、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍ
Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭＰＭＳＰ、２μｇ／ｍｌペプス
タチン、各１μｇ／ｍｌのＥ−６４およびロイペプチン）中に再懸濁した。細胞
を、微小流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用して氷上で溶解し
、そして１０，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離した。１００，０００
×ｇ上清を、緩衝液Ａ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０％グリセロー
ル（ｖ／ｖ）、２ｍＭＤＴＴ）を用いて５倍希釈し、そして４℃にてＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）陽イオン交換カラムにアプライした。
このカラムを、５カラム容量の緩衝液Ａ、続いて５０ｍＭＮａＣｌを含む、５
カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。結合したタンパク質を、７．５カラム容量の
５０〜３００ｍＭＮａＣｌの直線勾配で溶出し、そして短縮型ＪＮＫ３タンパ
ク質を１５０〜２００ｍＭＮａＣｌで溶出した。ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムから溶出したＪＮＫ３タンパク質を、緩衝液Ｂ（５％グリセロール（ｖ／ｖ
）、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＤＴＴを含む、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．０）に対して、４℃にて一晩、約１ｍｇ／ｍｌで透析し、そして３，００
０×ｇで遠心分離した。この上清を、限外濾過（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０、
Ａｍｉｃｏｎ）によって１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１６，０００×ｇで遠心分離
し、そして−７０℃で保存した。

【００９７】（実施例２）（ＪＮＫ３の結晶化）全長ヒトＪＮＫ３α１は、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２および他のＭＡＰキナーゼと比
較した場合に、Ｎ末端において３９残基の伸張を有する（図１およびＳ．Ｇｕｐ
ｔａら（１９９６））。本発明者らは、結晶学的研究に関して、最初の３９残基
を有さないＪＮＫ３の、保存されたＭＡＰキナーゼ相同性領域を示した。最初の
結晶化の試行は、８Åに回折される小さな結晶のみを生じた。Ｅｒｋ２およびｐ
３８のＣ末端での残基は無秩序であるので（Ｆ．Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、
３６７、７０４〜１１頁（１９９４）；Ｋ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．、２７１、２７６９６〜７００頁（１９９６））、本発明者らは、
ＪＮＫ３のＣ末端部分もまた可撓性であり得、そして十分に秩序化した結晶格子
の形成を妨げ得ると結論付けた。従って、本発明者らは、限定タンパク質分解お
よび系統的な短縮型のタンパク質を組み合わせることによって、活性な短縮型Ｊ
ＮＫ３について調査した。このスリーニングアプローチによって、より大きな、
十分に秩序化したＪＮＫ３の結晶の成長を生じた。これらの結晶は、Ｎ末端の３
９残基およびＣ末端の２０残基を欠如するＪＮＫ３タンパク質から成長する。短
縮型酵素（残基Ｓｅｒ４０〜Ｇｌｕ４０２）は、インビトロでＭＫＫ７によって
活性化される場合に、野生型キナーゼ活性を提示した。全ての結晶学的研究を、
この形態の酵素を使用して実行した。

【００９８】結晶化の試行を、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰの存在下および非存在下において、吊下
げ滴下蒸気拡散（ｈａｎｇｉｎｇｄｒｏｐｖａｐｏｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ
）技術と希薄な行列検索とを組み合わせることによって実施した。ＭｇＡＭＰ−
ＰＮＰの非存在下において結晶は得られなかったが、一方ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰの
存在下において実施された結晶化の試行は、１８〜２０％（ｖ／ｖ）ポリエチレ
ングリコールモノメチルエーテル（平均Ｍ_r＝５５０）、１０％（ｖ／ｖ）エチ
レングリコール、２０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび１００ｍＭＨｅ
ｐｅｓ（ｐＨ７．０）を含むリザーバ溶液上で、２０℃で斜方晶結晶形態を生じ
た。結晶化小滴は、氷上で１ｍＭＡＭＰ−ＰＮＰおよび２ｍＭＭｇＣｌ₂と
ともに予め１時間インキュベートされた１μＬのリザーバ溶液プラス１ｍＬのタ
ンパク質溶液の混合物を含んだ。この結晶は、非対称単位あたり１つの酵素分子
を有する斜方晶空間群Ｐ２₁２₁２₁（ａ＝５１．５０Å、ｂ＝７１．２４Åおよ
びｃ＝１０７．６０Å）に属した。結晶の溶媒含有量は４４％である。データ収
集の前に、結晶を、−１７０℃でのＸ線データ収集のための窒素ガス中での急速
凍結の前に、これらのリザーバ溶液で２〜５分間平衡化した。

【００９９】（実施例３）（Ｘ線データ収集および構造決定）Ｘ線データを、回転アノード供給源によって生成された鏡で集束された（ｍｉ
ｒｒｏｒ−ｆｏｃｕｓｅｄ）ＣｕＫα Ｘ線を用いて、ＲａｘｉｓＩＩＣ画像
板上で測定した。回折画像をプログラムＤＥＮＺＯを用いて処理し、そしてデー
タをＳＣＡＬＰＡＣＫを使用して縮尺した（Ｚ．Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、「Ｄａ
ｔｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」、Ｌ．Ｓａｗｙ
ｅｒ、Ｎ．ＩｓａａｃｓおよびＳ．Ｗ．Ｂａｉｌｅｙ編、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ
、Ｕ．Ｋ．：ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｏｕｎｃｉ
ｌ／ＤｅｒｅｓｂｕｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、５５〜６２頁（１９９３））
。統計学上の処理のデータを、表１に要約する。

【０１００】ＪＮＫ３についての開始相を、プログラムＡＭｏＲｅ（Ｊ．Ｎａｚａｚａ，Ａ
ｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、Ａ５０、１５７−６３頁（１９９４））に
おける検索モデルとしてリン酸化ＥＲＫ２の座標を使用する分子置換によって得
た。Ｅｒｋ２原子モデルを、ＪＮＫ３とは異なる残基についてＡｌａに短縮し、
そしてＥｒｋ２とＪＮＫ３との間の有意な挿入または欠失を有するループを欠失
することによって改変した。このハイブリッドモデルは、ＪＮＫ３についての回
転関数および並進関数の解（これは、１０〜４．０Å解像度の反射についてＲ因
子＝５０％を有する開始モデルを提供した）を首尾良く生じ、そしてＸ線データ
の１０％に基づいてＲ−遊離＝５１％は細分の開始時に除いた。従来の最小二乗
およびシュミレートアニーリング手順の両方を使用するモデルの細分を、８〜２
．３Åデータを使用して、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ、ＸＰＬＯＲ
、Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１Ｍａｎｕａｌ，ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＣＴ（１９９２））とともに行った。ＡＭＰ
−ＰＮＰ分子に対応する電子密度を、最初のモデル相を用いて計算されたマップ
から可視化したが、ＡＭＰ−ＰＮＰは、Ｒ因子を２８％降下させ、そしてＲ−遊
離を３９％降下させるまでモデル細分に含まれなかった。２．３Å解像度で細分
化したモデル（表１）は、ＪＮＫ３の３３９残基、１つのＡＭＰ−ＰＮＰ分子、
２つのＭｇ²⁺および１８３の水分子を含む。電子密度マップは、最終的なモデル
からいくつかのアミノ酸残基の欠損を誘導する、いくらかの離散領域の無秩序を
表した。Ｎ末端の残基４０〜４４およびＣ末端の残基４０１および４０２は、無
秩序であった。さらに、残基２１２〜２１６および残基３７４〜３７８を含む、
酵素の２つの中心領域は、無秩序であった。最終的に、Ｔｙｒ２２３の側鎖原子
は、乏しい電子密度に起因してＣβを越えてモデル化されなかった。提示される
Ｒ因子は、２２．１％（Ｒ−遊離＝２７．４％）である。異方性スケーリングお
よびバルク溶媒の補正を、細分（ｒｅｆ）の最終段階で適用した。首尾良く規定
される３３９の残基のうちの３３７のペプチドのねじれ角は、プログラムＰＲＯ
ＣＨＥＣＫ（Ｒ．Ａ．Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌ
ｏｇ．、２６、２８３−９１頁（１９９３））に規定されるＲａｍａｃｈａｎｄ
ｒａｎプロットの最も支持されるかまたは一般に許容される領域内に含まれる。

【０１０１】（実施例４）（全体の構造）結晶構造は、リン酸化されていないＪＮＫ３（残基４５〜２１１、２１７〜２
７３、３７９〜４００）、アデニルイルイミドジホスフェート（ＡＭＰ−ＰＮＰ
、ＡＴＰアナログ）および２つのＭｇ²⁺イオンを含む。残基４０〜４４、２１２
〜２１６および４０１〜４０２についての電子密度は観察されず、これらのアミ
ノ酸は、無秩序であると推定される。ＪＮＫ３のＭＡＰキナーゼ相同領域（Ｐｈ
ｅ４８〜Ｇｌｕ３９７）は、Ｅｒｋ２に対して、アミノ酸配列において４５％同
一であり、そしてｐ３８に対して５１％同一である。これらの構造は報告されて
いる（Ｆ．Ｚｈａｎｇら（１９９４）；Ｋ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎら（１９９６）；
図１）。予測したように、ＪＮＫ３の全体の構造（ａｒｔｉｔｅｃｔｕｒｅ）は
、Ｅｒｋ２およびｐ３８の構造に非常に類似する。ＪＮＫ３のＮ末端ローブ（残
基４５〜１４９、および３７９〜４００）は、主にβストランドを含むが、それ
に対してＣ末端ローブ（残基１５０〜２１１、２１７〜３７４）は、主にαヘリ
ックスである。２つのドメイン間の深い裂溝はＡＴＰ結合部位を含むが、ここで
、酵素のグリシンリッチな配列（ＧＳＧＡＱＧＩＶ）は、ヌクレオチドにわたっ
て十分に規定されたβストランド−ターン−βストランド構造を形成する。Ｃ末
端ドメインにおけるＭＡＰキナーゼ挿入体は、Ｅｒｋ２およびｐ３８よりもＪＮ
Ｋ３において、１２残基長く、ヘリックスαＨおよび異常３₁₀ヘリックスのＮ末
端伸張（αＨとα３Ｌ１４との間に３／１０（２）Ｌ１４を示した）を生じる（
図２ａ）。本発明者らは、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ全てにおいて存在するの
で（Ｓ．Ｇｕｐｔａら、（１９９６））、この１２残基の挿入体を「ＪＮＫ挿入
体」という。

【０１０２】Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの相対的な配向は、ＪＮＫ３の構造とＥ
ｒｋ２の構造との間の差異である（図２ｂ）。Ｅｒｋ２の対応するローブ上のＪ
ＮＫ３のＣ末端ドメインの重ね合わせは、活性部位に向かって約２．５°のＪＮ
Ｋ３の、Ｎ末端ドメインの回転を示した。ドメインの回転にもかかわらず、ＪＮ
Ｋ３およびＥｒｋ２の個々のドメインの構造は類似している。ＪＮＫ３に対する
Ｅｒｋ２のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの独立した重ね合わせ、リン酸
化ｌｉｐ領域の無視、ＪＮＫ挿入体およびタンパク質末端は、Ｎ末端ドメインに
ついて１．２３Å（ＪＮＫ３残基５６〜１４９および３８２〜４００）およびＣ
末端ドメインについて１．６０Å（ＪＮＫ３残基１５０〜２０８、２２６〜３１
５および３２９〜３６９）のタンパク質骨格の根平均２乗（ｔｍｅ）偏差を与え
た。

【０１０３】電子密度は、ＪＮＫ３のコア領域内の２つの無秩序な領域について可視的では
ない。１つの領域は、Ｃ末端ドメイン中のＡｒｇ２１２〜Ｔｈｒ２１６である（
図２ａ）。Ｅｒｋ２における対応する残基は、「リン酸化ｌｉｐ」に先行するβ
ストランドβ９を形成する（以下を参照のこと）。リン酸化されていないＪＮＫ
３構造において、無秩序なβ₉は、リン酸化ｌｉｐの可撓性構造を示す。第２の
無秩序な領域は、残基Ｇｌｎ３７４〜Ｌｙｓ３７８を含む。リン酸化Ｅｒｋ２の
構造は、Ｌ１６のこの部分がリン酸化に際して３₁₀ヘリックスに再配列されるこ
とが示されるので、これらのアミノ酸は、酵素の活性化状態に結合され得る（Ｂ
．Ｊ．Ｃａｎａｇａｒａｊａｈら、Ｃｅｌｌ，９０，８５９−６９頁（１９９７
））。

【０１０４】（リン酸化ｌｉｐ）本発明者らは、残基Ｔｈｒ２１７〜Ｔｈｒ２２６（リンカーＬ１２の一部）に
及ぶ領域を、「リン酸化ｌｉｐ」または「活性化ループ」という。なぜなら調節
リン酸化部位Ｔｈｒ２２１およびＴｙｒ２２３を含むからである（図２ａ）。Ｊ
ＮＫのＴｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒトリペプチド配列において、２つのリン酸化部位間の
保存された残基はＰｒｏであるが、一方、Ｅｒｋ２およびｐ３８それぞれにおい
ては、ＧｌｕおよびＧｌｙである。リン酸化ｌｉｐにおけるＪＮＫ３残基のほと
んどは、十分に秩序化されている。リン酸化ｌｉｐは、ＪＮＫ３において、Ｅｒ
ｋ２よりも４残基短く、そしてｐ３８よりも２残基長い。リン酸化ｌｉｐの長さ
における差異およびトリペプチド配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒにおける中心残基は、
活性化残基（Ｔｈｒ２２１およびＴｙｒ２２３）の位置およびコンフォメーショ
ンの変動、ならびに活性化ループの経路の変動を生じる。ＪＮＫ３に対するＥｒ
ｋ２のＣ末端ドメインの重ね合わせは、Ｅｒｋ２において、Ｔｈｒ２２８に対し
てＴｈｒ２２６のＣα位における２．５Åのシフトを示した（図２ｂ）。Ｔｈｒ
２２６のコンフォメーションはまた、Ｅｒｋ２のＴｈｒ１８８と比較される場合
に異なる。ＪＮＫ３において、一対の水分子は、Ｔｈｒ２２８の主鎖のカルボキ
シル基およびアミド基に水素結合し、ならびにＬｙｓ１９９の側鎖との相互作用
を媒介する。結果として、Ｔｈｒ２２６は、異なるΦ、Ψ角（ＪＮＫ３のＴｈｒ
２２６：Φ＝−８８°およびΨ＝１４４°；Ｅｒｋ２のＴｈｒ１８８：Φ＝−４
６°およびΨ＝１３０°）を採用し、これは、リン酸化ｌｉｐの経路を向け直す
。ｌｉｐのＮ末端部分は、ファンデルワールスをαＣヘリックスと接触させる。
次いで、これは、ヌクレオチドを包含するグリシンリッチなフラップと接触する
。まとめると、リン酸化ｌｉｐのタンパク質骨格は十分に秩序化され、そしてＥ
ｒｋ２およびｐ３８中の対応する残基から完全に異なるコンフォメーションを占
有する。

【０１０５】ｌｉｐのコンフォメーションの結果として、ＪＮＫ３における調節性リン酸化
部位は、Ｅｒｋ２およびｐ３８における部位と比較して、異なって位置付けられ
る。Ｔｈｒ２２１およびＴｙｒ２２３は、Ｅｒｋ２において対応する残基の位置
から１６Å離れ、そしてｐ３８においては１２Å離れている。異なる位置にも関
わらず、３つの酵素全てにおける調節性スレオニン残基は、溶媒に曝されている
。対照的に、チロシン残基の局所的環境は異なっている。Ｔｙｒ２２１の側鎖は
、ＪＮＫ３構造において溶媒に曝され、そして無秩序化される。ｐ３８における
対応するチロシン残基もまた溶媒に曝されるが、その側鎖は十分に秩序化され、
そして水分子を通じて、ｐ３８のＴｈｒ２２１のヒドロキシル基と相互作用する
（Ｋ．Ｐ．Ｗｉｌｓｏｎら、（１９９６））。対照的に、Ｅｒｋ２における対応
するスレオニンの側鎖は埋没されている。Ｅｒｋ２の残基Ｔｙｒ１８５は、Ａｒ
ｇ１４６の側鎖と水素結合を形成し、そして近傍の疎水性アミノ酸側鎖とファン
デルワールスを接触させる（Ｆ．Ｚｈａｎｇら（１９９４））。リン酸化されて
いないＥｒｋ２構造におけるＴｙｒ１８５側鎖コンフォメーションは、リン酸化
ｌｉｐが、Ｔｙｒ１８５がキナーゼを活性化するＥｒｋ２の上流に対する基質と
なり得る前に、再折り畳みされなければならないことを示唆する。同様の移動は
、ＪＮＫ３およびｐ３８をリン酸化するために必要ではないかもしれない。なぜ
なら、スレオニンおよびチロシンの両方は、ＪＮＫ３およびｐ３８のリン酸化さ
れていない形態において、溶媒に近接できるからである。

【０１０６】（ペプチド基質結合チャネル）ＪＮＫ３におけるペプチド基質結合部位は、ｃ−ＡＭＰ依存型タンパク質キナ
ーゼに対するその相同性によってマッピングされ得る（ｃＡＰＫ、図１）。ｃＡ
ＰＫ、ＰＫＩインヒビターおよびＭｎＡＭＰ−ＰＮＰによって形成される三次元
複合体の構造（Ｄ．Ｂｏｓｓｅｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯＪ．，１２，８４９−
５９頁（１９９３）；Ｄ．Ｒ．Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３、
４１４−２０頁（１９９１））は、ペプチド結合チャネルが主にＣ端ドメインに
あり、そしてＰ＋１結合部位の位置が、リン酸化ｌｉｐに近接しかつαＬ１２に
連結するループ（残基Ｌｅｕ１９８〜Ｌｅｕ２０５）によって形成されることを
示す（図３）。ＪＮＫ３のＣ末端ドメインは、ｃＡＰＫのＣ末端ドメインと十分
に重ね合わせられ、そしてこれは、ＪＮＫ３ペプチド基質結合のために重要であ
り得る残基を同定することを可能にする。ＪＮＫ３において、残基Ａｒｇ２２７
〜Ａｒｇ２３０のタンパク質骨格は、ｃＡＰＫにおける対応する残基（残基Ｐｒ
ｏ２０２〜Ｌｅｕ２０５）に対する類似の経路に従い、Ａｒｇ２３０の側鎖が基
質の結合のために好ましくないコンフォメーションでＰ＋１部位をふさぐ（図３
）。リン酸化ｌｉｐの部分（ｃＡＰＫにおける残基Ｌｅｕ１９８〜Ｔｈｒ２０１
に対応する）は、ｃＡＰＫのその部分とは異なる経路を取得する一方、ペプチド
基質のＰ＋１部位およびＰ＋２部位の位置を占有する（図３）。

【０１０７】ＪＮＫ３およびリン酸化Ｅｒｋ２の構造的比較は、ＪＮＫ３のＴｈｒ２２１お
よびＴｙｒ２２３でのリン酸化が、どのようにＪＮＫキナーゼの活性化において
役割を果たし得るかを示唆する。リン酸化Ｅｒｋ２において、ホスホスレオニン
（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）ｐＴｈｒ１８３は、３つのアルギニン残
基（αＣ中のＡｒｇ６８、触媒ループ（Ｃループ）中のＡｒｇ１４６およびリン
酸化ｌｉｐからのＡｒｇ１７０）と直接的に相互作用するが、一方ホスホチロシ
ン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）ｐＴｙｒ１８５は、Ａｒｇ１８９および
Ａｒｇ１９２によって連結される（Ｂ．Ｊ．Ｃａｎａｇａｒａｊａｈら（１９９
７）。Ｔｈｒ２２１およびＴｙｒ２２３はＪＮＫのリン酸化形態において同様に
連結されることを想定すると、これらは、これらのリガンドと非常に近接するよ
うに、リン酸化に対して約１５Å移動しなければならず、そしてリン酸化ｌｉｐ
の大きなコンフォメーションの変化が必要とされる。Ｔｈｒ２２１およびＴｈｒ
２２３でのリン酸化の結果として、リン酸化ｌｉｐの再構造化は、ペプチド基質
結合チャネルをブロックしないように補助し得る。リン酸化ｌｉｐならびにペプ
チド基質結合チャネルにおけるこれらのリン酸化に関連するコンフォメーション
の変化は、低活性の結晶構造およびリン酸化Ｅｒｋ２において観察された（Ｆ．
Ｚｈａｎｇら（１９９４）；Ｂ．Ｊ．Ｃａｎａｇａｒａｊａｈら（１９９７））
。

【０１０８】（活性部位）ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＭｇ²⁺の存在下においてＪＮＫ３の結晶化から得られる
ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰのバイナリー複合体の結晶は、本発明者らが、Ｊ
ＮＫ３のヌクレオチド結合形態のための構造的データを得ることを可能にした。
構造において表されるように、ＡＭＰ−ＰＮＰは、ＪＮＫ３の２つのローブ間の
深い裂溝において結合される（図２ａ）。ヌクレオチドアナログの結合様式は、
ｃＡＰＫ、ＭｎＡＭＰ−ＰＮＰおよびインヒビターペプチドＰＫＩ（５−２４）
によって形成される三次元複合体において見出される様式と同様である（Ｄ．Ｂ
ｏｓｓｅｍｅｙｅｒら（１９９３））（図４ａ）。これは、タンパク質キナーゼ
についての生物活性コンフォメーションを示すと考えられている。これらの知見
は、以前の、Ｅｒｋ２を用いる結晶浸漬実験とは異なり（Ｆ．Ｚｈａｎｇら（１
９９４））、そしてＪＮＫ３とヌクレオチドとの間の相互作用の、より詳細な説
明を可能にする。

【０１０９】タンパク質キナーゼの触媒コアは、ヌクレオチド結合配列Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ
−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘを含む。これは、その構造上の特徴およびヌクレオチ
ド結合における役割に起因して「グリシンリッチリン酸アンカーループ」といわ
れる［Ｄ．Ｒ．Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３、４０７−１３頁
（１９９１）］。グリシンリッチループは、ＪＮＫ３において充分規定されてお
り、そしてｃＡＰＫのグリシンリッチループに充分重ねられる。ここで、Ｉｌｅ
７０〜Ｓｅｒ７９までのタンパク質の主鎖の原子についてのｒｍｓの偏差は、０
．５４Åである（図４）。グリシンリッチ配列Ｇｌｙ７１−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ７３
−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ７６−Ｉｌｅ−Ｖａｌ７８は、そのヌクレオチドに対
してフラップを形成する。これは、そのヌクレオチドを、殆ど完全に覆う。その
ヌクレオチドのアデニン塩基は、ドメイン界面の裏側の奥深くに存在する。その
アミノ基（Ｎ６）は、Ｇｌｕ１４７のバックボーンのカルボニルと水素結合を形
成する。そして、Ｎ１は、Ｍｅｔ１４９のバックボーンのアミドへ結合する。非
極性の相互作用もまた、プリン環の両側に見出される。これには、一方のグリシ
ンリッチフラップからのＩｌｅ７０およびＶａｌ７８、ならびに他方のβ７から
のＶａｌ１９６が含まれる。このリボースＯ２’およびＯ３’のヒドロキシルは
、Ａｓｎｌ５２の側鎖およびＳｅｒｌ９３のカルボニル基に対して水素結合ネッ
トワークを形成する。トリホスフェート基は、水素結合を介して強固に結合する
。この基は、タンパク質キナーゼの不変アミノ酸のほとんどを直接または間接的
に含む。ホスフェートの酸素原子への水素結合は、Ｇｌｎ７５の主鎖のアミドお
よびＧｌｎ７５およびＬｙｓ９３の側鎖によって形成される。２つのマグネシウ
ムイオン（Ｍ１およびＭ２）がＪＮＫ３ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ複合体において観察
されている。Ａｓｎ１９４の側鎖のカルボニル基は、Ｍ１の金属イオンと密接に
接触している。次いで、この金属イオンは、ＡＭＰ−ＰＮＰのαホスホリル基お
よびγホスホリル基の酸素を架橋する。Ａｓｐ２０７は、Ｍ２と水分子を介して
相互作用する。Ｍ２は、βホスホリル基およびγホスホリル基の酸素と結合する
が、ｃＡＰＫにおいて、対応する残基（Ａｓｐ１８４）は、Ｍ１およびＭ２の両
方と直接配位する。この有意差は、ＪＮＫ３酵素の不活性コンホメーションに起
因するようである。金属キレート化における重要な役割が、ｃＡＰＫにおけるＡ
ｓｐ１８４について提唱されている。このキレート化には、アスパラギン酸残基
と金属イオンとの直接の相互作用を必要とする［Ｄ．Ｒ．Ｋｎｉｇｈｔｏｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３、４０７−１３頁（１９９１）；Ｄ．Ｂｏｓｓｅｍｅｙ
ｅｒら（１９９３）］。Ａｓｐ２０７は、リン酸化されていないＪＮＫ３におけ
る障害のあるβ９の前にある「ＤＦＧループ」と呼ばれるループに位置する。Ｊ
ＮＫ３の構造は、リン酸化の際に、リン酸化の縁を折り畳むことおよびドメイン
の回転が、Ａｓｐ２０７をヌクレオチドの近位へともたらして、その金属イオン
との直接の相互作用を可能にすることを示唆する。

【０１１０】ＪＮＫ３とｃＡＰＫとの構造の比較は、ＪＮＫ３の２つのドメインが、ｃＡＰ
Ｋの構造におけるその配向に比較して離れて回転していることを示す（図３）。
このツイストは、ＪＮＫ３の触媒部位の２つの半分の誤配置をもたらす。Ｎ末端
ドメインから、推定の触媒性Ｌｙｓ９３が、ｃＡＰＫにおけるその等価な残基の
類似の位置を採り、そしてαホスホリル基およびβホスホリル基の酸素原子と水
素結合を形成する。しかし、Ｃ末端ドメインにおける触媒性ループ（Ａｒｇｌ８
８−Ａｓｎｌ９４）およびＤＦＧループ（Ａｓｐ２０７−Ｇｌｙ２０９）は、誤
配置されている（図４ｂ）。保存されたＡｓｐｌ８９およびＡｓｐ２０７（これ
らは両方とも、タンパク質キナーゼ活性に必須であると考えられている［Ｃ．Ｓ
．Ｇｉｂｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、４８０６−１０頁（１９
９２）］）、は、ｃＡＰＫにおけるそれらに対応する残基の位置に比較して、Ｊ
ＮＫ３においてＬｙｓ９３から３Åさらに離れて位置する。これらの相違は、Ｊ
ＮＫ３におけるドメインの「オープン」コンホメーションが、リン酸化されてい
ない酵素の低い活性に寄与し得ることを示唆する。

【０１１１】（他の酵素とＪＮＫ３との類似性）ＪＮＫ３の全体の折り畳みは、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼおよび他の
ＭＡＰキナーゼであるＥｒｋ２およびｐ３８の公知の構造との類似性を示す。リ
ン酸化されていないＪＮＫ３は、「オープン」なコンホメーションを採り、ここ
で、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインは、触媒残基のいくつかが誤配置され
るように配向される。さらに、リン酸化の縁は、基質であるペプチドの結合部位
を部分的にブロックする。これらの調節機構の組合せは、全体的（触媒性残基を
近傍へともたらすためのドメイン閉合）および局所的（基質結合に対する立体的
制約を緩和するためのその縁の再折り畳み）での両方のコンホメーション変化が
、ＪＮＫ３活性化に必要であることを示唆する。

【０１１２】Ｅｒｋ２、ｐ３８およびＪＮＫ３の結晶学的研究は、β９およびリン酸化の縁
の領域が、リン酸化されていないＭＡＰキナーゼにおいて最も多様であり、そし
て不安定なコンホメーションを有することを示した。ＥＲＫ２のこの領域は、リ
ン酸化された酵素におけるホスフェートと活性ループの近くの残基との間の相互
作用によって安定化される構造を採用する［Ｂ．Ｊ．Ｃａｎａｇａｒａｊａｈら
（１９９７）］。リン酸化されたＥｒｋ２構造をＪＮＫ３の活性コンホメーショ
ンについてのモデルとして使用することで、２つのリン酸化部位であるＴｈｒ２
２１およびＴｙｒ２２３が、それらがＥｒｋ２において行うのと類似する役割を
ＪＮＫ３を活性化する際に果たし得ることが示される。ＪＮＫ３において、Ｔｈ
ｒ２２１のリン酸化は、Ａｒｇ１０７およびＡｒｇｌ８８と相互作用することに
よってドメイン閉合を促進し得るが、他方、Ｔｙｒ２２３のリン酸化は、そのホ
スホチロシンとＡｒｇ２２７およびＡｒｇ２３０（これらは、次いで、プロリン
指向性Ｐ＋１ポケットを構成する）との新たな相互作用を促進し得る。

【０１１３】ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ二成分複合体は、ＭＡＰキナーゼのＪＮＫサブ
ファミリーの中で、（構造が）決定された最初のキナーゼ構造である。残基Ｓｅ
ｒ４０から残基Ａｌａ４１８にわたる領域において、ＪＮＫ３は、ＪＮＫ１およ
びＪＮＫ２とそれぞれ９２％および８７％のアミノ酸同一性を共有する。従って
、ＪＮＫ３の構造は、詳細な構造の情報を提供する。そして、この情報は、この
クラスのＭＡＰキナーゼについての調節機構に対する洞察を提供する。ＪＮＫア
イソフォームの中での改変体残基は、２つの領域においてクラスター形成する（
図１）。１つの領域は、αＦおよびそれに続くループであるＬ１３のＣ末端部分
である。この領域における改変残基の殆どは、ＪＮＫ３構造において溶媒に曝露
されており、そしてｃＡＰＫと比較した場合、基質結合に関与するようである（
図５）。このことは、基質結合特異性におけるＪＮＫ３の役割を示唆する。これ
は、ＪＮＫキメラの研究から得られた結果と一致する。この研究は、ｃ−Ｊｕｎ
に対するＪＮＫ特異性がこの領域に指向されていることを示す［Ｔ．Ｋａｌｌｕ
ｎｋｉら，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．、８、２９９６−３００７頁（１９９４）］。
ＪＮＫアイソフォームおよび種々の基質のこれまでの結合研究は、この仮説をさ
らに支持する。そして、この領域においてより高い相同性を有するＪＮＫアイソ
フォームが基質に対して類似する結合選択性を提示することを示した［Ｓ．Ｇｕ
ｐｔａら、１９９６］。他の領域は、α３Ｌ１４およびＪＮＫの挿入物であり、
この挿入物は、ｃＡＰＫにおいて同定されるペプチド基質の結合チャネルの次の
タンパク質表面に存在する（図５）。この領域の配置は、この領域がＪＮＫキナ
ーゼにおける拡張した基質結合部位であり得、そしてこの領域における配列が基
質結合特異性にとって重要であり得ることを示唆する。

【０１１４】図ｌａ−５は、ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰ複合体の構造をさらに示す。従
って、図ｌａは、ＪＮＫ３［Ｓ．Ｇｕｐｔａら（１９９６）］、ＥＲＫ２［Ｔ
．Ｇ．Ｂｏｕｌｔｏｎら、Ｃｅｌｌ，６５、６６３−７５頁（１９９１）］、ｐ
３８［Ｊ．Ｃ．Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３７２、７３９−４６頁（１９９４）
］およびｃＡＰＫ［Ｍ．Ｄ．Ｕｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８３、１３００−０４頁（１９８６）］の構造に基づく配列整列を
示す。ヒトＪＮＫ３、ヒトＥＲＫ２、ヒトｐ３８キナーゼ、およびマウスｃＡＰ
Ｋのアミノ酸配列を構造類似性に基づいて整列する。Ｅｒｋ２、ｐ３８およびｃ
ＡＰＫの分岐したＮ末端およびＣ末端の領域は示さない。結晶学的研究のための
短縮型ＪＮＫ３（ＪＮＫ３：残基Ｓｅｒ４０−Ｇｌｕ４０２）において含まれな
いＮ末端およびＣ末端の残基を、小文字で示す。イタリックの残基は、このモデ
ルに含まれない。サブドメインを、Ｓ．Ｋ．Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
４１、４２−５２頁（１９８８）に従ってローマ数字にて標示する。ＪＮＫ３に
ついての二次構造エレメントを、配列の上に示す（図２ａについてと同様の命名
）。ここで、白四角は、ααヘリックスおよび３／１０ヘリックスを示し、そし
て白矢印は、ββストランドを示す。障害のある領域を、破線で示す。ＪＮＫ３
およびｃＡＰＫの両方の配列番号付けを示す。リン酸化の縁におけるリン酸化部
位を、アステリスクにより示す。ＪＮＫ１およびＪＮＫ２とは異なるＪＮＫ３の
残基をボールドで強調する。

【０１１５】図２ａは、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰと複合体化したＪＮＫ３の全体の折り畳みのリ
ボン図である。この構造は、二次構造エレメントおよびタンパク質キナーゼにお
いて保存されるループ、ならびにＭＡＰキナーゼに特徴的な伸長および挿入を示
す。ＪＮＫの挿入およびリン酸化の縁を示す。障害のある領域（残基２１２−２
１６）を、点線で示す。結合したＡＭＰ−ＰＮＰおよび２つのＭｇ²⁺イオンを、
空間充填モデルにより示す。調節性リン酸化部位であるＴｈｒ２２１およびＴｙ
ｒ２２３のＣαの位置を示し、そして標識する。二次構造エレメントを、ｒｅｆ
に従って標識する。この図は、ＲＩＢＢＯＮＳを用いて構築した［Ｍ．Ｃａｒｓ
ｏｎ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．、２４、９５８−６１頁（１９８７）］。

【０１１６】図２ｂは、ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰに重ねた構造の立体図である。そし
て、ＪＮＫ３およびＥｒｋ２の構造のＥｒｋ２Ｃαの表示を、そのＣ末端ドメ
インの重ね合わせの後に示す。最大の構造多岐性を有するセグメントを標識し、
そして強調する。

【０１１７】図３は、ＪＮＫ３およびｃＡＰＫの重ね合わせ構造の立体図である。ＪＮＫ３
およびｃＡＰＫの三次複合体のＣα表示を、そのＣ末端ドメイン重ね合わせの後
に示す。ＪＮＫ３およびｃＡＰＫにおけるリン酸化の縁、ならびにＰＫＩインヒ
ビターは、２つの酵素の間の縁の構造において相違を示し、そして、ＪＮＫ３の
縁は、ペプチド結合チャネルの部分を占める。ｃＡＰＫ三次複合体におけるＭｎ
ＡＭＰ−ＰＮＰは、図面から省略し、そしてｃＡＰＫのキナーゼ触媒コア部分の
みを示す。

【０１１８】図４ａは、ＪＮＫ３の活性部位の立体図である。ＡＭＰ−ＰＮＰの分子および
Ｍｇ²⁺をそれを取り囲むＪＮＫ３残基とともに示す。ＡＭＰ−ＰＮＰ分子を、太
線として示し、そしてそのタンパク質残基を、細線として示す。２つのＭｇ²⁺イ
オン（Ｍ１およびＭ２と標識）および２つの水分子（Ｗ１およびＷ２と標識）を
球体として示す。水素結合を、破線により示す。

【０１１９】図４ｂは、ＪＮＫ３の活性部位と、ｃＡＰＫの活性部位との詳細な比較である
。ＪＮＫ３およびｃＡＰＫのＡＴＰ結合部位の選択された残基の側鎖を伴うＣα
表示が含まれる。ＪＮＫ３二成分複合体およびｃＡＰＫ三次複合体におけるＡＭ
Ｐ−ＰＮＰの原子を、重ね合わせた。２つの酵素のＮ末端ドメインをうまく整列
し、他方でドメイン配向における相違は、ＣループおよびＤＦＧループにクラス
ター化した触媒残基（例えば、Ａｓｐｌ８９およびＡｓｐ２０７）と、Ｎ末端ド
メインの触媒残基（Ｌｙｓ９３）との誤整列をもたらす。

【０１２０】図５は、ＪＮＫアイソフォームの基質結合特異性である。ＪＮＫ３の溶媒接近
可能表面を、図３におけるＪＮＫ３およびｃＡＰＫの構造の同じ重ね合わせがな
された後にＰＫＩインヒビター（管として示す）とともに示す。ＪＮＫ１および
ＪＮＫ２において保存されていないＪＮＫ３の残基に対応する表面領域を斜線で
示す。アミノ酸配列整列から同定されたＪＮＫアイソフォームの多岐性領域の２
つのクラスターは、Ｃ末端葉におけるタンパク質表面において互いに隣に配置さ
れる。αＦおよびＬ１３を含む領域を、基質結合特異性をｃＪｕｎに対して指向
させるように示した。

【０１２１】（実施例５）（ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰの使用、インヒビター設計についての座標）図１の座標を使用して、ＪＮＫ３またはＪＮＫ３のホモログに関連する化合物
（阻害化合物を含む）を設計する。このプロセスは、１セットの機械実行可能な
指示を用いてコードされた機械読み取り可能なデータ記録媒体を備えるコンピュ
ータを用いて補助され得る。ここで、この記録された指示は、ＪＮＫ３／ＭＧＡ
ＭＰ−ＰＮＰ複合体またはその一部の三次元表示を提示し得る。このグラフ表示
を、本明細書において記載される方法に従って使用して、化合物を設計する。そ
のような化合物は、ＪＮＫ３と、活性部位にて会合する。

【０１２２】（実施例６）（ＪＮＫ３活性阻害アッセイ）（Ａ．ＪＮＫ３活性化）５ｍｇのＪＮＫ３を、１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、２０ｍＭＭ
ｇＣｌ₂、１ｍＭＡＴＰを含有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５
中に０．５ｍｇ／ｍｌに溶解した。ＧＳＴ−ＭＫＫ７（ＤＤ）キナーゼ（ＪＮＫ
３のキナーゼを活性化するうちの一つの上流の変異形態）を、１ＧＳＴ−ＭＫ
Ｋ７：２．５ＪＮＫ３のモル比で添加した。２５℃にて３０分後、反応混合物
を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で
の限外濾過により５倍に濃縮し、次いで１０ｍｌにまで希釈しなおし、そして、
さらに１ｍｌのＡＴＰを添加した。この手順を、３回反復して、ＡＤＰを除去し
、そしてＡＴＰを補充した。最終（三回目の）ＡＴＰの添加は、５ｍＭであり、
そしてその混合物を、４℃で一晩インキュベートした。

【０１２３】活性化ＪＮＫ３／ＧＳＴ−ＭＫＫ７（ＤＤ）反応混合物を、透析または限外濾
過によって、５ｍＭＤＴＴおよび５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ｗ／ｖ）を含む５０
ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５へと交換した。この反応混合物を、１．１
Ｍのリン酸カリウムｐＨ７．５に調整し、そしてＲａｉｎｉｎＨｙｄｒｏｐｏ
ｒｅカラムを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー（２５℃）により精製し
た。ＧＳＴ−ＭＫＫ７および不活化ＪＮＫ３は、これらの条件下では結合せず、
そして１．１Ｍから０．０５Ｍへのリン酸カリウム勾配を、６０分間に亙って１
ｍｌ／分の流速で展開する場合に、二重にリン酸化されたＪＮＫ３を、単一にリ
ン酸化されたＪＮＫから分離する活性化したＪＮＫ３（すなわち、二重にリン酸化された）を、０．２５〜１ｍ
ｇ／ｍｌにて−７０℃にて保存した。

【０１２４】（Ｂ．ＪＮＫ３阻害アッセイ）ＪＮＫ３に結合するその化合物のＩＣ₅₀を決定するために、ＪＮＫ３のキナー
ゼ活性を、連結した酵素アッセイによってモニターした。このアッセイにおいて
、ＪＮＫ３キナーゼ活性によって生成したＡＤＰのすべての分子について、ＮＡ
ＤＨの１つの分子を、ＮＡＤに変換する。ＮＡＤは、３４０ｎｍでの吸光度の減
少として簡便にモニターされ得る。以下は、このアッセイにおいて用いる種々の
試薬の最終濃度である：１００ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．６、１０ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、２５ｍＭ β−グリセロホスフェート、３０μＭＡＴＰ、２
ｍＭホスホエノールピルベート、２μＭピルベートキナーゼ、２μＭラクテート
デヒドロゲナーゼ、２００μＭＮＡＤＨ、２００μＭＥＧＦレセプターペプ
チドＫＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ、および１０ｎＭ活性化Ｊ
ＮＫ３。第一に、ＡＴＰを除いて上記の試薬の全てを混合し、そして１７５μｌ
のアリコートを、９６ウェルプレートの１ウェルごとに配置した。５μｌのその
化合物のＤＭＳＯ溶液を、各ウェルに添加し、混合し、そして３０℃で１０分間
放置した。代表的には、その化合物の約１０の異なる濃度を試験した。この反応
を、２０μｌのＡＴＰ溶液を添加することにより開始した。３４０ｎｍでの吸光
度の変化を、時間の関数としてモニターした。ＩＣ₅₀は、速度対化合物濃度デー
タを、単純な競合阻害モデルに対して適合させることによって入手する。

【０１２５】本発明者らは、本発明の多数の実施態様を記載してきたが、本発明者らの基本
的な構成を変更して本発明の産物、プロセスおよび方法を利用する他の実施態様
を提供し得ることは明白である。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範
囲によって規定され、例示として提示した特定の実施態様によっては規定されな
いということが認識される。

【０１２６】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、その複合体の結晶のＸ線回折により得られた、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰを
有する複合体におけるリン酸化されていないＪＮＫ３についての原子構造座標を
列挙する。以下の略語を図１で使用する：「原子型」とは、その座標が測定される元素をいう。欄の最初の文字は、元素
を規定する。「Ｘ、Ｙ、Ｚ」は、測定される元素の原子の位置を結晶学的に規定する。「Ｂ」は、その原子中心の周りの原子の挙動を測定する熱因子である。「Ｏｃｃ」は、各原子が座標により特定される位置を占める分子の画分をいう
占拠率である。「１」の値は、結晶の全ての分子において、各原子が同じ立体配
座、すなわち同じ位置を有することを示す。

【図１ａ】図１ａは、ＪＮＫ３、ＥＲＫ２、ｐ３８およびｃＡＰＫの構造に基づく配列ア
ラインメントである。

【図２ａ】図２ａは、ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰと複合体化したＪＮＫ３の折り畳み全体のリボ
ン表示である。

【図２ｂ】図２ｂは、ＪＮＫ３／ＭｇＡＭＰ−ＰＮＰとＥｒｋ２との構造を重ね合せた立
体視図である。

【図３】図３は、ＪＮＫ３とｃＡＰＫとの構造を重ね合せた立体視図である。

【図４ａ】図４ａは、ＪＮＫ３の活性部位の立体視図である。

【図４ｂ】図４ｂは、ＪＮＫ３の活性部位とｃＡＰＫの活性部位との詳細な比較である。

【図５】図５は、ＪＮＫアイソフォームの基質結合特異性である。

【図６】図６は、図７および図８の記憶媒体によりコードされる指示を実行するために
使用されるシステムの図を示す。

【図７】図７は、磁気性記憶媒体の断面を示す。

【図８】図８は、光学的に読取可能なデータ記憶媒体の断面を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月２１日（２００１．２．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１Ａ

【補正方法】追加

【補正内容】

【図１Ａ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８ // Ｃ１２Ｎ 15/09 17/30 １７０ＦＧ０６Ｆ 17/30 １７０Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 130 ＷａｖｅｒｌｙＳｔｒｅｅｔ，Ｃａｍｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 02139−4242，Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者グ，ヨンアメリカ合衆国マサチューセッツ 01748，ブルックリン，フリーマンストリート 119 (72)発明者マークランド，ウイリアムアメリカ合衆国マサチューセッツ 01757，ミルフォード，ウィンザーロード 26 (72)発明者ス，マイケルエス．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02159，ニュートン，ドナロード 15 (72)発明者カロン，ポールアール．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02148，モルデン，メイプルストリート 85 (72)発明者フォックス，エドワードアメリカ合衆国マサチューセッツ 01754，メイナード，リーブスロード４ (72)発明者ウィルソン，キースピー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 01748，ホプキントン，ロングウッドドライブ６Ｆターム(参考） 2G045 BA13 BA20 BB51 CB26 DA15 DA20 DA36 DA80 DB08 FA11 FA36 FB02 FB04 FB06 JA01 JA04 JA20 4B024 AA20 BA10 HA06 HA11 4B050 CC07 JJ10 KK13 LL10 5B046 AA00 GA01 GA09 5B075 ND03 ND06 NK07 NK50 UU19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】結晶化可能な組成物であって、以下：ａ）リン酸化されていないＪＮＫ１、リン酸化されていないＪＮＫ２、リン酸
化されていないＪＮＫ３、または酵素のリン酸化されていないアイソフォームか
ら選択される精製された酵素であって、ここで該酵素は、約２０アミノ酸のＣ−
末端欠失を含み、該酵素がリン酸化されていないＪＮＫ３である場合には、該酵
素はさらに約４０アミノ酸のＮ−末端欠失を含む、酵素；ｂ）加水分解不可能なＡＴＰアナログまたは自殺基質；ｃ）マグネシウムイオン；ｄ）約１０〜３０％ｖ／ｖの間のポリエチレングリコールモノメチルエーテ
ル；ｅ）約５〜２０％ｖ／ｖの間のエチレングリコール；ｆ）約５〜５０ｍＭの間の最終濃度の還元剤；およびｇ）約７．０と７．５との間のｐＨを維持する緩衝剤；を含有する、組成物。
【請求項２】前記リン酸化されていないＪＮＫ３酵素がＪＮＫ３α１であ
る、請求項１に記載の結晶化可能な組成物。
【請求項３】前記加水分解不可能なＡＴＰアナログがＡＭＰ−ＰＮＰであ
る、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】２．３Åの解像度で解像され得る結晶化された複合体であっ
て、以下：ａ）リン酸化されていないＪＮＫ１、リン酸化されていないＪＮＫ２、リン酸
化されていないＪＮＫ３、または該酵素のリン酸化されていないアイソフォーム
から選択される精製された酵素であって、ここで該酵素は、約２０アミノ酸のＣ
−末端欠失を含み、該酵素がリン酸化されていないＪＮＫ３である場合には、該
酵素はさらに約４０アミノ酸のＮ−末端欠失を含む、酵素；ｂ）加水分解不可能なＡＴＰアナログまたは自殺基質；およびｃ）マグネシウムイオン；を含有する、複合体。
【請求項５】前記リン酸化されていないＪＮＫ３酵素がＪＮＫ３α１であ
る、請求項４に記載の結晶化された複合体。
【請求項６】前記加水分解不可能なＡＴＰアナログがＡＭＰ−ＰＮＰであ
る、請求項４に記載の結晶化された複合体。
【請求項７】結晶を得る方法であって、該結晶は、リン酸化されていない
ＪＮＫ１、リン酸化されていないＪＮＫ２、リン酸化されていないＪＮＫ３、ま
たは該酵素のリン酸化されていないアイソフォームから選択される精製された酵
素を含み、該結晶は、２．３Åの解像度で解像され得、そして請求項１または２
に記載の組成物を、結晶化を促進する条件に供する工程を包含する、方法。
【請求項８】コンピュータであって、ａ）分子または分子複合体であって、ここで該分子または分子複合体は、図１
に記載のＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、
Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、
Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍ
ｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙ
ｓ１９１、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６、およびＬｅｕ２０６の
構造座標によって規定される結合ポケットを含む、分子または分子複合体；また
はｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、ここで該ホモログは、１．
５Åを超えない該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を有する結合ポケッ
ト含む、ホモログ、の三次元表示を作製するためのコンピュータであって、ここで、該コンピュータは、以下：（ｉ）機械読みとり可能データでコードされたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データが、図１に記載のＪＮＫ３
アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌ
ｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌｕ１１１、Ｉ
ｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓ
ｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙｓ１９１、Ｓｅｒ
１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６、およびＬｅｕ２０６の構造座標を含む、
データ記憶媒体；（ｉｉ）該機械読みとり可能データを処理するための命令を記憶するためのワ
ーキングメモリ；（ｉｉｉ）該機械読みとり可能データを該三次元表示へと処理するための、該
ワーキングメモリおよび該機械読みとり可能データ記憶媒体に連結された中央演
算処理装置；ならびに（ｉｖ）該三次元表示を表示するための該中央演算処理装置に連結されたディ
スプレイ装置、を備える、コンピュータ。
【請求項９】請求項８に記載のコンピュータであって、ここで該コンピュ
ータは、ａ）図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇ
ｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃ
ｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌａ９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌ
ｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１
２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１４５、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４
７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２
、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、
Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖ
ａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６、およびＡｓｐ２０７の構造座標によ
って規定される結合ポケットを含む、分子または分子複合体；またはｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、ここで該ホモログは、１．
５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を有する結合ポケット含
む、ホモログの三次元表示を作製するためのコンピュータであって、そしてここで、該機械読みとり可能データは、図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ
７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ
７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌａ
９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａｒ
ｇ１０７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ
１４５、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１
５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１５
５、Ａｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４
、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６、
およびＡｓｐ２０７の構造座標を含む、コンピュータ。
【請求項１０】請求項８または９に記載のコンピュータであって、ここで
該コンピュータは、ａ）図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸の構造座標によって規定される、分子また
は分子複合体；またはｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、ここで該ホモログは、１．
５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を有する結合ポケット含
む、ホモログ、の三次元表示を作製するためのコンピュータであって、そしてここで、該機械読みとり可能データは、図１に記載のＪＮＫ３複合体の該座標
を含む、コンピュータ。
【請求項１１】分子または分子複合体から得られたＸ線回折データに対応
する構造座標の少なくとも一部を決定するためのコンピュータであって、ここで
該コンピュータは、以下：ａ）機械読みとり可能なデータでコードされたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データは、図１に記載のＪＮＫ３
複合体の構造座標の少なくとも一部を含む、データ記憶媒体；ｂ）機械読みとり可能なデータでコードされたデータ記憶材料を含む機械読み
とり可能なデータ記憶媒体であって、ここで該データは、該分子または分子複合
体から得られたＸ線回折データを含む、データ記憶媒体；ｃ）（ａ）および（ｂ）の該機械読みとり可能データを処理するための命令を
記憶するためのワーキングメモリ；ｄ）（ａ）の機械読みとり可能データのフーリエ変換を実行するため、および
（ｂ）の該機械読みとり可能データを構造座標に処理するために、該ワーキング
メモリならびに（ａ）および（ｂ）の該機械読みとり可能データ記憶媒体に連結
された中央演算処理装置；ならびにｅ）該分子または分子複合体の該構造座標を表示するために該中央演算処理装
置に連結されたディスプレイ装置、を備える、コンピュータ。
【請求項１２】化学的実体の可能性を評価するための方法であって、該化学
的実体は、ａ）図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌ
ｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙ
ｓ９３、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１
４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５
５、Ｌｙｓ１９１、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６、およびＬｅｕ
２０６の構造座標によって規定される結合ポケットを含む、分子または分子複合
体；またはｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、ここで該ホモログは、１．
５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を有する結合ポケット含
む、ホモログ、と関連し、ここで、該方法は、以下の工程：（ｉ）該化学的実体と該分子または分子複合体の結合ポケットとの間の一致操
作を実行するためのコンピュータ手段を利用する工程；および（ｉｉ）該化学的実体と該結合ポケットとの間の関連を定量するための該一致
操作の結果を分析する工程；および（ｉｉｉ）該定量した関連性を適切な出力ハードウェアに出力する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法であって、ここで該方法は、ａ）図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸Ｉｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇ
ｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃ
ｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌａ９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌ
ｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１
２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａｌ１４５、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４
７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２
、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１５５、Ａｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、
Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖ
ａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６、およびＡｓｐ２０７の構造座標によ
って規定される結合ポケットを含む、分子または分子複合体；またはｂ）該分子または分子複合体のホモログであって、ここで該ホモログは、１．
５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を有する結合ポケット含
む、ホモログ、に関連する化学的実体の可能性を評価する、方法。
【請求項１４】請求項１２または１３に記載の方法であって、ここで該方
法は、ａ）図１に記載のＪＮＫ３アミノ酸の一組の構造座標によって規定される分子
または分子複合体；またはｂ）１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を有する、該
分子または分子複合体のホモログ、と関連する化学的実体の可能性を評価する、方法。
【請求項１５】その構造が未知である分子または分子複合体に関する構造
情報を得る方法であって、以下の工程：ａ）未知の構造の該分子または分子複合体を結晶化する工程；ｂ）該結晶化された分子または分子複合体からのＸ線回折パターンを生成する
工程；ｃ）図１に示される構造座標の少なくとも一部を、Ｘ線回折データに適用して
、その構造が未知である該分子または分子複合体の少なくとも一部の三次元電子
密度マップを作製する工程、を包含する、方法。
【請求項１６】ＪＮＫ３様結合ポケットを含む分子の潜在的なアゴニスト
またはアンタゴニストを同定するための方法であって、以下の工程：ａ）図１に記載のＩｌｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、Ａｌａ
７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｖａｌ７８、Ａｌａ９１、Ｌｙｓ９３、Ｇｌｕ
１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１
４９、Ａｓｐ１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｇｌｎ１５５、Ｌｙｓ１９
１、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９４、Ｖａｌ１９６、およびＬｅｕ２０６の原子座
標±１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差を使用して、Ｊ
ＮＫ３様結合ポケットを含む分子の三次元構造を作製する工程；ｂ）該三次元構造を利用して、該潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストを
設計または選択する工程；ｃ）該アゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程；およびｄ）該アゴニストまたはアンタゴニストを該分子と接触させて、該分子と相互
作用する該潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストの能力を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法であって、前記図１に記載のＩｌ
ｅ７０、Ｇｌｙ７１、Ｓｅｒ７２、Ｇｌｙ７３、Ａｌａ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌ
ｙ７６、Ｉｌｅ７７、Ｖａｌ７８、Ｃｙｓ７９、Ａｌａ８０、Ｖａｌ９０、Ａｌ
ａ９１、Ｉｌｅ９２、Ｌｙｓ９３、Ｌｙｓ９４、Ｌｅｕ９５、Ｈｉｓ１０４、Ａ
ｒｇ１０７、Ｇｌｕ１１１、Ｉｌｅ１２４、Ｓｅｒ１２５、Ｌｅｕ１４４、Ｖａ
ｌ１４５、Ｍｅｔ１４６、Ｇｌｕ１４７、Ｌｅｕ１４８、Ｍｅｔ１４９、Ａｓｐ
１５０、Ａｌａ１５１、Ａｓｎ１５２、Ｌｅｕ１５３、Ｃｙｓ１５４、Ｇｌｎ１
５５、Ａｓｐ１８９、Ｌｙｓ１９１、Ｐｒｏ１９２、Ｓｅｒ１９３、Ａｓｎ１９
４、Ｉｌｅ１９５、Ｖａｌ１９６、Ｖａｌ１９７、Ｌｙｓ２０４、Ｌｅｕ２０６
、およびＡｓｐ２０７の原子座標±１．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの
根平均２乗偏差が使用されて、ＪＮＫ３様結合ポケットを含む分子の三次元構造
を作製する、方法。
【請求項１８】請求項１６または１７に記載の方法であって、ここで前記
図１に記載のＪＮＫ３のアミノ酸の原子座標±１．５Å以下の該アミノ酸の骨格
原子からの根平均２乗偏差が使用されて、ＪＮＫ３様結合ポケットを含む分子の
三次元構造を作製する、方法。