CN102712696A - 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供用卷曲螺旋和/或系链构建的改造蛋白质复合体，及产生、使用和纯化这类复合体(如多特异性抗体或其他多特异性含Fc复合体)的方法。

Description

包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途

技术领域

本发明涉及新的改造蛋白质、多特异性蛋白质复合体(包括多特异性抗体)及构建它们和产生它们的方法。本发明还涉及用于获得多特异性蛋白质复合体的技术的新应用。

背景技术

对商业和治疗目的而言有用且可升级(scalable)的用于构建多特异性抗体的发现技术一直难以找到。已尝试了许多方法，但几乎全都具有明显的缺点，如可溶性差、在哺乳动物细胞中不可表达、显示低产率的异二聚体形成、制造的技术挑战、免疫原性、体内半衰期短、不稳定等问题(例如Hollinger等，(1993)PNAS 90：6444-6448；US5,932,448；US6,833,441；US 5,591,828；US7,129,330；US7,507,796；Fischer等，(2007)Pathobiology74：3-14；Booy(2006)Arch.Immunol.Ther.Exp.54：85-101；Cao等(2003)55：171-197；和Marvin等，(2006)Current Opinion in Drug Discovery&Development 9(2)：184-193)。因此，存在对产生多特异性抗体的改进的技术和方法的需要。

发明概述

本发明提供新的蛋白质复合体，及产生和制备蛋白质复合体的方法。一方面，本发明涉及与Fc CH组分连接的卷曲螺旋结构域，根据需要，该卷曲螺旋结构域可以或可以不从包含Fc的蛋白质切割。另一方面，本发明涉及包含系链(tether)和Fc CH组分复合体的蛋白质，该系链可以或可以不从该蛋白质切割。另一方面，本发明涉及可选地能够形成蛋白质复合体的包含卷曲螺旋、系链和Fc CH组分的蛋白质，取决于希望的作用，该系链和/或卷曲螺旋可以或可以不从该蛋白质切割。另一方面，本发明提供制备包含系链的蛋白质的方法，其中通过宿主细胞切割或通过体外化学或酶促反应切割该系链。另一方面，本发明涉及可选地能够形成蛋白质复合体的包含卷曲螺旋、系链和Fc CH组分的蛋白质，可通过宿主细胞来从该蛋白质切割该系链和/或卷曲螺旋，该宿主细胞表达该蛋白质，且过量表达能够从该蛋白质切割该系链和/或卷曲螺旋的酶。

另一方面，本发明提供产生包含卷曲螺旋和系链的蛋白质或蛋白质复合体的方法，其中通过宿主细胞切割或通过体外化学或酶促反应切割该系链和/或卷曲螺旋。在一个具体实施方案中，该蛋白质复合体进一步包含Fc CH组分。另一方面，本发明涉及用于制备异聚体蛋白质复合体的方法，其包括在从相同或不同的重组核酸序列表达两种不同蛋白质的条件下培养宿主细胞的步骤，其中各蛋白质包含卷曲螺旋结构域和系链。在另一实施方案中，该宿主细胞包含编码能够切割该系链和/或该卷曲螺旋的酶的重组核酸序列。在一个实施方案中，该制备方法进一步包括分离由该宿主细胞产生的蛋白质的步骤。在另一实施方案中，该制备方法进一步包括从宿主细胞产生的蛋白质切割该系链和/或该卷曲螺旋的步骤。

另一方面，本发明涉及含有或不含该系链和/或该卷曲螺旋的本文所述的蛋白质复合体。除本文提供的许多进步和优势外，本发明还提供用于制备基本上同质的异源多聚体复合体的简单、有效、高产率产生的方法。

在一个优选实施方案中，本发明提供包含两条或多条多肽的蛋白质复合体，其中

第一多肽包含第一卷曲螺旋结构域(CC)和第一Fc CH组分(FcCH)；和

第二多肽包含(1)第二卷曲螺旋结构域(CC)和第二FcCH；

其中该第一CC和该第二CC彼此复合；该第一FcCH和该第二FcCH彼此复合。

在一个实施方案中，该第一CC包含本文式I的序列，且该第二CC包含本文式II的序列。

第二方面，本发明涉及(feature)蛋白质复合体，其包含：(a)含有第一卷曲螺旋结构域(CC)的第一多肽，其中该第一CC包含式I的七残基重复序列；和(b)含有Fc CH组分和第二卷曲螺旋(CC)的第二多肽，其中该第二CC包含式II的七残基重复序列，其中式I和式II中的n大于或等于2，其中在各七残基重复序列中，该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₇残基相反的X₅残基，且该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₅残基相反的X₇残基。

在一个实施方案中，该第一多肽进一步包含VH结构域和VL结构域，且该第二多肽进一步包含VH和VL结构域，其中各多肽的VH和VL结构域以VL-CL-系链-VH的N端至C端的顺序相互连接。

在另一实施方案中，各多肽的VH结构域彼此不同。在另一实施方案中，各多肽的VL结构域彼此不同。

在一个实施方案中，本发明的蛋白质复合体包含铰链区，其中该铰链区包含其铰链区中的K222A突变、其铰链区中的C220A突变，或其铰链区中的K222A和C220A突变。

在一个实施方案中，该蛋白质复合体选自抗体、免疫黏附素、肽体(peptibody)或亲和体(affibody)。因此，根据另一实施方案，该第一和/或第二多肽可以进一步包含含有结合靶标的序列的抗体(例如VH或VL结构域)、肽体(例如肽)、免疫黏附素(例如胞外域)或支架蛋白的靶结合序列。

根据一个实施方案，该蛋白质复合体是单臂抗体。

一方面，本发明提供包含卷曲螺旋的蛋白质复合体，其包含：(a)含有第一卷曲螺旋结构域(CC)的第一多肽，其中该第一CC包含式I的七残基重复序列：

(X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇)_n(式I)(SEQ ID NO：29)

X₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X₂、X₃和X₆各是任意氨基酸残基，

X₄是疏水性氨基酸残基，和

X₅和X₇各是带电荷氨基酸残基；和

(b)含有第二卷曲螺旋结构域(CC)的第二多肽，其中该第二CC包含式II的七残基重复序列：

(X’₁X’₂X’₃X’₄X’₅X’₆X’₇)_n(式II)(SEQ ID NO：30)

X’₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X’₂、X’₃和X’₆各是任意氨基酸残基，

X’₄是疏水性氨基酸残基，和

X’₅和X’₇各是带电荷氨基酸残基；

其中式I和式II中的n大于或等于2；其中在各七残基重复序列中，该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₇残基相反的X₅残基，且该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₅残基相反的X₇残基。

在一个实施方案中，该第一和第二多肽各包含VH和CH1结构域，且可以各进一步包含铰合部结构域(hinge domain)。在另一实施方案中，该第一和第二多肽各进一步包含CH2和CH3结构域。还在另一实施方案中，该第一和第二多肽各包含相对于彼此以VH-CH1-铰合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CH1、铰合部、CH2和CH3结构域。

一方面，本发明提供抗体，其包含：(a)含有VH结构域和第一卷曲螺旋结构域(CC)的第一多肽，其中该第一CC包含式I的七残基重复序列：

(X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇)_n(式I)

X₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X₂、X₃和X₆各是任意氨基酸残基，

X₄是疏水性氨基酸残基，和

X₅和X₇各是带电荷氨基酸残基；和

(b)含有VH结构域和第二卷曲螺旋结构域(CC)的第二多肽，其中该第二CC包含式II的七残基重复序列：

(X’₁X’₂X’₃X’₄X’₅X’₆X’₇)_n(式II)

X’₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X’₂、X’₃和X’₆各是任意氨基酸残基，

X’₄是疏水性氨基酸残基，和

X’₅和X’₇各是带电荷氨基酸残基；

其中式I和式II中的n大于或等于2；其中在各七残基重复序列中，该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₇残基相反的X₅残基，且该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₅残基相反的X7残基。

在一个实施方案中，该第一和第二多肽各包含VH和CH1结构域，且可以各进一步包含铰合部结构域。在另一实施方案中，该第一和第二多肽各进一步包含CH2和CH3结构域。还在另一实施方案中，该第一和第二多肽各包含相对于彼此以VH-CH1-铰合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CHH1、铰合部、CH2和CH3结构域。

在具体实施方案中，该抗体进一步包含第三和第四多肽，其中该第三多肽包含第一VL结构域，且该第四多肽包含第二VL结构域。在一个实施方案中，该第一多肽的VH结构域通过系链连接至该第三多肽的VL结构域，且该第二多肽的VH结构域通过系链连接至该第四多肽的VL结构域。在另一实施方案中，该第三多肽进一步包含第一CL结构域，其中该第一VL和CL结构域相对于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在该第三多肽内，且该第四多肽进一步包含第二CL结构域，其中该第二VL和CL结构域相对于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在该第四多肽内。

在另一实施方案中，该第一VL结构域和该第二VL结构域的序列相同。在另一实施方案中，该第一或第二多肽中至少一个的VH的N端以系链连接至CL的C端。

第二方面，本发明涉及包含以下的抗体：(a)含有VH结构域和第一卷曲螺旋结构域(CC)的第一多肽，其中该第一CC包含式I的七残基重复序列；和(b)含有CH2和CH3结构域及第二卷曲螺旋(CC)的第二多肽，其中该第二CC包含式II的七残基重复序列，其中式I和式II中的n大于或等于2，其中在各七残基重复序列中，该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₇残基相反的X₅残基，且该第一CC包含电荷与该第二CC中的X’₅残基相反的X₇残基。

在本发明的第二方面的一个实施方案中，该第一多肽包含VH和CH1结构域，且可以进一步包含铰合部结构域。在另一实施方案中，该第一多肽进一步包含CH2和CH3结构域。在本发明的第二方面的另一实施方案中，该第一多肽包含相对于彼此以VH-CH1-铰合部-CH2-CH3的N端至C端顺序定位的VH、CH1、铰合部、CH2和CH3结构域。还在本发明的第二方面的另一实施方案中，该抗体进一步包含第三多肽，其中该第三多肽包含VL结构域。在一个实例中，该第三多肽进一步包含CL结构域，该VL和CL结构域相对于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位。还在本发明的第二方面的另一实施方案中，该第一多肽的VH的N端以系链连接至CL的C端。

在一个实施方案中，本发明的双臂抗体包含一个而不是两个系链，使得该抗体包含：(1)含有束缚于本发明的轻链的卷曲螺旋结构域和重链的多肽；(2)含有卷曲螺旋结构域和重链的多肽；和(3)含有轻链的多肽。在另一实施方案中，考虑表达这种双臂抗体的宿主细胞。

在其他实施方案中，X₁、X’₁、X₄和X’₄的任一个中的疏水性氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。在另一实施方案中，X₅、X’₅、X₇和X’₇的任一个中的带电荷氨基酸残基选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一实施方案中，在该第一CC的至少一个七残基重复序列中，X₁是天冬酰胺，且在该第二CC的至少一个七残基重复序列中，各X’₁是天冬酰胺。

还在其他实施方案中，该第一CC七残基重复序列，其中X₁是亮氨酸或天冬酰胺，X₂是丙氨酸或谷氨酰胺，X₃是丙氨酸或谷氨酰胺，X₄是亮氨酸，X₅是谷氨酸，X₆是赖氨酸或色氨酸，X₇是谷氨酸；该第二CC包含七残基重复序列，其中X’₁是亮氨酸或天冬酰胺，X’₂是丙氨酸或谷氨酰胺，X’₃是丙氨酸或谷氨酰胺，X’₄是亮氨酸，X’₅是赖氨酸，X’₆是赖氨酸或色氨酸，而X’₇是赖氨酸。

在其他实施方案中，式I和式II中的n大于或等于3，例如大于或等于4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。

在其他实施方案中，该第一或第二CC中的至少一个在该蛋白质的恒定结构域C端连接。例如，该恒定结构域是CH3结构域，该第一CC在该第一多肽的CH3结构域C端连接，该第二CC在该第二多肽的CH3结构域C端连接。该连接例如通过可切割的接头序列连接。在其他实施方案中，Lys-C内肽酶切割位点定位在该第一或第二CC中的至少一个的N端。

另一方面，本发明涉及包含第一多肽的抗体，该第一多肽含有相对于彼此以VL-CL-系链-VH-CH1-CH2-CH3(式III)的N端至C端方向定位的VL、CL、系链、VH、CH1、CH2和CH3结构域。在一个实施方案中，该抗体进一步包含式III的第二多肽。

在具体实施方案中，本发明的抗体是多特异性的。例如，该抗体能够结合至少2种抗原，或者该抗体能够结合同一抗原上的至少2个表位。在另一实施方案中，该抗体是双特异性的。

在另一实施方案中，本发明的蛋白质包含含有甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基的系链。在一个实施方案中，该系链的长度例如在15至50个氨基酸之间。在具体实施方案中，该系链的长度在20至32个氨基酸之间，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。在一个实施方案中，该系链包含GGS重复序列。在另一实施方案中，该系链是可切割的。在一个优选实施方案中，可通过同一种酶在该系链的N端和C端或N端和C端附近的两个位点中切割该系链。在一个实施方案中，该系链包含弗林蛋白酶的切割位点。在另一实施方案中，该弗林蛋白酶切割位点是RXRXRR(SEQ ID NO：25)，其中X是任意氨基酸。

在另一实施方案中，本发明的抗体包含去除Lys-C内肽酶切割位点的突变。在一个实施中，去除Lys-C内肽酶切割位点的突变在铰合部结构域中。例如，该抗体具有K222A取代(EU编号系统)。

在另一实施方案中，可通过以下内肽酶中的一种或多种来切割该系链或接头：弗林蛋白酶、凝血酶、Genenase、Lys-C、Arg-C、Asp-N、Glu-C、因子Xa、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、肠激酶、人鼻病毒C3蛋白酶(HRVC3)或激肽原酶。在具体实施方案中，该系链或接头包含天冬酰胺-甘氨酸肽键，例如可被羟胺切割的天冬酰胺-甘氨酸肽键。

在一个实施方案中，使用KnH技术，本发明的抗体进一步在CL/CH1中和/或在VH/VL界面中包含突变。在一个实施方案中，用本发明的卷曲螺旋及CL/CH1界面上的杵和臼构建本发明的多特异性抗体。

在另一实施方案中，本发明的抗体包含与细胞毒剂缀合的恒定区。

还在另一实施方案中，本发明的抗体由真核细胞表达，例如哺乳动物细胞，如CHO细胞。在备选实施方案中，该抗体由原核细胞表达，例如大肠杆菌(E.coli)细胞。

另一方面，本发明涉及用产生诸如抗体的蛋白质复合体的方法。因此，本发明提供几个新的方面。在一个实施方案中，此方法包括在培养基中培养包含编码本发明的蛋白质的载体的细胞的步骤。在一个实施方案中，该方法进一步包括从该细胞或该培养基回收蛋白质。在另一实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(a)在含有蛋白A的柱上捕获抗体；(b)从该柱洗脱抗体；和(c)将洗脱的抗体稀释在含有离液剂或温和去垢剂的溶液中。

还在另一方面，本发明涉及在溶液中保持含有卷曲螺旋的抗体的方法。该方法包括在离液剂或温和去垢剂的存在下保持抗体。可以用于此方法的离液剂或温和去垢剂的实例包括精氨酸、盐酸胍、尿素、高氯酸锂、组氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween、Triton和NP-40。

在一个实施方案中，本发明的异源多聚体复合体与两种或多种靶分子结合。在另一实施方案中，该异源多聚体复合体中的各多肽与不同的靶分子结合。还在另一实施方案中，该异源多聚体复合体抑制其所结合的一种或多种靶分子的生物学活性。在一个实施方案中，当希望的生物学作用是使细胞在靠近效应细胞(例如T淋巴细胞、天然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞或其他单核细胞)的地方排除或失活时，靶分子之一可以是CD3、CD16或CD64。

根据一个实施方案，本发明的异源多聚体复合体与选自以下的至少两种靶分子结合：IL-lα和IL-lβ；IL-12和IL-18；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-lβ；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；IL-13和PED2；IL17A和IL17F；CD3和CD19；CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CD20和BR3；TNFα和TGF-β；TNFα和IL-Iβ；TNFα和IL-2；TNFα和IL-3；TNFα和IL-4；TNFα和IL-5；TNFα和IL6；TNFα和IL8；TNFα和IL-9；TNFα和IL-10；TNFα和IL-11；TNFα和IL-12；TNFα和IL-13；TNFα和IL-14；TNFα和IL-15；TNFα和IL-16；TNFα和IL-17；TNFα和IL-18；TNFα和IL-19；TNFα和IL-20；TNFα和IL-23；TNFα和IFNα；TNFα和CD4；TNFα和VEGF；TNFα和MIF；TNFα和ICAM-1；TNFα和PGE4；TNFα和PEG2；TNFα和RANK配体；TNFα和Te38；TNFα和BAFF；TNFα和CD22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；VEGF和HER2；VEGF-A和HER2；VEGF-A和PDGF；HER1和HER2；VEGF-A和VEGF-C；VEGF-C和VEGF-D；HER2和DR5；VEGF和IL-8；VEGF和MET；VEGFR和MET受体；VEGFR和EGFR；HER2和CD64；HER2和CD3；HER2和CD16；HER2和HER3；EGFR和HER2；EGFR和HER3；EGFR和HER4；IL-13和CD40L；IL4和CD40L；TNFR1和IL-1R；TNFR1和IL-6R；TNFR1和IL-18R；EpCAM和CD3；MAPG和CD28；EGFR和CD64；CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGMA；NgR和RGMA；NogoA和RGMA；OMGp和RGMA；PDL-I和CTLA-4；及RGM A和RGM B。

在另一实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其包含含有SEQ IDNO：1的序列的第一重链、含有SEQ ID NO：2的序列的第二重链和含有SEQ ID NO：3的序列的轻链，其中该抗体特异性结合FcεR1和FcγR2b。

在另一实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其包含含有SEQ IDNO：4的序列的第一重链、含有SEQ ID NO：5的序列的第二重链和含有SEQ ID NO：6的序列的轻链，其中该抗体特异性结合HER2。

还在另一实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其包含含有SEQ IDNO：7的序列的第一重链、含有SEQ ID NO：5的序列的第二重链和含有SEQ ID NO：8的序列的轻链，其中该抗体特异性结合EGFR。

在另一实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其包含含有SEQ IDNO：9的序列的第一轻链序列和第一重链序列，及含有SEQ ID NO：10的序列的第二轻链序列和第二重链序列，其中该抗体特异性结合HER2和EGFR。

在另一实施方案中，本发明涉及分离的抗体，其包含含有SEQ IDNO：11的序列的第一轻链序列和第一重链序列，及含有SEQ ID NO：10的序列的第二轻链序列和第二重链序列，其中该抗体特异性结合HER2和EGFR。

本发明还涉及按照本文所述的方法产生的抗体在治疗方法中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合FcεR1和FcγR2b的抗体在在受试者中治疗变态反应或炎症反应(例如自身免疫病)的方法中的用途。此方法包括以足以在该受试者中治疗该变态反应或炎症反应的时间和量对受试者施用抗体或抗体片段。在另一实施方案中，本发明涉及特异性结合HER2或EGFR(或HER2和EGFR二者)的抗体在在受试者中治疗肿瘤的方法中的用途。此方法包括以足以在受试者中治疗该肿瘤的时间和量对该受试者施用抗体或抗体片段。

在具体实施方案中，本文所述治疗方法涉及缺乏卷曲螺旋和/或系链的抗体片段的用途。在此实施方案中，在产生后从抗体切割卷曲螺旋和/或系链序列，并将得到的改造抗体用于治疗施用。在另一实施方案中，该治疗方法涉及对受试者施用治疗有效量的第二药物。该第二药物可以包含另一抗体或抗体片段、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗、皮质类固醇、止吐药、癌症疫苗、止痛药或生长抑制剂。该第二药物可以在施用第一药物(例如抗体或抗体片段)之前或之后施用。在另一实施方案中，该第二药物与第一药物同时施用。

在另一实施方案中，本发明涉及：分离的多核苷酸，其编码SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17-18、26、31-32或35-36中任一个的序列或其组合；包含多核苷酸的载体，该多核苷酸含有SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17-18、26、31-32或35-36中任一个的序列或其组合；及包含这种载体的宿主细胞。该宿主细胞可以是真核细胞，如酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。该宿主细胞还可以是原核细胞，如大肠杆菌细胞。在其他实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其包含SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、17-18、26、31-32或35-36的序列中的任一个或其组合。

本发明的其他特征和优势将从以下发明详述、附图和权利要求书显而易见。

附图简述

图1是显示示例性卷曲螺旋(CC)结构中氨基酸间离子相互作用和疏水相互作用的示意图。第一CC中的残基标记为X₁至X₇，第二CC中的残基标记为X’₁至X’₇。显示了第一CC的X₅残基和第二CC的X’₇残基之间，以及第一CC的X₇残基和第二CC的X’₅残基之间的离子相互作用。此外，显示了X₄和X’₄及X₁和X’₁残基之间的疏水相互作用。

图2A显示示例性ACID.p1(SEQ ID NO：12)和BASE.p1(SEQ IDNO：13)卷曲螺旋异二聚化结构域的氨基酸序列及编码它们的DNA序列(分别为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。

图2B是显示示例性ACID.p1和BASE.p1卷曲螺旋异二聚化结构域间相互作用的示意图及各自的DNA序列SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。

图3是显示示例性双特异性抗体结构的示意图，该双特异性抗体包含共同轻链(共同LC)、异二聚体卷曲螺旋及第一和第二重链(HC1和HC2)的铰链区中去除Lys-C内肽酶切割位点的突变(K222A；Kabat编号系统)。

图4A是显示示例性单臂抗体结构的示意图，该单臂抗体包含全长重链(HC1)、缺乏VH和CH1结构域的部分重链(HC2)、轻链(共同LC)、异二聚体卷曲螺旋及HC1的铰链区中去除Lys-C内肽酶切割位点的突变(K222A)。

图4B是显示示例性缀合抗体结构的示意图，该缀合抗体包含全长重链、共同轻链、卷曲螺旋及与重链恒定区之一缀合的细胞毒剂。星号表示细胞毒剂。

图5是显示示例性束缚双特异性抗体结构的示意图。该抗体包含两条重链(HC1和HC2)和两条轻链(LC1和LC2)。系链将HC1可变重链的N端连接至LC1恒定轻链的C端，第二系链将HC2可变重链的N端连接至LC2恒定轻链的C端。在此实例中，系链包含甘氨酸甘氨酸丝氨酸(GGS)重复序列。在此图中，轻链(LC1和LC2)不同，但束缚抗体也可以包含共同轻链。该示例性束缚抗体进一步包含异二聚体卷曲螺旋及HC1和HC2的铰链区中去除Lys-C内肽酶切割位点的突变(K222A)。

图6是显示示例性重链(HC)和轻链(LC)以及将可变重链N端连接至恒定轻链C端的示例性系链的结构的示意图。在此实例中，系链的跨距约为

或长度约为22个氨基酸。测试了长度为20、23和26个氨基酸的系链。

图7A是显示包含可切割的系链和异二聚体卷曲螺旋的示例性抗体结构的示意图。如图中所示，该示例性系链将轻链(LC)的C端连接至重链(HC)的N端。可以用例如Lys-C内肽酶、弗林蛋白酶(PC1)或NH₂OH(羟胺)在切割位点(X)处从抗体切割系链。示例性切割位点定位在系链的N端和C端。图7A中所示的示例性抗体还包含异二聚体卷曲螺旋，其可以用例如Lys-C内肽酶、弗林蛋白酶(PC1)或NH₂OH在卷曲螺旋结构域N端的切割位点(X)处从抗体切割。

图7B是显示示例性可切割系链的一系列示意图。上图显示SEQ IDNO：31中的示例性26氨基酸系链序列(SEQ ID NO：17)，其可被弗林蛋白酶切割，且将轻链(LC)的N端连接至重链的C端。弗林蛋白酶可以在系链N端和C端的二碱基位点(精氨酸-精氨酸)切割系链序列。下图显示SEQ ID NO：32中的示例性26氨基酸系链序列(SEQ ID NO：18)，其可被Lys-C内肽酶在系链序列N端和C端的赖氨酸残基处切割。

图8显示与FcεR1和FcγR2b二者结合的双特异性抗体的重链(HC；抗-FcγR2b-BASE.p1序列和抗-FcεR1-ACID.p1序列)和共同轻链(4d5LC)的序列。抗-FcγR2b-BASE.p1序列(SEQ ID NO：1)包含含有BASE.p1卷曲螺旋异二聚化结构域序列和铰链区中的K222A突变的抗-人FcγR2b重链序列。抗-FcεR1-ACID.p1序列(SEQ ID NO：2)包含含有ACID.p1卷曲螺旋异二聚化结构域序列和铰链区中的K222A突变的抗-人FcεR1重链序列。4d5抗体轻链(SEQ ID NO：3)是此双特异性抗体的FcγR2b HC和FcεR1HC二者共同的。

图9-1和9-2是用来产生示例性单臂抗体的序列。一种示例性单臂抗体特异性结合HER2，且包含抗-HER2抗体1.ACID.p1序列(含有ACID.p1卷曲螺旋异二聚化结构域序列和K222A突变的抗-HER2抗体1HC；SEQID NO：4)、truncFC.BASE.p1序列(含有BASE.p1卷曲螺旋异二聚化结构域序列的缺乏VH和CH1结构域的重链；SEQ ID NO：5)和抗-HER2抗体1LC序列(SEQ ID NO：6)。另一示例性单臂抗体特异性结合EGFR，且包含抗-EGFR(D1.5).ACID.p1序列(含有ACID.p1卷曲螺旋异二聚化结构域序列和铰链区中的K222A突变的抗-EGFR(D1.5)HC；SEQ IDNO：7)、truncFC.BASE.p1序列(含有BASE.p1卷曲螺旋异二聚化结构域序列的缺乏VH和CH1结构域的重链；SEQ ID NO：5)和抗-EGFR(D1.5)抗体LC序列(SEQ ID NO：8)。

图10显示结合HER2和EGFR/HER1二者的双特异性抗体的束缚HC和LC(抗HER2(抗体1)26.ACID.p1和D1.5.26.BASE.p1)的序列。抗HER2(抗体1)26.ACID.p1序列包含含有ACID.p1卷曲螺旋异二聚化结构域和K222A突变的通过26氨基酸甘氨酸甘氨酸丝氨酸(GGS)系链束缚于抗-HER2抗体1HC序列的抗-HER2抗体1LC序列(SEQ ID NO：9)。D1.5.26.BASE.p1序列包含含有BASE.p1卷曲螺旋异二聚化结构域和K222A突变的通过26氨基酸GGS系链束缚于D1.5抗-EGFR抗体HC序列的D1.5抗-EGFR抗体LC序列(SEQ ID NO：10)。

图11显示结合HER2和EGFR/HER1二者的另一示例性抗体的束缚HC和LC(抗-HER2(抗体2).26.ACID.p1和D1.5.26.BASE.p1)的序列。抗-HER2(抗体2).26.ACID.p1序列包含含有ACID.p1卷曲螺旋异二聚化结构域和K222A突变的通过26氨基酸GGS系链束缚于抗-HER2抗体2HC序列的抗-HER2抗体2LC序列(SEQ ID NO：11)。D1.5.26.BASE.p1序列包含含有BASE.p1卷曲螺旋异二聚化结构域和K222A突变的通过26氨基酸GGS系链束缚于D1.5抗-EGFR抗体HC序列的D1.5抗-EGFR抗体LC序列(SEQ ID NO：10)。

图12A-1和12A-2及12B-1、12B-2和12B-3分别是用来构建包含卷曲螺旋异二聚化结构域的抗体的抗-HER2抗体1的部分HC(SEQ IDNO：15)和LC(SEQ ID NO：16)氨基酸序列及DNA序列SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。图12A中显示抗-HER2抗体1HC序列的起点，以及序列中K222A突变的位置。图12B中显示抗-HER2抗体1可变轻链(VL)的起点、抗-HER2抗体1LC的终点、抗-HER2抗体1可变重链(VH)的起点、抗-HER2抗体1VH的终点和K至A的突变的位置。图12A和12B中还显示用于构建包含这些序列的载体的ClaI/Bsp106、BamH1和ApaI限制位点的位置。

图13A和13B是一系列质谱分析结果图和示意图，显示可用Lys-C内肽酶从示例性α-FcεR1/α-FcγR2b双特异性抗体切割异二聚体卷曲螺旋。显示了含有卷曲螺旋的抗体(左图)和不含卷曲螺旋的抗体(右图)的理论质量，其处于各示意图上方的质谱分析结果图中所示的实验观测质量的误差范围之内，表明从抗体切割了卷曲螺旋。

图14A和14B是一系列质谱分析结果图和示意图，显示Lys-C内肽酶(右图)未在示例性α-FcεR1/α-FcγR2b双特异性抗体的LC或HC内切割，但确实从HC切割卷曲螺旋(左下方两张图和右下方两张图的比较)。轻链(MW＝26263)、含有卷曲螺旋结构域的重链(MW＝54917或55164)和不含卷曲螺旋结构域的重链(MW＝50528和50767)的理论质量处于各构建体的质谱分析结果图中所示的实验观测质量的误差范围之内。

图15是显示示例性α-FcεR1/α-FcγR2b双特异性抗体特异性和同时结合其两种抗原的一系列图。

图16是显示示例性共同LC α-FcεR1/α-FcγR2b双特异性抗体的组胺释放测定结果的图。测定中使用的抗体浓度(μg/ml)沿x轴显示，组胺释放量(ng/ml)沿y轴显示。

图17A和17B是一系列质谱分析结果图和示意图，显示可用Lys-C内肽酶从示例性单臂α-EGFR抗体切割卷曲螺旋。含有卷曲螺旋的单臂抗体(MW＝109112)和不含卷曲螺旋的单臂抗体(MW＝100419)的理论质量处于各构建体的质谱分析结果图中所示的实验观测质量的误差范围之内。

图18A、18B和18C是一系列质谱分析结果图和示意图，显示Lys-C内肽酶未切割示例性α-EGFR抗体的LC(单臂轻链；左图)、全长HC(单臂重链；中图)或缺乏VH和CH1结构域的HC(单臂Fc；右图)，但确实从HC及缺乏VH和CH1结构域的HC切割卷曲螺旋结构域。在显示质谱分析结果的图的下方显示各构建体的理论分子量，在各种情况下，理论分子量处于实验观测分子量的误差范围之内。

图19A和19B是一系列质谱分析结果图和示意图，显示可用Lys-C内肽酶从示例性束缚α-EGFR/α-HER2双特异性抗体切割卷曲螺旋。图中还显示了切割和未切割的抗体的理论分子量，其处于质谱分析结果中所示的各实验观测分子量的误差范围之内。

图20A和20B是一系列质谱分析结果图和示意图，显示可用Lys-C内肽酶从示例性束缚α-EGFR/α-HER2双特异性抗体切割卷曲螺旋，其中先用Lys-C内肽酶处理抗体，然后对样品进行质谱分析。图中还显示了切割和未切割的HC/LC复合体的理论分子量，且各构建体的理论分子量处于质谱分析结果中所示的实验观测分子量的误差范围之内。

图21是显示来自八隅体分析(Octet analysis)的结果的图，显示野生型抗-HER2抗体1和野生型α-EGFR抗体不与彼此的抗原交叉反应，但确实结合它们各自的抗原。

图22是显示来自八隅体分析的结果的图，显示单臂抗-HER2抗体1和单臂α-EGFR抗体不与彼此的抗原交叉反应，但确实结合它们各自的抗原。

图23A是显示来自八隅体分析的结果的图，显示示例性束缚双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR抗体(8323)同时结合HER2和EGFR二者。在上迹线中，先用EGFR胞外域(ECD)孵育抗体，然后用HER2受体ECD孵育，在下迹线中，先用HER2受体ECD孵育抗体，然后用EGFRECD孵育。

图23B是显示示例性双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR抗体对HER2(上)和EGFR1(下)的结合亲和力的图。

图24是免疫印迹图像，显示示例性双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR(D1.5)抗体以剂量依赖的方式抑制表达EGFR的NR6细胞中转化生长因子α(TGFα)介导的EGFR(表皮生长因子受体)磷酸化(左侧)。用D1.5抗-EGFR抗体作为对照(右侧)。用抗-磷酸酪氨酸(α-pTyr)抗体测定磷酸化水平，并用抗-微管蛋白抗体(α-微管蛋白)作为上样对照。

图25是显示双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR(D1.5)抗体在三天的时期内抑制稳定转染为表达EGFR的NR6细胞中TGFα诱导的生长的一系列图。

图26是显示示例性双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR(D1.5)抗体在五天的时期内以类似于抗-HER2抗体1对照的方式抑制HER2扩增的BT474细胞生长的图。

图27是显示使用SCID Beige小鼠的D1.5人IgG1对照抗体(抗-EGFR)十天药物代谢动力学(PK)分析的Fc-Fc测定和Fc-Fc ELISA测定结果的一系列图。

图28A和28B是显示使用SCID Beige小鼠的示例性双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR(D1.5)抗体十天PK分析的EGFR-HER2ELISA和Fc-Fc ELISA测定结果的一系列图。

图29是显示示例性双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR(D1.5)抗体与对照D1.5(抗-EGFR)和对照(抗-HER2抗体2)抗体在小鼠中的暴露的比较的图。示例性双特异性抗-HER2抗体1/α-EGFR(D1.5)抗体在测试时期内在小鼠中具有类似于对照抗体的暴露。

图30A-1和30A-2、30B-1和30B-2、30C-1、30C-2、30C-3、30C-4和30C-5、30D-1、30D-2和30D-3是质谱分析图，显示通过共表达弗林蛋白酶的细胞进行弗林蛋白酶切割后抗体的重链和轻链的切割产物。

图31是非还原型质谱分析图，显示通过在共表达弗林蛋白酶的CHO细胞中表达可被弗林蛋白酶切割的束缚卷曲螺旋抗体，并使该抗体暴露于羧肽酶消化而产生的双特异性抗体。

图32(A)和(B)是还原型质谱分析图，显示通过在共表达弗林蛋白酶的CHO细胞中表达可被弗林蛋白酶切割的束缚卷曲螺旋抗体，并使该抗体暴露于羧肽酶消化而产生的双特异性抗体。

发明详述

不受限于理论，申请人相信，即使在免疫球蛋白Fc区的存在下，本文所述卷曲螺旋异二聚化结构域也令人惊奇地提供驱动两个或多个分子以高准确度和效率结合在一起的最初触发，该Fc区也在细胞培养条件下天然相互吸引。

通过还原重链的同二聚化，本文所述卷曲螺旋异二聚化结构域的使用提供了产生包含Fc CH成分的蛋白质复合体(例如多特异性抗体或单臂抗体等)的同质群体的能力中的突破。多特异性复合体对用于治疗应用有利，因为例如它们可以指导靶标(例如肿瘤细胞)和针对该靶标的药剂(例如T细胞)的共定位，或者它们可以消除对联合治疗的需要及与向受试者提供两种或多种治疗相关的风险。此外，为了便于构建抗体(包括多特异性抗体)，可以用本发明的系链来连接抗体的轻链和重链，从而辅助各轻链与其关联重链的正确结合。

I.定义

本文以最广泛的含义使用术语“抗体”，其指包含两条重链和两条轻链的任意免疫球蛋白(Ig)分子，及其任意片段、突变体、变体或衍生物，只要它们显示希望的生物学活性(例如表位结合活性)。抗体的实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段。

在提到可变结构域中的残基(大致为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时一般使用Kabat编号系统(例如Kabat等，Sequences ofImmunological Interest.第5版Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1991))。在提到免疫球蛋白重链恒定区中的残基时一般使用“EU编号系统”或“EU指数”(例如Kabat等，上文中报道的EU指数)。“Kabat中的EU指数”指人IgG1EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，提到抗体可变结构域中的残基编号意指Kabat编号系统的残基编号。除非本文另有说明，提到抗体重链恒定结构域中的残基编号意指EU编号系统的残基编号。

以最广泛的含义使用术语“多特异性抗体”，且明确涵盖具有多表位特异性的抗体。这类多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)的抗体，其中V_HV_L单元具有多表位特异性；各V_HV_L单元与不同表位结合的具有两个或多个V_H和V_L结构域的抗体；各单可变结构域与不同表位结合的具有两个或多个单可变结构域的抗体；全长抗体；抗体片段，如Fab、Fv、dsFv、scFv；双抗体、双特异性双抗体和三链抗体；共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指与相同或不同靶标上的两个或多个不同表位特异性结合的能力。“单特异的”指仅与一个表位结合的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力与各表位结合的IgG抗体。

天然存在的基本四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本异四聚体单元连同另一称为J链的多肽组成，因此包含10个抗原结合部位，而分泌性IgA抗体可以多聚化形成包含2-5个基本四链单元连同J链的多价组合(assemblage))。在IgG的情况下，四链单元通常为约150,000道尔顿。各L链通过一个共价二硫键与H链连接，而取决于H链同种型，两条H链通过一个或多个二硫键相互连接。各H链和L链还具有规则间隔的链内二硫键。各H链在N端具有可变结构域，对于α链和γ链，随后是三个恒定结构域(CH)，对于μ和ε同种型，随后是四个CH结构域。各L链在N端具有可变结构域(VL)，随后是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH比对，CL与重链的第一恒定结构域(CH1)比对。认为特定氨基酸残基在轻链可变结构域和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对在一起形成单个抗原结合部位。不同种类抗体的结构和特性参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，71页和第6章。

根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的L链分配至称为κ和λ的两个明显不同的类型之一。取决于其重链恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配至不同种类或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别命名为α、δ、γ、ε和μ的重链。根据CH序列和功能的相对次要的差异，将γ和α类进一步划分为亚类，例如人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

术语“可变的”指可变结构域的某些区段的序列在抗体间广泛不同的事实。V结构域介导抗原结合，并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性并非在可变结构域的110个氨基酸的跨度内平衡分布。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的延伸组成，该构架区由长度各为9-12个氨基酸的称为“高变区”的极端可变的较短区域分隔开。天然重链和轻链的可变区各包含四个FR，四个FR主要采取β-折叠构象，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构的环，且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自其他链的高变区一起促成抗体抗原结合部位的形成(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。

在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指序列变异度高和/或形成结构上定义的环的抗体可变结构域区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3显示六个HVR中最大的多样性，尤其认为H3在赋予抗体精细特异性中发挥独特作用。见例如Xu等，Immunity13：37-45(2000)；Johnson和Wu，在Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003)中。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼(camelid)抗体在缺乏轻链的情况下具有功能且稳定。见例如Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。

许多HVR描述在使用，且为本文所涵盖。Kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性，且最常用(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，MD.(1991))。而Chothia指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR和Chothia结构环的折衷，且为Oxford Molecular′s AbM抗体建模软件所采用。“接触”HVR基于可得的复合体晶体结构的分析。下文记录了来自这些HVR中的每一个的残基。

HVR可以包含以下“延长HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，按照Kabat等，上文编号可变结构域残基。

“构架区”(FR)除CDR残基外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果按照Kabat定义CDR，那么轻链FR残基大致定位在残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)，而重链FR残基大致定位在重链残基中的残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，那么轻链FR残基大致定位在轻链中的残基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)，而重链FR残基大致定位在重链残基中的残基1-25(HCFRI)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)。在一些情况下，在CDR包含来自Kabat定义的CDR和高变环二者的氨基酸时，将相应地调整FR残基。例如，在CDRH1包含氨基酸H26-H35时，重链FR1残基在1-25位，而FR2残基在36-49位。

“人共有构架”是代表人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常存在的氨基酸残基的构架。通常，从可变结构域序列亚组选择人免疫球蛋白VL或VH序列。通常，该序列亚组是Kabat中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是Kabat中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是Kabat中的亚组III。

“完整”抗体的一个实例是包含抗原结合部位以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。

“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包含Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体(Db)；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微型抗体(minibody)、单链抗体分子；及从抗体片段形成的多特异性抗体(例如，包括但不限于b-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3和(scFV)4-Fc)。

表述“单结构域抗体”(sdAb)或“单可变结构域(SVD)抗体”通常指其中单可变结构域(VH或VL)可以赋予抗原结合的抗体。换言之，该单可变结构域无需与另一可变结构域相互作用来识别靶抗原。单结构域抗体的实例包含衍生自骆驼(美洲驼(lamas)和骆驼)和软骨鱼(例如铰口鲨)的那些，以及通过重组方法衍生自人类和小鼠抗体的那些(Nature(1989)341：544-546；Dev Comp Immunol(2006)30：43-56；Trend BiochemSci(2001)26：230-235；Trends Biotechnol(2003)：21：484-490；WO2005/035572；WO 03/035694；Febs Lett(1994)339：285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。

表述“线性抗体”通常指Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中所述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(V_H-C_H1-V_H-C_H1)，该区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。

本文提到的术语“杵入臼(knob-into-hole)”或“KnH”技术指通过在它们相互作用的界面上在一条多肽中引入隆突(pertuberance)(杵)，另一多肽中引入空穴(臼)来指导两条多肽在体外或体内配对在一起的技术。例如，已将KnH引入抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(例如US2007/0178552；WO 96/027011；WO 98/050431；和Zhu等(1997)Protein Science 6：781-788)。这对在多特异性抗体的制备过程中驱动两条不同的重链配对在一起尤其有用。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体可以进一步包含与各Fc区连接的单可变结构域，或进一步包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。还可以用KnH技术来将两个不同的受体胞外域或包含不同靶标识别序列的任意其他多肽序列(例如包括亲和体、肽体和其他Fc区)配对在一起。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余“Fc”片段(反映易于结晶的能力的命名)。Fab片段由整条L链连同H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。胃蛋白酶处理抗体产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性且仍能够交联抗原的两个通过二硫键连接的Fab片段。Fab’片段与Fab片段的不同在于在CH1结构域的羧基端具有另外几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)。Fab’-SH是本文对其中恒定区的一个或多个半胱氨酸残基具有自由巯基的Fab’的命名。最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab”片段对产生F(ab’)2抗体片段。还已知抗体片段的其他化学偶联。

Fc片段包含通过二硫键结合在一起的两条H链的羧基端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定；此区域也是由见于某些细胞类型上的Fc受体(FcR)识别的部分。

“Fv”由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发出六个高变环(3个环来自H链，3个环来自L链)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或仅包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，虽然通常以低于整个结合部位的亲和力结合。

也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接入单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步在VH和VL结构域之间包含多肽接头，其使得sFv能够形成希望的抗原结合结构。sFv的综述见Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)；Malmborg等，J.Immunol.Methods 183：7-13，1995。

术语“双抗体”指通过以下制备的小抗体片段：在VH和VL结构域之间用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见前一段)，使得达到V结构域的链间配对而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合部位的片段。双特异性双抗体是两个“交叠”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)中。

术语“单臂抗体”指包含以下的抗体：(1)通过肽键连接至包含CH2结构域、CH3结构域或CH2-CH3结构域的多肽的可变结构域；和(2)第二CH2、CH3或CH2-CH3结构域，其中可变结构域未通过肽键连接至包含该第二CH2、CH3或CH2-CH3结构域的多肽。在一个实施方案中，单臂抗体包含3条多肽：(1)包含可变结构域(例如VH)、CH1、CH2和CH3的第一多肽；(2)包含可变结构域(例如VL)和CL结构域的第二多肽；和(3)包含CH2和CH3结构域的第三多肽。在一个实施方案中，该第三多肽不包含可变结构域。在另一实施方案中，单臂抗体具有部分铰链区，该部分铰链区包含形成连接恒定重链的二硫键的两个半胱氨酸。在一个实施方案中，单臂抗体的可变结构域形成抗原结合区。在另一实施方案中，单臂抗体的可变结构域是单可变结构域，其中各单可变结构域是抗原结合区。

本发明的抗体可以是“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中的目的嵌合抗体包含灵长类化(primatized)抗体，其含有衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。

非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自具有希望的抗体特异性、亲和力和容量的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。产生这些修饰来进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个(且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，而全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详情见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

本文所用的“复合体”或“复合的”指通过不是肽键的键和/或力(例如范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)彼此相互作用的两个或多个分子的结合。在一个实施方案中，该复合体是异源多聚体。应理解，本文所用的术语“蛋白质复合体”或“多肽复合体”包括具有与蛋白质复合体中的蛋白质缀合的非蛋白质实体(例如，包括但不限于化学分子，如毒素或检测剂)的复合体。

本文所用的术语“异源多聚体”或“异源多聚体的”描述通过非肽键共价键(例如二硫键)和/或非共价作用(例如氢键、离子键、范德瓦尔斯力和疏水作用)相互作用的两条或多条多肽，其中至少两个分子具有相互不同的序列。

本文所用的术语“免疫黏附素”指将异源蛋白质(“黏附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区结构域的效应子功能组合的分子。在结构上，免疫黏附素包含具有希望的结合特异性的氨基酸序列(该氨基酸序列不同于抗体的抗原识别和结合部位(即与抗体的恒定区相比是“异源的”))与免疫球蛋白恒定结构域序列(例如IgG的CH2和/或CH3序列)的融合。示例性黏附素序列包含含有与目的蛋白质结合的受体或配体部分的连续氨基酸序列。黏附素序列还可以是结合目的蛋白质，但不是受体或配体序列的序列(例如肽体中的黏附素序列)。可以通过包括噬菌体展示技术和高流通量分选法的多种方法来选择或鉴定这类多肽序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以获自任意免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

本发明的“结合”目的抗原的抗体是这样的抗体，其以足够的亲和力结合抗原，使得该抗体可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向蛋白质或表达该抗原的细胞或组织，且未显著地与其他蛋白质交叉反应。在这类实施方案中，通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)或ELISA测定，抗体与“非靶”蛋白的结合程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合的约10％。对于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或与特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异性结合”或对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异”意指显著不同于非特异性相互作用的结合(例如非特异性相互作用可以是与牛血清白蛋白或酪蛋白相互作用)。可以例如通过测定分子与对照分子的结合相比的结合来测量特异性结合。例如，可以通过用类似于靶标的对照分子(例如过量的未标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果过量的未标记靶标竞争性抑制探针标记的靶标的结合，则指示特异性结合。可以例如通过对靶标具有至少约200nM、备选地至少约150nM、备选地至少约100nM、备选地至少约60nM、备选地至少约50nM、备选地至少约40nM、备选地至少约30nM、备选地至少约20nM、备选地至少约10nM、备选地至少约8nM、备选地至少约6

nM、备选地至少约4nM、备选地至少约2nM、备选地至少约1nM或更大的Kd的分子来显示本文所用的术语“特异性结合”或与特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异性结合”或对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“特异”。在一个实施方案中，术语“特异性结合”指这样的结合，其中分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合。

“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单个结合部位与其结合配偶体(例如抗原)之间的总和共价相互作用的强度。除非另有说明，本文所用的“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)成员间1∶1相互作用的内在结合亲和力。通常可以通过解离常数(Kd)来表示分子X对其配偶体Y的亲和力。例如，Kd可以是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更强。可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)来测量亲和力。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原，且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原，且倾向于保持结合更长时间。本领域已知测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可以用于本发明的目的。

在一个实施方案中，用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片在25℃下使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，通过使用表面等离振子共振测定来测量本发明的“Kd”或“Kd值”。简言之，按照供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。按5μl/分钟的流速注入前，用10mM柠檬酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃下将两倍系列稀释的Fab(例如0.78nM至500nM)注入含0.05％Tween 20的PBS(PBST)。通过同时拟合结合传感图和解离传感图，用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值k_off/k_on。见例如Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么可以通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，如在分光计，如装配停流的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，该技术在浓度渐增的抗原存在下测量含20nM抗-抗原的抗体(Fab形式)的PBS pH7.2在25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。

还可以用～10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片在25℃下使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，用上文所述的相同的表面等离振子共振技术来测定本发明的“结合速率(on-rate)”或“结合的速率”或“结合速率(association rate)”或“k_on”。简言之，按照供应商的说明用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。按5μl/分钟的流速注入前，用10mM柠檬酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(～0.2μM)，以达到约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺来封闭未反应的基团。对于动力学测量，按约25μl/分钟的流速在25℃下将两倍系列稀释的Fab(例如0.78nM至500nM)注入含0.05％Tween 20的PBS(PBST)。通过同时拟合结合传感图和解离传感图，用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。将平衡解离常数(Kd)计算为比值k_off/k_on。见例如Chen等，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。但是，如果通过以上表面等离振子共振测定测量的结合速率超过10⁶M^-1S^-1，则优选通过使用荧光淬灭技术来测定结合速率，如在分光计，如装配停流的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中测量，该技术在浓度渐增的抗原存在下测量含20nM抗抗原的抗体(Fab形式)的PBS pH7.2在25℃下的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。

除非另有说明，对于本发明的多肽，如抗体、其片段或衍生物，“具有生物学活性的”及“生物学活性”和“生物学特征”指具有与生物分子结合的能力。

“肽体”指随机产生的肽与Fc结构域的融合。见例如2003年12月9日授予Feige等的美国专利号6,660,843(以其整体引入作为参考)。它们包含与N端、C端、氨基酸侧链，或与一个以上这些位点连接的一条或多条肽。肽体技术使得能够设计掺入了靶向一种或多种配体或受体的肽、tumor-homing肽、膜转运肽等的治疗剂。已证明肽体技术可用于设计许多这类分子，包括线性肽和受二硫键限制的肽、“串联肽多聚体”(即单链Fc结构域上的一种以上肽)。见例如美国专利号6,660,843；2003年10月16日公开的美国专利申请号2003/0195156(对应于2002年11月21日公开的WO 02/092620)；2003年9月18日公开的美国专利申请号2003/0176352(对应于2003年4月17日公开的WO 03/031589)；1999年10月22日提交的美国系列号09/422,838(对应于2000年5月4日公开的WO 00/24770)；2003年12月11日公开的美国专利申请号2003/0229023；2003年7月17日公开的WO 03/057134；2003年12月25日公开的美国专利申请号2003/0236193(对应于2004年4月8日提交的PCT/US04/010989)；2003年9月18日提交的美国系列号10/666,480(对应于2004年4月1日公开的WO 04/026329)；其中每项专利在此以其整体引入作为参考。

“亲和体”指通过肽键与Fc区连接的蛋白质的用途，其中用该蛋白质作为支架来提供靶分子的结合表面。该蛋白质通常是天然存在的蛋白质，如葡萄球菌A蛋白或结合IgG的B结构域、或从其衍生的Z蛋白(见Nilsson等(1987)，Prot Eng 1，107-133；和美国专利号5,143,844)或其片段或衍生物。例如，可以从具有改变的与一个或多个靶分子的结合亲和力的Z蛋白变体产生亲和体，其中已通过随机诱变突变Z蛋白的区段来产生能够结合靶分子的变体的文库。亲和体的实例包括美国专利号6,534,628；Nord K等，Prot Eng 8：601-608(1995)；和Nord K等，Nat Biotech 15：772-777(1997).Biotechnol Appl Biochem.2008年6月；50(Pt 2)：97-112。

“分离的”异源多聚体或复合体指已从其天然细胞培养环境的成分分开和/或回收的异源多聚体或复合体。其天然环境的污染成分是可以干扰该异源多聚体的诊断用途或治疗用途的物质，且可以包含酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，将该异源多聚体纯化至：(1)通过Lowry法测定蛋白质大于95wt％，且最优选超过99wt％；(2)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)通过使用考马斯蓝染色或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE显示同质。

通常将本发明的异源多聚体纯化至基本上同质。用短语“基本上同质的”、“基本上同质的形式”和“基本同质”来指产物基本上不含有源自不希望的多肽组合(例如同型多聚体)的副产物。

按纯度表示，基本同质指副产物的量不超过10wt％、9wt％、8wt％、7wt％、6wt％、4wt％、3wt％、2wt％或1wt％或低于1wt％。在一个实施方案中，副产物低于5％。

“生物分子”指核酸、蛋白质、糖类、脂质及其组合。在一个实施方案中，该生物分子存在于自然界中。

在用来描述本文所述的多种抗体时，“分离的”指已从其所表达自的细胞或细胞培养物鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是通常可以干扰该多肽的诊断用途或治疗用途的物质，且可以包含酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，将该多肽纯化至：(1)足以通过使用旋杯式测序仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(2)通过使用考马斯蓝染色或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE显示同质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在该多肽天然环境的至少一种成分。但是，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。

本文所用的“连接的”或“连接”指第一和第二氨基酸序列间的直接肽键连接，或涉及第三氨基酸序列的连接，该第三氨基酸序列与第一和第二氨基酸序列连接，且处在第一和第二氨基酸序列之间。例如，接头肽与一条氨基酸序列的C端连接，与另一氨基酸序列的N端连接。

本文所用的“接头”指长度为两个或多个氨基酸的氨基酸序列。接头可以由中性极性或非极性氨基酸组成。接头长度可以是例如2至100个氨基酸，如长度在2至50个氨基酸之间，例如长度为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。接头可以是例如通过自身切割或酶切割或化学切割“可切割的”。氨基酸序列中的切割位点及在这类位点切割的酶和化学药品为本领域公知，且也在本文中描述。

本文所用的“系链”指连接其他两条氨基酸序列的氨基酸接头。本文所述的系链可以将免疫球蛋白重链可变结构域的N端与免疫球蛋白轻链恒定结构域的C端连接。在具体实施方案中，系链长度在约15至50个氨基酸之间，例如长度在20至26个氨基酸之间(例如长度为20、21、22、23、24、25或26个氨基酸)。系链可以是例如通过自身切割或使用本领域标准方法和试剂的酶切割或化学切割“可切割的”。

“接头”或“系链”的酶切割可以涉及诸如例如LYs-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、Genenase、因子Xa、TEV(烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶)、肠激酶、HRVC3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶以及枯草蛋白酶样蛋白原转化酶(例如弗林蛋白酶(PC1)、PC2或PC3)或N-精氨酸二碱基转化酶的内肽酶的使用。化学切割可以涉及例如羟胺、N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺或溴化氰的使用。

本文所用的“Lys-C内肽酶切割位点”是可以被Lys-C内肽酶在C端一侧切割的氨基酸序列中的赖氨酸残基。Lys-C内肽酶在赖氨酸残基的C端一侧切割。

本文所用的“七残基重复序列”指7个连续氨基酸的序列，其在氨基酸序列中重复至少一次。七残基重复序列可以按照第一重复序列的C端紧邻第二重复序列的N端在氨基酸序列中连续排列。在一个实施方案中，七残基重复序列具有本文定义的式I或式II的序列。

本文所用的“卷曲螺旋结构域”、“卷曲螺旋异二聚化结构域”、“螺旋”或“螺旋异二聚化结构域”指形成α-螺旋结构的氨基酸序列，该α-螺旋结构可以与第二α-螺旋结构(第二“卷曲螺旋结构域”)相互作用来形成“卷曲螺旋”或“异二聚体卷曲螺旋”。α-螺旋结构可以是右手α-螺旋。在一个实施方案中，α-螺旋结构由七残基重复序列构成。在一个具体实施方案中，卷曲螺旋结构域具有图1中所示的结构，其中第一和第二α-螺旋结构的“X₁”和“X₁’”位残基形成疏水相互作用，第一和第二α-螺旋结构的“X₄”和“X₄’”位残基形成疏水相互作用，第一α-螺旋结构的“X₅”位残基与第二α-螺旋结构的“X₇’”位残基形成离子相互作用，第一α-螺旋结构的“X₇”位残基与第二α-螺旋结构的“X₅’”位残基形成离子相互作用。卷曲螺旋结构域可以由本文定义的式I或式II的两个或多个七残基重复序列构成。

“疏水性残基”指丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或甲硫氨酸。在具体实施方案中，该疏水性残基不是脯氨酸。

“带电荷残基”指酸性或碱性氨基酸。赖氨酸、精氨酸和组氨酸是碱性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸是酸性氨基酸。

“离液剂”指通过干扰稳定化分子内相互作用(例如氢键、范德瓦尔斯力或疏水作用)来破坏蛋白质(例如抗体)三维结构的水溶性物质。示例性离液剂包括但不限于尿素、盐酸胍、高氯酸锂、组氨酸和精氨酸。

“温和去垢剂”指通过干扰稳定化分子内相互作用(例如氢键、范德瓦尔斯力或疏水作用)来破坏蛋白质(例如抗体)三维结构，但不永久性破坏蛋白质结构以致引起生物学活性丧失(即不变性蛋白质)的水溶性物质。示例性温和去垢剂包括但不限于Tween(例如Tween-20)、Triton(例如Triton X-100)、NP-40(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Nonidet P-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和十二烷基硫酸钠(SDS)。

“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置上，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。

Fc区的“下铰链区”通常定义为紧邻铰链区C端的残基延伸，即Fc区的残基233至239。在本发明之前，通常将FcγR结合归因于IgG Fc区的下铰链区中的氨基酸残基。

人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从IgG的约残基231延伸至约340。CH2结构域的独特性在于它未与另一结构域紧密配对。相反，完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两个N-连接分支糖链。已推测糖类可以提供结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。

“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的残基延伸(即从IgG的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。

本文用术语“Fc区”来定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以不同，但人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基端。可以例如在产生或纯化抗体的过程中，或通过重组改造编码抗体重链的核酸来去除Fc区的C端赖氨酸(EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包含去除了所有K447残基的抗体群体，未去除K447残基的抗体群体，及具有包含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。

“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。这类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，且可以用例如本文的定义中公开的多种测定评估。

“天然序列Fc区”包含与见于自然界中Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；天然序列人IgG4Fc区；及其天然存在的变体。

“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰(优选一个或多个氨基酸取代)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有天然序列Fc区中或亲本多肽Fc区中的至少一个氨基酸取代，例如约一个至约十个氨基酸取代，且优选约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽Fc区具有至少约80％同源性，且最优选与之具有至少约90％同源性，更优选与之具有至少约95％同源性。

本文所用的“Fc复合体”指相互作用在一起的Fc区的两个CH2结构域和/或相互作用在一起的Fc区的两个CH3结构域，其中CH2结构域和/或CH3结构域通过并非肽键的键和/或力(例如范德瓦尔斯力、疏水力、亲水力)相互作用。

本文所用的“Fc成分”指Fc区的铰链区、CH2结构域或CH3结构域。

本文所用的“Fc CH成分”或“FcCH”指包含Fc区的CH2结构域、CH3结构域或CH2和CH3结构域的多肽。

抗体“效应子功能”指可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型改变的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；及B细胞活化。

“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”指细胞毒性的一种形式，其中分泌型Ig结合至某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合具有抗原的靶细胞，并在随后用细胞毒剂杀死该靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，且绝对为这种杀伤所需。介导ADCC的初级细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以例如在动物模型，如Clynes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。

“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，且包含FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包含FcγRIIA(“活化”受体)和FcγRIIB(“活化”受体)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见

Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述M)。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖了其他FcR，包括有待将来鉴定的那些。该术语还包含负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)；和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR，并执行效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包含外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以分离自天然来源，例如分离自血液。

“依赖补体的细胞毒性”或“CDC”指在补体的存在下裂解靶细胞。通过补体系统的第一成分(C1q)与结合其关联抗原的(适当亚类的)抗体的结合来起始经典补体途径的活化。为了评估补体活化，可以进行例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述的CDC测定。

术语“治疗有效量”指在受试者中治疗疾病或障碍的抗体、抗体片段或衍生物的量。在肿瘤(例如癌性肿瘤)的情况下，抗体或抗体片段(例如多特异性抗体或抗体片段)的治疗有效量可以减少癌细胞数目；减小原发肿瘤大小；抑制(即在某种程度上减缓和优选阻止)癌细胞浸润进入外周器官；抑制(即在某种程度上减缓和优选阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与该障碍相关的一种或多种症状。在抗体或抗体片段可以防止生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。对于癌症治疗，可以例如通过评估存活时间、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、应答持续时间和/或生活质量来测量体内功效。

“减少或抑制”指引起优选20％或更大，更优选50％或更大，且最优选75％、85％、90％、95％或更大的总体减少的能力。减少或抑制可以涉及所治疗的障碍的症状、转移的存在或大小、原发肿瘤的大小或血管发生障碍中的血管大小或数目。

术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中的生理条件，其通常表征为不受调节的细胞生长/增殖。此定义中包含良性癌症和恶性癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直结肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛管癌、阴茎癌、黑色素瘤及多种类型的头癌和颈癌。“早期癌症”指未侵入或未转移或分类为0期、I期或II期癌症的癌症。术语“癌前期的”指通常先于癌症或发展为癌症的条件或生长。“非转移性的”指良性或保持在原发部位且未渗入淋巴管或血管系统或原发部位以外的组织的癌症。通常，非转移性癌症是0期、I期或II期癌症和有时为III期癌症的任意癌症。

“涉及HER2异常激活的非恶性疾病或障碍”是不涉及癌症的病症，其中患有或易感该疾病或障碍的受试者的细胞或组织中发生HER2的异常激活。这类疾病或障碍的实例包括自身免疫病(例如银屑病)，见下文定义；子宫内膜异位症；硬皮病；再狭窄；息肉，如结肠息肉、鼻息肉或胃肠道息肉；纤维腺瘤；呼吸道疾病(例如慢性支气管炎、哮喘(包括急性哮喘和变应性哮喘)、囊性纤维化、支气管扩张、变应性或其他鼻炎或鼻窦炎、α1-抗-胰蛋白酶缺乏病、咳嗽、肺气肿、肺纤维化或过度反应性气道、慢性阻塞性肺部疾病及慢性阻塞性肺障碍)；胆囊炎；神经纤维瘤病；多囊性肾病；炎性疾病；皮肤障碍(包括银屑病和皮炎)；血管病；涉及血管上皮细胞异常增殖的病症；胃肠溃疡；Menetrier病、分泌性腺瘤或蛋白质丢失综合症；肾障碍；血管发生障碍；眼病，如年龄相关性黄斑变性、拟眼组织胞浆菌病综合症、来自增生型糖尿病性视网膜病变、视网膜血管形成、糖尿病性视网膜病变或年龄相关性黄斑变性的视网膜新生血管形成；骨相关病变，如骨关节炎、佝偻病和骨质疏松症；脑缺血事件后损伤；纤维化或水肿病，如肝硬化、肺纤维化、carcoidosis、甲状腺炎、全身性高粘滞综合症、遗传性出血性毛细血管扩张症(Osler Weber-Rendu disease)、慢性阻塞性肺病或烧伤、创伤、辐射、中风、缺氧或缺血后的水肿；皮肤过敏反应；糖尿病性视网膜病变和糖尿病性肾病；Guillain-Barre综合症；移植物抗宿主病或移植排斥；Paget病；骨骼或关节炎症；光老化(例如由人皮肤的UV照射引起)；良性前列腺肥大；某些微生物感染，包括选自腺病毒、汉坦病毒、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，耶尔森氏菌属物种(Yersinia spp.)和百日咳杆菌(Bordetellapertussis)的微生物病原体；血小板聚集引起的血栓；生殖病症，如子宫内膜异位症、卵巢过度刺激综合症、先兆子痫、功能失调性子宫出血或月经频多；滑膜炎；粥样斑；急性和慢性肾病(包括增生性肾小球肾炎和糖尿病引起的肾病)；湿疹；增生性瘢痕形成；内毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤性息肉病；神经变性疾病(例如阿尔茨海默病、AIDS相关痴呆、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩和小脑变性)；骨髓增生异常综合症；再生障碍性贫血；缺血性损伤；肺、肾或肝的纤维化；T细胞介导的过敏性疾病；婴儿肥厚性幽门狭窄；尿路阻塞性综合症；银屑病关节炎；及桥本氏甲状腺炎。

本文的“变应性或炎性障碍”是由个体免疫系统过度激活引起的疾病或障碍。示例性变应性或炎性障碍包括但不限于哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、湿疹、器官移植、年龄相关性黄斑变性、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、嗜酸细胞性食管炎和与炎症相关的自身免疫病。

本文的“自身免疫病”是由个体自身组织引起且针对个体自身组织的疾病或障碍或其共分离或表现形式或从其产生的病症。自身免疫病或障碍的实例包括但不限于：关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎症性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、Lyme关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、椎骨关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、arthritis chronicaprogrediente、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)；炎性过度增殖性皮肤病；银屑病，如斑块状银屑病、gutattepsoriasis、脓疱性银屑病和指甲银屑病；皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎；X连锁高IgM综合症；荨麻疹，如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹；多肌炎/皮肌炎；青少年型皮肌炎；中毒性表皮坏死溶解症；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化症，如全身性硬化病、多发性硬化症(MS)(如spino-optical MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发-好转型MS(RRMS))、进行性全身性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调性硬化；炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎(如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，colitis ulcerosa)、微小性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎)和自身免疫性炎性肠病)；坏疽性脓皮病；结节性红斑；原发性硬化性胆管炎；巩膜外层炎；呼吸窘迫综合症，包括成人型或急性呼吸窘迫综合症(ARDS)；脑膜炎；全部或部分血管膜的炎症；虹膜炎；脉络膜炎；自身免疫性血液障碍；类风湿性脊椎炎；突发性耳聋；IgE介导的疾病，如过敏症及变应性和特发性鼻炎；脑炎，如Rasmussen脑炎及边缘性脑炎和/或脑干脑炎；葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎；伴随和不伴随肾病综合症的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫性GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和急进性GN；变应性病症；变应性反应；湿疹，包括变应性或特应性湿疹；哮喘，如支气管哮喘(asthma bronchiale，bronchial asthma)和自身免疫性哮喘；涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症；慢性肺炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白细胞黏附性缺陷；全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus(SLE)或systemic lupuserythematodes)，如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合症(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科、非肾、肾外、盘状、脱发)；幼年型(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；成年型糖尿病(II型糖尿病)；自身免疫性糖尿病；特发性尿崩症；与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；结核病；结节病；肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、Wegener肉芽肿病；粒细胞缺乏症；血管病，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括Kawasaki病和结节性多动脉炎)、微小性多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤性或过敏性血管炎、系统性坏死性血管炎和ANCA相关血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合症(CSS)、颞动脉炎；再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(pernicious anemia，anemia perniciosa)、Addison病、纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)、VIII因子缺乏、血友病A、自身免疫性中性白细胞减少、全血细胞减少、白细胞减少、涉及白细胞渗出的疾病；CNS炎性障碍；多器官损伤综合症，如败血症、创伤或出血继发的那些；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂抗体综合症；变应性神经炎；Bechet或Behcet病；Castleman综合症；Goodpasture综合症；Reynaud综合症；Sjogren综合症；Stevens-Johnson综合症；类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮；天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、pemphigus mucus-membrane pemphigoid和红斑性天疱疮)；自身免疫性多内分泌病；Reiter病或综合症；免疫复合物性肾炎；抗体介导的肾炎；视神经脊髓炎；多神经病；慢性神经病，如IgM多神经病或IgM介导的神经病；血小板减少症(例如心肌梗塞患者所发展)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导性血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP；睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎；原发性甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退；自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎(如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退、Grave病；多腺体综合症，如自身免疫性多腺体综合症(或多腺体内分泌病综合症)；瘤外综合症，包括神经系瘤外综合症，如Lambert-Eaton肌无力综合症或Eaton-Lambert综合症、僵人综合症(stiff-man syndrome或stiff-person syndrome)；脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis或encephalomyelitisallergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)；重症肌无力，如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛综合症或视性眼阵挛-肌阵挛综合症(OMS)；感觉神经病；多灶性运动神经病；Sheehan综合症；自身免疫性肝炎；慢性肝炎；狼疮样肝炎；巨细胞肝炎；慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎；淋巴性间质性肺炎；闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP；Guillain-Barré综合症；Berger病(IgA肾病)；特发性IgA肾病；线性IgA皮肤病；原发性胆汁性肝硬变；肺硬变；自身免疫性肠病综合症；乳糜泻；腹腔病；口炎性腹泻(麸质肠病)；顽固性腹泻；特发性腹泻；冷球蛋白血症；肌萎缩性侧索硬化症(ALS；Lou Gehrig病)；冠状动脉疾病；自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力丧失；视性眼阵挛-肌阵挛综合症(OMS)；多软骨炎，如顽固性或复发性多软骨炎；肺泡蛋白沉着症；淀粉样变性；巩膜炎；非癌性淋巴细胞增多；原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和意义未定性单克隆丙种球蛋白病(MGUS))；周围神经病；瘤外综合症；通道病(channelopathy)，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉障碍、聋、盲、周期性麻痹和CNS的通道病；孤独症；炎性肌病；局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)；内分泌性眼病；葡萄膜视网膜炎；脉络膜视网膜炎；自身免疫性肝障碍；纤维肌痛；多内分泌衰竭；Schmidt综合症；肾上腺炎；胃萎缩；早老性痴呆；脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病；糖尿病性肾病；Dressler综合症；斑秃；CREST综合症(钙质沉着、雷诺现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)；雄性和雌性自身免疫性不育；混合性结缔组织病；Chagas病；风湿热；习惯性流产；农民肺；多形性红斑；心脏切开术后综合症；Cushing综合症；养鸟者肺；变应性肉芽肿性血管炎；良性淋巴细胞性脉管炎；Alport综合症；肺泡炎，如变应性肺泡炎和致纤维性肺泡炎；间质性肺病；输血反应；麻风；疟疾；利什曼病；kypanosomiasis；血吸虫病；蛔虫病；曲霉病；Sampter综合症；Caplan综合症；登革热；心内膜炎；心内膜心肌纤维化；弥漫性肺间质纤维化；间质性肺纤维化；特发性肺纤维化；囊性纤维化；眼内炎；持久性隆起性红斑；胎儿有核红细胞增多症；嗜酸性筋膜炎；Shulman综合症；Felty综合症；flariasis；睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎；Henoch-Schonlein紫癜；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；艾柯病毒感染；心肌病；阿尔茨海默病；细小病毒感染；风疹病毒感染；接种后综合症；先天性风疹感染；EB病毒感染；流行性腮腺炎；Evan综合症；自身免疫性生殖腺衰竭；Sydenham舞蹈病；链球菌感染后肾炎；thromboangitisubiterans；甲状腺毒症；脊髓痨；脉络膜炎；巨细胞多肌痛；内分泌性眼病；慢性过敏性肺炎；干燥性角膜结膜炎；流行性角膜结膜炎；特发性肾炎综合征；微小病变性肾病；良性家族性和缺血-再灌注性损伤；视网膜自身免疫；关节炎症；支气管炎；慢性梗阻性气道疾病；硅肺病；口疮；口疮性口炎；动脉硬化性障碍；aspermiogenese；自身免疫性溶血；Boeck病；冷球蛋白血症；Dupuytren挛缩；晶状体过敏性眼内炎；过敏性肠炎；麻风结节性红斑；特发性面神经麻痹；慢性疲劳综合症；风湿性发热；Hamman-Rich病；感觉神经性听力丧失；haemoglobinuria paroxysmatica；性腺功能减退；区域性回肠炎；白细胞减少；传染性单核细胞增多症；贯性脊髓炎；原发性特发性黏液水肿；肾病；ophthalmia symphatica；肉芽肿性睾丸炎；胰腺炎；急性多神经根炎；坏疽性脓皮病；Quervain甲状腺炎；acquired spenic atrophy；抗精子抗体引起的不育；非恶性胸腺瘤；白癜风；SCID和EB病毒相关疾病；获得性免疫缺陷综合症(AIDS)；寄生虫病，如利什曼原虫；中毒性休克综合症；食物中毒；涉及T细胞侵润的病症；白细胞粘附缺陷；与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；涉及淋巴白细胞渗出的疾病；多器官损伤综合症；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；变应性神经炎；自身免疫性多内分泌病；卵巢炎；原发性黏液水肿；自身免疫性萎缩性胃炎；交感性眼炎；风湿性疾病；混合性结缔组织病；肾病综合症；胰岛炎；多内分泌腺衰竭；周围神经病；I型自身免疫性多腺体综合症；成人型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)；全秃；扩张型心肌病；获得性大疱性表皮松解症(EBA)；血色素沉着病；心肌炎；肾病综合症；原发性硬化性胆管炎；化脓性或非化脓性鼻窦炎；急性或慢性鼻窦炎；.筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦炎；嗜酸性粒细胞相关障碍，如嗜酸粒细胞增多、肺嗜酸细胞增多性浸润、嗜酸细胞增多-肌痛综合症、Loffler综合症、慢性嗜酸细胞性肺炎、热带性肺嗜酸细胞浸润症；支气管肺曲霉病；曲霉肿或包含嗜酸性细胞的肉芽肿；过敏反应；血清阴性脊椎关节炎；多内分泌自身免疫病；硬化性胆管炎；巩膜、巩膜外层慢性黏膜皮肤念珠菌病；Bruton综合症；婴儿一过性低丙种球蛋白血症；Wiskott-Aldrich综合症；共济失调性毛细血管扩张症；与胶原性疾病、风湿病、神经病、缺血性再灌注障碍、血压应答减少、血管功能障碍、antgiectasis、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴血管形成疾病相关的自身免疫性障碍；变应性过敏性障碍；肾小球肾炎；再灌注损伤；心肌或其他组织的再灌注损伤；具有基性岩性成分的皮肤病；急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性障碍；眼和眼眶炎性障碍；粒细胞输注相关综合症；细胞因子诱导的毒性作用；急性严重验证；慢性顽固性炎症；肾盂炎；肺硬变；糖尿病性视网膜病；糖尿病性大动脉障碍；动脉内增生；消化性溃疡；心瓣炎；子宫内膜异位症。

本文所用的术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞的破坏的物质。该术语旨在包含放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、Ra²²³、P³²及Lu的放射性同位素)；化疗剂，例如氨甲喋呤、adriamicin、长春花生物碱(长春花新碱、长春灭瘟碱、依托泊苷)、阿霉素、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂；酶及其片段，如核溶解酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或具有酶活性的毒素，包括其片段和/或变体；及本文公开的多种抗肿瘤剂、抗癌剂和化疗剂。本文描述其他细胞毒剂。杀肿瘤剂引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括：烷化剂，如噻替派(thiotepa)和

环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌酰硫烷(piposulfan)；氮丙啶，如benzodopa、卡波醌(carboquone)、meturedopa和uredopa；氮丙啶和methylamelamine，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚胺嗪(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和trimethylolomelamine；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是番荔枝内酯(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，

)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)

CPT-11(伊立替康(irinotecan)，

)、乙酰喜树碱、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷(teniposide)；cryptophycin(尤其是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、环磷酰胺(cholophosphamide)、磷雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆固醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；nitrosurea，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如enediyne antibiotics(例如棘孢霉素，尤其是棘孢霉素γ1(见例如Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A；esperamicin；以及新制癌菌素色基和相关色蛋白enediyne抗生素色基)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌素(carzinophilin)、chromomycinis、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、

阿霉素(包括吗啉基-阿霉素、氰基吗啉基-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、派来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链唑霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、氨甲喋呤、蝶酰三谷氨酸、三甲喋呤；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如盐酸环胞苷(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟脲苷(doxifluridine)、依诺他宾(enocitabine)、去氧氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素(anti-adrenal)，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素和美登木素柄型菌素；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-ethylhydrazide；甲基苄肼(procarbazine)；

多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；脱乙酰长春花碱

达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANETM Cremophor-free、紫杉醇的清蛋白改造纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，IL)和

doxetaxel(

Rorer，Antony，法国)；chloranbucil；吉西他滨(gemcitabine)

6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春灭瘟碱

铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春花新碱

奥沙利铂(oxaliplatin)；leucovovin；长春瑞滨(vinorelbine)

诺消灵(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基喋呤；伊班磷酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醛，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)

以上的任一种的可药用盐、酸或衍生物；以及以上的两种或多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春花新碱和强的松龙的联合治疗的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和leucovovin组合的治疗方案的缩写)。

此定义中还包含抗激素剂，其通常以系统治疗或全身治疗的形式发挥作用来调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用。它们可以是激素自身。实例包含：抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如三苯氧胺(包括

三苯氧胺)、

雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和

托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；发挥作用来抑制或关闭卵巢的药剂，例如，诸如

和

醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)的促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)和tripterelin；其他抗雄激素物质，如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；抑制芳香酶(其调节肾上腺中的雌激素产生)的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、

依西美坦(exemestane)、formestanie、法屈唑(fadrozole)、

伏氯唑(vorozole)、

来曲唑(letrozole)和

阿那曲唑(anastrozole)。此外，化疗剂的这种定义包含二磷酸盐，如氯曲磷酸盐(clodronate)(例如

或

)、

羟乙二磷酸盐(etidronate)、NE-58095、

唑来磷酸(zoledronic acid)/唑来磷酸盐(zoledronate)、

阿仑磷酸盐(alendronate)、

帕米磷酸盐(pamidronate)、

替鲁磷酸盐(tiludronate)或

利塞磷酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环胞嘧啶核苷类似物)；反义寡核苷酸，尤其是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因(例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R))表达的那些；疫苗，如疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、

疫苗和

疫苗；

拓扑异构酶1抑制剂；rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；及以上任一种的可药用盐、酸或衍生物。

在本文中使用时，“生长抑制剂”指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包含阻断细胞周期进程(在S期以外的地方)的药剂，如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包含长春碱(例如长春花新碱和长春灭瘟碱)、紫杉烷(taxane)及诸如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素的拓扑异构酶II抑制剂。停滞G1的药剂也涉及S期停滞，例如DNA烷化剂，如他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。其他信息可以见于TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel，编辑，第1章，标题″Cellcycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs″by Murakami等(WB Saunders：Philadelphia，1995)，尤其是第13页。紫杉烷(紫杉醇和紫杉萜(docetaxel))二者都是衍生自紫杉的抗癌药物。衍生自欧洲紫杉的紫杉萜(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(

Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和紫杉萜促进从微管蛋白二聚体组装微管，并通过阻止解聚来稳定微管，这导致细胞有丝分裂的抑制。

本文所用的“抗癌治疗”指在受试者中减少或抑制癌症的治疗。抗癌治疗的实例包含细胞毒性放射治疗，以及对受试者施用治疗有效量的细胞毒剂、化疗剂、生长抑制剂、癌症疫苗、血管发生抑制剂、前体药物、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、免疫抑制剂、止吐药、抗体或抗体片段、或止痛药。

本申请中所用的术语“前体药物”指药物活性物质的前体或衍生形式，与亲本药物相比，其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，且能够通过酶激活或转化为更具活性的亲本形式。见例如Wilman，“Prodrugs in CancerChemotherapy”Biochemical Society Transactions，14，375-382页，615thMeeting Belfast(1986)；和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach toTargeted Drug Delivery，”Directed Drug Delivery，Borchardt等，(编辑)，247-267页，Humana Press(1985)。前体药物包括但不限于：包含磷酸的前体药物、包含硫代磷酸的前体药物、包含硫酸的前体药物、包含肽的前体药物、D-氨基酸修饰的药物、糖基化的前体药物、包含β-内酰胺的前体药物、包含可选地取代的苯氧乙酰胺的前体药物或包含可选地取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶及可以转化为更具活性的细胞无毒性药物的其他5-氟胞嘧啶前体药物。可以衍生为在本发明中所使用的前体药物形式的毒害细胞的药物的实例包括但不限于那些上述化疗剂。

术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的作为胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通用术语。这类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子包含生长激素，如人生长激素(HGH)、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；表皮生长因子(EGF)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子(FGF)；促乳素；胎盘促乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如，TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所使用，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。

“细胞因子拮抗剂”指部分或完全阻断、抑制或中和至少一种细胞因子的生物学活性的分子。例如，细胞因子拮抗剂可以通过抑制细胞因子表达和/或分泌，或通过与细胞因子或细胞因子受体结合来抑制细胞因子活性。细胞因子拮抗剂包含与细胞因子或细胞因子受体结合的抗体、合成或天然序列肽、免疫黏附素和小分子拮抗剂。细胞因子拮抗剂可选地与细胞毒剂缀合或融合。示例性TNF拮抗剂是依那西普(etanercept)

英夫利昔单抗(infliximab)和阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA^TM)。

本文所用的术语“免疫抑制剂”指发挥作用来抑制或掩蔽所治疗的受试者的免疫系统的物质。这包含抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。免疫抑制剂的实例包含：2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利号4,665,077)；麦考酚酸酯(mycophenolatemofetil)，如

硫唑嘌呤(azathioprine)(

-巯基嘌呤；溴隐定(bromocryptine)；达那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所述)；MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，如皮质类固醇和糖皮质类固醇，例如强的松、诸如

(强的松龙磷酸钠)或

(强的松龙磷酸钠口服溶液)的强的松龙、甲基强的松龙和地塞米松；氨甲喋呤(口服或皮下)(

TREXALL^TM)；羟基氯喹/氯喹；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗-干扰素-γ、-β或-α抗体、抗-肿瘤坏死因子-α抗体(英夫利昔单抗或阿达木单抗)、抗-TNFα免疫黏附素(

依那西普)、抗-肿瘤坏死因子-β抗体、抗-白细胞介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；多克隆或pan-T抗体，或单克隆抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含LFA-3结合结构域的可溶性肽(WO 90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等，美国专利号5,114,721)；T-细胞受体片段(Offner等Science 251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway，Nature 341：482(1989)；和WO 91/01133)；T细胞受体抗体(EP 340,109)，如T10B9；环磷酰胺

氨苯砜；青霉胺

血浆置换；或静脉内免疫球蛋白(IVIG)。这些可以单独或相互组合使用，尤其是类固醇和另一免疫抑制剂的组合，或这类组合后跟随非类固醇药剂的维持剂量，以减少对类固醇的需要。

“止痛药”指发挥作用来在受试者中抑制或压制疼痛的药物。示例性止痛药包含非类固醇抗炎药(NSAID)，包括布洛芬(ibuprofen)

萘普生(naproxen)

乙酰水杨酸、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)和托美汀(tolmetin)，包括其盐和衍生物，以及用来减轻可存在的刺痛的多种其他药剂，包括抗惊厥剂(加巴喷丁(gabapentin)、苯妥英(phenyloin)、卡马西平(carbamazepine))或三环抗忧郁药。具体实例包含扑热息痛(acetaminophen)、阿司匹林、阿米替林(amitriptyline)卡马西平

苯妥英加巴喷丁

(E)-N-香草基-8-甲基-6-noneamid

或神经阻滞剂。

“皮质类固醇”指模拟或扩大天然存在的皮质类固醇的作用的具有类固醇的一般化学结构的几种合成或天然存在的物质中的任意一种。合成皮质类固醇的实例包含强的松、强的松龙(包括甲基强的松龙)、地塞米松、氟羟脱氢皮甾醇和倍他米松。

本文所用的“癌症疫苗”是在受试者中刺激针对癌症的免疫应答的组合物。癌症疫苗通常由对受试者而言可以是自体(来自自身)或异体(来自其他)的癌症相关物质或细胞(抗原)的来源，连同进一步刺激和加强针对该抗原的免疫应答的其他成分(例如佐剂)组成。癌症疫苗可以导致刺激受试者的免疫系统产生抗一种或几种具体抗原的抗体和/或产生攻击具有那些抗原的癌细胞的杀伤T细胞。

本文所用的“细胞毒性放疗”指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞的破坏的放射治疗。放射治疗可以包括例如外部束照射或放射性标记药剂(如抗体)治疗。该术语旨在包含放射性同位素(例如At²¹¹、I¹²¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、Ra²²³、p³²和Lu的放射性同位素)的使用。

“靶分子”指可以与本发明的蛋白质复合体结合的分子(根据斯卡查德分析，优选以高于1uM Kd的亲和力)。靶分子的实例包括但不限于血清可溶性蛋白质及其受体，如细胞因子和细胞因子受体、黏附素、生长因子及其受体、激素、病毒颗粒(例如RSV F蛋白质、CMV、StaphA、流感病毒、丙型肝炎病毒)、微生物(例如细菌细胞蛋白质、真菌细胞)、黏附素、CD蛋白及其受体。

“止吐药”是在受试者中减少或防止恶心的化合物。止吐化合物包含例如神经激肽-1受体拮抗剂；5HT3受体拮抗剂(如昂丹司琼(ondansetron)、格拉司琼(granisetron)、托烷司琼(tropisetron)和zatisetron)；GABAB受体激动剂，如巴氯芬(baclofen)；皮质类固醇，如地塞米松、

或抗多巴胺；酚噻嗪(例如丙氯拉嗪(prochlorperazine)、氟奋乃静(fluphenazine)、硫利达嗪(thioridazine)和美索达嗪(mesoridazine))；屈大麻酚；metroclopramide；多潘立酮(domperidone)；氟哌啶醇(haloperidol)；赛克利嗪(cyclizine)；氯羟安定(lorazepam)；丙氯拉嗪和左美丙嗪(levomepromazine)。

“受试者”是脊椎动物，如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于农场动物(如牛)、运动动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类、小鼠和大鼠。

除非另有说明，按照厂家的说明使用实施例中提到的市售试剂。在以下实施例和说明书通篇中通过ATCC检索号标识的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA。除非另有说明，本发明使用重组DNA技术的标准方法，如上文和以下教科书中所述的那些：Sambrook等，上文；Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience，NY，1989)；Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，Inc.，NY，1990)；Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(IRL Press，Oxford，1984)；Freshney，AnimalCell Culture，1987；Coligan等，Current Protocols in Immunology，1991。

在本说明书和权利要求书通篇中，单词“包含”或其词形变化形式将理解为意指包含所述整体或整体组，但不排除任意其他整体或整体组。

II.含卷曲螺旋的抗体和束缚抗体的构建

可以通过使用异二聚化结构域(例如卷曲螺旋)和/或系链来构建本文所述的蛋白质复合体。

异二聚化结构域的使用使得能够构建单个抗体内具有不同重链的抗体的相对纯的群体。具体而言，如上文所述，抗体通常包含各与相同的轻链配对的两条相同的重链。本发明的卷曲螺旋异二聚化结构域技术的使用使得不同抗体重链能够在单个抗体的形成中优选相互二聚化。因此，产生的抗体包含两条不同的重链，其中每一条通常(但无需)与相同的轻链配对。由于存在不同的重链，这种抗体内的每对重链和轻链具有不同的结合特异性，因此，可认为该抗体是多特异性抗体。还可以利用系链(单独或与卷曲螺旋技术组合)来改造本发明的抗体。系链可以将恒定轻链的C端与可变重链的N端连接，从而允许正确的轻链和重链结合，以及使用单个抗体编码质粒的重组抗体产生。下文进一步描述包含卷曲螺旋和/或系链的抗体。

A.卷曲螺旋结构域

用来产生本文所述蛋白质复合体的异二聚化结构域可以是α螺旋(例如右手α螺旋)，其可以通过与包含带相反电荷的残基的第二α螺旋结合来形成卷曲螺旋。为了产生异二聚体分子的同质或几乎同质的群体，异二聚化结构域必须具有超过同型二聚体的形成异二聚体的强烈偏好。在这方面，本文所述异二聚化结构域提供超过Fos/Jun亮氨酸拉链结构域的显著优势，因为Jun易形成同型二聚体。示例性α-螺旋异二聚化结构域显示于图1、2A和2B中。在具体实施方案中，第一卷曲螺旋结构域包含式I的七残基重复序列：

(X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇)_n(式I)，其中

X₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X₂、X₃和X₆各是任意氨基酸残基，

X₄是疏水性氨基酸残基，和

X₅和X₇各是带电荷氨基酸残基，

第二卷曲螺旋结构域包含式II的七残基重复序列：

(X’₁X’₂X’₃X’₄X’₅X’₆X’₇)_n(式II)，其中

X’₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X’₂、X’₃和X’₆各是任意氨基酸残基，

X’₄是疏水性氨基酸残基，和

X’₅和X’₇各是带电荷氨基酸残基。

在式I和式II二者中，n大于或等于2(例如大于或等于3或4)，且小于或等于100。在一个实施方案中，n在2至20之间。

第一卷曲螺旋结构域的X₅和X₇残基和第二卷曲螺旋结构域的X’₅和X’₇残基可以具有(但无需具有)相同的电荷。因此，在一个实例中，第一卷曲螺旋结构域的X₅和X₇残基是碱性残基，而第二卷曲螺旋结构域的X’₅和X’₇残基是酸性残基。在另一实例中，第一卷曲螺旋结构域中的X₅是碱性残基，而第一卷曲螺旋结构域中的X₇是酸性残基。在此实例中，第二卷曲螺旋结构域在X’₅位具有碱性残基，在X’₇位具有酸性残基。如图1中所示，第一卷曲螺旋结构域的X₅残基和第二卷曲螺旋结构域的X’₇残基之间，以及第一卷曲螺旋结构域的X₇残基和第二卷曲螺旋结构域的X’₅残基之间存在离子相互作用。在相关实例中，第一卷曲螺旋结构域中的X₅是酸性残基，第一卷曲螺旋结构域中的X₇是碱性残基，第二卷曲螺旋结构域中的X’₅是酸性残基，第二卷曲螺旋结构域中的X’₇是碱性残基。此外，包含在第一和第二卷曲螺旋结构域二者的X₁/X’₁位具有天冬氨酸的至少一个七残基重复序列可以用来确保第一和第二卷曲螺旋结构域的平行取向。

七残基重复序列中的疏水性残基优选选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。虽然脯氨酸是疏水性氨基酸，但在一个实施方案中，其不包含在式I或式II的卷曲螺旋结构域中，因为氨基酸序列中存在脯氨酸可以限制其形成α螺旋结构的能力。此外，在其他实施方案中，式I或式II的卷曲螺旋结构域不包含甘氨酸残基，这是因为甘氨酸由于其构象柔性而不易采取受限制的α螺旋结构。可以包含在式I或式II的卷曲螺旋结构域中的带电荷残基包含赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，其中赖氨酸、精氨酸和组氨酸是碱性残基，而天冬氨酸和谷氨酸是酸性残基。

本文所述抗体的构建可以使用式I的卷曲螺旋结构域和式II的卷曲螺旋结构域(第一和第二卷曲螺旋结构域)，其中第一卷曲螺旋结构域与抗体的第一恒定结构域(例如第一重链的CH3)连接，第二卷曲螺旋结构域与抗体的第二恒定结构域(例如第二重链的CH3)连接。该连接可以是通过肽键直接连接，或者可以通过接头序列连接。接头可以与一条氨基酸序列(例如恒定区)的C端和另一氨基酸序列(例如卷曲螺旋结构域)的N端形成肽键。接头可以足够长，以允许从抗体恒定区切割卷曲螺旋结构域(如本文其他地方进一步描述)，但足够短，以赋予两个抗体恒定区(例如两个重链恒定区)的异二聚体结合。因此，接头可以是长度为2至100个氨基酸的氨基酸序列。在具体实施方案中，接头长度在2至50个氨基酸之间，例如长度为3、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。接头可以由例如中性极性或非极性氨基酸组成。

B.多特异性抗体

应理解，这类抗体的可变结构域可以衍生自几种方法。例如，本发明的抗体的可变结构域可以与本领域已知的现有抗体相同。

可以用卷曲螺旋结构域来产生多特异性抗体(与至少两种抗原或与同一抗原上的至少两个表位结合的抗体)。在一个实例中，该多特异性抗体是双特异性抗体。通常，在天然存在的IgG抗体中，抗体中每对重链和轻链的可变区相同。本发明的卷曲螺旋结构域的使用使得抗体内的两条重链可以不同，产生具有具有不同结合特异性的抗原结合结构域的抗体。具体而言，每条重链上(例如CH3的C端)的卷曲螺旋异二聚化结构域促进不同重链间的结合。可选地，通过可被切割的接头将卷曲螺旋结构域连接至重链恒定区，使得可在组装后从抗体去除该卷曲螺旋。

图3中显示示例性双特异性抗体的示意图，该示例性双特异性抗体包含两条不同的重链(HC1和HC2)和两条相同或共同的轻链。图3中的示例性双特异性抗体还包含异二聚体卷曲螺旋。该抗体还在各卷曲螺旋异二聚化结构域的N端包含Lys-C内肽酶切割位点，该位点允许在抗体组装完成后从该抗体去除卷曲螺旋。此示例性双特异性抗体的两条重链都还在铰链区中包含K222A突变来去除Lys-C内肽酶切割位点，使得Lys-C内肽酶处理仅导致去除卷曲螺旋，而不导致重链恒定区内的切割。

虽然该示例性抗体在铰链区中包含去除Lys-C内肽酶切割位点的突变，但Lys-C内肽酶切割位点的位置可以取决于所使用的抗体序列而不同。本领域技术人员可以容易地扫描抗体序列来确定重链或轻链序列中是否存在需要去除，以避免在去除卷曲螺旋或系链序列时切割抗体自身的任何切割位点(例如Lys-C内肽酶切割位点)。

此外，可以用本文所述方法构建多特异性抗体，其中重链缺乏CH1结构域(VH直接与铰合部-CH2结构域连接)，对应的轻链缺乏CL结构域。这类抗体可以用来使不同抗原聚在一起或用来结合B细胞和T细胞。

C.单臂抗体

还可以用异二聚化卷曲螺旋结构域来产生单臂抗体。图4A中显示了说明单臂抗体实例的示意图。图4A中所示的示例性抗体包含轻链(LC)、一条全长重链(HC1)和缺乏VH和CH1结构域及部分铰链区的第二重链(HC2)。HC1和HC2都在C端包含卷曲螺旋异二聚化结构域。此实例中的HC1序列在铰链区中包含K222A突变来去除Lys-C内肽酶切割位点，使得Lys-C切割仅去除卷曲螺旋，而不导致重链内的切割。

D.缀合蛋白质复合体

还可以用卷曲螺旋异二聚化结构域来产生蛋白质复合体，如抗体(例如单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、单臂抗体或束缚抗体)，其中通过与细胞毒剂缀合来修饰恒定区。例如，卷曲螺旋异二聚化结构域使得能够构建这样的抗体，其中重链恒定区之一(HC1或HC2)包含允许与细胞毒剂缀合的修饰，而另一重链恒定区不包含。在一个实例中，HC1与细胞毒剂缀合，而HC2不缀合。图4B中显示了说明缀合抗体实例的示意图。该示例性抗体包含两条全长重链和两条相同的轻链(共同轻链)，以及卷曲螺旋。如星号所示，重链之一已与细胞毒剂(例如毒素)缀合。类似地，在备选抗体构建体中，轻链恒定区之一可以与细胞毒剂缀合，而另一轻链恒定区不缀合(例如LC1与细胞毒剂缀合，而LC2不缀合)。

在一个具体实例中，可以修饰抗体恒定区来引入亲电子部分，其可以与用来将细胞毒剂与抗体缀合的接头试剂上或细胞毒剂自身上的亲核取代基反应。可以例如用高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，以形成可与接头试剂或细胞毒剂的胺基反应的醛基或酮基。产生的亚胺希夫碱基团可以形成稳定连接，或者可以例如通过氢硼化物试剂还原，以形成稳定的胺连接。细胞毒剂上的亲核基团包括但不限于能够与抗体区和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，该接头试剂包括：(1)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。

E.束缚抗体

本发明还提供用系链构建的蛋白质复合体，例如抗体可以具有将恒定轻链的C端与可变重链的N端连接的系链。系链辅助轻链和重链的正确结合(即轻链与其所束缚的重链的结合)。可以在有或无上文所述异二聚化结构域的情况下构建这种束缚抗体。图5中显示包含卷曲螺旋的示例性束缚抗体的示意图。图5中所示的示例性抗体包含两条不同的重链(HC1和HC2)，以及两条不同的轻链(LC1和LC2)。还可以将束缚抗体构建为包含共同轻链和/或共同重链。在示例性抗体中，HC1和HC2包含上文所述去除Lys-C内肽酶切割位点的铰链区中的K222A突变，以及其C端的卷曲螺旋异二聚化结构域。

束缚抗体中加入异二聚化结构域辅助重链/轻链复合体聚在一起，从而减少或消除这类复合体的同二聚化。在具体实施方案中，系链足够长，以跨越组装的抗体中可变重链N端和恒定轻链C端之间的距离，以允许正确的轻链/重链结合，但足够短，以防止链间结合(即轻链与其不束缚的重链的结合)。在图6中所示的实例中，可变重链N端和恒定轻链C端之间的距离约为

肽键跨越约

在此实例中，系链长度应为约22个氨基酸，以跨越可变重链N端和恒定轻链C端之间的距离。恒定轻链C端和可变重链N端之间的距离可以在抗体间不同，因此，系链的长度也可以在抗体间不同。测试了长度为22、23和26个氨基酸的系链，一般而言，15-50个氨基酸的系链是有效的。系链可以保持柔韧而不形成二级结构，为了此目的，可以使用包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基的系链。系链可以仅由G和S残基组成，但也可以包含其他残基，只要该系链保持柔韧来允许抗体的轻链和重链的组装。在具体实施方案中，系链包含GGS重复序列(图5)。对于长度为15-30个氨基酸的系链，在一个实施方案中，系链包含至少5个GGS重复序列。本文所述和具有SEQ ID NO：14的序列的示例性系链包含8个GGS重复序列，且在N端和C端都包含附加的甘氨酸残基。其他示例性系链序列显示于图7B中，且在其N端和C端包含弗林蛋白酶切割位点或Lys-C内肽酶切割位点。

F.系链和接头序列的切割

一旦蛋白质复合体已组装，可以不再需要系链，可以根据需要从该抗体切割系链。可以用见于系链中，但不见于抗体序列中的切割位点来去除系链。类似地，一旦抗体已组装，可以不再需要卷曲螺旋，且可以根据需要从抗体切割卷曲螺旋。

图7A显示系链以及将卷曲螺旋连接至抗体的接头序列中的示例性切割位点的位置。一般而言，系链中的切割位点定位在或靠近系链序列的C端和N端，或定位在处于或靠近抗体和系链的连接位点的抗体序列内。接头的切割位点一般定位在接头序列(或卷曲螺旋)的N端，或定位在处于或靠近抗体和接头(或卷曲螺旋)的连接位点的抗体序列中。如果用Lys-C内肽酶(例如在恒定重链C端的赖氨酸残基处)切割接头，那么可以需要修饰抗体序列来去除Lys-C内肽酶切割位点。这种修饰的实例是将铰链区中的赖氨酸突变为丙氨酸(例如本文所述示例性抗体中的K222A，Kabat编号系统；K222A，EU编号系统)。在选择不同的切割剂用于本发明时，可以需要其他切割位点的修饰，并以相似的方式产生。

在特定位点切割氨基酸序列是本领域的标准方法，且可以涉及酶切割、化学切割或自体加工。例如可以用内肽酶从蛋白质切割系链或接头。示例性内肽酶非限制性地包括Lys-C、Asp-N、Arg-C、V8、Glu-C、凝血酶、Genenase(枯草蛋白酶BPN’的变体)、因子Xa、TEV(烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶)、肠激肽、HRV C3(人鼻病毒C3蛋白酶)、激肽原酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，其全都是市售可得的(例如从Boehringer Mannheim、Thermo Scientific或New England Biolabs)。Lys-C在赖氨酸残基的羧基侧切割，V8和Glu-C在谷氨酸残基的羧基侧切割，Arg-C在精氨酸残基的羧基侧切割，Asp-N在天冬氨酸残基的氨基侧切割，胰凝乳蛋白酶在酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和亮氨酸残基的羧基侧切割，胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸的羧基侧切割。TEV在“Gln”和“Gly”残基之间切割氨基酸序列GluAsnLeuTyrPheGlnGly(SEQ ID NO：19)。这类酶的使用是本领域的标准方法，且可从厂家获得流程。

备选地，可以用化学药品(如羟胺)从蛋白质切割系链或接头。羟胺切割天冬酰胺-甘氨酸肽键。如果用羟胺来从蛋白质切割系链和接头，可需要突变蛋白质中的几个甘氨酸或天冬酰胺残基来避免片段化该蛋白质。

切割肽键的许多其他化学药品为本领域已知。例如，N-氯代琥珀酰亚胺在色氨酸残基的C端一侧切割(Shechter等，Biochemistry 15：5071-5075

(1976))。N-溴代琥珀酰亚胺和溴化氰也在色氨酸残基的C端一侧切割。此外，可以用2-硝基氰硫基苯甲酸或有机磷来在半胱氨酸残基的N端一侧切割蛋白质(见例如EP 0339217)。

还可以在二碱基位点(例如精氨酸-精氨酸、赖氨酸-精氨酸或赖氨酸-赖氨酸位点)切割接头或系链。在二碱基位点切割的酶为本领域已知，且包括例如N-精氨酸二碱基转化酶(Chow等，JBC 275：19545-19551(2000))和枯草蛋白酶样蛋白原转化酶，如弗林蛋白酶(PC1)、PC2和PC3(PeptideBiosynthesis and Processing(Fricker编辑)1-16页，CRC Press，Boca Raton，FL中的Steiner(1991)；Muller等，JBC 275：39213-39222，(2000))。

还已知蛋白质自体加工。例如，Hedgehog蛋白质通过该蛋白质内的蛋白水解活性在Gly.AspTrpAsnAlaArgTrp.CysPhe切割位点(SEQ IDNO：20)切割。接头或系链序列中可以包含自我蛋白酶解位点。

G.其他蛋白质特征

本发明的蛋白质可以包含来自任意来源(包括人或鼠来源)的序列，或其组合。蛋白质的某些部分(例如高变区)的序列还可以是人工序列，如通过筛选包含随机序列的文库(例如噬菌体展示文库)鉴定的序列。

在抗体包含来自不同来源的序列的情况下，该抗体可以是“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。这类嵌合抗体可以例如包含鼠可变区(或其部分)和人恒定区。

可选地，嵌合抗体还可以是“人源化”抗体，其包含衍生自非人抗体的最少序列。人源化抗体通常是这样的人抗体(受体抗体)，其中用来自具有希望的抗体特异性、亲和力和容量的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。产生这些修饰来进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个(且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，而全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。可选地，人源化抗体还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详情见Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

更具体而言，人源化抗体可以具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变区。可以基本上按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代对应的人抗体序列来进行人源化。因此，“人源化”抗体是这样的嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中用对应的来自非人物种的序列取代了基本上少于完整的人可变结构域。实际上，人源化抗体通常是这样的人抗体，其中用来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代一些CDR残基，且可能取代一些FR残基。

用于产生人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对减低抗原性非常重要。按照所谓的“最佳适合”法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物的可变结构域序列。然后接受最接近于啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架。相同的构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immnol.151：2623(1993))。

保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性来人源化抗体也很重要。为了达到此目的，按照示例性方法，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可得，并为本领域技术人员所熟悉。说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序也可得。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列选择和组合FR残基，使得达到希望的抗体特征，如增加的对一种或多种靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最实质地涉及影响抗原结合。

III.载体、宿主细胞和重组方法

为了重组产生本发明的抗体，分离编码它的核酸并插入可复制载体进行进一步克隆(DNA的扩增)或进行表达。用常规方法(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码抗体的DNA。许多载体是可得的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞具有原核或真核(通常是哺乳动物，但也包括真菌(例如酵母)、昆虫、植物和来自其他多细胞生物的有核细胞)来源。应理解，任意同种型的恒定区(包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区)都可以用于此目的，且这类恒定区可以获自任意人种或动物物种。

a.用原核宿主细胞产生抗体

i.载体构建

可以用标准重组技术获得编码本发明的抗体的多肽成分的多核苷酸序列。可以从诸如杂交瘤细胞的产抗体细胞分离和测序希望的多核苷酸序列。备选地，可以用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，即可将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。可以将本领域可得和已知的许多载体用于本发明的目的。适当的载体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸的大小和待用该载体转化的具体宿主细胞。取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者)及其与它所驻留的具体宿主细胞的相容性，每个载体包含多种成分。载体成分通常包括但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。

通常，将包含衍生自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体用于这些宿主。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此提供了用于鉴定转化细胞的简便手段。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体还可以包含或修饰为包含微生物可以用其来表达内源蛋白质的启动子。Carter等，美国专利号5,648,237中详细描述了用来表达具体抗体的pBR322衍生物的实例。

此外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主相关的转化载体。例如，诸如λGEM.TM.-11的噬菌体可以用于产生可用来转化诸如大肠杆菌LE392的易感宿主细胞的重组载体。

本发明的表达载体可以包含编码多肽成分中的每一种的两个或多个启动子-顺反子对。启动子是定位在顺反子上游(5’)的不翻译的调节序列，其调节该顺反子的表达。原核启动子通常分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子是响应培养条件的变化(例如营养物的存在或却非或温度变化)而起始其控制下的顺反子的提高水平的转录的启动于。

多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是公知的。可以通过经限制酶消化从来源DNA去除启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体来将所选择的启动子与编码重链或轻链的顺反子DNA有效连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可以用来指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许所表达的靶基因的更多的转录和更高的产率。

适合用于原核宿主的启动子包含PhoA启动子、β-galactamase和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统及杂合启动子，如tac或trc启动子。但是，在细菌中具有功能的其他启动子(如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适宜的。已公开了它们的核苷酸序列，从而使得技术人员能够用接头或衔接子提供任意需要的限制位点来将它们连接至编码靶轻链和靶重链的顺反子(Siebenlist等，(1980)Cell 20：269)。

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子包含指导所表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列成分。通常，信号序列可以是载体的成分，或者它可以是插入载体中的靶多肽DNA的部分。选择用于本发明的目的的信号序列应是宿主细胞可识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列取代该信号序列。在本发明的一个实施方案中，用于表达系统的两个顺反子中的信号序列是STIII信号序列或其变体。

另一方面，本发明的免疫球蛋白的产生可以发生在宿主细胞的细胞质中，因此无需在各顺反子内存在分泌信号序列。在这方面，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠，并组装形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌trxB菌株)提供有利于二硫键形成的胞质条件，从而允许所表达的蛋白质亚基的正确折叠和组装(Proba和Pluckthun，Gene，159：203(1995))。

适合用于表达本发明的抗体的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。有用的细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌)、芽孢杆菌属(Bacilli)(例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and MolecularBiology，第2卷(Washington，D.C.：American Society for Microbiology，1987)，1190-1219页；ATCC保藏号27，325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其他菌株及其衍生物，如大肠杆菌294(ATCC 31，446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31，537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31，608)也适宜。这些实例是说明性的而不是限制性的。用于构建上述细菌中任一种的具有确定基因型的衍生物的方法为本领域已知，并描述于例如Bass等，Proteins 8：309-314(1990)中。通常有必要考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，在用诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410的公知质粒来提供复制子时，可以适宜地用大肠杆菌、沙雷氏菌属(Serratia)物种或沙门氏菌属(Salmonella)物种作为宿主。通常，宿主细胞应分泌最小量的蛋白水解酶，且可希望在细胞培养物中掺入附加的蛋白酶抑制剂。

ii.抗体产生

用上述表达载体转化宿主细胞，并在根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望的序列的基因的需要改进的常规营养培养基中培养。

转化意指将DNA引入原核宿主中，使得DNA可作为染色体外元件复制或通过染色体整合体(integrant)复制。取决于所使用的宿主细胞，用适合于这类细胞的标准技术进行转化。通常将利用氯化钙的钙处理用于包含实质性细胞壁障碍的细菌细胞。用于转化的另一种方法利用聚乙二醇/DMSO。所使用的另一种技术是电穿孔。

在本领域已知且适合用于培养所选择的宿主细胞的培养基中培养用于产生本发明的多肽的原核细胞。适宜的培养基的实例包括添加了必需的营养补充物的Luria培养基(LB)。在一些实施方案中，培养基还包含根据表达载体的构建选择的选择剂，以选择性允许包含表达载体的原核细胞的生长。例如，向培养基中加入氨苄青霉素使表达氨苄青霉素抗性基因的细胞生长。

还可以按适当浓度包含除碳、氮和无机磷酸盐来源以外的任意必需补充物，其单独引入或作为与另一补充物或培养基的混合物(如复合氮源)引入。可选地，培养基可以包含选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的一种或多种还原剂。

在适宜的温度培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌生长，例如，优选的温度在从约20℃至约39℃的范围内，更优选从约25℃至约37℃，甚至更优选在约30℃。主要取决于宿主生物，培养基的pH可以是从约5至约9的范围内的任意pH。对于大肠杆菌，pH优选从约6.8至约7.4，且更优选约7.0。

如果将诱导型启动子用于本发明的表达载体中，则在适合用于激活该启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一方面，用PhoA启动子控制多肽的转录。因此，在用于诱导的磷酸盐限制培养基中培养转化的宿主细胞。优选地，该磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(见例如Simmons等，J.Immunol.Methods(2002)，263：133-147)。如本领域已知，可以根据所利用的载体构建体使用多种其他诱导物。

在一个实施方案中，所表达的本发明的多肽分泌进入宿主细胞周质，且从宿主细胞周质回收。蛋白质回收通常涉及破裂微生物，通常通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的手段来破裂。一旦细胞破裂，即可通过离心或过滤去除细胞碎片或整个细胞。可以例如通过亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。备选地，蛋白质可以转运进入培养基，并从培养基中分离。可以从培养物去除细胞，并过滤和浓缩培养物上清来进一步纯化所产生的蛋白质。可以用公知的方法(如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定)进一步分离和鉴定所表达的多肽。

在本发明的一方面，通过发酵法大量进行抗体产生。可获得多种大规模补料分批发酵方法来进行重组蛋白质的产生。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐用搅拌桨来分配氧和营养物，尤其是葡萄糖(优选的碳/能量来源)。小规模发酵通常指体积容量不超过约100升，且可以在从约1升至约100升的范围内的发酵罐中的发酵。

在发酵法中，通常在细胞在适宜条件下生长至希望的密度(例如OD550为约180-220)后起始蛋白质表达的诱导，细胞在该阶段处于早稳定期。如本领域已知和上文所述，根据所利用的载体构建体，可以使用多种诱导物。可以在诱导前培养细胞较短时期。虽然可以使用更长或更短的诱导时间，但通常诱导细胞约12-50小时。

为了改善本发明的多肽的产率和质量，可以修改多种发酵条件。例如，为了改善分泌性抗体多肽的正确组装和折叠，可以用过量表达伴侣蛋白质(如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有分子伴侣活性的肽基脯氨酰顺反异构酶))的附加质粒来共转化宿主原核细胞。已显示伴侣蛋白质促进细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的正确折叠和可溶性(Chen等，(1999)J.Biol.Chem.274：19601-19605；Georgiou等，美国专利号6,083,715；Georgiou等，美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275：17100-17105；Ramm和Pluckthun，(2000)J.Biol.Chem.275：17106-17113；Arie等，(2001)Mol.Microbiol.39：199-210)。

为了最小化所表达的异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的那些)的蛋白水解，可以将某些蛋白水解酶缺陷的宿主菌株用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株来在编码已知的细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、Degp、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合)的基因中产生一个或多个遗传突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株是可得的，且描述于例如Joly等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2773-2777；Georgiou等，美国专利号5,264,365；Georgiou等，美国专利号5,508,192；Hara等，Microbial Drug Resistance，2：63-72(1996)中。

在一个实施方案中，用蛋白水解酶缺陷，且用过量表达一种或多种伴侣蛋白质的质粒转化的大肠杆菌菌株作为本发明的表达系统中的宿主细胞。

iii.抗体纯化

可以利用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下方法是适宜的纯化方法的示例：免疫亲和柱或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或阳离子交换树脂(如DEAE)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

一方面，用固定在固相上的A蛋白进行本发明的全长抗体产物的免疫亲和纯化。A蛋白是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的41kD细胞壁蛋白质，其以高亲和力与抗体的Fc区结合。Lindmark等，(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13。优选A蛋白所固定的固相是包含玻璃表面或二氧化硅表面的柱，更优选可控孔度玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，已在防止污染物的非特异性黏附的尝试中用诸如甘油的试剂包被柱。

作为纯化的第一步，将衍生自上述细胞培养物的制备物应用在固定了A蛋白的固相上，以允许目的抗体与A蛋白的特异性结合。然后洗涤固相，以去除与固相非特异性结合的污染物。可以通过洗脱在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中来从固相回收目的抗体。示例性离液剂和温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。从柱(例如mAbSure柱)洗脱后，将抗体稀释在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中，以保持洗脱后的抗体的稳定性，并允许通过Lys-C内肽酶有效去除卷曲螺旋。

b.用真核宿主细胞产生抗体

载体成分通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

i.信号序列成分

用于真核宿主细胞的载体可以包含信号序列或在成熟蛋白质或目的多肽的N端具有特异性切割位点的其他多肽。所选择的异源信号序列可以是宿主细胞识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列，以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹gD信号)是可得的。这类前体区的DNA与编码抗体的DNA符合读框地连接。

ii.复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点成分。例如，通常可以使用SV40起点，但只是因为它包含早期启动子。

iii.选择基因成分

表达载体和克隆载体可以包含选择基因，其也称为选择标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质，该蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素)的抗性；(b)弥补相关的营养缺陷；或(c)提供从复合培养基不可得的关键营养物。

选择方案的一个实例是利用药物来阻断宿主细胞的生长。异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因此从选择方案存活下来。这种显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适合用于哺乳动物细胞的选择标记的另一实例是使得能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的那些，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过在包含氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性抑制剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定DHFR选择基因转化的细胞。在利用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。

备选地，可以通过包含用于该选择标记的选择剂的培养基(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418)中的细胞生长来选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白质和另一选择标记(如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(尤其是包含内源DHFR的野生型宿主)。见例如美国专利号4,965,199。

iv.启动子成分

表达载体和克隆载体通常包含宿主生物可识别，且与抗体多肽核酸有效连接的启动子。已知真核生物的启动子序列。基本上所有真核基因都具有定位在转录起始位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域。见于许多基因的转录起点上游70至80个碱基的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任意核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，其可以是将poly A尾添加至编码序列3’端的信号。所有这些序列都适宜地插入真核表达载体中。

例如通过获自病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40))基因组、获自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)或获自热休克启动子的启动子来控制哺乳动物宿主细胞中来自载体的抗体多肽转录，只要这类启动子与宿主细胞系统相容。

作为SV40限制片段方便地获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该限制片段还包含SV40病毒复制起点。作为HindIII E限制片段方便地获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利号4,419,446中公开了用牛乳头状病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中描述了此系统的修改。备选地，可以用劳斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

v.增强子元件成分

可以通过将增强子序列插入载体来增加高等真核生物的编码抗体多肽的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(例如珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素基因)的许多增强子序列。另外，可以使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期一侧(bp 100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期一侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。用于增强真核启动子的激活的元件的描述还见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可以在抗体多肽编码序列5’或3’的位置连接入载体，只要达到增强，但通常定位在启动子5’的位点。

vi.转录终止成分

用于真核宿主细胞的表达载体通常还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和(偶尔)3’非翻译区获得这类序列。这些区域包含转录为编码抗体的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酰化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止成分是牛生长激素聚腺苷酰化区。见WO 94/11026及其中公开的表达载体。

vii.宿主细胞的选择和转化

适合用于克隆或表达本文的载体中的DNA的宿主细胞包含本文所述高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。培养脊椎动物细胞的繁殖(组织培养)已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CVI细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或针对在悬浮培养物中生长亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVlATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。

用上述用于抗体产生的表达载体或克隆载体转化宿主细胞，并在根据诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望的序列的基因的需要改进的常规营养培养基中培养。

viii.培养宿主细胞

可在多种培养基中培养用来产生本发明的抗体的宿主细胞。诸如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM，Sigma)的市售培养基适合用于培养宿主细胞。此外，可以用Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任意培养基作为宿主细胞的培养基。可以根据需要向任意这些培养基中补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能量来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任意其他必需的补充物。培养条件(如温度、pH等)是之前用于选择用于表达的宿主细胞的那些，且对普通技术人员而言将是显而易见的。

ix.抗体的纯化

使用重组技术时，抗体可以在胞内产生，或者直接分泌进入培养基。如果抗体在胞内产生，作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。多肽分泌进入培养基时，通常首先用市售蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意上述步骤中包含蛋白酶抑制剂(如PMSF)来抑制蛋白水解，且可以包含抗生素来防止外来污染物的生长。

可以用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化从细胞制备的抗体组合物，亲和层析是优选的纯化技术。A蛋白作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任意免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。可以用A蛋白来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。建议G蛋白用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常是琼脂糖，但其他基质也是可得的。与用琼脂糖可以达到的流速和处理时间相比，机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允许更快的流速和更短的处理时间。抗体包含CH3结构域时，用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。取决于待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其他技术(如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀)也是可得的。

在一个实施方案中，通过洗脱在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中来从柱的固相回收目的抗体。示例性离液剂和温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。

任意一个或多个初步纯化步骤后，可以对包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，该层析使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。

x.使用杆状病毒的抗体产生

可以通过用例如lipofectin(可从GIBCO-BRL购得)将编码抗体或抗体片段和BaculoGold^TM病毒DNA(Pharmingen)的质粒共转染入昆虫细胞(如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如Sf9细胞；ATCC CRL1711)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2细胞)来产生重组杆状病毒。在具体实例中，在包含于杆状病毒表达载体内的附加表位的上游融合抗体序列。这类附加表位包含聚组氨酸标记。可以利用多种质粒，包括衍生自诸如pVL1393(Novagen)或pAcGP67B(Pharmingen)的市售质粒的质粒。简言之，可以用与5’和3’区互补的引物PCR扩增编码抗体或其片段的序列。5’引物可以掺入侧翼(选择的)限制酶位点。然后可以用选择的限制酶消化产物，并亚克隆入表达载体。

用表达载体转染后，在28℃孵育宿主细胞(例如Sf9细胞)4-5天，收获释放的病毒，并用于进一步扩增。可以按例如O’Reilley等(Baculovirusexpression vectors：A Laboratory Manual.Oxford：Oxford U niversityPress(1994))所述进行病毒感染和蛋白质表达。

然后可以例如通过如下Ni²⁺螯合物亲和层析来纯化所表达的带有聚组氨酸标记的抗体。可以按Rupert等(Nature 362：175-179(1993)所述从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简言之，洗涤Sf9细胞，重悬在超声处理缓冲液(25mL HEPES pH 7.9；12.5mM MgCl₂；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中，并在冰上超声处理两次20秒。通过离心澄清超声处理产物(sonicate)，将上清50倍稀释在上样缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油；pH 7.8)中，并滤过0.45μm滤器。按5mL柱床体积制备Ni²⁺-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen购得)，用25mL水洗涤，并用25mL上样缓冲液平衡。按0.5mL/分钟将过滤的细胞提取物上样在柱上。用上样缓冲液洗涤柱至基线A₂₈₀，在该时间点开始级分收集。然后，用洗脱非特异性结合的蛋白质的第二洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mM NaCl；10％甘油；pH 6.0)洗涤柱。再次达到A₂₈₀基线后，用含0至500mM咪唑梯度的第二洗涤缓冲液冲洗柱。收集1mL级分，并通过SDS-PAGE和银染或用与碱性磷酸酶缀合的Ni²⁺-NTA(Qiagen)进行的Western印迹来分析。混合包含洗脱的带有His₁₀标记的抗体的级分，并对上样缓冲液透析。

备选地，可以用已知的层析技术(包括例如A蛋白或G蛋白柱层析)进行抗体的纯化。可以通过洗脱在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中来从柱的固相回收目的抗体。示例性离液剂和温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、精氨酸、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。

c.优化的纯化技术

下文显示可以用于包含卷曲螺旋的抗体的一种具体的纯化方法。

除精氨酸外，可以在最初的A蛋白柱步骤后用于以上纯化流程的其他离液剂或温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。在从最初的包含A蛋白的柱(例如mAbSure柱)洗脱后，将抗体稀释在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中，保持洗脱后的抗体的稳定性，并允许通过Lys-C内肽酶有效去除卷曲螺旋。

IV.缀合蛋白质

本发明还提供缀合蛋白质，如缀合抗体或免疫缀合物(例如“抗体-药物缀合物”或“ADC”)，其包含本文所述抗体中的任一种(例如包含卷曲螺旋的抗体、束缚抗体或按照本文所述方法产生的抗体)，其中轻链或重链的恒定区之一与化学分子(如染料或细胞毒剂，如化疗剂、药物、生长抑制剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)缀合。具体而言，如本文所述，卷曲螺旋结构域的使用使得能够构建包含两条不同重链(HC1和HC2)以及两条不同轻链(LC1和LC2)的抗体。用本文所述方法构建的免疫缀合物可以包含与仅一条重链(HC1或HC2)或仅一条轻链(LC1或LC2)的恒定区缀合的细胞毒剂。此外，由于免疫缀合物可以具有仅附着于一条重链或轻链的细胞毒剂，相对于具有附着于两条重链或轻链的细胞毒剂的抗体的施用，对受试者施用的细胞毒剂的量减少。减少对受试者施用的细胞毒剂的量限制了与细胞毒剂相关的不良副作用。

抗体-药物缀合物在局部递送细胞毒剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos和Epenetos，Anticancer Research19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz和Springer，Adv.Drg.Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利号4,975,278))中的用途允许靶向递送药物部分至肿瘤，并在胞内累积，其中全身施用这些未缀合的药剂可导致对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin等，Lancet(Mar.15，1986)：603-605(1986)；Monoclonal Antibodies‘84：Biological AndClinical Applications，A.Pinchera等(编辑)，475-506页中的Thorpe，(1985)“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”)。因此力求以最小的毒性达到最大的功效。已报道了多克隆抗体和单克隆抗体都可以用于这些策略(Rowland等，Cancer Immunol.Immunother.21：183-187(1986))。用于这些方法中的药物包括柔红霉素、阿霉素、氨甲喋呤和脱乙酰长春花碱(Rowland等，(1986)上文)。用于抗体-毒素缀合物中的毒素包括细菌毒素，如白喉毒素；植物毒素，如蓖麻毒蛋白；小分子毒素，如格尔德霉素(Mandler等，Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler等，Bioorganic&Med.Chem.Letters10：1025-1028(2000)；Mandler等，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))；美登木素生物碱(EP 1391213；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996))；和棘孢霉素(Lode等，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制来发挥其细胞毒害和细胞抑制作用。在与大的抗体或蛋白受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或低活性。

本文(例如上文)描述了用于产生免疫缀合物的化疗剂。可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。可获得多种放射性核素用于放射性缀合抗体的产生。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。用多种双功能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以按Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。见例如WO94/11026。

本文还考虑抗体和一种或多种小分子毒素(如棘孢霉素、美登木素生物碱、多拉司他汀、aurostatin、单端孢霉烯和CC1065)及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。

i.美登素和美登木素生物碱

在一些实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个美登木素生物碱分子缀合的本发明的抗体(全长或片段)。

美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初分离自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)(美国专利号3,896,111)。随后发现某些微生物也产生美登木素生物碱，如美登木醇和C-3美登木醇酯(美国专利号4,151,042)。例如美国专利号4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533中公开了合成的美登木醇及其衍生物和类似物。

美登木素生物碱药物部分是抗体药物缀合物中的吸引药物部分，因为它们：(i)相对易接近，以通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生来制备；(ii)顺从用适于通过非二硫键接头与抗体缀合的功能基团衍生；(iii)在血浆中稳定；和(iv)对多种肿瘤细胞系有效。

包含美登木素生物碱的免疫缀合物、其产生方法及其治疗用途公开于例如美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0425235B1中，其公开内容在此明确引用作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：8618-8623(1996)描述了抗人结直肠癌的包含与单克隆抗体C242连接的命名为DM1的美登木素生物碱的免疫缀合物。发现该缀合物对培养的结肠癌细胞具有高毒性，且在体内肿瘤生长测定中显示抗肿瘤活性。Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)描述了这样的免疫缀合物，其中美登木素生物碱通过二硫键接头与结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7缀合，或与结合HER-2/neu癌基因的另一鼠单克隆抗体TA.1缀合。在体外测试了TA.1-美登木素生物碱缀合物对人乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×10⁵个HER-2表面抗原。该药物缀合物达到了与自由美登木素生物碱药物相似的细胞毒性程度，其可以通过增加每个抗体分子的美登木素生物碱分子数来提高。A7-美登木素生物碱缀合物在小鼠中显示低的全身活性。

通过将抗体与美登木素生物碱化学连接而不显著减少抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备抗体-美登木素生物碱缀合物。见例如美国专利号5,208,020(其公开内容在此明确引用作为参考)。虽然预期甚至毒素/抗体的一个分子也具有超过使用裸抗体的增强的细胞毒性，但每个抗体分子平均缀合3-4个美登木素生物碱分子显示了增强靶细胞的细胞毒性的功效，而不负面影响抗体的功能或可溶性。美登木素生物碱为本领域公知，且可以通过已知的技术合成或从天然来源分离。适宜的美登木素生物碱公开于例如美国专利号5,208,020中及上文提到的其他专利和非专利出版物中。优选的美登木素生物碱是美登木醇和在美登木醇的芳香环中修饰或在其他位置修饰的美登木醇类似物，如多种美登木醇酯。

存在本领域已知的用于产生抗体-美登木素生物碱缀合物的许多连接基团，包括例如公开于美国专利号5,208,020或EP专利0425235B1、Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)和美国专利申请公开号2005/0169933中的那些，其公开内容在此明确引用作为参考。可以按照美国专利申请公开号2005/0169933所公开制备包含接头成分SMCC的抗体-美登木素生物碱缀合物。连接基团包括上述专利中公开的二硫基、硫醚基、酸敏感基团、光敏感基团、肽酶敏感基团或酯酶敏感基团，优选二硫基和硫醚基。本文描述和示例了其他连接基团。

可以用多种双功能蛋白质偶联剂产生抗体和美登木素生物碱的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括提供二硫键连接的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和4-(2-吡啶硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(“SPP”)。

取决于连接类型，接头可以在多种位置附着于美登木素生物碱分子。例如，可以通过用常规偶联技术与羟基反应形成酯键。反应可以发生在具有羟基的C-3位、羟甲基修饰的C-14位、羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位。在优选实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位形成键。

ii.Auristatin和多拉司他汀

在一些实施方案中，免疫缀合物包含与多拉司他汀或dolostatin肽类似物和衍生物auristatin缀合的本发明的抗体(美国专利号5,635,483和5,780,588)。已显示多拉司他汀和auristatin干扰微管动力学、GTP合成及核分裂和细胞分裂(Woyke等，Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584(2001))，且具有抗肿瘤(美国专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等，Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965(1998))。多拉司他汀或auristatin药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端附着于抗体(WO 02/088172)。

示例性auristatin实施方案包括公开于“MonomethylvalineCompounds Capable of Conjugation to Ligands，”美国申请公开号2005/0238649中的N端连接的单甲基auristatin药物部分DE和DF，该专利的公开内容在此明确引用作为参考。

通常，可以通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备肽基药物部分。可以例如按照肽化学领域公知的液相合成法(见E.

和K.Lübke，“The Peptides，”第1卷，76-136页，1965，AcademicPress)制备这类肽键。可以按照以下的方法制备auristatin/多拉司他汀药物部分：美国专利号5,635,483和5,780,588；Pettit等，J.Nat.Prod.44：482-485(1981)；Pettit等，Anti-Cancer Drug Design 13：47-66(1998)；Poncet，Curr.Pharm.Des.5：139-162(1999)；和Pettit，Fortschr.Chem.Org.Naturst.70：1-79(1997)。还见Doronina，Nat.Biotechnol.21(7)：778-784(2003)；和“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands，”美国申请公开号2005/0238649，在此以其整体引入作为参考(公开例如接头和制备与接头缀合的诸如MMAE和MMAF的单甲基缬氨酸化合物的方法)。

iii.棘孢霉素

在其他实施方案中，免疫缀合物包含与一个或多个棘孢霉素分子缀合的本发明的抗体。棘孢霉素家族的抗生素能够以低于皮摩尔的浓度产生双链DNA断裂。棘孢霉素家族缀合物的制备见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296(全都属于American Cyanamid Company)。可以使用的棘孢霉素结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman等，CancerResearch 53：3336-3342(1993)；Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；和前述属于American Cyanamid的美国专利)。抗体可以缀合的另一抗肿瘤药物是QFA，其是抗叶酸剂。棘孢霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易跨过质膜。因此，细胞通过抗体介导的内化摄取这些药剂大幅增强了的它们的细胞毒效应。

iv.其他细胞毒剂

可以与本发明的抗体缀合或按照本文所述方法产生的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲菌素、长春花新碱和5-氟尿嘧啶，美国专利号5,053,394和5,770,710中所述的统称为LL-E33288复合体的药剂家族，以及埃斯波霉素(esperamicin)(美国专利号5,877,296)。

可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、内毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白IIA链、α-帚曲霉素、油桐蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯(见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232)。

本发明还考虑抗体和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫缀合物。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可以包含高放射性原子。可获得多种放射性同位素来产生放射性缀合抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、pb²¹²和Lu的放射性同位素。在缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁照相研究的放射性同位素，例如tc^99m或I¹²³，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

放射性标记或其他标记可以按已知的方式掺入缀合物。例如，使用涉及例如氟-19取代氢的适宜氨基酸前体，可以生物合成或可以通过化学氨基酸合成来合成肽。可以通过肽中的半胱氨酸残基附着诸如tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹的标记。可以通过赖氨酸残基附着钇-90。可以用IODOGEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))来掺入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其他方法。

可以用多种双功能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCl)、活性酯(如如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2，6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以按照Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。见例如WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸敏感接头、肽酶敏感接头、光敏感接头、二甲基接头或包含二硫化物的接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本发明的化合物明确考虑，但不限于用交联剂制备的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB；以及市售可得(例如从Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，美国)的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸盐)。见2003-2004应用手册和目录的467-498页。

v.缀合抗体的制备

在本发明的缀合抗体中，可选地通过接头将抗体与一个或多个部分(例如药物部分)缀合，例如每个抗体约1至约20个部分。可以利用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂，通过几种途径制备缀合抗体，其包括：(1)抗体的亲核基团通过共价键与二价接头试剂反应，然后与目的部分反应；和(2)部分的亲核基团通过共价键与二价接头试剂反应，然后与抗体的亲核基团反应。本文描述了用于制备缀合抗体的其他方法。

接头试剂可以由一个或多个接头成分组成。示例性接头成分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、4-(2-吡啶硫)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚胺酯(“SMCC”)和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(“SIAB”)。其他接头成分为本领域已知，且本文描述了其中一些。还见“Monomethylvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands，”美国申请公开号2005/0238649，其内容在此以其整体引入作为参考。

在一些实施方案中，接头可以包含氨基酸残基。示例性氨基酸接头成分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性三肽包括甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头成分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及稀有氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可以就它们对特定酶(例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶)的酶切割的选择性来设计和优化氨基酸接头成分。

抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链巯基，例如半胱氨酸；和(iv)抗体糖基化时的糖羟基或氨基。胺基、巯基和羟基是亲核的，且能够与包括以下的接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键：(i)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可以通过用诸如DTT(二硫苏糖醇)的还原剂处理来使抗体具有与接头试剂缀合的反应性。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性巯基亲核体。可以通过赖氨酸与2-亚胺基硫烷(Traut试剂)反应导致胺基转化为巯基来向抗体中引入附加的亲核基团。可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基来向抗体(或其片段)中引入反应性巯基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的突变体抗体)。

还可以通过修饰抗体引入亲电子部分来产生本发明的缀合抗体，该亲电子部分可以与接头试剂或药物或其他部分上的亲核取代基反应。可以例如用高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖来形成醛基或酮基，该醛基或酮基可以与接头试剂或药物或其他部分的胺基反应。产生的亚胺希夫碱基团可以形成稳定连接，或者可以例如通过氢硼化物试剂还原来形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的糖类部分与glactose氧化酶或偏过碘酸钠的反应可以在蛋白质中产生羰基(醛和酮)，其可以与药物或其他部分上适当的基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一实施方案中，包含N端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与偏过碘酸钠反应，导致在第一氨基酸处产生醛(Geoghegan和Stroh，Bioconjugate Chem.3：138-146(1992)；美国专利号5,362,852)。这种醛可以与药物部分或接头亲核体反应。

同样，部分(如药物部分)上的亲核基团包括但不限于：能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键的胺、巯基、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基团，该接头试剂包括：(1)活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤甲酸酯和酰基卤；(ii)烷基卤和苄基卤，如卤乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基。

备选地，可以例如通过重组技术或肽合成来产生包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白质。DNA的长度可以包含编码缀合物的两个部分的各区域，该区域相互邻近，或通过编码不破坏希望的缀合物特性的接头肽的区域分开。还在另一实施方案中，可以将抗体与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)缀合用于肿瘤预寻靶，其中对个体施用抗体-受体缀合物，然后用清除剂从循环去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。

v.治疗用途

蛋白质复合体，如本文所述抗体和抗体片段(例如包含卷曲螺旋的抗体、束缚抗体或按照本文所述方法产生的抗体)可以用于治疗应用。例如，这类抗体和抗体片段可以用于治疗肿瘤，包括癌变前肿瘤、非转移性肿瘤、转移性肿瘤和癌性肿瘤(例如早期癌症)；用于治疗变应性或炎性障碍；或用于治疗自身免疫病；或用于治疗处于发展癌症(例如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌)、变应性或炎性障碍、或自身免疫病的风险的受试者。

术语癌症涵盖一批增生性障碍，其包括但不限于癌变前生长、良性肿瘤和恶性肿瘤。良性肿瘤仍定位在起始部位，不具有侵润、侵入或转移至远端部位的能力。恶性肿瘤将侵入和损伤其周围的其他组织。它们还可以获得从它们起始的位置突破并扩散至身体其他部分(转移)的能力，通常通过血流或通过淋巴结定位的淋巴系统。原发性肿瘤按它们出现的组织类型分类；转移性肿瘤按衍生癌细胞的组织类型分类。随时间推移，恶性肿瘤的细胞变得更为异常，显得更不像正常细胞。肿瘤细胞形态的这种变化称为肿瘤分级，将肿瘤细胞描述为良好分化、中度分化、低分化或未分化。良好分化的细胞显得非常正常，类似于其来源的正常细胞。未分化的细胞是已变得如此异常，以致不再可能确定细胞来源的细胞。

肿瘤可以是实体瘤或非实体或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(慢性髓性白血病、急性髓细胞白血病、成年型急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成熟B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、polymphocytic leukemia或多毛细胞白血病)或淋巴瘤(例如非Hodgkin淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤或Hodgkin病)。实体瘤包括除血液、骨髓或淋巴系统外的身体组织的任意癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的实体瘤和非上皮细胞来源的实体瘤。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、下唇、鼻咽、皮肤、子宫、雄性生殖器、泌尿器官、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮细胞来源的实体瘤包括肉瘤、脑肿瘤和骨肿瘤。

上皮癌通常从良性肿瘤发展至侵袭前阶段(例如原位癌)、至恶性癌症(其已渗透基膜，侵入上皮下基质)。

多特异性蛋白质复合体也可以用于这些治疗应用，结合HER2的抗体尤其可以用来治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。

作为接受本发明的组合物的候选者的其他受试者患有以下或处于发展以下的风险：维管组织的异常增生、红色痤疮、获得性免疫缺陷综合症、血管闭塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、Bechet病、血液肿瘤、颈动脉阻塞性疾病、脉络膜新生血管形成、慢性炎症、慢性视网膜脱离、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、contact lens overwear、角膜移植片排斥、角膜新生血管形成、角膜移植片新生血管形成、克罗恩氏病、视网膜静脉周围炎(Eales disease)、流行性角膜结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合症、Kaposi肉瘤、白血病、脂质变性、Lyme病、边缘性角膜溶解、蚕食性角膜溃疡、除麻风外的分枝杆菌感染、近视、眼部新生血管性疾病、optic pits、遗传性出血性毛细血管扩张症、骨关节炎、Paget病、睫状体扁平部炎、类天疱疮、phylectenulosis、多动脉炎、激光后并发症、原虫感染、弹性假黄色瘤、pterygium keratitis sicca、放射状角膜切开术、视网膜新生血管形成、早产儿视网膜病、晶状体后纤维增生症、肉样瘤、巩膜炎、镰状细胞贫血、Sogren综合症、实体瘤、Stargart病、Steven’s Johnson病、上缘角膜炎、梅毒、全身性红斑狼疮、Terrien边缘变性、弓形虫病、尤因肉瘤的肿瘤、神经母细胞瘤的肿瘤、骨肉瘤的肿瘤、视网膜母细胞瘤的肿瘤、横纹肌肉瘤的肿瘤、溃疡性结肠炎、视网膜静脉分枝阻塞、维生素A缺乏病、Wegener结节病、不希望的糖尿病相关血管发生、寄生虫病、异常伤口愈合、手术、损伤或创伤后肥大(例如急性肺损伤/ARDS)、毛发生长的抑制、排卵和黄体形成的抑制、植入抑制和子宫中胚胎发育的抑制。

可以用包含卷曲螺旋的抗体、束缚抗体或按照本文所述方法产生的抗体治疗的变应性或炎性障碍或自身免疫病或障碍的实例包括但不限于：关节炎(类风湿性关节炎，如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎症性关节炎、变性关节炎、感染性关节炎、Lyme关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、椎骨关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、arthritis chronica progrediente、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)；炎性过度增殖性皮肤病；银屑病，如斑块状银屑病、gutatte psoriasis、脓疱性银屑病和指甲银屑病；皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎；X连锁高IgM综合症；荨麻疹，如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹；多肌炎/皮肌炎；青少年型皮肌炎；中毒性表皮坏死溶解症；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化症，如全身性硬化病、多发性硬化症(MS)(如spino-optical MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发-好转型MS(RRMS))、进行性全身性硬化症、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化和共济失调性硬化；炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎(如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，colitis ulcerosa)、微小性结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎)和自身免疫性炎性肠病)；坏疽性脓皮病；结节性红斑；原发性硬化性胆管炎；巩膜外层炎；呼吸窘迫综合症，包括成人型或急性呼吸窘迫综合症(ARDS)；脑膜炎；全部或部分血管膜的炎症；虹膜炎；脉络膜炎；自身免疫性血液障碍；类风湿性脊椎炎；突发性耳聋；IgE介导的疾病，如过敏症及变应性和特发性鼻炎；脑炎，如Rasmussen脑炎及边缘性脑炎和/或脑干脑炎；葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎；伴随和不伴随肾病综合症的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫性GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性增生性GN(MPGN)(包括I型和II型)和急进性GN；变应性病症；变应性反应；湿疹，包括变应性或特应性湿疹；哮喘，如支气管哮喘(asthma bronchiale，bronchialasthma)和自身免疫性哮喘；涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症；慢性肺炎性疾病；自身免疫性心肌炎；白细胞黏附性缺陷；全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus(SLE)或systemic lupus erythematodes)，如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、新生儿狼疮综合症(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科、非肾、肾外、盘状、脱发)；幼年型(I型)糖尿病，包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)；成年型糖尿病(II型糖尿病)；自身免疫性糖尿病；特发性尿崩症；与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；结核病；结节病；肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、Wegener肉芽肿病；粒细胞缺乏症；血管病，包括血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括Kawasaki病和结节性多动脉炎)、微小性多动脉炎、CNS血管炎、坏死性、皮肤性或过敏性血管炎、系统性坏死性血管炎和ANCA相关血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合症(CSS)、颞动脉炎；再生障碍性贫血、自身免疫性再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond Blackfan贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(pernicious anemia，anemia perniciosa)、Addison病、纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)、VIII因子缺乏、血友病A、自身免疫性中性白细胞减少、全血细胞减少、白细胞减少、涉及白细胞渗出的疾病；CNS炎性障碍；多器官损伤综合症，如败血症、创伤或出血继发的那些；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂抗体综合症；变应性神经炎；Bechet或Behcet病；Castleman综合症；Goodpasture综合症；Reynaud综合症；Sjogren综合症；Stevens-Johnson综合症；类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮；天疱疮(包括寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、pemphigusmucus-membrane pemphigoid和红斑性天疱疮)；自身免疫性多内分泌病；Reiter病或综合症；免疫复合物性肾炎；抗体介导的肾炎；视神经脊髓炎；多神经病；慢性神经病，如IgM多神经病或IgM介导的神经病；血小板减少症(例如心肌梗塞患者所发展)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介导性血小板减少症，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP；睾丸和卵巢的自身免疫病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎；原发性甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退；自身免疫性内分泌疾病，包括甲状腺炎(如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)、自身免疫性甲状腺病、特发性甲状腺功能减退、Grave病；多腺体综合症，如自身免疫性多腺体综合症(或多腺体内分泌病综合症)；瘤外综合症，包括神经系瘤外综合症，如Lambert-Eaton肌无力综合症或Eaton-Lambert综合症、僵人综合症(stiff-man syndrome或stiff-person syndrome)；脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis或encephalomyelitis allergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)；重症肌无力，如胸腺瘤相关重症肌无力、小脑变性、神经性肌强直、视性眼阵挛综合症或视性眼阵挛-肌阵挛综合症(OMS)；感觉神经病；多灶性运动神经病；Sheehan综合症；自身免疫性肝炎；慢性肝炎；狼疮样肝炎；巨细胞肝炎；慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎；淋巴性间质性肺炎；闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP；Guillain-Barré综合症；Berger病(IgA肾病)；特发性IgA肾病；线性IgA皮肤病；原发性胆汁性肝硬变；肺硬变；自身免疫性肠病综合症；乳糜泻；腹腔病；口炎性腹泻(麸质肠病)；顽固性腹泻；特发性腹泻；冷球蛋白血症；肌萎缩性侧索硬化症(ALS；Lou Gehrig病)；冠状动脉疾病；自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力丧失；视性眼阵挛-肌阵挛综合症(OMS)；多软骨炎，如顽固性或复发性多软骨炎；肺泡蛋白沉着症；淀粉样变性；巩膜炎；非癌性淋巴细胞增多；原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和意义未定性单克隆丙种球蛋白病(MGUS))；周围神经病；瘤外综合症；通道病，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉障碍、聋、盲、周期性麻痹和CNS的通道病；孤独症；炎性肌病；局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)；内分泌性眼病；葡萄膜视网膜炎；脉络膜视网膜炎；自身免疫性肝障碍；纤维肌痛；多内分泌衰竭；Schmidt综合症；肾上腺炎；胃萎缩；早老性痴呆；脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病；糖尿病性肾病；Dressler综合症；斑秃；CREST综合症(钙质沉着、雷诺现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)；雄性和雌性自身免疫性不育；混合性结缔组织病；Chagas病；风湿热；习惯性流产；农民肺；多形性红斑；心脏切开术后综合症；Cushing综合症；养鸟者肺；变应性肉芽肿性血管炎；良性淋巴细胞性脉管炎；Alport综合症；肺泡炎，如变应性肺泡炎和致纤维性肺泡炎；间质性肺病；输血反应；麻风；疟疾；利什曼病；kypanosomiasis；血吸虫病；蛔虫病；曲霉病；Sampter综合症；Caplan综合症；登革热；心内膜炎；心内膜心肌纤维化；弥漫性肺间质纤维化；间质性肺纤维化；特发性肺纤维化；囊性纤维化；眼内炎；持久性隆起性红斑；胎儿有核红细胞增多症；嗜酸性筋膜炎；Shulman综合症；Felty综合症；flariasis；睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎或Fuch睫状体炎；Henoch-Schonlein紫癜；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；艾柯病毒感染；心肌病；阿尔茨海默病；细小病毒感染；风疹病毒感染；接种后综合症；先天性风疹感染；EB病毒感染；流行性腮腺炎；Evan综合症；自身免疫性生殖腺衰竭；Sydenham舞蹈病；链球菌感染后肾炎；thromboangitis ubiterans；甲状腺毒症；脊髓痨；脉络膜炎；巨细胞多肌痛；内分泌性眼病；慢性过敏性肺炎；干燥性角膜结膜炎；流行性角膜结膜炎；特发性肾炎综合征；微小病变性肾病；良性家族性和缺血-再灌注性损伤；视网膜自身免疫；关节炎症；支气管炎；慢性梗阻性气道疾病；硅肺病；口疮；口疮性口炎；动脉硬化性障碍；aspermiogenese；自身免疫性溶血；Boeck病；冷球蛋白血症；Dupuytren挛缩；晶状体过敏性眼内炎；过敏性肠炎；麻风结节性红斑；特发性面神经麻痹；慢性疲劳综合症；风湿性发热；Hamman-Rich病；感觉神经性听力丧失；haemoglobinuria paroxysmatica；性腺功能减退；区域性回肠炎；白细胞减少；传染性单核细胞增多症；贯性脊髓炎；原发性特发性黏液水肿；肾病；ophthalmia symphatica；肉芽肿性睾丸炎；胰腺炎；急性多神经根炎；坏疽性脓皮病；Quervain甲状腺炎；acquired spenic atrophy；抗精子抗体引起的不育；非恶性胸腺瘤；白癜风；SCID和EB病毒相关疾病；获得性免疫缺陷综合症(AIDS)；寄生虫病，如利什曼原虫；中毒性休克综合症；食物中毒；涉及T细胞侵润的病症；白细胞粘附缺陷；与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答；涉及淋巴白细胞渗出的疾病；多器官损伤综合症；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；变应性神经炎；自身免疫性多内分泌病；卵巢炎；原发性黏液水肿；自身免疫性萎缩性胃炎；交感性眼炎；风湿性疾病；混合性结缔组织病；肾病综合症；胰岛炎；多内分泌腺衰竭；周围神经病；I型自身免疫性多腺体综合症；成人型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)；全秃；扩张型心肌病；获得性大疱性表皮松解症(EBA)；血色素沉着病；心肌炎；肾病综合症；原发性硬化性胆管炎；化脓性或非化脓性鼻窦炎；急性或慢性鼻窦炎；.筛窦、额窦、上颌窦或蝶窦炎；嗜酸性粒细胞相关障碍，如嗜酸粒细胞增多、肺嗜酸细胞增多性浸润、嗜酸细胞增多-肌痛综合症、Loffler综合症、慢性嗜酸细胞性肺炎、热带性肺嗜酸细胞浸润症；支气管肺曲霉病；曲霉肿或包含嗜酸性细胞的肉芽肿；过敏反应；血清阴性脊椎关节炎；多内分泌自身免疫病；硬化性胆管炎；巩膜、巩膜外层慢性黏膜皮肤念珠菌病；Bruton综合症；婴儿一过性低丙种球蛋白血症；Wiskott-Aldrich综合症；共济失调性毛细血管扩张症；与胶原性疾病、风湿病、神经病、缺血性再灌注障碍、血压应答减少、血管功能障碍、antgiectasis、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴血管形成疾病相关的自身免疫性障碍；变应性过敏性障碍；肾小球肾炎；再灌注损伤；心肌或其他组织的再灌注损伤；具有基性岩性成分的皮肤病；急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性障碍；眼和眼眶炎性障碍；粒细胞输注相关综合症；细胞因子诱导的毒性作用；急性严重验证；慢性顽固性炎症；肾盂炎；肺硬变；糖尿病性视网膜病；糖尿病性大动脉障碍；动脉内增生；消化性溃疡；心瓣炎；子宫内膜异位症。

除治疗用途外，本发明的抗体还可以用于其他目的，包括诊断方法，如本文所述疾病和病症的诊断方法。

VI.剂量、制剂和持续时间

将以符合良好医疗实践的方式配制、制剂和施用本发明的蛋白质。在此背景中考虑的因素包括所治疗的具体障碍、所治疗的具体哺乳动物、个体受试者的临床病症、障碍的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排及医疗从业者已知的其他因素。待施用的蛋白质的“治疗有效量”将由这类考虑决定，且是预防、缓解或治疗特定障碍(例如癌症、变应性或炎性障碍或自身免疫性障碍)必需的最小量。蛋白质无需但可选地与目前用来预防或治疗该障碍的一种或多种药剂配制在一起。这类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的蛋白质的量、障碍或治疗的类型及上文讨论的其他因素。这些通常以与此前所用的剂量和给药途径相同的剂量和给药途径使用，或者是此前所用剂量的约1％至99％。通常，癌症的缓解或治疗涉及与该癌症相关的一种或多种症状或医疗问题的减轻。药物的治疗有效量可以达到以下之一或以下的组合：减少癌细胞的数目(减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)；减少或抑制肿瘤大小或肿瘤负荷；抑制(即以某种程度减少和/或阻止)癌细胞侵润进入外周器官；在腺瘤的情况下减少激素分泌；降低血管密度；抑制肿瘤转移；减少或抑制肿瘤生长；和/或以某种程度减轻与癌症相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，用蛋白质来在受试者中预防癌症或自身免疫性障碍的发生或复发。

在一个实施方案中，本发明可以用来增加易感癌症或自身免疫性障碍或诊断为患有癌症或自身免疫障碍的人受试者的存活时间。存活时间定义为从首次施用药物至死亡的时间。还可以通过治疗组对对照组的分层危害比(HR)来测量存活时间，HR表示受试者在治疗期间死亡的风险。

还在另一实施方案中，本发明的治疗在用多种抗癌疗法治疗的易感癌症或诊断为患有癌症的人受试者的组中显著提高应答率。应答率定义为应答治疗的治疗受试者的百分比。一方面，与用手术、放疗或化疗单独治疗的组相比，本发明的组合治疗(使用本发明的蛋白质和手术、放疗或一种或多种化疗剂)显著提高了治疗受试者组中的应答率，该提高具有小于0.05的卡方p值。美国专利申请公开号20050186208中描述了癌症治疗中的治疗功效的其他测量。

通过将具有希望的纯度的活性成分与可选的生理可用载体、赋形剂或稳定剂混合，用本领域已知的标准方法制备治疗制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences(第20版)，A.Gennaro编辑，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。可用的载体包括盐水或缓冲液，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。

可选地，但也是优选地，制剂包含可药用盐，优选氯化钠，且优选以约生理浓度包含。可选地，本发明的制剂可以包含可药用防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度在0.1％至2.0％(通常为v/v)的范围内。适宜的防腐剂包括制药领域已知的那些。优选的防腐剂是苄醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。可选地，本发明的制剂可以以0.005％至0.02％的浓度包含可药用表面活性剂。

本文的制剂还可以根据所治疗的具体适应症的需要包含一种以上活性化合物，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。这类分子以对预期目的有效的量适宜地组合存在。

活性成分还可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊中，例如在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或在粗滴乳状液中分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊。这类技术公开于Remington’sPharmaceutical Sciences，上文中。

可以制备缓释制剂。缓释制剂的适宜的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品的形式，例如膜或微囊。缓释基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物使得能够释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质较短时期。包封抗体长时间存留在体内时，它们可由于在37℃暴露于湿度而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性改变。取决于所涉及的机制，可以设计合理的策略来稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物(thio-disulfide)交换形成分子间S-S键，那么可以通过修饰硫氢残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂和发展特异性聚合物基质组合物来达到稳定。

按照已知的方法对人受试者施用本文所述蛋白质(例如包含卷曲螺旋的抗体、束缚抗体或按照本文所述方法产生的抗体)，如作为快速注射或通过在一定时期内连续输注静脉内施用、通过肌内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入途径。如果广泛的副作用或毒性与对蛋白质所识别的靶分子的拮抗作用相关，那么尤其希望进行局部施用。离体策略也可以用于治疗应用。离体策略涉及用编码本发明的蛋白质的多核苷酸转染或转导获自受试者的细胞。然后使转染或转导的细胞返回该受试者。该细胞可以是广范围的类型中的任一种，其非限制性地包括造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌细胞。

在一个实例中，在障碍或肿瘤位置允许时，可以例如通过直接注射来局部施用蛋白质复合体(例如包含卷曲螺旋的抗体、束缚抗体或按照本文所述方法产生的抗体)，且可以定时重复注射。蛋白质复合体还可以全身递送至受试者，或直接递送至肿瘤细胞，例如递送至肿瘤或手术切除肿瘤后的肿瘤床，以预防或减少局部复发或转移。

VII.制成品

本发明的另一实施方案是包含本文所述的一种或多种蛋白质复合体及用于治疗或诊断障碍(例如自身免疫病或癌症)的材料的制成品。制成品包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器等。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器装有对治疗病症有效的组合物，且可以具有无菌接口(例如容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或抗体片段。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗特定病症。标签或包装说明书将进一步包含对受试者施用抗体组合物的说明。还考虑包含本文所述组合治疗的制成品和试剂盒。

包装说明书指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症的信息和/或涉及这类治疗产品的使用的警告。在某些实施方案中，包装说明书指示该组合物用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤或卵巢癌。

此外，制成品可以进一步包含第二容器，该容器包含可药用缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格溶液和葡萄糖溶液。它还可以进一步包含从商业和用户角度考虑的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、滤器、针头和注射器。

还提供用于多种目的(例如用于从细胞纯化或免疫沉淀抗原(例如HER2或EGFR))的试剂盒。为了分离和纯化抗原(例如HER2或EGFR)，试剂盒可以包含与小球(例如琼脂糖小球)偶联的抗体(例如EGFR/HER2抗体)。可以提供包含用于在例如ELISA或Western印迹中体外检测和定量抗原的抗体的试剂盒。与制成品一样，试剂盒包含容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。容器装有包含至少一种本发明的多特异性抗体或抗体片段的组合物。还可以包含其他容器，该容器包含例如稀释液和缓冲液或对照抗体。标签或包装说明书可以提供组合物的描述，以及预期的体外用途或诊断用途的说明。

认为前面的书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。提供以下实施例只是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，除本文显示和描述的那些之外，对本领域技术人员而言，本发明的多种修改将从前面的描述变得显而易见，这些修改也在所附权利要求的范围之内。

VII.靶分子

本发明的复合体可以靶向的分子的实例包括但不限于可溶性血清蛋白及其受体和其他膜结合蛋白质(例如黏附素)。

在另一实施方案中，本发明的结合蛋白质能够结合选自以下的一种、两种或多种细胞因子、细胞因子相关蛋白质和细胞因子受体：BMPl、BMP2、BMP3B(GDFlO)、BMP4、BMP6、BMP8、CSFl(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGFl(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNBl、IFNG、IFNWl、FELl、FELl(EPSELON)、FELl(ZETA)、ILlA、ILlB、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、ILIl、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LIA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSFl0(TRAIL)、TNFSF1l(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILlR1、IL1R2、IL1RL1、LL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILl0RA、ILl0RB、IL1lRA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、ILlRAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、ILlRN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIFl、HGF、LEP(瘦蛋白)、PTN和THPO。

在另一实施方案中，靶分子是选自以下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白质：CCLl(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLH(嗜酸细胞活化趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/eXodus-2)、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLl(GROl)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCLlO(IP10)、CXCLIl(I-TAC)、CXCL12(SDFl)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYDl)、SCYEl、XCLl(淋巴细胞趋化蛋白)、XCL2(SCM-Ib)、BLRl(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRl(CKRl/HM145)、CCR2(mcp-lRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBIl)、CCR8(CMKBR8/TERl/CKR-Ll)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLl(VSHKl)、CCRL2(L-CCR)、XCRl(GPR5/CCXCRl)、CMKLRl、CMKORl(RDCl)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCRlO)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCPlO、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCClO(ClO)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDFlA、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREMl、TREM2和VHL。

在另一实施方案中，本发明的结合蛋白质能够结合选自以下的一种或多种靶标：ABCFl、ACVRl、ACVRlB、ACVR2、ACVR2B、ACVRLl、AD0RA2A、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、AGR2、AICDA、AIFl、AIGl、AKAPl、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPTl、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOCl、AR、AZGPl(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、BAD、BAFF(BLys)、BAGl、BAIl、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRl(MDR15)、BMPl、BMP2、BMP3B(GDFlO)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPRlA、BMPRlB、BMPR2、BPAGl(网蛋白)、BRCAl、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANTl、CASP1、CASP4、CAVl、CCBP2(D6/JAB61)、CCLl(1-309)、CCLIl(嗜酸细胞活化趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MTP-2)、SLC、eXodus-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MTP-Ia)、CCL4(MDP-Ib)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNAl、CCNA2、CCNDl、CCNEl、CCNE2、CCRl(CKRl/HM145)、CCR2(mcp-lRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBIl)、CCR8(CMKBR8/TERl/CKR-Ll)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLl(VSHKl)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CDlC、CD20、CD200、CD22、CD24、CD28、CD3、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CDHl(E-钙黏着蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKNlA(p21Wapl/Cipl)、CDKNlB(p27Kipl)、CDKNlC、CDKN2A(P16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CERl、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(密蛋白-7)、CLN3、CLU(簇蛋白)、CMKLRl、CMKORl(RDCl)、CNRl、COL18A1、COLlAl、COL4A3、COL6A1、CR2、CRP、CSFl(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTNNBl(b-联蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYDl)、CX3CR1(V28)、CXCLl(GROl)、CXCL10(IP-10)、CXCLIl(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDFl)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYCl、CYSLTRl、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCLl、DPP4、E2F1、ECGFl、EDGl、EFNAl、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、ENO1、ENO2、ENO3、EPHB4、EPO、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、ESRl、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCERlA、FCER2、FCGR3A、FGF、FGFl(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FELl(EPSILON)、FILl(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRTl(纤连蛋白)、FLTl、FOS、FOSLl(FRA-I)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEBl、GAGECl、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNASl、GNRHl、GPR2(CCRlO)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCClO(ClO)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTPl、HAVCR2、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIFlA、HDPl、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOXI、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNAl、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNγ、DFNWl、IGBPl、IGFl、IGFlR、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-I、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL-12、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、IL1A、IL1B、ILlF10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1HYl、IL1Rl、IL1R2、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RL1、IL1RL2、ILlRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、EL7、EL7R、EL8、IL8RA、DL8RB、IL8RB、DL9、DL9R、DLK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAKI、ERAK2、ITGAl、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整联蛋白)、JAGl、JAKI、JAK3、JUN、K6HF、KAIl、KDR、KITLG、KLF5(GCBoxBP)、KLF6、KLKIO、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)、LAMAS、LEP(瘦蛋白)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIBl、中期因子、MEF、MIP-2、MKI67、(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫蛋白-III)、MTSSl、MUCl(黏蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经聚糖、NFKBl、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEl(NM23A)、N0X5、NPPB、NROBl、NR0B2、NRlDl、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRPl、NRP2、NT5E、NTN4、ODZl、OPRDl、P2RX7、PAP、PARTl、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PDGFA、PDGFB、PECAMl、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、phosphacan、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCl、PPBP(CXCL7)、PPID、PRl、PRKCQ、PRKDl、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGSl、RGS13、RGS3、RNFIlO(ZNF144)、ROBO2、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(mammaglobin2)、SCGB2A2(mammaglobin1)、SCYEl(内皮单核细胞激活细胞因子)、SDF2、SERPINAl、SERPINA3、SERP1NB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINEl(PAI-I)、SERPDMF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPPl、SPRRlB(Sprl)、ST6GAL1、STABl、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCPlO、TDGFl、TEK、TGFA、TGFBl、TGFBlIl、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBRl、TGFBR2、TGFBR3、THlL、THBSl(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TMP3、组织因子、TLRlO、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAEP2(B94)、TNEAIP3、TNFRSFIlA、TNFRSFlA、TNFRSFlB、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSFlO(TRAIL)、TNFSFl1(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TOP2A(拓扑异构酶Ea)、TP53、TPMl、TPM2、TRADD、TRAFl、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TREMl、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGF、VEGFB、VEGFC、多能聚糖、VHLC5、VLA-4、XCLl(淋巴细胞趋化蛋白)、XCL2(SCM-Ib)、XCRl(GPR5/CCXCRl)、YYl和ZFPM2。

本发明所涵盖的抗体的优选的靶分子包括CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD20、CD34、CD64、CD200；ErbB受体家族的成员，如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子，如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子，如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα；白细胞介素，如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL17A/F、IL-18、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白质、蛋白C等。

在一个实施方案中，本发明的异源多聚体复合体与选自以下的至少两种靶分子结合：IL-lα和IL-lβ；IL-12和IL-18；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-lβ；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；IL-13和PED2；IL17A和IL17F；CD3和CD19；CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD38和CD138；CD38和CD20；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CD20和BR3；TNFα和TGF-β；TNFα和IL-lβ；TNFα和IL-2；TNFα和IL-3；TNFα和IL-4；TNFα和IL-5；TNFα和IL6；TNFα和IL8；TNFα和IL-9；TNFα和IL-10；TNFα和IL-11；TNFα和IL-12；TNFα和IL-13；TNFα和IL-14；TNFα和IL-15；TNFα和IL-16；TNFα和IL-17；TNFα和IL-18；TNFα和IL-19；TNFα和IL-20；TNFα和IL-23；TNFα和IFNα；TNFα和CD4；TNFα和VEGF；TNFα和MIF；TNFα和ICAM-1；TNFα和PGE4；TNFα和PEG2；TNFα和RANK配体；TNFα和Te38；TNFα和BAFF；TNFα和CD22；TNFα和CTLA-4；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；VEGF和HER2；VEGF-A和HER2；VEGF-A和PDGF；HER1和HER2；VEGF-A和VEGF-C；VEGF-C和VEGF-D；HER2和DR5；VEGF和IL-8；VEGF和MET；VEGFR和MET受体；VEGFR和EGFR；HER2和CD64；HER2和CD3；HER2和CD16；HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2；EGFR和HER3；EGFR和HER4；IL-13和CD40L；IL4和CD40L；TNFR1和IL-1R；TNFR1和IL-6R；TNFR1和IL-18R；EpCAM和CD3；MAPG和CD28；EGFR和CD64；CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGMA；NgR和RGMA；NogoA和RGMA；OMGp和RGMA；PDL-I和CTLA-4；及RGM A和RGM B.

可以用可选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段作为免疫原来产生抗体。对于跨膜分子，如受体，可以用这些的片段(例如受体的胞外域)作为免疫原。备选地，可以用表达跨膜分子的细胞作为免疫原。这类细胞可以衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是通过重组技术转化为表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对本领域技术人员而言显而易见。

本说明书中引用或提到的所有专利、专利申请、专利申请公开和其他出版物在此以相同的程度引入作为参考，就如同明确和单独地说明引入每个独立的专利、专利申请、专利申请公开或出版物作为参考一样。这类专利申请明确包含分别于2009年9月16日和2009年12月4日提交的美国临时申请号61/243,105和61/266,992，本申请从其要求权益。

实施例

实施例1.用于表达包含卷曲螺旋的抗体的载体的构建

本文所述卷曲螺旋异二聚化结构域可以与任意抗体的恒定链(例如HC的C端)连接。可以用来构建包含卷曲螺旋的抗体的许多抗体序列为本领域已知，操作DNA序列所需的技术也为本领域公知。下文描述用于构建包含卷曲螺旋的抗体的示例性方法。

按以下构建用于产生包含卷曲螺旋的抗体的HC主链。设计并合成具有5’AscI  和3’XbaI  突出端的编码ACID.p1(GGSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQGAT；SEQ IDNO：33)或BASE.p1(GGSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQGAT；SEQ IDNO：34)卷曲螺旋结构域序列的正义和反义寡核苷酸。退火、磷酸化寡核苷酸，连入经消化和去磷酸化的pRK质粒(Genentech Inc.；Eaton等，Biochemistry 25：8343-8347(1986))。用PCR(聚合酶链反应)制备hIgG1的C_H1至C_H3结构域来引入5’多克隆位点(MCS)(ClaI-BamHI-KpnI-ApaI)和3’AscI位点，并用ClaI和AscI克隆入之前制备的pRK-ACID.p1或pRK-BASE.p1载体。最后，用Stratagene的Quikchange II XL位点定向诱变试剂盒将H222位(Kabat编号系统)赖氨酸残基突变为丙氨酸，以防止在Lys-C切割过程中释放Fab。

按以下构建包含卷曲螺旋结构域的抗体。对于共同LC和单臂抗体，用PCR制备希望的抗体的V_H结构域来引入5’ClaI和3’ApaI限制位点。消化PCR片段，并克隆入类似地制备的主链载体。不必对这些抗体已可用的LC构建体进行改变。

对于束缚抗体，首先用PCR制备希望的抗体的V_H结构域(缺乏信号序列)，其中5’引物包含GGS系链的3’部分，并以5’BamHI位点终止，3’引物以3’ApaI位点终止。消化片段，并克隆入类似地制备的主链载体。然后用PCR制备希望的抗体的关联LC，其中5’引物以5’ClaI位点终止，3’引物包含GGS系链的5’部分，并以3’BamHI终止。通过用ClaI和BamHI将片段克隆在V_H前来将LC片段连接至其关联HC(此时在主链载体中)。将LC连接至V_H的完整系链序列是GGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSG(SEQ ID NO：14)。用标准转染技术将载体转染入哺乳动物细胞(CHO或293细胞)。

用本文所述方法制备了特异性结合FcεR1和FcγR2b二者，且具有共同LC的双特异性抗体。此抗体具有：“BASE.p1”序列，其包含含有BASE.p1卷曲螺旋结构域序列和K222A突变的抗-人FcγR2b HC序列(SEQ ID NO：1)；“ACID.p1”序列，其包含含有ACID.p1卷曲螺旋结构域序列和K222A突变的抗-人FcεR1HC序列(SEQ ID NO：2)；共同LC序列(SEQ ID NO：3)(图8)。

还制备了特异性结合HER2或EGFR的单臂抗体。特异性结合HER2的抗体包含：具有ACID.p1卷曲螺旋结构域序列和K222A突变的抗-HER2抗体1HC序列(SEQ ID NO：4)；具有BASE.p1卷曲螺旋结构域序列的缺乏VH和CH1结构域的HC区(SEQ ID NO：5)；及抗-HER2抗体1LC序列(SEQ ID NO：6)。特异性结合EGFR的抗体包含：具有ACID.p1卷曲螺旋结构域序列和K222A突变的抗-EGFR HC序列(SEQ ID NO：7)；具有BASE.p1卷曲螺旋结构域序列的缺乏VH和CH1结构域的HC区(SEQ ID NO：5)；及抗-EGFR(D1.5)LC序列(SEQ ID NO：8)(图9-1和9-2)。

还制备了特异性结合HER2和EGFR/HER1的束缚抗体(图10和11)。特异性结合HER2和EGFR的一种抗体包含：(1)通过26氨基酸GGS系链束缚于抗-HER2抗体1HC序列的抗-HER2抗体1LC序列、ACID.p1卷曲螺旋结构域序列及K222A突变(SEQ ID NO：9)；(2)通过26氨基酸GGS系链束缚于抗-EGFR抗体HC序列的抗-EGFR抗体LC序列、BASE.p1卷曲螺旋结构域序列及K222A突变(SEQ ID NO：10)(图10)。特异性结合HER2和EGFR的第二抗体包含：(1)通过26氨基酸GGS系链束缚于抗-HER2抗体2HC序列的抗-HER2抗体2LC序列、ACID.p1卷曲螺旋结构域序列及K222A突变(SEQ ID NO：11)；(2)通过26氨基酸GGS系链束缚于抗-EGFR抗体HC序列的抗-EGFR抗体LC序列、BASE.p1卷曲螺旋结构域序列及K222A突变(SEQ ID NO：10)(图11)。图12A和12B中显示用于构建包含卷曲螺旋的抗体的抗-HER2抗体1LC和HC序列(SEQ ID NO：15和16)。图12B1-3中还显示了用于构建编码这些抗体的载体的多种限制位点的位置。

实施例2.包含卷曲螺旋的抗体的纯化

下文显示可用来纯化包含卷曲螺旋的抗体的示例性方案。

具体而言，用来自GE Healthcare(瑞典)的mAbSure Select树脂在4℃下从条件培养基过夜纯化抗体。用2个柱体积(CV)的PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤柱，然后用10CV的PBS+0.1％Triton X114去垢剂洗涤，然后用10CV的磷酸钾缓冲液洗涤。用10mM乙酸(pH 2.9)洗脱柱，并立即用pH 8.0的精氨酸(100mM终浓度)和Tris(200mM终浓度)稀释。通过用1∶500(重量∶重量)比例的Lys-C内肽酶(Wako Pure ChemicalLaboratories)在37℃处理1-5小时来从抗体去除卷曲螺旋。将切割的样品再次上样在mAbSure树脂柱上来从抗体分离切割的卷曲螺旋，并按上文洗脱。调节抗体浓度至10mg/ml，然后通过在PBS、150mM NaCl、100mM精氨酸和1mM NaN₃中运行的使用Sephacryl S200柱的大小排阻层析分离。混合峰级分，并对PBS过夜透析，然后进行质谱分析来确保同一性和纯度。

除精氨酸外，可以在最初的mAbSure树脂柱步骤后用于以上纯化流程的其他离液剂或温和去垢剂包括但不限于盐酸胍、尿素、高氯酸锂、组氨酸、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween、Triton和NP-40，其全都是市售可得的。从最初的包含A蛋白的柱(例如mAbSure柱)洗脱后将抗体稀释在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中，保持洗脱后的抗体的稳定性，并允许通过Lys-C内肽酶有效去除卷曲螺旋。

表1显示抗-HER2抗体1/α-EGFR(D 1.5)抗体的纯化结果总结

表1

样品体积	mAb Sure柱回收	S200柱回收	产率	聚集
					40L	200mg	147mg	73％	18％
50L	246mg	196mg	80％	13％
					50L	280mg	213mg	76％	11％

纯化过程中通过Lys-C内肽酶从抗体去除卷曲螺旋。

用卷曲螺旋异二聚化结构域构建但不再包含该卷曲螺旋的抗体在以下实施例中称为“改造抗体”。

实施例3.包含卷曲螺旋的抗体的切割

对包含卷曲螺旋的多种抗体进行切割实验来显示可从抗体序列切割卷曲螺旋(和系链，如果存在)，同时保持抗体序列完整。具体而言，图13A和B显示，用Lys-C内肽酶从示例性α-FcεR1/α-FcγR2b抗体去除了卷曲螺旋，且抗体保持完整。具有卷曲螺旋的抗体的理论质量处于通过质谱分析法实验观测的质量的误差范围之内。类似地，不含卷曲螺旋的改造抗体的理论质量处于通过质谱分析法实验观测的质量的误差范围之内，表明Lys-C从抗体切割了卷曲螺旋。

质谱分析结果还表明，Lys-C内肽酶未切割示例性α-FcεR1/α-FcγR2b抗体的LC或HC(图14A和B)。具体而言，在Lys-C内肽酶处理前(左图)和Lys-C内肽酶处理后(右图)都用质谱分析法测定了LC(上部两张图)及α-FcεR1和α-FcγR2b HC(下部四张图)的分子量。实验观测的分子量处于多种构建体的理论质量的误差范围之内，表明Lys-C内肽酶从HC切割了卷曲螺旋结构域，但未切割LC或HC本身。

类似地，质谱分析结果表明，用Lys-C内肽酶从示例性单臂α-EGFR抗体切割了卷曲螺旋(图17A和B)。具体而言，实验观测的分子量处于具有卷曲螺旋的单臂抗体和不含卷曲螺旋的单臂抗体二者的理论质量的误差范围之内。如图18A-C中所示，理论分子量处于各构建体的实验观测分子量的误差范围之内，表明Lys-C内肽酶未切割示例性α-EGFR抗体的LC、HC或缺乏VH和CH1结构域的HC(单臂Fc)，但确实从HC及缺乏VH和CH1结构域的HC切割了卷曲螺旋结构域。

此外，质谱分析结果显示，用Lys-C内肽酶从示例性束缚α-HER2/α-EGFR抗体切割了卷曲螺旋(图19A和B)。如图19B中所示，理论分子量和实验观测分子量处于各构建体的误差范围之内。还用Lys-C内肽酶从示例性束缚α-HER2/α-EGFR抗体切割了卷曲螺旋，其中首先用Lys-C内肽酶处理抗体，然后对样品进行质谱分析法分析(图20A-B)。各构建体的理论分子量处于实验观测分子量的误差范围之内，表明确实从抗体序列切割了卷曲螺旋，且抗体序列本身未被切割。表2中总结了包含卷曲螺旋的示例性抗体的质谱分析结果，包括分子量(MS)。

表2

F＝全长；Conc.＝浓度；Agg.＝聚集

实施例4.改造抗体的表征

为了确定用卷曲螺旋异二聚化结构域构建的示例性改造抗体是否保留了衍生它们的序列的抗体的结合特性，进行了结合测定。在ForteBio Octet系统上用动力学向导程序运行这些结合测定。所有测试样品的浓度为25μg/ml，该浓度是在重复实验中和不同样品中显示饱和抗-人IgG探针的浓度。用第一样品装载探针15分钟，并在PBS中洗涤30秒。第二和第三样品的所有结合都进行10分钟，结合之间进行30秒的PBS洗涤。

具体而言，通过用25μg/ml的抗体孵育探针15分钟，然后进行PBS洗涤步骤来将共同LC抗-FcεR1/抗-FcγR2b双特异性改造抗体装载在抗-人IgG探针(八隅体)上。为了评价结合，用25μg/ml的FcεR1孵育装载的探针，随后用25μg/ml的FcγR2b孵育。在两次结合孵育之间进行PBS洗涤步骤。图15中所示的数据显示，双特异性改造抗体同时结合其两种抗原。

为了测试改造抗体的功能性，在含1μg/ml NP特异性人IgE(JW8.5.13)的完全生长培养基(含Earle盐(Gibco目录号11090)、1mM谷氨酰胺(Genentech Inc.)、1mM丙酮酸钠(Gibco目录号11360-070)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco目录号11140-050)、1.5g/L碳酸氢钠(Gibco目录号25080-094)、15％胎牛血清(Hyclone目录号SH30071.03)的MEM)中37℃培养产生用于表达人FcεRIa和人FcγR2b1的大鼠嗜喊细胞白血病(RBL)细胞系72小时。胰蛋白酶消化细胞，按3.5×10⁵细胞/ml在200μl含1μg/ml NP特异性人IgE的完全生长培养基中接种在96孔平底组织培养板上，使细胞贴壁2小时。随后，用新鲜培养基洗涤细胞3次，以去除未结合的NP特异性人IgE。用0-10μg/ml的双特异性抗体处理细胞，并在37℃孵育1小时，然后用抗原激活。通过用0.1μg/ml NP缀合的卵清蛋白(Biosearch Technologies，Inc.目录号N-5051-10)在37℃孵育45分钟来激活细胞。孵育后，使用组胺ELISA试剂盒(KMI Diagnostics，Minneapolis，MN)，通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量细胞上清(细胞培养基)中的组胺水平。从用NP特异性人IgE单独处理而不激活的细胞获得背景组胺水平(图16)。

还对示例性单臂抗体和束缚改造抗体进行了八隅体结合研究。作为对照，用八隅体分析来显示野生型抗-HER2抗体1和野生型α-EGFR抗体不与彼此的抗原交叉反应，但确实结合它们各自的抗原(图21)。为了测试包含卷曲螺旋的示例性抗体，用25μg/ml的单臂抗-HER2抗体1装载抗-人IgG抗体探针15分钟，随后用PBS洗涤探针30秒。然后用25μg/ml的EGFR ECD(胞外域)孵育装载的探针，其显示无结合。然后在PBS中洗涤探针30秒，并用25μg/ml的HER2受体ECD孵育，其显示强结合信号(图22；上部迹线)。

用25μg/ml的单臂EGFR改造抗体装载抗-人IgG抗体探针15分钟，随后用PBS洗涤30秒。然后用25μg/ml的HER2ECD孵育探针，其显示无结合信号。在PBS中洗涤探针30秒，用25μg/ml的EGFR ECD孵育，其显示强结合信号(图22；下部迹线)。

用25μg/ml的抗-人IgG抗体探针孵育束缚双特异性抗-EGFR(D1.5)/抗-HER2改造抗体15分钟，随后用PBS洗涤30秒。此孵育用双特异性抗体装载探针。然后用25μg/ml的EGFR ECD孵育探针3分钟，然后进行30秒的PBS洗涤，随后用25μg/ml的HER2受体ECD孵育3分钟(图23A；上部迹线)。对于图23A下部迹线中所示的结果，首先用HER2受体ECD孵育双特异性装载的探针，然后用EGFR ECD孵育。数据显示，双特异性改造抗体同时结合EGF受体和HER2受体二者。如图23B中所示，双特异性抗-EGFR(D1.5)/抗-HER2抗体以约0.06nM的Kd结合HER2，以约0.660nM的Kd结合EGF受体。

为了进一步分析改造抗体的结合特征，在表达EGFR或HER2的NR6，或共表达EGFR和HER2二者的HCA7细胞这两个细胞系上进行了基于细胞的测定。进行结合测定前，收集细胞，并使其在结合缓冲液(含1％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES和0.2％NaN₃的RPMI培养基)中冰上冷却30分钟。按希望的起始浓度制备未标记的抗体，并用结合缓冲液1∶1稀释，以产生多个数据点。按在整个测定中使用的一个浓度制备标记的抗体。用与多种浓度的未标记抗体竞争的放射性标记抗体进行平衡结合研究。将未标记的抗体放入96孔板中，然后放入标记的材料，然后向混合物中加入细胞。室温孵育平板2小时。孵育后，用Millipore Membrane Multi-ScreenPlates收集平板来从细胞分离溶液。然后在Perkin Elmer γ计数器上计数细胞结合的放射性标记抗体，并用New Ligand软件分析数据。表3中总结了单臂和束缚改造抗体构建体的亲和结合研究结果。

表3

还在生物化学上表征了示例性改造抗体的功能特性。将表达EGFR的NR6细胞接种在12孔板中。血清饥饿后，用多种浓度的抗体37℃预孵育2小时。随后，用TGFα刺激细胞12分钟。对全细胞裂解物进行SDS-PAGE分析，用抗-磷酸酪氨酸、抗-磷酸Akt或作为上样对照的抗-微管蛋白探测免疫印迹(图24)。结果显示，与D1.5IgG1对照抗体一样，示例性α-EGFR(D1.5)/抗-HER2(抗体1)改造抗体以剂量依赖的方式抑制表达EGFR的NR6细胞中TGFα诱导的磷酸化。

对于细胞增殖测定，将细胞接种在96孔板中(EGFR-NR6：2,000细胞/孔)(BT474：10,000细胞/孔)，并在37℃过夜孵育。次日，去除培养基，并在含1％血清的培养基中处理细胞。为了比较α-EGFR(D1.5)/抗-HER2(抗体1)改造抗体和D1.5抗体对EGFR-NR6细胞的细胞生长的影响，向培养基中加入3nM TGFα，并用多种浓度的抗体处理细胞。3天后，向孔中加入AlamarBlue，并用96孔荧光计以530nm的激发波长和590nm的发射波长读取荧光。以相对荧光单位(RFU)表示结果(图25)。为了比较α-EGFR(D1.5)/抗-HER2(抗体1)改造抗体和抗-HER2抗体1对细胞生长的影响，用多种浓度的抗体在含1％血清的培养基中处理BT474细胞(图26)。5天后，按上文所述进行AlamarBlue测定。结果显示，与D1.5IgG1对照抗体一样，示例性α-EGFR(D1.5)/抗-HER2(抗体1)改造抗体以剂量依赖的方式抑制表达EGFR的NR6细胞中TGFα诱导的磷酸化，且与抗-HER2抗体1一样抑制BT474细胞的生长。

实施例5.改造抗体的药物代谢动力学分析

进行了药物代谢动力学研究来将双特异性改造抗体的药物代谢动力学(PK)与典型的人IgG(hIgG)抗体的药物代谢动力学相比较，并确定功效实验的剂量。与D1.5hIgG1对照抗体一样，HER1/HER2(D1.5/抗-HER2抗体1)改造抗体也显示与小鼠的交叉反应性。抗-HER2抗体2hIgG1对照抗体未显示与小鼠的交叉反应性。

用SCID Beige小鼠在10天的时期内测定了D1.5hIgG1阳性对照抗体的PK。具体而言，按多种剂量(0.5mg/kg、5mg/kg和50mg/kg)施用抗体后用Fc-Fc测定测定了抗体血清浓度随时间的变化。此外，用Fc-FcELISA测定监测相对于剂量的血清浓度10天(图27)。还测定了按剂量归一化的曲线下面积(AUC)，并总结在表4中。在所测试的剂量范围内，D1.5hIgG1抗体在小鼠中显示非线性PK。

表4

剂量(mg/kg)	按剂量归一化的至第10天的AUC
		0.5	11.8
5	53.8
		50	135

此外，还用SCID Beige小鼠在10天的时期内测定抗-HER2抗体2hIgG1阳性对照抗体的PK。按10mg/kg施用抗体后用Fc-Fc ELISA或HER2-ECD(胞外域)ELISA测定了抗体血清浓度随时间的变化。还测定了按剂量归一化的AUC，并总结在表5中。

表5

类似地，在10天的时期内在SCID Beige小鼠中测定了HER1(EGFR)/HER2(D1.5/抗-HER2抗体1)改造抗体的PK。按多种剂量(0.5mg/kg、5mg/kg和20mg/kg)施用抗体后用Fc-Fc ELISA或EGFR-HER2ELISA测定了抗体血清浓度随时间的变化。此外，用Fc-Fc ELISA或EGFR-HER2ELISA监测相对于剂量的血清浓度10天(图28)。还测定了按剂量归一化的AUC，并总结在表6中。在所测试的剂量范围内，HER1(EGFR)/HER2(D1.5/抗-HER2抗体1)改造抗体在小鼠中显示非线性PK。

表6

根据PK测定的结果，还确定了与D1.5hIgG1对照抗体相比，HER1(EGFR)/HER2(D1.5/抗-HER2抗体1)改造抗体在所测试的时期内在小鼠中具有相似或更好的暴露(图29)。

实施例6.在改造为表达酶来切割系链的哺乳动物细胞系中产生束缚抗体

对于带有26AA弗林蛋白酶可切割系链的卷曲螺旋抗体(图30A)的构建，首先用PCR制备希望的抗体的VH结构域(缺乏信号序列)，其中5’引物包含GGS-弗林蛋白酶系链的3’部分，并以5’BamHI位点终止，3’引物以3’ApaI位点终止。消化片段，并克隆入类似地制备的抗体-卷曲螺旋主链载体。然后用PCR制备希望的抗体的关联LC，其中5’引物以5’ClaI位点终止，3’引物包含弗林蛋白酶-GGS系链的5’部分，并以3’BamHI终止。通过用ClaI和BamHI将片段克隆在VH前来将LC片段连接至其关联HC(此时在抗体卷曲螺旋主链中)。将CL连接至VH的完整系链序列是RCRRGSGGSGGSGGSGGSGGSGRSRKRR(SEQ ID NO：35)。对于26AA弗林蛋白酶可切割系链(-C)(图30B)的构建，在上述构建体中引入两个突变。用Stratagene的Quikchange II XL位点定向诱变试剂盒将LC的C端Cys残基突变为Ala残基。按照Kabat编号系统，CL中的Cys末端残基在214位。还将HC的C220突变为A，以消除此新形成的非二硫键连接的Cys引起的可能的错折叠。

除完成的系链序列是RKRKRRGSGGSGGSGGSGGSGGSGRSRKRR(SEQ ID NO：36)外，用于构建32AA弗林蛋白酶可切割系链(图30C)的方法与26AA弗林蛋白酶可切割系链的构建相同。对于弗林蛋白酶过量表达，将人或鼠弗林蛋白酶克隆入pRK载体系统，并与抗体链质粒共转染。

用1∶20wt∶wt的CpB在37℃下在50mM硼酸钠pH 8.0中进行羧肽酶B消化(图30D)1小时。

图30A1-2是26氨基酸弗林蛋白酶可切割系链的示意图和还原型质谱分析(MS)结果。重链MS迹线或图显示具有完全天然的N端和C端的重链(1)，以及较小量的“全长抗体”(即，对于这些研究，未在任一弗林蛋白酶位点切割(FL))。轻链MS迹线显示对应于LC加全长系链的峰(1)，及对应于系链3’端侵蚀的另外3个峰(2-4)，这可能是由CHO培养基中的羧肽酶B活性引起。MS峰在紫色椭圆指示的下部迹线区域内的缺乏证明，未在N端弗林蛋白酶位点切割。提供产生的抗体的简图，其显示非天然残基(下划线的“R”)以及23-26氨基酸系链仍附着于LC的C端。

图30B1-2是26氨基酸弗林蛋白酶可切割系链(“-C”)的示意图和还原型质谱分析(MS)结果。在此构建体中，去除并取代了C残基。重链MS迹线显示具有完全天然的N端和C端的重链(1)，没有残余的“全长抗体”(FL)。轻链MS迹线显示对应于LC加2个附加R残基(峰2)、LC加一个附加R残基(峰3)及具有其天然C端的LC(峰4)的峰，这可能是由CHO培养基中的羧肽酶B活性引起。提供产生的抗体的简图，其显示非天然残基(黄色)以及0、1或2个R残基仍附着于LC的C端。

图30C1-5是32氨基酸弗林蛋白酶可切割系链的示意图和还原型质谱分析(MS)结果。图30C3显示具有完全天然的N端和C端的重链(峰1)，以及较小量的未在任一弗林蛋白酶位点切割的“全长抗体”(FL)。图30C2和30C3显示从表达天然水平的弗林蛋白酶的CHO细胞获得的物质，而图30C4和图30C5显示从过量表达弗林蛋白酶的CHO细胞获得的物质。图30C2显示对应于LC加全长系链的峰(峰1)和对应于系链3’端侵蚀的另外5个峰(峰2-6)，以及显示仅仍然附着弗林蛋白酶识别序列的LC的另一个峰(峰7)和对应于C端碱性残基侵蚀的另外5个峰(峰8-12)，这可能是由培养基中的羧肽酶B活性引起。图30C5显示具有完全天然的N端和C端的重链(1)，没有残余的全长抗体(FL)，图30C4显示现已在N端弗林蛋白酶位点完全切割的LC(7)，及对应于C端碱性残基侵蚀的另外4个峰(峰8-11)。

图30D2与图30C4相同。用1∶20wt∶wt的CpB在37℃孵育1小时后，彻底去除了残余的残基(对应于峰7-11)，产生具有天然C端的LC(图30D3)。提供简图，其显示各HC中的K222A突变是仅有的非天然残基，否则将是完全天然(与亲本相比)的双特异性抗体。

实施例7.酶可切割的束缚卷曲螺旋多特异性抗体在真核细胞中的表达及不含系链或卷曲螺旋的多特异性抗体的产生

在上文所述过量表达人弗林蛋白酶的CHO细胞中产生束缚卷曲螺旋双特异性抗体，该抗体包含两个不同的VH和VL，每条臂识别不同的靶标。用Lys-C内肽酶处理该抗体(其还包含K222A突变)来去除卷曲螺旋，并用羧肽酶B处理。无需进一步在铰合部和恒定区中突变抗体来达到最终的产物。图31显示终产物的非还原型质谱分析迹线。虽然可在非还原型MS中观察到少量同型二聚体，但这是由两条Ab链的表达水平不平衡引起，且可以容易地通过调节它们的相对表达水平来校正。图32显示终产物的还原型质谱分析迹线。观察到的LC和HC的质量确认了Ab链全都具有天然的N端和C端。

这些结果显示，此平台可以用于在哺乳动物细胞中产生几种类型的单臂抗体和双特异性抗体。在我们手中，我们已经能够产生与它们的亲本野生型Ab的不同仅在于各HC铰链区内的单个Lys-Ala突变的成熟双特异性抗体。这些抗体保留了它们的特异性，且双特异性变体能够同时结合两种抗原。这些抗体以高亲和力结合它们的抗原。

Claims (55)

1.抗体，其包含：

(a)含有VH结构域和第一卷曲螺旋结构域(CC)的第一多肽，其中所述第一CC包含式I的七残基重复序列：

(X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇)_n(式I)

X₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X₂、X₃和X₆各是任意氨基酸残基，

X₄是疏水性氨基酸残基，和

X₅和X₇各是带电荷氨基酸残基；和

(b)含有VH结构域和第二卷曲螺旋结构域(CC)的第二多肽，其中所述第二CC包含式II的七残基重复序列：

(X’₁X’₂X’₃X’₄X’₅X’₆X’₇)_n(式II)

X’₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X’₂、X’₃和X’₆各是任意氨基酸残基，

X’₄是疏水性氨基酸残基，和

X’₅和X’₇各是带电荷氨基酸残基；

其中式I和式II中的n大于或等于2；和

其中在各七残基重复序列中，所述第一CC包含电荷与所述第二CC中的X’₇残基相反的X₅残基，且所述第一CC包含电荷与所述第二CC中的X’₅残基相反的X₇残基。

2.权利要求1的抗体，其中所述第一和第二多肽各包含VH和CH1结构域。

3.权利要求2的抗体，其中所述第一和第二多肽各进一步包含铰合部结构域。

4.权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述第一和第二多肽各进一步包含CH2和CH3结构域。

5.权利要求1的抗体，其中所述第一和第二多肽各包含相对于彼此以VH-CH1-铰合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CH1、铰合部、CH2和CH3结构域。

6.权利要求1-5中任一项的抗体，其中所述抗体进一步包含第三和第四多肽，其中所述第三多肽包含第一VL结构域，且所述第四多肽包含第二VL结构域。

7.权利要求6的抗体，其中所述第一多肽的VH结构域通过系链连接至所述第三多肽的VL结构域，且所述第二多肽的VH结构域通过系链连接至所述第四多肽的VL结构域。

8.权利要求6的抗体，其中所述第三多肽进一步包含第一CL结构域，其中所述第一VL和CL结构域相对于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在所述第三多肽内，且所述第四多肽进一步包含第二CL结构域，其中所述第二VL和CL结构域相对于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位在所述第四多肽内。

9.权利要求6-8中任一项的抗体，其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域的序列相同。

10.权利要求1-9中任一项的抗体，其中所述第一多肽或所述第二多肽中至少一个的VH的N端以系链连接至CL的C端。

11.抗体，其包含：

(a)含有VH结构域和第一卷曲螺旋结构域(CC)的第一多肽，其中所述第一CC包含式I的七残基重复序列：

(X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇)_n(式I)

X₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X₂、X₃和X₆各是任意氨基酸残基，

X₄是疏水性氨基酸残基，和

X₅和X₇各是带电荷氨基酸残基；和

(b)含有CH2和CH3结构域及第二卷曲螺旋(CC)的第二多肽，其中所述第二CC包含式II的七残基重复序列：

(X’₁X’₂X’₃X’₄X’₅X’₆X’₇)_n(式II)

X’₁是疏水性氨基酸残基或天冬酰胺，

X’₂、X’₃和X’₆各是任意氨基酸残基，

X’₄是疏水性氨基酸残基，和

X’₅和X’₇各是带电荷氨基酸残基；

其中式I和式II中的n大于或等于2；和

其中在各七残基重复序列中，所述第一CC包含电荷与所述第二CC中的X’₇残基相反的X₅残基，且所述第一CC包含电荷与所述第二CC中的X’₅残基相反的X₇残基。

12.权利要求11的抗体，其中所述第一多肽包含VH和CH1结构域。

13.权利要求12的抗体，其中所述第一多肽进一步包含铰合部结构域。

14.权利要求12或13的抗体，其中所述第一多肽进一步包含CH2和CH3结构域。

15.权利要求11的抗体，其中所述第一多肽包含相对于彼此以VH-CH1-铰合部-CH2-CH3的N端至C端方向定位的VH、CH1、铰合部、CH2和CH3结构域。

16.权利要求11-15中任一项的抗体，其中所述抗体进一步包含第三多肽，其中所述第三多肽包含VL结构域。

17.权利要求16的抗体，其中所述第三多肽进一步包含CL结构域，且所述VL和CL结构域相对于彼此以VL-CL的N端至C端方向定位。

18.权利要求11-17中任一项的抗体，其中所述第一多肽的VH的N端以系链连接至CL的C端。

19.权利要求1-18中任一项的抗体，其中X₁、X’₁、X₄和X’₄任一个中的所述疏水性氨基酸残基选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。

20.权利要求1-19中任一项的抗体，其中X₅、X’₅、X₇和X’₇任一个中的所述带电荷氨基酸残基选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

21.权利要求1-20中任一项的抗体，其中在所述第一CC的至少一个七残基重复序列中，X₁是天冬酰胺，其中在所述第二CC的至少一个七残基重复序列中，各X’₁是天冬酰胺。

22.权利要求1-21中任一项的抗体，其中

(a)所述第一CC包含七残基重复序列，其中

X₁是亮氨酸或天冬酰胺，

X₂是丙氨酸或谷氨酰胺，

X₃是丙氨酸或谷氨酰胺，

X₄是亮氨酸，

X₅是谷氨酸，

X₆是赖氨酸或色氨酸，和

X₇是谷氨酸；和

(b)所述第二CC包含七残基重复序列，其中

X’₁是亮氨酸或天冬酰胺，

X’₂是丙氨酸或谷氨酰胺，

X’₃是丙氨酸或谷氨酰胺，

X’₄是亮氨酸，

X’₅是赖氨酸，

X’₆是赖氨酸或色氨酸，和

X’₇是赖氨酸。

23.权利要求1-22中任一项的抗体，其中n大于或等于3。

24.权利要求23的抗体，其中n大于或等于4。

25.权利要求1-24中任一项的抗体，其中所述第一或所述第二CC中至少一个在所述抗体的恒定结构域C端连接。

26.权利要求25的抗体，其中所述恒定结构域是CH3结构域，且所述第一CC在所述第一多肽的CH3结构域C端连接，所述第二CC在所述第二多肽的CH3结构域C端连接。

27.权利要求25或26的抗体，其中通过可切割的接头序列连接。

28.权利要求1-27中任一项的抗体，其中Lys-C内肽酶切割位点定位在所述第一或所述第二CC中至少一个的N端。

29.包含第一多肽的抗体，所述第一多肽包含相对于彼此以VL-CL-系链-VH-CH1-CH2-CH3(式III)的N端至C端方向定位的VL、CL、系链、VH、CH1、CH2和CH3结构域。

30.权利要求29的抗体，其中所述抗体进一步包含式III的第二多肽。

31.权利要求1-9或30中任一项的抗体，其中所述抗体是多特异性的。

32.权利要求31的抗体，其中所述抗体能够结合至少2种抗原。

33.权利要求31的抗体，其中所述抗体能够结合同一抗原上的至少2个表位。

34.权利要求1-9或30中任一项的抗体，其中所述抗体是双特异性的。

35.权利要求7、10、18、29或30中任一项的抗体，其中所述系链包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。

36.权利要求7、10、18、29、30或35中任一项的抗体，其中所述系链长度在15至50个氨基酸之间。

37.权利要求36的抗体，其中所述系链长度在20至26个氨基酸之间。

38.权利要求7、10、18、29、30或35-37中任一项的抗体，其中所述系链包含GGS重复序列。

39.权利要求7、10、18、29、30或35-38中任一项的抗体，其中所述系链是可切割的。

40.权利要求28-39中任一项的抗体，其中所述抗体包含去除Lys-C内肽酶切割位点的突变。

41.权利要求40的抗体，其中所述去除Lys-C内肽酶切割位点的突变在铰合部结构域中。

42.权利要求41的抗体，其中所述抗体具有K222A取代(EU编号系统)。

43.权利要求27或39的抗体，其中所述系链或所述接头可被以下内肽酶中的一种或多种切割：弗林蛋白酶、凝血酶、Genenase、Lys-C、Arg-C、Asp-N、Glu-C、因子Xa、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)、肠激酶、人鼻病毒C3蛋白酶(HRV C3)和激肽原酶。

44.权利要求27或39的抗体，其中所述系链或所述接头包含天冬酰胺-甘氨酸肽键。

45.权利要求44的抗体，其中所述天冬酰胺-甘氨酸肽键可被羟胺切割。

46.权利要求1-45中任一项的抗体，其中所述抗体包含与细胞毒剂缀合的恒定区。

47.权利要求1-45中任一项的抗体，其中所述抗体由哺乳动物细胞表达。

48.权利要求47的抗体，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。

49.权利要求1-45中任一项的抗体，其中所述抗体由原核细胞表达。

50.权利要求49的抗体，其中所述原核细胞是大肠杆菌细胞。

51.产生抗体的方法，所述方法包括在培养基中培养包含编码权利要求1-45中任一项的抗体的载体的细胞的步骤。

52.权利要求51的方法，其中所述方法进一步包括从所述细胞或所述培养基回收所述抗体。

53.权利要求52的方法，其进一步包括以下步骤：

(a)在包含A蛋白的柱上捕获所述抗体，

(b)从所述柱洗脱所述抗体，和

(c)将所述洗脱抗体稀释在包含离液剂或温和去垢剂的溶液中。

54.在溶液中保持包含卷曲螺旋的抗体的方法，所述方法包括在离液剂或温和去垢剂的存在下保持所述抗体。

55.权利要求53或54的方法，其中所述离液剂或温和去垢剂是精氨酸、盐酸胍、尿素、高氯酸锂、组氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween、Triton或NP-40。

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