MXPA97009338A - Receptor de transmembrana-siete de tipo c5a - Google Patents
Receptor de transmembrana-siete de tipo c5aInfo
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Abstract
La presente invención provee secuencias de nucleótido y de aminoácido que identifican y codifican un receptor de transmembrana-7 de tipo C5a novedoso (CALR) expresado en células cebadas humanas. La presente invención también provee moléculas antisentido para las secuencias de nucleótido, las cuales codifican CALR, vectores de expresión para la producción del CALR purificado, anticuerpos capaces de unirse específicamente a CALR, sondas de hibridación o nucleótidos para la detección de secuencias de nucleótido que codifica CALR, pruebas de diagnóstico basadas en moléculas deácido nucleico que codifica CALR, células huésped genéticamente diseñadas por ingeniería para la expresión de CALR, y antagonistas e inhibidores del CALR de polipéptido.
Description
RECEPTOR DE TRANSMEMBRANA-SIETE DE TIPO C5a
CAMPO TÉCNICO
La presente invención está en el campo de biología molecular; más particularmente, la presente invención describe secuencias de ácido nucleico y aminoácido de un receptor de transmembrana-siete de tipo C5a.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El complemento, el cual es producido en el hígado y circula en la sangre y fluido extracelular, estimula células y anticuerpos para atacar infecciones. El complemento 5 (C5) es proteolíticamente dividido para producir C5a y C5b cada vez que el sistema de complemento es activado. C5a es una de las 13 proteínas responsables de limpiar proteínas extrañas y organismos de la sangre. Además, C5a humano, un péptido de aminoácido 74, funciona como un quimioatrayente para células del sistema inmune. El receptor C5a es un receptor de transmembrana-siete acoplado a la proteína G (T7G), el cual está presente en neutrofilos, macrófagos y células cebadas y se cree que se acopla con una proteína Gq-/Gn para activar la trayectoria de señalización del fosfoinositil. El receptor contiene 350 aminoácidos y es glicosilado en Asn5 para producir una proteína de 52-55 kDa. Un enlace de disulfuro une Cys109 en el primer lazo externo con Cys188 en el segundo lazo externo. El receptor C5a ha sido clonado (Boulay y otros (1991) Biochem. 30:2993-99; Gerard (1991) Nature 349:614-17; y Gerard y otros (1992) J. Immunol. 149:2600-06). Se cree que seis residuos de Asp en el término N del receptor C5a se unen a los residuos Arg y Lys en el ligando C5a. Con su afinidad para ligandos de péptido y su tercer lazo intracelular corto, el receptor C5a estrechamente se asemeja a los receptores T7G de neuroquinina. Los T7Gs característicamente contienen siete dominios hidrofóbicos, los cuales extienden la membrana del plasma y forman un haz de hélices a antiparalelas. Estos segmentos de transmembrana están designados por números romanos, l-VII, y representan aspectos estructurales y funcionales de receptor. En la mayoría de los casos, el haz forma una cavidad de unión; sin embargo, cuando el sitio de unión debe adaptar moléculas más voluminosas, el segmento N-terminal extracelular o uno o más de los tres lazos extracelulares participan en la unió (Watson S. y Arkinstall S. (1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA) y en la inducción subsecuente de cambio conformacional en porciones intracelulares del receptor. El receptor activado a su vez, interactúa con un complejo de proteína G intracelular, el cual media actividades de señalización intracelular adicionales, generalmente la producción de segundos mensajeros tales como AMP (cAMP) cíclica, fosfolipasa C, trifosfato de inositol, o proteínas del canal de iones.
Los receptores de neuroquinina incluyen taquiquinina (TK), péptido de formilo (fMLP), GnRH, y receptores E de prostaglandina. Son ligandos grandes, la mayoría péptidos, los cuales no fijan la cavidad de unión de T7G. Los términos N y los primeros lazos extracelulares tienen un sitio de reconocimiento de motivo de taquiquinina común, mientras que los segundo y tercer lazos extracelulares se unen a secuencias específicas de hormona, las cuales difieren entre los receptores. El término C, el cual es común a todas las isoformas se une a las hélices de la transmembrana y activa los receptores. El tercer lazo intracelular es el absolutamente corto en est grupo; y en fMLP, solamente tiene una longitud de 15 aminoácidos. Muchos de estos receptores tienen términos cortos C, y GnRH completamente carece del dominio C-terminal (Bolander FF (1994) Molecular Endocrinology, Academic Press, San Diego CA). La identificación del receptor de tipo C5a novedoso provee la oportunidad de diagnosticar o intervenir en aquellas condiciones patológicas o fisiológicas, en las cuales dichos receptores sin expresados o de otra manera están activamente involucrados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención provee una única secuencia de nucleótido, la cual codifica un homólogo de receptor de tipo C5a humano, novedoso, en la presente designado como CALR. El ADNc, en la presente designado como calr, fue identificado y clonado utilizando el clon Incyte No. 8118 de un colección de ADNc de célula cebada humana. La invención también se refiere al uso de la secuencia de nucleótido o la secuencia de aminoácido de CALR o sus variantes en el diagnóstico o tratamiento de condiciones o enfermedades asociadas con la actividad de expresión o de transducción de señal de CALR. Los aspectos de la invención incluye el ADN antisentido de calr; vectores de clonación o de expresión que contienen calr; células huésped u organismos transformados con vectores de expresión que contienen calr; y un método para la producción y recuperación de la proteína CALR purificada de células huésped. El CALR purificado puede ser utilizado para producir anticuerpos, antagonistas o inhibidores para uso diagnóstico o terapéutico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran la alineación entre las secuencias de nucleótido (SEC ID NO:1) y de aminoácido (SEC ID NO:2) para CALR. Los oligómeros utilizados para extender la secuencia de nucleótido parcial a una longitud completa fueron: XLR=GAAAGACAGCCACCACCACCACG y XLF=AGAAAGCAAGGCAG TTCATTCAGG. La Figura 2 presenta la alineación de CALR humano con CFOMC5AM, receptor de anafilatoxina de C5a de perro; los residuos en cajas son idénticos.
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Como se utiliza en la presente, CALR se refiere a un homólogo del receptor del tipo C5a, ya sea en una forma de existencia natural o sintética, o sus fragmentos activos, los cuales tienen la secuencia mostrada en SEC ID NO:2. En una modalidad, el polipéptido (designado por las letras mayúsculas, CALR) es codificado a través de ARNms transcribo del ADNc (designado por las letras minúsculas, calr) de SEC ID:NO:1. "Activo" se refiera a aquellas formas de CALR, las cuales retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de cualquier CALR de existencia natural. "CALR de existencia natural" se refiere a CALRs producidos por células humanas que no han sido genéticamente diseñadas por ingeniería y específicamente contempla varios CALRs que surgen de modificaciones post-translacionales del polipéptido incluyendo, pero no se limita a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. "Derivado" se refiere a CALRs químicamente modificados a través de cualesquiera técnicas tales como ubiquitinación, marcación (v. gr., radionúclidos, varias enzimas, etc.), pegilación (derivatización con glicol poilietilénico), e inserción o substitución mediante síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, la cual no es de existencia natural en proteínas humanas. "Variante recombinante" se refiere a cualquier polipéptido que tenga la actividad de la proteína CALR y difiere de los CALRs de existencia natural a través de inserciones, eliminaciones y substituciones de aminoácido, creada utilizando técnicas de ADN recombinante. La guía para determinar qué residuos de aminoácido pueden ser reemplazados, agregados o eliminados, sin abolir las actividades de interés, tales como transducción de señal, puede encontrarse comparando la secuencia del CALR con aquella de péptidos homólogos y reduciendo al mínimo el número de cambios de la secuencia de aminoácidos hechos en regiones altamente conservadas. Preferiblemente, las "substituciones" de aminoácido son el resultado de reemplazar uno aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina con una isoluecina o valina, un aspartato con glutamato, o una treonina con una serina, es decir, reemplazos conservadores. Las "inserciones" o "eliminaciones" están típicamente en la escala de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos, la variación permitida puede ser experimentalmente determinada produciendo el péptido sintéticamente o haciendo sistemáticamente inserciones, eliminaciones, o substituciones de nucleótidos en una molécula de calr utilizando técnicas de ADN y analizando las variantes recombinantes, expresadas, para la actividad. Cuando se desea, una "secuencia de señal o líder" puede dirigir al polipéptido a través de la membrana de una célula. Dicha secuencia puede estar normalmente presente sobre los polipéptidos de la presente invención o provistos de fuentes heterólogas a través de técnicas de ADN. Un "fragmento", "porción", o "segmento" de polipéptido es un estiramiento de residuos de aminoácido de por lo menos aproximadamente 5 aminoácidos, por lo regular por lo menos aproximadamente 7 aminoácidos, típicamente por lo menos alrededor de 9 a 13 aminoácidos, y, varías modalidades, por lo menos alrededor de 17 o más aminoácidos. Para ser activo, cualquier péptido de CALR debe tener una longitud suficiente para exhibir actividad biológica y/o inmunológica. Un "fragmento", "porción", "sonda" o "segmento" de "oligonucleótido" o polinucleótido es un estiramiento de residuos de nucleótido, el cual es suficientemente largo para usarse en una reacción de cadena de polimerasa (PCR) o varios procedimientos de hibridación. Los oligonucleótidos se preparan a base de la secuencia de ADNc, la cual codifica al CALR provisto por la presente invención y se utilizan para amplificar, o simplemente revelar la presencia de moléculas de ARN o ADN relacionadas. Los oligonucleótidos comprenden porciones de la secuencia de ADN que tienen por lo menos alrededor de 10 nucleótidos y tanto como aproximadamente 35 nucleótidos, de preferencia aproximadamente 25 nucleótidos. Las sondas de ácido nucleico comprenden porciones de la secuencia calr que tienen menos nucleótidos, aproximadamente menos de 6 kb, de preferencial menos de aproximadamente 1 kb. Después de una prueba apropiada para eliminar positivos falsos, tanto los oligonucleótidos como las sondas de ácido nucleico pueden ser utilizados para determinar si los ARNms que codifican CALR están presentes en una célula o tejido o para aislar secuencias de ácido nucleico similares del ADN cromosomal, según descrito por Wailsh PS y otros (1992, PCR Methods Appl. 1:241-50). Las sondas pueden derivarse de ácidos nucleicos de estructura de cadena individual o doble de existencia natural o recombinantes o químicamente sintetizados. Pueden ser marcados a través de translación de muesca, reacción llenado Klenow, PCR u otros métodos conocidos en la técnica. Las sondas de la presente invención, su preparación y/o marcación están elaborados en Sambrook J. y otros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Col Spring Harbor NY; o Ausubel FM y otros (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, ambas incorporadas aquí por referencia. Las variantes recombinantes que codifican T7Gs pueden ser sintetizadas o seleccionadas haciendo uso de la "redundancia" en el código genético. Varias substituciones de codon, tales como las cargas silenciosas, las cuales producen sitios de restricción específicos, pueden ser introducidas para optimizar la clonación a un plásmido o vector viral o para incrementar la expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. También se pueden introducir mutaciones específicas de uso o quimeras conteniendo los dominios de péptidos relacionados añadidos para probar o modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido, particularmente para cambiar las afinidades de unión de ligando, afinidades de intercadena, o régimen de degradación/cambio. La presente invención provee una única secuencia de nucleótido que identifica un receptor de tipo C5a novedoso, el cual fue identificado primero en células cebadas humanas. La secuencia para calr se muestra en SEC ID NO:1 y es homologa a la secuencia de GenBank, CFCOMC5AM para el receptor de anafilaoxina C5a. El Incyte 8118 tiene un 45% de identidad de aminoácido con el receptor C5a y difiere del mismo en que tiene solamente tres residuos de carboxilato en el término N, dos de los cuales son Glu en lugar de Asp. Además, el término N del Incyte 8118 es más corto que aquel del receptor C5a publicado y se podría esperar que tenga un carácter específico de unión diferente . Ya que CALR se expresa en células activas en inmunidad, el ácido nucleico (calr), polipéptido (CALR) y anticuerpos para CALR son útiles en investigaciones de intervención en los procedimientos fisiológicos y patológicos normales y anormales, los cuales están asociados con el papel de las células cebadas en la inmunidad. Por lo tanto, un ensayo para la expresión super-regulada de CALR puede acelerar el diagnóstico y el tratamiento apropiado de condiciones causadas por eventos de transducción de señal anormales debido a respuestas anafilácticas o hipersensibles, infecciones sistémicas y locales, daño traumático y otro daño al tejido, enfermedades hereditarias o ambientales asociados con hipertensión, carcinomas, y otros problemas fisiológicos o patológicos.
La secuencia de nucleótido que codifica CALR (o su complemento) tiene numerosas otras aplicaciones en técnicas conocidas por aquellos expertos en el campo de la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación para análisis Southern o Northern, uso como olígómeros para PCR, el uso para mapeo cromosomal y de genes, el uso en la producción recombinante de CALR, el uso en la generación de ADN o ARN antisentido, sus análogos y similares, y el uso en la producción de moléculas qiméricas para seleccionar agonistas, inhibidores o antagonistas para el diseño de moléculas terapéuticas de dominio específico. Los usos de los nucleótidos que codifican el CALR, descritos en la presente, son ilustrativos de técnicas conocidas y no pretenden limitar su uso en ninguna técnica conocida a un experto en la técnica. Además, las secuencias de nucleótido descritas en la presente, pueden ser utilizadas en técnicas de biología molecular que no han sido desarrolladas, siempre que las nuevas técnicas se basen en propiedades de las secuencias de nucleótido que actualmente sean conocidas, v. gr., el código genético de triplete, interacciones de pares de base específicas, etc. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótido que codifican CALR, algunas llevando una homología mínima para la secuencia de nucleótido de cualquier gen conocido y de existencia natural. La invención ha contemplado específicamente cada posible variación de la secuencia de nucleótido que puede hacerse seleccionando combinaciones a base de posibles elecciones de codon . Esta combinaciones se hacen de acuerdo con el código genético de triplete normal como se aplica a la secuencia de nucleótido del CALR de existencia natural, y todas estas variaciones serán consideradas como siendo específicamente descritas. Aunque las secuencias de nucleótido, las cuales codifican al CALR y sus variantes son preferiblemente capaces de la hibridación a la secuencia de nucleótido del gen de CALR de existencia natural bajo condiciones severas, puede ser ventajoso producir las secuencias de nucleótido que codifican al CALR o sus derivados poseyendo un uso de codon substancialmente diferente. Los codones pueden ser seleccionados para i ncrementar la velocidad a la cual ocurre la expresión del péptido en un huésped de expresión procariótico o eucariótico de acuerdo con la frecuencia con la cual los codones particulares son utilizados por el huésped . Otras razones para alterar substancialmente la secuencia de nucleótido que codifica al CALR y sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácido codificada i ncluyen la prod ucción de transcripciones de ARN que tienen más propiedades deseables, tales como vida media mayor, que las transcripciones producidas de la secuencia de existencia natural . La secuencia de nucleótido que codifica CALR puede ser unida a una variedad de otras secuencias de nucleótido a través de técnicas de ADN recombinante bien establecidas (Sambrook y otros, supra) Las secuencias de nucleótido útiles para unirse a calr incluyen una determinación de vectores de clonación tales como plásmidos, cósmidos , derivados del fago lambda, fagémidos, y similares, que son bien conocidos en la técnica y pueden ser seleccionados para dichas características como el inserto de tamaño en que pueden adaptarse, su utilidad , su fidelidad , etc. Otros vectores de interés incluyen vectores de expresión , vectores de replicación, vectores de generación de sonda, vectores de secuenciación , vectores de mapeo YAC o BAC, y similares. En general, estos vectores pueden contener un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, sitios sensi bles de endonucleasa de restricción convenientes, y marcadores seleccionables para recuperar células huésped transformadas . Otro aspecto de la presente invención es proveer sondas de hibridación de ácido nucleico específicas en calr capaces de la hibridación con secuencias de nucleótido de existencia natural que codifican al CALR . Dichas sondas también pueden ser utilizadas para la detección de secuencias que codifican al CALR y deben contener preferiblemente por lo menos 50% de los nucleótidos de cualquier dominio particular de interés a partir de esta secuencia que codifica calr. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser derivadas de la secuencia de nucleótido de S EC I D N O : 1 o de la secuencia genómica incluyendo promotores , elementos mejoradores e introns del calr de existencia natural respectivo. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas a través de una variedad de grupos reportadores, incluyendo radionúclidos tales como 32P p 3SS, o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda vía sistemas de avidina/biotina, y similares. La PCR, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,965,188 proveen usos adicionales para oligonucleótidos con base en las secuencias de nucleótido, las cuales codifican al CALR. Dichas sondas utilizadas en la PCR pueden ser de origen recombinante, pueden ser químicamente sintetizadas, o pueden ser una mezcla de ambos, y comprender una secuencia de nucleótido discreta para uso diagnóstico o un depósito de degeneración de posibles secuencias para la identificación de secuencias T7G estrechamente relacionadas. Los genes de longitud completa pueden ser clonados utilizando un nuevo método como se describe en la Solicitud de Patente Serie No. 08/487,112, presentada el 7 de Junio de 1995, e incorporada aquí por referencia, la cual emplea XL-PCR (Perkin-Elmer, Foster, CA) para amplificar piezas largas de ADN. Este método fue desarrollado para permitir que un sólo investigador procese genes múltiples (hasta 20 o más) en un momento y obtenga una secuencia extendida (posiblemente de longitud completa)en 6-10 días. Reemplaza los métodos actuales que utilizan sondas marcadas para clasificar colecciones y los cuales permiten que un investigador procese sólo aproximadamente 3-5 genes en 14-40 días. En el primer paso, el cual puede ser realizado en aproximadamente 2 días, se designan iniciadores y se sintetizan con base en una secuencia parcial conocida. En el paso 2, el toma aproximadamente de seis a ocho horas, la secuencia es extendida a través de amplificación de PCR de una colección seleccionada. Los pasos 3 y 4, los cuales toman aproximadamente un día, son la purificación del ADNc amplificado y su ligación a un vector apropiado. El paso 5, el cual toma aproximadamente un día, implica la transformación y el crecimiento de las bacterias huésped. En el paso 6, el toma aproximadamente cinco horas, se utiliza la PCR para clasificar clones bacterianos para una secuencia extendida. Los pasos finales, los cuales toman aproximadamente un día, implican la preparación y secuenciación de los clones seleccionados. Si el ADNc de longitud completa no ha sido obtenido , todo el procedimiento es repetido utilizando ya sea la colección origina o alguna otra colección preferida, la colección preferida puede ser una que ha sido seleccionada por tamaño para incluir sólo ADNc más grandes o puede consisti r de colecciones comercialmente dispon ibles individuales o combinadas, por ejemplo, pulmón, hígado y cerebro de Gibco/BRL (Gaithersburg MD). La colección de ADNc puede haber sido preparada con iniciadores oligo d(T) o aleatorios. La ventaja de utilizar colecciones con iniciadores aleatorios es que tendrán más secuencias que contengan extremos 5' de genes. Una colección con iniciador aleatorio pueden ser particularmente útiles si una colección oligo d(T) no produce un gen completo. Obviamente, entre más grande sea la proteína, es menos probable que el gen completo sea encontrado en un plásmido individual .
Otros medios para producir sondas de hibridación para ADNcs de T7G incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico que codifica CALR o sus derivados a vectores para la producción de sondas de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles y pueden ser utilizados para sintetizar sondas de ARN in vitro a través de la adición de la polimerasa de ARN apropiada como polímerasa de ARN de T7 o SP6 y los nucleótidos marcados apropiados. Ahora es posible producir una secuencia de ADN , o proteínas del mismo, que codifica CALR y/o sus derivados completamente mediante química sintética . Dichas moléculas pueden ser insertadas a cualquiera de los muchos vectores disponibles utilizando reactivos y métodos que son conocidos en la técnica en el momento de la presentación de esta solicitud . Además, se puede utilizar la química sintética para introducir mutaciones a las secuencias de calr o cualquier porción del mismo. La secuencia de nucleótido puede ser utilizada para desarrollar un ensayo para detectar la activación, inflamación o enfermedad asociada con niveles anormales de la expresión de CALR. La secuencia de nucleótido puede ser marcada a través de métodos conocidos en la técnica y añadida a una muestra de fluido o tejido de un paciente. Después de un período de incubación suficiente para efectuar la hibridación , la muestra se lavó con un fluido compatible, el cual contiene un marcador visible, un colorante u otra(s) molécula(s) apropiada(s) , si el nucleótido ha sido marcado con una enzima. Después de que el fluido compatible es enjuagado, el colorante es cuantificado y comparado con un normal. Si la cantidad de colorante es significativamente elevada (o reducida, según sea el caso), la secuencia de nucleótído se ha hibridizado con la muestra, y el ensayo indica una condición anormal tal como inflamación o enfermedad. La secuencia de nucleótido para calr puede ser utilizada para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen. La secuencia de nucleótído provista en la presente, puede ser mapeada a un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas de mapeo genético y/o cromosomal bien conocidas. Estas técnicas incluyen hibridación in situ. análisis de enlace contra marcadores cromosomales conocidos, clasificación de hibridación con colecciones o preparaciones cromosomales clasificadas por flujo, específicas a cromosomas conocidos, y similares. La técnica de hibridación fluorescente in situ de cromosomas se ha descrito ampliamente, entre otros lugares, en Verma y otros (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York. La hibridación fluorescente in situ de preparaciones cromosomales y otras técnicas de mapeo de cromosoma físico pueden estar correlacionadas con datos de mapa genético adicionales. Los ejemplos de datos de mapa pueden encontrarse en 1994 Genome Issue of Science (265:1981f). La correlación entre la ubicación de calr en un mapa cromosomal físico y una enfermedad específica (o predisposición a una enfermedad específica) puede ayudar a delimitar la región de ADN asociado con aquella enfermedad genética. La secuencia de nucleótido déla presente invención puede ser utilizada para detectar diferencias en la secuencia de gen entre individuos normales y portadores o afectados. La secuencia de nucleótido que codifica al CALR puede ser utilizada para producir CALR purificado utilizando métodos bien conocidos de la tecnología de ADN recombinante. Entre las michas publicaciones que enseñan métodos para la expresión de genes después de que han sido aislados es Goeddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego CA. El CALR puede ser expresado en una variedad de células huésped, ya sea procarióticas o eucarióticas. Las células huésped pueden ser de la misma especie en donde las secuencias de nucleótido de calr son endógenas o de una especie diferente. Las ventajas de producir CALR a través de tecnología de ADN recombinante incluyen obtener cantidades adecuadas de la proteína para la purificación y la disponibilidad de los procedimientos de purificación simplificados. Las células transformadas con ADN que codifica CALR pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de CALR y recuperación de la proteína del cultivo de célula. El CALR producido a través de una célula recombinante puede ser secretado o puede estar contenido intracelularmente dependiendo de la construcción genética particular. En general, es más conveniente preparar proteínas recombinantes en forma secretada. Los pasos de purificación varían con el procedimiento de producción y la proteína particular producida. Varios métodos para el aislamiento del polipéptido de CALR pueden lograrse a través de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, dicho polipéptido puede ser purificado mediante cromatografía de ¡nmunoafinidad empleando los anticuerpos provistos por la presente invención. Varios otros métodos de purificación de proteína, bien conocidos en la técnica, incluyen aquellos descritos en Deutscher M (1990) Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press, San Diego CA; y en Scopes R (1982) Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York, ambas incorporadas aquí por referencia. Además de la producción recombinante, se pueden producir fragmentos de CALR a través de síntesis directa de péptido utilizando técnicas de fase sólida (cf Stewart y otros (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco CA; Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). La síntesis de proteína in vitro puede ser realizada utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática puede ser lograda, por ejemplo, utilizando Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (ABI, Foster, California) de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante. Varios fragmentos de CALR pueden ser químicamente sintetizados en forma separada y combinados utilizando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa. El CALR para la inducción de anticuerpo no requiere actividad biológica; sin embargo, la proteína debe ser antigénica. Los péptidos utilizados para inducir anticuerpos específicos pueden tener una secuencia de aminoácido que consiste de por lo menos cinco aminoácidos, de preferencia por lo menos 10 aminoácidos. Estos deben asemejarse a una porción estructural expuesta de la secuencia de aminoácido (un epítope) de la proteína y puede contener toda la secuencia de aminoácido de un dominio individual de CALR. Los estiramientos cortos de aminoácidos de CALR pueden fusionarse con aquellos de otra proteína tal como una hemocianina de limpeto de clave, y un anticuerpo producido contra la proteína de fusión. Los anticuerpos específicos para CALR pueden ser producidos mediante la inoculación de un animal apropiado con el polipéptido o un fragmento antigénico. Un anticuerpo es específico para CALR si es específico para un epítope inmunogénico del polipéptido y se une a por lo menos parte de la proteína natural o recombinante. La producción de anticuerpo incluye no sólo la estimulación de una respuesta inmune mediante la inyección a animales, sino que también pasos análogos en la producción de anticuerpos sintéticos u otras moléculas de unión específica tales como la clasificación de colecciones de inmunoglobulina recombinante (Orlandi R. y otros (1989) PNAS 86:3833-37, o Huse WD y otros (1989) Science 256:1275-81) o la estimulación in vitro de poblaciones de linfocito. La tecnología actual (Winter G y Milstein C (1991) Nature 349:293-99) provee un número de reactivos de unión altamente específicos basados en los principios de la formación de anticuerpo. Estas técnicas pueden ser adaptadas para producir moléculas específicamente uniendo dominios particulares de CALR. Una modalidad adicional de la presente invención es el uso de anticuerpos específicos de CALR o similares como agentes bioactivos para tratar eventos de transducción de señal anormales asociados con infecciones sistémicas y locales de respuestas anafilácticas o hipersensibles, daño traumático o de tejido, enfermedades hereditarias o ambientales asociadas con hipertensión, carcinomas, y otros problemas fisiológicos o patológicos. La composiciones bioactivas que comprenden agonistas, antagonistas o inhibidores de CALR pueden ser administradas en una dosis terapéutica adecuada determinada por cualquiera de las varias metodologías incluyendo estudios clínicos es especies de mamíferos para determinar la dosis máxima tolerable y en sujetos seres humanos normales para determinar la dosis segura. Además, el agente bioactivo puede formarse como complejo con una variedad de compuestos o composiciones bien establecidas, los cuales mejoran la estabilidad o propiedades farmacológicas tales como vida media. Se contempla que una composición terapéutica, bioactiva es suministrada a través de infusión intravenosa a la corriente sanguínea o cualquier otro medio efectivo que pueda ser utilizado para el tratamiento. Los ejemplos que se presentan a continuación se proveen para describir la presente invención. Estos ejemplos se proveen a manera de ilustración y no son incluidos con el propósito de limitar la invención.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
I. Aislamiento de ARNm y Construcción de la Colección de
ADNc La secuencia de CALR de esta solicitud fue identificada primero en el clon 8118 de Incyte (SEC ID NO:1) entre las secuencias que comprenden la colección de célula cebada humana. Las células utilizadas para preparar la colección de célula cebada humana fueron obtenidas de un paciente con cáncer de la Clínica Mayo. La colección de ADNc de la célula cebada se preparó purificando el ARNm de poli-A+ y sintetizando, enzimáticamente, el ADN complementario de estructura de cadena doble. Se ligaron adaptadores sintéticos a los ADNcs de extremo rasurado, los cuales después se ligaron al vector Uni-ZAP™ derivado de lambda de fago (Stratagene, La Jolla CA). Esto permitió la construcción de la colección de lambda unidireccional (orientación de sentido) de alta eficiencia y la conveniencia de un sistema de plásmido con selección de cloro azul/blanco para detectar clones con inserciones de ADNc.
La calidad de la colección del ADNc fue clasificada utilizando sondas de ADN, y después, el fagémido pBluescript® (Stratagene) fue cortado. Este fagémido permite el uso de un sistema de plásmido para facilitar la caracterización de inserto, secuenciación, mutagénesis dirigida al sitio, la creación de eliminaciones unidireccionales y la expresión de polipéptidos de fusión. Subsecuentemente, las partículas de fago de colección construida como de costumbre fueron infectadas en XL1-Bue® de la cepa huésped de E. coli (Stratagene). La transformación de alta eficiencia de esta cepa bacteriana incrementa la probabilidad de que la colección de ADNc contendrá clones raros, sub-representados. Los vectores unidireccionales alternativos pueden incluir, pero no se limitan a, ADNIpc (Invitrogen, San Diego, CA) y pSHIox-1 (Novagen, Madison Wl).
II. Aislamiento de Clones de ADNc Las formas de fagémido de clones de ADNc individuales fueron obtenidas a través del procedimiento de corte in vivo, en el cual XL1-BLUE fue co-infectado con un fago auxiliar f1. Las proteínas derivadas tanto del fago lambda como del fago auxiliar f1 inician la nueva síntesis de ADN de las secuencias definidas en el ADN objetivo de lambda, y crean una molécula de ADN de fagémido circular, de estructura de cadena individual, más pequeña, que incluyó todas las secuencias de ADN del fagémido pBluescript y el inserto de ADNc. El ADN de fagémido fue liberado de las células y purificado y utilizado para reinfectar células huésped frescas (SOLR™, Stratagene), en donde se produjo ADN de fagémido de estructura de cadena doble. Ya que el fagémido lleva el gen para ß-lactamasa, las bacterias recientemente transformadas fueron seleccionadas en un medio conteniendo ampicilina. El ADN de fagémido se purificó utilizando el Sistema de Purificación de Plásmido QIAWELL-8 de QIAGEN® DNA Purification System (QIAGEN Inc. Chatsworth CA). Esta técnica provee un método de alta producción conveniente, rápido y confiable, para lisar las células bacterianas y aislar el ADN de fagémido altamente purificado. El ADN se eluyó de la resina de purificación y se preparó para la secuenciación de ADN y otras manipulaciones analíticas.
lll. Secuenciación de Clones de ADNc Los insertos de ADNc de los aislados aleatorios de la colección de placenta fueron secuenciados en parte. En la técnica son bien conocidos los métodos para secuenciar ADN. Los método enzimáticos convencionales emplearon fragmentos de Klenow de polimerasa de ADN, SEQUENASE® (US Biochemical Corp. Cleveland OH) o polimerasa de Taq para extender las cadenas de ADN de un iniciador de oligonucleótido reforzado a la plantilla de ADN de interés. Se han desarrollado métodos para el uso de plantillas tanto de estructura de cadena individual como doble. Los productos de reacción de terminación de cadena fueron electroforados sobre geles de urea-acrilamida y se detectaron tanto mediante autoradiografía (para precursores marcados con radionúclido) o mediante fluorescencia (o precursores marcados fluorescentes). Las recientes mejoras en la preparación de reacción mecanizada, secuenciación y análisis utilizando el método de detección fluorescente han permitido la expansión en el número de secuencias que pueden ser determinadas por día utilizando máquinas tales como Catalyst 800 y los secuenciadores de Applied Biosystems 377 o 373 DNA.
IV. Búsqueda de Homología de Clones de ADNc y Proteínas Deducidas Cada secuencia así obtenida se comparó con secuencias en GenBank, utilizando un algoritmo de búsqueda desarrollado por Applied Biosystems e incorporado en el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT™ 670. En este algoritmo, se utilizó un Lenguaje de Especificación de Patrón (Pattern Specification Language, desarrollado por TRW Inc., Los Angeles CA) para determinar regiones de homología. Los tres parámetros determinan cómo las comparaciones de secuencia realizaron el tamaño de ventana, desviación de ventana, y tolerancia de error. Utilizando una combinación de estos tres parámetros, la base de datos del ADN se buscó para secuencias conteniendo regiones de homología a la secuencia en cuestión, y las secuencias apropiadas fueron clasificadas con un valor inicial. Subsecuentemente, estas regiones homologas fueron examinadas utilizando gráficas de homología de matriz dot para distinguir las regiones de homología de las comparaciones de oportunidad. Las homologías de secuencias de péptido y proteína fueron averiguadas utilizando el Sistema de Análisis de Secuencia INHERIT™ 670 en una forma similar a aquella utilizada en homologías de secuencia de ADN. El Lenguaje de Especificación de Patrón y las ventanas de parámetro fueron utilizadas para buscar las bases de datos de la proteína para secuencias que contienen regiones de homología, las cuales fueron clasificadas con un valor inicial. Las gráficas de homología de matriz dot fueron examinadas para distinguir regiones de homología significativa de las comparaciones de oportunidad. Alternativamente, BLAST, el cual representa Basic Local Aligment Search Tool, se utilizó para buscar las alineaciones de secuencia locales (Altschul SF (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul, SF y otros (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10). BLAST produce alineaciones de secuencias tanto de nucleótido como de aminoácido para determinar la similitud de la secuencia. Debido a la naturaleza local de las alineaciones, BLAST es especialmente útil para determinar las comparaciones exactas o para identificar homólogos. Mientras que es ideal apara las combinaciones con contienen huecos, es inapropiado para realizar la búsqueda de estilo de motivo. La unidad fundamental de la producción del algoritmo BLAST es el Par de Segmento de Alta Clasificación (HSP). Un HSP consiste de dos fragmentos de secuencia de longitudes arbitrarias pero iguales, cuya alineación está localmente externa y para la cual la clasificación de la alineación satisface o excede un umbral o clasificación de corte fijadas por el usuario. El aspecto BLAST es buscar HSPs entre una secuencia en cuestión y una secuencia de base de datos, para evaluar la significancia estadística de cualesquiera comparaciones encontradas, y para reportar solamente aquellas comparaciones que satisfacen el umbral de significancia seleccionado por el usuario. El parámetro E establece el umbral estadísticamente significativo para reportar las comparaciones de la secuencia de base de datos. E es interpretada como la unión superior de la frecuencia esperada de ocurrencia de oportunidad de una HSP (o grupo de HSPs) dentro del contexto de toda la búsqueda de base de datos. Cualquier secuencia de base de datos, cuya comparación satisface E es reportada en la producción de programa.
V. Identificación, Clonación de Longitud Completa, Secuenciación y Translación El análisis de INHERIT™ resulta de las porciones aleatoriamente recogidas y secuenciadas de clones de la colección de célula cebada identificada como Incyte 8118 como un homólogo del receptor C5a canino, CFOMC5AM (Perret y otros, supra). El inserto de ADNc que comprende el Incyte 8118 fue totalmente secuenciado y utilizado como la base para la clonación del ADNc de longitud completa. El ADNc del Incyte 8118 se extendió a una longitud completa utilizando un procedimiento de XL-PCR modificado (Perkin Elmer) como se describe en la Solicitud de Patente Serie No. 08/487,112, por Guegler y otros, presentada el 7 de Junio de 1995, e incorporada aquí por referencia. Dos iniciadores fueron diseñados uno para iniciar la extensión en la dirección antisentido (XLR = GAAAGACAGCCACCACCACCACG) y el otro para extender la secuencia en la dirección de sentido (XLF = AGAAAGCAAGGCAG TTCATTCAGG). Los iniciadores permitieron que la secuencia fuera extendida "hacia afuera" de la secuencia conocida. Esto generó amplicones que contienen la secuencia de nucleótido desconocida, nueva para el gen de interés. Los iniciadores fueron diseñados utilizando Oligo 4.0 (National Biosciences Inc. Plymouth MN) para tener una longitud de 22-30 nucleótidos, tener un contenido de GC de 50% o más, y reforzar a la secuencia objetivo a temperaturas de aproximadamente 68-72°C. Cualquier estiramiento de nucleótidos, el cual podría resultar en estructuras de horquilla y se evitaron la dimerizaciones de inciador-iniciador. La colección de ADNc de célula cebada fue utilizada como una plantilla, y los iniciadores XLR y XLS fueron utilizados para extender y amplificar la secuencia 8118. Siguiendo las instrucciones para el equipo de XL-PCR y mezclando concienzudamente la enzima, mezcla de reacción, etc., se obtuvo la amplificación de alta fidelidad. Empezando con 25 pMoles de cada iniciador y las concentraciones recomendadas de todos los otros componentes del equipo, se realizó la PCR utilizando MJ PTC200 (MJ Research, Watertown MA) y los siguientes parámetros: Paso 1 94°C durante 60 seg. (desnaturalización inicial) Paso 2 94°C durante 15 seg. Paso 3 65°C durante 1 min . Paso 4 68°C durante 7 min. Paso 5 Repetir pasos 2-4 15 veces adicionales Paso 6 94°C durante 15 seg. Paso 7 65°C durante 1 min . Paso 8 68°C durante 7 min + 15 seg . /ciclo Paso 9 repetir pasos 6-8 1 1 veces adicionales Paso 10 72°C durante 8 min . Paso 1 1 4°C (y mantener) Al final de los 28 ciclos , se removieron 50 µl de la mezcla de reacción; y la mezcla de reacción restante se operó durante 10 ciclos adicionales como s observó anteriormente: Paso 1 94°C durante 15 seg. Paso 2 65°C durante 1 min. Paso 3 68°C durante ( 10 min . + 15 seg.)/ciclo Paso 4 Repetir pasos 1 -3 9 veces adicionales Paso 5 72°C durante 10 min . Se analizó una alícuota de 5- 10 µl de la mezcla de reacción mediante electroforesis sobre un mini gel de agarosa a una concentración baja, aproximadamente 0.6-0.8% , para determinar que reacciones tuvieron éxito para extender la secuencia. Aunque todas las extensiones potencialmente contuvieron un gen de longitud completa, algunos de los productos más grandes o bandas fueron seleccionados y cortados del gel. La purificación adicional implicó el uno de un método de extracción en gel comercial tal como QIAQuick™ (QIAGEN). Después de la recuperación del ADN, se utilizó la enzima Klenow para cortar las proyecciones de nucleótido, de estructura de cadena individual creando extremos rasurados, los cuales facilitan la religación y clonación. Después de la precipitación con etanol, los productos se volvieron a disolver en 13 µl de regulador de pH de ligación. Después, se añadieron 1 µl de ligasa de T4-ADN (15 unidades) y 1µl de quinasa de polinucleótido de T4, y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2-3 horas o durante la noche a 16°C. Las células de E^ coli competentes (en 40 µl de medios apropiados) fueron transformadas con 3 µl de mezcla de ligadura y se cultivaron en 80 µl de un medio de SOC(Sambrook J. y otros, supra). Después de la incubación durante una hora a 37°C, la mezcla de transformación completa se colocó en placas sobre agar Luria Bertani (LB) (Sambrook J. y otros, supra) conteniendo carbenicilina a 25 mg/L. Al día siguiente, se recogieron aleatoriamente de cada placa 12 colonias y se cultivaron en 150 µl de un medio de LB/carbenicilina colocado en una cavidad individual de una placa de microtitulación de 96 cavidades, estéril, comercialmente disponible. Al día siguiente, se transfirieron 5 µl de cada cultivo durante la noche a una placa de 96 cavidades no estéril y después de dilución con 1:10 con agua, se transfirieron 5 µl de cada muestra a una disposición de PCR. Para la amplificación mediante PCR, se añadieron a cada cavidad 15 µl de la mezcla de PCR (1.33X) concentrado conteniendo 0.75 unidades de polimerasa de Taq, un iniciador de vector y uno o ambos iniciadores específicos de gen utilizados para la reacción de extensión), la amplificación se realizó utilizando las siguientes condiciones: Paso 1 94°C durante 60 min. Paso 2 94°C durante 20 seg. Paso 3 55°C durante 30 seg. Paso 4 72°C durante 9o seg. Paso 5 Repetir pasos 2-4 durante 29 veces adicionales Paso 6 72°C durante 180 seg. Paso 7 4°C (y mantener). Las alícuota de estas reacciones de PCR se realizaron sobre geles de agarosa junto con marcadores de peso molecular. Los tamaños de los productos de PCR fueron comparados con los ADNcs parciales, originales, y se seleccionaron clones apropiados, se ligaron al plásmido y se secuenciaron. Las secuencias de ADNc (SEC ID NO:) y de aminoácido (SEC ID NO:2) para CALR humano se muestran en las Figuras 1A-C. El calr del Incyte produjo una clasificación de BLAST de 412 cuando se comparó con la secuencia del receptor C5a y tiene una probabilidad de 1.8"50 de que la similitud de la secuencia ocurrió por casualidad. Este homólogo de calr también se asemeja con varios receptores de N-formilpéptido generando clasificaciones de BLAST que varían de 381 a 363 con probabilidades de 7.4"46 a 3.2"43. Cuando la translación del CALR se buscó contra las bases de datos tales como SwissProt y PIR, no se encontraron comparaciones exactas. La Figura 2 muestra la comparación de la secuencia de calr humano con aquella del receptor C5a de perro, CFOMC5AM.
VI. Análisis de Antisentido El conocimiento de la secuencia de ADNc completa, correcta de calr permite su uso como una herramienta para la tecnología de antisentido en la investigación de la función del gen. Los oligonucleótidos, ADNc o fragmentos genómicos que comprenden la estructura de cadena de antisentido de calr se utilizan ya sea in vivo o in vitro para inhibir la expresión del ARNm. Dicha tecnología es ahora bien conocida en la técnica, y las moléculas de antisentido se designan en varias ubicaciones a los largo de las secuencias de nucleótido. Mediante el tratamiento de las células o animales de prueba completos con dichas secuencias de antisentido, el gen de interés puede ser efectivamente desactivado. Frecuentemente, la función del gen se averiguó observando el comportamiento a un nivel intracelular, celular, de tejido o de organismo (v. gr., pérdida de función diferenciada, cambios en la morfología, etc.). Además de utilizar las secuencias construidas para interrumpir la transcripción de un marco de lectura abierto particular, se obtienen modificaciones de expresión de gen diseñando secuencias de antisentido a regiones intron, promotores/elementos mejoradores, o aún genes de regulación de trans-acción. Similarmente, la inhibición se logra utilizando la metodología de pares de base Hogeboom, también conocida como pares de base de "hélice triple".
Vil. Expresión del CALR La expresión del calr se logra subclonando los ADNcs a vectores de expresión apropiados y transfectando los vectores a huéspedes de expresión análogos. En este caso particular, el vector de clonación previamente utilizado para la generación de la colección de ADNc, pBluescript, también provee la expresión directa de las secuencias de calr en E . coli. Corriente arriba del sitio de clonación, este vector contiene un promotor para ß-galactosidasa, seguido por la secuencia que contiene la amino-terminal Met y los 7 residuos subsecuentes de ß-galactosidasa. Inmediatamente después de estos ocho residuos está un promotor de bacteriófago diseñado mediante ingeniería útil para iniciadores artificiales y transcripción y un número de sitios de restricción únicos, incluyendo Eco Rl, para la clonación. La inducción de la cepa bacteriana transfectada, aislada con
IPTG utilizando métodos normales, produce una proteína de fusión que corresponde a los siete primeros residuos de ß-galactosidasa, aproximadamente 15 residuos de "eslabonador", y el péptido codificado dentro del ADNc. Ya que los insertos del clon de ADNc son generados mediante un procedimiento esencialmente aleatorio, existe una oportunidad en tres de que el ADNc incluido yace en el marco correcto para la translación apropiada. Si el ADNc no está en el marco de lectura apropiado, éste se obtiene mediante la eliminación o inserción del número apropiado de bases mediante métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa lll o nucleasa "mung bean", o la inclusión de un eslabonador de oligonucleótido de longitud apropiada. Alternativamente, el ADNc de calr es lanzado en otros vectores que se sabe que son útiles para la expresión de la proteína en huéspedes específicos. Los iniciadores de oligonucleótidos que contienen sitios de clonación así como un segmento de ADN (aproximadamente 25 bases) suficientes para la hibridación de los estiramientos en ambos extremos del ADNc objetivo son sintetizados químicamente mediante métodos normales. Estos iniciadores después son utilizados para amplificar el segmento de gen deseado mediante PCR. El segmento de gen resultante es digerido con enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones normales y aisladas a través de electroforesis en gel. Alternativamente, se producen segmentos de gen similares mediante la digestión del ADNc con enzimas de restricción apropiadas. Utilizando iniciadores apropiados, los segmentos para codificar la secuencia de más de un gen se ligan junto a y clonado en vectores apropiados. Es posible optimizar la expresión mediante la construcción de dichas secuencias quiméricas. Los huéspedes de expresión adecuados para dichas moléculas quiméricas incluyen , pero no se limitan a, células de mamífero tales como Ovario de Hámster Chino (CHO) y las células 293 humanas, células de insectos tales como las células Sf9, células de levadura tales como Saccharomvces cerevisiae, y bacterias tales como E. coli. Para cada uno de estos sistemas de célula, un vector de expresión útil incluye un origen de replicación que permite la propagación en bacterias y un marcador seleccionable tal como el gen de resistencia antibiótico de ß-lactamasa para permitir la selección del plásmido en la bacteria. Además, el vector incluye un segundo marcador seleccionable tal como el gen de fosfotransferas de neomicina para permitir la selección en células huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para utilizarse en huéspedes de expresión eucarióticos por lo regular requieren de elementos de procesamiento de ARN tal como las secuencias de poliadenilación 3', si no son parte del ADN c de interés . Además , el vector contiene promotores o mejoradores, los cuales incrementan la expresión del gen. Dichos promotores son huéspedes específicos e incluyen MMTV, SV40 y promotores de metalotionina para células CHO; promotores trp, lac, tac y T7 para huéspedes bacterianas; y un factor alfa , oxidasa de alcohol y promotores de PG H para levadura. Los mejoradores de transcripción , tales como el mejorador de virus de sarcoma rous , se utilizan en células huésped de mam ífero . U na vez que los cultivos homogéneos de células recombinantes se obtienen a través de métodos de cultivo normales , se recuperaron grandes cantidades de CALR recombinantemente producido del medio acondicionado y se analizó utilizando métodos cromatográficos conocidos en la técnica.
VIII. Aislamiento de CALR Recombinante El CALR es expresado como una proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptido adicionales añadidos para facilitar la purificación de proteína. Dicha purificación que facilita los dominios incluye, pero no se limita a, péptidos quelatadores de metal tales como módulos de histidina-triptofano que permiten la purificación en metales inmovilizados, los dominios de la proteína A permiten la purificación en la inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación de afinidad FLAGS (Immunex Corp. Seattle WA). La inclusión de una secuencia de eslabón de escisión tal como el Factor XA o enteroquinasa Invitrogen, San Diego CA) entre el dominio de purificación y la secuencia de calr es útil para facilitar la expresión de CALR.
IX. Prueba de T7Gs quimérica Se construyeron T7Gs quiméricas combinando las secuencias receptivas extracelulares de una nueva isoforma con la transmembrana y segmentos intracelulares de una isoforma conocida. Dichas moléculas quiméricas son útiles para propósitos de prueba. Este concepto fue demostrado por Kobilka y otros (1988, Science 240:1310-1316) quienes crearon una serie de receptores adrenérgicos a2-ß2 (AR) insertando cantidades progresivamente mayores de la secuencia de transmembrana a2-AR a ß2-AR. La actividad de unión de agonistas conocidos cambió a medida que la molécula se desplazó de tener más conformación de a2 que de ß2, y las construcciones de intermediarios demostraron carácter específico mezclado. El carácter específico para unir antagonistas, sin embargo, se correlacionó con la fuente del dominio Vil. La importancia del dominio Vil de T7G para el reconocimiento del ligando también se encontró en quimeras utilizando dos receptores del factor a de levadura y es importante ya que los receptores de levadura son clasificados como receptores misceláneos. De esta manera, el papel funcional de los dominios específicos parece ser conservado a través de la familia de T7G sin considerar la categoría.
En una forma paralela, los segmentos internos o dominios citoplásmicos de una isoforma particular son intercambiados con los dominios análogos de una T7G conocida y utilizados para identificar los determinantes estructurales responsables para acoplar los receptores a proteínas G triméricas (Dohlman y otros (1991) Annu. Rev. Biochem. 60:653-88). Un receptor quimérico en donde los dominios V, VI, y el lazo de conexión intracelular de ß2-AR son substituidos a a2-AR se muestran para unir ligandos con el carácter específico de a2-AR, pero estimulan ciclasa de adenilato en la forma de ß2-AR. Esto demuestra que para los receptores de tipo adrenérgico, el reconocimiento de la proteína G está presente en los dominios V y VI y sus lazos de conexión. La situación opuesta fue predicha y observada para una quimera en donde el lazo V ? VI de a1-AR reemplazó el dominio correspondiente en ß2-AR y los ligandos de unión del receptor resultantes con carácter específico de ß2-AR y el cambio de fosfatidilinositol mediado por la proteína G activada en la forma de a1-AR. Finalmente, las quimeras construidas de los receptores muscarínicos también demostraron que el lazo V-»VI es el determinante principal para el carácter específico de la actividad de la proteína G (Bolander FF, supra). Las T7Gs quiméricas o modificadas que contienen substituciones en las regiones extracelulares y de transmembrana han mostrado que ambas porciones del receptor determinan el carácter específico de unión de ligando. Por ejemplo, se conservaron dos residuos Ser en el dominio V de todos los receptores adrenérgicos y de catecolamina y son necesarios para una actividad potente agonista. Se cree que estas serinas están en el sitio de unión de T7G y para que forman enlaces de hidrógeno con la porción de catecol de los agonistas. Similarmente, un residuo Asp presente en el dominio lll de todas las T7Gs, las cuales unen aminas biogénicas se cree que está en el sitio de unión de T7G y que forman un par iónico con el grupo amina de ligando. Las T7Gs clonadas, funcionales se expresan en los sistemas de expresión heteróloga y se analizó su actividad biológica (Marullo y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85-7551-55, King y otros (1990) Science 250:121-23). Un sistema heterólogo introduce genes para una T7G de mamífero y en una proteína G de mamífero en células de levadura. La T7G mostró tener carácter específico de ligando apropiado y afinidad e iniciar la actividad biológica apropiada, la detención de crecimiento y cambios morfológicos de las células de la levadura. Las secuencias de Incyte para T7G se probaron en una forma similar.
X. Producción de Anticuerpos Específicos de CALR Se utilizaron dos aspectos para dar anticuerpos a CALR, y cada aspecto es útil para generar anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. En un aspecto, la proteína desnaturalizada de la separación mediante HPLC de fase inversa, es obtenida en cantidades hasta de 75 mg. La proteína desnaturalizada es utilizada para inmunizar ratones o conejos utilizando protocolos normales; aproximadamente 100 microgramos son adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que hasta 1 mg se puede usar para inmunizar un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína es naturalizada es radioyodada y usada para clasificar hibridomas de célula B de murino potenciales para aquellos que producen el anticuerpo. Este procedimiento requiere sólo pequeñas cantidades de proteína, de manera que 20 mg podrían ser suficientes para marcar y clasificar varios miles de clones. En un segundo aspecto, las secuencias de aminoácido de un dominio de CALR apropiado, como se deduce de la translación del ADNc, se analizó para determinar regiones de alta inmunogeneicidad. Los oligopéptidos que comprenden regiones hidrofílicas apropiadas, como se ilustra en la Figura 3, son sintetizados y utilizados en protocolos de inmunización adecuados para producir anticuerpos. El análisis para seleccionar epítopes apropiados se describe por Ausuble FM y otros (Supra). Las secuencias de aminoácido óptimas para la inmunización están usualmente en el término C, el término N y aquellas regiones de intervención, hidrofílica del polipéptido, las cuales probablemente van a ser expuestas al ambiente externo cuando la proteína está en conformación natural. Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente 15 residuos en longitud, son sintetizados utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer Modelo 431A utilizando química fmoc y acoplados a la hemocianina de limpeto de llave (KLH, Sigma, St. Louis MO) mediante la reacción con éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida (MBS; cf. Ausubel FM y otros, supra). Si es necesario, se puede introducir una cisteína en el término N del péptido para permitir el acoplamiento a KLH. Se pueden inmunizar animales con el complejo de péptido-KLH en un auxiliar completo de Freund. Los antisueros resultantes pueden ser probados para actividad de antipéptido uniendo el péptido al plástico, bloqueando con 1% de albúmina de suero de bovino, haciendo reacciona con antisueros, lavando y haciendo reaccionar con IgG anti-conejo de cabra específico, purificado por afinidad, marcado (radioactivo o fluorescente). Los hibridomas se pueden preparar y clasificar utilizando técnicas normales. Los hibridomas de interés pueden ser detectados clasificando con CALR marcado para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con el carácter específico deseado. En un protocolo típico, las cavidades de las placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) son revestidas, durante la incubación, con anticuerpos conejo-anti-ratón específicos (o Ig antiespecies adecuado) a 10 mg/ml. Las cavidades revestidas son bloqueadas con 1 % de BSA, lavadas e incubadas con sobrenadantes de los hibridomas. Después del lavado, las cavidades son incubadas con CALR marcado a 1 mg/ml. Los sobrenadantes con anticuerpos específicos unen más CALR marcado que el detectable por arriba del antecedente. Después los anticuerpos específicos que producen clones pueden ser expandidos y sometidos a 2 ciclos de clonación a una dilución limitante. Los hibridomas clonados son inyectados a ratones tratados con pristano para producir ascitos, y el anticuerpo monoclonal puede ser purificado del fluido ascítico de ratón mediante cromatografía de afinidad utilizando la Proteína A . Los anticuerpos monoclonales con afinidades de por lo menos 10e8 Me' 1 , preferiblemente de 10e9 a 10e10 o más fuerte, típicamente serán producidos a través de procedimientos normales como se describe en Harlow y Lañe ( 1988) Antibodies; A Laboratory Manual . Cold Spring Harbor Laboratory, N ueva York; y en Goding (1986)Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Nueva York, ambas incorporadas aquí por referencia .
XI. Prueba de Diagnóstico Utilizando Anticuerpos Específicos de CALR Los anticuerpos de CALR particulares son útiles para investigar casos de transducción de señal y la diagnosis de condiciones infecciosa o hereditarias, las cuales se caracterizan por diferencias en la cantidad o distribución de CALR o productos corriente abajo de una cascada de señalización. Ya que CALR se encontró en una colección de célula cebada humana, parece estar sobre-regulado en tipos de célula principalmente involucrados en protección o defensa inmune. Las pruebas de diagnóstico para CALR incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una marca para detectar CALR en fluidos del cuerpo humano, membranas, células, tejidos o extractos de dichos tejidos. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención son utilizados con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y los anticuerpos serán marcados uniéndolos, ya sea covalente o no covalentemente, con una substancia, la cual provee una señal detectable. Una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación son conocidas y han sido reportadas extensamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichas marcas incluyen las patentes de E.U.A. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. También, pueden ser producidas las inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en la patente de E. U .A. No. 4,816 ,567, incorporada aquí por referencia. Una variedad de protocolos para medir CALR soluble o de unión de membrana, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína , es conocida en la técnica. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA), radio-inmunoensayo (RÍA) y clasificación de célula activada fluorescente (FACS). Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes sin interferencia en CALR , pero se puede emplear un ensayo de unión competitiva . Estos ensayos se describen, entre otras partes, en Maddox, DE y otros (1983, J . Exp. Med . 158: 121 1 ) .
XII. Purificación de CALR Nativo Utilizando Anticuerpos Específicos El CALR nativo o recombi nante se purificó mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para CALR . En general , se construye una columna de inmunoafinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-CALR a una resina cromatográfica activada . La inmunoglobu linas policlonales se prepararan de suero inmune ya sea mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan de ascitos de ratón mediante precipitación de sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La ¡nmunoglobulina parcialmente purificada está covalentemente unida a una resina cromatográfica tal como CnBr-Sepharose activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo está acoplado a la resina, la resina es bloqueada, y la resina derivativa es lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dichas columnas de inmunoafinidad se utilizan en la purificación de CALR mediante la preparación de una fracción de células conteniendo CALR en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula completa o de una fracción sub-celular obtenida vía centrifugación diferencial (con la adición de detergente o no) o mediante otros métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el CALR conteniendo una secuencia de señal, es secretada en una cantidad útil al medio en el cual las células crecen. Una preparación que contiene CALR soluble se hace pasar sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna es lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de CALR (v. gr., reguladores de pH de alta resistencia iónica en presencia de detergente). Después, la columna es eluída bajo condiciones que rompen la unión del anticuerpo/CALR (v. gr., un regulador de pH con pH de 2-3 o una alta concentración de un chaotropo tal como urea o tiocianato (ion), y CALR es recolectada.
XII. Clasificación de Fármaco Esta invención es particularmente útil para clasificar compuestos terapéuticos utilizando CALR o sus fragmentos de unión en cualquier variedad de técnicas de clasificación de fármaco. El polipéptido o fragmento empleado en dicha prueba está ya sea libre en solución, fijo a un soporte sólido, sale de una superficie de célula, o se ubica intracelularmente. U n método para clasificar fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas, las cuales son establemente transformadas con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido, fragmento o quimera como se discutió anteriormente. Los fármacos son clasificados contra dichas células transformadas en ensayos de unión competitivos. Dichas células, ya sea en forma viable o fija , pueden ser utilizadas para ensayos de unión normales. Se miden la formación de complejos entre CALR y el agente que se está probando. Alternativamente, uno puede examinar la disminución en la formación de complejo entre CALR y un receptor causada por el agente q ue se está tratando. Así, la presente invención provee métodos para clasificar fármacos o cualesquiera otros agentes que pueden afectar la inflamación y enfermedad . Estos métodos, bien conocidos en la técnica , comprenden poner en contacto dicho agente con un polipéptido de CA LR o fragmento del mismo y analizar, (i) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido de CALR o fragmento , o (ii) la presencia de un complejo entre el polipéptido de CALR o fragmento y la célula. En dichos ensayos de unión competitivos, el polipéptido de CALR o fragmento es típicamente marcado. Después de una incubación adecuada, el polipéptido de CALR o fragmento se separó de aquel presente en forma de unión , y la cantidad de marca libre o en complejo es una medida de la habilidad del agente particular para unirse a CALR o para interferir con la formación del complejo de CALR y complejo de agente. Otra técnica para clasificar el fármaco provee una clasificación de alta producción para compuestos que tengan afinidad de u nión adecuada al polipéptido de CALR y se describe con detal le en la solicitud de patente europea 84/03564 , publicada el 13 de Septiembre de 1984, incorporada aquí por referencia. En resumen , números grandes de diferentes compuestos de prueba de péptido pequeño son sintetizados en un substrato sólido, tal como púas de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba de péptido se hacen reaccionar con el polipéptido de CALR y se lava n . El polipéptido de CA LR unido después es detectado a través de métodos bien conocidos en la técnica . Alternativamente, el CALR purificado también puede ser también colocado como revestimiento directamente sobre placas para utilizarse en las técnicas de clasificación de fármaco antes mencionadas. Además, se pueden utilizar anticuerpos sin neutralización para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de ensayos de clasificación de fármaco competitivos en donde los anticuerpos de neutralización capaces de unir CALR, específicamente compiten con un compuesto de prueba para unirse a polipéptidos de CALR o un fragmentos del mismo. De esta manera , los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar ia presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con CALR.
XIV. Diseño de Fármaco Racional * El objetivo del diseño de fármaco racional es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales interactúan , por ejemplo , agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede ser utilizado para diseñar fármacos, los cuales son formas más activas o estables del polipéptido o que mejoran o interfieren con la función de un polipéptido in vivo (cf. Hodgson (1991 ) Bio/Technology 9: 19-21 , incorporada aqu í por referencia) . En un aspecto, la estructura tridimensional de una proteína de i nterés, o de un complejo inhibidor de proteína , se determina a través de cristalografía de rayos x, a través de modelación por computadora o, más típicamente, mediante una combinación de los dos aspectos. Tanto la forma como las cargas del polipéptido deben ser averiguadas para ver la estructura y para determinar los sitios activos de la molécula. Menos frecuente, la información útil con respecto a la estructura de un polipéptido puede ser ganada a través de la modelación con base en la estructura de proteínas homologas. En ambos casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño de fármaco racional incluyen moléculas que tienen un carácter específico diferente o una actividad o estabilidad mejorada como se muestra por Braxton S y Wells JA (1992 Biochemistry 31:7796-7801) o la cual actúa como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se muestra por Athauda SB y otros (1993 J. Biochem. 113:742-746), incorporada aquí por referencia. También es posible aislar un anticuerpo específico en el objetivo, seleccionado mediante ensayo funcional, como se describió anteriormente, y después resolver su estructura de cristal. Este aspecto, en principio, produce un farmanúcleo en donde se puede basar el diseño de fármaco subsecuente. Es posible derivar la cristalografía de proteína generando anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) a una anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen de espejo de una imagen de espejo, el sitio de unión de los anti-ids podría esperarse que sea un análogo del receptor original. El anti-id entonces puede ser utilizado para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos química o biológicamente producidos. Los péptidos aislados entonces podrían actuar como el farmanúcleo. En virtud de la presente invención, una cantidad suficiente puede hacerse disponible para realizar dichos estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácido de CALR provista en la presente, proveerá la guía para aquellos que emplean técnicas de modelación por computadora en lugar de o además de la cristalografía de rayos X.
XV. Identificación de otros Miembros del Complejo de Transducción de Señal El CALR purificado es una herramienta de investigación para ia identificación , caracterización y purificación de proteínas G de interacción , fosfolipasa C, ciclasa de adenilato, u otras proteínas de trayectoria de transducción de señal . Las marcas radioactivas son incorporadas a un dominio de CALR seleccionado a través de varios métodos conocidos en la técnica y utilizados in vitro para capturar moléculas de interacción . Un método preferido implica marcar los grupos amino primarios en CALR con el reactivo 125l Bolton-Hunter (Bolton , AE and Hunter, WM (1973) Biochem J . 133: 529) . Este reactivo ha sido utilizado para marcar moléculas son pérdida concomitante de actividad biológica (Herbert CA y otros (1991 ) J . Biol. Chem . 266 : 18989; McColl S. y otros (1993) J . Immunol. 150:4550-4555). El CALR marcado es útil como un reactivo para la purificación de moléculas con las cuales interactúa. En una modalidad de purificación por afinidad, el CALR unido a la membrana está covalentemente acoplado a una columna de cromatografía . El extracto libre de célula derivado de células cebadas o células objetivo putativas se hace pasar sobre la columna , y las molécu las con la unión de afinidad apropiada pata CALR . El complejo de CALR es recuperado de la columna, es disasociado y la molécu la recuperada es sometida a secuenciación de proteína N-terminal. Esta secuencia de aminoácido es entonces utilizada para identificar la molécula capturada o para diseñar sondas de oligonucleótido de degeneración para la clonación del gen relevante de una colección de ADN apropiada. En un método alternativo, se desarrollan anticuerpos contra CALR, específicamente anticuerpos monoclonales, como se describió anteriormente. Los anticuerpos monoclonales son clasificados para identificar aquellos que inhiben la unión entre ligandos y CALR. Estos anticuerpos monoclonales se utilizan entonces terapéuticamente.
XVI. Uso y Administración de Anticuerpos, Inhibidores o Antagonistas Los anticuerpos, inhibidores o antagonistas de CALR (u otros tratamientos para limitar la transducción de señal, LST), proveen diferentes efectos cuando se administran terapéuticamente. Los LSTs se formulan en un medio portador acuoso, no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable, preferiblemente a un pH de alrededor de 5 a 8, muy preferiblemente de 6 a 8, aunque el pH varía de acuerdo con las características del anticuerpo, inhibidor o antagonista que es formulado, y la condición que será tratada. Las características de los LSTs incluyen la solubilidad de la molécula, la vida media y la antigeneicidad/inmunogeneicidad; éstas y otras características ayudan a definir un vehículo efectivo. Las proteínas humanas nativas se prefieren como LSTs, pero las moléculas orgánicas o sintéticas que resultan de clasificaciones de fármaco son igualmente efectivas en situaciones particulares. Los LSTs son suministrados a través de rutas de administración que incluyen, pero no se limitan a, cremas tópicas y geles; aspersión y aerosol transmucosal; parches y vendajes transdérmicos; formulaciones inyectables, intravenosa y de lavado; y líquidos y pildoras oralmente administrados formulados para resistir el ácido y las enzimas del estómago. La formulación particular, la dosis exacta, y la ruta de administración son determinadas por el médico que atiende, y varía de acuerdo con cada situación específica. Dichas determinaciones se hacen considerando variables múltiples tales como la condición que será tratada, el LST que será administrado, y el perfil farmacocinético del LST particular. Los factores adicionales, los cuales se toman en cuenta, incluyen el estado de la enfermedad (v. gr., severidad) del paciente, la edad, peso, género, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación del fármaco, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de LST de acción larga se administran cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y el régimen de claro del LST particular. Las cantidades normales de dosis varían de 0.1 a 100,000 microgramos, hasta un dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la ruta de administración. La guía de dosis particulares y métodos de suministro se provee en la literatura. Ver patentes de E. U .A. Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Aquellos expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para diferentes LSTs. La administración a células tales cqmo células nerviosas necesita el suministro, en una forma diferente de aquella de otras células, tales como células endoteliales vasculares. Se contempla que la transducción de señal anormal y las condiciones o enfermedades , las cuales atacan al daño del precipitado de actividad que se puede tratar con LSTs . Estas condiciones, particularmente respuestas anafilácticas o hipersensibles son tratadas como se discutió anteriormente. El LST también es utilizado para tratar otras infecciones sistémicas y locales, daño traumático de tejido, enfermedades hereditarias o ambientales asociadas con alergias, hipertensión , carcinomas, y otros problemas fisiológicos o patológicos. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación se incorporan aquí por referencia. Varias modificaciones y variaciones del método y sistema descritos de la invención serán evidentes para aquellos expertos en el campo sin apartarse del alcance y espíritu de la invención . Aunque la invención ha sido descrita junto con las modalidades específicas preferidas, se debe entender que la invención segú n se reclama no debe ser indebidamente limitada a dichas modalidades específicas. En realidad , varias modificaciones de los modos antes descritos para llevar a cabo la invención, las cuales son obvias para aquellos expertos en el campo de la biología molecular o campos relacionados, están dentro del alcance las reivindicaciones.
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (i¡) TITULO DE LA INVENCIÓN: Receptor de Transmembrana- 7 de Tipo C5a (iii) NUMERO DE SECUENCIAS : 2 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: INCYTE PHARMACEUTICALS, INC. (B) CALLE: 3330 Hillview Avenue (C) CIUDAD: Palo Alto (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO: 94304 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DEL MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS ACTUALES DE SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: será cedido (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: presentada con la misma (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) SERIE NO. DE SOLICITUD: 08/462,355 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de Junio de 1995 (viii) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Luther, Barbara J. (B) NUMERO DE REG. : 33954 (C) NO. DE REF. /APODERADO: PF-0040 PCT (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 415-855-0555 (B) TELEFAX: 415-852-0195 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1446 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) COLECCIÓN: Célula cebada (B) CLON: 8118 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO:1:
ATGGCGTCTT TCTCTGCTG-A GACCAATTCA ACTGACCTAC TCTCACAGCC ATGGAATGAG 60
CCCCCAGTAA TTCTCTCCAT GGTCATTCTC AGCCTTAC T TTTTACTGGG ATTGCCAGGC 120
AATGGGCTGG TGCTGTGGGT GGCTGGCCTG AAGATGCAGC GGACAOTGAA CACAATTTGG 180
TTCCTCCACC TCACCTTGGC GGACCTCCTC TGCTGCCTCT CCTTGGCCTT CTCGCTGGCT 240
CACTTGGCTC TCCAGGGACA GTGGCCCTAC GGCAGGTTCC TATGCAAGCT CATCCCCTCC 300
ATCATTGTCC TCAACATGTT TGGCAGT--TC TTCCTGCTTA CTGCCATTAG CCTGGATCGC 360
TGTCTTGTGG TATTCAAGCC AATCTGGTGT CAGAATCATC GCAATGTAGG GATGGCCTGC 420
TCTATCTGTG GATGTATCTG GGTGGTGGCT TTTGTGTTGT GCATTCCTGT GTTCGTGTAC 480 CGGGAAATCT TCACTACAGA CAACCATAAT AGATGTGGCT ACAAATTTGG TCTCTCCAGC S40
TCATTAGATT ATCCAGACTT TTATGGGGAT CCACTAGAAA ACAGßTCTCT TGAAAACATT 600
GTTCAGCCGC CTGGAGAAAT GAATGATAGG TTAflATCCTT CCTCTTTCCA AACAAATGAT 660
CATCCTTGGA CAGTCCCCAC TGTCTTCCAA CCTCAAACAT TTCAAASACC TTCTGCAGAT 720
TCACTCCCTA GGGGTTCTGC TAGGTTAACA AGTCAAAATC TGTATTCTAA TGTATTTAAA 780
CCTGCTGATG TGGTCTCACC TAAAATCCCC AGTGGGTTTC CTATTGAAGA TCACGAAACC 840
AGCCCACTGG ATAACTCTGA TGCTTTTCTC TCTACTCATT TAAAGCTGTT CCCTAGCGCT 900
TCTAGCAATT CCTTCTACGA GTCTGAGCTA CCACAAGGTT TCCAGOATTA TTACAATTTA 960
GGCCAATTCA CAGATGACGA TCAAGTGCCA ACACCCCTCG TGGCAATAAC GATCACTAGG 1020
CTAGTGGTGG GTTTCCTGCT GCCCTCTGTT ATCATGATAG CCTGTTACAG CTTCATTGTC 1080
TTCCGAATGC AAAGGGGCCG CTTCGCCAAG TCTCAGAGCA AAACCTTTCG AGTGGCCGTG 1140
GTGGTGGTGG C-TGTCTTTCT TGTCTGCTGG ACTCCATACC ACATTTGGGG AGTCCTGTCA 1200
TTGCTTACTG ACCCAGAAAC TCCCTTGGGG AAAACTCTGA TGTCCTGGGA TCATGTATGC 1260
ATTGCTCTAG CATCTGCCAA TAGTTGCTTT AATCCCTTCC TTTATGCCCT CTTGGGGAAA 1320
GATTTTAGGA AGAAAGCAAG GCAGTCCATT CAGGGAATTC TGGAGGCAGC CTTCAGTGAG 1380
GAGCTCACAC GTTCCACCCA CTGTCCCTCA AACAATGTCA TTTCAOAAAG AAATAGTACA 1440
(2) I N FORMACIÓN PARA SEC I D NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS D E S EC U E NC IA: (A) LONGITU D: 482 pares de base (B) TI PO : aminoácido (D) TOPOLOG ÍA : lineal (ii) TI PO DE MOLÉCU LA: proteína (ix) D ESC R I PC IÓN D E S EC U E NC IA : S EC I D NO :2 : Met Ala Ser Phe Ser Ala Glu Thr Asn Ser Thr Aßp Leu Leu Ser Gln 1 5 10 15 Pro Trp Asn Glu Pro Pro Val He Leu Ser Met Val He Leu Ser Leu 20 25 30 Thr Phe Leu Leu Gly Leu Pro Gly Asn Gly Leu Val Leu Trp Val Ala 35 *0 45 Gly Leu Lys Met Gln Arg Thr Val Aßn Thr He Trp Phe Leu His Leu 50 55 60 Thr Leu Ala Asp Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Ala Phe Ser Leu Ala 65 70 75 80
His Leu Ala Leu Gln Gly Gln Trp Pro Tyr Gly Arg Phe Leu Cys Lyß 85 90 95
Leu He Pro Ser He He Val Leu Asn Met Phe Gly Ser Val Phe Leu 100 105 110 Leu Thr Ala He Ser Leu Asp Arg Cys Leu Val Val Phe Lys Pro He 115 120 125 Trp Cys Gln Asn Hiß Arg Asn Val Gly Met Ala Cys Ser He Cys ßly 130 135 140 Cyß He Trp Val Val Ala Phe Val Leu Cys He Pro Val Phe Val Tyr 145 150 155 160
Arg Glu He Phe Thr Thr Asp Asn His Asn Arg Cys Gly Tyr Lys Phe 165 170 175
Gly Leu Ser Ser Ser Leu Asp Tyr Pro Asp Phe Tyr Gly Asp Pro Leu 180 185 190 Glu Asn Arg Ser Leu Glu Asn He Val Gln Pro Pro Gly Glu Met Asn
195 200 205 Asp Arg Leu Asp Pro Ser Ser Phe Gln Thr Asn Asp His Pro Trp Thr 210 215 220 Val Pro Thr Val Phe Gln Pro Gln Thr Phe Gln Arg Pro Ser Ala Asp 225 230 235 240
Ser Leu Pro Arg Gly Ser Ala Arg Leu Thr Ser G n Asn Leu Tyr Ser 245 250 255
Asn Val Phe Lys Pro Ala Asp Val Val Ser Pro Lys He Pro Ser Gly 260 265 270 Phe Pro He Glu Asp His Glu Thr Ser Pro Leu Asp Asn Ser Asp Ala 275 280 285 Phe Leu Ser Thr His Leu Lys Leu Phe Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ser 290 295 300 Phe Tyr Glu Ser Glu Leu Pro Gln Gly Phe Gln Asp Tyr Tyr Asn Leu 305 310 315 320
Gly Gln Phe Thr Asp Asp Asp Gln Val Pro Thr Pro Leu Val Ala He 325 330 335
Thr He Thr Arg Leu Val Val Gly Phe Leu Leu Pro Ser Val He Met 340 345 350 He Ala Cys Tyr Ser Phe He Val Phe Arg Met Gln Arg ßly Arg Phe 355 360 365 Ala Lys Ser Gln Ser Lys Thr Phe Arg Val Ala Val Val Val Val Ala 370 375 380 Val Phe Leu Val Cyß Trp Thr Pro Tyr His He Trp Gly Val Leu Ser 385 390 395 400
Leu Leu Thr Asp Pro Glu Thr Pro Leu Gly Lys Thr Leu Met Ser Trp 405 410 415
Asp His Val Cys He Ala Leu Ala Ser Ala Asn Ser Cys Phe Asn Pro 420 425 430 Phe Leu Tyr Ala Leu Leu Gly Lys ?sp Phe Arg Lys Lyß Ala Arg Gln 435 440 445 Ser He Gln Gly He Leu Glu Ala Ala Phe Ser Glu Glu Leu Thr Arg 450 455 460 Ser Thr His Cys Pro Ser Asn Asn Val He Ser ßlu Arg Asn Ser Thr 465 470 475 480
Thr Val
Claims (20)
1.- Un polinucleótido purificado que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO:2.
2.- El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácido comprende SEC ID NO:1, o su complemento.
3.- Una prueba para condiciones o enfermedades asociadas con la expresión del receptor de tipo C5a humano (calr) en una muestra biológica que comprende los pasos de. a) combinar la muestra biológica con el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo, bajo condiciones adecuadas para la formación del complejo de hibridación; y b) detectar el complejo de hibridación, en donde la presencia del complejo se correlaciona con la expresión del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 en la muestra biológica.
4.- Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
5.- Una célula huésped transformada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.
6.- Un método para producir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO:2, el método comprende los pasos de: a) cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido; y b) recuperar el polipéptido del cultivo de la célula huésped.
7.- Una molécula antisentido que comprende la secuencia de ácido nucleico complementaria para por lo menos una porción del polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
8.- Una composición farmacéutica que comprende la molécula antisentido de acuerdo con la reivindicación 7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9.- Un método para tratar un sujeto con una condición o enfermedad que implica la expresión alterada del homólogo de receptor de tipo C5a humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8 al sujeto.
10.- Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO:2.
11.- Un agonista del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10.
12.- Una composición farmacéutica que comprende el agonista de acuerdo con la reivindicación 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13 - Un método para tratar un sujeto con una condición o enfermedad asociada con la expresión alterada del homólogo de receptor de tipo C5a humano que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición de acuerdo con la reivindicación 12 al sujeto.
14.- Un inhibidor del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10.
15.- Una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de acuerdo con la reivindicación 14 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
16.- Un método para tratar a un sujeto con una condición o enfermedad asociada con la expresión alterada del homólogo de receptor de tipo C5a humano que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 al sujeto.
17.- Un anticuerpo específico para el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10.
18.- Una prueba de diagnóstico para una condición o enfermedad asociada con la expresión del homólogo de receptor de tipo C5a humano en una muestra biológica que comprende los pasos de: a) combinar la muestra biológica con el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17, bajo condiciones adecuadas para el anticuerpo para unir el polipéptido y formar un complejo de anticuerpo-polipéptido; y b) detectar el complejo, en donde la presencia del complejo se correlaciona con la expresión del polipéptido en la muestra biológica.
19.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 20.- Un método para tratar a un sujeto con una condición o enfermedad asociada con la expresión alterada del homólogo de receptor de tipo C5a humano que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19 al sujeto.
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