JP2003250550A

JP2003250550A - 脂肪細胞分化関連遺伝子およびタンパク質

Info

Publication number: JP2003250550A
Application number: JP2002048742A
Authority: JP
Inventors: Masayoshi Imagawa; 正良今川; Yuichi Oku; 裕一奥
Original assignee: Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Current assignee: Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2002-02-25
Publication date: 2003-09-09
Also published as: WO2003074694A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化開始１２時
間以内に活性化される遺伝子を見出す。【解決手段】特定配列で表される塩基配列と同一もし
くは少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含む
ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的な
ポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドがコードす
るタンパク質であって、特定のアミノ酸配列で表される
タンパク質の全長にわたり同一もしくは少なくとも９０
％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、脂肪細胞分化の初
期に発現するクローン１５８ポリヌクレオチド及びクロ
ーン１５８タンパク質に関し、さらには該クローン１５
８タンパク質の抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、お
よびこれらの製造、並びにこれらの物質を含有する医薬
および診断薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】栄養過剰による肥満は、糖尿病・高血圧
・動脈硬化などの深刻な生活習慣病の最大の要因となっ
ている。今後の生命科学・健康科学を考えるうえで、肥
満の分子機構を解明することは必須の課題といえる。肥
満に直接関わるのは脂肪細胞であり、脂肪細胞生成過程
が解明されれば肥満の治療に直結する。近年の分子生物
学の発展に伴い、脂肪細胞分化の機構が解明されつつあ
る。そこにはキーとなる遺伝子群が存在し、これらが巧
妙に情報をやり取りするネットワークを形成しているこ
とが知られている。

【０００３】脂肪細胞分化過程は複雑なステップより成
り、脂肪芽細胞（Ａｄｉｐｏｂｌａｓｔ）→前駆脂肪細
胞（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）→脂肪細胞（Ａｄｉｐ
ｏｃｙｔｅ）へ分化する。培養細胞や遺伝子改変個体を
用いた系などにより脂肪細胞分化に密接に関与する転写
因子が、近年、明らかになりつつある。

【０００４】ＰＰＡＲ (Peroxisome Proliferator-Acti
vated Receptor, ペルオキシソーム増殖剤応答性レセプ
ター) 、Ｃ／ＥＢＰ(CCAAT／Enhancer- Binding Protei
n)ファミリー、及びＳＲＥＢＰ−１／ＡＤＤ１ (Sterol
Regulatory Element Binding Protein 1 または Adipo
cyte Determination and Differentiation-dependentFa
ctor 1)は脂肪細胞の分化に最も重要な転写因子といわ
れている。

【０００５】ＰＰＡＲは、ファミリーを形成しているこ
とが明らかにされ、その中でもＰＰＡＲγは脂肪細胞分
化に特に重要であることが明らかになっている。すなわ
ち、脂肪芽細胞や前駆脂肪細胞において、ＰＰＡＲγを
強制的に発現させると脂肪細胞に分化することが明らか
になっている。この結果は、ＰＰＡＲγが脂肪細胞の分
化に重要な役割を担っていることを証明していると言え
る。

【０００６】Ｃ／ＥＢＰもＰＰＡＲと同様にファミリー
を形成しており、最近になって、Ｃ／ＥＢＰαがＰＰＡ
Ｒγと同じように脂肪細胞分化のマスターレギュレータ
ーとして機能していることが明らかにされている。ま
た、Ｃ／ＥＢＰβとＣ／ＥＢＰδは分化の初期に発現
し、Ｃ／ＥＢＰαとＰＰＡＲγの発現を制御していると
考えられている。

【０００７】ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１は、脂肪細胞の分
化を促進することが知られている一方、脂肪細胞の分化
過程においてＰＰＡＲγのリガンド生成に関わっている
ことも明らかにされている。

【０００８】前記３種類の転写因子群（ＰＰＡＲ、Ｃ／
ＥＢＰ、ＳＲＥＢＰ１／ＡＤＤ１）が、クロストークす
ることにより分化過程が進行することが明らかになって
いる。

【０００９】前記３種類の転写因子群は、脂肪細胞の分
化の比較的初期から発現が上昇することが明らかにされ
ており、複数の標的遺伝子の発現を制御するマスターレ
ギュレーターと考えられている。これらの転写因子群を
発現時期の面から見ると、Ｃ／ＥＢＰβとＣ／ＥＢＰδ
において比較的初期に発現が増加することが知られてい
る。しかし、前駆脂肪細胞より脂肪細胞へ分化する最も
初期に、即ち、分化開始から半日（１２時間）以内に、
どのような遺伝子が活性化されているかについてはほと
んど明らかにされていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前駆脂肪細胞より脂肪
細胞へ分化する最も初期、即ち、分化開始１２時間以内
に活性化される遺伝子の発現の有無、その程度、遺伝子
産物としてのタンパク質の有無、その量、発現している
場所の特定、また、遺伝子の変異を分析することは、肥
満のメカニズムを解明し、さらに肥満の進行状況を適切
に把握し、肥満の予防あるいは治療に役立たせる上で極
めて重要な要素となりうる。そのために、この遺伝子の
特定ならびにこの遺伝子産物であるタンパク質を特定
し、こうした遺伝子あるいはタンパク質を検出、あるい
は測定することが望まれる。

【００１１】そこで本発明は、前駆脂肪細胞より脂肪細
胞へ分化開始１２時間以内に活性化される遺伝子を見出
し、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを保持する形
質転換体、該形質転換体から生産されるタンパク質、該
タンパク質に特異的な抗体、該タンパク質の製造方法、
該タンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニス
ト、これらの化合物を含む医薬、診断薬を提供すること
を目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するために鋭意研究を行った結果、前駆脂肪培養細胞
株として周知のマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣＮ
ｏ．ＣＣＬ−９２．１．）を用い、分化の最も初期の過
程で遺伝子の発現の変動を解析するために、脂肪細胞分
化誘導前と誘導３時間後においてサブトラクション法に
よるクローニングを行った。その結果、１００近いクロ
ーンが、脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に脂肪細
胞分化を促進するタンパク質の発現が上昇し、脂肪細胞
分化誘導開始後１２時間以内に活性化される遺伝子とし
て得られたが、そのうち、特に発現が優れた遺伝子とし
て配列番号１で表される塩基配列のポリヌクレオチドが
得られた。配列番号１で表されるポリヌクレオチドの塩
基配列は、マウスの脂肪細胞分化の初期、即ち、脂肪細
胞分化誘導前と誘導３時間後に発現するｃＤＮＡにより
決定された。該ポリヌクレオチドをマウスのクローン１
５８ヌクレオチドと呼ぶ。

【００１３】即ち、本発明のポリヌクレオチドは、脂肪
細胞分化を促進する機能を有し且つ脂肪細胞分化誘導開
始後１２時間以内に活性化される性質を有するタンパク
質をコードするポリヌクレオチドである。

【００１４】本明細書において、活性化とは、発現する
ことあるいは発現が亢進することを意味する。

【００１５】配列番号１で表されるマウスの塩基配列と
相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、また
は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドをht
tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において検索したと
ころ、機能が全く記載されていないヒト由来のｍＲＮＡ
の配列が該当し、アクセッション番号がＭＮ＿０３２２
７０およびＡＬ１３６９１９で、２３４３ｂｐの長さで
登録されていることが分かった。配列番号１で表される
マウスの塩基配列と該ヒト由来のｍＲＮＡの塩基配列と
の相同性は７１．５９（２０４１／２８５１）％であ
り、また、配列番号１で表される塩基配列における開始
コドンから終始コドンまで（塩基配列の番号２３６から
２６４４まで）と前記公知のヒトのＯＲＦの配列の相同
性は、７６．６７（１８４７／２４０９）％である。

【００１６】本発明のポリヌクレオチドは、好ましく
は、配列番号１で表される塩基配列に対して同一、もし
くは少なくとも９０％、９３％、９５％または９８％の
相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは
該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドであっ
て、脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化され
る脂肪細胞分化を促進するタンパク質をコードし、且
つ、脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化され
るポリヌクレオチドである。

【００１７】また、本発明のポリヌクレオチドは、配列
番号１で表される塩基配列の番号２３６から２６４４に
対して同一もしくは少なくとも９０％、９３％、９５％
または９８％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌク
レオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌク
レオチドであって、脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以
内に活性化し且つ脂肪細胞分化を促進する機能を有する
タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。

【００１８】配列番号１で表されるマウスの塩基配列の
ポリヌクレオチドに基づき、新規な塩基配列のヒトのポ
リヌクレオチドがヒトホモログのクローニングにより決
定されたので、該塩基配列を配列番号９に示す。

【００１９】即ち、本発明のヒトのポリヌクレオチド
は、配列番号９で表される塩基配列を含むポリヌクレオ
チドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオ
チドであって、脂肪細胞分化を促進する機能を有し且つ
脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化される性
質を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドで
あり、例えば、ｃＤＮＡが挙げられる。該ポリヌクレオ
チドをヒトのクローン１５８ヌクレオチドと呼ぶ。本発
明のポリヌクレオチドは、配列番号９で表される塩基配
列９で表される塩基配列に対して同一もしくは少なくと
も９０％、９３％、９５％又は９８％の相同性を有する
ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的な
ポリヌクレオチドである。

【００２０】また、本発明のヒトのポリヌクレオチド
は、配列番号９で表される塩基配列の番号１２４から２
５３２を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチドであって、脂肪細胞分化
を促進する機能を有し且つ脂肪細胞分化誘導開始後１２
時間以内に活性化される性質を有するタンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドである。

【００２１】配列番号１で表されるマウスのクローン１
５８ポリヌクレオチドと配列番号９で表されるヒトのク
ローン１５８ポリヌクレオチドとの一致率は、７６．０
（２１６７／２８５１）％となる。

【００２２】前記ヒト由来のｍＲＮＡの配列と配列番号
９で表される塩基配列のヒトポリヌクレオチドの相同性
は２１９３／２５７５、即ち、８５．１７％であり、ま
た、配列番号９で表される塩基配列のヒトポリヌクレオ
チドにおける開始コドンから終始コドンまで（塩基配列
の番号１２４から２５３２まで）と前記公知のヒトのＯ
ＲＦの配列の相同性は、２１２４／２４０９、即ち、８
８．１７％である。

【００２３】配列番号９の観点から、本発明のポリヌク
レオチドは、前記公知のヒトのＯＲＦの配列の相同性
（８８．１７％）の関係から、本発明のポリヌクレオチ
ドは、配列番号９で表される塩基配列に対して同一もし
くは少なくとも８９％、９１％または９３％の相同性を
有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌ
クレオチドに相補的なポリヌクレオチドも含む。

【００２４】前記配列番号９で表されるヒトポリヌクレ
オチドにおける開始コドンから終始コドンまで（塩基配
列の番号１２４から２５３２まで）と前記公知のヒトの
ＯＲＦの配列の相同性（８８．１７％）の関係から、本
発明のポリヌクレオチドは、配列番号９で表される塩基
配列の番号１２４から２５３２に対して同一もしくは少
なくとも９０％、９３％、９５％または９８％の相同性
を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリ
ヌクレオチドに相補的な配列のポリヌクレオチドを含
む。

【００２５】本発明の上記各ポリヌクレオチドは、脂肪
細胞分化誘導開始後１２時間以内、特に６時間前後のマ
ウスの細胞、ヒトの細胞、その他の動物の細胞から抽出
することができる。また、ゲノムＤＮＡ、細胞・組織由
来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリ
ー、合成ＤＮＡの何れからでも本発明のポリヌクレオチ
ドを得ることができる。本発明の「ポリヌクレオチド」
には、ＤＮＡまたはＲＮＡがある。

【００２６】本明細書で単に「クローン」と呼ぶ場合に
は、クローン１５８ヌクレオチド又はクローン１５８ポ
リヌクレオチドを意味することがある。

【００２７】本発明のタンパク質は、脂肪細胞分化誘導
開始後１２時間以内、特に６時間前後に活性化されるタ
ンパク質であって、脂肪細胞分化を促進するタンパク質
である。

【００２８】本発明のタンパク質は、好ましくは、下記
配列番号２で表されるタンパク質のアミノ酸配列の全長
に対して同一もしくは少なくとも９０％、９３％、９５
％または９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタ
ンパク質である。さらに好ましくは、本発明のタンパク
質は、配列番号１で表されるポリヌクレオチドの塩基配
列の番号２３６から２６４４に対して同一もしくは少な
くとも９０％、９３％、９５％または９８％の相同性を
有する塩基配列を含むポリヌクレオチドの遺伝子翻訳産
物である。

【００２９】下記配列番号２で表されるタンパク質のア
ミノ酸配列と１００％の相同性を有する塩基配列を含む
ポリヌクレオチドには、マウスの脂肪細胞分化の初期に
活性化されるタンパク質が挙げられる。該タンパク質を
マウスのクローン１５８タンパク質と呼ぶ。

【００３０】また、本発明のヒトのタンパク質は、配列
番号１０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質であ
る。本発明のタンパク質は、配列番号１０で表されるア
ミノ酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％または
９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
を含む。また、本発明のヒトのタンパク質は、下記配列
番号９で表されるポリヌクレオチドの塩基配列の番号１
２４から２５３２を含むポリヌクレオチドの遺伝子翻訳
産物である。本発明は配列番号１０の観点から、配列番
号１０で表されるアミノ酸配列のタンパク質の全長に対
して少なくとも９０％、９３％、９５％、９７％または
１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む該タンパ
ク質またはその塩を含む。

【００３１】下記配列番号１０で表されるタンパク質
は、ヒトの脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内、特
に、６時間前後に活性化されるタンパク質であって、脂
肪細胞分化を促進するタンパク質である。該タンパク質
をヒトのクローン１５８タンパク質と呼ぶ。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドは、脂肪細胞分
化誘導開始後１２時間以降に発現するタンパク質である
ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα, Ｃ／ＥＢＰδ、ＳＲＥＢＰ
−１の発現に関係し、特に、ＰＰＡＲγの発現に密接に
関係する。本発明のタンパク質は、ＰＰＡＲファミリー
やＣ／ＥＢＰファミリー、ＳＲＥＢＰ−１／ＡＤＤ１な
どの転写因子に直接的あるいは間接的に作用していると
考えられるし、或いはこれ以外の経路を刺激している可
能性も考えられる。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドあるいは、該ポ
リヌクレオチドの遺伝子翻訳産物として生産されるタン
パク質またはペプチドは、肥満、高血圧、高脂血症、糖
尿病、動脈硬化による心臓病や脳卒中等から選ばれる生
活習慣病の治療または診断に有用である。

【００３４】配列の相同性本発明における相同性に関する記載において、例えば、
「配列番号１で表される塩基配列に対して同一もしくは
少なくとも９０％の相同性」とする理由は、http://ww
w.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/にアクセッション番号がＭ
Ｎ＿０３２２７０およびＡＬ１３６９１９で、２３４３
ｂｐの長さで登録されているヒト由来のｍＲＮＡの配列
と、配列番号１で表されるマウスの塩基配列との相同性
は７１．５９％であり、また、配列番号１で表される塩
基配列におけるタンパク質に翻訳される領域（ＯＲＦ、
塩基配列の番号２３６から２６４４まで）と前記公知の
ヒトのＯＲＦの配列の相同性は、７６．６７％であるこ
とから、該ｍＲＮＡの配列を除外するためである。

【００３５】また、本発明の別の発明において「塩基配
列の全長に対して相同性を少なくとも８０％」とする理
由は、マウスとヒトの間にはアミノ酸レベルで８４％の
相同性があることが既に報告されているからである［Y.
Zhangら、Nature, 第３７２巻、第４２５頁（１９９
４）、特開平８−３３３３９４号公報］。高血圧、糖尿
病、肥満などの生活習慣病に関わる遺伝子群は相同性が
動物間で８０％以上保存されていることが分かっている
（特開平１１−７５８６５号公報）ことから、本発明の
ポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質においても
ヒトなどの霊長類、ウサギなどの齧歯類なども本配列を
基本とし、相同性が８０％以上を越えると考えることが
妥当である。該妥当性は、配列番号１で表されるマウス
のクローン１５８ポリヌクレオチドのうち塩基配列の番
号２３６から２６４４までのＯＲＦと配列番号９で表さ
れるヒトのクローン１５８ポリヌクレオチドのうち塩基
配列の番号１２４から２５３２までのＯＲＦとの一致率
が、８７．０９％であることからも実証される。

【００３６】本発明のポリヌクレオチドのクローニング本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのク
ローニングの手段としては、例えば、本発明のタンパク
質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用い
てＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクター
に組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるい
は全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを
用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによっ
て選別することができる。ハイブリダイゼーションの方
法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecula
r Cloning ）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring
Harbor Lab. Press, 1989 ）に記載の方法などに従って
行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用
する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行な
うことができる。クローン化されたタンパク質をコード
するＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制
限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用す
ることができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始
コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳
終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有し
ていてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加するこ
ともできる。

【００３７】ポリヌクレオチドを発現させるベクター等本発明のベクターは、配列番号１で表されるポリヌクレ
オチドに対して同一もしくは少なくとも９０％の相同性
を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリ
ヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有させた
組み換えベクターであり、好ましくは、配列番号１で表
される塩基配列の番号２３６から２６４４に対して同一
もしくは少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列を
含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補
的なポリヌクレオチドを含有させた組み換えベクターで
ある。

【００３８】また、ヒトの脂肪細胞分化に関するポリヌ
クレオチドを含有する本発明のベクターは、配列番号９
で表される塩基配列に対して同一もくしは少なくとも９
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
を含有させた組み換えベクターであり、好ましくは、配
列番号９で表される塩基配列の番号１２４から２５３２
の塩基配列に対して同一もしくは少なくとも９０％の相
同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有さ
せた組み換えベクターである。

【００３９】本発明のポリヌクレオチド配列を有するベ
クターは既知の方法で構築することが可能である。こう
した目的に適したベクターは、本発明のポリヌクレオチ
ドの挿入部位の上流にプロモーター領域を有する。この
プロモーターは既知のものを使用することが可能であ
り、宿主細胞により選択することが可能である。例え
ば、宿主を大腸菌などの細菌にした場合は、ｌａｃプロ
モータ、ｔｒｐプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｔａｃプ
ロモータ、λＰＬプロモータなどを利用することが可能
である。酵母を宿主とする場合には、ＧＡＰＤＨプロモ
ータ、ＡＤＨプロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＰＨ０５
プロモータなどが挙げられる。動物由来の細胞を宿主と
した場合には、ヒトサイトメガロウイルスプロモータ、
ＳＶ４０ウイルス由来のプロモータ、ＥＦ−１αプロモ
ータ、βアクチンプロモータ、メタロチオネインプロモ
ータなどが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドを発
現するベクターにおける本発明のポリヌクレオチドの挿
入部位下流には、転写終結シグナルがあることが望まし
い。さらに、該ベクターには薬剤耐性マーカーなどの識
別マーカーがあることが望ましい。

【００４０】宿主本発明で使用可能な宿主には、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どを用いることができる。

【００４１】エシェリヒア属菌の具体例としては、Esch
erichia coli ＪＭ１０９〔ＡＴＣＣ５３３２３、東洋
紡株式会社製〕、ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ
・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０
９( １９８１) 〕，Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.
Sci.ＵＳＡ），６０巻，１６０( １９６８) 〕，ＪＡ２
２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１
７( １９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９( １９６
９) 〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３
９巻，４４０( １９５４) 〕などが挙げられる。

【００４２】バチルス属菌としては、例えば、バチルス
・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５( １９８３) 〕，２０７−２１〔ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bio
chemistry ），９５巻，８７( １９８４) 〕などが挙げ
られる。

【００４３】酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ- ，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセスポンベ（Schizosaccharo
myces pombe ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、
サッカロマイセスピキアパストリス（Saccharomycespic
jiapastoris ）などが挙げられる。

【００４４】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia ni の卵由来の
High FiveTM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞また
はEstigmena acrea 由来の細胞などが挙げられる。ウイ
ルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx m
ori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが挙げられる。該Ｓｆ細
胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓ
ｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（in
Vivo ）,13, 213-217,(1977) ）などが挙げられる。

【００４５】昆虫としては、例えば、カイコの幼虫など
が挙げられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５
巻，５９２( １９８５) 〕。

【００４６】動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯ
Ｓ−７，Ｖero ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャ
イニーズハムスター細胞ＣＨＯ〔略語：ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ- ）細胞〕，マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マ
ウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞など
が用いられる。

【００４７】形質転換体の製造本発明の形質転換体は、前記組み換えベクターを前記宿
主に保持させたものである。

【００４８】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ），６９巻，２１１
０( １９７２) やジーン（Gene），１７巻，１０７( １
９８２) などに記載の方法に従って行なうことができ
る。

【００４９】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics ），１６８巻，
１１１( １９７９) などに記載の方法に従って行なうこ
とができる。

【００５０】酵母を形質転換するには、例えば、メッソ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology
），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci.ＵＳＡ），７５巻，１９２９( １９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。

【００５１】昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、
例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6,
47-55(1988) ）などに記載の方法に従って行なうことが
できる。

【００５２】動物細胞を形質転換するには、例えば、細
胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２
６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Viro
logy），５２巻，４５６( １９７３) に記載の方法に従
って行なうことができる。

【００５３】形質転換体の培養本発明の形質転換体の培養は以下の条件を考慮したタン
パク質の生成に十分な条件下で、形質転換体を培養する
ことができ、その結果、培地または形質転換体からタン
パク質を回収することができる。

【００５４】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナ
トリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、
酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよ
い。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

【００５５】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。

【００５６】宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約
３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気
や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転
換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホー
ルダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.ら、
「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ），７７巻，４５０５
( １９８０) 〕や０. ５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ
ブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad.Sci.ＵＳ
Ａ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。

【００５７】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換
体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Mediu
m （Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００５８】宿主が動物細胞である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience ），１２２
巻，５０１( １９５２) 〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Virology），８巻，３９６( １９５９) 〕，ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（The Jounal of the Am
erican Medical Association）１９９巻，５１９( １９
６７) 〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding of the Society for the Biological Med
icine ），７３巻，１( １９５０) 〕などが用いられ
る。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約
３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体
の細胞内に本発明のタンパク質を生成せしめることがで
きる。

【００５９】無細胞系によるタンパク質生成上述した形質転換体を培養することによってタンパク質
を生成させる以外に、インビトロテック社（http://ww
w.inbitrotech.co.jp/)の高効率無細胞タンパク質合成
システムやＲｏｃｈｅ社のインビトロトランスレーショ
ン・トランスクリプションシステムなどを用いた無細胞
培養システムを用いることによって、当該タンパク質を
生成させることも可能である。

【００６０】タンパク質の分離精製上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するに
は、例えば、下記の方法により行なうことができる。本
発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出する
に際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を
集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチー
ムおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細
胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の
粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中
に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリト
ンＸ−１００（登録商標、Union Carbide 社製）などの
界面活性剤が含まれていてもよい。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およ
びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主
として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する
方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差
を利用する方法などが用いられる。

【００６１】上記各方法で得られるタンパク質が遊離体
で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる
方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られ
た場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法によ
り、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の存在は、標識したリガンドとの結合実験および特異
抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定
することができる。

【００６２】ヒトホモログのクローニング脂肪細胞分化誘導開始１２時間以内に活性化されるポリ
ヌクレオチドであって、前記に決定した配列番号１で示
されるマウスの全長ＤＮＡ配列をＮＣＢＩＧｅｎｏｍ
ｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅ
Ｄａｔａｂａｓｅ）でホモロジーサーチすることによ
って相同性の高い配列を見出して、ヒトホモログの全長
を予測することができる。ヒトホモログのクローニング
にはＲＴ−ＰＣＲ法などが適用できる。このようにして
予測し、実際にＲＴ−ＰＣＲ法により配列決定を行った
ヒトホモログの全長は、配列番号９で示される塩基配列
である。また、配列番号９で示されるヒトホモログの全
長の塩基配列から、該塩基配列は８０３アミノ酸からな
るタンパク質をコードする遺伝子であり、該タンパク質
のアミノ酸配列は、配列番号１０であると予想される。

【００６３】ヒトホモログの相同性配列番号９で表されるクローン１５８ヒトホモログ（単
に、ヒトホモログと呼ぶときがある）の塩基配列と相同
性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドは、前記
したhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/に、機能が全
く記載されていないヒト由来のｍＲＮＡの配列が該当
し、アクセッション番号がＭＮ＿０３２２７０およびＡ
Ｌ１３６９１９で、２３４３ｂｐの長さで登録されてい
る。

【００６４】配列番号９で表されるヒトホモログと該ヒ
ト由来のｍＲＮＡの全長及びＯＲＦ（タンパク質に翻訳
される領域）の長さの比較を図７に示す。配列番号９で
表される塩基配列の全長と該ヒト由来のｍＲＮＡの塩基
配列の全長との相同性は８５．１７（２１９３／２５７
５）％である。また、配列番号９で表される塩基配列に
おけるＯＲＦの長さは２４０９ｂｐであり、一方、前記
公知のヒトのＯＲＦの長さは２１２４であるので、両者
の配列の相同性は、８８．１７％（２１２４／２４０
９）である。

【００６５】アンタゴニストおよびアゴニストの同定方
法本発明のタンパク質をアンタゴナイズまたはアゴナイズ
する化合物の同定方法は次の工程（ａ）（ｂ）の工程を
含む。（ａ）本発明のタンパク質を発現している細胞または本
発明のタンパク質に応答する細胞に候補化合物を接触さ
せる工程；（ｂ）結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観
察する工程；あるいは候補化合物と接触した細胞の本発
明のタンパク質の活性に関する能力を接触しなかった同
種の細胞と比較する工程。

【００６６】上記同定方法により、本発明のアンタゴニ
スト或いはアゴニストを同定することができる。

【００６７】ポリヌクレオチドの検出方法；ポリヌクレ
オチドによる診断診断対象者の本発明のタンパク質の活性化に関連した、
診断対象者における疾病、またはかかる疾病に対する感
受性の診断は次のように行うことができる。即ち、診断
対象者のゲノム中の本発明のタンパク質をコードしてい
る塩基配列中の変異の存在または不存在を決定するこ
と；および／または該対象者由来の試料中の本発明のタ
ンパク質の存在または量を分析することにより行う。

【００６８】本発明のポリヌクレオチドを検出あるいは
測定するには、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列か
ら連続する８塩基以上１００塩基以下の配列を有するプ
ライマーを合成し、細胞あるいは血液などからｍＲＮＡ
を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡをＤＮＡに変
換しながら増幅する、あるいはＴ７−ｂａｓｅｄｍＲ
ＮＡ増幅法（Van GelderR.N.et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,87:1663-1667,1990）により、目的ポリヌクレオ
チドを増幅し、増幅されたポリヌクレオチドを種々の電
気泳動で検出することが可能である。また、Ｃｙ３−ｄ
ＵＴＰあるいは、Ｃｙ５−ｄＵＴＰをポリヌクレオチド
増幅時に添加して、増幅ポリヌクレオチドを蛍光標識
し、ＤＮＡチップまたはマイクロアレイ等（Brown, P.
O.et al.:Nature Genet.,21 sup.:33-37,1999）により
検出することも可能である。

【００６９】また、抽出したｍＲＮＡの量を定量する方
法としては、蛍光色素を用いた定量的ＰＣＲ法が行われ
る（羊土社ｎｏｎ−ＲＩ実験の最新プロトコール栗
原ら編１９９９８３−８９）。この方法により、細
胞中のｍＲＮＡがどの程度存在するかがわかる。この発
現の程度によって、肥満の状況を把握することができ
る。

【００７０】ＤＮＡチップまたはマイクロアレイ等を用
いて、複数のポリヌクレオチドを同時に検出、測定する
ことも可能である。例えば、糖尿病、高血圧、肥満など
の生活習慣病に関連する、本発明のポリヌクレオチドを
含む複数のポリヌクレオチドを基盤上に結合させてお
き、上述したような方法で、検体から調製した標識ポリ
ヌクレオチドを反応させてどのポリヌクレオチドが活性
化しているのか、存在しているのかということを判定す
ることが可能となる。この判定によって、生活習慣病の
状況を把握し、治療に役立てることが可能になる。ま
た、本発明のポリヌクレオチドを含む複数の肥満関連ポ
リヌクレオチドを基盤上に結合させておき、同様の手技
により、肥満の状況、程度を把握することが可能とな
り、治療に役立てることが可能となる。

【００７１】また、本発明のポリヌクレオチドを検出す
るにはアプライドバイオシステム社のＡＢＩＰＲＩＳ
Ｍ３１０あるいはＰＲＩＳＭ３１００あるいはＰＲＩＳ
Ｍ３７００などを利用したキャピラリー電気泳動による
検出も可能である。

【００７２】ポリヌクレオチド中の特定の核酸塩基が他
の塩基と置換されていることにより、遺伝子産物として
のタンパク質の活性が変化する、本発明のタンパク質の
その受容体への結合能が変化する、或いは該タンパク質
の薬剤に対しての反応性が変化する、或いは該タンパク
質の安定性が変化する、或いは該タンパク質の合成が途
中で停止してしまうなどの、遺伝子多型（single nucle
otide polymorphisms、以下ＳＮＰｓ）が、非常に重要
であることがわかってきているが、本発明のポリヌクレ
オチドにおいても、このＳＮＰｓを検出する意義は非常
に重要である。

【００７３】本発明の脂肪細胞分化関連のポリヌクレオ
チドの高密度のＳＮＰマーカーの遺伝子地図がつくられ
れば，糖尿病の原因遺伝子を特定できるＳＮＰｓを用い
て健康者と患者間の比較が容易にできる．高密度のＳＮ
Ｐマップを使えば家族と関連のない大規模なサンプルを
用いて相関解析（Whole Genome Association Study）が
可能となる。ＳＮＰｓは、特に１塩基が置換することに
より、対応するアミノ酸が変化し、この変化によって本
来の蛋白質の物性の変化が生じる。例えば、酵素におい
ては活性中心近傍のアミノ酸が変化することによる酵素
活性の低下や亢進が挙げられ、受容体であれば受容中心
近傍のアミノ酸が変化することによる結合力の低下や上
昇が挙げられる。それぞれの人の遺伝子多型に応じて、
薬剤の投与量を調整したり、異なる薬剤を選択すること
をテーラードメディシンなどと云われる。

【００７４】本発明のポリヌクレオチドにおけるＳＮＰ
ｓを検出する方法としては、例えば、アメリカNanogen
社（http://www.nanogen.com）のnanochipを用いる方法
（Gillesら、Nature biotechnology 365-370 17 199
9）、ポリヌクレオチド配列を決定する方法（http://ww
w.pyrosequencing.com ）、ＤＮＡチップ又はＤＮＡア
レイを用いた方法、質量分析計を用いる方法（Legler
ら、 Transfusion,36:426-431、1996 ）、プライマーエク
ステンションを用いた方法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（Iannon
e ら、Cytometry,39:131-140,2000 ）などが適用可能で
ある。

【００７５】上記各ポリヌクレオチドの検出のために構
成される診断薬は、配列番号１で表される塩基配列に対
して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩
基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬であ
る。好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の番号
２３６から２６４４に対して同一もしくは少なくとも９
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
を含有する診断薬である。

【００７６】また、配列番号１で表される塩基配列に対
して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩
基配列を含むポリヌクレオチド或いは該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なく
とも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む
診断薬としてもよい。好ましくは、配列番号１で表され
る塩基配列の番号２３６から２６４４に対して同一もし
くは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含む
ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的な
ポリヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の
塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬とする
ことができる。

【００７７】また、ヒトのポリヌクレオチドの検出の観
点にたった診断薬は、配列番号９に表される塩基配列に
対して同一もしくは少なくとも９０％の相同性を有する
塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオ
チドに相補的なポリヌクレオチドを含有する診断薬であ
る。好ましくは、配列番号９で表される塩基配列の番号
１２４から２５３２に対して同一もしくは少なくとも９
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
を含有する診断薬である。

【００７８】また、ヒトのポリヌクレオチドの検出の観
点にたった診断薬は、配列番号９に表される塩基配列に
対して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する
塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオ
チドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少な
くとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含
む診断薬である。好ましくは、配列番号９で表される塩
基配列の番号１２４から２５３２に対して同一もしくは
少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を含むポリ
ヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリ
ヌクレオチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基
配列を有するポリヌクレオチドを含む診断薬である。

【００７９】タンパク質またはペプチドの検出、および
タンパク質またはペプチドに対する抗体の検出、および
診断への応用本発明のタンパク質を検出するには、免疫測定法が一般
的に用いられる。例えば、配列番号２または配列番号１
０で示されるタンパク質、あるいはそれらの各配列に含
まれる３個以上の連続したアミノ酸配列からなるペプチ
ドを、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒ
ツジ、ニワトリなどに免疫して抗体を産生させることが
できる。この免疫を行う際に、通常、アジュバントとい
われる物質を加えるのが一般的である。アジュバントと
しては、フロイントのコンプリートアジュバント、イン
コンプリートアジュバント、明礬など種々の公知のアジ
ュバントを用いることができる。マウスを免疫した場合
では、一定期間免疫を行った後、免疫したマウスの脾臓
を取り出して、抗体産生細胞であるこの脾臓細胞とミエ
ローマ細胞と融合させて、クローニングを行って配列番
号２または配列番号１０のタンパク質を特異的に結合す
る抗体を産生するハイブリドーマを調製する。

【００８０】ハイブリドーマを培養することによって、
産生する抗体を種々の方法で精製し、得られた抗体を固
相に結合させる。これとは別に、該抗体を酵素、蛍光色
素、金属コロイド、ラテックス、ＤＮＡ、ＲＮＡなどで
標識して標識化抗体を得る。前記固相化抗体と該標識化
抗体を、細胞、血液あるいはその分画フラクションを検
体として反応させ、固相に結合した標識物の有無、ある
いは量を測定することにより、検体中の本発明のタンパ
ク質の量を測定することができる。

【００８１】本発明のタンパク質は、脂肪細胞内に特異
的に見出されるために、その量を測定することによって
肥満の程度、状況を把握することが可能となる。

【００８２】検体中に含まれる本発明のタンパク質の量
を測定するには、該タンパク質あるいは該タンパク質の
一部となるペプチドを抗原として、家兎、ネズミ、ヒツ
ジ、ヤギなどに免疫して抗体を調製する（この場合、特
定の認識部位に結合することが出来るモノクローナル抗
体を調製することも含まれる。）。ここで得られた抗体
を、ポリスチレン、ラテックス、ニトロセルロースなど
の材質のものに物理的に吸着させる、あるいは、抗体に
ビオチンを予め導入しておき、固相に予め結合させてお
いたストレプトアビジンまたはアビジンなどと反応させ
て固相を調製する、あるいは、固相上に存在するカルボ
キシル基、アミノ基、スルフヒドリル基などを介して、
抗体を共有結合させることにより、抗体結合固相を調製
する。ここで得られた抗体結合固相と、細胞、血液ある
いはその分画フラクションを検体として反応させ、検体
中に含まれる抗原を固相に結合させ、次いで、抗体結合
固相に結合した抗原に、上述した工程によって調製した
抗体に、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、核酸、ビオ
チンなどの標識を結合させた標識抗体を反応させる。な
お、抗体結合固相と検体と標識抗体を反応させる工程
は、同時に行うこともできる。こうして固相に結合した
標識物を、測定することによって検体中に含まれる該タ
ンパク質を測定することが出来る。

【００８３】抗体を検出する方法は、これとは別に以下
のような方法でも可能である。すなわち、本発明のタン
パク質あるいは該タンパク質の一部となるペプチドを抗
原として固相化して抗原固定化固相とし、次いで、該抗
原固定化固相に対して、抗原に標識した物質と、細胞、
血液あるいはその分画フラクションを検体として反応さ
せ、結合した標識物を、定量することによって、検体中
に含まれる抗体量を測定することができる。したがっ
て、本発明のタンパク質に対して免疫学的に特異的な抗
体を検出する診断薬を構築できる。

【００８４】以上、いずれも抗原あるいは抗体を直接固
相化した反応系を説明したが、米国特許第５，７８９，
１６５のように、固相にオリゴヌクレオチドを結合させ
ておき、このオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌク
レオチドを結合させた抗原あるいは抗体を結合させた反
応系も適用可能である。さらに、特開平１０−２５３６
３２号公報、ＥＰ０９０５５１７Ａ１の記載にあるよう
に、異なる項目を同時に検出あるいは測定することも可
能となる。例えば、糖尿病、高血圧、肥満などの生活習
慣病に関連するマーカーを同時に検出することにより、
どのタンパク質がどの程度検出されるかによって生活習
慣病がどの程度のレベルであるのかを判断することも可
能になると考えられる。また、肥満関連のタンパク質あ
るいはペプチドなどのマーカーを同時に検出、測定する
ことによって、肥満の状況を把握し治療に役立てること
も可能になると考えられる。

【００８５】本発明のタンパク質、あるいは該タンパク
質に対する抗体を免疫学的に検出するためには上述した
方法以外に、免疫凝集法による方法（特開平６−３３５
８号公報）、Biacore International AB（スウェーデ
ン）社（http://www.biacore.co.jp）のBIAcore などに
よる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance
＝SPR ）による方法、水晶発振子を用いた方法（特開平
９−２９２３９７号公報）、などによる方法が挙げられ
る。

【００８６】以上の本発明のタンパク質を検出するため
のに構成される診断薬は、本発明のタンパク質またはそ
の塩を含有している診断薬が挙げられる。また、好まし
い態様の本発明の診断薬は、本発明のタンパク質または
その塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるタ
ンパク質またはペプチドを含む診断薬が挙げられる。ま
た、本発明のタンパク質を検出するための別の診断薬
は、本発明のタンパク質に対する抗体を含有する診断薬
が挙げられる。

【００８７】治療目的の使用本発明は、過剰または不十分な量の本発明のタンパク質
あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドの活性
に関連する、肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿病、腎
臓疾患、インスリン耐性、脂肪異栄養、ＣＮＳ疾患、並
びに動脈硬化による心臓病又は脳卒中、等の生活習慣病
のごとき異常な状態の治療方法を提供する。本発明のタ
ンパク質あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチ
ドの活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いることが
できる。

【００８８】１つの手段は、有効量の上記阻害剤化合物
（アンタゴニスト）を医薬上許容される担体と調合して
なる医薬を治療対象者に投与して、本発明のタンパク質
あるいはペプチドへのリガンドの結合をブロックするこ
とあるいは第２のシグナルを阻害することにより活性化
を阻害し、そのことにより異常な状態を改善することを
特徴とする。

【００８９】他の手段は、本発明のポリヌクレオチドを
活性化する治療上有効量の化合物（すなわち、アゴニス
ト）を医薬上許容される担体と調合してなる医薬を投与
し、そのことにより異常な状態を改善することを特徴と
する。

【００９０】もう１つのアプローチにおいて、本発明の
タンパク質あるいはペプチドと競争してリガンドに結合
する能力を有している可溶性形態の本発明のタンパク質
あるいはペプチドまたはそれらの塩を投与してもよい。
かかる競争物質の典型的な具体例は本発明のタンパク質
あるいは該タンパク質の一部を構成するペプチドを含
む。即ち、本発明の医薬は該タンパク質或いはその塩、
または該タンパク質或いはその塩の連続する少なくとも
５個のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬とすること
ができる。

【００９１】このような本発明の医薬は、配列番号２で
表されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なく
とも９０％の相同性を有するタンパク質またはその塩を
含む医薬、或いは該タンパクの連続する少なくとも５個
のアミノ酸からなるペプチドを含む医薬である。

【００９２】また、本発明の医薬は、配列番号１０で表
されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくと
も９０％の相同性を有するタンパク質またはその塩を含
む医薬、或いは該タンパクの連続する少なくとも５個の
アミノ酸からなるペプチドを含む医薬である。

【００９３】さらにもう１つのアプローチにおいて、発
現ブロック法を用いて本発明のポリヌクレオチドまたは
該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを投与
して、遺伝子の活性化を阻害してもよい。

【００９４】このような本発明の医薬は、配列番号１で
表されるクローン１５８ポリヌクレオチドの塩基配列に
対して同一もしくは少なくとも９０％の相同性を有する
塩基配列を含むポリヌクレオチド、または該ポリヌクレ
オチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬であ
る。さらに好ましくは、配列番号１で表される塩基配列
の番号２３６から２６４４に対して同一もしくは少なく
とも９０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレ
オチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチドを含有する医薬である。

【００９５】また、配列番号１で表される塩基配列に対
して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩
基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なく
とも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む
医薬としてもよく、さらに好ましくは、配列番号１で表
される塩基配列の番号２３６から２６４４番目に対して
同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配
列を含むポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドに対し、相補的であり且つ
連続する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌク
レオチドを含む医薬としてもよい。

【００９６】特に、ヒトのクローン１５８ポリヌクレオ
チドについては、配列番号９で表される塩基配列に対し
て同一もしくは少なくとも９０％の相同性を有する塩基
配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドを含有する医薬である。好
ましくは、配列番号９で表される塩基配列の番号１２４
から２５３２番目に対して同一もしくは少なくとも９０
％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドま
たは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを
含有する医薬である。

【００９７】また、配列番号９で表される塩基配列に対
して同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩
基配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチ
ドに相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なく
とも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む
医薬としてもよく、さらに好ましくは、配列番号９で表
される塩基配列の１２４から２５３２番目に対して同一
もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列を
含むポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチドに相
補的なポリヌクレオチドに対し、相補的であり且つ連続
する少なくとも１０個の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドを含む医薬としてもよい。

【００９８】これらの医薬は、翻訳開始コドンであるＡ
ＴＧの前後の配列のアンチセンスを治療薬に利用するも
のである。これらの医薬には公知の方法で、細胞内で生
成した、あるいは別個に投与された、アンチセンス配列
を用いることができる。例えば、Oligodeoxynucleotide
s as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRCPr
ess,Boca Raton, FL(1988) 中、O'Connor,J.Neurochem
(1991)56:560。別法として、遺伝子とともに三重らせん
を形成するオリゴヌクレオチドを提供してもよい。例え
ば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Coone
y et al.,Science(1988)241:456;Dervan et al.,Scienc
e(1991)251:1360 。これらのオリゴマーはそれ自体投与
することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで
活性化させることもできる。

【００９９】別法として、遺伝子治療を用いて、治療対
象者中の細胞による本発明のポリヌクレオチドの細胞内
での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記のごと
く本発明のポリヌクレオチドを処理加工して複製欠損レ
トロウイルスベクターに入れて活性化するようにしても
よい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、本
発明のタンパク質をコードしているＲＮＡを含むレトロ
ウイルスプラスミドベクターでトランスダクションした
パッケージング細胞中に導入して、次いでパッケージン
グ細胞が目的のポリヌクレオチドを含む感染性ウイルス
粒子を生成するようにしてもよい。これらのプロデュー
サー細胞を治療対象者に投与して細胞をインビボで処理
加工して、インビボでタンパク質を活性化するようにし
てもよい。遺伝子治療の方法には、Human Molecular Ge
netics,T.Strachan and A.P.Read,BIOS Scientific Pub
lishers Ltd(1986) 中、第２０章、Gene Therapy and o
ther Molecular Genetic-based Therapeutic Approache
s （およびその中の引用文献）が適用可能である。

【０１００】配列番号２で表されるタンパク質の全長に
対して同一もしくは少なくとも９０％の相同性を有する
タンパク質或いは該タンパク質を構成するアミノ酸配列
の一部からなるペプチドに対して免疫学的に特異的な抗
体を含有させて医薬とすることができる。また、配列番
号１０で表されるタンパク質の全長に対して同一もしく
は少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質或いは
該タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペ
プチドに対して免疫学的に特異的な抗体を含有させて医
薬とすることができる。このような抗体を投与した場合
には、脂肪細胞分化活性を減弱させることが期待でき
る。

【０１０１】処方および投与本発明のタンパク質の増強された活性化を必要とする治
療対象者の治療方法においては、可溶性形態の前記本発
明のタンパク質、または該タンパク質の一部を構成する
ペプチド、またはそれらの塩、ならびに該タンパク質ま
たは該タンパク質の一部を構成するペプチドに対する抗
体、アゴニスト、アンタゴニストペプチド、またはそれ
らの小型分子の治療上有効量を医薬として治療対象者に
投与してもよい。

【０１０２】かかる処方は、治療上有効量の前記物質、
またはそれらの塩、および医薬上許容される担体または
賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライ
ン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられる
が、これらに限らない。処方は投与経路に適したものと
すべきであり、当業者によく知られている。さらに本発
明は、上記本発明成分の１種またはそれ以上を充填し
た、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パック
およびキットにも関する。

【０１０３】本発明のタンパク質および他の化合物を単
独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の
化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与
の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含す
る。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を
用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆
汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき
浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さら
に、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるな
らば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は
局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の
形態であってもよい。

【０１０４】必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、
処方の性質、治療対象者の症状の性質、および担当医師
の判断による。適当な用量は治療対象者の体重１ｋｇあ
たり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしなが
ら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざま
な有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思
われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量
が必要であると考えられる。当該分野においてよく理解
された最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれ
らの用量の変更を行うことができる。

【０１０５】しばしば「遺伝子治療」と称される上記治
療方法において、治療に使用する本発明のタンパク質を
治療対象者中において生成させることもできる。よっ
て、例えば、レトロウイルスプラスミドベクターを用い
ることにより、タンパク質をコードしているＤＮＡまた
はＲＮＡのごときポリヌクレオチドを用いて治療対象者
由来の細胞をエクスビボで処理加工してもよい。次い
で、処理された細胞を治療対象者に導入する。

【０１０６】

【実施例】〔実施例１〕脂肪細胞への分化の確認マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−９
２．１．）を、基本培地（ＤＭＥＭ, 40μg/ml KM, 10%
Calf Serum ）を用いて５％ＣＯ₂、３７℃において
collagen type I dish (FALCON社製) 中で培養した。細
胞がコンフレントに達してから２日間おき、細胞が休止
期に入った後、培地を分化誘導培地（ＤＭＥＭ, 40μg/
ml KM, 10% FBS, 0.5mM １−メチル−３−イソブチルキ
サンチン（以下、Mix と呼ぶ）、１０μg/ml インシュ
リン、１μM Dexamethasone(以下、Dex と呼ぶ）に変え
この分化条件において４８時間培養し、培地を分化促進
培地（ＤＭＥＭ, ４０μg/ml KM,１０％ FBS, ５μg/ml
insulin）に変えた。２日おきに分化促進培地で培地交
換を行った。4 日目頃から小さな脂肪滴を含み始め、一
週間後には成熟した脂肪細胞へ分化することを確認し
た。

【０１０７】〔実施例２〕ｍＲＮＡの調製脂肪細胞分化誘導前と分化誘導開始３時間後のマウス３
Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−９２．
１．）からTRIzol（GIBCO BRL 社製）を用いて、TRIzol
（GIBCO BRL 社製）に添付されている取扱説明書に従い
全量ＲＮＡを調製した。この全量ＲＮＡからOligotex-d
T ３０( 第一化学薬品社製) を用いて、添付されている
取扱説明書に従ってｍＲＮＡを調製した。

【０１０８】〔実施例３〕PCR-select cDNA Subtraction 法による脂肪細胞分化誘
導後３時間目の活性化の測定公知のPCR selectｃＤＮＡ subtraction kit (CLONTECH
Laboratories 社製)に従って以下のｉ）−viii）工程
を行った。

【０１０９】ｉ）テスターｃＤＮＡ、ドライバーｃＤＮ
Ａの合成脂肪細胞分化誘導前のｍＲＮＡをドライバーｍＲＮＡと
し、分化誘導３時間後のｍＲＮＡをテスターｍＲＮＡと
した。これらのドライバーｍＲＮＡおよびテスターｍＲ
ＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで、２本鎖のド
ライバーｃＤＮＡ、テスターｃＤＮＡを合成した。

【０１１０】ii) 制限酵素RsaIによる２本鎖ｃＤＮＡの
切断前記工程ｉ）で得られた２本鎖のドライバーｃＤＮＡと
テスターｃＤＮＡの各々を制限酵素RsaIで切断し、平滑
末端（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）の断片を作った。

【０１１１】iii)アダプターのライゲーション前記工程 ii)で得られた切断されたテスターｃＤＮＡを
二つのグループに分け、一方にアダプター１をライゲー
ションし、他方にアダプター２をライゲーションした。

【０１１２】iv）ファーストハイブリダイゼーション前記工程iii)で得られたアダプターをライゲーションし
た２種類のテスターｃＤＮＡと過剰量のドライバーｃＤ
ＮＡとの間で別々にハイブリダイゼーションを行った。

【０１１３】ｖ）セカンドハイブリダイゼーションさらに過剰量のドライバーｃＤＮＡと、前記 iｖ）工程
で得られたドライバーｃＤＮＡをハイブリダイズしてな
る２種類のテスターｃＤＮＡを合わせ、ハイブリダイゼ
ーションを行った。

【０１１４】vi) ファーストＰＣＲ前記 iv)工程で得られたハイブリダイズされたテスター
ｃＤＮＡを２種類のアダプター部位間で共通なプライマ
ーを用いてＰＣＲ法を行ってＤＮＡを増幅させた。

【０１１５】vii)セカンドＰＣＲ最後に２種類のアダプター部位に特異的な２種類のプラ
イマーを用いてＰＣＲ法を行いＤＮＡを増幅させた。

【０１１６】ドライバーｃＤＮＡとハイブリダイズして
なるテスターｃＤＮＡは増幅されなかった。一方、テス
ター特異的、つまり分化誘導３時間後に活性化が増加し
ているポリヌクレオチド（遺伝子）のみ増幅された。

【０１１７】〔実施例４〕ＰＣＲ産物のサブクローニング及びマウスのクローン１
５８のプラスミド図１にクローン１５８マウスｃＤＮＡの略図を示す。前
記実施例３のサブトラクション法で得られたセカンドＰ
ＣＲ法を行った後の増幅されたポリヌクレオチドを含む
反応液をフェノール抽出、ＣＩＡＡ抽出後、ＥｔＯＨ沈
殿を行い、ＤＮＡのペレットを滅菌水17μl に溶解し、
１０units のRsaIで１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 7.
5）, １０mM ＭｇＣｌ₂,１mMＤＴＴ条件下、３７℃一
晩反応させアダプターを切断した。０．７％アガロース
ゲルで電気泳動後、ＤＥ８１（Whatman 社製）を用いて
精製して、ＤＮＡ断片Ｓｕ（図１参照）を得た。

【０１１８】該ＤＮＡ断片Ｓｕの情報を元にプライマー
を設計し、５’−ＲＡＣＥを行った結果、約７００ｂｐ
のバンドか得られたので、これを回収してヌクレオチド
Ｒ−５’と呼んだ（図１参照）。該ヌクレオチドＲ−
５’をＴベクター（pBluescript KS +) にサブクローニ
ングして、ＤＳＱ−１０００（島津製作所社製）によ
り、塩基配列を決定した。一方、３’−ＲＡＣＥを行う
ことにより約２ｋのバンドが得られたのでこれを回収
し、Ｔベクターにサブクローニングしてこの領域の塩基
配列を決定した。また、3 ’側にはポリA があることが
明らかになった（図１参照）。

【０１１９】以上のようにして、マウスのクローン１５
８のｃＤＮＡ全長の単離を目的に５’−ＲＡＣＥおよび
３’−ＲＡＣＥを行った結果、２８５１ｋｂｐのポリヌ
クレオチドを得た。該ポリヌクレオチドをクローン１５
８ポリヌクレオチド（単に、クローン１５８と呼ぶこと
がある。）と呼ぶ。該ポリヌクレオチドの塩基配列を配
列表１に示す。該塩基配列について、翻訳開始コドンの
コンセンサスであるコザック配列と比較すると２３６塩
基目のＡＴＧの周りの配列が類似していたので、これを
翻訳開始コドンと仮定した。マウスのクローン１５８ア
ミノ酸配列を配列番号２に示す。

【０１２０】既存塩基配列、アミノ酸配列との比較マウスのクローン１５８の塩基配列およびマウスのクロ
ーン１５８タンパク質のアミノ酸配列について、Genban
k 、EMBL、EST 、SwissProt の各々のデータベースでホ
モロジー検索を行った。FASTA およびBLASTNを行った結
果、クローン１５８の塩基配列については登録されてい
る機能が既知のポリヌクレオチドとは同一性が無く、前
駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化する際に特異的に活性化さ
れるポリヌクレオチドとして新規の物質であることが分
かった。

【０１２１】また、BLASTNP を行った結果、クローン１
５８タンパク質のアミノ酸配列についても登録されてい
る機能が既知のタンパク質とは同一性が無く、前駆脂肪
細胞が脂肪細胞に分化する際に特異的に活性化されるタ
ンパク質として新規の物質であることが分かった。

【０１２２】５’末端を脱リン酸化したpBluescript KS
+/EcoRV ベクター５０ngとクローン１５８ポリヌクレオ
チド７５ｎｇをそれぞれライゲーション反応を行った。
ライゲーション反応液１．２μl をコンピテントセルと
してEscherichia coli ＤＨ５α〔ＡＴＣＣ５３８６
８、東洋紡株式会社製〕にheat shock法によりトランス
フォームして、サブクローニングされたクローン１５８
のプラスミドを得た。本実施例４で製造された形質転換
体は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研
究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−７８５
９として寄託されている。

【０１２３】〔実施例５〕インサートの回収およびプローブの作製前記実施例４で得られたサブクローニングされたクロー
ン１５８のプラスミドをMolecular Cloning に記載の方
法に従いアルカリＳＤＳ法により調製し、このプラスミ
ドを制限酵素XbaI, HindIII で切断後、１．０％アガロ
ースゲルで電気泳動し、インサートに相当するバンドを
ＤＥ８１（Whatman 社製）を用いて回収した。５０〜１
００ngのＤＮＡ断片をBcaBEST ^TM Labeling kit （TaKa
Ra社製）を用いて［α-³²P］dCTP（Amersham Pharmacia
biotech社製）で標識し、標識プローブを得た。得られ
た標識プローブをSephadex G-50 （Amersham Pharmacia
biotech社製）を用いたカラムに通し、³²Ｐ標識プロー
ブを調製した。

【０１２４】〔実施例６〕ノザンブロット解析脂肪細胞分化誘導開始前（０時間）と分化誘導開始０．
５、１、３、６、１２、２４時間後のマウス３Ｔ３−Ｌ
１細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−９２．１．）からそ
れぞれ調製した総ＲＮＡ２５μg を１％変性ゲル（２％
formaldehyde，１×Mops, １％アガロース）で電気泳
動した。ゲルを５０mM NaOH ２５分（アルカリ変性）、
２００mM NaOAc（pH４．０）、４０分 (中和) 処理後、
RNA をHybondN+（Amersham Pharmacia biotech社製）に
トランスファーした。トランスファーは１２時間以上行
い、バッファーは２０×SSC を用いた。トランスファー
したフィルターを５０mM NaOH ，５分間処理後、２×SS
C で洗浄し、８０℃、２時間乾燥させた。その後、UV照
射を行い固定した。

【０１２５】ハイブリダイゼーションバッファー (５×
SSPE,５０％ formaldehyde , ５×Denhalt's, ０．１
％ SDS, ２０μg/ml salmon sperm ＤＮＡ) で４２℃一
晩、プレハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダ
イゼーションバッファーを新しく変えた後、熱変性した
プローブを加え４２℃一晩、ハイブリダイゼーションを
行った。その後、フィルターを一次洗浄液（２× SSPE
０．１％ SDS）を用いて室温で１０分間、さらに一次洗
浄液を用いて５５〜６５℃で１５分間、二次洗浄液（１
× SSPE ０．１％ SDS）を用いて６５℃で１５分間、三
次洗浄液（０．５× SSPE ０．１％ SDS）を用いて６５
℃で１０分間の条件で洗浄し、オートラジオグラフィー
を行った。得られた結果を、図２に示す。

【０１２６】図２のオートラジオグラムによれば、クロ
ーン１５８より調製した標識プローブは、脂肪細胞分化
誘導開始前（０時間）の細胞から調製したｍＲＮＡとは
反応しないが、分化誘導開始６時間目をピークとして、
３時間目から１２時間目の細胞から調製したｍＲＮＡは
反応することが分かった。このことから、クローン１５
８にクローニングされている配列は、脂肪細胞分化に特
異的に活性化されている配列であることがわかった。

【０１２７】〔実施例７〕ｍＲＮＡの局在部位の特定ｉ）プラスミドの構築配列番号１で示されるクローン１５８のポリヌクレオチ
ドの全長をＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、回収精製後、Ｇ
ＦＰ発現ベクターである、pEGFP （Clontech社製）にサ
ブクローニングした。

【０１２８】ii）プラスミドの精製前記のサブクローニングしたプラスミドを、Triton lys
is法により、塩化セシムを用いて２回超遠心分離を行
い、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを精製した。

【０１２９】iii ）トランスフェクション lipofectamine (GIBCO BRL社製) 法を用い、前記工程で
得られたスーパーコイルプラスミドＤＮＡをマウスＮＩ
Ｈ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅ５６１１細胞（ＪＣＲＢ０６１
５）にトランスフェクションした。トランスフェクトさ
れた細胞を２日後にPBS(-)で３回洗浄した。次いで、径
６ｃｍのシャーレに収容されている３％パラホルムアル
デヒドを含むＰＢＳ３ｍｌで３０分間処理して細胞を固
定した。次いで、細胞をＰＢＳで二回洗浄し、洗浄後蛍
光顕微鏡（BX-50 、OLYMPUS 社製）でＧＦＰの発現を観
察した。図３（ｃ）は、上記工程により細胞内に発現し
たＧＦＰを示す顕微鏡写真である。図３（ａ）は対照と
して細胞全体を写した顕微鏡写真である。図３（ｂ）は
ＤＡＰＩ法により細胞質内の核のみを染色した顕微鏡写
真である。

【０１３０】図３（ａ）〜（ｃ）の写真を比較すると、
クローン１５８タンパク質をコードするｍＲＮＡは細胞
質内全域に存在することがあきらかになった。

【０１３１】〔実施例８〕アンチセンス配列発現によるクローン１５８タンパク質
生成阻害の脂肪細胞分化への影響本実施例８における実験材料および、培地組成は以下の
通りとした。実験材料：マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−９
２．１．）ダルベッコ変法イーグルMEM 培地（略語：ＤＭＥＭ）
（日水製薬株式会社製） Calf Serum（大日本製薬社製、GIBCO BRL 社製） Fetal Bovine Serum（略語：ＦＢＳ）（GIBCO BRL 社
製） 1-methyl-3-isobutylxanthine （略語：Ｍｉｘ）（ナカ
ライテスク社製） insulin （Ｓｉｇｍａ社製） dexamethasone （略語：Ｄｅｘ）（Ｓｉｇｍａ社製） kanamycin （略語：ＫＭ）（明治製菓株式会社製）培地組成：・基本培地：ＤＭＥＭ, ４０μg/ml KM 、１０％ Calf
Serum ・分化誘導培地：ＤＭＥＭ, ４０μg/ml KM 、１０％ F
BS, ０．５mM Mix、１０μg/ml insulin, １μM Dex ・分化促進培地：ＤＭＥＭ, ４０μg/ml KM 、１０％ F
BS, ５μg/ml insulinMix は０．５ＭとなるようにＤＭ
ＳＯに溶解後、５ｍＭとなるようにＤＭＥＭ(１０％FB
S)に溶解しフィルター滅菌した。Dex は２５ｍＭとなる
ようにethanol に溶解後、０．５ｍＭとなるようにＤＭ
ＥＭ (10% FBS)に溶解しフィルター滅菌した。insulin
は10mg/ml となるように０．１ＭＨＣｌ／ＰＢＳ (-)
に溶解しフィルター滅菌した。

【０１３２】ｉ）プラスミドの構築配列番号１で示される塩基配列の番号２３１から５９０
までを配列番号３で表される塩基配列のオリゴヌクレオ
チドを上層プライマーとし、配列番号４で表される塩基
配列のオリゴヌクレオチドを下層プライマーとしてAmpl
i Taq Gold (Perkin-Elmer社製) を用いてＲＴ−ＰＣＲ
により増幅した。ＰＣＲ生成物をphenol抽出、CIAA抽
出、EtOH沈殿を行い、制限酵素KpnI, XhoIで切断した。
１．０％ agarose gelで電気泳動し、ＤＥ８１（Whatma
n 社製）で回収精製後、ｐＯＰＲＳＶ１／ＭＣＳ(STRAT
AGENE 社製のLacSwitch Inducible Mammalian Expressi
on System(Code No.SC217450) に含まれる）のKpnI, Xh
oI部位にサブクローニングした。トランスフォームには
大腸菌XL1-Blue MR strain(STRATAGENE 社製) を用い
た。塩基配列は、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Ap
plied biosystems社製)により確認した。

【０１３３】ii) プラスミドの調製トランスフェクションに用いたプラスミドは、Triton l
ysis法により調製した。大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲ
(STRATAGENE 社製のLacSwitch Inducible Mammalian Ex
pression System(Code No.SC217450) に含まれる）を２
００ｍｌの系で３７℃で一晩振とう培養した。培養液を
５，０００ｒｐｍ (TOMY社製 TA-1), ４℃で１０分間遠
心し、沈殿をsucrose buffer [20% sucrose,２ｍＭ Tri
s-HCl (pH8.0)]に懸濁後、２ｍｌのlysozyme solution
[5mg/ml lysozyme, ２５ｍＭ Tris-HCl (pH8.0)]を加
え、４℃５分間放置した。氷冷した0.25M EDTA (pH8.0)
1mlを加え４℃５分間放置し、Triton lysis mixture
(0.3% TritonX-100, 0.187M EDTA, 0.16M Tris-HCl)８
ｍｌを加え45℃１０分間インキュベートした。３，００
０ｒｐｍ(Beckmann 社製型式 50.2Ti), ４℃３０分間
遠心分離後、上清を５０ｍｌチューブに移し０．１容量
の５ＭＮａＣｌと１容量のｐｈｅｎｏｌ／ＣＩＡＡを
加え、２００回穏やかに混ぜ、３，０００ｒｐｍ (TOMY
社製 TS-7), ２０分間室温で遠心した。水層を５０ｍｌ
チューブに移し１容量のエタノールを加え、−２０℃１
時間放置後、３，０００ｒｐｍ (TOMY社製 TS-7), ２０
分間４℃で遠心した。沈殿を７０％エタノールで洗浄し
乾燥させＴＥ２ｍｌに溶かし、５ｍｇ／ｍｌＲＮａｓ
ｅ溶液１３μｌを加え、５０℃３０分間インキュベート
した。２ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイド溶液１６７μ
ｌとＣｓＣｌ２．４ｇを加えた後、７５，０００ｒｐｍ
(Beckmann 社製TLN-100), ２０℃１４時間超遠心を行っ
た。スーパーコイルプラスミドＤＮＡのバンドを注射筒
で抜き取り、再度９８，０００ｒｐｍ(Beckmann 社製TL
N-100), ２０℃４時間超遠心を行った。再びスーパーコ
イルプラスミドＤＮＡのバンドを注射筒で抜き取り、イ
ソアミルアルコールでエチジウムブロマイドを完全に除
き、STE buffer [5mM NaCl, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1
mM EDTA (pH8.0)]で一晩透析後、試料として用いた。

【０１３４】iii) ３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養基本培地を用いて５％ＣＯ₂、３７℃において３Ｔ３−
Ｌ１細胞（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−９２．１．）を培養
した。

【０１３５】iv) トランスフェクションおよびstable t
ransformant の作製１日目：３Ｔ３−Ｌ１細胞を7x 10⁵cells/10cm dish (c
ollagen type I dish)にまいた。２日目：下記のＡとＢをピペッティングで穏やかに混
ぜ、30分間室温に放置した。ＤＭＥＭ（serum free）
５．６ｍｌを加え、ＤＭＥＭ（serum free）で一度洗浄
した細胞に添加した。３７℃５％ＣＯ₂条件下５時間イ
ンキュベート後、ＤＭＥＭ（20%Calf Serum ）７ｍｌを
添加しさらに１４時間培養した。 A. ＤＮＡ＋ＤＭＥＭ (serum free)７００μl １．対照：ｐＯＰＲＳＶ１／ＭＣＳ (STRATAGENE) ７μg ｐＣＭＶＬａｃＩ (STRATAGENE) ７μg ２．クローン１５８アンチセンス: ｐＯＰＲＳＶ１／ＭＣＳ−ＴＣ１０ａｎｔｉｓｅｎｓｅ７μｇｐＣＭＶＬａｃＩ７μｇＢ. lipofectamine （GIBCO BRL 社製）４２μｌ＋ＤＭ
ＥＭ(serum free)７００μl ３日目：PBS(-)で一度洗浄後、培地をＤＭＥＭ (10% Ca
lf Serum) に変え一晩培養した。４日目：培地を選択培地［ＤＭＥＭ (10% Calf Serum,
40μg/ml KM), 400 μg/ml G４１８（ナカライテスク社
製), 150μg/mlハイグロマイシン (Boehringer Mannhei
m 社製）に変え、細胞を段階希釈してまき直した。その
後、2 〜3 日置きに選択培地を交換した。選択培地に変
えてから１２〜１４日目ごろに、直径5mm程度に成長し
たコロニーを新しいdishに植え換え、選択培地で培養し
て、stabletransformant を得た。

【０１３６】クローン１５８アンチセンスｍＲＮＡの脂
肪細胞分化に対する影響ｉ）ＩＰＴＧの添加前記工程で作製したstable transformant のクローン１
５８のｍＲＮＡを発現させることによりクローン１５８
のｍＲＮＡの量を脂肪分化誘導開始０時間と、開始後３
時間について、アンチセンスの発現を引き起こすＩＰＴ
Ｇの添加したもの（＋）と、添加しないもの（−）につ
いてＲＴ−ＲＣＲ法を用いて測定した。その結果を図４
のグラフに示す。図４によれば、ＩＰＴＧの添加により
クローン１５８のバンドが約４０％減少していること、
即ち、本発明のクローン１５８のｍＲＮＡの発現が約４
０％抑制されていることがわかる。

【０１３７】ii) クローン１５８のアンチセンスｍＲＮ
Ａの脂肪分化に対する影響培地２ｍｌを除かずに、氷冷した４％ paraformaldehyd
e/PBS(-) １ｍｌを加え、室温で20分間放置した。培地
を除き、氷冷した４％ paraformaldehyde/PBS(-) １．
５ｍｌを加え、室温で１時間放置した。蒸留水で2 、3
回洗浄し、分化誘導から８日目にオイルレッドＯにより
染色した。室温で1 時間放置した。蒸留水で2 、3 回洗
浄後、風乾し顕微鏡 (BX-50, OLYMPAS社製) で観察し
た。コントロールとしてクローン１５８を導入していな
いベクターについて上記と同様にして観察した。その結
果、コントロールにおいては脂肪滴が蓄積され、ＩＰＴ
Ｇの添加によっても変化はなかったが、クローン１５８
アンチセンスではアンチセンスの発現を引き起こすＩＰ
ＴＧの添加により、脂肪滴の蓄積が阻害された。

【０１３８】クローン１５８のアンチセンスｍＲＮＡの
ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰδ、ＳＲＥＢＰ
−１の発現に対する影響前記「クローン１５８のアンチセンスｍＲＮＡの脂肪細
胞分化に対する影響」の実験によれば、クローン１５８
のアンチセンスｍＲＮＡを発現することで脂肪滴蓄積が
阻害されたことが分かった。そこで、脂肪細胞分化過程
で発現が増加し、分化のマーカー遺伝子として認識され
ている遺伝子のうち、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／
ＥＢＰδ、ＳＲＥＢＰ−１の発現に変化がみられるかど
うかの検討を次のようにして行った。

【０１３９】i) 脂肪細胞誘導前記実施例１に準じて行った。

【０１４０】ii) ＩＰＴＧの添加前記ＩＰＴＧの添加に準じて行った。

【０１４１】iii) プローブの作製ＰＰＡＲγ：ｐＳＶＳＰＯＲＴ／ｍｏｕｓｅＰＰＡＲ
γ（Dana-Farber Cancer Institute, Bruce M. Spiegel
man 博士よりご供与）を制限酵素ＸｂａＩ，ＨｉｎｄII
I で切断し、０．８％ agarose電気泳動後、ｃＤＮＡに
相当するバンドをDE81（Whatman 社製）で回収精製した
（Tontonz P, Hu E, Graves RA; Budavrai AI, Spiegel
man BM; mPPAR gamma 2:脂肪細胞エンハンサの組織- 特
異的な調節因子。 Genes Dev. 8: 1224-34, 1994）。

【０１４２】Ｃ／ＥＢＰα：ｐＥＭＢＬ１９／ＭＳＶ−
ｒａｔＣ／ＥＢＰα（McKnight博士よりご供与) を制
限酵素PstIで切断し、０．８％ agarose電気泳動後、ｃ
ＤＮＡに相当するバンドをDE81（Whatman 社製）で回収
精製した（Cao Z, Umek RM Mcknight SL. 脂肪転換中の
3 つのC/EBP アイソフォームの調節発現； Genes Dev.
5: 1538-52, 1991）。

【０１４３】Ｃ／ＥＢＰδ：ｐＢＳ／ＭＳＶ−ｍｏｕｓ
ｅＣ／ＥＢＰδ（McKnight博士よりご供与) を制限酵
素ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１で切断し、０．８％アガ
ロース電気泳動後、ｃＤＮＡに相当するバンドをＤＥ８
１で回収精製した（FriedamAD, Landschulz WH, McKnig
ht SL; CCAAT/エンハンサー結合タンパク質は培養され
たヘパトーマ細胞中の血清アルブミン遺伝子のプロモー
ターを活性化する。；ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１９８９
３：１３１４−２２，１９８９) 。

【０１４４】ＳＲＥＢＰ−１：ｐＣＲ・／ｍｏｕｓｅ
ＳＲＥＢＰ−１（佐藤隆一郎博士よりご供与）（Sato
R, Miyamoto W, Inoue J, Terada T, Imanaka T, Maeda
M;ステロール調節因子- 結合タンパク質は、消極的にm
icrosomalなトリグリセライド転移タンパク質遺伝子転
写を調節する。J Biol Chem, 274: 24714-20, 1999）を
制限酵素ＥｃｏＲ１で切断し、0.8% agarose電気泳動
後、ｃＤＮＡに相当するバンドをDE81（Whatman 社製）
で回収精製した。

【０１４５】５０〜１００ｎｇのＤＮＡ断片をBcaBEST
^TM Labeling kit (TaKaRa 社製) を用いて［α-³²P］dC
TP (Amersham Pharmacia biotech社製) で標識しプロー
ブを調製した。

【０１４６】iv) ノザンブロット解析脂肪細胞分化誘導開始前（０時間）と分化誘導開始２、
４、６、８時間後の細胞からそれぞれ調製した総ＲＮＡ
２５μｇを１％変性ゲル (2% formaldehyde, 1x Mops,
1% agarose) で電気泳動した。ゲルを５０ｍＭＮａＯ
Ｈ２５ｍｉｎ( アルカリ変性) 、２００ｍＭＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ４．０）４０分間（中和) 処理後、ＲＮＡを
ＨｙｂｏｎｄＮ＋ (Amersham Pharmacia biotech社製)
にトランスファーした。トランスファーは１２時間以上
行い、バッファーは20x SSC を用いた。トランスファー
したフィルターを50mM NaOH ５分間処理後、2xSSC で洗
浄し８０℃２時間乾燥させた。その後、ＵＶ照射を行い
固定した。

【０１４７】ハイブリダイゼーションバッファー (5x S
SPE, 50% formamide, 5x Denhalt's, 0.1% SDS, ２０μ
g/ml salmon sperm DNA)で４２℃一晩、プレハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーションバッフ
ァーを新しく変えた後、熱変性したプローブを加え４２
℃一晩、ハイブリダイゼーションを行った。その後、フ
ィルターを一次洗浄液 (2x SSPE 0.1% SDS) を用いて室
温で１０分間、さらに一次洗浄液を用いて５５〜６５℃
で１５分間、二次洗浄液 (1x SSPE 0.1% SDS)を用いて
６５℃で１５分間、三次洗浄液 (0.5x SSPE 0.1% SDS)
を用いて６５℃１０分間の条件で洗浄し、オートラジオ
グラフィーを行った。得られたオートラジオグラムを図
５に示す。図５の横軸は分化誘導開始時間を表わす。

【０１４８】図５によれば、クローン１５８のアンチセ
ンスの発現を引き起こすＩＰＴＧの添加（＋ＩＰＴＧ）
によりアンチセンスｍＲＮＡを発現させた時の、ＰＰＡ
Ｒγ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰδ、ＳＲＥＢＰ−１の
ｍＲＮＡレベルに対する影響については、全ての遺伝子
においてある程度の発現の減少が見られたが、特に、Ｐ
ＰＡＲγが発現が大きく減少したことが分かる。このこ
とは、クローン１５８のｍＲＮＡは、ＰＰＡＲγの発現
に密接に関係することが分かる。

【０１４９】〔実施例９〕ヒトホモログのクローニングｉ）NCBI Genome Sequencing（Human Genome Database
）を用いたヒトホモログの配列の予想前記実施例４で決定したクローン１５８マウスポリヌク
レオチドの全長配列をNCBI Genome SequencingのBLAST
the Human genome（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geno
me/seq/ ）でホモロジーサーチすることによって相同性
の高い配列を1番染色体上に見出した。イニシャルメチ
オニンを含むエキソンを第１エキソンとしたとき、該配
列は計３個のエキソンにより構成されていた。全てのエ
キソン、イントロン間にはgt-ag ルールが保存されてい
たことからヒトホモログの全長配列を予想することが出
来た。

【０１５０】ii) Hela細胞の培養ヒトホモログのクローニングはRT-PCRにより行った。テ
ンプレートにはHela細胞を用いた。Hela細胞の培養には
MEM （商品名、日水製薬株式会社製）、１０％FBS （商
品名、大日本製薬株式会社製）を用いた。

【０１５１】iii)総ＲＮＡの回収
１コンフレントに培養したHela細胞からTRIzol（GIBCO BR
L 社製）を用いて、その取扱説明書に従い、総ＲＮＡを
回収した。

【０１５２】iv）Reverse Transcriptase Coupled Poly
merase Chain Reaction （RT-PCR）によるヒトホモログ
のクローニング前記工程ｉ）で予想された全長配列をもとに下記の配列
番号５〜８で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを
プライマーとして組み合わせて用い、下記組成のＲＴ−
ＰＣＲ反応組成でＲＴ−ＰＣＲを行った。ｃＤＮＡテン
プレートには前記工程 ii ）及びiii)で作製したHela細
胞の総ＲＮＡからReverTra Dash （TOYOBO社製）を用い
てその取扱説明書に従って作製した。配列番号５（上層）： 5'-ACA AGC CAT GAG CAG CGA-
3’ 配列番号６（下層）： 5'-TGG TGC AGA GAG AGC TCT-
3’ 配列番号７（上層）： 5'-GAT ACC AGC CAC CAT TGC-
3’ 配列番号８（下層）： 5'-GGT AGA AGC GTG TTT CAG T
C-3 ’ ＲＴ−ＰＣＲ反応組成： 2 μl １０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯ
Ｄ−Ｐｌｕｓ− 2 μl ２ｍＭｄＮＴＰｓ 0.8 μl ２５ｍＭＭｇＳＯ₄ 2 μl ｃＤＮＡテンプレート 1.2 μl 上層及び下層プライマー（各１０ｍＭ） 11.6μl ｓｔｅｒｉｌｅＨ₂Ｏ 0.4 μl ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ(1.0 U/ μl) 上記プライマーの組み合わせは、配列番号５／配列番号
６、配列番号７／配列番号８とし、ＲＴ−ＰＣＲの反応
条件は、1 cycle : ９４℃２分、３０ cycles: ９４℃
１５秒、６０℃３０秒、６８℃２分とした。

【０１５３】ｖ）ＲＴ−ＰＣＲ断片の精製及び塩基配列
の決定ＰＣＲの反応生成物を０．７％アガロースゲル電気泳動
により分離後、DE81（Whatman 社製）を用いて回収精製
した。DNA 断片をpBluescript KS+ にサブクローニング
し、DSQ-1000（島津製作所社製）により、塩基配列を決
定した。

【０１５４】vi）クローン１５８ヒトホモログの全長配
列の決定図６にクローン１５８ヒトホモログｃＤＮＡの略図を示
す。配列番号５／配列番号６の組み合わせによりＲＴ−
ＰＣＲを行い、検出した１５５０ｂｐのバンドについて
配列を決定し、該バンドをＲＴ−１と称した。この領域
における配列は前記工程ｉ）により予想した配列と５塩
基異なっており（２３７Ｃ→Ｔ），（２４２−２４４
ＧＴＧ→ＴＧＴ），（７３７Ａ→Ｇ）、予想した配
列と一致率は１５４５／１５５０で９９．６７％であっ
た。アミノ酸レベルでは（４０Ｇ→Ｖ），（４１Ｖ→
Ｆ），（２０５Ｄ→Ｇ）となり、予想した配列と一致
率は８００／８０３で９９．６２％であった。

【０１５５】配列番号７／配列番号８の組み合わせによ
りＲＴ−ＰＣＲを行い、検出した１０７９ｂｐのバンド
について配列を決定し、該バンドをＲＴ−２と称した。
この領域における配列は前記工程ｉ）により予想した配
列と１００％同一であることが明らかとなった。

【０１５６】上記のようにしてクローニングされたクロ
ーン１５８ヒトホモログポリヌクレオチドの全長の核酸
配列は、配列番号９に示される。

【０１５７】また、配列番号１に示したマウスのクロー
ン１５８ポリヌクレオチドと配列番号９に示したクロー
ン１５８ヒトホモログポリヌクレオチドの一致率は、２
１６７／２８５１＝７６．００％であった。

【０１５８】クローン１５８ヒトホモログポリヌクレオ
チドにおいて、マウスクローン１５８においてイニシャ
ルメチオニンと定めたアミノ酸に対応する１２４塩基目
のＡＴＧを翻訳開始コドンと仮定した。その結果、この
ＯＲＦに相当する塩基番号１２４から２５３２までとマ
ウスクローン１５８のＯＲＦの相同性は、８７．０９％
（２０９８／２４０９）であることがわかった。また、
クローン１５８ヒトホモログポリヌクレオチドは８０３
アミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子である
と予想された。クローン１５８ヒトホモログアミノ酸配
列を配列番号１０に示した。

【０１５９】

【発明の効果】本発明のクローン１５８ポリヌクレオチ
ド及びクローン１５８タンパク質は、脂肪細胞分化誘導
開始後１２時間以内、特に６時間前後の細胞から抽出さ
れるポリヌクレオチド並びにタンパク質であり、脂肪細
胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化されるポリヌク
レオチド及びタンパク質としては新規なものである。こ
れらのポリヌクレオチドおよびタンパク質は、肥満のメ
カニズムを解明し、さらに肥満の進行状況を適切に把握
し、肥満の予防あるいは治療に役立たせる上で極めて有
用な物質である。

【０１６０】本発明のクローン１５８ポリヌクレオチ
ド、並びにクローン１５８ポリヌクレオチドから推定さ
れるタンパク質またはペプチド、およびこれらのペプチ
ドに対するアンタゴニストまたはアゴニストは、肥満を
含む糖尿病・高血圧・動脈硬化などの生活習慣病の治
療、および診断に有用である。

【０１６１】本発明のクローン１５８ポリヌクレオチ
ド、あるいは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチドのうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を
有するポリヌクレオチドは、肥満を含む糖尿病・高血圧
・動脈硬化などの生活習慣病の治療、および診断に有用
である。

【０１６２】

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ <110> Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Genes and proteins associated with adipocyte differentiation <130> NSM0043 <160> 10 <210> 1 <211> 2851 <212> DNA/RNA <213> Mouce <220> <221> cDNA to mRNA <400> 1 AAGACGAGGA CCGAGGCGCC GCSCGCCGTG GCRCGNCACT CTGAGCGCGA CAAGCCATGA 60 GCAGCGACGC CGCGGTCGCT TGCCGCCGCT GAGGCCCAAC CCGGACACCA GCTCGCCGCG 120 CCCTGGCATC CTTTTCTGCG GATACCCTCG CCCCCCAGAG ATTAATGTGG CTGCTTATGA 180 CTAAGGATTC TGGGACCACA GATGTTCAGA GAAGTAACAT ATACATATAA GAAACATGAT 240 TCCGGTGACC GAGTTCCGGC AGTTCTCCGA GCAGCAGCCC GCCTTCCGGG TGCTGAAGCC 300 GTGGTGGGAT GTGTTCACGG ATTACCTCTC GGTGGCCATG CTGATGATCG GAGTGTTTGG 360 ATGTACTTTA CAGGTCATGC AAGACAAGAT CATCTGCCTT CCGAAAAGAG TGCAGCCTGC 420 TCAGAACCAC TCTTCCGTTC CCAATGTCTC CCAGGCAGTT ATCAGTACCA CTCCGCTGCC 480 CCCACCTAAA CCCTCACCGA CCAACCCCGC GACCGTGGAG ATGAAGGGAC TGAAGACAGA 540 CCTGGACCTT CAGCAGTACA GTTTCATCAA CCAGATGTGC TACGAGCGAG CCCTCCACTG 600 GTATGCCAAG TACTTCCCAT ACCTGGTGCT CATCCACACC CTGGTCTTCA TGCTCTGTAG 660 CAACTTCTGG TTCAAATTCC CCGGATCCAG TTCCAAAATA GAACATTTCA TCTCCATCCT 720 GGGGAAGTGC TTTGACTCCC CGTGGACCAC ACGGGCTCTC TCCGAAGTGT CCGGAGAGGA 780 CTCCGAAGAG AAGGACAACA GAAAAAACAA CATGAACAGG TCCGGCACCA TCCAGTCTGG 840 TCCCGAGGGC AACCTGGTGA GGTCCCAGTC TCTCAAGTCA ATTCCTGAAA AGTTCGTGGT 900 TGACAAATCT GCTGCGGGGG CTCTGGACAA GAAGGAAGGT GAGCAGGCCA AGGCCTTGTT 960 TGAGAAGGTG AAGAAGTTCA GACTGCATGT GGAAGAAGGT GATATCCTGT ACGCCATGTA 1020 CGTGCGACAG ACTGTGCTGA AGGTCATCAA ATTCCTAATC ATCATTGCCT ACAACAGTGC 1080 CCTGGTTTCC AAAGTCCAGT TCACAGTGGA CTGTAATGTG GACATCCAGG ACATGACGGG 1140 CTATAAGAAC TTTTCTTGCA ATCACACCAT GGCTCATTTG TTCTCTAAGC TCTCCTTTTG 1200 CTACCTGTGC TTTGTAAGCA TCTATGGCCT GACGTGCCTT TACACCTTAT ACTGGCTGTT 1260 CTACCGTTCT CTGAGGGAAT ATTCCTTCGA GTATGTCCGG CAGGAGACGG GAATCGATGA 1320 CATTCCGGAT GTGAAAAATG ACTTTGCTTT CATGCTCCAT ATGATAGACC AGTATGACCC 1380 TCTCTATTCC AAGCGGTTTG CAGTGTTCCT GTCTGAAGTC AGCGAGAACA AGTTAAAACA 1440 ACTCAATTTA AATAACGAGT GGACCCCGGA CAAACTGCGG CAGAAGCTGC AGACAAATGC 1500 CCACAACCGC CTGGAGCTGC CGCTGATCAT GCTGTCTGGC CTCCCGGACA CCGTGTTTGA 1560 AATCACAGAG TTGCAGTCTC TGAAGCTGGA GATCATTAAG AATGTCATGA TCCCCGCCAC 1620 CATCGCCCAG CTAGACAACC TGCAGGAGCT CTGTCTGCAC CAGTGCTCCG TCAAGATCCA 1680 CAGCGCCGCG CTCTCCTTCC TGAAGGAGAA TCTCAAGGTC CTGAGTGTCA AGTTTGATGA 1740 CATGAGGGAG CTGCCCCCCT GGATGTACGG CCTCCGGAAC CTGGAAGAGC TCTATCTGGT 1800 TGGCTCTCTG AGTCACGACA TCTCCAAAAA TGTCACCCTG GAGTCTCTGA GGGACCTCAA 1860 AAGCCTTAAA ATCCTTTCCA TCAAGAGCAA CGTCTCCAAG ATCCCTCAGG CCGTGGTGGA 1920 TGTGTCCAGC CACCTCCAGA AGATGTGCGT CCACAATGAT GGCACCAAAC TGGTGATGCT 1980 CAACAACCTG AAGAAGATGA CCAACCTGAC GGAGCTGGAG CTGGTCCACT GCGACCTGGA 2040 ACGCATCCCC CACGCCGTGT TCAGCCTGCT CAGTCTCCAG GAGCTGGACC TGAAGGAGAA 2100 CAACCTCAAG TCCATAGAGG AGATCGTGAG CTTCCAGCAC TTGAGAAAGC TGACCGTGCT 2160 CAAACTGTGG TATAACAGCA TCGCTTACAT TCCAGAGCAC ATCAAGAAAC TGACCAGCCT 2220 GGAGAGACTG TTTTTCAGCC ACAATAAGGT AGAGGTGCTT CCCTCCCACC TCTTCCTGTG 2280 CAACAAAATC AGATACCTGG ACTTGTCCTA TAACGACATC CGCTTCATCC CGCCCGAAAT 2340 CGGAGTTCTG CAAAGTTTAC AGTATTTTTC CATCACTTGT AACAAAGTGG AGAGCCTCCC 2400 AGATGAACTC TACTTCTGCA AGAAACTTAA AACTTTGAAG ATTGGGAAAA ACAGCCTCTC 2460 CGTACTTTCA CCAAAAATTG GAAATCTACT ATTTCTTTCC TACTTAGACA TCAAAGGCAA 2520 TCACTTTGAA GTCCTCCCTC CCGAGCTGGG AGACTGCCGG GCTCTGAAGC GAGCCGGGCT 2580 AGTTGTGGAA GATGCTCTGT TTGAGACTCT GCCCTCAGAT GTCCGGGAGC AGATGAAAGC 2640 AGACTAACTT ATTTTTCATC AGAGTATGAC TGAAACATGC TTCTACCAAA TACAATATAA 2700 AGAATTAGGT AGTCCTAATG CCTTTCCTAT AYTATTTTTT TCCTTTTCCA CACAAGACAA 2760 CATGTACACA AAGATTGAGT AAGGAGTATG TATTTTTTAA TAAAAATTTA ATTGTATTTT 2820 TTCATTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2851 <210> 2 <211> 803 <212> PRT <213> Mouce <400> 2 Met Ile Pro Val Thr Glu Phe Arg Gln Phe Ser Glu Gln Gln Pro Ala 1 5 10 15 Phe Arg Val Leu Lys Pro Trp Trp Asp Val Phe Thr Asp Tyr Leu Ser 20 25 30 Val Ala Met Leu Met Ile Gly Val Phe Gly Cys Thr Leu Gln Val Met 35 40 45 Gln Asp Lys Ile Ile Cys Leu Pro Lys Arg Val Gln Pro Ala Gln Asn 50 55 60 His Ser Ser Val Pro Asn Val Ser Gln Ala Val Ile Ser Thr Thr Pro 65 70 75 80 Leu Pro Pro Pro Lys Pro Ser Pro Thr Asn Pro Ala Thr Val Glu Met 85 90 95 Lys Gly Leu Lys Thr Asp Leu Asp Leu Gln Gln Tyr Ser Phe Ile Asn 100 105 110 Gln Met Cys Tyr Glu Arg Ala Leu His Trp Tyr Ala Lys Tyr Phe Pro 115 120 125 Tyr Leu Val Leu Ile His Thr Leu Val Phe Met Leu Cys Ser Asn Phe 130 135 140 Trp Phe Lys Phe Pro Gly Ser Ser Ser Lys Ile Glu His Phe Ile Ser 145 150 155 160 Ile Leu Gly Lys Cys Phe Asp Ser Pro Trp Thr Thr Arg Ala Leu Ser 165 170 175 Glu Val Ser Gly Glu Asp Ser Glu Glu Lys Asp Asn Arg Lys Asn Asn 180 185 190 Met Asn Arg Ser Gly Thr Ile Gln Ser Gly Pro Glu Gly Asn Leu Val 195 200 205 Arg Ser Gln Ser Leu Lys Ser Ile Pro Glu Lys Phe Val Val Asp Lys 210 215 220 Ser Ala Ala Gly Ala Leu Asp Lys Lys Glu Gly Glu Gln Ala Lys Ala 225 230 235 240 Leu Phe Glu Lys Val Lys Lys Phe Arg Leu His Val Glu Glu Gly Asp 245 250 255 Ile Leu Tyr Ala Met Tyr Val Arg Gln Thr Val Leu Lys Val Ile Lys 260 265 270 Phe Leu Ile Ile Ile Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Val Ser Lys Val Gln 275 280 285 Phe Thr Val Asp Cys Asn Val Asp Ile Gln Asp Met Thr Gly Tyr Lys 290 295 300 Asn Phe Ser Cys Asn His Thr Met Ala His Leu Phe Ser Lys Leu Ser 305 310 315 320 Phe Cys Tyr Leu Cys Phe Val Ser Ile Tyr Gly Leu Thr Cys Leu Tyr 325 330 335 Thr Leu Tyr Trp Leu Phe Tyr Arg Ser Leu Arg Glu Tyr Ser Phe Glu 340 345 350 Tyr Val Arg Gln Glu Thr Gly Ile Asp Asp Ile Pro Asp Val Lys Asn 355 360 365 Asp Phe Ala Phe Met Leu His Met Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Leu Tyr 370 375 380 Ser Lys Arg Phe Ala Val Phe Leu Ser Glu Val Ser Glu Asn Lys Leu 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Leu Asn Asn Glu Trp Thr Pro Asp Lys Leu Arg Gln 405 410 415 Lys Leu Gln Thr Asn Ala His Asn Arg Leu Glu Leu Pro Leu Ile Met 420 425 430 Leu Ser Gly Leu Pro Asp Thr Val Phe Glu Ile Thr Glu Leu Gln Ser 435 440 445 Leu Lys Leu Glu Ile Ile Lys Asn Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Ala 450 455 460 Gln Leu Asp Asn Leu Gln Glu Leu Cys Leu His Gln Cys Ser Val Lys 465 470 475 480 Ile His Ser Ala Ala Leu Ser Phe Leu Lys Glu Asn Leu Lys Val Leu 485 490 495 Ser Val Lys Phe Asp Asp Met Arg Glu Leu Pro Pro Trp Met Tyr Gly 500 505 510 Leu Arg Asn Leu Glu Glu Leu Tyr Leu Val Gly Ser Leu Ser His Asp 515 520 525 Ile Ser Lys Asn Val Thr Leu Glu Ser Leu Arg Asp Leu Lys Ser Leu 530 535 540 Lys Ile Leu Ser Ile Lys Ser Asn Val Ser Lys Ile Pro Gln Ala Val 545 550 555 560 Val Asp Val Ser Ser His Leu Gln Lys Met Cys Val His Asn Asp Gly 565 570 575 Thr Lys Leu Val Met Leu Asn Asn Leu Lys Lys Met Thr Asn Leu Thr 580 585 590 Glu Leu Glu Leu Val His Cys Asp Leu Glu Arg Ile Pro His Ala Val 595 600 605 Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gln Glu Leu Asp Leu Lys Glu Asn Asn Leu 610 615 620 Lys Ser Ile Glu Glu Ile Val Ser Phe Gln His Leu Arg Lys Leu Thr 625 630 635 640 Val Leu Lys Leu Trp Tyr Asn Ser Ile Ala Tyr Ile Pro Glu His Ile 645 650 655 Lys Lys Leu Thr Ser Leu Glu Arg Leu Phe Phe Ser His Asn Lys Val 660 665 670 Glu Val Leu Pro Ser His Leu Phe Leu Cys Asn Lys Ile Arg Tyr Leu 675 680 685 Asp Leu Ser Tyr Asn Asp Ile Arg Phe Ile Pro Pro Glu Ile Gly Val 690 695 700 Leu Gln Ser Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Thr Cys Asn Lys Val Glu Ser 705 710 715 720 Leu Pro Asp Glu Leu Tyr Phe Cys Lys Lys Leu Lys Thr Leu Lys Ile 725 730 735 Gly Lys Asn Ser Leu Ser Val Leu Ser Pro Lys Ile Gly Asn Leu Leu 740 745 750 Phe Leu Ser Tyr Leu Asp Ile Lys Gly Asn His Phe Glu Val Leu Pro 755 760 765 Pro Glu Leu Gly Asp Cys Arg Ala Leu Lys Arg Ala Gly Leu Val Val 770 775 780 Glu Asp Ala Leu Phe Glu Thr Leu Pro Ser Asp Val Arg Glu Gln Met 785 790 795 800 Lys Ala Asp <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA <400> 3 GGCTCGAGGA AACATGATTC CGGTGACC 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA <400> 4 CCGGTACCCT CGCTCGTAGC ACATCTGG 28 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA <400> 5 ACAAGCCATG AGCAGCGA 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA <400> 6 TGGTGCAGAG AGAGCTCT 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA <400> 7 GATACCAGCC ACCATTGC 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA <400> 8 GGTAGAAGCG TGTTTCAGTC 20 <210> 9 <211> 2575 <212> DNA/RNA <213> Human being <220> <221> cDNA to mRNA <400> 9 ACAAGCCATG AGCAGCGACC CGCGGGCGAC GCGCTGTCCC TGGCAGCCGC TGAGCCCGAC 60 CCCGCAGGCA GCTCGCCGCT CCCTAGCACC TTCTCCAGTC GACACTCTCG CGCCCGGAGA 120 AACATGATTC CCGTGACAGA ATTCCGGCAG TTCTCTGAGC AGCAGCCTGC CTTCCGAGTG 180 CTGAAGCCAT GGTGGGATGT GTTTACCGAT TACCTCTCAG TAGCCATGCT CATGATTGGC 240 GTGTTTGGAT GTACTTTACA GGTCATGCAA GACAAGATAA TCTGCCTTCC GAAAAGAGTG 300 CAGCCTGCTC AGAACCACTC TTCCCTTTCG AATGTCTCTC AAGCAGTTGC CAGTACCACT 360 CCACTGCCTC CACCTAAACC ATCTCCTGCT AACCCCATCA CTGTGGAAAT GAAAGGCCTG 420 AAGACAGATT TGGACCTTCA GCAGTACAGC TTTATAAATC AGATGTGTTA TGAGCGAGCC 480 CTCCACTGGT ATGCCAAGTA TTTCCCTTAC CTTGTCCTCA TCCATACCCT GGTCTTTATG 540 CTCTGCAGTA ACTTTTGGTT CAAATTCCCT GGTTCCAGCT CCAAAATAGA ACATTTCATC 600 TCCATTCTGG GGAAGTGTTT TGACTCTCCT TGGACCACAC GGGCTTTATC TGAAGTGTCT 660 GGGGAGGACT CAGAAGAAAA GGACAACAGG AAGAACAACA TGAACAGGTC CAACACCATC 720 CAATCTGGTC CAGAAGGCAG CCTGGTCAAC TCTCAGTCTT TAAAGTCCAT TCCTGAGAAG 780 TTTGTAGTTG ATAAATCCAC TGCAGGGGCT CTGGATAAAA AGGAAGGTGA GCAGGCTAAG 840 GCCTTATTTG AGAAGGTGAA GAAGTTCAGG CTGCATGTGG AAGAAGGTGA TATTCTATAT 900 GCCATGTATG TTCGCCAGAC TGTACTTAAA GTTATCAAAT TCCTAATCAT CATTGCATAT 960 AATAGTGCTC TGGTTTCCAA GGTCCAGTTT ACAGTGGACT GTAATGTGGA CATTCAGGAC 1020 ATGACTGGAT ATAAAAACTT TTCTTGCAAT CATACCATGG CACACTTGTT CTCAAAACTG 1080 TCCTTTTGCT ATCTGTGCTT TGTTAGTATC TATGGATTGA CGTGCCTTTA TACCTTATAC 1140 TGGCTGTTCT ACCGTTCTCT ACGGGAATAT TCCTTTGAGT ATGTCCGTCA GGAGACTGGA 1200 ATTGATGATA TTCCAGATGT GAAAAATGAC TTTGCTTTTA TGCTTCATAT GATAGATCAG 1260 TATGACCCTC TCTATTCCAA GAGATTTGCA GTGTTCCTGT CTGAAGTCAG TGAAAACAAA 1320 TTAAAGCAGC TGAACTTAAA TAACGAATGG ACTCCTGATA AACTGAGGCA GAAGCTACAG 1380 ACAAATGCCC ATAATCGACT GGAATTGCCT CTTATCATGC TCTCTGGCCT TCCAGACACT 1440 GTTTTTGAAA TCACAGAGTT GCAATCTCTA AAACTTGAAA TCATTAAGAA CGTAATGATA 1500 CCAGCCACCA TTGCACAGCT AGACAATCTT CAAGAGCTCT CTCTGCACCA GTGTTCTGTC 1560 AAAATCCACA GTGCGGCGCT CTCTTTCCTG AAGGAAAACC TCAAGGTCTT GAGCGTCAAG 1620 TTTGATGACA TGAGGGAACT CCCCCCCTGG ATGTATGGGC TCCGAAATCT GGAAGAGCTG 1680 TACCTAGTTG GCTCTCTAAG TCATGATATT TCCAGAAATG TCACCCTTGA GTCTCTGCGG 1740 GATCTCAAAA GCCTTAAAAT TCTCTCTATC AAAAGCAACG TTTCCAAAAT CCCTCAGGCA 1800 GTGGTTGATG TTTCCAGCCA TCTCCAGAAG ATGTGCATAC ATAATGATGG CACCAAGCTG 1860 GTGATGCTCA ACAACTTAAA GAAGATGACC AATCTGACAG AGCTGGAGCT GGTCCACTGT 1920 GACCTGGAGC GTATTCCTCA TGCTGTGTTC AGCCTACTCA GCCTCCAGGA ATTGGACCTG 1980 AAGGAAAACA ATCTGAAATC TATAGAAGAA ATCGTTAGCT TTCAGCACTT AAGAAAGTTG 2040 ACAGTGCTAA AACTGTGGCA TAACAGCATC ACCTACATCC CAGAGCATAT AAAGAAACTC 2100 ACCAGCCTGG AACGCCTGTC CTTTAGTCAC AATAAAATAG AGGTGCTGCC TTCCCACCTC 2160 TTCCTATGCA ACAAGATCCG ATACTTGGAC TTATCGTACA ATGACATTCG ATTTATCCCC 2220 CCTGAAATTG GAGTTCTACA AAGTTTACAG TATTTTTCCA TCACATGTAA CAAAGTGGAA 2280 AGCCTTCCAG ATGAACTCTA CTTCTGCAAG AAACTTAAAA CTCTGAAGAT TGGAAAAAAC 2340 AGCCTATCTG TACTTTCACC GAAAATTGGA AATTTGCTAT TTCTTTCCTA CTTAGATGTA 2400 AAAGGTAATC ACTTTGAAAT CCTCCCTCCT GAACTGGGTG ACTGTCGGGC TCTGAAGCGA 2460 GCTGGTTTAG TTGTAGAAGA TGCTCTGTTT GAAACTCTGC CTTCTGACGT CCGGGAGCAA 2520 ATGAAAACAG AATAACTTAT TTTTCGTTAA AGTTTGACTG AAACACGCTT CTACC 2575 <210> 10 <211> 803 <212> PRT <213> Human being <400> 10 Met Ile Pro Val Thr Glu Phe Arg Gln Phe Ser Glu Gln Gln Pro Ala 1 5 10 15 Phe Arg Val Leu Lys Pro Trp Trp Asp Val Phe Thr Asp Tyr Leu Ser 20 25 30 Val Ala Met Leu Met Ile Gly Val Phe Gly Cys Thr Leu Gln Val Met 35 40 45 Gln Asp Lys Ile Ile Cys Leu Pro Lys Arg Val Gln Pro Ala Gln Asn 50 55 60 His Ser Ser Leu Ser Asn Val Ser Gln Ala Val Ala Ser Thr Thr Pro 65 70 75 80 Leu Pro Pro Pro Lys Pro Ser Pro Ala Asn Pro Ile Thr Val Glu Met 85 90 95 Lys Gly Leu Lys Thr Asp Leu Asp Leu Gln Gln Tyr Ser Phe Ile Asn 100 105 110 Gln Met Cys Tyr Glu Arg Ala Leu His Trp Tyr Ala Lys Tyr Phe Pro 115 120 125 Tyr Leu Val Leu Ile His Thr Leu Val Phe Met Leu Cys Ser Asn Phe 130 135 140 Trp Phe Lys Phe Pro Gly Ser Ser Ser Lys Ile Glu His Phe Ile Ser 145 150 155 160 Ile Leu Gly Lys Cys Phe Asp Ser Pro Trp Thr Thr Arg Ala Leu Ser 165 170 175 Glu Val Ser Gly Glu Asp Ser Glu Glu Lys Asp Asn Arg Lys Asn Asn 180 185 190 Met Asn Arg Ser Asn Thr Ile Gln Ser Gly Pro Glu Gly Ser Leu Val 195 200 205 Asn Ser Gln Ser Leu Lys Ser Ile Pro Glu Lys Phe Val Val Asp Lys 210 215 220 Ser Thr Ala Gly Ala Leu Asp Lys Lys Glu Gly Glu Gln Ala Lys Ala 225 230 235 240 Leu Phe Glu Lys Val Lys Lys Phe Arg Leu His Val Glu Glu Gly Asp 245 250 255 Ile Leu Tyr Ala Met Tyr Val Arg Gln Thr Val Leu Lys Val Ile Lys 260 265 270 Phe Leu Ile Ile Ile Ala Tyr Asn Ser Ala Leu Val Ser Lys Val Gln 275 280 285 Phe Thr Val Asp Cys Asn Val Asp Ile Gln Asp Met Thr Gly Tyr Lys 290 295 300 Asn Phe Ser Cys Asn His Thr Met Ala His Leu Phe Ser Lys Leu Ser 305 310 315 320 Phe Cys Tyr Leu Cys Phe Val Ser Ile Tyr Gly Leu Thr Cys Leu Tyr 325 330 335 Thr Leu Tyr Trp Leu Phe Tyr Arg Ser Leu Arg Glu Tyr Ser Phe Glu 340 345 350 Tyr Val Arg Gln Glu Thr Gly Ile Asp Asp Ile Pro Asp Val Lys Asn 355 360 365 Asp Phe Ala Phe Met Leu His Met Ile Asp Gln Tyr Asp Pro Leu Tyr 370 375 380 Ser Lys Arg Phe Ala Val Phe Leu Ser Glu Val Ser Glu Asn Lys Leu 385 390 395 400 Lys Gln Leu Asn Leu Asn Asn Glu Trp Thr Pro Asp Lys Leu Arg Gln 405 410 415 Lys Leu Gln Thr Asn Ala His Asn Arg Leu Glu Leu Pro Leu Ile Met 420 425 430 Leu Ser Gly Leu Pro Asp Thr Val Phe Glu Ile Thr Glu Leu Gln Ser 435 440 445 Leu Lys Leu Glu Ile Ile Lys Asn Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Ala 450 455 460 Gln Leu Asp Asn Leu Gln Glu Leu Ser Leu His Gln Cys Ser Val Lys 465 470 475 480 Ile His Ser Ala Ala Leu Ser Phe Leu Lys Glu Asn Leu Lys Val Leu 485 490 495 Ser Val Lys Phe Asp Asp Met Arg Glu Leu Pro Pro Trp Met Tyr Gly 500 505 510 Leu Arg Asn Leu Glu Glu Leu Tyr Leu Val Gly Ser Leu Ser His Asp 515 520 525 Ile Ser Arg Asn Val Thr Leu Glu Ser Leu Arg Asp Leu Lys Ser Leu 530 535 540 Lys Ile Leu Ser Ile Lys Ser Asn Val Ser Lys Ile Pro Gln Ala Val 545 550 555 560 Val Asp Val Ser Ser His Leu Gln Lys Met Cys Ile His Asn Asp Gly 565 570 575 Thr Lys Leu Val Met Leu Asn Asn Leu Lys Lys Met Thr Asn Leu Thr 580 585 590 Glu Leu Glu Leu Val His Cys Asp Leu Glu Arg Ile Pro His Ala Val 595 600 605 Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gln Glu Leu Asp Leu Lys Glu Asn Asn Leu 610 615 620 Lys Ser Ile Glu Glu Ile Val Ser Phe Gln His Leu Arg Lys Leu Thr 625 630 635 640 Val Leu Lys Leu Trp His Asn Ser Ile Thr Tyr Ile Pro Glu His Ile 645 650 655 Lys Lys Leu Thr Ser Leu Glu Arg Leu Ser Phe Ser His Asn Lys Ile 660 665 670 Glu Val Leu Pro Ser His Leu Phe Leu Cys Asn Lys Ile Arg Tyr Leu 675 680 685 Asp Leu Ser Tyr Asn Asp Ile Arg Phe Ile Pro Pro Glu Ile Gly Val 690 695 700 Leu Gln Ser Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Thr Cys Asn Lys Val Glu Ser 705 710 715 720 Leu Pro Asp Glu Leu Tyr Phe Cys Lys Lys Leu Lys Thr Leu Lys Ile 725 730 735 Gly Lys Asn Ser Leu Ser Val Leu Ser Pro Lys Ile Gly Asn Leu Leu 740 745 750 Phe Leu Ser Tyr Leu Asp Val Lys Gly Asn His Phe Glu Ile Leu Pro 755 760 765 Pro Glu Leu Gly Asp Cys Arg Ala Leu Lys Arg Ala Gly Leu Val Val 770 775 780 Glu Asp Ala Leu Phe Glu Thr Leu Pro Ser Asp Val Arg Glu Gln Met 785 790 795 800 Lys Thr Glu

【図面の簡単な説明】

【図１】クローン１５８マウスｃＤＮＡの略図である。

【図２】脂肪細胞分化に特異的に発現されている配列ク
ローン１５８は脂肪細胞分化に特異的に発現され、脂肪
細胞分化誘導開始１２時間以内に発現されることを示す
オートラジオグラムである

【図３】図３（ｃ）は、細胞内に発現したクローン１５
８のＧＦＰを示す顕微鏡写真である。図３（ａ）は対照
として細胞全体を写した顕微鏡写真である。図３（ｂ）
はＤＡＰＩ法により細胞質内の核のみを染色した顕微鏡
写真である。

【図４】クローン１５８アンチセンスｍＲＮＡのｓｔａ
ｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔのＩＰＴＧの添加に対
する脂肪細胞分化の影響を表すＲＴ−ＰＣＲ測定の結果
を示すグラフである。

【図５】クローン１５８アンチセンスｍＲＮＡを発現さ
せた時の、ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰδ、
ＳＲＥＢＰ−１のｍＲＮＡレベルに対する影響を表すオ
ートラジオグラムである。

【図６】クローン１５８ヒトホモログｃＤＮＡの略図で
ある。

【図７】配列番号１０で表されるヒトホモログと該ヒト
由来のｍＲＮＡの全長の比較、及びＯＲＦ（タンパク質
に翻訳される領域）の長さの比較を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/06 ４Ｃ０８４Ａ６１Ｐ 3/04 3/10 ４Ｃ０８５ 3/06 9/10 ４Ｃ０８６ 3/10 9/12 ４Ｈ０４５ 9/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 9/12 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｐ 21/02 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BA13 BB03 BB20 CA25 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA37 DA77 FB04 FB05 FB07 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B063 QA18 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA91X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 MA37 MA52 MA56 MA63 MA66 ZA422 ZA452 ZA702 ZC332 ZC352 4C085 AA13 BB11 DD88 EE01 GG02 GG03 GG04 GG06 GG08 4C086 AA01 AA02 EA16 NA14 ZA42 ZA45 ZA70 ZC33 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA01 EA27 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脂肪細胞分化を促進する機能を有し且つ
脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化される性
質を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドで
あって、配列番号１で表される塩基配列に対して同一も
しくは少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列を含
むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補的
なポリヌクレオチド。
【請求項２】脂肪細胞分化を促進する機能を有し且つ
脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化される性
質を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドで
あって、配列番号１で表される塩基配列の番号２３６か
ら２６４４に対して同一もしくは少なくとも９０％の相
同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは該
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項３】請求項１または２記載のポリヌクレオチ
ドがＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチド。
【請求項４】脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に
活性化されるタンパク質であって、配列番号２で表され
るタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくとも９
０％の相同性を有する脂肪細胞分化を促進するタンパク
質。
【請求項５】請求項１または２記載のポリヌクレオチ
ドまたは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチ
ドを含有する組み換えベクター。
【請求項６】請求項５記載の組み換えベクターを保持
する形質転換体。
【請求項７】請求項４記載のタンパク質に対して免疫
学的に特異的な抗体。
【請求項８】請求項４記載のタンパク質をアンタゴナ
イズまたはアゴナイズする化合物の同定方法であって、
（ａ）請求項４記載のタンパク質を発現している細胞ま
たは請求項４記載のタンパク質に応答する細胞に候補化
合物を接触させること；（ｂ）結合、または機能的応答
の刺激もしくは阻害を観察すること；あるいは候補化合
物と接触した細胞の請求項４記載のタンパク質の活性に
関する能力を接触しなかった同種の細胞と比較すること
を特徴とする方法。
【請求項９】請求項８記載の方法によって同定される
アゴニスト。
【請求項１０】請求項８記載の方法によって同定され
るアンタゴニスト。
【請求項１１】請求項４記載のタンパク質の生成に十
分な条件下で、請求項６記載の形質転換体を培養し、培
地または形質転換体からタンパク質を回収することを特
徴とするタンパク質またはその塩の製造方法。
【請求項１２】請求項１または２記載のポリヌクレオ
チド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチドを含有する医薬。
【請求項１３】配列番号１で表される塩基配列に対し
て同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくと
も１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医
薬。
【請求項１４】配列番号１で表される塩基配列の番号
２３６から２６４４に対して同一もしくは少なくとも８
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
のうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドを含む医薬。
【請求項１５】請求項１または２記載のポリヌクレオ
チド、または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレ
オチドを含有する診断薬。
【請求項１６】配列番号１で表される塩基配列に対し
て同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくと
も１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診
断薬。
【請求項１７】配列番号１で表される塩基配列の番号
２３６から２６４４に対して同一もしくは少なくとも８
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
のうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドを含む診断薬。
【請求項１８】請求項４記載のタンパク質またはその
塩を含有している医薬。
【請求項１９】請求項４記載のタンパク質またはその
塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチ
ドを含む医薬。
【請求項２０】請求項４記載のタンパク質またはその
塩を含有している診断薬。
【請求項２１】請求項４記載のタンパク質またはその
塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプチ
ドを含む診断薬。
【請求項２２】請求項７記載の抗体を含有する医薬。
【請求項２３】請求項７記載の抗体を含有する診断
薬。
【請求項２４】請求項９記載のアゴニストを含有して
いる医薬。
【請求項２５】請求項９記載のアゴニストを含有して
いる診断薬。
【請求項２６】請求項１０記載のアンタゴニストを含
有している医薬。
【請求項２７】請求項１０記載のアンタゴニストを含
有している診断薬。
【請求項２８】肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿
病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれ
た生活習慣病の治療薬である請求項１２、１３、１４、
１８、１９、２２、２４または２６記載の医薬。
【請求項２９】肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿
病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれ
た生活習慣病の診断薬である請求項１５、１６、１７、
２０、２１、２３、２５または２７記載の診断薬。
【請求項３０】脂肪細胞分化を促進する機能を有し且
つ脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化される
性質を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
であって、配列番号９で表される塩基配列に対して同一
もしくは少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列を
含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドに相補
的なポリヌクレオチド。
【請求項３１】脂肪細胞分化を促進する機能を有し且
つ脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内に活性化される
性質を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
であって、配列番号９で表される塩基配列の番号１２４
から２５３２に対して同一もしくは少なくとも９０％の
相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドまたは
該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項３２】請求項３０または３１記載のポリヌク
レオチドがＤＮＡまたはＲＮＡであるポリヌクレオチ
ド。
【請求項３３】脂肪細胞分化誘導開始後１２時間以内
に活性化されるタンパク質であって、配列番号１０で表
されるタンパク質の全長に対して同一もしくは少なくと
も９０％の相同性を有する脂肪細胞分化を促進するタン
パク質。
【請求項３４】請求項３３記載のタンパク質をアンタ
ゴナイズまたはアゴナイズする化合物の同定方法であっ
て、（ａ）請求項３３記載のタンパク質を発現している
細胞または請求項３３記載のタンパク質に応答する細胞
に候補化合物を接触させること；（ｂ）結合、または機
能的応答の刺激もしくは阻害を観察すること；あるいは
候補化合物と接触した細胞の請求項３３記載のタンパク
質の活性に関する能力を接触しなかった同種の細胞と比
較することを特徴とする方法。
【請求項３５】請求項３４記載の方法によって同定さ
れるアゴニスト。
【請求項３６】請求項３４記載の方法によって同定さ
れるアンタゴニスト。
【請求項３７】請求項３０または３１記載のポリヌク
レオチドを含有する組み換えベクター。
【請求項３８】請求項３７記載の組み換えベクターを
保持する形質転換体。
【請求項３９】請求項３３記載のタンパク質に対して
免疫学的に特異的な抗体。
【請求項４０】請求項３３記載のタンパク質の生成に
十分な条件下で、請求項３８記載の形質転換体を培養
し、培地または形質転換体からタンパク質またはその塩
を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項４１】請求項３０または３１記載のポリヌク
レオチドを含有している医薬。
【請求項４２】配列番号９で表される塩基配列に対し
て同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくと
も１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む医
薬。
【請求項４３】配列番号９で表される塩基配列の番号
１２４から２５３２に対して同一もしくは少なくとも８
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
のうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドを含む医薬。
【請求項４４】請求項３０または３１記載のポリヌク
レオチドを含有している診断薬。
【請求項４５】配列番号９で表される塩基配列に対し
て同一もしくは少なくとも８０％の相同性を有する塩基
配列を含むポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド
に相補的なポリヌクレオチドのうち、連続する少なくと
も１０個の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む診
断薬。
【請求項４６】配列番号９で表される塩基配列の番号
１２４から２５３２に対して同一もしくは少なくとも８
０％の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
のうち、連続する少なくとも１０個の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドを含む診断薬。
【請求項４７】請求項３３記載のタンパク質またはそ
の塩を含有している医薬。
【請求項４８】請求項３３記載のタンパク質またはそ
の塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプ
チドを含む医薬。
【請求項４９】請求項３３記載のタンパク質またはそ
の塩を含有している診断薬。
【請求項５０】請求項３３記載のタンパク質またはそ
の塩の連続する少なくとも５個のアミノ酸からなるペプ
チドを含む診断薬。
【請求項５１】請求項３９記載の抗体を含有する医
薬。
【請求項５２】請求項３９記載の抗体を含有する診断
薬。
【請求項５３】請求項３５記載のアゴニストを含有し
ている医薬。
【請求項５４】請求項３５記載のアゴニストを含有し
ている診断薬。
【請求項５５】請求項３６記載のアンタゴニストを含
有している医薬。
【請求項５６】請求項３６記載のアンタゴニストを含
有している診断薬。
【請求項５７】肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿
病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれ
た生活習慣病の治療薬である請求項４１、４２、４３、
４７、４８、５１、５３または５５記載の医薬。
【請求項５８】肥満症、高血圧症、高脂血症、糖尿
病、並びに動脈硬化による心臓病及び脳卒中から選ばれ
た生活習慣病の診断薬である請求項４４、４５、４６、
４９、５０、５２、５４または５６記載の診断薬。
【請求項５９】配列番号９で表されるポリヌクレオチ
ドについて、ｎａｎｏｃｈｉｐを用いる方法、ポリヌク
レオチド配列を決定する方法、ＤＮＡチップ又はＤＮＡ
アレイを用いる方法、質量分析計を用いる方法、プライ
マーエクステンションを用いる方法から選ばれた方法を
適用することを特徴とする塩基多型を調べる方法。