RU2729353C1

RU2729353C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF646, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН АСПАРТ, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН АСПАРТ

Info

Publication number: RU2729353C1
Application number: RU2019116106A
Authority: RU
Inventors: Виталий Феликсович Латыпов; Игорь Александрович Корнаков; Светлана Эдуардовна Робустова; Оксана Сергеевна Хомутова; Петр Петрович Родионов
Original assignee: Закрытое акционерное общество "ФАРМ-ХОЛДИНГ"
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2020-08-06

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению терапевтических белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного проинсулина аспарт человека. Рекомбинантный проинсулин получают в составе гибридного полипептида, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт человека, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А. Для этого используют рекомбинантную плазмидную ДНК pF646 и штамм-продуцент Escherichia coli BL21/pF646. Изобретение обеспечивает синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы, позволяет увеличить долю инсулина аспарт в гибридном белке до 49,5% и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг0-А-аспарт. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного инсулинового аналога инсулин аспарт и может быть использовано для приготовления лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Данное изобретение может быть использовано для получения рекомбинантного проинсулина аспарт, имеющего в своем составе цепь B, С- пептид и цепь А. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК, содержащая гибридный tac-промотор, терминатор рибосомного оперона Е. coli, искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из короткой лидерной последовательности фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, пептидного линкера GlyHis6GlySerArg, сайта протеолиза «Арг», цепи B, сайта протеолиза «Арг Арг», С-пептида, сайта протеолиза «Арг» и цепи А.

Также предложен штамм Escherichia coli - продуцента гибридного полипептида с последовательностью проинсулина аспарт. При этом, биосинтез гибридного полипептида индуцируется изопропилтиогалактопиранозидом, уровень его биосинтеза составляет не ниже 4% от массы влажного осадка клеточной биомассы.

Настоящее изобретение позволяет получать гибридный полипептид с высокой долей инсулина аспарт (49,5%) и повысить эффективность очистки целевого продукта за счет элиминации близкородственной примеси Арг₀-А-аспарт. Изобретение направлено на получение высокопродуктивного бактериального штамма - продуцента инсулинового аналога аспарт.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время сахарный диабет представляет собой серьезнейшую медицинскую и социально-экономическую проблему во всем мире. В связи с этим разработка и внедрение современных методов терапии сахарного диабета является одним из наиболее приоритетных направлений медицины и фармацевтической промышленности (1).

Эффективная заместительная инсулинотерапия как основной способ терапии инсулинозависимого сахарного диабета, имеет, в связи с этим, особое значение. Природные и рекомбинантные инсулины уже не способны в полной мере удовлетворить потребности клиницистов и пациентов. Несмотря на достоинства стандартных генно-инженерных препаратов инсулина, было установлено, что они далеки от идеального моделирования динамики и кинетики эндогенного инсулина в крови пациента, поскольку не могут полностью имитировать физиологическую пульсирующую секрецию эндогенного инсулина (2). Введенный экзогенный инсулин медленно абсорбируется из подкожного депо, поэтому его концентрация повышается медленно, а длительность действия препарата приводит к нефизиологично высокой концентрации инсулина в системном кровотоке на протяжении нескольких часов. В результате у пациентов наблюдается более выраженная, чем у здоровых, посталиментарная гипергликемия и склонность к гипогликемическим реакциям между приемами пищи и ночью.

Сегодня терапия требует применения более современных противодиабетических препаратов, таких как аналоги человеческого инсулина короткого и пролонгированного действия (3-6).

Аналоги инсулина человека ультракороткого действия отличаются быстрым началом (через 10-20 минут после введения) и короткой общей продолжительностью действия (3-5 часов). Благодаря этому их максимальный эффект совпадает с постпрандиальной гипергликемией. Различие в скорости начала действия инсулина и аналога инсулина ультракороткого действия обусловлено конформационными изменениями молекулы немодифицированного инсулина (7). Естественный инсулин как в β-клетках островка поджелудочной железы, так и в растворе инсулина присутствует в виде гексамеров. При парентеральном введении препаратов инсулина сначала происходит диссоциация гексамеров до димеров и мономеров, в виде которых инсулин и всасывается в межклеточную жидкость и кровь, достигая клеток-мишеней, где он оказывает биологическое действие.

В то же время быстродействующие аналоги инсулина человека имеют сниженную способность к образованию димеров и гексамеров. Вследствие этого большая часть молекул аналогов инсулина начинает всасываться в виде мономеров из подкожной клетчатки сразу после инъекции, создавая в течение короткого времени концентрации, достаточные для оказания биологического действия. Аналоги инсулина ультракороткого действия более удобны в использовании пациентами, поскольку их можно вводить непосредственно перед приемом пищи или сразу после еды.

Действие аналога инсулина аспарт в большей мере соответствует физиологическому раннему пику секреции инсулина. Следовательно, аспарт вызывает более выраженное снижение риска развития стойкой постпрандиальной гипергликемии (8).

Инсулин аспарт имеет эмпирическую формулу C₂₅₆H₃₈₁N₆₅O₇₉S₆ и молекулярный вес 5825,8. На основании показателей молярности инсулин аспарт является эквипотенциальным растворимому человеческому инсулину. В молекуле инсулина аспарт остаток пролина в положении В-28 В-цепи заменен остатком аспарагиновой кислоты (Фиг. 1). Эта замена снизила тенденцию мономерных молекул инсулина к агрегации из-за нарушения взаимодействия между остатками ProB28 и GlyB23 (8, 9). Вследствие такой модификации увеличилась скорость всасывания препарата с последующим сверхбыстрым гипогликемическим действием (10). Поскольку изменение первичной структуры не затрагивало область связывания гормона с соответствующим рецептором, то константы связывания с инсулиновым рецептором у инсулина аспарт и природного инсулина имеют сходные значения. При этом, в мире с каждым годом растет количество пациентов с диабетом 1 типа, которым необходим инсулин с такими свойствами как инсулин аспрат на постоянной основе.

Таким образом, разработка способов получения инсулинового аналога аспарт является актуальной медицинской задачей.

В настоящее время наиболее перспективной является технология получения инсулина и инсулиновых аналогов с использованием методологии экспрессии гена проинсулина человека в клетках Escherichia coli в составе гибридных белков в виде нерастворимых "телец включения" (11). Структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида), экспрессируемого в известных штаммах продуцентах инсулина человеческого, представляет собой лидерный пептид, сайт протеолиза «Арг» или «Лиз» или «Лиз Арг», цепь B, сайт протеолиза «Арг Арг», С-пептид, сайт протеолиза «Лиз Арг», цепь А (Фиг. 2).

Необходимость включать лидерные пептиды в состав гибридного полипептида связана с низкой стабильностью проинсулина в клетках Escherichia coli, время полужизни которого составляет 2 минуты (4). В качестве лидерных последовательностей, защищающих проинсулин от протеолитической деградации, используют глутатион-трансферазу (12), иммуноглобулин, связывающий (IgG) домен белка А из S.aureus X (13), интерлейкин-2 (14) и др.

Технологические схемы получения инсулина аспарт и инсулина человеческого идентичны и характеризуются следующими этапами: наращивание биомассы клеток штамма-продуцента, выделение телец включения, денатурация гибридного полипептида, ренатурация гибридного полипептида. Следующим этапом технологического процесса является ферментативный гидролиз с использованием смеси двух ферментов: трипсина и карбоксипептидазы B. Под действием трипсина осуществляется гидролиз пептидной связи преимущественно после аргинина, карбоксипептидаза B отщепляет положительно заряженные аминокислоты с C-конца (лизин и аргинин). В результате совместного гидролиза трипсином и карбоксипептидазой B образуется нативный инсулин или инсулиновый аналог инсулин аспарт.

К недостаткам использованных ранее генетических конструкций для экспрессии гибридного полипептида относятся:

Низкая доля конечного продукта - инсулина. Это связанно с тем, что лидерные пептиды представляют собой достаточно протяженные аминокислотные последовательности и составляют от 40 до 60% массы гибридного полипептида.

Образование близкородственной примеси Арг₀-А-инсулин в результате гидролиза трипсином пептидной связи после а.к. лизин между С-пептидом и А-цепью (фиг. 2).

Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому изобретению являются рекомбинантные плазмиды ДНК pPINS07 (15), pAS-2 (16) и pHINS11 (17), обеспечивающие синтез гибридных полипептидов, имеющих в своем составе IgG-связывающий домен стафилококкового белка А (pPINS07, pAS-2) и N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека (pHINS11).

Патент РФ №2144957 описывает штамм E.coli JM109/pPINS07, обеспечивающий синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 25-30%. Плазмида pPINS07 детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором единственный IgG-связывающий домен стафилококкового белка А соединен через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Преимущества предложенного конструкта заключаются в высоком уровне экспрессии гибридного полипептида и в его эффективной ренатурации (рефолдинге) и, как следствие, высоком выходе правильно свернутого полипептида.

Патент РФ №2337964 описывает штамм E.coli BL21/pAS-2 (16). Плазмида pAS-2 получена путем направленного мутагенеза плазмиды pPINS07 и детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором IgG-связывающий домен стафилококкового белка А соединен через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт.

Существенным недостатком рекомбинантных плазмидных ДНК pPINS07 и pAS-2 является то, что они кодируют полипептид с низкой долей инсулина и инсулина аспарта, соответственно, составляющего около 33%.

Патент РФ №2354702 описывает рекомбинантную плазмидную ДНК pHINS11 и штамм E.coli JM109/pHINS11. Данная плазмида детерминирует синтез гибридного полипептида, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека и обеспечивает его высокую экспрессию. Использование этих конструкций в технологическом процессе позволяет получать высокоочищенный инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не менее 27,5 МЕ/мг. Для данного штамма-продуцента характерен высокий уровень биосинтеза гибридного полипептида и более высокая доля инсулина в гибридном полипептиде (38%) по сравнения с рекомбинантной плазмидой pPINS07 (33%), однако стадия ренатурации продуцируемого гибридного полипептида недостаточно эффективна (17).

Общим недостатком гибридных полипептидов в описанных патентах является сайт протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью, допускающий образование близкородственной примеси Арг0-А-инсулин.

Задачей предлагаемого изобретения является конструирование плазмидной ДНК, обеспечивающей высокий уровень индуцируемой экспрессии гибридного полипептида с высокой долей инсулина аспарт и модифицированным сайтом протеолиза между С-пептидом и А-цепью с целью предотвращения возможности образования близкородственной примеси Арг0-А-аспарт при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.

Поставленная задача решается конструированием рекомбинантной плазмидной ДНК pF646 и штамма Escherichia coli BL21/pF646, обеспечивающего синтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы.

Описание фигур

На Фиг. 1 показана молекулярная структура инсулина аспарт.

На Фиг. 2 представлена структура одноцепочечного предшественника (гибридного полипептида) в штаммах продуцентах инсулина.

На Фиг. 3 показана структура последовательности ДНК, полученной методом химического синтеза.

На Фиг. 4 показано расположение праймеров на плазмиде pF173 для сайт-направленного мутагенеза сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью.

На Фиг. 5 представлена первичная структура EcoRI/HindIII-фрагмента плазмиды pF646, кодирующая гибридный полипептид. Подчеркнуты инициирующий и терминирующие кодоны, обозначены сайты узнавания рестриктаз.

На Фиг. 6 показана физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pF646. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции, pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды, Ptac - гибридный промотор транскрипции, rrnB - терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli, Лидерный пептид - MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), и пептидный линкер GlyHis6GlySerArg, Проаспарт - проинсулин аспарт, LacI - транскрипционный репрессор, регулирующий транскрипцию Tac-промотора.

Подробное описание изобретения

Согласно изобретению, предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pF646, кодирующая гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, с молекулярной массой 1,4 МДа (4345 п.о.), содержащая

- BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, в котором ген устойчивости к ампицилину замещен на ген устойчивости к канамицину;

- участок инициации репликации (ori);

- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды; XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

- EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyr GluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт;

- HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора,

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: XhoI - 54, EcoRI - 167, BamHI - 228, HindIII - 496, KasI - 1757, BglII - 1924, NdeI - 2528, AagI - 4215.

Также предложен штамм Escherichia coli BL21/pF646 - продуцента гибридного полипептида с последовательностью проинсулина аспарт, трансформированный рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.

Кроме того, предложен гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, полученный с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК согласно изобретению.

Общим недостатком гибридных полипептидов в патентах, описанных в предшествующем уровне техники, является сайт протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью, допускающий образование близкородственной примеси Арг0-А-аспарт.

Авторы настоящего изобретения установили, что при существенном сокращении размера гибридного полипептида за счет использования короткой лидерной последовательности, состоящей из 31 аминокислоты и изменении сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью на «Арг» можно достичь высоких выходов целевого полипептида.

В составе лидерного пептида имеется короткая последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, образующая выраженную пространственную структуру типа «альфа-спираль». Наличие N-концевого альфа-спирального участка в гибридном полипептиде положительно влияет на уровень ренатурации гибридного полипептида.

Исходной плазмидой для создания экспрессионного вектора pF646 послужила плазмида pF019, представляющая собой рекомбинантный вектор pBR322 (18), в которой методами молекулярного клонирования был полностью удален ген устойчивости к тетрациклину (пример 1).

На следующем этапе был синтезирован фрагмент ДНК размером 1,6 кб, содержащий следующие элементы и сайты рестрикции (Фиг. 3):

- Tac промотер и Lac оператор для контроля экспрессии гибридного полипептида (19), фланкированный сайтами рестрикции XhoI и EcoRI;

- Терминатор транскрипции rnnB оперона штамма K-12 ER3413 (REGION: 4143199..4143361), перед которым расположен сайт рестрикции HindIII;

- LacI ген штамма K-12 ER3413 (REGION: 365804 to 367006) с сайтом рестрикции BglII на 3’-конце. Введение LacI гена в экспрессионную конструкции решает задачу контроля экспрессии гибридного полипептида при использовании широкого круга штаммов-хозяев, включая BL21, характеризующийся повышенной стабильностью рекомбинантных белков за счет удаления клеточных протеаз lon и ompT.

Синтезированный фрагмент ДНК и плазмиду pF019 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции XhoI и BglII в течение 3-х часов при 37°С. Соответствующие ДНК-фрагменты выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coli выделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.

Таким образом, был получен экспрессионный вектор pF20 на основе плазмидной ДНК pBR322, содержащий Тас промотер, rnnB терминатор и LacI ген, кодирующий транскрипционный репрессор Тас промотера, а также сайты рестрикции EcoRI и HindIII для последующей вставки гена, кодирующего гибридный полипептид.

ДНК последовательность гибридного полипептида, содержащую в качестве лидерного пептида IgG-связывающий домен белка А из Staphylococcus aureus, пептидный линкер His6GlySerArg и проинсулина аспарта, вырезали из плазмидной ДНК pPIN07 (15) с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI /HindIII и вставляли по соответствующим сайтам рестрикции в экспрессионный вектор pF20 описанным выше способом, при этом в результирующем векторе появился сайт рестрикции BamHI, образованный кодирующей последовательностью двух аминокислот пептидного линкера GlySer (GGATCC). В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF100.

На следующим этапе получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF173 после замены ДНК последовательности IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus ДНК последовательностью, кодирующей более короткий лидерный пептид MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp, представляющий собой фрагмент человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы (TKS), регулируемой фактором роста гепатоцитов (пример 2).

Аминокислотная последовательность LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp локализована в альфа-спиральном участке белка TKS (№ 3D структуры в базе данных PDB: 3F1I). Наличие альфа-спирального участка в способствует эффективной ренатурации гибридного полипептида.

Методом сайт-направленного мутагенеза в рекомбинантной плазмидной ДНК pF173 удаляли кодон «aag» в положении 373-375, соответствующий аминокислоте лизин сайта протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью проинсулина. В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF265, экспрессирующую проинсулин человека в составе гибридного полипептида (пример 3).

На следующем этапе кодон «ccg», кодирующий аминокислоту пролина в положении 28 B-цепи заменяли методом сайт-направленного мутагенеза плазмиды pF265 на кодон «gac», кодирующий аспарагиновую кислоту. Описанным способом получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF475 с геном ампициллиновой устойчивости, экспрессирующую проинсулин аспарт (пример 4).

На последнем этапе ген устойчивости к ампициллину заменяли методом Fusion-PCR геном устойчивости к канамицину, амплифицированному с матрицы pET24a (Novagen, 69749-3) с использованием праймеров Pr408 (gatgcttttctgtgactggtg) и Pr122 (ctgtcagaccaagtttactcatatatac) (пример 5).

В результате описанных молекулярно-генетических манипуляций получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF646, кодирующую гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт, которая характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 1,4 МДа (4345 п.о.);

состоит из следующих структурных элементов (Фиг. 6):

BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, в котором ген устойчивости к ампициллину замещен на ген устойчивости к канамицину;

участок инициации репликации (ori);

ROP ген, регулирующий копийность плазмиды;

XhoI/EcoRI фрагмент, представляющий собой гибридный Tac-промотор транскрипции;

EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором последовательность короткого лидерного пептида MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт;

HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB, а также транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора;

содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: XhoI - 54, EcoRI - 167, BamHI - 228, HindIII - 496, KasI - 1757, BglII - 1924, NdeI - 2528, AagI - 4215.

Преимуществами предложенной плазмидной конструкции являются высокая доля инсулина аспарт в гибридном полипептиде (49,5%), наличие в составе лидерного пептида последовательности, образующей пространственную структуру типа «альфа-спирали» для улучшения эффективности ренатурации гибридного полипептида, модификация сайта протеолиза между С-пептидом и А-цепью, исключающая образование близкородственной примеси Арг0-А-аспарт при ферментативном гидролизе гибридного полипептида.

Для получения штамма-продуцента гибридного полипептида с проинсулином аспарт электрокомпетентные клетки штамма реципиента Escherichia coli BL21 трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК pF646 методом электропорации согласно описанной методике (20) и высевали на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина.

Полученный штамм-продуцент Escherichia coli BL21/pF646 характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки: Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, размером 1×3,5 мкм, подвижные, с хорошо различимыми тельцами включения после индукции синтеза гибридного полипептида.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые; край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением.

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, при оптимальном рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к канамицину (до 100 мг/мл).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование промежуточной генетической конструкции pF019.

ПЦР-продукт размером 2.8 кб, полученный в результате амплификации плазмиды pBR322 с праймерами Pr033 (5' - ccaacgtaacagatct (BglII) aacagctcgaactcgag ( XhoI) ttgaagacgaaagggcctcg - 3') и Pr039 (5'- ccaaccgtaacagatct (BglII) ctgtggaacacctacatctg- 3’), вырезали из геля, очищали с использованием набора Qiagen. После инкубации с эндонуклеазой рестрикции BglII в течение 3-х часов при 37°С очищенный ДНК-фрагмент лигировали с помощью T4 ДНК лигазы и использовали для трансформации XL1-Blue штамма E.coli (Agilent Technology, 200249) методом электропорации (20). Корректность плазмидной ДНК, выделенной из колоний, выросших на среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) подтверждали секвенированием. Описанным выше способом получали плазмиду pF019, представляющую собой фрагмент плазмиды pBR322 с полной делецией гена устойчивости к тетрациклину.

Пример 2. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF173.

Для введения в состав проинсулина короткого лидерного пептида синтезировали праймеры pr096 (tcaacgtaacgaattct atg ctg tat tat gaa ggc ctg cag gac ggc agc agc cac cac catcatcatcatggatcccg) и pr130 (tgcctggcggcagtagcgcg). Праймер pr096 имел в своем составе сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI; область, кодирующую аминокислотную последовательность лидерного пептида; последовательность, соответствующую пептидному линкеру His6GlySerArg конструкции pF100. В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

10 мкл 10-кратного буфера для Pfu ДНК-полимеразы,

0,1 нг плазмидной ДНК pF100,

1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

2 ед. Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 Thermal Cycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96°С (5 мин), 30 циклов - 96°С (15 сек), 55°С (15 сек), 72°С (30 сек).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру 600 п.о., вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE (Трис-борат-ЭДТА) c использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.

Вырезанный из геля ПЦР-продукт и плазмиду pF100 инкубировали с эндонуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII в течение 3-х часов при 37°С. Соответствующие ДНК-фрагменты (330 п.о. и 4,2 кб) выделяли из агарозного геля с использованием набора Quiagen и лигировали с помощью T4 ДНК лигазы. После электропорации XL1-Blue штамма E.coli выделенные из выросших колоний плазмидные ДНК анализировали с помощью методов ПЦР и секвенирования.

Пример 3. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 с помощью сайт-направленный мутагенеза плазмиды pF173.

Для модификации сайта протеолиза «Лиз Арг» между С-пептидом и А-цепью проинсулина синтезировали олигонуклеотиды Pr237 (cgtggtatcgttgaacagtg) и Pr238 (ctgcagagaaccttccagag), содержащие фосфатную группу с 5'- конца (Фиг. 3).

В состав реакционной смеси (100 мкл) для полимеразной цепной реакции (ПЦР) входили следующие компоненты:

0,1 нг плазмидной ДНК pF173,

1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

2 ед. Taq ДНК полимеразы.

ПЦР проводили с помощью ДНК амплификатора T100 Thermal Cycler, Bio-Rad в следующих условиях: 96°С (5 мин), 30 циклов - 96°С (15 сек), 55°С (15 сек), 72°С (3 мин).

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру плазмиде pF173 (4,5 кБ), вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE c использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.

Для получения плазмидной ДНК pF265 концы выделенного из геля ПЦР-продукта лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (10 мкл) использовали для трансформации штамма BL21 методом электропорации (20). После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с ампициллином, из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF265, экспрессирующую проинсулин в составе гибридного полипептида.

Пример 4. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pF475.

Плазмиду pF475 получали методом сайт-направленного мутагенеза рекомбинантной плазмидной ДНК pF265. Для этого синтезировали олигонуклеотиды (праймеры) Pr352 (cttctacaccgacaagacccg) и Pr353 (aaaccacgttcaccgcaaacc), содержащие фосфатную группу с 5'- конца. Праймер Pr352 содержал последовательность «gac», кодирующую аспарагиновую кислоту. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с применением праймеров Pr352 и Pr353 приводила к замене пролина B-цепи в положении 28 на аспарагиновую кислоту.

В состав реакционной смеси (100 мкл) для ПЦР входили следующие компоненты:

0,1 нг плазмидной ДНК pF265,

1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

2 ед. Taq ДНК полимеразы.

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-продукт, соответствующий по размеру рекомбинантной плазмидной ДНК pF265 (4,5 кБ), вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit. Электрофорез проводили в стандартном буфере TBE c использованием 1%-й агарозы. ДНК визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Fusion-SL2-400.

Для получения плазмидной ДНК концы выделенного из геля ПЦР-продукта лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (10 мкл) использовали для трансформации штамма BL21 методом электропорации.

После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с ампицилином, из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF475 с геном устойчивости к ампициллину, экспрессирующую проинсулин аспарт в составе гибридного полипептида.

Пример 5. Получение конечной генетической конструкции pF646 с геном канамициновой устойчивости, экспрессирующей гибридный полипептид проинсулина аспарт.

Рекомбинантную плазмидную ДНК pF646 получали методом Fusion-PCR. Для этого синтезировали олигонуклеотиды Pr121 (cctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagccatattcaacgggaaacg), Pr120 (ttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactg), Pr408 (gatgcttttctgtgactggtg), Pr122 (ctgtcagaccaagtttactcatatatac), при этом праймеры Pr120 и Pr121 содержали фосфатную группу с 5'- конца.

На первом этапе получали ПЦР- фрагменты 1 и 2.

С помощью матрицы pF266 и праймеров Pr408/Pr122 амплифицировали ПЦР фрагмент, размером 3958 п.о. (Фиг. 5).

Ген устойчивости к канамицину (ПЦР- фрагмент 2, 816 п.о.) амплифицировали помощью матрицы pET24a (Novagen, 69749-3) и праймеров Pr408/Pr122.

В состав реакционных смесей (100 мкл) для ПЦР входили следующие компоненты:

0,1 нг плазмидной ДНК,

1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ),

2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

2 ед. Taq ДНК полимеразы.

Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле с использованием интеркалирующего красителя GelRed, Biotium. ПЦР-фрагменты 1 и 2 вырезали из геля и очищали с помощью набора Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit.

ПЦР фрагменты 1 и 2 объединяли на этапе Fusion- PCR в следующих условиях:

0,1 нг ПЦР фрагмента 1,

0,6 нг ПЦР фрагмента 2

1 мкл смеси 10 мМ dNTP,

0,5 мкл праймера Pr120 (10 мкМ),

0,5 мкл праймера Pr122 (10 мкМ),

2 ед. Pfu ДНК-полимеразы,

2 ед. Taq ДНК полимеразы.

Для получения рекомбинантной плазмидной ДНК pF646 концы выделенного из геля ПЦР-продукта, размером 4345 п.о., лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы (NEB). Лигирующую смесь (10 мкл) использовали для трансформации штамма BL21 методом электропорации (20).

После трансформации отбирали колонии, выращенные на среде с канамицином (50 мг/л), из них выделяли плазмиды и анализировали с помощью секвенирования последовательности гибридного полипептида. В результате получали рекомбинантную плазмидную ДНК pF646 с геном устойчивости к канамицину, экспрессирующую проинсулин аспарт в составе гибридного полипептида.

Пример 6. Определение продуктивности штамма-продуцента гибридного полипептида.

Индивидуальную колонию клеток штамма E. coli BL21, содержащую рекомбинантную плазмидную ДНК pF646, инокулировали 2 мл LB среды, содержащей канамицин в концентрации 50 мкг/мл, растили в термошейкере при 37ºС в течение 22 часов при перемешивании (170 об./мин). После измерения оптической плотности OD₆₀₀ночной культуры засевали 40 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина (ODстартовая₆₀₀ = 0,1) и растили 1-2 часа при 37°С на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) до достижения оптической плотности OD₆₀₀= (0,8 ± 0,2). 20 мл культуры переносили в другую колбу (контроль без индукции), к оставшимся 20 мл добавляли 10 мкл 1М ИПТГ (изопропил-бета-галактопиранозид) (конечная концентрация ИПТГ - 0,5 мМ). После 4 часов инкубирования на шэйкере-инкубаторе при перемешивании (180 об/мин) клеточные культуры центрифугируют (15 мин, 3000 об/мин), определяли массу влажного осадка клеток, замораживают. Содержание гибридного полипептида в % от массы влажного осадка измеряли методом капиллярного электрофореза. Уровень экспрессии составил не ниже 4% от сырого веса клеточной биомассы.

Источники информации:

1. King H, Aubert RE, Herman WH. Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates, and projections. Diabetes care. 1998 Sep;21(9):1414-31. PubMed PMID: 9727886.

2. Hermansen K, Fontaine P, Kukolja KK, Peterkova V, Leth G, Gall MA. Insulin analogues (insulin detemir and insulin aspart) versus traditional human insulins (NPH insulin and regular human insulin) in basal-bolus therapy for patients with type 1 diabetes. Diabetologia. 2004 Apr;47(4):622-9. PubMed PMID: 15298338. Epub 2004/08/10.

3. Bolli GB, Owens DR. Insulin glargine. Lancet. 2000 Aug 5;356(9228):443-5. PubMed PMID: 10981882.

4. Meece JD, Campbell RK. Insulin lispro update. The Diabetes educator. 2002 Mar-Apr;28(2):269-77. PubMed PMID: 11924304.

5. Dunn CJ, Plosker GL. Insulin lispro: a pharmacoeconomic review of its use in diabetes mellitus. PharmacoEconomics. 2002;20(14):989-1025. PubMed PMID: 12403639.

6. Home PD, Ashwell SG. An overview of insulin glargine. Diabetes/metabolism research and reviews. 2002 Sep-Oct;18 Suppl 3:S57-63. PubMed PMID: 12324987.

7. Brange J, Owens DR, Kang S, Volund A. Monomeric insulins and their experimental and clinical implications. Diabetes care. 1990 Sep;13(9):923-54. PubMed PMID: 2226110. Epub 1990/09/01.

8. Owens D, Vora J. Insulin aspart: a review. Expert opinion on drug metabolism & toxicology. 2006 Oct;2(5):793-804. PubMed PMID: 17014395. Epub 2006/10/04.

9. Setter SM, Corbett CF, Campbell RK, White JR. Insulin aspart: a new rapid-acting insulin analog. The Annals of pharmacotherapy. 2000 Dec;34(12):1423-31. PubMed PMID: 11144701. Epub 2001/01/06.

10. Home PD, Barriocanal L, Lindholm A. Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of the novel rapid-acting insulin analogue, insulin aspart, in healthy volunteers. European journal of clinical pharmacology. 1999 May;55(3):199-203. PubMed PMID: 10379635. Epub 1999/06/24.

11. Баирамашвили ДИ. Генноинженерный инсулин человека: успехи и перспективы. Рос хим ж (Ж Рос об-ва им ДИ Менделеева). 2005;XLIX(1):34-45.

12. Berg H, Walter M, Mauch L, Seissler J, Northemann W. Recombinant human preproinsulin. Expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus. Journal of immunological methods. 1993 Sep 15;164(2):221-31. PubMed PMID: 8370928.

13. Jonasson P, Nilsson J, Samuelsson E, Moks T, Stahl S, Uhlen M. Single-step trypsin cleavage of a fusion protein to obtain human insulin and its C peptide. European journal of biochemistry / FEBS. 1996 Mar 1;236(2):656-61. PubMed PMID: 8612642.

14. Castellanos-Serra LR, Hardy E, Ubieta R, Vispo NS, Fernandez C, Besada V, et al. Expression and folding of an interleukin-2-proinsulin fusion protein and its conversion into insulin by a single step enzymatic removal of the C-peptide and the N-terminal fused sequence. FEBS letters. 1996 Jan 8;378(2):171-6. PubMed PMID: 8549827.

15. Коробко ВГ, Болдырева ЕФ, Шингарова ЛН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин человека, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека: Патент РФ №2144957; 1999.

16. Патрушев ЛИ, Мелихова ТД, Баирамашвили ДИ, Мирошников АИ, Зинченко АА, Патрушева НЛ, et al., Рекомбинантная плазмидная ДНК pAS-2, кодирующая полипептид проинсулина aspart человека, и штамм бактерий escherichia coli bas2 - продуцент рекомбинантного проинсулина aspart2006.

17. Шматченко ВВ, Шматченко НА, Байдусь АН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHINS11, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека, клетка Escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной ДНК pPHINS11, штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHINS11 - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека и способ получения инсулина человека2006. Available from: http://bd.patent.su/2263000-2263999/pat/servl/servletc85e.html.

18. Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW, et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene. 1977;2(2):95-113. PubMed PMID: 344137. Epub 1977/01/01.

19. de Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983 Jan;80(1):21-5. PubMed PMID: 6337371.

20. Lessard JC. Transformation of E. coli via electroporation. Methods in enzymology. 2013;529:321-7. PubMed PMID: 24011058. Epub 2013/09/10.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ZakrytoeAktsionernoeObshchestvo "FARM-Kholding"

<120> Recombinant Plasmid DNA pF646 encoding Hybrid polypeptide comprising proinsulinaspart, and proinsulinaspart- comprising hybrid polypeptide producer bacterial strain Escherichia coli

<140> RU 2019116106

<141> 2019-05-23

<160> 1

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 1

GlyHisHisHisHisHisHisGlySerArg

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 2

HisHisHisHisHisHisGlySerArg

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 3

HisProGlySerHisHisHisHisGlySerArg

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 4

MetLeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 5

LeuTyrTyrGluGlyLeuGlnAsp

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 6

gatgcttttctgtgactggtg

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 7

ctgtcagaccaagtttactcatatatac

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 8

ccaacgtaacagatct 16

aacagctcgaactcgag 17

ttgaagacgaaagggcctcg 20

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 9

ccaaccgtaacagatct 17

ctgtggaacacctacatctg 20

<210> 10

<211> 79

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 10

tcaacgtaacgaattct 17

atgctgtattatgaaggcctgcaggacggcagcagccaccac 42

catcatcatcatggatcccg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 11

tgcctggcggcagtagcgcg

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 12

cgtggtatcgttgaacagtg

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 13

ctgcagagaaccttccagag

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 14

cttctacaccgacaagacccg

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 15

aaaccacgttcaccgcaaacc

<210> 16

<211> 62

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 16

cctgataaatgcttcaataatattgaaaaa 30

ggaagagtatgagccatattcaacgggaaacg 32

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 17

ttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactg

<210> 18

<211> 720

<212> DNA

<213> E. coli

<400> 18

Tttgtttaactttaagaaggagagaattctatgctgtattatgaa 45

Aaacaaattgaaattcttcctctcttaagatacgacataatactt 45

Ggcctgcaggacggcagcagccaccaccatcatcatcatggatcc 45

Ccggacgtcctgccgtcgtcggtggtggtagtagtagtacctagg 45

Cgttttgttaaccaacacctgtgcggttctcacctggttgaagct 45

Gcaaaacaattggttgtggacacgccaagagtggaccaacttcga 45

Ctgtacctggtttgcggtgaacgtggtttcttctacaccgacaag 45

Gacatggaccaaacgccacttgcaccaaagaagatgtggctgttc 45

Acccgtcgtgaagctgaagacctgcaggttggtcaggttgaactg 45

Tgggcagcacttcgacttctggacgtccaaccagtccaacttgac 45

Ggtggtggtccgggtgctggtagcctgcaaccgctggctctggaa 45

Ccaccaccaggcccacgaccatcggacgttggcgaccgagacctt 45

Ggttctctgcagcgtggtatcgttgaacagtgctgcacctctatc 45

Ccaagagacgtcgcaccatagcaacttgtcacgacgtggagatag 45

Tgctctctgtaccagctggaaaactactgcggttagtaagcttag 45

Acgagagacatggtcgaccttttgatgacgссаatcattcgaatc 45

<210> 19

<211> 106

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 19

MetLeuTyrTyrGlu 5

GlyLeuGlnAspGlySerSerHisHisHisHisHisHisGlySer 15

ArgPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAla 15

LeuTyrLeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrAspLys 15

ThrArgArgGluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeu 15

GlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGlu 15

GlySerLeuGlnArgGlyIleValGluGlnCysCysThrSerIle 15

CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysGly 11

<---

Claims

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pF646 для экспрессии в Escherichia coli проинсулина аспарт человека в составе гибридного полипептида,

имеющая карту плазмиды, как показано на Фиг. 6, с молекулярной массой 1,4 МДа (4345 п.о.),

кодирующая гибридный полипептид, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин киназы, соединена через пептидный линкер GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19,

при этом плазмидная ДНК pF646 содержит:

BglII/XhoI фрагмент плазмиды pBR322, в котором ген устойчивости к ампицилину замещен на ген устойчивости к канамицину;

участок инициации репликации (ori);

ROP ген, регулирующий копийность плазмиды;

EcoRI/HindIII фрагмент, содержащий искусственный ген, в котором нуклеотидная последовательность соответствует SEQ ID NO: 18;

HindIII/BglII фрагмент, содержащий терминатор оперона рибосомальных РНК rrnB,

транскрипционный репрессор LacI, регулирующий транскрипцию Tac-промотора,

уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: XhoI – 54, EcoRI - 167, BamHI – 228, HindIII – 496, KasI – 1757, BglII – 1924, NdeI – 2528, AagI – 4215.

2. Штамм Escherichia coli BL21/pF646 - продуцент гибридного полипептида с последовательностью проинсулина аспарт, при этом штамм получен путем трансформации клеток штамма E.coli рекомбинантной плазмидной ДНК pF646 по п. 1.

3. Гибридный полипептид проинсулина аспарт человека, в котором последовательность фрагмента человеческого белка HGS, субстрата тирозин-киназы, соединена через пептидный линкер с последовательностью GlyHis6GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина аспарт, с аргинином в качестве сайта протеолиза между С-пептидом и цепью А, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.