CN109071611A

CN109071611A - 产生重组蛋白的方法

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Publication number: CN109071611A
Application number: CN201780028031.XA
Authority: CN
Inventors: R.A.埃明斯; G.B.芬卡; M.霍尔; A.P.刘易斯; W.J.K.刘易斯; A.D.麦基纳利; M.尤登; I.武尔加里斯
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: AU2017260277A1; WO2017191255A1; RU2742006C2; TWI794170B; CA3023025A1; MX2018013562A; US11098312B2; US20190177734A1; CN109071611B; KR20190003694A; RU2018137305A3; JP2022070902A; TW201805298A; EP3452496A1; BR112018072043A2; IL262544A; KR102504317B1; RU2018137305A; SG11201808976WA; JP2019516371A

Abstract

本发明涉及来源于大肠杆菌的重组信号序列。本发明还涉及包含该信号序列、重组蛋白的融合蛋白和产生该重组蛋白的方法。重组信号序列可用于提供用于控制发酵的粘度和/或控制重组蛋白的基础(诱导前)表达的方法。

Description

产生重组蛋白的方法

本发明涉及重组信号序列和包含该信号序列以及一种重组蛋白的融合蛋白。描述了使用重组信号序列产生重组蛋白的方法。具体而言，重组信号序列提供用于控制发酵的粘度和/或控制重组蛋白的基础(诱导前)表达的方法。

发明背景

重组蛋白的大规模且节约成本的制备、回收和纯化对于生物技术产业是重要的挑战。

微生物宿主细胞是用于产生重组蛋白的广泛使用的生物。在生产期间的考量包括宿主细胞生长和重组蛋白的表达、蛋白滴度、蛋白位置(例如，细胞内、细胞外、周质等)，以及从最终位置的选择性回收和纯化重组蛋白。平衡和优化这些不同因素并不简单。

革兰氏阴性真细菌大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)为用于工业生物过程的稳健表达系统，这是归因于：其良好表征的遗传学；其使用廉价底物能快速积聚生物量的能力；易于工艺规模放大和大量可用的宿主菌株和表达载体。大肠杆菌是用于产生不需要复杂翻译后修饰诸如糖基化的治疗蛋白的常用宿主。对于二硫键形成，可将表达引导至周质的氧化环境中以便于正确折叠。这可通过使用N端信号序列来实现，所述N端信号序列由细胞的分泌系统的成分识别以起始其通过专用转运系统的靶向和通过。

因此，存在对于生产、回收和纯化重组蛋白的改进方法的需要。

发明概述

本发明提供了重组信号序列，其包含(a)序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体和(b)在(a)的C端的异源信号序列。

本发明还提供了重组融合蛋白，其包含(a)如所定义的信号序列；和(b)在(a)的C端的异源重组蛋白。

本发明还提供了重组核酸序列，其编码如所定义的信号序列或融合蛋白。

本发明还提供了重组核酸序列，其编码包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)的信号序列，其中所述核酸序列已经密码子优化用于在宿主细胞中表达。

本发明还提供了包含如所定义的核酸序列的重组表达载体。

本发明还提供了用于在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，所述方法包括：

(a)在允许从存在于宿主细胞中的如所定义的重组表达载体表达重组蛋白的条件下培养宿主细胞；和

(b)回收重组蛋白。

本发明还提供了用于控制表达重组蛋白的宿主细胞培养液的粘度的方法，其包括：

在允许表达重组蛋白的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含重组核酸序列，所述重组核酸序列编码：(i)重组信号序列，所述重组信号序列包含序列MGRISSGG (SEQ IDNO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(ii)重组蛋白。

本发明还提供了用于控制通过宿主细胞培养液表达的重组蛋白的基础表达的方法，其包括：在诱导前条件下培养宿主细胞，

其中所述宿主细胞包含重组核酸序列，所述重组核酸序列编码：(i)重组信号序列，所述重组信号序列包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(ii)重组蛋白。

附图描述

图1. 不同N端信号序列对在24 dwp培养物中从大肠杆菌W3110表达dAb的影响。关键词：B-位于胞外的dAb(上清液)；C-位于胞内的dAb(全细胞裂解物：周质+胞质溶胶)。B + C-总dAb，B/(B+C)-释放的比例。B和C的总和允许形成的总dAb的视觉估计。样品在诱导后24 h采集，还原，和利用考马斯染色的SDS-PAGE来显现条带。‘Std’表示在0.5 mg.mL^-1浓度下的dAb标准物。

图2. 高细胞密度大肠杆菌W3110进料分批培养物的诱导后发酵概况。N端信号序列和基础(诱导前)表达水平：(∆), OmpASS，0.30 g.L^-1，(□) YceISS，0.64 g.L^-1或(◊)，IvySS，0.061 g.L^-1。所有结果均在用IPTG诱导形成dAb之后采集。(A)生物量通过OD_600nm估计；(B)胞外可溶dsDNA浓度；(C)在胞内(全细胞裂解物)、(D)在胞外(上清液)、作为(E)所形成的总dAb(胞内+胞外)和作为(F)总dAb在胞外空间中的百分比测定dAb产量。培养液粘度(µ)以幂律关系µ = K γ ^n-1来描述，其中γ是剪切速率，(G) K是流动稠度指数且(H) n是流动特性指数。结果取自求平均值的重复的发酵罐(n = 2-4)且添加的误差条对应于一个标准偏差。

图3. 信号序列氨基酸序列比对和其密码子适应指数的评估。(A) YceISS (SEQID NO: 35)和IvySS (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列比对针对OmpASS (SEQ ID NO: 33)来参考。(B)各密码子位置的适应性被计算为该密码子频率针对参考来源于Kazusa大肠杆菌密码子使用数据库的大肠杆菌密码子使用表最丰富的同义密码子的比率。‘B’中的氨基酸序列从Ivy'SS盒后的第一甲硫氨酸进行比对。

图4. 高细胞密度大肠杆菌W3110进料分批培养物的诱导后发酵概况。N端信号序列和基础(诱导前)表达水平：(∆)，IvyTruncSS，0.90 g.L^-1，(□)，Ivy’OmpASS，0.086 g.L^-1，(◊)，IvyOpt1SS，0.16 g.L^-1和(♦)，IvyOpt2SS，0.089 g.L^-1。对于细节，参见图2。结果取自单一发酵样品(m=3)。

图5. (A)被计算为每总诱导后时间每升培养液的胞外dAb质量的整体生产率；(B)表达具有不同N端信号序列的dAb的大肠杆菌收获培养物的离心性能；OmpASS (诱导后48h)、YceISS (48 h)、IvyTruncSS (55 h)、Ivy'OmpA (153 h)和Ivy密码子优化的信号序列IvyOpt1 (48 h)和IvyOpt2 (55 h)。细胞培养液暴露于以下的条件：()，无剪切；(□)高剪切应力(0.53 x10⁶ W.kg^-1的最大能量耗散率(ε)持续20 s)，且然后通过USD离心处理(V =2.0 mL，t = 420 s，Σ = 0.164 m²，(参见正文)，V/tΣ = 2.9 x 10^-8 m.s^-1)。结果取自针对OmpASS和YceISS的重复的发酵罐(n=3)或针对其余信号序列的单一发酵罐样品。(B)的样品表征一式三份(m=3)。结果显示为平均值+/- SD。

详述

本公开涉及以下认识，使用特定信号序列在发酵、重组蛋白表达和蛋白可回收性方面提供优点。

已针对重组蛋白的周质分泌对信号序列进行研究。信号序列提供由较低基础表达引起的低粘度培养液的优点。包含于信号序列中的八氨基酸序列被鉴定为导致该低基础表达的关键。信号序列的密码子优化成功地保持低基础表达，且因此保持低粘度培养液，同时增加重组蛋白的发酵生产率。因此，实现了高生产率和通过全规模离心的可实行的澄清的组合。

序列“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)可用于任何信号序列的N端(5')。例如，“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)可用于异源信号序列的N端。异源信号序列可以是非内源性IVY信号序列的信号序列。例如，异源信号序列是来自大肠杆菌的周质信号序列。例如，大肠杆菌周质信号序列是OmpA、MalE、PelB、OmpT或LamB。例如，“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)可以在MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 33)、或表3中的信号序列中的任一种或任何大肠杆菌周质信号序列的N端。

重组信号序列包含(a)序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(b)在(a)的C端的异源信号序列。异源信号序列可紧靠MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)的C端。例如，重组信号序列可包含紧靠异源大肠杆菌周质信号序列的N端的序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)。例如，重组信号序列可包含紧靠异源信号序列MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 33)的N端的序列MGRISSGG (SEQ IDNO: 1)，以形成重组信号序列MGRISSGGMKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 55)。

序列“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)可通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入来改变。序列“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)加异源信号序列可通过1至10个氨基酸取代、缺失或插入来改变。变体可保持“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的活性。

氨基酸取代可涉及用来自如下表1中所定义的相同类别的氨基酸置换至少一个氨基酸。

表1

氨基酸类别	氨基酸残基
		疏水的
不带电极性的
		碱性极性的

至少一个氨基酸取代、缺失或插入可通过维持与以下的共同序列来保存序列“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的一级结构：(i)一个或多个疏水性氨基酸、(ii)一个或多个碱性极性氨基酸、(iii)一个或多个疏水性氨基酸和(iv)一个或多个不带电的极性氨基酸，如表1中所定义。

可将当在信号序列的N端(5')时的“MGRISSGG” (SEQ ID NO: 1)的活性定义为对重组蛋白的基础表达(诱导前表达)的控制。基础表达发生在宿主细胞的诱导前指数生长期期间。在该生长期期间，重组蛋白应不被表达或应最小化，且相反，细胞的代谢负担集中于生长。然而，许多信号序列允许重组蛋白的一些基础表达。“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)或其变体的活性可用于将在诱导时的重组蛋白基础表达控制至0.5 g/L或更少的水平，即0.5g/L或更少的重组蛋白的诱导前表达水平。使用包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的信号序列可导致重组蛋白的低诱导前表达水平。例如，重组蛋白的诱导前表达水平可以是≤0.5g/L、≤0.4g/L、≤0.3g/L、≤0.2g/L、≤0.1g/L或≤0.05g/L。

另外任选地，可将当在信号序列的N端(5')时的“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的活性定义为对表达重组蛋白的宿主细胞培养液的粘度的控制。宿主细胞培养液由宿主细胞加上包含培养基的清液构成。培养液粘度可在发酵期间在以下时间点改变：诱导前、诱导时和诱导后。使用包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的信号序列可在发酵期间产生低粘度宿主细胞培养液。粘度可使用本领域中的常用方法来测量。例如，粘度可使用流动稠度指数(K)或表观粘度(μ)来测量。

例如，宿主细胞培养液具有等效于K 0.1 Nsⁿm^-2或更少的流动稠度指数的粘度。例如，宿主细胞培养液具有K 0.05 Nsⁿm^-2或更少、K 0.04 Nsⁿm^-2或更少、K 0.03 Nsⁿm^-2或更少、K 0.02 Nsⁿm^-2或更少或K 0.01 Nsⁿm^-2或更少的粘度。

例如，“低”粘度可等效于约0.001 Nsⁿm^-2至0.01 Nsⁿm^-2的K值，“中等”粘度可等效于约0.01 Nsⁿm^-2至0.1 Nsⁿm^-2的K值，且“高”粘度可等效于约高于0.1 Nsⁿm^-2的K值。

或者，例如，宿主细胞培养液具有0.1 Nsm^-2或更少的表观粘度μ (如在1 s^-1的剪切速率下所定义)。例如，宿主细胞培养液具有μ 0.05 Nsm^-2或更少、μ 0.04 Nsm^-2或更少、μ0.03 Nsm^-2或更少、μ 0.02 Nsm^-2或更少或μ 0.01 Nsm^-2或更少的表观粘度。表观粘度将随施加的剪切速率而变化，值可从流动特性指数(n)和所选剪切速率的给出值来计算。

在一个实施方案中，这是诱导时的培养液粘度。

编码包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的重组信号序列的核酸序列可经密码子优化用于在宿主细胞中表达。用于密码子优化(也称为密码子适应)的方法是本领域中已知的。例如，密码子适应指数(CAI)可针对特定细胞系的所有天然基因或仅高表达基因的密码子使用来参考。可参考所有大肠杆菌基因，或可参考所有大肠杆菌K12基因或大肠杆菌K12II类(高表达)基因。

编码包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的信号序列的核酸序列可具有0.40或更高、0.45或更高、0.50或更高、0.55或更高、0.60或更高、0.65或更高、0.70或更高、0.75或更高、0.80或更高、0.85或更高、或0.90或更高的CAI评分。

例如，编码包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的信号序列的核酸序列可包含密码子优化序列：

。

另外任选地，“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)或其变体或密码子优化序列的活性可用于将诱导后的重组蛋白表达控制至5 g/L或更高的水平。使用包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO:1)的信号序列可导致重组蛋白的高诱导后表达水平。例如，重组蛋白的诱导后表达水平可以是≥5g/L、≥6g/L、≥7g/L、≥8g/L、≥9g/L或≥10g/L。重组蛋白的表达水平可以是总产生的蛋白，或胞外蛋白。

另外任选地，“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)或其变体或密码子优化序列的活性可用于将诱导后的重组蛋白生产率控制至0.1 g/L/h或更高的水平。使用包含“MGRISSGG”(SEQID NO: 1)的信号序列可导致在诱导后的高重组蛋白生产率。例如，重组蛋白的诱导后生产率可以是≥0.10g/L/h、≥0.11g/L/h、≥0.12g/L/h、≥0.13g/L/h、≥0.14g/L/h或≥0.15g/L/h。重组蛋白的生产率可以是总产生的蛋白，或胞外蛋白。时间(小时)可以从诱导的点计算。

另外任选地，“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)或其变体或密码子优化序列的活性可用于将在离心收获物(即，澄清)后的残余固体% (如通过在600 nm下的光学密度的测量值所定义)控制至20%或更少的水平。使用包含“MGRISSGG”(SEQ ID NO: 1)的信号序列可导致在离心收获物后的低残余固体%。例如，在离心收获物后的残余固体%可以是≤20%、≤15%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%或≤5%。

如本公开中所使用的细胞培养被给出其最广泛的含义，即在生长培养基中的细胞的大量生长。如本文所用的“发酵”和“培养”意味着在生长培养基中大量生长细胞。术语“发酵”和“培养”在本文中可互换地使用。指数生长期是特征在于细胞倍增、因此大量生长的时段。每单位时间出现的新细胞的数目显著地增加且与现存群体成比例。细胞可以在诱导前处于指数生长期。例如，重组蛋白的基础表达在诱导前指数期期间。

稳定期是细胞的生长速率与死亡速率相等、导致线性生长期的情况。例如，重组蛋白的表达是在稳定期期间诱导的。细胞经常由于生长限制因素，诸如基本营养物的耗尽和/或抑制产物(诸如有机酸)的形成而达到稳定期。为了在稳定期中维持恒定生物量且因此大量生长，细胞继续生长。

生物量可通过OD⁶⁰⁰nm来估计。“高细胞密度”生物量可以是至少30的OD⁶⁰⁰nm。例如，高细胞密度可以指至少30、至少40、至少50或至少60的OD⁶⁰⁰nm。或者，生物量可通过细胞干重来测量。“高细胞密度”生物量可以是至少10gL^-1的细胞干重。例如，高细胞密度可以指至少10gL^-1、至少15gL^-1、至少20gL^-1或至少25gL^-1的细胞干重。或者，生物量可通过细胞湿重来测量。“高细胞密度”生物量可以是至少50 gL^-1的细胞湿重。例如，高细胞密度可以指至少50gL^-1、至少70gL^-1、至少85gL^-1或至少100gL^-1的细胞湿重。

术语细胞外培养基、上清液、细胞外环境、细胞外空间、培养基和发酵培养基在本文中都用于描述在细胞培养期间、在诱导点处和在收获点处的细胞的外部环境。

如本文所用，术语“诱导”或“诱导表达”是指开始诱导重组蛋白表达的点。例如，重组蛋白表达可能通过添加诱导剂或温度变化(其中诱导是温度依赖性的)而诱导。术语“诱导后”在本文中用于描述开始诱导的点之后经过的时间。

术语“收获”在本文中用于意指发酵结束。可在发酵期间的任何时间点处进行收获，所述时间点被视为足以结束发酵过程和回收所表达的重组蛋白。例如，在收获点处开始蛋白回收。收获时间可取决于上清液中的重组蛋白的最佳浓度。在收获时，可直接从细胞培养物的细胞外培养基回收重组蛋白并对其进行纯化。或者，可从宿主细胞的周质回收重组蛋白并进行纯化。

如本文所用，当指可测量值(诸如量、分子量、持续时间等)时，“约”意味着涵盖从指定值±1%、±0.75%、±0.5%、±0.25%、±0.2%和±0.1%的变化，因为此类变化适合于进行所述的方法。

重组蛋白

重组蛋白可包括抗原结合蛋白，例如单克隆抗体、抗体片段或结构域抗体(dAb)。

重组蛋白可包括病毒蛋白、细菌毒素、细菌类毒素或癌抗原。

如本文所用，“重组蛋白”是指可施用至哺乳动物以引发组织、系统、动物或人类的生物或医学反应的任何蛋白和/或多肽。重组蛋白可引发多于一种生物或医学反应。此外，术语“治疗有效量”意味着，与尚未接受此量的对应主体相比，导致（但不限于）疾病、病症或副作用的治愈、预防或改善，或疾病或病症的进展速率降低的任何量。该术语还包括在其范围内有效地增强正常生理功能的量，以及有效地引起患者体内的增强或有助于第二药剂的治疗效果的生理功能的量。

如本文所用的术语“抗原结合蛋白”是指能够与抗原结合的抗体、抗体片段和其他蛋白构建体，诸如结构域。

术语“抗体”在本文中用于在最广泛的意义上指具有免疫球蛋白样结构域的分子。如本文所用，“免疫球蛋白样结构域”是指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽家族，其含有两个b折叠和通常保守的二硫键。该家族包括单克隆抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重组抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体和异缀合抗体；单一可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv、双体、TANDABS™等。

短语“单一可变结构域”是指独立于不同可变区或结构域特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变结构域(例如，VH、VHH、VL)。“结构域抗体”或“dAb”可视为与“单一可变结构域”相同。

如本文所用，“结构域”是指独立于蛋白的其余部分保留其三级结构的折叠的蛋白结构。一般而言，结构域负责蛋白的离散的功能性质，并且在许多情况下，在蛋白和/或结构域的剩余部分无功能损失的情况下，可将结构域添加、移除或转移至其他蛋白。单一抗体可变结构域或免疫球蛋白单一可变结构域意味着包含抗体可变结构域的特征序列的折叠的多肽结构域。因此，其包括：完整抗体可变结构域和修饰的可变结构域(例如，其中一个或多个环已被不是抗体可变结构域的特征的序列替换)，或已经截短或包含N端或C端延伸的抗体可变结构域，以及至少部分地保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠的片段。

结构域抗体可以以具有其他可变区或可变结构域的形式(例如，同源或异源多聚体)存在，其中其他区域或结构域对于通过单一免疫球蛋白可变结构域的抗原结合不是必需的(即，其中免疫球蛋白单一可变结构域独立于额外可变结构域结合抗原)。

结构域抗体(dAb^TM)可以是人类抗体可变结构域。dAb^TM可以是人类来源的。换言之，dAb^TM可基于人类Ig构架序列。

如本文所用，术语“抗原结合位点”是指在抗原结合蛋白上能够特异性结合抗原的位点，这可以是单一结构域，或其可以是如可在标准抗体上发现的成对VH/VL结构域。单链Fv (ScFv) 结构域也可提供抗原结合位点。

抗原结合蛋白可包含用于不同抗原的额外抗原结合位点。例如，抗原结合蛋白可具有针对多于一种抗原(例如两种抗原)，或针对三种抗原或针对四种抗原的特异性。

抗原结合蛋白可由或基本上由抗体的Fc区或其在各端处直接或间接地(例如，经由接头序列)连接至结合结构域的部分组成。此类抗原结合蛋白可包含由Fc区域或其部分分离的两个结合结构域。分离意味着结合结构域并不直接地彼此连接，且可位于Fc区的相对端(C端和N端)或任何其他支架区域处。

抗原结合蛋白可包含两个支架区域，其各自可例如在各支架区域的N端和C端处直接或间接地(经由接头)与两个结合结构域结合。各结合结构域可结合不同抗原。

抗原结合蛋白可采取mAbdAb的蛋白支架形式。“mAbdAb”和“dAbmAb”可互换使用，且意欲在本文中使用时具有相同含义。此类抗原结合蛋白包含蛋白支架，例如，Ig支架(诸如IgG)，例如连接至另一结合结构域的单克隆抗体，例如结构域抗体。mAbdAb具有至少两个抗原结合位点，其中的至少一个来自结构域抗体，而至少一个来自成对VH/VL结构域。

结构域抗体可以单体或多聚(例如，二聚)形式存在并结合靶标，且可与其他分子组合使用以用于格式化和靶向途径。例如，可制备具有多个结构域的抗原结合蛋白，其中结构域之一结合血清蛋白诸如白蛋白。结合血清白蛋白的结构域抗体(AlbudAb)是已知的且可独立地为结构域融合配偶体提供延长的血清半衰期。

dAbs也可例如以与其他分子(例如，药物、另一蛋白、抗体分子或抗体片段)的dAb缀合物或dAb-融合体的形式与其他分子缀合。例如，dAb^TM可以作为格式化的dAb^TM存在，例如，dAb^TM可以作为dAb-Fc融合体或缀合物存在。或者，格式化的dAb^TM可以作为mAbdAb存在。dAb^TM可以作为与半衰期延长的蛋白或多肽的融合体或缀合物存在，例如，结合血清白蛋白(AlbudAb)或半衰期延长的化学部分诸如聚乙二醇(PEG)的另一dAb^TM。dAb^TM可作为与其他治疗或活性分子的融合体或缀合物存在。

如本文所用，“药物”是指可施用至个体以通过在个体中结合生物靶分子和/或改变其功能而产生有益治疗或诊断效果的任何化合物(例如，小有机分子、核酸、多肽)。靶分子可以是由个体的基因组编码的内源性靶分子(例如，由个体的基因组编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或由病原体的基因组编码的外源性靶分子。药物可以是dAb^TM或mAb。

“dAb缀合物”是指包含dAb^TM的组合物，药物借助于共价键或非共价键而与dAb^TM化学缀合。优选地，dAb^TM与药物是共价键合的。此类共价键可通过肽键或其他方式诸如经由修饰的侧链。非共价键合可以是直接的(例如，静电相互作用、疏水相互作用)或间接的(例如，通过互补结合配偶体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其中一个配偶体与药物共价键合且互补结合配偶体与dAb^TM共价键合)。当采用互补结合配偶体时，结合配偶体之一可直接地或通过合适接头部分与药物共价键合，且互补结合配偶体可直接地或经由合适接头部分与dAb^TM共价键合。

如本文所用，“dAb融合体”是指包含dAb^TM和多肽药物(其可以是多肽、dAb^TM或mAb)的融合蛋白。dAb^TM和多肽药物作为单一连续多肽链的离散组分(部分)存在。

因此，本公开的方法可应用于以下中的一种或多种：治疗蛋白、单克隆抗体(mAb)、结构域抗体(dAb^TM)、dAb^TM缀合物、dAb^TM融合体、mAbdAb或本文中所述的任何其他抗原结合蛋白。

在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白是干扰TNFα信号传导的dAb^TM。在一个实施方案中，所述dAb^TM中和TNFα。在一个实施方案中，所述dAb^TM特异性结合TNFα或TNFα受体。在一个实施方案中，所述dAb^TM特异性结合TNFR1。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白为SEQID NO: 53 (DOM0101)的VH dAb^TM (抗TNFR1)/DOM0101)。

蛋白的表达：宿主细胞

合适的宿主细胞包括微生物细胞诸如革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌(例如，W3110和BL21)、假单胞菌和沙门氏菌)。在一个具体实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。在一个实施方案中，所述大肠杆菌菌株是W3110。

本文还描述了包含编码信号序列和重组蛋白的重组核酸分子的载体。此类载体用于对细胞进行基因工程改造以表达所需蛋白产物。载体可以是包含一个或多个表达控制元件或序列的表达载体，所述表达控制元件或序列与信号序列和重组核酸可操作连接。载体的实例包括质粒和噬菌粒。

合适的表达载体可含有多种组分，例如，复制起点、可选择标记基因、一种或多种表达控制元件，诸如转录控制元件(例如，启动子、增强子、终止子)和/或一种或多种翻译信号、信号序列或前导序列。表达控制元件和信号序列(如果存在)可由载体或其他来源提供。例如，编码抗体链的克隆的核酸的转录和/或翻译控制序列可用于直接表达。

可提供启动子用于在所需细胞中表达。启动子可以是组成型或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的核酸可操作连接，使得其引导核酸的转录。可使用用于革兰氏阴性细菌的各种合适启动子(例如，用于大肠杆菌的lac、tac、trp、phoA、lambdapL、T3、T7(T7A1、T7A2、T7A3)启动子)。可采用的操纵子序列包括lac、gal、deo和gin。可采用一种或多种完美回文操纵子序列。在一个实施方案中，本公开的重组蛋白的表达在诱导型启动子的控制下进行。例如，大肠杆菌lac、tac和trc启动子可用乳糖或不可水解的乳糖类似物、异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，和phoA、trp和araBAD启动子可分别由磷酸盐、色氨酸和L-阿拉伯糖诱导。

另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的细胞的可选择标记，并在可复制表达载体的情况下包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常见的可选择标记且可使用(例如，内酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在各种细胞中用甲氨喋呤选择。

如WO2007/088371中所述的表达载体(例如pAVE037、pAVE007或pAVE011)可用于表达蛋白。在一个实施方案中，所述载体是pAVE011。或者，载体诸如pJExpress401可用于表达蛋白。

实例替代性表达载体和方法(例如与CHO、PerC6等一起使用)也是已知的。

宿主细胞包含上述重组核酸分子或载体。

本公开的宿主细胞培养物可在支持宿主细胞生长和重组蛋白表达的任何培养基中培养。此类培养基是本领域技术人员众所周知的。

蛋白靶向

尽管重组蛋白的表达发生在细胞质中，但重组蛋白的最终位置可以是细胞质、周质或细胞外，这取决于重组蛋白的性质、所使用的宿主细胞和所使用的发酵条件。

本发明中信号序列的使用可与靶向至细胞的周质(例如在革兰氏阴性细菌中)的重组蛋白相关。

在革兰氏阴性细菌中，一些分泌的蛋白以单一步骤经由I型、III型、IV型或VI型分泌途径跨越内膜和外膜输出，而其他蛋白首先经由通用Sec或Tat途径输出至周质中，且然后主要经由II型或V型机制跨越外膜易位。II型系统涉及两步骤过程，其中使用Sec途径将含有Sec前导序列的前体蛋白(premature protein)输出至周质。通过蛋白水解移除信号序列，产生成熟的加工的蛋白存在于周质中，且该蛋白是否分泌至培养基中高度取决于前导序列、蛋白、细胞的特性和培养条件。此外，在细胞裂解(自裂解)的情况下，可假定培养基中的大部分蛋白来源于周质且因此是经加工的。重组蛋白可经由信号序列主动地分泌至培养基中；或经由本领域中已知的其他细胞途径被动地从周质分泌至培养基中。

信号序列的加工包括信号序列从蛋白切割和移除。然而，信号的一些氨基酸可能保留在该蛋白的N端，使得信号序列未被适当加工。90%或更多的信号序列可被加工，使得10%或更少的序列保留在蛋白的N端。至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的信号序列可被加工。约100%的信号序列可被加工，使得在通过细胞的分泌性途径排出之后没有任何信号序列残留在蛋白的N端。

信号序列可以是周质靶向信号序列，例如，N端周质靶向序列。将蛋白引导至周质或细胞外环境的信号序列是本领域中已知的。信号序列可以包含异源信号序列。

收获

收获是发酵的结束。收获可在发酵期间的任何时间点处，所述时间点被视为足以终止发酵过程且回收所表达的重组蛋白。收获可发生在诱导后的10和160小时之间。例如，收获可发生在诱导后15和60小时之间。收获可发生在诱导后24、48或55小时。在收获时，微生物细胞群体的固体含量可在5%-30%的细胞湿重(WCW)之间。

发酵罐体积可以是：

(i)约10,000升；约5,000升；约2,000升；约1,000升；约500升；约125升；约50升；约20升；约10升；约5升；或

(ii) 5和10,000升之间；10和5,000升之间；20和2,000升之间；50和1,000升之间。

收获物可包含已天然裂解(也称为自裂解)的细胞。例如，收获物中的细胞的1-50%可已经历自裂解。或者，收获物中的细胞的20-50%、或30-50%、或40-50%已自裂解。或者，收获物中的细胞的10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、或50%或更多已自裂解。自裂解可间接地通过澄清的收获物中的DNA浓度测定，或通过电容测定。

收获可包括排空发酵罐的细胞和细胞外培养基(即，细胞培养物或培养液)的任选步骤。

收获物的任选预处理

根据宿主细胞和重组蛋白，收获物的预处理是调节收获物的方法。该步骤可在发酵罐中进行，或在已将收获物从发酵罐移除之后进行。预处理包括：热、机械或化学裂解收获物(例如，通过均质化、冻-融、裂解)；以及周质提取。可使用本领域中已知的方法提取至少一种周质提取物。或者，如果在细胞外环境中已存在足够的产物，则可不需要此预处理。

澄清

澄清是移除固体微粒的过程。澄清可降低对纯化期间的后续色谱步骤的负担。典型的澄清步骤包括沉降步骤 – 也称为沉积(例如，通过重力)，和/或离心步骤，和/或过滤步骤。

离心步骤可以是连续离心(例如，具有连续进料区域)。离心机可就排出固体而言是自身 “分批地”或“间歇地”或“连续地”操作。例如，管式转筒离心机可用作连续离心步骤。

重组蛋白的纯化

可直接从培养基回收重组蛋白。回收重组蛋白随后为纯化，以确保重组蛋白的足够纯度。在纯化中可使用一个或多个色谱步骤(例如，一种或多种色谱树脂)和/或一个或多个过滤步骤。例如，使用树脂(诸如蛋白A或L)的亲和色谱法可用于纯化重组蛋白。替代地或另外，离子交换树脂诸如阳离子交换可用于纯化重组蛋白。

实施例

研究一系列的天然、内源性大肠杆菌N端信号序列(SS)以用于从大肠杆菌W3110宿主菌株的结构域抗体(dAb)表达。将具有有前景属性的两个序列(YceISS和IvySS)用于在针对目前使用的信号序列(OmpASS)比较的情况下的生物反应器研究。对于所研究的生物反应器条件，OmpASS的使用在短发酵时间中产生高产物滴度，但产生有高度粘性培养液，这通过对于由全尺寸离心澄清有挑战性的超按比例缩减研究(ultra scale-down studies)来预测。YceISS的使用导致在滴度和粘度以及离心难度的方面与OmpASS相当的性能，而IvySS的使用导致相对易于离心的低粘度培养液和高产物滴度，但经更长发酵时间来实现。IvySS的密码子优化得到类似地适合于离心的低粘度培养液和高滴度，但现在是经与使用OmpASS的对照相当的更短发酵时间。使用IvySS或其优化版本实现的改善似乎与dAb的降低的基础表达(即在诱导前)相关。这种降低的表达被认为归因于来自信号序列的N端的八密码子盒的存在，如果将其移除则导致类似于使用OmpASS所获得的高粘度培养液。研究了基础表达和培养液粘度之间的关系。

材料和方法

分泌盒的分子克隆。大肠杆菌菌株One Shot^TM TOP10 (Life Technologies,California, USA)和W3110 (ATCC 27325)分别用作用于克隆和重组蛋白表达的宿主菌株。将经设计用于生成具有各种上游信号序列的dAb分泌盒的寡核苷酸(表2)按规格构建(Invitrogen, Paisley, UK)。使用的试剂是限制酶(NdeI和XhoI)、T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs UK Ltd., Hertfordshire, UK)和DNA聚合酶(Phusion™快速高保真PCR主混合物(Phusion™flash high-fidelity PCR master mix)，Finnzymes Oy, Espoo,Finland)。将pAVEway™表达载体(pAVE011，此处表示为p11) (WO2007088371；FujifilmDiosynth Biotechnologies UK Ltd., Billingham, UK)用作用于dAb分泌盒的骨架，所述表达载体含有四环素抗性基因(tetA)和异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导性T7A3启动子。

表2. 用于构建具有不同信号序列的dAb基因构建体的寡核苷酸。限制位点NdeI(CATATG)和XhoI (CTCGAG)加下划线。

将七种内源性大肠杆菌信号序列(表3)的选择基因融合在编码针对TNFR1的V_H结构域抗体(分子量为~13.1 kDa，此处表示为dAb，SEQ ID NO: 53)的基因的上游。最多达四个连续PCR反应用于用所需信号序列的DNA延伸dAb的上游端。这需要3或4个正向寡核苷酸(每个连续PCR反应一个)、反向寡核苷酸SEQ ID NO: 32 (参见表2)和作为初始模板的p11表达质粒(pDAB01，参见表3)。PCR反应物含有适当正向(fwd)寡核苷酸和反向(rev)寡核苷酸SEQ ID NO: 32 (表2)、DNA模板和Phusion™快速高保真PCR主混合物。在以下条件下执行热循环：98℃持续10 s，随后30个循环的98℃持续1 s，55℃持续5 s和72℃持续15 s，以及在72℃下最终孵育1 min。在各轮PCR之后，产物使用柱色谱法(QIAquick^TM PCR纯化试剂盒，QIAGEN Ltd., Manchester, UK)来纯化，并用作下一连续PCR反应的DNA模板，直至生成侧接NdeI和XhoI限制位点的信号序列-dAb融合盒。分泌盒用NdeI和XhoI消化，并使用T4DNA连接酶连接至NdeI-XhoI消化的p11表达载体中，然后通过热休克转化至大肠杆菌OneShot^TM TOP10细胞中并在vLB琼脂四环素板上进行选择。质粒pDAB02至质粒pDAB08 (表3)通过DNA测序来证实，然后被转化至大肠杆菌W3110细胞中以用于蛋白表达研究。将各制备的构建体的细胞文库(甘油储备液，20% v/v)储存在-80℃下。

通过分别地使用正向寡核苷酸23-25和26-28以及反向寡核苷酸SEQ ID NO: 32(表2)对来自pDAB01 (如上文所述)的编码dAb的基因进行PCR扩增来生成dAb表达质粒pDAB021和pDAB022 (表4)的分泌盒，所述分泌盒含有密码子优化的Ivy信号序列(IvyOpt1SS和IvyOpt2SS)。通过使用pDAB02作为模板(表3)和正向寡核苷酸29和反向寡核苷酸31进行PCR扩增来生成pDAB023 (表4)的分泌盒，所述分泌盒含有在dAb上游的截短的Ivy信号序列(IvyTruncSS)。编码具有上游信号序列Ivy’OmpASS的dAb的pDAB011的分泌盒由融合至OmpASS的IvySS的前8个密码子构成。这通过使用正向寡核苷酸30和反向寡核苷酸SEQ ID NO: 32对来自pDAB01(表3)的编码OmpASS-dAb的基因进行扩增来生成。随后，将所有分泌盒均连接至p11载体中在NdeI/XhoI处，并将其转化至大肠杆菌W3110菌株中。

各信号序列的密码子适应指数(CAI) (Sharp和Li 1987)使用参考的EMBOSS套件(Rice等人2000)仅针对II类(高表达)基因的密码子使用(Eecoli_high.cut)来测定。使用密码子适应算法(Leto软件, 版本1.0.26, Entelechon GmbH, Regensburg, Germany)将IvySS密码子优化用于在大肠杆菌中表达。参考所有大肠杆菌K12基因以及仅参考大肠杆菌K12 II类(高表达)基因，将密码子(Leto)阈值设定在70%以分别生成IvyOpt1SS和IvyOpt2SS(表4)。

发酵. 除非指定，否则所有培养基和试剂均购自Sigma-Aldrich (Dorset, UK)。接种和24深孔板(24 dwp)培养在Luria Bertani (vLB)培养基(pH 7.0)中进行，所述培养基为：10 g.L^-1 Difco™ Select大豆胨(Becton Dickinson and Co. (BD), New Jersey,USA)、5 g.L^-1 Bacto™酵母提取物(BD)和5 g.L^-1 NaCl。用于24 dwp培养的10×浓缩的甘油加强液(pH 7.0)含有：70 g.L^-1甘油、50 g.L^-1酵母提取物(BD)、25 g.L^-1 (NH₄)₂SO₄和1.0µg.mL^-1硫胺素。在如别处(Voulgaris等人2015)描述的复合培养基中进行高细胞密度发酵。所有发酵培养基(不包括TB/SB进料)均补充有15 μg.mL^-1四环素(Tet)以用于选择含有p11表达质粒的大肠杆菌克隆。

对于深孔板表达，用0.5% v/v的用pDAB表达质粒转化的大肠杆菌W3110在125 mLErlenmeyer挡板式通气帽摇瓶(Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands)中，制备vLB培养基(20 mL)中的接种培养物。在23℃、230 rpm下在具有25 mm偏移的轨道振荡器(Climo-shaker ISF1-X, Kühner Shaker Ltd., Derbyshire, UK)中将培养物孵育过夜至1-2的OD_600nm。这用于接种新鲜vLB培养基至0.05的OD_600nm，且分配至24深孔微量滴定板(24 dwp; Porvair Sciences Ltd., Wrexham, UK)的锥形底方形孔(2 mL工作体积)中，并用高细胞密度透气盖系统(Applikon Biotechnology, Tewkesbury, UK)覆盖。将板在37℃、230 rpm下孵育至OD_600nm 0.7 - 1.0，且然后用0.1 mM IPTG同时添加10×甘油加强液(配方参见上文)来诱导dAb形成。在23℃、230 rpm下将培养物再孵育24 h。使收获培养物(2mL)沉淀(16100×g持续10 min)并提取培养液上清液。将沉淀再悬浮于1 mL 0.1 M PBS中，并如前述再次离心。将培养液上清液和沉淀储存在-20℃。

对于生物反应器表达，用0.5% v/v甘油储备液在500 mL Erlenmeyer挡板式通气帽摇瓶(Corning Life Sciences)中制备vLB培养基(200 mL)中的接种培养物。在37℃、230rpm下在轨道振荡器中将培养物孵育4 h至5 h直至1-2的OD_600nm，并以0.05% v/v使用以接种含有上述复合培养基的1 L工作体积反应器(SR1000DLL生物反应器，容器直径100 mm，纵横比2.4:1，顶置式驱动的三重Rushton 6叶片，46 mm直径，叶轮，DASGIP AG, Jülich,Germany)。将反应器维持在30℃、pH 7.0 ±0.05 (使用25% v/v H₃PO₄和30% v/v NH₄OH)；溶解氧(DO) 30±5% (通过使用以下的级联控制：(1)叶轮速度(400 - 1200 rpm)；(2)气流速率(1-2 vvm)和(3)氧气含量(21-100%))。在指示完全耗尽甘油的DO尖峰后10 min开始以6.0 mL.L^-1.h^-1自动添加进料培养基。一旦培养物已达到75±3的OD_600nm(对应于大约25 dcwg.L^-1的生物量)，则通过添加0.2 mM IPTG诱导dAb的产生，并且将进料速率降低至3.6mL.L^-1.h^-1持续发酵剩余过程。记录pH、溶解氧、搅拌速度、温度、气流速率、氧气百分比、氧气吸收率、二氧化碳释放速率的实时值(DASGIP Control, Jülich, Germany)。通过在25℃增加和减少剪切扫描(1.3至110 s^-1，以五个增量，在各增量保持30 s)来测量新鲜细胞培养液的流变特征(DV-II+可程序化粘度计，其配备有ULA, 1.233N或SSA, 1.32N转轴，Brookfield Engineering Laboratories Inc., Massachusetts, USA)。将流变学用作培养液可加工性(例如通过离心)的指示。

细胞培养液加工. 将超按比例缩减剪切装置(20 mL不锈钢腔室，50 mm直径× 10mm高，其配备有不锈钢旋转盘；40 mm直径× 0.1 mm厚，12000 rpm，构建在UCL机械工作站中)用于将细胞培养液样品暴露至0.53 x10⁶ W.kg^-1的最大能量耗散速率(ε)下20 s(Chatel等人2014a)。此ε值通常模拟产生在高剪切持续流动工业规模离心机的进料区域中的值。然后将样品(2 mL的剪切或未剪切培养液)离心(在21℃下3400 × g持续7 min，离心机5415R，Eppendorf, Cambridge, UK)，且回收上清液(0.8 mL)。这些通过针对充分澄清的样品(16100 × g持续30 min)的基线OD_600nm值校正的OD_600nm下的测量值在残余固体方面进行表征。离心条件在组V/tΣ的方面表征，其中V是离心的体积(2.0 mL)，t是离心时间(420s)和Σ是针对离心机头的特定旋转速度和几何结构的离心管的等效沉降面积(= 0.164m²，对于计算的细节，参见Chatel等人2014a)。

分析方法.将细胞沉淀解冻且再悬浮于1 mL (24 dwp样品)或4 mL (1 L生物反应器样品)的pH 7.5的50 mM Tris-HCl中。使用30 s开和10 s关的两次脉冲以幅度8.0将1 mL的各再悬浮沉淀裂解(配备有指数微探针的Soniprep 150 Plus超声粉碎机，部件编号38121-114A，MSE (UK) Ltd., London, UK)。然后，将裂解的全细胞样品以16100 × g离心20 min，且回收上清液。然后，使用0.22 μm过滤板(GHP膜，AcroPrep™ 96过滤板，PallLife Sciences, Portsmouth, UK)以3000 × g下离心30 min，对发酵培养液样品和全细胞裂解物进行过滤。通过SDS-PAGE分析dAb从大肠杆菌24 dwp培养物的表达。根据制造商的说明书，将样品还原、变性且装载在SDS-PAGE凝胶(NuPAGE® 4-12% Bis-Tris,Invitrogen)上，其中凝胶电泳在1× MES电泳缓冲液(Invitrogen)中进行。通过考马斯染色检测蛋白，并使用密度测定法软件(Image Lab版本3.0, Bio-Rad Laboratories)定量产物。对于高细胞密度大肠杆菌发酵，培养液上清液和全细胞裂解物中的dAb产物滴度通过配备有1 mL HiTrap MabSelect Xtra柱(GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire,UK)的蛋白A HPLC (具有冷冻自动进样器的HP1100，Agilent Technologies UK Limited,Cheshire, UK)来测定。将柱平衡并用0.1 M PBS pH 7.3洗涤，且20 mM HCl pH 1.8用于产物洗脱(在280 nm下监测蛋白浓度)。使用标准曲线测定dAb的浓度。使用液相色谱飞行时间质谱(GSK内部方法，其使用Agilent HP1100 (Agilent Technologies UK Ltd.)，耦合至Micromass LCT质谱仪(Waters, Massachusetts, USA)，装备有电喷雾电离(ESI)探针，并使用MassLynx, 版本4.1, Waters, 软件来控制)来测定经纯化dAb的分子量。使用荧光测定法(Qubit^TMdsDNA BR分析试剂盒, Life Technologies)根据制造商的说明书来测量双链DNA。

实施例1

图1显示N端信号序列的初始筛选的最终生物量水平和SDS-PAGE凝胶(在胞外和胞内位置的方面详述dAb的表达)。

不同N端信号序列对在24 dwp发酵中从大肠杆菌W3110表达dAb的影响显示于图1中。关键词：B-位于胞外的dAb(上清液)；C-位于胞内的dAb(全细胞裂解物：周质+胞质溶胶)。B+C-总dAb，B/(B+C)-释放比例。B和C的总和允许视觉估计形成的总dAb。样品在诱导后24 h采集，还原，且通过考马斯染色的SDS-PAGE显现条带。‘Std’表示在0.5 mg.mL^-1浓度下的dAb标准物。

使用OmpA信号序列(OmpASS)、IvySS和YceISS导致每单位体积培养液(培养液=细胞+上清液，即胞外培养基)的高dAb表达水平，而使用YgiWSS、YncESS、FimASS、YehZSS和YcdOSS信号序列产生中等表达水平。OmpASS、IvySS、YceISS和FimASS产生每单位OD_600nm高胞内产物水平，而YgiWSS、YncESS、YehZSS和YcdOSS导致中等水平。对于OmpASS、YceISS、YgiWSS、FimASS和YehZSS，在每单位OD_600nm胞内产物水平和释放至上清液的产物之间存在一定程度的正相关。YceISS、YncESS和YcdOSS的使用似乎导致高释放水平，且对于YceISS，这加上实现的高滴度，使得其成为用于进一步研究的一个候选者。IvySS表现出相对低释放至上清液和高OD_600nm，其可能表示dAb形成的另外的可能。这加上所得高总产物和相对低比例的dAb释放至培养液，鉴定其作为用于进一步研究的第二候选者。这两种菌株用于进行针对使用OmpASS作为对照的生物反应器中的更详细的生长研究。

实施例2

使用OmpASS、YceISS和IvySS对大肠杆菌W3110的进料分批发酵的影响描述于图2中。经由OD_600nm作为细胞生长的指示、dsDNA释放作为裂解的指示、胞外和胞内dAb作为生产率和产物位置的指示、流变学作为培养液可加工性(例如通过离心)的指示，在诱导后时期中监测发酵。

图2显示高细胞密度大肠杆菌W3110进料分批培养物的诱导后发酵概况。N端信号序列和基础(诱导前)表达水平：(∆)、OmpASS，0.30 g.L^-1，(□) YceISS，0.64 g.L^-1或(◊)，IvySS，0.061 g.L^-1。所有结果均系在用IPTG诱导形成dAb之后采集。(A)生物量通过OD_600nm估计；(B)胞外可溶dsDNA浓度；(C)在胞内(全细胞裂解物)、(D)在胞外(上清液)、作为(E)所形成的总dAb(胞内+胞外)和作为(F)总dAb在胞外空间中的百分比来测定dAb产量。培养液粘度(µ)在幂律关系µ = K γ ^n-1方面进行描述，其中γ为剪切速率，(G) K为流动稠度指数和(H) n为流动特性指数。结果取自求平均值的重复的发酵罐(n = 2-4)且添加的误差条对应于一个标准偏差。

表6

使用OmpASS (∆)的菌株表明典型快速生长期和随后的细胞自裂解，如通过同时OD_600nm减少(图2A)和胞外dsDNA增加(图2B)所说明。这与快速形成dAb且释放至胞外环境/上清液中(图2C和图2D)一致。所形成的总dAb概述于图2E中，其中到发酵结束时几乎全部出现在胞外(图2F)。在诱导时，在细胞中已经表达显著量(0.30 g.L^-1)的dAb(图2C和图注)。这伴随有在诱导期开始时形成高度粘性、剪切稀化培养液(图2G和图2H)。培养液粘度在诱导后期期间继续增加24 h (图2G)，伴随胞外dsDNA水平的平行提高。

对于使用YceISS (□)，观察到使用OmpASS培养的类似倾向。此处在诱导时的产物表达水平(0.64 g.L^-1)大于使用OmpASS的菌株。这伴随有在诱导时较大培养液粘度，且随后降低的细胞生长和稍微较低的作为总dAb或作为胞外dAb的产物水平。

相比之下，IvySS的使用(◊)导致在诱导时的0.061 g.L^-1的低dAb表达水平和低粘度培养液。这随后为在整个发酵进程期间粘度增加，同时dsDNA释放增加(图2B)。在~ 72 h处开始裂解之前(即与使用OmpASS和YceISS观察的~12 h相比)，细胞生长持续更长时段。所得影响是dAb表达速率更慢且dAb释放至胞外空间延迟(图2D和图2F)。总体而言，其呈现：与OmpASS和YceISS相比，IvySS的使用提供在诱导之前dAb形成的更严格控制。

实施例3

在OmpASS、YceISS和IvySS之间的氨基酸序列比对(图3A)和其密码子适应指数(CAI)的评估(图3B和表3)鉴定在IvySS的N端处的八氨基酸(Ivy'SS)的盒，所述八氨基酸的盒在氨基酸序列的方面显著不同于OmpASS和YceISS，但也含有较大比例的罕见密码子(表3)。

图3显示信号序列氨基酸序列比对和其密码子适应指数的评估。(A) YceISS (SEQID NO: 35)和IvySS (SEQ ID NO: 34)的氨基酸序列比对针对OmpASS (SEQ ID NO: 33)来参考。保守氨基酸突出显示。(B)各密码子位置的适应性被计算为该密码子频率针对参考来源于Kazusa大肠杆菌密码子使用数据库的大肠杆菌密码子使用表最丰富的同义密码子的比率。‘B’中的氨基酸序列从Ivy'SS盒后的第一甲硫氨酸进行比对。

假设IvySS的该八密码子盒或所得氨基酸的存在可能影响在诱导之前的dAb表达的水平和速率(即，基础水平)。为了研究鉴定的Ivy'SS盒在促进在高细胞密度进料分批发酵期间的dAb形成中的影响，开发两种修饰的信号序列：IvyTruncSS，基于在移除Ivy'SS的情况下IvySS的信号序列的信号序列；以及Ivy'OmpASS，其为将Ivy'SS的密码子融合至OmpASS的N端的产物。另外，产生两种密码子优化的IvySS信号序列(IvyOpt1SS和IvyOpt2SS) (对于细节，参见图3B以及材料和方法)，以探究在不改变基础dAb表达水平和培养液粘度的情况下是否可以提高dAb的表达速率。四个修饰的Ivy相关的信号序列的所得CAI值在表4中给出。

实施例4

表达具有修饰的信号序列的dAb的大肠杆菌W3110培养物的生长描述于图4中。在图4中呈现的所有修饰的信号序列均被有效裂解，产生正确折叠的dAb分子。

图4显示高细胞密度大肠杆菌W3110进料分批培养物的诱导后发酵概况。N端信号序列和基础(诱导前)表达水平：(∆)，IvyTruncSS，0.90 g.L^-1，(□)，Ivy’OmpASS，0.086g.L^-1，(◊)，IvyOpt1SS，0.16 g.L^-1和(♦)，IvyOpt2SS，0.089 g.L^-1。对于细节，参见图2。结果取自单一发酵样品(m=3)。

表7

与IvySS的使用所观察到的相比，IvyTruncSS的使用导致生长的较早停止，dsDNA释放更多和dAb形成更低(图2)。在诱导时的dAb的基础表达的水平比使用IvySS更高，且正好诱导之前和诱导之后的粘度显著更高。因此，Ivy'SS的存在似乎对降低诱导之前的早期表达且因此对所得的高粘度水平是关键的(图4G)。观察到的提高表达速率(图4E)与移除含有大比例的罕见密码子的序列一致。Ivy'OmpASS的使用导致类似于当使用IvySS时所观察到的那些的生长、dsDNA释放、dAb形成和位置以及粘度概况(图2)，证实Ivy'SS在降低基础dAb表达中的重要性。再次，在开始诱导期时对于Ivy'OmpASS观察到低粘度，且后续粘度上升归因于胞外dsDNA的存在。类似地，如同IvySS，需要延长的发酵时间以产生显著表达水平的dAb且释放至胞外环境。IvyOpt1SS和IvyOpt2SS的使用在诱导时导致dAb的低基础表达(图4图注)。结果是低粘度培养液(图4G)。如所预期，优化信号序列中的罕见密码子的发生率降低导致dAb形成速率提高(图4E)。再次，如同使用IvySS，诱导后培养液的粘度上升可归因于dsDNA释放。与IvyOpt1SS相比，IvyOpt2SS似乎产生更低的基础表达、更高dAb滴度和更低粘度培养液。

实施例5

对于所研究的一系列信号序列，在图5A中比较如针对诱导后总滴度测量的发酵生产率。使用IvySS和Ivy'OmpASS的菌株的低dAb值明显地归因于产物形成和释放所需要的时间延长(~150 h)。使用IvyOpt1SS、IvyOpt2SS和IvyTruncSS的菌株均在诱导的24 h内产生最大dAb浓度和高发酵罐生产率水平。质谱分析(此处未显示)表明，对于图5中研究的所有构建体，信号序列从dAb完全移除。使用USD离心的最终培养液的澄清概述于图5B中。所使用的条件表示以该流动速率容量的低端操作且配备有高剪切应力进料区域的工业规模的碟式离心机或转鼓式连续流离心机(solid bowl continuous flow centrifuge)。至于台式离心机，模拟无剪切应力进料作为比较对照。

图5 (A)显示被计算为每总诱导后时间每升培养液的胞外dAb质量的总体生产率；且(B)显示表达具有不同N端信号序列的dAb的大肠杆菌收获培养物的离心性能；OmpASS(诱导后48 h)、YceISS (48 h)、IvyTruncSS (55 h)、Ivy'OmpA (153 h)和Ivy密码子优化信号序列IvyOpt1 (48h)和IvyOpt2 (55h)。细胞培养液暴露于以下的条件：()，无剪切；(□)高剪切应力(0.53 x10⁶ W.kg^-1的最大能量耗散率(ε)持续20 s)，且然后通过USD离心处理(V = 2.0 mL，t = 420 s，Σ = 0.164 m²，(参见正文)，V/tΣ = 2.9 x 10^-8 m.s^-1)。结果取自针对OmpASS和YceISS的重复的发酵罐(n=3)或针对其余信号序列的单一发酵罐样品。(B)的样品表征一式三份(m=3)。结果显示为平均值+/- SD。

使用OmpASS和YceISS获得的培养液的高粘度产生差澄清的上清液，其中分别地~50%和~80%的固体仍在上清液中。将残余培养液均澄清至＞10倍较大程度(~1-4%残余固体)，使得性能的差异较不明显。当使用IvyTruncSS(图4G)时获得的中等粘度培养液产生在该范围的高端(~4%)的澄清培养液。将残余培养液均澄清至较大程度，从而反映最终培养液的甚至较低粘度。在几乎所有情况下，高剪切应力的效果在澄清方面产生5-30%改善，指示粘度的可能减小例如归因于流体结构(诸如，聚合物桥键)的打破。几种菌株导致较高发酵罐生产率和良好离心澄清两者。基于该研究，使用IvyOpt2SS、随后IvyOpt1SS的菌株提供最有前景的选择。IvyTruncSS的使用也确实表现良好，但指示通过离心的澄清是更有挑战性的。

实施例的概述

已鉴定了两种信号序列(IvySS和YceISS)，所述两种信号序列使得异源蛋白能够分泌在大肠杆菌周质空间中。显示使用YceISS的菌株以与使用OmpASS相当的方式在1 L进料分批、搅拌的槽式发酵罐中进行(图2)。尽管生产速率较慢(图2和表3)且总体生产率较低(图5A)，但与通过使用OmpASS和YceISS获得的培养液粘度相比，使用IvySS导致相当较低的培养液粘度。我们首先讨论在此处使用的培养基和发酵策略的情况下形成高粘度培养液的原因，且其次讨论基于IvySS的信号序列的开发。

使用OmpASS、YceISS和IvySS的初始研究表明，dAb的高基础(即，诱导前)表达在开始诱导时导致高度粘性发酵液的形成(图2)。此类高粘度在整个剩余发酵过程中继续，其中任何进一步增加可能可归因于DNA随着细胞自裂解增加而释放。基础表达和粘度之间的该关系得到使用一系列其他信号序列(图4)的观察结果的支持且概述于表5中。初步研究(此处未显示)证实当在模拟高基础表达的指数生长期期间而非在其结束之后进行诱导时的IvySS的高粘度培养液(K ~ 1.1 Nsⁿm^-2)。

在诱导时观察到的高粘度可能归因于在发酵期间胞外聚合物质(EPS)的形成，这些是微生物生物膜的关键组分。因素(诸如，生长期、培养基组成、温度、氧气限制、氮气和阳离子不足)已显示控制EPS生物合成。对于其他微生物系统，指数生长自身已与EPS和生物膜的形成有关。乙酸也已与EPS形成有关。生物膜和EPS形成通常已显示导致生长速率降低。该研究中的观察结果表明，有可能的是，dAb的表达与诱导前环境条件的影响的组合可能促进EPS形成。

对于此处所研究的发酵，针对DO的控制策略使得导致低氧条件的氧气限制(DO ~0%)发生在诱导之前的指数生长期中。低氧和指数生长两者分别地与形成发酵性代谢副产物和溢流代谢产物(诸如，乙酸)有关。此类条件与高基础水平的dAb的存在的组合可能导致EPS形成。在诱导之后，所述条件使得所形成的任何乙酸可能在开始营养进料之前已经耗尽。从此点开始，受控的恒定营养进料速率将意味着，细胞处于线性生长期或生长稳定期，且DO控制有效地维持在30%；即，不可能存在任何显著水平的乙酸形成且因此不管dAb的高水平而无进一步EPS形成。因此，控制诱导之前的发酵条件可用于避免乙酸形成。或者，培养基调整可以减少生物膜形成，例如，降低大豆的存在或使用葡萄糖而非甘油(如在该工作中使用)作为碳源。在该研究中，使用含有大豆胨的培养基来进行发酵；已经通过使用不含大豆的发酵培养基来克服当使用OmpASS来产生相同dAb时的高粘度培养液的缺点。可通过使用更严格控制的表达系统来降低基础表达(和因此对于此处研究的系统，EPS形成)，但这可产生其他工艺相关的挑战。消除EPS形成的另一种可能途径是通过使用生物膜缺陷的大肠杆菌菌株。未来的工作将寻求证实导致在该研究中观察到的高粘度的EPS的影响。此处的焦点是，可如何改善所选择的信号序列以使用现有培养基和发酵操作条件来实现低粘度发酵。

IvySS的构成的两个方面似乎与其在决定dAb的基础表达和诱导后生产率方面的性能相关。首先，在IvySS开始时存在八密码子盒(Ivy'SS)导致在诱导之前蛋白表达的严格控制，即，低基础表达。其次，低密码子适应指数(CAI)似乎导致蛋白表达的低速率。信号序列(包括，用于保持低基础表达同时提高生产率的修饰的Ivy信号序列)的选择的影响概述于表5中。当Ivy'SS存在于信号序列的N端处时，dAb表达在诱导之前的基础表达水平是较低的，且获得低粘度的培养液。用IvyOpt1SS和IvyOpt2SS实现的低基础水平(图4)表明，决定基础表达水平的是氨基酸序列而非基因序列中的罕见密码子的存在。

初始生产率可能与CAI相关，所述CAI进而与翻译延长速率和dAb形成相关。已假设，在mRNA的5'端处的罕见密码子的存在导致新生多肽在翻译期间缓慢延伸以减少核糖体交通堵塞，这导致较低初始细胞生产率。从表5来看，针对序列长度值的低CAI导致较低初始生产率，例如，如对于IvySS和Ivy'OmpASS所见，而对于所有其他信号序列，存在导致高初始生产率的每密码子数目值的高CAI。理想地，该分析应着重朝向于构建体的N末端。当两种菌株存在罕见密码子时尤其如此，从而在使用IvySS和Ivy'OmpASS的情况得到低初始生产率。与使用IvySS获得的初始生产率相比，IvyOpt1SS和IvyOpt2SS的dAb的初始生产率的提高可能归因于修饰的密码子序列或罕见密码子的移除。

IvyOpt2SS通过基于在指数生长期间高度且持续表达的基因中频繁出现的最佳密码子的参考集优化来设计，而IvyOpt1SS基于所有大肠杆菌基因的表达来设计。前者导致每密码子数目的较高CAI (表5)，且这可能导致所指出的较大总体生产率(图5A)。未来的工作将进一步探究此类优化进一步改善总体表达水平同时仍阻止导致较高粘度培养液的显著基础表达的可能。

期刊参考文献

。

其他序列

序列表

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<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Met Gly Arg Ile Ser Ser Gly Gly

1 5

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<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

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tgatgtttaa ggcaataacg acagtcgccg ctctggtcat cgctaccagt g 51

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<211> 51

<212> DNA

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<223> 合成序列

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<212> DNA

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ttctctgccg gttcagcggt tgccgaagta caactgctgg agag 44

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 7

gaccatatga aaaaaagcct gcttggttta accttcgcgt ccctg 45

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

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<223> 合成序列

<400> 9

cagtaatcgc agtaatggcc ctgtgcagcg caccggtgat gg 42

<210> 10

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<212> DNA

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<223> 合成序列

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gaccatatga aaaaattcgc agcagtaatc gcagtaatgg ccctgtg 47

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ttactgttag gttcattgct tgttgtttca tcattcagta cgcaggc 47

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<223> 合成序列

<400> 13

ttttcatcgc gcctgcgtgg ttcattactg ttaggttcat tgcttgttg 49

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<223> 合成序列

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<211> 48

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<213> 人工的

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<211> 45

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<220>

<223> 合成序列

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<210> 21

<211> 48

<212> DNA

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<220>

<223> 合成序列

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<210> 22

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<223> 合成序列

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acgcattgca gttgagcgtg gctgcgctgt tttcttctgc ttttatggct aac 53

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成序列

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gaccatatga ccattaactt ccgccgtaac gcattgcagt tgagcgtg 48

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<223> 合成序列

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<211> 55

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<223> 合成序列

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atgatgttca aagcaatcac taccgttgca gctctggtta ttgcgacctc 50

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<212> DNA

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<223> 合成序列

<400> 29

gaccatatgg gtcgtatctc ttccggcggt atgatgttca aagcaatcac tac 53

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<223> 合成序列

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<211> 50

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<223> 合成序列

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成序列

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cttactcgag tcattagctg cttacggtga ccagag 36

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<211> 21

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<213> 大肠杆菌

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Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

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Thr Val Ala Gln Ala

20

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<211> 28

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Met Gly Arg Ile Ser Ser Gly Gly Met Met Phe Lys Ala Ile Thr Thr

1 5 10 15

Val Ala Ala Leu Val Ile Ala Thr Ser Ala Met Ala

20 25

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<211> 22

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 35

Met Lys Lys Ser Leu Leu Gly Leu Thr Phe Ala Ser Leu Met Phe Ser

1 5 10 15

Ala Gly Ser Ala Val Ala

20

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Met Lys Lys Phe Ala Ala Val Ile Ala Val Met Ala Leu Cys Ser Ala

1 5 10 15

Pro Val Met Ala

20

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<211> 30

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Met His Leu Arg His Leu Phe Ser Ser Arg Leu Arg Gly Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Gly Ser Leu Leu Val Val Ser Ser Phe Ser Thr Gln Ala

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ser Thr Ala Ala Leu Ala

20

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<211> 23

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<213> 大肠杆菌

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Met Pro Leu Leu Lys Leu Trp Ala Gly Ser Leu Val Met Leu Ala Ala

1 5 10 15

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20

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<212> PRT

<213> 大肠杆菌

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Met Thr Ile Asn Phe Arg Arg Asn Ala Leu Gln Leu Ser Val Ala Ala

1 5 10 15

Leu Phe Ser Ser Ala Phe Met Ala Asn Ala

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 41

atgaagaaaa ctgctatcgc tattgcggtt gctctggcag gttttgccac ggttgcgcag 60

gcc 63

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<212> DNA

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atgggcagga taagctcggg aggaatgatg tttaaggcaa taacgacagt cgccgctctg 60

gtcatcgcta ccagtgcaat ggcg 84

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<211> 66

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

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atgaaaaaaa gcctgcttgg tttaaccttc gcgtccctga tgttctctgc cggttcagcg 60

gttgcc 66

<210> 44

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌

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atgaaaaaat tcgcagcagt aatcgcagta atggccctgt gcagcgcacc ggtgatggca 60

<210> 45

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 45

atgcatttac gtcatctgtt ttcatcgcgc ctgcgtggtt cattactgtt aggttcattg 60

cttgttgttt catcattcag tacgcaggcc 90

<210> 46

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 46

atgaaaatta aaactctggc aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacagcg 60

gctctggcc 69

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<211> 69

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<213> 大肠杆菌

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atgccactct taaagctctg ggcaggttca ctggttatgt tggcagccgt gagcctgccg 60

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<212> DNA

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gcttttatgg ctaacgcc 78

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<212> DNA

<213> 人工的

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<223> 合成序列

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gttattgcta ctagcgctat ggct 84

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<211> 84

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<223> 合成序列

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atgggtcgta tctcttccgg cggtatgatg ttcaaagcaa tcactaccgt tgcagctctg 60

gttattgcga cctctgctat ggca 84

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atgatgttta aggcaataac gacagtcgcc gctctggtca tcgctaccag tgcaatggcg 60

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<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 52

atgggcagga taagctcggg aggaatgaag aaaactgcta tcgctattgc ggttgctctg 60

gcaggttttg ccacggttgc gcaggcc 87

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 53

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Glu

20 25 30

Thr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser His Ile Pro Pro Asp Gly Gln Asp Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Ala Leu Leu Pro Lys Arg Gly Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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<212> DNA

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<223> 合成序列

<400> 54

gaagtacaac tgctggagag cggtggcggc ctggttcaac cgggtggttc cctgcgcctg 60

tcctgtgcgg catctggttt caccttcgca cacgaaacca tggtgtgggt tcgccaagct 120

ccgggcaaag gcctggaatg ggtaagccac attcctccag atggccagga cccattctat 180

gcggattccg ttaagggtcg ctttaccatt tctcgtgata actccaaaaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg cgccgaggat actgcggtgt accattgtgc gctgctgcct 300

aaacgtggcc cgtggttcga ttactggggt cagggtactc tggtcaccgt aagcagc 357

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<211> 29

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<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

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Met Gly Arg Ile Ser Ser Gly Gly Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile

1 5 10 15

Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala

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Claims

1.重组信号序列，其包含：(a)序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(b)在(a)的C端的异源信号序列。

2.重组融合蛋白，其包含(a)权利要求1的重组信号序列；和(b)在(a)的C端的异源重组蛋白。

3.重组核酸序列，其编码权利要求1的重组信号序列或如权利要求2中所定义的重组融合蛋白。

4.重组核酸序列，其编码包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)的信号序列，其中所述核酸序列已经密码子优化用于在宿主细胞中表达。

5.权利要求4的重组核酸序列，其中密码子优化的核酸序列编码重组信号序列，所述重组信号序列包含：(a)序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(b)在(a)的C端的异源信号序列。

6.权利要求4的重组核酸序列，其中密码子优化的核酸序列编码信号序列，所述信号序列包含序列MGRISSGGMMFKAITTVAALVIATSAMA (SEQ ID NO:34)或其通过1至10个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体。

7.权利要求4的重组核酸序列，其中密码子优化的核酸序列编码信号序列，所述信号序列包含序列MGRISSGGMKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 55)或其通过1至10个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体。

8.权利要求3至7中任一项的重组核酸序列，其中所述核酸序列已经密码子优化用于在宿主细胞中表达，且具有0.40或更高的密码子适应指数(CAI)。

9.重组表达载体，其包含权利要求3至8中任一项的核酸序列。

10.根据权利要求9所述的重组表达载体，其中所述信号序列可操作地连接至所述重组蛋白。

11.用于在宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其包括：

(a)在允许从存在于所述宿主细胞中的根据权利要求9或10所述的重组表达载体表达所述重组蛋白的条件下培养所述宿主细胞；和

(b)回收所述重组蛋白。

12.用于控制表达重组蛋白的宿主细胞培养液的粘度的方法，其包括：

在允许表达所述重组蛋白的条件下培养所述宿主细胞，其中所述宿主细胞包含重组核酸序列，所述重组核酸序列编码：(i)重组信号序列，其包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(ii)所述重组蛋白。

13.用于控制通过宿主细胞培养液表达重组蛋白的基础表达的方法，其包括：在诱导前条件下培养所述宿主细胞，

其中所述宿主细胞包含重组核酸序列，所述重组核酸序列编码：(i)重组信号序列，其包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其通过1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的变体，和(ii)所述重组蛋白。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述核酸序列如权利要求3至8中任一项所定义。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白从周质或胞外培养基回收。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中所述信号序列可操作地连接至所述重组蛋白。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白的诱导前表达水平为≤0.5g/L；和/或所述重组蛋白的诱导后表达水平为≥5g/L。

18.根据权利要求11至17中任一项所述的方法，其中所述信号序列从所述重组蛋白切割。

19.根据权利要求11至18中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白为抗原结合蛋白。

20.根据权利要求11至19中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为具有周质的微生物细胞。