JP2003514525A - メタロプロテアーゼファミリーのヒト酵素 - Google Patents

メタロプロテアーゼファミリーのヒト酵素

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igs5
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ヴィーガース リコ
ヴェスケ ミヒャエル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＩＧＳ５と呼称する、新規に同定されたポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、療法および療法において効果的に使用される刺激物質および／またはインヒビターであってもよい化合物を同定するためのこれらの使用、およびこのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造に関する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、メタロプロテアーゼファミリーに関連し、好ましくはヒト型のメタロプロテアーゼファミリーに関連する。また、本発明は、このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの作用の阻害または刺激／活性、このようなポリヌクレオチドを含有するベクターおよびこのようなベクターを含有するホスト細胞に関する。さらに、本発明は、前記ＩＧＳ５酵素の刺激物質またはインヒビターとして作用することが可能な化合物のスクリーニング方法に関する。本発明のポリペプチドは、幾つかの機能不全、障害または疾病に関連して重要である。本発明のポリペプチドは、特に、心臓血管疾患に関して特に重要である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明は、新たに同定されたポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、療法のための使用および療法で効果的に使用される
刺激物質および／またはインヒビターであってもよい化合物の同定のための使用
、ならびにこのようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造に関する。よ
り詳細には、本発明によるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ポリペプチ
ドのメタロプロテアーゼファミリーのメンバーまたは構造的および機能的関連ポ
リペプチドの特別なファミリーのメンバーである酵素に関する。これらの酵素は
、以下ＩＧＳ５と呼称する。さらに、本発明は、このようなポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドの活性の阻害または刺激／活性化、前記ポリヌクレオチドを含
有するベクターおよびこのようなベクターを含有するホスト細胞に関する。さら
に、本発明は、前記ＩＧＳ５酵素の刺激物質またはインヒビターとして作用する
ことが可能な化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【０００２】 背景技術 医薬物質開発プロセスは、近年になって、“機能的ゲノム”、すなわち、高い
情報量を有するゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を含む、本質的な変革がおこ
なわれている。治療的ターゲットとして遺伝子および遺伝子産物を同定する手段
としてのこの試みは、“ポジショナルクローニング”に基づく簡単な前述の早期
のアプローチである。表現型、すなわち、生物学的機能障害または遺伝病は同定
することができ、その後に、その遺伝地図の位置に基づいて、原因となる遺伝子
を追跡することができる。
【０００３】 機能的ゲノムは、高い情報量のＤＮＡシークエンシング技術および現在利用可
能な多くの分子生物学データベースから潜在的に重要性な遺伝子配列を同定する
ための種々のバイオインフォマティクスツールに基づくものである。医薬物質開
発のためのターゲットとして、なおも他の遺伝子およびそれに関連するポリペプ
チド／タンパク質を同定し、特徴付ける必要性がある。
【０００４】 医薬物質の開発において重要なポリペプチドとして、メタロプロテアーゼおよ
び特に構造的および機能的関連酵素のファミリーがある。幾つかの疾病が同定さ
れ、その際、メタロプロテアーゼは、疾病の病理学において重要な役割を示す。
たとえば、亜鉛メタロプロテアーゼまたは構造的および機能的関連酵素の特別な
ファミリーのメンバーは、従来技術において同定され、特徴付けられ、かつ、こ
れらの酵素、たとえば、亜鉛メタロプロテアーゼの関与が、正常の状態および疾
病の状態の双方を含む生物学的機能の種々の配列中で作用することが明らかにな
った。亜鉛メタロプロテアーゼは、触媒的機能が、活性部位での亜鉛イオンに決
定的に依存するこのような酵素のサブセットである。配列および構造的情報の双
方に基づいてクラス分けされた種々のファミリーを含有するこの酵素群は、たと
えば、胚の発達、血管および骨形成、ペプチドホルモンの生成、生殖、心臓血管
障害、関節炎および癌のプロセスにおいて、密接に関与し含まれるべきことが記
載されている。すでに、いくつかの亜鉛メタロプロテアーゼの活性部位の直接的
なインヒビターは、治療的に、たとえば、抗高血圧症の治療において使用されて
いる。
【０００５】 亜鉛メタロプロテアーゼの亜鉛結合部位周囲の配列および構造的情報に基づい
て、これらの酵素は、いくつかのファミリーに分類され、この場合、これは、さ
らに、たとえば、“メトジンシン（metzincins）”（アスタシン、セラチア、レ
プロライシン、マトリクシン）、“グルジンシン（gluzincins）”（セルモリシ
ン、ネプリライシン、アンジオテンシン変換酵素、アミノペプチダーゼ）のスー
パーファミリー、またはメトジンシンおよびグルジンシンのスーパーファミリー
を含む“ジンシン”のようなスーパーファミリーに分類される。このようなグル
ープ分けは、一般的な触媒的および生合成的プロセス機構の解明手段であるばか
りか、さらに、亜鉛結合モチーフとの類似する新規に同定されたタンパク質の機
能の解明において非常に評価されている。メタロプロテアーゼのいくつかの独立
した例は、たとえば、すでに従来技術において同定された亜鉛酵素であり、この
場合、これは、ネプリライシン、エンドセリン変換酵素、アンジオテンシン変換
酵素、セモライシン、アミノペプチダーゼ、アスタシン、セラチア、レプロライ
シン、マトリクシン、インシュリナーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびＤＤ−
カルボキシペプチダーゼを含む。
【０００６】 従来技術に基づく前記の証明から、メタロプロテアーゼおよび特定の構造的お
よび機能的関連酵素は、健康および疾病の鍵となるものであることが明らかにな
った。したがって、依然として、この酵素群に関しての重要な機能および潜在的
な治療的適用をさらに発見し、かつ、新規の合成刺激因子（アクチベーター）ま
たはインヒビターの二次的な発生を有する新規メタロプロテアーゼを提供する必
要性があり、この場合、これは、社会経済学的に重要な、種々の疾病の新規治療
方法を提供するのに役立つ。
【０００７】 発明の開示 一つの態様において、本発明は、ＩＧＣＳ５、特にＩＧＳ５ポリペプチドおよ
びＩＧＳ５ポリヌクレオチド、好ましくは、ヒトに関連するこれらのもの、組換
体およびこれらの製造方法に関する。他の態様において、本発明は、このような
ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組換え体を使用する方法に関し、この場
合、これは、ポリペプチド様のメタロプロテアーゼまたは構造的または機能的関
連酵素の特定のファミリーが、以下に一般に“疾病”とする、治療すべき機能不
全、障害または疾病の病理学において重大な役割を示す、疾病の治療を含む。本
発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用に関して有用であるとされる
疾病の例は：精神分裂病、偶発発作性不安障害（ＥＰＡ）、たとえば、強迫性障
害（ＯＣＤ）、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、恐怖症およびパニックを含む
ＣＮＳ障害、強抑鬱障害、双極性障害、パーキンソン氏病、汎性不安障害、自閉
症、せん妄、多発性硬化症、アルツハイマー氏病／痴呆および他の神経変性障害
、重症精神遅滞および運動異常症、たとえば、ハンチントン病またはジル・ド・
ラ・ツレット症候群、拒食症、多食症、発作、嗜癖／依存／欲求、睡眠障害、て
んかん、片頭痛；注意欠陥障害／多動性障害（ＡＤＨＤ）；心臓血管障害、たと
えば、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心臓血管肥大、低血圧症、高血圧症
、たとえば、本態性高血圧症、腎性高血圧症、肺性高血圧症、血栓症、動脈硬化
症、大脳血管痙攣、クモ膜下出血、大脳虚血、脳梗塞、周囲血管障害、レイノー
病、腎臓病、たとえば、腎不全、異脂肪症（dyslipidemias）；肥満症、嘔吐；
胃腸障害、たとえば、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸障害（ＩＢＤ）、胃
腸性弛緩障害（gastroesophagal reflux disease）（ＧＦＲＤ）、自動運動性障
害および遅延性空腹状態、たとえば、胃潰瘍、下痢、骨粗鬆症を含む他の疾病；
炎症；たとえば、細菌、真菌、原虫およびウイルス感染による感染症、特に、Ｈ
ＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって生じる感染症；疼痛、癌、化学療法誘発性障
害；腫瘍浸潤；免疫障害；尿閉；喘息；アレルギー；関節炎；良性前立腺肥大症
；エンドトキシンショック；敗血症；糖尿病の合併症である。他の態様において
、本発明は、本発明によって提供された材料を用いて、アゴニストおよびアンタ
ゴニストまたはインヒビターを同定するための方法、および同定された化合物を
用いてのＩＧＳ５不均衡に付随する症状を治療するための方法に関する。さらな
る態様において、本発明は、不適切なＩＧＳ５活性またはレベルに付随する疾病
を検出するための診断アッセイに関する。
【０００８】 本発明によるポリペプチドは、特に、心臓血管障害に関して重要である。
【０００９】
【表１】
【００１０】
【表２】
【００１１】
【表３】
【００１２】
【表４】
【００１３】
【表５】
【００１４】
【表６】
【００１５】 本発明の詳細な記載 略記 以下の略記は、本明細書中においてしばしば使用される特定の用語の理解を容
易にするために提供される。
【００１６】 “ＩＧＳ５”は、特に、配列番号２、配列番号４および配列番号６の一つにお
いて示されるアミノ酸配列か、またはこれらのそれぞれの変異体を含有するポリ
ペプチドに関する。したがって、“ＩＧＳ５”は、特に、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ、Ｉ
ＧＳ５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳＰＲＯＴ２を含む。
【００１７】 “酵素活性”または“生物学的活性”は、類似する活性または改善された活性
か、または望ましくない副作用を減少されたこれらの活性を含む前記ＩＧＳ５の
代謝機能または生理学的機能に関する。さらに、前記ＩＧＳ５の抗原的活性およ
び免疫学的活性をも含む。
【００１８】 “ＩＧＳ５−遺伝子”は、配列番号１、配列番号３および配列番号５の一つに
おいて示されるヌクレオチド配列か、またはそれぞれの変異体、たとえば、これ
らの対立変異体（alleic variants）および／またはこれらの補体に関する。
【００１９】 ここで使用される“抗体”は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントを
含み、この場合、Ｆａｂフラグメントは、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現
ライブラリーの産物を含むものである。
【００２０】 “単離された”は、天然の状態から“ヒトの手によって”改変されたか、およ
び／または天然の環境から分離されたことを意味する。したがって、天然におい
て生じる“単離された”組成物または物質が“単離される”場合には、その本来
の環境から変更されているかまたは取り除かれているか、あるいはその双方であ
る。たとえば、生存する動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは、“単離”されていないが、しかしながら、その天然の状態で共存する
材料から分離された、同様のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書
中において“単離”の用語を使用する。
【００２１】 “ポリヌクレオチド”は、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドに関し、この場合、これは、修飾されていないＲＮＡま
たはＤＮＡであるか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡに関する。“ポリ
ヌクレオチド”は、制限することなく、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、この場合、
ＤＮＡは、一本鎖および二本鎖領域の混合物であり、および一本鎖および二本鎖
ＲＮＡ、この場合、ＲＮＡは一本鎖および二本鎖領域の混合物であるを含み、そ
の際、ハイブリッド分子は、一本鎖であるか、あるいはより典型的には二本鎖ま
たは一本鎖または二本鎖領域の混合物であってもよい。さらに、“ポリヌクレオ
チド”は、ＲＮＡまたＤＮＡであるか、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含
有する３重鎖（triple-strand）領域に関する。また、“ポリヌクレオチド”の
用語は、一つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡｓまたはＲＮＡ
ｓおよび安定性かまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡｓまた
はＲＮＡｓを含む。“修飾された”塩基は、たとえば、トリチル化された塩基お
よび通常ではない塩基、たとえばイノシンを含む。種々の修飾は、ＤＮＡおよび
ＲＮＡになされていてもよく；したがって、“ポリヌクレオチド”は、典型的に
天然の状態で見出されるような、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝
的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特異的
な化学的形態を含む。さらに、“ポリヌクレオチド”は、相対的に短いポリヌク
レオチドを含み、しばしば、オリゴヌクレオチドに関する。
【００２２】 “ポリペプチド”は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち
、ペプチド アイソステレス（peptide isosteres）によって、互いに結合され
た２個またはそれ以上のアミノ酸を含有する任意のペプチドまたはタンパク質に
関する。“ポリペプチド”は、短鎖、一般的にはペプチドとしてのオリゴペプチ
ドまたはオリゴマー、および長鎖、一般的にはタンパク質の双方に関する。ポリ
ペプチドは、遺伝子でコードされた２０アミノ酸以外のアミノ酸を含有していて
もよい。“ポリペプチド”は、自然な方法、たとえば、翻訳後プロセシングによ
って修飾されたか、あるいは従来公知の化学的修飾技術によって修飾されたアミ
ノ酸配列を含む。このような修飾は、基本書およびより詳細な研究論文、ならび
に大部の研究書中において十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミ
ノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、ポリペプチド中の任意
の箇所で生じてもよい。適切には、修飾の同様の型は、同じかまたは異なる頻度
で、得られたポリペプチドの幾つかの箇所において存在していてもよい。さらに
、得られたポリペプチドは、多数の修飾の型を有していてもよい。ポリペプチド
は、ユビキチン化の結果として分枝になっていてもよく、かつこれらは分枝かま
たは非分枝の環状であってもよい。環状、分枝または分枝の環状ポリペプチドは
、翻訳後の自然な工程から生じてもよいか、あるいは、合成工程によって生じて
もよい。修飾は、アセチル化、アクリル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビ
オチン化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌク
レオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合；架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カル
ボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、
メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、ホスホリル化、
プレニレーション（Prenylation）、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパ
ク質へのトランスファーＲＮＡ介在型アミノ酸付加、たとえば、アルギニル化、
およびユビキチン化（たとえば、“Proteins-Structure and Molecular Propert
ies”,2ndEd., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993;
Wold, F., “Post-tranlational Protein Modifications: Prespectives and Pr
ospects”, pp. 1-12 in “Post-translational Covalent Modification of Pro
teins”, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; seifter et a
l., “Analysis for Protein modifications and nonprotein cofactors”, Met
h. Enzymol. (1990) 182: 626-646; and Rattan et al., “Protein Synthesis:
Post-translational Mdification and Aging”, Ann. NY Acad. Sci. (1992) 6
63:48-62）を含む。
【００２３】 “変異体”は、それぞれ、基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関するが、しかしながら、本質
的な特性を保持するものである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、他の、
基準となるヌクレオチドとはヌクレオチド配列において異なるものである。変異
体のヌクレオチド配列の変化は、基準となるポリヌクレオチドによってコードさ
れたポリペプチドのアミノ酸配列を改変するかまたはしないものであってもよい
。ヌクレオチドの改変は、以下に記載しているように、基準となる配列によって
コードされたポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断（tr
uncation）を生じうる。ポリペプチドの典型的な変異体は、他の、基準となるポ
リヌクレオチドのアミノ酸配列とは異なる。一般に、差異は、基準となるポリペ
プチドおよび変異体の配列が、すべてのおいて非常に類似しており、かつ、多く
の領域において同一である程度に制限される。変異体および引用されたポリペプ
チドは、一つまたはそれ以上の置換、付加および欠失の任意の組み合わせによっ
て、アミノ酸配列中で異なっていてもよい。置換されたかまたは挿入されたアミ
ノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるかまたはされていなくてもよい
。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、天然に生じるような、たと
えば対立変異であってもよいか、または天然に生じることが知られていない変異
であってもよい。天然的に生じることのないポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの変異は、突然変異技術または直接的な合成によって製造されてもよい。
【００２４】 性質における同一性の尺度として公知である“同一性”は、配列を比較するこ
とによって測定されるような、２個またはそれ以上のポリペプチド配列であるか
、あるいは２個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関連性である。性質
において、さらに“同一性”は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の
配列関連性の度合いを意味し、場合によっては、このような一連の配列の一致に
よって、たとえば、一般には、最も高い頻度での一致が得られる程度に、配列を
整列させることによって測定される。したがって、“同一性”またはいいかえれ
ば“類似性”は、技術的に認識されている意味を有し、かつ、公知方法によって
簡単に算定されてもよく、この場合、この方法は、制限することなく、“Comput
ational Molecular Biology”, Leck, A.M. Ed., Oxford University Press, Ne
w York, 1988; “Biocomputing: Informatics and Genome Projects”, Smith,
D.W., Ed., Academic Press. New York, 1993; “Computer Analysis of Sequen
ce Data”, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., Eds., Humena Press,
New Jersey, 1994; “Sequence Analysis in Molecular Biology”von Heinje,
G., Academic Press, 1987; “Sequence Analysis Primer”, Gribskob, M. an
d Devereux, J., Eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H.,
and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) の記載を含む。同
一性を測定するための好ましい方法は、試験された配列間での最も大きい一致を
生じるように設定された。同一性および類似性を測定するための方法は、公的に
入手可能なコンピュータープログラム中で確立されている。２個の配列間の同一
性および類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラムは、制限す
ることなく、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Ac
ids Research 12 (1): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＡＰ、ＢＬＡＳＲＮおよびＦ
ＡＳＴＡ（Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)）を
含む。ＢＬＡＳＴ Ｘ プログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に入
手可能である（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Betgesda,
MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）。さ
らに、よく知られたスミス ウオーターマン アルゴリズム（Smith Waterman a
lgorithm）は、同一性を測定するために使用されてもよい。それぞれ、ポリペプ
チド配列またはポリヌクレオチド配列の同一性または類似性を測定するために有
用な、公的に入手可能なプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩからの“ｇａｐ”プログラムとして公知であ
り、この場合、これは、通常は、比較のためのディフォールトパラメーターとし
て実施される（エンドギャップのためのペナルティーはないことに加えて）。ポ
リペプチド配列比較のための好ましい（すなわち、ディフォールト）パラメータ
ーは、以下のものを含む：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ および Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８ ４４３〜４５３（１９７０）；Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆおよ
びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９
：１０９１５−１０９１９からのＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯ
ＳＳＵＭ６２：Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：１２；Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ：１４で記載されている。ポリヌクレオチド配列比較のための好ましい
（すなわち、ディフォールト）パラメーターは、以下のものを含む：Ｎｅｅｄｌ
ｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１
９７０）によって記載されたアルゴリズム；Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍａｔｒｉ
ｘ：一致＝＋１０、不一致＝０；Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：５０；Ｇａｐ Ｌｅ
ｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：３。用語“相同性”は、用語“同一性”に置き換え
ることができる。
【００２５】 例証されているように、引用されたヌクレオチド配列、たとえば、配列番号１
；配列番号３および配列番号５の群から選択されたヌクレオチド配列に対して、
少なくとも、たとえば９５％の“同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ポリヌクレ
オチド配列が、それぞれ引用されたヌクレオチド配列の１００個のヌクレオチド
に対して５箇所までの突然変異を含んでいてもよいことを除いて、引用された配
列と同一である。いいかえれば、引用されたヌクレオチド配列に対して少なくと
も９５％が同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために
、引用された配列中の５％までのヌクレオチドが、欠如していてもよいかまたは
他のヌクレオチドによって置換されていてもよいか、あるいは、引用された配列
中の総ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が、引用された配列中に挿入さ
れていてもよいか、あるいは、引用された配列中の総ヌクレオチドの５％までの
ヌクレオチド数が、欠失、挿入および置換の組み合わせであってもよい。引用さ
れた配列のこれらの突然変異は、引用されたヌクレオチド配列の５’または３’
末端の位置であるか、あるいは、これらの末端位置の任意の位置で生じてもよく
、この場合、これは、相当するヌクレオチド中か、あるいは相当する配列の範囲
内の一つまたはそれ以上の隣接する群において、別個に散在していてもよい。
【００２６】 同様に、引用されたアミノ酸配列、たとえば、配列番号２、配列番号４および
配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも、たとえば９
５％の“同一性”を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、ポリペ
プチドのアミノ酸配列は、ポリペプチドが、それぞれ引用されたアミノ酸の１０
０個のアミノ酸に対して５個までのアミノ酸改変が含まれていてもよいことを除
いて、引用された配列と同一である。いいかえれば、引用されたアミノ酸配列に
対して、少なくとも９５％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得
るために、引用された配列中の５％までのアミノ酸残基が、欠失しているかまた
は他のアミノ酸によって置換されていてもよいか、あるいは、引用された配列中
の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸の数が、引用された配列中に挿入されて
いてもよい。引用された配列のこれらの変異は、引用されたアミノ酸配列のアミ
ノ末端かまたはカルボキシ末端で生じるか、あるいはこれら末端間の任意の位置
においても生じてもよく、この場合、これは、引用された配列中かまたは引用さ
れた配列の範囲内の一つまたはそれ以上の隣接する群中の残基中に、別個に散在
されていてもよい。
【００２７】 “相同性”は、対象となる配列に対して技術において高い度合いの配列関連性
を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示す、遺伝学的用語として
使用されている。このような関連性は、ここで比較されている配列間の同一性お
よび／または類似性の度合いを測定することによって計量することができる。こ
よく知られた遺伝学的用語は、“オルトログ”であり、この場合、これは、異な
る種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的に等しいであるポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、かつ、“パラログ”は、同種の範囲
であるとみなされる場合に、機能的に類似している配列を意味する。したがって
、たとえば、ヒトにおいて、エンドセリン変換酵素 ＥＣＥ−１のファミリーの
範囲内で、他のパラログのメンバーは、たとえばＥＣＥ−２である。
【００２８】 “融合タンパク質”は、しばしば関連のない、融合された遺伝子かまたはこれ
らのフラグメントの２個によってコードされたタンパク質に関する。この用語は
、たとえば、免疫グロブリン分子の一定の領域の種々の部分と一緒に他のヒトタ
ンパク質またはこれらの一部分を含有する融合タンパク質によって例証されても
よい。多くの場合において、融合タンパク質の一部分として、免疫グロブリンの
Ｆｃ領域を使用することは、治療および診断の用途において有利であり、たとえ
ば、改善された薬物動態的性質を生じる（たとえば、ＥＰ−Ａ ０２３２２６２
）。他方において、幾つかの使用に関して、融合タンパク質が発現し、検出され
、かつ精製した後にＦｃ部位を排除可能であることは好ましい。
【００２９】 本発明のポリペプチド 本発明は、ＩＧＳ５ポリペプチド（またはＩＧＳ５酵素、たとえばそれぞれＩ
ＧＳ５ＰＲＯＴ、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１またはＩＧＳ５ＰＲＯＴ２）、特に、ヒト
ＩＧＳ５ポリペプチド（またはヒトＩＧＳ５酵素）、さらには、前記の完全なＩ
ＧＳ５ポリペプチドの本質的な部分を含有するＩＧＳ５ポリペプチドフラグメン
トに関する。したがって、第１の態様として、本発明によるＩＧＳ５ポリペプチ
ドは、単離されたポリペプチド、特に単離されたヒト種のポリペプチドを含み、
この場合、これは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択され
た一つに対して、それぞれ配列番号２、配列番号４および配列番号６の全長上で
、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％および特に少なくと
も８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましく
は少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するアミノ酸配列を含有する。このようなポリペプチドは、配列番号２、配
列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一つを含有するも
のを含む。
【００３０】 第２の態様において、本発明のＩＧＳ５ポリペプチドは、単離されたポリペプ
チド、特に、単離されたヒトＩＧＳ５ポリペプチドを含み、この場合、これは、
配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸配列の一
つに対して、それぞれ、配列番号２、配列番号４および配列番号６の全長上で、
少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％および特には少なくとも８５％
、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も
好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含有してい
る。このようなポリペプチドは、それぞれ、配列番号２、配列番号４および配列
番号６のＩＧＳ５ポリペプチドを含む。
【００３１】 本発明の他のポリペプチドは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の一
つを含む配列を含有する、単離されたＩＧＳ５ポリペプチドを含み、かつ、特に
はヒト種ポリペプチドである。
【００３２】 本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのメタロプロテアーゼファミリーのメ
ンバーである。これらは、メタロプロテアーゼが、疾病の病理学において重要な
役割を示す幾つかの機能不全、障害または疾病が同定されておりことから重要で
ある。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用を包含する、疾病の
例は、以下のものを含むことが有用であると考えられている：ＣＮＳ障害、この
場合、これは、精神分裂病、偶発発作性不安障害（ＥＰＡ）、たとえば、強迫性
障害（ＯＣＤ）、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、恐怖症およびパニックであ
り、強抑鬱障害、双極性障害、パーキンソン氏病、汎性不安障害、自閉症、せん
妄、多発性硬化症、アルツハイマー氏病／痴呆および他の神経変性障害、重症精
神遅滞および運動異常症、たとえば、ハンチントン病またはジル・ド・ラ・ツレ
ット症候群、拒食症、多食症、発作、嗜癖／依存／欲求、睡眠障害、てんかん、
片頭痛、注意欠陥障害／多動性障害（ＡＤＨＤ）；心臓血管障害、たとえば、心
不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心臓血管肥大、低血圧症、高血圧症、たとえ
ば、本態性高血圧症、腎性高血圧症、肺性高血圧症、血栓症、動脈硬化症、大脳
血管痙攣、クモ膜下出血、大脳虚血、脳梗塞、周囲血管障害、レイノー病、腎臓
病、たとえば、腎不全、異脂肪症（dyslipidemias）；肥満症、嘔吐；胃腸障害
、たとえば、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸障害（ＩＢＤ）、胃腸性弛緩
障害（gastroesophagal reflux disease）（ＧＦＲＤ）、自動運動性障害および
遅延性空腹状態、たとえば、胃潰瘍、下痢、骨粗鬆症を含む他の疾病；炎症；た
とえば、細菌、真菌、原虫およびウイルス感染による感染症、特に、ＨＩＶ−１
またはＨＩＶ−２によって生じる感染症；疼痛、癌、化学療法誘発性障害；腫瘍
浸潤；免疫障害；尿閉；喘息；アレルギー；関節炎；良性前立腺肥大症；エンド
トキシンショック；敗血症；糖尿病の合併症である。本発明のポリペプチドは、
特に心臓血管性疾病に関して重要である。さらに、本発明のＩＧＳ５ポリペプチ
ドは、これらポリペプチドの刺激物質またはインヒビターを同定し、不適切なＩ
ＧＳ５活性またはレベルに付随する疾病を検出するための診断方法を提供し、か
つ、刺激物質またはインヒビターであると同定された化合物を用いて、ＩＧＳ５
不均衡に付随する症状を治療するために重要である。したがって、本発明のＩＧ
Ｓ５ポリペプチドは、選択的な刺激物質またはインヒビターの構築またはスクリ
ーニングに使用されてもよく、これによって、新規薬剤の開発を導くことができ
る。本発明のＩＧＳ５ポリペプチドの特性、特に、ヒト種のＩＧＳ５ポリペプチ
ドの特性は、以下に、“ＩＧＳ５活性”または“ＩＧＳ５ポリペプチド活性”ま
たは“ＩＧＳ５の生物学的活性”として示す。さらに、これらの活性に含まれる
のは、前記ＩＧＳ５ポリペプチドの抗原活性および免疫活性、特に配列番号２、
配列番号４および配列番号６の群から選択されたポリペプチドの一つの抗原活性
および免疫活性である。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＩＧＳ５、好ま
しくはヒトＩＧＳ５の少なくとも一つの生物学的活性を示す。
【００３３】 本発明のＩＧＳ５ポリペプチドは、“成熟”のタンパク質の形であってもよい
か、または大きいタンパク質の一部分、たとえば、前駆体または融合タンパク質
であってもよい。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、幾つかのヒスタミン
残基のような精製において促進させる配列を含有する付加的なアミノ酸配列、ま
たは、組換え製造中での安定性に関する付加的な配列を含むことはしばしば有利
である。
【００３４】 さらに、本発明は、前記ポリペプチドの変異体を含み、この場合、これは アミノ酸の保存的置換によって導かれたものとは異なるポリペプチドであり、こ
れによって、残基は、同様の性質を有する他のものによって置換されていてもよ
い。このような置換の典型的なものは、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間
；ＳｅｒおよびＴｈｒ間、酸性残基 ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌ
ｎ間；および塩基性残基 ＬｙｓおよびＡｒｇ間；または芳香族残基 Ｐｈｅま
たはＴｙｒ間である。特に好ましくは、幾つかの、５〜１０個、１〜５個、１〜
３個、１〜２個または１個のアミノ酸が、任意の組み合わせで置換、欠失または
付加されている変異体である。
【００３５】 さらに、本発明は、ＩＧＳ５ポリペプチド、特に、完全なＩＧＳ５ポリペプチ
ドの本質的な部位を含有するＩＧＳ５ポリペプチドフラグメントに関する。フラ
グメントは、前記ＩＧＳ５ポリペプチドのアミノ酸配列と、すべてではなく一部
分がまったく同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＩＧＳ５ポ
リペプチドに関して、フラグメントは、“フリースタンディング（free-standin
g）”であるかまたは部分的にかまたは領域、最も好ましくは単一の連続した領
域を形成する大きいポリペプチドの範囲内に含まれていてもよい。
【００３６】 好ましいフラグメントは、たとえば、アミノ末端を含有する残基の連続した群
またはカルボキシル末端を含む残基の連続した群を欠失するか、あるいは一つが
アミノ末端を含み、かつ一つがカルボキシル末端を含む残基の２つの連続した群
を欠失することを除いては、ＩＧＳ５ポリペプチドのアミノ酸配列を有する分断
ポリペプチド（truncation polypeptide）を含む。さらに、好ましくは、α−ヘ
リックスおよびα−ヘリックス形成領域、β−シート、β−シート形成領域、タ
ーンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性
領域、α−両親媒性領域、β−両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域
、基質結合領域、および高い抗原性インデックス領域を含有するフラグメントに
、構造的または機能的に寄与することによって特徴付けられているフラグメント
である。他の好ましいフラグメントは、生物学的に活性のフラグメントである。
生物学的に活性のフラグメントは、酵素活性を介在するものであり、この場合、
これは、同様の活性かまたは改善された活性を有するか、あるいは望ましくない
活性を減少させるものが含まれる。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原的また
は免疫的であるものが含まれる。
【００３７】 配列番号２、配列番号４および配列番号６の一つに示されているような、完全
なＩＧＳ５ポリペプチドの本質的な部分を含有するポリペプチドフラグメントに
適した本発明の変異体に関して、“本質的な”の用語は、ＩＧＳ５ポリペプチド
のフラグメントが、特に少なくとも５０アミノ酸のサイズ、好ましくは少なくと
も約１００アミノ酸のサイズ、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸のサ
イズ、さらに好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸のサイズ、最も好ましくは
少なくとも３００アミノ酸のサイズを有することを示す。これに関連して、“約
”は、数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸によって、多いかまたは少な
い、特に制限された大きさを含むものである。本発明によるＩＧＳ５ポリペプチ
ドフラグメントは、ＩＧＳ５ポリペプチドそれ自体に特徴的な性質の少なくとも
一つを、少なくとも幾つかの範囲で示す。
【００３８】 本発明のＩＧＳ５ポリペプチドに関して、生物学的に活性のペプチドの代謝中
に含まれてもよいことが見出された。特に、これらのＩＧＳ５ポリペプチドが、
種々のバソアクティブペプチドとして作用してもよいメタロプロテアーゼ型ペプ
チドであることが見出された。従来技術から公知のバソアクティブポリペプチド
は、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加ペプチド（ＡＮＰ）、ブラジキニン、
Ｂｉｇエンドセリン（Big ET-1）、エンドセリン（ET-1）、サブスタンスＰおよ
びアンジオテンシン−１である。本発明に関して、新規ヒトメタロプロテアーゼ
であるＩＧＳ５エクトドメイン（ectodomain）が、たとえば、インヴィトロ（in
vitro）で、Ｂｉｇ ＥＴ−１、ＥＴ−１、ＡＮＰおよびブラジキニンを含む、
種々の前記バソアクティブペプチドを加水分解することが見出された。
【００３９】 さらに、本発明のＩＧＳ５メタロプロテアーゼ型の酵素は、たとえば、ホスホ
アミドンのような化合物によって阻害される、ＥＣＥ／ＮＥＰ特性を有する酵素
に関する抑制の性質を測定するために使用される引用された化合物によって阻害
されていてもよい。ＩＧＳ５の阻害は、特異的にＮＥＰを阻害する引用された化
合物に関して観察されることはなく、たとえば、ＩＧＳ５は、たとえば、チオフ
ァンのような化合物によって阻害されることはない。任意のＩＧＳ５の阻害は、
特異的にＥＣＥを阻害する引用された化合物に関して観察されることはなく、た
とえば、ＩＧＳ５は、選択的ＥＣＥインヒビター ＣＧＳ−３５０６６（De Lon
bart et al., J.Med. Chem. 2000, Feb. 10; 43(3): 488-504）のような化合物
によって阻害されることはない。本発明のＩＧＳ５ メタロプロテア−ゼ型の阻
害に関する、前記に引用された化合物の阻害データは、さらに、以下の試験例、
特に例７において記載されている。
【００４０】 本発明のポリペプチドは、任意の適した方法で製造されてもよい。このような
ポリペプチドは、単離された、天然に生じるポリペプチド、組換えによって製造
されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチドまたはこれらの方法の組
み合わせによって製造されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを製
造するための方法は、従来的によく知られている。
【００４１】 本発明によるポリヌクレオチド 他の態様において、本発明は、ＩＧＳ５ポリヌクレオチド（たとえば、それぞ
れ、ＩＧＳ５ＤＮＡ、ＩＧＳ５ＤＮＡ１またはＩＧＳ５ＤＮＡ２）、特に、ヒト
ＩＧＳ５ポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは、単離され
たポリヌクレオチド、好ましくは、単離されたヒト種のポリヌクレオチドを含み
、この場合、これは、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択さ
れたアミノ酸配列の一つに対して、それぞれ配列番号２、配列番号４または配列
番号６の全長上で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％および特に
少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なく
とも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有
する。これに関連して、少なくとも９７％の同一性を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドは高く好ましく、さらに少なくとも９８〜９９％の同一
性はさらに好ましく、かつ、少なくとも９９％の同一性、特に９９．９％の同一
性を有するものは最も好ましい。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１、
配列番号３または配列番号５の一つに含まれるヌクレオチド配列を含有するポリ
ヌクレオチドを含み、この場合、これは、配列番号２、配列番号４または配列番
号６のそれぞれのポリペプチドをコードしている。
【００４２】 この態様の変法において、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌク
レオチド、特に、単離されたヒトポリヌクレオチドを含み、この場合、これは、
配列番号２、配列番号４または配列番号６の群から選択されたポリペプチドの一
つをコードするヌクレオチド配列に対して、全てのコーディング領域上で、少な
くとも７０％、好ましくは少なくとも８０％および特には少なくとも８５％、よ
り好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を
有するヌクレオチド配列を含む。これに関して、少なくとも９７％の同一性を有
するポリヌクレオチドは高く好ましく、同時に、少なくとも９８〜９９％の同一
性は高く好ましく、かつ少なくとも９９％、特に９９．９％の同一性は最も高く
好ましい。
【００４３】 さらに、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチド、特に単
離されたヒトポリヌクレオチドを含み、この場合、これは、配列番号１、配列番
号３または配列番号５の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して、そ
れぞれ、配列番号１、配列番号３および配列番号５の全長上で、少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも８０％および特に少なくとも８５％、より好ましくは
少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。特に
、本発明のポリヌクレオチドは、それぞれ引用されたヌクレオチド配列に対して
、引用されたヌクレオチド配列の全長上で、少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも８０％および特に好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくと
も８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の同一性
を有する単離されたポリヌクレオチドを含む。これに関連して、配列番号１、配
列番号３または配列番号５の群から選択されたヌクレオチド配列の一つに対して
、少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含有するかまたは有す
るポリヌクレオチドが高く好ましく、さらに、少なくとも９８〜９９％の同一性
はさらに好ましく、かつ、少なくとも９９％、特に９９．９％の同一性は最も高
く好ましい。このようなポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３または配
列番号５のポリヌクレオチドの一つ、ならびに配列番号１、配列番号３または配
列番号５のポリヌクレオチドそのものを含み、この場合、これは、特に、ヒト種
ポリヌクレオチドである。
【００４４】 さらに本発明は、前記のポリヌクレオチドのすべてに対して相補的なポリヌク
レオチドを提供する。
【００４５】 配列番号１（“ＩＧＳ５ＤＮＡ”と呼称する）のヌクレオチド配列は、２０７
６ヌクレオチドの長さを有するヒト（ホモサピエンス）を起源とするｃＤＮＡ配
列であり、かつ、６９１アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコー
ディング配列（ヌクレオチド１〜２０７３からのもの）、配列番号２（“ＩＧＳ
５ＰＲＯＴ”を呼称する）のポリペプチドを含む。配列番号２のポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペプチドコーディン
グ配列と同一であってもよいか、または配列番号１中に含まれるもの以外の配列
であってもよく、この場合、これは、遺伝子コードの重複性（縮重）の結果であ
り、さらに、配列番号２のポリペプチドをコードする。
【００４６】 配列番号３のヌクレオチド配列（“ＩＧＳＤＮＡ１”と呼称される）は、２３
４０ヌクレオチドの長さを有するヒト（ホモサピエンス）を起源とするｃＤＮＡ
配列（終止コドン ｔａｇを含む）であり、かつ、７７９アミノ酸のポリペプチ
ドをコードするポリペプチドエンコーディング配列（ヌクレオチド番号 １〜２
３３７）、配列番号４のポリペプチド（“ＩＧＳ５ＰＲＯＴ”と呼称する）を含
有する。配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号
３中に含まれるポリペプチドコーディング配列と同一であってもよいか、あるい
は配列番号３中に含まれるもの以外の配列であってもよく；この場合、これは、
遺伝子コードの重複性（縮重）の結果として、さらに、配列番号４のポリペプチ
ドをコードする。
【００４７】 配列番号５のヌクレオチド配列（“ＩＧＳ５ＤＮＡ２”と呼称される）は、２
２６２ヌクレオチドの長さを有するヒトを起源とするのｃＤＮＡ配列（ホモ種）
（終止コドン ｔａｇを含む）であり、かつ、７５３アミノ酸のポリペプチドを
コードするポリペプチドコーディング配列（ヌクレオチド番号 １〜２２５９）
、配列番号６のポリペプチド（“ＩＧＳ５ＰＲＯＴ２”と呼称される）を含有す
る。配列番号６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５に
含まれるポリペプチドコーディング配列と同様であってもよいか、あるいは、配
列番号５中に含まれるもの以外の配列であってもよく、この場合、これは、重複
性（縮重）の結果として、さらに、配列番号６のポリペプチドをコードする。
【００４８】 本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド型の特徴は、以
下に詳細に記載される。
【００４９】 メタロプロテアーゼの生物学的および製薬学的特徴 本発明のポリペプチドおよび特にヒト種ポリペプチドであるこれらのものは、
メタロプロテアーゼファミリーの他のタンパク質と構造的および機能的に関連し
ており、たとえば、メタロプロテアーゼまたは関連酵素、たとえばそれぞれ、Ｍ
ＭＰｓ、ＡＣＥ、ＥＣＥまたはＮＥＰとの相同性および／または構造的類似性を
示す。したがって、たとえば、配列番号２のポリペプチドは、メタロプロテアー
ゼファミリーの他のタンパク質と構造的および機能的に関連し、この場合、これ
は、たとえばＮＥＰまたはＥＣＥ（たとえばＥＣＥ−１）のような酵素、特には
ＮＥＰとの相同性および／または構造的類似性を有するものである。したがって
、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、すなわち、その相
同的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似する生物学的機能／特性を有
することが期待される。さらに、本発明による好ましいポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドは、少なくとも一つのＩＧＳ５活性を有する。
【００５０】 特に、本発明に関するメタロプロテアーゼの一般的特徴およびその活性は、す
でに前記において述べられた。本発明によるポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドの性質および特性、特にこれらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの作用
に関する詳細のために、ＭＭＰｓ、ＡＣＥ、ＥＣＥまたはＮＥＰのようなそれぞ
れの酵素のいくつかのより特異的な特徴は、以下に要約される。
【００５１】 マトリックス メタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、さらには示されたマトリキ
シンは、細胞外マトリックスの成分のターンオーバーに作用する亜鉛メタロプロ
テアーゼのファミリーである。今日において、マトリキシンファミリーの幾つか
のメンバーが、ヒトで同定されている。ＭＭＰｓは合成され、多くの細胞型、た
とえば、繊維芽細胞、上皮細胞、食細胞、リンパ球およびガン細胞から分泌され
る。ＭＭＰｓは、好中球以外のすべての生成細胞からプロ酵素として分泌される
運命であるプレプロ酵素として合成される。生理学的条件下で、これらの酵素は
、形態発生、組織リモルディングおよび再吸収の中心的役割として機能する。さ
らに、これらは、多くの関連する組織の障害、たとえば、関節炎、歯周病、糸球
体腎炎およびガン細胞浸潤および転移に付随する、細胞外マトリックスの分解中
にかかわる。したがって、ＭＭＰｓは中心的役割として、たとえば、正常な胚形
成および組織リモルディングおよび多くの疾病、たとえば、関節炎、癌、歯周病
、糸球体腎炎、脳脊髄炎、アテローム硬化症および組織の潰瘍で作用する。関連
する組織マトリックスの生理学的および病理学的異化作用の双方におけるマトリ
キシンの重要性は強調され、それというのも、少ないＭＭＰｓ活性が正常な恒常
状態（steady-state）の組織で検出されるからであるが、しかしながら、多くの
ＭＭＰｓの合成は、炎症性サイトカイン、ホルモン、成長因子および細胞性形質
転換上で、転写によって合成されている。ＭＭＰｓの生物学的活性は、さらに、
不活性前駆体（プロＭＭＰｓ）からのその活性段階中で、ならびに細胞外基質お
よび内在性インヒビターとの相互作用を介して、細胞外的にコントロールされる
。ＭＭＰｓは、細胞外マトリックスの変性およびリモルディング中に含まれる亜
鉛依存性 メタロプロテアーゼの重要なクラスである。これら酵素のインヒビタ
ーは、たとえば、癌、関節炎、骨粗鬆症およびアルツハイマー氏病において治療
的ポテンシャルを有し、かつ、これらのインヒビターのいくつかは、臨床的な評
価がなされている。
【００５２】 アンジオテンシンＩ 変換酵素（ＡＣＥ；ペプチジル ジペプチダーゼＡ；Ｅ
Ｃ ３．４．１５．１）は、亜鉛メタロプロテアーゼのアンジオテンシン 変換
酵素ファミリーメンバーである。ＡＣＥは、細胞外酵素として内皮細胞、上皮細
胞および好中球細胞（体細胞ＡＣＥ）の表面で主に発現し、この場合、これは、
その大きい質量を有する細胞膜に対して固定されていることを示し、その触媒部
位を含み、細胞外環境に対向する。ＡＣＥは、血管性内皮細胞の細胞膜中で見出
され、その際、高いレベルが、肺の血管性内皮表面で、ＡＣＥ活性部位が循環す
る物質を代謝するために配置される程度に見出される。ＡＣＥの内皮での局在に
加えて、さらに酵素は、小腸および腎臓近位尿細管曲部の吸収上皮の刷子縁中で
見出された。さらに、ＡＣＥは単核細胞、たとえば、マクロファージ分化作用後
の単球およびＴ−リンパ球中、および繊維芽細胞中で見出された。インヴィトロ
オートラジオグラフィーにおいて、放射性標識化された特異的なＡＣＥインヒビ
ターの使用および免疫組織的研究は、脳におけるＡＣＥの主要な局在をマッピン
グした。ＡＣＥは主に脈絡集網において見出され、この場合、これは、髄液、上
衣、脳弓下器官、脳底神経節（尾形−被殻および淡蒼球）、黒質および下垂体で
のＡＣＥ源であってもよい。ＡＣＥの可溶な形は、多くの生物学的液体、たとえ
ば、血清、精液、羊水および髄液中で検出される。ＡＣＥの可溶性な形は、内皮
細胞中の酵素の膜結合の形から誘導されることが明かになった。ＡＣＥの主要な
生理学的活性は、アンジオテンシンＩからＣ−末端ジペプチドを切断して効果的
な血管収縮性ペプチド アンジオテンシンＩＩを製造し、かつ２個のＣ−末端
ジペプチドの連続的な除去によって、血管拡張性ペプチドブラジキニンを不活性
化する。これら２つのバソアクティブペプチド アンジオテンシンＩＩおよびジ
ラジキニンの代謝におけるＡＣＥの関連性の結果として、ＡＣＥは、高血圧およ
び鬱血性心不全の治療における決定的な分子ターゲットとなる。これは、高く効
果的かつ特異的なＡＣＥインヒビターの開発を導き、この場合、これは、前記の
高血圧および鬱血性心不全の症状をコントロールするための経口的活性薬剤とし
て、臨床的に重要であり広まった。バソアクティブペプチドの代謝が、ＡＣＥの
最も良好な公知の生理学的機能を維持すると同時に、さらに酵素は、血圧調節と
は関連のない他の生理学的プロセスの範囲で、たとえば、免疫、再生および神経
ペプチド代謝の範囲で、ＡＣＥの局在化および／または生物学的活性ペプチドの
範囲のインヴィトロ分断中で影響を与える。
【００５３】 中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ、neprilysin, EC 3.4.24.11）は、亜鉛メタ
ロプロテアーゼであり、かつ、ネプリライシン ファミリーメンバーとして分類
される。ＮＥＰは最初にウサギ腎臓の刷子縁膜から単離された。その後に、ＮＥ
Ｐ−様酵素をラットの脳において、オピオイドペプチド、エンケファリンの分解
中に含まれるものとして同定した。外酵素 ＮＥＰのクローニングおよび引き続
いての特定部位の突然変異誘発試験は、サーモライシンと類似する特異性、さら
には、同様の活性部位機構を有することを示した。さらに、ＮＥＰは、疎水性残
基のＮ−末端側でペプチド切断に関してサーモライシン様の特異性を有すること
を示した。ＮＥＰの一般的な分布に関しては、脳および脊髄中で測定され、かつ
病変および電子顕微鏡的試験は、一般に、ＮＥＰの主要な神経性局在を支持する
が、しかしながら、酵素は、末梢神経系において、線条体淡蒼球および線条体黒
質経路の繊維周囲の乏突起神経膠芽細胞上およびシュワン細胞上に存在していて
もよい。ＮＥＰは、たとえば、シナプスのような特異的膜インターフェイス上に
濃縮されることが見られないが、しかしながら、神経単位の細胞質および樹状突
起の表面上にむしろ不均一に分散されている。末梢においてＮＥＰは、特に、腎
臓および腸の刷子縁膜、リンパ節および胎盤中に富んでおり、かつ、大動脈の血
管壁を含む多くの他の多くの組織中で低い濃度で見出される。一般的な急性リン
パ芽球白血病抗原がＮＥＰであることが見出されたことによって、さらに、酵素
がリンポヘマトポエティク細胞（lymphohaematopoietic cell）の表面において
、過剰に存在し、かつ特定の疾病での成熟リンパ球上で高いレベルで見出される
。ＮＥＰ中の臨床的重要性、特に効果的な臨床的試薬としてのＮＥＰインヒビタ
ーの重要性は、他の亜鉛メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ、
メンブラン アラニル アミノペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１１．２）と関連し
て、エンケファリンの分解中でのＮＥＰの作用から、さらにはその心房性ナトリ
ウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）を分解する役割から導かれる。たとえば、Ｎ
ＥＰおよびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の二重のインヒビターは、有効
な抗高血圧性を有し、結果として、同時に、ＮＥＰを抑制することによって心房
性ナトリウム排泄増加ペプチドの循環レベルを増加させ、かつ、ＡＣＥ抑制によ
ってアンジオテンシンＩＩの循環レベルを減少させる。さらに、末梢性酵素が、
循環性ナトリウム排泄増加性および利尿性ペプチド、心房性ナトリウム排泄増加
ペプチドの低下を示す場合には、ＮＥＰインヒビターの臨床的ポテンシャルが重
要になる。したがって、ＮＥＰインヒビターを、その抗高血圧の性質に関して試
験した。他の例から、合成ＮＥＰインヒビター、チオファンによるエンケファリ
ン代謝の阻害は、マウスにおいて、ナロキソン可逆性抗受容反応を生じる。これ
は、その標的受容体の領域における内因性オピオイドのレベルを増加させること
によって可能性が開かれ、痛覚欠如は、モルホリンまたは他の古典的オピエート
剤の副作用がほとんどない程度に得ることができる。任意の有意な効果を達成す
るために、他のエンケファリン代謝酵素、特にアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）
は阻害されなければならないことが明かになった。このような二重のＮＥＰ／Ａ
ＰＮ インヒビターは、エンケファリン代謝を完全にブロックし、かつ強力な抗
受容性の性質を有する。
【００５４】 エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）は、有効な血管収縮ペプチド エンドセリン
（ＥＴ）の生合成の最終段階を触媒する。これは、不活性の中間体、Ｂｉｇエン
ドセリン中のＴｒｐ−Ｖａｌ結合の切断を含む。ＥＣＥ−１は、中性エンドペプ
チダーゼと相同である亜鉛メタロプロテアーゼである（NEP; neprilysin; EC 3.
4.24.11、前記参照）。ＮＥＰのようにＥＣＥ−１は、化合物ホスホアミドンに
よって抑制され、かつ、型ＩＩの内在性膜タンパク質である。しかしながら、Ｎ
ＥＰとは異なって、ＥＣＥ−１は、ジスルフィド結合二量体として示され、かつ
、他のＮＥＰインヒビター、たとえばチオファンによって阻害されない。免疫細
胞化学的試験は、ＥＣＥ−１に対して、主な細胞−表面局在を示し、この場合、
これは、外酵素として存在する。ＥＣＥ−１は、内皮細胞およびいくつかの分泌
細胞、たとえば、膵臓中のβ−細胞および平滑筋細胞中に局在する。ＥＣＥの有
効かつ選択的なインヒビターか、またはＥＣＥおよびＮＥＰの二重のインヒビタ
ーは、心臓血管系および腎臓のための医薬品中での治療的適用を有していてもよ
い。２個の分子内ジスルフィド結合を含有する、２１個のアミノ酸の二環性ペプ
チドであるエンドセリン（ＥＴ）は、今日において同定されている最も有効な血
管収縮性ペプチドの一つであり、かつ動物への投与は、血圧の持続的な増加を生
じ、心臓血管系の調節におけるその有効な役割を増強させる。ヒトにおけるＥＴ
−１の内因性の製造は、基底脈管の調子を保持するのに役立つ。したがって、エ
ンドセリン系およびＥＣＥの様の関連酵素は、新規薬剤の開発のための適した対
象を示す。したがって、ＥＣＥでの臨床的重要性、特に、有効な臨床的試薬とし
てのＥＣＥインヒビターでの重要性は、ＥＣＥの作用、特にＥＴの生合成の内容
から導かれた。したがって、著しいエンドセリン変換酵素阻害活性を示す化合物
は、ＥＴによって誘発されたかまたは誘発されると考えられうる種々の疾病、た
とえば、心不全、狭心症、不整脈、心筋梗塞、心臓肥大、低血圧症、高血圧症、
たとえば本態性高血圧症、腎性高血圧症または肺高血圧症、血栓症、アテローム
性硬化症、大脳血管痙攣、クモ膜下出血、大脳虚血、大脳骨折、末梢血管障害、
レイノー病、腎臓病、たとえば、腎不全、喘息、卒中、アルツハイマー氏病、糖
尿病の合併症、潰瘍、たとえば胃潰瘍、癌、たとえば肺癌、エンドトキシンショ
ック、敗血症等の治療および予防に有用である。
【００５５】 本発明のポリペプチドは、心臓血管性障害に関して特に重要である。
【００５６】 本発明のポリヌクレオチドを得るための方法 本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング技
術を用いて、ヒト精巣組織の細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラ
リーから、発現配列 ｔａｇ（ＥＳＴ）分析を用いて得られてもよい（Adams, M
.D., et al. Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, M.D. et al., Nature, (
1992) 355: 632-634; Adams, M.D., et al., Nature (1995) 377 Supp: 3-174）
。さらに、本発明のポリヌクレオチドは天然源、たとえば、ゲノミック ＤＮＡ
ライブラリーから得られてもよいか、または公知かつ商業的に入手可能な技術を
用いて（たとえば、F.M. Ausubel et al., 2000, Current Protocols in Molecu
lar Biology）、合成することができる。
【００５７】 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え体作製のために
使用される場合には、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのためのコーディ
ング配列を、それ自体によってか、または他のコーディング配列を有するリーデ
ィングフレーム中の成熟ポリペプチドに関してコーディング配列、たとえば、リ
ーダー配列または分泌配列、プレ−タンパク質配列、またはプロ−タンパク質配
列またはプレプロ−タンパク質配列、あるいは他の融合ペプチド部位をコードす
るものを含んでいてもよい。たとえば、融合ポリペプチドの精製を促進するマー
カー配列はコードされていてもよい。本発明のこの態様に関する特定の好ましい
実施態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Quagen, Inc.）中で供給
されたような、ヘキサ−ヒスチジン ペプチドであり、かつ、Ｇｅｎｔｚら、Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２
４中に記載されているか、あるいはＨＡ ｔａｇである。また、ポリヌクレオチ
ドは、非−コーディング ５’および３’配列、たとえば、転写、非翻訳配列、
スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲ
ＮＡを安定化させる配列を含んでいてもよい。
【００５８】 本発明の他の実施態様は、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から
選択されたアミノ酸配列の一つを含有し、かつ、いくつかの、すなわち、５〜１
０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸残基が、任意の組み
合わせで、置換、欠失または付加されているものである。
【００５９】 配列番号１、配列番号３または配列番号５の一つ中に含まれるヌクレオチド配
列と同一であるかまたは十分に同一であるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよび
ゲノミックＤＮＡのためのハイブリダゼーションプローブとしてか、または核酸
増幅反応（ＰＣＲ）のためのプライマーとして、完全長のｃＤＮＡおよび本発明
のポリペプチドをコードするゲノミッククローンを単離し、かつ、配列番号１、
配列番号３または配列番号５の一つとの高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃ
ＤＮＡまたはゲノミッククローン（ヒトを起源とするパラログをコードする遺伝
子およびヒト以外の種からのオルトログおよびパラログを含む）を単離する。典
型的にこれらのヌクレオチド配列は、前記配列に対して少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９
０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。プローブまたはプラ
イマーは、少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌ
クレオチドを含有し、かつ、少なくとも５０個のヌクレオチドを含有していても
よい。特に好ましいプローブは、３０〜５０個のヌクレオチドを有していてもよ
い。特に好ましいプライマーは、２０〜２５個のヌクレオチドを有していてもよ
い。
【００６０】 ヒト以外の種からのホモログおよびオルトログを含む、本発明のポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、
配列番号３または配列番号５またはこれらのフラグメントの一つの配列を有する
標識化されたプローブでの適したライブラリーのスクリーニング、完全長ｃＤＮ
Ａおよび前記ポリヌクレオチド配列を含有するゲノミッククローンを単離する工
程を含む方法によって得られてもよい。このようなハイブリダーゼーション技術
は、当業者に公知である。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デ
ンハルト溶液、１０％デキストランスルフェート（ｗ／ｖ）および２０ｍｇ／ｍ
ｌの変性細断化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩に亘ってのインキ
ュベーション、その後の０．１×ＳＳＣ中約６５℃でのフィルターの洗浄を含む
。したがって、また、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション下
で、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列か、またはこれらのフラグ
メントを有する標識化されたプローブで、適したライブラリーをスクリーニング
することによって得ることが可能なポリヌクレオチドを含む。
【００６１】 当業者は、多くの場合において、単離されたｃＤＮＡ配列が完全なものではな
く、この場合、ここで、ポリヌクレオチドをコードする領域が、ｃＤＮＡの５’
末端で短く切断されているためであることを理解している。これは、逆翻訳の結
果であって、固有の低い“処理能力”（重合反応中のテンプレートの結合を維持
するための酵素能力の尺度）を有する酵素が、ｃＤＮＡ合成の第１ストランド中
において、ｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完全にすることができなかっ
たためである。
【００６２】 完全長ｃＤＮＡ、または延長された短いｃＤＮＡｓを得るための幾つかの方法
が使用可能であり、かつ従来技術から公知である。これは、たとえば、ｃＤＮＡ
末端の急速増幅法（ＲＡＣＥ）に基づく方法である（たとえば、Frohman et al.
, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988）。たとえば、Ｍａｒａｔｈｏｎ（ＴＭ）技術
（Clontech Laboratories Inc.）によって例証されている最近の技術の変法は、
長鎖ｃＤＮＡを検出するために著しく簡略化されている。Ｍａｒａｔｈｏｎ（Ｔ Ｍ） 技術において、ｃＤＮＡｓは、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡおよ
びそれぞれの末端上でライゲーションされた“アダプター”配列から製造された
。その後に、核酸増幅法（ＰＣＲ）は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーおよびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ物を使
用して、“ミッシング”ｃＤＮＡ５’末端を増幅するためにおこなわれる。その
後に、ＰＣＲ反応は、“ネスト（nested）”プライマーを用いて、反復されても
よく、この場合、これは、増幅産物の範囲内でアニーリングのためにデザインさ
れたものである（典型的には、アダプター配列中でさらに３’をアニーリングす
るアダプター特異的プライマーおよび公知の遺伝子配列中でさらに５’をアニー
リングする遺伝子特異的プライマー）。この反応の産物は、その後にＤＮＡシー
クエンシングによって分析されてもよく、かつ、完全長ｃＤＮＡは、存在するｃ
ＤＮＡに対して直接的に産物を結合されることによって構築され完全な配列を生
じるか、あるいは、５’プライマーのデザインに関する新規配列情報を用いて、
完全長ＰＣＲの分離を実施する。
【００６３】 ベクター、ホスト細胞、発現 本発明の組換えポリペプチドは、発現系を有する遺伝子工学的に製造されたホ
スト細胞から、当業者に公知の方法によって製造されてもよい。したがって、他
の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドまたはポリヌクレオチド
を含有する発現系、このような発現系を有する遺伝子工学的に作製したホスト細
胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造に関する。さらに、無
細胞系翻訳系は、本発明のＤＮＡコンストラクトから誘導されたＲＮＡｓを用い
て、このようなタンパク質を製造するために使用することができる。
【００６４】 組換体作製に関して、ホスト細胞は、本発明のポリヌクレオチドのための発現
系またはこれらの一部分を組み込むために遺伝子工学的に作製されてもよい。ホ
スト細胞へのポリヌクレオチドの導入は、多くの実験マニュアル、たとえば、Ｄ
ａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９
）に記載された方法によっておこなわれてもよい。好ましくはこのような方法は
、たとえば、リン酸カルシウム トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラ
ン介在型トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクショ
ン、カチオン脂質−介在型トランスフェクション、エレクトロポレーション、ト
ランスダクション、スクレープローディング（scrape loading）、衝撃導入法（
ballistic introduction）またはインフェクションを含む。
【００６５】 適切なホストの表現型は、細菌細胞、たとえば、連鎖球菌、ブドウ球菌、Ｅ．
Ｃｏｌｉ、ストレプトマイセスおよび枯草菌細胞；真菌細胞、たとえばイースト
細胞およびアスペルギルス属、昆虫細胞、たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ Ｓ２
およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞；動物細胞、たとえば、ＣＨＯ、ＣＯ
Ｓ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓ メ
ラノーマー細胞；および植物細胞を含む。
【００６６】 種々の発現系は、たとえば、染色体系、上皮系およびウイルス運搬系、たとえ
ば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピゾー
ム、挿入要素（insertion elements）、イースト染色体要素、細菌、たとえばバ
キュロウイルス、パボラウイルス、たとえばＳＶ４０、バシニアウイルス、アデ
ノウイルス、フォウルポックスウイルス、シュードモナスウイルスおよびレトロ
ウイルスから誘導されたベクター、およびこれらの組み合わせ物から誘導された
ベクター、たとえば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的要素から誘導
されたもの、たとえば、コスミドおよびファージミドである。発現系は、エンジ
ェンダー（engender）発現と同様に調節されるコントロール領域を含んでいても
よい。一般に、ホスト中でポリペプチドを製造するためのポリヌクレオチドを保
持するか、遺伝させる（propagate）かまたは発現させることが可能な任意の系
またはベクターが使用されてもよい。適切なヌクレオチド配列は、任意の種々の
公知でありかつ通常の技術によって、発現系に挿入されてもよく、たとえば、こ
れらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ｓｕｐｒａ）に記載されて
いる。適した分泌シグナルは、好ましいポリペプチドに導入されていてもよく、
これによって、小胞体の管腔、ペリプラスム間隙または細胞外環境中への翻訳さ
れたタンパク質の分泌が可能になる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対し
て内因性のものであってもよいか、または不均一なシグナル、すなわち、異なる
種から誘導されたものであってもよい。
【００６７】 本発明のポリペプチドが、スクリーニングアッセイ中での使用のために発現さ
れるべき場合には、一般に、ポリペプチドは、細胞の表面かまたは二者択一的に
、可溶性のタンパク質の形で製造することが可能である。ポリペプチドが媒体中
に分泌される場合には、媒体は、ポリペプチドを回収かつ精製するために回収す
ることができる。細胞内で製造される場合には、最初に、細胞は、ポリペプチド
が回収される前に溶解されてもよい。ポリペプチドは、細胞の表面（膜結合ポリ
ペプチド）で結合される場合には、通常、膜画分は、膜結合ポリペプチドを蓄積
するために調製される。
【００６８】 本発明のポリペプチドは、アンモニウムスルフェートまたはエタノール沈殿法
、酸抽出法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収または精
製されてもよい。最も好ましくは、高性能の液体クロマトグラフィーを、精製の
ために使用することができる。タンパク質のリフォールディングための公知技術
は、細胞内合成、単離および／または精製中でポリペプチドが変性される場合に
は、活性構造を再生するために使用されてもよい。
【００６９】 診断的アッセイ さらに、この発明は、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関
する。機能不全に関連する、配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から
選択されたポリヌクレオチドの一つによって特徴付けられた遺伝子の突然変異型
の検出は、疾病の診断または疾病の感受性に付加するかまたはこれを定義するこ
とができる診断ツールを提供してもよく、この場合、この疾病は、遺伝子の低発
現（under-expression）、過剰発現または空間的または時間的に改変された発現
によって生じるものである。遺伝子中で独立して生じる突然変異は、種々の技術
によるＤＮＡレベルで検出されてもよい。
【００７０】 診断のための核酸は、対象となる細胞、たとえば、血液、尿、唾液、組織生検
材料または剖検材料から得られてもよい。ゲノミックＤＮＡは検出のために直接
使用されるかまたはＰＣＲまたは他の増幅技術を用いることによって、分析前に
増幅されてもよい。また、ＲＮＡまたはｃＤＮＡは、類似の様式中で使用されて
もよい。欠失および挿入は、増幅産物のサイズと通常の遺伝子型のサイズとの差
異を比較することによって検出されてもよい。点変異は、標識化されたＩＧＳ５
ヌクレオチド配列に対して増幅されたＤＮＡをハイブリダイゼーションすること
によって同定されてもよい。完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅでの消化によっ
てかまたは融点の差異によって、ミスマッチの重複とは区別することができる。
また、ＤＮＡ配列の相違は、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動易動度の差
異によって、変性試薬を用いるかまたは用いないで検出されるか、あるいは、直
接的にＤＮＡシークエンシングによって検出されてもよい（たとえば、Myers et
al., Science (1985) 230: 1242参照のこと）。また、特異的箇所での配列の変
更は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、たとえば、ＲＮａｓｅおよびＳ１プロテクシ
ョンとしてかまたは化学的切断方法によって示されてもよい（たとえば、Cotton
et al., Proc Natl acid Sci USA (1985) 85: 4397-4401）。他の態様において
、ＩＧＳ５ヌクレオチド配列またはこれらのフラグメントを含有するオリゴヌク
レオチドプローブの配列は構築され、たとえば、遺伝子突然変異の効果的スクリ
ーニングを導く。配列の技術的方法は公知であり、かつ、一般的な適用可能であ
り、かつ、遺伝子発現、遺伝子リンケージおよび遺伝子多様性を含む、分子遺伝
学中における種々の問題に注意を向けるために使用されてもよい（たとえば、M.
Chee et al., Science, Vol 274, pp610-613 (1996)）。
【００７１】 診断的アッセイは、ＩＧＳ５遺伝子中の突然変異を検出することによって、記
載された方法によって、診断するかまたは疾病に対する感受性を測定するための
方法を提供する。さらに、このような疾病は、対象物由来の試料からのポリペプ
チドまたはｍＲＮＡの不適切に減少したかまたは増加したレベルを検出を含む方
法によって診断されてもよい。減少されたかまたは増加した発現は、ポリヌクレ
オチドの計量に関する公知技術の任意の方法を用いて、ＲＮＡレベルで測定され
てもよく、たとえば、この方法は、核酸増幅法、すなわち、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ、ＲＮａｓｅプロテクション、ノーザンブロッティングおよび他のハイブルダ
イゼーション法である。アッセイ技術は、タンパク質、たとえば本発明のタンパ
ク質のレベルを測定するために、当業者に公知のホスト由来の試料中で使用され
てもよい。このようなアッセイ方法は、ラジオ−イムノ−アッセイ、競合的結合
測定法、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００７２】 したがって、他の態様において、本発明は診断キットに関し、この場合、これ
は： （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号１、配列番号３または
配列番号５の一つのヌクレオチド配列またはこれらのフラグメント； （ｂ）（ａ）と相補的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号２、配列番号４または配列
番号６の一つのポリペプチドまたはこれらのフラグメント；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２、配列番号４
または配列番号６のポリペプチドの一つに対する抗体 を含む。
【００７３】 任意のこのようなキットにおいて、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）
は、前記診断キットの本質的な成分として提供されていてもよい。このようなキ
ットは、疾病または疾病の感受性、特に、本発明のポリペプチドに関して前記に
示されたような他の疾病またはその感受性を診断するために、使用することがで
きる。
【００７４】 染色体アッセイ また、本発明のヌクレオチド配列は、染色体の位置決めのために有用である。
シークエンスは、特に、独立したヒト染色体上での特定位置決めをターゲットと
し、かつハイブリダイズすることが可能である。本発明による染色体に対して相
当する配列をマッピンングすることは、疾病に関連する遺伝子を有するこれらの
配列を対比させることが、最初のステップとして重要である。シークエンスは、
正確な染色体の位置決めをマッピングすると同時に、染色体上の配列の物理的位
置が、遺伝的地図データと相関されていてもよい。このようなデータは、たとえ
ば、Ｖ．Ｍｃｋｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
ｉｎ Ｍａｎ（Johns Hopkins-University Welch Medical Library）で見出され
る。同様の染色体領域に対してマッピングされる遺伝子および疾病の関係は、そ
の後に、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同調遺伝（coinheritance））に
よって同定される。
【００７５】 また、疾患固体および非疾患固体間のｃＤＮＡ配列またはゲノミック配列中の
差異は測定することができる。突然変異が、任意の正常固体ではまったくみられ
る、いくつかかまたはすべての疾患固体中で観察される場合には、突然変異が、
これらの疾病の原因物質であるとみなされる。
【００７６】 組織の局在化 また、本発明のヌクレオチドは、組織の局在化（tissue localization）に関
して重要である。このような技術は、組織中のＩＧＳ５ポリペプチドの発現パタ
ーンを、これらをコードするｍＲＮＡの検出によって、測定することを可能にす
る。これらの技術は、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション技術およびヌク
レオチド増幅技術、たとえば、ＰＣＲを含む。このような技術は当業者に公知で
ある。これら研究の結果から、器官におけるポリペプチドの通常の機能の示唆を
提供する。さらに、ＩＧＳ５ｍＲＮＡｓの通常の発現パターンと、ＩＧＳ５遺伝
子によってコードされるｍＲＮＡの発現パターンとの比較研究は、疾病における
突然変異ＩＧＳ５ポリペプチドの役割または通常のＩＧＳ５ポリペプチドの不適
切な発現における価値ある洞察を可能にする。このような不適切な発現は、時間
的、空間的または簡単に量的な状態であってもよい。
【００７７】 本発明のポリペプチドまたはこれらのフラグメントまたはこれらのオルトログ
、またはこれらを発現する細胞は、免疫源として、本発明のポリペプチドのため
の免疫特異的抗体を製造するために使用することができる。“免疫特異的”の用
語は、本発明のポリペプチドに関するアフィニティーが、従来技術の他の関連ポ
リペプチドに関するアフィニティーよりも本質的に大きいことを示す。
【００７８】 抗体 本発明のポリペプチドに対して作製した抗体は、ポリペプチドまたはエピトー
プを有するフラグメント、アナログまたは細胞を、動物、好ましくは非ヒトであ
る動物に、一般的なプロトコールを用いて投与することによって得ることができ
る。モノクローナル抗体を製造するために、連続した細胞系の培養物によって作
製された抗体を提供する任意の方法が使用されてもよい。例は、ハイブリドーマ
技術（Kohler, G. and Milstein, C., nature (1975) 256: 495-497）、トリー
マ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Cole et al., Moleclonal Antibodi
es and Cancer Therapy, 77-96 Akan R. Liss, Inc, 1995）を含む。一本鎖抗体
、たとえば、米国特許第４９４６７７８号明細書中に記載されるような技術は、
本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を作製するために結合されてもよい。
さらに、トランスジェニックマウス、または他の動物を含む他の生物体は、ヒト
化抗体を発現させるために使用されてもよい。
【００７９】 前記に示された抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定す
るために、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによってポリペプチドを
精製するために使用されてもよい。
【００８０】 また、本発明のポリペプチドに対する抗体は、前記に示したような疾病を治療
するために使用されてもよい。
【００８１】 融合タンパク質 他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを含有する遺伝子工学的
に作製された可溶性融合タンパク質、またはこれらのフラグメント、および種々
のサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫ブロブリンの重鎖また
は軽鎖の定常領域の種々の部位に関する。免疫グロブリンとして好ましいのは、
ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部位であり、その際、融合は、ヒンジ領
域で生じる。特に好ましい実施態様において、Ｆｃ部位は、血液凝固因子Ｘａで
開裂されてもよい開裂配列（cleavage sequence）の導入によって簡単に除去す
ることができる。さらに、本発明は、遺伝子工学によるこれらの融合タンパク質
の製造方法および、これらの薬剤スクリーニング、診断および治療のための使用
に関する。また、本発明の他の態様は、このような融合タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質技術の例は、国際特許出願 Ｎｏｓ
．ＷＯ９４／２９４５８およびＷＯ９４／２２９１４中で見出すことができる。
【００８２】 ワクチン 本発明の他の態様は、動物における免疫学的応答を誘発させるための方法に関
し、この場合、これは、本発明のポリペプチドの哺乳類への投与（たとえば、接
種法による）、抗体作製のための適合、および／または前記に挙げられた疾病か
ら前記動物を保護するためのＴ細胞免疫反応を含む。さらに、他の態様は、哺乳
類における免疫学的応答を誘発するための方法に関し、この場合、この方法は、
ポリヌクレオチドを直接的に発現し、かつ、生体内でポリペプチドをコーディン
グするベクターを介しての本発明のポリペプチドの運搬を含み、前記疾病から前
記動物を保護するための抗体を作製するためのこのような免疫学的応答を誘発す
る。
【００８３】 本発明の他の態様は、免疫学的／ワクチン調剤（組成物）に関し、この場合、
これは、哺乳類のホストに導入する場合には、動物中での本発明のポリペプチド
に対する免疫学的反応を誘導し、その際、組成物は、本発明のポリペプチドまた
はポリヌクレオチドを含有する。このような免疫学的／ワクチン調剤（組成物）
は、治療のための免疫学的／ワクチン調剤かまたは予防のための免疫学的／ワク
チン調剤であってもよい。ワクチン調剤は、さらに、適したキャリアーを含有し
ていてもよい。ポリペプチドは胃中において分解されることから、好ましくは、
非経口的に投与する（たとえば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射）。非経
口的投与に適した製剤は、水性および非水性滅菌注射液を含み、この場合、これ
は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤およびレシピエントの血液との等張性を製剤に与
えるための溶質を含有していてもよく；かつ、懸濁液または増粘剤を含んでいて
もよい水性および非水性の滅菌懸濁液を含有していてもよい。製剤は、単回量か
または多回量の容器中に存在していてもよく、たとえば、これは、密閉されたア
ンプル剤およびバイアル剤であってもよく、かつ、使用直前に滅菌液を添加する
だけの凍結乾燥の形で保存されていてもよい。また、ワクチン製剤は、製剤の免
疫性を増大するためのアジュバンドを含み、たとえば、これは、水中油系かまた
は当業者に公知の他の系であってもよい。用量は、ワクチンの特異的活性に依存
していてもよく、かつ、通常の試験によって簡単に決定することができる。
【００８４】 スクリーニングアッセイ 本発明のポリペプチドは、一つまたはそれ以上の生物学的機能に関して重要で
あり、この場合、この生物学的機能は、一つまたはそれ以上の疾病状態、特に前
記に示した疾病を含む。したがって、ポリペプチドの機能を刺激するかまたは阻
害する化合物を同定するためのスクリーニング法を見出すことが望ましい。した
がって、他の態様において、本発明は、ポリペプチドの機能を刺激するかまたは
阻害する化合物を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。化合
物は、種々の起源から同定されてもよく、たとえば、細胞、細胞不含調剤、化学
的ライブラリーおよび天然産物混合物である。このようにして同定される刺激物
質またはインヒビターは、天然かまたは改質化された物質、リガンド、レセプタ
ー、酵素等であってもよく、場合によってはポリペプチドであってもよいか；あ
るいはこれらの構造的または機能的模倣物（mimetics）であってもよい（Coliga
n et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991)）。
【００８５】 スクリーニング方法は、ポリペプチドの活性上かまたはポリペプチドを含有す
る細胞または膜上で、候補化合物の影響を簡単に測定することができる。二者択
一的に、スクリーニング方法は、競合物質との競合を含んでいてもよい、さらに
、これらのスクリーニング方法は、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻
害によって生じるシグナルを生じるかどうか、ポリペプチドの活性かまたはポリ
ペプチドを有する細胞または膜に適した検出系を用いて試験してもよい。ポリペ
プチド活性の阻害は、一般には、公知の物質の存在下でアッセイされ、かつ、候
補化合物の効果は、活性の変化によって、たとえば、候補化合物が、ポリペプチ
ドの阻害または刺激を生じることを試験することによって観察される。たとえば
、スクリーニング法は、対象化合物と本発明のポリペプチドを含有する溶液およ
び混合物を形成するのに適した基質とを混合させる工程、混合物中のＩＧＳ５活
性を測定する工程、および混合物のＩＧＳ５活性と対象化合物を含まないスタン
ダードとを比較する工程を含んでいてもよい。
【００８６】 また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する
抗体は、細胞中でのｍＲＮＡおよびポリペプチドの製造において添加された化合
物の効果を検出するためのスクリーニング方法を形成するために使用されてもよ
い。たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイは、ポリペプチドの分泌または細胞に関連す
るレベルを測定するために、従来公知の標準方法によるモノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体を用いて形成されてもよい。これは、適切に操作された細
胞または組織からのポリペプチドの製造を阻害するかまたは増長することができ
る薬剤を見出すために使用されてもよい。
【００８７】 効果的なポリペプチドインヒビターの例は、抗体または、幾つかの場合におい
てはオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を含み、この場合、これは、リガンド
、基質、レセプター、酵素等と密接に関連しており、場合によってはポリペプチ
ドであり、たとえば、リガンド、基質、レセプター、酵素のフラグメント等であ
るか、あるいは、本発明のポリペプチドと結合するが、反応を誘発することはな
い低分子であり、したがって、ポリペプチドの活性が回避される。
【００８８】 したがって、他の態様において、本発明は、特にインヒビター、刺激物質、リ
ガンド、レセプター、基質、酵素等を同定するためのスクリーニングキット、本
発明のポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの製造を減少または増強さ
せる化合物に関し、この場合、この方法は、 （ａ）本発明のポリペプチド； （ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体；を含み、この場合、ポリペプチドは
、好ましくは、配列番号２、配列番号４または配列番号６の一つである。
【００８９】 適切には、このような任意のキットにおいて、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）ま
たは（ｄ）は前記キットの本質的な部分として提供されていてもよい。
【００９０】 また、適切には、本発明のポリペプチドが、ポリペプチドのシ刺激物質または
インヒビターの構造に基づくデザインのための方法において使用され、この場合
、これは、 （ａ）最初の段階においてポリペプチドの３次元構造を決定し、 （ｂ）刺激物質またはインヒビターの適当な反応部位または結合部位のための３
次元構造を推測し、 （ｃ）推測された結合部位または反応部位との結合または反応が予測される候補
化合物を合成し、かつ、 （ｄ）候補化合物が本当に刺激物質またはインヒビターであるかどうかを試験す
ることによっておこなわれてもよい。
【００９１】 また、これは通常は、相互的プロセスであることが適切である。
【００９２】 予防的および治療的方法 他の態様において、本発明は、異常な状態、たとえば、治療すべきである前記
機能不全、障害または疾患を治療するための方法を提供し、この場合、これは、
前記にあるように、一般には、本発明のポリペプチドに関する“疾病”として、
ＩＧＳ５ポリペプチド活性の過剰発現または低い発現に関するものとして引用さ
れる。
【００９３】 ポリペプチドの活性が過剰である場合には、幾つかの試みが可能である。一つ
の試みは、前記に示したようなインヒビター化合物、場合によっては、製薬学的
に認容性のキャリアーとの組み合わせ物を、ポリペプチドの機能を抑制するのに
効果的な量で、これを必要とする対象物に投与することを含み、これによって、
異常な状態を緩和する。他の試みにおいて、さらに、基質、酵素等を結合させる
能力を内因性ポリペプチドとの競合において有する、可溶な形のポリペプチドを
投与してもよい。このような競合物質の典型的な例は、ＩＧＳ５ポリペプチドの
フラグメントを含む。
【００９４】 また、他の試みにおいて、内因性ＩＧＳ５ポリペプチドをコードする遺伝子の
発現は、発現ブロッキング技術を用いて阻害することができる。公知のこのよう
な技術は、内的に生成されたかまたは別個に投与された、アンチセンス配列の使
用を含む（たとえば、O'Connor, J. Neurochem. (1991) 57: 560 in Oligodeoxy
nucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca
Raton, FL (1988)、参照）。二者択一的に、遺伝子を含むトリプルヘリックス（
“Triplexes”）を形成するオリグヌクレオチドは、供給されてもよい（たとえ
ば、Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science
(1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251: 1360）。これらのオリ
ゴマーは、それ自体を投与してもよいかまたは関連オリゴマーを生体内で発現さ
せてもよい。合成アンチセンスまたはトリプレックスオリゴヌクレオチドは、修
飾された塩基または修飾された骨格を含有していてもよい。修飾さえた骨格の例
は、メチルホスホネート、ホスホロチオエート（phosphorothioate）またはペプ
チド核酸骨格を含む。このような骨格は、ヌクレアーゼによる変性からの保護を
提供するために、アンチセンスまたはトリプレックスオリゴヌクレオチド中に組
み込まれ、かつ、当業者に公知である。また、前記のものまたは他の修飾された
骨格で合成されたアンチセンスまたはトリプレックス分子は、本発明の一部分を
形成するものである。
【００９５】 さらに、ＩＧＳ５ポリペプチドの発現は、ＩＧＳ５ｍＲＮＡ配列に対して特異
的なリボザイムを用いることによって回避されてもよい。リボザイムは触媒的に
活性のＲＮＡｓであり、この場合、これは、天然のものであるかまたは合成のも
のであってもよい（たとえば、Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol (
1996) 6 (4), 527-33）。合成リボザイムは、選択された部位において特異的な
開裂（cleave）ＩＧＳ５ｍＲＮＡｓをデザインすることができ、これによって、
ＩＧＳ５ｍＲＮＡｓの機能的ポリペプチドへの翻訳を回避する。リボザイムは、
たとえば、ＲＮＡ分子中で天然に見出される、天然のリボースホスフェート骨格
および天然の塩基によって合成されてもよい。二者択一的に、リボザイムは、非
天然の骨格で合成され、リボヌクレアーゼ分解からの保護基、たとえば、２’−
Ｏ−メチルＲＮＡを提供し、かつ、修飾塩基を含有していてもよい。
【００９６】 ＩＧＳ５およびその活性の低い発現に関する異常な状態を治療するために、い
くつかの試みが可能である。一つの試みは、本発明のポリペプチドを刺激する化
合物の治療的有効量を、製薬学的に認容性のキャリアーとの組み合わせ物で、対
象物に投与することを含み、これによって、異常な状態を緩和する。二者択一的
に、遺伝子治療は、細胞中の関連細胞によるＩＧＳ５の内的製造をもたらすため
に使用してもよい。たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、前記に示したよう
に、複製欠陥レトロウイルスベクター中での発現のために作製されてもよい。レ
トルウイルスによる発現コンストラクトは、その後に単離され、かつ、本発明の
ポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクター
で形質導入するパッケージング細胞中に、次にパッケージング細胞が、重要な遺
伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生じる程度に導入されてもよい。これらの
プロデューサー細胞は、生体内での人為的細胞および生体内でのポリペプチド発
現において製造された細胞に関して、対象物に投与することができる。遺伝子治
療の概略に関しては、Ｃｈａｐｔｅｒ２０，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ
Ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその引用文献），ｉｎ Ｈｕｍａ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｎｅｔｉｃｓ，Ｔ Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ａ
Ｐ Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔ
ｄ（１９９６）。他の試みは、本発明のポリペプチドの治療的効果量を、適した
製薬学的キャリアーと組み合わせて投与するものである。
【００９７】 処方および投与 他の態様において、本発明は、ポリペプチド、たとえば、可溶性の形の本発明
のポリペプチド、刺激因子ペプチドまたはインヒビターペプチド、または低分子
量化合物の治療的有効量を、製薬学的に認容性のキャリアーまたは賦形剤との組
み合わせで含有する製薬学的組成物を提供する。このようなキャリアーは、制限
することなく、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、グリセロール、エタ
ノール、およびこれらの混合物を含む。また、本発明は、本発明の前記組成物の
一つまたはそれ以上の成分を装填した一つまたはそれ以上の容器を含有する製薬
学的パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、
単独でかまたは他の化合物、たとえば、治療的化合物との組み合わせで使用され
てもよい。
【００９８】 組成物は、投与経路、たとえば、全身経路かまたは経口的経路に適応させても
よい。全身投与の好ましい形態は、注入、典型的には静脈内注入を含む。他の注
入経路は、たとえば、皮下、筋肉内または腹腔内注射が用いられてもよい。全身
投与のための二者択一的な手段は、浸透剤、たとえば、胆汁酸塩またはフシジン
酸または他のデタージェントを用いての、粘膜吸収的および経皮吸収的投与を含
む。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物は、腸溶カプセルまたはカ
プセル化製剤で処方されてもよく、また、経口的投与も可能である。前記化合物
の投与は、局所および／または局在で、軟膏、ペースト、ゲル等の形であっても
よい。
【００９９】 必要とされる用量の範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与
経路、製剤の性質、対象物の症状、および担当の医師の判断に依存する。しかし
ながら、適した用量は、対象物１ｋｇに対して０．１〜１００μｇの範囲である
。しかしながら、必要とされる用量の広範囲の変化は、使用可能な化合物の多様
性および種々の投与経路の異なる効率で予測されるべきである。たとえば、経口
的投与は、静脈内注入による投与よりも高い用量を予測される。これらの投与レ
ベルの多様性は、最適化のための標準的な経験的経路ならびに、当業者に公知の
技術を使用することによって調整されてもよい。
【０１００】 また、治療において使用されるポリペプチドは、対象物中で、前記に示したよ
うにしばしば“遺伝子治療”と呼称される治療様式中で、内的に製造されてもよ
い。したがって、たとえば、対象物からの細胞は、ポリヌクレオチド、たとえば
、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いて、生体外（ex vivo）でポリペプチドをコードす
るために、かつ、たとえば、レトロウイルスプラスミドベクターの使用によって
製造されてもよい。その後に、細胞は対象物に導入する。
【０１０１】 ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、類似のホモロジーの他の配
列を同定することが可能な価値ある情報源を形成する。これは、コンピュターに
おいて読み取り可能な媒体中に配列を保存し、かつその後に、保存されたデータ
ーを用いて簡略化され、公知のサーチのための手段、たとえば、ＧＣＣおよびレ
ーザージーンソフトウエアパッケージ（Lasergene software packages）中のも
のを用いて、配列データーベースをサーチする。したがって、他の態様において
、本発明は、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列および／またはこ
れによってコードされたポリペプチド配列を含有するポリヌクレオチドを保存し
ている、コンピューターによって読み取り可能な媒体を提供する。
【０１０２】 本明細書中に引用された、特許および特許明細書に制限することない、本明細
書で引用されたすべての刊行物は、ここで参考のためにのみ記載されているにす
ぎず、この場合、これは、あたかもそれぞれの独立した刊行物が特異的にかつ独
立して、ここで参考のために組み込まれるべきことを示した。
【０１０３】 以下の例は、本発明をさらに詳細に例証するものであり、したがって、これら
の例は、どのような場合であっても、本発明の範囲を制限するようなものではな
い。
【０１０４】 実施例 例１ ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーの新規のメンバーをコード
するｃＤＮＡのクローニング 例１ａ．ＮＥＰ／ＥＣＥ メタロプロテアーゼファミリーの新規のメンバーのｃ
ＤＮＡフラグメントのホモロジーＰＣＲクローニング 発現配列 ｔａｇｓ（ＥＳＴｓ）のＤＮＡデーターバンクにおいて、４個のオ
ーバーラッピングＥＳＴ配列（受託番号 ＡＡ５２４２８３、ＡＩ０８８８９３
、ＡＩ２１７３６９およびＡＩ３８０８１１）は、中性エンドペプチダーゼ ２
４．１１／エンドセリン変換酵素（ＮＥＰ／ＥＣＥ） メタロプロテアーゼタン
パク質ファミリー（Turner A.J. et al. Fabes J. ［1997］11: 355-364）のメ
ンバーのＣ−末端部分と類似することが示されたタンパク質のストレッチをコー
ドする小さいオープンリーディングフレームを含むことが検出された。前記ＥＳ
Ｔｓ中のＮＥＰ／ＥＣＥ様の小さいオープンリーディングフレームは、終止コド
ンによって終結され（ＡＡ５２４２８３の場合）、かつ、４個すべてのＥＳＴｓ
中で、３個すべてのリーディングフレーム中で終止コドンを含有する配列によっ
て生じた。この生じる配列は、ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーメ
ンバーとは全く関連のないことが示された。小さいオープンリーディングフレー
ムの極性は、前記ＥＳＴｓが誘導されるものからのｍＲＮＡの５’−＞３’方向
に対して反対であるけれども、これらの配列は、ＲＴ−ＰＣＲホモロジークロー
ニングの試みの基準として使用することを決めた。同時に、前記に示された４個
のＥＳＴｓとして同様の構造を示す付加的なＥＳＴ配列は、公的なドメインデー
ターバンク中に見られることが観察され、この場合、これは、たとえば、受託番
号：ＡＩ８２５８７６、ＡＩ８８８３０６、ＡＩ４２２２２４、ＡＩ４２２２２
５、ＡＩ４６９２８１、ＡＡ９７５２７２、ＡＡ４９４５３４、ＡＷ００６１０
３、ＡＩ８２７７０１、ＡＩ６５０３８５、ＡＩ８２７８９８、ＡＩ９３４４９
９およびＡＡ４２２１５７である。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＥＳＴクラスター（Ｎ
ＥＰ／ＥＣＥファミリーとの類似性を示す領域の範囲内）上にデザインされたリ
バーズプライマー（ＩＰ１１６８９；配列番号７）および変性されたフォワード
プライマー（ＩＰ１１６８５、配列番号８）を用いて実施し、かつ、ＮＥＰ／Ｅ
ＣＥファミリーの保存的ペプチドモチーフ上の中心においた。
【０１０５】 ｃＤＮＡ ２μｇの合成のために、ヒト肺 全ＲＮＡ（Clontech ＃64023-1）
、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（５００μｇ／ｍｌ）および９μｌ Ｈ２Ｏを混合
し［最終濃度＝１２μｌ］、７０℃に１０分間に亘って過熱し、その後に氷上で
冷却した。４μｌの５ Ｘ 第１標準バッファー［２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２］、０．１Ｍ Ｄ
ＴＴ ２μｌ、１０ｍＭｄＴＮＰ ｍｉｘ １μｌおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐ
ｔＴＭＩＩ（Life Technologies）１μｌ（２００Ｕ）、リバーストランスクリ
プターゼを添加した。混合物を４２℃で５０分に亘ってインキュベートし、かつ
反応を７０℃で１５分に亘って加熱することによって不活性化した。
【０１０６】 ＰＣＲ反応を、ｃＤＮＡ合成反応物 １μｌ；ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ １０ＸＰ
ＣＲバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、１
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ ２μｌ、フォワードプライマーおよびリバー
スプラーマーそれぞれ１０ｐｍｏｌおよびＡｎｐｌｉＴａｇＴＭポリメラーゼ（
Perkin Elmer） ５ｕｎｉｔを含有する５０μｌ容量中で実施した。９５℃で５
分間に亘っての最初の変性の後に、ＰＣＲ反応は、以下のように４０Ｘサイクル
でおこなった：変性 ９４℃ １分間、アニーリング６０℃ １分間および伸長
７２℃ １分間。ＰＣＲ反応産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した
。ＩＰ１１６８５／ＩＰ１１６８９ ＲＴ−ＰＣＲ反応は±６００ｂｐのアンプ
リコン（amplicon）を生じた。フラグメントは、Ｑｉａｅｘ−ＩＩＴＭ精製キッ
ト（Quiagen）から精製され、かつ、供給元（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｓｙｓ
ｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって奨励されている手技にしたがってｐＧＥＭ−
Ｔ Ｅａｓｙプラスミドにライゲートした。組換えプラスミドは、その後にコン
ピテントＥ．Ｃｏｌｉ ＳＵＲＥＴＭ２ バクテリア（Stratagene）に形質転換
させるために使用した。形質転換細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｌ）、ＩＰ
ＴＧ（０．５ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレー
ト上にプレートした。プラスミドＤＮＡをＢｉｏＲｂｏｔＴＭ９６００核酸精製
システム（Qiagen）を用いて、別個のコロニーのミニカルチャーから精製した。
ＤＮＡシークエンシング反応を、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭタ
ーミネーターサイクル シークエンシング レディリアクションキット（ＰＥ−
ＡＢＩ）で、インサート−フランキングまたはインターナル（ＩＧＳ５特異的）
プライマーを用いて、精製されたプラスミドＤＮＡ上でおこなった。プラスミド
インサートは双方のストランド上で完全にシークエンスした。サイクルシークエ
ンシング反応産物を、ＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈殿によって精製し、かつ、ＡＢＩ
３７３オートシークエンサー上で分析した。組換えクローンＹＶＥ１４、ＹＣＥ
１５およびＹＣＥ１６（ＩＰ１１６８５／ＩＰ１１６８９アンプリコンから誘導
されたもの）のインサートのＤＮＡ配列は、Ｎ−末端の方向の本来のＥＳＴクラ
スターのオープンリーディングフレームを伸長し、かつ、さらに、このオープン
リーディングフレームがＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼタンパク質ファミリ
ー（図１参照）の新規メンバーから誘導されることを確認した。したがって、こ
の上流の配列は、ＥＳＴ配列中に存在する上流の配列とは全く逸脱したものであ
る。この新規配列は、本発明の内容の範囲内で、概して“ＩＧＳ５”として引用
される。
【０１０７】 例１ｂ．ＩＧＳ５の推測エクトドメイン（ectodomein）を含有するｃDNAのクロ
ーニング さらにＩＧＳ５ｃＤＮＡ配列を得るために、他の範囲のＲＴ−ＰＣＲ反応は、
前記に示された条件下で、ＩＧＳ５特異的リバースプライマー ＩＰ１２１９０
（配列番号９）および変性されたフォワードプライマー（ＩＰ１２４３３、配列
番号１０）を用いて、ヒト肺ＲＮＡ上で実施され、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの
保存的ペプチドモチーフ［LXXLXWMD］上に中心をおいた。ＩＰ１２１９０／１２
４３３ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ生成クロー
ン ＹＣＥ１９、ＹＣＥ２２およびＹＣＥ２３中にクローン化された±６００ｂ
ｐのアンピリコンを製造した。すべてのクローンは、十分にシークエンスされ、
さらに上流にＩＧＳ５オープンリーディングフレームを伸長させた（図１参照）
。
【０１０８】 ＩＧＳ５転写産物の５’末端をカバーするｃＤＮＡクローンを得るために、セ
ミ−ネスト ５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を、ヒト心臓 Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒ
ｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ上で、ＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡ増幅キット（Clon
tech K1802-1）によって提供された、アダプタープライマー１（ＡＰ１：配列番
号１１）と、ＩＧＳ特異的プライマーＩＰ１２１８９（配列番号１２）およびＩ
Ｐ１２５８５との組み合わせでおこなった。ＰＣＲ ＲＡＣＥ反応は、Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ社から提供されたＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡユーザーマニュアルで
の教示にしたがっておこなった。ＲＡＣＥ産物は、アガロースゲル上で分離され
、エチジウムブロマイドで可視化され、かつ、ハイボンド Ｎ＋メンブレン上に
ブロットした。ブロットは、６５℃で２時間に亘って、モディファイトチャーチ
バッファー（０．５Ｍ ホスファターゼ、７％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中
でプレハイブリダイズし、その後に、３２Ｐ−標識されたクローンＹＣＥ２３の
インサート ２Ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌを含有する同様のバッファー中で、６５℃
で一晩に亘ってハイブリダイズした。ＹＣＥ２３インサートは、［α−３２Ｐ］
ｄＣＴＰのランダムプライム組み込みによって、放射性同位元素標識し、Ｐｒｉ
ｍｅ−Ｉｔ ＩＩ ｋｉｔＴＭ（Stratagene）を用いて、供給元によって提供さ
れた説明書にしたがって、＞１０９ｃｐｍ／μｇの特異的活性にした。ハイブリ
ダイズされたブロットは、高いストリンジェンシーで洗浄し（２Ｘ３０分、室温
、２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でおこない、引き続いて０．１ＸＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ中で６５℃で４０分に亘って２回洗浄した）、かつ一晩に亘って、オ
ートラジオグラフィーをおこなった。ハイブリダイズしたフラグメントを、ゲル
から精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（生成 clones YCE59, YC
E64およびYCE65）にクローン化し、かつ、前記に示したようにシークエンスした
。
【０１０９】 すべての単離されたクローンのＤＮＡ配列は、さらに上流にＩＧＳ５のオープ
ンリーディングフレームを伸長する単一のコンティグ（ＩＧＳ５ＣＯＮＳ；図１
参照）中で構築されてもよいが、しかしながら、翻訳コドンのＡＴＧスタートと
まだ遭遇していない。プライマー ＩＰ１１６８９は、ＥＳＴ ＡＩ３８０８１
１上にデザインされており、かつ、調整されたＥＳＴ配列中に存在する終止コド
ン前の最後の４個のヌクレオチドを含有してない。終止コドンで終結されたオー
プンリーディングフレームを製造するために、整列されたＥＳＴ配列の最後の（
コンセンサス）２２ヌクレオチドは、ＩＧＳ５ＣＯＮＳのすべての構築体中に含
まれる。
【０１１０】 相同性のサーチは、（部分的に）コードされたタンパク質が、中性エンドペプ
チダーゼ（NEP; 例２参照）と最も類似することを示した。しかしながら、ＩＧ
Ｓ５ＣＯＮ５ オープンリーディングフレームの最初の２０個のアミノ酸は、Ｎ
ＥＰとの任意の類似性を示さなかった。これは、おそらく、これらがイントロン
から誘導された事実によるものである。さらに、ヒトＮＥＰの４個のエクソンは
、前記２０アミノ酸の下流にほぼ相当する位置で開始される（D'Adamio L. etal
. Proc. Natl. Acad. Sci. USA［1989］86:7103-7107）。ヒドロパジー分析（Ky
te J. et al.［1982］J. Mol. Biol. 157: 105-132; Klein P. et al.［1985］
Biochim. Biophys. acta 815: 468-476）は、推定されるＩＧＳ５ＣＯＮＳアミ
ノ酸配列の範囲内での膜貫通ドメインの存在を示すことはなく、それというのも
、このような膜貫通ドメインは、最初の２０アミノ酸の範囲内で生じる（または
少なくともオーバーラップする）と予測されるためである。これらの理由から、
ＩＧＳ５コンティグの最初の配列部分を排除することが好ましい（図１）。生じ
るＤＮＡ配列（IGS5DNA; 配列番号１）は、２０７６ヌクレオチドの長さ（終止
コドンを含む）であり、かつ、６９１残基のタンパク質をコードする（ＩＧＳ５
ＰＲＯＴ、配列番号２）。ヒトＮＥＰタンパク質配列を有するＩＧＳ５ＰＲＯＴ
の調整は、ＮＥＰの完全なエクトドメイン配列に相当するＩＧＳ５ＰＲＯＴを示
した。したがって、ＩＧＳ５ＰＲＯＴは、推測ＩＧＳ５酵素の完全な酵素活性を
有することを予測することができ、この場合、これは、ＮＥＰのエクトドメイン
を証明するものである（Fossie F et al. Biochem. J. ［1992］284, 53-59）。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】 例２．ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配列
を有するＩＧＳ５の調整 例１ａ中でクローン化されたＩＧＳ５配列に関して、最新のタンパク質データ
ーバンクのホモロジーサーチおよび翻訳ＤＮＡのデーターバンクは、ＢＬＡＳＴ
アルゴリズムを用いて実行された（Altschul S.F. et al.［1997］, Nucleic Ac
ids Res. 25: 3389-3402）。これらのサーチは、ＩＧＳ５タンパク質がマウス、
ラットおよびヒトの中性エンドペプチダーゼに対して最も類似性を有することを
示した（SW:NEP＿MOUSE、受託番号Ｑ６１３９１；ＳＷ：ＮＰ＿ＲＡＴ、受託番
号Ｐ０７８６１およびＳＷ：ＮＥＰ＿ＨＵＭＡＮ 受託番号Ｐ０８４７３）。
【０１１３】 したがって、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの他のメンバーを有するほとんど完全
なＩＧＳ５タンパク質のこの整列は、一般に、ＩＧＳ５とメタロプロテアーゼ、
特にはＮＥＰおよび／またはＥＣＥメタロプロテアーゼとの相関を示す。この構
造整列から、ＩＧＳ５はメタロプロテアーゼの機能性を有し、この場合、これは
、さらには、動物およびヒトにおける幾つかの機能不全、障害または疾病に関し
て重要であることと判断される。
【０１１４】 例３．ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼファミリーの新規メンバーをコードす
るｃＤＮＡのクローニング 例３ａ．ＮＥＰ／ＥＣＥ メタロプロテアーゼファミリーの新規メンバーのｃＤ
ＮＡフラグメントのホモロジーＰＣＲクローニング 発現配列 ｔａｇｓ（ＥＳＴｓ）のＤＮＡデーターバンクにおいて、４オーバ
ーラッピングＥＳＴ配列（受託番号ＡＡ５２４２８３、ＡＩ０８８８９３，ＡＩ
２１７３６９およびＡＩ３８０８１１）が検出され、この場合、これは、中性エ
ンドペプチダーゼ ２４．１１／エンドセリン変換酵素（ＮＥＰ／ＥＣＥ）メタ
ロプロテアーゼタンパク質ファミリー（Turner A.J. et al., Faseb J. ［1997
］11: 355-364）のメンバーのＣ−末端部分に対して類似性を示すタンパク質の
ストレッチをコードする小さいオープンリーディングフレームを含有していた。
前記ＥＳＴｓ中のＮＥＰ／ＥＣＥ様の小さいオープンリーディングフレームは、
終止コドンによって終結され（ＡＡ５２４２８３の場合）、かつ、すべての４Ｅ
ＳＴｓ中で、すべての３リーディングフレーム中の終止コドンを含有する配列に
よって進められる。この処理された配列は、ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼ
ファミリーのメンバーに対して全く関係のないことが明かである。しかしながら
、小さいオープンリーディングフレームの極性は、ｍＲＮＡの５’−＞３’方向
に対して逆方向であり、これから前記ＥＳＴｓが誘導されるけれども、ＲＴ−Ｐ
ＣＲ ホモロジークローニングアプローチに基づいて、前記配列を使用すること
に決めた。それと同時に、前記に示された４ＥＳＴｓと同様の構造を示す付加的
なＥＳＴ配列は、公的なドメインデーターバンク、たとえば、受託番号：ＡＩ８
２５８７６、ＡＩ８８８３０６、ＡＩ４２２２２４、ＡＩ４２２２２５、ＡＩ４
６９２８１、ＡＡ９７５２７２、ＡＡ４９２５３４、ＡＷ００６１０３、ＡＩ８
２７７０１、ＡＩ６５０３８５、ＡＩ８２７８９８、ＡＩ９３４４９９およびＡ
Ａ４２２１５７中に示されていることが見出された。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＥＳ
Ｔクラスター上にデザインされたリバースプライマー（ＩＰ１１６８９；配列番
号７）および変性されたフォワードプライマー（ＩＰ１１６８５：配列番号８）
を用いておこなわれ、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの保存的ペプチドモチーフ［Ｖ
ＮＡ（Ｆ，Ｙ）Ｙ］上に中心をおいた。
【０１１５】 ｃＤＮＡ ２μｇの合成のために、ヒト肺全ＲＮＡ ２μｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ ＃６４０２３−１）、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（５００μｇ／ｍｌ） １
μｌおよびＨ２Ｏ ９μｌを混合し（最終容量＝１２μｌ）、７０℃で１０分に
亘って加熱し、その後に氷上で冷却した。５Ｘ第１標準バッファー（２５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ） ４μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌお
よびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（Life Technologies）リバーストランス
クリプターゼ １μｌ（２００Ｕ）を添加した。混合物を、４２℃で５０分に亘
ってインキュベートし、かつ、反応を、７０℃で１５分に亘って加熱することに
よって不活化した。
【０１１６】 ＰＣＲ反応を、ｃＤＮＡ合成反応物 １μｌ、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ１０ｘＰＣ
Ｒバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、３７
５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン；ＰＥ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） ５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ ２μｌ、フォワ
ードおよびリバースプライマー それぞれ１０ｐｍｏｌおよびＡｍｐｌｉ Ｔａ
ｇＴＭポリメラーゼ ５ｕｎｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する５
０μｌ容量中で実施した。９５℃で５分間に亘っての最初の変性の後に、ＰＣＲ
反応チューブは、以下のような４０Ｘサイクル下においた：変性 ９４℃、１分
間、アニーリング ６０℃、１分間および伸長 ７２℃、１分間。ＰＣＲ産物は
、アガロース電気泳動によって分析した。ＩＰ１１６８５／ＩＰ１１６８９ Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ反応は、±６００ｂｐのアンプリコンを製造した。フラグメントは、
Ｑｉａｅｘ−ＩＩＴＭ精製キット（Quagen）を用いてゲルから精製し、かつ、供
給元（pGEMＴＭ-T Easy system, Promega）によって奨励された手技にしたがっ
て、ｐＧＥＭＴＭ−Ｔ Ｅａｓｙ プラスミド中にライゲートした。その後に、
組換えプラスミドを使用し、コンピテントＥ．Ｃｏｌｉ ＳＵＲＥＴＭ２ バク
テリア（Stratagene）へ形質転換した。形質転換細胞を、アンピシリン（１００
μｇ／ｍｌ）、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ／ｍｌ）を
含有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡをＢｉ
ｏＲｏｂｏｔＴＭ９６００核酸精製システム（Qiagen）を用いて、別個のコロニ
ーのミニカルチャーから精製した。ＤＮＡシークエンシング反応を、ＡＢＩ Ｐ
ｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭターミネーターサイクルシークエンシング レ
ディリアクションキット（PE Biosystems）で、インサート−フランキングプラ
イマーかまたはインターナルプライマーを用いて、精製したプラスミドＤＮＡ上
で実施した。プラスミドインサートを、双方のストランド上で、完全にシークエ
ンスした。サイクルシークエンシング反応生成物を、ＥｔＯＨ／ＮａＯＡｃ沈殿
によって精製し、かつ、ＡＢＩ３７７ オートシークエンサー上で分析した。組
換えクローン、ＹＣＥ１４、ＹＣＥ１５およびＹＣＥ１６（ＩＰ１１６８５／Ｉ
Ｐ１１６８９から誘導された）のインサートのＤＮＡ配列は、Ｎ−末端方向に、
本来のＥＳＴクラスターのオープンリーディングフレームを伸長させ、さらにこ
のオープンリーディングフレームが、ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼタンパ
ク質ファミリーの新規メンバー（図２）から誘導されたという仮説を支持するも
のであった。したがって、この上流の配列は、ＥＳＴ配列中に存在する上流の配
列から完全にはずれていた。
【０１１７】 この新規配列は、概して“ＩＧＳ５”として、本発明の内容の範囲内で引用さ
れる。
【０１１８】 例３ｂ．ＩＧＳ５の全長コーディング配列を含有するｃＤＮＡフラグメントのク
ローニング 付加的なＩＧＳ５ｃＤＮＡ配列を得るために、ＲＴ−ＰＣＲ周囲の反応を、前
記に示した条件下で、ＩＧＳ５特異的リバースプライマー ＩＰ１２１９０（配
列番号９）および変性されたフォワードプライマー（ＩＰ１２４３３；配列番号
１０）を用いて、ヒト肺ＲＮＡ上で実施し、ＮＥＰ／ＥＣＥタンパク質ファミリ
ーの保存的ペプチドモチーフ［ＬＸＸＬＸＷＷＤ］上に中心をおいた。ＩＰ１２
１９０／１２４３３ ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ｐＧＥＭＴＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅ
ｃｔｏｒ 生成クローン ＹＣＥ１９、ＹＣＥ２２およびＹＣＥ２３中にクロー
ン化された±６００ｂｐのアンプリコンを製造した。すべてのクローンは、十分
にシークエンスされ、かつ、さらに上流にＩＧＳ５オープンリーディングフレー
ムを伸長させることができた（図２参照）。
【０１１９】 ＩＧＳ５転写産物の５’末端がカバーすることができるｃＤＮＡクローンを得
るために、セミ−ネスト５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を、ＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃ
ＤＮＡ増幅キット（Clontech K1802-1）によって提供されたアダプタープライマ
ー１（ＡＰＩ：配列番号１１）と一緒にＩＧＳ５特異的プライマーＩＰ１２１８
９（配列番号１２）およびＩＰ１２５８５（配列番号１３）を組み合わせて、ヒ
ト心臓 Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ上でおこなった。ＰＣＲ
ＲＡＣＥ反応は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社によって提供された、Ｍａｒａｔｈｏｎ−
ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡユーザーマニュアルの説明書にしたがって実施した。Ｒ
ＡＣＥ産物を、アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで可視化され
、かつ、ハイボンドＴＭ−Ｎ＋メンブレン（Amersham）上でブロットした。ブロ
ットを６５℃で２時間に亘って、モディファイトチャーチバッファー（０．５Ｍ
ホスフェート、７％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中でプレハイブリダイゼーシ
ョンし、その後に、クローンＹＣＥ２３の３２Ｐ−標識化インサート ２Ｘ１０ ６ ｃｐｍ／μｇを含有する同様のバッファー中で、６５℃で一晩に亘ってハイブ
リダズした。ＹＣＥ２３インサートを、供給元によって提供された説明書にした
がって、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ ｋｉｔＴＭ（Stratagene）を用いて、［α− ３２ Ｐ］ｄＣＴＰのランダムプライム組み込みによって、放射性同位元素標識し
ｍ特異的活性＞１０９ｃｐｍ／μｇにした。ハイブリダイズしたブロットを、高
いストリンジェンシー（２ＸＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中で室温で２Ｘ３０分、
引き続いて０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で４０分に亘って２回洗
浄した）で洗浄し、かつ、一晩に亘ってオートラジオグラフィーをおこなった。
ハイブリダイズしたフラグメントを、ゲルから精製し、ｐＧＥＭＴＭ−Ｔ Ｅａ
ｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（生成クローン YCE59,YCE64およびYCE65）中にクローン化
し、かつ、前記に示したようにシークエンスした。
【０１２０】 すべての単離されたクローンのＤＮＡ配列は、さらに上流にＩＧＳ５のオープ
ンリーディングフレームを伸長した単一のコンティグ中に構築されてもよいが、
それというのも、翻訳コドンのスタートをいまだ得ていないためである。プライ
マーＩＰ１１６８９は、ＥＳＴＡＩ３８０８１１上にデザインし、かつ、調整さ
れたＥＳＴ配列中に存在する終止コドン前の最後の４ヌクレオチドは組み込まれ
なかった。この終止コドンで終結するオープンリーディングフレームを作製する
ために、調整されたＥＳＴ配列の最後の２２ヌクレオチド（コンセンサス）を、
コンティグ中に含んだ。
【０１２１】 ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ 伸長かまたはｃＤＮＡライブラリーのシークエンシン
グによる、ＩＧＳ５コーディング配列の依然として欠落しているアミノ末端部分
のクローンのための幾つかの試みは、失敗に終わっている。したがって、予備的
なＩＧＳコンティグの５’末端の周囲および上流の領域で、遺伝子情報配列を得
ることを試みた。λＥＭＢＬ３ファージベクター（Clontech HL1067j）中に構築
されたヒト ゲノミックＤＮＡライブラリーのおおよそ５５００００プラークを
、ハイボンドＴＭ−Ｎ＋メンブレン上に乗せた。このメンブレンを、６５℃で、
２時間に亘って、モディファイトチャーチバッファー中でプレハイブリダイゼー
ションし、その後に、クローンＹＣＥ５９の５’末端に局在する、３２Ｐ−標識
された±１５０ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩＩフラグメント ２Ｘ１０６ｃｐ
ｍ／ｍｌを含有する同様のバッファー中で、６５℃で一晩に亘ってハイブリダイ
ズした。ｃＤＮＡプローブを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ ｋｉｔＴＭ（Stratage
ne）を用いて、供給元によって提供された説明書にしたがって、［α−３２Ｐ］
ｄＣＴＰのランダムプライム組み込みによって、放射性同位元素標識し、特異的
活性＞１０９ｃｐｍ／μｇにした。ハイブリダイズされたメンブレンを、高いス
トリンジェント（２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温で２Ｘ３０分、引き続い
て０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６５℃で、４０分に亘って１回洗浄した
）で洗浄し、オートラジオグラフィーをおこなった。ハイブリダイズしたプラー
クを、２ラウンド目のシークエンシングに用い、かつ、純粋な単一のプラークを
得た。組換えファージＤＮＡをインフェクションさせた液体培養物から、Ｑｉａ
ｇｅｎＴＭ λ Ｍｉｄｉｋｉｔ（Qiagen）を用いて精製し、かつ、前記に示し
たように、フランキング ＥＭＢＬ３ベクタープライマーおよびＩＧＳ５インタ
ーナルプライマーを用いてシークエンシングした。クローンＩＧＳ５／Ｓ１のイ
ンサートから、予備ＩＧＳ５コンティグの５’末端の上流のおおよそ５０００ヌ
クレオチドをシークエンスした。翻訳ＤＮＡデータバンクのホモロジーサーチは
、この５０００ｂｐのフラグメントが、マウスＳＥＰ配列（Genbank 受託番号Ａ
Ｆ１５７１０５）中の二者択一的なスプライシングされた６９ｂｐフラグメント
と最も類似するペプチドをコードする７８ｂｐのストレッチを含むことを示し、
この場合、これは、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの新規メンバーであることが最近
になって示された（Ikeda et al.［1999］JBC 274: 32469-32477）。この７８ｂ
ｐのヒトフラグメントは、それぞれ、推測コンセンサススプライシングアセプタ
ーおよびドナー部位によっておよび引き続いて進められるが、しかしながら、翻
訳コドンの“ＡＴＧ”スタートを含んではいなかった。
【０１２２】 ＩＧＳコーディング配列のアミノ末端部分を含有するｃＤＮＡクローンを得る
ために、セミ−ネスト ５’ ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を、ヒト精巣 Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ（Clontech 7414-1）上で、Ｍａｒａｔｈｏｎ
ＴＭｃＤＮＡ増幅キット（Clontech K1802-1）によって提供されたアダプタープ
ライマー１（ＡＰ１：配列番号１１）を、ＩＧＳ５特異的アンチセンスプライマ
ーＩＰ１４２４１（配列番号１４）およびＩＰ１４２４２（配列番号１５）と組
み合わせて用いておこない、この場合、これは、前記に示したように７８ｂｐの
ゲノミックフラグメントの範囲内でデザインされている。ＰＣＲ ＲＡＣＥ反応
は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（反応容量＝２５μｌ）によって提供されたＭａｒａｔ
ｈｏｎＴＭｃＤＮＡユーザーマニュアルの説明書にしたがっておこなった。ＲＡ
ＣＥ産物は、アガロースゲル上で分離され、エチジウムブロマイドで可視化され
、かつ、サザンブロッティングによって分析された。
【０１２３】 ブロットされたＲＡＣＥ産物のための特異的なハイブリダイゼーションプロー
ブを製造するために、セミ−ホモロジーＰＣＲ反応を、前記で得られたネストＲ
ＡＣＥ産物上で、リバースオリゴヌクレオチドプライマー ＩＰ１４２４１（配
列番号１４）および変性されたフォワードプライマー（ＩＰ１３７９８；配列番
号１６）を用いておこない、この場合、これは、マウスＳＥＰタンパク質の膜貫
通ドメインの範囲内でのペプチドモティーフ［ＧＬＭＶＬＬＬＬ］上に中心をお
いた。ＰＣＲ反応を、セミ−ネスト ５’ ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応産物 １μｌ
、ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ １０ＸＰＣＲバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ、
フォワードおよびリバースプライマーそれぞれ１０ｐｍｏｌおよびＡｍｐｌｉＴ
ａｑ−ＧｏｌｄＴＭポリメラーゼ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） ２．５ｕｎ
ｉｔを含有する２５μｌ容量中で実施した。９５℃で１０分に亘っての最初の変
性後に、ＰＣＲ反応チューブを、以下のような３５Ｘサイクル下においた：変性
９５℃ １分間、アニーリング ５０℃ ３０秒間、伸長 ７２℃ ３０秒間
。ＰＣＲ反応産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析した。セミ−ホモロ
ジーＰＣＲ反応は、±１１０ｂｐのアンピリコンを製造した。フラグメントを、
ゲルから、Ｑｉａｅｘ−ＩＩＴＭ精製キット（Qiagen）を用いて精製し、かつ、
供給元（ｐＧＥＭＴＭ−Ｔｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって奨励されて
いる方法にしたがってｐＧＥＭＴＭ−Ｔ プラスミドにライゲートした。組換え
プラスミドはその後に、コンピテント Ｅ．Ｃｏｌｉ ＳＵＲＥＴＭ２ バクテ
リア（Stratagene）に形質転換するために使用した。形質転換細胞を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｌ）、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）およびＸ−ｇａｌ（５０μｇ
／ｍｌ）を含有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。プラスミドＤ
ＮＡを、別個のコロニーのミニカルチャーから、ＢｉｏＲｏｂｏｔＴＭ９６００
核酸精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、かつ、前記に示したように
シークエンスした。組換えクローン、ＹＣＥ２０７、ＹＣＥ２１２、ＹＣＥ２１
６、ＹＣＥ２１７、ＹＣＥ２１８およびＹＣＥ２１９のインサートのＤＮＡ配列
は、前記に示されたように７８ｂｐのゲノミックフラグメントで、単一のコンテ
ィグ中に構築することができる（図２参照）。
【０１２４】 セミーネスト５’-ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応産物のサザンブロットを、モディフ
ァイトチャーチバッファー中で、６５℃で１時間に亘ってプレハイブリダイゼー
ションし、その後に、３２Ｐ−標識されたクローンＹＣＥ２０７のインサート
２Ｘ１０６ｃｐｍ/ｍｌ含有する同様のバッファー中で、６５℃で一晩に亘って
ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイズされたブロットを、高いストリン
ジェンシーで洗浄し、かつオートラジオグラフィーした。ハイブリダイズされた
フラグメントをゲルから精製し、ｐＧＥＭＴＭ―Ｔベクター（生成クローンＹＣ
Ｅ２２３、ＹＣＥ２２４およびＹＣＥ２２６）中にクローン化し、かつ、前記に
示したようにシークエンスした。これらクローンのＤＮＡ配列を、７８ｂｐのゲ
ノミックフラグメントおよびクローンＹＣＥ２０７、ＹＣＥ２１２、ＹＣＥ２１
６、ＹＣＥ２１７、ＹＣＥ２１８およびＹＣＥ２１９で、単一のコンティグに構
築した（図２）。生じるコンティグは、“ＡＴＧ”開始コドンから出発し、マウ
スＳＥＰタンパク質のＮ―末端配列との高い類似性を示すタンパク質をコードす
るオープンリーディングフレームを含有していた。
【０１２５】 ＩＧＳ５コーディング配列のアミノ末端部分をカバーし、かつクローンＹＣＥ
５９とオーバーラップするｃＤＮＡクローンを得るために、ＰＣＲ反応を、ＩＧ
Ｓ５の５’ＵＴＲ配列に基づく特異的フォワードプライマー（ＩＰ１４５３５；
配列番号１７）およびＹＣＥ５９の範囲内に配置される特異的リバースプライマ
ー（ＩＰ１４５３７；配列番号１８）を用いて、ヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ―Ｒ
ｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ（Clontech 7414-1）上でおこなった。ＰＣＲ反応を、ヒ
ト精巣 Ｍａｒａｔｈｏｎ―ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ ２．５μｌ、ＧｅｎｅＡ
ｍｐＴＭ １０ＸＰＣＲバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、ＰＥＢ
ｉｏｓｙｓｔｅｍ） ２．５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ、フォワ
ードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ１０ｐｍｏｌおよびＡｍｐｌ
ｉＴａｑ−ＧｏｌｄＴＭポリメラーゼ ２．５ｕｎｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍ）を含有する２５μｌ容量中でおこなった。最初の変性９５℃１０分間の後
に、ＰＣＲ反応チューブを、以下のような４１Ｘサイクル下においた：変性 ９
５℃、１分間、アニーリング ５３℃、１分間および伸長 ７２℃、１分間。Ｐ
ＣＲ反応産物をアガロース電気泳動によって分析した。ＰＣＲ反応によって、そ
れぞれ±３００および３８０ｂｐの２個のアンプリコンが製造された。３００ｂ
ｐおよび３８０ｂｐのフラグメントをゲルから精製し、ｐＧＥＭＴＭ−Ｔベクタ
ー中にクローン化し、かつ前記のようにシークエンシングした。これによってク
ローンＹＣＥ２３１、ＹＣＥ２３３およびＹＣＥ２３５（３００ｂｐフラグメン
ト）およびＹＣＥ２２９（３８０ｂｐフラグメント）が得られた。
【０１２６】 すべての単離されたクローンのＤＮＡ配列の構築は、２つの型のｃＤＮＡ配列
の存在を示し、この場合、これは、７８ｂｐのセグメントが存在するかどうかに
よって異なり、ゲノミッククローンＩＧＳ５／Ｓ１の範囲内で最初に同定された
。これら２個の配列は同様に、二者択一的なスプライシングＲＮＡ分子に由来す
る。もっとも長い転写産物は、２３３７ヌクレオチドのオープンリーディングフ
レーム（７７９残基のタンパク質をコードする）を含有し、その一方で短い転写
産物は、２２５９ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含有する（７
５３残基のタンパク質をコードするタ）。我々は、長い形のコーディング配列お
よびタンパク質配列を、それぞれＩＧＳ５ＤＮＡ１（配列番号３に示された、終
止コドンｔａｇを含有する２３４０ｂｐ）およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ１（配列番号
４）として引用し、その一方で、短い形のコーディング配列およびタンパク質配
列を、それぞれＩＧＳ５ＤＮＡ２（配列番号５に示された、終止コドンｔａｇを
含有する２２６２ｂｐ）およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２（配列番号６）として引用し
た。ＩＧＳ５ＤＮＡ１およびＩＧＳ５ＤＮＡ２の推測メチオニン開始コドンの下
流において、付加的なフレーム内のメチオニンコドンは、コドン位置１０におい
て存在する。我々は、開始コドンとして、コドン位置１０でのいくつか（または
唯一）の翻訳開始が排除されない最初のメチオニンコドンを決めたけれども、し
かしながら、双方のメチオニンは、同等に好ましい翻訳部分“Kozak”開始の範
囲内で生じるべきである（Kozak M., Gene ［1999］: 234: 187-208）。ＩＧＳ
５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２配列のヒドロパシー分析（Kyte J. et a
l., J. Mol. Biol.［1982］157: 105-132; Klein P et al., Biochim. Biophys.
Acta［1985］815: 468-476）は、残基２２〜５０間の単一の膜貫通領域の存在
を示した。これは、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２が、ＩＩ型
内在性膜タンパク質であり、したがって、ＮＥＰ／ＥＣＥタンパク質ファミリー
の他の群と類似する膜トポロジーを有する。
【０１２７】
【表８】
【０１２８】 例４ ＮＥＰ／ＥＣＥ メタロプロテアーゼファミリーメンバーのタンパク質配
列を有するＩＧＳ５の整列 例３でクローン化されたＩＧＳ５配列に関して、最新のタンパク質データーバ
ンクおよび翻訳ＤＮＡデーターバンクのホモロジーサーチは、ＢＬＡＳＴアルゴ
リズムを用いておこなった（Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. ［199
7］25: 3389-3402）。これらのサーチは、ＩＧＳＰＲＯＴ１が、マウスＳＥＰ（
GenBank 受託番号 AF157105）に最も類似（７７８調整残基上の７６％の同一性
）していることを示し、さらには、マウス、ラットおよびヒト中性エンドペプチ
ターゼ（SW:NEP＿MOUSE、受託番号Ｑ６１３９１；ＳＷ：ＮＥＰ＿ＲＡＴ、受託
番号Ｐ０７８６１、ＳＷ：ＮＥＰ＿ＨＵＭＡＮ、受託番号Ｐ０８４７３）に対す
る６９６調整残基上で５４〜５５％の同一性を示した。ＩＧＳ５ＰＲＯＴ２のホ
モロジーサーチは、この配列が、マウスＳＥＰ（GenBank 受託番号ＡＦ１５７
１０６）と最も類似していることを示した（７５２調整残基上での７８％の同一
性）。マウスＳＥＰおよびＳＥＰタンパク質とのアナロジーにおいて、ＩＧＳ５
ＰＲＯＴ１およびＩＧＳ５ＰＲＯＴ２が、それぞれ、膜結合され、かつ可溶性の
形のＩＧＳ５を示すことが予測される。これは、二者択一的にスプライシングさ
れた７８ｂｐエキソンの３’末端でコードされた二塩基性残基（ＫＲＫ）の存在
によって確認された。
【０１２９】 したがって、ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーの他のメンバーを有する完全なＩＧＳ
５タンパク質配列の整列は、一般に、ＮＥＰ／ＥＣＥメタロプロテアーゼ、特に
、ＳＥＰおよびＮＥＰファミリーメンバーに対するＩＧＳ５の関係を示す。この
構造的整列から、ＩＧＳ５タンパク質は、メタロプロテアーゼの機能を有し、こ
の場合、これは、動物およびヒトにおける幾つかの機能不全、障害または疾病に
関連して重要である。
【０１３０】 例５．ＩＧＳ５のＲＮＡ発現分析 ヒトＲＮＡマスターブロット（Master BlotＴＭ）上のＩＧＳ５発現分析 Ｅｘｐｒｅｓｓ−ＨｙｂＴＭ（Clontech #8015-1）および細断されたサケ精巣
ＤＮＡの溶液を、以下のようにして調製した：Ｅｘｒｅｓｓ−Ｈｙｂ １５ｍｌ
を、５０〜６０℃で予め加熱した。細断したサケ精巣ＤＮＡ １．５ｍｇを９５
℃で５分間に亘って加熱し、その後に、氷上で急冷した。熱変性し細断したサケ
精子ＤＮＡを、予め加熱したＥｘｐｒｅｓｓ−ＨｙｂＴＭと一緒に混合した。ヒ
トＲＮＡマスターブロット（Master BlotＴＭ）（Clontech #7770-1）を前記の
ようにして調製した溶液 １０ｍｌ中で、３０分に亘って６５℃で連続的に攪拌
しながら、プレハイブリダイズした。３２Ｐ−標識されたＹＣＥ１５プローブ（
Prime-it IIＴＭ kit Stratagene で標識した）を、熱変性し、かつ、残りのＥ
ｘｐｒｅｓｓ−ＨｙｂＴＭ溶液 ５ｍｌに添加した。ハイブリダイゼーションを
、６５℃で一晩に亘っておこなった。洗浄を、２ＸＳＳＣ／１％ＳＤＳで、６５
℃で１００分（５Ｘ２０分）に亘っておこなった。２回の付加的な２０分に亘る
洗浄を、０．１ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ ２００ｍｌ中で、５５℃でおこなった
。最終的に、マスターブロットをＸ線フィルムを用いてオートジオグラフィーを
おこなった。マスターブロット（Master BlotＴＭ）上のＩＧＳ５プローブのハ
イブリダーゼーションは、組織において広範囲での発現を示し、かつ、特に、精
巣、小腸、前立腺および胃においてみられた（第３図）。
【０１３１】 ヒト脳多層組織（Multiple tissue）ノーザンブロットＩＩおよびＩＶ上でのＩ
ＧＳ５発現の分析（それぞれ、＃７７５５−１および＃７７６９−１） Ｅｐｒｅｓｓ−ＨｙｂＴＭ溶液（Clontech #8015-1）を、６８℃で予め加熱し
た。ブロットを、６８℃で１時間に亘ってプレハイブリダイズした。細断しサケ
精巣ＤＮＡ １００μｇを、３２Ｐ標識されたＹＣＥ１５プローブ（Ｐｒｉｍｅ
−ｉｔＩＩＴＭ ｋｉｔ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅで標識した）に添加し、９５℃
で１０分間に亘って熱変性させた。プローブを、残りのＥｘｐｒｅｓｓ−Ｈｙｂ ＴＭ 溶液 ５ｍｌに添加し、かつハイブリダイゼーションを、６８℃で２時間に
亘っておこなった。洗浄を、２ＸＳＳＣ／０．０５％ ＳＤＳ中で、ＲＴで、４
０分に亘って（２Ｘ２０分）おこなった。２回の付加的な２０分に亘る洗浄は、
０．１ＸＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ ２００ｍｌ中で、５５℃でおこなった。ブ
ロットを、Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーした。
【０１３２】 このノーザンブロット分析では、±３ｋｂのハイブリダーゼーションのメジャ
ーバンドおよび±５．５〜６ｋｂのマイナーバンドが、試験されたすべての組織
中で検出された。
【０１３３】 例６．ヒトＩＧＳ５のＨＩＳ−ｔａｇされたエクトドメインの発現および精製 実験の目的は、バキュロウイルス発現系を用いて、可溶性ＩＧＳ５タンパク質
を製造することである。組換えバキュロウイルスは、Ｓｆ９細胞系のインフェク
ション上で発現されたＨｉｓ６−ＴａｇされたＩＧＳ５エクトドメインを構築す
る。可溶性のＩＧＳ５タンパク質は、その後に、培養上清から、レンチル−レク
チンおよびＺｎ−ＩＭＡＣクロマトグラフィーを含む２段階工程で精製した。
【０１３４】 プロ−オピオメラノコルチン前駆体（ＰＯＭＣ）の単一ペプチドをＩＧＳ５コ
ーディング配列のＨｉｓ−Ｔａｇされた細胞外部分と融合させた。タンパク質の
酵素的活性部位（メタロプロテアーゼ）が、Ｃ−末端に存在する場合には、タン
パク質のＮ−末端でＨｉｓ−精製ｔａｇを添加することが好ましい。さらに、Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、ＰＯＭＣシグナルペプチドおよびＩＧＳ５エクトドメ
イン間に挿入した。発現したＩＧＳ５タンパク質は、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ２の残基
６０（ＳＥＶＣ・・・）で開始され、このようにして、ほぼ完全なＩＧＳ５エク
トドメインを含有していた。クローニング戦略は、合成オリゴヌクレオチド構造
体、オーバーラップＰＣＲおよび３−ポイントライゲーションを含む。これは、
結果として、ＰＯＭＣシグナル（分泌上で分断した）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー
、Ｈｉｓ６ペプチドおよびＩＧＳ５細胞外領域から成るタンパク質の発現を生じ
た。
【０１３５】 例６ａ．ｐＡｃＳＧ２ＳＯＬｈｕｌＧＳＨｉｓ６バキュロトランスファーベクタ
ーの構築 ｐＡｃＳＧ２ＳＯＬｈｕｌＧＳ５バキュロトランスファーベクターの構築のた
めに、以下のＤＮＡフラグメントを製造した： １．ｐＡｃＳＧ２ベクター（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、ＳｔｕＩ／Ｎ
ｏｔＩで消化した。５５２７ｂｐのフラグメントを、ＱｉａＥｘＩＩ 抽出キッ
ト（Westburg）を用いてアガロースゲルから抽出し、かつ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ８．５ ３０μｌ中に溶解させた。
【０１３６】 ２．ｐＧＥＭＴクローンおよびＹＣＥ１７４を、クローンＹＣＥ１５、ＹＣＥ２
２、ＹＣＥ６４およびＹＣＥ６５から、ＰＣＲおよび制限酵素消化／ライゲーシ
ョンの組み合わせによって構築した。プライマーＩＰ１３５４１は、ＩＰ１１６
８９とは対照的に、ＩＧＳ５コーディング配列および終止コドンの最後の４ヌク
レオチドを含有しており、かつ、この方法に使用した（第９表）。したがって、
ＹＣＥ１７４は、終止コドン（第２表）下方の（そしてこの終止コドンを含む）
ｈｕＩＧＳ５細胞外領域のほぼ完全なコーディング領域を含有していた。ＹＣＥ
１７４は、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化され、結果として３０２５ｂｐ、１７２３
ｂｐおよび４４８ｂｐのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって示し
たように切り出した。ｈｕＩＧＳ５ エクトドメインのためのコーディング領域
を含有する１７２３フラグメントを、ゲルから抽出され（QiaexII, Qiagen）、
かつ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５ ２０μｌ中に溶解させた。
【０１３７】 ３．ＰＯＭＣシグナル配列、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、Ｈｉｓ６ ｔａｇおよび
６５ｂｐのＩＧＳ５エクトドメインコーディング配列の５’末端に引き続いて、
５’末端でＳｔｕＩ認識部位を含有する、合成核酸フラグメント（１８０ｂｐ）
を、プライマーＩＰ１４１６６およびＩＰ１４１１０（第９表、図４参照）での
オーバーラップＰＣＲによる、オリゴヌクレオチド ＩＰ１４１６５、ＩＰ１４
１１４、ＩＰ１４１１５、ＩＰ１４１１６、ＩＰ１４１１７、ＩＰ１４１１８、
ＩＰ１４１１９およびＩＰ１４１２０の組み合わせによって構築した。天然のＰ
ＯＭＣシグナルペプチドコーディング配列中に存在するＳｔｕＩ部位を、ｂｐ位
置５７でのサイレント突然変異を導入することによって除去した（ＩＰ１４１１
５、ヌクレオチド３０Ｇ−＞Ａ）。
【０１３８】
【表９】
【０１３９】 第２ＰＣＲフラグメント（４９５ｂｐ）を、クローンＹＣＥ１７４テンプレー
トから、プライマーＩＰ１４１１１およびＩＰ１４１１２を用いて増幅させた。
第１および第２ＰＣＲ産物を、６５ｂｐの長さのオーバーラッピング領域を分割
する。テンプレートとして双方のＰＣＲ産物の混合物を使用することによって、
オーバーラップＰＣＲを、プライマーＩＰ１４１６６およびＩＰ１４１１２を用
いておこない、最終的に６１０ｂｐのＰＣＲフラグメントを得た。このフラグメ
ントを、ＱｉａＱｕｉｃｋ スピンカラム（Qiagen）上で精製し、ＳｔｕＩ／Ｘ
ｈｏＩ消化された結果しての４９６ｂｐのフラグメントを、アガロースゲルから
抽出した（QiaexII）。
【０１４０】 前記に示したように製造された３個のＤＮＡフラグメント（５５２７，１７２
３および４９６ｂｐ）を、ライゲーション反応中で組み合わせた。ライゲーショ
ン反応は１６℃で一晩に亘ってインキュベートし、コンピテント細胞 ＤＨ５ａ
ｌｐｈａＦ’の形質転換のために使用した。形質転換したバクテリアを、ＬＢア
ガー／アンピシリン プレート上にプレーティングした（１００μｇ／ｍｌ ア
ンピシリン）。プレートを３７℃で一晩に亘ってインキュベートした。３０個の
ランダムコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが添加された５ｍｌのＬ
Ｂ培地中で培養した。プラスミドＤＮＡを、ＢｉｏｒｏｂｏｔＴＭ９６００核酸
精製システム（Qiagen）を用いて製造し、かつ、ＢａｍＨＩ消化によってスクリ
ーニングした。正確な制限酵素消化パターンを示す７個のコロニーを、さらにＸ
ｈｏＩ、ＳｔｕＩ、ＡｌｗＮＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｃＩＩ消化によって
分析し、かつインサートの配列を分析した。正確な制限酵素パターンおよび期待
されたインサート配列を有する１個のコロニーが最終的に選択され、かつ、ＩＣ
ＣＧ４５０２としてカルチャーコレクション（菌株リスト）に寄託された（この
クローンは、トランファーベクターのｂｐ位置８７８（Ｇ−＞Ａ）で、サイレン
ト突然変異を含有する）。
【０１４１】 滅菌されたＱｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ プレップ（Westburg）を寄託さ
れたクローンから作製し、この場合、これは、１１０μｇのＤＮＡを得た。Ｘｈ
ｏＩ、ＡｌｗＮＩ、ＳｔｕＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩ消化による制
限酵素分析は、アガロースゲル電気泳動によって示されたような正確な制限酵素
パターンを示した。配列分析によって、期待された配列が確認された。ｐＡｃＳ
Ｇ２ＳＯＬｈｕｌＧＳＨｉｓ６ バキュロトランスファーベクターは、図５に示
した。
【０１４２】 例６ｂ．可溶性ｈｕｌＧＳ５Ｈｉｓ６の発現のための組換えバキュロウイルスの
製造 Ｎ−末端Ｈｉｓ ｔａｇされたヒトＩＧＳ５の細胞外領域（マイナス２，３の
ＡＡ）を発現する組換えバキュロウイルスは、ホスト昆虫細胞（Spodoptera fru
giperda Sf9 cells）中のｐＡｃＳG２ＳＯＬｈｕｌＧＳ５Ｈｉｓ６トランスファ
ーベクターＤＮＡ（ＩＣＣＧ ４５０２）の、ホスト昆虫細胞（Spodoptera fru
giperda Sf9 cell）中の野生型バキュロウイルスゲノムの改質型の直線化された
ゲノミックＤＮＡ（BaculoGold; Pharmingen ｃａｔ番号21100D）へのｃｏ−ト
ランスフェクション（Ｃａ−リン酸塩トランスフェクション法）によって作製さ
れた。Ｂａｃｕｌｏ ＧｏｌｄＤＮＡは、致死的欠損を含み、かつ生存可能なウ
イルスをコードしない。Ｂａｃｕｌｏ ＧｏｌｄＤＮＡの完全なバキュロウイル
ス トランフファー ベクターへのｃｏ−トランスフェクションは、相同組換え
によって致死的欠損を回避する。この試みを用いて、３個の独立した候補組換え
体をプラーク精製した。すべての候補組換え体を増幅させた。
【０１４３】 例６ｃ．真核性発現 キネティック発現分析 １０％の不活性化されたウシ胎児血清（Gibco BRL Cat番号 10084168）を添
加したＴＣ１００培地（JRH Biosciences Cat番号 56941）中で、スピナーフラ
スコ中で、２７℃で、懸濁液中で指数的に成長させたＳｆ９細胞（ＩＧＣＬ ８
３．０）を、低速の遠心分離によって回収し、かつ、血清不含のＴＣ１００培地
中に、５Ｘ１０５細胞／フラスコ（２５ｃｍ２）で播いた。候補組換えウイルス
クローンを、３ｐｆｕ／細胞のインフェクション多重度（ＭＯＩ）で添加し、か
つ、細胞／ウイルス培養物をその後に２７℃でインキュベートした。候補媒体（
ＣＭ）を、２回の連続した低速遠心分離によってインフェクション後２４時間、
４８時間および７２時間でハーベストした。試料を、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気
泳動およびウエスタンブロッティングによって分析した。
【０１４４】 ウエスタンブロットは、すべての候補クローンのＣＭ中で約８１ｋＤａの明瞭
なバンドを示し、この場合、これは、成熟タンパク質の理論的Ｍｒ（８１．２ｋ
Ｄａ）に相当した（示されていない）。すべての３個のクローンの発現レベルは
、インフェクション後４８〜７２時間でピークに達した。クローン２を、さらな
る増幅のために選択し、かつ、ＩＧＢＶ７３として寄託した。最適なハーベスト
時間は、インフェクション後７２時間に設定された。
【０１４５】 脱グリコシル化試験 可溶性のヒトＩＧＳ５タンパク質配列は、８ポテンシャルＮ−グリコシル化部
位を含有する（図６）。精製方法が、レンチル−レクチンカラム上の糖残基の結
合を含むことから、インフェクション後７２時間でハーベストされたすべての候
補組換え体ウイルスクローンのＣＭ試料を、Ｎ−グリコシダーゼＦを用いて、脱
グリコシル化試験のために使用し、組換え体可溶性Ｈｉｓ６ＩＧＳ５タンパク質
が、グリコシル化タンパク質として正確に発現するかどうか調べた。
【０１４６】 試料に、ＳＤＳを最終濃度１％になるように添加し、かつ、９５℃で５分間に
亘ってインキュベートした。２Ｘインキュベーションバッファー（２５０ｍＭホ
スフェートバッファー、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ Ｎ−オクチルグリコシド、
１％ ２−メルカプトエタノール）の１容量を添加し、かつ、９５℃で５分間に
亘ってのインキュベーションの後に、試料を３７℃に冷却した。Ｎ−グリコシダ
ーゼＦ １Ｕ（Borhringer mannheim, cat番号 1365177）を添加し、かつ、３
７℃で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、試料を１００ｍＭ ＤＴＴ（
最終濃度）で還元した。
【０１４７】 Ｎ−グリコシダーゼＦ処理されたＣＭ試料および非処理コントロール群のウエ
スタンブロット分析は、試料が脱グリコシル化された場合に、Ｍｒにおけるシフ
トを示し（図７）、可溶性ヒトＨｉｓ−ｔａｇＩＧＳ５が、グリコシル化された
タンパク質として発現することを証明した。
【０１４８】 例６ｄ．精製 分取製造および試料の前処理 １０％不活性化ウシ胎児血清（Gibco BRL, cat番号1084168）を添加したＴＣ
１００培地（JRH Biosciences, cat番号 56941）中で、２７℃で、スピナーフ
ラスコ中で、懸濁液中で指数的に成長したＳｆ９細胞（ＩＧＣＬ ８３−２）を
、低速の遠心分離によって回収し、かつ、０．０１３ＴＩＵ アプロチニン／ｍ
ｌ（Pentex）を添加したＴＣ１００培地中で２Ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で再懸
濁した。組換えウイルス ＩＧＢＶ７３を細胞に、２．２５ｐｆｕ／細胞の感染
多重度（ＭＯＩ）で添加した。その後に、細胞／ウイルス懸濁液をガラス回転容
器（３Ｘ５００ｍｌ／１２６０ｃｍ２）中で、２７℃で、７２時間に亘ってイン
キュベートした。その後に、ＣＭ（１．５ｌ）を細胞および細胞崩壊物から、２
個の連続的な低速遠心分離によって清浄化した。ＥＤＴＡ不含のコンプレートの
１タブレット（ＥＦＣ；Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ｃａｔ番号
１８７３５８０）を、清浄化されたＢａｃｕｌｏ ＣＭ ３００ｍｌに添加した
。ＨＥＰＥＳ、グリセロールおよびＴｗｅｅｎ２０を、それぞれ２０ｍＭ、５％
（ｖ／ｖ）および０．０５％（ｗ／ｖ）で添加した。ＣＭのｐＨを、７．４に調
整し、かつ試料を濾過した（Durapore Menbrane Filters 0.2μGV）。すべての
精製工程を、４℃で実施した。
【０１４９】 レンチルレクチンクロマトグラフィー バキュロ試料を、Ｃ１０／１０カラム（Pharmacia）中のレンチルレシチンセ
ファロース樹脂５ｍｌ上で、０．３ｍｌ／分で、一晩に亘ってロードし、この場
合、これは、１タブレット ＥＦＣ／５００ｍＬを添加したバッファーＡ（20mM
Hepes, pH7.4, 150mM NaCl, 5% グリセロール、0.005% Tween20）で平衡化した
。カラムを平衡化バッファーで、２８０ｎｍでの吸光度が基準レベルがに達する
まで洗浄し、かつ、結合タンパク質を、０．５Ｍアルファメチルピラノシドを含
有するバッファーＡを適用させることによって、１ｍｌ／分で溶離させた。カラ
ムを、１００ｍＭ アセテート、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０を適用させ
ることによって再生した。溶離液および再生液を回収し、かつプールをＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって、１２．５％Ｐｈａｓｔ ｇｅｌ（Pharmacia）上で分析し、
かつ、銀染色した。プレステインドマーカー（Gibco）を、相対分子量（Mr）ス
タンダードとして含んだ。タンパク質の主要な量を、流動（flow through）中で
検索し、かつ、約８５０００のＭｒを有するＩＧＳ５−候補結合を、溶離プール
１〜３（図８）中で見出した。ａｎｔｉ−Ｈｉｓ Ｔａｇ ｍａｂでのレンチル
クロマトグラフィーのウエスタンブロットは、可溶性ｈＩＧ５タンパク質（Ｍｒ
〜８５０００）が、定量的に、レンチルレクチン樹脂に結合し、かつ、このｈｉ
ｓ−ｔａｇタンパク質が、全体の溶離ピーク上で回収されるが、しかしながら、
主に、プール１および２中で回収されることを示した（図９）。レンチルレクチ
ン溶離プール１および２は、さらに、亜鉛−ＩＭＡＣカラム（ランＡおよびＢ）
上で処理した。
【０１５０】 固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および透析 １ｍｌのキレート化ＨｉＴｒａｐ（Pharmacia）を、亜鉛イオンで、製造者に
よって記載されたようにロードし、かつ、バッファーＢ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
，１００ｍＭ ＮａＣｌ，５％グリセロール，０．００５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０，ｐＨ７．２）で平衡化した。レンチル溶離プール１および２を別個に、
０．５ｍｌ／分で、ＨｉＴｒａｐ カラム上にロードした（ＩＭＡＣ ランＡお
よびＩＭＡＣ ランＢ）。ブランクのランを、クロマトグラフィー吸光度プロフ
ィールを比較するために含む。カラムを、バッファーＢで、基準レベルまで洗浄
し、かつ、結合タンパク質を、バッファーＢ中のイミダゾール段階勾配（imidaz
ole step gradient）（５０，１００および２００ｍＭ）を適用させることによ
って溶離した。分画を捕集した。ＩＭＡＣカラムを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５
０ｍＭ ＥＤＴＡ，５００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２を適用させることによっ
て再生させた。溶離および再生プールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（12.5% Phast gels
, Pharmacia）によって分析し、かつ銀染色した。２００ｍＭ イミダゾールプ
ールを、スライドアナライザー−カセット（ＭＷＣＯ １００００，Ｐｉｅｒｃ
ｅ）に移し、かつ、バッファーＢ（１３０倍過剰量、バッファーは再添加しない
）に対して一晩に亘って透析した。透析プール中の可溶性ＩＧＳ５の量は、マイ
クロ−ＢＣＡ（Pierce）で測定した。ＢＳＡを参考例として含む。透析されたバ
キュロＩＧＳ５を、（１）還元条件および非還元条件下でＳＤ−ＰＡＧＥによっ
て、かつ、ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ ｍＡｂ（２１Ｅ１Ｂ４，Innogenetics）
でウエスタンブロットし、引き続いて、アルカリホスファターゼ標識されたラビ
ットａｎｔｉ−マウスＩｇ（Ｄａｋｏ）でインキュベーションし、かつ、ＮＢＴ
／ＢＣＩＰ染色で検出した。可溶性ＩＧＳ５のグリコシル化の状態は、ＰＧＮａ
ｓｅＦ処理（Biorad）によって証明された。
【０１５１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および銀染色は、汚染されたタンパク質のバルクが、２
０ｍＭおよび５０ｍＭのイミダゾール工程を適用することによって溶離したこと
を示した（図１０）。ｈＩＧＳ５タンパク質を、１００ｍＭおよび２００ｍＭの
イミダゾール溶離工程で検索した。２００ｍＭイミダゾールプール中の８５ｋＤ
ａのバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのシングルバンドであり、この場合、これ
は、ａｎｔｉ ｈｉｓ−ｔａｇ ｍＡｂと反応させる（図９）。銀染色は、ＩＭ
ＡＣから得られたｈＩＧＳ５材料のランＡおよびランＢ間で、純度の任意の差を
示すことはない。バキュロＣＭ ３００ｍｌから出発して、３４０μｇの９５％
を上廻る純度のｈｉｓ−ｔａｇ ｈＩＧＳ５エンクトドメインを、２段階の精製
工程によって得た（たとえば、収率 約１ｍｇ／Ｌ）。
【０１５２】 ２００ｍＭ イミダゾール Ｚｎ−ＩＭＡＣ プールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
に、ＰＶＤＦメンブレン上にブロットし、かつ、タンパク質をアミノブラック染
色によって可視化した。ＰＶＤＦバンドを、連続的に２０％アセトニトリル、お
よび２０％メタノールで洗浄し、かつ乾燥させた。アミノ−末端シークエンシン
グを、ＰｒｏｃｉｓｅＴＭ ４９２Ａ（Applied Biosystems）を用いて、取り扱
い説明書にしたがって、Ｅｄｍａｎ変性によって実施した。アミノ末端シークエ
ンシングは、バキュロＩＧＳ５が、８５ｋＤａ タンパク質バンド中で回収され
ることを確認した。
【０１５３】 例７ 酵素阻害アッセイ 本発明のＩＧＳ５ポリペプチドの酵素活性を、生物学的活性ペプチドの代謝に
関して試験した。特に、これらのＩＧＳ５ポリペプチドが、従来技術から公知の
種々のバソアクティブペプチド、たとえば、心房性ナトリウム排泄増加ペプチド
（ＡＮＰ）、ブラジキニン、ｂｉｇ エンドセリン（Ｂｉｇ ＥＴ−１）、エン
ドセリン（ＥＴ−１）、サブスタンスＰおよびアンジオテンシン−１上で作用す
るかどうかを試験した。本発明に関連して、特に、新規ヒト メタロプロテアー
ゼであるＩＧＳ５エクトドメインが、前記バソアクティブペプチドを加水分解す
るかどうかを試験した。比較のために、アッセイはさらに、可溶性の分泌型エン
ドペプチダーゼ（ＳＥＰ）としてＥｍｏｔｏら（J.Biol.Chem., Vol.274 (1999)
: pp. 32469-32477）によって先に記載された、公知のメタロプロテアーゼファ
ミリーメンバーに関してもおこなった。さらに、Ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログ（い
わゆる１７ａａ Ｂｉｇ−ＥＴ）を変換するＩＧＳ５の活性が、引用された化合
物によって抑制されるかどうか試験し、この場合、この化合物は、ＥＣＥおよび
／またはＮＥＰ−特性を有する酵素に関して、阻害特性を測定するために使用さ
れる。Ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログ上のＩＧＳ５活性の阻害を試験するために使用
された化合物は、ＮＥＰおよびＥＣＥのようなエンドペプチダーゼを阻害する化
合物 ホスホアミドン、ＮＥＰを特異的に阻害する化合物 チオルファン、およ
び選択的ＥＣＥ阻害剤である化合物 ＣＧＳ−３５０６６である。
【０１５４】 例７ａ．材料 酵素：ＩＧＳ−５（ｓｏｌ ｈｕ）（ｈｉｓ）６；または：Ｈｉｓ６−ｔａｇ
ＩＧＳ５エクトドメイン；ストック溶液 ：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５％グリセロール、０．０
０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中で５３ｍｇ／ｍｌ、純度＞９
９％；４℃保存ワーキング溶液 ：アッセイバッファーで１０ｍｇ／ｍｌに希釈したストック溶液
基質： Ｍｃａ−Ａｓｐ−ＩＩｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄｐａ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ； 蛍光消光（Fluorescence-quenched）Ｂｉｇ−ＥＴ−１アナログ； Ｍｃａ＝（７−メトキシコウマリン(Methoxycoumarin)−４−イル）； Ｄｐａ＝（３−［２，４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオ
ニル；ストック溶液 ：アッセイバッファー中１００μＭ；−２０℃保存 （Polypeptide Laboratories, Wolfenbuettel, Germanyから市販されている） アッセイバッファー：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０、２５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ。
【０１５５】 すべての試験化合物は、１０ｍＭでＤＭＳＯ中に溶解され、さらにアッセイバ
ッファーで希釈された。
【０１５６】 例７b．アッセイ方法 アッセイバッファー ７０μｌ、酵素ワーキング溶液 １０μｌおよび試験化
合物溶液 １０μｌの量を、エッペンドルフチューブ中で混合し、３７℃で１５
分に亘ってプレインキュベートした。その後に、１０μｌの基質ストック溶液を
添加し、かつ、反応混合物を、３７℃で６０分に亘ってインキュベートし、酵素
的加水分解させた。引き続き、酵素反応を９５℃で５分間に亘って加熱すること
によって停止させた。遠心分離（Heraeus Biofuge B, 3分）の後に、上清をＨＰ
ＬＣ分析に用いた。
【０１５７】 例７ｃ．ＨＰＬＣ法 残留する基質を分断産物から分離するために、逆相ＨＰＬＣ技術を、ＣＣ１２
５／４ ヌクレオシル ３００／５ Ｃ１８ＲＰカラムおよびＣＣ８／４ヌクレ
オシル１００／５ Ｃ１８プレカラムで使用した（Macherey-Nagel, Dueren, Ge
rmanyから市販されている）。したがって、例７ｂで得られた反応試料 ６０μ
ｌを、ＨＰＬＣに導入し、かつ、カラムを１ｍｌ／分の流量で、以下の勾配およ
び溶液を適用することによって溶離させた： 溶液Ａ：１００％ Ｈ２Ｏ＋０．５Ｍ Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ＝２．０ 溶液Ｂ：１００％ アセトニトリル＋０．５Ｍ Ｈ３ＰＯ４ ０〜２分 ２０％ Ｂ ２〜６分 ２０〜６０％ Ｂ ６〜８分 ６０％ Ｂ ８〜１０分 ６０〜９０％ Ｂ １０〜１３分 ９０％ Ｂ １３〜１５分 ９０〜１００％ Ｂ ペプチドを、２１４ｎｍの吸光度および励起波長３２８ｎｍおよび放出波長３
９３ｎｍでの蛍光によって検出した。
【０１５８】 例７ｄ．算定 加水分解後に、消光されていないＭｃａ−蛍光体でのペプチドのＨＰＬＣピー
クの増加した蛍光シグナルは、任意の算定の基準とした。このシグナルを、イン
ヒビターを有するかまたは有しない試料と比較し、かつ、阻害の％をそれぞれの
ピーク領域に基づいて算定した。
【０１５９】 阻害％＝１００★（１−Ａ阻害／Ａコントロール） すべての試料は、二重反復で流し、平均値を使用した。
【０１６０】 標準的なインヒビター（１０ｎＭおよび１００ｎＭホスホアミドン）および溶
剤コントロール（０．１％）をそれぞれのアッセイランに添加した。
【０１６１】 例７ｅ．結果 本発明のＩＧＳ５ポリペプチドに関して、例７の結果は、前記ＩＧＳ５メタロ
プロテアーゼ ポリペプチドが、生体内において、従来技術から公知の種々のバ
ソアクティブペプチド、特に、たとえば、Ｂｉｇ ＥＴ−１、ＥＴ−１、ＡＮＰ
およびブラジキノンを加水分解することを示した。ＳＥＰの活性と比較しての加
水分解アッセイの結果は、第１０表に示した。前記結果から、ＩＧＳ５が特に、
前記生物学的活性ペプチドの代謝において含まれてもよいことを結論づけた。
【０１６２】
【表１０】
【０１６３】 さらに、ＥＣＥ−および／またはＮＥＰ−活性の阻害に関する引用化合物での
試験結果は、Ｂｉｇ−ＥＴ−１ アナログ１７ａａ Ｂｉｇ−ＥＴを変換する本
発明のＩＧＳ５メタロプロテアーゼポリペプチドの活性が、ホスホアミドン、Ｅ
ＣＥ／ＮＥＰ−阻害のための引用化合物によって阻害されるが、しかしながら、
ＩＧＳ５は、ＮＥＰ−インヒビター チオルファンによって効果的に阻害されな
い。前記結果は、第１１表に示されている。さらに、ＩＧＳ５ポリペプチドは、
作用の連続的な持続作用を有するエンドセリン変換酵素−１の有効な選択的非ペ
プチドインヒビターである、選択的ＥＣＥ−インヒビター ＣＧＳ−３５０６６
によって阻害されることはない（De Lombart et al., J. Med. Chem. 2000, Feb
. 10; 43(3): 488-504）。
【０１６４】
【表１１】
【０１６５】 図面の詳細な説明 図１ 部分的なＩＧＳ５コンセンサスｃＤＮＡ配列を製造するために単離され、
かつ十分にシークエンスされた、異なるｃＤＮＡの相対的位置を示す概略図。５
’−ＲＡＣＥおよびセミ−ホモロジーＰＣＲクローニングに使用されたＰＣＲプ
ライマーは、本明細書中に記載されている（それぞれのＩＰ＃によって示された
）。ＩＧＳ５ＣＯＮＳは、すべての得られた配列を組み合わせた後に得られたコ
ンセンサスコンティグを示す。６９１アミノ酸長のオープンリーディングフレー
ムは、ＩＧＳ５コンティグ中に存在し、この場合、これは、ＩＧＳ５酵素（ＩＧ
Ｓ５ＤＮＡ、ＩＧＳ５ＰＲＯＴ）のエクトドメインが、オープンボックス（“□
□”）で示されていることを含むと推測される。ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーメン
バーに対して相同性を有する、整列されたＥＳＴ配列（受託番号ＡＡ５２４２８
３、ＡＩ０８８８９３、ＡＩ２１７３６９およびＡＩ３８０８１１）の一部分を
、“＋＝＝＋”（IGS5EST）で示した。“ｂｐ”は塩基対である。
【０１６６】 図２ ＩＧＳ５ＤＮＡ１およびＩＧＳ５ＤＮＡ２ｃＤＮＡ配列を製造するために
単離され、かつ完全にシークエンスされた異なるｃＤＮＡクローンの相対的位置
を示す概略図。ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよびセミ−ホモロジーＰＣＲクローニ
ングに使用されたＰＣＲプライマーが示され、かつ、本明細書中に記載されてい
る（それぞれのＩＰ＃によって示された）。ＩＧＳ５ＣＯＮＳ１およびＩＧＳ５
ＣＯＮＳ２は、すべての得られた配列を組み合わせた後に得られた、２個の異な
るコンセンサスコンティグを示す。ＩＧＳ５ＤＮＡ１およびＩＧＳ５ＤＮＡ２は
、それぞれＩＧＳＣＯＮＳ１およびＩＧＳ５ＣＯＮＳ２（“★★”）中に存在す
るオープンリーディングフレームを示す。ＮＥＰ／ＥＣＥファミリーメンバーに
対して相同性を有する、整列されたＥＳＴ配列（受託番号ＡＡ５２４２８３、Ａ
Ｉ０８８８９３、ＡＩ２１７３６９およびＡＩ３８０８１１）の一部分を、“＋
＝＝＋”（IGS5EST）で示した。“ｂｐ”は塩基対である。ゲノミッククローン
ＩＧＳ５／Ｓ１の範囲内で同定された７８ｂｐのフラグメントを、“ＩＧＳ５／
Ｓ１／７８ｂｐ”として示した。クローンＹＣＥ２３１、ＹＣＥ２３３およびＹ
ＣＥ２３５の範囲内、およびＩＧＳ５ＣＯＮ２およびＩＧＳ５ＤＮＡ２の範囲内
の７８ｂｐの交互（alternate）エキソン配列の不在は、ｇａｐによって示され
ている。
【０１６７】 図３ ＩＧＳ５遺伝子のＲＮＡ ＭａｓｔｅｒＢｌｏｔＴＭ分析。
【０１６８】 図４ ＰＯＭＣシグナル配列、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、Ｈｉｓ６ ｔａｇおよ
びＩＧＳ５エクトドメイン配列の開始をコードする、１８０ｂｐフラグメントの
配列、この場合、これは、異なるオリゴヌクレオチド（★サイレント突然変異（
ｂｐ５７のｐｏｍｃシグナル配列））を用いて、オーバーラッピングＰＣＲによ
って構築された。
【０１６９】 図５ ベクター ｐＡｃＳＧ２ＳＯＬｈｕｌＧＳ５Ｈｉｓ６のプラスミドマップ
図６ 組換えバキュロウイルス ＩＧＢＶ７３（２６ＡＡ長ＰＯＭＣシグナル配
列の分断後）でのインフェクション上で、Ｓｆ６細胞中で発現した、可溶性組み
換え体成熟Ｈｉｓ−ｔａｇ ヒトＩＧＳ５の推測タンパク質配列。ポテンシャル
グリコシル化部位に下線を引いた。
【０１７０】 図７ 脱グリコシル化試験−ウエスタンブロット分析。３個の可溶性組み換えＨ
ｉｓ６ ＩＧＳ５クローンでインフェクションした７２ｈ ＣＭハーベスト（ク
ローン１：レーン１〜３、クローン２：レーン４〜６、クローン３：レーン７〜
９）は、Ｎ−グリコシダーゼＦの添加するかまたは添加なしで処理された。２０
μｌの非処理ＣＭをコントロールとして、１０μｌ ＣＭ等量をゲル上にロード
した。ａｎｔｉ―Ｈｉｓ抗体（２１Ｅ１Ｂ４ＥＰＲ３００、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、１μｇ／ｍｌ 最終濃度）で検出および実施した。第２抗体は、ラビッ
ト ａｎｔｉ マウス−アルカリホスファターゼ結合体（Ｓｉｇｍａ Ａ−１９
０２）であった。結合のレベル化はＮＢＴ―ＢＣＩＰでおこなった。Ｍｒマーカ
ーは、Ｂｉｏｌａｂｓ ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ＭＷマーカーである（ｃａｔ
番号 ７７０７Ｓ）。
【０１７１】 図８ 還元条件下（＋ＤＴＴ）で、レンチルクロマトグラフィー工程の１２．５
％ＰＨＡＳＴゲル（Pｈａｒｍａｃｉａ；4μｌ／スロット）上でのＳＤＳ ＰＡ
ＧＥ分析。タンパク質は銀染色によって可視化した。
【０１７２】 図９ 精製方法の異なる段階でのＩＧＳ５ウエスタンブロット分析。試料は、７
．５％ ミニゲル（Biorad MINI-Protean II）上で分離し、かつ、ａｎｔｉ Ｈ
ｉｓ６ 第１ ｍａｂ ２１Ｅ１Ｂ４を用いてウエスタンブロットによって分析
し、引き続いて、第２抗体としてのアルカリホスファターゼ結合ラビット ａｎ
ｔｉマウスＩｇに用い、かつ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰによって検出した。
【０１７３】 ＋ＤＴＴ、−ＤＴＴ ：タンパク質をＤＴＴで還元したかまたは還元しなかった
もの。
【０１７４】 図１０ レンチルクロマトグラフィー溶離液からのプール１のＺｎ−ＩＭＡＣの
異なるイミダゾール溶離プールの１２．５％ ＰＨＡＳＴゲル（Pharmacia, 4μ
ｌ スロット）上での、還元条件下（＋ＤＴＴ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。タ
ンパク質は、銀染色によって可視化された。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 部分的なＩＧＳ５コンセンサスｃＤＮＡ配列を製造するために単離され、かつ
十分にシークエンスされた、異なるｃＤＮＡの相対的位置を示す概略図。
【図２】 ＩＧＳ５ＤＮＡ１およびＩＧＳ５ＤＮＡ２ｃＤＮＡ配列を製造するために単離
され、かつ完全にシークエンスされた異なるｃＤＮＡクローンの相対的位置を示
す概略図。
【図３】 ＩＧＳ５遺伝子のＲＮＡ ＭａｓｔｅｒＢｌｏｔＴＭ分析を示す図。
【図４】 ＰＯＭＣシグナル配列、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、Ｈｉｓ６ ｔａｇおよびＩ
ＧＳ５エクトドメイン配列の開始をコードする、１８０ｂｐフラグメントの配列
を示す図。
【図５】 ベクター ｐＡｃＳＧ２ＳＯＬｈｕｌＧＳ５Ｈｉｓ６のプラスミドマップを示
す図。
【図６】 組換えバキュロウイルス ＩＧＢＶ７３（２６ＡＡ長ＰＯＭＣシグナル配列の
分断後）でのインフェクション上で、Ｓｆ６細胞中で発現した、可溶性組み換え
体成熟Ｈｉｓ−ｔａｇ ヒトＩＧＳ５の推測タンパク質配列を示す図。
【図７】 脱グリコシル化試験−ウエスタンブロット分析を示す図。
【図８】 還元条件下（＋ＤＴＴ）で、レンチルクロマトグラフィー工程の１２．５％Ｐ
ＨＡＳＴゲル（Pｈａｒｍａｃｉａ；4μｌ／スロット）上でのＳＤＳ ＰＡＧＥ
分析を示す図。
【図９】 精製方法の異なる段階でのＩＧＳ５ウエスタンブロット分析を示す図。
【図１０】 レンチルクロマトグラフィー溶離液からのプール１のＺｎ−ＩＭＡＣの異なる
イミダゾール溶離プールの１２．５％ ＰＨＡＳＴゲル（Pharmacia, 4μｌ ス
ロット）上での、還元条件下（＋ＤＴＴ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年１月１０日（２００２．１．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/08 Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｃ０８４ 1/12 3/10 ４Ｈ０４５ 3/04 7/02 3/10 7/10 7/02 9/04 7/10 9/06 9/04 9/10 9/06 １０１ 9/10 １０３ １０１ 9/12 １０３ 11/06 9/12 13/08 11/06 13/12 13/08 19/02 13/12 19/10 19/02 25/00 19/10 25/04 25/00 25/06 25/04 25/08 25/06 25/14 25/08 25/16 25/14 25/18 25/16 25/20 25/18 25/22 25/20 25/24 25/22 25/28 25/24 25/30 25/28 25/36 25/30 29/00 25/36 31/04 29/00 31/10 31/04 31/12 31/10 31/18 31/12 33/02 31/18 35/00 33/02 37/00 35/00 37/08 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/64 ＺＮＡＺ 1/21 9/99 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/64 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ 9/99 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/54 (31)優先権主張番号 ００２０１９３７．０ (32)優先日 平成12年５月31日(2000．5．31) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 １０１５３５６ (32)優先日 平成12年５月31日(2000．5．31) (33)優先権主張国 オランダ（ＮＬ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヴィリー デレールスニィダー オランダ国 シーピー ウェースプ シー ／オー シー ジェイ ファン ハウテン ラアン 36 (72)発明者 リコ ヴィーガース オランダ国 シーピー ウェースプ シー ／オー シー ジェイ ファン ハウテン ラアン 36 (72)発明者 ミヒャエル ヴェスケ オランダ国 シーピー ウェースプ シー ／オー シー ジェイ ファン ハウテン ラアン 36 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB01 BB10 BB20 BB24 CB01 DA13 FB02 FB03 FB05 FB06 4B024 AA01 BA14 CA04 DA02 DA05 DA06 DA11 EA02 EA04 4B050 CC01 CC03 DD11 EE10 FF09E LL01 4B063 QA05 QA07 QA18 QQ08 QQ13 QQ95 QR16 4B065 AA26X AA57X AA90X AB01 CA33 CA44 4C084 AA01 AA13 AA16 DC02 DC09 NA14 ZA02 ZA05 ZA08 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA22 ZA24 ZA36 ZA40 ZA42 ZA45 ZA54 ZA59 ZA66 ZA68 ZA70 ZA71 ZA73 ZA81 ZA83 ZA96 ZA97 ZB07 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35 ZB38 ZC35 ZC39 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA09 BA54 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 それぞれ配列番号２、配列番号４または配列番号６の配列の
    全長上を通して、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択された
    アミノ酸配列の一つに対して少なくとも７０％の同一性を含有する、アミノ酸配
    列を有する単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 それぞれ配列番号２、配列番号４または配列番号６の全長を
    通して、配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されたアミノ酸配列
    の一つと、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する、請求項
    １に記載の単離されたポリペプチド。
  3. 【請求項３】 配列番号２、配列番号４および配列番号６から選択されたア
    ミノ酸配列の一つを含有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  4. 【請求項４】 配列番号２、配列番号４または配列番号６の一つの単離され
    たポリペプチドまたはこれらのフラグメント。
  5. 【請求項５】 メタロプロテアーゼか、または構造的または機能的関連酵素
    の特異的活性の一つを示す、請求項１から４までのいずれか１項に記載の任意の
    単離されたポリペプチドの単離されたフラグメント。
  6. 【請求項６】 ヒトポリペプチドまたはヒトポリペプチドフラグメントであ
    る、請求項１から４までのいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたは
    請求項５に記載のポリペプチドフラグメント。
  7. 【請求項７】 それぞれ配列番号２、配列番号４または配列番号６の全長を
    通して、配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選択されたアミノ酸
    配列の一つと、少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌ
    クレオチド配列であるか、あるいは、前記の単離されたポリヌクレオチドに対し
    て相補的なヌクレオチド配列を含有する、単離されたポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 全コーディング領域上で、配列番号２、配列番号４および配
    列番号６の群から選択されたポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に
    対して、少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチドを含有するかまたは前
    記の単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含有する、単離
    されたポリヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 それぞれ配列番号１、配列番号３または配列番号５の全長を
    通して、配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から選択された一つに対
    して、少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含有するかまたは
    前記の単離されたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列を含有する、単
    離されたポリヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 少なくとも９５％の同一性である、請求項７から９までの
    いずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 ａ）配列番号２、配列番号４および配列番号６の群から選
    択されたポリヌクレオチドの一つをコードするヌクレオチド配列を含有するポリ
    ヌクレオチド； ｂ）配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から選択されたポリヌクレオ
    チド、および ｃ）配列番号１、配列番号３および配列番号５の群から選択された配列を含有す
    る標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
    件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得ることが可能
    なポリヌクレオチドまたはこれらのフラグメント； の群から選択された単離されたポリヌクレオチドであるか、あるいはこの単離さ
    れたポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列。
  12. 【請求項１２】 請求項５に記載のポリペプチドをコードする単離されたポ
    リヌクレオチドフラグメントであるか、あるいはこの単離されたポリヌクレオチ
    ドフラグメントと相補的なヌクレオチド配列。
  13. 【請求項１３】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項７から１２のいずれか
    １項に記載のポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 ヒトポリヌクレオチドである、請求項７から１３までのい
    ずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 発現系が、適合可能なホスト細胞中に存在する、請求項１
    から６までのいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する能力を有するポリヌ
    クレオチドを含有する発現系。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の発現系を含有するホスト細胞であるか
    、あるいは請求項１から６までのいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する
    前記の膜。
  17. 【請求項１７】 ポリペプチドを製造するのに十分な条件下で、請求項１６
    に記載のホスト細胞を培養し、かつ、培地からポリペプチドを回収する、請求項
    １から６までのいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチド
    、請求項５に記載のポリペプチドフラグメントまたは請求項６に記載のポリペプ
    チドに対して免疫特異的な抗体。
  19. 【請求項１９】 請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチド
    、または請求項５に記載のポリペプチド、または請求項６に記載のポリペプチド
    の活性に作用する化合物を同定するためのスクリーニング方法において、 （ａ）請求項１から６までのいずれか１項に記載のポリペプチドを有する請求項
    １６に記載の細胞または膜、または請求項１から４までのいずれか１項に記載の
    ポリペプチド、請求項５に記載のこれらのフラグメントまたは請求項６に記載の
    ポリペプチドと対象となる化合物とを接触させ；かつ、 （ｂ）前記の対象となる化合物が、前記ポリペプチドの活性を刺激または抑制す
    る結果を生じるかどうか評価することを含む、 請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項５に記
    載のポリペプチドフラグメント、または請求項６に記載のポリペプチドの活性に
    作用する化合物を同定するためのスクリーニング方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチド
    、または請求項５に記載のポリペプチドフラグメント、または請求項６に記載の
    ポリペプチドの機能を刺激または抑制する化合物を同定するためのスクリーニン
    グ方法において、 （ａ）ポリペプチドの活性上かまたはポリペプチドを有する細胞または膜上での
    対象化合物かまたはこれらの融合タンパク質の影響を、前記ポリペプチドのため
    に適した基質の存在下で測定し、 （ｂ）ポリペプチドの活性上かまたはポリペプチドを有する細胞または細胞膜上
    での対象化合物、またはこれらの融合タンパク質の影響を、前記ポリペプチドの
    競合物質の存在下で測定し、 （ｃ）対象化合物が、ポリペプチドの活性化または抑制によるシグナルを生じる
    かどうか、ポリペプチドの活性またはポリペプチドを有する細胞または膜に対し
    て適切な検出系を用いて試験し、 （ｄ）対象化合物と、請求項１に記載のポリペプチドおよび適した基質を含有す
    る溶液とを混合し、混合物を形成し、混合物中のポリペプチドの活性を測定し、
    かつ、混合物の活性と対象化合物を含まないスタンダードとの活性を比較するか
    、あるいは、 （ｅ）前記ポリペプチドおよび細胞中の前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
    の生成上で、たとえばＥＬＩＳＡアッセイを用いて、対象化合物の効果を検出す
    ることから成る群から選択された方法を含む、請求項１から４までのいずれか１
    項に記載のポリペプチド、または請求項５に記載のポリペプチドフラグメント、
    または請求項６に記載のポリペプチドの機能を刺激または抑制する化合物を同定
    するためのスクリーニング方法。
  21. 【請求項２１】 スクリーニングが、心臓血管障害の治療および／または予
    防に適した化合物を同定するのに役立つ、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法によって
    同定された、請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項
    ５に記載のポリペプチドフラグメント、または請求項６に記載のポリペプチドに
    対する刺激物質またはインヒビター。
  23. 【請求項２３】 （ａ）請求項１９から２１までのいずれか１項に記載の方
    法によって同定された、請求項１から４までのいずれか１項に記載のポリペプチ
    ドに対する刺激物質またはインヒビター、 （ｂ）請求項１９から２１までのいずれか１項に記載の方法によって同定された
    、請求項５または６に記載のポリペプチドに対する刺激物質またはインヒビター
    、 （ｃ）請求項７から１４までのいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチ
    ド、または （ｄ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を変
    化させる核酸分子、 から成る群から選択された、療法に使用するための化合物。
  24. 【請求項２４】 対象物中で請求項１に記載のポリペプチドの発現または活
    性に関連して、対象物における疾病または疾病に対する感受性を診断するための
    方法において、 （ａ）前記対象物のゲノム中で、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列中の突然変異が存在するかどうかを測定し、および／または （ｂ）前記対象物から誘導された試料中の前記ポリペプチド発現の存在または量
    を分析することを含む、対象物中で請求項１に記載のポリペプチドの発現または
    活性に関連して、対象物における疾病または疾病に対する感受性を診断するため
    の方法。
  25. 【請求項２５】 増大したＩＧＳ５活性を必要とする対象物の治療のための
    方法において、 （ａ）前記ＩＧＳ５に対する刺激物質の治療的有効量を対象物に投与し、および
    ／または （ｂ）生体内における前記ＩＧＳ５活性を効果的に生じるような形で、ＩＧＳ５
    を対象物に供給することを含む、増強されたＩＧＳ５活性を必要とする対象物を
    治療するための方法。
  26. 【請求項２６】 減少したＩＧＳ５活性を必要とする対象物を治療するため
    の方法において、 （ａ）前記ＩＧＳ５に対するインヒビターの治療的有効量を対象物に投与し、こ
    の場合、インヒビターは、請求項１９から２１までのいずれか１項に記載の任意
    の方法によって同定されており、および／または、 （ｂ）前記ＩＧＳ５をコードするヌクレオチド配列の発現を抑制する核酸分子を
    対象物に投与し、および／または （ｃ）その物質自体に対して、前記ＩＧＳ５と競合するポリペプチドの治療的有
    効量を対象物に投与し、および／または （ｄ）前記ＩＧＳ５を変性させるポリペプチドの治療的有効量を対象物に投与し
    、および／または （ｅ）前記ＩＧＳ５を変性させるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
    発現を増強させる核酸分子を、対象物に投与することを含む、減少したＩＧＳ５
    を必要とする対象物を治療するための方法。
  27. 【請求項２７】 心臓血管障害の治療および／または予防のために、請求項
    ２２に記載の刺激物質またはインヒビター、または療法に使用するための請求項
    ２３に記載の化合物。
  28. 【請求項２８】 疾病または増強されたかまたは減少されたＩＧＳ５活性が
    、心臓血管障害と関連する、請求項２４に記載の診断方法、または請求項２５ま
    たは２６に記載の治療方法。
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