MXPA97010408A - Homologo humano del gen rab18 de raton - Google Patents

Abstract

La presente invención provee secuencias del nucleótido y de aminoácido que identifican y codifican un homólogo humano deRAB18 de ratón (HRAB18) expresado en la pituitaria humana. La presente invención también proveémoléculas antisentido a las secuencias de nucleótido, las cuales codifican HRAB18, sondas de hibridación u oligonucleótidos para la detección de secuencias de nucleótido que codifican HRAB18, y una prueba de diagnóstico a base de moléculas deácido nucleico que codifica HRAB18. La presente invención también provee células huésped genéticamente diseñadas por ingeniería para la expresión de HRAB18, HRAB18 biológicamente activo, anticuerpos capaces de unir especificamente a HRAB18 y métodos de tratamiento que comprenden la administrción de compuestos capaces de unir HRAB18.

Description

HOMOLOGO HUMANO DEL GEN RAB18 DE RATÓN CAMPO TÉCNICO La presente invención está dentro del campo de la biología molecular; más particularmente, la presente invención describe las secuencias de ácido nucleico y aminoácido de un homólogo humano del gen RAB18 de ratón ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas RAB pertenecen a la superfamilia RAS de proteínas G que comprenden absolutamente 50 GTPasas monoméricas relacionadas con pesos moleculares de entre aproximadamente 20,000 y 30,000 Las proteínas G monoméricas pueden interactuar con varios tipos de proteínas efectoras para activar respuestas celulares específicas Las proteínas RAB actúan como reguladores específicos de tráfico de membrana íntracelular, exocitosis y endocitosis para controlar el brote, activación y fusión de vesícula Las proteínas RAS activan una cascada de cinasas de proteína de sepna/treonma para regular el crecimiento y diferenciación celular. Las proteínas RHO y RAC están implicadas en señales de transmisión de receptores de superficie celular hacia el citoesqueleto de actina. (Alberts, B et al., Molecular Biology of the Cell. 3rd ed, Garland Publishing, Inc., New York City, NY (1994)). Las proteínas G existen en equilibrio entre dos formas, la forma unida a GTP, la cual es activa e ¡nteractúa con proteínas efectoras, y la forma unida a GDP la cual es inactiva La distribución de las proteínas G activas e inactivas, parece ser modulada en pare por ciertas proteínas reguladoras que afectan las velocidades de liberación de GDP o hidrólisis de GTP a través de las proteínas G. por ejemplo, las proteínas de liberación de nucleótido de guanina (GNRP) catalizan la liberación de GDP unido. Subsecuentemente, GTP se une al sitio de unión de nucleótido, y después la proteína G es activada Alternativamente, las proteínas que activan GTPasa (GAP) incrementan la velocidad de hidrólisis de GTP con producción concomitante de GDP y fosfato. El GDP permanece unido a la proteína G e inactiva la proteína Otras proteínas G interactúan con un inhibidor de disociación de nucleótido de guanidina (GDI) que inhibe la liberación de GDP (Barangar (1994) J Biol. Chem 269 13637-43). La mayor parte de la información con respecto a proteínas G monoméricas, ha sido obtenida estudiando la estructura y función de las proteínas RAS como se describe en Hesketh R, The Oncogene FactsBook, Academic Press, Great Bptam (1995) Mucho menos se sabe con respecto a los aspectos estructurales importantes para la actividad de los otros miembros de la superfamilia de RAS.

Proteínas RAB En cuanto a las 30 proteínas RAB que han sido identificada en células de mamíferos con secuencias que comparten entre 35% y 95% de la identidad indicando una amplia escala de características específicas funcionales Usualmente, estas proteínas han sido localizadas en organelos específicos Por ejemplo, RAB1 está localizado en el complejo ER y Golgí, RAB2 en el ER transicional y la red cis Golgí, RAB3 en vesículas secretorias, RAB4 en endosomas antiguos, RAB5 en endosomas antiguos y la membrana del plasma, RAB6 en cisternas medias y trans Golgí, RAB7 en endosomas tardíos, y RAB9 en endosomas tardíos y la red de trans Golgí (Alberts, supra) Además, las proteínas de RAB están localizadas en tipos de tejido específicos Por ejemplo, RAB17 se encuentra en células epiteliales, las cuales contienen diferentes trayectorias de transporte apicales, vasolaterales y transitóticas Las isoformas de RAB3 con aproximadamente 77-85% de homología parecen estar enormemente restringidas a líneas de célula que contienen trayectorias secretoras reguladas, tales como neuronas, endocrina y células exocpnas (Fischer von Mollard (1994) J Biol chem 269 10971-74) RAB18 se encuentra que se expresa a un alto nivel en el cerebro de ratón, a un nivel moderado en la glándula pituitaria y a bajos niveles en el hígado Esta proteína puede jugar un papel importante en la recirculación de vesícula secretoria (Yu H et al (1993) Gene 132 273-8) Las proteínas tanto como RAB y RAS parecen compartir dominios conservados, los cuales están implicados en la unión de nucleótido de guanidina o están implicados en los cambios conformacionales asociados con la unión de GTP y la hidrólisis de GTP Los motivos estructurales característicos asociados con el sitio de unión de GTP incluyen un primer motivo, GX4GK(s/T), el cual interactúa con los alfa y beta fosfatos de GDP o GTP Otro motivo, DXXG, también parece interactuar con la gama fosfato Un tercer motivo, (N/T) (K/Q)XD, interactua con el anillo de guanina Un enlace hermético Mg+ está coordinado a un residuo de treonina conservada y a los grupos beta y gama fosfato de GTP Ademas, Mg+ interactúa con el residuo de sepna/treonina del primer motivo, y con el aspartato invariante del tercer motivo Los dominios que parecen ser importantes para cambios conformacionales incluyen el lazo L2 efector de la hélice a2/lazo5 (a2L5) que parece estar implicado en interacciones con GEP y GAP específicos (Ferro-Novick S (1993) Ann Rev Cell Biol 9 575-99) Además, las modificaciones post-traslacionales a través de una porción de lípido son críticas para la localizacion de membrana y la actividad apropiada de RB Esta modificación ocurre en el extremo de terminal-C de las proteínas RAB mientras que una porción de geranilgeranilo (GG), una unidad de isopreno de 20 carbonos, usualmente está unida a través de un enlace de tioeter a uno de los dos residuos de cisteína La mayoría de las proteínas de RAB tienen términos C que terminan en -XXCC (35%), -XCXC (37%), -CCXX (8%) y -CXXX (5%) Algunas proteínas RAB, tales como RAB3A, que tienen un motivo -XCXC parecen ser geranilgeraniladas en cada uno de los residuos de cisteína adyacente (Farnsworth (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91- 11963-7) Esta reacción de modificación parece implicar una geranilgeraniltransferasa específica en RAB individual (RAB GGTasa II) que transfiere las porciones de lípidos a diferentes motivos de RAB Una proteína acompañante RAB (REP) además participa en la reacción de lipidación uniendo el sustrato de proteína, y después formando el complejo con RAB GGTasa II Después, el GGTasa II transfiere la porción de geranilgeranilo del geranilgeranilpirofosfato al sustrato de proteína El modo de las proteínas RAB de acción como reguladores del tráfico de membrana entre los compartimientos intracelulares no está bien entendido Se ha propuesto que el ciclo de las proteínas RAB entre formas solubles y de unión de membrana e interactúan con proteínas de unión de membrana vesiculares y objetivo Cuando una proteína TAB se une a través de GDP (es decir una forma inactiva), existe en una conformación en donde su porción de lípido está oculta dentro de la proteína Por lo tanto, la proteina permanece en forma soluble Una vez que la proteína RAB es activada por GNRP la GDP es intercambiada para GTP, la cual altera la conformación de la proteína de manera que la porción de lípido permanece expuesta y RAB se une a la membrana El RAB unido a la membrana con GTP en el sitio de unión con nucleótido es localizado en donde las vesículas de membrana están siendo punzonadas y se unen con un complejo de ciertas proteínas específicas de vesícula (v-SNARE) La proteína RAB permanece unida a la superficie de la vesícula hasta que la vesícula entra a la membrana objetivo en cuyo momento el v-SNARE interactúa con SNARE asociado objetivo (t-SNARE) En este momento, la GTP unida a RAB es hidrolizada a GDP Concomitante, RAB altera su conformación, de manera que su porción de lípido ya no está más expuesta y RAB es liberado de la superficie de membrana objetivo Por lo tanto, parece que los complejos SNARE pueden servir como los últimos objetivos de regulación a través de RAB (Alberts, supra) DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La prénsete invención se refiere a polinucleótidos y péptidos de un homólogo humano de RAB18 de ratón designado en la presente como HRAB18 La presente invención también proporciona ADN antisentido de HRAB18 y vectores de expresión y células huésped que comprenden pohnucleótidos que codifican HRAB18 Ademas, la presente invención proporciona un método para producir HRAB18, y un poli pépt ido HRAB18 purificado que tiene la secuencia mostrada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 2 La presente invención también se refiere a pruebas de diagnóstico y composiciones para la detección de trastornos asociados con la expresión alterada de HRAB18 y más particularmente trastornos asociados con la glándula pituitaria Un método para clasificar una pluralidad de compuestos de prueba para identificar los compuestos que se unen a HRAB18 también se propone junto con su uso para compuestos terapéuticos para el tratamiento de trastornos relacionados con la expresión alterada de HRAB18 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 presenta la secuencia de nucleótido (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 1) y la secuencia de aminoácido predicha (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 2) para HRAB18 encontrado en el clon Incyte 112352 La Figura 2 muestra la alineación de aminoácido de HRAB18 con RAB18 de ratón Las alineaciones mostradas fueron producidas utilizando el programa de alineación de secuencias múltiples del software DNASTAR (DNASTAR Ine Madison Wl) La Figura 3 muestra una gráfica de hidrofobicidad para la secuencia de aminoácido de HRAB18 utilizando el programa de hidrofobicidad de DNASTAR MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "homólogo humano de rabld de ratón" o "HRAB18" se refiere al polipéptido mostrado en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 2 Las secuencias de polmucleótido que codifican HRAb18 fueron encontradas en una colección de ADNc de pituitaria humana HRAB18 es un miembro de la subfamilia de RAB de proteínas G monoméricas y puede estar implicado en la regulación de la recirculación de vesícula secretoria En una modalidad descrita en la presente, HRAB18 es codificado por el pohnucleótido mostrado en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 1, empezando con el nucleótido 45 y terminando con el nucleótido 664 La presente invención también se refiere a las secuencias corriente arriba y corriente abajo mostradas en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 1, es decir, los nucleótidos 1 a 44, y 665 a 1148 en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 1, los cuales afectan la estabilidad de transcripción de ARNm HRAB18 puede ser de existencia natural, producido recombinante o químicamente sintetizado También se incluye dentro del alcance de la presente invención fragmentos activos de HRAB18 Como se utiliza en la presente, "hrab18" en minúsculas se refiere a la secuencia de ácido nucleico, mientas que "HRAB18" en mayúsculas se refiere a una secuencia de proteína, péptido o aminoácido "Activo" se refiere a aquellas formas de HRAB18 que retienen las actividades biológicas y/o inmunologicas de HRAB18 de existencia natural "HRAB18 de existencia natural" se refiere a HRAB18 producido por células humanas que no han sido genéticamente diseñadas por ingeniería y específicamente contemplan varias formas de HRAB18 que surgen de modificaciones post-traslacionales del péptido, incluyendo pero no limitándose a acetilación, carboxilacion glicosilacion fosforilación lipidacion y acilación "Derivados" se refiere a pohpeptidos derivados de HRAB18 de existencia natural a través de modificaciones químicas tales como ubiquinación, marcación (por ejemplo con radionuclidos, varias enzimas, etc ), pgilacion (depvatizacion con glicol polietileno) o a través de la inserción o sustitución mediante síntesis química de aminoácidos tal como ornitma las cuales no ocurren normalmente en proteínas humanas "Variante recombinante" se refiere a cualquier polipéptido que difiera de HRAB18 de existencia natural a través de inserciones eliminaciones y sustituciones de aminoácido creadas utilizando técnicas de ADN recombinante La guia para determinar que residuo de aminoácido puede ser reemplazo agregado o eliminado sin abolir las actividades de ínteres puede encontrarse comparando la secuencia del HRAB18 particular con aquella de otras proteínas de RAB y reduciendo al mínimo el numero de cambios de secuencia de aminoácidos, hechos en regiones de homología. Preferiblemente, las "sustituciones" de aminoácido son el resultado de remplazar un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el remplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato o una tponina con una sepna, es decir, remplazados de aminoácido conservadores "Inserciones" o "eliminaciones" están típicamente en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos Las variaciones permitidas pueden ser expepmentalmente determinadas a través de inserciones sistemáticamente hechas, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en HRAB18 utilizando técnicas de ADN recombinantes y analizando las variantes recombinantes resultantes para actividad Cuando se desee, una "secuencia de señal o líder" puede dirigir el pol ipéptido HRAB18 a través de la membrana de una célula Tal secuencia puede ser presentada naturalmente en los polipéptidos HRAB18 de la presente invención o provista de fuentes de proteína heterólogas a través técnicas de ADN recombinantes Un "fragmento", "porción" o "segmento" de poli peptido , es un estiramiento de residuos de aminoácido de por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos, por lo menos aproximadamente 7 aminoácidos, típicamente por lo menos aproximadamente 9 a 13 aminoácidos, y en varias modalidades, por lo menos aproximadamente 17 o más aminoácidos. Para ser activos, los polipéptidos HRAB18 deben tener una longitud suficiente para exhibir una actividad biológica y/o inmunológica Un "fragmento", "porción" o "segmento" de "ohgonucleótido" o polmucleótido es un estiramiento de residuos de nucleótido, el cual es lo suficientemente largo para utilizarse en la reacción de cadena de polimerasa (PCR) o varios procedimientos de hibridación para identificar o amplificar moléculas de ARNm o ADN de HRAB18. La presente invención incluye pohpéptidos de HRAB18 purificado de fuentes naturales o recombinantes, es decir, células transformadas con moléculas de ácido recombinante que modifica HRAB18 Varios métodos para el aislamiento de los pohpéptidos de HRAB18 pueden ser logrados a través de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales pohpéptidos pueden ser purificados a través de cromatografía de inmunoafinidad empleando los anticuerpos provistos por la presente invención Varios otros métodos de purificación de proteína bien conocidos en la técnica, incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press San Diego, y Scopes R (1982) Protein Pupfication Principies and Practice, Sppnger-Verlag, NYC, ambos incorporados aquí por referencia "Recombinante" se refiere a un pohnucleótido que codifica HRAB18 y es preparado utilizando técnicas de ADN recombinante El ADN que codifica HRAB18 también puede incluir variantes alélicas o recombinantes y mutantes de los mismos "Oligonucleótidos" o "sondas de ácido nucleico" se preparan con base en la secuencia de ADNc que codifica HRAB18 (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2). Los oligonucleótidos comprenden porciones de la secuencia de ADN que tienen de entre 10 y 60 nucleótidos y de preferencia de entre 15 y 60 nucleótidos. Las sondas de ácido nucleico comprenden porciones de la secuencia que tiene menos nucleótidos que aproximadamente 6 kg, usualmente menos de aproximadamente 1 kb. En una modalidad de la presente invención, las sondas de oligonucleótido, comprenderán la secuencia que es idéntica o complementaria a una porción de HRAB18 en donde existe muy poca o identidad o capacidad complementaria con alguna molécula conocida o de la técnica anterior. Después de la prueba apropiada para eliminar positivos falsos, estas sondas pueden utilizarse para determinar si ARNm codifica HRAB18 está presente en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácido nucleico similares del ADN cromosomal como se describe por Walsh PS et al (1992 PCR Methods Appl 1 241-250) Las sondas pueden ser derivadas de ácidos nucleicos de estructura de cadena individual o doble de existencia natural o recombinantes, o pueden ser químicamente sintetizadas Pueden ser marcadas con traslación de ranura, reacción de llenado Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica Las sondas de la presente invención, su preparación y/o marcación, se elaboran en Sambrook J et al (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, o Ausubel FM et al (1989) Current Protocols in Molecular Bíology, John Wiley & Sons, NYC, ambas incorporadas aquí por referencia Alternativamente, las variantes recombinantes que codifican HRAB18 pueden ser sintetizadas o seleccionadas haciendo uso de la "redundancia" en el código genético Varias sustituciones de codón como los cambios silenciosos que producen varios sitios de restricción, pueden ser introducidas para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o expresión en un sistema particular procapótico o eucariótico Las mutaciones también pueden ser introducidas para modificar las propiedades del polipéptido, para cambiar las afinidades de unión de ligando, las afinidades de intercadena o la degradación del po 11 pépt i do y la velocidad de cambio La presente invención, en un aspecto proporciona una secuencia de nucleótido identificada por Incyte 112352 que codifica HRAB18, un homólogo humano del gen rab18 de ratón En otro aspecto, la presente invención proporciona un po 11 pé pt id o de HRAB18 purificado de fuentes naturales o recombinantes La secuencia de aminoácido se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 2 Una modalidad de la presente invención es proporcionar sondas de hibridación de acido nucleico especificas en HRAB18 capaces de hibpdizarse con secuencias de nucleotido de existencia natural que codifica HRAB18. Otras modalidades de la presente invención son células transformadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican HRAB18 y anticuerpos para HRAB18. Los polinucléotidos, polipéptidos y anticuerpos para HRAB18 pueden ser útiles para ensayos de diagnóstico para detectar transtorno de la reacción del tráfico entre membranas, tales como, por ejemplo, endocitosis o exocitosis y como composiciones de diagnóstico para la detección de transtorno de tejido secretorio, particularmente tejido neuronal o pituitario Además, estas herramientas de diagnóstico pueden ser útiles para diagnosticar trastornos asociados con daño de tejido La secuencia de nucleótido que codifica HRAB18 tiene numerosas aplicaciones en técnicas conocidas por aquellos expertos en el arte de al biología molecular Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación, el uso en la construcción de oligómeros para PCr, el uso para mapeo de cromosomas y de genes, el uso en la producción recombinante de HRAB18, y el uso en la generación de ADN o ARN de antisentido, sus análogos químicos y similares Los usos de nucleótidos que codifican HRAB18 descritos en la presente, son ilustrativos de técnicas conocidas y no pretenden limitar su uso en ninguna técnica conocida a algún experto en la técnica Además, las secuencias de nucleótido descritas en la presente, pueden ser utilizadas en técnicas de biología molecular que no han sido desarrolladas, siempre que las nuevas técnicas se basen en propiedades de secuencia de nucleótido que sean ya conocidas (por ejemplo, código genético tpplete, y las interacciones de pares de bases específicas) Se apreciará por algún experto en la técnica que como resultado de la generación del código genético, se puede producir secuencias de nucleótido que codifican HRAB18, algunas llevando homología mínima a la secuencia de nucleótido de cualquier gen conocido y de secuencia natural La invención ha contemplado específicamente cada una de las variaciones posibles de secuencia de nucleótido que pueden hacerse seleccionando combinaciones a base de elecciones de codón posibles Estas combinaciones se hacen de acuerdo con el código genético de tpplete normal según se aplica a la secuencia de nucleotido de HRAB18 de secuencia natural, y todas estas variaciones se consideran como siendo específicamente descritas Aunque la secuencia de nucleotido que codifican HRAB18 y/o sus variantes, son preferiblemente capaces de hibpdizarse a la secuencia de nucleotido de HRAB18 de existencia natural bajo condiciones severas puede ser ventajoso producir secuencias de nucleotido que codifican HRAB18 y sus derivados que poseen un uso de codón sustancialmente diferente Los codones pueden ser seleccionados para incrementar la velocidad a la cual ocurre la expresión del peptido en un huésped de expresión particular procapótico o eucariótico de acuerdo con la frecuencia con la cual se utilicen los codones particulares por el huésped Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótido que codifica HRAB18 y/o sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácido codificada incluyen la producción de transcripciones de ARN que tienen propiedades mas deseables, tales como vida media mayor, que las transcripciones producidas de las secuencias de existencia natural Las secuencias de nucleótido que codifican HRAB18 pueden ser unidas a una variedad de otras secuencias de nucleótido a través de técnicas de ADN recombinantes bien establecidas (Sambrook J et al , supra) Las secuencias de nucleótido útiles para unirse a hrabld incluyen una selección de vectores de clonación, por ejemplo, plásmidos, cosmidos, derivados de fago lambda, fagémidos y similares, que son bien conocidos en la técnica Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de rephcación, vectores de generación de sonda, vectores de secuenciacion y similares En general, los vectores de ínteres pueden contener un origen de replicacion funcional en por lo menos un organismo sitios sensibles de endonucleasa de restricción convenientes y marcados seleccionables para la célula huésped La presente invención proporciona las sondas de hibridación de acido nucleico especificas en hrabld capaces de hibpdizarse con secuencias de nucleotido de existencia natural que codifican HRAB18 Tales sondas también pueden ser utilizadas para la detección de otras secuencias que codifican el gen rab, y deben contener preferiblemente por lo menos 50% de los nucleótidos de la región conservada o sitio activo. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden derivadas de la secuencia de nucleótido de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1 o de las secuencias genómicas incluyendo promotores, mejoradores y/o posible sintrones de polmucleótidos de hrabld de existencia natural respectivos Las sondas de hibridación pueden ser marcadas a través de una variedad de grupos reportadores, incluyendo radionúclidos tales como 32p 0 35s, o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada con la sonda a través de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina, y similares Además, la presente invención proporciona sondas de hibridación de ácido nucleico capaces de hibpdizarse con secuencias ya sea corriente arriba o corriente abajo que pueden jugar un papel importante en la traslación de HRAB18 Tales sondas pueden ser utilizadas para detectar secuencias regulatoras similares para la traslación de poli pé pt id o PCR, como se describe en las Patentes US 4,683,195, 4 800,195, y 4,965,188, proporciona usos adicionales para oligonucleótido con base en la secuencia de nucleotido que codifica HRAB18 Tales sondas utilizadas en PCR pueden ser de origen recombinante, pueden ser químicamente sintetizadas, o una mezcla de ambos y comprenden una secuencia de nucleotido completas para uso de diagnóstico o un vaciado de degeneración de las posibles secuencias para la identificación de las secuencias genómicas estrechamente relacionadas Genes de longitud completa pueden ser clonados de la secuencia conocida utilizando un nuevo método que emplea XL-PCR (Perkin-Elmer, Foster City, CA) para amplificar piezas largas de ADN Este método fue desarrollado para permitir que un solo investigador procese genes múltiples (hasta 20 o más) en un omento y para obtener una secuencia extendida (posiblemente de longitud completa) en 6-10 días Remplaza los métodos actuales, los cuales utilizan sondas marcadas para clasificar colecciones y permitir que un investigador procese solamente aproximadamente 3-5 genes en 14-40 días En el primer paso, el cual puede ser realizado en aproximadamente dos días, los iniciadores son designados y sintetizados con base en una secuencia parcial conocida En la etapa 2, la cual toma de aproximadamente seis a ocho horas, la secuencia es extendida a través de amplificación de PCR de una colección seleccionada Las etapas 3 y 4, los cuales toman aproximadamente un día, son la purificación del ADNc amplificado y su ligación en un vector apropiado La etapa 5, la cual toma aproximadamente un día, implica la transformación y el desarrollo de la bacteria huésped En la etapa 6 la cual toma aproximadamente cinco horas, se utiliza PCR para clasificar clones bacterianos para secuencia extendida Los pasos finales, los cuales toman aproximadamente un día, implican la preparación y secuenciación de clones seleccionados Si el ADNc del longitud completa no ha sido obtenido, todo el procedimiento es repetido utilizando ya sea la colección original o algunas otras colecciones preferidas. La colección preferida puede ser una que haya sido seleccionada por tamaño para incluir solamente ADNc más grandes, o puede consistir de colecciones comercialmente disponibles, individuales o combinadas, por ejemplo, pulmón, hígado, corazón y cerebro de Gibco/BRL (Gaithersburg MD). La colección de ADNc puede haber sido preparada con iniciadores oligo dT o aleatorios. La ventaja de utilizar colecciones de inicio aleatorio es que generalmente tienen más secuencias que contienen extremos 5' de genes Una colección aleatoriamente iniciada puede ser particularmente útil si una colección oligo dT no produce un gen completo. Obviamente, entre más grande sea la proteína, menos probable es que el gen completo sea encontrado en un plásmido individual. Otros medios para producir sondas de hibridación específicas para ADN de HRAB18 incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico que codifican HRAB18 o derivados de HRAB18 en vectores para la producción de sondas de ARNm Tales vectores son conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles, y pueden ser utilizados para sintetizar sondas de ARN in vitro a través de la adición de la polimerasa de ADN apropiada como polimerasa ARN de T7 o SP6, y los nucleótidos radiactivamente marcados apropiados Ahora es posible producir una secuencia de ADN, o porciones de la misma, codificando HRAB18 y sus derivados completamente a través de químicamente sintética, después de lo cual el gen puede ser insertado en cualquiera de los vectores de ADN disponibles, utilizando reactivos, vectores y células que son conocidas en la técnica en el momento de presentar esta solicitud Además, se puede utilizar química sintética para introducir mutuaciones en las secuencias hrabld o cualquier porción de las mismas Las secuencias de nucleótidos de las secuencias hrabld puede se confirmada a través de técnicas de secuenciación de ADN En la técnicas son bien conocidos los métodos de para secuenciar ADN Los métodos enzimáticos convencionales emplearon fragmento de Klenow de polimerasa de ADN, SEQUENASER (US Biochemical) Corp Cleveland, OH) o polimerasa de Taq para extender las cadenas de ADN de un iniciador de oligonucléotido reforzado a la plantilla de ADN de ínteres Los métodos han sido desarrollados para utilizarse en plantillas de estructura de cadena tanto individual como doble Los productos de reacción de terminación de cadena fueron electroforeados sobre geles de urea-acplamida y detectados ya sea a través de autorradiografia (para precursores marcados con radionucléotido) o a través de fluorescencia (para productores marcadores fluorescentes) Las recientes mejoras en la preparación de reacción mecánica, secuenciación y análisis utilizando el método de detección fluorescente han permitido la expansión en el número de secuencias que pueden ser determinadas por día (utilizando máquinas tales como el catalizador 800 y el secuenciador Applied Biosystems 377 o 373 de ADN). Alternativamente, los insertos de ADNc pueden ser secuenciados en un Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), en combinación con cuatro ciclizadores Peltier Térmicos (PTC200 de MJ Research, Watertown, MA) junto con un sistema de secuenciación Applied Biosystem 377 o 373 de ADN. La secuencia de nucleótido, puede ser utilizada en un ensayo para detectar trastornos asociados con la expresión alterada de HRAB18. La secuencia de nucleótido puede ser marcada a través de métodos conocidos en la técnica y agregada a una muestra de fluido o tejido de un paciente bajo condiciones de hibridación Después de un periodo de incubación, la muestra es lavada con un fluido compatible, el cual opcionalmente contiene un colorante, u otra marca que requiere un revelador) si el nucleótido ha sido marcado con una enzima Después de que el fluido compatible es enjuagado, el colorante es cuantificado y comparado con uno normal Si la cantidad de colorante es significativamente elevada, la secuencia de nucleótido se ha hibpdizado con la muestra, y el ensayo indica la presencia de trastornos de tráfico de membrana La secuencia de nucleótido para hrabld puede ser utilizada para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen. La secuencia de nucleótido proporcionada en la presente puede ser mapeada a un cromosoma particular o a regiones específicas de aquel cromosoma utilizando técnicas de mapeo genético y/o cromosomal bien conocidas. Estas técnicas incluyen hibridación in situ, análisis de unión contra marcados cromosomales conocidos, clasificación de hibridación con colecciones, preparaciones cromosomales de selección de flujo, o construcciones de cromosoma artificiales YAC o construcciones P1 La técnica de fluorescencia en hibridación in situ de cromosomas ha sido descrita, entre otras partes en Verma et al (1988) Human Chromosomes A Manual of Bsic Techniques. Pergamon Press, New York City. La hibridación in situ fluorescente de preparación cromosomales y otras técnicas de mapeo de cromosoma física pueden ser correlacionadas con datos de mapa genético adicionales Ejemplos de los datos de mapa genéticos pueden ser encontrados en 1994 Genome Issue of Science (265 1981 f ) La correlación entre la localización de hrabld sobre un mapa cromosomal físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociada con aquela enfermedad genética La secuencia de nucleótido en la presente invención puede ser utilizada para detectar diferencias en la secuencia de gen entre individuos normales y portadores, o afectados Las secuencias de nucleótido que codifican HRAB18 pueden ser utilizadas para producir HRABId purificado utilizando métodos bien conocidos de la técnica de ADN recombinante Entre las muchas publicaciones que enseñan los métodos para la expresión de genes después de que han sido aislados es Goeddel (1990) Gene Expression Technology. Methods and Enzymology, Vol 165, Academic Press, San Diego, CA Las etapas de purificación varían con el procedimiento de producción y la proteína particular producida Varios métodos para aislar de los polipéptidos de HRAB18 pueden lograse a través de procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology. Vo 182, academic Press San Diego CA y Scopes R (1982) Protein Pupfication. Principies and Practice Sppnger-Verlag, New York City, ambas incorporadas en la presente para referencia HRAB18 puede ser expresado en una variedad de células huésped ya sea eucarióticas o procapoticas Las células huésped pueden ser de la misma especie en donde las secuencias de nucleótido de HRAB18 son endógenas o de una especie diferente Las ventajas de producir HRAB18 a través de tecnología de ADN recombinante incluyen obtener cantidades adecuadas de la proteina para la purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados Las células transformadas con ADN que codifica HRAB18 pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas parala expresión de proteínas RAB y recuperación de la proteina del cultivo de célula HRAB16 producido a través de una célula recombinante puede ser secretado o puede ser contenido intracelularmente, dependiendo de la secuencia de HRAB18 y la construcción genética utilizada En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada Además de la producción recombinante se pueden producir fragmentos de HRAB18 a través de síntesis de peptido directa utilizando técnicas de fase solida (Stewart et al (1969) Sohd-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco, CA, Merpfield J (1963) J Am Chem Soc 85 2149-2154 Se pueden realizar la síntesis de proteína in vitro utilizando técnicas manuales o a través de automatización La síntesis automática puede lograrse, utilizando un sintetizador Applied biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster, City, CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante Varios fragmentos de HRAB18 pueden ser químicamente sintetizados en forma separada y combinados utilizando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa HRAB18 para la inducción de anticuerpo no requiere actividad biológica, sin embargo, la proteína debe ser antigenica Los peptidos utilizados para inducir a anticuerpos específicos pueden tener una secuencia de aminoácido que consisten de por lo menos cinco residuos de aminoácidos preferiblemente por lo menos 10 residuos de aminoácido Estos deben asemejarse a una porción de la secuencia de aminoácido de una proteina y pueden contener toda la secuencia de aminoácido de una molécula pequeña de existencia natural tal como HRAB18 Los estiramientos cortos de HRABId pueden ser fusionados con aquellos de otra proteína, tal como hemocianina de limpeto de llave (LKB, Sigma, St Louis, MO), y la molécula quimérica utilizada para la producción de anticuerpo. Los anticuerpos específicos para HRAB18 pueden ser producidos mediante inoculación de un animal apropiado con el polipéptido o un fragmento antigénico Un anticuerpo es específico para HRAB18 si este es producido contra un epítope del pohpéptido y se une a por lo menos parte de la proteína natural o recombinante Cualquier producción de anticuerpo incluye no solamente la estimulación de la respuesta inmune a través de inyección al animal, sino que también los pasos análogos en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de unión específica, tal como la clasificación de colecciones e inmunoglobulina recombinante (Orlandi R et al (1989) Proc Nat Acad Sci USA' 86 3833-3837. o Huse WD et al (1989 Science 256 1275-1281 o estimulación m vitro de poblaciones de linfocito La tecnología actual (Wmter G and Milstein C (1991) Nature 349 293-299) proporciona un número de reactivos de unión altamente específicos con base en los principios de formación de anticuerpos Estas técnicas pueden ser adaptadas para producir moléculas específicamente uniendo HRAB18 La presente invención incluye poli pe pt ido de HRAB18 purificado de fuentes naturales o recombinantes es decir, células transformadas con moléculas de acido nucleico recombinantes que codifica HRAB18. Varios métodos para el aislamiento de los polipéptidos HRAB18 pueden ser logrados a través de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales polipéptidos pueden ser purificados a través de cromatografía de inmunoafinidad empleando los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Varios otros métodos de purificación de proteína bien conocidos en la técnica, incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzylmology. Vol 182, Academic Press, San Diego, CA; y Scopes R (1982) Protein Pupfication: Principies and Practice. Springer-Velag, New York City, ambas incorporadas en la presente para referencia. HRAB18 puede ser utilizado para clasificar o diseñar fármacos que pueden ser empleados para regular secreciones hormonales o la expresión de receptores específicos de la pituitaria que están asociados con la expresión anormal de HRABId. Alternativamente, el mismo HRAB18 puede servir para controlar la expresión hormonal en exceso o para regular la expresión de receptores específicos. Además, HRAB18 puede servir como funciones similares en otros tejidos neuronales particularmente en donde las trayectorias secretorias juegan un papel importante en la función. HRAB18 como agente bioactivo o composición puede ser administrado en una dosis terapéutica adecuada, determinada por cualquiera de las varias metodologías, incluyendo estudios clínicos o especies mamíferas, para determinar la dosis tolerable máxima y en sujetos humanos normales, para determinar la dosis segura Además, el agente bioactivo puede ser formado en complejo con una variedad de compuestos bien establecidos, o composiciones que mejoran la estabilidad o propiedades farmacológicas tales como la vida media Se contempla que la composición terapéutica, bioactiva, puede ser suministrada a través de infusión intravenosa en la corriente sanguínea o cualquier otro medio efectivo, el cual puede ser utilizado para tratar problemas que impliquen la expresión alterada o actividad de proteínas RAB Los ejemplos que siguen se proporcionan para ilustran la presente invención Estos ejemplos se proporcionan a manera de ilustración y no están incluidos con el proposito de limitar la invención APLICABILIDAD INDUSTRIAL I Aislamiento de ARNm y construcción de Colecciones de ADNc Se identificó el clon Incyte 112352 entre las secuencias de una colección de ADNc de pituitaria humana construida de una muestra vaciada de 21 glándulas pituitarias humanas enteras normales, de cerebro de hombres y mujeres caucásicos con una escala de edades de 16-70 años SE aislo el ARN de poli A + utilizando el iniciador oligo d(T) biotinilado y estreptavidina acoplada a una partícula paramagnetica (Promega Corp Madison Wl) y enviada a Stratagene (La Jolla CA) El Stratagene preparó la colección de ADNc utilizando iniciación ohgo (T) Los oligonucleótidos adaptadores sintéticos fueron ligados sobre moléculas de ADNc permitiéndoles ser insertados en el sistema de vector Uni-ZAP^M (Stratagene) Esto permitió una construcción de colección lambda unidireccional de alta eficiencia (orientación de sentido) y la conveniencia de un sistema de plásmido con una selección de color azul/blanco para detectar clones con inserción de ADNc La calidad de la colección de ADNc se clasificó utilizando sondas de ADN, y después se dividió el fagémido pBluescpptR (Stratagene) Este fagmemido permite el uso de un sistema de plásmido para facilitar la caracterización de inserto, secuenciación, mutagénesis dirigida al sitio, la creación de eliminaciones unidireccionales y la expresión de poli pépt idos de fusión Subsecuentemente, las partículas de fago de colección construidas de costumbre, fueron infectadas a la cepa huésped E_ coli XL1-BlueR (Stratagene) La eficiencia de alta transformación de esta cepa bacteriana incrementa la probabilidad de que ADNc contendrá clones raros, sub-representados Los vectores unidireccionales alternativos pueden incluir, pero no se limitan a, ADNpcl (Invitrogen, San Diego, CA) y pSH1ox-1 (Novagen, Madison, Wl) II Aislamiento de Clones de ADNc Las formas de fagmemido de los clones de ADNc individuales fueron obtenidos a través de un procedimiento de escisión in vivo, en donde XL1-BLUE fue coinfectado con un fago auxiliar f1 Las proteínas derivadas tanto del fago de lambda como del fago auxiliar f1 iniciaron una nueva síntesis de ADN a partir de las secuencias definidas en el ADN objetivo de lambda y crearon una molécula de ADN de fagémido circular de estructura de cadena individual, más pequeña, que incluye todas las secuencias del plásmido pBluescppt y el inserto ADNc El ADN de fagémido se liberó de las células y se purificó, después se utilizo para volver a reinfectar células huésped bacterianas frescas (SOLR, Stratagene Ine) en donde se produjo ADN de fagémido de estructura de cadena doble Ya que el fagémido lleva el gen para ß-lactamasa, las bacterianas nuevamente transformadas fueron seleccionadas en un medio conteniendo ampicilina El ADN de fagémido se purificó utilizando el sistema de purificación de plásmido QIAWELL-8 de QIAGENR DNA Pupfication System (QIAGEN Ine, Chatsworth, CA) Esta técnica proporciona un método rápido de alta producción, confiable para lisar las células bacterianas y el aislar el ADN de fagemido altamente purificado El ADN eluido de la resina de purificación fue adecuado para la secuenciación de ADN y otras manipulaciones analíticas Un método alternativo de purificación de fagemido recientemente ha estado disponible Este utiliza el Miniprep Kit (Catálogo No 77468, Advanced Genetic Technologies Corporation, Geithersburg, MD) Este equipo está en un formato de 96 cavidades, y proporciona suficientes reactivos para 960 purificaciones Cada equipo está proporcionado con un protocolo recomendado, el cual ha sido empleado, excepto para los siguientes cambios En primer lugar, las 96 cavidades, cada una se llenan con solamente 1 ml de caldo terrífico estéril con carbenicilina a 25 mg/l y glicerol a 04% Después de que las cavidades fueron inoculadas, las bacterianas se cultivaron durante 24 horas y se lisaron con 60 µl de regulador de pH de lisis Un paso de centrifugación (2900 rpm durante 5 minutos) se realizó antes de que los contenidos del bloque se agregaran a la placa de filtro primaria El paso opcional de agregar isopropanol al regulador de TRIS no se realiza por rutina Después del último paso en el protocolo, las muestras son transferidas a un bloque de 96 cavidades Beckman para almacenamiento lll Secuenciación de Clones de ADNc Los insertos de ADNc de aislados aleatorios de la colección de pituitaria fueron secuenciados a través del método de Sanger F y AR Coulson (1975, J Mol Biol 94 441 f) utilizando un Hamilton Micro Lab 220 (Hamilton, Reno NV), en combinación con cuatro Cichzadores Térmicos Peltier (PCT200 de MJ Research, Watertown MA) y Sistemas de Secuenciación Applied Biosystems 377 o 373 DNA (Perkm Elmer) y se determinó el marco de lectura IV Búsqueda de Homología de Clones de ADNc y Proteínas Deducidas Cada secuencia así obtenida se comparó en secuencias en GenBank utilizando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems Inc. e incorporado en el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT™ 670 En este algoritmo, se utilizó un Lenguaje de Especificación de Patrón (desarrollado por TRW Ine , Los Angeles, CA) para determinar las regiones de homología Los tres parámetros que determinan cómo corren las comparaciones de secuencia fueron tamaño de ventana, desviación de ventana y tolerancia de error Utilizando una combinación de estos tres parámetros, la base de datos de ADN fue buscada para secuencias que contienen regiones de homología a la secuencia solicitada, y las secuencias apropiadas fueron clasificadas con un valor inicial Subsecuentemente, estas regiones homologas fueron examinadas utilizando gráficas de homología de matriz dot para distinguir las regiones de homología de las comparaciones de oportunidad Se utilizaron alineaciones de Smith-Waterman de la secuencia de proteína para presentar los resultados de la búsqueda de homología Las homologías de secuencia de péptido y de proteína fueron averiguadas utilizando un INHERTIT 670 Sequence Analysis System en una forma similar a aquella utilizadas en las homologías de secuencia de ADN El Lenguaje de Especificación de Patrón y las ventanas de parámetro fueron utilizadas para buscar las bases de datos de proteína para secuencias que contienen regiones de homología, las cuales fueron clasificadas con un valor inicial Se examinaron las gráficas de homología matriz dot para distinguir las regiones de homología importante de las comparaciones de oportunidad Alternativamente, BLAST, el cual quiere decir Basic Local Alignment Search Tool (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica), se utilizó par buscar las alineaciones de secuencia locales (Altschul SF (1993) J Mol Evol 36 290-300, Altschul, SF et al (1990) J Mol Biol 215403-10) BLAST produce alineaciones de secuencias tanto de nucleótido como aminoácido para determinar la similitud de secuencia Debido a la naturaleza local de las alineaciones, BLAST es especialmente util para determinar las comparaciones exactas o para identificar homólogos Aunque es ideal para las comparaciones que no contengan huecos, es inapropiado realizar la búsqueda de estilo motivo La unidad fundamental de la producción de algoritmo BLAST es el par de segmento de alta clasificación (HSP) Un HSP consiste de dos fragmentos de secuencia de longitud arbitraria pero igual, cuya alineación es localmente máxima y para la cual la clasificación de alineación satisface o excede un umbral o clasificación de corte establecida por el usuario El aspecto de BLAST es buscar HSP entre una secuencia de solicitud y una secuencia de base de datos para evaluar la importancia estadística de cualesquiera comparaciones encontradas y para reportar solo aquellas comparaciones que satisfacen el umbral seleccionado de importancia El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para reportar comparaciones de secuencia de base de datos E se interpreta como la unión superior de la frecuencia esperada de la ocurrencia de oportunidad de un HSP (o un grupo de HSP) dentro de contexto de la búsqueda de base de datos completa Cualquier secuencia de base de datos cuya comparación satisfagan E se reporta en la salida del programa Un E mayor que, o igual a 25, usualmente indica una comparación que es significativa La secuencia de nucleótido para la región de codificación completa (incluida dentro de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 1) del homólogo humano de RAB18 HRAB18 de ratón, se muestra en la Figura 1 Los resultados de BLAST mostraron que la secuencia de codificación del clon de la presente invención tuvo un valor de parámetro E de 156 cuando se comparo con aquel del gen rabld de ratón (números de acceso de GenBank X80333 y L04966) La secuencia de codificación también comparte secuencias HSP con una secuencia de codificación rab2 humano (numero de acceso GenBank M28213) con un valor de E de 54, y una secuencia de codificación de rab13 humano (número de acceso GenBank X75593) con un valor de E de 51 La secuencia de codificación también comparte secuencias de HSP con varios clones en la base de dato LIFSEQ™ incluyendo el clon Incyte 45334 derivado del estroma corneo (E = 37), el clon Incyte 57291 derivado del músculo esquelético (E = 37), el clon INcyte 181288 derivado de placenta humana (E = 36) Los tres tipos de tejidos son enervados La presencia de secuencia de nucleótido relacionadas con hrabld en estos tipos de tejido puede dar como resultado la presencia de células nerviosas que contiene proteínas de RAB relacionadas implicadas en el trafico de vesícula secretoria Ademas, el clon INcyte 269502 derivado de una linea celular neuronal (HNT) contiene una secuencia de codificación que comparte una alta homología con el gen de rab18 de ratón (d7%) V Identificación y Secuenciación de Longitud Total de los Genes La secuencia de nucleotido de hrabld completa fue obtenida del clon Incyte 112352 La secuencia para el gen hrabld de longitud completa fue traducida y la traslación dentro del marco putativa se muestra en la Figura 1 Cuando las tres posibles traslaciones predichas fueron buscadas contra bases de datos de proteina SwissProt y PIR, no se encontró ninguna combinación exacta a la posibles traslaciones de HRABId La Figura 2 muestra la comparación de la secuencia de aminoácido de HRAB18 con RAB1d de ratón de GenBank La región sustancial de homología entre estas moléculas abarca la longitud completa de la molécula con sólo dos de 207 residuos no conservados VI Análisis Antisentido El conocimiento de la secuencia de ADNc del gen hrabld permitirá su uso en tecnología antisentido en la investigación de la función del gen Los ohgonucleótidos, fragmentos genómicos o de ADNc que comprenden la estructura de cadena antisentido de hrab18 son utilizados ya sea in vitro o m vivo para inhibir la expresión de la proteína Tal tecnología es bien conocida en la técnica, y las sondas son diseñadas en diversas ubicaciones a lo largo de la secuencia de ohgonucleotido Mediante la transfección de las células o animales de prueba completos, con tales secuencias de antisentido, el gen de ínteres es efectivamente desactivado La función del gen es averiguada observando el comportamiento a un nivel celular, de tejido o de organismo (por ejemplo, los cambios en las trayectorias secretorias, la capacidad letal, la pérdida de función diferenciada, cambios en morfología, por ejemplo) Además de utilizar secuencias construidas para interrumpir la transcripción del marco de lectura abierto se obtienen modificaciones de expresión de gen diseñando secuencias de antisentido a regiones intron, elementos promotores/mejoradores, o aun a genes reguladores de trans-accion Similarmente la inhibición se logra utilizando metodología de bases de pares Hogeboom, también conocida como pares de base de "hélice triple" VIII Expresión de HRAB18 La expresión de HRAB18 se logra subclonando los ADNc en vectores de expresión apropiados y transfectando los vectores a huéspedes de expresión apropiados En este caso, el vector de clonación utilizado en la generación del clon de longitud completa, también proporciona la expresión de la secuencia hrabld incluida en E. coli. Corriente arriba del sitio de clonación, este vector contiene un promotor para ß-galactosidasa, seguido por la secuencia que contiene Met aminoterminal y los 7 residuos subsecuentes de ß-galactodisasa. Inmediatamente después de estos ocho residuos está un promotor de bacteriófago diseñado por ingeniería útil para la iniciación y transcripción artificiales y un número de sitios de restricción únicos, incluyendo Eco Rl, para clonación. La inducción de la cepa bacteriana transfectada, aislada con IPTG utilizando métodos normales, producirá una proteína de fusión que corresponde a los primeros siete residuos de ß-galactosidasa, aproximadamente 15 residuos de "enlazador" y el péptido codificado dentro del ADNc Ya que los insertos de clon de ADNc son generados por un procedimiento esencialmente aleatorio, existe una oportunidad en tres de que el ADNc incluido yacerá en el marco correcto para traslación apropiada Si el ADNc no está en el marco de lectura apropiado, éste puede ser obtenido a través de la eliminación o inserción del número apropiado de bases a través de métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa lll o nucleasa mung bean, o inclusión de enlazador de oligonucleótido El ADNc de hrabld puede ser lanzado hacia otros vectores que se saben que son útiles para la expresión de proteína en huéspedes específicos Los amplificadores de oligonucleótido que contienen sitios de clonación así como un fragmento de ADN suficientes para hibpdizar a estiramientos en ambos extremos del ADNc objetivo (25 bases) pueden ser sintetizados químicamente a través de métodos normales Los nuevos segmentos de gen resultantes, pueden ser digeridos con enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones normales y aislados a través de electroforesis en gel. Alternativamente, se pueden producir segmentos de gen similares, mediante la digestión de ADNc con enzimas de restricción apropiadas y llenando en los segmentos de gen faltantes con oligonucleótidos químicamente sintetizados Los segmentos de la secuencia de codificación de más de un gen pueden ser ligados en conjunto y clonados en vectores apropiados para optimizar la expresión de la secuencia recombinante Los huéspedes de expresión apropiados para tales moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero, tales como Ovario de Hámster Chino (CHO) y las células 293 humanas, células de insecto tales como células Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae. y bacterias tales como E coli Para cada uno de estos sistemas de célula, un vector de expresión útil incluye un origen de replicación para permitir la propagación en bacterias y un marcador seleccionable tales como el gen de resistencia antibiótica ß-lactamasa para permitir la selección en bacteria. Además, los vectores incluyen un segundo marcador seleccíonable tal como el gen fosforotransferasa de neomicina para permitir la selección de células huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para utilizarse en huéspedes de expresión eucarióticos, requieren de elementos de procesamiento de ARN tales como las secuencias 3' de poliadenílación si tales no son parte del ADNc de injerto. Además, el vector puede contener vectores o mejoradores los cuales incrementan la expresión del gen Tales promotores son huéspedes específicos e incluyen MMTV, SV40 o promotores de metalotionina para células CHO; trp, lac, tac o T7 para huéspedes bacterianos, o factores alfa, oxidada de alcohol o promotores de PGH para levaduras Los mejoradores de transcripción tales como el virus de sarcoma rous (RSV) pueden ser utilizados en células huésped de mamífero Una vez que los cultivos homogéneos de células recombinantes son obtenidos a través de métodos de cultivo normales, se pueden recuperar grandes cantidades de HRABId recombinantemente producido del medio acondicionado y analizados utilizando métodos cromatográficos conocidos en la técnica.

VIII Aislamiento del HRAB18 recombinante El HRAB18 es expresado como una proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptido adicionales agregados para facilitar la purificación de la proteína Tales dominios para facilitar la purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos quelatadores de metal tales como módulos de histidina-tpptofano que permiten la purificación de metales inmobilizado, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobuhna inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGs (Immunex Corp , Seattle, WA) La inclusión de una secuencia enlazadora de escisión tal como el factor XA o enterocinasa (Invitrogen) entre el dominio de purificación y la secuencia hrabld proporciona la purificación de HRABId de la proteína de fusión IX Producción de Anticuerpos Específicos en HRAB18 Se utilizaron dos aspectos para incrementar los anticuerpos a HRAB16, y cada aspecto fue util para generar anticuerpos ya sea policlonales o monoclonales En un aspecto, la proteína desanaturalizada de la separación de CLAP de fase inversa se obtuvo en cantidades de hasta 75 mg Esta proteína desnaturalizada de utilizó para inmunizar ratones o conejos utilizando protocolos normales, aproximadamente 100 microgramos fueron adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que hasta 1 mg se utilizaron para inmunizar un conejo Para identificar los hibpdomas de ratón, la proteína desnaturalizada se radioyodó y se utilizó para clasificar hibpdomas de célula B de mupno potenciales para aquellos que producen anticuerpos Este procedimiento requiere sólo pequeñas cantidades de proteína, tal como 20 mg que es suficiente para marcar y clasificar vanos miles de clones En el segundo aspecto, la secuencia de aminoácido de HRABId, según deducido a partir de la traslación de ADNc, se analizó para determinar regiones de alta inmunogenicidad Los oligopeptidos que comprenden las regiones apropiadas hidrof i hcas , como se muestra en la Figura 3, fueron sintetizados y utilizados en protocolos de inmunización adecuados para dar surgimiento a anticuerpos El análisis para seleccionar los epitopes apropiados es descrito por Ausubel FM et al , supra Las secuencias de aminoácido óptimas para la inmunización están en el térmico C, el término N y aquellas regiones de intervención hidrofíhcas, del po 11 pépt ido , las cuales probablemente serán expuestas al ambiente externo cuando la proteína esté en la conformación natural Típicamente, los polipeptidos seleccionados, aproximadamente 15 residuos en la longitud son sintetizados utilizando Applied Biosystems Peptide Synthesizer Modelo 431A) utilizando la química fmoc y acoplado a la hemociamna de hmpeto de clave (KLH Sigma) a través de la reacción con ester N-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida (MBS Ausubel FM et al supra) Si es necesario, se produce una cisterna en el termino N del péptido para permitir el acoplamiento a KLH Los conejos fueron inmunizados con el complejo péptido-KLH en auxiliar completo de Freund. Los antisueros resultantes fueron probados para la actividad antipéptido unido el péptido al plástico, bloqueando con 1% de BSA, haciendo reaccionar con antisuero, lavando y haciendo reaccionar con IgG anticonejo de cabra específico, de afinidad purificado, marcado (radioactivo o fluorescente). Se prepararon hibridomas y se clasificaron utilizando técnicas normales. Los hibridomas de interés se detectaron clasificaron con HRABId marcados para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con el carácter específico deseado. En un protocolo típico, se revistieron las cavidades de placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) con anticuerpos de conejo-anti-ratón, específicos de afinidad purificada (o antiespecies Ig adecuadas) a 10 mg/ml Las cavidades revestidas se bloquearon con 1% de BSA, se lavaron y se expusieron a los sobrenadantes de los hibpdomas Después de la incubación las cavidades se expusieron a HRAB16 marcado, 1 mg/ml Los clones que producen los anticuerpos se unieron a una cantidad de HRAB18 marcado, la cual es un antecedente detectable. Tales clones se expandieron y se sometieron a 2 ciclos de clonación a una dilución limitante (1 célula/3 cavidades). Los hibpdomas clonadas fueron inyectados a ratones ppstano para producir ascitos, y el anticuerpo monoclonal se purificó a partir del fluido ascítico de ratón a través de cromatografía de afinidad en Proteína A Los anticuerpos monoclonales con afinidades de por lo menos 108 M"1, preferiblemente de 109 a 1010 o más fuertes, se hicieron a través de procedimientos normales como se describió por Harlow and Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y en Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice. Academic Press, New York City, ambas incorporadas en la presente para referencia.

X Prueba de Diagnóstico Utilizando Anticuerpos Específicos de HRAB18 Los anticuerpos de HRAB18 particulares son útiles para la diagnosis de trastornos que se caracterizan por la diferencia o la cantidad de distribución de HRAB18 en la pituitaria u otras células neuronalmente derivadas. Las pruebas de diagnóstico para HRABId incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una marca para detectar HRABId en fluidos del cuerpo humano, tejidos o extractos de tales tejidos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán marcados uniéndolos, ya sea covalente o no covalentemente con una sustancia que proporciona una señal detectable. Una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación son conocidas y han sido reportadas extensamente tanto en la literatura científica como en la de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, partículas magnéticas y similares. Las patentes que muestran el uso de tales marcas incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nos 3, 617,637, 3, 650,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149, y 4,366,241 También, se pueden producir inmunoglobuhnas recombinantes como se muestra en la Patente de los Estados Unidos No 4,d16,567, incorporada aquí para referencia Una variedad de protocolos para medir HRABId soluble o de unión a la membrana, utilizando anticuerpos ya sea policlonales o monoclonales específicos para la proteína respectiva, son conocidos en la técnica Los ejemplos incluyen el análisis inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA), radioinmunoensayo y clasificación de célula activada fluorescente (FACS) Un inmunoensayo a base de monoclonal de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes sin interferencia en HRABId, es preferido, pero se puede emplear un ensayo de unión competitiva Estos ensayos se describen entre otras partes en Maddox, DE et al (1983), J Exp Med 158 1211) XI. Purificación de HRAB18 Nativo que Utiliza Anticuerpos Específicos El HRAB18 de existencia natural o recombinante se purificó a través de cromatografía de inm unoafinidad utilizando anticuerpos específicos para HRAB18 En general se construyo una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo ant?-HRAB18 a una resina cromatografica activada Se prepararon inmunoglubulinas policlonales a partir de sueros inmunes ya sea a través de la precipitación con sulfato de amonio o a través de la purificación en proteína inmobilizada A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) Asimismo, se prepararon anticuerpos monoclonales a partir de fluidos de ascitos de ratón mediante la precipitación de sulfato de amonio o cromatografía sobre proteína inmobihzada A La inmonoglobuhna parcialmente purificada covalentemente se unió a una resina cromatográfica tal como Sepharosa activada con CnBr- (Pharmacia LKB Biotechnology) El anticuerpo se acopló a la resina, la resina se bloqueo y la resina derivativa se lavó de acuerdo con las instrucciones del fabricante Dichas columnas de inmunoafinidad se utilizaron en la purificación de HRAB18 preparando una fracción de células conteniendo HRABId en una forma soluble Esta preparación se deriva a través de la solubilización de célula entera de una fracción subcelular obtenida a través de la centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o a través de otros métodos bien conocidos en la técnica Alternativamente, HRABId soluble que contiene una secuencia de señal, es secretado en una cantidad util hacia el medio en el cual se desarrollan las células Una preparación conteniendo HRAB18 soluble se hizo pasar sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lavó bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de las proteínas RAB (por ejemplo reguladores de pH de alta resistencia iónica en presencia de detergente) Después la columna se eluyo bajo condiciones que separaron la unión de ant?cuerpo/HRAB1 d (por ejemplo, un regulador de pH 2-3 o una alta concentración de un chaótropo tal como urea o ¡on de tiocianato) y se recogió el HRAB16.

XII. Localización y Actividad de HRAB18 El HRABId puede ser localizado en células neuronales, particularmente células de la pituitaria, en la siguiente forma Primero, se purificó HRABId de existencia natural o HRABId purificado de E Coh expresando la proteína con su termino C premiado in vitro se obtuvo La premiación permitió que HRAB16 se localizará en compartimientos celulares, tales como los endosomas finales, la red trans Golgí, la red cis Golgí, o el retículo endoplásmico, dentro de una célula El HRABId premiado se añadió a un sistema libre de célula, tal como uno en donde la membrana de plasma ha sido solubilizada a través de digitomna El HRABId se añadió a una concentración con el fin de observar la unión específica de HRAB16 a los compartimientos celulares específicos La localizacion se verificó con anticuerpos radiomarcados Una vez que HRAB18 se localizó en un compartimiento celular específico, se realizaron estudios de reconstitución libres de célula para investigar su función Por ejemplo, se puede desarrollar un sistema libre de célula que sea capaz de medir el transporte vesicular del retículo endoplásmico hacia la red trans Golgí Preferiblemente, este sistema libre de célula esta libre de HRAB18 de existencia natural y permite el estudio del efecto de los sistemas libres de célula carentes de RAB1d en transportes vesiculares La concentración de HRABId es gradualmente incrementada para recuperar la actividad de HRABId en el transporte vesicular Este método se utilizó para probar derivados de HRABId para actividad biológica XIII Clasificación de Fármaco Se utilizaron HRABId o células huésped conteniendo HRABId para clasificar compuestos que pueden afectar el tráfico vesicular a través de HRAB18, sus isoformas o aun otras proteina de RAB El polipéptido o fragmento empleados en tal prueba se utilizó en un sistema libre de célula o se ubico intracelularmente Un método para clasificar compuestos utiliza células huésped eucarióticas o procapoóticas, las cuales son establemente transformadas con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el pohpéptido del fragmento Los fármacos se clasificaron contra tales células transformadas en ensayos de unión competitivos Uno puede medir, por ejemplo las alteraciones en el transporte vesicular de péptidos específicos o neurotransmisores De esta manera, la presente invención provee métodos para clasificar compuestos de prueba los cuales pueden afectar la actividad de HRAB18 Estos métodos comprenden poner en contacto un compuesto con HRAB18 y analizar la presencia entre un complejo y el HRAB18 a través de métodos bien conocidos en la técnica. Después de la incubación adecuada, se separó el compuesto libre de aquél en forma unida, y la cantidad de compuesto unido es una medida de su capacidad para interferir en el funcionamiento regular de HRABId Otra técnica para clasificar el fármaco provee una clasificación de alta producción para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a HRAB18, como se describe en la Patente Europea 84/03564, incorporada aquí por referencia Los ensayos de clasificación de fármaco competitivos en los cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unir HRAB18 específicamente compiten con un compuesto de prueba para unirse a HRABId, son utilizados para determinar compuestos que se unen específicamente a HRABId De esta manera, los anticuerpos son utilizados para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con HRABId XIV Diseño de Fármaco Racional El objetivo del diseño de fármaco racional es producir análogos estructurales de poli péptidos biológicamente activos de interés o de pequeñas moléculas con las cuales interactua, incluyendo análogos no hidrolizables de GTP, por ejemplo Cualquiera de estos ejemplos puede ser utilizado para diseñar fármacos, los cuales son formas mas activas o estables del polipéptido o los cuales mejoran o interfieren con la función de un polipéptido m vivo (Hodgson J (1991) Bio/Tecnology 9 19-12, incorporada aquí por referencia) En un aspecto, la estructura tridimensional de una proteína de interés, o de un complejo de proteína-inhibidor, según determinado por cristalografía de rayos X, a través de modelación por computadora o más típicamente, a través de una combinación de dos aspectos Tanto la forma como las cargas del polipeptido son averiguadas para producir la estructura y para determinar sitios activos de la molécula Menos frecuente, la información util con respecto a la estructura de un polipeptido se obtiene modelando con base a una estructura de proteínas homologas En ambos casos, se utiliza la información estructural relevante para diseñar moléculas de tipo RAB análogas o para identificar inhibidores eficientes Los ejemplos útiles de diseño refarmaco racional pueden incluir moléculas que tengan actividad mejorada o estabilidad como se muestra por Braxton S y Wells JA (1992) Biochemistry 31 7796-7801 o las cuales actúan como inhibidores, agonistas, antagonistas de péptidos nativos como se muestra por Athauda SB et al (1993) J Biochem 113 742-746, incorporadas aquí por referencia También es posible aislar un anticuerpo específico en el objetivo, seleccionado mediante ensayo funcional como se describe anteriormente y después resolver su estructura de cristal Este aspecto, en principio, produce un farmaconucleo sobre el cual se puede basar el diseño de fármaco subsecuente Es posible derivar la cristalografía de proteína Generando anticuerpos anti-idiotí picos (anti-ids) a un anticuerpo funcional farmacológicamente activo Como una imagen de espejo de una imagen de espejo, el sitio de unió de los anti-ids es un análogo del receptor original El anti-id entonces puede ser utilizado para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química y biológicamente Los péptidos aislados actúan como el farmanúcleo HRAB18 se utiliza para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácido HRAB16 provisto en la presente proporcionará la guía de aquellas técnicas de moldeo de computadora en lugar de o además de la cristalografía de rayos X XV Uso y Administración de Fármacos Numerosas enfermedades han sido asociadas con la secreción alterada de hormonas o la resiculacion anormal de receptores de superficie en el tejido secretorio, particularmente el tejido de la pituitaria Por ejemplo, la mayoría de los casos de enanismo son ocasionados por una deficiencia de toda la secreción de la pituitaria anterior, mientras que el gigantismo resulta de la actividad en exceso y secreción en exceso de GH por las células somatropicas Todas estas enfermedades pueden ser asociadas con la regulación anormal de transporte vesicular, función y objetivo asociado con la expresión alterada de HRABId Ademas ya que HRABId puede jugar un papel en la endocitosis la expresión alterada de HRAB18 puede dar como resultado trastornos relacionados con la recirculación anormal de receptores Ya que HRAB16 parece regular el transporte vesicular entre los compartimientos intracelulares, se pueden utilizar compuestos que unan HRABId terapéuticamente para tratar la secreción anormal de hormonas pituitarias o niveles anormales de receptores en la superficie de la célula de pituitaria Alternativamente, estos compuestos pueden regular la secreción anormal de neutransmisores de la células neuronales Ademas, el mismo HRABId puede ser administrado para tratar un transtorno asociado con la expresión alterada de HRABId Los compuestos terapéuticos son formulados en un medio de vehículo acuoso no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable, de preferencia un pH de aproximadamente 5 a 8 muy preferiblemente de 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo con las características de la formulación y su administración Las características tales como solubilidad de la molécula vida media y antigenecidad/inmunogenecidad ayudaran para definir un vehículo efectivo Las moléculas recombinantes, orgánicas o sintéticas que resultan del diseño de fármaco pueden ser igualmente efectivas en situaciones particulares Los compuestos terapéuticos son administrados a través de rutas conocidas de administración incluyendo pero no limitándose a, cremas y geles tópicos aspersiones transmucosales y en aerosol parches y vendajes transtérmicos formulaciones inyectables, intravenosas y de lavado, líquidos realmente administrados y pildoras, particularmente para resistir las enzimas y el ácido del estómago La formulación particular, la dosis exacta y la ruta de administración serán determinadas por el médico que atiende y variarán de acuerdo con cada situación específica Tales determinaciones se hacen considerando variables múltiples tales como la condición que será tratada el compuesto terapéutico que será administrado y el perfil farmacocinético del compuesto terapéutico particular Factores adicionales que pueden tomarse en cuenta incluyen el estado de la enfermedad (por ejemplo severidad) del paciente, edad, peso, género, dieta, tiempo de administración, combinación de fármaco, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia Las formulaciones de compuesto terapéuticas de larga acción pueden ser administradas cada 3 o 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y el régimen de claro de HRAB18 terapéutico particular Las cantidades de dosis normales pueden variar de 0 1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración La guia de las dosis particulares y métodos para suministro se provee en la literatura, ver patentes EUA Nos 4,657,760, 5,206,344, o 5 225,212 Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para diferentes usos de los compuestos terapéuticos y que la administración con objeto a un tejido u órgano puede necesitar de el suministro en una forma específica Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan aquí por referencia La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la técnica practique la invención. En realidad, varias modificaciones de los modos descritos anteriormente para llevar a cabo la invención, los cuales son fácilmente evidentes para aquellos expertos en el campo de la biología molecular o campos relacionados pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC (n) TITULO DE LA INVENCIÓN HOMOLOGO HUMANO DEL GEN RAB 18 DE RATÓN (ni) NUMERO DE SECUENCIAS 2 (iv) DIRIGIR LA CORRESPONDENCIA (A) DIRECCIÓN INCYTE PHARM ACEUTICALS, INC (B) CALLE 3174 Porter Drive (C) CIUDAD Palo Alto (D) ESTADO CA (E) PAÍS E U A (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) 94304 (v) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO Disco blando (B) COMPUTADORA compatible con una PC IBM (C) SISTEMA DE OPERACIÓN PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE Patentln Reléase #1 0 Versión #1 30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL (A) NUMERO DE SOLICITUD PCT para ser designado (B) FECHA DE PRESENTACIÓN 21 de Jumo de 1996 (C) CLASIFICACIÓN (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR (A) NUMERO DE SOLICITUD: 60/000,377 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 de jumo de 1995 (víi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD 08/569,062 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 de diciembre de 1995 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE (A) NOMBRE: Glaister, Debra J (B) NUMERO DE REGISTRO 33ddd (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE. PF-0043 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO- 415-655-0555 (B) TELEFAX: 415-645-4166 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD. 1148 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE LA CADENA sencilla (D) TOPOLOGÍA lineal (li) TIPO DE MOLÉCULA ADNc (vil) FUENTE INMEDIATA (A) BIBLIOTECA Pituitaria (B) CLONAS 112352 (B) CLONA 112352 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 1: CGCACCCGGG CGGCCAGCTG GGCTCGGAGC GGAACGGGGT CAGGATGGAC GAGGACGTGC 60 TAACCACCCT GAAGATCCTC ATCATCGGCG AGAGTGGGGT GGGCAAGTCC AGCCTGCTCT 120 TGAGGTTCAC AGATGATACG TTTGATCCAG AACTTGCAGC AACAATAGGT GTTGACTTTA 180 AGGTGAAAAC AATTTCAGTG GATGGAAATA AGGCTAAACT TGCAATATGG GATACTGCTG 240 GTCAAGAGAG GTTTAGAACA TTAACTCCCA GCTATTATAG AGGTGCACAG GGTGTTATAT 300 TAGTTTATGA TGTCACAAGA AGAGATACAT TTGTTAAACT GGATAACTGG TTAAATGAAT 360 TGGAAACATA CTGTACAAGA AATGACATAG TAAACATGCT AGTTGGAAAT AAAATCGATA 420 AGGAAAATCG TGAAGTCGAT AGAAATGAAG GCCTGAAATT TGCACGAAAG CATTCCATGT 480 TATTTATAGA GGCAAGTGCA AAAACCTGTG ATGGTGTACA ATGTGCCTTT GAAGAACTTG 540 TTGAAAAGAT CATTCAGACC CCTGGACTGT GGGAAAGTGA GAACCAGAAT AAAGGAGTCA 600 AACTGTCACA CAGGGAAGAA GGCCAAGGAG GAGGAGCCTG TGGTGGTTAT TGCTCTGTGT 660 TATAAACTCT GGGAAATTCC ATCTCTTGCA TATTTGATCA GATAGTGACA TCTTTCTGTA 720 TATAAACTCT TTAACCTGCT ATTTTAGGGA CCTTGCAGTT TGCACATAAT TGTTTTATAT 780 CATAGCAGTA AATATTTGCA AGAAATCCCA CTCATCGACC CCGGGTAAAA TGTTATGGTA 840 AGCATGCACA GTTTGCAGTC TACAGTTTTT TTATGTAGCA CCAAATAGGT GTACCTTTAT 900 AAGTACATTC AATTTTATGA TTTACATTTA TCATGTAATT TTTAAAAAAA TCCATCTATC 960 TAGGATATGT TGATACAAAG TCTGCTTTTG CTATTCTTTT TGCTTAAATA CTCCTATCAT 1020 TTTCTGAATT ACTTGGTATT TAGAACTCCT AGCACCACGG GGAAGAATAG AGGTATCATC 1080 AAACGTGGCA AATTTTCTTT CAGGAATAAT AAAGAGCATG ATTCCACAGC CAAAAAAAAA 1140 AAAAAAAA 1148 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO 2 (i) CARACTERIZTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 206 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC. DE IDENT NO 2 Met Asp Glu Asp Val Leu Thr Thr Leu Lys Me Leu e Me 1 5 10 Gly Glu 5 Ser Gly Val Gly Lys Ser Ser Leu Leu Leu Arg Phe Thr Asp 20 25 30 Asp Thr Phe Asp Pro Glu Leu Ala Ala Thr lie Gly Val Asp Phe Lys 35 40 45 Val Lys Thr lie Ser Val Asp Gly Asn Lys Ala Lys Leu Ala Me Trp Asp 50 55 60 Thr Ala Gly Gin Glu Arg Phe Arg Thr Leu Thr Pro Ser Tyr Tyr Arg 65 70 75 Gly 80 Ala Gln Gly Val Me Leu Val Tyr Asp Val Thr Arg Arg Asp Thr 65 90 95 Phe Val Lys Leu Asp Asn Trp Leu Asn Glu Leu Glu Thr Tyr Cys Thr 100 105 110 Arg Asn Asp Me Val Asn Met Leu Val Gly Asn Lys Me Asp Lys Glu 115 120 125 Asn Arg Glu Val Asp Arg Asn Glu Gly Leu Lys Phe Ala Arg Lys His 130 135 140 Ser Met Leu Phe Me Glu Ala Ser Ala Lys Thr Cys Asp Gly Val Gln 145 150 155 Cys 160 Ala Phe Glu Glu Leu Val Glu Lys Me Me Gln Thr Pro Gly Leu 165 170 175 Trp Glu Ser Glu Asn Gln Asn Lys Gly Val Lys Leu Ser His Arg Glu 180 185 190 Glu Gly Gln Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Tyr Cys Ser Val Leu 195 200 205

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1 Un polmucleótido purificado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene la secuencia representada en SEQ ID No 2, o su complemento

2 El polmucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia mostrada en SEQ ID No 1 del nucleótido 45 al nucleotido 664

3 Un polinucle?tido purificado que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No 1 del nucleótido 1 al nucleótido 44

4 Un polinucleótido purificado que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No 1 del nucleótido 665 al nucleótido 1148

5 Un vector de expresión que comprende el pohnucleótido de la reivindicación 1

6 Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 5

7 Una molécula antisentido que comprende una secuencia de polinucleótido complementaria por lo menos una porción del polinucleótido de la reivindicación 2

8. Un método para producir un pol ipéptido que comprende la secuencia representada en SEQ ID No 2, dicho método comprendiendo: a) cultivar las células huésped de la reivindicación 6, bajo condiciones adecuadas para la expresión de pol i péptid o , y b) recuperar el polipéptido del cultivo celular

9. HRAB18 Purificado que tiene la secuencia de aminoácido presentada en SEQ ID No 2 10 Un anticuerpo específico para el pohpéptído purificado de la reivindicación 9. 11 Un método para clasificar una pluralidad de compuestos de prueba unirse al pohpéptido de la reivindicación 9, o a una porción del mismo, el método comprendiendo los pasos de a) proveer una pluralidad de compuestos de prueba b) combinar el pol ipéptido de la Reivindicación 9 o una porción del mismo, con cada uno de compuestos durante un tiempo suficiente para permitir la unión bajo condiciones adecuadas y c) detectar la unión del pol ipéptido de las reivindicación 9 o un fragmento del mismo, a cada uno de la pluralidad de compuestos, identificando así los compuestos que específicamente unen el polipépt ido de la reivindicación 9 o un fragmento del mismo 12 Una prueba de diagnóstico para la detección de secuencias de ácido nucleico que codifican HRABId en una muestra biológica, que comprende los pasos de a) combinar la muestra biológica con un pohnucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No 1, o un fragmento del mismo, bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo de hibridación de ácido nucleico entre la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID No y una secuencia de ácido nucleico complementario en la muestra, b) detectar el complejo de hibridación y c) comparar la cantidad del complejo de hibridación con un normal, en donde la presencia de un nivel anormal del complejo de hibridación se correlaciona positivamente con una condición asociada con la expresión alterada de HRABId 13 La prueba de diagnostico para la detección de secuencias de nucleótido que codifica HRABId en una muestra biológica, que comprende los pasos de a) combinar la muestra biológica con iniciadores de reacción de cadena de polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificación de ácido nucleico en donde los iniciadores comprenden fragmentos de la secuencia de nucleotido de SEQ ID No 1, b) detectar las secuencias del nucleótido amplificadas, y c) comparar la cantidad de secuencias de nucleótido amplificadas en la muestra biológica con un normal, determinado así si la cantidad de la secuencia de nucleótido vana de la normal, en donde la presencia de un nivel anormal de las secuencia de nucleótido se correlaciona positivamente con una condición asociada con la expresión alterada de HRABId