CN1496254A - 男性性功能障碍的治疗 - Google Patents

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Abstract

神经肽Y(NPY)、优选NPY Y1受体的抑制剂在药剂制备/制造中的用途，该抑制剂对与男性生殖器有关的NPY或NPY Y1受体是有选择性的，该药剂用于男性勃起功能障碍(MED)的治疗或预防。

Description

男性性功能障碍的治疗
发明领域
本发明涉及化合物和药物，它们可用于治疗和/或预防男性性功能障碍(MSD)、具体为男性勃起功能障碍(MED)。
本发明还涉及预防和/或治疗MSD、具体为MED的方法。
本发明还涉及筛选可用于治疗MSD、具体为MED的化合物的测定法。
为方便起见，在权利要求书部分之前列出在下文中用到的缩写。
发明背景
性功能障碍(SD)是既能影响男性也能影响女性的突出的临床问题。SD的原因既可以是器质性的也可以是心理上的。器质性SD通常由基础性血管疾病所致，例如与高血压或糖尿病有关的那些，以及处方药物治疗和/或精神病学疾病，例如抑郁。心理学因素包括恐惧、行为焦虑和人际矛盾。SD削弱性行为，降低自尊心，破坏人际关系，由此诱发人的苦恼。在临床中，SD症已被分为女性性功能障碍(FSD)症和男性性功能障碍(MSD)症(Melman等1999)。最好的FSD定义是妇女对性表现很难或者不能满意。男性性功能障碍(MSD)一般与勃起功能障碍有关，也已知为男性勃起功能障碍(MED)(Benet等1994)。
男性勃起功能障碍(MED)也已知为男性勃起障碍，其定义为：“不能实现和/或维持令人满意的性行为所需的阴茎勃起(NIH ConsensusDevelopment Panel on Impotence，1993)”。
据估计，各种程度勃起功能障碍(ED)(轻微、中度与完全阳痿)的普遍性在40至70岁男性中为52％，在70岁以上的人群中比例更高(Melman等1999)。该疾病对个人及其伴侣的生活质量具有显著的消极影响，经常导致焦虑和紧张增加，引起抑郁和自尊心降低。过去二十年来，MED主要被视为一种心理学障碍(Benet等1994)，不过现在已知对大多数个人而言，存在基础性器质性原因。其结果是，在确定正常阴茎勃起的机理和MED的病理生理学中已经取得了重大进展。
阴茎勃起是一种血液动力学事件，它依赖于海绵体平滑肌和阴茎脉管系统的收缩与弛张平衡(Lerner等1993)。海绵体平滑肌在本文中也称为体平滑肌，或者在多数情形中称为海绵体。海绵体平滑肌的松弛引起流入海绵体小梁空间的血液增加，导致它们向周围的被膜扩张，压缩引流静脉。这引起血压的急剧升高，导致勃起(Naylor，1998)。
在勃起过程期间发生的变化是复杂的，需要高度的协调控制，牵涉外周与中枢神经系统和内分泌系统(Naylor，1998)。体平滑肌收缩受到交感神经去甲肾上腺素能神经支配经由突触后α1肾上腺受体活化的调节。MED可能与海绵体的内源性平滑肌步调增加有关。不过，体平滑肌松弛的过程在部分程度上是由非肾上腺素能、非胆碱能(NANC)神经传递的介导。除了NO以外，在阴茎中还发现大量其他NANC神经递质，例如降钙素基因相关性肽(CGRP)和血管作用性肠肽(VIP)。负责介导这种松弛作用的主要松弛因子是一氧化氮(NO)，它是从L-精氨酸被一氧化氮合成酶(NOS)合成的(Taub等1993；Chuang等1998)。据认为，降低体平滑肌步调可能有助于NO诱导海绵体的松弛。在男性的性欲激发期间，NO是从神经元和内皮释放的，结合并激活位于平滑肌细胞和内皮中的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，引起细胞内环鸟苷3’，5’-一磷酸盐(cGMP)水平的升高。这种cGMP上升引起海绵体因细胞内钙浓度([Ca2+]i)减少而松弛，机理是未知的，不过据认为牵涉蛋白激酶G活化作用(可能由于Ca2+泵和Ca2+激活的K+通道的活化作用；Chuang等，1998)。
枸橼酸西地那非(也已知为万艾可TM)最近已经被辉瑞开发作为第一种MED口服治疗药。西地那非通过选择性抑制磷酸二酯酶5(PDE5)，抑制海绵体中的cGMP分解，由此抑制cGMP水解为5’GMP(Boolel等，1996；Jeremy等，1997)，由此增加细胞内cGMP浓度，促进海绵体平滑肌松弛。
最近，所有其他在市场上可得到的MED疗法、例如用前列腺素类化合物、即前列地尔治疗——它可以被尿道内给药(可从VivUs Inc.得到的MuseTM)或经由小针剂注射给药(可从Pharmacia & Upjohn得到的CaverjectTM)——都是不方便的和/或侵入性的。其他治疗包括真空收缩装置、血管作用性药物注射或阴茎假体植入(Montague等，1996)。尽管可注射的血管作用性药物显示很高的功效，副作用仍然是常见的，例如阴茎疼痛、纤维变性和阴茎异常勃起，并且注射疗法不如口服疗法方便，因此西地那非目前代表市场上最优选的疗法。
因而，需要发现新的治疗男性性功能障碍、具体为MED的途径。
发明概述
本发明的精髓发现是利用神经肽Y抑制剂(NPYi)、优选NPY Y1受体抑制剂(NPY Y1i)选择性治疗患有性功能障碍、具体为MED的男性的能力，而没有外周副作用。惊人的是，申请人还已经发现用神经肽Y抑制剂——以下称为NPYi——抑制NPY、优选NPY Y1会显著增强神经刺激的勃起过程。术语I：NPY与NPYi和I：NPY Y1与NPY Y1i在下面可互换使用。
本文所用的术语“没有外周副作用”意味着NPYi、优选NPY Y1i缺乏——或者基本上缺乏——任何对心血管系统的活性。因而，当NPYi、优选NPY Y1i被全身给药(即口服)时，NPYi、优选NPY Y1i对心血管系统是无活性的，从而减少或消除心血管事件的可能性，例如血压下降。外周副作用是由除生殖器和/或中枢神经系统以外的NPY或NPY Y1受体的抑制所导致的。按照本发明，NPYi、优选NPY Y1i除了作用于生殖器中的NPY、优选NPY Y1受体以外，还可以中枢性作用于中枢神经系统，例如有效治疗异常的饮食摄取障碍，例如肥胖、食欲缺乏、食欲过盛和代谢障碍。不过，按照本发明，NPYi、优选NPY Y1i在使用时优选地没有或者基本上没有外周活性，也就是对心血管系统和/或胃肠系统的活性，在生殖器方面除外。从而存在对生殖器的全身选择性，尽管也可能存在一定的对中枢神经系统的活性。
按照本发明，提供了神经肽Y(NPY)抑制剂、优选NPY Y1受体抑制剂的用途，它在使用时对与男性生殖器有关的NPY或NPY Y1受体是选择性的或高度选择性的，用于治疗男性性功能障碍、具体为MED。
按照本发明，提供了神经肽Y(NPY)抑制剂、优选NPY Y1受体抑制剂的用途，它在使用时对与男性生殖器有关的NPY或NPY Y1受体是选择性的或高度选择性的，用于增强神经刺激的勃起过程。
优选地，根据本发明的用于治疗男性性功能障碍、具体为MED的NPY/NPY Y1抑制剂的IC50小于100纳摩尔(nM)，优选小于75nM，更优选小于50nM。
本文所用的术语“选择性”意味着根据本发明的NPY抑制剂对男性生殖器、优选海绵体中的NPY、具体为NPY Y1受体具有大于约100倍、更优选大于约300倍于NPY Y2或NPY Y5受体的选择性。优选地，NPYi或NPY Y1i对内肽酶NEP EC 3.4.24.11和/或血管紧张素转化酶(ACE)没有或者基本上没有活性。优选地，根据本发明的NPY或NPY Y1抑制剂对内皮素转化酶(ECE)没有活性。适当地，根据本发明的NPY或NPY Y1抑制剂对NPY/NPY Y1具有大于300倍、更优选大于500倍、更优选大于1000倍于NEP和/或ACE的选择性。优选地，NPYi还具有大于1000倍于ECE的选择性。当NPYi或NPY Y1i被全身给药(例如口服)时，这减少了心血管事件(例如血压下降)的可能性。术语“选择性”应当被如此解释。
本文所用的术语“高度选择性”意味着根据本发明的NPY/NPY Y1抑制剂对男性生殖器(具体为海绵体)中的NPY、具体为NPY Y1受体具有大于约400倍于NPY Y2或NPY Y5受体的选择性，优选至少约500倍的选择性，优选至少约600倍的选择性，优选至少约700倍的选择性，优选至少约800倍的活性，优选至少约900倍的活性，优选至少约1000倍的选择性。优选地，NPYi或NPY Y1i对NEP和/或ACE和/或ECE没有或者基本上没有活性。术语“高度选择性”应当被如此解释。
优选地，根据本发明的用于治疗男性性功能障碍、具体为MED的NPY抑制剂、优选NPY Y1抑制剂在使用时对生殖道是高度选择性的。因而，NPY抑制剂、优选NPY Y1i的使用导致对生殖器的局限性活性，和/或对心血管系统没有或者基本上没有活性。当NPYi、优选NPY Y1i被全身给药(例如口服)时，这减少了心血管事件(例如血压下降)的可能性。
进一步提供了NPYi、优选NPY Y1i在药剂制造中的用途，该药剂用于选择性治疗和/或选择性预防MED。
进一步提供了NPYi、优选NPY Y1i在药剂制备中的用途，该药剂用于选择性治疗和/或预防MED。这里，NPYi或NPY Y1i例如可以用于根据本发明的药物的制造步骤和/或鉴定制备步骤和/或修饰制备步骤。
已报道的NPY在阴茎中的功能是其在静脉闭塞机理中的作用，这发生在阴茎水平上，以维持勃起。也就是说，已经报道NPY充当血管收缩剂，导致阴茎静脉的限制，具体为调节血液从阴茎回流的静脉。因而，在勃起期间，NPY被认为通过导致阴茎静脉的收缩有助于勃起的维持，因此防止或者减少血液从阴茎海绵体回流。按照本发明之前的教导，NPY的抑制将被预期导致调节血液从海绵体回流的阴茎静脉的舒张，因而，NPYi或NPY Y1i的给药将被预期导致阴茎的退肿。换句话说，在本发明之前，NPY的抑制将被预期保持阴茎的疲软状态。
不过，申请人已经惊人地发现，NPY抑制剂的使用、具体为NPY Y1受体拮抗剂的使用导致阴茎海绵体内压力的增加，从而促进和/或导致阴茎勃起。由NPYi、优选NPY Y1i的使用所导致的海绵体内压力的增加优选地发生在性刺激期间。
进一步提供了一种抑制剂，它在使用时对与性响应有关的——优选在生殖器中的——NPY、优选NPY Y1受体是高度选择性的。
本发明进一步提供NPYi、优选NPY Y1i，它在使用时对海绵体中与海绵体内压力增加有关的NPY受体、优选NPY Y1受体是高度选择性的。
本发明进一步提供NPYi、优选NPY Y1i在药剂制造中的用途，该药剂用于选择性增加性欲激发期间的海绵体内(i.c.)压力。NPYi、优选NPY Y1i有利地增强性欲激发介导的i.c.压力增加，适当地，本发明的NPY/NPY Y1抑制剂选择性增强性欲激发介导的i.c.压力增加。NPYi和/或NPY Y1i可以通过增加i.c.压力用于治疗MED，例如通过影响生殖器血流。
具体而言，本发明提供用于选择性治疗和/或选择性预防MED的NPYi、优选NPY Y1i化合物。
除了使用NPY Y1受体抑制剂以外，或者作为替代选择，还可以使用NPY Y2受体抑制剂。本文所用的术语NPYi包括NPY Y2抑制剂。
本发明是有利的，因为它提供恢复正常性欲激发响应的手段，也就是增加阴茎血流，引起阴茎勃起。因此，本发明提供恢复或者加强正常性欲激发响应的手段。
作为药物试验了一些NPYi、具体为NPY Y1i化合物，发现可用于增强内源性勃起过程，由此可用于治疗MED。关于NPYi、具体为NPY Y1i的一些实验数据列在实验部分(在下)中。
不限于任何具体理论的是，本文提出通过抑制NPY、具体为NPY Y1，海绵体内部与周围的腺苷酸环化酶水平得以直接或间接提高。这可以最终增加海绵体内部与周围的cAMP水平。增加了的腺苷酸环化酶和/或cAMP水平介导海绵体的血管舒张，流入海绵体的生殖器血液得以提高。
详细说明
一方面，本发明涉及NPYi、优选NPY Y1i化合物和包含NPYi、优选NPY Y1i的药物组合物，和由NPYi、优选NPY Y1i与PDEi、优选PDE5i组成的药物组合，用于(或者在使用时)选择性治疗和/或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED。在药物组合物中，NPYi或NPY Y1i(和PDEi或PDE5i，如果有的话)是可选地与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的。这里，组合物(象本文提到的任意其他组合物一样)可以被包装起来，随后用于治疗男性性功能障碍、具体为MED。
另一方面，本发明涉及NPYi、优选NPY Y1i在药剂(例如药物组合物)制造中的用途，该药剂用于选择性或高度选择性治疗男性性功能障碍、具体为MED。
另一方面，本发明涉及NPYi、优选NPY Y1i在药剂(例如药物组合物)制备中的用途，该药剂用于选择性或高度选择性治疗男性性功能障碍、具体为MED。
另一方面，本发明涉及包含NPYi、优选NPY Y1i的药物，该抑制剂在使用时对生殖器中的NPY、优选NPY Y1受体是选择性的。
另一方面，本发明涉及选择性或高度选择性治疗或预防人或动物MED的方法，该方法包含对个体给以有效量的NPYi、优选NPY Y1i，其中该NPYi、优选NPY Y1i是可选地与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的。
另一方面，本发明涉及治疗患有男性性功能障碍具体为MED的男性的方法，该方法包含对该男性给以NPYi、优选NPY Y1i，它能够选择性增加性欲激发期间的海绵体内压力，没有外周副作用。
进一步提供了包含一个或多个格间的药包，其中至少一个格间包含一种或多种NPYi、优选NPY Y1i。
本发明进一步提供根据本发明的药物组合物的制备方法，所述方法包含将一种或多种NPYi、优选NPY Y1i与药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体混合。
本发明进一步提供根据本发明的NPYi、优选NPY Y1i在药剂制造或制备中的用途，该药剂既用于选择性治疗和/或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED，又用于治疗和/或预防异常的饮食摄取障碍，具体为肥胖、食欲缺乏、食欲过盛和代谢障碍。
另一方面，本发明涉及用于鉴定药物(以下称为NPYi或NPY Y1i)的测定方法，该药物能够用于选择性治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED，该测定方法包含：测定供试药物是否能够直接增强内源性勃起过程；其中所述增强作用被定义为在如本文所定义的供试药物的存在下对海绵体内(i.c.)压力(和/或海绵体血流)的加强作用；供试药物的这类加强作用提示了供试药物可以用于选择性治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED，其中所述供试药物是NPYi、优选NPY Y1i。优选地，该药物抑制与生殖器、具体为海绵体有关的NPY、优选NPY Y1受体。优选地，该药物对动脉血压没有或者基本上没有影响。
举例来说，本发明涉及用于鉴定药物的测定方法，该药物能够直接增强内源性勃起过程，目的是治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED，该测定方法包含：接触供试药物，该药物具有能够抑制肽(优选荧光标记的肽)代谢分解的部分，所述肽在正常情况下被NPY或NPY Y1代谢；测量一定时间后剩余的肽的活性和/或水平(例如经由荧光分析)；其中借助荧光测量的肽水平的变化表示供试药物的效力(IC50)，并且提示了供试药物可以用于治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及包含下列步骤的方法：
(a)进行根据本发明的测定方法；
(b)鉴定一种或多种能够抑制NPY、优选NPY Y1的药物；和
(c)制备一定量的一种或多种所鉴定的药物；
其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
关于这方面，可以修饰在步骤(b)中鉴定的药物，以便最大化活性，然后可以重复步骤(a)。可以重复这些步骤，直至达到所需的活性或药动学。
因而，另一方面，本发明涉及包含下列步骤的方法：
(a1)进行根据本发明的测定方法；
(b1)鉴定一种或多种能够直接增强内源性勃起过程的药物；
(b2)修饰一种或多种所述所鉴定的药物；
(a2)可选地重复步骤(a1)；和
(c)制备一定量的一种或多种所鉴定的药物(也就是已被鉴定的那些)；
其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及包含下列步骤的方法：
(i)进行根据本发明的测定方法；
(ii)鉴定一种或多种能够抑制NPY、优选NPY Y1的药物；
(iii)试验所鉴定的药物对试验动物、例如经过麻醉的兔的动脉血压的影响；
(iv)选择对动脉血压没有或者基本上没有影响的药物；和
(v)制备一定量的一种或多种所选择的药物；
其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
关于这方面，可以修饰在步骤(b)中鉴定的药物，以便最大化活性，然后可以重复步骤(a)。可以重复这些步骤，直至达到所需的活性或药动学。
另一方面，本发明涉及治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED的方法，该方法通过利用药物测量海绵体内压力或海绵体血流，体内加强神经刺激的内源性勃起过程(例如在兔中)；其中在体外测定方法中，该药物能够直接抑制荧光肽的代谢分解(如上所述)；其中该体外测定方法是根据本发明的测定方法；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及药物在药物组合物制备中的用途，该药物组合物用于选择性治疗或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED，其中当借助根据本发明的测定方法体外测定时，该药物能够直接抑制荧光肽的代谢分解；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及药物在药物组合物制造中的用途，该药物组合物用于选择性治疗或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED，其中当借助根据本发明的测定方法体外测定时，该药物能够直接抑制荧光肽的代谢分解；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及用于鉴定药物的动物模型，该药物能够治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED，所述模型包含经过麻醉的雄性动物，包括测量所述动物在其骨盆神经刺激后的海绵体内压力和/或海绵体血流变化的工具；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。该动物模型可以进一步包含测量所述动物动脉血压的工具。
另一方面，本发明涉及用于鉴定药物的测定方法，该药物能够直接增强内源性勃起过程，目的是选择性治疗或选择性预防MED，该测定方法包含：将药物对本发明的动物模型给药；测量内源性勃起过程的变化；其中所述变化被定义为在如上所定义的供试药物的存在下动物模型海绵体内压力(和/或海绵体血流)的加强作用；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及用于鉴定药物的测定方法，该药物能够直接增强内源性勃起过程而对动脉血压没有影响，目的是选择性治疗或选择性预防MED，该测定方法包含：将药物对本发明的动物模型给药；测量内源性勃起过程的变化；其中所述变化被定义为在如上所定义的供试药物的存在下动物模型海绵体内压力(和/或海绵体血流)的加强作用；测量动物模型的动脉血压，以确保血压没有或者基本上没有变化；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及诊断方法，该方法包含从男性分离样本；测定样本是否含有这样一种实体，其含量是否足以导致男性性功能障碍、优选MED；其中该实体对男性海绵体的内源性勃起过程具有直接影响；其中利用药物可以调节所述实体，以达到有益效果；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
另一方面，本发明涉及诊断组合物或试剂盒，包含用于检测所分离的男性样本中一种实体的工具；其中该工具能够用于测定样本是含有导致男性性功能障碍、优选MED的量的该实体还是其含量足以导致男性性功能障碍、优选MED；其中该实体对内源性勃起过程具有直接影响；其中可以利用药物调节所述实体，以达到有益效果；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
申请人还已惊人地发现用NPYi、具体为NPY Y1i抑制NPY、具体为NPY Y1，显著加强PDE抑制剂、具体为PDE5抑制剂介导的勃起过程增强作用。
由于NPY和NPY Y1受体存在于体内各处，非常意外的是NPYi和/或NPY Y1i能够被全身给药，在男性生殖器中引起治疗响应，而不会诱导无法忍受的(不利的)副作用，具体为无法忍受的(不利的)外周副作用。因而在下面的体内(例如兔)结果中，单独的NPY Y1i(具体具有如上的选择性)和NPYi/PDE5组合在被全身给药时增加性欲激发(用骨盆神经刺激模拟)后的生殖器血流，而不会不利地影响心血管参数，例如导致显著的低血压或高血压后果。
因而按照本发明的另一方面，提供了被全身给药(优选口服，例如可吞咽的片剂或胶囊剂、舌下或颊用制剂)的NPYi、优选NPY Y1i在药剂制备中的用途，该药剂用于选择性治疗或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED。
因而按照本发明的另一实施方式，提供了包含一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s和一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s的组合在药剂制造/制备中的用途，该药剂用于选择性治疗或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED。
因而按照本发明的另一实施方式，提供了包含一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s和一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s的组合在药剂制造/制备中的用途，该药剂用于治疗或预防男性性功能障碍、具体为MED。优选地，只有NPYi’s、具体为NPY Y1i’s和PDEi’s、具体为PDE5i’s是被一起使用的。
优选地，所述联合治疗包含一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s与一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s的组合。更优选地，这样一种组合提供一种或多种NPYi’s、具体为NPY Y1i’s与一种或多种PDEi’s、具体为PDE5i’s的相伴给药，用于治疗MED。
在另一实施方式中，本发明提供药物组合物的用途，该组合物包含一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s与一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s，(在没有其他活性组分/成分的存在下，例如其他抑制剂，例如中性内肽酶(NEP)抑制剂，例如)用于治疗或预防MED。优选地，药物组合物仅由一种或多种NPYi’s、具体为NPY Y1i’s与一种或多种PDEi’s、具体为PDE5i’s组成作为活性组分/成分，用于治疗MED。
在另一实施方式中，本发明提供药物组合物的用途，该组合物包含一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s、一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s、和如下公开的另外一种辅助性活性药物。
按照另一实施方式，本发明提供药物组合物，由一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s和一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s组成，可选地是与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的。
我们的结果显示，这种组合惊人地能够被全身给药(优选口服，例如可吞咽的片剂或胶囊剂、舌下或颊用制剂)，血压下降最小，从而利用该组合使男性性功能障碍的全身治疗成为可行。
尤其优选用在根据本发明的用于选择性治疗或预防MED的药物组合物中的是强效的选择性NPYi’s、优选NPY Y1i’s与强效的选择性PDEi、优选PDE5i的组合。
因而按照本发明的另一实施方式，提供了药物组合物的用途，该组合物由一种或多种NPYi’s、优选NPY Y1i’s和一种或多种PDEi’s、优选PDE5i’s组成，用于选择性治疗MED。
在优选的实施方式中，本文所述NPYi、优选NPY Y1i和PDEi、优选PDE5i的联合给药是相伴的。如本文所定义的相伴给药涵盖PDEi(具体为PDE5i)和NPYi(具体为NPY Y1i)的同时(独立)给药、同时联合给药、独立给药、联合给药、连续给药和配伍联合给药。
正如上面所详述的，本发明进一步提出，与可用单独的PDE、具体为PDE5获得的MED疗法相比，PDEi(具体为PDE5i)和NPYi(具体为NPY Y1i)的相伴给药能够实现功效的增加。
按照本发明的另一方面，本文提出了NPYi、优选NPY Y1i和PDEi、优选PDE5i的相伴给药能够提供比单独的PDEi或PDE5i更快的起效。换句话说，本发明另外提供速效组合物治疗MED的用途。如本文所定义的速效MED组合物意味着在组合物(由NPYi、优选NPY Y1i和PDEi、优选PDE5i组成)的i.v.给药之后，减少了达到对海绵体内压力最大效果的时间，相对等剂量单独的PDEi或PDE5i所得相当的时间而言。
因而，本发明的另一方面提供速效药物组合物，它包含NPYi、优选NPY Y1i和PDEi、优选PDE5i，用于选择性治疗MED。
本发明的另一方面提供速效药物组合物，它由NPYi、优选NPY Y1i和PDEi、优选PDE5i组成，用于选择性治疗MED。
本文进一步提出，NPY Y1i/PDE5i组合的使用可以增强PDE5i的功效，由此能够减少特定功效所需的PDE5抑制剂剂量。如本文所定义的包含NPY Y1i和减量的PDE5i的制剂意味着在与根据本发明的有效量NPY Y1i联合时，实现具体响应所需的既定PDE5i的量比单用PDE5i所需的量减少了。这类用于治疗MED的减剂量组合物减少潜在的PDE5与硝酸盐相互作用。进而，这对特定个体来说可能是可取的，例如患有轻微MED的男性。这可能特别有利于对单独的PDE5抑制剂(例如西地那非)响应差的个体。
还提供了适于口服给药的药物组合在药剂制备中的用途，该药剂用于选择性治疗男性性功能障碍，所述组合包含NPY或NPY Y1抑制剂，分别对NPY或NPY Y1具有小于100nM的IC50，对生殖器中的NPY或NPY Y1受体具有大于1000倍于血管紧张素转化酶的选择性，和磷酸二酯酶5型(PDE5)抑制剂，对PDE5具有小于100nM的IC50，对PDE5具有大于100倍于PDE3的选择性。
优选地，本文所用的PDE5i是西地那非，优选枸橼酸西地那非。
按照另一方面，本发明涉及本质上由NPYi、优选NPY Y1i组成作为唯一活性成分的组合物在药剂(例如药物组合物)制造中的用途，该药剂用于治疗男性性功能障碍、具体为MED。
按照另一方面，本发明涉及由NPYi、优选NPY Y1i组成作为唯一活性成分的组合物在药剂(例如药物组合物)制造中的用途，该药剂用于治疗男性性功能障碍、具体为MED。
本文所用的术语“活性成分”表示在治疗男性性功能障碍、具体为MED中有活性的成分。
为了方便引述，在适当的小节标题下面讨论本发明的这些和其他方面。不过，每小节下面的教导没有必要限于每个特定小节。
优选方面
根据本发明的用于选择性治疗或选择性预防MED的药物优选地是NPY抑制剂和/或NPY Y1抑制剂。
与体内其他外周位置、例如心血管系统和/或胃肠系统中的NPY和/或NPY Y1受体相比，根据本发明的用于选择性治疗或选择性预防MED的药物在使用时优选地对生殖器中的NPY和/或NPY Y1受体是高度选择性的。
根据本发明的用于选择性治疗或预防MED的药物除了在使用时对生殖器中的NPY和/或NPY Y1受体是高度选择性的以外，对中枢神经系统中的NPY和/或NPY Y1受体也有活性，因而可以用于治疗或预防MED和饮食摄取障碍。
在一种实施方式中，按照本发明使用的药物优选地是口服给药的。
在另一种实施方式中，按照本发明使用的药物可以是局部给药的或海绵体内给药的。
本发明还涵盖本发明药物在性欲激发/刺激之前和/或期间的给药。这是有利的，因为可以提供全身的选择性活性，以便NPYi或NPY Y1i对生殖器有活性，但是例如对心血管系统没有活性。这种选择性可能是生理学效果而非药理学效果。
因而，关于本发明的有些方面，非常可取的是存在性欲激发/刺激步骤。我们已经发现该步骤能够提供全身选择性。
这里，“性欲激发/刺激”可以是视觉激发/刺激、身体激发/刺激、听觉激发/刺激或思维激发/刺激的一种或多种。
因而，本发明的药物优选地是在性欲激发/刺激之前或期间给药的，特别是当这些药物被口服给药时。
因此，关于这个优选的方面，本发明提供药物在药剂制造中的用途，该药剂用于选择性治疗或选择性预防男性性功能障碍、具体为MED；其中所述药物能够抑制个体生殖器中的NPYi、优选NPY Y1i，没有外周副作用；其中所述个体是在所述药剂给药之前或期间被性欲激发/刺激的。
优选地，使所述个体口服该药剂。
另外，关于这个优选的方面，本发明提供治疗个体的方法；该方法包含对该个体给以药物，该药物能够抑制生殖器中的NPYi、优选NPYY1i，没有外周副作用；其中该药物为选择性治疗或选择性预防MED的量；其中该药物可选地是与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的；其中所述个体是在所述药物给药之前或期间被性欲激发/刺激的。
优选地，使所述个体口服所述药物。
惊人和意外的发现
本发明证明了下列惊人和意外的发现：
(a)NPY受体、具体为NPY Y1受体的抑制导致海绵体内压力增加，从而促进/导致阴茎勃起；
(b)抑制NPY或NPY Y1的药物可以用于增强勃起响应，可以帮助克服勃起功能障碍，例如MED，而没有外周副作用；
(c)NPYi、优选NPY Y1i的全身给药(例如口服)导致MED的选择性治疗，没有外周副作用，具体为没有任何不利的心血管事件，例如血压下降；
(d)NPYi、优选NPY Y1i的全身给药可以用于选择性治疗或选择性预防MED和饮食摄取障碍，因为除了外周作用于生殖器以外(尽管不是外周别处)，该药物还可以作用于中枢神经系统；
(e)用NPYi、具体为NPY Y1i抑制NPY、具体为NPY Y1，显著加强PDE抑制剂、具体为PDE5抑制剂介导的勃起过程增强作用。
优点
本发明是有利的，因为：
(i)抑制生殖器中的NPY、具体为NPY Y1受体的药物能够提供用于选择性预防和/或选择性治疗和/或选择性恢复正常性响应的手段，例如男性勃起响应，它们诱导海绵体内压力和/或流入海绵体的血液增加，没有不利的副作用的危险，例如不利的心血管事件。因此，本发明提供恢复或者模拟正常勃起响应的手段。
(ii)通过NPY、具体为NPY Y1的抑制与性欲激发的组合，海绵体内压力和/或流入海绵体的血液增加似乎是生殖器、包括海绵体所特有的，对其他外周系统、具体为心血管系统没有影响。这种选择性定向减少和/或消除与目前用于治疗MED的有些血管作用性药物有关的危险和副作用(例如血压降低)。
上文和下列评注讨论和阐明了其他优点。
患者组
患有轻微至中度MED的患者应当受益于NPYi或NPY Y1i治疗，严重MED患者也可能有响应。不过，早期调查揭示，轻微、中度与严重MED患者的响应率将因NPY或NPY Y1抑制剂/PDE5抑制剂组合而更高。轻微、中度与严重MED将是本领域技术人员熟知的术语，不过指导可以参见The Journal of Urology，vol.151，54-61(Jan 1994)。
早期调查揭示，下面提到的MED患者组应当受益于NPYi/NPY Y1i与PDE5i(或其他下文所列组合)的治疗。这些患者组更详细地描述在Clinical Andrology vol.23，no.4，p773-782和chapter 3 ofthe book by I.Eardley and K.Sethia“Erectile Dysfunction-Current Investigation and Management”，published byMosby-Wolfe中，如下：精神性、器质性、血管性、内分泌性、神经性、动脉生成性、药物诱发的性功能障碍(催乳性)和涉及海绵体因素、具体为静脉生成性原因的性功能障碍。
NPY
如上所述，药物可以是任意适合的能够充当NPY抑制剂(有时称为NPY拮抗剂)的药物。
关于NPY及其有关受体的背景教导已经由Victor A.McKusick等在http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm准备好了。下列关于NPY的文字摘自该来源。
“神经肽Y(NPY)是哺乳动物神经系统中一种丰富和广泛存在的肽。它显示与肽YY的序列同源性，50％以上同源于胰多肽(PNP；167780)的氨基酸和核苷酸序列。NPY是一种36个氨基酸的肽。Minth等(1984)从嗜铬细胞瘤的mRNA开始克隆了NPY基因。Takeuchi等(1985，1986)分别从嗜铬细胞瘤和胰内分泌肿瘤分离了NPY和PNP基因的cDNA克隆体。利用这些cDNA探针分析来自人-小鼠体细胞杂交体的染色体排布系列基因组DNA，他们检查了这些基因是否同线的问题。研究显示不同线，NPY位于7pter-7q22，PNP位于17p11.1-17qter。通过与Musspretus回交的研究，Bahary等(1991)绘制了同源于小鼠染色体6的NPY基因。由于小鼠染色体6具有与人7q的同源性，有可能人NPY基因位于7cen-q22区域。Meisler等(1987)排除了囊性纤维变性位(219700)与神经肽Y之间的紧密键合。Terenghi等(1987)借助就地杂交技术测定了编码NPY的mRNA在手术活组织检查样本与死后尸检的大脑皮质神经元中的分布。他们显示NPY基因转录和表达在正常成熟皮质神经元中的一致性定位作用。Baker等(1995)借助就地杂交荧光显示NPY基因位于7p15.1，存在单一的副本。他们评述道，NPY是已知最保守的肽之一，例如在人与鲨鱼之间仅有3个氨基酸差异。神经肽Y是参与能量平衡控制的一种神经调节剂，在ob/ob小鼠的下丘脑中被过度产生。为了测定NPY在苗条蛋白(164160)缺乏应答中的作用，Erickson等(1996)创造了NPY缺乏的ob/ob小鼠。在没有NPY的存在下，ob/ob小鼠较少肥胖，因为减少了食物摄取，增加了能量消耗，也较少严重地受到糖尿病、不育和亲躯体细胞缺陷的影响。这些结果被解释为说明NPY是苗条蛋白缺乏的中心性效应器。经过选择性喂养而偏爱酒精的大鼠的基因键合分析确定了包括NPY基因的染色体区域(Carr等，1998)。与不偏爱酒精的大鼠相比，偏爱酒精的大鼠在若干大脑区域具有更低的NPY水平。Thiele等(1998)因此研究了小鼠的酒精消耗，作为靶向基因分布的结果，这些小鼠完全缺乏NPY(Erickson等，1996)。他们发现与野生型小鼠相比，NPY缺乏的小鼠增加了含有6％、10％与20％(体积比)乙醇的溶液消耗。NPY缺乏的小鼠还对乙醇的镇静/催眠效果不太敏感，更快地从乙醇诱发的睡眠中苏醒，即使血浆乙醇浓度与对照组没有显著差异。相形之下，在通常表达NPY基因的神经元中过度表达被标记的NPY基因的转基因小鼠比对照组具有更低程度的乙醇偏爱，对乙醇的镇静/催眠效果更加敏感。这些数据提供了直接的证据，证明酒精的消耗与耐受性与大脑NPY水平成反比。作为正在进行中的肥胖遗传基础研究的一部分，Karvonen等(1998)确定了1128T-C多态性，它导致在前原NPY的信号肽部分中的残基7位亮氨酸被脯氨酸取代。这种多态性与肥胖或能量代谢没有关系，但是在正常体重与肥胖的芬兰人和肥胖的荷兰人受试者中，显著和始终地与高血清总胆固醇与LDL胆固醇水平有关。Uusitupa等(1998)发现pro7多态性占芬兰人的14％，但是仅占荷兰人的6％。NPY中具有pro7的受试者的血清总胆固醇水平比没有这种基因变体的人平均高0.6至1.4mmol/L。由于在正常体重的荷兰人中不能见到pro7 NPY对血清胆固醇水平的影响，可以假定肥胖者可能对该基因变体的后果更加敏感。根据计算，在总血清胆固醇等于或高于8mmol/L的肥胖受试者中，NPY中具有pro7的概率可以高达50至60％。至少在芬兰人中，NPY的pro7型是最强烈影响血清胆固醇水平的乙醇因素之一。另见Allen和Bloom(1986)；Dockray(1986)；Maccarrone；Minth等(1986)。”
如上所述，关于NPY及其有关受体的背景教导已经由Victor A.McKusick等准备好了(出处同上)。下列关于NPY Y1的文字摘自该来源。
“神经肽Y(NPY；162640)是哺乳动物神经系统中最为丰富的神经肽之一，表现广泛的重要的生理活性，包括对精神运动活性、食物摄取、中枢内分泌调节的作用和对心血管系统的强效血管作用。NPY的两种主要亚型(Y1和Y2)已经有药理学标准的定义。NPY Y1受体已被确定存在于各种组织中，包括脑、脾、小肠、肾、睾丸、胎盘和主动脉平滑肌。Y2受体主要见于中枢神经系统。Herzog等(1992)报道了编码人NPY受体的cDNA的克隆，他们确认是G蛋白偶联受体总科的成员。当在中国仓鼠卵巢(CHO)或人胚胎肾细胞中被表达时，该受体表现特有的配体特异性。在肾细胞系中，该受体与百日咳毒素敏感性G蛋白偶联，介导环AMP蓄积的抑制作用。另一方面，在CHO细胞系中，该受体与腺苷酸环化酶的抑制作用无关，而是与细胞内钙的升高有关。因而，NPY受体的第二信使偶联是细胞类型特异的，取决于存在于该细胞类型中的特异性G蛋白所有组成成分和效应器系统。Larhammar等(1992)独立克隆和鉴别了神经肽Y受体。Herzog等(1993)测定了人NPY Y1受体基因的分子体制和调节作用。与大多数G蛋白偶联受体基因的毗邻结构相反，他们发现NPY Y1受体基因具有3个外显子。他们还确定了在该基因第一内含子中的共有的Pstl多态性。借助就地杂交的高分辨率荧光，他们定位了该基因于4q31.3-q32。Herzog等(1997)发现NPY1R和NPY5R(602001)基因共同位于染色体4q31-q32。这两个基因从共同的启动子区域向相反的方向被转录。Y1受体基因的交替接合的5个起始外显子之一是Y5受体的编码序列的一部分。这种不寻常的排列提示了Herzog等(1997)这两个基因产生于基因复制事件，它们可能被协同表达。通过种间回交分析，Lutz等(1997)绘制了分别逆向键合于小鼠染色体8和3的Npy1r和Npy2r基因，它们相当于人染色体4q的远端区域。”
如上所述，关于NPY及其有关受体的背景教导已经由Victor A.McKusick等准备好了(出处同上)。下列关于NPY Y2的文字摘自该来源。
“神经肽Y(NPY)通过存在于大脑和交感神经元中的G蛋白偶联受体家族发信号。在药理学标准、组织分布和编码基因的结构的基础上，已经定义了至少3种类型的神经肽Y受体；参见162641和162643。Rose等(1995)报道了编码人2型受体NPY2R的cDNA在COS细胞中的表达克隆。被转染的细胞对NPY(162640)、肽YY(PYY；600781)和包括氨基酸13至36的NPY片段显示很高的亲合性。所预言的381个氨基酸的蛋白质具有G蛋白偶联受体特有的7个跨膜结构域，与人Y1受体(NPY1R；162641)仅有31％的同一性。在来自神经系统若干区域的组织样本的Northern印迹上检测了4-kb mRNA。Gerald等(1995)利用放射性标记的PYY结合测定法克隆了对应于人Y2受体的cDNA，该受体来自人海马cDNA表达文库。他们在COS-7细胞中表达了Y2基因，进行了激素结合测定法，显示Y2受体与PYY、NPY和胰多肽(PP；167780)激素结合(亲合性从高到低)。Ammar等(1996)克隆和鉴别了编码2型NPY受体的人基因。转录体跨越9kb的基因组序列，在2个外显子中被编码。正如1型NPY受体基因，NPY2R的5个起始未转译区域被4.5-kb间插序列所中断。Ammar等(1996)借助啮齿动物-人细胞杂交体的DNA印迹分析和就地杂交荧光(FISH)证明，NPY2R基因映射于4q31，即含有NPY1R基因的相同区域，这提示了这些亚型可能产生于基因复制，尽管它们有结构上的差异。通过种间回交分析，Lutz等(1997)绘制了分别逆向键合于小鼠染色体8和3的Npy1r和Npy2r基因，它们相当于人染色体4q的远端区域。”
NPY序列数据
关于NPY及其受体(即NPY Y1)的核苷酸序列和氨基酸序列可从文献获得。图4-6列举了一些序列。
NPY抑制剂和/或NPY Y1抑制剂
适合于鉴定和/或研究NPYi(或NPY Y1i)的测定系统细节列在下面题为“NPY测定法”的小节，并且基于WO-A-98/52890所列举的测定法(参见96页2至28行)。
下列评述文章公开和讨论了进一步的NPY抑制剂或NPY Y1抑制剂实例：
·Dunlop J，Rosenzweig-Lipson S：Therapeutic approaches to obesity ExpOpin Ther Pat 1999 8 12 1683-1694
·Wang S，Ferguson KC，Burris TP，Dhurandhar NV：8th annual internationalconference on obesity and non-insulin dependent diabetes mellitus：noveldrug developments.Exp Opin Invest Drugs 1999 87 1117-1125
·Ling AL：Neuropeptide Y receptor antagonists Exp Opin Ther Pat 1999 94375-384
·Adham N，Tamm J，Du P，Hou C，et al：Identification of residues involvedin the binding of the antagonist SNAP 6608 to the Y5 receptor SocNeurosci Abstr 1998 24 part 2 626.9
·Shu YZ，Cutrone JQ，Klohr SE，Huang S：BMS-192548，a tetracyclicbinding inhibitor of neuropeptide Y receptors，from Aspergillus nigerWB2346.II.Physico-chemical properties and structural characterization JAntibiot 1995 48 10 1060-1065
·Rigollier P，Rueger H，Whitebread S，Yamaguchi Y，Chiesi M，Schilling W，Criscione L：Synthesis and SAR of CGP 71683A，a potent and selectiveantagonist of the neuropeptide Y Y5 receptor.Int Symp Med Chem 199815th Edinburgh 239
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下列文献公开了更进一步的NPYi’s和/或NPY Y1i’s实例：
WO-98/07420
WO-94/00486
WO-96/22305
WO-97/20821
WO-97/20822
WO-96/14307
JP-07267988
WO-96/12489
US-5552422
WO-98/35957
WO-96/14307
WO-94/17035
EP-0614911
WO-98/40356
EP-0448765
EP-0747356
WO-98/35941
WO-97/46250
EP-0747357
EP-0896822
EP-1033366
WO-00/66578
进一步的NPY抑制剂和/或NPY Y1抑制剂实例选自下列结构：
Figure A0182055600311
Figure A0182055600321
Figure A0182055600331
NPY测定法
如WO98/52890所述(96页2至28行)，利用本质上如M.W.Walker等Journal of Neurosciences 8：2438-2446(1988)所述方案可以评估化合物与NPY结合的能力。
这种测定法采用细胞系SK-N-MC。这种细胞系可从Sloane-Kettering Memorial Hospital，New York获得。
使用补充有5％胎牛血清的Dulbecco氏最低基本培养基(DMEM)，在T-150烧瓶内培养这些细胞。手工刮除细胞，使成粒状沉淀，贮存在-70℃下。
利用玻璃匀化器，将粒状沉淀再次悬浮在25mM HEPES(pH7.4)缓冲液中，其中含有2.5mM氯化钙、1mM氯化镁和2g/L杆菌肽。在室温下培育两小时，最终体积为200μl，其中含有0.1nM125I-肽YY(2200Ci/mmol)和0.2-0.4mg蛋白质。
非特异性结合被定义为在1μM神经肽Y的存在下培育后仍然与组织结合的放射性的量。在有些实验中，在培育混合物中包括不同浓度的化合物。
培育终止于利用96孔收获器快速通过玻璃纤维滤器过滤，后者预先浸泡在0.3％聚乙烯亚胺中。将滤器用4℃的5ml 50mM Tris(pH7.4)洗涤，迅速在60℃下干燥。然后将滤器用熔融闪烁片处理，计数保留在滤器上的放射性。利用各种软件包分析结果。使用标准的库马斯蛋白质测定试剂，以牛血清白蛋白作为标准，测量蛋白质浓度。
组合
详细而言，本发明进一步包含用于治疗如本文所述的男性性功能障碍(更具体为男性勃起功能障碍)的本发明化合物与一种或多种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)的组合。该组合提供器质性、血管性、神经性、药物诱发和/或精神性起因的勃起功能障碍的治疗。
本发明进一步包含本质上由根据本发明的NPYi或NPY Y1i与两种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成的组合在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗或预防如本文所述的男性性功能障碍(更具体为男性勃起功能障碍)。该组合提供器质性、血管性、神经性、药物诱发和/或精神性起因的勃起功能障碍的治疗。
本发明进一步包含由根据本发明的NPYi或NPY Y1i与两种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成的组合在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗或预防如本文所述的男性性功能障碍(更具体为男性勃起功能障碍)。该组合提供器质性、血管性、神经性、药物诱发和/或精神性起因的勃起功能障碍的治疗。
本发明进一步包含本质上由根据本发明的NPYi或NPY Y1i与一种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成的组合在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗或预防如本文所述的男性性功能障碍(更具体为男性勃起功能障碍)。该组合提供器质性、血管性、神经性、药物诱发和/或精神性起因的勃起功能障碍的治疗。
本发明进一步包含由根据本发明的NPYi或NPY Y1i与一种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成的组合在药剂制造中的用途，该药剂用于治疗或预防如本文所述的男性性功能障碍(更具体为男性勃起功能障碍)。该组合提供器质性、血管性、神经性、药物诱发和/或精神性起因的勃起功能障碍的治疗。
因而，本发明的另一组合方面提供药物组合(用于同时、独立或连续给药)，包含本发明的化合物和一种或多种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)。
本发明的另一组合方面提供药物组合(用于同时、独立或连续给药)，本质上由NPYi或NPY Y1i和两种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成。
本发明的另一组合方面提供药物组合(用于同时、独立或连续给药)，由NPYi或NPY Y1i和两种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成。
本发明的另一组合方面提供药物组合(用于同时、独立或连续给药)，本质上由NPYi或NPY Y1i和一种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成。
本发明的另一组合方面提供药物组合(用于同时、独立或连续给药)，由NPYi或NPY Y1i和一种辅助性活性药物(见后关于适合实例的讨论)组成。
辅助性活性药物
适合用在本发明组合中的辅助性活性药物包括：
1)天然存在或合成的前列腺素或其酯。适用于此的前列腺素包括这样的化合物，例如前列地尔、前列腺素E1、前列腺素E0、13，14-二氢前列腺素E1、前列腺素E2、eprostinol，天然、合成与半合成的前列腺素及其衍生物，包括2000年3月14日公布的WO00/33825和/或US 6,037,346所述那些，引用在此作为参考，PGE0、PGE1、PGA1、PGB1、PGF1α、19-羟基PGA1、19-羟基-PGB1、PGE2、PGB2、19-羟基-PGA2、19-羟基-PGB2、PGE3α、卡前列素氨丁三醇、地诺前列素氨丁三醇、地诺前列酮、lipoprost、吉美前列素、甲烯前列素、硫前列酮、噻前列素和莫西赛利；
2)α-肾上腺素能受体拮抗剂化合物，也已知为α-肾上腺受体或α-受体或α-阻滞剂。适用于此的化合物包括：如1998年6月14日公开的PCT申请WO99/30697所述的α-肾上腺素能受体阻滞剂，其涉及α-肾上腺素能受体的公开内容引用在此作为参考，包括选择性α1-肾上腺受体或α2-肾上腺受体阻滞剂和非选择性肾上腺受体阻滞剂，适合的α1-肾上腺受体阻滞剂包括：酚妥拉明、甲磺酸酚妥拉明、曲唑酮、阿夫唑嗪、吲哚拉明、萘哌地尔、坦洛新、达哌唑、苯氧苄胺、咪唑克生、依法克生、育亨宾、萝芙木生物碱、Recordati 15/2739、SNAP 1069、SNAP 5089、RS 17053、SL 89.0591、多沙唑嗪、特拉唑嗪、阿巴诺喹和哌唑嗪；来自US 6,037,346(2000年3月14日)的α2-阻滞剂地苯那明、妥拉唑林、曲马唑嗪和地苯那明；如下美国专利所述的α肾上腺素能受体：4,188,390；4,026,894；3,511,836；4,315,007；3,527,761；3,997,666；2,503,059；4,703,063；3,381,009；4,252,721和2,599,000，各自引用在此作为参考；α2-肾上腺受体阻滞剂包括：可乐定、罂粟碱、盐酸罂粟碱，可选地在cariotonic剂的存在下，例如pirxamine；
3)NO供体(NO激动剂)化合物。适用于此的NO供体化合物包括有机硝酸盐，例如一、二或三硝酸盐，或者有机硝酸酯，包括甘油三硝酸酯(也已知为硝酸甘油)、异山梨醇5-单硝酸酯、异山梨醇二硝酸酯、季戊四醇四硝酸酯、赤藓醇四硝酸酯、硝普酸钠(SNP)、3-吗啉代sydnonimine吗多明、S-亚硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP)、S-亚硝基-N-谷胱苷肽(SNO-GLU)、N-羟基-L-精氨酸、硝酸戊酯、林西多明、林西多明氯水合物(SIN-1)、S-亚硝基-N-半胱氨酸、diazeniumdiolates(NONOates)、1，5-戊烷二硝酸酯、L-精氨酸、人参、大枣、吗多明、Re-2047、亚硝基化莫西赛利衍生物，例如NMI-678-11和NMI-937，如已公开的PCT申请WO00/12075所述；
4)钾通道开放剂或调节剂。适用于此的钾通道开放剂/调节剂包括尼可地尔、色满卡林、左色满卡林、lemakalim、吡那地尔、cliazoxide、米诺地尔、charybdotoxin、格列本脲、4-氨基吡啶、BaCl2；
5)多巴胺能剂，优选阿朴吗啡或选择性D2、D3或D2/D3激动剂，例如普拉克索和ropirinol(如WO00/23056所要求保护)、PNU95666(如WO00/40226所要求保护)；
6)血管舒张剂。适用于此的血管舒张剂包括尼莫地平、吡那地尔、环扁桃酯、异克舒令、氯丙嗪、氟哌啶醇、Rec 15/2739、曲唑酮；
7)凝血噁烷A2激动剂；
8)CNS活性剂；
9)麦角生物碱。适合的麦角生物碱描述在2000年3月14日公布的美国专利6,037,346中，包括乙酰麦角胺、溴麦角林、溴麦角脲、氰麦角林、地麦角腈、地舒勒近、马来酸麦角新碱、酒石酸麦角胺、乙舒麦角、麦角腈、麦角二乙胺、美舒麦角、甲麦角林、甲麦角胺、尼麦角林、培高利特、普罗麦角、丙麦角脲和特麦角脲；
10)调节促尿钠排泄因子的化合物，具体为心房促尿钠排泄因子(也已知为心房促尿钠排泄肽)、B型与C型促尿钠排泄因子，例如中性内肽酶抑制剂；
11)血管紧张素受体拮抗剂，例如洛沙坦；
12)NO合成酶底物，例如L-精氨酸；
13)钙通道阻滞剂，例如氨氯地平；
14)内皮素受体拮抗剂和内皮素转化酶抑制剂；
15)胆固醇降低剂，例如他汀类(例如atorvastatin/Lipitor商标)和贝特类；
16)抗血小板与抗血栓形成剂，例如tPA、uPA、华法令、水蛭素和其他凝血酶抑制剂、肝素、促凝血酶原激酶活化因子抑制剂；
17)胰岛素致敏剂，例如rezulin，和降血糖剂，例如格列吡嗪；
18)L-多巴或卡比多巴；
19)乙酰胆碱酯酶抑制剂，例如donezipil；
20)固醇类或非固醇类抗炎剂；
21)雌激素受体调节剂和/或雌激素激动剂和/或雌激素拮抗剂，优选雷洛昔芬或lasofoxifene、(-)-顺式-6-苯基-5-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯基]-5，6，7，8-四氢萘-2-酚及其药学上可接受的盐，其制备详见WO96/21656；
22)PDE抑制剂，更具体为PDE2、3、4、5、7或8抑制剂，优选PDE2或PDE5抑制剂，最优选PDE5抑制剂(见下)，所述抑制剂优选地对各自的酶具有小于100nM的IC50(其条件是PDE3和4抑制剂仅是通过局部或注射给药至阴茎的)；
23)NEP抑制剂，优选地对NEP具有小于300nM的IC50，更优选小于100nM；
24)血管作用性肠蛋白(VIP)、VIP模拟物、VIP类似物，更具体地受到一种或多种VIP受体亚型VPAC1、VPAC或PACAP(垂体腺苷酸环化酶活化肽)、一种或多种VIP受体激动剂或VIP类似物(例如Ro-125-1553)或VIP片段、一种或多种α-肾上腺受体拮抗剂与VIP的组合(例如Invicorp、Aviptadil)的介导作用；
25)melanocortin受体激动剂或调节剂或增强剂，例如melanotan II、PT-14、PT-141或下列申请要求保护的化合物：WO09964002，WO 00074679，WO 09955679，WO 00105401，WO 00058361，WO 00114879，WO 00113112，WO 09954358；
26)血清素受体激动剂、拮抗剂或调节剂，更具体为5HT1A(包括VML 670)、5HT2A、5HT2C、5HT3和/或5HT6受体的激动剂、拮抗剂或调节剂，包括WO 09902159、WO 00002550和/或WO 00028993所述那些；
27)睾酮替代剂(包括脱氢雄甾烯二酮)、睾酮(Tostrelle)、二氢睾酮或睾酮植入物；
28)雌激素、雌激素与甲羟孕酮或乙酸甲羟孕酮(MPA)(也就是作为组合)，或者雌激素与甲基睾酮激素替代治疗剂(例如HRT，尤其是Premarin、Cenestin、Oestrofeminal、Equin、Estrace、Estrofem、Elleste Solo、Estring、Eastraderm TTS、Eastraderm Matrix、Dermestril、Premphase、Preempro、Prempak、Premique、Estratest、Estratest HS、Tibolone)；
29)去甲肾上腺素、多巴胺和/或血清素的转运蛋白的调节剂，例如安非他酮、GW-320659；
30)嘌呤能受体激动剂和/或调节剂；
31)神经激肽(NK)受体拮抗剂，包括WO 09964008所述那些；
32)阿片类受体激动剂、拮抗剂或调节剂，优选ORL-1受体激动剂；
33)催产素/后叶加压素受体激动剂或调节剂，优选选择性催产素激动剂或调节剂；
34)大麻碱类受体调节剂；
35)铃蟾肽受体拮抗剂，更具体为铃蟾肽BB1、BB2或BB3受体拮抗剂，优选铃蟾肽BB1抑制剂(见下)，所述抑制剂优选地对各自的酶具有小于100nM的IC50；
36)SEP抑制剂(SEPi)，例如SEPi具有小于100nM的IC50，更优选小于50nM。优选地，根据本发明的SEP抑制剂对SEP具有大于30倍、更优选大于50倍于中性内肽酶NEP EC 3.4.24.11和血管紧张素转化酶(ACE)的选择性。优选地，SEPi还具有大于100倍于内皮素转化酶(ECE)的选择性；
37)能够调节个体性生殖器中的中级电导钙活化钾(IKCa)通道活性的药物。
通过对按照本发明能够使用的包含在专利和专利申请中的化合物的交叉引用，我们表示如权利要求(具体为权利要求1)和特定实施例所定义的治疗活性化合物(全部引用在此作为参考)。
如果将活性药物的组合给药，那么它们可以被同时、独立或连续给药。
辅助性药物——PDE5抑制剂
任意具体cGMP PDE5抑制剂的适合性都容易这样确定，利用文献方法评价它的效力和选择性，然后按照标准的药学实践评价它的毒性、吸收、代谢、药动学等。
cGMP PDE5抑制剂的IC50可以利用PDE5测定法(见下)测定。
优选地，用在根据本发明的药物组合中的cGMP PDE5抑制剂对PDE5酶是选择性的。优选地(当口服使用时)，它们不选择PDE3，更优选地不选择PDE3和PDE4。优选地(当口服时)，本发明的cGMP PDE5抑制剂具有大于100倍、更优选大于300倍于PDE3、更优选PDE3和PDE4的选择性比。
选择性比可以容易被技术人员测定。关于PDE3和PDE4酶的IC50值可以利用既定的文献方法测定，参见S A Ballard等，Journal ofUrology，1998，vol.159，p.2164-2171和下文详述。
适用于本发明的cGMP PDE5抑制剂包括：
公开在EP-A-0463756中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在EP-A-0526004中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在已公布的国际专利申请WO93/06104中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在已公布的国际专利申请WO93/07149中的异构的吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮；公开在已公布的国际专利申请WO93/12095中的喹唑啉-4-酮；公开在已公布的国际专利申请WO94/05661中的异构的吡啶并[3，2-d]嘧啶-4-酮；公开在已公布的国际专利申请WO94/00453中的嘌呤-6-酮；公开在已公布的国际专利申请WO98/49166中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在已公布的国际专利申请WO99/54333中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在EP-A-0995751中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-4-酮；公开在已公布的国际专利申请WO00/24745中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在EP-A-0995750中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-4-酮；公开在已公布的国际申请WO95/19978中的化合物；公开在已公布的国际申请WO99/24433中的化合物和公开在已公布的国际申请WO93/07124中的化合物。公开在已公布的国际申请WO01/27112中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在已公布的国际申请WO01/27113中的吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮；公开在EP-A-1092718中的化合物和公开在EP-A-1092719中的化合物。
进一步适用于本发明的PDE5抑制剂包括：
5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基磺酰基)苯基]-1-甲基-3-正丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(西地那非)，也已知为1-[[3-(6，7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-5-基)-4-乙氧基苯基]磺酰基]-4-甲基哌嗪(参见EP-A-0463756)；5-(2-乙氧基-5-吗啉代乙酰基苯基)-1-甲基-3-正丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见EP-A-0526004)；3-乙基-5-[5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)-2-正丙氧基苯基]-2-(吡啶-2-基)甲基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO 98/49166)；3-乙基-5-[5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)-2-(2-甲氧基乙氧基)吡啶-3-基]-2-(吡啶-2-基)甲基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO 99/54333)；(+)-3-乙基-5-[5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)-2-(2-甲氧基-1(R)-甲基乙氧基)吡啶-3-基]-2-甲基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，也已知为3-乙基-5-{5-[4-乙基哌嗪-1-基磺酰基]-2-([(1R)-2-甲氧基-1-甲基乙基]氧基)吡啶-3-基}-2-甲基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO99/54333)；5-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)吡啶-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧基乙基]-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，也已知为1-{6-乙氧基-5-[3-乙基-6，7-二氢-2-(2-甲氧基乙基)-7-氧代-2H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-5-基]-3-吡啶基磺酰基}-4-乙基哌嗪(参见WO01/27113实施例8)；5-[2-异丁氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)吡啶-3-基]-3-乙基-2-(1-甲基哌啶-4-基)-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO01/27113实施例15)；5-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)吡啶-3-基]-3-乙基-2-苯基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO 01/27113实施例66)；5-(5-乙酰基-2-丙氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-异丙基-3-氮杂环丁烷基)-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO01/27112实施例124)；5-(5-乙酰基-2-丁氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-乙基-3-氮杂环丁烷基)-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO01/27112实施例132)；(6R，12aR)-2，3，6，7，12，12a-六氢-2-甲基-6-(3，4-亚甲二氧基苯基)-吡嗪并[2’，1’：6，1]吡啶并[3，4-b]吲哚-1，4-二酮(IC-351)，也就是已公布的国际申请WO95/19978的实施例78和95化合物，以及实施例1、3、7和8化合物；2-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基-1-磺酰基)苯基]-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑并[5，1-f][1，2，4]三嗪-4-酮(vardenafil)，也已知为1-[[3-(3，4-二氢-5-甲基-4-氧代-7-丙基咪唑并[5，1-f]-as-三嗪-2-基)-4-乙氧基苯基]磺酰基]-4-乙基哌嗪，也就是已公布的国际申请WO99/24433的实施例20、19、337和336化合物；已公布的国际申请WO93/07124(EISAI)的实施例11化合物；和Rotella D P，J.Med.Chem.，2000，43，1257的化合物3和14。
其他适合的PDE5抑制剂包括：
4-溴-5-(吡啶基甲氨基)-6-[3-(4-氯苯基)丙氧基]-3(2H)-哒嗪酮；1-[4-[(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)氨基]-6-氯-2-喹唑啉基]-4-哌啶羧酸，-钠盐；(+)-顺式-5，6a，7，9，9，9a-六氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]甲基-5-甲基戊环并[4，5]咪唑并[2，1-b]嘌呤-4(3H)-酮；furazlocillin；顺式-2-己基-5-甲基-3，4，5，6a，7，8，9，9a-八氢戊环并[4，5]咪唑并[2，1-b]嘌呤-4-酮；3-乙酰基-1-(2-氯苄基)-2-丙基吲哚-6-羧酸酯；3-乙酰基-1-(2-氯苄基)-2-丙基吲哚-6-羧酸酯；4-溴-5-(3-吡啶基甲氨基)-6-(3-(4-氯苯基)丙氧基)-3-(2H)-哒嗪酮；1-甲基-5(5-吗啉代乙酰基-2-正丙氧基苯基)-3-正丙基-1，6-二氢-7H-吡唑并(4，3-d)嘧啶-7-酮；1-[4-[(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)氨基]-6-氯-2-喹唑啉基]-4-哌啶羧酸，一钠盐；Pharmapro jects No.4516(GlaxoWellcome)；Pharmapro jects No.5051(Bayer)；Pharmapro jects No.5064(Kyowa Hakko；see WO 96/26940)；Pharmapro jects No.5069(Schering Plough)；GF-196960(Glaxo Wellcome)；E-8010和E-4010(Eisai)；Bay-38-3045 & 38-9456(Bayer)和Sch-51866。
对环鸟苷3’，5’-一磷酸(cGMP)与环腺苷3’，5’-一磷酸(cAMP)磷酸二酯酶的体外PDE抑制活性是通过测量它们的IC50值(抑制50％酶活性所需的化合物浓度)加以测定的。
所需的PDE酶是从各种来源分离的，包括人海绵体、人与兔血小板、人心室、人骨骼肌和人与犬视网膜，尤其按照W.J.Thompson和M.M.Appleman的方法(Biochem.，1971， 10，311)。具体而言，cGMP特异性PDE(PDE5)和抑制cGMP的cAMP PDE(PDE3)是从人海绵体或人血小板得到的；刺激cGMP的PDE(PDE2)是从人海绵体和人血小板得到的；钙/钙调蛋白(Ca/CAM)依赖性PDE(PDE1)是从人心室得到的；cAMP特异性PDE(PDE4)是从人骨骼肌和在SF9细胞中被表达的人重组体得到的；光感受器PDE(PDE6)是从人或犬视网膜得到的。磷酸二酯酶7-11是从被转染至SF9细胞内的全长人重组克隆体生成的。
测定法是这样进行的，利用W.J.Thompson等的“批量”方法(Biochem.，1979， 18，5228)的改进，或者利用Amersham plc在产品代码TRKQ 7090/7100下所述方案的改进，使用闪烁近似测定法直接检测AMP/GMP。总之，PDE抑制剂的效果是这样研究的，在不同浓度抑制剂和少量底物的存在下测定固定量的酶(cGMP或cAMP的未标记与[3H]-标记之比为3∶1，浓度～1/3Km)，以便 I C 50 &cong; K i . 将最终的测定体积用测定缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4，5mM MgCl2，1mg/ml牛血清白蛋白)调至100μl。用酶引发反应，在30℃下培育30-60min，得到底物周转率＜30％，用50μl硅酸钇SPA珠粒(含有3mM关于PDEs9和11各自未标记的环核苷酸)终止反应。将平板重新密封，摇动20min，然后使珠粒在暗处沉降30min，然后在TopCount平板读数器(Packard，Meriden，CT)上计数。将放射性单位转化为未被抑制的对照(100％)的活性％，利用“Fit Curve”Microsoft Excel扩展版(或内部等价版本)对抑制剂浓度和所得抑制剂IC50值作图。这些试验结果显示本发明化合物是cGMP特异性PDE5的抑制剂。
功能活性可以这样体外测定，利用基于S.A.Ballard等(Brit.J.Pharmacol.，1996， 118(suppl.)，abstract 153P)或S.A.Ballard等(J.Urology，1998， 159，2164-2171)所述的方法，测定本发明化合物增强硝普酸钠或电场刺激诱导的预收缩兔海绵体组织条松弛的能力。
化合物可以这样进行体内筛选，利用基于Trigo-Rocha等(Neurourol.and Urodyn.，1994， 13，71)所述方法，在试验动物中，例如麻醉的兔，测定它们在i.v.给药后增强由硝普酸钠的海绵体内注射诱导的阴茎海绵体内压力上升的能力。
非常优选与NPYi联合用在本文药物组合物中的是强效的选择性PDE5抑制剂。
本文尤其优选的是一种或多种强效的选择性cGMP PDE5抑制剂与一种或多种高度选择性NPY Y1受体抑制剂的组合。
辅助性药物——NEP抑制剂(I：NEP＝NEPi)
NEP EC3.4.24.11(FEBS Lett.229(1)，206-210(1988))也已知为脑啡肽酶或neprilysin，是一种锌依赖性中性内肽酶。这种酶参与若干生物活性寡肽的分解，裂解疏水性氨基酸残基的氨基一侧上的肽键(Turner等，1997)。由NEP代谢的、关键的神经元释放的生物活性剂或神经肽包括促尿钠排泄肽，例如心房促尿钠排泄肽(ANP)以及脑促尿钠排泄肽和C型促尿钠排泄肽、铃蟾肽、缓激肽、降钙素基因相关性肽、内皮素、脑啡肽、神经降压素、P物质和血管作用性肠肽。这些肽中有些具有强大的血管舒张与神经激素功能、利尿与促尿钠排泄活性或间接的行为效果。关于NEP的背景教导已经由Victor A.McKusick等列在http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm上。
任意具体I：NEP的适合性都容易这样确定，利用文献方法评价它的效力和选择性，然后按照标准的药学实践评价它的毒性、吸收、代谢、药动学等。
优选地，I：NEP具有大于300倍于ACE的选择性。
对ACE的IC50值和选择性比可以按照EP 1097719A1所述方法测定。
下列评述文章公开和讨论了NEP抑制剂的实例：
Pathol.Biol.，46(3)，1998，191；Current Pharm.Design，2(5)，1996，443；Biochem.Soc.Trans.，21(3)，1993，678；Handbook Exp.Pharmacol.，104/1，1993，547；TiPS，11，1990，245；Pharmacol.Rev.，45(1)，1993，87；Curr.Opin.Inves.Drugs，2(11)，1993，1175；Antihypertens.Drugs，(1997)，113；Chemtracts，(1997)，10(11)，804；Zinc Metalloproteases HealthDis.(1996)，105；Cardiovasc.Drug Rev.，(1996)，14(2)，166；Gen.Pharmacol.，(1996)，27(4)，581；Cardiovasc.Drug Rev.，(1994)，12(4)，271；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，(1995)，22(1)，63；Cardiovasc.Drug Rev.，(1991)，9(3)，285；Exp.Opin.Ther.Patents(1996)，6(11)，1147.
下列文献进一步公开了NEP抑制剂的实例：
EP-509442A；US-192435；US-4929641；EP-599444B；US-884664；EP-544620A；US-798684；J.Med.Chem.1993，3821；Circulation 1993， 88(4)，1；EP-136883；JP-85136554；US-4722810；Curr. Pharm.Design，1996，2，443；EP-640594；J.Med.Chem.1993，36(1)，87；EP-738711-A；JP-270957；CAS#115406-23-0；DE-19510566；DE-19638020；EP-830863；JP-98101565；EP-733642；WO9614293；JP-08245609；JP-98245609；WO9415908；JP05092948；WO-9309101；WO-9109840；EP-519738；EP-690070；J.Med.Chem.(1993)，36，2420；JP-95157459；Bioorg.Med.Chem.Letts.，1996，6(1)，65；EP-A-0274234；JP-88165353；Biochem.Biophys.Res.Comm.，1989， 164，58；EP-629627-A；US-77978；Perspect.Med.Chem.(1993)，45；EP-358398-B
进一步的NEP抑制剂实例公开在EP 1097719-A1中，具体为其中的化合物FXII至FXIII。
优选的NEP抑制剂是EP 1097719-A1的化合物FV至FXI和F57至F65。
辅助性药物——铃蟾肽受体拮抗剂
已经发现铃蟾肽受体拮抗剂可用于治疗男性性功能障碍，尤其是药物诱发的男性性功能障碍和与普遍性感觉迟钝和性欲激发能力衰退有关的精神性男性性功能障碍。
已经利用动物模型试验了铃蟾肽受体拮抗剂化合物，这些模型据信是可靠的和预言性的，具体关于为女性进行预测的能力。在啮齿动物中，规定(proceptive)行为是在激素控制之下的，孕酮是与雌激素联合诱导规定行为所必需的(Johnson M和Everitt B.，EssentialReproduction(3rd edn)，Blackwell，Oxford，1988)。灵长类行为的激素控制证据与之有冲突，但是大体上雌激素和/或雄激素似乎增强规定行为(Baum M.J.，J.Biosci.，1983；33：578-582)。大鼠规定行为的行为表现包括“跳跃和疾走”运动，伴有耳朵的快速振动。评估渴望寻求性接触(性动机)的试验已被报道为最适当的测量规定行为的途径(Meyerson B.J.，Lindstrom L.H.，Acta Physiol.Scand.，1973；389(Suppl.)：1-80)。当雌性呈现前凸位置时，证明了大鼠的接受能力。这发生在雄性爬上后用其前爪施加压力于接受它的雌性胁腹之时。神经元对这种行为的主要控制部位是腹内侧核(VMN)和中脑中央灰色区(MCG)(关于评述，参见Wilson，C.A.，In：SexualPharmacology，Riley A.J.等(Eds)，Clarendon Press，Oxford，1993：1-58)。
铃蟾肽是一种14个氨基酸的肽，最初是从欧洲蛙类Bombinabombina的皮肤分离到的(Anastasi A.等，Experientia，1971；27：166)。它属于一类在其C末端十肽区域共享结构同源性的肽(Dutta A.S.，Small Peptides；Chemistry，Biology，and Clinical Studies，Chapter 2，pp 66-82)。目前，已经鉴定了两种哺乳动物铃蟾肽样肽，即十肽的神经调节肽B(NMB)和23个氨基酸残基的胃泌素释放肽(GRP)。
通过对异种受体群体的作用，铃蟾肽引起大量中枢效果。BB1受体与神经调节肽B(NMB)结合，亲合性高于胃泌素释放肽(GRP)和神经调节肽C(NMC)，BB2受体与GRP和NMC结合，亲合性高于NMB。近来，有证据表明另有两种受体亚型BB3和BB4，但是由于药理作用有限，目前对它们的功能知之甚少。BB1和BB2受体在中枢神经系统内具有不均匀的分布，说明这些受体的内源性配体可能各不相同地调节神经传递。其中，BB1受体尤其存在于腹侧正中的下丘脑中(Ladenheim E.E.等，Brain Res.，1990；537：233-240)。
已经在哺乳动物脑中检测到铃蟾肽样免疫反应性和mRNA(Braun M.等，Life Sci.，1978；23：2721)(Battey J.等，TINS，1991；14：524)。NMB和GRP据信介导各种生物学作用(关于评述，参见WO98/07718)。
下列专利申请公开了能够拮抗NMB和/或GRP对铃蟾肽受体的作用的化合物：CA 2030212，EP
0309297，EP 0315367，EP 0339193，EP 0345990，EP 0402852，EP 0428700，EP 0438519，EP 0468497，EP 0559756，EP 0737691，EP 0835662，JP07258081，UK 2231051，US 4943561，US 5019647，US 5028692，US5047502，US 5068222，US 5084555，US 5162497，US 5244883，US 5439884，US 5620955，US 5620959，US 5650395，US 5723578，US 5750646，US5767236，US 5877277，US 5985834，WO 88/07551，WO 89/02897，WO89/09232，WO 90/01037，WO 90/03980，WO 91/02746，WO 91/04040，WO91/06563，WO 92/02545，WO 92/07830，WO 92/09626，WO 92/20363，WO92/20707，WO 93/16105，WO 94/02018，WO 94/02163，WO 94/21674，WO95/00542，WO 96/17617，WO 96/28214，WO 97/09347，WO 98/07718，WO00/09115，WO 00/09116.
我们相信，公开在这些申请中的化合物能够用于预防或治疗性功能障碍，上述申请——或者甚至任何以前关于铃蟾肽受体的科技文献——没有公开或提示这一适应症。
公开在WO 98/07718中的一种优选的铃蟾肽受体拮抗剂包含式(I)化合物
及其药学上可接受的盐，其中：
·j是0或1；
·k是0或1；
·l是0、1、2或3；
·m是0或1；
·n是0、1或2；
·Ar是苯基、吡啶基或嘧啶基，各自是未取代的或者被1至3个取代基取代，取代基选自烷基、卤素、烷氧基、乙酰基、硝基、氨基、-CH2NR10R11、氰基、-CF3、-NHCONH2和-CO2R12；
·R1是氢或1至7个碳原子的直链、支链或环状烷基；
·R8是氢或者与R1构成3至7个碳原子的环；
·R2是氢或1至8个碳原子的直链、支链或环状烷基，它还可以含有1至2个氧或氮原子；
·R9是氢或者与R2构成3至7个碳原子的环，它可以含有氧或氮原子；或者R2和R9可以一起是羰基；
·Ar1可以独立地选自Ar，还可以包括吡啶基-N-氧化物、吲哚基、咪唑基和吡啶基；
·R4、R5、R6和R7各自独立地选自氢和低级烷基；R4还可以与R5构成2至3个碳原子的共价连接，它可以包括氧或氮原子；
·R3可以独立地选自Ar，或者是氢、羟基、-NMe2、N-甲基吡咯基、咪唑基、N-甲基咪唑基、四唑基、N-甲基四唑基、噻唑基、-CONR13R14、烷氧基、
Figure A0182055600491
或
Figure A0182055600493
其中p是0、1或2，Ar2是苯基或吡啶基；
·R10、R11、R12、R13和R14各自独立地选自氢或1至7个碳原子的直链、支链或环状烷基。
上述种类中特别优选的化合物是(S)-3-(1H-吲哚-3-基)-N-[1-(5-甲氧基吡啶-2-基)环己基甲基]-2-甲基-2-[3-(4-硝基苯基)脲基]丙酰胺及其药学上可接受的盐。
BB1和BB2结合测定法
下列实验中，BB1和BB2结合的测量如下。使稳定表达被克隆的人NMB受体(用于BB1测定)和GRP受体(用于BB2测定)的CHO-K1细胞常规生长在Ham氏F12培养基中，其中补充有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺。关于结合实验，通过胰蛋白酶作用收获细胞，冷冻贮存在-70℃Ham氏F12培养基中备用，其中含有5％DMSO。在使用当天，将细胞快速融化，用过量培养基稀释，在2000g下离心5分钟。将细胞再次悬浮在50mM Tris-HCl测定缓冲液(pH7.4，21℃，含有0.02％ BSA，40μg/ml杆菌肽，2μg/ml胰凝乳蛋白酶抑制剂，4μg/ml亮肽素，2μM膦酰二肽)，计数，polytronned(5档，10sec)，然后在28,000g下离心10分钟。将最终的粒状沉淀再次悬浮在测定缓冲液中，最终的细胞浓度为1.5×105/ml。关于结合测定，在有和没有供试化合物的存在下，将200μl膜试样用[125I][Tyr4]铃蟾肽(＜0.1nM)培育(最终测定体积为250μl)，关于NMB和GRP受体分别培育60分钟和90分钟。非特异性结合是由1μM铃蟾肽所定义的。测定终止于在真空下、在预浸泡在0.2％PEI中的Whatman GF/C滤器上快速过滤＞2小时，用50mMTris-HCl洗涤(pH6.9，21℃，61ml)。利用γ计数器测定所结合的放射性。
采用Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，USA)中的迭代曲线-标绘程序，利用非线性回归分析所有竞争数据。利用Cheng-Prusoff方程将IC50值校正为Ki值(Cheng Y.，Prusoff W.H.，Biochem.Pharmacol.22：3099-3108，1973)。
辅助性药物——SEP抑制剂(SEPi)
SEPi是抑制或选择性抑制具有SEP活性的多肽的化合物。
SEP是一种可溶性所分泌的内肽酶。内肽酶包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属内肽酶，在肽内的序列裂解。
一组重要的内肽酶已知为锌金属蛋白酶，是以在其催化部位具有结合锌离子的需要为特征的。锌金属蛋白酶可以分为几类(关于评述参见FEBS Letters 354(1994)pp.1-6)，其中一类是neprilysin(NEP)样锌金属蛋白酶(FASEB Journal，Vol 11，1997pp.355-384)。NEP类包括至少7种酶，它们在结构上是彼此相关的(见后)。它们通常是与膜结合的，具有很大的羧基末端细胞外结构域、很短的膜跨越区和很短的氨基末端细胞内结构域。该家族的已知成员是neprilysin(也称NEP、CD10、CALLA、脑啡肽酶或EC3.4.24.11)、内皮素转化酶(ECE-1和ECE-2)、PEX、KELL、X转化酶/损伤诱导的神经内肽酶(XCE/DINE)和一种在啮齿动物中鉴定的酶，称为可溶性所分泌的内肽酶/neprilysin II(SEP/NEPII；Ghaddar，G等，Biochem Journal，Vol347，2000，pp.419-429；Ikeda，K等，Journal BiologicalChemistry，Vol 274，1999，pp.32469-32477；Tanja，O等，BiochemBiophys Research Communicat ion，Vol 271，2000，pp.565-570；国际专利申请WO 99/53077)。这类成员的功能被认为与肽能发信号有关。这是一种发生在大多数生物体中的过程，包括人，其中肽分子被用作“信使”，引起生理应答。这通常牵涉特定细胞产生和释放肽信使，有时作为无活性的前体，被蛋白酶裂解后变为有活性。肽的活性形式然后与另一个细胞表面上的特异性受体结合，在那里引起应答。肽然后被另一种蛋白酶的降解作用所灭活。
NEPII很可能是SEP的大鼠等价物，SEP是一种小鼠的酶，因为它们共享91％的氨基酸同一性。它们在氨基酸序列上是这类最接近NEP的成员，二者都有54％与人NEP的同一性。二者的mRNA在睾丸中都是非常丰富的，在广泛的其他组织中也可以被低水平地检测到。在大鼠NEPII的情况下，还已在大脑和垂体中发现较高水平的mRNA。当在哺乳动物细胞中通过重组方式产生时，在生长介质中都可以发现小鼠SEP和大鼠NEPII。这提示了它们可能是所分泌的蛋白酶，能够循环，因此能够在体内其他部位裂解肽。小鼠SEP和大鼠NEPII象该类有些其他成员一样，例如ECE-1，表现接合变异。在小鼠SEP和大鼠NEPII的情况下，这种接合变异导致同种型，伴有参与膜定位和分泌的序列改变。这一点的生理学意义是不清楚的，但是有可能存在这些酶的与膜结合的、循环的和细胞内的形式。小鼠SEP已经显示能够裂解一些重要的生物肽，包括脑啡肽、内皮素、大内皮素、缓激肽和P物质。因此象NEP一样，它具有相当宽泛的底物特异性，可以在不同的组织中具有若干生理功能。
这类NEP中的酶象其他金属蛋白酶一样，已经显示可被药物样小分子(例如噻吩烷和膦酰二肽)所抑制。这一点与一些NEP样酶成员在调节肽能发信号中的生理功能的新兴性质一起使它们成为药物干预的诱人目标。
SEP序列列在WO 99/53077、EP 1069188和WO 00/47750以及图7-9中(SEQ ID No.4-6)。
本文例如关于测定法所提到的SEP序列包括对下列一种或多种序列的引用：WO99/53077、EP 1069188或WO00/47750或者SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6，或其变体、片段、同源物、类似物或衍生物。
SEQ ID No.4和SEQ ID No.5各自公开了编码人SEP的核苷酸序列(cDNA)。SEQ ID No.5包括5’与3’部分载体序列。SEQ ID No.6显示人SEP蛋白。
任意具体SEPi的适合性都容易这样确定，利用文献方法评价它的效力和选择性，然后按照标准的药学实践评价它的毒性、吸收、代谢、药动学等。
一种可以用于检测候选SEP抑制剂的SEP测定法是荧光共振能量转移(FRET)测定法。最优选地，所述被标记的底物肽是若丹明绿-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSYTM-7)-βAla-NH2。
SEP FRET测定法
SEP FRET测定法基于由Carvalho等开发的用于NEP的测定法(Carvalho等，Annal.Biochem.237，pp.167-173(1996))。SEPFRET测定法采用相似的分子内猝灭的荧光肽底物，但是采用新颖的荧光供体/受体染剂的组合，具体为若丹明绿(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)和QSYTM-7(以下缩写为QSY-7或QSY7；MolecularProbes，Inc.)。
SEP的内肽酶活性是这样测量的，监测它对合成的肽底物若丹明绿-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY7)-βAla-NH2的蛋白水解能力。
为该测定法所选择的两种荧光团(荧光染剂)具有重叠的发射与吸收光谱，因此适合于能量转移。若丹明绿充当供体，当在485nm下被激发时，在535nm下产生发光(荧光)，继而激发QSY7(发生FRET)。QSY7是荧光静息的，因此在535nm以上不发光，也就观察不到信号(若丹明绿发光被猝灭了)。
在肽底物Arg-Val肽键处被SEP裂解(选择性水解)时，若丹明绿和QSY7部分分开，并在485nm激发，不再发生能量转移。结果，对若丹明绿在535nm观察到荧光增加。
合成的肽底物若丹明绿-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY7)-βAla-NH2的制备
肽的装配是这样完成的，在0.25mmol FMOC-PAL-PEG-PS树脂上，按照固相肽合成方案，并对厂商(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)提供的9-芴基甲氧羰基(FMOC)类合成周期加以改进。我们的改进的周期利用20％哌啶/N-甲基吡咯烷酮(NMP)的2×5分钟处理去保护氨基末端；通过301nm下的UV吸收监测其效率，使少量去保护溶液试样穿过UV吸收检测器。在单独的药筒内，将新来的氨基酸用各为0.9当量的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)/1-羟基苯并三唑(HOBt)的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液活化。加入2当量二异丙基乙胺(DIEA)。同时，将树脂用NMP洗涤，以除去去保护副产物。从树脂中排出洗涤溶液，将被活化的氨基酸酯转移至树脂，搅拌20分钟，与氨基末端偶联。排出残留的偶联溶液，将树脂再次用NMP洗涤。为了确保肽的同质性，向树脂加入0.4M乙酸酐/0.04MHOBt的NMP溶液和12mmol DIEA，以乙酰化任意可能未反应的部位。最后，将树脂用NMP洗涤，排干，然后用二氯甲烷/2，2，2-三氟乙醇的1∶1混合物洗涤，排干。这代表肽合成的-个周期。将完成了的合成树脂裂解，利用K试剂(King，D.S.等，(1990)，Int.J.Pep.Prot.Res.，36，pp.255-66)去保护，得到251mg(100％)粗肽CP1。电子喷射质谱法(ESMS)(m/z计算值(calc.)＝977.21(MH+平均)，obs.＝977.47)。
QSY-7与半胱氨酸的连接：
将50mg(51μmol)粗CP1溶于含有45mg(52.4μmol)QSY-7马来酰亚胺的10％DIEA/DMF溶液。10分钟后，经由HPLC-MS分析判断反应不完全，加入另外30mg(30.7μmol)粗肽。另外30分钟后，经由HPLC-MS判断反应完全，所有起始试剂均被消耗。通过C18制备型HPLC色谱法分离产物，收集根据矩阵辅助性激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)表现所需产物分子量的部分，冻干，得到73.7mg(50％)紫色粉末CP2，ESMS(m/z calc.＝1797.86(MH+单同位素)，obs.＝1797.86)。
双(三氟乙酰基)若丹明绿与氨基末端的连接：
将73.7mg(41μmol)CP2溶于含有35mg(52.8μmol)若丹明绿羧酸、三氟乙酰胺、琥珀酰亚氨基酯(5(6)-CR 110 TFA，SE)*混合异构体*的2％DIEA/DMF溶液。2小时后，经由HPLC-MS分析判断反应完全。经由C4制备型HPLC色谱法分离产物，收集表现所需产物分子量(MALDI-MS)的部分，冻干，得到71.4mg(74％)紫色粉末CP3，ESMS(m/zcalc.＝2345.92(MH+单同位素)，obs.＝2345.47)
从若丹明绿除去三氟乙酰基保护基团
将71.4mg(30.4μmol)CP3溶于10ml4∶1 CH3CN/H2O。向其中加入200mg(1886μmol)Na2CO3。涡旋16小时后，从不溶物滗出上清液。将反应容器用1ml DMSO冲洗；将其与上清液合并，经由C4制备型HPLC色谱法分离产物。合并表现所需产物分子量(MALDI-MS)的部分，冻干，得到64mg(98％)紫色粉末CP4，ESMS(m/z calc.＝2155.54(MH+平均)，obs.＝2155.27)。CP4是所需的合成肽底物若丹明绿-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY7)-βAla-NH2。
材料
所有试剂均购买所能买到的商品纯度最高者，无需进一步精制即可使用。所有用于肽合成的试剂均购自Applied Biosystems，FosterCity，CA，USA，下列例外：QSYTM-7马来酰亚胺(目录编号Q-10257)和若丹明绿羧酸、三氟乙酰胺、琥珀酰亚氨基酯(5(6)-CR110 TFA，SE)*混合酯*(目录编号R-6112)购自Molecular Probes，Inc.，OR，USA；FMOC-PAL-PEG-PS购自Perseptive Biosystems，MA，USA(目录编号GEN913384)；FMOC-B-丙氨酸和FMOC-d-苯基丙氨酸购自Novabiochem，CA，USA；FMOC-Arg(Pbf)-OH购自AnaSpec，Inc.，CA，USA；2，2，2-三氟乙醇购自Aldrich，WI，USA。碳酸钠购自Fisher，PA，USA。
制备型HPLC色谱法是这样进行的，在Vydac(CA，USA)C18(目录编号218TP1022)或C4(目录编号214TP1022)柱上，流速10ml/min，洗脱的线性梯度历经30分钟从0％至80％(A＝5％CH3CN/0.1％TFA/94.9％H2O，B＝100％CH3CN)，组织原则每30秒收集一份。分析型HPLC-MS是这样进行的，利用Micromass(Manchester，UK)LCT质谱仪(基于外部校正标准的质量)，连接Waters(MA，USA)2690 HPLC入口和Waters 996光电二极管阵列检测器，在Vydac C4(目录编号214TP5415)柱上进行色谱法，洗脱的线性梯度历经30分钟从0％至80％(A＝5％CH3CN/0.1％TFA/94.9％H2O，B＝100％CH3CN)，流速1ml/min。利用Micromass转化软件从多重带电观测离子计算去卷积的分子量。MALDI-MS是这样获得的，在Perseptive Biosystems Voyager-DE线性质谱仪上，使用α氰基4-羟基肉桂酸基质(Hewlett Packard，CA，USA)，所报道的质量基于外部校正。
工艺(包括化学结构)
CP4(＝合成的肽底物若丹明绿-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSYTM-7)-βAla-NH2)是这样合成的，在固相肽合成流程中引入关键的中间体CP3。
流程1：
Figure A0182055600561
总之，利用为收率和时间进行过优化的固相肽合成方案加工FMOC-PAL-PEG树脂。这些周期(细节见上)包含2个FMOC去保护、洗涤、一次HBTU活化氨基酸的偶联、洗涤、加帽，最后先用NMP、再用1∶1三氟乙醇/二氯甲烷洗涤。这些洗涤有助于松弛树脂的二级结构，以便彻底的去保护和在下面的周期中有效的偶联下一个新来的氨基酸。
CP2是按照流程2合成的(细节见上)：
在这种QSY-7标记物的结合之后，按照流程3加入第二荧光团若丹明绿作为双(三氟乙酰基)保护的染剂：
Figure A0182055600581
最后，用Na2CO3处理除去三氟乙酰基，得到所需底物CP4：
测定法
用于该测定法的试剂首先是如下制备的。
底物溶液是这样制备的，将底物若丹明绿-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY7)-βAla-NH2重新悬浮在50mM HEPES缓冲液pH7.4(Sigma，UK)中，浓度为2μM，然后加入1片无EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche Diagnostics，UK)每25ml。
将上述SEP酶试样融化，然后稀释在50mM HEPES pH7.4中，稀释比例因每批酶而异，以便50μl含有足以在测定期间转化大约30％底物为产物的酶。
制备4％DMSO溶液，其中包含4ml DMSO加96ml 50mM HEPES pH7.4。
产物溶液是这样制备的，向250μl酶溶液加250μl 4％DMSO溶液加入500μl底物溶液，在37℃下培育16小时。
测定是如下设置的。
在黑色96孔微量滴定板中，向50μl 4％DMSO溶液加入100μl底物溶液。还设置相似的非特异性背景空白，其中50μl 4％DMSO溶液另外含有40μM膦酰二肽。向测定组和空白组加入50μl酶溶液，将96孔平板置于BMG galaxy荧光读数器中，利用Biolise软件包进行操作(BMG Lab technologies，Offenberg，Germany)。
在荧光读数器中，将平板在37℃下培育1小时，每3分钟进行一次荧光测量(激发(Ex)485nm/发射(Em)535nm)。SEP的蛋白水解活性相当于样本荧光增加的速率—非特异性背景空白的荧光单位的增加速率。在这种计算中使用由软件对四种连续读数所计算的最大速度量度(MaxV)。
采用来自等同的微量滴定平板小孔中的200μl产物的荧光量度。如果需要的话，该树脂以及从SEP测定法60min时间终点测量的荧光单位一起用于计算在1小时培育期间被蛋白水解的底物百分率(％)，或者用于转化所测量的荧光增加速率为其他有用的单位，例如被蛋白水解的底物ng/min/ml酶。
遵循Fundamentals of Enzyme Kinetics by Athel CornishBowden，1979，published by Butterworths所述的标准原理，该测定法用于计算酶动力学参数，例如Vmax和Km。
利用SEP测定法测定SEP抑制剂的抑制参数
为了测定SEP抑制剂(例如膦酰二肽)的IC50，如上所述利用一定范围的供试抑制剂浓度进行多个SEP测定，抑制剂被包括在50μl DMSO溶液中(将抑制剂的10mM 100％DMSO储备溶液用4％DMSO/50mM HEPESpH7.4适当稀释)。利用适合的适配计算机程序的标准图表，根据抑制剂浓度对数和MaxV(或抑制％或活性％)作S形剂量响应曲线。计算IC50，为导致50％最大抑制的抑制剂浓度。通常关于给定的IC50测定，使用至少10个半数对数单位增量不同的抑制剂浓度的剂量范围。
例如遵循Fundamentals of Enzyme Kinetics by Athel CornishBowden，1979，published by Butterworths所述的标准酶学原理，SEP测定法用于测定Ki和抑制方式(也就是抑制作用是否是竞争性的、混合型的、非竞争性的等)。
辅助性药物——中级电导钙活化钾(IKCa)通道调节剂
术语“钙活化钾通道”包括大电导钙活化(BKCa)通道(也称为MaxiK+通道)、小电导钙活化(SKCa)通道和中级电导钙活化(IKCa)通道，有时称为hSK4通道或IK通道或hIK1通道。
目前，存在三种钙活化钾通道亚型。它们是大电导钙活化(BKCa)通道、中级电导钙活化(IKCa)通道和小电导钙活化(SKCa)通道。这些通道是以在一次开放期间穿过通道孔的离子电导程度为特征的(Fan等，1995)。作为区别，大电导(BK)通道被内部钙离子和膜电位的协同作用所关闭，单位电导为100至220微微西门子(pS)；而中级电导(IK)和小电导(SK)通道仅被内部钙离子所关闭。作为进一步区别，IKCa和SKCa通道的单位电导分别为20至85pS和2至20pS，比BK通道更敏感于钙。每种类型的通道显示不同的药理学(Ishii等，1997)。
本文所用的术语“中级电导钙活化(IKCa)通道”表示这样一种钙活化钾通道亚型，它是以在一次开放期间穿过通道孔的离子电导程度为特征的(Fan等，1995)。与大电导(BK)通道相反，后者被内部钙离子和膜电位的协同作用所关闭，单位电导为100至220微微西门子(pS)，中级电导(IK)通道仅被内部钙离子所关闭，单位电导为20至85pS，比BK通道更敏感于钙。
本文所用的术语“调节IKCa通道活性”表示任意下列一种或多种：提高、增加、增强、加剧、去极化或上调IKCa通道活性，或者增加IKCa通道的Ca2+敏感性——也就是说，引发IKCa通道活性/开放所需的钙浓度降低了。IKCa通道的直接或间接开放可以增加/增强IKCa通道的Ca2+敏感性增加。这种IKCa通道的Ca2+敏感性增加可以导致IKCa通道特征的改变，以便以这样一种方式影响IKCa通道的开放，IKCa通道更早地开放，和/或在更低的细胞内钙浓度下开放，和/或开放更长的时间，和/或开放次数的概率增加了。
术语“调节IKCa通道活性”还包括对海绵体平滑肌组织中的IKCa通道表达的上调作用，例如借助增加IKCa通道表达的药物和/或药物对这样一种物质的作用，该物质减少和/或拮抗IKCa通道活性的调节和/或IKCa通道的表达。
举例来说，调节剂可以具有式(I)结构：
Figure A0182055600621
其中
R1是H或适合的取代基，例如可以可选地被取代的烷基；
R2是H或适合的取代基，优选H；
R3代表一个或多个适合的可选的取代基。
作为替代选择，调节剂可以具有式(1)结构：
Figure A0182055600622
其中：
X选自NR、O或S，
其中R是H或烷基(优选低级烷基，更优选C1-6烷基)；
R1是烷基(优选低级烷基，更优选C1-6烷基)；
R2选自H、卤化物、烷基(优选低级烷基，更优选C1-6烷基)、烷氧基(优选低级烷氧基，更优选C1-6烷氧基)；
R3选自H、卤化物、烷基(优选低级烷基，更优选C1-6烷基)、烷氧基(优选低级烷氧基，更优选C1-6烷氧基)；
R4选自H、卤化物、烷基(优选低级烷基，更优选C1-6烷基)、烷氧基(优选低级烷氧基，更优选C1-6烷氧基)；
R5选自H、卤化物、烷基(优选低级烷基，更优选C1-6烷基)、烷氧基(优选低级烷氧基，更优选C1-6烷氧基)。
式(1)化合物——其中X＝O(式(1a))或X＝S(式(1b))——可以在碱性条件下通过各自对应的母体杂环(2a)或(2b)的N-烷基化作用加以制备，后者继而可以通过将各自对应的氨基苯酚(3a)或氨基苯硫酚(3b)用光气或另一种适合的羰基化剂处理加以制备。氨基苯酚和氨基苯硫酚通常是这样制备的，从各自对应的硝基苯酚(4a)或硝基苯硫酚(4b)开始，进行还原。很多取代的硝基苯酚(4a)和硝基苯硫酚(4b)是商业上可得到的。
Figure A0182055600631
其中X＝NH的式1化合物(式(1c))可以通过改进上述流程加以制备。在这点上，在硝基还原之前进行各自对应的硝基苯胺(5c)的烷基化作用，得到苯二胺(3c，X＝NH)，再如上所述通过羰基化作用环化为1c。
Figure A0182055600641
优选地，调节剂是EBIO(1-乙基-2-苯并咪唑啉酮)或其模拟物或其任意的药学上可接受的盐。EBIO的结构是：
关于有些应用，药物的IC50值优选地小于300nM、250nM、200nM、150nM，优选地小于约100nM，优选地小于约75nM，优选地小于约50nM，优选地小于约25nM，优选地小于约20nM，优选地小于约15nM，优选地小于约10nM，优选地小于约5nM。
关于有些应用，药物优选地对所需靶具有至少约25、50、75、100倍的选择性，优选地对所需靶具有至少约150倍的选择性，优选地对所需靶具有至少约200倍的选择性，优选地对所需靶具有至少约250倍的选择性，优选地对所需靶具有至少约300倍的选择性，优选地对所需靶具有至少约350倍的选择性。
海绵体
本文所用的术语“海绵体”尤其表示见于阴茎中的组织物。在这点上，阴茎体由三个圆柱形组织物组成，各自被称为白膜的纤维组织所围绕。成对的背外侧物称为阴茎海绵体(corpora cavernosa penis)(体＝主体；海绵体＝中空的)；较小的中腹侧物是阴茎海绵体(corpusspongiosum penis)，含有海绵状尿道，起到在射精期间保持海绵状尿道开放的功能。所有三种组织物被筋膜和皮肤包裹，由充满血窦的勃起组织组成。海绵体包含平滑肌细胞。
治疗
不言而喻的是，本文涉及治疗的所有称谓包括治愈、减轻和预防性处置的一种或多种。
性欲刺激
本发明还涵盖如前文所定义的经由NPYi、优选NPY Y1i(可行的话，和PDEi、优选PDE5i)在性欲刺激之前和/或期间给药的用途。这里，术语“性欲刺激”可以与术语“性欲激发”是同义的。本发明的这个方面是有利的，因为它提供全身的(生理学)选择性。自然的级联仅发生在生殖器，而非其他位置——例如心脏等。因此，有可能经由根据本发明的MED治疗实现对生殖器的选择性效果。
因而，按照本发明，非常可取的是在有些阶段存在性欲刺激步骤。我们已经发现该步骤能够提供全身选择性。这里，“性欲刺激”可以是视觉刺激、身体刺激、听觉刺激或思维刺激的一种或多种。
药物
用于治疗男性性功能障碍、具体为MED的药物可以是根据本发明的任意适合能够充当NPYi、优选NPY Y1i的药物，酌情为NPYi、优选NPY Y1i与PDEi、优选PDE5i的组合。本文所用的术语“药物”包括任意能够抑制NPY和/或NPY Y1受体的实体。
这类药物(也就是如上所定义的药物)可以是氨基酸序列或其化学衍生物。该物质甚至可以是有机化合物或其他化学品。药物甚至可以是核苷酸序列——它可以是有义序列或反义序列。药物甚至可以是抗体。
因而，术语“药物”包括但不限于可以任意适合来源得到或产生的化合物，无论天然与否。
药物可以是被设计出来的或从化合物文库得到的，可以包含肽以及其他化合物，例如小的有机分子，例如前导化合物。
举例来说，药物可以是天然物质、生物大分子、或来自生物材料的提取物，例如细菌、真菌、或动物(具体为哺乳动物)细胞或组织，有机或无机分子、合成药物、半合成药物、结构或功能模拟物、肽、拟肽、派生药物、从全蛋白质裂解的肽、或通过合成手段合成的肽(例如利用肽合成仪或者借助重组技术或其组合)、重组药物、抗体、天然或非天然药物、融合蛋白或其等价物和突变体、衍生物或其组合。
下面列举ACE测定法。关于有些应用(例如对具体的个体)，这类药物(也就是还显示ACE抑制作用的那些)可能不适合于口服给药。优选地，根据本发明的NPY或NPY Y1抑制剂没有或者基本上没有针对ACE的活性。
ECE测定法是本领域熟知的。
本文所用的术语“药物”可以是单一的实体或者可以是药物的组合。
如果药物是一种有机化合物，那么关于有些应用——例如如果药物是NPYi或NPY Y1i，该有机化合物通常可以包含两种或多种连接着的烃基。关于有些应用，药物优选地包含至少两个环状基团——可选地其中一个环状基团可以是稠合环结构。关于有些应用，至少一个环状基团是杂环基。关于有些应用，该杂环基优选地在环中包含至少一个N。这类化合物的实例列在本文中。
如果药物是一种有机化合物，那么关于有些应用——例如如果药物是PDE5i，该有机化合物通常可以包含两种或多种连接着的烃基。关于有些应用，药物优选地包含至少两个环状基团——可选地其中一个环状基团可以是稠合环结构。关于有些应用，至少一个环状基团是杂环基。关于有些应用，该杂环基优选地在环中包含至少一个N。这类化合物的实例列在本文PDE5小节中。
药物可以含有卤代基团。这里，“卤代”表示氟、氯、溴或碘。
药物可以含有一个或多个烷基、烷氧基、链烯基、亚烷基和亚烯基——它们可以是不分支的或分支的链。
药学上可接受的盐
药物可以是药学上可接受的盐的形式和/或可以作为药学上可接受的盐的形式给药——例如酸加成盐或碱盐——或其溶剂化物，包括其水合物。关于适合的盐的评述，参见Berge等，J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19。
通常，药学上可接受的盐可以容易地酌情利用所需的酸或碱加以制备。盐可以从溶液中沉淀出来，过滤收集，或者通过蒸发溶剂回收。
适合的酸加成盐是从构成无毒盐的酸生成的，实例是盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、糖质酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐。
适合的碱盐是从构成无毒盐的碱生成的，实例是钠、钾、铝、钙、镁、锌和二乙醇胺的盐。
多晶型/不对称碳
药物可以存在多晶型。
药物可以含有一个或多个不对称的碳原子，因此存在两种或多种立体异构型。若药物含有链烯基或亚烯基，还可能存在顺式(E)和反式(Z)异构。本发明包括药物的单个立体异构体，酌情和其单个互变异构型及其混合物。
非对映异构体或顺反式异构体的分离可以通过常规技术实现，例如药物或其适合的盐或衍生物的立体异构体混合物的分布结晶、色谱或H.P.L.C.。药物的单个对映体还可以从对应的光学纯中间体制备，或者通过拆分制备，例如使用适合的手性载体进行对应的外消旋物的H.P.L.C.，或者通过非对映异构盐的分布结晶加以制备，该盐是通过对应的外消旋物与适合的旋光活性酸或碱的反应而生成的，视情况而定。
同位素变例
本发明还包括该药物或其药学上可接受的盐的所有适合的同位素变例。本发明的药物或其药学上可接受的盐的同位素变例被定义为其中至少一个原子被原子数相同但原子质量不同于自然界常见的原子质量的原子所代替。可以结合在药物及其药学上可接受的盐中的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl。药物及其药学上可接受的盐的某些同位素变例——例如其中结合有3H或14C等放射性同位素的那些——可用于药物和/或底物组织分布研究。氚、即3H和碳-14、即14C同位素是特别优选的，因为它们容易制备和检测。进而，被氘、即2H等同位素取代因代谢稳定性更高可以提供某些治疗上的优点，例如体内半衰期增加或剂量需求减少，因此在有些情况下可能是优选的。药物及其药学上可接受的盐的同位素变例一般可以通过常规工艺制备，使用适合试剂的适当同位素变例。
前体药物
将为本领域技术人员所领会到的是，药物可以从前体药物衍生而来。前体药物的实例包括这样的实体，它们具有某些被保护的基团，并且本身可能不具有药理活性，但是在某些情形中可以被给药(例如口服或肠胃外)，之后在体内被代谢生成有药理活性的药物。
前体部分
将被进一步领会到的是，已知为“前体部分”的部分——例如“Design of Prodrugs”，H.Bundgaard，Elsevier，1985所述(其公开内容引用在此作为参考)——可以被置于药物的适当的官能度上。这类前体药物也包括在本发明的范围内。
抑制剂/拮抗剂
本文涉及NPYi或NPY Y1i(可行的话，和PDEi或PDE5i化合物和其他辅助性活性药物)所用的术语抑制剂被视为与术语拮抗剂是可互换的。
本文所用的术语“拮抗剂”表示任意减少另一种药物或靶的作用的药物。拮抗作用可以来自被拮抗物质的组合(化学拮抗作用)或通过不同的靶产生相反的效果(功能拮抗作用或生理拮抗作用)，或者是对联系靶活化作用与所观察到的效果的中间体结合部位的竞争作用的结果(间接拮抗作用)。
进而，措辞“增强内源性勃起过程”被视为与措辞“上调内源性勃起过程”是可互换的。
药物组合物
本发明还提供药物组合物，包含治疗有效量的本发明药物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
药物组合物可以在人类医学和兽医学中用于人或动物，通常将包含任意一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。治疗用途可接受的载体或稀释剂是药学领域熟知的，例如描述在Remington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)中。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预定给药途径和标准药学实践。药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的——或者除此以外的——任意适合的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。
在药物组合物中可以包含防腐剂、稳定剂、色素、甚至矫味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
根据不同的释放系统，可能存在不同的组合物/制剂需求。举例来说，本发明的药物组合物可以被配制成利用微型泵或者通过粘膜途径释放，例如用于吸入的鼻用喷雾剂或气雾剂或可摄取的溶液，或者通过肠胃外途径释放，其中组合物被配制成可注射的形式，例如通过静脉内、肌内或皮下途径释放。作为替代选择，制剂可以被设计成通过两种途径释放。
若药物有待通过胃肠粘膜释放，它应当能够在经过胃肠道期间保持稳定；例如，它应当耐受蛋白水解性降解作用、在酸性pH下稳定和耐受胆汁的清洁作用。
在适当时候，药物组合物可以通过吸入途径给药，剂型为栓剂或阴道栓剂，通常为洗剂、溶液、霜剂、软膏剂或撒布粉剂、皮肤贴剂，通过口服途径给药，剂型为片剂——含有淀粉或乳糖等赋形剂、胶囊剂或卵状体剂——单独或与赋形剂混合、或者酏剂、溶液或悬液——含有矫味剂或着色剂，或者它们可以被肠胃外注射，例如静脉内、肌内或皮下。关于肠胃外给药，组合物最好使用无菌水溶液的形式，其中可以含有其他物质，例如足量的盐或单糖，使溶液与血液等渗。关于颊部或舌下给药，组合物可以以片剂或锭剂的形式给药，它们可以按常规方式配制。
关于有些实施方式，本发明的药物还可以与环糊精结合使用。已知环糊精与药物分子形成包埋和非包埋的复合体。药物-环糊精复合体的形成可以改变药物分子的溶解度、溶解速率、生物利用度和/或稳定性。药物-环糊精复合体一般可用于大多数剂型和给药途径。作为与药物直接复合的替代选择，环糊精还可以用作辅助性添加剂，例如载体、稀释剂或增溶剂。α-、β-与γ-环糊精是最常用的，适合的实例描述在WO-A-91/11172、WO-A-94/02518和WO-A-98/55148中。
在优选的实施方式中，本发明的药物是被全身释放的(例如口服、颊部、舌下)，更优选口服。
因此，药物优选地是适合于口服释放的形式。
关于有些实施方式，药物优选地在使用时除了外周作用于生殖器以外，还作用于中枢神经系统。
关于有些实施方式，药物优选地在使用时除了对位于生殖器中的受体以外没有外周作用，优选与海绵体有关的那些受体。
给药
术语“给药”包括通过病毒或非病毒技术释放。病毒释放机理包括但不限于腺病毒载体、腺相关性病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体。非病毒释放机理包括脂质介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染剂、阳离子表面两亲物(CFA)及其组合。
本发明的药物可以被单独给药，但是一般将作为药物组合物给药，例如药物是与适合的药物赋形剂、稀释剂或载体混合的，后者是根据预定给药途径和标准药学实践加以选择的。
例如，药物的给药(例如口服或局部)剂型可以是片剂、胶囊剂、卵状体剂、酏剂、溶液或悬液，其中可以含有矫味剂或着色剂，用于立即、延迟、改性、持续、脉冲或控制释放的应用。
片剂可以含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、枸橼酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；和造粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山萮酸酯和滑石。
还可以采用相似类型的固体组合物作为明胶胶囊剂中的填充剂。在这一点上优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子聚乙二醇。关于水悬液和/或酏剂，药物可以与各种甜味剂或矫味剂、着色物或色素混合，还有乳化剂和/或悬浮剂，以及稀释剂，例如水、乙醇、丙二醇和甘油，及其组合。
给药(释放)途径包括但不限于下列一种或多种：
口服(例如片剂、胶囊剂或可摄取的溶液)、局部、粘膜(例如用于吸入的鼻用喷雾剂或气雾剂)、鼻、肠胃外(例如可注射的形式)、胃肠、脊柱内、腹膜内、肌内、静脉内、子宫内、眼内、真皮内、颅内、气管内、阴道内、脑室内、大脑内、皮下、眼(包括玻璃体内或房内)、透皮、直肠、颊、阴茎、阴道、硬膜外、舌下。
不言而喻的是，不是所有的药物都需要通过相同途径给药。同样，如果组合物包含一种以上的活性组分，那么这些组分可以通过不同途径给药。如果本发明的药物是肠胃外给药的，那么这类给药的实例包括下列一种或多种：静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内或皮下；和/或利用输注技术。
关于肠胃外给药，药物最好使用无菌水溶液的形式，其中可以含有其他物质，例如足量的盐或葡萄糖，使溶液与血液等渗。如果必要的话，水溶液应当被适当缓冲(优选至pH3至9)。借助本领域技术人员熟知的标准药学技术，容易在无菌条件下制备适合的肠胃外制剂。
如上所述，本发明的药物可以被鼻内给药或者通过吸入给药，适宜以干粉吸入剂或气雾剂的形式从加压容器、泵、喷雾器或雾化器中释放出来，释放利用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、氟代烷烃，例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134ATM)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EATM)，二氧化碳或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，借助计量释放的阀门可以确定剂量单位。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性化合物的溶液或悬液，例如使用乙醇与推进剂的混合物作为溶剂，其中可以另外含有润滑剂，例如脱水山梨醇三油酸酯。用在吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可以被配制成含有药物与适合的粉末基质、例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
作为替代选择，本发明的药物可以以栓剂或阴道栓剂的形式给药，或者它可以以凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、霜剂、软膏剂或撒布粉剂的形式局部用药。本发明的药物还可以被经皮或透皮给药，例如利用皮肤贴剂。它们还可以通过肺或直肠途径给药。它们还可以通过眼部途径给药。关于眼用，化合物可以被配制成在等渗的、pH调节的、无菌盐水中的微粉化悬液或者优选在等渗的、pH调节的、无菌盐水中的溶液，可选地与防腐剂的组合，例如苯扎氯铵。作为替代选择，它们可以被配制成软膏剂，例如利用凡士林。
关于皮肤局部用药，本发明的药物可以被配制成适合的软膏剂，其中含有悬浮或溶解在下列一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。作为替代选择，它可以被配制成适合的洗剂或霜剂，悬浮或溶解在下列一种或多种的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
本发明的组合物可以通过直接注射给药。
关于有些应用，药物优选地是口服给药的。
关于有些应用，药物优选地是局部给药的。
剂量水平
通常，医师将决定最适合于个体受治疗者的实际剂量。关于任意特定个体的具体剂量水平和给药频率可以各不相同，将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药的方式和时间、排泄的速率、药物组合、特定疾病的严重性和接受疗法的个体。本发明的药物和/或药物组合物的给药方案可以按照每天1至10次，例如每天一次或两次。
关于对人口服和肠胃外给药，药物的每日剂量水平可以是单一的或分次的剂量。
根据需要，药物的给药剂量可以从0.01至30mg/kg体重，例如0.1至10mg/kg，更优选0.1至1mg/kg体重。本文提到的剂量当然是平均情况的例证。当然可以存在个别情形，其中更高或更低的剂量范围也是值得的。
通常，每日口服剂量例如可以在20-1000mg之间，例如优选50-300mg。
制剂
本发明的药物可以被配制成药物组合物，例如利用本领域已知的技术，与一种或多种适合的载体、稀释剂或赋形剂混合。
下面列举一些制剂的非限制性实例。
制剂1：使用下列成分制备片剂：
                                  重量(mg)
               药物               250
               微晶纤维素         400
               发烟二氧化硅       10
硬脂酸                              5
总计                                665
将各组分掺合，压制成片，每片重665mg。
制剂2：如下可以制备静脉内制剂：
                药物                100mg
                等渗盐水            1000ml
个体
本文所用的术语“个体”表示脊椎动物，具体为哺乳动物的成员。该术语包括但不限于家养动物、竞技动物、灵长类和人类。
生物利用度
优选地，本发明的化合物(和组合)是口服生物可利用的。口服生物利用度表示到达全身循环的口服给药的药物比例。决定药物的口服生物利用度的因素是溶解性、膜透过性和代谢稳定性。通常，利用先体外后体内的筛选级联技术测定口服生物利用度。
溶解性即胃肠道(GIT)水性成分对药物的增溶作用，在模拟GIT的适当pH下进行体外溶解度实验可以预测之。优选地，本发明的化合物具有50mcg/ml的最小溶解度。溶解度可以通过本领域已知的标准工艺加以测定，例如Adv.Drug Deliv.Rev.23，3-25，1997所述。
膜透过性表示化合物的GIT细胞通过性。亲脂性是预测膜透过性的关键性质，利用有机溶剂和缓冲液进行体外Log D7.4测量定义之。优选地，本发明的化合物具有-2至+4的Log D7.4，更优选-1至+2。log D可以通过本领域已知的标准工艺加以测定，例如J.Pharm.Pharmacol.1990，42：144所述。
单细胞层测定法例如CaCO2法，基本上也能预测在流出转运蛋白、例如p-糖蛋白的存在下的可取的膜透过性，即所谓的caco-2 flux。优选地，本发明的化合物具有大于2×10-6cms-1的caco-2 flux，更优选大于5×10-6cms-1。caco flux值可以通过本领域已知的标准工艺加以测定，例如J.Pharm.Sci.1990，79，595-600所述。
代谢稳定性涉及GIT或肝在吸收过程期间代谢化合物的能力：首过效应。测定系统例如微粒体、肝细胞等，有代谢倾向的预兆。优选地，实施例化合物在与肝提取物相称的测定系统中显示小于0.5的代谢稳定性。测定系统实例和数据处理描述在Curr.Opin.Drug Disc.Devel.，201，4，36-44；Drug Met.Disp.，2000，28，1518-1523中。
由于上述过程的相互作用，通过动物体内实验能够获得药物对人将是口服生物可利用的进一步证实。绝对生物利用度是在这些研究中测定的，通过口服途径将化合物单独或混合给药。关于绝对测定(吸收％)，还采用静脉内途径。动物口服生物利用度评估的实例可以参见Drug Met.Disp.，2001，29，82-87；J.Med.Chem.，1997，40，827-829；DrugMet.Disp.，1999，27，221-226。
化学合成方法
通常，适用于本发明的NPYi/NPY Y1i(和/或PDEi/PDE5i，可行的话)将通过化学合成技术制备。
药物或靶或其变体、同源物、衍生物、片段或模拟物可以利用化学方法制备，以合成完整的药物或其一部分。例如，肽可以通过固相技术合成，从树脂裂解，经过制备型高效液相色谱法纯化(Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles，WH Freeman andCo，New York NY)。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序加以确认(例如Edman降解工艺；Creighton，出处同上)。
药物或其变体、同源物、衍生物、片段或模拟物的直接合成可以利用各种固相技术进行(Roberge JY等(1995)Science 269：202-204)，自动合成例如可以利用ABI 431A肽合成仪实现(Perkin Elmer)，按照由厂商提供的指导。另外，包含该药物或其任意部分的氨基酸序列可以在直接合成期间被改变，和/或可以利用化学方法与来自其他亚单位的序列或其任意部分组合得到变异的药物或靶，例如变异的NPY或NPYY1。
在可供替代的发明实施方式中，药物靶或其变体、同源物、衍生物、片段或模拟物的编码序列可以利用本领域熟知的化学方法加以完整地合成或合成其一部分(Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23，Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
模拟物
本文所用的术语“模拟物”涉及任意化学品，它包括但不限于肽、多肽、抗体或其他有机化学品，它对靶具有与参照药物相同性质的活性或效果。也就是说模拟物可以是已知药物的功能等价物。
化学衍生物
本文所用的术语“衍生”或“被衍生”包括药物的化学修饰。这类化学修饰的例证将是氢被卤代基团、烷基、酰基或氨基所代替。
化学修饰
在本发明的一种实施方式中，药物可以是经过化学修饰的药物。
药物的化学修饰能够增强或减少药物与药物之间的氢键相互作用、电荷相互作用、疏水性相互作用、范德华相互作用或偶极相互作用。
一方面，所鉴定的药物可以充当模型(例如模板)，用于开发其他化合物。
靶
在本发明的一个方面，NPY或NPY Y1受体可以在筛选中用作靶，以鉴定能够抑制NPY或NPY Y1的药物。在这一点上，靶可以包含被如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列或其变体、同源物、衍生物或片段，它是借助包含它的表达实体的重组和/或合成手段制备的。
作为替代选择，NPY或NPY Y1受体可以用作靶，以鉴定能够通过抑制NPY或NPY Y1介导海绵体内压力增加的药物。在这一点上，靶可以是适合的组织提取物。
靶甚至可以是这类组织和/或重组靶的组合。
重组方法
通常，本发明的药物可以通过重组DNA技术制备。
在一种实施方式中，药物优选地是NPYi或NPY Y1i。NPYi或NPYY1i可以通过重组DNA技术制备。
氨基酸序列
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在有些情形中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在有些情形中，术语“氨基酸序列”与术语“蛋白质”是同义的。
氨基酸序列可以是从适合的来源中分离的，或者它可以是合成的，或者它可以利用重组DNA技术加以制备。
一方面，本发明提供能够在用于鉴定一种或多种药物和/或其衍生物的测定法中充当靶的氨基酸序列。
优选地，该靶是NPY或NPY Y1受体。
优选地，该NPY或NPY Y1受体是所分离的NPY或NPY Y1受体和/或是纯化的和/或是非天生的。
本发明的NPY或NPY Y1受体可以基本上是所分离的形式。不言而喻的是NPY或NPY Y1受体可以是与载体或稀释剂混合的，后者将不会干扰受体的预期目的，并且仍将被视为基本上分离的。本发明的NPY或NPY Y1受体还可以是基本上纯净的形式，在这种情况下它一般将在制备物中包含NPY或NPY Y1受体，其中在制备物中90％以上、例如95％、98％或99％的NPY或NPY Y1受体是可从SEQ ID No.1、2或3的表达得到的肽或其变体、同源物、衍生物或片段。
核苷酸序列
本文所用的术语“核苷酸序列”与术语“多核苷酸”是同义的。
核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的DNA或RNA。核苷酸序列可以是双链的或单链的，代表有义链或反义链或其组合。
关于有些应用，优选地，核苷酸序列是DNA。
关于有些应用，优选地，核苷酸序列是利用重组DNA技术制备的(例如重组DNA)。
关于有些应用，优选地，核苷酸序列是cDNA。
关于有些应用，优选地，核苷酸序列可以与在这方面天然存在的形式相同。
一方面，本发明提供核苷酸序列，它编码能够在用于鉴定一种或多种药物和/或其衍生物的测定法中充当靶的物质。
在本发明的一个方面中，核苷酸序列编码NPY或NPY Y1受体。
将为技术人员所理解的是，大量不同的核苷酸序列都可以编码相同的相同的靶，这是遗传密码的简并性的结果。另外，不言而喻的是，利用惯用技术，技术人员可以进行基本上不会影响被本发明核苷酸序列编码的活性的核苷酸取代，反映了其中靶被表达的任意特定宿主生物的密码子用途。因而，涉及附加序列表中核苷酸序列的术语“变体”、“同源物”或“衍生物”包括一种(或多种)核酸形式或序列的任意取代、变异、修饰、代替、删去或添加，使所得核苷酸序列编码根据本发明的功能靶(或者如果所述药物包含核苷酸序列或氨基酸序列，甚至是根据本发明的药物)。
如上所述，关于序列同源性，优选地存在与本文交叉引用的NPY序列至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％的同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％的同源性。核苷酸同源性比较可以如上所述进行。优选的序列比较程序是如上所述的GCG Wisconsin Bestfit程序。默认的评分模型关于每种等同的核苷酸的匹配值为10，关于每种误配的匹配值为-9。关于每种核苷酸，默认的裂隙产生罚分是-50，默认的裂隙延长罚分是-3。
本发明还涵盖这样的核苷酸序列，它们能够与本文所列举的序列或其任意变体、片段或衍生物或者与任意上述的补体选择性杂交。核苷酸序列的长度优选为至少15个核苷酸，长度更优选为至少20、30、40或50个核苷酸。这些序列能够用作探针，例如在诊断试剂盒中。
变体/同源物/衍生物
除了本文提到的具体核苷酸序列和可从其衍生的氨基酸序列以外，本发明还涵盖其变体、同源物和衍生物的使用。这里，术语“同源性”可以等于“同一性”。
在本文中，同源性序列被认为包括可以是至少75、85或90％等同的氨基酸序列，优选至少95或98％等同的。具体而言，同源性通常应当考虑已知为活性所必需的序列区域。尽管同源性也可以考虑相似性(也就是具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，不过在本发明的上下文中优选的是在序列同一性的意义上表述同源性。
同源性比较可以通过肉眼进行，或者更通常地借助容易得到的序列比较程序。这些商业上可得到的计算机程序能够计算两种或多种序列之间的同源性％。
可以针对连续的序列计算同源性％，也就是说，将一种序列与其他序列对应排列，直接比较一种序列中的每个氨基酸与其他序列中的对应氨基酸，每次一个残基。这称为“不间断”排列。通常，这类不间断排列仅是针对相对少的残基进行的。
尽管这是一种非常简单和一致的方法，不过它不能考虑——例如在不等同的序列对中——一个插入或删去将导致随后的氨基酸残基排除在排列之外，从而在进行综合排列时可能导致同源性％大为降低。所以，大多数序列比较方法被设计为产生最优排列，考虑可能的插入和删去，不会过分影响总体同源性得分。这是通过在序列排列中插入“裂隙”来实现的，试图最大化局部同源性。
不过，这些更复杂的方法赋予存在于排列中的每个裂隙以“裂隙罚分”，以便就相同数量的等同氨基酸而言，具有尽可能少的裂隙的序列排列——反映在两种被比较的序列之间具有更高的相关性——将比具有很多裂隙的序列排列获得更高的分数。通常使用“同源裂隙成本”为裂隙的存在承担相对高的成本，为裂隙中每种随后的残基承担更少的罚分。这是最常用的裂隙评分系统。高裂隙罚分当然将产生具有很少裂隙的优化排列。大多数排列程序允许修改裂隙罚分。不过，在利用这类软件进行序列比较时优选使用默认值。例如在使用GCG WisconsinBestfit软件包时(见下)，氨基酸序列的默认裂隙罚分关于裂隙为-12，关于每次延长为-4。
最大同源性％的计算因此首先要求产生最优排列，并考虑裂隙罚分。适用于进行这样一种排列的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。其他可以进行序列比较的软件实例包括但不限于BLAST软件包(Ausubel等，1999，出处同上，Chapter 18)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA都可用于脱机和联机检索(Ausubel等，1999，出处同上，p.7-58至7-60)。不过，优选的是使用GCG Bestfit程序。一种新的工具称为BLAST 2序列，也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终的同源性％可以用同一性表示，不过排列过程本身通常不是基于全或无的成对比较。相反，一般使用成比例的相似性分数模型，它为基于化学相似性或调优距离的每次成对比较打分。这样一种常用模型的实例是BLOSUM62模型——BLAST程序组的默认模型。GCGWisconsin程序一般使用公共的默认值或自定义的符号对照表，如果提供的话(进一步的细节参见用户手册)。优选的是关于GCG软件包使用公共的默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认的模型，例如BLOSUM62。
一旦软件已经产生了最优排列，即有可能计算同源性％，优选序列同一性％。软件通常执行该任务作为序列比较的一部分，生成一数值结果。
序列还可以具有氨基酸残基的删去、插入或取代，这产生沉默改变，得到功能等价物。有意的氨基酸取代可以在残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的基础上进行，只要保留物质的次级结合活性即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有亲水性值相似的不带电极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸和酪氨酸。
保守性取代例如可以按照下表进行。第二列同一组中的氨基酸和优选第三列同一行中的氨基酸可以互相取代。
脂族 非极性 GAP
ILV
极性不带电 CSTM
NQ
极性带电 DE
KR
芳族 HFWY
本发明还涵盖可以发生同源性取代(取代和代替在本文中都用于表示现有氨基酸残基与替代残基的交换)，也就是相似性取代，例如碱性的取代碱性的、酸性取代酸性的、极性取代极性的等。也可以发生非同源性取代，也就是从一类残基到另一类，或者作为替代选择牵涉包含非天然氨基酸，例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
还可以被非天然氨基酸所代替，包括：α*与α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物——例如三氟酪氨酸*、p-Cl-苯基丙氨酸*、p-Bt-苯基丙氨酸*、p-I-苯基丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、p-硝基-L-苯基丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯基丙氨酸(Phe)的甲基衍生物——例如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。符号*已经用于上述讨论的目的(涉及同源性或非同源性取代)，以表示衍生物的疏水性，而#已经用于表示衍生物的亲水性，#*表示两亲性特征。
变异的氨基酸序列可以包括适合的间隔基团，它们可以被插入在序列的任意两个氨基酸残基之间，包括烷基，例如甲基、乙基或丙基，以及氨基酸间隔基，例如甘氨酸或β-丙氨酸残基。变异的进一步形式牵涉一个或多个氨基酸残基以类胨形式存在，这将为本领域技术人员所充分理解。为了避免疑问，“类胨形式”用于表示变异的氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而非该α-碳。制备类胨形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
杂交
本文所用的术语“杂交”应当包括“核酸的一条链通过碱基配对结合一条互补链的过程”以及如聚合酶链反应(PCR)过程所进行的扩增过程。
能够与本文所列举的核苷酸序列或其补体选择性杂交的本发明核苷酸序列一般将至少75％、优选至少85或90％、更优选至少95％或98％同源于本文所列举的对应的互补性核苷酸序列，跨越至少20个、优选至少25或30个、例如至少40、60或100个或以上邻近核苷酸的区域。
术语“可选择性杂交的”意味着核苷酸序列在用作探针时是在这样的条件下使用的，其中发现靶核苷酸序列在显著高于背景的水平上与探针杂交。可能发生背景杂交的原因是例如在所筛选的cDNA或基因组DNA文库中存在其他核苷酸序列。在这种情况下，背景暗示了由探针与文库的非特异性DNA成员之间的相互作用所生成的信号水平，其强度比利用靶DNA所观察到的特异性相互作用小10倍，优选小100倍。相互作用的强度例如可以通过——例如用32P——放射性标记探针加以测量。
根据Berger和Kimmel的教导(1987，Guide to MolecularCloning Techniques，Methods in Enzymology，Vol.152，AcademicPress，San Diego CA)，杂交条件是基于核酸结合配合物的熔化温度(Tm)的，下面解释所规定的“严格性”。
最大严格性通常发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；高严格性发生在低于Tm约5℃至10℃；中等严格性发生在低于Tm约10℃至20℃；低严格性发生在低于Tm约20℃至25℃。正如将为本领域技术人员所理解的，最大严格性杂交可以用于鉴定或检测等同的核苷酸序列，而中等(或低)严格性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
在优选的方面，本发明涵盖能够在严格条件下(65℃，0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M枸橼酸钠pH7.0)与本发明核苷酸序列杂交的核苷酸序列。若本发明的核苷酸序列是双链的，双螺旋链无论单独还是结合都为本发明所涵盖。若核苷酸序列是单链的，不言而喻的是该核苷酸序列的互补性序列也包括在本发明的范围内。
不是100％同源于本发明序列但是属于本发明范围的核苷酸序列可以通过大量途径获得。本文所述序列的其他变体例如可以通过探查由广泛来源制成的DNA文库而得。另外，可以得到其他病毒/细菌或细胞同源物、具体为在哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，这类同源物及其片段一般将能够与本文序列表所示序列选择性杂交。这类序列可以通过探查由其他动物物种制成的cDNA文库或基因组DNA文库而得，在中等至高严格条件下利用本文所列核苷酸序列的全部或一部分的探针探查这类文库。相似的考虑适用于获得本发明氨基酸和/或核苷酸序列的物种同源物和等位变体。
变体和株/种同源物还可以利用简并性PCR获得，它将使用这样的引物，被设计为定向于编码本发明序列内保守氨基酸序列的变体和同源物内的序列。例如通过排列来自若干变体/同源物的氨基酸序列，可以预测保守序列。序列排列可以利用本领域已知的计算机软件进行。例如，普遍使用GCG Wisconsin PileUp程序。用在简并性PCR中的引物将含有一个或多个简并性位置，使用的严格条件将低于用于对已知序列克隆具有单一序列引物的序列的条件。
作为替代选择，这类核苷酸序列可以通过特征化序列的位点指向诱变而得，例如本发明序列表SEQ ID No.1或2中所列举的核苷酸序列。这对于这样的情况是有用的，其中例如序列需要沉默的密码子变化，以优化密码子对表达核苷酸序列的特定宿主细胞的偏爱。还可能需要其他序列变化，目的是引入限制酶识别位点，或者改变被核苷酸序列编码的蛋白质活性。
本发明的核苷酸序列可以用于制备引物，例如PCR引物、交替扩增反应引物，和探针，例如利用放射性或非放射性标记借助常规手段标记以暴露性标记，或者核苷酸序列被克隆到载体中。这类引物、探针和其他片段的长度将是至少15个、优选至少20个、例如至少25、30或40个核苷酸，也为本文所用的术语本发明核苷酸序列所涵盖。
核苷酸序列、例如根据本发明的DNA多核苷酸和探针可以借助重组、合成或本领域技术人员可利用的任意手段加以制备。它们还可以通过标准技术加以克隆。
一般而言，引物将借助合成手段制备，牵涉所需核酸序列的逐步制造，每次一个核苷酸。用于实现之的自动化技术是本领域容易得到的。
较长的核苷酸序列一般将利用重组手段制备，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将牵涉制备一对引物(例如约15至30个核苷酸)，在侧面连接需要克隆的定向序列区域，使引物与得自动物或人细胞的mRNA或cDNA接触，在引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应(PCR)，分离经过扩增的片段(例如在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，回收经过扩增的DNA。引物可以被设计为含有适合的限制酶识别位点，以便经过经过扩增的DNA能够被克隆到适合的克隆载体中。
由于基因代码的固有简并性，编码基本上相同或功能上等价的氨基酸序列的其他DNA序列可以用于克隆和表达靶序列。正如将为本领域技术人员所理解的是，关于某些表达系统，可能有利的是制备具有非天然存在密码子的靶序列。可以选择为特定原核生物或真核生物宿主所优选的密码子(Murray E等(1989)Nuc Acids Res 17：477-508)，例如以增加靶表达的比率或者制备具有可取性质的重组RNA副本，例如比从天然存在的序列制备的副本更长的半衰期。
载体
在本发明的一种实施方式中，药物(即NPYi或NPY Y1i)可以直接对个体给药。
在本发明的另一种实施方式中，将包含编码本发明药物的核苷酸序列的载体对个体给药。
优选地，使用基因载体制备重组药物和/或释放至靶部位。
正如本领域所熟知的，载体是一种工具，允许或促进实体从一个环境转移至另一个环境。按照本发明，并且举例来说，有些用在重组DNA技术中的载体允许实体、例如DNA节段(例如异种的DNA节段，例如异种的cDNA节段)转移到宿主和/或靶细胞中，其目的是复制包含本发明核苷酸序列和/或表达被本发明核苷酸序列编码的本发明蛋白质的载体。用在重组DNA技术中的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体或病毒。
术语“载体”包括载体和/或转化载体。
术语“表达载体”表示能够体内或体外/来自体内表达的构建体。
术语“转化载体”表示能够从一个物种转移至另一个物种的构建体。
裸DNA
包含编码用于治疗MSD、例如MED的本发明药物的核苷酸序列的载体可以直接作为“裸露的核酸构建体”给药，优选地进一步包含与宿主细胞基因组的侧链序列。
本文所用的术语“裸DNA”表示包含编码本发明药物的核苷酸序列以及控制其产生的短启动子区的质粒。之所以被称为“裸”DNA是因为质粒不被任何释放载体所携带。当这样一种DNA质粒进入宿主细胞时，例如真核生物细胞，它所编码的蛋白质(例如本发明药物)在细胞内被转录和转译。
非病毒释放
作为替代选择，包含本发明核苷酸序列或本发明药物(即NPYi或NPY Y1i)或本发明靶(即NPY或NPY Y1)的载体可以利用本领域已知的各种非病毒技术被引入适合的宿主细胞，例如转染、转化、电穿孔和biolistic转化。
本文所用的术语“转染”表示使用非病毒载体释放基因至靶哺乳动物细胞的过程。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA biolistics、脂质介导的转染、致密DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染剂、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFAs)(Nature Biotechnology 1996 14：556)、多价阳离子——例如精胺、阳离子脂质或多赖氨酸、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)-胆固醇配合物(Wolff和Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16：421)及其组合。
若干已知的转染技术可增强哺乳动物细胞对裸核酸构建体的摄取，例如包括使用转染试剂的那些。这些试剂的实例包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂转染剂(例如lipofectamTM和transfectamTM)。通常，将核酸构建体与转染试剂混合，形成组合物。
病毒载体
作为替代选择，包含本发明药物或靶或本发明核苷酸序列的载体可以利用本领域已知的各种病毒技术被引入适合的宿主细胞中，例如用重组病毒载体感染，例如逆病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒。
优选地，载体是一种重组的病毒载体。适合的重组病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关性病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体或微小病毒载体(Kestler等1999 Human Gene Ther 10(10)：1619-32)。在病毒载体的情况下，编码本发明药物的核苷酸序列的释放是被靶细胞的病毒感染所介导的。
定向载体
术语“定向载体”表示这样一种载体，它的感染/转染/转导细胞或者在宿主和/或靶细胞中被表达的能力被限制于宿主生物体内的某些细胞类型，通常为具有共同或相似表型的细胞。
复制载体
编码本发明药物(即NPYi或NPY Y1i或PDEi或PDE5i)或靶(例如NPY或NPY Y1)的核苷酸序列可以被引入到重组的可复制的载体中。载体可以用于在可相容的宿主细胞中复制核苷酸序列。因而在本发明的一种实施方式中，本发明提供制备本发明靶的方法，该方法向可复制的载体中引入本发明核苷酸序列，向可相容的宿主细胞引入该载体，使宿主细胞生长在引起载体复制的条件下。可以从宿主细胞中回收载体。
表达载体
优选地，将被插入载体中的本发明药物或本发明核苷酸序列或本发明靶与对照序列连接，后者能够提供宿主细胞的编码序列的表达，例如本发明NPY或NPY Y1的编码序列，也就是说，该载体是一种表达载体。本发明药物或由宿主重组细胞产生的靶可以被分泌出来或者可以被包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。正如将为本领域技术人员所理解的，含有编码序列的本发明药物或靶的表达载体能够被设计为具有信号序列，后者引导编码序列的本发明药物或靶分泌通过特定的原核生物或真核生物细胞膜。
体外表达
本发明载体可以如下所述被转化或转染到适合的宿主细胞和/或靶细胞中，提供本发明药物或靶的表达。该过程可以包含在一定条件下培养用表达载体转化的宿主细胞和/或靶细胞，以提供编码本发明药物或靶的编码序列的载体表达，再可选地回收被表达的本发明药物或靶。载体例如可以是质粒或病毒载体，具有复制来源、可选的用于表达所述多核苷酸的启动子和可选的启动子的调节子。载体可以含有一种或多种可选择的标志基因，在细菌质粒的情况下例如氨苄西林耐药性基因，或者用于哺乳动物载体的新霉素耐药性基因。本发明药物或本发明靶的表达可以是构成性的，以便它们被连续产生，或者是可诱导的，需要刺激物引发表达。在可诱导的表达的情况下，本发明药物或靶的产生可以在需要时例如引发于向培养基加入诱导物，例如地塞米松或IPTG。
融合蛋白
本发明的NPY或NPY Y1或药物(即NPYi或NPY Y1i)可以作为融合蛋白被表达，以有助于本发明药物的提取和纯化和/或释放或者NPY/NPY Y1受体定向于个体和/或促进药物筛选法的开发。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱苷肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录活化结构域)和β-半乳糖苷酶。它还可以适宜在融合蛋白配偶体与有关蛋白质序列之间包括蛋白水解性裂解位点，允许除去融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不妨碍靶的活性。
融合蛋白可以包含与本发明物质融合的抗原或抗原决定子。在这种实施方式中，融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，其中包含可以充当佐剂的物质，提供对免疫系统的泛化刺激。抗原或抗原决定子可以连接在物质的氨基或羧基末端上。
在本发明的另一种实施方式中，氨基酸序列可以结合异种序列，以编码融合蛋白。例如，关于筛选用于能够影响物质活性的药物的肽文库，可能有用的是编码表达异种表位的嵌合物质，该表位是被商业上可得到的抗体所识别的。
宿主细胞
可以采用多种宿主细胞来表达编码药物——例如本发明药物——的核苷酸序列或本发明的NPY/NPY Y1受体靶。这些细胞可以是原核生物和真核生物宿主细胞。适合的宿主细胞包括细菌——例如大肠杆菌(E.coli)、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞，通常是不死化的，例如小鼠、CHO、人和猴细胞系及其衍生物。
在本发明范围内适合的表达宿主的实例是真菌，例如曲霉属(例如EP-A-0184438和EP-A-0284603所述)和木霉属；细菌，例如杆菌属(例如EP-A-0134048和EP-A-0253455所述)、链霉菌属和假单胞菌属；和酵母，例如克鲁维氏酵母属(例如EP-A-0096430和EP-A-0301670所述)和酵母属。举例来说，典型的表达宿主可以选自黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉塔宾变种(Aspergillus niger var.tubigenis)、黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var.awamori)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatis)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、米曲霉(Aspergillus orvzae)、Trichoderma reesei、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、地衣型芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
适合的宿主细胞——例如酵母、真菌和植物宿主细胞——的使用可以提供转译后修饰(例如肉豆蔻酰化、葡糖基化、截头、lapidation和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这可能是赋予本发明重组表达产物以最优生物活性所必需的。
优选的宿主细胞能够加工表达产物，生成适当的成熟多肽。加工的实例包括但不限于葡糖基化、遍在蛋白化、二硫键形成和一般的转译后修饰。
抗体
在本发明的一种实施方式中，药物可以是一种抗体。另外，或者作为替代选择，靶可以是一种抗体。
抗体可以通过标准技术制备，例如用本发明物质致免疫或者利用噬菌体陈列文库。
出于本发明的目的，术语“抗体”除非有相反指示，包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段、由Fab表达文库产生的片段以及模拟物。这类片段包括保留其对靶物质的结合活性的全抗体片段、Fv、F(ab’)与F(ab’)2片段、以及单链抗体(scFv)、融合蛋白和其他包含抗体的抗原结合位点的合成蛋白质。进而，抗体及其片段可以是人源化抗体。中和抗体、也就是抑制物质多肽的生物活性的那些是诊断和治疗所尤其优选的。
如果需要多克隆抗体，将所选择的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)用携带表位的免疫原性多肽致免疫，后者可从所鉴定的本发明药物和/或物质获得。根据宿主的种类，可以使用各种佐剂以增加免疫应答。这类佐剂包括但不限于弗罗因德氏佐剂，矿物凝胶、例如氢氧化铝，和表面活性物质、例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小型棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是可以采用的潜在有用的人佐剂，如果纯化的话，将物质多肽对无免疫应答的个体给药，目的是刺激全身防卫。
收集来自致免疫动物的血清，按照已知工艺处理。如果含有对抗可从所鉴定的本发明药物和/或物质得到的表位的多克隆抗体的血清含有对抗其他抗原的抗体，那么多克隆抗体可以通过免疫亲合色谱法加以纯化。用于产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可以制备这类抗体，本发明还提供被半抗原化为另一种多肽的本发明多肽或其片段，用作动物或人中的免疫原。
对抗可从所鉴定的本发明药物和/或物质得到的表位的单克隆抗体也可以容易为本领域技术人员所制备。用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是熟知的。不死的产生抗体的细胞系可以借助细胞融合作用创建，也可以借助其他技术，例如将B淋巴细胞直接用致癌基因DNA转化，或者用EB病毒转染。所产生的对抗轨道表位的单克隆抗体组可以根据各种性质加以筛选，例如对同位型和表位的亲合性。
对抗物质和/或所鉴定的药物的单克隆抗体可以利用任意技术制备，由培养物中的连续细胞系产生抗体分子。这些包括但不限于最初由Koehler和Milstein所描述的杂交瘤技术(1975 Nature 256：495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)Immunol Today 4：72；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80：2026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R Liss Inc，pp 77-96)。另外，可以使用为制备“嵌合抗体”所开发的技术，也就是使小鼠抗体基因与人抗体基因接合得到具有适当抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等(1984)ProcNatl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312：604-608；Takeda等(1985)Nature 314：452-454)。作为替代选择，可以修改单链抗体制备技术(美国专利No.4,946,779)，以制备物质特异性单链抗体。
指向可从所鉴定的药物和/或物质得到的表位的单克隆与多克隆抗体特别可用于诊断，中和抗体可用于被动的免疫疗法。单克隆抗体具体可以用于提高抗遗传型抗体。抗遗传型抗体是携带需要保护的物质和/或药物的“内部影像”的免疫球蛋白。用于提高抗遗传型抗体的技术是本领域已知的。这些抗遗传型抗体还可以用于治疗。
抗体还可以这样产生，体内诱导淋巴细胞群的产生，或者筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或组，参见Orlandi等(1989，Proc Natl Acad Sci 86：3833-3837)和Winter G与Milstein C(1991，Nature 349：293-299)。
还可以生成含有物质的特异性结合位点的抗体片段。例如，这类片段包括但不限于F(ab’)2片段，它可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生，和Fab片段，它可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而生成。作为替代选择，可以构建Fab表达文库，以便快速和容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse WD等(1989)Science 256：1275-1281)。
报道基因
多种报道基因可以用在本发明的测定方法(以及筛选)中，优选的报道基因提供适宜检测的信号(例如借助光谱学)。举例来说，报道基因可以编码催化改变光吸收性质的反应的酶。
报道基因分子的实例包括但不限于β-半乳糖苷酶、转化酶、绿荧光蛋白、荧光素酶、氯霉素、乙酰转移酶、β-葡糖醛酸酶、外-葡聚糖酶和葡糖淀粉酶。作为替代选择，可以向初生的副本中结合放射性标记或荧光标记的核苷酸，然后在与寡核苷酸探针结合后加以鉴定。
在一种优选的实施方式中，报道基因分子的产生是通过报道基因产物的酶活性加以测量的，例如β-半乳糖苷酶。
各种用于检测和测量靶表达的方案是本领域已知的，例如使用蛋白质特异性单克隆或多克隆抗体。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)和荧光活化细胞挑选(FACS)。双位点的单克隆类免疫测定法是优选的，它利用对多肽上两个非干扰性表位具有反应性的单克隆抗体，但是也可以采用竞争性结合测定法。这些和其他测定法尤其可以参见Hampton R等(1990，Serological Methods，A Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 158：1211)。
多种标记和缀合技术是本领域技术人员已知的，可以用在各种核酸与氨基酸测定法中。用于产生标记杂交或PCR探针以检测靶多核苷酸序列的手段包括寡标记、切口转译、末端标记或用被标记的核苷酸进行PCR扩增。作为替代选择，编码序列或其任意部分可以被克隆到载体中，用于产生mRNA探针。这类载体是本领域已知的，是商业上可得到的，可以用于体外合成RNA探针，方法是加入适当的RNA聚合酶，例如T7、T3或SP6，和被标记的核苷酸。
很多公司供应用于这些工艺的商用试剂盒和方案，例如PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和USBiochemical Corp(Cleveland，OH)。适合的报道基因分子或标记物包括放射性核素、酶、荧光剂、化学荧光剂或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。教导这类标记物的使用的专利包括US-A-3817837、US-A-3850752、US-A-3939350、US-A-3996345、US-A-4277437、US-A-4275149和US-A-4366241。而且，重组免疫球蛋白可以如US-A-4816567所示制备。
其他量化特定分子表达的方法包括放射性标记(Melby PC等1993 JImmunol Methods 159：235-44)或生物素基化(Duplaa C等1993 AnalBiochem 229-36)核苷酸、对照核酸的共同扩增、和添加实验结果的标准曲线法。按照ELISA格式进行测定可以加速多个样本的量化，其中提供各种稀释比的有关寡聚物，分光光度或量热反应可进行快速的量化。
尽管标志基因表达的存在与否提示了还存在有关的基因，不过仍然需要确认它的存在和表达。例如，如果核苷酸序列被插入到标志基因序列内，含有它的重组细胞可能因标志基因功能的不存在而被鉴定。作为替代选择，标志基因可以被纵排放置，靶编码序列处于单一启动子的控制之下。标志基因响应于诱导或选择的表达通常表示靶也被表达了。
作为替代选择，含有靶编码序列并且表达靶编码区的宿主细胞可以通过本领域技术人员已知的各种工艺加以鉴定。这些工艺包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，它们包括用于检测和/或量化核酸或蛋白质的膜类、溶液类或芯片类技术。
筛选
任何一种或多种适当的靶——例如氨基酸序列和/或核苷酸序列——都可以在任意各种药物筛选技术中用于鉴定药物，例如NPYi或NPY Y1i。用在这样一种试验中的靶可以游离于溶液中、附着于固体载体上、被携带在细胞表面上或者位于细胞内。靶甚至可以在动物模型内，其中所述靶可以是外源性靶或被引入的靶。动物模型将是一种非人类动物模型。可以测量靶活性的消失或者靶与供试药物之间结合配合物的形成。
药物筛选技术可以是基于1984年9月13日公布的Geysen欧洲专利申请84/03564所述方法的。总之，在固体底物上合成大量不同的小分子肽供试化合物，例如在塑料针或一些其他表面上。使肽供试化合物与适合的靶或其片段反应，洗涤。然后检测所结合的实体——例如适当地调整本领域熟知的方法。经过纯化的靶还可以被直接涂覆在平板上，用于药物筛选技术。
作为替代选择，非中和抗体可以用于捕获肽，并固定在固体载体上。
本发明还涵盖竞争性药物筛选测定法的使用，其中能够特异性结合靶的中和抗体与供试化合物竞争结合靶。
另—种筛选技术为对物质具有适合的结合亲合性的药物提供高产筛选(HTS)，是基于WO 84/03564所述方法的。
预计本发明的测定方法将适合于供试化合物的小规模与大规模筛选以及定量测定。
在优选的方面，本发明的筛选包含至少下列步骤(顺序不必如此)：(a)进行体外筛选，以确定候选药物是否具有有关的活性(例如调节NPY，具体为NPY Y1，例如来自狗肾脏的NPY或NPY Y1)；(b)进行一项或多项选择性筛选，以确定所述候选药物的选择性(例如观察所述药物是否也是ACE抑制剂——例如利用本文所列举的测定方案，和/或观察所述药物是否对NPY Y2和/或NPY Y5有活性)；和(c)利用所述候选药物进行体内筛选(例如利用功能性动物模型，包括通过测定药物对动脉血压的效果确定药物的选择性)。通常，如果所述候选药物通过了(a)项和(b)项筛选，那么进行(c)项筛选。
诊断
本发明还提供用于检测MED倾向的诊断组合物或试剂盒。在这方面，组合物或试剂盒将包含这样一种实体，它指示供试样本中一种或多种靶的存在——或者甚至一种或多种靶的不存在。优选地，供试样本是从阴茎得到的。
举例来说，诊断组合物可以包含任意一种本文提到的核苷酸序列或其变体、同源物、片段或衍生物，或者能够与任意一种核苷酸序列的全部或部分杂交的序列。
为了提供疾病诊断的基础，应当建立来自靶的正常或标准值。可以这样来完成，在本领域熟知的适合于配合物形成的条件下，混合取自正常受试者——动物或人——的体液或细胞提取物与抗靶抗体。标准配合物形成量可以这样进行量化，将其与一系列阳性对照稀释液进行比较，在对照中混合有已知量的抗体与已知浓度的纯化靶。然后，可以将得自正常样本的标准值与得自可能患有MED的受试者的数值进行比较。标准值与受试者数值之间的差异可确立疾病状态的存在。
靶本身或其任意部分可以提供诊断和/或治疗化合物的基础。出于诊断目的，靶多核苷酸序列可以用于检测和量化可能牵涉有MED的病症、障碍或疾病中的基因表达。
编码靶的多核苷酸序列可以用于诊断由靶的表达所致MED。例如，编码靶的多核苷酸序列可以在活检或尸检组织或生物体液的杂交或PCR测定中用于检测靶表达的异常。这类定性或定量方法的形式可以包括DNA印迹或RNA印迹分析、斑点印迹或其他膜类技术；PCR技术；浸量尺、针或芯片技术；和ELISA或其他多样本形式技术。所有这些技术都是本领域熟知的，事实上是很多商业上可得到的诊断试剂盒的基础。
这类测定法经过改进，可以评价特定治疗性处置方案的功效，可以用于动物研究、临床试验或监测个体的治疗。为了提供疾病诊断的基础，应当建立靶表达的正常或标准分布型。可以这样来完成，在适合于杂交或扩增的条件下，混合取自正常受试者——动物或人——的体液或细胞提取物与靶或其部分。标准杂交可以这样进行量化，将正常受试者所得数值与同一实验中的一系列阳性对照稀释液进行比较，在对照中使用已知量的纯化靶。可以将得自正常样本的标准值与得自可能患有涉及靶编码序列表达的障碍或疾病的受试者数值进行比较。标准值与受试者数值之间的差异可确立疾病状态的存在。如果疾病被确立存在，则给以现有的治疗剂，可以得出治疗分布型或数值。最后，可以有规律地重复测定，以评价数值是否发展或恢复为正常或标准水平。连续的治疗方案可以用于显示治疗历经若干天或若干月的功效。
因而，本发明在一方面涉及靶多肽或其变体、同源物、片段或衍生物的用途，用于制备抗靶抗体，后者例如能够在诊断中用于检测和量化MED中的靶水平。
本发明进一步提供用于检测细胞和组织中的靶的诊断测定法和试剂盒，包含可以用作阳性对照的纯化靶、和抗靶抗体。这类抗体可以在溶液类、膜类或组织类技术中用于检测任意涉及靶蛋白表达或者删去或其变体、同源物、片段或衍生物表达的疾病状态或病症。
诊断试剂盒
本发明还包括诊断组合物或诊断方法或试剂盒，用于(i)生物体液和组织中的NPY和NPY Y1活性检测和测量；和/或(ii)勃起组织中的NPY和NPY Y1活性定位；和/或(iii)男性性功能障碍、例如MED倾向的检测。在这方面，组合物或试剂盒将包含这样一种实体，它能够指示供试样本中一种或多种靶的存在——或者甚至一种或多种靶的不存在，例如NPY或NPY Y1活性。优选地，供试样本是从男性生殖器或其分泌物得到的。
举例来说，诊断组合物可以包含任意一种本文提到的核苷酸序列或其变体、同源物、片段或衍生物，或者能够与任意一种核苷酸序列的全部或部分杂交的序列。
诊断测试
为了提供疾病诊断的基础，应当建立来自靶的正常或标准值。可以这样来完成，在本领域熟知的适合于配合物形成的条件下，混合取自正常受试者——动物或人——的体液或细胞提取物与抗靶抗体。标准配合物形成量可以这样进行量化，将其与一系列阳性对照稀释液进行比较，在对照中混合有已知量的抗体与已知浓度的纯化靶。然后，可以将得自正常样本的标准值与得自可能患有男性性功能障碍(例如MED)的受试者的数值进行比较。标准值与受试者数值之间的差异可确立疾病状态的存在。
靶本身或其任意部分可以提供诊断和/或治疗化合物的基础。出于诊断目的，靶多核苷酸序列可以用于检测和量化可能牵涉有男性性功能障碍、具体为MED的病症、障碍或疾病中的基因表达。
编码靶的多核苷酸序列可以用于诊断由靶的表达所致SD。例如，编码靶的多核苷酸序列可以在活检或尸检组织或生物体液的杂交或PCR测定中用于检测靶表达的异常。这类定性或定量方法的形式可以包括DNA印迹或RNA印迹分析、斑点印迹或其他膜类技术；PCR技术；浸量尺、针或芯片技术；和ELISA或其他多样本形式技术。所有这些技术都是本领域熟知的，事实上是很多商业上可得到的诊断试剂盒的基础。
这类测定法经过改进，可以评价特定治疗性处置方案的功效，可以用于动物研究、临床试验或监测个体的治疗。为了提供疾病诊断的基础，应当建立靶表达的正常或标准分布型。可以这样来完成，在适合于杂交或扩增的条件下，混合取自正常受试者——动物或人——的体液或细胞提取物与靶或其部分。标准杂交可以这样进行量化，将正常受试者所得数值与同一实验中的一系列阳性对照稀释液进行比较，在对照中使用已知量的纯化靶。可以将得自正常样本的标准值与得自可能患有涉及靶编码序列表达的障碍或疾病的受试者数值进行比较。标准值与受试者数值之间的差异可确立疾病状态的存在。如果疾病被确立存在，则给以现有的治疗剂，可以得出治疗分布型或数值。最后，可以有规律地重复测定，以评价数值是否发展或恢复为正常或标准水平。连续的治疗方案可以用于显示治疗历经若干天或若干月的功效。
因而，本发明在一方面涉及靶多肽或其变体、同源物、片段或衍生物的用途，用于制备抗靶抗体，后者例如能够在诊断中用于检测和量化男性性功能障碍状态中的靶水平。
本发明进一步提供用于检测细胞和组织中的靶的诊断测定法和试剂盒，包含可以用作阳性对照的纯化靶、和抗靶抗体。这类抗体可以在溶液类、膜类或组织类技术中用于检测任意涉及靶蛋白表达或者删去或其变体、同源物、片段或衍生物表达的疾病状态或病症。
包含这些实体的诊断组合物和/或试剂盒可以用于快速、可靠、灵敏和特异性测量和定位勃起组织提取物中的NPY或NPY Y1活性。在某些情形中，试剂盒可以指示男性性功能障碍、例如MED的存在。
测定方法
诊断组合物和/或方法和/或试剂盒可以用在下列技术中，包括但不限于：竞争性与非竞争性测定法、放射免疫测定法、生物发光与化学发光测定法、荧光测定法、三明治测定法、免疫放射测定法、斑点印迹、酶联测定法——包括ELISA、微量滴定板、抗体涂层条或浸量尺，用于快速监测尿液或血液、免疫组织化学和免疫细胞化学。
举例来说，免疫组织化学试剂盒还可以用于生殖器组织中的NPY或NPY Y1活性定位。这种免疫组织化学试剂盒允许利用光学与电子显微镜检查定位组织切片和培养细胞中的NPY或NPY Y1，可以用于研究和临床目的。这类信息在MED的检测和/或预防和/或治疗中对诊断目的和可能的治疗目的都是有用的。关于每种试剂盒，确立测定法的范围、灵敏度、精确度、可靠性、特异性和可再现性。测定法内与测定法间的差异在标准置换或活性曲线上被确定在20％、50％和80％点处。
探针
本发明的另一方面提供核酸杂交或PCR探针，它们能够检测(尤其能够选择性检测)多核苷酸序列，包括基因组序列，这些序列编码靶编码区，例如NPY或NPY Y1受体，或密切相关的分子，例如等位基因。探针的特异性——也就是它是从高度保守性、保守性还是非保守性区域或结构域衍生的——和杂交或扩增的严格性(高、中或低)将决定探针是仅鉴定天然存在的靶编码序列还是还鉴定相关序列。用于检测相关核酸序列的探针选自靶家族成员的保守性或高度保守性核苷酸区域，这类探针可以用在简并性探针库中。关于等同核酸序列的检测，或者若需要最大特异性，核酸探针选自靶多核苷酸的非保守性核苷酸区域或独特区域。本文所用的术语“非保守性核苷酸区域”表示这样一种核苷酸区域，它是本文所公开的靶编码序列所独有的，不存在于相关家族成员中。
如US-A-4683195、US-A-4800195和US-A-4965188所述PCR提供了基于靶序列的寡核苷酸的另外用途。这类寡聚物一般是化学合成的，但是它们也可以通过酶学方法生成或者从重组来源产生。寡聚物一般包含两条核苷酸序列，一条具有有义取向(5’-＞3’)，一条具有反义取向(3’＜-5’)，在优化条件下用于鉴定特异性基因或条件。相同的两种寡聚物——寡聚物嵌套——或者甚至是寡聚物的简并性库可以在不太严格的条件下用于检测和/或量化密切相关的DNA或RNA序列。
药物或靶的核酸序列还可以用于生成杂交探针，如前文所述，用于绘制内源性基因组序列。利用熟知的技术，序列可以反映特定的染色体或染色体的特异性区域。这些包括就地杂交为染色体延伸区(Verma等(1988)Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York City)、流式分选染色体制备物或人工染色体构建体，例如YACs、细菌人工染色体(BACs)、细菌PI构建体或单一染色体cDNA文库。
染色体制备物的就地杂交和物理绘图技术——例如利用既定的染色体标志进行键分析——在扩充遗传图中是无价的。遗传图的实例可以参见Science(1995；270：410f和1994；265：1981f)。经常，将基因置于另一种哺乳动物染色体上，可以揭示有关的标志，即使特定人染色体的数量或臂是未知的。通过物理绘图，可以指定新的序列为染色体臂或其部分。这为研究人员提供有价值的信息，利用位置克隆或其他基因发现技术研究疾病基因。一旦疾病或症状已经被基因键合粗略定位于特定的基因组区域，任何反映该区域的序列都可以代表有关的或调节性基因，用于进一步研究。本发明的核苷酸序列还可以用于检测正常个体、携带者或患病个体之间由易位、反转等引起的染色体位置差异。
生物体
涉及本发明的术语“生物体”包括任意可能包含靶和/或其产物的生物体。生物体的实例可以包括哺乳动物、真菌、酵母或植物。
涉及本发明的术语“转基因生物”包括任意包含靶和/或其产物的生物体。
宿主细胞/宿主生物体的转化
如前文所述，宿主生物可以是原核生物或真核生物。适合的原核生物宿主的实例包括大肠杆菌(E.coli)和枯草杆菌(Bacillussubtilis)。关于原核生物宿主转化的教导在本领域已有详尽记载，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley& Sons，Inc。
如果使用原核生物宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前被适当修饰——例如除去内含子。
在另一种实施方式中，转基因生物可以是酵母。在这点上，酵母也已经被普遍用作异种基因表达的载体。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有悠久的工业应用历史，包括它用于异种基因表达。异种基因在酿酒酵母中的表达已有前人的评述：Goodey等(1987，YeastBiotechnology，D R Berry等eds，pp 401-429，Allen and Unwin，London)和King等(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton and G T Yarronton，eds，pp 107-133，Blackie，Glasgow)。
出于若干原因，酿酒酵母特别适合于异种基因表达。首先，它对人来说是非病原性的，不会产生某些内毒素。其次，它具有悠久的安全使用历史，为各种目的进行商业开发已有若干世纪。这使它具有普遍的公众接受性。第三，致力于生物体的广泛商业应用和研究已经获得丰富的遗传学和生理学知识以及酿酒酵母的大规模发酵特征。
酿酒酵母中异种基因表达原理和基因产物分泌的评述参见EHinchcliffe E Kenny(1993，“Yeast as a vehicle for theexpression of heterologous genes”，Yeasts，Vol.5，AnthonyH Rose和J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic PressLtd.)。
有若干类型的酵母载体是可得到的，包括综合载体，它要求与宿主基因组重组以便供养，和自主复制质粒载体。
为了制备转基因酵母属，向被设计为在酵母中表达的构建体插入本发明的核苷酸序列，制备表达构建体。已经开发了若干类型用于异种表达的构建体。构建体含有启动子，对酵母有活性，与本发明核苷酸序列融合，通常使用酵母来源的启动子，例如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，例如编码SUC2信号肽的序列。对酵母有活性的终止子终止于表达系统。
关于酵母的转化，已经开发了若干转化方案。例如，根据本发明的转基因酵母属可以按照下列教导制备：Hinnen等(1978，Proceedingsof the National Academy of Science of the USA 75，1929)；BeggsJ D(1978，Nature，London，275，104)；and Ito，H等(1983，JBacteriology 153，163-168)。
利用各种选择性标志选择已转化的酵母细胞。用于转化的标志是大量营养缺陷型标志，例如LEU2、HIS4和TRP1，和显性抗生素耐药性标志，例如氨基苷抗生素标志，例如G418。
另一种宿主生物是植物。经过遗传修饰的植物构建的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，以便得到稳定生长的被插入的遗传材料。现有若干技术用于插入遗传信息，两种主要的原理是直接引入遗传信息和利用载体系统引入遗传信息。一般性技术的评述可以参见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)。关于植物转化的进一步教导可以参见EP-A-0449375。
因而，本发明还提供用核苷酸序列转化宿主细胞的方法，该序列有待成为靶或者有待表达靶。可以在适合于表达和从细胞培养物回收所编码的蛋白质的条件下，培养用核苷酸序列转化的宿主细胞。由重组细胞产生的蛋白质可以被分泌出来或者可以被包含在细胞内，这取决于所使用的序列和/或载体。正如将为本领域技术人员所理解的，含有编码序列的表达载体能够被设计为具有信号序列，后者引导编码序列分泌通过特定的原核生物或真核生物细胞膜。其他重组构建可以把编码序列加入到编码多肽结构域的核苷酸序列中，这将促进可溶性蛋白质的纯化(Kroll DJ等(1993)DNA Cell Biol 12：441-53)。
ACE测定法
按照下列测定法测定NPY或NPY Y1抑制剂对ACE的效力值或优于ACE的选择性值。
来自猪和人肾皮质的可溶性血管紧张素转化酶(ACE)的制备和测定
可溶性ACE得自肾皮质，通过测量ACE底物Abz-Gly-p-硝基-Phe-Pro-OH裂解生成其荧光产物Abz-Gly的比率，测定活性。
1.材料
所有水都是双重去离子的。
1.1人肾脏
IIAM(Pennsylvania，U.S.A.)或UK Human Tissue Bank(UK HTB)
1.2猪肾脏ACE
Sigma(A2580)
1.3匀化缓冲液-1
100mM甘露糖醇和20mM Tris@pH7.1
在室温下，将2.42g Tris(Fisher T/P630/60)稀释在1升水中，用6M HCl调节pH至7.1。向其中加入18.22g甘露糖醇(SigmaM-9546)。
1.4匀化缓冲液-2
100mM甘露糖醇、20mM Tris@pH7.1和10mM MgCl2.6H2O(FisherMO600/53)
向500ml匀化缓冲液1(1.4)加入1.017g MgCl2。
1.5 Tris缓冲液(ACE缓冲液)
50mM Tris和300mM NaCl@pH7.4
将50ml 50mM Tris pH7.4(Sigma T2663)和17.52g NaCl(FisherS/3160/60)溶于1000ml水。
1.6底物(Abz-D-Gly-p-硝基-Phe-Pro-OH)(Bachem M-1100)
将ACE底物以粉末形式贮存在-20℃下。将底物小心地再悬浮在ACE缓冲液中，制备2mM储备溶液，这不必经过涡旋或声波处理。将400μl的2mM储备溶液试样在-20℃下贮存至多一个月。
1.7总产物
在平板上包括相当于100％底物-产物转化率的样本，以便测定底物周转率％(参见计算部分)。将1ml 2mM底物用20μl酶储备溶液在37℃下培育24小时，生成总产物。
1.8终止溶液
将0.5M EDTA(Promega CAS[6081/92/6])按1∶250稀释在ACE缓冲液中，制成2mM溶液。
1.9二甲基亚砜(DMSO)。
1.10氯化镁-MgCl2.6H2O(Fisher MO600/53)。
1.11黑色96孔平底测定板(Costar 3915或Packard)。
1.12 Topseal A(Packard 6005185)。
1.13离心管
2.特殊设备
2.1 Sorvall RC-5B离心机(SS34 GSA转子，预冷却至4℃)。
2.2 Braun miniprimer混合机。
2.3 Beckman CS-6R离心机。
2.4 BMG Fluostar Galaxy。
2.5 Wesbart 1589摇动恒温箱。
3.方法
3.1组织制备
3.2人ACE得自肾皮质，利用改自Booth，A.G.& Kenny，A.J.(1974)Biochem.J.142，575-581的方法。
3.3使冷冻的肾脏在室温下融化，从髓质切去皮质。
3.4将皮质跺碎，利用Braun miniprimer(2.2)在大约10体积匀化缓冲液-1(1.4)中匀化。
3.5向匀化产物加入氯化镁(1.11)(20.3mg/gm组织)，在冰水浴中搅拌15分钟。
3.6在Beckman离心机(2.3)中，将匀化产物在1,500g(3,820rpm)下离心12分钟，然后移取上清液至新鲜的离心管，弃去粒状沉淀。
3.7在Sovall离心机(2.1)中，将上清液在15,000g(12,100rpm)下离心12分钟，弃去上清液。
3.8除去其余粒状沉淀顶部淡粉红色层，再悬浮在匀化缓冲液-2(1.5)中(5ml缓冲液每1g组织)。
3.9在Beckman离心机中，将上清液在2,200g(4,630rpm)下离心12分钟，然后弃去粒状沉淀。
3.10利用Sorvall离心机，将上清液在15,000g(12,100rpm)下离心12分钟，弃去上清液。
3.11将最终的粒状沉淀再悬浮在匀化缓冲液-2中(0.5ml缓冲液每1g组织)。利用Braun miniprimer得到均匀的悬液。然后按100μl试样冷冻，用于NPY或NPY Y1活性测定。
4.0 ACE活性的测定
通过裂解ACE特异性肽底物的能力，测量前述ACE试样的活性。
将猪ACE(1.2)解冻，再悬浮在ACE缓冲液(1.6)中，浓度0.004U/μl，按50μl试样冷冻。
4.1制备4％DMSO/ACE缓冲溶液(含4mls DMSO的96mls ACE缓冲液)。
4.2将底物(1.7)、总产物(1.8)和酶(1.1，1.2，1.3)置于冰上，融化。
4.3向每孔加入50μl 4％DMSO/ACE缓冲溶液。
4.4将2mM底物储备溶液按1∶100稀释，得到20μM溶液。向每孔加入100μl 20μM底物(测定时的最终浓度为10μM)。
4.5加入50μl一系列酶稀释液，引发反应(通常使用1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600和1∶3200)。向空白孔加入50μl ACE缓冲液。
4.6将2mM总产物按1∶200稀释，得到10μM溶液。向新板的前四个孔加入200μl 10μM产物。
4.7在摇动恒温箱内，将平板在37℃下培育60分钟。
4.8在终止酶反应时，加入100μl 2mM EDTA的ACE缓冲溶液，在摇动恒温箱内在37℃下培育20分钟，然后在BMG Fluostar Galaxy上读数(ex320/em420)。
5.ACE抑制测定法
5.1将底物、总产物和酶储备溶液置于冰上，融化。
5.2将化合物储备溶液溶于100％DMSO，按1∶25稀释在ACE缓冲液中，得到4％DMSO溶液。所有进一步的稀释都是在4％DMSO/ACE缓冲溶液中进行的(含4mls DMSO的96mls ACE缓冲液)。
5.3向96孔平板加入50μl化合物，一式两份，向对照和空白孔加入50μl 4％DMSO/ACE缓冲液。
5.4步骤5.2和5.3可以手工进行或者利用Packard多探针机器人进行。
5.5将2mM底物储备溶液按1∶100稀释在ACE缓冲液中，得到20μM溶液(测定时的最终浓度为10μM)(向10.89ml缓冲液加入110μl 2mM底物，对1个平板来说足矣)。
5.6将酶储备溶液稀释在ACE缓冲液中，同活性检查(4.0)。
5.7将2mM总产物储备溶液按1∶200稀释在ACE缓冲液中，得到10μM溶液。向另一平板的前四个孔加入200μl。
5.8将0.5mM EDTA按1∶250稀释，得到2mM储备溶液(向10.96mlACE缓冲液加入44μl EDTA)。
5.9向96孔平板的每个小孔加入下列试剂：
表1：加入到96孔平板中的试剂
化合物/DMSO Tris缓冲液 底物 ACE酶 总产物
样本 2μl化合物 50μl 100μl 50μl 无
对照 2μl DMSO 50μl 100μl 50μl 无
空白 2μl DMSO 100μl 100μl 无 无
总计 2μl DMSO 无 无 无 200μl
5.10向与总计相同的96孔平板(5.7)加入50μl最高浓度的用在该测定法中的每种化合物。加入150μl ACE缓冲液，以测定任何化合物荧光。
5.11加入ACE酶引发反应，然后在摇动恒温箱内在37℃下培育1小时。
5.12在终止反应时，加入100μl 2mM EDTA，在摇动恒温箱内在37℃下培育20分钟，然后在BMG Fluostar Galaxy上读数(ex320/em420)。
6.计算
在有和没有化合物的存在下测定ACE酶的活性，以百分率表示。
FU＝荧光单位
(i)对照活性％(酶的周转率)：
(平均对照FU-平均空白FU)/(平均总FU-平均空白FU)×100
(ii)抑制剂活性％：
(平均化合物FU-平均空白FU)/(平均总FU-平均空白FU)×100
(iii)以对照％表示的活性：
抑制剂活性％/对照活性％×100
或者
(平均化合物FU-平均空白FU)/(平均对照FU-平均空白FU)×100
(iv)抑制％＝100-对照％
(v)关于荧光化合物，从用于计算活性％的平均化合物FU值中减去含有化合物(5.10)的平均空白FU。
使S形剂量响应曲线适配活性％(对照的％)-化合物浓度，在Excel中利用LabStats适配曲线计算IC50。
本文涉及的PDE作用效力值是按照下列测定法测定的：
PDE5抑制剂——试验方法
磷酸二酯酶(PDE)抑制活性
适用于本发明的优选PDE化合物是强效的选择性cGMP PDE5抑制剂。对抗环鸟苷3’，5’-一磷酸(cGMP)和环腺苷3’，5’-一磷酸(cAMP)磷酸二酯酶的体外PDE抑制活性可以通过测量它们的IC50值(抑制50％酶活性所需的化合物浓度)加以测定。
所需的PDE酶可以从各种来源分离，包括人海绵体、人与兔血小板、人心室、人骨骼肌和牛视网膜，尤其借助W.J.Thompson和M.M.Appleman的方法(Biochem.，1971， 10，311)。具体而言，cGMP特异性PDE(PDE5)和抑制cGMP的cAMP PDE(PDE3)可以从人海绵体组织、人血小板或兔血小板得到；刺激cGMP的PDE(PDE2)是从人海绵体得到的；钙/钙调蛋白(Ca/CAM)依赖性PDE(PDE1)是从人心室得到的；cAMP特异性PDE(PDE4)是从人骨骼肌得到的；光感受器PDE(PDE6)是从牛视网膜得到的。磷酸二酯酶7-11可以从被转染至SF9细胞内的全长人重组克隆体生成。
测定法可以这样进行，利用W.J.Thompson等的“批量”方法(Biochem.，1979， 18，5228)的改进，或者利用Amersham plc在产品代码TRKQ 7090/7100下所述方案的改进，使用闪烁近似测定法直接检测AMP/GMP。总之，PDE抑制剂的效果是这样研究的，在不同浓度抑制剂和少量底物的存在下测定固定量的酶(cGMP或cAMP的未标记与[3H]-标记之比为3∶1，浓度～1/3Km)，以便 I C 50 &cong; K i . 将最终的测定体积用测定缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4，5mM MgCl2，1mg/ml牛血清白蛋白)调至100μl。用酶引发反应，在30℃下培育30-60min，得到底物周转率＜30％，用50μl硅酸钇SPA珠粒(含有3mM关于PDEs9和11各自未标记的环核苷酸)终止反应。将平板重新密封，摇动20min，然后使珠粒在暗处沉降30min，然后在TopCount平板读数器(Packard，Meriden，CT)上计数。将放射性单位转化为未被抑制的对照(100％)的活性％，利用“Fit Curve”Microsoft Excel扩展版(或内部等价版本)对抑制剂浓度和所得抑制剂IC50值作图。
功能活性
可以这样体外评估，测定本发明化合物增强硝普酸钠诱导的预收缩兔海绵体组织条松弛的能力，如S.A.Ballard等(Brit.J.Pharmacol.，1996， 118(suppl.)，abstract 153P)所述。
在上述说明中提到的所有出版物都引用在此作为参考。本发明所述方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的，不会背离本发明的范围和精神。尽管本发明已经就具体优选的实施方式加以描述，不过应当不言而喻的是所要求保护的发明不应仅限于这类具体的实施方式。事实上，所述实施发明的方式的各种修改对生物化学和生物工程或有关领域技术人员来说是显而易见的，也属于权利要求书的范围。
通过对可以用于本发明的、包含在专利中的化合物的交叉引用，我们把治疗活性化合物定义为权利要求(具体为权利要求1)和具体实施例(全部引用在此作为参考)。
现在将借助实施例进一步描述发明，其中引用下列附图：
附图
图1为图形；
图2为图形；
图3为图形；
图4为核苷酸序列；
图5为核苷酸序列；
图6为核苷酸序列；
图7为核苷酸序列；
图8为核苷酸序列；
图9为核苷酸序列；
图10为图形。
更详细地：
图1显示NPY Y1拮抗剂BIBP3226(1-100pg/kg iv)对受刺激时麻醉兔海绵体内压力(ICP)的效果(*P＜0.05，学生T检验)；
图2显示PDE5抑制剂对受刺激时麻醉兔海绵体内压力(ICP)的效果。数据以相对对照增加的ICP增加百分率(*P＜0.01，学生T检验，与对照增加进行未成对比较)；
图3显示NPY Y1拮抗剂BIBP3226(0.03-0.3mg/kg)对麻醉兔平均动脉血压的效果。平均动脉压力值以平均±s.e.平均表示(n＝3)。浅灰色条代表给药之前的基础平均动脉压，深灰色条代表BIBP3226静脉内用药后的平均动脉压。白色条代表载体对照；
图4显示人神经肽Y(NPY)核苷酸序列(SEQ ID No.1)；
图5显示人NPY Y1受体核苷酸序列(SEQ ID No.2)；
图6显示人NPY Y2受体核苷酸序列(SEQ ID No.3)；
图7和8显示编码人SEP的核苷酸序列(cDNAs)(分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)。SEQ ID No.5包括5’和3’部分载体序列；
图9显示人SEP蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.6)；和
图10显示NPY Y1受体拮抗剂、PDE5抑制剂和NPY Y1受体拮抗剂与PDE5抑制剂的组合对麻醉兔受刺激时海绵体内压力(ICP)的效果。数据以相对对照增加的ICP增加百分率表示。
实施例
1.0方法
1.1动物试验方法
1.1.1麻醉兔工艺
向雄性新西兰兔(～2.5kg)预先给以美托咪定(Domitor)0.5ml/kg i.m.与氯胺酮(Vetalar)0.25ml/kg i.m.的组合，同时经由面罩维持氧摄取。利用PortexTM无管头气管内管3ID切开兔子的气管，与换气设备相连，使换气比率在每分钟30-40次呼吸，潮流气量大约18-20ml，最大气道压力为10cm H2O。然后转用异氟烷麻醉，继续用O2换气，速率为2L/min。向右耳缘静脉插23G或24G导管，按0.5ml/min灌注乳酸盐林格氏溶液。在侵入型手术期间向兔子给以3％异氟烷，维持麻醉时降至2％。暴露左颈静脉，分离，然后插PVC导管(17G)，用于灌注药物和化合物。
剪去兔子左腹股沟部位的皮毛，沿大腿作垂直切口，长5cm。暴露股静脉和动脉，分离，然后插PVC导管(17G)，用于灌注药物和化合物。关于股动脉反复插套管，插入套管至10cm深度，以确保导管到达腹主动脉。这支动脉导管与Gould系统相连，以记录血压。血液气相分析的样本也是经由动脉导管采集的。测量收缩压和舒张压，利用(舒张压×2+收缩压)/3计算平均动脉压。心率是经由脉冲式氧量计和Po-ne-mah数据获取软件系统(Ponemah Physiology Platform，GouldInstrument Systems Inc.)测量的。
对腹腔作腹侧中线切口。切口长约5cm，恰好在耻骨上方。在麻醉下切去脂肪和肌肉，露出下腹神经，它位于体腔下。有必要保持接近耻骨壁侧面曲线，目的是避免损伤位于耻骨上方的股静脉和动脉。坐骨与骨盆神经位于更深处，在进一步切开兔子背侧之后才能定位。一旦鉴别出坐骨神经，骨盆神经也容易被定位。术语骨盆神经的使用不严格；关于解剖学的书籍也没有对这些神经有详尽的鉴别。不过，刺激该神经导致海绵体内压力和海绵体血流增加，和骨盆区的神经支配。从周围组织剥离骨盆神经，在神经附近放置Harvard双极性刺激电极。略微抬高神经，产生一定的张力，然后将电极固定到位。在神经和电极附近放置大约1ml轻石蜡油。这充当神经的保护性润滑剂，防止血液污染电极。将电极与Grass S88刺激器连接。利用下列参数刺激骨盆神经：-5V，脉冲宽度0.5ms，刺激持续时间20秒，频率16Hz。当每15-20分钟刺激神经时，得到可再现的响应。利用上述参数进行若干次刺激，建立平均对照响应。利用Harvard 22输注泵，经由颈静脉输注供试化合物，实现连续的15分钟刺激周期。除去阴茎附近的皮肤和结缔组织，暴露阴茎。插入一组导管(Insyte-W，Becton-Dickinson 20 Gauge 1.1×48mm)，穿过白膜，进入左海绵体空间，除去针头，留下柔软的导管。该导管经由压力传感器(Ohmeda 5299-04)与Gould系统相连，以记录海绵体内压力。一旦确立海绵体内压力，利用Vetbond(组织粘合剂，3M)将导管密封在适当的位置。心率是经由脉冲式氧量计和Po-ne-mah数据获取软件系统(Ponemah Physiology Platform，GouldInstrument Systems Inc.)测量的。
记录海绵体内血流，它是利用Po-ne-mah数据获取软件(PonemahPhysiology Platform，Gould Instrument Systems Inc.)直接从流量计得到的，或者是间接从Gould图表记录痕迹得到的。校准设置在实验开始时(0-125ml/min/100g组织)。将NPY抑制剂溶于盐水+10％1M NaOH，将5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂溶于盐水+5％1M HCl。抑制剂和载体对照是按0.1ml/秒的速率输注的。在骨盆神经刺激之前，使NPY抑制剂和PDEcAMP抑制剂留置15分钟。
全部数据以平均±s.e.m.表示。利用学生t检验鉴别显著性改变。
2.0结果和讨论
2.1 NPY受体拮抗剂
存在大量勃起的麻醉动物模型，模拟阴茎勃起的生理过程，也就是阴茎血流和海绵体内压力增加。通过刺激支配阴茎的骨盆神经元，模仿性欲激发的效果。这是研究勃起机理和评估潜在的MED治疗剂的机理。
现已确立，选择性PDE5抑制剂、例如西地那非增强神经刺激的动物模型海绵体内压力(ICP)增加，神经刺激模拟在人类中观察到的勃起过程(Carter等，1998，Traish等，1999，Omote 1999，Wallis1999)。这种PDE5抑制剂诱导的ICP增强是PDE5抑制剂的作用机理的特征，解释了西地那非等药物如何克服与MED或阳痿有关的任何弛缓缺陷。与这些前人的研究相一致，下面的实施例已经证明静脉内给药的PDE5抑制剂加强神经刺激的麻醉兔ICP增加(实施例2)。
下面的实施例证明，用选择性NPY Y1受体拮抗剂(BIBP3226)抑制NPY受体，剂量依赖性地加强神经刺激的麻醉兔海绵体内压力增加(实施例1)。在该研究所用剂量下，利用NPY拮抗剂观察到与利用PDE5抑制剂(实施例2)相似的勃起过程增强作用。这些实施例强调了NPY受体拮抗剂疗法的潜在临床应用，用于增强勃起过程，因此治疗MED。
NPY或NPY Y1受体和PDE5受体的共同抑制产生比利用相同剂量单独的同一PDE5抑制剂更显著的ICP或勃起过程增强作用。利用兔勃起模型，我们能够证明由PDE5抑制诱导的ICP加强能够被NPY Y1受体拮抗剂的共同给药进一步加强。在PDE5抑制剂的1mg/kg(iv)剂量下，我们观察到最大的ICP加强作用，ICP能够被加强超过这种最大PDE5抑制剂介导的程度这一发现是非常意外的。这阐明了PDE5抑制剂与NPYY1受体抑制剂的共同给药产生优于单独的PDE5抑制剂疗法大量临床益处。这些包括增加了治疗对PDE5抑制剂疗法没有响应的MED的功效和机会。
NPY Y1受体拮抗剂和PDE5抑制剂或二者的组合对未受刺激的ICP没有显著效果，也就是说它们在没有性欲驱使/激发的存在下不会直接诱导ICP增加。这是非常有利的，因为需要性欲刺激才发挥作用的唯一其他已上市的MED疗法是西地那非，因而本发明提供有希望替代西地那非和所有其他单独的PDE5抑制剂类药物的口服疗法。
NPYi——动物模型实施例
用在实施例1至6中的化合物：
NPY受体拮抗剂：BIBP3226
Figure A0182055601111
BIBP3226对人天然NPY Y1的IC50为7nM，NPY Y1(人)选择性比NPY Y5(人)大1000倍，NPY Y1选择性比NPY Y2(人)大1000倍(参见Rudolf等(1994)和Jacques等(1995))。
PDE5i：3-乙基-5-{5-[4-乙基哌嗪磺酰基]-2-丙氧基苯基}-2-(2-吡啶基甲基)-6，7-二氢-2H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮，也已知为3-乙基-5-[5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)-2-正丙氧基苯基]-2-(吡啶-2-基)甲基-2，6-二氢-7H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(参见WO 98/491066)。对人天然PDE5的IC50为1.1nM，PDE5选择性比PDE3(均为人天然型)大90,000倍，优于PDE4的选择性是18,545倍。
所有引用的效力和选择性数值都是关于人天然型酶的(参见本文的测定法)。
实施例1
NPY Y1受体的抑制作用剂量依赖性地加强勃起的麻醉兔模型神经刺激的海绵体内压力增加
由神经刺激诱导的海绵体内压力(ICP)次最大增加在递增剂量的选择性NPY Y1受体拮抗剂(BIBP3226)的存在下(iv大丸剂)显著增加了。这种增加在30μg/kg和以上的剂量下变得更显著。在30μg/kg下观察到最大加强作用(大约127％)。数据以增加百分率(％)表示，与对照刺激的增加相比。数值以平均±s.e.平均表示。与对照增加进行未成对比较，*P＜0.05，学生t检验(见图1)。
NPY Y1受体拮抗作用对基础/未刺激的海绵体内压力没有明显影响。
实施例2
PDE5抑制作用显著增加PDE5抑制剂增强勃起的麻醉兔模型阴茎勃起的功效
选择性PDE5抑制剂的静脉内给药(1mg/kg)显著增强神经刺激的ICP增加达133±22％，与对照增加相比。数据以优于对照增加的ICP增加百分率表示。数值以平均±s.e.平均表示。与对照增加进行未成对比较，*P＜0.01，学生t检验(见图2)。
PDE5抑制作用对基础/未刺激的海绵体内压力没有影响。
实施例3
增强海绵体内压力的药物对麻醉兔平均动脉血压的影响
在寻找新的治疗男性性功能障碍、例如MED的疗法中，可取的是不存在有关的心血管副作用，例如对血压或心率的影响。在我们的研究中，我们已经发现NPY Y1受体拮抗剂BIBP3226(0.03-0.3mg/kg)对血压或心率没有实质性影响，该剂量类似于增强骨盆神经刺激的海绵体内压力增加。
BIBP3226(选择性NPY Y1拮抗剂)的静脉内给药对阴茎勃起的麻醉兔模型平均动脉血压没有实质性影响。图3证明，BIBP3226对麻醉兔平均动脉压没有显著影响，其剂量增强骨盆神经刺激的海绵体内压力增加。平均动脉压(MAP)的数值以平均±s.e.平均表示(n＝3)。浅灰色条代表给药之前的基础MAP，深灰色条代表BIBP3226静脉内用药后的MAP。白色条代表载体对照。与对照增加进行未成对比较，*P＜0.05，学生t检验。
实施例4
NPY 1受体拮抗剂显著增加PDE5抑制剂增强勃起的麻醉兔模型阴茎勃起的功效
选择性PDE5抑制剂的静脉内给药(1mg/kg)显著增强神经刺激的ICP增加达133％，与对照增加相比(见实施例2)。BIBP3226的静脉内给药(选择性NPY Y1拮抗剂，100μg/kg)显著增强神经刺激的ICP增加达110％，与对照增加相比。一旦NPY Y1拮抗剂介导的增加持续了，选择性PDE5抑制剂的共同给药(1mg/kg)进一步增强神经刺激的ICP增加，最大增加为350％(见图10)。加强作用的程度似乎大于利用NPY Y1拮抗剂与PDE5抑制剂的共同用药预期水平(也就是说，133％+110％＝243％，与350％相比)。数据以优于对照增加的ICP增加百分率表示。
PDE5抑制作用或联合的PDE5抑制作用/NPY Y1拮抗作用对基础/未刺激的海绵体内压力没有明显影响。
实施例5
在勃起的麻醉兔模型中，NPY Y1受体拮抗剂加强PDE5抑制剂的勃起效果，加速PDE5抑制剂的起效
早期研究提示，在麻醉兔模型中，NPY Y1受体拮抗剂有益地加强PDE5抑制剂的功效，加速PDE5抑制剂的起效。
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缩写
cAMP      ＝    环腺苷-3’，5’-一磷酸
cGMP      ＝    环鸟苷-3’，5’-一磷酸
PDE       ＝    磷酸二酯酶
PDEcGMP   ＝    cGMP水解性PDE
PDEi      ＝    PDE抑制剂(也已知为I：PDE)
PDE5      ＝    5型磷酸二酯酶
PDE5i     ＝    PDE5抑制剂
NPY       ＝    神经肽Y
NPYi      ＝    NPY抑制剂
NPY Y1    ＝    神经肽Y Y1受体
NPY Y1i   ＝    NPY Y1抑制剂
kDa       ＝    千道尔顿
bp        ＝    碱基对
kb        ＝    千碱基对

Claims (44)

1、神经肽Y(NPY)抑制剂在药剂制备中的用途，该抑制剂在使用时对与男性生殖器有关的NPY是有选择性的，该药剂用于男性勃起功能障碍(MED)的治疗或预防。
2、神经肽Y Y1受体(NPY Y1)抑制剂在药剂制备中的用途，该抑制剂在使用时对与男性生殖器有关的NPY Y1是有选择性的，该药剂用于MED的治疗或预防。
3、根据权利要求1或权利要求2的用途，其中所述抑制剂在使用时对位于男性生殖器中的NPY/NPY Y1是有高度选择性的。
4、根据权利要求1-3任意一项的用途，其中所述抑制剂对内肽酶NEP和/或血管紧张素转化酶没有或者基本上没有活性。
5、根据前述权利要求任意一项的用途，其中所述MED的治疗或预防是有选择性的。
6、根据前述权利要求任意一项的用途，其中观察到海绵体内压力的增加。
7、根据前述权利要求任意一项的用途，其中药剂是口服给药的。
8、根据前述权利要求任意一项的用途，其中所述抑制剂在使用时对与海绵体有关的NPY和/或NPY Y1受体是有高度选择性的。
9、根据前述权利要求任意一项的用途，其中所述NPY和/或NPY Y1抑制剂是在性欲激发之前和/或期间给药的。
10、NPY Y1抑制剂在药剂制造中的用途，该药剂用于选择性增加性欲激发期间的海绵体内压力。
11、用于治疗男性勃起功能障碍(MED)的药物组合物，该药物组合物包含神经肽Y(NPY)抑制剂，该抑制剂在使用时对与男性生殖器有关的NPY是有选择性的，其中该抑制剂是可选地与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的。
12、根据权利要求11的药物组合物，其中该抑制剂是NPY Y1抑制剂。
13、治疗或预防人或动物MED的方法，该方法包含对个体给以有效量的NPYi，该NPYi在使用时对与雄性生殖器有关的NPY是有选择性的，其中该NPYi是可选地与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的。
14、根据权利要求13的方法，其中该抑制剂是NPY Y1抑制剂。
15、治疗或预防人或动物MED的方法，该方法包含对个体给以NPYi，该NPYi能够选择性增加性欲激发期间的海绵体内压力。
16、根据权利要求15的方法，其中所述NPYi是NPY Y1i。
17、用于鉴定能够用于治疗MED的药物的测定方法，该测定法包含：测定供试药物是否能够直接增强内源性勃起过程，其中所述增强作用被定义为在供试药物的存在下加强海绵体内压力(和/或海绵体血流)，供试药物的这类加强作用表示该供试药物可能在MED的治疗中是有用的，其中所述供试药物是NPYi。
18、根据权利要求17的测定法，其中所述供试药物是NPY Y1。
19、根据权利要求17或18的测定法，其中所述供试药物选择性抑制与生殖器有关的NPY或NPY Y1受体。
20、一种方法，包含下列步骤：
(a)进行根据权利要求17-19任意一项的测定法；
(b)鉴定一种或多种能够抑制NPY或NPY Y1的药物；和
(c)制备一定量的一种或多种所鉴定的药物；
其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
21、根据权利要求20的方法，其中所述方法进一步包含测试所述一种或多种在步骤(b)中鉴定的药物对动脉血压的影响，选择对血压没有或者基本上没有影响的药物。
22、用于鉴定能够用于治疗或预防MED的药物的测定方法，该测定法包含：接触一种供试药物，它具有能够抑制肽(优选荧光标记的肽)代谢分解的部分，所述肽在正常情况下被NPY或NPY Y1所代谢；测量一定时间后剩余的肽活性和/或水平(例如经由荧光分析)；其中通过荧光测量的肽水平的变化表示供试药物的效力(IC50)，还表示该供试药物可能在MED的治疗中是有用的；其中所述供试药物是NPYi。
23、根据权利要求22的测定法，其中所述供试药物是NPY Y1。
24、利用药物治疗MED的方法，其中该药物在体外测定方法中能够抑制NPY或NPY Y1，其中该体外测定方法是如权利要求22-23任意一项所定义的测定方法。
25、由根据权利要求17-19或权利要求22-23的测定方法所鉴定的药物。
26、根据权利要求25的药物，用于治疗或预防MED。
27、用于口服给药治疗MED的药剂，其中该药剂包含根据权利要求25的药物。
28、一种诊断方法，其中该方法包含：从男性分离样本；测定该样本是否含有其含量足以导致MED的实体；其中该实体对男性海绵体的内源性勃起过程具有直接影响；其中利用一种药物能够调节所述实体，以实现有益效果，其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
29、诊断组合物或试剂盒，包含用于检测所分离的男性样本中实体的工具，其中该工具能够用于测定样本是否含有该实体，其含量是否足以导致MED，其中该实体对内源性勃起过程具有直接影响，其中利用一种药物能够调节所述实体，以实现有益效果，其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
30、用于鉴定能够治疗MED的药物的动物模型，所述模型包含一种麻醉动物，包括测量所述动物在刺激其骨盆神经之后的海绵体内压力和/或海绵体血流变化的工具，其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
31、根据权利要求30的动物模型，其中所述模型进一步包含测量所述动物动脉血压的工具。
32、一种测定方法，用于鉴定能够直接增强内源性勃起过程以治疗MED的药物，该测定方法包含：将药物对权利要求30或权利要求31的动物模型给药；测量内源性勃起过程的变化；其中所述变化被定义为在所定义的供试药物的存在下动物模型海绵体内压力(和/或海绵体血流)的加强作用；其中所述药物是NPYi或NPY Y1i。
33、根据权利要求1-10任意一项的用途，其中除了治疗MED以外，还治疗异常的饮食摄取障碍，具体为肥胖、食欲缺乏、食欲过盛和代谢障碍。
34、由一种或多种NPYi和一种或多种下列辅助性活性药物组成的组合在药剂制造/制备中的用途，该药剂用于MED的治疗或预防：
1)  天然存在或合成的前列腺素或其酯；
2)  α-肾上腺素能受体拮抗剂化合物；
3) NO供体(NO激动剂)化合物；
4)  钾通道开放剂或调节剂；
5)  多巴胺能剂，优选阿朴吗啡或选择性D2、D3或D2/D3激动剂；
6)  血管舒张剂；
7)  凝血吗烷A2激动剂；
8)  CNS活性剂；
9)  麦角生物碱；
10) 调节促尿钠排泄因子的化合物，具体为心房促尿钠排泄因子(也已知为心房促尿钠排泄肽)、B型与C型促尿钠排泄因子，例如中性内肽酶抑制剂；
11) 血管紧张素受体拮抗剂，例如洛沙坦；
12)NO合成酶底物，例如L-精氨酸；
13) 钙通道阻滞剂，例如氨氯地平；
14) 内皮素受体拮抗剂和内皮素转化酶抑制剂；
15) 胆固醇降低剂，例如他汀类(例如atorvastatin/Lipitor商标)和贝特类；
16)抗血小板与抗血栓形成剂，例如tPA、uPA、华法令、水蛭素和其他凝血酶抑制剂、肝素、促凝血酶原激酶活化因子抑制剂；
17) 胰岛素致敏剂，例如rezulin，和降血糖剂，例如格列吡嗪；
18) L-多巴或卡比多巴；
19) 乙酰胆碱酯酶抑制剂，例如donezipil；
20) 固醇类或非固醇类抗炎剂；
21) 雌激素受体调节剂和/或雌激素激动剂和/或雌激素拮抗剂；
22) PDE抑制剂，更具体为PDE2、3、4、5、7或8抑制剂，优选PDE2或PDE5抑制剂，最优选PDE5抑制剂；
23) NEP抑制剂；
24) 血管作用性肠蛋白(VIP)、VIP模拟物、VIP类似物，更具体地受到一种或多种VIP受体亚型VPAC1、VPAC或PACAP(垂体腺苷酸环化酶活化肽)、一种或多种VIP受体激动剂或VIP类似物或VIP片段、一种或多种α-肾上腺受体拮抗剂与VIP的组合的介导作用；
25) melanocortin受体激动剂或调节剂或增强剂；
26) 血清素受体激动剂、拮抗剂或调节剂，更具体为5HT1A(包括VML 670)、5HT2A、5HT2C、5HT3和/或5HT6受体的激动剂、拮抗剂或调节剂；
27) 睾酮替代剂(包括脱氢雄甾烯二酮)、睾酮(Tostrelle)、二氢睾酮或睾酮植入物；
28) 雌激素、雌激素与甲羟孕酮或乙酸甲羟孕酮(MPA)(也就是作为组合)，或者雌激素与甲基睾酮激素替代治疗剂；
29) 去甲肾上腺素、多巴胺和/或血清素的转运蛋白的调节剂；
30) 嘌呤能受体激动剂和/或调节剂；
31) 神经激肽(NK)受体拮抗剂；
32) 阿片类受体激动剂、拮抗剂或调节剂，优选ORL-1受体激动剂；
33) 催产素/后叶加压素受体激动剂或调节剂，优选选择性催产素激动剂或调节剂；
34) 大麻碱类受体调节剂；
35) 铃蟾肽受体拮抗剂，更具体为铃蟾肽BB1、BB2或BB3受体拮抗剂，优选铃蟾肽BB1抑制剂；
36) SEP抑制剂；
37) 能够调节个体性生殖器中的中级电导钙活化钾(IKCa)通道活性的药物。
35、由一种或多种NPYi和一种或多种PDEi组成的组合在药剂制造/制备中的用途，该药剂用于MED的治疗或预防。
36、根据权利要求35的用途，其中所述NPYi是NPY Y1i。
37、根据权利要求35或权利要求36的用途，其中所述PDEi是PDE5i。
38、根据权利要求35-37任意一项的用途，其中该药剂是口服给药的。
39、药物组合物，由一种或多种NPYi和一种或多种PDEi组成，可选地混合有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
40、根据权利要求39的药物组合物，其中所述NPYi是NPY Y1i。
41、根据权利要求39或40的药物组合物，其中所述NPY Y1i对与生殖器有关的NPY Y1受体是有高度选择性的。
42、根据权利要求39或权利要求41的药物组合物，其中所述PDEi是PDE5i。
43、根据权利要求39至42任意一项的药物组合物，其中该组合物是口服给药的。
44、根据权利要求39-43任意一项的药物组合物在药剂制备中的用途，该药剂用于MED的治疗或预防。
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