TWI794170B

TWI794170B - 製造重組蛋白質之方法

Info

Publication number: TWI794170B
Application number: TW106114729A
Authority: TW
Inventors: 羅賓亞歷山大艾曼斯; 蓋瑞布萊恩芬卡; 麥可霍爾; 艾倫彼得利維斯; 威廉約翰肯尼斯利威斯; 亞當丹尼爾麥克納利; 馬克尤登; 艾恩尼斯奧格里斯
Original assignee: 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2023-03-01
Also published as: IL262544A; KR102504317B1; TW201805298A; WO2017191255A1; JP2019516371A; MX2018013562A; JP2022070902A; CN109071611A; EP3452496A1; SG11201808976WA; CA3023025A1; CN109071611B; KR20190003694A; US11098312B2; RU2018137305A; RU2742006C2; AU2017260277A1; BR112018072043A2; US20190177734A1; RU2018137305A3

Abstract

本發明係關於一種來源於大腸桿菌(E. Coli )之重組信號序列。本發明亦關於一種包含該信號序列之融合蛋白質、一種重組蛋白質，及製造該重組蛋白質之方法。該重組信號序列可用於提供一種用於控制醱酵之黏度及/或控制該重組蛋白質之基礎(誘導前)表現的方法。

Description

製造重組蛋白質之方法

本發明係關於一種重組信號序列及一種包含該信號序列之融合蛋白質以及一種重組蛋白質。描述使用重組信號序列製造重組蛋白質之方法。特定言之，重組信號序列提供一種用於控制醱酵之黏度及/或控制重組蛋白質之基礎(誘導前)表現之方法。

重組蛋白質之大規模且有成本效益的製造、回收及純化對於生物技術行業而言係重要的挑戰。微生物宿主細胞係廣泛地用於製造重組蛋白質之生物體。在製造期間之考量包括宿主細胞生長及重組蛋白質之表現、蛋白質滴度、蛋白質位置(例如，胞內、胞外、周質等)及自重組蛋白質之最終位置之選擇性回收與進行純化。平衡及最佳化此等不同因素並非簡單的。革蘭氏陰性真細菌大腸桿菌(Escherichia coli ，E. coli )為適用於工業生物過程之穩定表現系統，此係歸因於：其較佳表徵之遺傳學；其使用廉價基質能快速積聚生物質量之能力；易於製程規模放大及大量可用的宿主菌株及表現載體。大腸桿菌係用於製造不需要諸如糖基化之複雜轉譯後修飾之治療蛋白的常用宿主。對於二硫鍵形成，可將表現引導至周質之氧化環境中以便於正確摺疊。此可藉由使用N端信號序列來達成，該等N端信號序列由細胞之分泌系統之成分識別以起始其經由專用轉運系統之靶向及通過。因此，存在對於製造、回收及純化重組蛋白質之經改良方法之需要。

本發明提供一種重組信號序列，其包含(a)序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其藉由1、2或3個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體及(b)在(a) C端之異源信號序列。本發明亦提供一種重組融合蛋白質，其包含(a)如所定義之信號序列；及(b)在(a) C端之異源重組蛋白質。本發明亦提供一種重組核酸序列，其編碼如所定義之信號序列或融合蛋白質。本發明亦提供一種重組核酸序列，其編碼包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)之信號序列，其中該核酸序列已經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現。本發明亦提供一種包含如所定義之核酸序列之重組表現載體。本發明亦提供一種用於在宿主細胞中製造重組蛋白質之方法，該方法包含： (a)在允許自存在於宿主細胞中之如所定義之重組表現載體表現重組蛋白質之條件下培養宿主細胞；及 (b)回收重組蛋白質。本發明亦提供一種用於控制表現重組蛋白質之宿主細胞培養液之黏度的方法，該方法包含：在允許表現重組蛋白質之條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包含重組核酸序列，該重組核酸序列編碼(i)重組信號序列，該重組信號序列包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其藉由1、2或3個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體及(ii)重組蛋白質。本發明亦提供一種用於控制利用宿主細胞培養液表現之重組蛋白質之基礎表現的方法，該方法包含：在誘導前條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包含重組核酸序列，該重組核酸序列編碼(i)重組信號序列，該重組信號序列包含序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其藉由1、2或3個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體及(ii)重組蛋白質。

本發明涉及以下認識，使用特定信號序列在醱酵、重組蛋白質表現及蛋白質可回收性方面提供優勢。已針對重組蛋白質之周質分泌對信號序列進行研究。信號序列提供由較低基礎表現引起之低黏度培養液的優勢。包含於信號序列中之八胺基酸序列被確認為引起此較低基礎表現之關鍵。信號序列之密碼子最佳化成功地保持較低基礎表現，且因此保持低黏度培養液，同時增加重組蛋白質之醱酵生產率。因此，達成較高生產率及利用全尺寸離心之可實行的澄清之組合。序列「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)可用於任何信號序列之N端(5')。舉例而言，「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)可用於異源信號序列之N端。異源信號序列可為非內源性IVY信號序列之信號序列。舉例而言，異源信號序列為來自大腸桿菌之周質信號序列。舉例而言，大腸桿菌周質信號序列為OmpA、MalE、PelB、OmpT或LamB。舉例而言，「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)可為MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 33)、或表3中之信號序列中之任一者或任何大腸桿菌周質信號序列的N端。重組信號序列包含(a)序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)或其藉由1、2或3個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體及(b)在(a) C端之異源信號序列。異源信號序列可緊靠MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)之C端。舉例而言，重組信號序列可包含緊靠異源大腸桿菌周質信號序列之N端的序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)。舉例而言，重組信號序列可包含緊靠異源信號序列MKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 33)之N端的序列MGRISSGG (SEQ ID NO: 1)，以形成重組信號序列MGRISSGGMKKTAIAIAVALAGFATVAQA (SEQ ID NO: 55)。序列「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)可能利用1、2或3個胺基酸取代、缺失或插入來改變。序列「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)加異源信號序列可能利用1至10個胺基酸取代、缺失或插入來改變。變異體可保持「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之活性。胺基酸取代可涉及用來自如下表1中所定義之相同類別之胺基酸置換至少一個胺基酸。表 1 至少一個胺基酸取代、缺失或插入可藉由保持與以下各者之共同序列來保存序列「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之一級結構：(i)一或多個疏水性胺基酸、(ii)一或多個鹼性極性胺基酸、(iii)一或多個疏水性胺基酸及(iv)一或多個不帶電的極性胺基酸，如表1中所定義。可將當在信號序列之N端(5')時之「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之活性定義為對重組蛋白質之基礎表現(誘導前表現)的控制。基礎表現發生在宿主細胞之誘導前指數生長期期間。在此生長期期間，重組蛋白質應不被表現或降至最低，且實際上細胞之代謝負擔聚焦於生長。然而，多個信號序列允許重組蛋白質之一些基礎表現。「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)或其變異體之活性可用於將在誘導時之重組蛋白質基礎表現控制至0.5 g/L或更少之量，亦即0.5 g/L或更少之重組蛋白質之誘導前表現量。使用包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列可產生重組蛋白質之較低誘導前表現量。舉例而言，重組蛋白質之誘導前表現量可≤ 0.5 g/L、≤ 0.4 g/L、≤ 0.3 g/L、≤ 0.2 g/L、≤ 0.1 g/L或≤ 0.05 g/L。另外視情況，可將當在信號序列之N端(5')時之「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之活性定義為對表現重組蛋白質之宿主細胞培養液之黏度的控制。宿主細胞培養液由宿主細胞加包含培養基之上清液組成。培養液黏度可在醱酵期間在以下時間點改變：誘導前、誘導時及誘導後。使用包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列可在醱酵期間產生低黏度宿主細胞培養液。黏度可使用本領域中之常用方法來量測。舉例而言，黏度可使用流動稠度指數(K)或表觀黏度(μ)來量測。舉例而言，宿主細胞培養液具有等效於K 0.1 Nsⁿ m^-2 或更少之流動稠度指數的黏度。舉例而言，宿主細胞培養液具有K 0.05 Nsⁿ m^-2 或更少、K 0.04 Nsⁿ m^-2 或更少、K 0.03 Nsⁿ m^-2 或更少、K 0.02 Nsⁿ m^-2 或更少、或K 0.01 Nsⁿ m^-2 或更少的黏度。舉例而言，「低」黏度可等效於約0.001 Nsⁿ m^-2 至0.01 Nsⁿ m^-2 之K值，「中等」黏度可等效於約0.01 Nsⁿ m^-2 至0.1 Nsⁿ m^-2 之K值，且「高」黏度可等效於約高於0.1 Nsⁿ m^-2 之K值。可替代地，舉例而言，宿主細胞培養液具有0.1 Nsm^-2 或更少之表觀黏度μ (如在1 s^-1 之剪切速率下所定義)。舉例而言，宿主細胞培養液具有μ 0.05 Nsm^-2 或更少、μ 0.04 Nsm^-2 或更少、μ 0.03 Nsm^-2 或更少、μ 0.02 Nsm^-2 或更少、或μ 0.01 Nsm^-2 或更少的表觀黏度。表觀黏度將隨所施加之剪切速率而變化，值可根據流動特性指數(n)及所選剪切速率之給出值來計算。在一個實施例中，此為誘導時之培養液黏度。編碼包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之重組信號序列之核酸序列可經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現。用於密碼子最佳化(亦稱為密碼子適應)之方法為此項技術中已知。舉例而言，密碼子適應指數(CAI)可對照特定細胞株之所有原生基因或僅較高表現基因之密碼子使用來參考。可參考所有大腸桿菌基因，或可參考所有大腸桿菌K12基因或大腸桿菌K12 II類(較高表現)基因。編碼包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列之核酸序列可具有0.40或更高、0.45或更高、0.50或更高、0.55或更高、0.60或更高、0.65或更高、0.70或更高、0.75或更高、0.80或更高、0.85或更高、或0.90或更高的CAI分值。舉例而言，編碼包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列之核酸序列可包含密碼子最佳化序列：「atgggacgtatttcttcgggcggaatgatgttcaaagcaatcaccacagtggcagctctggttattgctactagcgctatggct」(SEQ ID NO: 49)；或「atgggtcgtatctcttccggcggtatgatgttcaaagcaatcactaccgttgcagctctggttattgcgacctctgctatggca」(SEQ ID NO: 50)。另外視情況，「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)或其變異體或密碼子最佳化序列之活性可用於將誘導後之重組蛋白質表現控制至5 g/L或更高之量。使用包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列可產生重組蛋白質之較高誘導後表現量。舉例而言，重組蛋白質之誘導後表現量可≥ 5 g/L、≥ 6 g/L、≥ 7 g/L、≥ 8 g/L、≥ 9 g/L或≥ 10 g/L。重組蛋白質之表現量可為總製造的蛋白質，或胞外蛋白質。另外視情況，「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)或其變異體或密碼子最佳化序列之活性可用於將誘導後之重組蛋白質生產率控制至0.1 g/L/h或更高之量。使用包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列可產生在誘導後之較高重組蛋白質生產率。舉例而言，重組蛋白質之誘導後生產率可≥ 0.10 g/L/h、≥ 0.11 g/L/h、≥ 0.12 g/L/h、≥ 0.13 g/L/h、≥ 0.14 g/L/h或≥ 0.15 g/L/h。重組蛋白質之生產率可為總製造的蛋白質，或胞外蛋白質。時間(小時)自誘導時開始計算。另外視情況，「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)或其變異體或密碼子最佳化序列之活性可用於將在離心收集物(亦即，澄清)後之殘餘固體% (如利用在600 nm下之光學密度之量測值所定義)控制至20%或更少之量。使用包含「MGRISSGG」(SEQ ID NO: 1)之信號序列可產生在離心收集物後之較低殘餘固體%。舉例而言，在離心收集物後之殘餘固體%可≤20%、≤15%、≤10%、≤9%、≤8%、≤7%、≤6%或≤5%。如本發明中所使用之細胞培養係給出其最廣泛的含義，亦即在生長培養基中之細胞的大量生長。如本文所使用，「醱酵」及「培養」意謂在生長培養基中之細胞的大量生長。術語「醱酵」及「培養」在本文中可互換地使用。指數期特徵在於細胞倍增因此大量生長的時段。每單位時間出現之新細胞之數目顯著地增長且與現存群體成正比。細胞可能在誘導前處於指數生長期。舉例而言，重組蛋白質之基礎表現係在誘導前指數期期間。生長停滯期係細胞之生長率與死亡率相等，產生線性生長期之時。舉例而言，重組蛋白質之表現係在生長停滯期期間誘導的。細胞通常因生長限制因素(諸如必需的營養耗盡)及/或形成抑制產物(諸如有機酸)而到達生長停滯期。為維持生長停滯期中之恆定生物質量且因此大量生長，細胞繼續生長。生物質量可利用OD_600nm 來評估。「較高細胞密度」生物質量可為至少30之OD_600nm 。舉例而言，較高細胞密度可指至少30、至少40、至少50或至少60之OD_600nm 。可替代地，生物質量可利用細胞乾重來量測。「較高細胞密度」生物質量可為至少10 gL^-1 之細胞乾重。舉例而言，較高細胞密度可指至少10 gL^-1 、至少15 gL^-1 、至少20 gL^-1 或至少25 gL^-1 之細胞乾重。可替代地，生物質量可利用細胞濕重來量測。「較高細胞密度」生物質量可為至少50 gL^-1 之細胞濕重。舉例而言，較高細胞密度可指至少50 gL^-1 、至少70 gL^-1 、至少85 gL^-1 或至少100 gL^-1 之細胞濕重。術語胞外培養基、上清液、胞外環境、胞外空間、培養基及醱酵培養基，在本文中全部用於描述在細胞培養期間、誘導時及收集時之細胞外部環境。如本文所使用，術語「誘導」或「誘導表現」係指開始誘導重組蛋白質表現之時。舉例而言，重組蛋白質表現可藉由添加誘導劑或改變溫度(在誘導為溫度依賴性時)來誘導。術語「誘導後」在本文中用於描述在開始誘導之時間點後所經過的時間。術語「收集」在本文中用於意謂醱酵結束。收集可在醱酵期間認為足以結束醱酵製程及回收所表現之重組蛋白質的任何時間點下。舉例而言，蛋白質回收在收集時開始。收集時間可視上清液中之重組蛋白質之最佳濃度而定。在收集時，可直接自細胞培養物之胞外培養基回收重組蛋白質並對其進行純化。可替代地，可自宿主細胞之周質回收重組蛋白質並對其進行純化。如本文中所使用，「約」當指可量測值(諸如，量、分子量、時間持續期及其類似值)時，意謂涵蓋距指定值之±1%、±0.75%、±0.5%、±0.25%、±0.2%及±0.1%之變化，因為此類變化適合於執行所描述之方法。重組蛋白質 重組蛋白質可包含抗原結合蛋白質，例如單株抗體、抗體片段或域抗體(dAb)。重組蛋白質可包含病毒蛋白質、細菌毒素、細菌類毒素或癌抗原。如本文中所使用，「重組蛋白質」係指可投與哺乳動物以引起組織、體系、動物或人類之生物或醫學反應的任何蛋白質及/或多肽。重組蛋白質可引起多於一個生物或醫學反應。此外，術語「治療有效量」意謂，與尚未接受此量的對應個體相比，引起(但不限於)疾病、病症或副作用之治癒、預防或改善，或引起疾病或病症之進展速率降低之任何量。該術語亦在其範疇內包括可有效增強正常生理功能之量，以及可有效引起患者體內之增強或有助於第二藥物試劑之治療效果之生理功能的量。如本文中所使用，術語「抗原結合蛋白質」係指能夠與抗原結合之抗體、抗體片段及諸如域(domain)之其他蛋白質結構。術語「抗體」在本文中在最廣泛的意義上用於指帶有免疫球蛋白樣域之分子。如本文中所使用，「免疫球蛋白樣域」係指保持抗體分子之免疫球蛋白摺疊特徵之多肽家族，其含有兩個b片且通常含有保守的二硫鍵。此家族包括：單株抗體(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重組抗體、多株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體及異結合抗體；單一可變域、域抗體、抗原結合片段、免疫有效片段、Fab、F(ab')2、Fv、二硫鍵鍵聯之Fv、單鏈Fv、雙功能抗體、TANDABS™等。片語「單一可變域」係指與不同可變區或域無關地特異性結合抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白質可變域(例如，VH、VHH、VL)。「域抗體」或「dAb」可視為與「單一可變域」相同。如本文中所使用，「域」係指與蛋白質之其餘部分無關地保持其三級結構之摺疊蛋白質結構。一般而言，域係負責蛋白質之分立功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不喪失該蛋白質之其餘部分及/或該域之功能。單一抗體可變域或免疫球蛋白單一可變域意謂包含抗體可變域之序列特徵之摺疊多肽域。因此，其包括完整抗體可變域及經修飾可變域，例如其中一或多個環已經以下置換：非抗體可變域特徵的序列、或已經截斷或包含N端或C端延伸之抗體可變域、以及至少部分保持全長域之結合活性及特異性之可變域之摺疊片段。域抗體可以具有其他可變區或可變域之形式(例如同源多聚體或異源多聚體)存在，其中該等其他區或域不為單一免疫球蛋白可變域之抗原結合所需(亦即其中免疫球蛋白單一可變域結合抗原與該等其他可變域無關)。域抗體(dAb^TM )可為人類抗體可變域。dAb^TM 可為人類來源。換言之，dAb^TM 可基於人類Ig構架序列。如本文中所使用，術語「抗原結合位點」係指在抗原結合蛋白質上能夠與抗原特異性結合之位點，此位點可為單一域，或可為可在標準抗體上發現之成對VH/VL域。單鏈Fv (ScFv)域亦可提供抗原結合位點。抗原結合蛋白質可包含用於不同抗原之另外抗原結合位點。舉例而言，抗原結合蛋白質可具有針對多於一種抗原，例如兩種抗原，或針對三種抗原或針對四種抗原之特異性。抗原結合蛋白質可由或基本上可由抗體之Fc區或其部分在各端直接或間接地(例如經由連接子序列)鍵聯至結合域組成。此抗原結合蛋白質可包含由Fc區或其部分隔開的兩個結合域。隔開意謂該等結合域不彼此直接鍵聯，且可位於Fc區或任何其他骨架區之相對端(C端及N端)。抗原結合蛋白質可包含兩個骨架區，各骨架區可例如在各骨架區之N端及C端直接或間接地(經由連接子)與兩個結合域結合。各結合域可與不同抗原結合。抗原結合蛋白質可呈mAbdAb之蛋白質骨架格式。「mAbdAb」及「dAbmAb」可互換地使用，且意欲具有如本文所使用之相同含義。此類抗原結合蛋白質包含蛋白質骨架，例如，Ig骨架(諸如IgG)，例如鍵聯至另一結合域之單株抗體，例如域抗體。mAbdAb具有至少兩個抗原結合位點，其中之至少一者來自域抗體，且至少一者來自成對VH/VL域。域抗體可存在且與呈單體或多聚(例如，二聚)形式之目標結合，且可用於與其他分子組合以用於格式化及靶向途徑。舉例而言，可製得具有多個域之抗原結合蛋白質，其中域中之一者與諸如白蛋白之血清蛋白質結合。結合血清白蛋白之域抗體(AlbudAb)為已知的，且可提供域融合搭配物憑藉其自身延長的血清半衰期。 dAb亦可結合其他分子，例如，與例如藥物、另一蛋白質、抗體分子或抗體片段之其他分子呈dAb-結合物或dAb-融合物形式。舉例而言，dAb^TM 可作為格式化dAb^TM 存在，例如，dAb^TM 可作為dAb-Fc融合物或結合物存在。可替代地，格式化dAb^TM 可作為mAbdAb存在。dAb^TM 可以與半衰期延長性蛋白質或多肽之融合物或結合物形式存在，例如，與血清白蛋白(AlbudAb)或與諸如聚乙二醇(PEG)之半衰期延長性化學部分結合之另外dAb^TM 。dAb^TM 可以與其他治療或活性分子之融合物或結合物形式存在。如本文中所使用，「藥物」係指可投與個體以經由在個體中與生物靶分子結合及/或更改生物靶分子之功能而產生有益治療或診斷效果之任何化合物(例如，小型有機分子、核酸、多肽)。靶分子可為由個體之基因組編碼之內源性靶分子(例如，由個體之基因組編碼之酶、受體、生長因子、細胞介素)或由病原體之基因組編碼之外源性靶分子。藥物可為dAb^TM 或mAb。「dAb結合物」係指包含dAb^TM 之組合物，藥物藉助於共價或非共價鍵聯而與該dAb^TM 化學結合。較佳地，dAb^TM 與藥物係共價鍵合的。此類共價鍵聯可經由肽鍵或諸如經由經修飾側鏈之其他方式。非共價鍵合可為直接的(例如，靜電交互作用、疏水交互作用)或間接的(例如，經由互補結合搭配物(例如，生物素及抗生素蛋白)之非共價結合，其中一個搭配物與藥物共價鍵合且互補結合搭配物與dAb^TM 共價鍵合)的結合。當採用互補結合搭配物時，結合搭配物中之一者可直接地或經由合適連接子部分與藥物共價鍵合，且互補結合搭配物可直接地或經由合適連接子部分與dAb^TM 共價鍵合。如本文中所使用，「dAb融合物」係指融合蛋白質，其包含dAb^TM 及多肽藥物(其可為多肽、dAb^TM 或mAb)。dAb^TM 及多肽藥物作為單一連續性多肽鏈之不連續組分(部分)存在。因此，本發明之方法可應用於以下中之一或多者：治療蛋白質、單株抗體(mAb)、域抗體(dAb^TM )、dAb^TM 結合物、dAb^TM 融合物、mAbdAb或本文中所描述之任何其他抗原結合蛋白質。在一實施例中，抗原結合蛋白質為干擾TNFα信號傳導之dAb^TM 。在一實施例中，dAb^TM 中和TNFα。在一實施例中，dAb^TM 與TNFα或TNFα受體特異性結合。在一實施例中，dAb^TM 特異性地結合TNFR1。在一實施例中，抗原結合蛋白質為SEQ ID NO: 53 (DOM0101)之VH dAb^TM (抗TNFR1/ DOM0101)。蛋白質之表現：宿主細胞 合適的宿主細胞包括諸如革蘭氏陰性細菌之微生物細胞，例如，大腸桿菌(例如，W3110及BL21)、假單胞菌(Pseudomonas )及沙門氏菌(Salmonella )。在一特定實施例中，宿主細胞為大腸桿菌。在一實施例中，大腸桿菌菌株為W3110。亦在本文中描述包含編碼信號序列及重組蛋白質之重組核酸分子之載體。此類載體用於對細胞進行基因改造以表現所需蛋白質產物。載體可為包含可操作地連接於信號序列及重組核酸之一或多個表現控制元件或序列的表現載體。載體之實例包括質體及噬菌粒。合適的表現載體可含有多種組分，例如：複製起點、可選標記基因、一或多個表現控制元件，諸如，轉錄控制元件(例如，啟動子、強化子、終止子)及/或一或多個轉譯信號、信號序列或前導序列。表現控制元件及信號序列(若存在)可由載體或其他來源提供。舉例而言，編碼抗體鏈之純系化核酸之轉錄及/或轉譯控制序列可用於直接表現。可提供啟動子以用於在所需細胞中表現。啟動子可為組成性或誘導性的。舉例而言，啟動子可與編碼抗體、抗體鏈或其部分之核酸可操作地連接，使得其引導核酸之轉錄。可使用用於革蘭氏陰性細菌之各種合適啟動子(例如，用於大腸桿菌之lac、tac、trp、phoA、lambdapL、T3、T7 (T7A1、T7A2、T7A3)啟動子)。可採用之操縱序列包括lac、gal、deo及gin。可採用一或多個完美回文操縱子序列。在一實施例中，本發明之重組蛋白質之表現係在誘導性啟動子之控制下進行。舉例而言，大腸桿菌lac、tac及trc啟動子係用乳糖或不可水解乳糖類似物、異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)及phoA可誘導，trp及araBAD啟動子分別由磷酸鹽、色胺酸及L-阿拉伯糖可誘導。另外，表現載體通常包含用於選擇攜載載體之細胞之可選標記，且在可複製表現載體之情況下包含複製起點。編碼賦予抗生素或藥物抗性之產物之基因為常用可選標記，且可使用該等基因(例如，內醯胺酶基因(安比西林(ampicillin)抗性)、四環素(tetracycline)抗性之Tet 基因)。二氫葉酸還原酶標記基因准許在各種細胞中用甲胺喋呤(methotrexate)選擇。如WO2007/088371中所描述之表現載體(例如，pAVE037、pAVE007或pAVE011)可用於表現蛋白質。在一實施例中，載體為pAVE011。可替代地，諸如pJExpress401之載體可用於表現蛋白質。實例替代表現載體及方法(例如，以與CHO、PerC6等一起使用)亦為已知的。宿主細胞包含上述重組核酸分子或載體。本發明之宿主細胞培養物可在支持宿主細胞生長及重組蛋白質之表現之任何培養基中培養。此類培養基為熟習此項技術者所熟知。蛋白質靶向 儘管重組蛋白質之表現在細胞質中進行，但重組蛋白質之最終位置可視重組蛋白質之性質、所使用之宿主細胞及所使用之醱酵條件而為細胞質、周質或胞外。本發明中之信號序列之使用可能與靶向(例如，革蘭氏陰性細菌中之)細胞之周質的重組蛋白質有關。在革蘭氏陰性細菌中，一些分泌的蛋白質以單一步驟經由I型、III型、IV型或VI型分泌路徑跨內膜與外膜輸出，而其他蛋白質首先經由通用Sec或Tat路徑輸出至周質中，並接著主要經由II型或V型機器跨越外膜易位。II型系統涉及兩步處理，其中使用Sec路徑將含有Sec前導序列之前體蛋白質輸出至周質。藉由蛋白質水解移除前導序列從而產生存在於周質中之成熟、經加工蛋白質，且蛋白質是否分泌至培養基高度視前導序列、蛋白質、細胞之特徵及培養條件而定。此外，在細胞溶胞(自溶)之情況下，可假定培養基中之大部分蛋白質來自周質且因此為經加工的。重組蛋白質可經由信號序列主動地分泌至培養基中；或被動地經由此項技術中已知之其他細胞路徑自周質分泌至培養基。信號序列之加工包括自蛋白質裂解信號序列及將其移除。然而，信號之一些胺基酸可保留在蛋白質之N端處，使得信號序列加工不當。90%或更高之信號序列可經加工，使得10%或更少之序列保留在蛋白質之N端處。至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之信號序列可經加工。約100%之前導序列可經加工，使得在通過細胞之分泌性路徑之後在蛋白質之N端處無保留。信號序列可為周質靶向信號序列，例如，N端周質靶向序列。將蛋白質引導至周質或胞外環境之信號序列為此項技術中已知。信號序列可包含異源信號序列。收集收集為醱酵結束。收集可在醱酵期間認為足以結束醱酵製程及回收所表現之重組蛋白質的任何時間點下。收集可發生在誘導後10小時與160小時之間。舉例而言，收集可發生在誘導後15小時與60小時之間。收集可發生在誘導後24小時、48小時或55小時。在收集時，微生物細胞群體之固體含量可介於其細胞濕重(WCW)之5%至30%之間。醱酵器體積可為： (i)約10,000公升；約5,000公升；約2,000公升；約1,000公升；約500公升；約125公升；約50公升；約20公升；約10公升；約5公升；或 (ii)在5公升與10,000公升之間；在10公升與5,000公升之間；在20公升與2,000公升之間；在50公升與1,000公升之間。收集物可包含已自然地溶胞(亦稱為自溶)之細胞。舉例而言，收集物中之細胞之1%至50%可經歷自溶。替代地，收集物中之細胞之20%至50%、或30%至50%、或40%至50%已自溶。替代地，收集物中之細胞之10%或更多、20%或更多、30%或更多、40%或更多、或50%或更多已自溶。自溶可利用澄清收集物中之DNA濃度或利用電容來間接測定。收集可包括排空細胞醱酵器及胞外培養基(亦即，細胞培養物或培養液)的可選步驟。收集物之視情況選用之預處理 視宿主細胞及重組蛋白質而定，收集物之預處理為調節收集物之方法。此步驟可在醱酵器中進行，或在已將收集物自醱酵器移除之後進行。預處理包括：熱、機械或化學溶解收集物(例如，藉由均質化、凍融、溶胞)；以及周質提取。可使用此項技術中已知之方法提取至少一種周質提取物。可替代地，若在胞外環境中已存在足夠的產物，則可不需要此預處理。澄清澄清為移除固體粒子之過程。澄清可降低在純化期間之後續層析步驟上之負擔。典型澄清步驟包含沈降步驟(亦稱為沈積(例如，利用重力))，及/或離心步驟及/或過濾步驟。離心步驟可為持續離心(例如，具有持續進料區域)。離心自身可關於排出固體進行「分批地」或「間歇地」或「連續地」操作。舉例而言，管杯式離心機可用作連續性離心步驟。重組蛋白質之純化 可直接自培養基回收重組蛋白質。回收重組蛋白質之後藉由純化，以確保重組蛋白質之恰當純度。在純化中可使用一或多個層析步驟(例如，一或多個層析樹脂)及/或一或多個過濾步驟。舉例而言，使用樹脂(諸如，蛋白質A或L)之親和性層析法可用以純化重組蛋白質。可替代地或另外，諸如陽離子交換之離子交換樹脂可用以純化重組蛋白質。實例研究一系列原生、內源性大腸桿菌N端信號序列(SS )以用於自大腸桿菌W3110宿主菌株之域抗體(dAb)表現。將具有有前景屬性的兩個序列(YceISS 及IvySS )用於在針對目前所使用信號序列(OmpASS )比較之情況下的生物反應器研究。對於所研究的生物反應器條件，OmpASS 之使用在較短醱酵時間中產生較高產物滴度但具有高度黏稠培養液，此係利用對於由全尺寸離心澄清具挑戰性的超按比例縮減研究來預測。YceISS 之使用產生可比於OmpASS 關於滴度及黏度以及離心難度的效能，而IvySS 之使用產生相對易於離心之低黏度培養液及較高產物滴度但歷經更長醱酵時間來達成。IvySS 之密碼子最佳化產生類似適合於離心之低黏度培養液及較高滴度但現今歷經可比於使用OmpASS 之對照的更短醱酵時間。使用IvySS 或其最佳化形式達成之改良似乎與dAb之降低的基礎表現(亦即在誘導之前)相關。此降低的表現被認為係歸因於來自信號序列之N端之八密碼子卡匣的存在，若移除該八密碼子卡匣則產生類似使用OmpASS 所獲得之高黏度培養液。研究基礎表現與培養液黏度之間的關係。材料及方法 分泌卡匣之分子選殖。 大腸桿菌菌株One Shot^TM TOP10 (Life Technologies, California, USA)及W3110 (ATCC 27325)分別地用作用於選殖及重組蛋白質表現之宿主菌株。將經設計用於產生具有不同上游信號序列之dAb分泌卡匣之寡核苷酸(表2)按規格構築(Invitrogen, Paisley, UK)。所使用之試劑為限制酶(Nde I及Xho I)、T4 DNA連接酶(New England Biolabs UK Ltd., Hertfordshire, UK)及DNA聚合酶(Phusion™快速高保真PCR主混合物(Phusion™ flash high-fidelity PCR master mix)，Finnzymes Oy, Espoo, Finland)。將pAVEway™表現載體(pAVE011，此處表示為p11) (WO2007088371；Fujifilm Diosynth Biotechnologies UK Ltd., Billingham, UK)用作用於dAb分泌卡匣之骨架，該表現載體含有四環素抗性基因(tetA )及異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導性T7A3啟動子。表 2. 用於構築具有不同信號序列之dAb 基因構築體的寡核苷酸。帶下劃線的為限制位點Nde I (CATATG)及限制位點Xho I (CTCGAG)。將七種內源性大腸桿菌信號序列(表3)之選擇以基因方式融合在編碼針對TNFR1之V_H 域抗體(分子量為約13.1 kDa，此處表示為dAb，SEQ ID NO: 53)之基因的上游。至多四個連續PCR反應用於將具有所需信號序列之DNA之dAb 的上游端延伸。此需要3或4個正向寡核苷酸(每個寡核苷酸對應一個連續PCR反應)、反向寡核苷酸SEQ ID NO: 32 (參見表2)及作為初始模板之p11表現質體(pDAB01，參見表3)。PCR反應物含有合適正向(fwd)寡核苷酸及反向(rev)寡核苷酸SEQ ID NO: 32 (表2)、DNA模板及Phusion™快速高保真PCR主混合物。在以下條件下執行熱循環：98℃持續10 s，接著98℃持續1 s之30個循環，55℃持續5 s及72℃持續15 s，以及在72℃下最終培育1 min。在各輪PCR之後，產物使用管柱層析法(QIAquick^TM PCR純化套組，QIAGEN Ltd., Manchester, UK)來純化，且用作下一連續PCR反應的DNA模板，直至產生側接Nde I限制位點及Xho I限制位點之信號序列-dAb 融合卡匣。分泌卡匣用Nde I及Xho I來消化，且使用T4 DNA連接酶與經NdeI-XhoI 消化之p11表現載體接合，接著藉由熱休克轉型至大腸桿菌One Shot^TM TOP10細胞中並在vLB瓊脂四環素盤上對其進行選擇。質體pDAB02至質體pDAB08 (表3)藉由DNA定序來確定，接著被轉型至大腸桿菌W3110細胞中以用於蛋白質表現研究。將各製備的構築體之細胞庫(甘油儲備液，20% v/v)儲存在-80℃下。表3.用於dAb表現研究之表現質體及大腸桿菌信號序列。 ^a 信號序列名稱及[密碼子之數目]； ^b 其中C端裂解位點在序列的末端處的信號序列胺基酸序列。 ^c 各信號序列之密碼子適應指數(CAI)係使用EMBOSS套件針對大腸桿菌II類(較高表現)基因(Eecoli_high.cut)之密碼子使用參考來分析。 *胺基酸序列係關於Ivyss。在位置23處之密碼子序列已經自gcc更改為gct。表4.含有經修飾之大腸桿菌Ivy信號序列之表現質體，其用於研究密碼子適應指數(CAI)對於模型dAb之表現率之影響及對於在較高細胞密度進料分批(fed-batch)醱酵期間之培養液黏度的後續影響。 ^a 信號序列名稱及[密碼子之數目]。 ^b 各信號序列之密碼子使用指數係使用EMBOSS套件針對大腸桿菌II類(較高表現)基因(Eecoli_high.cut)之密碼子使用參考來分析。表5. N端信號肽序列對於在較高細胞密度大腸桿菌醱酵期間之基礎的dAb表現量、培養液黏度及初始生產率的影響。 ^a 初始生產率為在誘導後第一個24 h內表現之總dAb (圖2E及4E)。 ^b N端卡匣包含來自IvySS之前八個胺基酸之密碼子。藉由分別地使用正向寡核苷酸23至25及26至28以及反向寡核苷酸SEQ ID NO: 32 (表2)來對來自pDAB01 (如上文所描述)之編碼dAb之基因進行PCR擴增來產生dAb表現質體pDAB021及pDAB022 (表4)之分泌卡匣，該等分泌卡匣含有經密碼子最佳化之Ivy信號序列(IvyOpt1SS 及IvyOpt2SS )。藉由使用pDAB02作為模板(表3)及正向寡核苷酸29及反向寡核苷酸31進行PCR擴增來產生pDAB023 (表4)之分泌卡匣，該分泌卡匣含有在dAb 上游之經截斷的Ivy信號序列(IvyTruncSS )。編碼具有上游信號序列Ivy ' OmpASS 之dAb之pDAB011之分泌卡匣由融合至OmpASS 之IvySS 的前8個密碼子構成。此係藉由使用正向寡核苷酸30及反向寡核苷酸SEQ ID NO: 32對來自pDAB01(表3)之編碼OmpASS -dAb之基因進行擴增來產生。隨後，將所有分泌卡匣均與p11載體在Nde I/Xho I處接合，且將其轉型至大腸桿菌W3110菌株中。各信號序列之密碼子適應指數(CAI) (Sharp及Li 1987)係使用EMBOSS套件(Rice等人2000)僅針對II類(較高表現)基因(Eecoli_high.cut)之密碼子使用參考來測定。使用密碼子適應演算法(Leto軟體, 版本1.0.26, Entelechon GmbH, Regensburg, Germany)將IvySS 密碼子最佳化以用於在大腸桿菌中表現。參考所有大腸桿菌K12基因以及僅參考大腸桿菌K12 II類(較高表現)基因，將密碼子(Leto)臨限值設定在70%以分別地產生IvyOpt1SS 及IvyOpt2SS (表4)。醱酵 . 除非指定，否則所有培養基及試劑均購自Sigma-Aldrich (Dorset, UK)。接種及24深孔盤(24 dwp)培養係在盧里亞貝爾塔尼(Luria Bertani，vLB)培養基(pH 7.0)中進行，該培養基為：10 g.L^-1 Difco™精選大豆腖(Becton Dickinson and Co. (BD), New Jersey, USA)、5 g.L^-1 Bacto™酵母提取物(BD)及5 g.L^-1 NaCl。24 dwp培養物之經10×濃縮的甘油加強液(pH 7.0)含有：70 g.L^-1 甘油、50 g.L^-1 酵母提取物(BD)、25 g.L^-1 (NH₄ )₂ SO₄ 及1.0 µg.mL^-1 硫胺。在如其他處(Voulgaris等人2015)描述之複合培養基中進行較高細胞密度醱酵。所有醱酵培養基(不包括TB/SB進料)均補充有15 μg.mL^-1 四環素(Tet)以用於選擇含有p11表現質體之大腸桿菌純系。對於深孔盤表現，用0.5% v/v經pDAB表現質體轉型之大腸桿菌W3110在125 mL Erlenmeyer擋板式通風孔蓋搖瓶(Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands)中，製備於vLB培養基(20 mL)中之接種培養物。在23℃、230 rpm在具有25 mm偏移之迴轉式振盪器(Climo-shaker ISF1-X, Kühner Shaker Ltd., Derbyshire, UK)中培育培養物隔夜至OD_600nm 為1至2。此係用於接種新鮮vLB培養基至OD_600nm 為0.05，且分配至24深孔微量滴定盤(24 dwp; Porvair Sciences Ltd., Wrexham, UK)之錐形底方形孔(2 mL工作體積)中，並且用高細胞密度透氣蓋系統(Applikon Biotechnology, Tewkesbury, UK)覆蓋。在37℃、230 rpm將盤培育至OD_600nm 為0.7至1.0，且接著用0.1 mM IPTG同時添加10×甘油加強液(配方參見上文)來誘導dAb形成。在23℃、230 rpm將培養物再培育24 h。使收集培養物(2 mL)成集結粒(16100×g持續10 min)並提取培養液上清液。將集結粒再懸浮於1 mL 0.1 M PBS中，並如前述再離心。將培養液上清液及集結粒儲存在-20℃。對於生物反應器表現，用0.5% v/v甘油儲備液在500 mL Erlenmeyer擋板式通風孔蓋搖瓶(Corning Life Sciences)中製備於vLB培養基(200 mL)中之接種培養物。在37℃、230 rpm在迴轉式振盪器中培育培養物4 h至5 h直至OD_600nm 為1至2，且使用0.05% v/v以接種含有上述複合培養基之1 L工作體積反應器(SR1000DLL生物反應器，容器直徑100 mm，縱橫比2.4:1，塔頂驅動的三重Rushton 6葉片(46 mm直徑)葉輪，DASGIP AG, Jülich, Germany)。將反應器維持在30℃、pH 7.0 ±0.05 (使用25% v/v H₃ PO₄ 及30% v/v NH₄ OH)；溶解氧(DO) 30±5% (藉由使用以下級聯控制：(1)葉輪速度(400 rpm至1200 rpm)；(2)氣流速率(1 vvm至2 vvm)及(3)氧氣含量(21%至100%))。在指示完全耗盡甘油之DO尖峰後10 min開始以6.0 mL.L^-1 .h^-1 自動添加進料培養基。藉由添加0.2 mM IPTG誘導dAb之製造，一旦培養物已達到75±3之OD_600nm (對應於大約25 dcw g.L^-1 之生物質量)，則將進料速率降低至3.6 mL.L^-1 .h^-1 以進行剩餘醱酵。記錄pH、溶解氧、攪拌速度、溫度、氣流速率、氧氣百分比、氧氣吸收率、二氧化碳釋放速率的即時值(DASGIP Control, Jülich, Germany)。藉由在25℃增加及減少剪切掃描(1.3 s^-1 至110 s^-1 以五個增量，在各增量保持30 s)來量測新鮮細胞培養液之流變特性(DV-II+可程式化黏度計，安裝有ULA, 1.233N或SSA, 1.32N轉軸，Brookfield Engineering Laboratories Inc., Massachusetts, USA)。將流變用作培養液可加工性(例如藉由離心)之指示。 細胞培養液加工 . 超按比例縮減剪切裝置(20 mL不鏽鋼腔室，50 mm直徑× 10 mm高，安裝有不鏽鋼旋轉盤；40 mm直徑× 0.1 mm厚，12000 rpm，構築在UCL機械工作場中)用於將細胞培養液樣品暴露至0.53 × 10⁶ W.kg^-1 之最大能量耗散速率(ε)下20 s (Chatel等人2014a)。此ε值通常模擬產生在較高剪切持續流動工業規模離心機之進料區域中之值。接著對樣品(2 mL之經剪切或未剪切培養液)進行離心(在21℃下3400 × g持續7 min，離心機5415R，Eppendorf, Cambridge, UK)，且回收上清液(0.8 mL)。此等利用對照充分澄清之樣品(16100 × g持續30 min)之基線OD_600nm 值校正的OD_600nm 下的量測值根據殘餘固體表徵。離心條件根據組V/tΣ表徵，其中V為離心的體積(2.0 mL)，t為離心時間(420 s)及Σ為針對離心機頭之特定旋轉速度及幾何結構之離心管的等效沈降面積(= 0.164 m² ，欲見計算詳情，參見Chatel等人2014a)。 分析方法 . 對細胞集結粒進行解凍且再懸浮在1 mL (24 dwp樣品)或4 mL (1 L生物反應器樣品)之pH 7.5之50 mM Tris-HCl中。使用30 s開及10 s關在幅度8.0下的兩個脈衝將1 mL之各再懸浮集結粒溶胞(安裝有指數微探針之Soniprep 150增強版超音波散解機，零件編號38121-114A，MSE (UK) Ltd., London, UK)。接著，在16100 × g下對溶胞的全細胞樣品離心20 min，且回收上清液。接著，使用0.22 μm過濾器盤(GHP膜，AcroPrep™ 96過濾器盤，Pall Life Sciences, Portsmouth, UK)在3000 × g下離心30 min，對醱酵培養液樣品及全細胞溶胞物進行過濾。利用SDS-PAGE分析dAb自大腸桿菌24 dwp培養物之表現。根據製造商的說明書，對樣品進行還原、變性且裝載在SDS-PAGE凝膠(NuPAGE® 4-12% Bis-Tris, Invitrogen)上，其中凝膠電泳在1× MES電泳緩衝液(Invitrogen)中進行。利用庫馬斯染色偵測蛋白質，且使用密度測定法軟體(Image Lab版本3.0, Bio-Rad Laboratories)對產物進行定量。對於較高細胞密度大腸桿菌醱酵，培養液上清液及全細胞溶胞物中之dAb產物滴度係利用安裝有1 mL HiTrap MabSelect Xtra管柱(GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK)之蛋白質A HPLC (具有冷凍自動進樣器之HP1100，Agilent Technologies UK Limited, Cheshire, UK)來測定。對管柱進行平衡且用pH 7.3之0.1 M PBS洗滌，且pH 1.8之20 mM HCl用於產物溶離(在280 nm下監測蛋白質濃度)。使用標準曲線測定dAb之濃度。使用液相層析飛行時間質譜分析(GSK內部方法，其使用Agilent HP1100 (Agilent Technologies UK Ltd.)，耦合至Micromass LCT質譜儀(Waters, Massachusetts, USA)，裝備有電噴霧電離(ESI)探針，且使用MassLynx, 版本4.1, Waters, 軟體來控制)來測定經純化dAb之分子量。使用螢光測定法(Qubit^TM dsDNA BR分析套組, Life Technologies)根據製造商的說明書來量測雙股DNA。實例 1 圖1展示N端信號序列之初始篩檢之生物質量水準及SDS-PAGE凝膠(就胞外及胞內位置而言詳述dAb的表現)。不同N端信號序列對在24 dwp醱酵中自大腸桿菌W3110表現dAb的影響展示於圖1中。關鍵詞：B-位於胞外之dAb(上清液)；C-位於胞內之dAb(全細胞溶胞物：周質+胞溶質)。B+C-總dAb，B/(B+C)-釋放比例。B及C之總和提供所形成之總dAb之視覺評估。樣品係在誘導後24 h採集，還原，且條帶利用庫馬斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE來顯現。『Std』指示在0.5 mg.mL^-1 濃度下之dAb標準物。使用OmpA 信號序列(OmpASS )、IvySS 及YceISS 產生每單位體積培養液(培養液=細胞+上清液，亦即胞外培養基)之較高dAb表現量，而使用YgiWSS 、YncESS 、FimASS 、YehZSS 及YcdOSS 信號序列產生中等表現量。OmpASS 、IvySS 、YceISS 及FimASS 產生每單位OD_600nm 較高胞內產物量，而YgiWSS 、YncESS 、YehZSS 及YcdOSS 產生中等量。對於OmpASS 、YceISS 、YgiWSS 、FimASS 及YehZSS ，在每單位OD_600nm 胞內產物量與釋放至上清液之產物之間存在一定程度的正相關。YceISS 、YncESS 及YcdOSS 之使用似乎產生較高釋放量，且對於YceISS ，此加上達成之較高滴度，使得其成為用於進一步研究的一個候選者。IvySS 呈現相對較低釋放至上清液及較高OD_600nm ，此可表示dAb形成之另外的可能。此加上所得較高總產物及dAb釋放至培養液之相對較低比例，鑑別其作為用於進一步研究之第二候選者。沿用此兩種菌株，以進行針對使用OmpASS 作為對照之生物反應器中之更多詳細生長研究。實例 2 使用OmpASS 、YceISS 及IvySS 對大腸桿菌W3110之進料分批醱酵之影響描述於圖2中。經由OD_600nm 作為細胞生長之指示，dsDNA釋放作為溶胞之指示，胞外及胞內dAb作為生產率及產物位置之指示，流變作為培養液例如藉由離心可加工性之指示，在誘導後期中監測醱酵。圖2展示較高細胞密度大腸桿菌W3110進料分批培養物之誘導後醱酵特徵曲線。N端信號序列及基礎(誘導前)表現量：(∆)，OmpASS ，0.30 g.L^-1 ；(□)YceISS ，0.64 g.L^-1 或(◊)，IvySS ，0.061 g.L^-1 。所有結果均係在用IPTG誘導形成dAb之後採集。(A)生物質量利用OD_600nm 評估；(B)胞外可溶dsDNA濃度；(C)在胞內(全細胞溶胞物)、(D)在胞外(上清液)、以(E)所形成之總dAb(胞內+胞外)形式及以(F)總dAb在胞外空間中之百分比形式測定dAb產量。培養液黏度(µ)係以冪律關係µ = K γ^n-1 來描述，其中γ為剪切速率，(G) K為流動稠度指數及(H) n為流動特性指數。結果獲自求平均值之複製的醱酵器(n =2至4)且誤差槓對應於一個標準差添加。表 6 使用OmpASS (∆)之菌株表明，典型快速生長期後接細胞自溶，如利用同時OD_600nm 減少(圖2A)及胞外dsDNA增加(圖2B)所證實。此與快速形成dAb且釋放至胞外環境/上清液中(圖2C及圖2D)一致。所形成之總dAb概述在圖2E中，其中在醱酵結束時幾乎全部出現在胞外(圖2F)。誘導時，已經有大量(0.30 g.L^-1 ) dAb表現在細胞中(圖2C及圖例)。此伴隨有在誘導期開始時形成高度黏稠、剪切稀化培養液(圖2G及圖2H)。培養液黏度在誘導後期期間繼續提高24 h (圖2G)，伴隨胞外dsDNA量平行提高。對於使用YceISS (□)，觀測到使用OmpASS 培養之類似傾向。此處在誘導時之產物表現量(0.64 g.L^-1 )大於使用OmpASS 之菌株的產物表現量。此伴隨有在誘導時較大培養液黏度，且隨後降低的細胞生長及稍微降低的總dAb產物量或胞外dAb產物量。對比而言，IvySS 之使用(◊)產生在誘導時之0.061 g.L^-1 之較低dAb表現量及低黏度培養液。在此後，在整個醱酵進程期間黏度增加同時dsDNA釋放增加(圖2B)。在約72 h(亦即與使用OmpASS 及YceISS 觀測之約12 h相比)處開始溶胞之前，細胞生長持續更長時間段。所得影響為dAb表現速率減慢且dAb延遲釋放至胞外空間(圖2D及圖2F)。總體而言，其呈現：與OmpASS 及YceISS 相比，IvySS 之使用提供在誘導之前dAb形成的更嚴格控制。實例 3 在OmpASS、YceISS及IvySS之間的胺基酸序列比對(圖3A)及其密碼子適應指數(CAI)之評價(圖3B及表3)鑑別出在IvySS之N端處之八胺基酸(Ivy'SS)之卡匣，該八胺基酸之卡匣就胺基酸序列而言顯著不同於OmpASS及YceISS，但亦含有較大比例之罕見密碼子(表3)。圖3展示信號序列胺基酸序列比對及其密碼子適應指數之評價。(A)YceISS (SEQ ID NO: 35)及IvySS (SEQ ID NO: 34)之胺基酸序列比對係對照OmpASS (SEQ ID NO: 33)來參考。保守胺基酸經高亮顯示。(B)各密碼子位置之適應性被計算為該密碼子頻率與參考來源於Kazusa大腸桿菌密碼子使用資料庫之大腸桿菌密碼子使用表最豐富同義密碼子的比。『B』中之胺基酸序列係自Ivy'SS卡匣後之第一甲硫胺酸起比對。假設，IvySS 之此八密碼子卡匣或所得胺基酸之存在可能影響在誘導之前之dAb表現量及dAb表現速率(亦即，基礎量)。為研究經鑑別之Ivy ' SS 卡匣在便於在較高細胞密度進料分批醱酵期間之dAb形成中的影響，研發兩種經修飾信號序列：IvyTruncSS ，基於在移除Ivy ' SS 之情況下IvySS 之信號序列的信號序列；以及Ivy ' OmpASS ，其為將Ivy ' SS 之密碼子融合至OmpASS 之N端的產物。另外，創建兩種密碼子最佳化IvySS 信號序列(IvyOpt1SS 及IvyOpt2SS ) (詳情見圖3B以及材料及方法)，以探究在不改變基礎dAb表現量及培養液黏度之情況下是否能提高dAb之表現速率。四個經修飾Ivy 相關之信號序列之所得CAI值在表4中給出。實例 4 表現具有經修飾之信號序列之dAb之大腸桿菌W3110培養物之生長描述於圖4中。在圖4中呈現之所有經修飾之信號序列均經有效裂解，從而產生正確摺疊的dAb分子。圖4展示較高細胞密度大腸桿菌W3110進料分批培養物之誘導後醱酵特徵曲線。N端信號序列及基礎(誘導前)表現量：(∆)，IvyTruncSS ，0.90 g.L^-1 ；(□)，Ivy ' OmpASS ，0.086 g.L^-1 ；(◊)，IvyOpt1SS ，0.16 g.L^-1 及(♦)，IvyOpt2SS ，0.089 g.L^-1 。詳情參見圖2。結果係獲自單一醱酵樣品(m=3)。表 7 使用IvyTruncSS 引起生長之較早停止，與使用IvySS (圖2)所觀測到的相比dsDNA釋放更多及dAb形成更低。在誘導時之dAb之基礎表現量比使用IvySS 的高且二者之黏度僅在誘導之前及之後顯著更高。因此，Ivy ' SS 之存在似乎對降低誘導之前之早期表現且因此所得較高黏度水準(圖4G)係關鍵的。觀測到的經提高表現速率(圖4E)與移除含有較大比例之罕見密碼子的序列一致。使用Ivy ' OmpASS 產生類似當使用IvySS (圖2)時所觀測到的彼等之生長、dsDNA釋放、dAb形成及位置以及黏度特徵曲線，從而確認Ivy ' SS 在降低基礎dAb表現中的重要性。同樣，在開始誘導期時對於Ivy ' OmpASS 觀測到低黏度，且後續黏度上升係歸因於胞外dsDNA之存在。類似地，如同IvySS ，需要延長醱酵時間以產生顯著表現量之dAb且釋放至胞外環境。使用IvyOpt1SS 及IvyOpt2SS 在誘導時產生dAb之較低基礎表現(圖4圖例)。結果為低黏度培養液(圖4G)。正如預期的，降低最佳化信號序列中之罕見密碼子之發生率使得dAb形成速率提高(圖4E)。同樣，如同使用IvySS ，誘導後培養液之黏度上升可歸因於dsDNA釋放。與IvyOpt1SS 相比，IvyOpt2SS 似乎產生更低基礎表現、更高dAb滴度及更低黏度培養液。實例 5 對於所研究之一系列信號序列，在圖5A中比較如針對誘導後總滴度量測之醱酵生產率。使用IvySS 及Ivy ' OmpASS 之菌株之更低dAb值明顯地係歸因於產物形成及釋放所需要的時間延長(約150 h)。使用IvyOpt1SS 、IvyOpt2SS 及IvyTruncSS 之菌株均在誘導之24 h內產生最大dAb濃度及較高醱酵器生產率水準。質譜分析(此處未展示)表明，對於圖5中研究之所有構築體，信號序列自dAb完全移除。使用USD離心之最終培養液之澄清概述在圖5B中。所使用之條件表示以此流動速率容量之低端操作且安裝有較高剪應力進料區域之工業規模盤式堆疊或臥螺連續流離心機。至於台式離心機，模擬無剪應力進料作為比較對照。圖5 (A)展示被計算為每總誘導後時間每公升培養液之胞外dAb質量的總體生產率；及(B)展示表現具有不同N端信號序列之dAb之大腸桿菌收集培養物之離心效能，該等N端信號序列為：OmpASS (誘導後48 h)、YceISS (48 h)、IvyTruncSS (55 h)、Ivy ' OmpA (153 h)及Ivy 密碼子最佳化信號序列IvyOpt1 (48 h)及IvyOpt2 (55 h)。細胞培養液暴露於以下之條件：(■)，無剪切；(□)較高剪應力(0.53 × 10⁶ W.kg^-1 之最大能量耗散率(ε)持續20 s)，且接著利用USD離心處理(V = 2.0 mL，t = 420 s，Σ = 0.164 m² ，(參見正文)，V/tΣ = 2.9 × 10^-8 m.s^-1 )。結果係獲自針對OmpASS 及YceISS 之複製的醱酵器(n =3)或針對其餘信號序列之單一醱酵器樣品。(B)之樣品表徵重複三次(m =3)。結果展示為平均值+/- SD。使用OmpASS 及YceISS 獲得之高黏度培養液產生不良澄清的上清液，其中分別地約50%之固體及約80%之固體仍在上清液中。將殘餘培養液均澄清至＞10倍較大程度(約1%至4%殘餘固體)，使得效能不同較不明顯。當使用IvyTruncSS (圖4G)時獲得之培養基黏度培養液產生在此範圍之高端(約4%)的澄清培養液。將殘餘培養液均澄清至較大程度，從而反映最終培養液之甚至較低黏度。在幾乎所有情況下，較高剪應力之效果在澄清方面產生5%至30%改良，從而指示黏度之可能減小例如歸因於流體結構(諸如，聚合物橋鍵)之打破。若干菌株產生較高醱酵器生產率及良好離心澄清兩者。基於此研究，使用IvyOpt2SS 接著IvyOpt1SS 之菌株提供最有前景的選擇。使用IvyTruncSS 亦確實表現較佳，但指示藉由離心之澄清係更具挑戰性的。實例之概述 已鑑別出兩種信號序列(IvySS 及YceISS )，該兩種信號序列使得異源蛋白質能夠分泌在大腸桿菌周質空間中。展示使用YceISS 之菌株以與使用OmpASS (圖2)可比之方式在1 L進料分批、攪拌的槽式醱酵器中進行。儘管生產速率較慢(圖2及表3)且總體生產率較低(圖5A)，但相比於藉由使用OmpASS 及YceISS 獲得之培養液黏度，使用IvySS 產生相當較低的培養液黏度。吾等首先論述在此處使用之培養基及醱酵策略之情況下形成較高黏度培養液的原因，且其次論述基於IvySS 之信號序列之研發。使用OmpASS 、YceISS 及IvySS 之初始研究表明，dAb之較高基礎(亦即，誘導前)表現在開始誘導時引起高黏稠醱酵液之形成(圖2)。此類較高黏度在整個剩餘醱酵中繼續，其中任何進一步增加可能可歸因於DNA隨著細胞自溶增加而釋放。基礎表現與黏度之間的此關係得到使用一系列其他信號序列(圖4)之觀測結果的支持且概述在表5中。初步研究(此處未展示)表明，當誘導係在指數生長期期間而非在其結束之後進行時，IvySS 之較高黏度培養液(K約1.1 Nsⁿ m^-2 )模擬較高基礎表現。在誘導時觀測到之較高黏度可能係歸因於在醱酵期間胞外高分子物質(EPS)之形成，此等物質為微生物生物膜之關鍵成分。因素(諸如，生長期、培養基組成、溫度、氧氣限制、氮氣及陽離子不足)已展示控制EPS生物合成。對於其他微生物系統，指數生長自身已與EPS及生物膜之形成有關。乙酸亦已與EPS形成有關。生物膜及EPS形成一般而言已展示使得生長速率降低。此研究中之觀測結果表明，有可能的係，dAb之表現結合誘導前環境條件之影響可能促使EPS形成。對於此處所研究的醱酵，針對DO之控制策略為使得導致低氧條件之氧氣限制(DO約0%)發生在誘導之前之指數生長期中。低氧及指數生長兩者分別地與形成醱酵性代謝副產物及溢流代謝產物(諸如，乙酸)有關。此類條件結合較高基礎量之dAb之存在可能導致EPS形成。在誘導之後，該等條件為使得所形成之任何乙酸很可能在開始營養進料之前已經耗盡。自此點來看，受控恆定營養進料速率將意謂，細胞處於線性生長期或生長停滯期，且DO控制有效地維持在30%下；亦即，不大可能存在任何顯著量之乙酸形成且因此不管dAb之較高量而無另外EPS形成。因此，控制誘導之前之醱酵條件可用於避免乙酸形成。可替代地，培養基調整可減少生物膜形成，例如，降低大豆之存在或使用葡萄糖而非甘油(如在此工作中使用)作為碳源。在此研究中，使用含有大豆腖之培養基來進行醱酵；已經由使用不含大豆之醱酵培養基來克服當使用OmpASS 產生相同dAb時較高黏度培養液的缺點。可藉由使用更嚴格控制的表現系統來降低基礎表現(及因此對於此處研究之系統，EPS形成)，但此可產生其他工藝相關的挑戰。消除EPS形成之另一可能途徑為使用生物膜缺陷型大腸桿菌菌株。未來工作將尋求確認導致在此研究中觀測到的較高黏度之EPS之影響。此處的焦點係，可如何改良所選擇的信號序列以使用現有培養基及醱酵操作條件來達成低黏度醱酵。IvySS 之構成的兩個態樣似乎與其在決定dAb之基礎表現及誘導後生產率方面的效能相關。首先，在IvySS 開端存在八密碼子卡匣(Ivy ' SS )導致在誘導之前蛋白質表現的嚴格控制，亦即，較低基礎表現。其次，較低密碼子適應指數(CAI)似乎導致蛋白質表現之較低速率。信號序列(包括，用以保持較低基礎表現同時提高生產率的經修飾之Ivy信號序列)之選擇的影響概述在表5中。當Ivy ' SS 存在於信號序列之N端處時，dAb表現在誘導之前之基礎表現量係較低的，且獲得低黏度之培養液。用IvyOpt1SS 及IvyOpt2SS (圖4)達成之較低基礎量表明，決定基礎表現量的為胺基酸序列而非基因序列中之罕見密碼子之存在。初始生產率可能與CAI有關，該CAI又與轉譯延伸及dAb形成之速率有關。已假設，在mRNA之5'端處之罕見密碼子的存在導致新生多肽在轉譯期間緩慢延伸以減少核糖體交通堵塞，此導致較低初始細胞生產率。自表5，針對序列長度值之低CAI導致較低初始生產率，例如，如對於IvySS 及Ivy ' OmpASS 所見，而對於所有其他信號序列，存在導致較高初始生產率之每密碼子數目值較高CAI。理想地，此分析應著重朝向構築體之N末端進行。當兩種菌株存在罕見密碼子時尤其如此，從而至於使用IvySS 及Ivy ' OmpASS 之一者獲得較低初始生產率。與使用IvySS 所獲得之初始生產率相比，IvyOpt1SS 及IvyOpt2SS 之dAb之初始生產率之提高可能歸因於經修飾之密碼子序列或罕見密碼子之移除。IvyOpt2SS 係基於頻繁表示於在指數生長期間高度且持續表現之基因中之最佳密碼子之參考集來最佳化設計的，而IvyOpt1SS 係基於所有大腸桿菌基因之表現來設計的。前者導致每密碼子數目之較高CAI (表5)，且此可能導致所指出之較大總體生產率圖(5A)。未來工作將進一步探究此類最佳化進一步改良總體表現量同時仍阻止導致較高黏度培養液之顯著基礎表現的可能。期刊參考文獻 Rice P, Longden I, Bleasby A. 2000. EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trend Genet 16(6):276-277. Voulgaris I, Finka G, Uden M, Hoare M. 2015. Enhancing the selective extracellular location of a recombinantE. coli domain antibody by management of fermentation conditions. Appl Microbiol Biotechnol 99(20):8441-8453. Chatel A, Kumpalume P, Hoare M. 2014a. Ultra scale-down characterization of the impact of conditioning methods for harvested cell broths on clarification by continuous centrifugation-Recovery of domain antibodies from rec E. coli. Biotechnol Bioeng 111(5):913-924. Sharp PM, Li W-H. 1987. The codon adaptation index-a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic Acids Res 15(3):1281-1295.其他序列 SEQ ID NO: 53：DOM0101之胺基酸序列

SEQ ID NO: 54：DOM0101之DNA序列-(無信號序列)

圖1.不同N端信號序列對在24 dwp培養物中自大腸桿菌W3110表現dAb的影響。關鍵詞：B-位於胞外之dAb(上清液)；C-位於胞內之dAb(全細胞溶胞物：周質+胞溶質)。B+C-總dAb，B/(B+C)-釋放比例。B及C之總和提供所形成之總dAb之視覺評估。樣品係在誘導後24 h採集，還原，且條帶利用庫馬斯染色的SDS-PAGE來顯現。『Std』指示在0.5 mg.mL^-1 濃度下之dAb標準物。圖2.較高細胞密度大腸桿菌W3110進料分批培養物之誘導後醱酵特徵曲線。N端信號序列及基礎(誘導前)表現量：(∆)，OmpASS ，0.30 g.L^-1 ；(□)YceISS ，0.64 g.L^-1 或(◊)，IvySS ，0.061 g.L^-1 。所有結果均係在用IPTG誘導形成dAb之後採集。(A)生物質量利用OD_600nm 評估；(B)胞外可溶dsDNA濃度；(C)在胞內(全細胞溶胞物)、(D)在胞外(上清液)、以(E)所形成之總dAb(胞內+胞外)形式及以(F)總dAb在胞外空間中之百分比形式測定dAb產量。培養液黏度(µ)係以冪律關係µ = K γ^n-1 來描述，其中γ為剪切速率，(G) K為流動稠度指數及(H) n為流動特性指數。結果獲自求平均值之複製的醱酵器(n =2至4)且誤差槓對應於一個標準差添加。圖3.信號序列胺基酸序列比對及其密碼子適應指數之評價。(A) YceISS (SEQ ID NO: 35)及IvySS (SEQ ID NO: 34)之胺基酸序列比對係對照OmpASS (SEQ ID NO: 33)來參考。(B)各密碼子位置之適應性被計算為該密碼子頻率與參考來源於Kazusa大腸桿菌密碼子使用資料庫之大腸桿菌密碼子使用表最豐富同義密碼子的比。『B』中之胺基酸序列係自Ivy'SS卡匣後之第一甲硫胺酸起比對。圖4A至圖4H.較高細胞密度大腸桿菌W3110進料分批培養物之誘導後醱酵特徵曲線。N端信號序列及基礎(誘導前)表現量：(∆)，IvyTruncSS ，0.90 g.L^-1 ；(□)，Ivy ' OmpASS ，0.086 g.L^-1 ；(◊)，IvyOpt1SS ，0.16 g.L^-1 及(♦)，IvyOpt2SS ，0.089 g.L^-1 。詳情參見圖2。結果係獲自單一醱酵樣品(m=3)。圖5.(A)被計算為每總誘導後時間每公升培養液之胞外dAb質量的整體生產率；(B)表現具有不同N端信號序列之dAb之大腸桿菌收集培養物之離心效能，該等N端信號序列為：OmpASS (誘導後48 h)、YceISS (48 h)、IvyTruncSS (55 h)、Ivy'OmpA (153 h)及Ivy 密碼子最佳化信號序列IvyOpt1 (48 h)及IvyOpt2 (55 h)。細胞培養液暴露於以下之條件：(■)，無剪切；(□)較高剪應力(0.53 × 10⁶ W.kg^-1 之最大能量耗散率(ε)持續20 s)，且接著利用USD離心處理(V = 2.0 mL，t = 420 s，Σ = 0.164 m² ，(參見正文)，V/tΣ = 2.9 × 10^-8 m.s^-1 )。結果係獲自針對OmpASS及YceISS之複製的醱酵器(n =3)或針對其餘信號序列之單一醱酵器樣品。(B)之樣品表徵重複三次(m =3)。結果展示為平均值+/- SD。

<110> 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司(GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited)

<120> 製造重組蛋白質之方法

<130> PB66104

<140> TW106114729

<141> 2017-05-04

<150> US62/332636

<151> 2016-05-06

<150> US62/338045

<151> 2016-05-18

<160> 55

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 2

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 17

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 18

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 19

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 20

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 21

<210> 22

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 22

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 23

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 24

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 25

<210> 26

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 26

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 27

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 28

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 29

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 30

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 31

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 32

<210> 33

<211> 21

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 33

<210> 34

<211> 28

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 34

<210> 35

<211> 22

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 36

<210> 37

<211> 30

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 37

<210> 38

<211> 23

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 38

<210> 39

<211> 23

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 39

<210> 40

<211> 26

<212> PRT

<213> 大腸桿菌

<400> 40

<210> 41

<211> 63

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 41

<210> 42

<211> 84

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 42

<210> 43

<211> 66

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 43

<210> 44

<211> 60

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 44

<210> 45

<211> 90

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 45

<210> 46

<211> 69

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 46

<210> 47

<211> 69

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 47

<210> 48

<211> 78

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 48

<210> 49

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 49

<210> 50

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 50

<210> 51

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 51

<210> 52

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 52

<210> 53

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 53

<210> 54

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 54

<210> 55

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成序列

<400> 55

Claims

一種重組信號序列，其包含(a)序列MGRISSGG(SEQ ID NO：1)或其藉由1個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體，及(b)在(a)的C端之異源信號序列。
一種重組融合蛋白質，其包含(a)如請求項1之重組信號序列；及(b)在(a)的C端之異源重組蛋白質。
一種重組核酸序列，其編碼如請求項1之重組信號序列或如請求項2之重組融合蛋白質。
如請求項3之重組核酸序列，其中該核酸序列已經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現。
如請求項4之重組核酸序列，其中該經密碼子最佳化之核酸序列編碼信號序列，該信號序列包含序列MGRISSGGMKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO：55)或其藉由1、2或3個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體。
如請求項3至5中任一項之重組核酸序列，其中該核酸序列已經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現，且具有0.40或更高之密碼子適應指數(CAI)。
一種重組表現載體，其包含如請求項3至6中任一項之核酸序列。
如請求項7之重組表現載體，其中該信號序列可操作地連接於該重組蛋白質。
一種用於在宿主細胞中製造重組蛋白質之方法，該方法包含：(a)在允許存在於該宿主細胞中之如請求項7或8之重組表現載體表現該重組蛋白質之條件下培養該宿主細胞；及(b)回收該重組蛋白質。
一種用於控制表現重組蛋白質之宿主細胞培養液之黏度的方法，該方法包含：在允許表現該重組蛋白質之條件下培養該宿主細胞，其中該宿主細胞包含重組核酸序列，該重組核酸序列編碼(i)重組信號序列，該重組信號序列包含(a)序列MGRISSGG(SEQ ID NO：1)或其藉由1個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體，及(b)在(a)的C端之異源信號序列，以及(ii)該重組蛋白質。
一種用於控制藉由宿主細胞培養液表現重組蛋白質之基礎表現的方法，該方法包含：在誘導前條件下培養該宿主細胞，其中該宿主細胞包含重組核酸序列，該重組核酸序列編碼(i)重組信號序列，該重組信號序列包含(a)序列MGRISSGG(SEQ ID NO：1)或其藉由1個胺基酸取代、缺失或插入而在序列上不同的變異體，及(b)在(a)的C端之異源信號序列，以及(ii)該重組蛋白質。
如請求項9至11中任一項之方法，其中該重組蛋白質係自周質或胞外培養基回收。
如請求項9至11中任一項之方法，其中該信號序列可操作地連接於該重組蛋白質。
如請求項9至11中任一項之方法，其中該重組蛋白質之誘導前表現量為
0.5g/L；及/或該重組蛋白質之誘導後表現量為
5g/L。
如請求項9至11中任一項之方法，其中該信號序列係自該重組蛋白質裂解。
如請求項9至11中任一項之方法，其中該重組蛋白質為抗原結合蛋白質。
如請求項9至11中任一項之方法，其中該宿主細胞為具有周質之微生物細胞。