CN110551199A - 一种提高工程菌分泌表达重组人表皮生长因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高工程菌分泌表达重组人表皮生长因子的方法。所述方法包括下述步骤：(1)将甘油冻存的工程菌接种至包含卡那霉素的LB液体培养基中，培养，得到种子培养液；(2)将所述种子培养液接种至MBL培养基中，培养，然后加入IPTG、甘氨酸、Triton X‑100，诱导，得到发酵上清液；和(3)从所述发酵上清液中分离和纯化重组人表皮生长因子。其中，诱导时，加入终浓度为0.1mM至0.3mM的IPTG；终浓度为按质量计0.2％至1.5％的甘氨酸，终浓度为按质量计0.002％至0.2％的Triton X‑100。本发明提高了hEGF的分泌量，缩短了发酵时间，从而降低了成本。

Description

一种提高工程菌分泌表达重组人表皮生长因子的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及通过采用基因工程方法生产重组人表皮生长因子的方法。
背景技术
人表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸组成的小分子多肽，分子量约为6000道尔顿，等电点约为4.2-4.6。分子内有三对二硫键，对酸、碱、热等理化因素均较稳定。
hEGF具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在医学上已用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。hEGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。
20世纪80年代前，hEGF的来源主要是通过组织和体液提取，由于hEGF的含量极低，造成提取成本高且产品纯度低，使hEGF的应用受到了限制。80年代以后，随着基因工程技术的发展，人们通过基因重组技术，利用大肠杆菌、酵母菌等生产hEGF获得了成功，为工业化生产重组人表皮生长因子打下了基础。
目前大规模生产hEGF大多采用重组工程菌的方法，例如，中国专利CN1854294A公开了分泌表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌表达系统，其中将设计的phoAspL10基因与hEGF的串联基因，构建表达质粒pBL10EGF(该质粒含有入噬菌体的PL启动子)，进而以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞而构建了工程菌株BE-2，该菌株分泌表达rhEGF至384mg/L。又如中国专利CN102952817A公开了一种温度诱导生产重组人表达生长因子的方法，该发明将PL启动子、OmpA信号肽、hEGF基因串联构建分泌表达质粒，将质粒转化原核生产菌株，优化菌株培养条件，温度诱导生产hEGF产量达到452mg/L。
重组蛋白的分泌表达有利于后续纯化，但是分泌表达的缺点是有一部分蛋白在胞内无法分泌。因此，如何提高重组蛋白，尤其是hEGF的分泌，同时缩短培养时间，成为本领域急需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种提高工程菌分泌表达重组人表皮生长因子的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将甘油冻存的工程菌接种至包含卡那霉素的LB液体培养基中，培养，得到种子培养液；
(2)将所述种子培养液接种至MBL培养基中，培养，然后加入IPTG、甘氨酸和TritonX-100，诱导，得到发酵上清液；以及
(3)从所述发酵上清液中分离和纯化重组人表皮生长因子。
在一个方面中，在步骤(1)中，所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下，在180rpm至230rpm下震荡4小时至6小时，并且所述种子培养液的OD600为2至3。
在一个方面中，在步骤(2)中，所述种子培养液的接种量为3vol.％至5vol.％；所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下，在180rpm至230rpm下震荡3小时至5小时，加入终浓度为0.1mM至0.3mM的IPTG；终浓度为按质量计0.2％至1.5％的甘氨酸和终浓度为按质量计0.002％至0.2％的Triton X-100，然后诱导10小时至15小时。
接种量是指所加入的工程菌或种子培养液的体积和接种后培养液的体积的比例，以vol.％表示。
在一个方面中，加入IPTG、甘氨酸和Triton X-100时，MBL培养基的OD600为3至5。
在一个方面中，在步骤(2)中，所述种子培养液的接种量为3vol.％至5vol.％；所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下，在180rpm至230rpm下震荡3小时至5小时，当OD600为3至3.5时，加入终浓度为0.1mM至0.3mM的IPTG；接着，当OD600为4至4.5时，加入终浓度为按质量计0.2％至1.5％的甘氨酸；最后，当OD600为5至5.5时，加入终浓度为按质量计0.002％至0.2％的Triton X-100，然后诱导10小时至15小时。
在一个方面中，诱导10小时至15小时之后，OD600为50至70。
在一个方面中，MBL培养基成分为：葡萄糖，1g/L至20g/L、蛋白胨，20g/L、酵母粉，10g/L、KH2PO4，3.5g/L、K2HPO4，5g/L、(NH4)2HPO4，3.5g/L、NaCl，1g/L、MgSO4·7H2O，1g/L、泡敌，0.3ml/L、微量元素溶液，3ml/L、卡那霉素，50mg/L；其中
所述微量元素溶液的成分如下：
FeSO4·7H2O，0.167g/L、ZnSO4·7H2O，0.0193g/L、CoCl2·6H2O，0.12g/L、Na2MoO4·2H2O，0.012g/L、CaCl2·2H2O，0.006g/L、CuSO4·5H2O，1.9g/L、H3BO3，0.5g/L、HCl(37％，w:v)，37ml/L。
在一个方面中，所述工程菌为HE1。
在一个方面中，所述重组人表皮生长因子的氨基酸序列为NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR(SEQ ID No.1)。
在一个方面中，编码重组人表皮生长因子的核酸序列为aattccgactctgaatgcccgctgtctcacgacggttactgcctgcacgatggtgtttgcatgtatatcgaagctctggacaaatacgc gtgcaactgtgttgttggttacatcggtgaacgttgccagtaccgtgacctgaaatggtgggaactgcgt(SEQ ID No.2)。
本发明通过在诱导时添加IPTG、甘氨酸和Triton X-100，提高了hEGF的分泌量，缩短了发酵时间，从而降低了成本。
具体实施方式
根据本发明的实施方式，在培养工程菌的过程中，将甘氨酸和Triton X-100添加到培养基中，提高了细胞膜对于重组人表皮生长因子的通透性，促进其分泌到胞外。
对于本发明中使用的重组工程菌，将大肠杆菌外膜蛋白A引导序列MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID No.3)的基因编码序列融合到人EGF基因序列的5’端，送南京金斯瑞科技有限公司优化合成并在两端添加Nco I和Xho I酶切位点。将优化合成的基因片段双酶切装入pET28a表达载体中，然后，转化到BL21(DE3)菌株中，得到重组工程菌，命名为HE1。
在本发明中使用的材料，除非另外指出，否则都是本领域常见的，并且可在商业上购买得到的材料。
在一个实施方式中，LB液体培养基中使用的卡那霉素的含量为25ug/ml至50ug/ml。
在一个实施方式中，工程菌的接种量为0.1vol.％至0.4vol.％。
在本发明中，使用的IPTG的全称为异丙基硫代半乳糖苷。
在本发明中，使用的泡敌的全称为聚氧丙烯聚氧乙烯有规二醇，或三醇醚，是发酵中常用的消泡剂。具体而言，使用的泡敌由江苏斯德瑞克化工有限公司生产，货号为GPE。
在本发明中，Triton X-100，化学式为C14H22O(C2H4O)n是一种非离子型表面活性剂，带有一个亲水性的聚乙二醇链(n常为9或10)和一个亲脂性的烃基基团(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基基团)。
通过向MBL培养基中添加甘氨酸和Triton X-100，增加了工程菌的细胞膜通透性，因甘氨酸和Triton X-100能破坏大肠杆菌细胞壁的外层。利于工程菌中所产生的重组人表皮生长因子分泌至胞外。
在一个实施方式中，添加的甘氨酸的浓度为0.2％至1.5％，优选0.3％至1.2％，更优选0.5％至1.0％，最优选0.5％。
在一个实施方式中，添加的Triton X-100的浓度为0.002％至2.0％，优选0.002％至0.2％，更优选0.02％至0.2％，最优选0.2％。
在本发明中，从发酵上清液中分离和纯化重组人表皮生长因子的方法是本领域公知的。比如，可采用苯基琼脂糖凝胶6FF(高分辨率)、Q Sepharose High Performance阴离子交换、Superdex 30prep grade凝胶过滤三步法纯化；或采用将pH调节至重组人表皮生长因子的等电点4.6之后，加硫酸铵至35％饱和度，将所得沉淀离心回收并且溶解，然后用Sephadex G50 superfine纯化等。
在一个实施方式中，使用紫外分光光度计，在600nm处检测吸光度，测量种子培养液和MBL培养基的OD600值。
在一个实施方式中，通过使用本发明的方法，培养工程菌之后，发酵上清液中重组人表皮生长因子的浓度为1.7mg/L至8.79mg/L，优选8.37mg/L至8.79mg/L，最优选8.79mg/L。
采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检测重组人表皮生长因子的浓度。酶联免疫吸附测定的主要步骤如下：
1、包被
用包被液将人表皮生长因子抗体稀释至10ug/ml，每孔100ul，将ELISA平板在4℃下静置过夜。
2、洗涤
丢弃ELISA平板中的包被液，用PBST进行洗涤3至5次。
3、封闭
将体积100ul的封闭液添加至ELISA平板的每个孔，置于37℃下温育1小时。
4、洗涤
使用步骤2的方法洗涤ELISA平板，最后拍干等待加入样品。
5、加入样品
将样品用样品稀释液稀释，添加至相应的孔中，每孔100ul，37℃下温育1小时。
6、洗涤
与步骤4相同。
7、加相应的HRP-标记的抗体
加相应的商品化HRP-标记的抗体，一般也用样品稀释液稀释，稀释至0.2ug/ml。将稀释好的HRP-标记的抗体加入各孔，每孔100ul，37℃下温育1小时。
8、洗涤
与步骤4相同，洗涤6次。
9、显色
将A液和B液1:1混合，现配现用，各孔加混合的TMB底物液100μl，室温避光反应10分钟。
10、终止
每孔加终止液(2mol/L硫酸溶液)终止反应，立即在酶标仪上读数。
上述步骤中使用的材料如下：
1、包被液的配置(PH9.6的碳酸盐缓冲液)
无水Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
软水 100ml
完全溶解至4℃
2、封闭液
含有0.5％BSA的包被液
完全溶解至4℃
3、PBST的配方
NaCl 8.0g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.24g
吐温20 0.5ml
软水 1000ml
4、样品稀释液
含有0.5％BSA、0.01％吐温20的PBS，4℃保存
5、终止液 2mol/L硫酸溶液
6、显色液：
A液：Na2HPO4·12H2O 3.682g
柠檬酸 1.021g
过氧化脲 0.06g
用软水定容至100ml，4℃避光
B液：柠檬酸 1.05g
EDTA 0.0146g
TMB 0.02g
用软水定容至100ml，4℃避光。
下面结合具体的实施例进一步详细描述本发明。但是，应理解，这些实施例仅用于阐释本发明而不期望限制本发明的范围。
实施例1
取100ul甘油冻存的工程菌接种至50ml含50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中，35℃，220rpm培养5小时，测量OD600为2.3，得到种子培养液；
将种子培养液按4vol.％的接种量接种至含50ml MBL培养基的摇瓶中，在37℃，220rpm下培养4小时，当OD600为3时，加入终浓度为0.1mM的IPTG、终浓度为按质量计0.2％的甘氨酸、终浓度为按质量计0.002％的Triton X-100开始诱导，在25℃下诱导10小时，OD600为5.38，得到发酵上清液。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检测重组人表皮生长因子的浓度。上清液中重组人表皮生长因子的浓度为4.51mg/L，见下面表1。
摇瓶中MBL培养基成分为：葡萄糖，1g/L、蛋白胨，20g/L、酵母粉，10g/L、KH2PO4，3.5g/L、K2HPO4，5g/L、(NH4)2HPO4，3.5g/L、NaCl，1g/L、MgSO4·7H2O，1g/L、泡敌，0.3ml/L、微量元素溶液，3ml/L、卡那霉素，50mg/L；
其中，微量元素溶液的成分如下：
FeSO4·7H2O，0.167g/L、ZnSO4·7H2O，0.0193g/L、CoCl2·6H2O，0.12g/L、Na2MoO4·2H2O，0.012g/L、CaCl2·2H2O，0.006g/L、CuSO4·5H2O，1.9g/L、H3BO3，0.5g/L、HCl(37％，w:v)，37ml/L。
在4℃下，将发酵液以6000rpm离心30分钟，收集上清。上清液中缓慢加入硫酸铵至60％饱和度，用0.1mol/L HCl调节pH至6.0，4℃下静置4至16小时后，12000rpm离心10分钟，收集沉淀，沉淀用1/10体积的，pH7.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液溶解。将溶解的上清液加热至60℃保持30分钟，然后冰浴快速降温至4℃，离心去除沉淀，向样品中加入硫酸铵至0.5mol/L，上Phenyl NUPharose FF层析柱(杭州纽龙生物科技有限公司)，用pH7.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，用1mol/L盐酸将洗脱的液调节PH至4.0，上CM NUPharose FF层析柱(杭州纽龙生物科技有限公司)，用pH4.0的20mmol/L乙酸-乙酸钠和250mmol/L的氯化钠洗脱。然后，将洗脱液用pH7.2的20mmol/L Tris-HCl稀释5倍，上Q NUPharose FF层析柱(杭州纽龙生物科技有限公司)，用pH7.2的20mmol/L的Tris-HCl和120mmol/L的氯化钠洗脱。将洗脱液透析至pH7.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液，即为纯化的hEGF。
实施例2
根据上述实施例1相同的方式进行实施例2，只是加入的IPTG的终浓度为0.3mM。该实施例的结果，见下面表1。
实施例3
根据上述实施例1相同的方式进行实施例3，只是加入的IPTG的终浓度为0.2mM。该实施例的结果，见下面表1。
实施例4
根据上述实施例1相同的方式进行实施例4，只是加入的甘氨酸的终浓度按质量计为0.5％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例5
根据上述实施例1相同的方式进行实施例5，只是加入的甘氨酸的终浓度按质量计为1％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例6
根据上述实施例1相同的方式进行实施例6，只是加入的甘氨酸的终浓度按质量计为1.5％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例7
根据上述实施例1相同的方式进行实施例7，只是加入的Triton X-100的终浓度按质量计为0.02％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例8
根据上述实施例1相同的方式进行实施例8，只是加入的Triton X-100的终浓度按质量计为0.05％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例9
根据上述实施例1相同的方式进行实施例9，只是加入的Triton X-100的终浓度按质量计为0.2％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例10
根据上述实施例1相同的方式进行实施例10，只是开始诱导时OD600为3.5。该实施例的结果，见下面表1。
实施例11
根据上述实施例1相同的方式进行实施例11，只是开始诱导时OD600为5。该实施例的结果，见下面表1。
实施例12
根据上述实施例1相同的方式进行实施例12，只是诱导的时间为12小时。该实施例的结果，见下面表1。
实施例13
根据上述实施例1相同的方式进行实施例13，只是诱导的时间为15小时。该实施例的结果，见下面表1。
实施例14
根据上述实施例1相同的方式进行实施例14，只是接种量为3vol.％。该实施例的结果，见下面表1。
实施例15
根据上述实施例1相同的方式进行实施例15，只是接种量为5vol.％。该实施例的结果，见下面表1。
比较例1
根据上述实施例1相同的方式进行比较例1，只是加入的IPTG的终浓度为0.05mM。该比较例的结果，见下面表1。
比较例2
根据上述实施例1相同的方式进行比较例2，只是加入的IPTG的终浓度为0.4mM。该比较例的结果，见下面表1。
比较例3
根据上述实施例1相同的方式进行比较例3，只是加入的甘氨酸的终浓度按质量计为0.1％。该比较例的结果，见下面表1。
比较例4
根据上述实施例1相同的方式进行比较例4，只是加入的甘氨酸的终浓度按质量计为2％。该比较例的结果，见下面表1。
比较例5
根据上述实施例1相同的方式进行比较例5，只是加入的Triton X-100的终浓度按质量计为0.001％。该比较例的结果，见下面表1。
比较例6
根据上述实施例1相同的方式进行比较例6，只是加入的Triton X-100的终浓度按质量计为0.3％。该比较例的结果，见下面表1。
比较例7
根据上述实施例1相同的方式进行比较例7，只是开始诱导时OD600为1。该比较例的结果，见下面表1。
比较例8
根据上述实施例1相同的方式进行比较例8，只是开始诱导时OD600为6。该比较例的结果，见下面表1。
比较例9
根据上述实施例1相同的方式进行比较例9，只是诱导的时间为4小时。该比较例的结果，见下面表1。
比较例10
根据上述实施例1相同的方式进行比较例10，只是开始诱导的时间为17小时。该比较例的结果，见下面表1。
比较例11
根据上述实施例1相同的方式进行比较例11，只是接种量为1vol.％。该比较例的结果，见下面表1。
比较例12
根据上述实施例1相同的方式进行比较例14，只是接种量为7vol.％。该比较例的结果，见下面表1。
表1
由上面表1可见，在本申请的实施例1至15中，上清液中hEGF的浓度的范围为4.18mg/L至8.72mg/L。而在本申请的比较例1-12中，上清液中hEGF的浓度的范围为2.29mg/L至4.91mg/L。可见，本申请的实施例中hEGF的浓度明显高于对比例中hEGF的浓度。具体而言，对比例1至对比例12与实施例1相比，仅仅是将所加入的IPTG、甘氨酸和Triton X-100的浓度、开始诱导时OD600、诱导时间以及接种量中的一个因素改变为不在本发明的保护范围内，就使得其上清液中hEGF的浓度均不如实施例1中的高。至于对于比较例6中较高的hEGF的浓度4.91mg/L比实施例1中的高的特殊情况，经分析，在添加了高浓度的Triton X-100，即0.3％的Triton X-100之后，造成菌株死亡，从而释放出未切割信号肽的EGF，由此造成测量值较高。
上述实施例1至15以及比例较1至12都是同时添加IPTG、甘氨酸和Triton X-100的情况。为例测定在不同的时间点添加IPTG、甘氨酸和Triton X-100的效果，发明人进行了如下实验。
实施例16
根据上述实施例1相同的方式进行实施例16，只是当OD600为3时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，当OD600为4时，加入终浓度为按质量计0.2％的甘氨酸；最后，当OD600为5时，加入终浓度为按质量计0.002％的Triton X-100。该实施例的结果，见下面表2。
实施例17
根据上述实施例1相同的方式进行实施例17，只是当OD600为3.5时，加入终浓度为0.3mM的IPTG，当OD600为4.5时，加入终浓度为按质量计1.0％的甘氨酸；最后，当OD600为5.5时，加入终浓度为按质量计0.02％的Triton X-100。该实施例的结果，见下面表2。
实施例18
根据上述实施例9相同的方式进行实施例18，只是当OD600为3时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，当OD600为4时，加入终浓度为按质量计1.5％的甘氨酸；最后，当OD600为5时，加入终浓度为按质量计0.2％的Triton X-100。该实施例的结果，见下面表2。
表2
从表2中可见，当OD600为3至3.5时，加入终浓度为0.1mM至0.3mM的IPTG；接着，当OD600为4至4.5时，加入终浓度为按质量计0.2％至1.5％的甘氨酸；最后，当OD600为5至5.5时，加入终浓度为按质量计0.002％至0.2％的Triton X-100，实现了比同时添加IPTG、甘氨酸和Triton X-100的更好的技术效果，即，上清液中更高的hEGF浓度。
虽然具体描述了若干实施方式，但是本领域技术人员显然知道可以修改所公开的实施方式。因此，上述实施方式是非限制性的。请求保护的范围以所附的权利要求书为准。
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<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 2
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattccgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctgcacga tggtgtttgc 60
atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tgcaactgtg ttgttggtta catcggtgaa 120
cgttgccagt accgtgacct gaaatggtgg gaactgcgt 159
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20

Claims (6)

1.一种提高工程菌分泌表达重组人表皮生长因子的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)将甘油冻存的工程菌接种至包含卡那霉素的LB液体培养基中，培养，得到种子培养液；
(2)将所述种子培养液接种至MBL培养基中，培养，然后加入IPTG、甘氨酸和Triton X-100，诱导，得到发酵上清液；以及
(3)从所述发酵上清液中分离和纯化所述重组人表皮生长因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(1)中，所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下，在180rpm至230rpm下震荡，并且所述种子培养液的OD600为2至3。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2)中，所述种子培养液的接种量为3vol.％至5vol.％；所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下，在180rpm至230rpm下震荡，加入终浓度为0.1mM至0.3mM的IPTG；终浓度为按质量计0.2％至1.5％的甘氨酸和终浓度为按质量计0.002％至0.2％的Triton X-100，然后诱导10小时至15小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(2)中，所述种子培养液的接种量为3vol.％至5vol.％；所述培养的条件为在35℃至37℃的温度下，在180rpm至230rpm下震荡，当OD600为3至3.5时，加入终浓度为0.1mM至0.3mM的IPTG；当OD600为4至4.5时，加入终浓度为按质量计0.2％至1.5％的甘氨酸，和当OD600为5至5.5时，加入终浓度为按质量计0.002％至0.2％的Triton X-100，然后诱导10小时至15小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其中同时加入IPTG、甘氨酸和Triton X-100，并且加入IPTG、甘氨酸和Triton X-100时，所述MBL培养基的OD600为3至5。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述工程菌为通过下述得到的菌株：将编码大肠杆菌外膜蛋白A引导序列MKKTAIAIAVALAGFATVAQA的基因序列融合到人EGF基因序列的5’端，并在两端添加Nco I和Xho I酶切位点，接着，将合成的基因片段双酶切装入pET28a表达载体，最后，转化到BL21(DE3)菌株中，得到工程菌。
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