CN115716876A - 一种融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种融合蛋白，基于该融合蛋白的编码多核苷酸、表达载体、工程菌和应用。本发明的融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和胰岛素前体依次连接而成，促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。基于本发明的融合蛋白构建的重组工程菌可以显著提高融合蛋白在大肠杆菌中表达量，从而实现长效酰化胰岛素衍生物的产业化生产应用，商业应用前景广阔。同时，基于本发明的充足工程菌，提出一种制备长效酰化胰岛素衍生物的方法，制备得到的长效酰化胰岛素衍生物具备一周使用一次的潜力，且降糖效果显著。

Description

一种融合蛋白及其应用

本申请要求2022年7月4日提交的申请号为202210788609.4的专利申请的全部优先权。该申请的全部内容全部以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种融合蛋白，基于该融合蛋白的多核苷酸、表达载体、工程菌及应用。

背景技术

随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。

糖尿病是由遗传和环境因素长期相互作用导致的复杂的慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺乏导致，以高血糖为特征的疾病，分为I型糖尿病和II型糖尿病，其中II型糖尿病(T2DM)在我国糖尿病患者中占到了95％以上的比例。

而治疗糖尿病最主要的药物就是胰岛素及其衍生物、胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)受体激动剂(GLP-1RAs)及其相关多靶点共激动剂。上述药物均为蛋白或多肽类药物。

目前已公开了一系列在天然人胰岛素序列的不同位点上有氨基酸取代的胰岛素类似物的专利申请。EP0425482B1公开了一种在B25位上有His或Tyr取代的胰岛素类似物。EP0419504B1公开了一种在B3有取代，同时在A5或A15有Gln取代，或在A18或A21有Asn取代的胰岛素类似物。US5008241A公开了一种在A21有特定氨基酸取代，同时在A4、A17、B13或B21有特定氨基酸取代的胰岛素类似物。US5164366A公开了在B24、B25、B26或B27位其中有一位缺失的胰岛素类似物。CN1195777C公开了在A8、A9、A10、B30上有取代的胰岛素类似物。US7193035B2公开了在B3和至少在B27、B28或B29中的一位有取代的胰岛素类似物晶型。CN1780854公开了一种A0(Arg)A21(Gly)B31(Arg)B32(Arg)胰岛素类似物。

通常，胰岛素制剂是通过皮下注射给药的。然而，长期的注射会给患者带来很大痛苦，因此，人们希望可以通过延长胰岛素的降糖效果，以减少注射的次数，减少患者的痛苦。

Icodec胰岛素是一种在研的长效基础胰岛素类似物，其分子设计为去除胰岛素的B30，同时引入若干个氨基酸突变：A14E、B16H、B25H。并在B29K连接一个C₂₀的脂肪酸链。相对于地特胰岛素和德谷胰岛素，Icodec具备更长半衰期。A14E、B16H、B25H突变目的在于减少酶切降解，同时减弱与肤岛素受体(IR)的亲和力，减少IR介导的清除，进一步延长半衰期。在注射进人体后，Icodec胰岛素会与白蛋白紧密但可逆的结合在一起。这一结果可在一周时间内连续、缓慢且稳定地降低血糖。基于其浓缩配方，每周注射一次的Icodec胰岛素用量与每日注射一次的甘精胰岛素U100相当，从而可以实现一周一次给药。

目前采用基因工程表达人胰岛素及其类似物早已成为工业主流手段。基因工程中表达胰岛素的微生物主要分为2类，分别是大肠杆菌及酵母菌。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌(Escherichiacoli)来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。但是，对于部分具备特殊结构或氨基酸序列组成的多肽，如胰岛素前体，其往往难以表达或表达量低，无法满足商业化使用需求。为此，有时需要一些其他方案，进一步增加其表达量，例如通过增加一段促表达肽，促表达肽连接于引导肽之后，能够显著增强融合蛋白表达量，并通过酶切等处理后得到目的蛋白片段。对于能够进一步增强上述蛋白或多肽高表达的促表达肽及使用促表达肽构建的具备高表达潜力的表达载体及其重组工程菌研究较少。

本发明申请人构建了一系列长效且降糖效果优于Icodec的胰岛素衍生物。由于结构特殊性(存在较多GQAP重复序列)，上述胰岛素衍生物的多肽发酵表达和生产存在诸多困难。为了克服表达量低，生产成本高的问题，申请人开展了大量对表达体系的研究工作，得到一种适用于所述胰岛素衍生物的多肽前体表达的融合蛋白及表达体系。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种长效酰化胰岛素衍生物的融合蛋白，其多核苷酸、表达载体和工程菌。

如本文所用，术语“引导肽”是指连接于目标多肽或蛋白，引导蛋白可溶表达、分泌，或帮助目标多肽或蛋白正确折叠实现可溶表达的多肽序列，也称为“前导肽”、“先导肽”、“分泌肽”。

如本文所用，术语“促表达肽”是指连接在引导肽后或目的蛋白或多肽前，进一步增强目的蛋白或多肽表达量，或能够促进难以通过常规引导肽表达的目的蛋白或多肽的表达的多肽序列。

术语“肽”是指包括通过肽键连接的氨基酸序列的分子，无论长度、翻译后修饰或功能。

如本文所用，术语“胰岛素”是指为51个氨基酸残基多肽(5808道尔顿)的激素，其在许多关键细胞过程中起重要作用。人胰岛素的成熟形式由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808Da的A链(GlyAl-AsnA21)和B链(PheB1-ThrB30)。该分子通过两个链间(A20-B19，A7-B7)和一个链内二硫键(A6-A11)稳定。本发明的胰岛素包括天然的、通过合成提供的或基因工程化的(例如重组的)来源，在本发明的各种实施方式中，胰岛素可以是人胰岛素。

如本文所用，术语“胰岛素类似物”是指胰岛素的改变形式，其是胰岛素的更快速作用形式或更均匀作用形式。这样的类似物的非限制性实例是赖脯胰岛素、德谷胰岛素(Insulin Degludec)、门冬胰岛素(Insulin Aspart)和甘精胰岛素。“赖脯”胰岛素类似物在初级结构上与人胰岛素相同，通过交换B28位置处的赖氨酸和B29位置处的脯氨酸而不同于人胰岛素。它是一种短效胰岛素单体类似物。“甘精”胰岛素类似物通过在A21处用天冬酰胺替换甘氨酸，以及在B链的C末端添加两个精氨酸残基而不同于人胰岛素。在pH4.0下配制和注射甘精胰岛素溶液。这些修饰将等电点提高至更中性的pH，降低了生理条件下的溶解度，并且导致甘精胰岛素在注射位置沉淀，从而减慢了吸收。甘精胰岛素是一种持续20～24小时的长效类似物。

如本文所用，术语“胰岛素前体”是指天然胰岛素或胰岛素类似物的胰岛素A链和B链连接而成的单链分子，其具体为通过C肽连接胰岛素B链和胰岛素A链而成。

如本文所用，术语“多核酸片段”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷酸链。本发明的核酸片段可以是脱氧核糖核酸片段(DNA)或核糖核酸片段(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。可以根据本文提供的方法使用的编码胰岛素的核酸片段可以是编码胰岛素多肽或其前体(包括胰岛素原和前胰岛素原)的任何核酸片段。

如本文所用，术语“编码序列”是指一种多核苷酸序列，当其置于适当的控制序列的控制下时被转录成mRNA，mRNA被翻译成多肽。编码序列的边界通常由位于mRNA的5'端的开放阅读框的开始的起始密码子和位于mRNA的开放阅读框的3'端的终止密码子确定。

为了制备得到长效酰化胰岛素衍生物，需要先制备得到衍生物的胰岛素肽链。而蛋白或多肽的制备方法包括化学合成法和生物表达发酵法。本发明采用构建重组基因工程菌进行生物表达发酵的方法。为此，本发明首先构建一种包含长效酰化胰岛素衍生物的胰岛素肽链前体(胰岛素前体)的融合蛋白，并基于该融合蛋白进一步构建表达该融合蛋白的重组工程菌。

本发明涉及的融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和胰岛素前体依次连接而成，其中，促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明提出的如SEQ IDNO.6所示的多肽作为促表达肽，可以高效表达一些难以表达的目的蛋白或多肽，或显著增强表达量低的目的蛋白或多肽的表达，经试验发现，其尤其适用于该特定胰岛素衍生物的表达，可以显著提高其表达量。

具体的，在本发明的融合蛋白中，酶切位点的氨基酸序列可以选自K或DDDDK。引导肽也可以是本领域常规的引导肽序列，并优选为FKFEFKFE或FEFKFEFK。

作为本发明的一个改进的技术方案，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列选自SEQID NO.1或SEQ ID NO.2；经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。

本发明的胰岛素前体有经修饰的胰岛素A链和经修饰的胰岛素B链经C肽连接而成，优选的，C肽选自如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。

本发明的融合蛋白可以显著提高其在重组大肠杆菌工程菌中的表达量，能够用于长效酰化胰岛素衍生物的产业化生产，对产量提高、成本控制等意义重大。

本发明的融合蛋白中所涉及引导肽、促表达肽、经修饰的胰岛素A链和经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如表1所示：

表1

作为本发明的一个改进的技术方案，胰岛素衍生物中经修饰的胰岛素A链和经修饰的胰岛素B链的具体组成如表2所示：

表2

衍生物编号	经修饰的胰岛素A链	经修饰的胰岛素B链
			衍生物1	SEQ ID NO.1	SEQ ID NO.3
衍生物2	SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.3
			衍生物3	SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.4
衍生物4	SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.5

上述组合的经修饰的胰岛素A链和经修饰的胰岛素B链，经C肽连接进一步添加引导肽、促表达肽和酶切位点片段制备得到相应的融合蛋白，具体的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.14任一项所示。氨基酸序列具体信息如表3所示。

表3

本发明还涉及用于编码上述融合蛋白的核苷酸片段。具体的，多核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18所示。核苷酸序列具体如表4示。

表4

本发明还涉及一种表达载体，该表达载体包含上述多核苷酸片段。具体的，表达载体可以采用重组pET-30a(+)表达载体。

本发明还涉及一种重组大肠杆菌工程菌，该重组大肠杆菌工程菌转化入上述表达载体，具体的，大肠杆菌可以采用大肠杆菌BL21(DE3)。

作为本发明技术方案的一种改进，重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：

(1)合成上述多核苷酸片段；

(2)将合成得到的多核苷酸克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

(3)将表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌工程菌，冻存备用。

本发明进一步提供一种制备长效酰化胰岛素衍生物的方法，具体包括如下步骤：

(1)培养本发明构建的重组大肠杆菌工程菌，表达所述融合蛋白；

(2)融合蛋白经变性、复性和酶切，得到胰岛素类似物；

(3)在胰岛素类似物上连接脂肪酸侧链，制备得到胰岛素衍生物。

其中，脂肪酸侧链通过酰胺键连接至胰岛素肽链的氨基酸K上的ε氨基上，脂肪酸侧链选自：HOOC(CH₂)_14-20CO-γ-Glu-(AEEA)₂，AEEA表示2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸。γ-Glu-(AEEA)₂的化学式结构如下所示(s和n均为1)：

具体的，侧链可以选自HOOC(CH₂)₁₄CO-γ-Glu-(AEEA)₂、HOOC(CH₂)₁₆CO-γ-Glu-(AEEA)₂、HOOC(CH₂)₁₈CO-γ-Glu-(AEEA)₂或HOOC(CH₂)₂₀CO-γ-Glu-(AEEA)₂。

具体的，步骤(1)包括：挑取冻存的重组大肠杆菌工程菌，加入LB培养基中，震荡过夜，按照1：80～150的比例将过夜菌液加入到LB液体培养基中，培养3～6小时后加入IPTG诱导表达，恒温震荡培养18～36小时，离心收集得到湿菌体；

优选的，按照1/100的比例将过夜菌液加入到LB液体培养基中，4小时后加入0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达，37℃恒温震荡培养24小时，7000rpm离心20分钟收菌。

进一步优选的，步骤(2)包括：取湿菌体按照质量体积比为10～15：200的比例重悬于缓冲液中，破碎后离心得到包涵体沉淀。优选的，破碎采用细胞破碎仪进行破碎，并进一步优选破碎2～5次；离心额时间优选为20～40分钟。包涵体沉淀中加入8M尿素缓冲液变性，再加入1M尿素缓冲液复性，得到复性液；其中，8M尿素缓冲液中还含有50mM的DTT；1M尿素缓冲液的pH为9.5。

将复性液浓缩后(优选超滤浓缩)，使用层析柱分离，获得洗脱液，洗脱液按照1000：0.2～10的质量比加入赖氨酸内切酶进行酶切，当酶切液的电导率至80～100ms/cm时，使用层析柱分离，获得洗脱液。

其中，第一次使用层析柱分离时可采用Capto Q柱(GE公司)，上样复性液，0～100％洗脱液(pH9.0，20mM Tris，1M NaCL)洗脱；第二次使用层析柱分离时可采用phenyl柱(GE)，上样酶切液，0～100％洗脱液(pH9.0，20mM Tris)洗脱。

步骤(3)包括：将洗脱液浓缩至含胰岛素类似物5～10mg/mL、优选5～7mg/mL，调节pH至10～12、优选pH为11，按胰岛素类似物与脂肪酸侧链的摩尔比1：4～5称取脂肪酸侧链前体；将胰岛素类似物与脂肪酸侧链前体在有机溶剂中混合，室温反应0.5～2小时，调节pH值为4.5～5时终止反应；加酸脱保护，然后滴入碱调节pH值为7.5～8.5时终止反应，获得长效酰化胰岛素衍生物。有机溶剂可选自醇类有机溶剂、腈类有机溶剂、醚类有机溶剂等，并优选为乙腈。优选的，脱保护脱为加入反应液2倍体积的酸溶液。

进一步优选的，长效酰化胰岛素衍生物的制备还包括纯化的步骤，具体采用制备柱进行纯化，例如UniPS10-300(购自苏州纳微科技有限公司)。具体条件为，将反应后的反应液用水稀释5倍，上样0～100％洗脱液(10Mm TFA，80％乙腈)洗脱，洗脱峰HPLC检测纯度达到95％以上，洗脱液冻干-20℃保存备用。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明的融合蛋白可以显著提高其在重组大肠杆菌工程菌中的表达量，能够实现长效酰化胰岛素衍生物的产业化生产制备，显著提高产量、降低生产成本，具有极高的应用价值。

同时，实验结果证实，本发明制备得到的长效酰化胰岛素衍生物具备等同、甚至高于Icodec的长效降糖效果。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

本实施例用于说明长效酰化胰岛素衍生物的制备工艺：

(1)质粒构建：本发明选择SEQ ID NO.8(FKFEFKFE)作为引导肽，SEQ ID NO.6所示的多肽作为促表达肽，K(赖氨酸内切酶酶切序列)为酶切序列，并将引导肽、促表达肽、酶切位点片段和目标蛋白依次串联融合得到目标蛋白前体融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示；合成编码前体融合蛋白核苷酸片段(表达框序列)，其核苷酸序列为SEQ IDNO.15所示。通过Nde1及Xho1位点，将构建的表达框序列插入原核表达质粒PET30a中并测序验证，得到重组表达质粒。

(2)重组工程菌构建：向30μL BL21(DE3)中加入构建的重组表达质粒，冰浴30min，42℃热激30s～90s，冰浴2min后加入500μL LB培养基，37℃震荡培养1小时，涂至LB固体培养板上，37℃静置过夜，挑取单克隆加入5mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡过夜，取500μL过夜菌液，加入500μL 50％的甘油菌混匀，得到甘油冻存菌，-80℃保存。

(3)摇瓶表达

挑取冻存菌株加入50mL LB培养基中，37℃震荡过夜，按照1/100的比例将过夜菌液加入到LB液体培养基中，4小时后加入0.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达。37℃恒温震荡培养24小时。7000rpm离心20分钟收菌。

(4)SDS-PAGE电泳检测表达

称取120g摇瓶表达得到的湿菌体，重悬于2L缓冲液(20mM tris，2mM EDTA)中，细胞破碎仪反复破碎3次，离心30min，弃上清取包涵体沉淀加入8M(50mM DTT)尿素缓冲液变性，pH9.5的1M尿素缓冲液缓慢复性。

复性液超滤浓缩，用pH9.0的20mM Tris缓冲液平衡Capto Q柱(GE公司)，上样复性液，0～100％洗脱液(pH9.0，20mM Tris，1M NaCL)洗脱，洗脱液按照1000：1质量比加入赖氨酸内切酶，37℃过夜酶切。

酶切液调电导率至90ms/cm，上样phenyl柱(GE公司)，0～100％洗脱液(pH9.0，20mM Tris)洗脱。

洗脱液浓缩至6mg/mL左右，调pH至11.0左右，按照胰岛素类似物与二十烷二酸单叔丁酯-谷氨酸(1-叔丁酯)-AEEA-AEEA-OSU摩尔比1：4称取脂肪酸粉末于乙腈中，两者混合，室温静置1小时，加酸调pH值为4.8终止反应。继续加2倍的体积的酸溶液，置于室温静置脱保护1小时，然后滴入NaOH调节pH7.5～8.5终止反应。

反应液用水稀释5倍，上样UniPS10-300(购自苏州纳微科技有限公司)，0～100％洗脱液(10Mm TFA，80％乙腈)洗脱，洗脱峰HPLC检测纯度达到95％以上，获得本发明的长效酰化胰岛素衍生物1，洗脱液冻干-20℃保存备用。

采用上述相同的方法，按照表3和表4所示的氨基酸与核苷酸序列，可以分别制备得到长效酰化胰岛素衍生物2～4，并且可以按照本实施例相同方法制备得到Icodec。

通过在高血糖小鼠中的降糖实验证实，本发明制备方法得到的长效胰岛素衍生物降糖活性与专利CN202211090263.7中表现一致。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (13)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少由引导肽、促表达肽、酶切位点片段和胰岛素前体依次连接而成，

所述促表达肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述酶切位点的氨基酸序列选自K或SEQ ID NO.10；

所述胰岛素前体由经修饰的胰岛素A链和经修饰的胰岛素B链经C肽连接而成；

所述经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

所述经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述C肽选自如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述引导肽选自如SEQ ID NO.8或SEQID NO.9所示的氨基酸序列的多肽。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

或，经修饰的胰岛素A链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，经修饰的胰岛素B链的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.根据权利要求1～4任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.14。

6.一种用于编码权利要求1～5任一项所述融合蛋白的多核苷酸片段。

7.根据权利要求6所述的多核苷酸片段，其特征在于，所述多核苷酸片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.18。

8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求6或7所述的多核苷酸片段。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组pET-30a(+)表达载体。

10.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌包含权利要求8或9所述的表达载体，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)。

11.根据权利要求10所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：

(1)合成如权利要求6或7所述的多核苷酸片段；

(2)将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

(3)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。

12.一种制备权利要求10所述的重组大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)合成如权利要求6或7所述的多核苷酸；

(2)将所述多核苷酸片段克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；

(3)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌，冻存备用。

13.一种制备长效酰化胰岛素衍生物的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

(1)培养如权利要求10所述的重组大肠杆菌工程菌，表达所述融合蛋白；

(2)所述融合蛋白经变性、复性和酶切，得到胰岛素类似物；

(3)在所述胰岛素类似物上连接脂肪酸侧链，获得所述长效酰化胰岛素衍生物。