KR20030061441A - 남성 성기능 장애의 치료 - Google Patents

남성 성기능 장애의 치료 Download PDF

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Abstract

남성 발기 부전증 (MED)을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조/생산에 있어서 남성 생식기와 관련된 NPY 또는 NPY Y1 수용체에 대해 선택적인, 신경펩티드 Y (NPY), 바람직하게는 NPY Y1 수용체의 억제제의 용도.

Description

남성 성기능 장애의 치료{TREATMENT OF MALE SEXUAL DYSFUNCTION}
성기능 장애 (SD)는 남성 및 여성 모두에게 영향을 미칠 수 있는 중요한 임상적 문제이다. SD의 원인은 기질적 및 심리적 원인 모두일 수 있다. SD의 기질적 측면은 통상적으로 고혈압 또는 당뇨병에 연관된 것과 같은 근본적인 혈관 질환, 처방 의약 및(또는) 우울증과 같은 정신 질환에 의해 야기된다. 심리적 인자는 두려움, 수행 불안 및 대인 갈등을 포함한다. SD는 성 수행능력을 손상시키고, 자긍심을 감소시키고 대인 관계를 파괴함으로써 개인의 고통을 유발시킨다. 임상에서, SD 장애는 여성 성기능 장애 (FSD) 및 남성 성기능 장애 (MSD)로 나누어진다 (Melmanet al1999). FSD는 여성이 성 표현에서 만족감을 찾는데 있어서의 곤란또는 불능으로 가장 잘 정의된다. 남성 성기능 장애 (MSD)는 일반적으로 남성 발기 부전증 (MED)으로도 잘 알려진 발기 부전증과 관련되어 있다 (Benetet al1994).
남성 발기 장애로도 알려진 남성 발기 부전증 (MED)은:
"만족스러운 성기능 수행을 위한 음경 발기를 달성 및(또는) 유지할 수 없는 상태 (NIH Consensus Development Panel on Impotence, 1993)"로 정의된다.
모든 정도 (최소, 중등도 및 완전 불능)의 발기 부전증 (ED)이 40 내지 70 세 남성의 52%, 70세 이상에서는 더 높은 비율에 달하는 것으로 추정되었다 (Melmanet al1999). 이 질환은 개인 및 그의 배우자의 삶의 질에 상당히 부정적인 영향을 미치고, 우울증 및 자긍심의 저하에 이르게 되는 불안 및 긴장을 증가시키는 결과를 가져오는 경우가 많다. 20년 전, MED는 심리적 장애로 주로 여겨졌으나 (Benetet al1994), 현재는 대다수의 환자에게 있어서 근본적인 기질적 원인이 있는 것으로 알려졌다. 그 결과, 정상 음경 발기의 기전 및 MED의 병태생리를 확인하는 데 있어서 많은 발전이 있었다.
음경 발기는 음경해면체 평활근 및 음경의 맥관계의 수축 및 이완의 균형에 의존하는 혈역학적 사건이다 (Lerneret al1993). 음경해면체 평활근은 본원에서 해면체 평활근 또는 복수의 의미로 음경 해면체들로도 언급된다. 음경해면체 평활근의 이완은 음경 해면체의 지주 공간 (trabecular spaces)으로의 혈류 증가를 유도하여 주변의 막에 대하여 확장되게 하고 배수 정맥 (draining vein)을 압박한다. 이로 인해 혈압의 광범위한 상승이 유발되어 발기가 일어난다 (Naylor, 1998).
발기 과정 중 일어나는 변화는 복잡하고 말초 및 중추 신경계 및 내분비계를 관여시키는 고도의 통합된 조절을 필요로 한다 (Naylor, 1998). 해면체 평활근 수축은 시냅스후 α1아드레노셉터의 활성화를 통하여 교감신경 노르아드레날린성 신경자극에 의해 조절된다. MED는 음경 해면체의 내인성 평활근 긴장의 증가와 관련될 수 있다. 그러나, 음경 평활근 이완의 과정은 비아드레날린성, 비콜린성 (NANC) 신경전달에 의해 부분적으로 매개된다. NO 이외의 몇몇 다른 NANC 신경전달물질, 예를 들면 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) 및 혈관활성 장 펩티드 (VIP)가 음경에서 발견된다. 이 이완을 매개하는 원인이 되는 주요한 이완 인자는 산화질소 (NO)이고, 이는 산화질소 생성효소 (NOS)에 의해 L-아르기닌으로부터 합성된다 (Taubet al1993; Chuanget al1998). 해면체 평활근 긴장의 감소는 NO가 음경 해면체의 이완을 유도하는 것을 도울 수 있는 것으로 생각된다. 남성의 성적 흥분 중, NO는 뉴론 및 내피로부터 방출되고 평활근 세포 및 내피에 위치하는 가용성 구아닐레이트 시클라제 (sGC)에 결합하여 그것을 활성화시켜서, 세포내 시클릭 구아노신 3',5'-모노포스페이트 (cGMP) 수준을 상승시킨다. 이 cGMP 수준의 상승은 단백질 키나아제 G 활성화가 관여된다고 생각되는 알려지지 않은 기전 (Ca2+펌프 및 Ca2+-활성화 K+채널의 활성화에 기인할 가능성이 있음)을 통해 세포내 칼슘 농도 ([Ca2+]i)의 감소로 인한 음경 해면체의 이완을 유도한다 (Chuang et al., 1998).
실데나필 시트레이트 (비아그라TM으로도 알려짐)는 MED에 대한 첫번째 경구 약물 치료로서 화이자에 의해 최근 개발되었다. 실데나필은 음경 해면체에서 포스포디에스테라제 5 (PDE5)를 선택적으로 억제하여 cGMP 분해를 억제하고, 그럼으로써 cGMP의 5'GMP로의 가수분해를 제한하고 (Boolelet al., 1996; Jeremyet al., 1997) 그럼으로써 cGMP의 세포내 농도를 증가시키고 음경 해면체 평활근 이완을 용이하게 함으로써 작용한다.
현재, 시판되는 모든 다른 MED 요법, 예를 들면 프로스타글란딘 기반 화합물을 사용한 치료, 즉 요도내로 투여할 수 있거나 (비부스 인크 (Vivus Inc.)에서 뮤즈 (MuseTM)로서 시판됨) 작은 바늘로 주사되는 (파마시아 앤드 업존 (Pharmacia & Upjohn)에서 카버젝트 (CaverjectTM)로 시판됨) 알프로스타딜은 불편하고(하거나) 관혈적이다. 다른 치료는 진공 수축 장치, 혈관활성 약물 주사 또는 음경 보형물 이식 (Montague et al., 1996)을 포함한다. 주사가능한 혈관활성 약물이 높은 효능을 보이나, 음경 통증, 섬유증 및 지속발기와 같은 부작용이 자주 발생하고, 주사 요법은 경구 요법처럼 편하지 않으므로 실데나필은 시판되는 가장 바람직한 요법으로 대표된다.
따라서, 남성 성기능 장애, 특히 MED를 치료하는 새로운 방법을 찾는 것이 바람직하다.
요약 측면
본 발명의 독창적 발견은 신경펩티드 Y 억제제 (NPYi), 바람직하게는 NPY Y1수용체 억제제 (NPY Y1i)를 사용하여 말초 부작용 없이 성기능 장애, 특히 MED를 겪는 남성을 선택적으로 치료하는 능력이다. 놀랍게도 출원인은 또한 신경펩티드 Y 억제제 (이하에서는 NPYi로 언급함)를 사용하여 NPY, 바람직하게는 NPY Y1를 억제함으로써 신경-자극된 발기 과정을 현저히 증강시킬 수 있는 것을 발견했다. 이하에서는 용어 I:NPY 및 NPYi, 및 I:NPY Y1 및 NPY Y1i를 상호 교환하여 사용한다.
본원에 사용된 "말초 부작용이 없는"이라는 용어는 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i가 심혈관계에 활성이 없거나 실질적으로 없는 것을 의미한다. 따라서, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i는 심혈관계에서 활성이 없으므로, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i가 전신적으로 투여될 때 (즉, 경구로) 예를 들면 혈압 강하와 같은 심혈관계 사건의 가능성이 감소되거나 제거된다. 말초 부작용은 생식기 및(또는) 중추신경계 이외의 NPY 또는 NPY Y1 수용체의 억제에 기인하는 것이다. 본 발명에 따른 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i는 생식기에서 NPY, 바람직하게는 NPY Y1 수용체에 작용할 뿐만 아니라, 중추신경계에 중추적으로 작용하여 예를 들면 이상 음식물 섭취 장애, 예를 들면 비만, 거식증, 대식증 및 대사 장애를 효과적으로 치료할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i은 사용시 바람직하게는 생식기에 대한 것 이외에는 말초 활성, 즉 심혈관계 및(또는) 위장관계에 미치는 작용이 없거나, 실질적으로 없다. 따라서, 중추신경계에서는 일부 작용이 발생할 수 있으나 생식기계의 선택성이 있다.
본 발명에 따르면, 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료를 위한, 사용시 남성 생식기와 관련된 NPY 또는 NPY Y1 수용체에 대해 선택적이거나 매우 선택적인 신경펩티드 Y (NPY)의 억제제, 바람직하게는 NPY Y1 수용체의 억제제의 용도가 제공된다.
본 발명에 따르면, 신경-자극된 발기 과정을 증강시키기 위한, 사용시 남성 생식기와 관련된 NPY 또는 NPY Y1 수용체에 대해 선택적이거나 매우 선택적인 신경펩티드 Y (NPY)의 억제제, 바람직하게는 NPY Y1 수용체의 억제제의 용도가 제공된다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 사용하기 위한 NPY/NPY Y1 억제제는 100 나노몰농도 (nM) 미만, 바람직하게는 75 nM 미만, 더욱 바람직하게는 50 nM 미만의 IC50을 갖는다.
본원에 사용된 "선택적"이라는 용어는 본 발명에 따른 NPY 억제제가 남성 생식기에서, 바람직하게는 음경 해면체에서 NPY Y2 또는 NPY Y5 수용체에 비해 NPY, 특히 NPY Y1 수용체에 대해 약 100 배 보다 큰, 더욱 바람직하게는 약 300 배 보다 큰 선택성을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는 NPYi 또는 NPY Y1i는 엔도펩티다제 NEP EC 3.4.24.11 및(또는) 안지오텐신 전환 효소 (ACE)에 대한 활성이 없거나 실질적으로 없다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 NPY 또는 NPY Y1 억제제는 엔도텔린 전환 효소 (ECE)에 대한 활성이 없다. 적절히는, 본 발명에 따른 NPY 또는 NPY Y1 억제제는 NEP 및(또는) ACE에 비해 NPY/NPY Y1에 대해 300 배 보다 큰, 더욱 바람직하게는 500 배 보다 큰, 더욱 바람직하게는 1000 배 보다 큰 선택성을 갖는다. 바람직하게는 NPYi는 또한 ECE에 비해 1000 배 보다 큰 선택성을 갖는다.이는 NPYi 또는 NPY Y1i가 전신적으로 (예를 들면 경구로) 투여되었을 때 심혈관계 사건 (예를 들면 혈압 강하)의 가능성을 감소시킨다. "선택적으로"라는 용어는 이에 따라 해석되어야 한다.
본원에 사용된 "매우 선택적인"이라는 용어는 본 발명에 따른 NPY/NPY Y1 억제제가 남성 생식기 (특히 음경 해면체)에서 NPY Y2 또는 NPY Y5 수용체에 비해 NPY, 특히 NPY Y1 수용체에 대해 약 400 배 보다 큰 선택성, 바람직하게는 약 500 배 이상의 선택성, 바람직하게는 약 600 배 이상의 선택성, 바람직하게는 약 700 배 이상의 선택성, 바람직하게는 약 800 배 이상의 활성, 바람직하게는 약 900 배 이상의 활성, 바람직하게는 약 1000 배 이상의 선택성을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는 NPYi 또는 NPY Y1i는 NEP 및(또는) ACE 및(또는) ECE에 대한 활성이 없거나 실질적으로 없다. "매우 선택적으로"라는 용어는 이에 따라 해석되어야 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 사용하기 위한 NPY 억제제, 바람직하게는 NPY Y1 억제제는 사용시 생식 관에 대해 매우 선택적이다. 따라서, NPY 억제제, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도는 생식기에 집중된 활성을 나타내게 되고(되거나), 심혈관계에서의 활성이 없거나 실질적으로 없다. 이는 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i가 전신적으로 (예를 들면 경구로) 투여될 때 심혈관계 사건 (예를 들면 혈압 강하)의 가능성을 감소시킨다.
MED의 선택적 치료 및(또는) 선택적 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도가 또한 제공된다.
또한, MED의 선택적 치료 및(또는) 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도가 제공된다. 여기서, NPYi 또는 NPY Y1i는 본 발명에 따른 약제의 예를 들면 생산 단계 및(또는) 확인 제조 단계 및(또는) 변형 제조 단계에 사용될 수 있다.
음경에서 NPY의 보고된 기능은 발기를 지속시키기 위하여 음경 수준에서 발생하는 정맥 폐쇄 기전에서의 역할이다. 즉, NPY는 혈관수축제로서 작용하고 음경 정맥의 수축, 특히 음경으로부터의 혈류를 조절하는 혈관의 수축을 일으키는 것으로 보고되었다. 따라서, 발기 중 NPY는 음경 정맥의 수축을 일으키고, 그럼으로써 음경에서 음경 해면체로부터의 혈류를 막거나 감소시킴으로써 발기의 유지를 돕는 것으로 여겨진다. 본 발명 이전의 교시에 따르면, NPY의 억제가 음경 해면체로부터의 혈류를 조절하는 음경 정맥의 이완을 일으키는 것으로 기대되므로, NPYi 또는 NPY Y1i의 투여는 음경의 발기감퇴를 일으킬 것으로 기대되었다. 즉, 본 발명 이전에 NPY의 억제는 음경을 이완 상태로 유지할 것으로 기대되었다.
그러나 놀랍게도, 본 출원인들은 NPY 억제제의 사용, 특히 NPY Y1 수용체의 길항제의 사용이 음경의 해면체내압의 증가를 일으키고, 따라서 음경 발기를 용이하게 하고(하거나) 일으키는 것을 발견하였다. NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 사용으로 인한 해면체 내압의 증가는 바람직하게는 성적 자극 중 일어난다.
또한 사용시 바람직하게는 생식기에서 성적 반응과 관련된 NPY, 바람직하게는 NPY Y1 수용체에 매우 선택적인 억제제가 제공된다.
본 발명은 또한 사용시 음경 해면체의 해면체내압의 증가와 관련된 NPY 수용체, 바람직하게는 NPY Y1 수용체에 대해 매우 선택적인 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 제공한다.
본 발명은 또한 성적 흥분 중 해면체내(i.c.)압을 선택적으로 증가시키기 위한 의약의 제조에 있어서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도를 제공한다. NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i는 성적 흥분에 의해 매개되는 i.c.압의 증가를 유리하게 증강시키고, 적절하게는 본 발명의 NPY/NPY Y1 억제제는 성적 흥분에 의해 매개되는 i.c.압의 증가를 선택적으로 증강시킨다. NPYi 및(또는) NPY Y1i는 i.c.압을 증가시킴으로써, 예를 들면 생식기 혈류에 영향을 미침으로써 MED를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
특히 본 발명은 MED의 선택적 치료 및(또는) 선택적 예방에 사용하기 위한 화합물, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i 화합물을 제공한다.
NPY Y1 수용체의 억제제 이외에, 또는 그것의 사용 대신에 NPY Y2 수용체의 억제제가 사용될 수 있다. 본원에 사용된 NPYi라는 용어는 NPY Y2 억제제를 포함한다.
본 발명은 정상 성적 흥분 반응- 즉 음경의 발기로 유도하는 증가된 음경 혈류를 회복시키는 방법을 제공하므로 유익하다. 따라서, 본 발명은 정상 성적 흥분 반응을 회복하거나 강화하는 방법을 제공한다.
몇몇 NPYi, 특히 NPY Y1i 화합물을 약제로서 시험하였고, 내인성 발기 과정을 증강시키는데 유용하므로 MED의 치료에 유용하다는 것이 확인되었다. NPYi, 특히 NPY Y1i에 관련된 몇몇 실험 데이터를 실험 부분 (하기 참조)에 제시한다.
어떤 특정 이론에 한정되지 않고, 본원에서는 NPY, 및 특히 NPY Y1을 억제함으로써 음경 해면체 내 및 주변의 아데닐레이트 사이클라제 수준이 직접 또는 간접적으로 상승될 수 있다는 것이 제시된다. 이는 결국 음경 해면체 내 및 주변의 cAMP의 수준을 증가시킬 수 있다. 아데닐레이트 사이클라제 및(또는) cAMP 매개된 음경 해면체 혈관이완 및 음경 해면체로의 생식기 혈류의 증가된 정도가 증강될 수 있다.
자세한 측면
한 측면에서 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 및(또는) 선택적 예방에 사용하기 위한 (또는 사용시), NPYi (바람직하게는 NPY Y1i) 화합물 및 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 포함하는 제약 조성물, 및 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i로 이루어진 제약 복합제에 관한 것이다. 제약 조성물에서 NPYi 또는 NPY Y1i (및 존재한다면 PDEi 또는 PDE5i)는 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합된다. 여기서, 조성물 (본원에 언급된 다른 모든 조성물과 같이)은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 추후 사용하기 위하여 포장될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 선택적, 또는 매우 선택적인 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료를 위한 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 생산에 있어서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 선택적, 또는 매우 선택적인 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료를 위한 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 있어서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도에 관한 것이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 사용시 생식기에서 NPY, 바람직하게는 NPY Y1 수용체에 대해 선택적인 억제제인 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 포함하는 의약에 관한 것이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 투여하는 것을 포함하는, 선택적으로, 또는 매우 선택적으로 사람 또는 동물에서 MED를 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이고, 여기서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i는 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합된다.
추가적 측면에서, 본 발명은 말초 부작용 없이 성적 흥분 중 해면체내압을 선택적으로 증가시킬 수 있는 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 남성에거 전달하는 것을 포함하는, 남성 성기능 장애, 특히 MED를 겪는 남성을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한 1 이상의 구획이 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 포함하는, 1 이상의 구획을 포함하는 제약 팩이 제공된다.
본 발명은 또한 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 제약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 제약 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 및(또는) 선택적 예방 및 이상 음식물 섭취 장애, 특히 비만, 거식증, 대식증 및 대사 이상의 치료 및(또는) 예방 모두를 위한 의약의 생산 또는 제조에 있어서 본 발명에 따른 NPYi,바람직하게는 NPY Y1i의 용도를 제공한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED를 선택적으로 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있는 약제 (이하에서는 NPYi 또는 NPY Y1i를 의미한다)를 확인하는 분석 방법에 관한 것으로서, 이 분석 방법은 시험 약제가 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는지를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 증강은 본원에 정의된 시험 약제의 존재 하에서 해면체내(i.c.)압 (및(또는) 해면체 혈류)의 강화로서 정의되고; 시험 약제에 의한 이러한 강화는 시험 약제가 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 또는 예방에 유용할 수 있다는 것을 나타내고, 여기서 상기 시험 약제는 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i이다. 바람직하게는, 약제는 생식기와 관련된, 특히 음경 해면체와 관련된 NPY, 바람직하게는 NPY Y1 수용체를 억제한다. 바람직하게는 상기 약제는 동맥 혈압에 영향을 미치지 않거나 실질적으로 미치지 않는다.
예를 들면, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED를 치료 또는 예방하기 위하여 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이고, 상기 분석 방법은 펩티드 (바람직하게는 형광으로 표지된 펩티드)의 대사적 분해를 억제할 수 있는 부분을 갖는 시험 약제를 접촉시키는 단계 (상기 펩티드는 NPY 또는 NPY Y1에 의해 정상적으로 대사됨); 일정 시간 후 남아 있는 펩티드의 활성 및(또는) 수준을 (예를 들면 형광분석을 통하여) 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 형광에 의해 측정된 펩티드의 수준의 변화는 시험 약제의 효력(IC50)을 나타내고 시험 약제가 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료 또는 예방에 유용할 수 있음을 나타내고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은
(a) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행하는 단계;
(b) NPY, 바람직하게는 NPY Y1을 억제할 수 있는 1 이상의 약제를 확인하는 단계; 및
(c) 다량의 1 이상의 확인된 약제를 제조하는 단계 (여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다)
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이 측면에서, 단계 (b)에서 확인된 약제를 예를 들면 활성을 최대화하기 위하여 변형시킬 수 있고 단계 (a)를 반복할 수 있다. 이 단계들을 목적하는 활성 또는 약동학적 프로파일이 얻어질 때까지 반복할 수 있다.
따라서, 추가적 측면에서, 본 발명은 (a1) 본 발명에 따른 분석법을 수행하는 단계; (b1) 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는 1 이상의 약제를 확인하는 단계; (b2) 1 이상의 상기 확인된 약제를 변형하는 단계; (a2) 임의로 단계 (a1)을 반복하는 단계; 및 (c) 댜량의 상기 1 이상의 확인된 약제 (즉, 변형된 것)를 제조하는 단계 (여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다)를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가적 측면에서, 본 발명은
(i) 본 발명에 따른 분석 방법을 수행하는 단계;
(ii) NPY, 바람직하게는 NPY Y1을 억제할 수 있는 1 이상의 약제를 확인하는 단계;
(iii) 시험 동물, 예를 들면 마취된 토끼에서 동맥 혈압에 미치는 영향에 대해 확인된 약제를 시험하는 단계;
(iv) 동맥 혈압에 영향이 없거나 실질적으로 없는 약제를 선별하는 단계;
(v) 다량의 1 이상의 선별된 약제를 제조하는 단계 (여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다)
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이 측면에서, 단계 (b)에서 확인된 약제를 예를 들면 활성을 최대화하기 위하여 변형시킬 수 있고 단계 (a)를 반복할 수 있다. 이 단계들을 목적하는 활성 또는 약동학적 프로파일이 얻어질 때까지 반복할 수 있다.
추가적 측면에서, 본 발명은 약제 사용시의 해면체내압 또는 해면체 혈류를 측정하여 생체 내에서 (예를 들면 토끼에서) 신경 자극된 내인성 발기 과정을 강화함으로써 남성 성기능 장애, 특히 MED를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 약제는 시험관내 분석 방법에서 형광 펩티드 (상기에서 설명한 바와 같은)의 대사적 분해를 직접 억제할 수 있고, 여기서 시험관내 분석 방법은 본 발명에 따른 분석 방법이고, 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방을 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 약제의 용도에 관한 것이고,여기서 상기 약제는 본 발명에 따른 분석 방법에 의해 시험관 내에서 분석될 때 형광 펩티드의 대사적 분해를 직접 억제할 수 있고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방을 위한 제약 조성물의 생산에 있어서 약제의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 약제는 본 발명에 따른 분석 방법에 의해 시험관 내에서 분석될 때 형광 펩티드의 대사적 분해를 직접 억제할 수 있고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 남성 성기능 장애 (특히 MED)를 치료 또는 예방할 수 있는 약제를 확인하기 위하여 사용되는 동물 모델에 관한 것이고, 상기 모델은 동물의 골반 신경의 자극 후 상기 동물의 해면체 내압 및(또는) 해면체 혈류의 변화를 측정하는 수단을 포함하는 마취된 수컷 동물을 포함하고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
동물 모델은 상기 동물의 동맥 혈압을 측정하기 위한 수단을 더 포함한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 MED를 선택적으로 치료하거나 선택적으로 예방하기 위하여 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이고, 상기 분석 방법은 본 발명의 동물 모델에게 약제를 투여하는 단계; 및 내인성 발기 과정의 변화를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 변화는 정의한 바와 같은 시험 약제의 존재 하에서 동물 모델의 해면체내압 (및(또는) 해면체 혈류)의 강화로서 정의되고, 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 MED를 선택적으로 치료하거나 선택적으로 예방하기 위하여 동맥 혈압에 미치는 영향 없이 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법에 관한 것이고, 상기 분석 방법은 본 발명의 동물 모델에게 약제를 투여하는 단계; 및 내인성 발기 과정의 변화를 측정하는 단계 (여기서 상기 변화는 정의한 바와 같은 시험 약제의 존재 하에서 동물 모델의 해면체내압 (및(또는) 해면체 혈류)의 강화로서 정의됨); 동물 모델의 동맥 혈압을 측정하여 혈압이 변화하지 않거나 실질적으로 변화하지 않은 것을 확인하는 단계를 포함하고, 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 진단 방법에 관한 것이고, 상기 진단 방법은 남성에게서 시료를 단리하는 단계; 시료가 남성 성기능 장애, 특히 MED를 일으키는 양으로 존재하는 물질을 함유하는지 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 물질은 남성의 음경 해면체에서 내인성 발기 과정에 직접적 영향을 미치고, 여기서 상기 물질은 약제를 사용함으로써 유익한 효과를 얻도록 변형시킬 수 있고, 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
추가적 측면에서, 본 발명은 단리된 남성 시료 중의 물질을 검출하기 위한 수단을 포함하는 진단 조성물 또는 키트에 관한 것이고, 여기서 상기 수단은 시료가 물질을 포함하는지 또한 남성 성기능 장애, 바람직하게는 MED를 일으키는 양으로 포함하는지, 또는 남성 성기능 장애, 바람직하게는 MED를 일으키는 양으로 존재하는지를 결정하기 위하여 사용될 수 있고, 여기서 상기 물질은 내인성 발기 과정에 직접적 영향을 미치고, 여기서 상기 물질은 약제를 사용함으로써 유익한 효과를얻도록 변형시킬 수 있고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다.
놀랍게도, 또한 출원인은 NPYi, 특히 NPY Y1i로 NPY, 및 특히 NPY Y1을 억제함으로써 PDE 억제제, 특히 PDE5 억제제로 매개된 발기 과정의 증강이 현저하게 강화되는 것을 발견하였다.
NPY 및 NPY Y1 수용체가 몸 전체에 존재하므로, NPYi 및(또는) NPY Y1i가 전신적으로 투여되어 견딜 수 없는 (부정적) 부작용, 특히 견딜 수 없는 (부정적) 말초 부작용을 일으키지 않고 남성 생식기에서 치료 반응을 달성할 수 있다는 사실은 매우 예상하기 힘든 것이다. 이하의 생체내 (예를 들면 토끼)에서의 결과에서, NPY Y1i 단독 (특히 상기와 같은 선택성을 갖는 것) 및 NPYi/PDE5 복합제가 전신적으로 투여되었을 때 성적 흥분시 (골발 신경 자극에 의해 모방됨) 현저한 저혈압 또는 고혈압 효과 유발과 같은 심혈관계 파라미터에의 부정적 영향 없이 생식기 혈류를 증가되었다.
따라서, 본 발명의 추가적 측면에 따르면 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 전신 투여 (바람직하게는 경구, 예를 들면 삼킬 수 있는 정제 또는 캡슐, 또는 설하 또는 협측 제제)에 의한 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 용도가 제공된다.
따라서, 본 발명의 추가적 실시태양에 따르면 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방을 위한 의약의 생산/제조에 있어서 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 및 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i를 포함하는 복합제의 용도를 제공한다.
따라서 본 발명의 추가적 실시태양에 따르면 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료 또는 예방을 위한 의약의 생산/제조에 있어서 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 및 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i로 이루어진 복합제의 용도를 제공한다. 바람직하게는, NPYi, 특히 NPY Y1i 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i 만이 함께 사용된다.
바람직하게는 상기 복합 치료는 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i와 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 복합제를 포함한다. 더욱 바람직하게는 이러한 복합제는 MED의 치료를 위한 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i와 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 공동 투여를 위해 제공된다.
추가적 실시태양에서, 본 발명은 MED의 치료 또는 예방을 위한 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i와 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i를 포함하는 제약 조성물 (추가적 활성 성분/요소, 예를 들면 중성 엔도펩티다제 (NEP) 억제제와 같은 다른 억제제는 포함하지 않음)의 용도를 제공한다. 바람직하게는 제약 조성물은 MED의 치료를 위한 활성 성분/요소로서 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i와 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i만으로 이루어진다.
추가적 실시태양에서, 본 발명은 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i, 및 이하에 개시되는 하나의 추가적 보조 활성 약제를 포함하는 제약 조성물의 용도를 제공한다.
추가적 실시태양에 따르면, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합된 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 및 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i로 이루어진 제약 조성물을 제공한다.
본원의 결과는 이 복합제가 놀랍게도 혈압을 최소로 강하시키면서 전신적으로 (바람직하게는 경구로, 예를 들면 삼킬 수 있는 정제 또는 캡슐, 설하 또는 협측 제제) 투여될 수 있으므로 이 복합제를 사용하여 남성 성기능 장애의 전신적 치료를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
본 발명에 따른 MED의 선택적 치료 또는 예방을 위한 제약 조성물에 사용하기 위하여 특히 바람직한 것은 강력하고 선택적인 PDEi, 바람직하게는 PDE5i와 강력하고 선택적인 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 복합제이다.
따라서, 본 발명의 추가적 실시태양에 따르면, MED의 선택적 치료를 위한, 1 이상의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 및 1 이상의 PDEi, 바람직하게는 PDE5i로 이루어진 제약 조성물의 용도가 제공된다.
본원의 바람직한 실시태양에서, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i의 상기 복합 투여는 공동으로 이루어진다. 본원에서 정의되는 공동 투여란 PDEi (특히 PDE5i) 및 NPYi (특히 NPY Y1i)의 동시 (분리) 투여, 동시 복합 투여, 분리 투여, 복합 투여, 순차 투여 및 공동-조제된 복합 투여를 포함한다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 또한 PDEi (특히 PDE5i) 및 NPYi (특히 NPY Y1i)의 공동 투여가 PDE, 특히 PDE5만이 관련된 MED 요법에 의해 얻을 수 있는 것과 비교하여 효능의 증가를 이룰 수 있다는 것을 제시한다.
본 발명의 추가적 측면에 따르면, 본원에서는 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i의 공동 투여가 PDEi 또는 PDE5i 단독에 의해 얻을 수 있는 것에 비해 더 빠른 작용의 개시를 제공할 수 있다는 것을 제시한다. 즉, 본 발명은 MED의 치료를 위한 속효성 조성물의 용도를 추가적으로 제공한다. 본원에 정의되는 속효성 MED 조성물은 조성물 (NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i, 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i로 이루어짐)의 i.v. 투여 후 해면체내압 상의 최대 효과에 걸리는 시간이 PDEi 또는 PDE5i 단독의 동일 용량으로 얻어지는 동등 시간에 비하여 단축된다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 추가적 측면은 MED의 선택적 치료에 사용하기 위한, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i를 포함하는 속효성 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가적 측면은 MED의 선택적 치료에 사용하기 위한, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i로 이루어진 속효성 제약 조성물을 제공한다.
본원에서는 또한 NPY Y1i/PDE5i 복합제가 PDE5i의 효능을 증강시킬 수 있으므로 특정 효능에 요구되는 PDE5 억제제의 용량을 감소시킬 수 있다는 것이 제시된다. 본원에 정의된 NPY Y1i 및 감소된 양의 PDE5i를 포함하는 제제는 본 발명에 따른 NPY Y1i의 유효량과 결합될 때 PDE5i 단독의 요구되는 양에 비하여 특정 반응을 일으키기 위해 감소된 양의 일정 PDE5i가 요구된다는 것을 의미한다. MED의 치료를 위한 이러한 감소된 용량 조성물은 PDE5의 가능한 질산염 상호작용을 감소시킨다. 또한, 이는 예를 들면 약한 MED를 갖는 남성과 같은 특정 개체에 대해 바람직할 수 있다. 이는 특히 PDE5 억제제 단독 (예를 들면 실데나필)에 잘 반응하지 않는 개체에 특히 유익할 수 있다.
본원에서는 남성 성기능 장애의 선택적 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 경구로 투여되도록 적합화된 제약 복합제의 용도가 제공되고, 상기 복합제는 NPY 또는 NPY Y1에 대한 IC50이 각각 100 nM 미만이고 생식기에서 안지오텐신 전환 효소에 비한 NPY 또는 NPY Y1 수용체에 대한 선택성이 1000 보다 큰 NPY 또는 NPY Y1의 억제제, 및 PDE5에 대한 IC50이 100 nM 미만이고 PDE3에 비한 PDE5에 대한 선택성이 100 보다 큰 포스포디에스테라제 타입 5 효소 (PDE5)의 억제제를 포함한다.
바람직하게는, 본원에 사용된 PDE5i는 실데나필, 바람직하게는 실데나필 시트레이트이다.
추가적 측면에 따르면, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 사용하기 위한 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 있어서 단일 활성 성분으로서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i로 본질적으로 이루어진 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가적 측면에 따르면, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 사용하기 위한 의약 (예를 들면 제약 조성물)의 제조에 있어서 단일 활성 성분으로서 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i으로 이루어진 조성물의 용도에 관한 것이다.
본원에 사용된 "활성 성분"이라는 용어는 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 활성이 있는 성분을 의미한다.
용이한 참고를 위하여, 본 발명의 이 측면 및 추가적 측면은 이하에서 적절한 부분 제목 하에 논의된다. 그러나, 각 부분의 교시는 각 특정 부분에 반드시 한정되는 것은 아니다.
바람직한 측면
본 발명에 따른 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방에 사용하기 위한 약제는 바람직하게는 NPY 억제제 및(또는) NPY Y1 억제제이다.
본 발명에 따른 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방에 사용하기 위한 약제는 사용시 바람직하게는 신체의 다른 말초 부위, 예를 들면 심혈관계 및(또는) 위장관계의 NPY 및(또는) NPY Y1 수용체에 비하여 생식기의 NPY 및(또는) NPY Y1 수용체에 대해 매우 선택적이다.
본 발명에 따른 MED의 선택적 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제는 사용시 생식기의 NPY 및(또는) NPY Y1 수용체에 대해 매우 선택적일 뿐만 아니라 중추신경계의 NPY 및(또는) NPY Y1 수용체에 대해 활성이 있으므로 MED의 치료 또는 예방 및 음식물 섭취 장애 모두에 사용될 수 있다.
한 실시태양에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 용도를 위한 약제는 경구 투여용이다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 약제는 국소 투여 또는 해면체내 투여용일 수 있다.
본 발명은 또한 성적 흥분/자극 전 및(또는) 중의 본 발명의 약제의 투여를 포함한다. 이는 NPYi 또는 NPY Y1i가 생식기에서 활성이 있지만 예를 들면 심혈관계에서는 활성이 없도록 전신 선택성 활성을 제공할 수 있으므로 유익하다. 이 선택성은 약물학적 효과 보다는 생리적 효과에 기인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 측면에 대해서는 성적 흥분/자극 단계가 있는 것이 매우 바람직하다. 발명자들은 이 단계가 전신적 선택성을 제공할 수 있음을 발견하였다.
본원에서, "성적 흥분/자극"은 1 이상의 시각적 흥분/자극, 물리적 흥분/자극, 청각적 흥분/자극 또는 정신적 흥분/자극일 수 있다.
따라서, 바람직하게는 본 발명의 약제는 특히 이 약제가 경구 투여용일 때 성적 흥분/자극 전 또는 중에 전달된다.
그러므로, 이 바람직한 측면에 대하여, 본 발명은 남성 성기능 장애, 특히 MED의 선택적 치료 또는 선택적 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 약제의 용도를 제공하고, 여기서 상기 약제는 말초 부작용 없이 개체의 생식기의 NPY, 바람직하게는 NPY Y1를 억제할 수 있고, 여기서 상기 개체는 상기 의약의 투여 전 또는 중에 성적으로 흥분/자극된다.
바람직하게는, 상기 의약은 경구로 상기 개체에 전달된다.
또한, 이 바람직한 측면에 대하여, 본 발명은 개체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 개체에게 말초 부작용 없이 생식기의 NPY, 바람직하게는 NPY Y1을 억제할 수 있는 약제를 전달하는 것을 포함하고, 여기서 상기 약제는 MED를 선택적으로 치료하거나 선택적으로 예방하는 양이고, 여기서 상기 약제는 임의로 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되고, 여기서 상기 개체는 상기 약제의 투여 전 또는 중에 성적으로 흥분/자극된다.
바람직하게는 상기 약제는 상기 개체에 경구로 투여된다.
놀랍고 예기치 못한 발견
본 발명은 하기와 같은 놀랍고 예기치 못한 발견을 입증한다:
(a) NPY 수용체, 특히 NPY Y1 수용체의 억제가 해면체 내압을 증가시키므로 음경 발기를 용이하게 하거나 유발한다는 것;
(b) NPY 또는 NPY Y1을 억제하는 약제는 발기 반응을 증강시키는데 유용할 수 있고 말초 부작용 없이 MED와 같은 발기 부전을 극복하는 것을 도울 수 있다는 것;
(c) NPYi, 바람직하게는 NPY Yi의 전신적 (예를 들면 경구) 투여는 말초 부작용 없이, 특히 혈압 강하와 같은 부정적 심혈관계 사건을 일으키지 않고 MED의 선택적 치료를 일으킨다는 것;
(d) NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i의 전신적 투여는 이 약제가 생식기에 말초적으로 작용할 뿐만 아니라 (말초의 다른 부분에는 작용하지 않음에도 불구하고) 중추 신경계에도 작용할 수 있으므로 MED 또는 음식물 섭취 장애 모두의 선택적 치료 또는 선택적 예방에 유용할 수 있다는 것
(e) NPYi, 특히 NPY Y1i로 NPY, 및 특히 NPY Y1을 억제함으로써 PDE 억제제, 특히 PDE5 억제제로 매개된 발기 과정의 증강을 현저히 강화할 수 있다는 것.
이점
본 발명은 다음과 같은 이유로 유익하다:
(i) 생식기에서 NPY, 특히 NPY Y1 수용체를 억제하는 약제는 부정적 심혈관계 사건과 같은 부정적 부작용의 위험 없이 해면체내압 및(또는) 음경 해면체로의 혈류의 증가를 유도함으로써 정상 성적 반응, 예를 들면 남성 발기 반응을 선택적으로 예방하고(하거나) 선택적으로 치료하고(하거나) 선택적으로 회복시키는 수단을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 정상 발기 반응을 회복 또는 모방하는 수단을 제공한다.
(ii) 성적 흥분과 결합하여 NPY, 특히 NPY Y1의 억제를 통한 해면체내압 및(또는) 음경 해면체로의 혈류의 증가는 음경 해면체를 비롯한 생식기에 특이적이고 다른 말초계, 특히 심혈관계에는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 이 선택적 표적화는 MED를 치료하기 위하여 현재 사용되는 일부 혈관활성 약물과 관련된 위험 및 부작용 (예를 들면 혈압 강하)을 감소시키고(시키거나) 제거한다.
다른 이점은 상기 및 하기 설명에서 논의되고 명백해진다.
환자군
경증 내지 중등도 MED가 있는 환자는 NPYi 또는 NPY Y1i를 사용한 치료로부터 효과를 보게 되고, 중증 MED가 있는 환자도 또한 반응할 수 있다. 그러나, 초기 연구에서는 경증, 중등도 및 중증 MED가 있는 환자의 반응 비율이 NPY 또는 NPY Y1 억제제/PDE5 억제제 복합제를 사용하면 더 클 것이라고 제시한다. 경증, 중등도 및 중증 MED는 당업자에게 공지인 용어일 것이지만, 문헌 [The Journal of Urology, vol. 151, 54-61 (Jan 1994)]에서 지침을 찾아볼 수 있다.
초기 연구에 의하면 하기 MED 환자군은 NPYi/NPY Y1i 및 PDE5i (또는 하기 다른 복합제)를 사용한 치료로부터 효과를 보게 된다는 것이 제시된다. 문헌[Clinical Andrology vol. 23, no.4, p773-782] 및 모스비-울페 (Mosby-Wolfe)에서 출판된 아이. 이어들레이 (I. Eardley) 및 케이. 세티아 (K. Sethia)의 서적 [Erectile Dysfunction- Current Investigation and Management]의 3장에 상세히 기재된 이 환자군은 다음과 같다: 심인성, 기질성, 혈관성, 내분비성, 신경성, 동맥성, 약물-유도 성기능 장애 (최유성) 및 해면체 인자, 특히 정맥성 원인과 관련된 성기능 장애.
NPY
상기한 바와 같이, 상기 약제는 NPY의 억제제 (어떤 경우는 NPY 길항제로도 불린다)로서 작용할 수 있는 모든 적합한 약제일 수 있다.
NPY 및 그에 관련된 수용체에 대한 배경 기술 교시는 빅터 에이.맥쿠시크 (Victor A. McKusick) 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm에 제공되어 있다. NPY에 관한 하기 정보는 이 공급원에서 발췌한 것이다.
"신경펩티드 Y (NPY)는 포유류 신경계에 풍부하고 널리 분포하는 펩티드이다. 이는 펩티드 YY와 서열 상동성을 나타내고 췌장 폴리펩티드 (PNP; 167780)과 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 50%가 넘는 상동성을 나타낸다. NPY는 36 개의 아미노산 펩티드이다. 민트 (Minth) 등 (1984)은 크롬친화세포종의 mRNA로부터 출발하여 NPY 유전자를 클로닝하였다. 타케우치 (Takeuchi) 등 (1985, 1986)은 크롬친화세포종 및 췌장 내분비 종양으로부터 각각 NPY 및 PNP 유전자의 cDNA 클론을 단리하였다. 이 cDNA 탐침을 사용하여 인간-마우스 체세포 하이브리드의 염색체할당 패널로부터 게놈 DNA를 분석하여, 유전자가 신테닉 (syntenic)한지의 문제를 검증하였다. 이 연구에서 NPY는 7pter-7q22 상에 또한 PNP는 17p11.1-17qter 상에 존재하여 신테니가 없는 것으로 나타났다. 무스 스프레터스 (Mus spretus)를 사용한 역교배 연구에서, 바하리 (Bahary) 등 (1991)은 상동성 NPY 유전자를 마우스 6번 염색체에 매핑하였다. 마우스 6번 염색체가 인간 7q와 상동성이 있으므로, 사람에서 NPY 유전자는 7cen-q22 영역에 위치할 것이다. 메이슬러 (Meisler) 등 (1987)은 낭성 섬유증 (219700) 및 신경펩티드 Y에 대한 위치 사이에 밀접한 연관성을 배제하였다. 테렌지 (Terenghi) 등 (1987)은 인시투 (in situ) 혼성화 기술을 이용하여 외과적 생검 재료 및 사후 뇌의 대뇌 피질의 뉴론에서 NPY를 코딩하는 mRNA의 분포를 결정하였다. 이들은 정상 성숙 피질 뉴론에서 NPY 유전자 전사 및 발현이 일관성 있게 위치하는 것을 입증하였다. 베이커 (Baker) 등 (1995)은 형광 인시투 혼성화에 의해 NPY 유전자가 7p 15.1에 위치하고 단일 카피로 존재한다는 것을 입증하였다. 이들은 NPY가 예를 들면 사람과 상어 사이에 단지 3 개의 아미노산 차이만을 갖는 공지된 가장 고도로 보존된 펩티드 중의 하나라고 설명하였다. 신경펩티드 Y는 에너지 균형의 조절에 관련된 신경조절자이고 ob/ob 마우스의 시상하부에서 과다생산된다. 렙틴 (164160) 결핍에 대한 반응에서 NPY의 역할을 결정하기 위하여, 에릭슨 (Erickson) 등 (1996)은 NPY가 결핍된 ob/ob 마우스를 생성시켰다. NPY의 부재 하에서 ob/ob 마우스는 비만화가 덜 되었는데, 이는 음식 섭취가 감소하고 에너지 소비가 늘어났기 때문이며, 당뇨병, 불임증, 및 성장호르몬 결함에 의해 심각한 영향을 받는 정도가 감소하였다. 이 결과는 NPY가 렙틴 결핍의중심적 효과제라는 것을 나타내는 것으로 해석되었다. 알콜 선호에 대해 선택적으로 교배된 랫트의 유전적 연관 분석에 의해 NPY 유전자를 포함하는 염색체 영역이 확인되었다 (Carr et al., 1998). 알콜-선호 랫트는 알콜-비선호 랫트에 비해 몇몇 뇌 영역에서 NPY의 수준이 더 낮았다. 그러므로, 티엘레 (Thiele) 등 (1998)은 표적 유전자 파괴의 결과 NPY가 완전히 결핍된 마우스에 의한 알콜 소비에 대해 연구하였다 (에릭슨 등, 1996). 이들은 NPY-결핍 마우스가 야생형 마우스에 비해 6 %, 10% 및 20% (부피%) 에탄올을 함유하는 용액의 소비가 증가하는 것을 발견하였다. NPY-결핍 마우스는 또한 에탄올의 진정/수면 효과에 덜 민감하였는데, 이는 혈장 에탄올 농도가 대조군과 현저히 다르지 않으나 에탄올-유도 수면으로부터 더 빨리 회복되는 것으로 알 수 있었다. 대조적으로, 보통 NPY 유전자를 발현하는 뉴론에서 표지된 NPY 유전자를 과다발현하는 트랜스제닉 마우스는 에탄올에 대한 낮은 선호도를 가졌고, 대조군에 비해 에탄올의 진정/수면 효과에 더 민감하였다. 이 데이터는 알콜 소비 및 내성이 뇌의 NPY 수준에 역으로 관계된다는 직접적 증거를 제공한다. 비만의 유전적 기반에 대한 연구의 일부로서, 카르보넨 (Karvonen) 등 (1998)은 프리-프로-NPY의 신호 펩티드 부분의 잔기 7에서 프롤린으로 류신을 치환하는 결과를 일으키는 1128T-C 다형을 확인하였다. 이 다형은 비만 또는 에너지 대사와 관련이 없지만, 정상-체중 및 비만 핀란드인 및 비만 네덜란드 환자 모두에서 높은 혈청 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 수준과 현저하고 일관성 있게 관련되었다. 우시투파 (Uusitupa) 등 (1998)은 14%의 핀란드인에게서 프로7 다형을 발견하였지만, 네덜란드인에게서는 6%만이 발견되었다. NPY에 프로7을 갖는 환자는 이 유전자 변이체를 갖지 않는 환자에 비해 평균 0.6 내지 1.4 mmol/L의 더 높은 혈청 총 콜레스테롤 수준을 가졌다. 혈청 콜레스테롤 수준에 미치는 프로7 NPY의 영향이 정상-체중 네덜란드인에게서는 발견될 수 없었으므로, 비만한 사람이 이 유전자 변이체의 효과에 더 영향받기 쉬울 수 있다는 것을 추정할 수 있다. NPY에 프로7을 가질 확률은 총 혈청 콜레스테롤이 8 mmol/L 이상인 비만 환자에서 50 내지 60%일 정도일 수 있는 것으로 계산되었다. 적어도 핀란드인 중에는 NPY의 프로7 형태가 혈청 콜레스테롤 수준에 영향을 미치는 가장 강력한 유전적 인자 중의 하나이다. 문헌 [Allen and Bloom (1986)]; [Dockray (1986)]; [Maccarrone]; 및 [Minth et al. (1986)]을 또한 참고하라."
상기한 바와 같이, NPY 및 그에 관련된 수용체에 대한 배경기술 교시는 빅터 에이. 맥쿠시크 등 (상기 참조)에 의해 제공되었다. NPY Y1에 관한 하기 본문은 그 공급원으로부터 발췌된 것이다.
"신경펩티드 Y (NPY; 162640)는 포유류 신경계에 가장 풍부한 신경펩티드 중 하나이고 정신운동 활성, 음식 섭취, 중추 내분비물 분비의 조절, 및 심혈관계에서 강력한 혈관활성 효과를 포함하는 다양한 범위의 중요한 생리 작용을 나타낸다. NPY의 두 가지 주요 서브타입 (Y1 및 Y2)이 약물학적 기준에 의해 정의되었다. NPY Y1 수용체는 뇌, 비장, 소장, 신장, 고환, 태반 및 대동맥 평활근을 비롯한 다양한 조직에서 확인되었다. Y2 수용체는 주로 중추신경계에서 발견된다. 헤르조그 (Herzog) 등 (1992)은 인간 NPY 수용체를 코딩하는 cDNA의 클로닝을 보고하였고, 이 수용체를 G 단백질-결합 수용체 초군 (superfamily)의 구성원인 것으로 확인하였다. 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 또는 인간 배아 신장 세포에서 발현될 때, 이 수용체는 특징적인 리간드 특이성을 나타냈다. 신장 세포주에서, 이 수용체는 시클릭 AMP 축적의 억제를 매개하는 백일해 독소-민감성 G 단백질과 결합되었다. 반면, CHO 세포주에서 이 수용체는 아데닐 시클라제의 억제가 아니라 세포내 칼슘의 상승과 결합되었다. 따라서 NPY 수용체의 2차 전달물질 결합은 G 단백질의 특정 종류 및 세포 유형에 존재하는 효과물질 시스템에 의존하여 세포 유형에 따라 특이적이었다. 라르하마르 (Larhammar)등 (1992)는 독립적으로 신경펩티드 Y 수용체를 클로닝하고 특성을 확인하였다. 헤르조그 (Herzog) 등 (1993)은 인간 NPY Y1 수용체 유전자의 분자 구성 및 조절을 결정하였다. 대부분의 G 단백질-결합 수용체 유전자의 인접 구조와 대조적으로, 이들은 NPY Y1 수용체 유전자가 3 개의 엑손을 갖는 것을 확인하였다. 이들은 또한 유전자의 첫번째 인트론에서 공통의 Pstl 다형을 확인하였다. 고-해상 형광 인시투 혼성화에 의해, 이들은 이 유전자가 4q31.3-q32에 위치하는 것을 확인하였다. 헤르조그 등 (1997)은 NPY 1R 및 NPY 5R (602001) 유전자가 염색체 4q31-q32에 공돈 존재하는 것을 발견하였다. 이 두 유전자는 공통의 프로모터 영역으로부터 반대 방향으로 전사된다. 교대로 스플라이싱된 Y1 수용체 유전자의 5-프라임 엑손 중의 하나는 Y5 수용체의 코딩 서열의 일부이다. 헤르조그 등 (1997)은 이 보기 드문 배열을 통해 두 유전자가 유전자 복제 사건에 의해 발생하고 이들이 협력하여 발현될 수 있다는 것을 제시하였다. 종간 역교배 분석에 의하여, 루츠 (Lutz) 등 (1997)은 Npy1r 및 NPY2r 유전자를 인간 염색체 4q의 원위 영역에 해당하는 마우스 염색체 8 및 3상의 보존 연관 그룹에 각각 매핑하였다."
상기한 바와 같이, NPY 및 그에 관련된 수용체에 대한 배경기술 교시는 빅터 에이. 맥쿠시크 등 (상기 참조)에 의해 제공되었다. NPY Y2에 관한 하기 본문은 그 공급원으로부터 발췌된 것이다.
"신경펩티드 Y (NPY)는 뇌 및 교감신경 뉴론에 존재하는 G 단백질-결합 수용체의 군을 통해 신호를 전달한다. 약물학적 기준, 조직 분포 및 코딩하는 유전자의 구조 (162641 및 162643 참조)에 근거하여 3 유형 이상의 신경펩티드 Y 수용체가 정의되었다. 로즈 (Rose) 등 (1995)은 COS 세포에서 인간 타입 2 수용체, NPY2R에 대한 cDNA의 발현 클로닝을 보고하였다. 형질감염된 세포는 NPY (162640), 펩티드 YY (PYY; 600781) 및 아미노산 13 내지 36을 포함하는 NPY의 단편에 대해 높은 친화성을 나타냈다. 예측된 381개의 아미노산 단백질은 G 단백질 결합 수용체의 특징적 7 개의 막횡단 도메인을 갖고 인간 Y1 수용체 (NPY1R; 162641)과 31 % 만이 동일하다. 신경계의 몇몇 영역으로부터의 조직 시료의 노던 블롯 상에서 4-kb mRNA가 검출되었다. 제랄드 (Gerald) 등 (1995)은 방사성 표지된 PYY-결합 분석을 사용하여 인간 해마 cDNA 발현 라이브러리로부터 인간 Y2 수용체에 해당하는 cDNA를 클로닝하였다. 이들은 COS-7 세포에서 Y2 유전자를 발현시켰고 호르몬-결합 분석을 수행하여 Y2 수용체 (가장 높은 활성으로부터 가장 낮은 활성)가 PYY, NPY 및 췌장 폴리펩티드 (PP; 167780) 호르몬에 결합한다는 것을 입증하였다. 아마르 (Ammar) 등 (1996)은 타입 2 NPY 수용체를 코딩하는 인간 유전자를 클로닝하고 특성을 확인하였다. 전사체는 9 kb의 게놈 서열에 걸쳐 있고 2개의 엑손에 코딩된다. 타입 1 NPY 수용체 유전자에서와 같이, NPY2R의 5-프라임 비번역 영역은 4.5 kb의 개재 서열에 의해 방해된다. 아마르 등 (1996)은 설치류-인간 세포 하이브리드의 서던 분석에 이어 형광 인시투 혼성화 (FISH)에 의해 NPY2R 유전자가 NPY1R 유전자를 포함하는 영역과 같은 영역인 4q31에 매핑되는 것을 증명하였고. 이는 이 서브타입들이 이들의 구조적 차이에도 불구하고 유전자 복제에 의해 발생할 수 있음을 암시한다. 루츠 등 (1997)은 종간 역교배 분석에 의해 NPY1r 및 NPY2r 유전자를 인간 염색체 4q의 원위 영역에 해당하는 마우스 염색체 8 및 3 상의 보존 연관 그룹에 각각 매핑하였다."
NPY 서열 데이타
NPY 및 그의 수용체 (즉 NPY Y1)에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 문헌에서 입수 가능하다. 일부 서열을 도 4-6에 나타내었다.
NPY 억제제 및(또는) NPY Y1 억제제
NPYi (또는 NPY Y1i)를 확인하고(하거나) 연구하기 위한 적합한 분석 시스템의 세부 사항은 하기 NPY 분석이라는 제목의 부분에 기재하였고 WO-A-98/52890 (96 페이지, 2 내지 28행 참조)에 기재된 분석에 기초한 것이다.
NPY 억제제 또는 NPY Y1 억제제의 추가적 예는 하기 검토 문헌에 개시되고 논의되어 있다.
NPYi 및(또는) NPY Y1i의 추가적 예는 하기 문헌에 개시되어 있다.
NPY 억제제 및(또는) NPY Y1 억제제의 추가적 예는 하기 구조루부터 선택된다:
F57 R1= NR2R3-CO2H, 피페리디노, 모르폴리노R2= H, 알킬R3= NH2CH2CH=CH2, 4-(Me)피페라지노, 임의로 치환된 알킬, Ph I:NPYEP-0896822
F58 R = H, FR1= NEt2, 피페리디노, 피롤리디노, 2,5-Me2-피롤리디노, SO2NMe2, SO2NEt2X, Y = CH, N I:NPYEP-1033366
F59 R = 임의로 치환된 PhR1= 임의로 치환된 피페라지노, 테트라히드로피리딘-1-일, 피롤리디노 I:NPYWO-00/66578
NPY 분석
WO 98/52890 (96 페이지, 2-28 행)에 자세히 기재되어 있듯이, NPY에 화합물이 결합하는 능력은 문헌 [M.W. Walker et al, Journal of Neurosciences 8:2438-2446 (1988)]에 기재된 프로토콜을 본질적으로 사용하여 평가할 수 있다.
이 분석에서 세포주는 SK-N-MC가 사용되었다. 이 세포주는 뉴욕의 슬로안-케터링 메모리얼 병원 (Sloane-Kettering Memorial Hospital)에서 입수가능하다.
이 세포를 5% 소 태아 혈청이 보충된 둘베코스 최소 필수 배지 (DMEM)를 사용하여 T-150 플라스크에서 배양하였다. 세포를 긁어서 플라스크로부터 수작업으로 떼내어, 펠렛화하여, -70℃에서 저장하였다.
펠렛을 유리 호모게나이저를 사용하여 2.5 mM 염화칼슘, 1 mM 염화마그네슘 및 2 g/L 바시트라신을 함유하는 25 mM HEPES (pH 7.4) 완충액에 재현탁하였다. 0.1 nM125I-펩티드 YY (2200 Ci/mmol) 및 0.2-0.4 mg 단백질을 함유하는 200 ㎕ 최종 부피로 약 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
비특이적 결합은 1 μM 신경펩티드 Y의 존재 하에서 인큐베이션 후 조직에 잔류하여 결합되어 있는 방사능의 양으로서 정의하였다. 일부 실험에서 다양한 농도의 화합물을 인큐베이션 혼합물에 포함시켰다.
96 웰 하베스터 (harvester)를 사용하여 0.3% 폴리에틸렌이민 중에 미리 담궈둔 유리 섬유 필터를 통해 신속히 여과함으로써 인큐베이션을 종결시켰다. 필터를 4℃에서 5 ml의 50 mM 트리스 (pH 7.4)로 세척하고, 60℃에서 신속히 건조하였다. 그 후 필터를 멜트-온 (melt-on) 섬광 시트로 처리하고 필터에 남아있는 방사능을 계수하였다. 결과를 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. 표준 코마시 단백질 분석 시약을 사용하고 소 혈청 알부민을 표준물질로 하여 단백질 농도를 측정하였다.
복합제
더욱 상세하게는, 본 발명은 본원에 약술된 남성 성기능 장애 (특히 남성 발기 부전)의 치료를 위한 1 이상의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)와 본 발명의 화합물의 복합제를 더 포함한다. 이 복합제는 기질성, 혈관성, 신경원성, 약물 유도 및(또는) 심인성 기원의 발기 부전에 대한 치료를 제공한다.
본 발명은 본원에 약술된 남성 성기능 장애 (특히 남성 발기 부전)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 NPYi 또는 NPY Y1i 및 2 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 본질적으로 이루어진 복합제의 용도를 더 포함한다. 이 복합제는 기질성, 혈관성, 신경원성, 약물 유도 및(또는) 심인성 기원의 발기 부전에 대한 치료를 제공한다.
본 발명은 본원에 약술된 남성 성기능 장애 (특히 남성 발기 부전)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 NPYi 또는 NPY Y1i 및 2 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 이루어진 복합제의 용도를 더 포함한다. 이 복합제는 기질성, 혈관성, 신경원성, 약물 유도 및(또는) 심인성 기원의 발기 부전에 대한 치료를 제공한다.
본 발명은 본원에 약술된 남성 성기능 장애 (특히 남성 발기 부전)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 생산 또는 제조에 있어서 본 발명에 따른 NPYi 또는 NPY Y1i 및 1 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 본질적으로 이루어진 복합제의 용도를 더 포함한다. 이 복합제는 기질성, 혈관성, 신경원성, 약물 유도 및(또는) 심인성 기원의 발기 부전에 대한 치료를 제공한다.
본 발명은 본원에 약술된 남성 성기능 장애 (특히 남성 발기 부전)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 생산 또는 제조에 있어서 본 발명에 따른 NPYi 또는 NPYY1i 및 1 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 이루어진 복합제의 용도를 더 포함한다. 이 복합제는 기질성, 혈관성, 신경원성, 약물 유도 및(또는) 심인성 기원의 발기 부전에 대한 치료를 제공한다.
따라서, 본 발명의 추가적 복합제 측면은 본 발명의 화합물 및 1 이상의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)를 포함하는 제약 복합제 (동시, 분리 또는 순차 투여를 위한)를 제공한다.
본 발명의 또다른 추가적 복합제 측면은 NPYi 또는 NPY Y1i 및 2 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 본질적으로 이루어진 제약 복합제 (동시, 분리 또는 순차 투여를 위한)를 제공한다.
본 발명의 또다른 추가적 복합제 측면은 NPYi 또는 NPY Y1i 및 2 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 이루어진 제약 복합제 (동시, 분리 또는 순차 투여를 위한)를 제공한다.
본 발명의 또다른 추가적 복합제 측면은 NPYi 또는 NPY Y1i 및 1 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 본질적으로 이루어진 제약 복합제 (동시, 분리 또는 순차 투여를 위한)를 제공한다.
본 발명의 또다른 추가적 복합제 측면은 NPYi 또는 NPY Y1i 및 1 개의 보조 활성 약제 (적절한 예에 대한 하기 논의 참조)로 이루어진 제약 복합제 (동시, 분리 또는 순차 투여를 위한)를 제공한다.
보조 활성 약제
본 발명의 복합제에 사용하기 위한 적절한 보조 활성 약제는 하기를 포함한다:
1) 자연 발생 또는 합성 프로스타글란딘 또는 그의 에스테르. 본원에 사용하기에 적합한 프로스타글란딘은 알프로스타딜, 프로스타글란딘 E1, 프로스타글란딘 E0, 13,14-디히드로프로스타글란딘 E1, 프로스타글란딘 E2, 에프로스티놀, WO-00033825 및(또는) 2000년 3월 14일에 특허된 US 6,037,346호 (모두 본원에 인용함으로써 삽입됨)에 기재된 것을 포함하는 천연, 합성 및 반합성 프로스타글란딘 및 그의 유도체, PGE0, PGE1, PGA1, PGB1, PGF1α, 19-히드록시-PGA1, 19-히드록시-PGB1, PGE2, PGB2, 19-히드록시-PGA2, 19-히드록시-PGB2, PGE3α, 카르보프로스트 트로메타민 디노프로스트, 트로메타민, 디노프로스톤, 리포 프로스트, 게메프로스트, 메테노프로스트, 설프로스툰, 티아프로스트 및 목시실레이트와 같은 화합물을 포함함;
2) α-아드레노셉터 또는 α-수용체로도 알려진 α-아드레날린성 수용체 길항제 화합물 또는 α-차단제. 본원에 사용하기에 적합한 화합물은 1998년 6월 14일에 공개된 PCT 출원 W099/30697호에 기재된 α-아드레날린성 수용체 차단제를 포함하고, α-아드레날린성 수용체와 관련된 개시는 본원에 인용함으로써 삽입되고, 선택적 α1-아드레노셉터 또는 α2-아드레노셉터 차단제 및 비선택적 아드레노셉터 차단제를 포함하고, 적합한 α1-아드레노셉터 차단제는 펜톨아민, 펜톨아민 메실레이트, 트라조돈, 알푸조신, 인도라민, 나프토피딜, 탐술로신, 다피프라졸, 페녹시벤자민, 이다족산, 에파락산, 요힘빈, 라우볼피아 알칼로이드, 레코르다티 15/2739, SNAP 1069, SNAP 5089, RS17053, SL 89.0591, 독사조신, 테라조신, 아바노퀼 및 프라조신을 포함하고; α2-차단제는 US 6,037,346호 [2000년 3월 14일]에서의 차단제, 디베나르닌, 톨라졸린, 트리마조신 및 디베나르닌을 포함하고; 미국 특허 4,188,390; 4,026,894; 3,511,836; 4,315,007; 3,527,761; 3,997,666; 2,503,059; 4,703,063; 3,381,009; 4,252,721 및 2,599,000호 (이들 각각은 본원에 인용함으로써 삽입됨)에 개시된 바와 같은 α-아드레날린성 수용체 차단제; α2-아드레노셉터 차단제는 임의로 피륵사민 (pirxamine)과 같은 강심제의 존재하에 클로니딘, 파파베린, 파파베린 염산염을 포함함;
3) NO-공여체 (NO-효능제) 화합물. 본원에 사용하기 위한 적합한 NO-공여체 화합물은 유기 질산염, 예를 들면 모노-, 디- 또는 트리-질산염 또는 글리세릴 트리니트레이트 (니트로글리세린이라고도 알려짐), 이소소르비드 5-모노니트레이트, 이소소르비드 디니트레이트, 펜타에리트리톨 테트라니트레이트, 에리트리틸 테트라니트레이트, 소듐 니트로프루시드 (SNP), 3-모르폴리노시드노니민 몰시도민, S-니트로소-N-아세틸 페니실리아민 (SNAP), S-니트로소-N-글루타치온 (SNO-GLU), N-히드록시-L-아르기닌, 아밀니트레이트, 린시도민, 린시도민 클로로히드레이트, (SIN-1) S-니트로소-N-시스테인, 디아제늄 디올레이트, (NONOates), 1,5-펜탄디니트레이트, L-아르기넨, 인삼, 대추, 몰시도민, Re-2047, 공개된 PCT 출원 WO 0012075호에 기재된 NMI-678-11 및 NMI-937과 같은 니트로실화 막시실라이트 유도체를 포함하는유기 질산염 에스테르를 포함함;
4) 칼륨 채널 개방제 또는 조절제. 본원에 사용하기 위한 적합한 칼륨 채널 개방제/조절제는 니코란딜, 크로모칼림, 레브크로마칼림, 레마칼림, 피나시딜, 클리아족시드, 미녹시딜, 차리브도톡신, 글리부리드, 4-아미노 피리딘, BaCl2를 포함함;
5) 도파민성 약제, 바람직하게는 아포모르핀 또는 선택적 D2, D3 또는 D2/D3 효능제, 예를 들면 프라미펙솔 및 로피리놀 (WO-0023056에서 청구됨), PNU95666 (WO-0040226에서 청구됨)을 포함함;
6) 혈관확장제. 본원에 사용하기 위한 적합한 혈관 확장제는 니모데핀, 피나시딜, 시클란델레이트, 이속수프린, 클로로프로마진, 할로페리돌, Rec 15/2739, 트라조돈을 포함함;
7) 트롬복산 A2 효능제;
8) CNS 활성 약제;
9) 맥각 알칼로이드. 적합한 맥각 알칼로이드는 2000년 3월 14일에 등록된 미국 특허 6,037,346호에 개시되고, 아세테르가민, 브라제르골린, 브로메르구리드, 시아네르골린, 델로르고트릴, 디설레르긴, 에르고노빈 말리에이트, 에르고타민 타르트레이트, 에티설레르긴, 레르고트릴, 리세르기드, 메설레르긴, 메테르골린, 메테르고타민, 니세르골린, 페르골리드, 프로피세르기드, 프로테르구리드 및 테르구리드를 포함함;
10) 나트륨이뇨 인자, 특히 심방 나트륨이뇨 인자 (심방 나트륨이뇨 펩티드라고도 알려짐), B 타입 및 C 타입 나트륨이뇨 인자의 작용을 조절하는 화합물, 예를 들면 중성 엔도펩티다제의 억제제;
11) 안지오텐신 수용체 길항제, 예를 들면 로사르탄;
12) NO-생성효소에 대한 기질, 예를 들면 L-아르기닌;
13) 칼슘 채널 차단제, 예를 들면 암로디핀;
14) 엔도텔린 수용체의 길항제 및 엔도텔린 전환 효소의 억제제;
15) 콜레스테롤 저하제, 예를 들면 스타틴 (예를 들면 아토르바스타틴/리피토르TM) 및 피브레이트;
16) 항혈소판 및 항혈전제, 예를 들면 tPA, uPA, 와르파린, 히루딘 및 다른 트롬빈 억제제, 헤파린, 트롬보플라스틴 활성화 인자 억제제;
17) 인슐린 민감화제, 예를 들면 레줄린, 및 혈당강하제, 예를 들면 글리피지드;
18) L-도파 또는 카르비도파;
19) 아세틸콜린에스테라제 억제제, 예를 들면 도네지필;
20) 스테로이드 또는 비-스테로이드 항염증제;
21) 에스트로겐 수용체 조절제 및(또는) 에스트로겐 효능제 및(또는) 에스트로겐 길항제, 바람직하게는 랄록시펜 또는 라소폭시펜, (-)-시스-6-페닐-5-[4-(2-피롤리딘-1-일-에톡시)-페닐]-5,6,7,8-테트라히드로나프탈렌-2-올 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염 (이의 제조방법은 WO 96/21656호에 상술되어 있음).
22) PDE 억제제, 특히 PDE 2, 3, 4, 5, 7 또는 8 억제제, 바람직하게는 PDE2 또는 PDE5 억제제, 가장 바람직하게는 PDE5 억제제 (하기 참조), 상기 억제제는 바람직하게는 각 효소에 대하여 100nM 미만의 IC50을 가짐 (단 PDE3 및 4 억제제는 국소적으로 또는 음경 주사만으로 투여됨);
23) NEP 억제제, 바람직하게는 NEP에 대한 IC50이 300 nM 미만, 더욱 바람직하게는 100 nM 미만인 것;
24) 혈관활성 장 단백질 (VIP), VIP 모방약, VIP 유사체, 특히 1 이상의 VIP 수용체 서브타입 VPAC1, VPAC 또는 PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 펩티드)에 의해 매개되는 것, 1 이상의 VIP 수용체 효능제 또는 VIP 유사체 (예를 들면 Ro-125-1553) 또는 VIP 단편, VIP 복합제를 포함하는 1 이상의 α-아드레노셉터 길항제 (예를 들면, 인비코르프, 아빕타딜);
25) 멜라노코르틴 수용체 효능제 또는 조절제 또는 멜라노코르틴 증강제, 예를 들면 멜라노탄 II, PT-14, PT-141 또는 WO-09964002, WO-00074679, WO-09955679, WO-00105401, WO-00058361, WO-00114879, WO-00113112, WO-09954358에 청구된 화합물;
26) WO-09902159, WO-00002550 및(또는) WO-00028993호에 기재된 것을 포함하는 세로토닌 수용체 효능제, 길항제 또는 조절제, 특히 5HT1A (VML 670 포함), 5HT2A, 5HT2C, 5HT3 및(또는) 5HT6 수용체에 대한 효능제, 길항제 또는 조절제;
27) 테스토스테론 대체제 (데히드로안드로스텐디온을 포함), 테스토스테르논(토스트렐레 (Tostrelle)), 디히드로테스토스테론 또는 테스토스테론 임플란트;
28) 에스트로겐, 에스트로겐 및 메드록시프로게스테론 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA) (즉 복합제로서), 또는 에스트로겐 및 메틸 테스토스테론 호르몬 대체 요법제 (예를 들면, HRT 특히 프레마린, 세네스틴, 오에스트로페미날, 에퀸, 에스트레이스, 에스트로펨, 엘레스테 솔로, 에스트링, 이스트라덤 TTS, 이스트라뎀 매트릭스, 데르메스트릴, 프렘페이스, 프림프로, 프렘팩, 프레미크, 에스트라테스트, 에스트라테스트 HS, 티볼론);
29) 노르아드레날린, 도파민 및(또는) 세로토닌에 대한 운반체의 조절제, 예를 들면 부프로피온, GW-320659;
30) 퓨린성 수용체 효능제 및(또는) 조절제;
31) WO-09964008호에 기재된 것을 포함하는, 뉴로키닌 (NK) 수용체 길항제;
32) 오피오이드 수용체 효능제, 길항제 또는 조절제, 바람직하게는 ORL-1 수용체에 대한 효능제;
33) 옥시토신/바소프레신 수용체에 대한 효능제 또는 조절제, 바람직하게는 선택적 옥시토신 효능제 또는 조절제;
34) 카나비노이드 수용체의 조절제;
35) 봄베신 수용체 길항제, 특히 봄베신 BB1, BB2, 또는 BB3수용체 길항제, 바람직하게는 봄베신 BB1억제제 (하기 참조), 상기 억제제는 바람직하게는 각 효소에 대해 100 nM 미만의 IC50을 가짐;
35) SEP 억제제 (SEPi), 예를 들면 IC50이 100 nM 미만, 더욱 바람직하게는 50 nM 미만인 SEPi.
바람직하게는, 본 발명에 따른 SEP 억제제는 중성 엔도펩티다제 NEP EC 3.4.24.11 및 안지오텐신 전환 효소 (ACE)에 비해 SEP에 대해 30 배 보다 큰, 더욱 바람직하게는 50 배 보다 큰 선택성을 갖는다. 바람직하게는 SEPi는 또한 엔도텔린 전환 효소 (ECE)에 비해 100 배 보다 큰 선택성을 갖는다.
37) 개체의 성 생식기에서 중간 전도 칼슘-활성화 칼륨 (IKCa) 채널의 활성을 조절할 수 있는 약제.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 특허 및 특허 출원에 개시된 화합물을 본원에 상호 인용함으로써 발명자들은 청구항 (특히 제1항) 및 특정 실시예에 정의된 치료적 활성 화합물을 의미한다 (모든 특허 및 특허출원은 본원에 인용함으로써 도입된다).
활성 화합물의 복합제가 투여되는 경우, 동시, 분리 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
보조 약제-PDE5 억제제
특정 cGMP PDE5 억제제의 적합성은 문헌의 방법을 사용하여 그의 효력 및 선택성을 평가한 후 표준 제약 절차에 따라 그 독성, 흡수, 대사, 약동학 등을 평가함으로써 쉽게 결정할 수 있다.
cGMP PDE5 억제제에 대한 IC50 값은 PDE5 분석 (하기 참조)을 사용하여 결정할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 제약 복합제에 사용되는 cGMP PDE5 억제제는 PDE5 효소에 대해 선택적이다. 바람직하게는 (경구로 사용될 때) 이들은 PDE3에 비해, 더욱 바람직하게는 PDE3 및 PDE4에 비해 선택적이다. 바람직하게는 (경구로 사용될 때), 본 발명의 cGMP PDE5 억제제는 PDE3에 비해, 더욱 바람직하게는 PDE3 및 PDE4에 비해 100 보다 큰, 더욱 바람직하게는 300 보다 큰 선택성 비율을 갖는다.
선택성 비율은 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다. PDE3 및 PDE4 효소에 대한 IC50 값은 확립된 문헌의 방법을 사용하여 측정할 수 있고, 문헌 [S A Ballard et al, Journal of Urology, 1998, vol. 159, pages 2164-2171] 및 하기 설명을 참조하라.
본 발명에 따라 사용하기 위한 적합한 cGMP PDE5 억제제는 다음을 포함한다:
EP-A-0463756에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-0526004에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 93/06104에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 93/07149에 개시된 이성질체 피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 93/12095에 개시된 퀴나졸린-4-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 94/05661에 개시된 피리도[3,2-d]피리미딘-4-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 94/00453에 개시된 퓨린-6-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 98/49166에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 99/54333에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-0995751에 개시된피라졸로[4,3-d]피리미딘-4-온; 공개된 국제 특허 출원 WO 00/24745에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-0995750에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-4-온; 공개된 국제 출원 W095/19978에 개시된 화합물; 공개된 국제 출원 WO 99/24433에 개시된 화합물 및 공개된 국제 출원 WO 93/07124에 개시된 화합물. 공개된 국제 출원 WO 01/27112에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; 공개된 국제 출원 WO 01/27113에 개시된 피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; EP-A-1092718에 개시된 화합물 및 EP-A-1092719에 개시된 화합물.
본 발명에 따라 사용하기 위한 적절한 추가적 PDE5 억제제는 다음을 포함한다:
1-[[3-(6,7-디히드로-1-메틸-7-옥소-3-프로필-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)-4-에톡시페닐]설포닐]-4-메틸피페라진으로도 알려진 5-[2-에톡시-5-(4-메틸-1-피페라지닐설포닐)페닐]-1-메틸-3-n-프로필-1,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (실데나필) (EP-A-0463756 참조); 5-(2-에톡시-5-모르폴리노아세틸페닐)-1-메틸-3-n-프로필-1,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (EP-A-0526004 참조); 3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)-2-n-프로폭시페닐]-2-(피리딘-2-일)메틸-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (W098/49166 참조); 3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)-2-(2-메톡시에톡시)피리딘-3-일]-2-(피리딘-2-일)메틸-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (W099/54333 참조); 3-에틸-5-{5-[4-에틸피페라진-1-일설포닐]-2-([(1R)-2-메톡시-1-메틸에틸]옥시)피리딘-3-일}-2-메틸-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온으로도알려진 (+)-3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)-2-(2-메톡시-1(R)-메틸에톡시)피리딘-3-일]-2-메틸-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (W099/54333 참조); 1-{6-에톡시-5-[3-에틸-6,7-디히드로-2-(2-메톡시에틸)-7-옥소-2H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일]-3-피리딜설포닐}-4-에틸피페라진으로도 알려진 5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)피리딘-3-일]-3-에틸-2-[2-메톡시에틸]-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (WO 01/27113, 실시예 8 참조); 5-[2-이소-부톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)피리딘-3-일]-3-에틸-2-(1-메틸피페리딘-4-일)-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (WO 01/27113, 실시예 15 참조); 5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)피리딘-3-일]-3-에틸-2-페닐-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (WO 01/27113, 실시예 66 참조); 5-(5-아세틸-2-프로폭시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-이소프로필-3-아제티디닐)-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (WO 01/27112, 실시예 124 참조); 5-(5-아세틸-2-부톡시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-에틸-3-아제티디닐)-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (WO 01/27112, 실시예 132 참조); (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-헥사히드로-2-메틸-6-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-피라지노[2',1':6,1]피리도[3,4-b]인돌-1,4-디온 (IC-351), 즉, 공개된 국제 출원 W095/19978의 실시예 78 및 95의 화합물, 및 실시예 1, 3, 7 및 8의 화합물; 1-[[3-(3,4-디히드로-5-메틸-4-옥소-7-프로필이미다조[5,1-f]-as-트리아진-2-일)-4-에톡시페닐]설포닐]-4-에틸피페라진으로도 알려진 2-[2-에톡시-5-(4-에틸-피페라진-1-일-1-설포닐)-페닐]-5-메틸-7-프로필-3H-이미다조[5,1-f][1,2,4]트리아진-4-온 (바르데나필), 즉 공개된 국제 출원 W0 99/24433의 실시예 20, 19, 337 및 336의 화합물; 및 공개된 국제 출원 W0 93/07124 (EISAI)의 실시예 11의 화합물; 및 문헌 [Rotella D P, J. Med. Chem., 2000, 43, 1257]의 화합물 3 및 14.
또다른 적절한 PDE5 억제제는 4-브로모-5-(피리딜메틸아미노)-6-[3-(4-클로로페닐)-프로폭시]-3(2H)피리다지논; 1-[4-[(1,3-벤조디옥솔-5-일메틸)아미노]-6-클로로-2-퀴나졸리닐]-4-피페리딘-카르복실산, 일나트륨염; (+)-시스-5,6a,7,9,9,9a-헥사히드로-2-[4-(트리플루오로메틸)-페닐메틸-5-메틸-시클로펜트-4,5]이미다조[2,1-b]퓨린-4(3H)온; 푸라즐로실린; 시스-2-헥실-5-메틸-3,4,5,6a,7,8,9,9a-옥타히드로시클로펜트[4,5]-이미다조[2,1-b]퓨린-4-온; 3-아세틸-1-(2-클로로벤질)-2-프로필인돌-6-카르복실레이트; 3-아세틸-1-(2-클로로벤질)-2-프로필인돌-6-카르복실레이트; 4-브로모-5-(3-피리딜메틸아미노)-6-(3-(4-클로로페닐)프로폭시)-3(2H)피리다지논; I-메틸-5(5-모르폴리노아세틸-2-n-프로폭시페닐)-3-n-프로필-1,6-디히드로-7H-피라졸로(4,3-d)피리미딘-7-온; 1-[4-[(1,3-벤조디옥솔-5-일메틸)아미노]-6-클로로-2-퀴나졸리닐]-4-피페리딘카르복실산, 일나트륨 염; 파마프로젝트 (Pharmaprojects) No. 4516 (Glaxo Wellcome); 파마프로젝트 No. 5051 (Bayer); 파마프로젝트 No. 5064 (Kyowa Hakko; WO 96/26940 참조); 파마프로젝트 No. 5069 (Schering Plough); GF-196960 (Glaxo Wellcome); E-8010 및 E-4010 (Eisai); Bay-38-3045 & 38-9456 (Bayer) 및 Sch-51866을 포함한다.
시클릭 구아노신 3',5'-모노포스페이트 (cGMP) 및 시클릭 아데노신 3',5'-모노포스페이트 (cAMP) 포스포디에스테라제에 대한 시험관내 PDE 억제 활성을 이들의 IC50값(효소 활성의 50% 억제에 요구되는 화합물의 농도)을 측정함으로써 결정하였다.
필요한 PDE 효소는 본질적으로 문헌 [W.J.Thompson and M.M.Appleman, Biochem., 1971,10, 311]의 방법에 의해, 사람 음경 해면체, 사람 및 토끼 혈소판, 사람 심실, 사람 골격근 및 소 망막을 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리하였다. 특히, cGMP-특이성 PDE (PDE5) 및 cGMP-억제된 cAMP PDE (PDE3)는 사람 음경 해면체 또는 사람 혈소판으로부터 얻었고; cGMP-자극된 PDE (PDE2)는 사람 음경 해면체 및 사람 혈소판으로부터 얻었고; 칼슘/칼모둘린 (Ca/CAM)-의존성 PDE (PDE1)는 사람 심실로부터; cAMP-특이성 PDE (PDE4)는 SF9 세포에서 발현된 사람 골격근 및 사람 재조합체로부터; 광수용체 PDE (PDE6)는 사람 또는 소 망막으로부터 얻었다. 포스포디에스테라제 7-11은 SF9 세포로 형질감염된 전장 사람 재조합 클론으로부터 생성되었다.
분석은 문헌 [W.J.Thompson et al., Biochem., 1979,18, 5228]의 "배치" 방법의 변형을 사용하거나 제품 코드 TRKQ7090/7100 하의 아머샴 (Amersham) plc에 의해 기재된 프로토콜의 변형을 사용하여 AMP/GMP의 직접 검출을 위한 섬광 근접 분석법 (scintillation proximity assay)를 사용하여 수행할 수 있다. 요약하면, PDE 억제제의 효과는 IC50≒ Ki가 되도록 다양한 억제제 농도 및 낮은 기질 (∼1/3Km의 농도로, 비표지된 것 대 [3H]-표지된 것의 비율이 3:1인 cGMP 또는 cAMP )의 존재 하에 고정된 양의 효소를 분석함으로써 연구하였다. 최종 분석 부피는 분석 완충액 [20 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민]으로 100㎕ 이하로 제조하였다. 효소를 사용하여 반응을 개시하고, 30-60분 동안 30℃에서 인큐베이션하여 <30% 기질 전환이 되었고, 50㎕ 이트륨 실리케이트 SPA 비드 (PDE9 및 11에 대해 3mM의 각각 비표지된 시클릭 뉴클레오티드를 함유)를 사용하여 종결시켰다. 플레이트를 재-밀봉하고 20 분 동안 진탕하고, 그 후 비드를 30 분 동안 암소에서 정치시킨 후 톱카운트 (TopCount) 플레이트 리더 (Packard, Meriden, CT)에서 계수하였다. 방사능 단위를 억제되지 않은 대조군의 % 활성 (100%)으로 전환시켜서, 억제제 농도에 대하여 플롯하였고 '피트 커브' 마이크로소프트 엑셀 익스텐션 (또는 자체 개발된 등가물)을 사용하여 억제제 IC50값을 얻었다. 이 시험에서의 결과는 본 발명의 화합물이 cGMP-특이성 PDE5의 억제제라는 것을 나타낸다.
기능적 활성은 문헌 [S. A. Ballard et al. (Brit. J. Pharmacol., 1996, 118(suppl.), abstract 153P] 또는 [S. A. Ballard et al., Urology, 1998, 159, 2164-2171]에 기재된 바에 근거한 방법을 사용하여, 본 발명의 화합물이 시험관내에서 미리 수축시킨 토끼의 음경 해면체 조직 스트립의 소듐 니트로프루시드 또는 전기장 자극-유도 이완을 증강시키는 능력을 측정함으로써 평가할 수 있다.
문헌 [Trigo-Rocha et al., Neurourol. and Urodyn., 1994,13, 71)에 기재된 바에 기초한 방법을 사용하여, 화합물이 iv로 투여된 후, 소듐 니트로프루시드의 해면체내 주사에 의해 유도된 음경 해면체내 압력 상승을 증강시키는 능력을 측정하기 위하여 마취된 토끼와 같은 시험 동물에서 화합물을 생체내 스크리닝할 수 있다.
본원의 제약 조성물에서 NPYi와의 복합제로 사용하기에 매우 바람직한 것은 강력하고 선택적인 PDE5 억제제이다.
특히 본원에서 바람직한 것은, 1 이상의 매우 선택적인 NPY Y1 수용체 억제제와 1 이상의 강력하고 선택적인 cGMP PDE5 억제제의 복합제이다.
보조 약제- NEP 억제제 (I:NEP = NEPi)
엔케팔리나제 (enkephalinase) 또는 네프릴리신 (neprilysin)으로도 알려진 NEP EC3.4.24.11 (FEBS Lett. 229(1), 206-210 (1998))는 아연-의존적 중성 엔도펩티다제이다. 이 효소는 소수성 아미노산 잔기의 아미노 쪽의 펩티드 결합을 절단하여, 몇몇 생체활성 올리고펩티드의 분해에 관여한다 (문헌 [Turner et al., 1997]에 검토되어 있음). NEP에 의해 대사된 신경세포에서 방출된 생체활성제 또는 신경펩티드는 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP) 및 뇌 나트륨이뇨 펩티드 및 C-형 나트륨이뇨 펩티드와 같은 나트륨이뇨 펩티드, 봄베신, 브라디키닌, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드, 엔도텔린, 엔케팔린, 뉴로텐신, 물질 P 및 혈관활성 장 펩티드를 포함한다. 이들 펩티드 중 일부는 강한 혈관확장성 및 신경호르몬 기능, 이뇨 및 나트륨이뇨 활성을 갖거나 행동 효과를 매개한다. NEP에 대한 배경기술 교시는 빅터 에이. 맥쿠시크 등에 의해 http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm에 제공되어 있다.
특정 I:NEP의 적합성은 문헌의 방법을 사용하여 그의 효력 및 선택성을 평가한 후 표준 제약학적 절차에 따라 그의 독성, 흡수, 대사, 약동학 등을 평가함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
바람직하게는, I:NEP는 ACE에 비해 300보다 큰 선택성을 갖는다.
IC50 값 및 ACE에 대한 선택성 비율은 EP 1097719A1에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
NEP 억제제의 예는 하기 검토 문헌에 개시되고 논의되어 있다: Pathol. Biol., 46(3), 1998, 191; Current Pharm. Design, 2(5), 1996, 443; Biochem. Soc. Trans., 21(3), 1993, 678; Handbook Exp. Pharmacol., 104/1, 1993, 547; TiPS, 11, 1990, 245; Pharmacol. Rev., 45(1), 1993, 87; Curr. Opin. Inves. Drugs, 2(11), 1993, 1175; Antihypertens. Drug, (1997), 113; Chemtracts, (1997), 10(11), 804; Zinc Metalloproteases Health Dis. (1996), 105; Cardiovasc. Drug Rev., (1996), 14(2), 166; Gen. Pharmacol., (1996), 27(4), 581; Cardiovasc. Drug Rev., (1994), 12(4), 271; Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., (1995), 22(1), 63; Cardiovasc. Drug Rev., (1991), 9(3), 285; Exp. Opin. Ther. Patents (1996), 6(11), 1147.
NEP 억제제의 추가적 예는 하기 문헌에 개시되어 있다: EP-509442A; US-192435; US-4929641; EP-599444B; US-884664; EP-544620A; US-798684; J. Med. Chem. 1993, 3821; Circulation 1993, 88(4), 1; EP-136883; JP-85136554; US-4722810; Curr. Pharm. Design, 1996, 2, 443; EP-640594; J. Med. Chem. 1993,36(1), 87; EP-738711-A; JP-270957; CAS #115406-23-0; DE-19510566; DE-19638020; EP-830863; JP-98101565; EP-733642; WO9614293; JP-08245609; JP-96245609; WO9415908; JP05092948; WO-9309101; WO-9109840; EP-519738; EP-690070; J. Med. Chem. (1993), 36, 2420; JP-95157459; Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996, 6(1), 65; EP-A-0274234; JP-88165353; Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989,164, 58; EP-629627-A; US-77978; Perspect. Med. Chem. (1993), 45; EP-358398-B.
NEP 억제제의 추가적 예는 EP 1097719-A1에, 특히 화합물 FXII 내지 FXIII로 개시되어 있다.
바람직한 NEP 억제제는 EP 1097719-A1의 화합물 FV 내지 FXI 및 F57 내지 F65이다.
보조 약제- 봄베신 수용체 길항제
봄베신 수용체 길항제는 남성 성기능 장애, 특히 약물-유도된 남성 성기능 장애 및 일반화된 무반응성 및 노화-관련 성적 흥분성 감퇴와 관련된 심인성 남성 성기능 장애의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다.
봄베신 수용체 길항제인 화합물을 특히 여성에 대한 예측 능력을 갖는 신뢰성 있고 예측성 있다고 여겨지는 동물 모델을 사용하여 시험하였다. 설치류에서 프로셉티브 (proceptive) 행동은 호르몬 조절 하에 있고, 이 중 프로게스테론이 에스트로겐과 함께 프로셉티브 행동을 유도하는데 필수적이다 (Johnson M andEveritt B., Essential Reproduction (3rdedn), Blackwell, Oxford, 1988). 영장류에서 프로셉티브 행동의 호르몬적 조절에 대한 증거는 상충되나, 전체적으로 에스트로겐 및/또는 안드로겐이 프로셉티브 행동을 증강스키는 것으로 보인다 (Baum M.J., J. Biosci., 1983; 33:578-582). 랫트에서 프로셉티브 행동의 행동적 발현은 귀의 빠른 진동과 함께 "뛰기 및 돌진" 운동을 포함한다. 성적 접촉을 찾으려는 욕구 (성적 동기화)를 평가하기 위한 시험은 프로셉티버티 (proceptivity)를 측정하기 위해 가장 적절한 방법으로 보고되었다 (Meyerson B.J., Lindstorm L.H., Acta Physiol. Scand., 1973; 389 (Supp.): 1-80). 랫트에서 수용성 (receptivity)은 암컷이 전만위 (lordotic position)를 취했을 때 입증된다. 이는 올라탔을 때 수컷이 앞발로 수용성 암컷의 측복부에 압력을 가할 때 발생한다. 이 행동에 대한 신경 조절의 주요 부위는 복내측핵 (VMN) 및 중뇌 중심 회색질 영역 (MCG)이다 (검토를 위해, 문헌 [Wilson C.A., In: Sexual Pharmacology, Riley A.J. et al, (Eds), Clarendon Press, Oxford, 1993: 1-58] 참조).
봄베신은 원래 유럽 개구리봄비나 봄비나 (Bombina bombina)의 피부로부터 단리된 14-아미노산 펩티드이다 (Anastasi A. et al., Experientia, 1971; 27:166). 이는 C-말단 데카펩티드 영역에 구조적 상동성을 갖는 펩티드의 일종에 속한다. (Dutta A.S., Small Peptides; Chemistry, Biology, and Clinical Studies, Chapter 2, pp 66-82). 현재, 두 가지 포유류 봄베신-유사 펩티드가 확인되었고, 이는 데카펩티드인 뉴로메딘 B (NMB) 및 23-잔기 아미노산인 가스트린-분비 펩티드 (GRP)이다.
봄베신은 불균질한 집단의 수용체에의 작용을 통해 다수의 중추 효과를 일으킨다. BB1수용체는 가스트린-관련 펩티드 (GRP) 및 뉴로메딘 C (NMC)보다 뉴로메딘 B (NMB)에 더 높은 친화성으로 결합하고 BB2수용체는 NMB 보다 GRP 및 NMC에 더 높은 친화성으로 결합한다. 최근 BB3및 BB4로 명명된 두 개의 수용체 서브타입이 더 존재한다는 증거가 나타났지만, 제한된 약물학적 특성으로 인해, 현재 이들의 기능은 별로 알려지지 않았다. BB1및 BB2수용체는 중추신경계 내에 불균질하게 분포하고 이는 이 수용체에 대한 내인성 리간드가 신경전달을 차별적으로 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. 다른 영역 중에서, BB1수용체는 시상하부 복내측에 존재한다 (Ladenheim E.E et al, Brain Res., 1990; 537:233-240).
포유류 뇌에서 봄베신-유사 면역활성 및 mRNA가 검출되었다 (Braun M., et al., Life. Sci., 1978; 23:2721) (Battey J. et al., TINS, 1991; 14:524). NMB 및 GRP는 다양한 생물학적 작용을 매개하는 것으로 생각된다 (검토를 위하여 WO 98/07718 참조).
하기 특허 출원은 봄베신 수용체에서 NMB 및(또는) GRP의 효과에 길항할 수있는 화합물을 개시한다:
발명자들은 이 출원에 개시된 화합물이 성기능 장애의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다고 생각하고, 이는 상기 출원 또는 봄베신 수용체와 관련된 이전의 과학 출판물에 의해 개시되거나 제시되지 않은 적응증이다.
WO 98/07718에 개시된 봄베신 수용체 길항제의 한 바람직한 부류는 화학식 (I)의 화합물 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
상기 식에서,
- j는 0 또는 1이고;
- k는 0 또는 1이고;
- l은 0, 1, 2 또는 3이고;
- m은 0 또는 1이고;
- n은 0, 1 또는 2이고;
- Ar은 각각 치환되지 않거나 알킬, 할로겐, 알콕시, 아세틸, 니트로, 아미노, -CH2NR10R11, 시아노, -CF3, -NHCONH2및 -CO2R12에서 선택된 1 내지 3 개의 치환체로 치환된 페닐, 피리딜 또는 피리미딜이고;
- R1은 수소 또는 1 내지 7 개의 탄소 원자의 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알킬이고;
- R8은 수소이거나 3 내지 7 개의 탄소 원자의 R1과 고리를 형성하고;
- R2는 수소 또는 1 내지 2 개의 산소 또는 질소 원자를 또한 포함할 수 있는 1 내지 8 개의 탄소 원자의 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알킬이고;
- R9는 수소이거나 R2와 산소 또는 질소 원자를 포함할 수 있는 3 내지 7 개의 탄소 원자의 고리를 형성하거나; R2및 R9가 함께 카르보닐일 수 있고;
- Ar1은 독립적으로 Ar로부터 선택되고 또한 피리딜-N-옥시드, 인돌릴, 이미다졸릴, 및 피리딜을 포함할 수 있고;
- R4, R5, R6및 R7은 각각 독립적으로 수소 및 저급 알킬로부터 선택되고; R4는 또한 R5와 함께 산소 또는 질소 원자를 포함할 수 있는 2 내지 3 개의 원자의 공유 링크를 형성할 수 있고;
- R3은 독립적으로 Ar로부터 선택될 수 있거나 수소, 히드록시, -NMe2, N-메틸-피롤릴, 이미다졸릴, N-메틸-이미다졸릴, 테트라졸릴, N-메틸-테트라졸릴, 티아졸릴, -CONR13R14, 알콕시,
(상기 식에서 p는 0, 1 또는 2이고 Ar2는 페닐 또는 피리딜임)이고;
- R10, R11, R12, R13및 R14는 각각 독립적으로 수소 또는 1 내지 7 개의 탄소 원자의 직쇄, 분지쇄 또는 시클릭 알킬로부터 선택된다.
상기 부류 내에서 특히 바람직한 화합물은 (S) 3-(1H-인돌-3-일)-N-[1-(5-메톡시-피리딘-2-일)-시클로헥실메틸]-2-메틸-2-[3-(4-니트로-페닐)-우레이도]-프로피온아미드 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염이다.
BB1및 BB2결합 분석
하기 실험에서, BB1및 BB2결합의 측정은 다음과 같았다. 클로닝된 인간NMB (BB1분석에 대해) 및 GRP 수용체 (BB2분석에 대해)를 안정적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 10% 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 보충한 햄스 (Ham's) F12 배양 배지에서 배양하였다. 결합 실험을 위해서, 세포를 트립신 처리하여 수거하고 필요할 때까지 5% DMSO를 함유하는 햄스 F12 배양 배지에서 -70℃에서 냉동 보관하였다. 사용하는 날, 세포를 급속히 해동시키고, 과량의 배양 배지로 희석하고 2000 g에서 5 분간 원심분리하였다. 세포를 50 mM 트리스-HCl 분석 완충액 (21℃, pH 7.4, 0.02% BSA, 40 ㎍/mL 바시트라신, 2 ㎍/mL 키모스타틴, 4 ㎍/mL 류펩틴, 및 2 μM 포스포라미돈을 함유함)에 재현탁하고, 계수하고, 대량조직파쇄기 (polytron) (5, 10초로 설정)로 분쇄한 후, 28,000 g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 최종 펠렛을 분석 완충액에 현탁하여 최종 세포 농도를 1.5 x 105/mL가 되게 하였다. 결합 분석을 위하여, 200 μL 분취량의 멤브레인을 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 (최종 분석 부피 250 μL) [125I][Try4]봄베신 (<0.1 nM)과 함께 NMB 및 GRP 수용체 각각에 대하여 60 분 및 90 분 동안 인큐베이션하였다. 비특이적 결합은 1 μM 봄베신에 의해 정의되었다. 2 시간 넘게 0.2% PEI 중에 미리 담궈둔 와트만 (Whatman) GF/C 필터로 진공 하에서 급속히 여과함으로써 분석을 종결시키고, 50 mM 트리스-HCl (pH 6.9, 21℃; 6 1 mL)로 세척하였다. 감마 카운터를 사용하여 부착된 방사능을 결정하였다.
모든 경쟁 데이타는 프리즘 (Prism)(등록상표) (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)에서 반복 곡선-플로팅 과정을 사용하는 비선형 회귀를 사용하여분석하였다. IC50값은 쳉-프루소프 (Cheng-Prusoff) 방정식을 사용하여 Ki 값으로 수정하였다 (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, 1973).
보조 약제 - SEP 억제제 (SEPi)
SEPi는 SEP 활성을 갖는 폴리펩티드를 억제하거나 선택적으로 억제하는 화합물이다.
SEP는 가용성 분비 엔도펩티다제이다. 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제 및 메탈로엔도펩티다제를 포함하는 엔도펩티다제는 펩티드 내의 서열에서 절단한다.
아연 메탈로프로테아제로 알려진 중요한 군의 엔도펩티다제는 촉매 부위에 아연 이온의 결합을 필요로 하는 것이 특징이다. 아연 메탈로프로타제는 몇 군으로 소분류될 수 있고 (검토를 위하여 문헌 [FEBS Letters 354 (1994) pp. 1-6] 참조), 한 군은 네프릴리신 (NEP) 유사 아연 메탈로프로테아제이다 (FASEB Journal, Vol 11, 1997 pp 335-384). NEP 군은 서로 구조적으로 연관된 7 개 이상의 효소를 포함한다 (하기 참조). 이들은 통상적으로 멤브레인에 결합되어 있고, 큰 카르복시-말단 세포외 도메인, 짧은 멤브레인에 걸친 영역, 및 아미노 말단에 짧은 세포내 도메인을 갖는다. 이 군 중 공지된 구성원은 네프릴리신 (NEP, CD10, CALLA, 엔케팔리나제 또는 EC 3.4.24.11로도 불림), 엔도텔린-전환 효소 (ECE-1 및 ECE-2), PEX, KELL, X-전환 효소/손상 유도 신경 엔도펩티다제 (XCE/DINE), 및 가용성분비 엔도펩티다제/네프릴리신 II (SEP/NEPII; Ghaddar, G et al, Biochem Journal, Vol 347, 2000, pp. 419-429; Ikeda, K et al, Journal Biological Chemistry, Vol 274, 1999, pp. 32469-32477; Tanja, O et al, Biochem Biophys Research Communication, Vol 271, 2000, pp. 565-570; 국제 특허 출원 WO 99/53077)로 불리는 설치류에서 확인된 효소이다. 이 군의 구성원의 기능은 펩티드에 의해 유발되는 신호전달과 관련된다. 이는 인간을 비롯한 대부분의 유기체에서 발생하는 과정이고, 여기서 펩티드 분자는 생리적 반응을 일으키는 "전달물질"로서 사용된다. 이는 통상적으로 특정 세포에 의한 펩티드 전달물질의 생산 및 분비를 포함하고, 이러한 전달물질은 때로는 프로테아제에 의해 절단되어 활성형이 되는 불활성 전구체로서 생산 및 분비된다. 이 펩티드의 활성형은 그 후 반응을 일으키는 다른 세포의 표면 상의 특정 수용체에 결합한다. 그 후 펩티드는 다른 프로테아제에 의한 분해에 의해 불활성화된다.
NEPII는 마우스 효소인 SEP의 랫트 등가물인 것으로 보이는데, 이는 이들이 91%의 아미노산 동일성을 갖기 때문이다. 이들은 아미노산 서열면에서 NEP에 가장 가까운 이 군의 구성원이고, 둘 다 인간 NEP와 54% 동일하다. 양자의 mRNA는 고환에 매우 많이 존재하고 넓은 범위의 다른 조직에서도 낮은 수준으로 검출될 수 있다. 랫트 NEPII의 경우, mRNA는 뇌 및 뇌하수체에서 비교적 높은 수준으로 발견된다. 포유류 세포에서 재조합적으로 생산될 때, 마우스 SEP 및 랫트 NEPII는 모두 성장 배지에서 발견될 수 있다. 이는 이들이 체내에서 순환하여 체내의 다른 부위에서 펩티드를 절단할 수 있는 분비 프로테아제일 수 있다는 것을 암시한다. 마우스 SEP 및 랫트 NEPII는 ECE-1과 같은 이 군의 일부 다른 구성원과 같이, 스플라이스 변이를 나타낸다. 마우스 SEP 및 랫트 NEPII의 경우에, 이 스플라이스 변이는 멤브레인 위치 및 분비에 관여하는 서열의 변경을 갖는 이성체 (isoform)를 발생시킨다. 이의 생리적 중요성은 명확하지 않으나 멤브레인-결합, 순환 및 세포내 형태의 이 효소들이 있을 수 있는 것으로 보인다. 마우스 SEP는 엔케팔린, 엔도텔린, 빅-엔도텔린, 브라디키닌 및 물질 P를 포함하는 일정 범위의 중요한 생체 펩티드를 절단할 수 있는 것으로 나타났다. 그러므로 NEP와 같이 이는 꽤 넓은 기질 특이성을 갖고 상이한 조직에서 몇몇 생리학적 기능을 가질 수 있다.
이 NEP 군의 효소는 다른 메탈로프로테아제 효소와 같이 작은 약물-유사 분자 (예를 들면 티오르판 및 포스포라미돈)에 의한 억제를 받을 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 최근 밝혀진 펩티드에 의한 신호전달을 조절하는데 있어서 NEP-유사 효소의 일부 구성원의 생리적 기능의 성질과 함께 이 효소를 제약학적 개입에 대한 매력적 표적이 되게 한다.
SEP에 대한 서열은 WO 99/53077, EP 1069188 및 WO 00/47750 및 도 7-9 (SEQ ID No. 4-6)에 기재되어 있다.
예를 들면 분석을 위한 본원에 언급된 SEP 서열은 WO 99/53077, EP 1069188 및 WO 00/47750에 기재되거나 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6으로 기재된 1 이상의 서열, 또는 그의 변이체, 단편, 상동체, 유사체 또는 유도체에 대한 인용을 포함한다.
SEQ ID No. 4 및 SEQ ID No. 5는 각각 인간 SEP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (cDNA)를 개시한다. SEQ ID No. 5는 5' 및 3' 부분 벡터 서열을 포함한다. SEQ ID No. 6은 인간 SEP 단백질을 나타낸다.
특정 SEPi의 적합성은 예를 들면 하기 분석을 사용하여 효력 및 선택성을 평가한 후, 표준 제약 절차에 따라 그의 독성, 흡수, 대사, 약동학 등을 평가함으로써 결정할 수 있다.
SEP의 후보 억제제를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 SEP 분석은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석이다. 가장 바람직하게는, 상기 표지된 기질 펩티드는 로다민 (Rhodamine) 그린-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSYTM-7)-βAla-NH2이다.
SEP FRET 분석
SEP FRET 분석은 NEP와 함께 사용하기 위한 카르발호 (Carvalho) 등에 의해 개발된 분석에 기초한다 (Carvalho et al., Annal. Biochem. 237, pp. 167-173 (1996)). SEP FRET 분석은 유사한 분자내 소거 (quenching)되는 형광을 띠는 펩티드 기질을 사용하지만, 형광을 띠는 공여체/수용체 염료의 신규 조합, 특히 로다민 그린 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) 및 QSYTM-7 (이하에서는 "QSY-7" 또는 "QSY7"로 약칭함; Molecular Probes, Inc.)와 함께 사용한다.
SEP의 엔도펩티다제 활성은 합성 펩티드 기질 로다민 그린-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY-7)-βAla-NH2을 단백분해할 수 있는 능력을 모니터함으로써 측정한다.
이 분석을 위해 선택된 두 개의 형광발색단 (형광 염료)은 겹치는 방출 및 흡수 스펙트럼을 가지므로 에너지 전달에 적합하다. 로다민 그린은 공여체로서 작용하고 485 nm에서 여기할 때 535 nm에서 방출이 일어나고 (형광), 이는 다시 QSY7을 여기시킨다 (FRET이 일어남). QSY7은 형광을 방출하지 않으므로 535 nm를 넘어서 방출이 일어나지 않고 따라서 아무런 신호가 관찰되지 않는다 (로다민 그린 방출이 소거됨).
SEP에 의해 펩티드 기질의 Arg-Val 펩티드 결합이 절단될 때 (선택적 가수분해), 로다민 그린 및 QSY7 부분은 서로 떨어지게 되고, 따라서 485 nm에서 여기할 때, 더이상 에너지 전달이 일어나지 않는다. 그 결과, 로다민 그린에 대한 535 nm에서의 형광의 증가가 관찰된다.
합성 펩티드 기질 로다민 그린-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY-7)-βAla-NH2의 제조
제조자 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)가 공급한 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (FMOC)-기초 합성 주기에 대한 변형을 사용하여 0.25 mmol FMOC-PAL-PEG-PS 수지 상에서 고상 펩티드 합성 프로토콜에 의해 펩티드 제조를 완수하였다. 우리의 변형된 주기는 20% 피페리딘/N-메틸피롤리디논 (NMP)으로 2x5 분 처리하여 아미노 말단을 탈보호하고; 그 효율을 UV 흡광도 검출기를 통하여 탈보호 용액의 적은 분취량을 통과시킴으로써 301 nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터하였다. 별도의 카트리지에서, 도입되는 아미노산을 N,N-디메틸포름아미드 (DMF)에 용해된각각 0.9 당량의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt)로 활성화시켰다. 2 당량의 디이소프로필에틸 아민 (DIEA)을 첨가하였다. 동시에, 수지를 NMP로 세척하여 탈보호 부산물을 제거하였다. 세척액을 수지로부터 빼내고, 활성화된 아미노산 에스테르를 수지로 옮기고 교반하여 20 분 동안 아미노 말단에 커플링되게 하였다. 남은 커플링 용액을 빼내고 수지를 다시 NMP로 세척하였다. 펩티드 균질성을 확실히 하기 위하여, NMP 중의 0.4 M 무수 아세트산/0.04 M HOBt 및 12 mmole DIEA를 수지에 첨가하여 반응하지 않았을 가능성이 있는 부위를 아데닐화시켰다. 마지막으로, 수지를 NMP로 세척하고, 세척액을 빼내고 1:1 디클로로메탄/2,2,2-트리플루오로에탄올로 세척하고, 세척액을 빼냈다. 이는 펩티드 합성의 1 주기를 예시한 것이다. 완결된 합성 수지를 시약 K (Reagent K) (King, D.S. et al., (1990), Int. J. Prep. Prot. Res., 36, pp. 255-66)를 사용하여 절단하고 탈보호시켜서 251 mg (100%)의 조 펩티드 CP1를 얻었다. 전자분사 질량 분광법 (ESMS) (m/z 계산치 (calc.) = 977.21 (MH+ 평균), 실측치 (obs.) = 977.47).
QSY-7의 시스테인에의 부착:
50 mg (51 μmol)의 조 CP1을 45 mg (52.4 μmol)의 QSY-7 말레이미드를 함유하는 10% DIEA/DMF의 용액에 용해시켰다. 10 분 후, HPLC-MS 분석을 통해 반응이 완결되지 않은 것을 확인하고, 30 mg (30.7 μmol)의 조 펩티드를 더 첨가하였다. 30 분이 더 지난 후, HPLC-MS를 통해 반응이 완결되고 모든 출발 시약이 소모되었음을 확인하였다. 생성물을 C18 제조용 HPLC 크로마토그래피로 단리하고 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광분석법 (MALDI-MS)에 의해 목적 생성물 분자량을 나타내는 분획을 수거하고 동결건조하여 73.7 mg (50%)의 보라색 분말, CP2를 얻었다. ESMS (m/z 계산치 = 1797.86 (MH+ 단일동위원소 (monoisotopic)), 실측치 = 1797.86).
비스(트리플루오로아세틸) 로다민 그린의 아미노 말단에의 부착
73.7 mg (41 μmol)의 CP2를 35 mg (52.8 μmol) 로다민 그린 카르복실산, 트리플루오로아세트아미드, 숙신이미딜 에스테르 (5(6)-CR 110 TFA, SE) *혼합 이성체*를 함유하는 2% DIEA/DMF 용액에 용해시켰다. 2 시간 후, 반응이 HPLC-MS 분석에 의해 완결된 것으로 판단되었다. 생성물을 C4 제조용 HPLC 크로마토그래피를 통해 단리하고, 목적 생성물 분자량을 나타내는 (MALDI-MS) 분획을 수거하고 동결건조하여 71.4 mg (74%)의 보라색 분말 CP3을 얻었다. ESMS (m/z 계산치 = 2345.92 (M+ 단일동위원소), 실측치 = 2345.47).
로다민 그린으로부터 트리플루오로아세틸 보호기의 제거:
71.4 mg (30.4 μmol)의 CP3를 10 ml의 4:1 CH3CN/H2O에 용해시켰다. 여기에 200 mg (1886 μmol)의 Na2CO3를 첨가하였다. 16 시간 동안 보르텍싱한 후, 상청액을 불용성 물질로부터 따라버렸다. 반응 용기를 1 ml DMSO로 헹구고, 이를 상청액과 합하고 C4 제조용 HPLC 크로마토그래피를 통해 생성물을 단리하였다. 생성물 분자량을 나타내는 (MALDI-MS) 분획을 합하고 동결건조하여 64 mg (98%)의 보라색 분말, CP4를 얻었다. ESMS (m/z 계산치 = 2155.54 (MH+ 평균), 실측치 =2155.27). CP4는 목적 합성 펩티드 기질 로다민 그린-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY-7)-βAla-NH2이다.
재료:
모든 시약은 입수가능한 가장 높은 화학 순도의 것을 구입하였고 추가적 정제 없이 사용하였다. 펩티드 합성을 위한 모든 시약은 다음의 예외를 제외하고는 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로부터 구입하였다: QSYTM-7 말레이미드 (카탈로그 번호 Q-10257) 및 로다민 그린 카르복실산, 트리플루오로아세트아미드, 숙신이미딜 에스테르 (5(6)-CR 110 TFA, SE) *혼합 이성체* (카탈로그 번호 R-6112)는 몰레큘라 프로브스, 인크. (Molecular Probes, Inc., OR, USA)로부터 구입하였고; FMPC-PAL-PEG-PS는 퍼셉티브 바이오시스템즈 (Perseptive Biosystems, MA, USA (카탈로그 번호 GEN913384))로부터 구입하였고; FMOC-B-알라닌 및 FMOC-d-페닐알라닌은 노바바이오켐 (Novabiochem, CA, USA)로부터 구입하였고; FMOC-Arg(Pbf)-OH는 아나스펙 인크. (AnaSpec,Inc., CA, USA)로부터 구입하였고; 2,2,2-트리플루오로에탄올은 알드리치 (Aldrich, WI, USA)로부터 구입하였다. 탄산나트륨은 피셔 (Fisher, PA, USA)로부터 구입하였다.
제조용 HPLC 크로마토그래피는 비다크 (Vydac, CA, USA) C18 (카탈로그 번호 218TP1022) 또는 C4 (카탈로그 번호 214TP1022) 컬럼 상에서 10 ml/분의 유속으로 0% 내지 80% (A = 5% CH3CN/0.1% TFA/94.9% H2O, B = 100% CH3CN)의 직선 구배로 30 분에 걸쳐 용출시키고 30 초 때의 분획을 수거하였다. 분석용 HPLC-MS는 0% 내지80% (A = 5% CH3CN/0.1% TFA/94.9% H2O, B=100% CH3CN)의 직선 구배로 30 분에 걸쳐 1 ml/분의 유속으로 비다크 C4 (카탈로그 번호 214TP5415) 컬럼 상에서 크로마토그래피를 수행하는 워터스 (Waters, MA, USA) 2690 HPLC 인렛 및 워터스 996 광다이오드 어레이 검출기와 결합된 마이크로매스 (Micromass, Manchester, UK) LCT 질량 분광계 (외부 보정된 표준에 근거한 질량)를 사용하여 수행하였다. 디컨볼루티드 (deconvoluted) 분자량을 마이크로매스 변환 소프트웨어를 사용하여 관측된 다가 이온으로부터 계산하였다. MALDI-MS는 퍼셉티브 바이오시스템즈 보이저-DE 직선 질량 분광계 상에서 알파 시아노 4-히드록시 시남산 매트릭스 (Hewlett Packard, CA, USA) 및 외부 보정에 근거하여 보고된 질량을 사용하여 얻었다.
방법 (화학 구조 포함):
주요 중간체 CP3를 고상 펩티드 합성 반응식에 삽입함으로써 CP4 (= 합성 펩티드 기질 로다민 그린-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSYTM-7)-βAla-NH2)를 합성하였다.
요약하면, FMOC-PAL-PEG 수지를 수율 및 시간의 효율에 대해 최적화된 고상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 제작하였다. 이 주기 (전체의 설명은 상기 참조)는 2 FMOC 탈보호, 세척, HBTU 활성화 아미노산의 단일 커플링, 세척, 캡핑 및 마지막으로 먼저 NMP로 세척한 후 1:1 트리플루오로에탄올/디클로로메탄으로 세척하는 것을 추가한다. 이 세척은 수지 이차 구조를 이완시키는 것을 도와 완전한탈보호 및 다음 주기 동안 다음에 도입되는 아미노산의 효율적 커플링을 가능하게 한다.
CP2는 반응식 2에 따라 합성한다 (전체의 설명은 상기 참조):
QSY-7 태그의 혼입 후, 반응식 3에 따라 두번째 형광 발색단, 로다민 그린을 반응식 3에 따라 비스-트리플루오로아세틸 보호된 염료로서 첨가한다:
마지막으로, Na2CO3로 처리하여 트리플루오로아세틸기를 제거하여 목적 기질, CP4를 얻는다.
분석
분석을 위한 시료는 처음에 다음과 같이 제조하였다:
기질 용액은 2 μM 농도로 기질 로다민 그린-Gly-Gly-dPhe-Leu-Arg-Arg-Val-Cys(QSY-7)-βAla-NH2를 pH 7.4의 50 mM HEPES 완충액 (Sigma, UK)에 재현탁시킨 후, 25 ml 당 EDTA가 없는 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche Diagnostics, UK) 하나를 첨가함으로써 제조하였다.
상기한 SEP 효소의 분취량을 해동한 후, 각 효소 배치에 대해 특이적인 미리 결정된 인자에 의해 pH 7.4의 50 mM HEPES에 희석하여, 50 ㎕가 분석 중 약 30%의 기질을 생성물로 전환시키기에 충분한 효소를 함유하도록 하였다.
4 ml DMSO 및 pH7.4의 96 ml 50 mM HEPES로 이루어진 4% DMSO 용액을 제조하였다.
생성물 용액은 500 ㎕의 기질 용액을 250 ㎕의 효소 용액 및 250 ㎕의 4% DMSO 용액에 첨가하고, 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션함으로써 제조하였다.
분석은 다음과 같이 확립하였다:
블랙 96 웰 마이크로타이터 플레이트에서, 100 ㎕의 기질 용액을 50 ㎕의 4% DMSO 용액에 첨가하였다. 50 ㎕의 4% DMSO 용액이 40 μM의 포스포라미돈을 더 함유하는 유사한 비-특이적 백그라운드 블랭크도 확립하였다. 50 ㎕의 효소 용액을 분석 및 블랭크에 첨가하고 96 웰 플레이트를 바이오라이스 (Biolise) 소프트웨어 패키지 (IBM Lab technologies, Offenberg, Germany)로 작동되는 BMG 갤럭시 형광 리더에 놓았다.
플레이트를 형광 리더에서 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고 매 3 분 마다 형광을 측정하였다 (여기 (Ex) 485 nm/방출 (Em) 535 nm). SEP의 단백분해 활성은 시료의 형광의 증가 비율 - 비특이적 백그라운드 블랭크의 형광 단위의 증가 비율에 상응하였다. 4 번의 연속적 리딩에 걸친 소프트웨어에 의해 계산된 최대 속도 측정 (MaxV)이 이 계산에 사용되었다.
동일한 마이크로타이터 플레이트 상에서 웰 내의 200 ㎕의 생성물로부터 형광 측정을 하였다. 필요하다면 SEP 분석의 60 분 시점에서 측정된 형광 단위와 함께 이 값을 사용하여 1 시간의 인큐베이션 기간 동안 단백분해된 기질의 퍼센트 (%)를 계산하거나, 측정된 형광 증가의 비율을 단백분해된 기질 ng/분/ml 효소와 같은 다른 유용한 단위로 전환하였다.
1979년 버터워스 (Butterworths)에서 출판된 아텔 코니쉬 보우덴 (Athel Cornish Bowden)의 서적 [Fundamentals of Enzyme Kinetics]에 기재된 표준 원리에 따라 Vmax 및 Km과 같은 효소의 속도론적 파라미터를 계산하기 위하여 분석을 사용하였다.
SEP 분석을 사용하여 SEP 억제제의 억제 파라미터를 결정함
SEP 억제제 (예를 들면 포스포라미돈)의 IC50을 결정하기 위하여, 50 ㎕의 DMSO 용액에 포함된 일정 범위의 시험 농도의 억제제 (4% DMSO/50 mM HEPES pH 7.4를 사용하여 억제제의 10 mM 100% DMSO 스톡을 적절히 희석하여 제조)를 사용하여 상기한 바와 같이 수회의 SEP 분석을 수행하였다. 적절한 표준 그래프 피팅 컴퓨터 프로그램을 사용하여 S자형 용량 반응 곡선을 log 억제제 농도 대 MaxV (또는 % 억제제 또는 % 활성)의 플롯으로 그렸다. IC50을 50% 최대 억제를 일으키는 억제제 농도로서 계산하였다. 통상적으로 IC50결정을 위하여, 절반 로그 단위 증분 차이가 나는 10 개 이상의 억제제 농도의 용량 범위를 사용하였다.
예를 들면 1979년 버터워스 (Butterworths)에서 출판된 아텔 코니쉬 보우덴 (Athel Cornish Bowden)의 서적 [Fundamentals of Enzyme Kinetics]에 기재된 표준 효소학 원리에 따라 SEP 분석을 사용하여 Ki 및 억제 방식 (즉, 억제가 경쟁적, 혼합, 비경쟁적 등인지 여부)을 결정하였다.
보조 약제 - 중간 전도 칼슘-활성화 칼륨 (IK Ca ) 채널의 조절제
"칼슘-활성화 칼륨 채널"이라는 용어는 대량 전도 칼슘 활성화 (BKCa) 채널 (Maxi K+ 채널로도 언급됨), 소량 전도 칼슘 활성화 (SKCa) 채널 및 때로는 hSK4채널 또는 IK 채널 또는 hIK1채널로 불리는 중간 전도 칼슘 활성화 (IKCa) 채널을 포함한다.
현재 세가지 서브타입의 칼슘-활성화 칼륨 채널이 존재한다. 이들은 대량 전도 칼슘 활성화 (BKCa) 채널, 중간 전도 칼슘 활성화 (IKCa) 채널 및 소량 전도 칼슘 활성화 (SKCa) 채널이다. 이 채널들은 단일 개방 (single opening) 중 채널 소공 (pore)을 통과하는 이온성 전도의 정도에 의해 특성화된다 (Fan et al 1995). 구별의 방법으로는, 대량 전도 (BK) 채널은 내부 칼슘 이온 및 멤브레인 전위의 협력 작용에 의해 개폐되고 100 내지 220 피코시멘스 (pS)의 단위 전도를 갖는 반면, 중간 전도 (IK) 및 소량 전도 (SK) 채널은 내부 칼슘 이온에 의해서만 개폐된다. 추가적 구별 방법으로는, IKCa및 SKCa채널은 각각 20 내지 85 pS 및 2 내지 20 pS의 단위 전도를 갖고, BK 채널보다 칼슘에 더 민감하다. 각 타입의 채널은 뚜렷한 약리를 나타낸다 (Ishii et al, 1997).
본원에 사용되는 "중간 전도 칼슘 활성화 (IKCa) 채널"이라는 용어는 단일 개방 중 채널 소공을 통해 통과하는 이온성 전도의 정도에 의해 특성화되는 칼슘 활성화 칼륨 채널의 서브타입을 말한다 (Fan et al 1995). 내부 칼슘 이온 및 멤브레인 전위의 협력 작용에 의해 개폐되고 100 내지 220 피코시멘스 (pS)의 단위 전도를 갖는 대량 전도 (BK) 채널과는 대조적으로, 중간 전도 (IK) 채널은 내부 칼슘 이온에 의해서만 개폐되고, 20 내지 85 pS의 단위 전도를 갖고, BK 채널보다 칼슘에 더 민감하다.
본원에 사용된 "IKCa채널 활성을 조절하는"이라는 용어는 IKCa채널 활성을향상, 증가, 증강, 아고나이징, 탈극화 또는 상향조절하는 것 중의 하나 이상을 의미하거나 IKCa채널의 Ca2+민감성이 증가하는 것, 즉 IKCa채널 활성/개방을 유발하는데 필요한 칼슘 농도가 저하되는 것을 의미한다. IKCa채널의 Ca2+민감성의 증가는 IKCa채널의 직접 또는 간접 개방에 의해 증가/증강될 수 있다. IKCa채널의 Ca2+민감성의 증가는 IKCa채널 특성의 변형을 일으켜서 IKCa채널이 더 빨리 및(또는) 더 낮은 세포내 칼슘 농도에서 및(또는) 더 긴 시간 동안 및(또는) 증가된 개방 시간 확률로 열리는 방식으로 IKCa채널 개방이 영향을 받게 되는 결과를 일으킨다.
"IKCa채널 활성을 조절하는"이라는 용어는 또한 예를 들면 IKCa채널의 발현을 증가시키는 약제에 의하여 및(또는) 약제가 작용하지 않으면 IKCa채널 활성의 조절 및(또는) IKCa채널의 발현을 손상시키고(시키거나) 길항할 물질에 약제가 작용함으로써 음경 해면체 평활근 조직에서 IKCa채널 발현을 상향조절하는 것을 포함한다.
예를 들면, 조절제는 하기 화학식 (I)의 구조를 가질 수 있다.
<화학식 I>
상기 식에서,
R1은 H 또는 적절한 치환체, 예를 들면 임의로 치환될 수 있는 알킬기이고;
R2는 H 또는 적절한 치환체, 바람직하게는 H이고,
R3는 1 이상의 적절한 임의의 치환체를 나타낸다.
선택적으로, 조절제는 하기 화학식 (1)의 구조를 가질 수 있다.
<화학식 1>
상기 식에서,
X는 NR, O 또는 S로부터 선택되고,
여기서 R은 H 또는 알킬 (바람직하게는 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬)이고,
R1은 알킬 (바람직하게는 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬)이고,
R2는 H, 할라이드, 알킬 (바람직하게는 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬), 알콕시 (바람직하게는 저급 알콕시, 더욱 바람직하게는 C1-6 알콕시)로부터 선택되고,
R3는 H, 할라이드, 알킬 (바람직하게는 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬), 알콕시 (바람직하게는 저급 알콕시, 더욱 바람하게는 C1-6 알콕시)로부터 선택되고,
R4는 H, 할라이드, 알킬 (바람직하게는 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬), 알콕시 (바람직하게는 저급 알콕시, 더욱 바람직하게는 C1-6 알콕시)로부터 선택되고,
R5는 H, 할라이드, 알킬 (바람직하게는 저급 알킬, 더욱 바람직하게는 C1-6 알킬), 알콕시 (바람직하게는 저급 알콕시, 더욱 바람직하게는 C1-6 알콕시)로부터 선택된다.
화학식 (1)의 화합물 (여기서 X=O (화학식 (1a) 또는 X=S (화학식 (1b))은 염기성 조건 하에서 각각 상응하는 모체 헤테로고리 (2a) 또는 (2b)의 N-알킬화에 의해 제조될 수 있고, (2a) 또는 (2b)는 상응하는 아미노페놀 (3a) 또는 아미노티오페놀 (3b)을 포스겐 또는 다른 적합한 카르보닐화제로 처리함으로써 제조될 수 있다. 아미노페놀 및 아미노티오페놀은 보통 각각 상응하는 니트로페놀 (4a) 또는 니트로티오페놀 (4b)로부터 환원에 의해 제조된다. 많은 치환된 니트로페놀 (4a)및 니트로티오페놀 (4b)이 시판된다.
X = NH (화학식 (1c))인 화학식 1의 화합물은 상기 반응식을 수정함으로써 제조할 수 있다. 이에 대하여, 각각의 상응하는 니트로아닐린 (5c)의 알킬화를 니트로기의 환원 전에 수행하여 상기한 바와 같이 카르보닐화에 의해 고리화되는 페닐디아민 (3c, X=NH)을 제조한다.
바람직하게는 조절제는 EBIO (1-에틸-2-벤즈이미다졸리논) 또는 그의 모방제 또는 그의 제약학적으로 허용가능한 염이다. EBIO의 구조는 다음과 같다:
어떤 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM 미만, 바람직하게는 약 100 nM 미만, 바람직하게는 약 75 nM 미만, 바람직하게는 약 50 nM 미만, 바람직하게는 약 25 nM 미만, 바람직하게는 약 20 nM 미만, 바람직하게는 약 15 nM 미만, 바람직하게는 약 10 nM 미만, 바람직하게는 약 5 nM 미만의 IC50값을 갖는다.
어떤 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 목적 표적에 대하여 약 25, 50, 75, 100 배 이상의 선택성, 바람직하게는 목적 표적에 대한 약 150 배 이상의 선택성, 바람직하게는 목적 표적에 대한 약 200 배 이상의 선택성, 바람직하게는 목적 표적에 대한 약 250 배 이상의 선택성, 바람직하게는 목적 표적에 대한 약 300 배 이상의 선택성, 바람직하게는 목적 표적에 대한 약 350 배 이상의 선택성을 갖는다.
음경 해면체
본원에 사용된 "음경 해면체"라는 용어는 특히 음경에서 발견되는 다수의 조직을 말한다. 이 점에서, 음경의 몸체는 백막이라 불리는 섬유 조직에 의해 각각 둘러싸인 세 개의 원통형 덩어리의 조직으로 이루어진다. 쌍을 이룬 배측 덩어리는 음경 코포라 카버노사 (corpora cavernosa) (corpora = 주 몸체; carvernosa = 속이 빈)라고 불리고; 더 작은 중간복측 덩어리인 음경 코푸스 스폰지오섬 (corpus spongiosum)은 요도 해면을 포함하고 사정시 요도 해면이 열려 있게 하는 기능을 한다. 모든 세 개의 덩어리가 근막 및 피부로 둘러쌓여 있고, 혈액동에 의해 투과된 발기 조직으로 이루어진다. 음경 해면체는 평활근 세포를 포함한다.
치료
치료에 대한 본원에서 말하는 치료는 1 이상의 치유, 완화 및 예방적 치료를 포함하는 것으로 이해된다.
성적 자극
본 발명은 또한 성적 자극 전 및(또는) 중의 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i (및 적용 가능한 경우 PDEi, 바람직하게는 PDE5i)의 투여를 통한 상기 정의된 용도를 포함한다. 본원에서 "성적 자극"이라는 용어는 "성적 흥분"이라는 용어와 동의어일 수 있다. 본 발명의 이 측면은 전신적 (생리적) 선택성을 제공하므로 유리하다. 자연적 캐스케이드는 생식기에서만 일어나고 다른 위치- 예를 들면 심장 등에서는 일어나지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 MED 치료를 통하여 생식기에 선택적 효과를 달성할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명에 따르면 어떤 단계에서 성적 자극 단계가 있는 것이 매우 바람직하다. 이 단계가 전신적 선택성을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 본원에서 "성적 자극"은 1 이상의 시각적 자극, 물리적 자극, 청각적 자극 또는 심리적 자극일 수 있다.
약제
본 발명에 따른 남성 성기능 장애, 특히 MED의 치료에 사용하기 위한 약제는 NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i로서 작용할 수 있는 적합한 약제, 및 적절한 경우, NPYi, 바람직하게는 NPY Y1i 및 PDEi, 바람직하게는 PDE5i의 복합제일 수 있다. 본원에 사용된 "약제"라는 용어는 NPY 및(또는) NPY Y1 수용체를 억제할 수 있는 물질을 포함한다.
이러한 약제 (즉 상기에 정의된 약제)는 아미노산 서열 또는 그의 화학적 유도체일 수 있다. 이 물질은 유기 화합물 또는 다른 화학물질일 수도 있다. 약제는 센스 서열 또는 안티-센스 서열일 수 있는 뉴클레오티드 서열일 수도 있다. 약제는 항체일 수도 있다.
따라서, "약제"라는 용어는 천연물이던 아니던 간에 임의의 적합한 공급원으로부터 얻을 수 있거나 생성될 수 있는 화합물을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
약제는 펩티드 뿐만 아니라 저분자 유기물질, 예를 들면 선도 화합물과 같은 다른 화합을 포함할 수 있는 화합물의 라이브러리로부터 디자인되거나 얻을 수 있다.
예로써, 약제는 천연물질, 생물학적 거대분자, 또는 세균, 진균 또는 동물 (특히 포유류) 세포 또는 조직과 같은 생물학적 재료로부터 제조된 추출물, 유기 또는 무기 분자, 합성 약제, 반합성 약제, 구조적 또는 기능적 모방약, 펩티드, 펩티드모방약, 유도체 약제, 전체 단백질로부터 절단된 펩티드, 또는 합성적으로 합성된 펩티드 (예를 들면 펩티드 합성기 또는 재조합 기술 또는 이들의 조합을 사용한 것), 제조합 약제, 항체, 천연 또는 비-천연 약제, 융합 단백질 또는 그의 등가물 및 돌연변이체, 유도체 또는 이들의 조합일 수 있다.
ACE 분석을 하기에 기재한다. 어떤 적용의 경우 (특정 개체에 대해서와 같은), 이러한 약제 (즉, ACE 억제 작용도 나타내는 것)는 경구 투여에 적합하지 않을 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 NPY 또는 NPY Y1 억제제는 ACE에 대해 활성이 없거나 실질적으로 없다.
ECE 분석은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 "약제"라는 용어는 단일 물질일 수 있거나 약제의 조합일 수 있다.
악제가 유기 화합물이면 어떤 적용의 경우- 예를 들면 약제가 NPYi 또는 NPYY1i이면- 그 유기 화합물은 통상적으로 2 이상의 연결된 히드로카르빌기를 포함할 수 있다. 어떤 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 2 이상의 시클릭기를 포함하고, 이 경우 임의로 1 이상의 시클릭기는 융합된 시클릭 고리 구조일 수 있다. 어떤 적용의 경우, 1 이상의 시클릭기는 헤테로시클릭기이다. 어떤 적용의 경우, 바람직하게는 헤테로시클릭기는 고리에 1 이상의 N을 포함한다. 이러한 화합물의 예를 본원에 기재한다.
약제가 유기 화합물이면 어떤 경우- 예를 들면 약제가 PDE5i이면 - 유기 화합물은 통상적으로 2 이상의 연결된 히드로카르빌기를 포함할 수 있다. 어떤 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 2 이상의 시클릭기를 포함하고- 이 경우 이 시클릭기 중의 하나는 융합된 시클릭 고리 구조일 수 있다. 어떤 경우, 바람직하게는 1 이상의 시클릭기는 헤테로시클릭기이다. 어떤 경우, 바람직하게는 헤테로시클릭기는 1 이상의 N을 고리에 포함한다. 이러한 화합물의 예는 본원의 PDE5 부분에 기재되어 있다.
약제는 할로기를 포함할 수 있다. 여기서, "할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 의미한다.
약제는 1 이상의 분지되지 않거나 분지쇄일 수 있는 알킬, 알콕시, 알케닐, 알킬렌 및 알케닐렌기를 포함할 수 있다.
제약학적으로 허용가능한 염
약제는 산 부가 염 또는 염기 염과 같은 제약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 수화물을 포함하는 이들의 용매화물의 형태일 수 있고(있거나) 이러한 형태로 투여될 수 있다. 적합한 염에 대한 검토를 위해서는 문헌 [Berge et al, J. Pharm. Sci., 1977,66, 1-19]를 참조하라.
통상적으로, 제약학적으로 허용가능한 염은 원하는 산 또는 염기를 적절히 사용하여 쉽게 제조될 수 있다. 염을 용액으로부터 침전시키고 여과에 의해 수거하거나 용매의 증발에 의해 회수할 수 있다.
적합한 산 부가 염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 형성되고, 그 예는 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 이황산염, 질산염, 인산염, 제이인산염, 아세테이트, 말리에이트, 푸마레이트, 락테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트, 숙시네이트, 사카레이트, 벤조에이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트 염이다.
적합한 염기 염은 비독성 염을 형성하는 염기로부터 형성되고, 그 예는 나트륨, 칼륨, 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연 및 디에탄올아민 염이다.
다형/비대칭 탄소
약제는 다형 형태로 존재할 수 있다.
약제는 1 이상의 비대칭 탄소 원자를 포함할 수 있으므로 2 이상의 입체이성질체 형태로 존재한다. 또한 약제가 알케닐 또는 알케닐렌기를 갖는 경우 시스 (E) 및 트랜스 (Z) 이성질체가 발생할 수 있다. 본 발명은 약제의 각 입체이성질체, 적절한 경우 이들의 각각의 토토머 형태, 이들의 혼합물을 포함한다.
부분입체이성질체 또는 시스 및 트랜스 이성질체는 통상의 기술, 예를 들면 약제의 입체이성질체 혼합물 또는 이들의 적절한 염 또는 유도체의 분별 결정화,크로마토그래피 또는 H.P.L.C.에 의해 분리될 수 있다. 약제의 각각의 거울상이성질체는 광학적으로 순수한 상응하는 중간체로부터 제조되거나 또는 상응하는 라세미체를 적절한 키랄 지지체를 사용하여 H.P.L.C.에 의하는 것과 같은 분리방법에 의해, 또는 상응하는 라세미체를 적절한 광학 활성 산 또는 염기와 반응시킴으로써 형성되는 부분입체이성질체 염의 분별 결정화에 의해 얻을 수 있다.
동위원소 변이
본 발명은 또한 약제의 모든 적절한 동위원소 변이체 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 본 발명의 약제의 동위원소 변이체 또는 그의 제약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 원자가 원자번호는 동일하지만 자연에서 보통 발견되는 원자량과 다른 원자량을 갖는 원자로 대체된 것으로 정의된다. 약제에 혼입될 수 있는 동위원소 및 그의 제약학적으로 허용되는 염의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 염소의 동위원소, 예를 들면2H,3H,13C,14C,15N,17O,18O,31P,32P,35S,18F 및36Cl을 각각 포함한다. 약제의 어떤 동위원소 변이체 및 그의 제약학적으로 허용가능한 염, 예를 들면3H 또는14C와 같은 방사성 동위원소가 혼입된 것은 약물 및(또는) 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 삼중수소, 즉3H, 및 탄소-14, 즉14C 동위원소는 제조의 용이성 및 검출능으로 인해 특히 바람직하다. 또한, 중수소, 즉2H와 같은 동위원소로의 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들면 생체내 반감기의 증가 또는 용량 요구의 감소로 인해 특정 치료적 이점을 제공할 수 있고, 따라서, 어떤 경우에는 바람직할 수 있다. 약제의 동위원소 변이체 및 그의 제약학적으로 허용되는 염은 일반적으로 적합한 시약의 적절한 동위원소 변이체를 사용하여 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다.
프로드럭
당업자는 약제가 프로드럭으로부터 유도될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 프로드럭의 예는 특정 보호기를 갖고 그 자체로는 약물학적 활성을 갖지 않을 수 있으나, 특정한 경우에 투여된 (경구 또는 비경구로) 후 체내에서 대사되어 약물학적 활성이 있는 약제를 형성할 수 있는 물질을 포함한다.
전-부분 (pro-moiety)
예를 들면 문헌 ["Design of Prodrugs" by H. Bundgaard, Elsevier, 1985] (그 개시 부분은 본원에 인용함으로써 삽입됨)에 기재된 "전-부분 (pro-moiety)"으로 알려진 특정 부분은 약제의 적절한 작용기에 위치될 수 있다. 이러한 프로드럭은 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
억제제/길항제
NPYi 또는 NPY Y1i (및 적용가능한 경우 PDEi 또는 PDE5i 화합물 및 다른 보조 활성 약제)과 관련하여 본원에 사용된 억제제라는 용어는 길항제라는 용어와 상호변경 가능한 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "길항제"라는 용어는 다른 약제 또는 표적의 활성을 감소시키는 모든 약제를 의미한다. 길항 작용은 길항되는 물질 (화학적 길항작용) 또는 다른 표적을 통한 반대 효과의 생성 (기능적 길항작용 또는 생리적 길항작용)의 조합에 기인하거나 또는 표적 활성화를 관찰되는 효과에 연결시키는 중간체의 결합 부위에 대한 경쟁의 결과로서 (간접 길항작용) 생길 수 있다.
또한, "내인성 발기 과정을 향상시키는"이라는 어구는 "내인성 발기 과정의 상향조절"이라는 어구와 상호변경 가능하다.
제약 조성물
본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 약제 및 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 (그의 조합 포함)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
제약 조성물은 인간 및 동물 의약으로 인간 또는 동물 용도일 수 있고, 1 이상의 제약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제이다. 치료적 용도에 허용가능한 담체 또는 희석제는 제약 기술 분야에서 공지이고, 예를 들면 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 제약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 목적하는 투여 경로 및 표준 제약 절차를 고려하여 선택할 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이들 이외에 적당한 결합제, 윤활제, 현탁제, 코팅제, 가용화제를 포함할 수 있다.
보존제, 안정화제, 염료 및 향미제를 제약 조성물에 넣을 수 있다. 보존제의 예는 벤조산 나트륨, 소르빈산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용할 수 있다.
상이한 전달 시스템에 따라 상이한 조성물/제제 요구조건이 있을 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 제약 조성물은 미니-펌프를 사용하거나 예를 들면 흡입을 위한 코 스프레이 또는 에어로졸로서 점막 경로 또는 섭취가능한 용액에 의해, 또는 비경구로 (이 경우 조성물은 주사가능한 형태, 예를 들면 정맥내, 근육내 또는 피하 경로로 전달하기 위하여 조제됨) 전달하기 위하여 조제될 수 있다. 별법으로, 제제는 양쪽 경로 모두로 전달되도록 디자인될 수 있다.
약제를 위장관 점막을 통해 점막으로 전달할 때, 약제는 위장관 통과에도 불구하고 안정한 상태로 있을 수 있어야 하고, 예를 들면 단백분해에 의해 분해되지 않아야 하고, 산성 pH에서 안정하고 담즙의 세정 효과에 대해 저항성이 있어야 한다.
적절할 경우, 제약 조성물은 흡입에 의해, 좌약 또는 페서리의 형태로, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포분말의 형태로 외용으로, 피부 패치의 사용에 의해, 전분 또는 락토스와 같은 부형제를 함유하는 정제의 형태로, 또는 캡슐 또는 오불 (ovules)을 단독 또는 부형제와 혼합한 형태로, 향미제 또는 착색제를 함유하는 엘릭실, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구로 투여되거나, 비경구로, 예를 들면 정맥내, 근육내 또는 피하로 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해서는, 조성물은 다른 물질, 예를 들면 용액을 혈액과 등장액으로 만들기 위해 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 협측 또는 설하 투여를 위해서, 조성물은 통상적 방법으로 조제될 수 있는 정제 또는 로젠지제의 형태로 투여될 수 있다.
어떤 실시태양의 경우에는, 본 발명의 약제는 시클로덱스트린과의 조합으로 사용될 수 있다. 시클로덱스트린은 약물 분자와 포접 및 비-포접 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 약물-시클로덱스트린 복합체의 형성은 약물 분자의 용해도, 용해 속도, 생체이용율 및(또는) 안정성 성질을 변경시킬 수 있다. 약물-시클로덱스트린 복합체는 대부분의 투약 형태 및 투여 경로에 일반적으로 유용하다. 약물과의 직접 복합체 형성에 대한 대안으로서 시클로덱스트린은 보조 첨가제로서, 예를 들면 담체, 희석제 또는 가용화제로서 사용될 수 있다. 알파-, 베타- 및 감마-시클로덱스트린이 가장 흔히 사용되고 적합한 예는 WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 및 WO-A-98/55148에 기재되어 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약제는 전신적으로 (예를 들면 경구, 협측, 설하로), 더욱 바람직하게는 경구로 전달된다.
그러므로, 바람직하게는 약제는 경구 전달에 적합한 형태이다.
어떤 실시태양의 경우에, 바람직하게는 약제는 사용시 생식기에서 말초적으로 작용하는 것 이외에 중추신경계에도 작용한다.
어떤 실시태양의 경우에, 바람직하게는 약제는 사용시 생식기에 위치하는 수용체, 바람직하게는 음경 해면체에 관련된 것에 대해서 작용하는 것 이외에는 말초적으로 작용하지 않는다.
투여
"투여된다"라는 용어는 바이러스 또는 비-바이러스 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 기전은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AAV)벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 비-바이러스 전달 기전은 지질 매개 형질감염, 리포좀, 이뮤노리포좀, 리포펙틴, 양이온성 페이셜 친양쪽성체 (cationic facial amphiphiles, CFAs) 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 약제는 단독으로 투여될 수 있지만 일반적으로 제약 조성물로서, 예를 들면 원하는 투여의 경로 및 표준 제약학적 절차를 고려하여 선택된 적절한 제약학적 부형제, 희석제 또는 담체와 약제가 혼합된 제약 조성물로서 투여될 것이다.
예를 들면, 약제는 즉시-, 지연-, 변형-, 맥동성- 또는 조절된 방출 적용을 위한, 향미제 또는 착색제를 포함할 수 있는, 정제, 캡슐, 오불, 엘릭실, 용액 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다 (경구 또는 국소로).
정제는 부형제, 예를 들면 미세결정성 셀룰로스, 락토스, 구연산 나트륨, 탄산 칼슘, 제2인산 칼슘 및 글리신과 같은 부형제, 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 소듐 스타치 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 소듐 및 특정 콤플렉스 실리케이트와 같은 붕해제, 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC), 히드록시프로필셀룰로스 (HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아라비아 고무와 같은 과립 결합제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 윤활제, 예를 들면 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크가 포함될 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물을 젤라틴 캡슐 내에 충전제로서 사용할 수 있다. 이 측면에서 바람직한 부형제는 락토스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 현탁액 및(또는) 엘릭실을 위해서는, 본 발명의 화합물은 다양한 감미제 또는 향미제, 착색 물질 또는 염료, 유화 및(또는) 현탁제 및 희석제, 예를 들면 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린 및 이들의 조합과 결합될 수 있다.
투여 (전달)를 위한 경로는 경구 (예를 들면, 정제, 캡슐 또는 섭취가능한 용액으로서), 국소, 점막 (예를 들면 흡입을 위한 코 스프레이 또는 에어로졸로서), 경비, 비경구 (예를 들면 주사가능한 형태로), 위장관, 척수강내, 복강내, 근육내, 정맥내, 자궁내, 안내, 피내, 두개내, 기관내, 질내, 뇌실내, 뇌내, 피하, 안과용 (유리체내 또는 전방내 포함), 경피, 직장, 협측, 음경, 질, 경막, 설하 중 1 이상을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
모든 약제가 동일한 경로로 투여될 필요는 없는 것으로 이해된다. 유사하게, 조성물이 1 이상의 활성 성분을 포함한다면 이러한 성분들은 상이한 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 약제가 비경구로 투여된다면, 이러한 투여의 예는 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하로 약제를 투여하는 것 및(또는) 주입 기술을 사용하여 투여하는 것 중 1 이상을 포함한다.
비경구 투여를 위해서는, 약제는 혈액과 등장 용액을 만들기 위하여 충분한 염 또는 글루코스와 같은 다른 물질을 함유할 수 있는 무균 수용액의 형태로 가장 잘 사용된다. 수용액은 필요하다면 적절하게 완충되어야 한다 (바람직하게는 pH 3 내지 9로). 무균 조건 하의 적절한 비경구 제제는 당업자에게 공지인 표준 제약기술에 의해 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 약제는 비내로 또는 흡입에 의해 투여될 수 있고, 적절한 분사제, 예를 들면 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 히드로플루오로알칸, 예를 들면 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134ATM또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 (HFA 227EATM), 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여 가압 용기, 펌프, 분무기 또는 연무기로부터의 건조 분말 흡입기 또는 에어로졸 분무 제제의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로솔의 경우에, 용량 단위는 계측된 양을 송달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 분무기 또는 연무기는 예를 들면 용매로서 에탄올 및 분사제의 혼합물을 사용하고, 소르비탄 트리올리에이트와 같은 윤활제를 추가로 함유할 수 있는 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지 (예를 들면 젤라틴으로부터 제조됨)는 약제 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재의 분말 혼합을 함유하도록 제조될 수 있다.
별법으로, 본 발명의 약제는 좌약 또는 페서리의 형태로 투여될 수 있거나, 겔, 히드로겔, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포분말의 형태로 국소적으로 적용될 수 있다. 본 발명의 약제는 또한 예를 들면 피부 패치를 사용하여 피부로 또는 경피로 투여될 수 있다. 이들은 또한 폐 또는 직장 경로로 투여될 수 있다. 이들은 또한 안과 경로로 투여될 수 있다. 안과적 용도를 위해서는, 화합물은 등장의, pH조정된 무균 식염수 중의 미세화 현탁액으로서, 또는 바람직하게는 등장의, pH 조정된 무균 식염수 중의 용액으로서, 임의로 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제와 함께 제조될 수 있다. 별법으로, 이들은 바셀린과 같은 연고로 제조될 수 있다.
피부에 국소적으로 도포하기 위하여, 본 발명의 약제는 예를 들면, 1 이상의 하기 물질과의 혼합물 중에 현탁되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고제로서 제조될 수 있다: 광유, 유동 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물. 별법으로, 이들은 예를 들면, 1 이상의 하기 물질의 혼합물에 현탁되거나 용해된 적합한 로션 또는 크림으로 제조될 수 있다: 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 유동 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물.
본 발명의 조성물은 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.
어떤 적용의 경우, 바람직하게는 약제는 경구로 투여된다.
어떤 적용의 겨우, 바람직하게는 약제는 국소적으로 투여된다.
용량 수준
통상적으로, 의사는 각 환자에 대해 가장 적합한 실제 용량을 결정할 것이다. 특정 개체를 위한 특정 용량 수준 및 투약의 빈도는 사용된 특정 화합물의 활성, 대사적 안정성 및 그 화합물의 작용 기간, 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별, 음식, 투여의 방식 및 시간, 배설 비율, 약물 조합, 환자 상태의 심각성, 각개체가 받고 있는 요법을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. 본 발명의 약제 및(또는) 제약 조성물은 하루에 1 또는 2회와 같이 하루에 1 내지 10 회의 투약법에 따라 투여될 수 있다.
인간의 경구 및 비경구 투여에 있어서, 약제의 1 일 용량 수준은 1회 또는 분할 투약으로 할 수 있다.
필요에 따라, 약제는 0.01 내지 30 mg/kg 체중, 예를 들면 0.1 내지 10 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 mg/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있다. 물론, 본원에 기재된 투약량은 평균의 경우의 예시이다. 물론 더 높거나 낮은 투약량 범위가 이로운 각각의 경우가 있을 수 있다.
통상적으로 1일 경구 용량은 예를 들면 20-1000 mg, 바람직하게는 예를 들면 50-300 mg일 수 있다.
제제
본 발명의 약제는 당해 기술분야에서 공지인 기술을 사용하여 예를 들면 1 이상의 적절한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하여 제약 조성물로 조제할 수 있다.
하기에 제제의 몇몇 비-제한적 실시예를 기재한다.
제제 1: 하기 성분을 사용하여 정제를 제조하였다.
중량 (mg)
약제 250
미세결정성 셀룰로스 400
발연 이산화규소 10
스테아르산 5
총 665
성분을 혼합하고 압축하여 각각 665 mg의 정제를 형성하였다.
제제 2: 정맥내 제제는 하기와 같이 제조할 수 있다:
약제 100 mg
등장 식염수 1,000 ml
개체
본원에 사용된 "개체"라는 용어는 척추동물, 특히 포유류 종의 구성원을 말한다. 이 용어는 가축, 스포츠용 동물, 영장류 및 인간을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
생체이용률
바람직하게는, 본 발명의 화합물 (및 복합제)는 경구로 생체이용가능하다. 경구 생체이용률은 전신 순환에 도달하는 경구로 투여된 약물의 비율을 말한다. 약물의 경구 생체이용률을 결정하는 인자는 용해, 멤브레인 투과성 및 대사 안정성이다. 통상적으로, 먼저 시험관내, 그 후 생체내 기술의 스크리닝 캐스케이드를 사용하여 경구 생체이용률을 결정한다.
위장관 (GIT)의 수성 내용물에 의한 약물의 용해, 가용화는 GIT를 모방하기 위하여 적절한 pH에서 수행되는 시험관내 용해도 실험으로부터 예측될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 화합물은 50 mcg/ml의 최소 용해도를 갖는다. 용해도는 문헌 [Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3-25, 1997]에 기재된 것과 같은 당해 기술 분야의 공지의 표준 절차에 의해 결정할 수 있다.
멤브레인 투과성은 GIT의 세포를 통한 화합물의 통과를 말한다. 친지성이이를 예측하는데 있어서 주요 성질이고, 유기 용매 및 완충액을 사용하는 시험관내 Log D7.4측정에 의해 정의된다. 바람직하게는 본 발명의 화합물은 -2 내지 +4, 더욱 바람직하게는 -1 내지 +2의 Log D7.4를 갖는다. Log D는 문헌 [J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42:144]에 기재된 바와 같은 당해 기술분야에서 공지인 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
CaCO2와 같은 세포 단층 분석은 카코-2 (caco-2) 플럭스라고 불리는 p-당단백질과 같은 유출 운반체 (efflux transporter)의 존재 하에서 양호한 멤브레인 투과성을 예측하는데 실질적으로 역할을 한다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 2x10-6cms-1보다 큰, 더욱 바람직하게는 5x10-6cms-1보다 큰 카코-2 플럭스를 갖는다. 카코 플럭스는 문헌 [J. Pharm. Sci., 1990, 79, 595-600]에 기재된 바와 같은 당해 기술 분야에서 공지인 표준 절차에 의해 측정할 수 있다.
대사 안정성은 GIT 또는 간이 흡수 과정 중 화합물을 대사하는 능력: 초회 통과 효과를 말한다. 마이크로좀, 간세포 등과 같은 분석 시스템에 의해 대사 취약성을 예측한다. 바람직하게는, 실시예의 화합물은 분석 시스템에서 0.5 미만의 간 추출율 정도의 대사 안정성을 나타낸다. 실시예의 분석 시스템 및 데이터 조작은 문헌 [Curr. Opin. Drug Disc. Devel., 201, 4, 36-44, Drug Met. Disp., 2000, 28, 1518-1523]에 기재되어 있다.
상기 방법의 상호작용으로 인하여, 약물이 사람에게서 경구로 생체이용가능하다는 추가적 증거는 동물에서의 생체내 실험에 의해 얻을 수 있다. 이 연구에서경구로 화합물을 별도로 또는 혼합물로 투여함으로써 절대 생체이용률을 측정한다. 절대 측정 (흡수 %)을 위하여 정맥내 경로도 또한 사용된다. 동물에서 경구 생체이용률의 평가의 예는 문헌 [Drug Met. Disp., 2001, 29, 82-87; J. Med Chem, 1997, 40, 827-829, Drug Met. Disp., 1999, 27, 221-226]에 기재되어 있다.
화학적 합성 방법
통상적으로 본 발명에 따른 용도에 적합한 NPYi/NPY Y1i (및(또는) 적용가능한 경우 PDEi/PDE5i)는 화학적 합성 기술에 의해 제조될 것이다.
약제 또는 그의 표적 또는 변이체, 상동체, 유도체, 단편 또는 모방약은 전체 또는 일부의 약제를 합성하는 화학적 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 고상 기술에 의하여 합성되고, 수지로부터 절단되고, 제조용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY]). 합성 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석에 의하여 확인될 수 있다 (예를 들면, 에드만 분해 방법 (Edman degradation procedure; 상기 Creighton의 문헌)).
약제 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체, 단편 또는 모방약의 직접 합성은 다양한 고상 기술을 사용하여 수행될 수 있고 (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204) 예를 들면, ABI 43 1 A 펩티드 합성기 (Perkin Elmer)를 사용하여 제조자에 의해 제공된 지시에 따라 자동화 합성을 수행할 수 있다. 또한 약제 또는 그의 일부를 포함하는 아미노산 서열은 직접 합성 중 변경되고(되거나) 다른 서브유닛으로부터의 서열과 화학적 방법을 사용하여 합쳐져서, 예를 들면 변이체 NPY 또는 NPY Y1과 같은 변이체 약제 또는 표적이 생성될 수 있다.
본 발명의 대체적 실시태양에서, 약제 표적 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체, 단편 또는 모방약의 코딩 서열은 전부 또는 일부가 당해 기술분야에서 공지인 화학적 방법을 사용하여 합성될 수 있다 (문헌 [Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23], [Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232] 참조).
모방약
본원에 사용된 "모방약"이라는 용어는 표적에 대하여 비교 약물과 동일한 정성적 활성 또는 효과를 갖는 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 다른 유기 화학물질을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 모방약은 공지의 약제와 기능적 등가물일 수 있다.
화학적 유도체
본원에 사용된 "유도체" 또는 "유도체화된"이라는 용어는 약제의 화학적 변형을 포함한다. 이러한 화학적 변형의 예는 수소를 할로기, 알킬기, 아실기 또는 아미노기로 대체하는 것일 것이다.
화학적 변형
본 발명의 한 실시태양에서, 약제는 화학적으로 변형된 약제일 수 있다.
약제의 화학적 변형은 약제와 표적 간의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을 상승시키거나 감소시킬 수 있다.
한 측면에서, 확인된 약제는 다른 화합물의 개발에 모델 (예를 들면, 주형)로서 작용할 수 있다.
표적
본 발명의 한 측면에서, NPY 또는 NPY Y1 수용체는 NPY 또는 NPY Y1을 억제할 수 있는 약제를 확인하기 위한 스크리닝에서 표적으로 사용될 수 있다. 이에 대하여, 표적은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No.2 또는 SEQ ID No. 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조되는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편 또는 그를 포함하는 발현 물질을 포함할 수 있다.
별법으로, NPY 또는 NPY Y1 수용체는 NPY 또는 NPY Y1의 억제를 통해 해면체내압의 증가를 매개할 수 있는 약제를 확인하기 위하여 표적으로 사용될 수 있다. 이 관점에서, 표적은 적절한 조직 추출물일 수 있다.
표적은 이러한 조직 및(또는) 재조합 표적의 조합일 수 있다.
재조합 방법
통상적으로 본 발명의 약제는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
한 실시태양에서, 바람직하게는 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i이다. NPYi 또는 NPY Y1i는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
아미노산 서열
본원에 사용된 "아미노산 서열"이라는 용어는 용어 "폴리펩티드" 및(또는)용어 "단백질"과 동의어이다. 어떤 경우, "아미노산 서열"이라는 용어는 용어 "펩티드"와 동의어이다. 어떤 경우, "아미노산 서열"이라는 용어는 용어 "단백질"과 동의어이다.
아미노산 서열은 적합한 공급원으로부터 단리하여 제조할 수 있거나 합성적으로 제조할 수 있거나 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 1 이상의 약제 및(또는) 그의 유도체를 확인하기 위한 분석에서 표적으로 작용할 수 있는 아미노산 서열을 제공한다.
바람직하게는, 표적은 NPY 또는 NPY Y1 수용체이다.
바람직하게는, NPY 또는 NPY Y1 수용체는 단리된 NPY 또는 NPY Y1 수용체이고(이거나) 정제되고(되거나) 비-천연 (non-native)의 것이다.
본 발명의 NPY 또는 NPY Y1 수용체는 실질적으로 단리된 형태일 수 있다. NPY 또는 NPY Y1 수용체는 수용체가 의도하는 목적을 방해하지 않고 역시 실질적으로 분리된 것으로 여겨지는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 NPY 또는 NPY Y1 수용체는 또한 실질적으로 순수한 형태일 수 있고, 이 경우 제제 중 90% 초과, 예를 들면 95%, 98% 또는 99%의 NPY 또는 NPY Y1 수용체가 SEQ ID No. 1, 2 또는 3의 발현으로부터 얻을 수 있는 펩티드 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편인 제제 중에 NPY 또는 NPY Y1 수용체를 일반적으로 포함할 것이다.
뉴클레오티드 서열
본원에 사용된 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어와 동의어이다.
뉴클레오티드 서열은 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 센스 또는 안티센스 가닥 또는 이들의 조합을 나타내는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.
어떤 적용에서, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 DNA이다.
어떤 적용에서는, 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술 (예를 들면, 재조합 DNA)을 사용하여 제조된다.
어떤 적용에서는, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 cDNA이다.
어떤 적용에서는, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열은 이 측면에 대하여 자연 발생하는 형태와 동일할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 1 이상의 약제 및(또는) 그의 유도체를 확인하기 위한 분석에서 표적으로 작용할 수 있는 물질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 뉴클레오티드 서열은 NPY 또는 NPY Y1 수용체를 코딩한다.
당업자는 유전 코드의 퇴화의 결과 많은 상이한 뉴클레오티드 서열이 동일한 표적을 코딩할 수 있는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자가 통상의 기술을 사용하여 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들어 표적이 발현될 임의의 특정한 숙주 개체의 코돈 사용을 반영할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 첨부된 서열 목록에 기재된 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"라는 용어는본 발명에 따른 기능적 표적 (본 발명에 따른 약제가 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다면 상기 약제)을 코딩하게 하는 생성된 뉴클레오티드 서열을 제공하는, 그 서열로부터의 또는 그 서열에의 하나의 (또는 그 이상의) 핵산의 임의의 치환, 변경, 변형, 대체, 결실 또는 첨가를 포함한다.
앞에서 지적하였듯이, 서열 상동성의 측면에서, 본원에 상호 인용된 NPY 서열에 대해 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성이 있다. 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 있다. 뉴클레오티드 상동성 비교는 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직한 서열 비교 프로그램은 상기한 GCG 위스콘신 베스트피트 (Wisconsin Bestfit) 프로그램이다. 디폴트 점수 매트릭스는 각 동일한 뉴클레오티드에 대하여 10의 매치 값을, 각 미스매치에 대하여는 -9를 갖는다. 디폴트 갭 생성 벌점 (default gap creation penalty)은 각 뉴클레오티드에 대하여 -50이고 디폴트 갭 익스텐션 (extension) 벌점은 -3이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 서열에, 또는 그의 임의의 변이체, 단편 또는 유도체에, 또는 상기 중 임의의 것의 상보서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 15 개 이상의 뉴클레오티드의 길이, 더욱 바람직하게는 20, 30, 40 또는 50 개 이상의 뉴클레오티드의 길이이다. 이 서열은 탐침으로, 예를 들면 진단 키트에 사용될 수 있다.
변이체/상동체/유도체
본원에 언급된 특정 뉴클레오티드 서열 및 그로부터 유도가능한 아미노산 서열 이외에, 본 발명은 또한 그의 변이체, 상동체 및 유도체의 용도를 포함한다. 여기서, "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 동등하게 취급될 수 있다.
본 발명의 경우에, 상동성 서열은 75, 85 또는 95% 이상, 바람직하게는 95 또는 98% 이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 여겨진다. 특히, 상동성은 통상적으로 활성에 필수적이라고 알려진 서열의 영역에 대한 것으로 여겨진다. 상동성이 유사성에 관한 것으로 여겨질 수 있지만 (즉, 유사한 화학적 성질/기능을 갖는 아미노산 잔기), 본 발명의 경우에는 바람직하게는 상동성을 서열 동일성에 관해서 표현하는 것으로 한다.
상동성 비교는 육안으로, 또는 더 통상적으로는 쉽게 입수가능한 서열 비교 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 이 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2 이상의 서열 간에 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 근접 서열, 즉 한 서열이 다른 서열과 함께 정렬되어 있는 경우에 대하여 계산될 수 있고, 한 서열 내의 각 아미노산이 한번에 한 잔기씩, 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "갭 없는 (ungapped)" 정렬이라고도 불린다. 통상적으로 이러한 갭 없는 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에 대하여만 수행된다.
이는 매우 단순하고 일관된 방법이지만, 예를 들면, 동일한 서열의 쌍에서도, 하나의 삽입 또는 결실에 의해 다음 아미노산 잔기가 정렬에서 빠져서, 전체적 정렬이 수행될 때 % 상동성에 큰 감소를 가져올 수 있다는 것을 고려하지 못한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 부당하게 전체 상동성 점수에 벌점을 부과하지 않고, 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 디자인된다. 이는 서열 정렬에 "갭"을 삽입하여 국부 상동성을 최대화하려고 함으로써 달성된다.
그러나, 이 더 복잡한 방법은 정렬 내에 발생하는 각 갭에 "갭 벌점"을 할당하여 같은 수의 동일 아미노산에 대하여, 가능한한 적은 갭을 갖는 서열 정렬 (비교된 두 서열 간에 더 높은 관련성을 반영함)이 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 점수를 얻도록 한다. "어파인 (affine) 갭 값"은 통상적으로 사용되며 갭의 익스텐션에 대하여 상대적으로 높은 값을 부여하고 갭 내의 각 연속하는 잔기에 대하여 더 적은 벌점을 부여한다. 이는 가장 흔히 사용되는 갭 점수 시스템이다. 높은 갭 벌점은 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정열 프로그램은 갭 벌점이 변경될 수 있게 한다. 그러나, 서열 비교를 위한 이러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 GCG 위스콘신 베스트피트 패키지 (하기 참조)를 사용할 때 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 벌점은 하나의 갭에 대하여 -12이고 각 익스텐션에 대하여 -4이다.
최대 % 상동성의 계산은 그러므로 갭 벌점을 고려하여 최적의 정렬의 생성을 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트피트 패키지 (미국 위스콘신 대학; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지 (문헌 [Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18] 참조), FASTA (문헌 [Atschul et aL, 1990, J. Mol. Biol., 403-410] 참조) 및 GENEWORKS 비교 도구 조를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. BLAST 및 FASTA는 오프라인 및 온라인 서치에 이용할 수 있다 (문헌 [Ausubel ef al., 1999 ibid, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, GCG 베스트피트 프로그램을 하용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 시퀀시스라고 분리는 새로운 도구는 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 또한 사용할 수 있다 (문헌 [FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8] 및 tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조).
최종 % 상동성이 동일성에 대하여 측정될 수 있지만, 정렬 방법 그 자체는 통상적으로 실무율의 쌍 비교에 기초하지 않는다. 그 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기초한 각 쌍단위 비교에 점수를 할당하는 척도화된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 통상적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 (BLAST 프로그램 조를 위한 디폴트 매트릭스)이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 퍼블릭 (public) 디폴트 값 또는 공급된다면 커스텀 (custom) 심볼 (symbol) 비교 표를 사용한다 (더 자세한 내용은 사용자 매뉴얼 참조). GCG 패키지를 위한 퍼블릭 디폴트 값 또는 다른 소프트웨어의 경우, BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면, % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산할 수 있다. 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고 수치적 결과를 생성한다.
서열은 또한 침묵 (silent) 변화를 생성하여 결과적으로 기능적으로 동등한 물질이 생성되는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적치환은 물질의 2차적 결합 활성이 유지되는 한 아미노산 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및(또는) 양극성 성질의 유사성에 기초하여 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 음 전하를 띠는 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양전하를 띠는 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 타이로신을 포함한다.
보존적 치환은, 예를 들면 하기 표에 따라 생성될 수 있다. 두번째 열의 같은 구역의 아미노산 및 바람직하게는 세번째 열의 같은 줄에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
지방족 비-극성 G A P
I L V
극성-전하를 띠지 않음 C S T M
N Q
극성-전하를 띰 D E
K R
방향족 H F W Y
본 발명은 또한 상동성 치환 (치환 및 대체는 본원에서 모두 기존의 아미노산을 별도의 잔기로 상호변경하는 것을 의미하기 위하여 사용됨), 즉 유사한 것끼리의 치환, 예를 들면 염기성은 염기성으로, 산성은 산성으로, 극성은 극성으로 등의 치환이 발생할 수 있는 것을 포함한다. 비-상동성 치환, 즉 한 부류로부터 다른 부류의 잔기로의 치환 또는 별법으로 오르니틴 (이하에서는 Z로 표시), 디아미노부티르산 오르니틴 (이하에서는 B로 표시), 노르류신 오르니틴 (이하에서는 O로 표시), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함이 관여하는 치환도 또한 발생할 수 있다.
비천연 아미노산에 의해 대체가 일어날 수 있는데; 비천연 아미노산은 알파*및 알파-이치환*아미노산, N-알킬 아미노산*, 락트산*, 천연 아미노산의 할리드 유도체, 예를 들면 트리플루오로타이로신*, p-Cl-페닐알라닌*, p-페닐알라닌*, p-l-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-α-아미노 부티르산*, L-γ-아미노 부티르산*, L-α-아미노 이소부티르산*, L-ε-아미노 카프로산#, 7-아미노 헵탄산*, L-메티오닌 설폰#*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-히드록시프롤린#, L-티오프롤린*, 페닐알라닌 (Phe)의 메틸 유도체, 예를 들면 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe (4-아미노)#, L-Tyr (메틸)*, L-Phe (4-이소프로필)*, L-Tic (1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산#및 L-Phe (4-벤질)*을 포함한다. * 표시는 상기 논의 (상동성 또는 비상동성 치환과 관련)의 목적으로 유도체의 소수성 성질을 나타내기 위하여 사용된 것이고, #는 유도체의 친수성 성질을 나타내기 위하여 사용된 것이고, #*은 양극성 성질을 나타낸다.
변이체 아미노산 서열은 서열 중 임의의 두개의 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적절한 스페이서 그룹을 포함할 수 있고, 이는 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 이외에 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를포함한다. 변이체의 추가적 형태는, 펩토이드 (peptoid) 형태의 1 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하고, 당업자에게 잘 이해될 것이다. 확실히 하기 위해, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환체 기가 α-탄소보다 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이체 아미노산 잔기를 언급하기 위하여 사용된다. 펩토이드 형태의 펩티드를 제조하기 위한 방법은 당해 기술분야, 예를 들면 문헌 [Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371] 및 [Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134]에 공지되어 있다.
혼성화
본원에 사용된 "혼성화"라는 용어는 "핵산의 가닥이 염기 짝짓기를 통해 상보성 가닥과 접합하는 과정" 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술에서 수행되는 증폭의 과정을 포함할 것이다.
본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 성보 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 20 이상, 바람직하게는 25 또는 30 이상, 예를 들면 40, 60 또는 100 이상의 근접 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 본원에 기재된 상응하는 상보성 뉴클레오티드 서열에 대하여 일반적으로 75% 이상, 바람직하게는 85 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 또는 98% 이상의 상동성일 것이다.
"선택적으로 혼성화될 수 있는"이라는 용어는 뉴클레오티드 서열이 탐침으로 사용될 때, 표적 뉴클레오티드 서열이 백그라운드 보다 높은 현저한 수준으로 탐침에 혼성화하는 것으로 발견되는 조건 하에서 사용되는 것을 의미한다. 백그라운드혼성화는 예를 들면 스크리닝되는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에 존재하는 다른 뉴클레오티드 서열 때문에 발생할 수 있다. 이 경우, 백그라운드는 표적 DNA와의 특이적 상호작용에서 관찰되는 것의 10 배 미만, 바람직하게는 100 배 미만의 강도인, 탐침과 라이브러리의 비-특이적 DNA 구성원 간의 상호작용에 의해 발생한 신호의 수준을 뜻한다. 상호작용의 강도는 예를 들면 방사성 표지된 탐침에 의해, 예를 들면32P로 측정할 수 있다.
혼성화 조건은 문헌 [Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)]에 교시된, 핵산 결합 복합체의 융해 온도 (Tm)에 기초하고, 아래에 설명한 바와 같은 한정된 "가혹도 (stringency)"를 부여한다.
최대 가혹도는 통상적으로 Tm-5℃ (탐침의 Tm 보다 5℃ 낮음)에서 발생하고; 높은 가혹도는 Tm 보다 약 5℃ 내지 10℃ 낮은 온도에서; 중간 가혹도는 Tm보다 약 10℃ 내지 20℃ 낮은 온도에서; 낮은 가혹도는 Tm보다 20℃ 내지 25℃ 낮은 온도에서 발생한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 최대 가혹도 혼성화는 동일 뉴클레오티드 서열을 확인 또는 검출하기 위하여 사용될 수 있고, 중간 (또는 낮은) 가혹도 혼성화는 유사하거나 관련있는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인 또는 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 가혹 조건 (예를 들면, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0}) 하에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 이중-가닥인 경우, 이중나선의 양 가닥은 개별적으로 또는 조합으로 본 발명에 포함된다. 뉴클레오티드 서열이 단일-가닥인 경우, 그 뉴클레오티드의 상보 서열도 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명의 서열에 100% 상동성이 아니지만 본 발명의 범위 내인 뉴클레오티드 서열은 여러가지 방법으로 얻을 수 있다. 본원에 기재된 다른 변이체는 예를 들면 일정 범위의 공급원으로부터 만들어진 DNA 라이브러리를 탐침함으로써 얻을 수 있다. 또한, 다른 바이러스/세균, 또는 세포의 상동체, 특히 포유류 세포 (예를 들면, 랫트, 마우스, 소 및 영장류 세포)에서 발견되는 세포의 상동체를 얻을 수 있고, 이러한 상동체 및 그의 단편은 일반적으로 본원의 서열 목록에 나타낸 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 것이다. 이러한 서열은 다른 동물 종으로부터 만들어진 cDNA 라이브러리 또는 다른 동물종의 게놈 DNA 라이브러리를 탐침하고, 중간 또는 높은 가혹도의 조건 하에서 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 탐침으로 이러한 라이브러리를 탐침함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 아미노산 및(또는) 뉴클레오티드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체를 얻는 데에도 유사한 연구를 적용한다.
변이체 및 균주/종 상동체는 본 발명의 서열 내의 보존된 아미노산 서열을 코딩하는 변이체 및 상동체 내의 표적 서열에 대하여 디자인된 프라이머를 사용하는 퇴화 (degenerate) PCR을 사용하여 얻을 수도 있다. 보존된 서열은 예를 들면, 몇몇 변이체/상동체로부터 아미노산 서열을 정렬함으로써 예측할 수 있다. 서열정렬은 당해 기술분야에서 공지인 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, GCG 위스콘신 파일업 (PileUp) 프로그램이 널리 사용된다. 퇴화 PCR에 사용되는 프라이머는 1 이상의 퇴화 위치를 포함할 것이며, 공지 서열에 대한 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하기 위하여 사용되는 것보다 낮은 가혹도 조건에서 사용될 것이다.
별법으로, 이러한 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 서열 목록의 SEQ ID No 1 또는 2에 기재된 뉴클레오티드 서열과 같은 특정 서열의 부위 지정 돌연변이에 의해 얻을 수 있다. 이는 예를 들면 뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 선호성을 최적화하기 위하여 침묵 코돈 변경이 서열에 필요한 경우에 유용하다. 다른 서열 변경은 제한 효소 인식 부위를 도입하기 위하여, 또는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 변경하기 위하여 필요할 수도 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 프라이머, 예를 들면 PCR 프라이머, 대체적 증폭 반응을 위한 프라이머, 탐침, 예를 들면 방사성 또는 비방사성 표지를 사용하는 통상의 방법에 의한 노출시킨 (revealing) 표지로 표지된 탐침을 생산하기 위하여 사용될 수 있거나, 뉴클레오티드 서열이 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 프라이머, 탐침 및 다른 단편은 15 이상, 바람직하게는 20 이상, 예를 들면 25, 30 또는 40 이상의 뉴클레오티드의 길이이고, 본원에 사용되는 본 발명의 뉴클레오티드 서열이라는 용어에도 포함된다.
본 발명에 따른 DNA 폴리뉴클레오티드 및 탐침과 같은 뉴클레오티드 서열은재조합적으로, 합성에 의해, 또는 당업자가 사용가능한 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
일반적으로, 프라이머는 한번에 하나의 뉴클레오티드씩 원하는 핵산 서열의 단계적 제조 방법이 관여하는 합성 방법에 의해 생산될 것이다. 자동화 기술을 사용하는 이를 수행하기 위한 기술은 당업계에서 쉽게 사용할 수 있다.
더 긴 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 재조합 수단, 예를 들면 PCR (중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 사용하여 생산될 것이다. 이는 클로닝하기 원하는 표적 서열의 영역의 측면에 위치하는 프라이머의 쌍 (예를 들면 약 15 내지 30 뉴클레오티드)을 제조하고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 영역의 증폭을 일으키는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하고, 증폭된 단편을 단리하고 (예를 들면 반응 혼합물을 아가로스 겔 상에서 정제함으로써), 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함할 것이다. 프라이머는 적합한 제한 효소 인식 부위를 포함하여 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 디자인될 수 있다.
유전 코드의 고유의 퇴화로 인해, 실질적으로 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 코딩하는 다른 DNA 서열이 표적 서열을 클로닝 및 발현하기 위하여 사용될 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 특정 발현 시스템을 위해서는, 자연 발생하지 않는 코돈으로 표적 서열을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 자연 발생하는 서열로부터 생산된 전사체 보다 표적 발현의 속도를 증가시키기 위하여 또는 반감기가 더 긴 것과 같은 바람직한 성질을 갖는 재조합 RNA전사체를 생산하기 위하여, 특정 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 선호되는 코돈을 선택할 수 있다 (Murray Eet al(1989) Nuc Acids Res 17:477-508).
벡터
본 발명의 한 실시태양에서, 약제 (즉 NPYi 또는 NPY Y1i)를 개체에 직접 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 약제를 코딩하는 뉴클레오티드 서여을 포함하는 벡터를 개체에 투여한다.
바람직하게는 재조합 약제는 유전적 벡터를 사용하여 제조되고(되거나) 표적 부위로 전달된다.
당해 기술 분야에 공지된 바 대로, 벡터는 한 환경으로부터 다른 곳으로 물질의 전달을 가능하게 하거나 용이하게 하는 수단이다. 본 발명에 따라, 또한 예로써, 재조합 DNA 기술에 사용된 몇몇 벡터는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 복제하고(하거나) 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 본 발명의 단백질을 발현할 목적으로 DNA의 절편 (예를 들면, 이종 DNA 절편, 예를 들면 이종 cDNA 절편)과 같은 물질이 숙주 및(또는) 표적 세포로 전달될 수 있게 한다. 재조합 DNA 기술에 사용되는 벡터의 예는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 또는 바이러스를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
"벡터"라는 용어는 발현 벡터 및(또는) 형질전환 벡터를 포함한다.
"발현 벡터"라는 용어는 생체내 또는 시험관내/생체외 발현이 가능한 구성체 (construct)를 의미한다.
"형질전환 벡터"라는 용어는 한 종으로부터 다른 종으로 전달될 수 있는 구성체를 의미한다.
네이키드 (naked) DNA
MED와 같은 MSD를 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 약제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 바람직하게는 숙주 세포 게놈에 상동성인 플랭킹 서열을 더 포함하는 "네이키드 핵산 구성체"로서 직접 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 "네이키드 DNA"라는 용어는 그의 생산을 조절하기 위한 짧은 프로모터 영역과 함께 본 발명의 약제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드를 말한다. 이는 플라스미드가 어떠한 전달 비히클에도 들어 있지 않으므로 "네이키드" DNA라고 불린다. 이러한 DNA 플라스미드가 진핵세포와 같은 숙주 세포에 들어갈 때, 그것이 코딩하는 단백질 (예를 들면, 본 발명의 약제)은 세포 내에서 전사되고 번역된다.
비-바이러스 전달
별법으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 약제 (즉 NPYi 또는 NPY Y1i) 또는 본 발명의 표적 (즉 NPY 또는 NPY Y1)을 포함하는 벡터는 형질감염, 형질전환, 전기충격법 및 바이오리스틱 (biolistic) 형질전환과 같은 해당 기술분야에서 공지인 다양한 비-바이러스 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.
본원에 사용된 "형질감염"이라는 용어는 비-바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 표적 포유류 세포에 전달하는 방법을 의미한다.
통상적 형질감염 방법은 전기충격법, DNA 바이오리스틱, 지질-매개 형질감염, 컴팩티드 (compacted) DNA 매개 형질감염, 리포좀, 이뮤노리포좀, 리포펙틴, 양이온성 약제-매개, 양이온성 페이셜 친양쪽성체 (CFAs) (Nature Biotechnology 1996 14;556), 스퍼민과 같은 다가 양이온, 양이온성 지질 또는 폴리라이신, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판(DOTAP)-콜레스테롤 복합체 (Wolff and Trubetskoy 1998 Nature Biotechnology 16:421) 및 이들의 조합을 포함한다.
포유류 세포에 의한 네이키드 핵산 구성체의 흡수는 몇몇 공지의 형질감염 기술, 예를 들면 형질감염제의 사용을 포함하는 기술에 의해 증강된다. 이 약제의 예는 양이온성 약제 (예를 들면 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙턴트 (예를 들면 리포펙탐TM및 트랜스펙탐TM)를 포함한다. 통상적으로, 핵산 구성체는 형질감염제와 혼합하여 조성물을 생성한다.
바이러스 벡터
별법으로, 본 발명의 약제 또는 표적 또는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 재조합 바이러스 벡터로 감염시키는 것과 같은 당해 기술분야에서 공지인 다양한 바이러스 기술을 사용하여 적합한 숙주 세포에 도입할 수 있다.
바람직하게는 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 적절한 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 (AVV) 벡터, 헤르페스-바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터 또는 파르보바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 (문헌 [Kestler et al 1999 Human Gene Ther 10(10):1619-32] 참조). 바이러스 벡터의 경우, 본 발명의 약제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전달은 표적 세포의 바이러스 감염에 의해 매개된다.
표적화된 벡터
"표적화된 벡터"라는 용어는 세포를 감염/형질감염/형질도입하는 능력 또는 숙주 및(또는) 표적 세포에서 발현되는 능력이 숙주 유기체 내의 특정 세포 유형, 보통 공통의 또는 유사한 표현형을 갖는 세포에 한정된 벡터를 말한다.
복제 벡터
본 발명의 약제 (NPYi 또는 NPY Y1i 또는 PDEi 또는 PDE5i) 또는 표적 (예를 들면, NPY 또는 NPY Y1)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 재조합 복제가능한 벡터 내로 혼입될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열을 복제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 복제가능한 벡터 내로 도입하고, 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입하고 숙주 세포를 벡터의 복제를 일으키는 조건 하에서 증식시킴으로써 본 발명의 표적을 만드는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수할 수 있다.
발현 벡터
바람직하게는, 벡터 내로 삽입되는 본 발명의 약제 또는 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 표적은 숙주 세포에 의해 본 발명의 NPY 또는 NPY Y1의 코딩 서열과 같은 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게연결되는데, 이 벡터가 발현 벡터이다. 숙주 재조합 세포에 의해 생산되는 본 발명의 약제 또는 표적은 사용된 서열 및(또는) 벡터에 따라 분비되거나 세포내에 함유될 수 있다. 당업자가 이해하듯이, 본 발명의 약제 또는 표적 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터는 특정 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 본 발명의 약제 또는 표적 코딩 서열의 분비를 지시하는 신호 서열과 함께 디자인될 수 있다.
시험관내 발현
본 발명의 벡터는 본 발명의 약제 또는 표적의 발현을 위해 제공되는 하기 적합한 숙주 세포 및(또는) 표적 세포로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 이 방법은 벡터에 의한 본 발명의 약제 또는 표적을 코딩하는 코딩 서열의 발현을 위한 조건 하에서 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및(또는) 표적 세포를 배양하고 임의로 발현된 본 발명의 약제 또는 표적을 회수하는 것을 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들면 복제 기점, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절자를 갖춘 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 1 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들면 세균 플라스미드의 경우 앰피실린 내성 유전자 또는 포유류 벡터의 경우 네오마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제 또는 본 발명의 표적의 발현은 이들이 연속적으로 생산되거나 발현을 개시하기 위한 자극을 필요로 하면서 유도가능하도록 구성될 수 있다. 유도가능한 발현의 경우, 본 발명의 약제 또는 표적의 생산은 예를 들면 유도제 물질, 예를 들면 덱사메타손 또는 IPTG를 배양 배지에 첨가함으로써 요구될 때 개시될 수 있다.
융합 단백질
NPY 또는 NPY Y1 또는 본 발명의 약제 (즉, NPYi 또는 NPY Y1i)는 추출 및 정제 및(또는) 본 발명의 약제 또는 NPY/NPY Y1 수용체 표적의 개체로의 전달을 돕기 위하여 및(또는) 약제에 대한 스크리닝의 개발을 용이하게 하기 위하여 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타치온-S-전이효소 (GST), 6xHis, GAL4 (DNA 결합 및(또는) 전사 활성화 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 융합 단백질 파트너 및 관심있는 단백질 서열 사이의 단백질분해 절단 부위를 포함하게 하여 융합 단백질 서열이 제거될 수 있도록 하는 것이 또한 편리할 수 있다. 바람직하게는 융합 단백질은 표적의 활성을 방해하지 않을 것이다.
융합 단백질은 본 발명의 물질에 융합된 항원 또는 항원 결정부위를 포함할 수 있다. 이 실시태양에서, 융합 단백질은 면역계의 일반적 자극을 제공하는 의미에서 애주번트 (adjuvant)로서 작용할 수 있는 물질을 포함하는 자연발생이 아닌 융합 단백질일 수 있다. 항원 또는 항원 결정부위는 물질의 아미노 또는 카르복시 말단에 부착될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 아미노산 서열은 상동성 서열에 접합되어 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들면, 물질 활성에 영향을 미칠 수 있는 약제에 대한 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 위해, 시판되는 항체에 의해 인식되는 상동성 에피토프를 발현하는 키메라 물질을 코딩하는 것이 유용할 수 있다.
숙주 세포
다양한 숙주 세포가 본 발명의 약제와 같은 약제 또는 본 발명의 NPY/NPY Y1수용체 표적을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 사용될 수 있다. 이 세포는 원핵 및 진핵 숙주 세포 모두일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 이. 콜라이와 같은 세균, 효모, 사상성 진균, 곤충 세포, 통상적으로 불멸화된 포유류 세포, 예를 들면 마우스, CHO, 인간 및 원숭이 세포주 및 이들의 유도체를 포함한다.
본 발명의 범위 내의 적합한 발현 숙주의 예는 진균류, 예를 들면 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종 (예를 들면 EP-A-0184438 및 EP-A-0284603에 기재된 것) 및 트리코더마 (Trichoderma) 종; 세균, 예를 들면 바실러스 (Bacillus) 종 (예를 들면 EP-A-0134048 및 EP-A-0253455에 기재된 것), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 종; 및 효모, 예를 들면 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종 (EP-A-0096430 및 EP-A-0301670에 기재된 것) 및 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종이다. 예를 들면 통상적인 발현 숙주는 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니거 바르. 투비제니스 (Aspergillus niger var. tubigenis), 아스퍼질러스 니거 바르. 아와모리 (Aspergillus niger var awamori), 아스퍼질러스 아쿨레아티스 (Aspergillus aculeatis), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 오르브재 (Aspergillus orvzae), 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택될 수 있다.
적합한 숙주 세포, 예를 들면 효모, 진균류 및 식물 숙주 세포의 사용은 최적의 생물학적 활성을 본 발명의 재조합 발현 생성물에 부여하기 위하여 요구될 수 있는 번역후 변형 (예를 들면 미리스토일화, 글리코실화, 절단, 라피데이션 (lapidation) 및 타이로신, 세린 또는 트레오닌 인산화)에 제공될 수 있다.
바람직한 숙주 세포는 발현 생성물을 가공하여 적절한 성숙 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 가공의 예는 글리코실화, 유비퀴틴화, 디설파이드 결합 형성 및 일반적 번역후 변형을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
항체
본 발명의 한 실시태양에서, 약제는 항체일 수 있다. 또한, 또는 별법으로, 표적이 항체일 수 있다.
항체는 표준 기술에 의해, 예를 들면 본 발명의 물질로의 면역법에 의해 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, "항체"라는 용어는 달리 명시되지 않는 한, 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 및 이의 모방제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 단편은 표적 물질에 대한 결합 활성을 보유하는 전체 항체의 단편, Fv, F(ab') 및 F(ab')2단편, 및 단일 사슬 항체 (scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 다른 합성 단백질을 포함한다. 또한, 항체 및 이의 단편은 인간화 항체일 수 있다. 중화 항체, 즉 물질 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 항체는진단제 및 치료제로 특히 바람직하다.
폴리클로날 항체를 원하는 경우, 선택된 포유류 (예를 들면, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)를 본 발명의 확인된 약제 및(또는) 물질로부터 얻을 수 있는 에피토프를 갖는 면역원성 폴리펩티드로 면역화한다. 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위하여 다양한 애주번트를 사용할 수 있다. 이러한 애주번트는 수산화 알루미늄과 같은 프로인트 (Freund's) 미네랄 겔, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온 (polyanion), 오일 에멀젼, 키홀 림페트 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 및 디니트로페놀과 같은 표면 활성 물질을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)은 정제된 물질 폴리펩티드가 면역학적으로 손상된 개인에게 전신 방어를 자극할 목적으로 투여된다면 사용될 수 있는 잠재적으로 유용한 인간 애주번트이다.
면역화된 동물의 혈청을 수거하고 공지의 방법에 따라 처리한다. 본 발명의 확인된 약제 및(또는) 물질로부터 얻을 수 있는 에피토프에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유한다면, 폴리클로날 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클로날 항혈청을 생산하고 처리하는 기술은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 이러한 항체를 제조할 수 있기 위해서, 본 발명은 동물 또는 사람에 면역원으로서 사용하기 위한 다른 폴리펩티드에 합텐화된 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제공한다.
본 발명의 확인된 약제 및(또는) 물질로부터 얻을 수 있는 에피토프에 대한모노클로날 항체는 당업자에 의해 용이하게 생산될 수 있다. 히브리도마에 의해 모노클로날 항체를 만드는 일반적 방법론은 공지이다. 불멸의 항체-생산 세포주는 세포 융합에 의해, 또한 다른 기술, 예를 들면 암유발 DNA를 사용한 B 림프구의 직접 전환, 또는 엡스테인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스를 사용한 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 오르비트 (orbit) 에피토프에 대해 생산된 모노클로날 항체의 패널은 다양한 성질에 대하여, 즉 이소타입 및 에피토프 친화성에 대해 스크리닝될 수 있다.
물질 및(또는) 확인된 약제에 대한 모노클로날 항체는 배양에서 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 가능하게 하는 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이는 문헌 [Koehler and Milstein, 1975 Nature 256:495-497]에 최초로 기재된 히브리도마 기술, 인간 B-세포 히브리도마 기술 (Kosboret al(1983) Immunol Today 4:72; Coteet al(1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-히브리도마 기술 (Coleet al(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, "키메라 항체"의 생산을 위하여 개발된 기술, 즉, 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 얻기 위하여 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 절단 접합 (splicing)하는 기술을 사용할 수 있다 (Morrisonet al(1984) Proc Nati Acad Sci 81:6851-6855; Neubergeret al(1984) Nature 312:604-608; Takedaet al(1985) Nature 314:452-454). 별법으로, 단일 사슬 항체의 생산에 대해 기재한 기술 (미국 특허 제4,946,779호)을 물질 특이적 단일 사슬 항체를 생산하기 위하여적용할 수 있다.
확인된 약제 및(또는) 물질로부터 얻을 수 있는 에피토프에 대한 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 모두, 특히 진단에 유용하고, 중화하는 것은 수동 면역요법에 유용하다. 모노클로날 항체는, 특히 항-개별특이형 (anti-idiotype) 항체를 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 항-개별특이형 항체는 보호가 필요한 물질 및(또는) 약제의 "내부 이미지 (internal image)"를 운반하는 면역글로불린이다. 항-개별특이형 항체를 상승시키는 기술은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 이 항-개별특이형 항체는 요법에 유용할 수도 있다.
항체는 또한 림프구 집단에서의 생체내 생산을 유도함으로써, 또는 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 문헌 [Orlandi et al 1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837] 및 문헌 [Winter G and Milstein C 1991, Nature 3499:293-299)]에 개시된 바와 같이 매우 특이적인 결합 시약의 패널을 스크리닝 함으로써 생산할 수 있다.
물질에 대해 특이적 결합 부위를 갖는 항체 단편도 생산할 수 있다. 예를 들면, 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2단편 및 F(ab')2단편의 디설피드 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 별법으로, Fab 발현 라이브러리를 구축하여 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 빠르고 쉽게 동정할 수 있다 (Huse WDet al(1989) Science 256:1275-1281).
리포터
본 발명의 분석 방법 (및 스크리닝)에 다양한 리포터를 사용할 수 있고, 바람직한 리포터는 편리하게 감지할 수 있는 신호 (예를 들면 분광법에 의하여)를 제공한다. 예로써, 리포터 유전자는 광 흡수 성질을 변경시키는 반응을 촉매하는 효소를 코딩할 수 있다.
리포터 분자의 예는 β-갈락토시다제, 인버타제, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein), 루시퍼라제, 클로람페니콜, 아세틸트랜스퍼라제, β-글루쿠로니다제, 엑소-글루카나제 및 글루코아밀라제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 별법으로, 방사성표지 또는 형광 태그-표지된 뉴클레오티드를 초기의 전사체에 혼입시킬 수 있고, 이는 올리고뉴클레오티드 탐침에 결합할 때 확인된다.
한 실시태양에서, 리포터 분자의 생산은 β-갈락토시다제와 같은 리포터 유전자 산물의 효소 활성에 의해 측정된다.
예를 들면 단백질에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용함으로써, 표적의 발현을 감지하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜은 공지되어 있다. 그 예는 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사성면역측정법 (RIA) 및 형광 활성화 세포 분류법 (Fluorescent activated cell sorting)(FACS)을 포함한다. 폴리펩티드 상의 두 개의 비-간섭 (non-interfering) 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 사용하는 2-부위, 모노클로날-기반 면역분석법이 바람직하지만 경쟁적 결합 분석법을 사용할 수도 있다. 이 분석법 및 다른 분석법은 다른 문헌 중에서도 문헌 [Hampton Ret al, 1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APSPress, St Paul MN] 및 [Maddox DEet al, 1983, J Exp Med 15 8:121 1]에 기재되어 있다.
다양한 표지 및 접합 기술은 당업자에게 공지이고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 감지하기 위한 표지된 혼성화 또는 PCR 탐침을 생산하기 위한 수단은 올리고라벨링, 닉 (nick) 번역, 엔드(end)-라벨링 또는 표지된 뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭을 포함한다. 별법으로, 코딩 서열, 또는 그의 임의의 부분은 mRNA 탐침의 생산을 위하여 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 벡터는 당해 기술분야에 공지이고, 시판되며, 적절한 RNA 중합효소, 예를 들면 T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오티드를 첨가함으로써 시험관내에서 RNA 탐침을 합성하기 위하여 사용될 수 있다.
파미시아 바이오텍 (Piscataway, NJ), 프로메가 (Promega)(Madison, WI) 및 US 바이오케미칼 주식회사 (Cleveland, OH)와 같은 다수의 회사가 상업용 키트 및 이 과정에 대한 프로토콜을 공급한다. 적합한 리포터 분자 또는 표지는 방사성핵종, 효소, 형광, 화학발광, 또는 발색제 및 기질, 공동인자, 억제제, 자분 (magnetic particle) 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허는 US-A-3717837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 및 US-A-4366241을 포함한다. 또한, 재조합 면역글로불린은 US-A-4816567에서 보는 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 분자의 발현을 정량하는 추가적 방법은 뉴클레오티드의 방사성표지 (Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159:235-44) 또는 바이오티닐레이팅(biotinylating) (Duplaa C et al 1993 Anal Biochem 229-367), 대조 핵산의 공동증폭, 및 실험 결과가 외삽되는 표준 곡선을 포함한다. 다수의 표본의 정량은 관심있는 올리고머가 다양한 희석액으로 제공되고 분광광도적 또는 열측정적 반응에 의해 신속한 정량을 할 수 있는 ELISA 형식으로 분석을 수행함으로써 속도를 증가시킬 수 있다.
마커 유전자 발현의 존재/부재에 의해 관심있는 유전자가 역시 존재한다는 것을 알 수 있지만, 그의 존재 및 발현은 확인되어야 한다. 예를 들면, 핵산 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입되면, 이를 함유하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 별법으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에 표적 코딩 서열과 직렬로 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 보통 표적의 발현도 역시 나타낸다.
별법으로, 표적에 대한 코딩 서열을 함유하고 표적 코딩 영역을 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 공지인 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다. 이 방법은 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 및 핵산 또는 단백질의 검출 및(또는) 정량을 위한 멤브레인-기반, 용액-기반, 칩 (chip)-기반 기술을 포함하는 단백질 생물분석 또는 면역분석 기술을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
스크리닝
다양한 약물 스크리닝 기술에서 1 이상의 적절한 표적, 예를 들면 아미노산 서열 및(또는) 뉴클레오티드 서열을 약제, 예를 들면 NPYi 또는 NPY Y1i를 확인하기 위하여 사용할 수 있다. 이러한 시험에 사용된 표적은 용액 중에 자유롭게 있거나, 고체 지지체에 부착되거나, 세포 표면에 제공되거나 세포 내에 존재할 수 있다. 표적은 동물 모델 내에 있을 수도 있고, 여기서 상기 표적은 외인성 표적 또는 도입된 표적일 수 있다. 동물 모델은 비-인간 동물 모델일 것이다. 표적 활성의 제거 또는 표적 및 시험 약제 사이에 결합 복합체의 형성을 측정할 수 있다.
약물 스크리닝을 위한 기술은 1984년 9월 13일에 공개된 게이센 (Geysen)의 유럽 특허 출원 84/03564에 기재된 방법에 기초할 수 있다. 요약하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 다른 표면과 같은 고체 기질 상에서 합성한다. 펩티드 시험 화합물을 적절한 표적 또는 그의 단편과 반응시키고 세척한다. 그 후 당해 기술 분야에 공지인 적절히 개조된 방법으로 결합된 물질을 검출한다. 정제된 표적은 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위하여 플레이트 상에 직접 코팅할 수도 있다.
별법으로, 비-중화 항체를 펩티드를 포착하고 고체 지지체 상에 고정시키기 위하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 표적에 결합할 수 있는 중화 항체가 표적에의 결합에 대해 시험 물질과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 용도를 제시한다.
스크리닝을 위한 다른 기술은 물질에 대해 적절한 결합 친화성을 갖는 약제의 대량 처리 스크리닝 (HTS)을 위해 제공되고, 이는 WO 84/03564에 자세히 기재된 방법에 근거한다.
본 발명의 분석 방법은 시험 화합물의 소규모 및 대규모 스크리닝 모두 및 정량적 분석에 적합할 것으로 기대된다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 스크리닝은 적어도 하기 단계를 포함한다 (이 단계는 이와 동일한 연속적 순서일 필요는 없다): (a) 후보 약제가 관련 활성 (예를 들면 NPY, 특히 NPY Y1, 예를 들면 개 신장의 NPY 또는 NPY Y1의 조절)을 갖는지 결정하기 위하여 시험관내 스크리닝을 수행하는 단계; (b) 상기 후보 약제의 선택성을 결정하기 위하여 (예를 들면 본원에 기재된 분석 프로토콜을 사용함으로써 상기 약제가 ACE 억제제이기도 한지 알아보기 위하여 및(또는) 상기 약제가 NPY Y2 및(또는) NPY Y5에 대한 활성이 있는지 알아보기 위하여) 1 이상의 선택성 스크리닝을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 후보 약제를 사용하여 생체내 스크리닝을 수행하는 단계 (예를 들면 기능적 동물 모델을 사용하여, 약제가 동맥 혈압에 미치는 효과를 결정함으로써 약제의 선택성을 결정하는 단계를 포함). 통상적으로, 상기 후보 약제가 스크리닝 (a) 및 스크리닝 (b)를 통과하면 스크리닝 (c)를 수행한다.
진단제
본 발명은 또한 MED에 대한 소인의 검출을 위한 진단 조성물 또는 키트를 제공한다. 이 측면에서, 조성물 또는 키트는 시험 표본에 1 이상의 표적의 존재 (또는 부재)를 나타낼 수 있는 물질을 포함할 것이다. 바람직하게는, 시험 표본은 음경으로부터 얻는다.
예로써, 진단 조성물은 본원에 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변이체, 상동체, 단편, 유도체 중 임의의 것, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 중 임의의 것의 전부 또는 일부에 혼성화할 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
질병의 진단에 대한 기초를 제공하기 위하여, 표적으로부터의 정상 또는 표준 값이 확립되어야 한다. 이는 동물 또는 사람의 정상 대상으로부터 취한 체액 또는 세포 추출물을 당해 기술분야에서 공지인 복합체 형성에 적합한 환경 하에서 표적에 대한 항체와 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 표준 복합체 형성의 양은 양성 대조군의 희석 계열과 비교함으로써 정량할 수 있고, 여기서 공지의 양의 항체는 공지의 농도의 정제된 표적과 결합된다. 그 후, 정상 표본으로부터 얻어진 표준 값을 MED에 의해 영향 받을 수 있는 대상으로부터의 표본에서 얻어진 값과 비교할 수 있다. 표준 및 대상 값 사이의 편차가 질병 상태의 존재를 입증한다.
표적 자체 또는 그의 임의의 부분이 진단적 및(또는) 치료적 화합물에 대한 기초를 제공할 수 있다. 진단 목적을 위하여, 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 MED가 관련될 수 있는 질환, 장애 또는 질병에서 유전자 발현을 검출 및 정량하기 위하여 사용될 수 있다.
표적을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표적을 발현함으로써 MED의 진단에 사용될 수 있다. 예를 들면, 표적을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 생검 또는 부검으로부터의 조직 또는 체액의 혼성화 또는 PCR 분석에 사용되어 표적 발현에서의 비정상성을 감지할 수 있다. 이러한 정성적 또는 정량적 방법의 형태는 서던 또는 노던 분석, 도트 블롯 또는 다른 멤브레인-기반 기술; PCR 기술; 딥 스틱, 핀 또는 칩 기술; 및 ELISA 또는 다른 다수 표본 형식의 기술을 포함할 수 있다. 이 기술 모두는 당해 기술분야에서 공지이고 실제로 많은 시판 진단 키트의 기본이 된다.
이러한 분석은 특정 치료 요법 처방의 효능을 평가하기 위해 맞추어질 수 있고 동물 연구, 임상 시험, 또는 각 환자의 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 질병의 진단에 대한 기초를 제공하기 위하여, 표적 발현에 대한 정상 또는 표준 프로파일이 확립되어야 한다. 이는 동물 또는 사람의 정상 대상으로부터 취한 체액 또는 세포 추출물을 혼성화 또는 증폭에 적합한 환경 하에서 표적 또는 그의 일부와 결합시킴으로써 달성된다. 표준 혼성화는 정상 대상에서 얻어진 값을 공지의 양의 정제된 표적이 사용된 같은 실험에서 수행된 양성 대조군의 희석 계열과 비교함으로써 정량될 수 있다. 정상 표본으로부터 얻어진 표준 값은 표적 코딩 서열의 발현과 관계된 장애 또는 질병에 의해 영향을 받을 수 있는 대상으로부터의 표본에서 얻어진 값과 비교할 수 있다. 표준 및 대상 값 사이의 편차는 질병 상태의 존재를 입증한다. 질병이 입증되면, 기존의 치료제를 투여하고, 치료 프로파일 또는 값이 생성될 수 있다. 마지막으로, 정규적으로 분석을 반복하여 값이 정상 또는 표준 양식으로 진전되거나 회복되었는지를 평가할 수 있다. 연속 치료 프로파일은 수일 또는 수개월에 걸친 치료의 효능을 보이기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 예를 들면 MED에서 표적 수준을 검출하고 정량하기 위하여 진단적으로 사용될 수 있는 항-표적 항체를 생산하기 위한 표적 폴리펩티드, 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 양성 대조군으로 사용할 수 있는 정제된 표적, 및 항-표적 항체를 포함하는, 세포 및 조직에서의 표적의 검출을 위한 진단 분석법 및 키트를 제공한다. 이러한 항체는 표적 단백질의 발현 또는 결실 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체의 발현에 관계된 질병 상태 또는 질환을 검출하기 위한용액-기반, 멤브레인-기반, 또는 조직-기반 기술에 사용될 수 있다.
진단 키트
본 발명은 또한 (i) 생물학적 액 및 조직에서 NPY 및 NPY Y1 활성의 검출 및 측정; 및(또는) (ii) 발기 조직에서 NPY 및 NPY Y1 활성의 위치 측정; 및(또는) (iii) 남성 성기능 장애, 예를 들면 MED의 소인 검출을 위한 진단 조성물 또는 진단 방법 또는 키트를 포함한다. 이 측면에서, 조성물 또는 키트는 시험 시료 중 1 이상의 표적, 예를 들면 NPY 또는 NPY Y1 활성의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있는 물질을 포함할 것이다. 바람직하게는, 시험 시료는 남성 성기 또는 그의 또는 그로부터의 분비물에서 얻는다.
예를 들면, 진단 조성물은 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 중 하나의 전부 또는 일부에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다.
진단 시험
질병의 진단에 대한 기준을 제공하기 위하여, 표적으로부터의 정상 또는 표준 값을 확립해야 한다. 이는 동물 또는 인간의 정상 대상으로부터의 체액 또는 세포 추출물을 예를 들면 해당 기술분야에서 공지인 복합체 형성에 적합한 조건 하에서 표적에 대한 항체와 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 표준 복합체 형성의 양은 공지의 양의 항체가 공지의 농도의 정제된 표적과 결합되는 양성 대조군의 희석 계열과 이를 비교함으로써 정량할 수 있다. 그 후, 정상 시료로부터 얻은 표준값을 남성 성기능 장애 (예를 들면 MED)가 있을 가능성이 있는 대상으로부터의 시료에서 얻은 값과 비교할 수 있다. 표준 및 대상 값 사이의 편차가 질병 상태의 존재를 입증한다.
표적 자체 또는 그의 일부분은 진단 및(또는) 예방 및(또는) 치료적 화합물에 대한 기준을 제공할 수 있다. 진단 목적을 위해서, 남성 성기능 장애, 특히 MED가 관계될 수 있는 질환, 장애 또는 질병에서 유전자 발현을 검출 및 정량하기 위하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다.
표적을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표적을 발현함으로써 SD의 진단에 사용될 수 있다. 예를 들면, 표적을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 생검 또는 부검으로부터의 조직 또는 체액의 혼성화 또는 PCR 분석에 사용되어 표적 발현에서의 비정상성을 감지할 수 있다. 이러한 정성적 또는 정량적 방법의 형태는 서던 또는 노던 분석, 도트 블롯 또는 다른 멤브레인-기반 기술; PCR 기술; 딥 스틱, 핀 또는 칩 기술; 및 ELISA 또는 다른 다수 시료 형식의 기술을 포함할 수 있다. 이 기술 모두는 당해 기술분야에서 공지이고 실제로 많은 시판 진단 키트의 기본이 된다.
이러한 분석은 특정 치료 요법 처방의 효능을 평가하기 위해 맞추어질 수 있고 동물 연구, 임상 시험, 또는 개체의 치료를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 질병의 진단에 대한 기초를 제공하기 위하여, 표적 발현에 대한 정상 또는 표준 프로파일이 확립되어야 한다. 이는 동물 또는 사람의 정상 대상으로부터 취한 체액 또는 세포 추출물을 혼성화 또는 증폭에 적합한 환경 하에서 표적 또는 그의 일부와 결합시킴으로써 달성된다. 표준 혼성화는 정상 대상에서 얻어진 값을 공지의양의 정제된 표적이 사용된 같은 실험에서 수행된 양성 대조군의 희석 계열과 비교함으로써 정량될 수 있다. 정상 표본으로부터 얻어진 표준 값은 표적 코딩 서열의 발현과 관계된 장애 또는 질병에 의해 영향을 받을 수 있는 대상으로부터의 표본에서 얻어진 값과 비교할 수 있다. 표준 및 대상 값 사이의 편차는 질병 상태의 존재를 입증한다. 질병이 입증되면, 기존의 치료제를 투여하고, 치료 프로파일 또는 값이 생성될 수 있다. 마지막으로, 정규적으로 분석을 반복하여 값이 정상 또는 표준 양식으로 진전되거나 회복되었는지를 평가할 수 있다. 연속 치료 프로파일은 수일 또는 수개월에 걸친 치료의 효능을 보이기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 예를 들면 남성 성기능 장애 상태에서 표적 수준을 검출하고 정량하기 위하여 진단적으로 사용될 수 있는 항-표적 항체를 생산하기 위한 표적 폴리펩티드, 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 양성 대조군으로 사용할 수 있는 정제된 표적, 및 항-표적 항체를 포함하는, 세포 및 조직에서의 표적의 검출을 위한 진단 분석법 및 키트를 제공한다. 이러한 항체는 표적 단백질의 발현 또는 결실의 발현 또는 그의 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체에 관계된 질병 상태 또는 질환을 검출하기 위한 용액-기반, 멤브레인-기반, 또는 조직-기반 기술에 사용될 수 있다.
이러한 물질을 포함하는 진단 조성물 및(또는) 키트는 빠르고, 믿을 수 있고, 민감하고 특이적인 측정 및 발기 조직 추출물에서 NPY 또는 NPY Y1 활성의 위치 측정을 위하여 사용될 수 있다. 어떤 상황에서 키트는 MED와 같은 남성 성기능장애의 존재를 나타낼 수 있다.
분석 방법
진단 조성물 및(또는) 방법 및(또는) 키트는 경쟁적 및 비경쟁적 분석, 방사성면역분석, 생물발광 및 화학발광 분석, 형광 분석, 샌드위치 분석, 면역방사계측 분석, 도트 블롯, 뇨 또는 혈액의 신속한 모니터링을 위한 ELISA, 마이크로타이터 플레이트, 항체 코팅된 스트립 또는 딥스틱을 포함하는 효소결합 분석, 면역조직화학법 및 면역세포화학법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 기술에 사용될 수 있다.
예로써, 면역조직화학 키트는 생식기 조직에서 NPY 또는 NPY Y1 활성의 위치측정을 위하여 사용될 수 있다. 이 면역조직화학 키트는 연구 및 임상 목적 모두에 사용될 수 있는 광학 및 전자 현미경 모두를 사용하여 조직 부분 및 배양된 세포에서 NPY 또는 NPY Y1의 위치측정을 할 수 있게 한다. 이러한 정보는 MED의 검출 및(또는) 예방 및(또는) 치료에 진단적 및 가능하게는 치료적 목적에 유용할 수 있다. 각 키트에 대하여, 분석의 영역, 감도, 정확성, 신뢰성, 특이성 및 재현성이 확립되어 있다. 분석내 (intraassay) 및 분석간 (interassay) 편차는 치환 또는 활성의 표준 곡선 상의 20%, 50% 및 80% 지점에서 확립되어 있다.
탐침
본 발명의 다른 측면은 NPY 또는 NPY Y1 수용체와 같은 표적 코딩 영역 또는 대립 유전자와 같이 밀접하게 관련된 분자를 코딩하는, 게놈 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있는 (특히 선택적으로 선택할 수 있는) 핵산 혼성화 또는 PCR 탐침의 제공이다. 탐침의 특이성, 즉 고도의 보존적, 보존적 또는 비보존적 영역 또는 도메인으로부터 유래하는지 여부, 및 혼성화 또는 증폭의 가혹도 (높은, 중간 또는 낮은)는 탐침이 자연 발생 표적 코딩 서열 또는 관련 서열을 확인하는지를 결정할 것이다. 관련 핵산 서열의 검출을 위한 탐침은 표적 패밀리 구성원의 보존적 또는 고도의 보존적 뉴클레오티드 영역으로부터 선택되고, 이러한 탐침은 퇴화 탐침의 풀에 사용될 수 있다. 동일한 핵산 서열의 검출을 위하여, 또는 최대의 특이성이 요구되는 경우, 핵산 탐침은 표적 폴리뉴클레오티드의 비보존적 뉴클레오티드 영역 또는 고유의 영역으로부터 선택된다. 본원에 사용되는 용어 "비보존적 뉴클레오티드 영역"은 본원에 개시된 표적 코딩 서열에 고유한 뉴클레오티드 영역을 말하고 관련 패밀리 구성원에서 발견되지 않는다.
US-A-4683195, US-A-4800195 및 US-A-4965188에 기재된 PCR은 표적 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드에 대한 추가적 용도를 제공한다. 이러한 올리고머는 일반적으로 화학적으로 합성되지만, 효소적으로 생성될 수 있거나 재조합 공급원으로부터 생산될 수 있다. 올리고머는 일반적으로 2 개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 하나는 센스 방향 (5' →3')이고, 하나는 안티센스 (3' →5')이며, 특정 유전자 또는 상태의 확인을 위한 최적화된 조건 하에서 사용된다. 동일한 두개의 올리고머, 중첩된 세트의 올리고머, 또는 올리고머의 퇴화 풀은 밀접하게 관련된 DNA 또는 RNA 서열의 검출 및(또는) 정량을 위하여 덜 가혹한 조건 하에서 사용될 수 있다.
약제 또는 표적에 대한 핵산 서열은 또한 전술한 바와 같이, 내인성 게놈 서열을 맵핑 (mapping) 하기 위한 혼성화 탐침을 생성시키기 위하여 사용될 수 있다.서열은 공지의 기술을 사용하여 특정 염색체에 또는 염색체의 특정 영역에 맵핑될 수 있다. 이는 염색체 스프레드 (spread) (Verma et al (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), 플로우-소르티드 (flow-sorted) 염색체 제조물, 또는 YACs, 세균 인공 염색체 (BACs), 세균 PI 구성체와 같은 인공 염색체 구성체 또는 단일 염색체 cDNA 라이브러리에 대한 인시투 혼성화를 포함한다.
염색체 제조물의 인시투 혼성화 및 확립된 염색체 표지를 사용한 연관 분석과 같은 물리 맵핑 기술은 유전자 지도를 확장하는데 매우 중요하다. 유전자 지도의 예는 문헌 [Science 1995; 270:410f 및 1994; 265:1981f]에서 찾아볼 수 있다. 다른 포유류 종의 염색체 상의 유전자의 위치는 특정 인간 유전자의 수 또는 완 (arm)이 알려지지 않았더라도 관련 표지를 밝힐 수 있는 경우가 많다. 새로운 서열은 물리 맵핑에 의해 염색체 완 또는 그의 일부에 배정될 수 있다. 이는 연구자에게 위치 클로닝 (positional cloning) 또는 다른 유전자 발견 기술을 사용하여 질병 유전자를 찾는데 중요한 정보를 제공한다. 질병 또는 증후군이 특정 게놈 영역에의 유전적 연관에 의해 대충 위치지정되면, 그 지역에 매핑되는 모든 서열은 추가적 연구를 위한 관련 또는 조절 유전자를 나타낼 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 정상인, 보유자 또는 병에 걸린 개인 사이에 전좌, 역위 등으로 인한 염색체 위치 내의 차이를 검출하기 위하여 사용될 수도 있다.
유기체
본 발명과 관련하여 "유기체"라는 용어는 표적 및(또는) 그로부터 얻어진 생성물을 포함할 수 있는 임의의 유기체를 포함한다. 유기체의 예는 포유류, 진균류, 효모 또는 식물을 포함할 수 있다.
본 발명과 관련하여 "트랜스제닉 유기체"라는 용어는 표적 및(또는) 그로부터 얻어진 생성물 포함하는 임의의 유기체를 포함한다.
숙주 세포/숙주 유기체의 형질전환
앞에서 언급했듯이, 숙주 유기체는 원핵 또는 진핵생물 유기체일 수 있다. 적합한 원핵생물 숙주의 예는 이. 콜라이 (E. coli) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 포함한다. 원핵생물 숙주의 형질전환에 대한 교시는 선행기술, 예를 들면 문헌 [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.]에 잘 기재되어 있다.
원핵생물 숙주가 사용된다면 뉴클레오티드 서열은 형질전환 전에 적합하게 변형 (예를 들면 인트론의 제거에 의해)될 필요가 있을 것이다.
다른 실시태양에서 트랜스제닉 유기체는 효모일 수 있다. 이와 관련하여, 효모는 이종 유전자 발현에 대한 운반체로서 널리 사용되었다. 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 종은 이종 유전자 발현을 위한 용도를 포함하여 오랜 역사의 산업적 용도를 갖는다. 사카로마이세스 세레비지애에서의 이종 유전자의 발현은 문헌 [Goodey et al, 1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al, eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London] 및 [King et al, 1989, Molecularand Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow]에서 검토되었다.
몇몇 이유로, 사카로마이세스 세레비시애는 이종 유전자 발현에 잘 맞는다. 첫째로, 이는 사람에게 비-병원성이고, 특정 엔도톡신을 생산하지 못한다. 둘째로, 수 세기 동안의 다양한 목적을 위한 상업적 개발에 이어 오랜 기간 동안 안전하게 사용되었다. 이에 의해 널리 일반적으로 수용되었다. 세째로, 광범위한 상업적 사용 및 이 유기체에 쏟아진 연구의 결과 사카로마이세스 세레비지애의 유전학 및 생리학 뿐만 아니라 대량 발효 특성에 관한 많은 지식이 축적되었다.
사카로마이세스 세레비지애에서의 이종 유전자 발현의 원리 및 유전 산물의 분비는 문헌 [E Hinchcliffe E Kenny, 1993 "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.]에 검토되어 있다.
자신의 유지를 위해서 숙주 게놈과의 재조합을 필요로 하는 통합 (integrative) 벡터 및 자가 복제하는 플라스미드 벡터를 포함하는 몇몇 유형의 효모 벡터를 사용할 수 있다.
트랜스제닉 사카로마이세스를 제조하기 위하여, 발현 구성체는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 효모에서의 발현을 위하여 디자인된 구성체 내로 삽입함으로써 제조된다. 이종 발현을 위하여 사용되는 몇몇 유형의 구성체가 개발되었다. 구성체는 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 융합된 효모에서 활성 있는 프로모터를 함유하고, 프로모터는 보통 GAL1 프로모터와 같은 효모 기원의 프로모터가 사용된다.보통 SUC2 신호 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 효모 기원의 신호 서열이 사용된다. 효모에서 활성이 있는 종결자는 발현 시스템을 종결시킨다.
효모의 형질전환을 위해서, 몇몇 형질전환 프로토콜이 개발되었다. 예를 들면, 본 발명에 따른 트랜스제닉 사카로마이세스는 문헌 [Hinnen et al, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929], [Beggs, J D, 1978, Nature, London, 275, 104] 및 [Ito, H et al, 1983, J Bacteriology 153, 163-168]의 교시에 따라 제조될 수 있다.
형질전환된 효모 세포는 다양한 선택성 표지를 사용하여 선택될 수 있다. 표지 중 형질전환을 위하여 사용되는 것은 수 개의 영양요구성 표지, 예를 들면 LEU2, HIS4 및 TRP1, 및 주요한 항생제 내성 표지, 예를 들면 아미노글리코시드 항생제 표지, 예를 들면 G418이 사용된다.
다른 숙주 유기체는 식물이다. 유전적으로 변형된 식물 제조의 기본 원리는 식물 게놈에 유전 정보를 삽입하여 삽입된 유전 물질의 안정한 유지를 획득하는 것이다. 몇몇 기술이 유전 정보를 삽입하기 위하여 존재하고, 두가지 주요 원리는 유전 정보의 직접 도입 및 벡터 시스템을 사용한 유전 정보의 도입이다. 일반적 기술은 문헌 [Potrykus, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1991) 42:205-225] 및 [Christou, Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27]에서 찾아볼 수 있다. 식물 형질전환에 관한 추가적 교시는 EP-A-0449375에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 표적이 되거나 표적을 발현하는 뉴클레오티드 서열로 숙주 세포를 형질전환시키는 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 발현 및 세포 배양물로부터 코딩된 단백질의 회수에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 사용된 서열 및(또는) 벡터에 따라 분비되거나 세포 내에 함유될 수 있다. 당업자에게 이해되듯이, 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터는 특정 원핵 또는 진핵 세포막을 통한 코딩 서열의 분비를 지시하는 신호 서열을 사용하여 디자인될 수 있다. 다른 재조합 구성체는 코딩 서열을 가용성 단백질의 정제를 용이하게 할 폴리펩티드 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 결합시킬 수 있다 (Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol 12:441-53).
ACE 분석
ACE에 대한 효력 값 또는 ACE에 비한 NPY 또는 NPY Y1 억제제에 대한 선택성 값은 다음 분석법에 의하여 측정된다.
돼지 및 사람 신장 피질로부터 가용성 안지오텐신 전환 효소 (ACE)의 제조 및 분석
가용성 ACE 활성을 신장 피질로부터 얻고 ACE 기질 Abz-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH가 절단되어 그의 형광 생성물, Abz-Gly을 생성하는 속도를 측정함으로써 분석한다.
1. 재료
모든 물은 이중으로 탈이온화한다.
1.1 인간 신장 IIAM (Pennsylvania. U.S.A.) 또는 UK 인간 조직 은행 (UKHTB)
1.2 돼지 신장 ACE Sigma (A2580)
1.3 균질화 완충액-1
100mM 만니톨 및 20mM 트리스 @ pH 7.1
2.42g 트리스 (Fisher T/P630/60)를 1 리터의 물에 희석하고 6M HCl을 사용하여 실온에서 pH를 7.1로 조정한다. 여기에 18.22g의 만니톨 (Sigma M-9546)을 첨가한다.
1.4 균질화 완충액-2
100mM 만니톨, 20mM 트리스 @ pH 7.1 및 10mM MgCl2.6H2O (Fisher MO600/53)
500ml의 균질화 완충액 1 (1.4)에 1.017g의 MgCl2를 첨가한다.
1.5 트리스 완충액 (ACE 완충액)
50mM 트리스 및 300mM NaCl @ pH 7.4
50ml의 50mM 트리스 pH 7.4 (Sigma T2633) 및 17.52g NaCl (Fisher S/3160/60)을 물 중의 1000ml로 만든다.
1.6 기질 (Abz-D-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH) (Bachem M-1100)
ACE 기질을 분말로서 -20℃에서 저장한다. 기질을 ACE 완충액에 부드럽게 재현탁함으로써 2mM 스톡을 제조하고, 이를 보르텍스 또는 초음파처리하지 않아야 한다. 2mM 스톡의 400㎕ 분취량을 1 개월 이하 동안 -20℃에서 저장한다.
1.7 전체 생성물
기질의 생성물로의 100% 전환에 상응하는 표본을 플레이트에 포함시켜서 % 기질 전환을 측정할 수 있도록 한다 (계산 참조). 20㎕의 효소 스톡과 함께 2mM 기질 1ml를 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 전체 생성물을 생성시킨다.
1.8 중단 용액
0.5mM EDTA (Promega CAS [6081/92/6])를 ACE 완충액 중에서 1:250으로 희석하여 2mM 용액을 만든다.
1.9 디메틸 설폭시드 (DMSO).
1.10 염화 마그네슘 MgCl2.6H20 (Fisher M0600/53).
1.11 블랙 96 웰 평면 바닥 분석 플레이트 (Costar 3915 또는 Packard).
1.12 톱실 (Topseal) A (Packard 6005185).
1.13 원심분리 튜브.
2. 특정 장치
2.1 소르발 (Sorvall) RC-5B 원심분리기 (SS34 GSA 로터, 4℃로 미리 냉각시킴).
2.2 브라운 미니프라이머 (Braun miniprimer) 믹서.
2.3 베크만 (Beckman) CS-6R 원심분리기.
2.4 BMG 플루오스타 갤럭시 (Fluostar Galaxy).
2.5 웨스바르트 (Wesbart) 1589 진탕 인큐베이터.
3. 방법
3.1 조직 준비
3.2 문헌 [Booth,A.G. & Kenny,A.J. (1974) Biochem.J. 142, 575-581]으로부터 개조된 방법을 사용하여 신장 피질로부터 인간 ACE를 얻는다.
3.3 냉동 신장을 실온에서 해동시키고 피질을 수질로부터 잘라낸다.
3.4 피질을 잘게 썰고 브라운 미니프라이머 (2.2)를 사용하여 약 10 부피의 균질화 완충액-1 (1.4)에 균질화시킨다.
3.5 염화 마그네슘 (1.11) (20.3mg/gm 조직)을 균질화물에 첨가하고 얼음수조에서 15 분 동안 교반한다.
3.6 균질화물을 베크만 원심분리기 (2.3)에서 1,500g (3,820rpm)에서 12 분 동안 원심분리하고 상청액을 새로운 원심분리 튜브에 옮기고 펠렛을 버린다.
3.7 상청액을 소르발 원심분리기 (2.1)에서 15,000g (12,100rpm)에서 12분 동안 원심분리하고 상청액을 버린다.
3.8 남은 펠렛의 맨위의 옅은 분홍색 층을 제거하고 균질화 완충액-2 (1.5)에 재현탁한다 (1g 조직당 5ml 완충액).
3.9 현탁액을 베크만 원심분리기에서 2,200g (4,630rpm)에서 12 분 동안 원심분리한 후 펠렛을 버린다.
3.10 상청액을 소르발 원심분리기를 사용하여 15,000g (12,100rpm)에서 12 분 동안 원심분리하고 상청액을 버린다.
3.11 최종 펠렛을 균질화 완충액-2 (1g 조직당 0.5ml 완충액) 중에 재현탁한다. 브라운 미니프라이머를 사용하여 균질한 현탁액을 얻는다. 이를 100㎕ 분취량으로 냉동하여 NPY 또는 NPY Y1 활성에 대하여 분석한다.
4.0 ACE 활성의 측정
앞에서 분취된 ACE의 활성을 ACE 특이적 펩티드 기질을 절단하는 능력으로써 측정한다.
돼지 ACE (1.2)를 녹이고 0.004U/㎕로 ACE 완충액 (1.6)에 재현탁시키고, 이를 50㎕ 분취량으로 냉동시킨다.
4.1 4% DMSO/ACE 완충 용액을 제조한다 (96 ml ACE 완충액 중의 4ml DMSO).
4.2 기질 (1.7), 전체 생성물 (1.8) 및 효소 (1.1, 1.2, 1.3)를 해동시키기 위하여 얼음에 둔다.
4.3 50㎕의 4% DMSO/ACE 완충 용액을 각 웰에 첨가한다.
4.4 2mM 기질 스톡을 1:100으로 희석하여 20μM 용액을 제조한다. 100㎕의 20μM 기질을 각 웰에 첨가한다 (분석에서의 최종 농도 10μM).
4.5 50㎕의 일정 범위의 효소 희석액을 첨가하여 반응을 개시시킨다 (보통 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 및 1:3200이 사용된다). 50㎕의 ACE 완충액을 블랭크 웰에 첨가한다.
4.6 2mM 전체 생성물을 1:200으로 희석하여 10μM 용액을 제조한다. 200㎕의 10μM 생성물을 새 플레이트의 첫번째 네개의 웰에 첨가한다.
4.7 플레이트를 진탕 인큐베이터에서 60 분 동안 37℃에서 인큐베이션한다.
4.8 ACE 완충액 중의 100㎕ 2mM EDTA를 첨가함으로써 효소 반응을 중단시키고 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 20 분 동안 교반한 후, BMG 플루오스타 갤럭시(ex320/em420)에서 읽는다.
5. ACE 억제 분석
5.1 기질, 전체 생성물 및 효소 스톡을 얼음에 두어 해동시킨다.
5.2 화합물 스톡을 100% DMSO 중에서 제조하고 ACE 완충액 중에서 1:25로 희석하여 4% DMSO 용액을 만든다. 모든 추가적 희석을 4% DMSO/ACE 완충 용액에서 수행한다 (96ml ACE 완충액 중의 4ml DMSO).
5.3 50㎕의 화합물을 이중으로 96 웰 플레이트에 첨가하고 50㎕의 4% DMSO/ACE 완충액을 대조군 및 블랭크 웰에 첨가한다.
5.4 단계 5.2 및 5.3은 손으로 수행하거나 패카드 (Packard) 멀티프로브 로보트를 사용하여 수행할 수 있다.
5.5 2mM 기질 스톡을 ACE 완충액 중에서 1:100으로 희석하여 20μM 용액으로 만든다 (분석에서 10μM 최종 농도) (1 플레이트에 대해 10.89 ml 완충액에 첨가된 110㎕의 2mM 기질이면 충분하다).
5.6 활성 체크 (4.0)로부터 측정된 대로, 효소 스톡을 ACE 완충액에 희석한다.
5.7 2mM 전체 생성물 스톡을 ACE 완충액 중에서 1:200으로 희석하여 10μM 용액으로 만든다. 200㎕를 별도의 플레이트의 첫번째 4개의 웰에 첨가한다.
5.8 0.5mM EDTA 스톡을 1:250으로 희석하여 2mM 스톡을 만든다 (44㎕ EDTA 대 10.96ml ACE 완충액)
5.9 96 웰 플레이트의 각 웰에 다음과 같이 첨가한다:
표 1: 96웰 플레이트에 첨가된 시약
화합물/DMSO 트리스 완충액 기질 ACE 효소 전체 생성물
표본 2㎕화합물 50㎕ 100㎕ 50㎕ 무
대조군 2㎕DMSO 50㎕ 100㎕ 50㎕ 무
블랭크 2㎕DMSO 100㎕ 100㎕ 무 무
전체 2㎕DMSO 무 무 무 200㎕
5.10 이 분석에 사용된 최고 농도의 각 화합물 50㎕를 이중으로 동일한 96 웰 플레이트에 전체 (5.7)로서 첨가한다. 화합물 형광을 측정하기 위하여 150㎕의 ACE 완충액을 첨가한다.
5.11 ACE 효소를 첨가함으로써 반응을 개시시킨 후 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
5.12 100㎕ 2mM EDTA를 첨가함으로써 반응을 중단시키고 37℃에서 20 분 동안 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션한 후, BMG 플루오스타 갤럭시 (ex320/em420)에서 읽는다.
6. 계산
ACE 효소의 활성을 화합물의 존재 및 부재 하에 측정하고 퍼센트로서 나타낸다.
FU = 형광 단위
(i)% 대조군 활성 (효소의 전환):
(ii)억제제 사용시의 % 활성:
(iii)대조군에 대한 %로 표현된 활성
또는
(iv) % 억제 = 100 - % 대조군
(v) 형광 화합물에 대해서는 % 활성을 계산하기 위하여 사용된 화합물의 평균 FU 값으로부터 화합물을 함유하는 블랭크 (5.10)의 평균 FU를 뺐다.
% 활성 (대조군에 대한 %) 대 화합물 농도에 대한 S형 용량-반응 곡선을 얻고 엑셀에서의 랩스타츠 (LabStats) 피트-커브를 사용하여 IC50값을 계산한다.
본원에 언급된 PDE 활성 효력 값은 하기 분석법으로 측정된다:
PDE5 억제제 - 시험 방법
포스포디에스테라제 (PDE) 억제제 활성
본 발명에 따른 용도에 적합한 바람직한 PDE 화합물은 강력하고 선택적인 cGMP PDE5 억제제이다. 시클릭 구아노신 3',5'-모노포스페이트 (cGMP) 및 시클릭 아데노신 3',5'-모노포스페이트 (cAMP) 포스포디에스테라제에 대한 시험관내 PDE억제 활성은 이들의 IC50값 (효소 활성의 50% 억제에 요구되는 화합물의 농도)을 측정함으로써 결정될 수 있다.
필요한 PDE 효소는 본질적으로 문헌 [W.J.Thompson and M.M.Appleman, Biochem., 1971,10, 311]의 방법에 의해, 사람 음경 해면체, 사람 및 토끼 혈소판, 사람 심실, 사람 골격근 및 소 망막을 포함하는 다양한 공급원으로부터 분리될 수 있다. 특히, cGMP-특이성 PDE (PDE5) 및 cGMP-억제된 cAMP PDE (PDE3)는 사람 음경 해면체 조직, 사람 혈소판 또는 토끼 혈소판으로부터 얻을 수 있고; cGMP-자극된 PDE (PDE2)는 사람 음경 해면체로부터 얻어지고; 칼슘/칼모둘린 (Ca/CAM)-의존성 PDE (PDE1)는 사람 심실로부터; cAMP-특이성 PDE (PDE4)는 사람 골격근으로부터; 광수용체 PDE (PDE6)는 소 망막으로부터 얻을 수 있다 포스포디에스테라제 7-11은 SF9 세포로 트랜스팩션된 전장 사람 재조합 클론으로부터 생성될 수 있다.
분석은 문헌 [W.J.Thompson et al., Biochem., 1979,18, 5228]의 "배치" 방법의 변형을 사용하거나 제품 코드 TRKQ7090/7100 하의 아머샴 (Amersham) plc에 기재된 프로토콜의 변형을 사용하여 AMP/GMP의 직접 검출을 위한 섬광 근접 분석법 (scintillation proximity assay)를 사용하여 수행할 수 있다. 요약하면, PDE 억제제의 효과는 IC50≒ Ki가 되도록 다양한 억제제 농도 및 낮은 기질 (∼1/3 Km의 농도로, 비표지된 것 대 [3H]-표지된 것의 비율이 3:1인 cGMP 또는 cAMP)의 존재 하에 고정된 양의 효소를 분석함으로써 연구하였다. 최종 분석 부피는 분석 완충액 [20 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM MgCl2, 1 mg/ml 소 혈청 알부민]으로 100㎕ 이하로제조하였다. 효소를 사용하여 반응을 개시하고, 30-60분 동안 30℃에서 인큐베이션하여 <30% 기질 전환이 되었고, 50㎕ 이트륨 실리케이트 SPA 비드 (PDE9 및 11에 대한 3mM의 각각 비표지된 시클릭 뉴클레오티드를 함유)를 사용하여 종결시켰다. 플레이트를 재-밀봉하고 20 분 동안 교반하고, 그 후 비드를 30 분 동안 암소에서 정치시킨 후 톱카운트 (TopCount) 플레이트 리더 (Packard, Meriden, CT)에서 계수하였다. 방사능 단위를 억제되지 않은 대조군의 % 활성 (100%)으로 전환시켜서, 억제제 농도에 대하여 플롯하였고 '피트 커브' 마이크로소프트 엑셀 익스텐션을 사용하여 억제제 IC50값을 얻었다.
기능적 활성
이는 문헌 [S.A.Ballard et al., Brit. J. Pharmacol., 1996, 118(suppl.), abstract 153P]에 기재된 바와 같이, 시험관내에서 토끼의 미리 수축시킨 음경 해면체 조직 스트립의 소듐 니트로프루시드-유도 이완을 상승시키는 본 발명의 화합물의 능력을 측정함으로써 평가할 수 있다.
상기 명세서에 언급된 모든 출판물은 본원에 인용함으로써 삽입된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 본 발명의 범위 및 취지로부터 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기재되었지만, 청구된 발명이 이러한 특정 실시태양에 부당하게 국한되지 않아야 한다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 이내인 것으로 의도된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 특허에 포함된 화합물을 본원에 상호 인용함으로써, 치료적 활성 화합물은 청구범위 (특히 청구항 1) 및 특정 실시예 (이들 전부는 본원에 인용함으로써 삽입됨)에서 정의되는 것으로 한다.
이하에서는 하기 도면을 참고하여 본 발명에 대해 단지 예시로서 추가적으로 기재할 것이다:
도면
도1은 그래프를 나타내고;
도2는 그래프를 나타내고;
도3은 그래프를 나타내고;
도4는 뉴클레오티드 서열을 나타내고;
도5는 뉴클레오티드 서열을 나타내고;
도6은 뉴클레오티드 서열을 나타내고;
도7은 뉴클레오티드 서열을 나타내고;
도8은 뉴클레오티드 서열을 나타내고;
도9는 뉴클레오티드 서열을 나타내고;
도10은 그래프를 나타낸다.
더 자세히는,
도1은 마취된 토끼에서 자극시 NPY Y1 길항제 BIBP 3226 (1-100 ㎍/kg iv)가 해면체내압 (ICP)에 미치는 효과를 나타낸다 (*P<0.05, 스튜던츠 T-테스트).
도2는 마취된 토끼에서 자극시 PDE5 억제제가 해면체내압 (ICP)에 미치는 효과를 나타낸다. 데이타는 대조군 증가에 비한 ICP의 증가 퍼센트로 표현한다 (*P<0.01, 대조군 증가에 비한 언페어드 (unpaired) 스튜던츠 T-테스트).
도3은 마취된 토끼에서 NPY Y1 길항제 BIBP 3226 (0.03-0.3 mg/kg)이 평균 동맥 혈압에 미치는 효과를 나타낸다. 평균 동맥 혈압의 값은 평균 ±s.e.평균 (n=3)으로 표현한다. 연한 회색 바는 약물 투여 전의 기본 평균 동맥 혈압을 나타내고, 짙은 회색 바는 BIBP 3226의 정맥내 투여 후 평균 동맥 혈압을 나타낸다. 흰색 바는 비히클 대조군을 나타낸다.
도4는 인간 신경펩티드 Y (NPY) 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No.1)을 나타낸다.
도5는 인간 NPY Y1 수용체 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No.2)을 나타낸다.
도6은 인간 NPY Y2 수용체 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID No.3)을 나타낸다.
도7 및 8은 인간 SEP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들 (cDNAs) (각각 SEQ ID No.4 및 SEQ ID No.5)을 나타낸다. SEQ ID No. 5는 5' 및 3' 부분 벡터 서열을 포함한다.
도9는 인간 SEP 단백질의 아미노산 서열 (SEQ ID No.6)을 나타낸다.
도10은 마취된 토끼에서 자극시 NPY Y1 수용체 길항제, PDE5 억제제 및 NPY Y1 수용체 길항제 및 PDE5 억제제의 조합이 해면체내압 (ICP)에 미치는 효과를 나타낸다. 데이타는 대조군 증가에 비한 ICP의 증가 퍼센트로 나타낸다.
실시예
1.0 방법
1.1 동물 시험 방법
1.1.1 마취된 토끼를 사용하는 방법
수컷 뉴질랜드 토끼 (∼2.5kg)에 메데토미딘 (Domitor)(등록상표) 0.5ml/kg i.m., 및 케타민 (Vetalar)(등록상표) 0.25ml/kg i.m.의 조합을 미리 투여하고, 얼굴 마스크를 통하여 산소 흡입을 유지하였다. 토끼를 포르텍스 (PortexTM) 기낭없는 (uncuffed) 기관내 튜브 3 ID.를 사용하여 기관절개하고, 호흡기에 연결하고 분당 30-40 호흡수의 호흡 속도로 유지하면서, 18-20 ml의 일호흡량, 및 10 cm H2O의 최대 기도내압으로 유지하였다. 그 후 마취를 이소플루란으로 변경하고, 2ℓ/min에서 O2로 호흡을 계속하였다. 오른쪽 모서리 귀 정맥을 23G 또는 24G 카테터를 사용하여 삽관하고, 락테이트화 링거 용액을 0.5ml/min으로 관류하였다. 침습 수술 중 토끼를 3% 이소플루란에서 유지하고, 마취를 유지하기 위하여 2%로 떨어뜨렸다. 왼쪽 경정맥을 노출시키고, 분리한 후 약물 및 화합물의 주입을 위하여 PVC 카테터 (17G)로 삽관하였다.
토끼의 왼쪽 서혜부를 면도하고, 약 5cm 길이로 대퇴부를 따라 수직으로 절개하였다. 대퇴 정맥 및 동맥을 노출시키고, 분리한 후 약물 및 화합물의 주입을 위하여 PVC 카테터 (17G)로 삽관하였다. 카테터가 복부 대동맥에 확실히 이르도록 하기 위하여 10cm의 깊이까지 카테터를 삽입하여, 대퇴 동맥에 대하여 삽관을 반복하였다. 이 동맥 카테터를 굴드 (Gould) 시스템에 연결하여 혈압을 기록하였다.혈액 기체 분석에 대한 표본도 동맥 카테터를 통하여 취하였다. 수축기 및 이완기압을 측정하고, 평균 동맥압을 식 [(이완기 ×2 + 수축기)÷3]을 사용하여 계산하였다. 심박수를 맥박 산소측정기 및 포-네-마 (Po-ne-mah) 데이터 입수 소프트웨어 시스템 (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc.)를 통하여 측정하였다.
복측 중심선 절개를 복강내로 실시하였다. 절개는 치골 바로 위에 약 5cm의 길이였다. 지방 및 근육을 둔하게 잘라 내어 체강으로 흐르는 하복 신경이 드러나게 하였다. 치골 위에 놓인 대퇴 정맥 및 동맥이 손상을 입지 않도록 하기 위하여 치골 벽의 측면 곡선에 가깝게 유지시키는 것이 필수적이었다. 좌골 및 골반 신경은 더 깊이 있었고 토끼의 등쪽에 추가적 절개를 한 후에 발견되었다. 좌골신경이 확인되면, 골반신경은 쉽게 발견되었다. 골반신경이라는 용어는 부정확하게 적용된다; 이 주제에 관한 해부학 책은 충분히 상세히 그 신경을 식별하지 못한다. 그러나, 그 신경의 자극은 해면체 내압 및 해면체 혈류의 증가, 및 골반 영역의 신경자극을 야기한다. 골반 신경을 주변 조직으로부터 분리하고 하바드 (Harvard) 쌍극 자극 전극을 신경 주변에 위치시킨다. 신경을 약간 들어올려 약간의 긴장을 준 후, 전극이 위치에 있는 것을 확실히 하였다. 약 1 ㎖의 경질 파라핀 오일을 신경 및 전극 주위에 놓았다. 이는 신경에 보호성 윤활제로 작용하고, 전극의 혈액 오염을 방지한다. 전극을 그라스 (Grass) S88 자극기에 연결시켰다. 골반 신경을 하기 파라미터를 사용하여 자극하였다:- 5V, 펄스 폭 0.5ms, 16Hz의 주파수로 자극 시간 20초. 신경을 15-20 분마다 자극했을 때, 재현성있는 반응을 얻었다. 평균대조 반응을 설정하기 위하여 상기 파라미터를 사용한 수 개의 자극을 수행하였다. 시험할 화합물을 하바드 22 주입 펌프를 사용하여 연속적인 15 분 자극 주기가 되도록 하면서 경정맥을 통하여 주입하였다. 음경 주변의 피부 및 결합 조직을 제거하여 음경이 드러나도록 하였다. 카테터 세트 (Insyte-W, Becton-Dickinson 20 Gauge 1.1 x 48mm)를 백색막 (tunica albica)을 통하여 왼쪽 음경 해면체 공간으로 삽입하고 유연성 카테터를 남기고 바늘을 제거하였다. 카테터를 압력 변환기 (Ohmeda 5299-04)를 경유하여 굴드 시스템에 연결시키고 해면체 내압을 기록하였다. 해면체 내압이 확립된 후, 베트본드 (Vetbond) (조직 접착제, 3M)를 사용하여 카테터를 적소에서 밀봉하였다. 심박수를 맥박 산소측정기 및 포-네-마 데이터 수집 소프트웨어 시스템 (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc.)을 통하여 측정하였다.
해면체 혈류량은 포-네-마 데이터 수집 소프트웨어 (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc.)를 사용하여 유량계로부터 직접 수로서 기록하거나, 굴드 차트 기록기 트레이스 (trace)로부터 간접적으로 기록하였다. 실험의 시작 시점에서 (0-125 ml/min/100g 조직) 검정하였다. NPY 억제제는 식염수 + 10% 1M NaOH 중에서 제조하였고, 포스포디에스테라제 타입 5 (PDE5) 억제제는 식염수 + 5% 1M HCl 중에서 제조하였다. 억제제 및 비히클 대조군은 0.1ml/초의 속도로 주입하였다. NPY 억제제 및 PDEcAMP억제제를 골반 신경 자극 전에 15 분 동안 놓아 두었다.
모든 데이터는 평균 ±s.e.m으로 기록하였다. 유의성 있는 변화는 스튜던츠 t-테스트를 사용하여 확인하였다.
2.0결과 및 논의
2.1NPY 수용체 길항제
음경 발기 (즉, 음경 혈류 및 해면체 내압의 증가)의 생리를 모방하는 발기의 마취 동물 모델이 다수 있다. 성적 흥분의 효과는 음경을 신경자극하는 골반 신경의 자극에 의해 모방된다. 이는 발기 기전을 연구하고 MED의 치료를 위한 가능성있는 치료제를 평가하기 위한 기전이다.
실데나필과 같은 선택적 PDE5 억제제가 동물 모델에서 신경 자극에 의한 해면체 내압 (ICP)의 증가를 상승시킨다는 것과 신경 자극이 남성에게서 관찰되는 발기 과정을 모방하는 것이 현재 확립되어 있다 (Carter et al., 1998, Traish et al., 1999, Omote 1999, Wallis 1999). 이 ICP의 PDE5 억제제-유도 증강은 PDE5 억제제의 작용 기전의 특징이고, 실데나필과 같은 약제가 어떻게 MED 또는 발기부전과 관련된 어떠한 이완적 결함을 극복하지를 설명한다. 이 이전의 연구와 일치하게, 이하의 실시예는 마취된 토끼에서 정맥내로 투여된 선택적 PDE5 억제제가 신경-자극된 ICP의 증가를 강화시킨다는 것을 입증한다 (실시예 2).
이하의 실시예는 선택적 NPY Y1 수용체 길항제 (BIBP3226)를 사용한 NPY 수용체의 억제가 마취된 토끼에서 용량 의존적으로 신경 자극된 해면체 내압의 증가를 강화시킨다는 것을 입증한다 (실시예 1). 이 연구에서 사용된 용량에서 NPY 길항제를 사용하였을 때 PDE5 억제제에서 관찰되는 것과 유사한 발기 과정의 증강이관찰되었다 (실시예 2). 이 실시예는 발기 과정을 증강시킴으로써 MED의 치료에 있어서 NPY 수용체 길항제 요법의 임상 적용 가능성을 나타낸다.
NPY 또는 NPY Y1 수용체 및 PDE5 수용체의 공동 억제는 동일 용량의 동일한 PDE5 억제제 단독으로 달성할 수 있는 것에 비하여 ICP 또는 발기 과정의 현저한 증강을 일으켰다. 발기의 토끼 모델을 사용하여 발명자들은 PDE5 억제에 의해 유도되는 ICP의 강화가 NPY Y1 수용체 길항제의 공동-투여에 의해 더 강화될 수 있다는 것을 입증할 수 있었다. 1 mg/kg (iv) 용량의 PDE5 억제제에서 ICP의 최대 강화가 관찰되었고, ICP가 PDE5 억제제에 의해 매개된 이 최대값보다 더 강화될 수 있다는 발견은 예상하지 못했던 것이다. 이는 PDE5 억제제 및 NPY Y1 수용체 억제제의 공동 투여가 PDE5 억제제 단독 요법에 비하여 많은 임상적 유용성이 있다는 것을 설명한다. 이는 증가된 효능 및 PDE5 억제제 요법에 반응하지 않는 MED 서브그룹을 치료할 가능성을 포함한다.
NPY Y1 수용체 길항제 및 PDE5 또는 이 둘의 복합제는 비자극된 ICP에는 현저한 효과를 갖지 않았고, 즉 이들은 성적 동기유발/흥분이 없는 상태에서는 직접적으로 ICP의 증가를 유도하지 않았다. 작용하는데 성적 자극을 필요로 하는 MED에 대한 단 하나의 시판되는 요법이 실데나필이므로 이러한 효과는 매우 유용한 것이고, 따라서, 본 발명은 실데나필 및 모든 다른 PDE5 단독 기반 약물에 대한 실용가능한 대안적 경구 요법을 제공한다.
NPYi - 동물 모델 실시예
실시예 1 내지 6에 사용된 화합물:
NPY 수용체 길항제: BIBP 3226
NPY Y1 길항제닥터 칼 토마 게엠베하 (Dr Karl Thomae GmbH)에서 입수가능함(이전의 베링거 잉겔하임 파마 카게 (Boehringer Ingelheim Pharma KG)BIBP-3226WO-09417035
BIBP3226은 인간 천연 NPY Y1에 대한 IC50이 7 nM이고, NPY Y5 (인간)에 비한 NPY Y1 (인간)에 대한 선택성이 1000 보다 크고, NPY Y2 (인간)에 비한 NPY Y1 선택성이 1000 보다 크다 (문헌 [Rudolf et al (1994)] 및 [Jacques et al (1995)] 참조).
PDE5i: 3-에틸-5-[5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)-2-n-프로폭시프레닐]-2-(피리딘-2-일)-메틸-2,6-디히드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온으로도 알려진 3-에틸-5-{5-[4-(에틸피페라지노)설포닐-2-프로폭시페닐}-2-(2-피리딜메틸)-6,7-디히드로-2H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온 (WO 98/491066 참조).
인간 천연 PDE5에 대한 IC50은 1.1 nM이고, PDE3에 비한 PDE5 (둘다 천연 인간의 것)에 대한 선택성이 90,000 보다 크고 PDE4에 비한 선택성이 18,545이다.
인용된 모든 효력 및 선택성 값은 인간 천연 효소에 대한 것이다 (본원의 분석 참조).
실시예 1.NPY Y1 수용체의 억제가 마취된 토끼의 발기 모델에서 신경 자극된 해면체 내압의 증가를 용량-의존적으로 강화시킨다:
신경-자극에 의해 유도된 해면체 내압 (ICP)의 최대하 증가는 선택적 NPY Y1수용체 길항제 (BIBP3226) (iv 일시주사)의 용량 증가의 존재 하에 현저히 증가되었다. 증가는 30 ㎍/kg의 용량 및 그 이상에서 현저해졌다. 최대 강화 (약 127%)는 30 ㎍/kg에서 관찰되었다. 데이타는 대조군 자극된 증가에 비한 퍼센트 (%) 증가로서 표현된다. 값들은 평균 ±s.e.평균으로서 표현된다. *P<0.05, 대조군 증가에 비한 언페어드 스튜던츠 t-테스트 (도 1 참조).
기본/비자극 해면체 내압에 미치는 NPY Y1 수용체 길항작용의 주요 효과는 없었다.
실시예 2.마취된 토끼의 발기 모델에서 PDE5 억제제가 음경 발기를 증강시키는 효능이 PDE5의 억제에 의해 현저히 증가된다:
선택적 PDE5 억제제 (1 mg/kg)의 정맥내 투여는 신경 자극된 ICP의 증가를 대조군 증가에 비하여 133±22%까지 현저히 증강시켰다. 데이타는 대조군 증가에 비한 ICP 증가 퍼센트로서 표현하였다. 값들은 평균 ±s.e.평균으로 표현하였다. *P<0.01, 대조군 증가에 비한 언페어드 스튜던츠 t-테스트 (도 2 참조).
기본/비자극 해면체 내압에 미치는 PDE5 억제의 효과는 없었다.
실시예 3.해면체내압을 증강시키는 약제가 마취된 토끼에서 평균 동맥 혈압에 미치는 효과
MED와 같은 남성 성기능 장애를 치료하기 위한 신규 요법에 대한 검색에 있어서, 관련된 부정적 심혈관계 효과, 예를 들면 혈압 또는 심박수에 미치는 효과가 없는 것이 바람직하다. 발명자의 연구에서, NPY Y1 수용체 길항제 BIBP3226 (0.03-0.3 mg/kg)이 골반 신경 자극된 해면체 내압의 증가를 증강시키는 것과 유사한 용량에서 혈압 또는 심박수에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것을 발견하였다.
BIBP3226 (선택적 NPY Y1 길항제)의 정맥내 투여는 마취된 토끼의 음경 발기 모델에서 평균 동맥 혈압에 실질적 효과를 미치지 않았다. 도 3에 나타낸 그래프는 BIBP3226이 마취된 토끼에서 골반 신경 자극된 해면체내압의 증가를 증강시키는 용량에서 평균 동맥 혈압에 현저한 효과를 미치지 않는 것을 입증한다. 평균 동맥압 (MAP)의 값은 평균 ±s.e.평균 (n=3)으로 표현하였다. 옅은 회색 바는 약물 투여 전의 기본 MAP를 나타내고 짙은 회색 바는 BIBP3226의 정맥내 투여 후의 MAP를 나타낸다. 흰색 바는 비히클 대조군을 나타낸다. *P<0.05, 대조군 증가에 비한 언페어드 스튜던츠 t-테스트.
실시예 4.NPY 1 수용체 길항제는 마취된 토끼 발기 모델에서 PDE5 억제제가 음경 발기를 증강시키는 효능을 현저히 증가시킨다.
선택적 PDE5 억제제 (1mg/kg)의 정맥내 투여는 신경 자극된 ICP의 증가를 대조군 증가에 비하여 133% 만큼 현저히 증강시킨다 (실시예 2 참조). BIBP 3226 (선택적 NPY Y1 길항제, 100 ㎍/kg)의 정맥내 투여는 대조군 증가에 비하여 신경 자극된 ICP의 증가를 110% 만큼 현저히 증가시켰다. NPY Y1 길항제-매개 증가가 유지되면, 선택적 PDE5 억제제 (1 mg/kg)의 공동 투여가 신경 자극된 ICP의 증가를 최대 350%의 증가까지 더 증강시킨다 (도 10 참조). 강화의 정도는 NPY Y1 길항제 및 PDE5 억제제의 공동 투여에 의해 예상할 수 있는 것보다 더 큰 것으로 보인다 (즉 133% + 110% = 243%, 이를 350%와 비교). 데이터는 대조군 증가에 비한 ICP의 증가 퍼센트로서 나타낸다.
기본/비-자극 해면체 내압에 미치는 PDE5 억제 또는 결합된 PDE5 억제/NPY Y1 길항작용의 주요한 효과는 없었다.
실시예 5:NPY Y1 수용체 길항제는 마취된 토끼 발기 모델에서 PDE5 억제제의 발기 효과를 강화시키고 PDE5 억제제의 작용 개시를 빠르게 한다.
초기 연구에서, NPY Y1 수용체 길항제가 마취된 토끼 모델에서 PDE5 억제제의 효능을 유리하게 강화시키고 PDE5 억제제 작용의 개시를 빠르게 한다는 것이 제시되었다.
참고문헌
약어
cAMP = 시클릭 아데노신-3',5'-모노포스페이트
cGMP = 시클릭 구아노신-3',5'-모노포스페이트
PDE = 포스포디에스테라제
PDEcGMP= cGMP를 가수분해하는 PDE
PDEi = PDE의 억제제 (I:PDE로도 알려짐)
PDE5 = 포스포디에스테라제 타입 5
PDE5i = PDE5의 억제제
NPY = 신경펩티드 Y
NPYi = NPY의 억제제
NPY Y1 = 신경펩티드 Y Y1 수용체
NPY Y1i = NPY Y1의 억제제
kDa = 킬로달톤
bp = 염기쌍
kb = 킬로베이스 쌍
본 발명은 남성 성기능 장애 (MSD), 특히 남성 발기 부전증 (MED)의 치료 및(또는) 예방에 유용한 화합물 및 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 MSD, 특히 MED의 예방 및(또는) 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 MSD, 특히 MED의 치료에 유용한 본 발명의 화합물에 대해 스크리닝하기 위한 분석법에 관한 것이다.
편의상, 하기 본문에서 사용되는 약어의 목록을 청구범위 부분 앞에 기재한다.

Claims (44)

  1. 남성 발기 부전증 (MED)의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 사용시 남성 생식기와 관련된 NPY에 대해 선택적인 신경펩티드 Y (NPY)의 억제제 (NPYi)의 용도.
  2. MED의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 사용시 남성 생식기와 관련된 NPY Y1에 대해 선택적인 신경펩티드 Y Y1 수용체 (NPY Y1)의 억제제 (NPY Y1i)의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 억제제가 사용시 남성 생식기에 위치한 NPY/NPY Y1에 대해 매우 선택적인 것인 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 엔도펩티다제 NEP 및(또는) 안지오텐신 전환 효소에 대한 활성이 없거나 실질적으로 없는 것인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, MED의 상기 치료 또는 예방이 선택적인 것인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 해면체내압의 증가가 관찰되는용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 경구로 투여되는 것인 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제가 사용시 음경 해면체와 관련된 NPY 및(또는) NPY Y1 수용체에 대해 매우 선택적인 것인 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NPY 및(또는) NPY Y1 억제제가 성적 흥분 전 및(또는) 중에 투여되는 것인 용도.
  10. 성적 흥분 중 해면체내압을 선택적으로 증가시키기 위한 의약의 제조에 있어서 NPY Y1 억제제의 용도.
  11. 사용시 남성 생식기와 관련된 NPY에 대해 선택적인 신경펩티드 Y (NPY)의 억제제를 포함하며, 여기서 상기 억제제는 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는, 남성 발기 부전증 (MED)의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 억제제가 NPY Y1의 억제제인 제약 조성물.
  13. 사용시 남성 생식기와 관련된 NPY에 대해 선택적인 유효량의 NPYi를 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 NPYi는 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는, 인간 또는 동물의 MED를 치료하거나 예방하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 억제제가 NPY Y1 억제제인 방법.
  15. 성적 흥분 중 해면체내압을 선택적으로 증가시킬 수 있는 NPYi를 개체에게 전달하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물의 MED를 치료하거나 예방하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 NPYi가 NPY Y1i인 방법.
  17. 시험 약제가 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는지 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 증강은 시험 약제의 존재 하에 해면체내압 (및(또는) 해면체 혈류)의 강화로서 정의되고; 시험 약제에 의한 이러한 강화는 시험 약제가 MED의 치료에 유용할 수 있다는 것을 나타내고, 여기서 상기 시험 약제는 NPYi인, MED를 치료하기 위하여 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 시험 약제가 NPY Y1인 분석 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 시험 약제가 생식기와 관련된 NPY 또는 NPY Y1 수용체를 선택적으로 억제하는 것인 분석 방법.
  20. (a) 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 분석을 수행하는 단계;
    (b) NPY 또는 NPY Y1을 억제할 수 있는 1 이상의 약제를 확인하는 단계; 및
    (c) 다량의 1 이상의 확인된 약제를 제조하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 방법이 단계 (b)에서 확인된 상기 1 이상의 약제가 동맥 혈압에 미치는 효과를 시험하고 혈압에 영향을 미치지 않거나 실질적으로 미치지 않는 약제를 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
  22. NPY 또는 NPY Y1에 의해 정상적으로 대사되는 펩티드 (바람직하게는 형광으로 표지된 펩티드)의 대사적 분해를 억제할 수 있는 부분을 갖는 시험 약제를 접촉시키는 단계; 및 일정 시간 후 남아 있는 펩티드의 활성 및(또는) 수준을 예를 들면 형광분석을 통하여 측정하는 단계를 포함하고; 여기서 형광에 의해 측정된 펩티드의 수준의 변화는 시험 약제의 효력 (IC50)을 나타내고 시험 약제가 MED의 치료에 유용할 수 있음을 나타내고, 여기서 상기 약제는 NPYi인, MED를 치료하거나 예방하기 위하여 사용될 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 시험 약제가 NPY Y1인 분석 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 정의된 시험관내 분석 방법에서 NPY 또는 NPY Y1을 억제할 수 있는 약제로 MED를 치료하는 방법.
  25. 제17항, 제18항, 제19항, 제22항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 분석 방법에 의해 확인된 약제.
  26. 제25항에 있어서, MED의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제.
  27. 제25항에 따른 약제를 포함하는, MED를 치료하기 위한 경구 투여용 의약.
  28. 남성으로부터 시료를 단리하는 단계; 시료가 MED를 일으키는 양으로 존재하는 물질을 함유하는지 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 물질은 남성의 음경 해면체에서 내인성 발기 과정에 직접적 효과를 갖고, 여기서 상기 물질은 약제를 사용함으로써 유용한 효과를 얻기 위하여 변형될 수 있고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i인 진단 방법.
  29. 단리된 남성 시료에서 물질을 검출하기 위한 수단을 포함하며, 여기서 상기 수단은 시료가 물질을 MED를 일으키는 양으로 함유하는지, 또한 MED를 일으키는 양으로 존재하는지 결정하기 위하여 사용될 수 있고, 여기서 상기 물질은 내인성 발기 과정에 직접적 영향을 미칠 수 있고, 여기서 상기 물질은 약제를 사용함으로써 유익한 효과를 얻도록 변형시킬 수 있고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i인 진단 조성물 또는 키트.
  30. 동물의 골반 신경의 자극 후 상기 동물의 해면체내압 및(또는) 해면체 혈류의 변화를 측정하기 위한 수단을 포함하는 마취된 동물을 포함하며, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i인, MED를 치료할 수 있는 약제를 확인하기 위한 동물 모델.
  31. 제30항에 있어서, 상기 모델이 상기 동물의 동맥 혈압을 측정하기 위한 수단을 더 포함하는 동물 모델.
  32. 제30항 또는 제31항의 동물 모델에게 약제를 투여하는 단계; 및 내인성 발기 과정의 변화를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 변화는 정의된 시험 약제의 존재 하에서 동물 모델의 해면체내압 (및(또는) 해면체 혈류)의 강화로서 정의되고, 여기서 상기 약제는 NPYi 또는 NPY Y1i인, MED를 치료하기 위한 내인성 발기 과정을 직접 증강시킬 수 있는 약제를 확인하기 위한 분석 방법.
  33. MED의 치료 이외에 비정상적 음식물 섭취 장애, 특히 비만, 거식증, 대식증 및 대사 장애도 치료하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  34. MED의 치료 또는 예방을 위한 의약의 생산/제조에 있어서 1 이상의 NPYi 및 1 이상의 하기 보조 활성 약제로 이루어지는 복합제의 용도:
    1) 자연 발생 또는 합성 프로스타글란딘 또는 그의 에스테르;
    2) α-아드레날린성 수용체 길항제 화합물;
    3) NO-공여체 (NO-효능제) 화합물;
    4) 칼륨 채널 개방제 또는 조절제;
    5) 도파민성 약제, 바람직하게는 아포모르핀 또는 선택적 D2, D3 또는 D2/D3 효능제;
    6) 혈관확장제;
    7) 트롬복산 A2 효능제;
    8) CNS 활성 약제;
    9) 맥각 알칼로이드;
    10) 나트륨이뇨 인자, 특히 심방 나트륨이뇨 인자 (심방 나트륨이뇨 펩티드로도 알려짐), B 타입 및 C 타입 나트륨이뇨 인자의 작용을 조절하는 중성 엔도펩티다제의 억제제와 같은 화합물;
    11) 로사르탄과 같은 안지오텐신 수용체 길항제;
    12) L-아르기닌과 같은 NO-생성효소에 대한 기질;
    13) 암로디핀과 같은 칼슘 채널 차단제;
    14) 엔도텔린 수용체의 길항제 및 엔도텔린 전환 효소의 억제제;
    15) 스타틴 (예를 들면 아토르바스타틴/리피토르TM) 및 피브레이트와 같은 콜레스테롤 저하제;
    16) 항혈소판 및 항혈전제, 예를 들면 tPA, uPA, 와르파린, 히루딘 및 다른 트롬빈 억제제, 헤파린, 트롬보플라스틴 활성화 인자 억제제;
    17) 레줄린과 같은 인슐린 민감화제 및 글리피지드와 같은 혈당강하제;
    18) L-도파 또는 카르비도파;
    19) 도네지필과 같은 아세틸콜린에스테라제 억제제;
    20) 스테로이드 또는 비-스테로이드 항염증제;
    21) 에스트로겐 수용체 조절제 및(또는) 에스트로겐 효능제 및(또는) 에스트로겐 길항제;
    22) PDE 억제제, 특히 PDE 2, 3, 4, 5, 7 또는 8 억제제, 바람직하게는 PDE2 또는 PDE5 억제제, 가장 바람직하게는 PDE5 억제제;
    23) NEP 억제제;
    24) 혈관활성 장 단백질 (VIP), VIP 모방약, VIP 유사체, 특히 1 이상의 VIP 수용체 서브타입 VPAC1, VPAC 또는 PACAP (뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 펩티드)에 의해 매개되는 것, 1 이상의 VIP 수용체 효능제 또는 VIP 유사체 또는VIP 단편, VIP 복합제와 함께 1 이상의 α-아드레노셉터 길항제;
    25) 멜라노코르틴 수용체 효능제 또는 조절제 또는 멜라노코르틴 증강제;
    26) 세로토닌 수용체 효능제, 길항제 또는 조절제, 특히 5HT1A (VML 670 포함), 5HT2A, 5HT2C, 5HT3 및(또는) 5HT6 수용체에 대한 효능제, 길항제 또는 조절제;
    27) 테스토스테론 대체제 (데히드로안드로스텐디온을 포함), 테스토스테르논 (토스트렐레 (Tostrelle)), 디히드로테스토스테론 또는 테스토스테론 임플란트;
    28) 에스트로겐, 에스트로겐 및 메드록시프로게스테론 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA) (즉 복합제로서), 또는 에스트로겐 및 메틸 테스토스테론 호르몬 대체 요법제;
    29) 노르아드레날린, 도파민 및(또는) 세로토닌에 대한 운반체의 조절제;
    30) 퓨린성 수용체 효능제 및(또는) 조절제;
    31) 뉴로키닌 (NK) 수용체 길항제;
    32) 오피오이드 수용체 효능제, 길항제 또는 조절제, 바람직하게는 ORL-1 수용체에 대한 효능제;
    33) 옥시토신/바소프레신 수용체에 대한 효능제 또는 조절제, 바람직하게는 선택적 옥시토신 효능제 또는 조절제;
    34) 카나비노이드 수용체의 조절제;
    35) 봄베신 수용체 길항제, 특히 봄베신 BB1, BB2, 또는 BB3수용체 길항제,바람직하게는 봄베신 BB1억제제;
    35) SEP 억제제;
    36) 개체의 성 생식기에서 중간 전도 칼슘-활성화 칼륨 (IKCa) 채널의 활성을 조절할 수 있는 약제.
  35. MED의 치료 또는 예방용 의약의 생산/제조를 위한, 1 이상의 NPYi 및 1 이상의 PDEi로 이루어진 복합제의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상기 NPYi가 NPY Y1i인 용도.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 PDEi가 PDE5i인 용도.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 의약이 경구로 투여되는 것인 용도.
  39. 제약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 임의로 혼합되는 1 이상의 NPYi 및 1 이상의 PDEi로 이루어진 제약 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 NPYi가 NPY Y1i인 제약 조성물.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 NPY Y1i가 생식기와 관련된 NPY Y1 수용체에 매우 선택적인 제약 조성물.
  42. 제39항 또는 제41항에 있어서, 상기 PDEi가 PDE5i인 제약 조성물.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 경구로 투여되는 제약 조성물.
  44. MED의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한, 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물의 용도.
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