TW202309097A - 抗ｃ－ｃ模體趨化因子受體８（ｃｃｒ８）抗體及其使用方法 - Google Patents

抗ｃ－ｃ模體趨化因子受體８（ｃｃｒ８）抗體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露提供抗 CCR8 抗體，以及它們的製備及用途之組成物及方法。

Description

抗　C-C　模體趨化因子受體　8　(CCR8)　抗體及其使用方法
本揭露提供抗 CCR8 抗體，以及它們的製備及用途之組成物及方法。
表現轉錄因子 Foxp3 的調節性 T (Treg) 細胞對保持周圍免疫耐受性並且預防自身免疫很重要。參見例如 Sakaguchi 等人， Cell(2008) 133:775-787。Treg 細胞還構成實性癌的免疫浸潤之主要組分，藉由建立免疫抑制腫瘤微環境並抑制抗腫瘤免疫反應來促進腫瘤的發展和進展。參見例如 Plitas 及 Rudensky, Annu. Rev. Cancer Biol.(2020) 4:459-477。Treg 細胞也會阻礙免疫療法的功效。參見例如 Nishikawa 及 Sakaguchi, Curr. Opin. Immunol.(2014) 27:1-7。腫瘤浸潤淋巴細胞中 Treg 細胞比例增加與若干癌症適應症的較差結果相關。參見例如 Fu 等人， Gastroenterology(2007) 132:2328-2339；Petersen 等人， Cancer(2006) 107:2866-2872；Shang 等人， Nature - Scientific Reports(2015) 5:15179 (9 頁)；Shen 等人， J. Cancer Res. Clin. Oncol.(2010) 136:1585-1595；以及 Tanaka 及 Sakaguchi, Eur. J. Immunol.(2019) 49:1140-1146。
在臨床前乳癌、黑色素瘤和大腸癌模型中，涉及 Treg 細胞消耗或抑制之若干策略已被證明可增強抗腫瘤免疫並導致腫瘤生長抑制。參見例如 Bos 等人， J. Exp. Med.(2013) 2435-2446；Klages 等人， Cancer Res.(2010) 70:7788-7799；及 Pastille 等人， Cancer Res.(2014) 74:4258-4269。然而，靶向 Treg 細胞及效應 T 細胞上表現的表面受體 (諸如，CD25) 之策略在所建立之腫瘤中示出有限的功效，這可能是由於同時消耗了對抗腫瘤免疫至關重要之效應 T 細胞。參見例如 Onizuka 等人， Cancer Res.(1999) 59:3128-3133。
趨化因子受體 CCR8 為一種七跨膜 G 蛋白偶聯受體 (GPCR)，並藉由人/小鼠 CCL1 以高親和力連接，並且在腫瘤微環境中由 Treg 細胞選擇性且高度表現，但外周 Treg 細胞或效應 T 細胞基本不表現。Treg 細胞上的高 CCR8 表現係與乳癌患者中之晚期疾病階段及整體存活期降低相關。參見例如 Plitas 等人， Immunity(2016) 45:1122-1134。因此，CCR8 代表了癌症治療中 Treg 細胞耗竭的有前景且更安全的目標。因此，需要識別 CCR8 的藥劑及使用此等藥劑之方法。
本揭露提供抗 CCR8 抗體、組成物及其製備和使用方法。
實施例 1. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 C-C 模體趨化因子受體 8 (CCR8) 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。
實施例 2. 如實施例 1 之前述抗體，其不依賴 CCR8 硫酸化而與 CCR8 結合。
實施例 3. 如實施例 1 或 2 之前述抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 2 至 6 中之一者或多者組成的表位結合。
實施例 4. 如實施例 1 至 3 中任一項之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 5. 如實施例 1 至 4 中任一項之前述抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列。
實施例 6. 如實施例 1 至 5 中任一項之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 7. 如實施例 1 至 6 中任一項之前述抗體，其包含：VH 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 VL 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性。
實施例 8. 如實施例 1 至 7 中任一項之前述抗體，其中該 VL 包含 V4M 突變、P43A 突變、F46L 突變、C90Q 突變或其組合。
實施例 9. 如實施例 1 至 8 中任一項之前述抗體，其中該 VH 包含 G49S 突變、K71R 突變、S73N 突變或其組合。
實施例 10. 如實施例 1 至 9 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 55 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 11. 如實施例 1 至 9 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 60 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 12. 如實施例 1 至 9 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 111 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 13. 如實施例 1 至 9 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 113 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 14. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列。
實施例 15. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列。
實施例 16. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
實施例 17. 如實施例 16 之前述抗體，其不依賴 CCR8 硫酸化而與 CCR8 結合。
實施例 18. 如實施例 16 或 17 之前述抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 91 至 104 及 172 至 193 中之一者或多者組成的表位結合。
實施例 19. 如實施例 16 至 18 中任一項之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 20. 如實施例 16 至 19 中任一項之前述抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列。
實施例 21. 如實施例 16 至 20 中任一項之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 22. 如實施例 16 至 21 中任一項之前述抗體，其包含：VH 序列，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 VL 序列，其與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性。
實施例 23. 如實施例 16 至 22 中任一項之前述抗體，其中 VL 包含 Y2I 突變。
實施例 24. 如實施例 16 至 23 中任一項之前述抗體，其中 VH 包含 S73N 突變、V78L 突變、T76N 突變、F91Y 突變及 P105Q 突變、或其組合。
實施例 25. 如實施例 16 至 24 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 57 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 26. 如實施例 16 至 24 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 61 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 27. 如實施例 16 至 24 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 112 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 28. 如實施例 16 至 24 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 114 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 29. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列。
實施例 30. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列。
實施例 31. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
實施例 32. 如實施例 31 之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 95 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 33. 如實施例 31 或 32 之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列。
實施例 34. 如實施例 31 至 33 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 101 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 100 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 35. 如實施例 31 至 33 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 115 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 100 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 36. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。
實施例 37. 如實施例 36 之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 97 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 38. 如實施例 36 或 37 之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列。
實施例 39. 如實施例 36 至 38 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 103 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 40. 如實施例 36 至 38 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 116 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 41. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。
實施例 42. 如實施例 41 之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 43. 如實施例 41 或 42 之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列。
實施例 44. 如實施例 41 至 43 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 105 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 45. 如實施例 41 至 44 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 117 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 46. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體不依賴 CCR8 硫酸化而與 CCR8 結合。
實施例 47. 如實施例 46 之前述抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 2 至 6 中之一者或多者組成的表位結合。
實施例 48. 如實施例 46 之前述抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 91 至 104 及 172 至 193 中之一者或多者組成的表位結合。
實施例 49. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種與小鼠 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
實施例 50. 如實施例 49 之前述抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列：(a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；(b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
實施例 51. 如實施例 49 或 50 之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列。
實施例 52. 如實施例 49 至 51 中任一項之前述抗體，其包含 SEQ ID NO: 72 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 71 之輕鏈胺基酸序列。
實施例 53. 如實施例 1 至 48 中任一項之前述抗體，其為人類抗體。
實施例 54. 如實施例 1 至 48 中任一項之前述抗體，其為人源化抗體。
實施例 55. 如實施例 1 至 52 中任一項之前述抗體，其為嵌合抗體。
實施例 56. 如實施例 1 至 55 中任一項之前述抗體，其為與 CCR8 結合之抗體片段。
實施例 57. 如實施例 1 至 56 中任一項之前述抗體，其為全長抗體。
實施例 58. 如實施例 57 之前述抗體，其為全長 IgG1 抗體。
實施例 59. 如實施例 1 至 58 中任一項之前述抗體，其包含 IgG1 恆定域，該 IgG1 恆定域包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
實施例 60. 如實施例 1 至 59 中任一項之前述抗體，其包含 κ 恆定域，該 κ 恆定域包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
實施例 61. 如實施例 1 至 60 中任一項之前述抗體，其中該抗體以約 1 × 10-12 M 至約 1 × 10-11 M 之結合親和力 (Kd) 與 CCR8 結合。
實施例 62. 如實施例 1 至 48 中任一項之前述抗體，其中 CCR8 為人類 CCR8。
實施例 63. 如實施例 1 至 62 中任一項之前述抗體，其中該抗體為去岩藻醣基化 (afucosylated)。
實施例 64. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種分離之核酸，其編碼如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體。
實施例 65. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種宿主細胞，其包含如實施例 64 之前述核酸。
實施例 66. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種生產與 CCR8 結合之抗體的方法，其包含在適合於表現該抗體之條件下培養如實施例 65 之前述宿主細胞。
實施例 67. 如實施例 66 之前述方法，其進一步包含自宿主細胞回收該抗體。
實施例 68. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種抗體，其藉由如實施例 67 之前述方法生產。
實施例 69. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供一種醫藥組成物，其包含如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體及醫藥上可接受之載劑。
實施例 70. 如實施例 69 之前述醫藥組成物，其進一步包含另外的治療劑。
實施例 71. 如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物，其用為藥物。
實施例 72. 如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物，其用於治療癌症。
實施例 73. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物在製造用於治療癌症之藥物中的用途。
實施例 74. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物在製造用於消耗調節性 T 細胞之藥物中的用途。
實施例 75. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種治療有此需要之個體的癌症之方法，其包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物。
實施例 76. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種消耗患有癌症之個體的腫瘤微環境中之調節性 T 細胞的方法，其包含向個體投予有效量之如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物，該有效量足以消耗腫瘤微環境中之調節性 T 細胞。
實施例 77. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種消耗患有癌症之個體的腫瘤微環境外部之調節性 T 細胞的方法，其包含向個體投予有效量之如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物，該有效量足以消耗腫瘤微環境外部之調節性 T 細胞。
實施例 78. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種消耗來自癌細胞群體中之調節性 T 細胞的活體外方法，其包含使細胞群體與一定量之如實施例 1 至 63 中任一項之前述抗體或如實施例 69 至 70 中任一項之前述醫藥組成物接觸，該一定量足以消耗來自細胞群體中之調節性 T 細胞。
實施例 79. 如實施例 73 至 78 中任一項之前述用途或方法，其中該癌症係選自由以下所組成之群組：膀胱癌、胚細胞瘤、血癌、骨癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎臟癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、皮膚癌、睾丸癌及子宮癌。
實施例 80. 如實施例 74、76、78 及 79 中任一項之前述用途或方法，其中存在於該癌症之腫瘤微環境中的調節性 T 細胞被消耗。
實施例 81. 如實施例 74、77、78 及 79 中任一項之前述用途或方法，其中癌症之腫瘤微環境外部的調節性 T 細胞被消耗。
實施例 82. 如實施例 73 至 81 中任一項之前述用途或方法，其進一步包含投予另外的治療劑。
實施例 83. 如實施例 82 之前述用途或方法，其中另外的治療劑為抗癌劑。
實施例 84. 如實施例 83 之前述用途或方法，其中該抗癌劑係選自由以下所組成之群組：微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡誘導劑、抗血管生成劑、免疫調節劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑或細胞生長抑制劑、細胞凋亡誘導劑、增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑、細胞激素、抗癌疫苗或溶瘤病毒、類鐸受體 (TLR) 劑、雙特異性抗體、細胞療法及免疫細胞接合物。
實施例 85. 如實施例 83 或 84 之前述用途或方法，其中該抗癌劑為 PD-L1 結合拮抗劑。
實施例 86. 如實施例 85 之前述用途或方法，其中 PD-L1 結合拮抗劑為阿替利珠單抗 (atezolizumab)。
實施例 87. 如實施例 73 至 85 中任一項之前述用途或方法，其中該個體為人類。
實施例 88. 如實施例 73 至 85 中任一項之前述用途或方法，其中該個體為小鼠。
實施例 89. 在某些非限制性實施例中，目前揭示的標的提供了一種治療小鼠之疾病的方法，其包含向該小鼠投予有效量之如前述實施例 49 至 52 中任一項之單株抗體以治療該疾病。
實施例 90. 如實施例 89 之前述方法，其中小鼠包含異種移植體。
實施例 91. 如實施例 63 之前述抗體，其中去岩藻醣基化之比例係在約 80% 至約 95% 之間。
實施例 92. 如實施例 1 至 15 及 46 至 48 中任一項之前述抗體，其中在第 1 天靜脈內投予單一 10 mg/kg 劑量後之平均清除率在 35 天期間係在約 3 至約 5 mL/天/kg 之間。
相關申請的交叉引用
本申請案主張 2021年 10 月 8 日所申請之美國臨時申請案第 63/253,676 號及 2021 年 7 月 14 日所申請之美國臨時申請案第 63/221,734 號之優先權，兩者之全部內容以引用方式併入本文中，並主張彼等優先權。 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已經以 xml 格式經由 EFS-Web 提交且其全部內容以引用方式併入本文中。該 xml 拷貝創建於 2022 年 7 月 12 日，命名為 00B206.1290.xml。 I. 界定
「受體人框架」為本文中之目的是如下述定義的衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架、包含輕鏈可變域 (VL) 框架或重鏈可變域 (VH) 框架的胺基酸序列之框架。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些態樣中，胺基酸變更數目為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些態樣中，VL 受體人框架與 VL 人免疫球蛋白框架序列或人共同框架序列的序列相同。
「親和力」指代分子 (例如，抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如，抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文所用的「結合親和力 (binding affinity)」指代反映結合對成員 (例如，抗體與抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K D) 來表示。可以藉由本領域已知的習知方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。本文描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和例示性方法。
術語「親和力成熟」之抗體是指在一或多個互補決定區 (CDR) 中具有一或多種變化之抗體，與不具有此等變化之親本抗體相比，此類變化引起該抗體對抗原之親和力的改善。
術語「抗 CCR8 抗體」及「結合至 CCR8 之抗體」係指能夠以足夠親和力結合 CCR8，從而使得該抗體可用作靶向 CCR8 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體與無關、非 CCR8 蛋白質結合之程度低於該抗體與 CCR8 結合約 10%，其藉由例如表面電漿子共振 (SPR) 所量測。在某些態樣中，結合至 CCR8 之抗體之解離常數 (K D) 是 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更少，例如 10 -13M 至 10 -8M，例如 10 -13M 至 10 -9M)。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -10M、約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -11M 或約 1 × 10 -11M 至約 5 × 10 -11M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 2 × 10 -11M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 5 × 10 -12M 之 K D。當抗體具有 1 μM 或更少之 K D時，該抗體被稱為與 CCR8「特異性結合」。在某些實施例中，抗 CCR8 抗體與至少兩種不同物種 (例如，人和食蟹獼猴) 中的 CCR8 表位結合。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括 (但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab') 2；從抗體片段所形成之雙功能抗體 (diabody)、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv 及 scFab)；單域抗體 (dAbs)；及多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology(2005) 23:1126-1136。
術語「表位 (epitope)」表示抗 CCR8 抗體與之結合的抗原上的位點，無論是蛋白性的還是非蛋白性的。表位可由連續的胺基酸延伸形成 (線性表位) 或包含非連續的胺基酸 (構象表位)，例如，由於抗原的折疊，即藉由蛋白抗原的三級折疊而在空間上接近。線性表位通常在蛋白抗原暴露於變性劑後仍與抗 CCR8 抗體結合，而構象表位通常在變性劑處理後被破壞。表位包含至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個、至少 8 個、至少 10 個、至少 15 個、至少 20 個、至少 30 個、或至少 35 個、或 3 個至 25 個、3 個至 20 個、3 個至 15 個、3 個至 10 個、3 個至 5 個、30 個至 40 個、35 個至 40 個或 5 個至 10 個獨特空間構形的胺基酸。
篩選與特定表位結合的抗體 (即與相同表位結合者) 可使用本領域的常規方法進行，例如像是但不限於丙胺酸掃描、胜肽印漬 (參見例如 Kobeissy 等人， Meth. Mol. Biol.(2004) 248: 443-463)、胜肽裂解分析、表位切除、表位萃取、抗原的化學修飾 (參見 Hochleitner 等人，Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) 及交叉阻斷 (參見「Antibodies」，Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY))。
基於抗原結構的抗體剖析 (ASAP)，也稱為修飾輔助剖析 (MAP)，允許根據從眾多化學或酶修飾的抗原表面的各抗體結合剖析，將特異性結合 CCR8 的眾多單株抗體進行分箱 (bin)(參見例如 US 2004/0101920)。各分箱中的抗體都與相同表位結合，這個表位可能是獨特的表位，與另一分箱所代表的表位明顯不同或部分重疊。
又，競爭性結合可用來易於確定抗體是否與 CCR8 的相同表位結合，或與參考抗 CCR8 抗體競爭性結合。例如，與參考抗 CCR8 抗體「結合在相同表位的抗體」係指在競爭性測定中阻斷參考抗 CCR8 抗體與其抗原結合 50% 或更多的抗體，且反之，參考抗體在競爭測定中阻斷該抗體與其抗原結合 50% 或更多。又例如，為了確定抗體是否與參考抗 CCR8 抗體結合在相同表位，讓參考抗體在飽和條件下與 CCR8 結合。在去除過量的參考抗 CCR8 抗體後，評估有關抗 CCR8 抗體與 CCR8 結合的能力。如果在參考抗 CCR8 抗體飽和結合後，抗 CCR8 抗體與能夠與 CCR8 結合，則可以斷定該抗 CCR8 抗體與參考抗 CCR8 抗體結合的表位不同。但是，如果在參考抗 CCR8 抗體飽和結合後，該抗 CCR8 抗體不能與 CCR8 結合，則該抗 CCR8 抗體可能與參考抗 CCR8 抗體結合的表位相同。為了確認該抗體是否與相同的表位結合，或者只是由於立體原因而阻礙了結合，可以使用常規實驗 (例如，使用 ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞術或本領域中可獲得的任何其他定量或定性的抗體結合測定進行胜肽突變和結合分析)。此測定應分兩次設置進行，即以兩種抗體為飽和抗體。如果在這兩種設置中，只有第一種 (飽和) 抗體能夠與 CCR8 結合，則可斷定該抗 CCR8 抗體和參考抗 CCR8 抗體競爭結合至 CCR8。
在一些態樣中，如果一個抗體的 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍或 100 倍的過量抑制另一抗體的結合至少 50%、至少 75%、至少 90% 或甚至 99% 或更多 (藉由競爭性結合測定測量)，則認為兩個抗體與相同或重疊的表位結合 (參見例如 Junghans 等人，Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502)。
在一些態樣中，如果抗原中基本上所有的胺基酸突變降低或消除了一個抗體的結合，也降低或消除了另一抗體的結合，則認為兩個抗體與相同表位結合。如果只有減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變的次集合 (subset) 減少或消除另一抗體的結合，則認為兩種抗體具有「重疊表位 (overlapping epitope)」。
術語「嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為亞型 (同型 (isotype))，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 1同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 1同型，具有 P329G、L234A 及 L235A 突變以減少 Fc 區域效應功能。在其他態樣中，該抗體是屬 IgG 2同型。在某些態樣中，該抗體是屬 IgG 4同型，在鉸鏈區中具有 S228P 突變以改善 IgG 4抗體之穩定性。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
如本申請中使用的術語「衍生自人源的恆定區」或「人恆定區」表示亞類 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 的人抗體的恆定重鏈區及/或恆定輕鏈區 κ 或 λ 區。此等恆定區在現有技術中係習知者，例如，Kabat, E.A. 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 中所揭示者 (亦參見例如 Johnson, G. 與 Wu, T.T.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218；Kabat, E.A. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785--2788)。除非本文另有說明，否則恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統，也稱為 Kabat 之 EU 索引，如 Kabat, E.A.等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 所述。
「效用功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的下調；以及 B 細胞活化。
藥劑例如醫藥組成物的「有效量」係指在必要之劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在一個態樣中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種，特別是一種或兩種胺基酸之轉譯後切割。因此，由宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變異體。重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，EU 編號系統)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (Lys447)。在一個態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文指明之 Fc 區的重鏈包含另外的 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，EU 編號系統)。在一個態樣中，包含在根據本發明之抗體中的包括本文指明之 Fc 區的重鏈包含另外的 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 EU 索引編號)。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 ( Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。
「框架」或「FR」係指互補決定區 (CDR) 之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體或具有含有本文定義的 Fc 區域的重鏈之抗體。應理解，全長抗體包含如本文所定義之重鏈可變域及輕鏈可變域，以及如本文所定義之 Fc 區域。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指已向其中引入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括與自原始轉變細胞中所篩選或選擇具有相同功能或生物活性的突變子代細胞。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列之亞組是如 Kabat 等人在 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷 中所述之亞組。在一個態樣中，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I。在一個態樣中，對於 VH，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 III。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」是指已經歷人源化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區域，例如「互補決定區」(「CDR」)。
在某些態樣中，抗體包含六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，且三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在某些態樣中，包含六個 CDR 的抗體為全長抗體。在某些態樣中，包含六個 CDR 的抗體為抗體片段。
在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3) 處 (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))；及 (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))。
除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人之上述文獻及 Chothia 之上述文獻中所述之方法確定。本領域之技術人員將理解，亦可以根據 McCallum 之上述文獻或任何其他科學上可接受之命名系統來確定 CDR 名稱。
在一個態樣中，CDR 殘基包括圖 5A 至圖 5D 和圖 6A 至圖 6D 及表 C1、C2、D1 和 D2 中所識別之殘基。在其他態樣中，CDR 殘基包括在表 N1、N2、O1 和 O2 中所識別之殘基。
「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些態樣中，個體為人類。
「分離的」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些態樣中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由例如電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人， J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如，互補 DNA (cDNA) 和基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言訊息 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個該等分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生糖、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還涵蓋適於在體外及/或體內例如在宿主或個體體內直接表現如本文所述之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。該等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表現，從而將 mRNA 注入個體以產生體內抗體 (參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，線上發表于 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「經分離之編碼抗 CCR8 抗體的核酸」係指編碼抗 CCR8 抗體重鏈和輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨抗體中之此等核酸分子，並且此等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置。
如本文所用的術語「單株抗體」是指獲自實質上同質抗體群體之抗體， 即群體中包含的個別抗體是相同的且/或結合相同抗原決定位，但不包括， 例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常是以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，根據本揭露的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體顯示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「裸抗體」是指未與異源部分 (例如，細胞毒性部分) 或放射性標記共軛之抗體。裸抗體可存在於醫藥組成物中。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體醣蛋白。從 N 端 至 C 端，每條重鏈具有可變域 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區，接著係三個重鏈恆定域 (CH1、CH2及CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變域 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域。
術語「藥品仿單」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、聯合療法、禁忌症及/或警告等資訊。
相對於參照多肽序列所述之「胺基酸序列同一性百分比 (%)」，是指候選序列中胺基酸殘基與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟件或 FASTA 程式套件實現。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。可替代地，可使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2001/007611 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 套件 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式及 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性百分比值。FASTA 程式套件由以下作者開發：W. R. Pearson 及 D. J. Lipman (1988) (「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」, PNAS85:2444-2448)；W. R. Pearson (1996) (「Effective protein sequence comparison」 Meth. Enzymol.266:227-258)；及 Pearson 等人(1997) Genomics 46:24-36，且可從 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta 公開獲取。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_ www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
術語「醫藥組成物」及「醫藥製劑」在本文可以互換使用，係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對醫藥組成物將投予之個體具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」是指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另有說明，否則如本文所用的術語「CCR8」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然 CCR8，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類及食蟹獼猴 (「cyno」)) 及囓齒類動物 (例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 CCR8 以及在細胞處理中得到的任何形式的 CCR8。該術語亦涵蓋天然生成之 CCR8 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。在某些態樣中，CCR8 為人類 CCR8 (「hCCR8」或「huCCR8」)。例示性人類 CCR8 之胺基酸序列在 SEQ ID NO:106 中列出，如下表所示。在某些態樣中，CCR8 為食蟹獼猴 (「cyno」) CCR8。例示性食蟹獼猴 CCR8 之胺基酸序列在 SEQ ID NO: 107 中列出，如下表所示。在某些態樣中，CCR8 為小鼠 CCR8 (「mCCR8」)。例示性小鼠 CCR8 之胺基酸序列在 SEQ ID NO: 108 中列出，如下表所示。
表 1. 例示性 CCR8 序列
說明 序列
人 CCR8 SEQ ID NO: 106 MDYTLDLSVTTVTDYYYPDIFSSPCDAELIQTNGKLLLAVFYCLLFVFSLLGNSLVILVLVVCKKLRSITDVYLLNLALSDLLFVFSFPFQTYYLLDQWVFGTVMCKVVSGFYYIGFYSSMFFITLMSVDRYLAVVHAVYALKVRTIRMGTTLCLAVWLTAIMATIPLLVFYQVASEDGVLQCYSFYNQQTLKWKIFTNFKMNILGLLIPFTIFMFCYIKILHQLKRCQNHNKTKAIRLVLIVVIASLLFWVPFNVVLFLTSLHSMHILDGCSISQQLTYATHVTEIISFTHCCVNPVIYAFVGEKFKKHLSEIFQKSCSQIFNYLGRQMPRESCEKSSSCQQHSSRSSSVDYIL
食蟹獼猴 CCR8 SEQ ID NO: 107 MDYTLDPSMTTMTDYYYPDSLSSPCDGELIQRNDKLLLAVFYCLLFVFSLLGNSLVILVLVVCKKLRNITDIYLLNLALSDLLFVFSFPFQTYYQLDQWVFGTVMCKVVSGFYYIGFYSSMFFITLMSVDRYLAVVHAVYAIKVRTIRMGTTLSLVVWLTAIMATIPLLVFYQVASEDGVLQCYSFYNQQTLKWKIFTNFEMNILGLLIPFTIFMFCYIKILHQLKRCQNHNKTKAIRLVLIVVIASLLFWVPFNVVLFLTSLHSMHILDGCSISQQLNYATHVTEIISFTHCCVNPVIYAFVGEKFKKHLSEIFQKSCSHIFIYLGRQMPRESCEKSSSCQQHSFRSSSIDYIL
小鼠 CCR8 SEQ ID NO: 108 MDYTMEPNVTMTDYYPDFFTAPCDAEFLLRGSMLYLAILYCVLFVLGLLGNSLVILVLVGCKKLRSITDIYLLNLAASDLLFVLSIPFQTHNLLDQWVFGTAMCKVVSGLYYIGFFSSMFFITLMSVDRYLAIVHAVYAIKVRTASVGTALSLTVWLAAVTATIPLMVFYQVASEDGMLQCFQFYEEQSLRWKLFTHFEINALGLLLPFAILLFCYVRILQQLRGCLNHNRTRAIKLVLTVVIVSLLFWVPFNVALFLTSLHDLHILDGCATRQRLALAIHVTEVISFTHCCVNPVIYAFIGEKFKKHLMDVFQKSCSHIFLYLGRQMPVGALERQLSSNQRSSHSSTLDDIL
如本文所用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病 (例如，癌症) 自然病程的臨床干預，並且可進行預防 (「預防性治療過程」或「預防性治療中」) 或在臨床病理 (「治療性治療過程」或「治療性治療中」) 過程中執行。期望之治療性治療效果包括但不限於減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防癌症轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、及緩解或改善預後。期望之預防性治療效果包括但不限於預防疾病之發生或復發。在一些態樣中，如本文所述之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。(參見例如，Kindt 等人， Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007))。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見例如，Portolano 等人， J. Immunol.150:880-887 (1993)；Clarkson 等人， Nature352:624-628 (1991)。
如本文所用，術語「載體」是指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠引導與其操作性連接之核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。 II. 組成物及方法
在一個態樣中，本揭露部分基於對新型抗 CCR8 抗體之發現，該抗體對 CCR8 具有獨特且改善之結合及選擇性。目前揭示的抗 CCR8 抗體還具有改善之抗體穩定性 (例如，低聚集、良好溶解性及低黏度)。本揭露進一步部分基於以下發現：目前揭示的抗體之去岩藻醣基化形式具有增加的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 及抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活性。在某些態樣中，提供了與 CCR8 結合之抗體。如本文所述之抗體例如可用於治療癌症。 A. 例示性抗 CCR8 抗體
在一個態樣中，本揭露提供了與 CCR8 結合之抗體。在一個態樣中，提供之抗體為與 CCR8 結合之分離的抗體。在一個態樣中，本揭露提供了與 CCR8 特異性結合之抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 2 至 6 中之一者或多者組成的表位結合。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 91 至 104 及 172 至 193 中之一者或多者組成的表位結合。在某些態樣中，CCR8 為人類 CCR8、小鼠 CCR8 或食蟹獼猴 CCR8。在某些態樣中，CCR8 為人類 CCR8。在一個態樣中，本揭露提供了與 CCR8 結合之抗體，該抗體不依賴 CCR8 之酪胺酸硫酸化 (「不依賴硫酸化」)。發明人已發現不依賴硫酸化之例示性抗體包括 Ab4及 Ab5，如下文更詳細地描述。
在某些態樣中，本文提供之抗體具有的解離常數 (K D) 是 ≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM、或 ≤ 0.001 nM (例如 10 -8M 或更少，例如 10 -8M 至 10 -13M，例如 10 -9M 至 10 -13M)。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -10M、約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -11M 或約 1 × 10 -11M 至約 5 × 10 -11M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 2 × 10 -11M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 5 × 10 -12M 之 K D。在一個態樣中，使用放射性標記之 IgG 及穩定表現抗原之 CHO 細胞株來測量 K D。將表現抗原之穩定 CHO 細胞以每孔 50,000 個細胞接種在冷結合緩衝液 (Opti-MEM+2% FBS+50mM HEPES，pH 7.2+0.1% 疊氮化鈉) 中。使用 NEX244 Iodogen 方法 (PerkinElmer) 將固定濃度的 125I 放射性標記之目標抗原與從 20nM 或 50nM 開始之連續稀釋的目標抗體混合。將抗體混合物添加至細胞中並在溫和攪拌下在室溫孵育 12 小時。然後將細胞及抗體轉移至 Millipore 多篩過濾盤中。將濾盤用 250 µL 冷結合緩衝液洗滌 4 次並乾燥至少 30 分鐘，然後將濾盤衝入 5 mL 聚苯乙烯管中。使用 Perkin Elmer Wallac Wizard 2470 伽馬計數器量測放射性，該計數器設定為每分鐘 1 次計數，計數效率為 0.8。使用 GraphPad Prism 中的異源一個位點擬合 Ki 競爭性結合模型來擬合資料。
在某些態樣中，本文提供之抗體展示出在第 1 天靜脈內投予單一 10 mg/kg 劑量後，平均清除率在 35 天期間係在約 3 至約 5 mL/天/kg 之間。舉例而言但並不加以限制，此等投予可以包括單一 10 mg/kg IV 推注之 mAb。可以在給藥後 0.25、2 及 6 小時；1、2、7、14、21、28 及 35 天收集用於分析之血樣，並且使用各種手段 (例如合格的 ELISA 分析方法) 測定血清的 mAb 濃度。在某些態樣中，投予係針對哺乳動物。在某些態樣中，投予係針對靈長類動物。在某些態樣中，投予係針對非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。在某些態樣中，投予係針對人。 (i) Ab5 及其片段之實施例
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 及食蟹獼猴 CCR8 兩者結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 32。在另一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 32；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 28。在再一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 32, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 28；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 31。在再一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26；(b) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 27；及 (c) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 28。
在另一態樣中，如本文所述之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 及食蟹獼猴 CCR8 兩者結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列之一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列之一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列之 CDR 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列之 CDR 序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列的 CDR 序列。在另一個實施例中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 48 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 47 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 47 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 48 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 48 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與 SEQ ID NO: 48 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列；及 VH 域，其與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列；及 VH 域，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 47 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO:48 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 48 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣中的 VH 序列及上文提供的任一態樣中的 VL 序列。在一個態樣中，該抗體包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個態樣中，該抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VL 序列包含 V4M 突變、P43A 突變、F46L 突變、C90Q 突變或其組合。在一個態樣中，VH 包含 G49S 突變、K71R 突變、S73N 突變或其組合。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 (a) IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列，及 (b) κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列及 SEQ ID NO:48: 之 VL 序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 55 之重鏈及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 60 之重鏈及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體之重鏈包含縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 111 之重鏈及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 113 之重鏈及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體不與 CCR8 配體結合。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體不具有 CCR8 配體阻斷活性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為非中和抗體。在一個態樣中，CCR8 配體為 CCL1。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體不依賴用於結合的 CCR8 之酪胺酸硫酸化 (即，不依賴硫酸化) 而與 CCR8 結合。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體為去岩藻醣基化抗體變異體。在在一個態樣中，去岩藻醣基化抗體變異體具有增強的 FcγRIIIa 受體結合。在一個態樣中，去岩藻醣基化抗 CCR8 抗體變異體具有增強的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。在一個態樣中，抗 CCR8 去岩藻醣基化抗體變異體具有抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活性。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體具有改善之抗體穩定性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體具有低聚集、良好溶解性及/或低黏度。在任何上述實施例之某些態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體具有約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -11M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 5 × 10 -12M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 4 × 10 -12M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 3 × 10 -12M 之 K D。
在一個態樣中，本揭露中抗 CCR8 抗體命名為「hu.Ab5.H13L1」，其可以為岩藻醣基化或去岩藻醣基化，其視情況在 G236A 及 I331E 處包含一個或多個重鏈突變，並且視情況包含縮短的重鏈 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。
在再一態樣中，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或人類抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或 F(ab') 2片段。 (ii) Ab4 及其片段之實施例
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 及食蟹獼猴 CCR8 兩者結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 7。在另一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 7；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 3。在再一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 7, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 3；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 6。在再一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在另一態樣中，如本文所述之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 及食蟹獼猴 CCR8 兩者結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列之一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列之一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列之 CDR 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列之 CDR 序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列的 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 24 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 21 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 21 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 21 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 21 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 21 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 21 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 21 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 21 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 24 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 24 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 24 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 24 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 24 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 24 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 24 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與 SEQ ID NO: 24 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；及 VH 域，其與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；及 VH 域，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 21 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 24 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣中的 VH 序列及上文提供的任一態樣中的 VL 序列。在一個態樣中，該抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列，其包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個態樣中，該抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VL 序列包含 Y2I 突變。在一個態樣中，VH 序列包含 S73N 突變、V78L 突變、T76N 突變、F91Y 突變及 P105Q 突變或其組合。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 (a) IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列，及 (b) κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列及 SEQ ID NO:24: 之 VL 序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 57 之重鏈及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 61 之重鏈及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體之重鏈包含縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 112 之重鏈及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 114 之重鏈及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體與 CCR8 配體結合。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體針對 CCR8 配體具有拮抗作用。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體具有 CCR8 配體阻斷活性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為中和抗體。在一個態樣中，CCR8 配體為 CCL1。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體不依賴用於結合的 CCR8 之酪胺酸硫酸化 (即，不依賴硫酸化) 而與 CCR8 結合。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體為去岩藻醣基化抗體變異體。在在一個態樣中，去岩藻醣基化抗體變異體具有增強的 FcγRIIIa 受體結合。在一個態樣中，去岩藻醣基化抗 CCR8 抗體變異體具有增強的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。在一個態樣中，抗 CCR8 去岩藻醣基化抗體變異體具有抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活性。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體具有改善之抗體穩定性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體具有低聚集、良好溶解性及/或低黏度。在任何上述實施例之某些態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體具有約 1 × 10 -11M 至約 5 × 10 -11M 之 K D。在某些態樣中，與 CCR8 結合之抗體具有約 2 × 10 -11M 之 K D。
在一個態樣中，本揭露中抗 CCR8 抗體命名為「hu.Ab4.H12L3」，其可以為岩藻醣基化或去岩藻醣基化，其視情況在 G236A 及 I331E 處包含一個或多個重鏈突變，並且視情況包含縮短的重鏈 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。
在再一態樣中，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或人類抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或 F(ab') 2片段。 (iii) Ab1 及其片段之實施例
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 85。在另一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 85；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 75。在再一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 85, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 75；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 84。在再一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
在另一態樣中，如本文所述之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列的 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 94 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 95 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 95 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 95 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 95 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 95 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 95 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 95 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 95 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 94 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 94 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 94 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 94 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 94 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 94 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 94 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與 SEQ ID NO: 94 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列；及 VH 域，其與 SEQ ID NO: 95 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 95 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 95 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 95 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 95 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 94 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣中的 VH 序列及上文提供的任一態樣中的 VL 序列。在一個態樣中，該抗體包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 (a) IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列，及 (b) κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列及 SEQ ID NO:94: 之 VL 序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 101 之重鏈及 SEQ ID NO: 100 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體之重鏈包含縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 115 之重鏈及 SEQ ID NO: 100 之輕鏈。
在一個態樣中，本揭露中抗 CCR8 抗體命名為「hu.Ab1.H1L1」，其可以為岩藻醣基化或去岩藻醣基化，其視情況在 G236A 及 I331E 處包含一個或多個重鏈突變，並且視情況包含縮短的重鏈 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在再一態樣中，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或人類抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或 F(ab') 2片段。 (iv) Ab2 及其片段之實施例
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 89。在另一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 89；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 78。在再一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 89, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 78；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 88。在再一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。
在另一態樣中，如本文所述之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列的 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 96 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 97 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 97 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 97 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 97 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 97 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 97 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 97 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 97 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 96 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 96 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 96 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 96 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 96 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 96 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 96 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與 SEQ ID NO: 96 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；及 VH 域，其與 SEQ ID NO: 97 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 97 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 97 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 97 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 97 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO:96 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 96 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣中的 VH 序列及上文提供的任一態樣中的 VL 序列。在一個態樣中，該抗體包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 (a) IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列，及 (b) κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列及 SEQ ID NO:96: 之 VL 序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 103 之重鏈及 SEQ ID NO: 102 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體之重鏈包含縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 116 之重鏈及 SEQ ID NO: 102 之輕鏈。
在一個態樣中，本揭露中抗 CCR8 抗體命名為「hu.Ab2.H1L1」，其可以為岩藻醣基化或去岩藻醣基化，其視情況在 G236A 及 I331E 處包含一個或多個重鏈突變，並且視情況包含縮短的重鏈 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除
在再一態樣中，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或人類抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或 F(ab') 2片段。 (v) Ab3 及其片段之實施例
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 93。在另一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 93；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 81。在再一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 93, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 81；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 92。在再一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。
在另一態樣中，如本文所述之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人類抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為人源化抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與人類 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列的 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 98 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 99 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 99 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 99 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 99 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 99 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 99 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 99 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 99 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 98 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 98 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 98 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 98 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 98 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 98 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 98 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與 SEQ ID NO: 98 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列；及 VH 域，其與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 99 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 98 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣中的 VH 序列及上文提供的任一態樣中的 VL 序列。在一個態樣中，該抗體包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含 (a) IgG1 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列，及 (b) κ 恆定域，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列及 SEQ ID NO:98: 之 VL 序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 105 之重鏈及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈。
在任何上述實施例之另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體之重鏈包含縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 117 之重鏈及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈。
在一個態樣中，本揭露中抗 CCR8 抗體命名為「hu.Ab3.H1L1」，其可以為岩藻醣基化或去岩藻醣基化，其視情況在 G236A 及 I331E 處包含一個或多個重鏈突變，並且視情況包含縮短的重鏈 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。
在再一態樣中，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或人類抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或 F(ab') 2片段。 (vi) 小鼠替代物之實施例
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其與小鼠 CCR8 結合且包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個 CDR：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列、(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體包含全部六個上述 CDR。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與小鼠 CCR8 結合之全長抗體。在某些態樣中，抗 CCR8 抗體為與小鼠 CCR8 結合之全長抗體且為嵌合抗體 (例如，兔及小鼠嵌合體)。
在一個態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 68。在另一態樣中，該抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 68；及 CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 64。在再一態樣中，該抗體抗體包含：CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 68, CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 64；及 CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 6。在再一態樣中，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在一個態樣中，該抗體包含 (a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
在另一態樣中，如本文所述之抗體包含：(a) VH 域，該 VH 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VH CDR 序列：(i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；及 (b) VL 域，該 VL 域包含選自由以下所組成之群組的至少一個、至少兩個或全部三個 VL CDR 序列：(i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供了一種抗體，該抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列的 CDR 序列。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列的一個或多個 CDR 序列。
在再一態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 域的 CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 胺基酸序列及 SEQ ID NO: 69 之 VL 域的 CDR-L1、CDR-L2 和 CDR-L3 胺基酸序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 70 之 VH 域的一個或多個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 70 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 70 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 70 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 70 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 70 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 70 之 VH 域的三個重鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 70 之 VH 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 69 之 VL 域的一個或多個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 69 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 69 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 69 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 69 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架與 SEQ ID NO: 69 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含：SEQ ID NO: 69 之 VL 域的三個輕鏈 CDR 胺基酸序列；及框架，該框架特別地與 SEQ ID NO: 69 之 VL 域的框架胺基酸序列具有至少 98% 的序列同一性。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列；及 VH 域，其與 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；及 VL 域，其與 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，VH 域與 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，VL 域與 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在一個態樣中，該抗體與小鼠 CCR8 結合的解離常數 (K D) 相比於包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列和 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列的抗體的解離常數 (K D) 減小多達 10 倍或增加多達 10 倍。
在另一態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其與 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VH 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與小鼠 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 70 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VH 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列、(c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列。在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO:69 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含輕鏈可變域 (VL) 序列，其與 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列具有至少 95% 的序列同一性。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性的 VL 序列包含相對於參照序列的取代 (例如保守取代)、插入或缺失，但是包含該序列的抗 CCR8 抗體保留與 CCR8 結合之能力。在某些態樣中，在 SEQ ID NO: 69 的胺基酸序列中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。視情況，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列，其包括該序列之轉譯後修飾。在一個特定態樣中，VL 包含選自以下項的一個、兩個或三個 CDR：(a) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(b) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (c) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供了一種抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣中的 VH 序列及上文提供的任一態樣中的 VL 序列。在一個態樣中，該抗體包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供了一種與小鼠 CCR8 結合之抗 CCR8 抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列、(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列、(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列及 SEQ ID NO:69: 之 VL 序列。
在一個態樣中，抗 CCR8 抗體包含 SEQ ID NO: 72 之重鏈及 SEQ ID NO: 71 之輕鏈。
在再一態樣中，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體為單株抗體，包括嵌合抗體。在一個態樣中，抗 CCR8 抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或 F(ab') 2片段。 (vii) 其他實施例
在再一態樣中，如以下 1-5 部分所述，根據任一上述態樣之抗 CCR8 抗體可單獨或組合地結合任何特徵： 1. 抗體片段
在某些態樣中，本文提供之抗體為抗體片段。
在一個態樣中，抗體片段為 Fab、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’) 2片段，特別是 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈 (包含 VL 域和 CL 域) 及重鏈片段 (包含 VH 域和 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合抗原決定位位殘基且具有增加的 體內半衰期之 Fab 及 F(ab') 2片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。
在另一態樣中，抗體片段為雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。雙抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可為二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003) 中亦描述三功能抗體及四功能抗體。
在再一態樣中，抗體片段為單鏈 Fab 片段。「單鏈 Fab 片段」或「scFab」是由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定而言，該連接子為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 至 50 個胺基酸組成之多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然雙硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間雙硫鍵而得到進一步穩定 ( 例如，根據 Kabat 編號，在變異重鏈之位置 44 和變異輕鏈之位置 100 處插入)。
在另一態樣中，抗體片段為單鏈可變片段 (scFv)。「單鏈變異片段」 或 「scFv」 為抗體之重鏈 (VH) 和輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其通過連接子連接。特別地，連接子為 10 個至 25 個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將 VH 之 N 端與 VL 之 C 端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，(Springer-Verlag, New York)，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利號 5,571,894 及 5,587,458。
在另一態樣中，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些態樣中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利號 6,248,516 B1)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌) 之重組產生。 2. 嵌合和人源化抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利號 4,816,567；及 Morrison 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)) 中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區 ( 例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物 (諸如猴) 之可變區)及人類恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些態樣中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人類抗體 (例如衍生 CDR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 及 Fransson， Front. Biosci.13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如：Riechmann 等人 ， Nature332:323-329 (1988)；Queen 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA86:10029-10033 (1989)；美國專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 及 7,087,409；Kashmiri 等人， Methods36:25-34 (2005)(具體描述了決定區 (SDR) 接枝)；Padlan， Mol. Immunol.28:489-498 (1991)(描述了「表面重塑」)；Dall’Acqua 等人， Methods36:43-60 (2005)(描述了「FR 改組」)；Osbourn 等人， Methods36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人， Br. J. Cancer，83:252-260 (2000)(描述了 FR 改組的「導向選擇」法)。
可以用於人源化的人框架區域包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區 (參見例如 Sims 等人 J. Immunol.151:2296 (1993))；衍生自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共通序列的框架區 (參見例如 Carter 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及 Presta 等人 J. Immunol., 151:2623 (1993))；人類成熟 (體細胞突變) 框架區或人類種系框架區 (參見例如 Almagro 及 Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008))；及衍生自篩選 FR 文庫之框架區 (參見例如 Baca 等人， J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) 及 Rosok 等人， J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996))。 3. 人抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為人抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel， Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001)；及 Lonberg， Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008)。
可透過對轉基因動物投予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從轉基因動物中獲得人抗體的方法的綜述，參見 Lonberg， Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005)。亦參見 例如描述 XENOMOUSE TM技術之美國專利第 6,075,181 號及第 6,150,584 號；描述 HuMab® 技術之美國專利第 5,770,429 號；描述 K-M MOUSE® 技術之美國專利第 7,041,870 號及描述 VelociMouse® 技術之美國專利申請公開案第 US 2007/0061900 號。由此類動物產生之完整抗體的人類可變區可進一步加以修飾， 例如藉由與不同人類恆定區組合。
人抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見例如：Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 等人， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner 等人， J. Immunol., 147: 86 (1991).) 經由人 B 細胞融合瘤技術產生的人類 抗體也描述於 Li 等人 ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA，103:3557-3562 (2006)。其他方法包括描述於例如以下文獻中的那些：美國專利號 7,189,826 (描述了由融合瘤細胞株生產單株人 IgM 抗體)，及 Ni， Xiandai Mianyixue，26(4):265-268 (2006) (描述了人-人融合瘤)。人融合瘤技術 (Trioma 技術) 也描述於以下文獻中：Vollmers 和 Brandlein， Histology and Histopathology，20(3):927-937 (2005)；及 Vollmers 和 Brandlein， Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3):185-91 (2005)。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示文庫的可變域序列來產生。然後可以將此等可變域序列與所需的人恆定域結合。下文描述了從抗體文庫中選擇人類抗體的技術。 4. 多特異性抗體
在某些態樣中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同表位或同一抗原上之不同表位) 具有結合特異性的單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在某些態樣中，結合特異性之一為對 CCR8 的結合特異性，而其他特異性則為針對任何其他抗原。在某些態樣中，雙特異性抗體可與 CCR8 的兩個 (或更多個) 不同表位結合。多特異性 (例如，雙特異性) 抗體亦可用於將細胞毒性劑或細胞定位於表現 CCR8 之細胞。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (參見 Milstein 及 Cuello， Nature305: 537 (1983)) 及「杵臼」(knob-in-hole) 工程 (參見例如美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人 J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利號 4,676,980；及 Brennan 等人， Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny 等人， J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)；及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙功能抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如 Gruber 等人， J. Immunol., 152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人 J. Immunol.147: 60 (1991) 所述之方法製備三特異性抗體。 5. 抗體變異體
在某些態樣中，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能希望改變抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施刪除、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵， 例如抗原結合特徵。 a) 取代、插入和刪除變異體
在某些態樣中，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。
在一個態樣中，本文所揭示之抗體的 VL 序列包含 V4M 突變、P43A 突變、F46L 突變、C90Q 突變或其組合。在一個態樣中，本文所揭示之抗體的 VH 序列包含 G49S 突變、K71R 突變、S73N 突變或其組合。在一個態樣中，本文所揭示之抗體的 VL 序列包含 Y2I 突變。在一個態樣中，本文所揭示之抗體的 VH 序列包含 S73N 突變、V78L 突變、T76N 突變、F91Y 突變及 P105Q 突變或其組合。
保守取代在表 2 中的「保守取代」標題下顯示。表 2 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善之抗原結合、降低之免疫原性或改善之 ADCC 或 CDC。
表 2. 所考慮之胺基酸取代
原始 殘基 例示性 取代 保守 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代變異體涉及取代親代抗體 ( 例如，人源化或人類抗體) 之一個或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親代抗體將在某些生物特性方面具有修飾 ( 例如改良) ( 例如親和力提高、免疫原性減少)，及/或將實質上保留親代抗體之某些生物特性。一種示例性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可 例如使用基於噬菌體顯示之親和力成熟技術 (諸如本文所述之技術) 便利地生成。簡而言之，取代一個或多個。CDR 殘基發生突變，並且變異體抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 ( 例如，結合親和力)。
可以在 CDR 中進行修改 (例如，取代)，以改善抗體親和力。此等修改可以在 CDR「熱點」中進行，亦即由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟期間經歷高頻率突變 (參見例如 Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)) 及/或與抗原接觸的殘基，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和力。藉由構建和從二級文庫中重選以實現親和力成熟，例如在 Hoogenboom 等人， Methods in Molecular Biology178:1-37 (O’Brien 等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, (2001)) 中已有描述。在親和力成熟之一些態樣中，經由多種方法 ( 例如，易錯 PCR、鏈改組 (chain shuffling) 或寡核苷酸定向誘變) 將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二文庫。然後篩選該文庫，以識別具有所需之親和性的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法涉及 CDR 定向方法，其中若干 CDR 殘基（例如，一次 4-6 個殘基）是隨機的。可特異性地鑑定抗原結合所涉及之 CDR 殘基， 例如，使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來鑑定。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。
在某些態樣中，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中實施基本上不降低結合親和力的保守修改 (例如，本文所提供之保守取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989) ( Science，244:1081-1085) 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在此方法中，殘基或標靶殘基組 ( 例如帶電殘基，諸如 arg、asp、his、lys 及 glu) 經鑑定且經中性或帶負電胺基酸 ( 例如丙胺酸或聚丙胺酸) 置換以確定抗體與抗原之交互作用是否受影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 ( 例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前驅藥治療)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 b) 醣基化變異體
在某些態樣中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度。抗體中添加或缺失醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的寡糖。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。參見例如 Wright 等人 TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物， 例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，及接附至雙觸寡醣結構之「莖」中之 GlcNAc 的岩藻醣。在一些態樣中，可對如本文所述之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個態樣中，提供具有非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體， 即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區的岩藻醣的寡醣結構。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣，且此等抗體在本文中進一步稱為「去岩藻醣基化抗體」。在一個態樣中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區中具有增加比例的非岩藻糖基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣之比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。在某些實施例中，去岩藻醣基化之比例係在約 65% 至約 100% 之間、約 80% 至約 100% 之間或約 80% 至約 95% 之間。非岩藻醣基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡糖的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域中約位置 297 (Fc 區域殘基之 Eu 編號) 處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體之輕微序列變化，Asn297 亦可位於位置 297 上游或下游約 ±3 個胺基酸處，亦即，位置 294 與 300 之間，例如 Asn 299。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡糖的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見 例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
在一個態樣中，本揭露提供了具有增強的 FcγRIIIa 受體結合的去岩藻醣基化抗體變異體。在一個態樣中，本揭露提供了具有增強的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 的去岩藻醣基化抗體變異體。在一個態樣中，本揭露提供了具有抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 活性的去岩藻醣基化抗體變異體。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和剔除細胞株，諸如剔除 α-1,6-岩藻醣基轉移酶基因 FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人， Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人， Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻醣合成或轉運蛋白活性減少或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。另參見 Pereira 等人， MABS(2018) 693-711。
在再一態樣中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣， 例如，其中連接至抗體之 Fc 區的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於 例如WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 c) Fc 區域變異體
在某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG 1、IgG 2、IgG 3或 IgG 4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一种具有一部分但非全部效應子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體體內半衰期很重要，但某些效應子功能 (例如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 和抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施 活體外及/或 活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。舉例而言，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 的主要細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞表現 FcγRI、FcγRII 和 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 ( Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的體外測定方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人， Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986)) 及 Hellstrom, I 等人， Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人， J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括周邊血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998) 中揭示之動物模型中在體內評估目標分子之 ADCC 活性。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見 例如WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中之 C1q 及 C3c 結合 ELISA。為了評估補體活化，可以進行 CDC 測定 (參見例如，Gazzano-Santoro 等人， J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人， Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 及 M.J. Glennie, Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合及體內清除率/半衰期測定也可使用本領域中已知的方法進行 (參見例如，Petkova, S.B.等人， Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 Al)。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變異體。(參見例如，美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312 及 Shields 等人， J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001))。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代改良 ADCC， 例如Fc 區的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代減弱 FcγR 結合， 例如Fc 區的位置 234 和 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一個態樣中，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。在某些態樣中，抗體變異體進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人 IgG 1Fc 區。在一個態樣中，取代為 Fc 區中的 L234A、L235A 和 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG 1Fc 區。(參見 例如WO 2012/130831)。在另一態樣中，取代為 Fc 區中的 L234A、L235A 和 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG 1Fc 區。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，該等取代改善了 FcγR 結合 (並從而改善了效應功能)，例如多個位置處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含具有 G236A、I332E、S298A、E333A、K334A、S239D、A330L、F243L、R292P、Y300L、V305I、P396L、L235V、L234Y、L235Q、G236W、S239M、H268D、D270E、K326D、A330M、K334E 的至少一個胺基酸取代之 Fc 區域 (參見例如，Liu 等人， Antibodies (Basel)(2020);9(4):64)。
在一些態樣中，在 Fc 區域中進行修改，得到修改 (即改善或減弱) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn)(其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，參見 Guyer 等人 J. Immunol.117:587 (1976) 及 Kim 等人 J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區域殘基 434 之取代 (參見例如，美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F. 等人， J. Biol. Chem.281 (2006) 23514-23524)。
藉由定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 交互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 及 H435 (殘基的 EU 編號) 參與交互作用 (Medesan, C. 等人， Eur. J. Immunol.26 (1996) 2533；Firan, M. 等人， Int. Immunol.13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人， Eur. J. Immunol.24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與鼠 FcRn 之交互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人， Eur. J. Immunol.29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於交互作用至關重要 (Firan, M. 等人， Int. Immunol.13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 ( J. Immunol.182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代減少 FcRn 結合， 例如Fc 區之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 253、310 和 435 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 和 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代減少 FcRn 結合， 例如Fc 區之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 310、433 和 436 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 和 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見 例如WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代增加 FcRn 結合， 例如Fc 區之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 252、254 和 256 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人 IgG 1Fc 區。另參見 Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個態樣中，重鏈之 C 端為縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有方面中之一個態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報告的所有方面中之一個態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報導的所有態樣中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端脯胺酸殘基 (P445，胺基酸位置的 EU 索引編號)。 d) 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些態樣中，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMAB TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所述之方法產生。 e) 抗體衍生物
在某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或無規共聚物) 以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，該等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。 B. 重組方法和組成物
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如 US 4,816,567 中所述。對於這些方法，提供了一個或多個編碼抗體的分離之核酸。
如果是天然抗體或天然抗體片段，則需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，且另一個用於重鏈或其片段。此等核酸編碼包含抗體的 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體的 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上。
如果是具有異二聚體重鏈的雙特異性抗體，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於第一重鏈 (其包含第一異源單體 Fc 區多肽)，一個用於第二輕鏈，且一個用於第二重鏈 (其包含第二異源單體 Fc 區多肽)。這四個核酸可包含在一個或多個核酸分子或表現載體中。此等核酸編碼抗體的包含第一 VL 之胺基酸序列、及/或抗體的包含第一 VH (其包括第一異源單體 Fc 區域) 之胺基酸序列、及/或抗體的包含第二 VL 之胺基酸序列、及/或抗體的包含第二 VH (其包括第二異源單體 Fc 區域) 之胺基酸序列 (例如，抗體之第一及/或第二輕鏈、及/或第一及/或第二重鏈)。該等核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上，通常該等核酸位於兩個或三個表現載體上，即一個載體可包含多於一個該等核酸。該等雙特異性抗體的實例為 CrossMabs (參見例如 Schaefer, W. 等人，PNAS, 108 (2011) 11187-1191)。例如，異源單體重鏈之一包含所謂「杵突變」 (T366W，且視情況為 S354C 或 Y349C 之一)，且另一個包含所謂「臼突變」 (T366S、L368A 及 Y407V，且視情況為 Y349C 或 S354C)(參見例如 Carter, P. 等人，Immunotechnol.2 (1996) 73) (根據 EU 索引編號)。
在一個態樣中，提供了編碼抗體的經單離之核酸，該抗體用於如本文所報導的方法中。
在一個態樣中，提供了一種製備抗 CCR8 抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養包含如上文提供之一種或多種編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況自宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 回收抗體。
在重組產生抗 CCR8 抗體時，將例如上所述之編碼抗體之核酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可使用習用方法 (例如，藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並序列化，或藉由重組方法生產或藉由化學合成獲得。
適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應子功能的情況下。有關抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (編輯)，Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與可溶性部分中的細菌細胞糊分離，並可經過進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的抗體編碼載體的選殖或表現宿主，包括其醣基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人醣基化模式的抗體的產生。參見 Gerngross, T.U.，Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及 Li, H. 等人，Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。
用於表現 (醣基化) 抗體的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。
植物細胞培養物亦可以用作宿主。參見例如 US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978 及 US 6,417,429 (描述了在轉基因植物中生產抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物細胞也可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用之哺乳動物宿主細胞株的其他實例係由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 株；人胚胎腎株 (例如 Graham, F.L.等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 所述之 293 或 293T 細胞)；幼倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (例如 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK；牛鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (例如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。關於某些適合於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。 C. 分析
可採用此領域中所習知的各種測定法對本文所提供之抗 CCR8 抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。 1. 結合測定及其他測定
在一個態樣中，利用已知方法諸如 ELISA、Western blot 等，檢測如本文所述之抗體的抗原結合活性。
在另一態樣中，競爭測定可用於識別與目前揭示的標的之抗 CCR8 抗體 (例如 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4 及 Ab5) 競爭結合 CCR8 之抗體。在某些態樣中，此等競爭抗體與目前揭示的標的之抗 CCR8 抗體 (例如 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4 及 Ab5) 所結合之同一表位 (例如，線性或構象表位) 結合。用於將抗原決定位映射至抗體結合的詳細例示性方法提供於 Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」 (在 Methods in Molecular Biology第 66 卷 (Humana Press, Totowa, NJ) 中)。
在例示性競爭測定中，將固定化 CCR8 置於溶液中孵育，該溶液包含與 CCR8 結合的第一標記抗體 (例如，目前揭示的標的之抗 CCR8 抗體，例如 Ab1、Ab2、Ab3、Ab4 及 Ab5) 及正在測試其與第一抗體競爭與 CCR8 結合的能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，將固定化 CCR8 置於包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中進行孵育。在允許第一抗體與 CCR8 結合的條件下孵化後，去除多餘的未結合抗體，並測量與固定化 CCR8 相關聯之標記物的量。如果試驗樣品中與固定化 CCR8 相關的標記物的數量相對於對照樣品而言明顯減少，則表明第二抗體正在與第一抗體競爭與 CCR8 的結合。參見 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manualch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。 2. 活性測定
在一個態樣中，提供了鑒別抑制抗 CCR8 抗體之生物學活性的測定方法。生物活性可包括例如抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)、針對 Treg 之 ADCC、抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、Treg 之耗竭。還提供了在 體內及/或 體外具有此等生物學活性之抗體。
在某些態樣中，測試如本文所述之抗 CCR8 抗體，用於測量該抗體之 ADCC。ADCC 測定如先前在以下文獻中所報導進行：Kamen, L. 等人， Development of a kinetic antibody-dependent cellular cytotoxicity assay.J Immunol Methods, 2019. 468: 第 49-54 頁，及 Schnueriger, A., 等人， Development of a quantitative, cell-line based assay to measure ADCC activity mediated by therapeutic antibodies.Mol Immunol, 2011. 48(12-13): 第 1512-17 頁，經過一些修改，其使用 CD16 工程化 NK-92_F158 作為效應細胞並且使用穩定地表現人 CCR8 及 Ga 15 次單元的 CHO 細胞 (CHO/hCCR8.Gna15) 作為標靶細胞。簡而言之，藉由鈣黃綠素釋放方法測量 ADCC 對標靶細胞之裂解。標靶細胞用鈣黃綠素 AM 標記，然後洗滌並以 3000 個細胞/孔的密度鋪盤到 384 孔板上。以 0.004 至 1 μg/mL 的不同濃度添加抗 CCR8 抗體，然後以 10:1 的效應物:標靶 (E:T) 比率添加 NK-92_F158 細胞。然後將盤在 37℃ 孵育 2.5 小時。孵育後，將盤在 200 × g 下離心 3 分鐘，將上清液轉移至白色不透明 384 孔微孔盤，並以相對螢光單位 (RFU) 量測螢光訊號。來自僅含有標靶細胞之孔的訊號代表鈣黃綠素從標記細胞中的自發釋放 (自發釋放)，而含有用 Triton X-100 裂解的標靶細胞的孔提供最大可用訊號 (最大釋放)。在不添加抗體的情況下，在含有標靶細胞及效應細胞的孔中量測抗體非依賴性細胞介導的細胞毒性 (AICC)。樣品及對照在同一盤中至少以兩重複方式進行測試。特定 ADCC 活性之程度計算如下： %ADCC = 100 x (平均實驗釋放-平均 AICC)/(平均最大釋放-平均自發釋放)
ADCC 活性被繪製為抗體濃度的函數，並將資料擬合至不對稱 S 型四參數邏輯 (4PL) 模型。
在某些態樣中，測試如本文所述之抗 CCR8 抗體以量測針對 Treg 細胞之 ADCC。為了在來自人周邊血單核細胞 (PBMC) 的 T 細胞上誘導 CCR8 表現，將 10 7個人 PBMC 腹膜內轉移到 NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠 (JAX) 並在轉移後 2-3 週收集脾臟。人 T 細胞自 NSG 脾細胞的單細胞懸浮液中富集，且原代 NK 細胞自人 PBMC 中富集。將人 T 細胞與 0.001-1 µg/mL 抗 CCR8 抗體在室溫孵育 30 分鐘，然後以 2:1 的效應物：標靶比率添加原代 NK 細胞。在 37℃ 孵育過夜後，收集細胞，表面染色，並在細胞內染色。用於定義 T 細胞群體之抗體為 CD45 (HI30)、CD3 (SK7)、CD8 (RPA-T8) 及 CD14 (63D3)；CD4 (RPA-T4)；及 FOXP3 (236A/E7)。在採集之前，將 CountBright Absolute Counting Beads 添加至每個樣品中。進行流式細胞術。計算絕對細胞計數。藉由計算回收之 Treg 細胞與回收之 CD8 細胞之比 (Treg/CD8) 或常規 CD4 T 細胞與回收之 CD8 T 細胞之比 (CD4conv/CD8) 來量測針對 Treg 細胞之 ADCC 活性。
在某些態樣中，藉由螢光活化細胞分選 (FACS) 流式細胞術測試本文所述之抗 CCR8 抗體以量測其與調節性 T 細胞 (Treg 細胞或 Tregs) 之結合。將人結腸直腸分離腫瘤細胞 (DTC) 解凍。將細胞用 eFluor 780 結合的可固定活力染料及 2 ug/mL 對 CCR8 特異性之 mAb、OX40 (陽性對照)、赫賽汀 (陰性對照) 或抗 hIgG (陰性對照) 在 4℃ 表面染色 20 分鐘，然後藉由以 AF647 結合的 AffiniPure F(ab’)2 片段山羊抗人 IgG、Fcg 片段特異性在 4℃ 二次偵測 10 分鐘。然後對細胞進行細胞內染色。用於定義 T 細胞群體之抗體為來自 BD Biosciences 之 CD45 (HI30)、CD3 (SK7)、CD8 (RPA-T8) 及 CD14 (63D3)；CD4 (RPA-T4)；及 FOXP3 (236A/E7)。進行流式細胞術並進行分析。
在某些態樣中，測試如本文所述之抗 CCR8 抗體，用於測量該抗體之 ADCP。首先自具有已知 FcgRIIa 及 FcgRIIIa 基因型資訊之供體血液中分離人 CD14 +單核細胞。將純化的 CD14 +單核細胞分化為巨噬細胞。然後加入 50 ng/mL hIL-10 以使巨噬細胞極化 24 小時，然後進行 ADCP 測定。在存在 20 mg/mL 非特異性人 IgG 的情況下，將 NucLight Red 轉染的 CHO/hCCR8.Gna15 標靶細胞與抗 CCR8 抗體預孵育 20 分鐘。然後將上述細胞混合物以 1:1 的 E:T 比率添加至巨噬細胞 (效應細胞) 盤中。每隔一小時以明場及紅色雷射設置獲得細胞影像，持續 6 小時。每個孔中之紅細胞計數 (剩餘的標靶細胞) 由巨噬細胞數標準化。ADCP 活性被計算為每個樣品中標準化之紅細胞計數與存在同型對照抗體之陰性對照相比減少的百分比。然後 ADCP 活性被繪製為抗體濃度的函數，並將資料擬合至不對稱 S 型四參數邏輯 (4PL) 模型。每種抗體之 EC 50值確定為達到 50% 標靶細胞毒殺之濃度。
在某些態樣中，測試如本文所述之抗 CCR8 抗體 (例如，小鼠替代抗體) 以量測體內 Treg 細胞的消耗，用抗 CCR8 抗體 (例如，本文揭示之小鼠替代抗體) 治療具有已確立腫瘤的小鼠，並且分析腫瘤、脾臟及腫瘤引流淋巴結中白血球中 Treg 細胞、常規 CD4 T 細胞及 CD8 T 細胞的比例。為此，在對數生長期收穫腫瘤細胞，並以 1:1 的比率重新懸浮在含有基質膠的 HBSS 中。用 100 微升 HBSS+基質膠中的 10 萬個腫瘤細胞在小鼠的側腹皮下接種。監測腫瘤，直至其建立並且平均腫瘤體積達到 130-230 mm 3。然後將小鼠隨機分入治療組中。靜脈內投予抗 CCR8 或抗 gp120 同型對照 Ab 治療。三天後處死小鼠並獲得腫瘤、脾臟及腫瘤引流淋巴結用於分析。為了產生單細胞懸浮液，將腫瘤切碎並消化。將單細胞懸浮液用螢光標記的抗 CD45、抗 CD4 及抗 CD8 抗體進行表面染色，並用螢光標記的抗 Foxp3 抗體進行細胞內染色。可對 Fortessa X-20 或 FACSymphony 執行流式細胞術，並使用 FlowJo 軟體進行分析。
在某些態樣中，在 體內抗 CCR8 介導的腫瘤浸潤性 Treg 細胞耗竭後，測試本文所述之抗 CCR8 抗體 ( 例如，小鼠替代抗體) 的腫瘤生長抑制。用小鼠替代抗 CCR8 抗體治療具有已確立腫瘤的小鼠，並監測腫瘤隨時間的生長情況。 D. 用於診斷和檢測之方法及組成物
在某些態樣中，本文提供的任何抗 CCR8 抗體均可用於檢測生物樣品中是否存在 CCR8。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些態樣中，生物樣品包含細胞或組織，諸如腫瘤。
在一個態樣中，提供了一種用於診斷或檢測方法中的抗 CCR8 抗體。在再一態樣中，提供了一種檢測生物樣品中是否存在 CCR8 的方法。在某些態樣中，該方法包含在允許抗 CCR8 抗體與 CCR8 結合的條件下使生物樣品與如本文所述之抗 CCR8 抗體接觸，並檢測抗 CCR8 抗體與 CCR8 之間是否形成複合物。此等方法可為體外或體內方法。在一個態樣中，使用抗 CCR8 抗體來選擇適合使用抗 CCR8 抗體進行治療的個體，例如，其中 CCR8 為用於選擇個體的生物標記物。
在某些態樣中，提供了標記的抗 CCR8 抗體。標記包括但不限於直接偵測的標記或部分 (例如螢光、髮色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接偵測 (例如，透過酶促反應或分子交互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素 32、P 14C、 125I、 3H 及 131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前體 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基，諸如此類。 E. 醫藥組成物
在再一態樣中，提供了包含本文所提供之任何抗體的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體和醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體及至少一種另外的治療劑， 例如，如下所述。
如本文所述之抗 CCR8 抗體的醫藥組成物 (調配物) 可以藉由將抗體與本領域之技術人員已知的醫藥上可接受之載劑或賦形劑組合來製備。參見例如 Remington's Pharmaceutical Sciences第 16 版，Osol, A. 編輯 (1980), Shire S., Monoclonal Antibodies: Meeting the Challenges in Manufacturing, Formulation, Delivery and Stability of Final Drug Product, 第 1 版，Woodhead Publishing (2015), §4 and Falconer R.J., Biotechnology Advances (2019), 37, 107412。如本文所述之抗 CCR8 抗體的例示性醫藥組成物為凍乾的、水性的、冷凍的等。
醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對接受者無毒，其包括但不限於：緩衝劑，諸如組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑 (諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苄烷銨；氯化苯索寧；苯酚、丁醇或芐醇；對羥苯甲酸烷基酯，如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (諸如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物 ( 例如，鋅蛋白複合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇 (PEG)。
本文所述之醫藥組成物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能希望進一步提供可用於治療相同疾病之另外的治療劑。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
用於 活體內投予之醫藥組成物通常為無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。 F. 治療方法及投予途徑
本文所提供之任何抗 CCR8 抗體均可用於治療方法。
在一個態樣中，提供了一種用為藥物的抗 CCR8 抗體。在其他態樣中，提供了一種用於治療癌症的抗 CCR8 抗體。在某些態樣中，提供了一種用於治療方法中的抗 CCR8 抗體。在某些態樣中，本揭露提供一種用於治療有此需要之個體 (例如，人類個體) 之方法中的抗 CCR8 抗體，該方法包含向該個體投予有效量之抗 CCR8 抗體。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外的治療劑 (例如，如下文所述)(例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑) 投予該個體。在其他態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其用於消耗腫瘤微環境中之調節性 T 細胞 (「Treg」)。在某些態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其用於消耗個體的腫瘤微環境中之 Treg 之方法中，該方法包含向個體投予有效量之抗 CCR8 抗體以消耗腫瘤微環境中之 Treg。
在再一態樣中，本揭露提供了抗 CCR8 抗體在藥物的製造或製備中的用途。在一個態樣中，該藥物用於治療癌症。在再一態樣中，該藥物用於治療癌症之方法中，該方法包含向有此需要之個體 (例如，人類個體) 投予有效量之藥物。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外的治療劑 (例如，如下文所述) 投予該個體。在再一態樣中，該藥物係用於消耗腫瘤微環境中之 Treg。在再一態樣中，該藥物用於消耗個體的腫瘤微環境中之 Treg 之方法中，該方法包含向個體投予有效量之藥物以消耗腫瘤微環境中之 Treg。
在再一態樣中，本揭露提供一種用於治療癌症的方法。在一個態樣中，該方法包含向有此需要之個體 (例如，人類個體) 投予有效量之抗 CCR8 抗體以治療癌症。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外的治療劑 (如下文所述) 投予該個體。
在再一態樣中，本揭露提供了一種抗 CCR8 抗體，其用於消耗例如在腫瘤微環境外部或在腫瘤微環境中之 Treg 細胞。例如，在某些實施例中，本揭露提供了一種用於消耗有此需要的患有癌症之個體 (例如，人類個體) 的腫瘤微環境中之 Treg 細胞的方法，該方法包含向個體投予有效量之抗 CCR8 抗體從而治療癌症，該有效量足以消耗腫瘤微環境中之 Treg 細胞。在某些態樣中，本揭露提供了一種用於消耗有此需要的患有癌症之個體 (例如，人類個體) 的腫瘤微環境外部 (例如，循環中) 之 Treg 細胞的方法，該方法包含向個體投予有效量之抗 CCR8 抗體從而治療癌症，該有效量足以消耗腫瘤微環境外部之 Treg 細胞。不希望受任何特定理論之束縛，藉由減少腫瘤微環境外部之 Treg 細胞數目，當浸潤到腫瘤微環境中之 Treg 細胞數目減少時治療癌症，從而減少腫瘤微環境中之 Treg 細胞數目。
例示性癌症包括但不限於膀胱癌 ( 例如，尿路上皮癌)、胚細胞瘤、血癌 ( 例如，淋巴瘤，例如非霍奇金 (Non-Hodgkin’s) 淋巴瘤、白血病)、骨癌、腦癌、乳癌 ( 例如，三陰性乳腺癌)、子宮頸癌、結腸直腸癌 ( 例如大腸癌、直腸癌)、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌 ( 例如，頭頸部鱗狀細胞癌)、腎癌 ( 例如，腎細胞癌)、肝癌 ( 例如，肝細胞癌)、肺癌 ( 例如，非小細胞肺癌、小細胞肺癌)、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、皮膚癌 ( 例如，黑色素瘤、鱗狀細胞癌)、睾丸癌及子宮癌。
在某些態樣中，癌症為膀胱癌、血癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌及皮膚癌。
在某些態樣中，癌症為膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、頭頸癌、肝癌、肺癌或皮膚癌。
在某些態樣中，癌症為實性瘤。
在某些態樣中，癌症表現 CCR8。
在某些態樣中，癌症為 T 細胞發炎的腫瘤或包含 T 細胞發炎的腫瘤微環境。
在某些態樣中，癌症包括腫瘤微環境中的調節性 T 細胞，並且如本文所述，癌症暴露於 CCR8 抗體導致腫瘤微環境中的調節性 T 細胞消耗。在再一態樣中，本揭露提供包含本文所述之任何抗 CCR8 抗體的醫藥組成物，其例如用於任何上述治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗 CCR8 抗體及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗 CCR8 抗體及至少一種另外的治療劑 (例如，如下文所述)。
如本文所述之抗體可以單獨投予或用於聯合療法中，例如，可用於治療癌症。例如，聯合療法包括投予如本文所述之抗體並投予至少一種另外的治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。
至少一種另外的治療劑涵蓋可以被投予用於治療的任何藥劑。在某些態樣中，另外的治療劑為另外的抗癌劑。例示性抗癌劑包括但不限於微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡誘導劑、抗血管生成劑、免疫調節劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑或細胞生長抑制劑、細胞凋亡誘導劑、增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑、細胞激素、抗癌疫苗或溶瘤病毒、類鐸受體 (TLR) 劑、雙特異性抗體、細胞療法及免疫細胞接合物。在某些態樣中，另外的治療劑係免疫調節抗癌劑， 例如檢查點抑制劑 (CPI)，例如抗 CTLA4 抗體 ( 例如易普利姆瑪)、PD-L1 結合拮抗劑或 PD-1 結合拮抗劑。
術語「PD-L1 結合拮抗劑」係指一種分子，其減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-L1 與其任一種或多種結合配偶體 (諸如 PD-1 及/或 B7-1) 之交互作用引起的信號轉導。在一些實例中，PD-L1 結合拮抗劑為抑制 PD-L1 與其結合配偶體之結合的分子。在具體態樣中，PD-L1 結合拮抗劑抑制 PD-L1 與 PD-1 及/或 B7-1 之結合。在一些實例中，PD-L1 結合拮抗劑包括抗 PD-L1 抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽以及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-L1 與其一種或多種結合配偶體 (諸如，PD-1 及/或 B7-1) 之交互作用引起的信號轉導的其他分子。在一個實例中，PD-L1 結合拮抗劑減少了由 T 淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白所介導或藉由其表現的負共刺激信號 (藉由 PD-L1 介導的信號傳導)，從而減輕了功能障礙 T 細胞的功能障礙 (例如，增強效應子對抗原識別的應答)。在一些實例中，PD-L1 結合拮抗劑與 PD-L1 結合。在一些實例中，PD-L1 結合拮抗劑為抗 PD-L1 抗體 (例如，抗 PD-L1 拮抗劑抗體)。例示性抗 PD-L1 拮抗劑抗體包括阿替利珠單抗、MDX-1105、MEDI4736 (度伐利尤單抗)、MSB0010718C (阿維魯單抗，avelumab)、SHR-1316、CS1001、恩弗利單抗 (envafolimab)、TQB2450、ZKAB001、LP-002、CX-072、IMC-001、KL-A167、APL-502、柯希利單抗 (cosibelimab)、洛達利單抗 (lodapolimab)、FAZ053、TG-1501、BGB-A333、BCD-135、AK-106、LDP、GR1405、HLX20、MSB2311、RC98、PDL-GEX、KD036、KY1003、YBL-007 和 HS-636。在一些態樣中，抗 PD-L1 抗體為阿替利珠單抗、MDX-1105、MEDI4736 (度伐利尤單抗) 或 MSB0010718C (阿維魯單抗)。在一個具體態樣中，PD-L1 結合拮抗劑為 MDX-1105。在另一具體態樣中，PD-L1 結合拮抗劑為 MEDI4736 (度伐利尤單抗)。在另一具體態樣中，PD-L1 結合拮抗劑為 MSB0010718C (阿維魯單抗)。在其他方面，PD-L1 結合拮抗劑可以為小分子，例如，GS-4224、INCB086550、MAX-10181、INCB090244、CA-170 或 ABSK041，其在一些實例中可以口服投予。其他例示性 PD-L1 結合拮抗劑包括 AVA-004、MT-6035、VXM10、LYN192、GB7003 和 JS-003。在一個態樣中，PD-L1 結合拮抗劑為阿替利珠單抗。
術語「PD-1 結合拮抗劑」係指一種分子，其減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-1 與其一種或多種結合配偶體 (諸如 PD-L1 及/或 PD-L2) 之交互作用引起的信號轉導。PD-1 (計畫性死亡 1) 在本技術領域中亦稱為「計畫性細胞死亡 1」、「PDCD1」、「CD279」及「SLEB2」。例示性的人 PD-1 顯示於 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. Q15116。在一些實例中，PD-1 結合拮抗劑為抑制 PD-1 與其一種或多種結合配偶體之結合的分子。在具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑抑制 PD-1 與 PD-L1 及/或 PD-L2 之結合。例如，PD-1 結合拮抗劑包括抗 PD-1 抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽以及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由 PD-1 與 PD-L1 及/或 PD-L2 之交互作用引起的信號轉導的其他分子。在一個實例中，PD-1 結合拮抗劑減少了由 T 淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白所介導或藉由其表現的負共刺激信號 (藉由 PD-1 介導的信號傳導)，從而減輕了功能障礙 T 細胞的功能障礙 (例如，增強效應子對抗原識別的應答)。在一些實例中，PD-1 結合拮抗劑與 PD-1 結合。在一些實例中，PD-1 結合拮抗劑是抗 PD-1 抗體 (例如，抗 PD-1 拮抗劑抗體)。例示性抗 PD-1 拮抗劑抗體包括納武利尤單抗 (nivolumab)、帕博利珠單抗、MEDI-0680、PDR001 (spartalizumab)、REGN2810 (西米普利單抗，cemiplimab)、BGB-108、普羅格利單抗 (prolgolimab)、卡瑞利珠單抗 (camrelizumab)、信迪利單抗 (sintilimab)、替雷利珠單抗 (tislelizumab)、特瑞普利單抗 (toripalimab)、多塔利單抗 (dostarlimab)、瑞弗利單抗 (retifanlimab)、薩善利單抗 (sasanlimab)、派安普利單抗 (penpulimab)、CS1003、HLX10、SCT-I10A、zimberelimab、巴替利單抗 (balstilimab)、杰諾單抗 (genolimzumab)、BI 754091、西利單抗 (cetrelimab)、YBL-006、BAT1306、HX008、布格利單抗 (budigalimab)、AMG 404、CX-188、JTX-4014、609A、Sym021、LZM009、F520、SG001、AM0001、ENUM 244C8、ENUM 388D4、STI-1110、AK-103 和 hAb21。在具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 MDX-1106 (納武利尤單抗 (nivolumab))。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 MK-3475 (帕博利珠單抗 (pembrolizumab))。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 PD-L2 Fc 融合蛋白，例如，AMP-224。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 MED1-0680。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 PDR001 (spartalizumab)。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 REGN2810 (西米普利單抗)。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為 BGB-108。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為普羅格單抗。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為卡瑞利珠單抗。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為信迪利單抗。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為替雷利珠單抗。在另一具體態樣中，PD-1 結合拮抗劑為特瑞普利單抗。其他例示性 PD-1 結合拮抗劑包括 BION-004、CB201、AUNP-012、ADG104 和 LBL-006。上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或更多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，如本文所述之抗體的投予可在投予另外的一種或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。在一個態樣中，投予抗 CCR8 抗體及投予另外的治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。在一個態樣中，在治療之第 1 天將抗體及另外的治療劑投予個體。如本文所述之抗體亦可用於與放射療法組合使用。
如本文所述之抗體 (及任何另外的治療劑) 可藉由任何合適的方式投予，包括腸胃外、肺內和鼻內投予，且如果需要局部治療，則可以採用病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。可透過任何適當途徑給藥， 例如，透過注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
如本文所述之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥和投予。在此情況下，考慮的因素包括待治療的具體疾病、待治療的個體物種、個體的臨床狀態、疾病的原因、遞送藥劑的部位、投予方法、投予時程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於治療該疾病之藥劑一起配製。此等其他藥劑的有效量取決於醫藥組成物中存在之抗體的量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量和藉由任何途徑使用。
在一次或一系列的治療中適宜地對個體投予抗體。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病狀而定，治療通常將持續至出現期望的疾病症狀阻抑。然而，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
在另外的實施例中，考慮小鼠替代物的用途，其例如用為體外或體內工具分子。例如，在一個態樣中，提供了一種治療小鼠之疾病的方法，其包含向小鼠投予有效量之如本文所述的小鼠替代物抗體以治療疾病。在某些實施例中，小鼠包含異種移植體。在某些實施例中，小鼠模型為癌症模型，例如皮膚癌模型。 G. 製品
在另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料例如玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防及/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為如本文所揭示之抗體。標籤或包裝插頁指示，該組成物可用於治療所選病狀。此外，該製品可包含：(a) 其中含有組成物之第一容器，其中該組成物包含如本文所揭示之抗體；及 (b) 其中含有組成物之第二容器，其中該組成物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。如本文所述之此態樣中的製品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 範例
以下為如本文所述之抗體、方法和組成物的其他非限制性實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。 實例 1. 抗 CCR8 單株抗體的發現和工程化
用重組 huCCR8、huCCR8+ 兔細胞株、含有 huCCR8 之細胞外囊泡以及源自 huCCR8 N 末端區域的硫酸化及非硫酸化肽對新西蘭白兔進行免疫。按照 Lin 等人 ， PLoS ONE15(12), 2020 中規定之方案分離單個 B 細胞。然後藉由將 IgG+ B 細胞直接流式活化細胞分選 (FACS；流式細胞術) 至單個孔中以結合人及食蟹獼猴 CCR8+ CHO 細胞以及對照 CHO 細胞來測定 B 細胞培養物上清液。裂解 CCR8 特異性 B 細胞，立即在 ‑80°C 下冷凍保存，直至進行分子選殖。如 Lin 等人， PLoS ONE15(12), 2020 所述，將來自兔 B 細胞的各種單株抗體之可變區 (VH 及 VL) 選殖到來自所提取之 mRNA 的表現載體中。個別的重組兔抗體被表現於 Expi293 細胞中，後續使用蛋白質 A 純化。
獲得了超過 480 種與人或食蟹獼猴 CCR8 CHO 細胞結合之抗 CCR8 抗體。基於抗體在人及食蟹獼猴 CCR8 CHO 細胞株上之相對平均螢光強度 (MFI) 及序列多樣性進一步選擇抗體。從在人及食蟹獼猴 CCR8 CHO 細胞上顯示 MFI 差異小於 5 倍之抗體中，識別出五組獨特的抗體 (稱為 Ab1-Ab5)。從每組中選擇一個代表性序列用於人源化。
在兔單株抗體人源化過程中構建的變異體以人 IgG1 的形式進行評估。將每個兔抗體的高度變異區 (即 VL 域中的位置 24-34 (L1)、50-56 (L2) 及 89-97 (L3)，以及 VH 域中的位置 26-35 (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3)) 分別移植到各種受體框架中。根據 Kabat 等人，Sequences of proteins of immunological interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991) 進行殘基編號。另外，將來自兔抗體之所有 VL 及 VH 游標位置移植到其相應的人種系框架中。所有兔胺基酸都位於游標位置之移植物稱為 H1L1。將人源化 CCR8 抗體與 CHO-huCCR8.Gna15 穩定細胞株之結合能力與其嵌合親代殖株進行比較。將 H1L1 版抗體的兔游標位置轉換回人殘基，以評估每個兔游標位置對 huCCR8 的結合之貢獻。
藉由螢光活化細胞分選 (FACS) 流式細胞術評估 mAb 與調節性 T 細胞 (Treg 細胞或 Tregs) 的結合。根據供應商的方案將人結腸直腸分離腫瘤細胞 (DTC) (Discovery Life Sciences) 解凍。將細胞用 eFluor 780 結合的可固定活力染料 (ThermoFisher Scientific) 及 2 ug/mL 對 CCR8 特異性之 mAb、OX40 (陽性對照)、赫賽汀 (Herceptin)(陰性對照) 或抗 hIgG (陰性對照) 在 4℃ 表面染色 20 分鐘，然後藉由以 AF647 結合的 AffiniPure F(ab’)2 片段山羊抗人 IgG、Fcg 片段特異性 (Jackson ImmunoResearch) 在 4℃ 二次偵測 10 分鐘。然後根據製造商的方案，使用 eBioscience Foxp3/轉錄因子染色緩衝液組 (ThermoFisher Scientific) 對細胞進行細胞內染色。用於定義 T 細胞群體之抗體為來自 BD Biosciences 之 CD45 (HI30)、CD3 (SK7)、CD8 (RPA-T8) 及 CD14 (63D3)；來自 BioLegend 之 CD4 (RPA-T4)；及來自 ThermoFisher Scientific 之 FOXP3 (236A/E7)。在 Fortessa X-20 (BD Biosciences) 上進行流式細胞術，並用 FlowJo 軟體 (BD Biosciences，版本 10.5.3) 進行分析。 圖 1所示係 CD8 T 細胞 (定義為 CD45+ CD14- CD3+ CD8+ CD4-)(圓圈，⚪)、常規 CD4 T 細胞 (定義為 CD45+ CD14- CD3+ CD8- CD4+ FOXP3-)(正方形，◻) 及 Treg 細胞 (定義為 CD45+ CD14- CD3+ CD8- CD4+ FOXP3+)(三角形，▲) 之平均螢光強度 (MFI) 值。五個 CCR8 mAb 殖株中之三個殖株特異性染色 Treg 細胞而不是常規 CD4 或 CD8 T 細胞，並根據 CCR8 MFI 進行排序，大於 500 MFI： hu.Ab4.H1L1 ＞ hu.Ab5.H1L1 ＞ hu.Ab3.H1L1。在確認該三個 CCR8 mAb 殖株，即 hu.Ab3.H1L1、 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1亦保留了人-食蟹獼猴交叉反應性 (在人及食蟹獼猴 CCR8 CHO 細胞上的差異小於 5 倍) 後，該等抗體繼續進行進一步探索。
例如，進一步研究了 hu.Ab3.H1L1、 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。hIgG1 同型用為陰性對照。參見 圖 2。ADCC 測定如先前在以下文獻中所報導進行：Kamen, L. 等人， Development of a kinetic antibody-dependent cellular cytotoxicity assay.J Immunol Methods, 2019. 468: 第 49-54 頁，及 Schnueriger, A., 等人， Development of a quantitative, cell-line based assay to measure ADCC activity mediated by therapeutic antibodies.Mol Immunol, 2011. 48(12-13): 第 1512-17 頁，經過一些修改，其使用 CD16 工程化 NK-92_F158 作為效應細胞並且使用穩定地表現人 CCR8 及 G-α 15 次單元的 CHO 細胞 (CHO/hCCR8.Gna15) 作為標靶細胞。簡而言之，藉由鈣黃綠素釋放法量測 ADCC 對標靶細胞之裂解。根據製造商的方案，用 Calcein-AM (C3100MP，ThermoFisher Scientific) 標記標靶細胞，然後洗滌並以 3000 個細胞/孔的密度接種至 384 孔盤上。以 0.004 至 1 μg/mL 的不同濃度添加抗 CCR8 抗體，然後以 10:1 的效應物:標靶 (E:T) 比率添加 NK-92_F158 細胞。然後將盤在 37℃ 孵育 2.5 小時。孵育後，將盤在 200 x g 下離心 3 分鐘，將上清液轉移至白色不透明 384 孔微孔盤 (OptiPlate-384，PerkinElmer，Waltham，MA)，並以相對螢光單位 (RFU) 使用在 485/520 nm 激發/發射的 EnSight多模式讀盤器 (PerkinElmer) 量測螢光訊號。來自僅含有標靶細胞之孔的訊號代表鈣黃綠素從標記細胞中的自發釋放 (自發釋放)，而含有用 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 裂解的標靶細胞的孔提供最大可用訊號 (最大釋放)。在不添加抗體的情況下，在含有標靶細胞及效應細胞的孔中量測抗體非依賴性細胞介導的細胞毒性 (AICC)。樣品及對照在同一盤中至少以兩重複方式進行測試。特定 ADCC 活性的程度計算如下： %ADCC = 100 x (平均實驗釋放-平均 AICC)/(平均最大釋放-平均自發釋放)
ADCC 活性被繪製為抗體濃度的函數，並使用 Prism (Graphpad; La Jolla, CA) 將資料擬合至不對稱 S 型四參數邏輯 (4PL) 模型。參見 圖 2。EC 50值確定為達到每個個別抗體的 50% 最大 ADCC 活性之濃度。EC 50值也在下文中列出。
表 A. ADCC 活性
抗體 EC 50(nM)
hu.Ab3.H1L1 0.02
hu.Ab5.H1L1 0.02
hu.Ab4.H1L1 0.08
進一步分析了 hu.Ab3.H1L1、 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1的促效劑 (CCR8 活化) 及拮抗劑 (CCL1 之抑制；中和) 活性。hIgG1 同型用為陰性對照。使用螢光成像酶標儀 (FLIPR) FDSS/µCell (Hamamatsu, Japan) 藉由 Ca 2+流入監測 CCR8 活化。簡而言之，將 CHO/hCCR8.Gna 15 細胞裝載以螢光 Ca 2+染料 Fluo-8 NW (Cat#36307, AAT Bioquest) 並在 37℃ 孵育 30 分鐘，然後在室溫再孵育 30 分鐘。在透明的 384 孔盤中在 HHBS 緩衝液中製備系列稀釋的測試抗 CCR8 抗體，並將 HHBS 緩衝液中之 hCCL1 亦等分到透明的 384 孔盤中。在 FDSS/µ細胞 上設置 FLIPR 測定，在 10 秒時添加抗體，在 300 秒時加入 hCCL1，且總共監測 500 秒。將激發及發射波長分別設定為 485 nm 及 525 nm。運行後，應用陰性對照校正，且將資料針對 hCCL1 訊號 (100%) 進行標準化，並使用 Prism 繪製為抗體濃度的函數。
如 圖 3A所示，CCR8 的已知配體 CCL1 示出促效劑活性，但無一抗 CCR8 測試抗體示出促效作用。 圖 3B中的資料表明抗 CCR8 抗體 hu.Ab4.H1L1具有針對 CCR8 配體 CCL1 (20 nM 配體) 之拮抗 (中和) 活性，而抗 CCR8 抗體 hu.Ab5.H1L1及 hu.Ab3.H1L1在研究濃度下未表明配體阻斷 (非中和) 活性。 圖 3C中的資料進一步表明對照品抗 CCR8 抗體 (Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體、鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)) 藉由 CCR8 配體 CCL1 阻斷 CCR8 之活化也示出拮抗 (中和) 活性。表 B 中提供了配體阻斷活性之 IC 50值。如 Van Damme 等人， J. Immunother.Cancer(2021), 9:e001749 所示，僅配體阻斷不足以耗竭小鼠腫瘤中之 Treg 細胞。因此，即使 hu.Ab5.H1L1及 hu.Ab3.H1L1證明沒有配體阻斷，該兩種抗體仍被視為有前景的候選者，因為目標係找到與 CCR8 結合並消耗 Treg 細胞之選擇性抗 CCR8 抗體。
表 B. 抗 CCR8 抗體之 CCL1 阻斷效力
抗體 IC 50(nM)
hu.Ab5.H1L1 無抑制
hu.Ab4.H1L1 57.9
hu.Ab3.H1L1 無抑制
鼠抗人 CCR8 Ab L263G8 (Biolegend, Commercial Ab) 23.6
鼠抗人 CCR8 Ab 433H (BD Biosciences, Commercial Ab) 17.6
Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體 (對照品) 13.3
為了確認對 CCR8 之選擇性， hu.Ab3.H1L1、 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1以及 Yoshida 人源化抗人 CCR8、鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend, Commercial Ab) 及鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences, Commercial Ab) 之結合藉由流式細胞術在 HEK293 細胞上進行表徵，該等細胞用編碼 FLAG 標籤化的其他相關人類 GPCR (CCR2-5、CXCR4、ACKR2 及 ACKR4) 之質體瞬時轉染。每個 GPCR 之細胞表面表現藉由用抗 FLAG 抗體對照染色來確認。參見 圖 4A 至 4F。特別地，將 HEK293 細胞用 N 端 FLAG 標記的人 CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CXCR4、ACKR2、ACKR4、hCCR8 構建體或用 Mock 構建體使用 transIT X2 (試劑:DNA=3:1) 轉染 24 小時，並分別用 5 ug/ml 的各種抗 hCCR8 單株抗體或兔抗 Flag pAb (Sigma) 然後用 AF647 抗 hIgG 或 AF647 抗 RbIgG 進行表面染色。抗體 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1僅染色含有 hCCR8 的細胞，確認了它們對 hCCR8 之特異性。抗體 hu.Ab3.H1L1示出多個其他 GPCR 之染色，指示缺乏特異性。因此，具有最佳 ADCC 活性的 CCR8 選擇性 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1抗體被繼承。 實例 2. Ab4 及 Ab5 抗 CCR8 抗體之突變分析
進一步探索並表徵 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1抗 CCR8 抗體之變異體。 圖 5A 至 5D示出所研究之兔 ( rb.Ab4) 及人源化 Ab4(L1-L4 及 H1-H12) CCR8 抗體的序列的輕鏈可變區 ( 圖 5A) 及重鏈可變區 ( 圖 5B 至 5D) 之比對。 圖 6A 至 6D示出所研究之兔 ( rb.Ab5) 及人源化 Ab5(L1-L5 及 H1-H13) CCR8 抗體的序列的輕鏈可變區 ( 圖 6A) 及重鏈可變區 ( 圖 6B 至 6D) 之比對。另參見下表 C1 至 C3 及 D1 至 D3。表 E 提供了重鏈恆定域和輕鏈恆定域。
表 C1. Ab4 變異體的輕鏈 CDR 區域
說明 CDR L1 (Kabat 及 Chothia) CDR L2 (Kabat 及 Chothia) CDR L3 (Kabat 及 Chothia)
rb.Ab4 QASQSISSYLS (SEQ ID NO: 1) KASTLAS (SEQ ID NO: 2) QQGYTSSNIDNI (SEQ ID NO: 3)
hu.Ab4.L1 QASQSISSYLS (SEQ ID NO: 1) KASTLAS (SEQ ID NO: 2) QQGYTSSNIDNI (SEQ ID NO: 3)
hu.Ab4.L2 QASQSISSYLS (SEQ ID NO: 1) KASTLAS (SEQ ID NO: 2) QQGYTSSNIDNI (SEQ ID NO: 3)
hu.Ab4.L3 QASQSISSYLS (SEQ ID NO: 1) KASTLAS (SEQ ID NO: 2) QQGYTSSNIDNI (SEQ ID NO: 3)
hu.Ab4.L4 QASQSISSYLS (SEQ ID NO: 1) KASTLAS (SEQ ID NO: 2) QQGYTSSNIDNI (SEQ ID NO: 3)
表 C2. Ab4 變異體的重鏈 CDR 區域
說明 CDR H1 (Kabat) CDRH1 (Chothia) CDR H2 (Kabat 及 Chothia) CDR H3 (Kabat 及 Chothia)
rb.Ab4 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H1 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H2 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H3 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H4 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H5 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H6 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H7 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H8 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H9 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H10 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H11 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
hu.Ab4.H12 NYAMI (SEQ ID NO: 4) GFSLSNY (SEQ ID NO: 5) TISLGGYTYYANWAKG (SEQ ID NO: 6) ARWSTDSAIYTYAFDP (SEQ ID NO: 7)
表 C3. Ab4 變異體的重鏈可變區及輕鏈可變區
說明 序列
rb.Ab4 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 8) QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAMIWVRQAPGEGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKTSTTVDLKISSPTTEDTATYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
rb.Ab4 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 9) AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISSYLSWYQQKPGQRPELLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCQQGYTSSNIDNIFGGGTEVVVK
hu.Ab4.H1 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 10) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H2 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 11) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H3 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 12) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H4 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 13) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H5 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 14) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H6 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 15) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H7 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 16) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H8 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 17) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H9 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 18) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.H10 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 19) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVGTISLGGYTYYANWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGQGTLVTVSS
hu.Ab4.H11 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 20) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARARWSTDSAIYTYAFDPWGQGTLVTVSS
hu.Ab4.H12 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 21) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSS
hu.Ab4.L1 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 22) DYQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKRPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTSSNIDNIFGGGTKVEIK
hu.Ab4.L2 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 23) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKRPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTSSNIDNIFGGGTKVEIK
hu.Ab4.L3 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 24) DYQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTSSNIDNIFGGGTKVEIK
hu.Ab4.L4 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 25) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTSSNIDNIFGGGTKVEIK
表 D1. Ab5 變異體的輕鏈 CDR 區域
說明 CDR L1 (Kabat 及 Chothia) CDR L2 (Kabat 及 Chothia) CDR L3 (Kabat 及 Chothia)
rb.Ab5 QASENIANALA (SEQ ID NO: 26) GASNLAS (SEQ ID NO: 27) QCAYYGNSFVEGT (SEQ ID NO: 109)
hu.Ab5.L1 QASENIANALA (SEQ ID NO: 26) GASNLAS (SEQ ID NO: 27) QQAYYGNSFVEGT (SEQ ID NO: 28)
hu.Ab5.L2 QASENIANALA (SEQ ID NO: 26) GASNLAS (SEQ ID NO: 27) QQAYYGNSFVEGT (SEQ ID NO: 28)
hu.Ab5.L3 QASENIANALA (SEQ ID NO: 26) GASNLAS (SEQ ID NO: 27) QQAYYGNSFVEGT (SEQ ID NO: 28)
hu.Ab5.L4 QASENIANALA (SEQ ID NO: 26) GASNLAS (SEQ ID NO: 27) QQAYYGNSFVEGT (SEQ ID NO: 28)
hu.Ab5.L5 QASENIANALA (SEQ ID NO: 26) GASNLAS (SEQ ID NO: 27) QQAYYGNSFVEGT (SEQ ID NO: 28)
表 D2. Ab5 變異體的重鏈 CDR 區域
說明 CDR H1 (Kabat) CDR H1 (Chothia) CDR H2 (Kabat 及 Chothia) CDR H3 (Kabat 及 Chothia)
rb.Ab5 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H1 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H2 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H3 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H4 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H5 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H6 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H7 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H8 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H9 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H10 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H11 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H12 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
hu.Ab5.H13 TYAMG (SEQ ID NO: 29) GIDLSTY (SEQ ID NO: 30) LIHRSGRTYYATWAKG (SEQ ID NO: 31) SYPDYSATASI (SEQ ID NO: 32)
表 D3. Ab5 變異體的重鏈可變區及輕鏈可變區
說明 序列
rb.Ab5 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 33) QSVEESGGRLVSPGTPLTLTCTVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCTRSYPDYSATASIWGPGTLVTVSS
rb.Ab5 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 34) DIVVTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASENIANALAWYQQKSGQPPMFLIYGASNLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAAVYYCQCAYYGNSFVEGTFGGGTEVVVK
hu.Ab5.H1 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 35) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H2 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 36) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H3 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 37) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H4 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 38) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H5 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 39) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWISLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H6 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 40) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H7 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 41) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H8 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 42) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H9 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 43) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H10 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 44) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGPGTTVTVSS
hu.Ab5.H11 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 45) EQQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWIGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSS
hu.Ab5.H12 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 46) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVSLIHRSGRTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSS
hu.Ab5.H13 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 47) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSS
hu.Ab5.L1 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 48) DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIANALAWYQQKPGKPPKFLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQAYYGNSFVEGTFGGGTKVEIK
hu.Ab5.L2 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 49) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIANALAWYQQKPGKPPKFLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQAYYGNSFVEGTFGGGTKVEIK
hu.Ab5.L3 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 50) DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIANALAWYQQKPGKAPKFLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQAYYGNSFVEGTFGGGTKVEIK
hu.Ab5.L4 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 51) DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIANALAWYQQKPGKPPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQAYYGNSFVEGTFGGGTKVEIK
hu.Ab5.L5 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 52) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIANALAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQAYYGNSFVEGTFGGGTKVEIK
表 E. 恆定域
說明 序列
hIgG1 恆定域 (重鏈) (SEQ ID NO: 53) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
κ 恆定域 (輕鏈) (SEQ ID NO: 54) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
評估人源化變異體與 hIgG1 Fc 的 CCR8 結合涉及藉由流式細胞術進行篩選，並將人 CCR8 CHO 細胞上的相對 EC 50及 MFI 與親本兔抗體進行比較。具體來說，將穩定的 CHO-huCCR8.Gna15 細胞在 4℃ 用不同濃度 (從 10 ug/ml 或 66.66 nM，1:4 連續稀釋總共 8 個濃度點) 的 Ab4及 Ab5變異體染色 30 分鐘，然後用 FACS 緩衝液 (含 0.5% BSA 及 0.2 mM EDTA 的 PBS) 洗滌兩次，然後在 4℃ 用 AF647 抗 hIgG 染色 15 分鐘。將細胞用 FACS 緩衝液洗滌兩次，並用碘化丙啶 (0.5 ug/ml) 重新懸浮在 FACS 緩衝液中，並且用 iQue3 (Sartorius) 分析。
對於表 F1 中提供的 Ab4LC 變異體 L1-L4，含有 Y2I 突變之變異體 L2 及 L4 顯示出 EC 50或 MFI 的顯著變化。因此確定輕鏈上的 Y2 為關鍵的兔游標殘基。變異體 L1 及 L3 含有該 Y2 殘基，且選擇變異體 L3 進行進一步分析。
表 F1. Ab4 LC 變異體之相對 EC 50 及 MFI
抗體 相對 EC 50 相對 MFI
rb.Ab4 1.0 1.0
hu.Ab4.H1L1 0.88 0.95
hu.Ab4.H1L2 1.06 0.73
hu.Ab4.H1L3 1.23 1.00
hu.Ab4.H1L4 1.04 0.80
對於表 F2 中提供的 Ab4HC 變異體 H2-H11，變異體 H6 (具有 S73N 突變)、變異體 H7 (具有 T76N 突變)、變異體 H8 (具有 V78L 突變)、變異體 H9 (具有 F91Y 突變)、變異體 H10 (具有 P105Q 突變) 及變異體 H11 (具有 S73N、V78L、F91Y 及 P105Q 突變) 顯示出 EC 50或 MFI 的顯著變化。因此確定重鏈上的 S73、T76、V78、F91 及 P105 為關鍵的兔游標殘基。將該五個殘基組合以構建變異體 H12 ( hu.Ab4.H12)。
表 F2. Ab4 HC 變異體之相對 EC 50 及 MFI
抗體 相對 EC 50 相對 MFI
rb.Ab4 1.0 1.0
hu.Ab4.H2L1 0.99 1.07
hu.Ab4.H3L1 1.00 1.02
hu.Ab4.H4L1 0.96 1.06
hu.Ab4.H5L1 1.02 0.90
hu.Ab4.H6L1 1.06 0.68
hu.Ab4.H7L1 1.05 0.44
hu.Ab4.H8L1 1.03 0.72
hu.Ab4.H9L1 1.04 0.87
hu.Ab4.H10L1 1.07 0.77
hu.Ab4.H11L1 0.88 0.66
對於表 F3 中提供的 Ab5LC 變異體 L2-L5，變異體 L2 (具有 V4M 突變)、變異體 L3 (具有 P43A 突變)、變異體 L4 (具有 F46L 突變) 及變異體 L5 (具有 V4M、P43A 及 F46L 突變) 顯示出 EC 50或 MFI 的顯著變化。因此確定輕鏈上的 V4、P43 及 F46 為關鍵的兔游標殘基。所有變異體皆在 CDR L3 中含有 C90Q 突變，引入該突變是為了去除不成對的半胱胺酸，此將在製造期間為不利影響。選擇含有所有三個 V4、P43 及 F46 殘基的變異體 L1 進行進一步研究。
表 F3. Ab5 LC 變異體之相對 EC 50 及 MFI
抗體 相對 EC 50 相對 MFI
rb.Ab5 1.0 1.0
hu.Ab5.H1L2 1.4 0.79
hu.Ab5.H1L3 1.5 0.81
hu.Ab5.H1L4 1.7 0.51
hu.Ab5.H1L5 0.3 0.31
對於表 F4 中提供的 Ab5HC 變異體 H2-H12，變異體 H5 (具有 G49S 突變)、變異體 H6 (具有 K71R 突變)、變異體 H7 (具有 S73N 突變) 及 H12 (具有 G49S、K71R 及 S73N 突變) 顯示出 EC 50或 MFI 的顯著變化。因此，確定重鏈上的 G49、K71 及 S73 為關鍵的兔游標殘基。將該三個殘基組合以構建變異體 H13。
表 F4. Ab5 HC 變異體之相對 EC 50 及 MFI
抗體 相對 EC 50 相對 MFI
rb.Ab5 1 1
hu.Ab5.H2L1 1.1 0.93
hu.Ab5.H3L1 1.5 1.0
hu.Ab5.H4L1 1.5 0.95
hu.Ab5.H5L1 7.6 0.35
hu.Ab5.H6L1 2.4 0.97
hu.Ab5.H7L1 2.2 0.96
hu.Ab5.H8L1 1.4 0.94
hu.Ab5.H9L1 1.3 0.92
hu.Ab5.H10L1 1.2 0.87
hu.Ab5.H11L1 1.3 0.87
hu.Ab5.H12L1 2.3 0.26
實例 3. hu.Ab4.H12L3 及 hu.Ab5.H13L1 變異體之表徵 (a) 人類 - 食蟹獼猴交叉反應性
對於 hu.Ab5.H13L1 及 hu.Ab4.H12L3 ，使用放射性標記的 IgG 及穩定表現人或食蟹獼猴 CCR8 之 CHO 細胞株執行基於細胞之親和力量測。
表 G1. hu.Ab4.H12L3 全長序列
說明 序列
hu.Ab4.H12 全長 重鏈 (SEQ ID NO: 57) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu.Ab4.L3 全長 輕鏈 (SEQ ID NO: 58) DYQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTSSNIDNIFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表 G2. hu.Ab5.H13L1 全長序列
說明 序列
hu.Ab5.H13 全長 重鏈 (SEQ ID NO: 55) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu.Ab5.L1 全長 輕鏈 (SEQ ID NO: 56) DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIANALAWYQQKPGKPPKFLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQAYYGNSFVEGTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
簡而言之，將表現人或食蟹獼猴 CCR8 之穩定 CHO 細胞以每孔 50,000 個細胞接種在冷結合緩衝液 (Opti-MEM+2% FBS+50mM HEPES，pH 7.2+0.1% 疊氮化鈉) 中。將固定濃度的使用 NEX244 Iodogen 方法 (PerkinElmer) 放射性標記的 125抗 CCR8 與從 20nM 或 50nM 開始的連續稀釋的抗 CCR8 抗體混合。將抗體混合物添加至細胞中並在溫和攪拌下在室溫孵育 12 小時。然後將細胞及抗體轉移至 Millipore 多篩過濾盤中。將濾盤用 250 µL 冷結合緩衝液洗滌 4 次並乾燥至少 30 分鐘，然後將濾盤衝入 5 mL 聚苯乙烯管中。使用 Perkin Elmer Wallac Wizard 2470 伽馬計數器量測放射性，該計數器設定為每分鐘 1 次計數，計數效率為 0.8。使用 GraphPad Prism 中的異源一個位點擬合 Ki 競爭性結合模型來擬合資料。
如 圖 7A 至 7D所示， hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab5.H13L1對人類及食蟹獼猴 CCR8 具有類似的親和力，其指示期望之交叉反應性。下文提供了來自該等研究之列出的親和力 Kd (nM) 資料。
表 G3. CCR8 人類和食蟹獼猴親和力
抗體 K D(nM) CCR8 人類 K D(nM) CCR8 食蟹獼猴
hu.Ab4.H12L3 0.0284 0.0243
hu.Ab5.H13L1 0.0040 0.0034
(b) CCR8 選擇性
為了再次確認與相應的 H1L1 變體相比， Ab4及 Ab5變異體保持對 CCR8 的選擇性，按照 圖 4A及 圖 4B所述的程序，藉由流式細胞術分析結合。如前所述， hu.Ab4.H12L3( 圖 8A) 及 hu.Ab5.H13L1( 圖 8B) 均選擇性地結合至表現 CCR8 的細胞。 (c) CCR8 活化和配體阻斷
為了再次確認 Ab4及 Ab5變異體保留了它們關於 CCR8 活化及配體阻斷能力的特性，用 hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab5.H13L1抗體進行了實驗，如先前在實例 1 及 圖 3A 至圖 3C所述。參見 圖 9A 至 9B 。與 圖 3A類似， 圖 9A中的資料再次確認在不存在 CCR8 配體 CCL1 的情況下 Ab4及 Ab5抗 CCR8 抗體變異體均未示出促效作用。與 圖 3B資料類似， 圖 9B中的資料再次確認 Ab4變異體藉由 CCR8 配體 CCL1 (20 nM 配體) 阻斷 CCR8 之活化而表明拮抗作用，而 Ab5變異體在研究濃度下未表明配體阻斷活性。下表中提供了配體阻斷活性之 IC 50值。
表 H1. 配體阻斷活性
抗體 IC 50(nM)
hu.Ab5.H13L1 無抑制
hu.Ab4.H12L3 57.9
(d) 硫酸化獨立性
人 CCR8 在 N 末端含有四個潛在的酪胺酸硫酸化位點，且現有證據表明該等位點之修飾表現出一些異質性 (Gutierrez 等人JBC 2004；Jen, 等人Biochemistry 2010)。因此，識別 CCR8 中該等硫酸化酪胺酸之抗體可能表現出 CCR8 結合的可變性，從而介導可變的 Treg 細胞消耗。所產生的人 CCR8+ HEK293 細胞缺乏酪胺酸亞硫酸基轉移酶 (TPST) 1 及 2，它們係催化酪胺酸硫酸化之酶。然後分析各種抗 CCR8 mAb 與野生型 (293T) 及 TPST1/2 NTC 以及 KO 細胞的結合。
特定而言，將 HEK293、HEK293-hCCR8.TPST1/2 NTC 及 HEK293-hCCR8.TPST1/2 KO 穩定細胞株在 4℃ 用測試及比較抗 CCR8 抗體 (1 ug/ml) 染色 30 分鐘，然後用 FACS 緩衝液 (含 0.5% BSA 及 0.2 mM EDTA 之 PBS) 洗滌兩次，然後在 4℃ 用 AF647 抗 hIgG 染色 15 分鐘。將細胞用 FACS 緩衝液洗滌兩次，並用碘化丙啶 (0.5 ug/ml) 重新懸浮在 FACS 緩衝液中，並且用 BD FACSCelesta 流式細胞儀或 iQue3 (Sartorius) 進行分析。
圖 10A 至 10E示出相比於 Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體及商用抗體鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)， hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab5.H13L1對含有 (hCCR8.TPST1/2 NTC) 以及不含酪胺醯基蛋白轉磺酶 (TPST) 1 及酪胺醯基蛋白轉磺酶 (TPST) 2 (hCCR8.TPST1/2 KO) 的 CCR8 + HEK293 細胞之染色差異。 hu.Ab4.H12L3( 圖 10A) 及 hu.Ab5.H13L1( 圖 10B) 對兩種細胞株 (hCCR8.TPST1/2 NTC 及 hCCR8.TPST1/2 KO) 示出類似的結合/染色，表明它們不依賴酪胺酸硫酸化 (「不依賴硫酸化」) 結合 CCR8。相比之下，Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體 ( 圖 10C) 及商用抗體鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences)( 圖 10D) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)( 圖 10E) 未能結合 TPST1/2 KO 細胞，表明它們需要 CCR8 之酪胺酸硫酸化以用於結合，並且因此被認為是「硫酸化依賴性」。 實例 4. hu.Ab4.H12L3 及 hu.Ab5.H13L1 去岩藻醣基化變異體
去岩藻醣基化 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3變異體 (在 Fc N-聚醣位置 Asn 299) 以及去岩藻醣基化抗 gD 對照藉由來自 FUT8 剔除 (KO) CHO 細胞之表現及純化來製備，如 Wong 等人， Biotechnology and Bioengineering(2010) 106:751-763 所述。 (a) 去岩藻醣基化百分比
CHO FUT8KO 培養基中岩藻醣的滴定產生一組 hu.Ab5.H13L1，其具有不同水平的去岩藻醣基化， 例如在約 14% 至約 93% 之間的去岩藻醣基化之 hu.Ab5.H13L1。
如下表所示，將非岩藻醣基化水平從 14% 提高至 49% 會使 ADCC 活性增加 4 倍以上，且 ADCP 活性增加 3 倍以上。
在以下體外及體內實驗中研究之去岩藻醣基化之 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3含有約 80% 至約 95% 的去岩藻醣基化水平。
表 H2. 去岩藻醣基化百分比對 ADCC 及 ADCP 活性之影響
% 去岩藻醣基化 ADCC EC 50(pM) ADCP EC 50(pM)
93 3.53 0.049
89 4.63 0.052
73 5.42 0.047
62 6.61 0.068
53 8.45 0.093
49 9.24 0.075
14 39.7 0.25
(b) 去岩藻醣基化變異體的增強的 Fcgamma RIIIa 結合
藉由 ELISA 研究了 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3的岩藻醣基化及去岩藻醣基化變異體與兩種 FcgR3a 蛋白的結合。簡而言之，將抗 GST 抗體包被在 Nunc Maxisorp 盤上。以 500 ng/mL 捕獲 GST-FcgR3a.V158 及 GST-FcgR3a.F158。然後洗滌盤，然後將從 100 ug/mL 開始連續稀釋的抗 CCR8 抗體在盤上於室溫孵育 1 小時。洗滌盤並藉由 HRP 結合的抗人 IgG 二級抗體偵測結合的抗體。藉由酶標儀測量 450 nm 處之吸光度。使用 Softmax Pro 中的 4 參數邏輯曲線擬合資料。如下表所示，相比於去岩藻醣基化的對應物 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3，岩藻醣基化的 IgG1 抗 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3表現出增強的 Fcgamma RIIIa 結合活性 (結合效力增加約 10 倍)。
表 I. Fcγ RIIIa 結合活性
抗體 FcgR3a.F158 蛋白 EC 50(ug/mL) FcgR3a.V158 蛋白 EC 50(ug/mL)
hu.Ab5.H13L1 4.107 ± 1.036 0.39 ± 0.049
Afuc.hu.Ab5.H13L1 0.101 ± 0.057 0.035 ± 0.006
hu.Ab4.H12L3 3.74 ± 2.03 0.388 ± 0.178
Afuc.hu.Ab4.H12L3 0.08 ± 0.025 0.033 ± 0.006
(c) 去岩藻醣基化變異體之增強的 ADCC 活性
分析 Afuc.hu.Ab4.H12L3、 hu.Ab4.H12L3、 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab5.H13L1之抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。ADCC 測定如先前在以下文獻中所報導進行：Kamen 等人， Development of a kinetic antibody-dependent cellular cytotoxicity assay.J Immunol Methods(2019)468:49-54 及 Schnueriger 等人， Development of a quantitative, cell-line based assay to measure ADCC activity mediated by therapeutic antibodies.Mol Immunol(2011) 48:1512-17，經過一些修改，其使用 CD16 工程化 NK-92_F158 作為效應細胞並且使用穩定地表現人 CCR8 及 Ga 15 次單元的 CHO 細胞 (CHO/hCCR8.Gna15) 作為標靶細胞。簡而言之，藉由鈣黃綠素釋放法量測 ADCC 對標靶細胞之裂解。根據製造商的方案，用 Calcein-AM (C3100MP，ThermoFisher Scientific) 標記標靶細胞，然後洗滌並以 3000 個細胞/孔的密度接種至 384 孔盤上。以 0.004 至 1 μg/mL 的不同濃度添加抗 CCR8 抗體，然後以 10:1 的效應物:標靶 (E:T) 比率添加 NK-92_F158 細胞。然後將盤在 37℃ 孵育 2.5 小時。孵育後，將盤在 200 x g 下離心 3 分鐘，將上清液轉移至白色不透明 384 孔微孔盤 (OptiPlate-384，PerkinElmer，Waltham，MA)，並以相對螢光單位 (RFU) 使用在 485/520 nm 激發/發射的 EnSight多模式讀盤器 (PerkinElmer) 量測螢光訊號。來自僅含有標靶細胞之孔的訊號代表鈣黃綠素從標記細胞中的自發釋放 (自發釋放)，而含有用 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 裂解的標靶細胞的孔提供最大可用訊號 (最大釋放)。在不添加抗體的情況下，在含有標靶細胞及效應細胞的孔中量測抗體非依賴性細胞介導的細胞毒性 (AICC)。樣品及對照在同一盤中至少以兩重複方式進行測試。特定 ADCC 活性的程度計算如下： %ADCC = 100 x (平均實驗釋放-平均 AICC)/(平均最大釋放-平均自發釋放)
ADCC 活性被繪製為抗體濃度的函數，並使用 Prism (Graphpad; La Jolla, CA) 將資料擬合至不對稱 S 型四參數邏輯 (4PL) 模型。 圖 11A 至 11B示出相比於針對穩定表現 hCCR8 的 CHO 細胞、使用 NK-92 F158 ( 圖 11A) 及 NK-92 V158 ( 圖 11B) 作為效應細胞之其岩藻醣基化對應物 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3，去岩藻醣基化 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3具有增強的 (改善 ＞ 10 倍) ADCC 活性。
還針對 Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體及商用抗體鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend) 測量 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3之 ADCC 活性。參見 圖11C。資料表明，Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體展示出比抗 CCR8 抗體 Afuc.Ab5.H13L1 、 Afuc.Ab4.H12L3更弱之 ADCC 活性 (ADCC 活性低 10-20 倍)。市售抗體鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)(其包含鼠 Fc 域) 如所預期表明無 ADCC 活性，因為在此實例中所用測定主要與包含人 Fc 域之抗體相關。
鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend) 在與包含鼠 Fc 區域的抗體相關之測定中測試 ADCC 活性，而即使用 Jurkat/mFcgR4 穩定株作為效應細胞並且 CHO/hCCR8 作為標靶細胞測試抗人 CCR8 活性。人類 CCR8 (hCCR8) 用於模擬人類臨床環境。具體而言，該測定由表現小鼠 FcgRIV 受體之基因工程化 Jurkat T 細胞株及由 NFAT 響應元件 (NFAT-RE) 驅動之螢光素酶報告基因組成。當與標靶細胞及相關抗體共培養時，mFcgRIV 效應細胞結合抗體之 Fc 域，產生 mFcgRIV 訊號傳導及 NFAT-RE 介導的螢光素酶活性。材料和試劑：測定緩衝劑：RPMI1640 不含酚紅，補充有 4% 的低 IgG；96 孔白色平底聚苯乙烯 TC 處理微孔盤，Corning #3601；Bio-Glo 試劑。測定程序：在測定緩衝液中加入 25 μL/孔稀釋的抗體 (準備 3x，從 30ug/mL 開始，以 1:4 連續稀釋 10 個點)。將標靶細胞重懸於測定緩衝液中，將最終密度調整為1 x 10 6/ml；將 25 µL 細胞分配至每個孔中，使得標靶細胞密度為 25,000/孔；將盤在室溫孵育 20 分鐘。每孔加入 25 μL/孔 Jurkat/mFcgRIV 細胞 (5 x10 6個細胞/mL)，使效應細胞密度為 125,000/孔；在此過程期間定期重新混合容器中的細胞，以防止細胞沉降至底部。將測定盤蓋上蓋子並在 37℃ 將盤與 5% CO 2孵育箱一起孵育 16 小時。不要將盤堆放在孵育箱內。從孵育箱中取出測定盤並平衡至環境溫度持續 15 分鐘。使用多通道移液器，將 75μl Bio-Glo™ 試劑添加至測定盤中，注意不要產生氣泡。將盤在室溫孵育 15 分鐘。使用 EnSight 發光讀盤器量測發光。測試 mIgG2a 同型、hIgG1 及 ratIgG2b 作為對照。人類 CCR8 (hCCR8) 用於模擬人類臨床環境。從資料中可以看出，每個測試的抗 hCCR8 mAb - L263G8 (BioLegend) 及 433H (BD Biosciences) - 在約 1 nM 的抗體濃度水平下顯示出高誘導倍數結果 - 分別顯示出超過約 10 及約 12 之誘導倍數結果。該等抗體中的每一種的高誘導倍數在約 40 nM 的抗體濃度水平下達到平台期——誘導倍數值分別為約 11 及 13。在 圖 11D中提供了該等實驗之結果。
下表中還提供了來自該等研究之活性資料。總之，所研究的每種抗體，無論具有人源化還是鼠 Fc 區，皆在抗體同型與相關效應報告細胞物種匹配的測定中證明了 ADCC 活性。
表 J. ADCC 活性
所測試之 Ab NK-92 F158 細胞 EC 50(nM) 圖 11A NK-92 V158 細胞 EC 50(nM) 圖 11B NK-92 F158 細胞 EC 50(nM) 圖 11C 具有 CHO/hCCR8 EC 50(nM) 之 mFcgRIV Jurkat 細胞 圖 11D
hu.Ab5.H13L1 0.14 0.094      
Afuc.hu.Ab5.H13L1 0.0047 0.0073 0.003   
hu.Ab4.H12L3 0.27 0.21      
Afuc.hu.Ab4.H12L3 0.006 0.011 0.006   
Yoshida Ab       0.060   
L263G8 (Biolegend)       無活性* 0.28
433H (BD Biosciences)       無活性* 0.26
*無活性 = 與特定 Ab 同型無關之測定條件 (d) 針對 Treg 細胞之 ADCC 增強
為了在來自人周邊血單核細胞 (PBMC) 的 Treg 細胞上誘導 CCR8 表現，將 10 7個人 PBMC 腹膜內轉移到 NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠 (JAX) 並在轉移後 2-3 週收集脾臟。根據製造商的方案，使用小鼠譜系細胞耗竭套組 (Miltenyi Biotec) 從 NSG 脾細胞的單細胞懸浮液中富集人 T 細胞，使用人 NK 細胞分離套組 (Miltenyi Biotec) 分別從人 PBMC 中富集原代 NK 細胞。將人 T 細胞與 0.001-1 ug/mL CCR8 mAb 在室溫孵育 30 分鐘，然後以 2:1 的效應物：標靶比率添加原代 NK 細胞。在 37℃ 孵育過夜後，根據製造商的方案，收集細胞、表面染色，並使用 eBioscience Foxp3/轉錄因子染色緩衝液組 (ThermoFisher Scientific) 進行細胞內染色。用於定義 T 細胞群體之抗體為來自 BD Biosciences 之 CD45 (HI30)、CD3 (SK7)、CD8 (RPA-T8) 及 CD14 (63D3)；來自 BioLegend 之 CD4 (RPA-T4)；及來自 ThermoFisher Scientific 之 FOXP3 (236A/E7)。在採集之前，將 CountBright Absolute Counting Beads (ThermoFisher Scientific) 添加至每個樣品中。在 Fortessa X-20 (BD Biosciences) 上進行流式細胞術，並用 FlowJo 軟體 (BD Biosciences，版本 10.5.3) 進行分析。根據製造商的方案計算絕對細胞計數。
藉由計算回收之 T 細胞與回收之 CD8 細胞之比 (Treg/CD8) 或常規 CD4 T 細胞與回收之 CD8 T 細胞之比 (CD4conv/CD8) 來量測針對 Treg 細胞之 ADCC 活性。在所有濃度的 CCR8 mAb 及測試的同型對照 mAb (「gD.afuc」) 中回收的 CD8 T 細胞數目相似。如 圖 12A 至 12D所示，去岩藻醣基化 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3以及岩藻醣基化 CCR8 抗體 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3選擇性介導 ADCC 活性，其中相比於常規 CD4 T 細胞 ( 圖 12B及 12D)，來自體內混合淋巴細胞反應 (MLR) 活化之人 PBMC ( 圖 12A及 12C) 的 Treg 之消耗增加，並且其中去岩藻醣基化變異體介導增加的 ADCC 活性。在常規 CD4 T 細胞中觀察到低水平的去岩藻醣基化抗 CCR8 介導的 ADCC，此與轉移至 NSG 小鼠後常規 CD4 T 細胞上 CCR8 的中度上調一致 (資料未顯示)。
其他資料表明，去岩藻醣基化 CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3對來自 RCC 腫瘤的 Treg 表現出選擇性 ADCC。簡而言之，根據供應商的方案，將人分離腫瘤細胞 (腎細胞癌，Discovery Life Sciences) 解凍。根據製造商的方案，使用人 NK 細胞分離套組 (Miltenyi Biotec) 從人 PBMC 中富集原代 NK 細胞。將人分離腫瘤細胞與 0.001-1 ug/mL CCR8 mAb 在室溫孵育 30 min，然後以 2:1 的效應物：標靶比率添加原代 NK 細胞。在 37℃ 孵育過夜後，如上所述處理細胞以確定 CD8、常規 CD4 及調節性 T 細胞的絕對細胞計數。
如 圖 13A 至 13D所示，去岩藻醣基化 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3以及岩藻醣基化 CCR8 抗體 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3選擇性介導 ADCC 活性，其中相比於常規 CD4 T 細胞 ( 圖 13B及 13D)，來自 RCC 之人分離腫瘤細胞 ( 圖 13A及 3C) 的 Treg 細胞之消耗增加，並且其中去岩藻醣基化變異體介導增加的 ADCC 活性。與腫瘤內常規 CD4 T 細胞上沒有 CCR8 染色一致，在常規 CD4 T 細胞上未觀察到 CCR8 mAb 介導的 ADCC 活性，此表明 CCR8 mAb 介導的 ADCC 對腫瘤內調節性 T 細胞具有選擇性。 (e) ADCP 增強
關於非岩藻醣基化對 ADCP 的影響存在相互矛盾的報導。參見例如 Herter 等人， J Immunol(2014) 192: 2252-2260；Silence 等人， mAbs(2013) 6:523-532；及 Kwiatkowski 等人， mAbs(2020) 12:e1803645 (9 頁)。此外，先前已證明 G236A.I332E 突變體經由增強 FcgR2a 結合來增加 ADCP。參見 Richards 等人， Molecular Cancer Therapeutics(2008) 7:2517-2527。因此，製備 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3兩者之岩藻醣基化及去岩藻醣基化 hIgG1.G236A.I332E Fc 版本以研究是否會觀察到 ADCP 活性。下表中提供了 G236A.I332E 突變體 hIgG1 恆定域，其中與正常 hIgG1 恆定域之突變差異用底線標出，以及 Ab4及 Ab5G236A.I332E 變異體之全長重鏈序列。
表 K. hIgG1.G236A.I332E 變異體
說明 序列
hIgG1.G236A.I332E 恆定域 (SEQ ID NO: 59) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL A GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP E EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Afuc.hu.Ab5.H13.G236A.I332E 全長重鏈 (SEQ ID NO: 60) a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL A GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP E EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Afuc.hu.Ab4.H12.G236A.I332E 全長重鏈 (SEQ ID NO: 61) b EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL A GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP E EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
a Ab5G236A.I332E 變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab5.L1(SEQ ID NO: 56)。 b Ab4G236A.I332E 變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab4.L3(SEQ ID NO: 58)。
藉由使用 EasySep 人單核細胞富集套組 (幹細胞技術)，首先從具有已知 FcgRIIa 及 FcgRIIIa 基因型資訊之基因泰克供體血液中分離人 CD14 +單核細胞。將純化的 CD14 +單核細胞在含有 100 ng/mL hM-CSF(PeproTech, Inc) 的 RPMI + 10% FBS 中分化為巨噬細胞持續 5 天。然後加入 50 ng/mL of hIL-10 ((PeproTech, Inc) 以使巨噬細胞極化 24 小時，然後進行 ADCP 測定。在存在 20 mg/mL 非特異性人 IgG 的情況下，將 NucLight Red 轉染的 CHO/hCCR8.Gna15 標靶細胞與抗 CCR8 抗體預孵育 20 分鐘。然後將上述細胞混合物以 1:1 的 E:T 比率添加至巨噬細胞 (效應細胞) 盤中。將盤放入 IncuCyte Zoom 儀器 (Essen Biosciences；Ann Harbor，MI) 後，每隔一小時使用明場及紅色雷射設置獲得細胞影像，持續 6 小時的時間段。使用儀器嵌入式軟體，藉由同一孔中的巨噬細胞數目對每個孔中的紅細胞計數 (剩餘的標靶細胞) 進行標準化。ADCP 活性被計算為每個樣品中標準化之紅細胞計數與存在同型對照抗體之陰性對照相比減少的百分比。然後 ADCP 活性被繪製為抗體濃度的函數，並使用 Prism 將資料擬合至不對稱 S 型四參數邏輯 (4PL) 模型。每種抗體之 EC 50值確定為達到 50% 標靶細胞毒殺之濃度。
此外，如 圖 14A 至 14D所示，在來自四個不同供體 (其 FcgRIIa (H131R)/FcgRIIIa (V158F) 基因型為 HR/FF ( 圖 14A)、RR/FF ( 圖 14B)、HR/VF ( 圖 14C) 及 RR/VF ( 圖 14D)) 的 CD14 +單核細胞衍生之巨噬細胞中，相比於岩藻醣基化抗體 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3，去岩藻醣基化抗 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3展示出增強的 ADCP 活性。結果表明，在 CCR8 靶向抗體的情況下，去岩藻醣基化導致 ADCP 增強。
相比於 Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體，去岩藻醣基化抗 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3還展示出增強的 ADCP 活性 (改善 3-4 倍)( 圖 14E)。
下表中還提供了來自該等研究之活性資料。
表 L. ADCP 活性
抗體 HR/FF EC 50(nM) 圖 14A RR/FF EC 50(nM) 圖 14B HR/VF EC 50(nM) 圖 14C RR/VF EC 50(nM) 圖 14D HR/FF EC 50(nM) 圖 14E
hu.Ab5.H13L1 n.d. n.d. n.d. n.d.   
Afuc.hu.Ab5.H13L1 0.017 0.2 0.01 0.50 0.022
hu.Ab4.H12L3 0.35 0.81 n.d. 0.41   
Afuc.hu.Ab4.H12L3 0.025 0.12 0.017 0.079 0.035
Yoshida Ab             0.096
n.d.= 未確定
此外，如 圖 15A 至 15D所示，在來自四個不同供體 (其 FcgRIIa (H131R)/FcgRIIIa (V158F) 基因型為基因型 HR/FF ( 圖 15A)、RR/FF ( 圖 15B)、HR/VF ( 圖 15C) 及 RR/VF ( 圖 15D)) 的 CD14 +單核細胞衍生之巨噬細胞中，相比於 FcgRIIa 增強之 G236A.I332E 變異體 Afuc.hu.Ab5.H13L1G236A.I332E，去岩藻醣基化抗 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1展示出類似的改善的 ADCP 活性。鑑於先前的報導稱，儘管使用抗 EPCAM mAb，結合 G236A.I332E 仍介導顯著更高水平的 ADCP，去岩藻醣基化之 hIgG1 變異體與 G236A.I332E 突變之間的 ADCP 活性的相似性令人驚訝。參見 Richards 等人， Molecular Cancer Therapeutics(2008) 7:2517-2527。 (f) Ab4 及 Ab5 抗體之物理表徵
在高濃度下評估了 Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3兩者在熱應力下的溶解度、黏度及行為 (保質期穩定性)。如下表所示，兩種抗體均顯示出可用於其製造及配製的有利化學及物理特性，表現出低聚集性、良好溶解性、低黏度及良好的保質期穩定性。
表 M. 抗體物理表徵
測定 Afuc.hu.Ab5.H13L1 Afuc.hu.Ab4.H12L3
熱應力 (150 mg/mL 於 200 mM 精胺酸琥珀酸鹽中，pH5.5) 2.0% SEC 單體損失 1.9% SEC 單體損失
在 PBS 中的溶解度，pH7.4 (OD) 0.383 0.376
黏度 (於 200 mM 精胺酸琥珀酸鹽中，pH5.5) 9.6 cP (180.3 mg/mL) 12.4 cP (187.1 mg/mL)
熱應力條件：將抗體樣品在 200 mM 精胺酸琥珀酸鹽，pH 5.5 中以 150 mg/mL 在 40 ℃ 孵育 2 週。將對照樣品儲存在-70℃。使用粒徑排阻層析法 (SEC) 評估對照及應力樣品的尺寸變異體。使用 Waters Acquity UPLC H-Class (Waters, Milford, MA) 及 TSKgel® UP-SW3000 管柱，4.6 x 300 mm (Tosoh Biosciences, King of Prussia, PA) 進行 SEC。流動相係含有 0.25 M 氯化鉀的 0.2 M 磷酸鉀緩衝液 (pH 6.2)。在環境溫度以 0.3 mL/min 的流速進行分離，並在 280 nm UV 波長下監測管柱流出物。
在磷酸鹽緩衝生理食鹽水 (PBS) 中的溶解度：將抗體在 200 mM 精胺酸琥珀酸鹽，pH 5.5 中配製為 150 mg/mL，並在 37℃ 透析至 pH 7.4 的 PBS 中 24 小時以確定它們的溶解度。透析後，目視檢查樣品的可見顆粒，並藉由使用 SpectraMax M2/M2e 讀盤器 (Molecular Devices, San Jose, CA) 量測 340、345、350、355 及 360 奈米處的吸光度來確定濁度。對 5 個波長的值求平均，得出最終的溶解度值。
黏度確定：使用 AR G2 流變儀 (TA Instruments，New Castle，DE) 測定 100、150 及 180 mg/mL 樣品在 200 mM 精胺酸琥珀酸鹽，pH 5.5 中的黏度。使用 20 mm 錐形幾何結構，並在 1,000 反秒的恆定剪切速率下進行了 2.5 分鐘的量測。 (g) hu.Ab5.H13L1 之表位圖
為了進行岩藻醣基化 hu.Ab5.H13L1之表位作圖，藉由流式細胞術分析與人類 CCR8 中的丙胺酸點突變之結合。
產生了編碼在 hCCR8 中位置 2-24 處具有 C 端 FLAG 標籤的單個丙胺酸點突變的構建體。將 HEK 293 細胞用編碼突變體 hCCR8 的構建體或使用 transIT X2 (試劑:DNA=3:1) 的模擬構建體轉染 24 小時，並用 huCCR8 抗體 hu.Ab5.H13L1(hIgG1) 進行表面染色，然後固定及透化，且然後是 FITC 抗 Flag (Sigma F4049)。
如 圖 16A所示， hu.Ab5.H13L1不結合 D2A、Y3A、L5A 及 D6A，表明該表位至少包括人類 CCR8 N 端的 DYTLD 區域之至少一個胺基酸殘基。 (h) hu.Ab4.H12L3 之表位圖
為了進行岩藻醣基化 hu.Ab4.H12L3之表位作圖，藉由流式細胞術分析與人類 CCR8 的嵌合形式之結合。
產生了編碼人 CCR8.CCR5 嵌合體 (N-term1 (人 CCR8 的胺基酸殘基 1-23)、N-term2 (人 CCR8 的胺基酸殘基 1-36)、ECL1 (人 CCR8 的胺基酸殘基 91-104)、ECL2 (人 CCR8 的胺基酸殘基 172-193) 及 ECL3 (人 CCR8 的胺基酸殘基 264-271) 的構建體，其中 CCR8 的不同胞外區域被具有 C 端 FLAG 標籤的 CCR5 的對應區域替換。ECL 被定義為細胞外環。將 293 細胞用編碼突變體 hCCR8 的構建體或使用 transIT X2 (試劑:DNA=3:1) 的模擬構建體轉染 24 小時，並用 huCCR8-Ab4.H12L3.hIgG1 進行表面染色，然後固定及透化，且然後是 FITC 抗 Flag (Sigma F4049)。
如 圖 16B所示， hu.Ab4.H12L3不結合 ECL1 及 ECL2 嵌合體，表明該表位包括 CCR8 的 ECL1 及 ECL2 區域之至少一個胺基酸殘基。 實例 5. 小鼠大腸癌模型 CT26 中的小鼠替代抗 CCR8 單株抗體 (mAb) (a) Treg 細胞耗竭
為了證明抗 CCR8 Ab 在體內消耗腫瘤浸潤性 Treg 細胞的能力，用小鼠替代抗 CCR8 mAb 治療患有已確立 CT26 腫瘤之 BALB/c 小鼠，且藉由流式細胞術來分析腫瘤、脾臟及腫瘤引流淋巴結中白血球中的 Treg 細胞、常規 CD4 T 細胞及、CD8 T 細胞的比例。
下表中提供了小鼠替代抗 CCR8 mAb 之輕鏈及重鏈 CDR 區域、輕鏈及重鏈可變區以及全長重鏈及輕鏈序列。
表 N1. 小鼠替代物的輕鏈 CDR 區域
說明 CDR L1 (Kabat 及 Chothia) CDR L2 (Kabat 及 Chothia) CDR L3 (Kabat 及 Chothia)
抗 mCCR8 RSSKSVYSNYLS (SEQ ID NO: 62) RASTLTP (SEQ ID NO: 63) AGGYSSGSDNT (SEQ ID NO: 64)
表 N2. 小鼠替代物的重鏈 CDR 區域
說明 CDR H1 (Kabat) CDR H1 (Chothia) CDR H2 (Kabat 及 Chothia) CDR H3 (Kabat 及 Chothia)
抗 mCCR8 EYSMA (SEQ ID NO: 65) RIDLNEY (SEQ ID NO: 66) YIDAGSGSAYYASWAKG (SEQ ID NO: 67) DVYPGYTTGTNLGL (SEQ ID NO: 68)
表 N3. 小鼠替代物的輕鏈可變區及重鏈可變區
說明 序列
抗 mCCR8 變異 輕鏈    (SEQ ID NO: 69) AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISCRSSKSVYSNYLSWYQQKPGQPPKLLIYRASTLTPGVPSRFKGSGSGTQFSLTIRDVQSADAGSYYCAGGYSSGSDNTFGGGTKLEIK
抗 mCCR8 變異 重鏈 (SEQ ID NO: 70) QSVKESGGRLVTPGGSLTLTCTVSRIDLNEYSMAWVRQAPGKGLEWIGYIDAGSGSAYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLEMTTLTTEDTATYFCARDVYPGYTTGTNLGLWGPGTLVTVSS
表 N4. 全長輕鏈及重鏈小鼠替代物序列
說明 序列
抗 mCCR8 全長輕鏈 (SEQ ID NO: 71) AAVLTQTPASVSAAVGGTVSISCRSSKSVYSNYLSWYQQKPGQPPKLLIYRASTLTPGVPSRFKGSGSGTQFSLTIRDVQSADAGSYYCAGGYSSGSDNTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
抗 mCCR8 全長重鏈 (SEQ ID NO: 72) QSVKESGGRLVTPGGSLTLTCTVSRIDLNEYSMAWVRQAPGKGLEWIGYIDAGSGSAYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLEMTTLTTEDTATYFCARDVYPGYTTGTNLGLWGPGTLVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
在對數生長期收穫 CT26 腫瘤細胞，並以 1:1 的比率重新懸浮在含有基質膠的 HBSS 中。將 BALB/c 小鼠用 100 微升 HBSS+基質膠中的 10 萬個 CT26 細胞在小鼠的側腹皮下接種。監測腫瘤，直至其建立並且平均腫瘤體積達到 130-230 mm 3。然後將小鼠隨機分入治療組中。用小鼠替代抗 CCR8 (mIgG2a) 或抗 gp120 同型對照 Ab 治療係以 0.003mg/kg 至 5mg/kg 抗 CCR8 Ab 於組胺酸緩衝液 #08：20 mM 乙酸組胺酸，240 mM 蔗糖，0.02% 聚山梨醇酯 20 (Tween-20)，pH5.5 中之劑量靜脈內投予。
三天後處死小鼠並獲得腫瘤、脾臟及腫瘤引流淋巴結用於分析。為了產生單細胞懸浮液，將腫瘤切碎並在含有 1% 胎牛血清 (FBS)、0.2 U/mL Liberase DL (Sigma) 及 0.2 mg/mL DNaseI (Sigma) 的 RPMI-1640 培養基中在 37℃ 邊攪拌邊消化 30 分鐘。使腫瘤細胞通過 100 mm 過濾器並用含有 10% FBS 的 RPMI-1640 培養基洗滌。將單細胞懸浮液在 4℃ 用螢光標記的抗 CD45、抗 CD4 及抗 CD8 抗體表面染色 15 分鐘，並根據製造商的方案，使用 eBioscience Foxp3/轉錄因子染色緩衝液組 (Thermo Fisher) 用螢光標記的抗 Foxp3 進行細胞內染色。在 Fortessa X-20 (BD Biosciences) 或 FACSymphony (BD Biosciences) 上進行流式細胞術，並用 FlowJo 軟體 (BD Biosciences) 進行分析。
圖 17A 至 17I示出相對於同型治療組，CT26 荷瘤小鼠之腫瘤中而非脾臟或腫瘤引流淋巴結 ( 圖 17A 至 17C) 之 Treg 細胞 (繪製為 CD45+ 白血球中之 Treg 細胞的分數) 的劑量依賴性消耗。相對於同型對照組，用抗 CCR8 處理時，未觀察到常規 CD4 T 細胞 ( ( 圖 17D 至 17F)) 或 CD8 T 細胞 ( 圖 17G 至 17I) 之比例下降。該等觀察結果證明了抗 CCR8 介導的腫瘤內 Treg 細胞消耗之特異性。 (b) 腫瘤生長抑制
為了證明在體內抗 CCR8 介導的腫瘤浸潤性 Treg 細胞消耗後的腫瘤生長抑制，將患有已確立 CT26 腫瘤的 BALB/c 小鼠用小鼠替代抗 CCR8 mAb 治療並監測腫瘤隨時間的生長。
在對數生長期收穫 CT26 腫瘤細胞，並以 1:1 的比率重新懸浮在含有基質膠的 HBSS 中。將 BALB/c 小鼠用 100 微升 HBSS+基質膠中的 10 萬個 CT26 細胞在小鼠的側腹皮下接種。監測腫瘤，直至其建立並且平均腫瘤體積達到 130-230 mm 3。然後將小鼠隨機分入治療組中。將小鼠用 0.1mg/kg 抗 CCR8 (mIgG2a)、0.1mg/kg 抗 CD25 抗體 (殖株 PC61 mIgG2a) 或抗 gp120 同型對照 Ab 在組胺酸緩衝液 #08：20 mM 乙酸組胺酸、240 mM 蔗糖、0.02% 聚山梨醇酯 20 (Tween-20)，pH5.5 中之單一或每週兩次劑量 (第一劑量為靜脈內，後面的劑量為腹膜內) 靜脈內治療。使用 Ultra Cal-IV 卡尺 (Fred V. Fowler Co.) 在兩個維度 (長度及寬度) 上量測腫瘤體積，並使用以下公式計算體積：腫瘤大小 (mm 3) = (長度 x 寬度 2) x 0.5。
圖 18A 至 18D示出個別小鼠 (灰色線) 及治療組 (擬合曲線，黑色線) 的腫瘤體積隨時間推移之變化。在 CT26 大腸癌模型中，以單一劑量 ( 圖 18B) 或每週兩次 ( 圖 18C) 投予小鼠替代抗 CCR8 mAb 時，觀察到有效的腫瘤生長抑制。兩種治療方案均導致 8/9 小鼠之腫瘤完全消退。用抗 CCR8 mAb 治療比抗 CD25 Ab 治療更有效 ( 圖 18D)，這導致 3/9 小鼠之腫瘤消退。使用同型對照 mAb (抗 gp120)( 圖 18A)。 實例 6. 效應能力與效應無能小鼠替代抗 CCR8 Ab 的比較
為了評估抗 CCR8 Ab 治療是否主要藉由促進 ADCC 及 ADCP 介導的 Treg 細胞消耗或亦藉由抑制 CCR8 的配體依賴性活化起作用，在 CT26 腫瘤模型中，我們將配體阻斷效應能力 mIgG2a 小鼠替代抗 CCR8 Ab 與同一抗 CCR8 殖株之配體阻斷效應無能 mIgG2a.LALAPG 突變體進行比較。
在對數生長期收穫 CT26 腫瘤細胞，並以 1:1 的比率重新懸浮在含有基質膠的 HBSS 中。將 BALB/c 小鼠用 100 微升 HBSS+基質膠中的 10 萬個 CT26 細胞在小鼠的側腹皮下接種。在第一個治療組中，在組胺酸緩衝液 #08：20 mM 乙酸組胺酸、240 mM 蔗糖、0.02% 聚山梨醇酯 20 (Tween-20)，pH5.5 中以 5 mg/kg 的劑量每週兩次投予小鼠替代抗 CCR8 mAb (mIgG2a) 或效應無能 mIgG2a.LALAPG 突變體抗 CCR8 或抗 gp120 同型對照 mAb，在腫瘤接種當天開始 (第一劑靜脈內給藥，所有後續劑量皆腹膜內給藥)。對於第二治療組，監測腫瘤直到它們被確立並達到平均腫瘤體積 130-230mm 3，然後將小鼠隨機分為治療組並在組胺酸緩衝液 #08：20 mM 乙酸組胺酸、240 mM 蔗糖、0.02% 聚山梨醇酯 20 (Tween-20)，pH5.5中，以 5 mg/kg 的劑量 (第一劑量為靜脈內投予，所有後續劑量皆為腹膜內投予) 每週兩次用抗 CCR8 (mIgG2a) 或效應無能 mIgG2a LALAPG 突變抗 CCR8 Ab 治療。使用 Ultra Cal-IV 卡尺 (Fred V. Fowler Co.) 在兩個維度 (長度及寬度) 上量測腫瘤體積，並使用以下公式計算體積：腫瘤大小 (mm 3) = (長度 x 寬度 2) x 0.5。使用 Adventurer Pro AV812 天平 (Ohaus Corporation) 測量小鼠體重。
圖 19A 至 19E示出個別小鼠 (灰色線) 及治療組 (擬合曲線，黑色線) 的腫瘤體積隨時間推移之變化。用效應能力 mIgG2a 小鼠替代抗 CCR8 mAb ( 圖 19B 及 19D) 時，觀察到腫瘤生長抑制，但用無配體阻斷效應 mIgG2a.LALAPG 突變體抗 CCR8 mAb ( 圖 19C 及 19E) 時，未觀察到腫瘤生長抑制。在腫瘤接種 ( 圖 19B) 或在所建立之腫瘤中 ( 圖 19D) 給予時，mIgG2a 抗 CCR8 Ab 有效。該等發現表明，阻斷配體與 CCR8 受體之結合不足以介導抗 CCR8 mAb 治療後之腫瘤生長抑制。使用同型對照 mAb (抗 gp120)( 圖 19A)。 實例 7. 抗 CCR8 及抗 PDL1 mAb 治療的聯合功效
為了評估由抗 CCR8 mAb 與檢查點抑制的組合增加腫瘤生長抑制的潛力，將具有已確立 EMT6 腫瘤的小鼠單獨或組合使用抗 CCR8 及抗 PDL1 mAb 治療。
在對數生長期收穫 EMT6 腫瘤細胞，並以 1:1 的比率重新懸浮在含有基質膠的 HBSS 中。將 BALB/c 小鼠用 100 微升 HBSS+基質膠中的 10 萬個 EMT6 細胞在第 5 個乳房脂肪墊中皮下接種。監測腫瘤，直至其建立並且平均腫瘤體積達到 130-230 mm 3。然後將小鼠隨機分入治療組中。以 0.1 mg/kg 的單劑量靜脈內投予小鼠替代抗 CCR8 (mIgG2a) 或同型對照 Ab。將效應無能抗 PDL1 (mIgG2a.LALAPG) Ab 之第一劑量為 10mg/kg 靜脈內給藥，且隨後的劑量為 5mg/kg 腹膜內給藥，每週兩次。將抗體在組胺酸緩衝液 #08：20 mM 乙酸組胺酸、240 mM 蔗糖、0.02% 聚山梨醇酯 20 (Tween-20)，pH5.5 中稀釋。每週兩次量測腫瘤體積及體重。使用 Ultra Cal-IV 卡尺 (Fred V. Fowler Co.) 在兩個維度 (長度及寬度) 上量測腫瘤體積，並使用以下公式計算體積：腫瘤大小 (mm 3) = (長度 x 寬度 2) x 0.5。使用 Adventurer Pro AV812 天平 (Ohaus Corporation) 測量小鼠體重。
圖 20A 至 20D示出個別小鼠 (灰色線) 及治療組 (擬合曲線，黑色線) 的腫瘤體積隨時間推移之變化。儘管小鼠替代抗 CCR8 及抗 PDL1 mAb 作為單一治療 ( 圖 20B 至 20C) 導致部分腫瘤生長抑制，但兩種 mAb 之組合 ( 圖 20D) 出乎意料地導致完全腫瘤排斥。使用同型對照 mAb (抗 gp120)( 圖 20A)。 實例 8. Ab1-Ab3 H1L1 變異體及抗 CCR8 抗體比對物 (i) Ab1-Ab3 H1L1 變異體
下表中提供了 Ab1-Ab3 H1L1 變異體之輕鏈及重鏈 CDR 區域、輕鏈及重鏈可變區以及全長重鏈及輕鏈序列。
表 O1. Ab1 、 Ab2 及 Ab3 變異體的輕鏈 CDR 區域
說明 CDR L1 (Kabat 及 Chothia) CDR L2 (Kabat 及 Chothia) CDR L3 (Kabat 及 Chothia)
hu.Ab1.H1L1 QASQRIGNALA (SEQ ID NO: 73) RASTLES (SEQ ID NO: 74) LGGYISIGNVYT (SEQ ID NO: 75)
hu.Ab2.H1L1 QSSKSVNNNNLA (SEQ ID NO: 76) FASALAS (SEQ ID NO: 77) QGAYSGGSDSYA (SEQ ID NO: 78)
hu.Ab3.H1L1 QASQSISNALA (SEQ ID NO: 79) EVSKVAS (SEQ ID NO: 80) QSAYYGNSYVWGA (SEQ ID NO: 81)
表 O2. Ab1 、 Ab2 及 Ab3 變異體的重鏈 CDR 區域
說明 CDR H1 (Kabat) CDR H1 (Chothia) CDR H2 (Kabat 及 Chothia) CDR H3 (Kabat 及 Chothia)
hu.Ab1.H1L1 SNYYMC (SEQ ID NO: 82) GFDFSSN (SEQ ID NO: 83) CIHISSVTNTWYASWATG (SEQ ID NO: 84) VGNSDYRYFNL (SEQ ID NO: 85)
hu.Ab2.H1L1 YGYDMC (SEQ ID NO: 86) GFSFSYG (SEQ ID NO: 87) CISAGSSDNTWYASWAKG (SEQ ID NO: 88) YLGL (SEQ ID NO: 89)
hu.Ab3.H1L1 SYAMS (SEQ ID NO: 90) GFSLSSY (SEQ ID NO: 91) VISASGRIIYATWAKG (SEQ ID NO: 92) GVPSYSLVMSD (SEQ ID NO: 93)
表 O3. Ab1 、 Ab2 及 Ab3 變異體的重鏈可變區及輕鏈可變區
說明 序列
hu.Ab1.H1L1 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 94) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQRIGNALAWYQQKPGKPPKLLIYRASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYISIGNVYTFGGGTKVEIK
hu.Ab1.H1L1 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 95) EQQLVESAGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSSNYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIHISSVTNTWYASWATGRFTISKDTSSTTVYLQMISLKTEDTAVYFCTRVGNSDYRYFNLWGPGTLVTVSS
hu.Ab2.H1L1 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 96) EQVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQSSKSVNNNNLAWYQQKPGQPPRLLIYFASALASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQGAYSGGSDSYAFGGGTKVEIK
hu.Ab2.H1L1 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 97) EQQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSYGYDMCWVRQAPGKGLEWIACISAGSSDNTWYASWAKGRFTISKDTSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCSRYLGLWGPGTLVTVSS
hu.Ab3.H1L1 輕鏈可變區 (SEQ ID NO: 98) EPVMTQSPATLSVSPGERATLSCQASQSISNALAWYQQKPGQPPRLLIYEVSKVASGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQSAYYGNSYVWGAFGQGTKVEIK
hu.Ab3.H1L1 重鏈可變區 (SEQ ID NO: 99) EQQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVISASGRIIYATWAKGRFTISKDSAKTSVYLQMNSLRDEDTAVYFCARGVPSYSLVMSDWGPGTTVTVSS
表 O4. Ab1 、 Ab2 及 Ab3 變異體的重鏈全長序列及輕鏈全長序列
說明 序列
hu.Ab1.H1L1 全長 輕鏈 (SEQ ID NO: 100) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQRIGNALAWYQQKPGKPPKLLIYRASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGGYISIGNVYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu.Ab1.H1L1 全長 重鏈 (SEQ ID NO: 101) EQQLVESAGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSSNYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIHISSVTNTWYASWATGRFTISKDTSSTTVYLQMISLKTEDTAVYFCTRVGNSDYRYFNLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu.Ab2.H1L1 全長 輕鏈 (SEQ ID NO: 102) EQVLTQSPGTLSLSPGERATLSCQSSKSVNNNNLAWYQQKPGQPPRLLIYFASALASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQGAYSGGSDSYAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu.Ab2.H1L1 全長 重鏈 (SEQ ID NO: 103) EQQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSYGYDMCWVRQAPGKGLEWIACISAGSSDNTWYASWAKGRFTISKDTSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCSRYLGLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu.Ab3.H1L1 全長 輕鏈 (SEQ ID NO: 104) EPVMTQSPATLSVSPGERATLSCQASQSISNALAWYQQKPGQPPRLLIYEVSKVASGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQSAYYGNSYVWGAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu.Ab3.H1L1 全長 重鏈 (SEQ ID NO: 105) EQQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVISASGRIIYATWAKGRFTISKDSAKTSVYLQMNSLRDEDTAVYFCARGVPSYSLVMSDWGPGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(ii) 抗 CCR8 抗體比對物
本文研究的 Yoshida 人源化抗人 CCR8 抗體的全長重鏈及全長輕鏈序列揭示於在 2019 年 10 月 30 日在USSN 16/183,216 的起訴期間提交的美國聲明中公開 (公佈為 US 2019/0071508，且後來被授權為 US 10,550,191)。此相同抗體的輕鏈可變區、輕鏈恆定區、重鏈可變區及重鏈恆定區在 PCT 申請公開號 WO2020138489 中作為序列 59、52、41 及 53 揭示。Yoshida 抗體表現為人 hIgG1 抗體 (即，具有人 Fc 區域)。為該等研究購買了市售鼠抗人 CCR8 抗體 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 抗體 L263G8 (Biolegend)。433H (BD Biosciences) 及 L263G8 (Biolegend) 為包含小鼠 IgG2a 同型 Fc 區域之小鼠單株抗體。另參見 Mutalithas 等人， Clinical & Experimental Allergy(2010) 40:1175 (433H, BD Biosciences), Mitson-Salazar 等人， J. Allergy Clin. Immunol. (2016) 907-918 (L263G8, Biolegend) 及 www.labome.com/review/gene/human/CCR8-antibody.html (L263G8, Biolegend)。 實例 9 ： Ab1-Ab5 之末端離胺酸變異體
考慮了目前揭示的抗 CCR8 抗體之另外的 Fc 變異體，其中親代抗體的重鏈之 C 端為縮短的 C 端，其中 C 端離胺酸已被去除，導致縮短的 C 端結尾 PG。下表 P 中提供了 Ab1-Ab-5 之末端離胺酸變異體。
Ab5末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab5.L1(SEQ ID NO: 56)。
Ab4末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab4.L3(SEQ ID NO: 58)。
Ab5G236A.I332E 末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab5.L1(SEQ ID NO: 56)。
Ab4G236A.I332E 末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab4.L3(SEQ ID NO: 58)。
Ab1末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab1.L1(SEQ ID NO: 100)。
Ab2末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab2.L1(SEQ ID NO: 102)。
Ab3末端離胺酸變異體之輕鏈全長序列對應於 hu.Ab3.L1(SEQ ID NO: 104)。
表 P. Ab1 、 Ab2 、 Ab3 、 Ab4 及 Ab5 變異體之重鏈末端離胺酸變異體序列
說明 序列
hu.Ab5.H13 末端離胺酸變異體重鏈 (SEQ ID NO: 111) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
hu.Ab4.H12 末端離胺酸變異體重鏈 (SEQ ID NO: 112) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Afuc.hu.Ab5.H13.G236A.I332E 末端離胺酸變異體重鏈 (SEQ ID NO: 113) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSTYAMGWVRQAPGKGLEWVGLIHRSGRTYYATWAKGRFTISKDSSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSYPDYSATASIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Afuc.hu.Ab4.H12.G236A.I332E 末端離胺酸變異體重鏈 (SEQ ID NO: 114) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNYAMIWVRQAPGKGLEWVSTISLGGYTYYANWAKGRFTISRDSSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARARWSTDSAIYTYAFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
hu.Ab1.H1L1 末端離胺酸變異體 重鏈 (SEQ ID NO: 115) EQQLVESAGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSSNYYMCWVRQAPGKGLEWIGCIHISSVTNTWYASWATGRFTISKDTSSTTVYLQMISLKTEDTAVYFCTRVGNSDYRYFNLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
hu.Ab2.H1L1 末端離胺酸變異體 重鏈 (SEQ ID NO: 116) EQQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSYGYDMCWVRQAPGKGLEWIACISAGSSDNTWYASWAKGRFTISKDTSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCSRYLGLWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
hu.Ab3.H1L1 末端離胺酸變異體重鏈 (SEQ ID NO: 117) EQQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVISASGRIIYATWAKGRFTISKDSAKTSVYLQMNSLRDEDTAVYFCARGVPSYSLVMSDWGPGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
實例 10. 食蟹獼猴中測試抗 CCR8 mAb 之血清濃度及 ADA
抗 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1、 Afuc.hu.Ab4.H12L3及對照抗 gD 用於本研究。在三個劑量組中之各者中均存在三隻雄性食蟹獼猴 - 對照：指定為 1001、1002、1003； Afuc.hu.Ab5.H13L1：指定為 2001、2002、2003；及 Afuc.hu.Ab4.H12L3：指定為 3001、3002、3003。每隻均被給予單一 10 mg/kg IV 推注之抗 gD 或測試抗 CCR8 mAb。給藥後 0.25、2 及 6 小時；1、2、7、14、21、28 及 35 天收集用於分析之血樣，並且使用合格的 ELISA 分析方法測定血清的抗 gD (對照組) 及抗 CCR8 抗體之濃度。該測定之定量下限 (LLOQ) 為 0.015625 μg/mL。PK 參數使用 Phoenix 1.4 (WinNonlin 藥物動力學軟體版本 6.4)(Certara, USA)、使用與 IV 推注投予一致之非隔室分析來估計。在預給藥和第 1、8、15、22、29 和 36 天收集血樣用於抗藥物抗體 (ADA) 分析，並使用合格的 ELISA 測定，針對試驗品分析血清之抗體。
投予單一 10 mg/kg IV 劑量後，食蟹獼猴中抗 gD、 Afuc.hu.Ab5.H13L1或 Afuc.hu.Ab4.H12L3之血清濃度曲線示於 圖 21中。已發現抗 gD 組與 Afuc.hu.Ab5.H13L1組之間的全身曝露量相當，在給藥後 35 天期間展示出持續的血清濃度水平，相應的平均清除率為 3.96 ± 0.412 mL/天/kg 及 4.38 ± 0.291 mL/天/kg。相比之下， Afuc.hu.Ab4.H12L3在同一給藥後 35 天期間展示出較低的曝露量，平均清除率為 9.00 ± 1.01 mL/天/kg。如 Afuc.hu.Ab5.H13L1所展示，在較長時間段內保持血清濃度水平且清除較慢預計將引發更為持續之標靶接合，這可能轉化為更佳的抗癌活性及更少的給藥頻率。
相比於抗 gD 組及 Afuc.hu.Ab5.H13L1組，觀察到 Afuc.hu.Ab4.H12L3的全身曝露量之差異可以藉由在稍後的時間點之 Afuc.hu.Ab4.H12L3治療組中存在抗藥物抗體 (ADA) 來部分解釋。例如，用抗 gD 給藥之動物 1001、1002 及 1003 對 ADA 之存在呈陰性。投予 Afuc.hu.Ab5.H13L1後，動物 2001 呈 ADA 陽性，但當相比於呈 ADA 陰性之其他兩隻 Afuc.hu.Ab5.H13L1給藥的動物 (編號 2002 及 2003) 時，ADA 之存在似乎對曝露量無影響。在投予 Afuc.hu.Ab4.H12L3後，已發現動物 3002 及 3003 呈 ADA 陽性，並且當相比於呈 ADA 陰性之動物 3001 時，ADA 之存在似乎對全身曝露量有影響。 實例 11. 監測食蟹獼猴中 CCR8+ T-reg 細胞之水平
抗 CCR8 抗體 Afuc.hu.Ab5.H13L1、 Afuc.hu.Ab4.H12L3及對照抗 gD 用於本研究。在三個劑量組中之各者中均存在三隻雄性食蟹獼猴 - 對照組：指定為 1001、1002、1003； Afuc.hu.Ab5.H13L1第 2 組：指定為 2001、2002、2003；及 Afuc.hu.Ab4.H12L3第 3 組：指定為 3001、3002、3003。在第 1 天給藥前 (「預研究」) 以及第 1 天 0 小時 (「預給藥」) 從每隻動物收集血液。然後經由靜脈內注射向每隻動物給藥單一劑量之 10 mg/kg 去岩藻醣基化抗 gD (對照組)、 Afuc.hu.Ab5.H13L1(第 2 組) 或 Afuc.hu.Ab4.H12L3(第 3 組)。在第 1 天開始，在給藥後的以下時間點收集含有初始劑量的測試 CCR8 mAb 的血液：6、24、48、168、336、504、668 及 840 小時，並在流式細胞術分析之前，進行以下處理：(i) 未加標任何測試 CCR8 mAb (「未加標」) 之血樣，(ii) 進一步加標飽和濃度的 Afuc.hu.Ab5.H13L1之血樣，及 (iii) 進一步加標飽和濃度的 Afuc.hu.Ab4.H12L3之血樣。然後用標記的山羊抗人 IgG 抗體處理每個未加標及加標的樣品，該抗體偵測測試抗 CCR8 mAb 與 cynoCCR8 的結合，並介於流式細胞術進行分析。
使用針對表型標記抗原的特異性抗體識別 T 細胞亞群。具體而言，T 調節性 (T-reg) 細胞被識別為 CD3+CD4+Foxp3+ 細胞。使用未加標的血樣識別藥物結合的 CCR8+ T-reg 細胞。
正如在未加標樣品中觀察到的，兩種測試抗 CCR8 mAb 在給藥後長達 840 小時內都沒有顯著降低全血中的總 T-reg 細胞絕對計數。參見 圖 22A 至 22C。兩種測試抗 CCR8 mAb 在全部給藥後長達 840 小時內亦沒有顯著降低全血中的總淋巴細胞計數 (資料未顯示)。
如前所述， Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3結合至 CCR8， Afuc.hu.Ab4.H12L3及 Afuc.hu.Ab5.H13L1二者均作為彼此之非競爭性 CCR8 結合劑，且 Afuc.hu.Ab4.H12L3對人及食蟹獼猴 CCR8 具有稍高的親和力。參見例如， 圖 16A 至 16B，以及表 G3 中提供之親和力 Kd (nM) 資料。 Afuc.hu.Ab4.H12L3在稍後的時間點也具有增加的 ADA 形成傾向。參見實例 10。
如 圖 23A 至 23C可見，最初用對照 (第 1 組) 處理的來自食蟹獼猴的未加標之血液的流式細胞術分析表明總 CCR8+ T-reg 細胞沒有調節。此外，加標之血液 (即，最初用對照 (第 1 組) 處理然後用飽和濃度的 Afuc.hu.Ab5.H13L1加標之血液，或最初用對照 (第 1 組) 處理然後用飽和濃度的 Afuc.hu.Ab4.H12L3加標之血液) 的流式細胞術對總 CCR8+ T-reg 細胞計數之影響也很小。相對百分比係指藉由每種測試抗 CCR8 mAb 檢測到的 CCR8+ T-reg 細胞之百分比。由於相比於 Afuc.hu.Ab5.H13L1， Afuc.hu.Ab4.H12L3具有略高之親和力，因此加標之 Afuc.hu.Ab4.H12L3樣品的相對百分比具有更高的檢測百分比。
關於第 3 組，如 圖 23D 至 23F可見，在三隻動物中之各者中，(i) 最初用 Afuc.hu.Ab4.H12L3(「未加標」) 處理之血液，(ii) 最初用 Afuc.hu.Ab4.H12L3處理然後加標 Afuc.hu.Ab5.H13L1之血液，或 (iii) 最初用 Afuc.hu.Ab4.H12L3處理然後加標 Afuc.hu.Ab4.H12L3之血液的流式細胞術，表明在給藥後多達 168 小時內，CCR8+ T-reg 細胞降低。從給藥後 336 小時開始，在兩隻動物中注意到 CCR8+ Treg 細胞頻率的部分恢復，此可能是由於針對 Afuc.hu.Ab4.H12L3的 ADA 的存在增加。
關於第 2 組，如 圖 23G 至 23I可見，在動物 2002 及 2003 中，(i) 最初用 Afuc.hu.Ab5.H13L1(「未加標」) 處理之血液，(ii) 最初用 Afuc.hu.Ab5.H13L1處理然後用飽和濃度的 Afuc.hu.Ab5.H13L1加標之血液，或 (iii) 最初用 Afuc.hu.Ab5.H13L1處理然後飽和濃度的 Afuc.hu.Ab4.H12L3加標之血液的流式細胞術，表明 CCR8+ T-reg 細胞降低。
第 2 組和第 3 組動物均表明對總 Treg 細胞計數幾乎沒有影響 ( 圖 22A 至 22C)，但在投予後表明周邊血 CCR8+ T-reg 細胞數目減少 ( 圖 23D 至 23I)，無論加標或未加標，這與所提出之作用機制一致 (參見 圖 2A)。 其他實施例
儘管為了清楚理解起見，藉由圖示及實例的方式對前述者進行了詳細描述，但此等描述及實例不應被解釋為限制本揭露之範圍。本文引用的所有專利及科學文獻皆以引用的方式明確納入其所有內容。
圖 1示出與來自人結腸直腸癌分離腫瘤細胞 (DTC) (獲自 Discovery Life Sciences) 之 Treg 細胞 (Treg) 選擇性結合的抗 CCR8 單株抗體 (mAb) 之篩選結果。所示係 CD8 T 細胞 (定義為 CD45+ CD14- CD3+ CD8+ CD4-)(圓圈，⚪)、常規 CD4 T 細胞 (定義為 CD45+ CD14- CD3+ CD8- CD4+ FOXP3-)(正方形，◻) 及 Treg 細胞 (定義為 CD45+ CD14- CD3+ CD8- CD4+ FOXP3+)(三角形，▲) 之平均螢光強度 (MFI) 值。五個抗 CCR8 mAb 殖株 Ab1-Ab5 中之三個殖株特異性染色腫瘤內 Treg 細胞而不是常規 CD4 或 CD8 T 細胞，並根據 CCR8 MFI 進行排序： hu.Ab4.H1L1 ＞ hu.Ab5.H1L1 ＞ hu.Ab3.H1L1。 圖 2A 至 2B示出所提出的自然殺手 (NK) 細胞介導的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 之作用機制，其導致腫瘤浸潤性表現 CCR8 之 Treg ( 圖 2A) 耗竭並且提出人/食蟹獼猴交叉反應性抗 CCR8 mAb 之 ADCC 活性以進一步研究 ( 圖 2B)。抗 CCR8 mAb hu.Ab3.H1L1、 hu.Ab5.H1L1及 hu.Ab4.H1L1之 EC 50值分別確定為 0.02 nM、0.02 nM 及 0.08 nM。 圖 3A 至 3D示出人/食蟹獼猴交叉反應性抗 CCR8 mAb hu.Ab4.H1L1 、 hu.Ab5.H1L1及 hu.Ab3.H1L1以及對照品抗 CCR8 mAb (人源化抗人 Yoshida 抗 CCR8 抗體、鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)) 之促效劑及拮抗劑活性。如 圖 3A所示，CCR8 的已知配體 CCL1 示出促效劑活性，但無一抗 CCR8 測試 mAb 示出促效作用。 圖 3B中的資料示出抗 CCR8 mAb hu.Ab4.H1L1表明針對 CCR8 配體 CCL1 (20 nM 配體) 之拮抗 (中和) 活性，而抗 CCR8 mAbs hu.Ab5.H1L1及 hu.Ab3.H1L1在研究濃度下未表明配體阻斷 (非中和) 活性。 圖 3C中的資料示出對照品抗 CCR8 mAb (人源化抗人 Yoshida 抗 CCR8 抗體、鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)) 不示出促效作用，而 CCR8 配體 CCL1 可以。 圖 3D中的資料示出對照品抗 CCR8 mAb (人源化抗人 Yoshida 抗 CCR8 抗體、鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 Biolegend L263G8 (Biolegend)) 表明針對 CCR8 配體 CCL1 之拮抗 (中和) 活性。實例中提供了配體阻斷活性之 IC 50值。 圖 4A 至 4F示出 hu.Ab3.H1L1 ( 圖 4A) 、 hu.Ab4.H1L1 ( 圖 4B)及 hu.Ab5.H1L1 ( 圖 4C)以及商用抗 CCR8 mAb 鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) ( 圖 4D)及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend) ( 圖 4E)及人源化抗人 Yoshida 抗 CCR8 mAb ( 圖 4F)與 HEK293 細胞之結合資料，該等細胞用編碼人類 GPCR (CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR8、CXCR4、ACKR2 及 ACKR4)、hCCR8 構建體之 N 端 FLAG 標籤化質體或用使用 transIT X2 (試劑：DNA=3:1) 的模擬構建體瞬時轉染。每個 GPCR 之細胞表面表現藉由用抗 FLAG 抗體對照 (5 ug/mL) 染色來確認。mAb hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1僅染色含有 hCCR8 之細胞，證實它們對 hCCR8 之特異性。mAb hu.Ab3.H1L1示出多個其他 GPCR 之染色，指示缺乏特異性。表明最佳 ADCC 活性 (如 圖 2所示) 之 CCR8 選擇性 hu.Ab4.H1L1及 hu.Ab5.H1L1mAb 被用於進一步研究。 圖 5A 至 5D示出所研究之兔 ( rb.Ab4) 及人源化 Ab4(L1-L4 及 H1-H12) CCR8 mAb 的序列的輕鏈可變區 ( 圖 5A) 及重鏈可變區 ( 圖 5B 至 5D) 比對。根據變異體抗體之結合評估，輕鏈 (L3) 上的 Y2 以及重鏈 (H12) 上的 S73、T76、V78、F91 及 P105 被確定為關鍵的兔游標殘基。實例中提供了 CDR、可變區、恆定區及全長序列。 圖 6A 至 6D示出所研究之兔 ( rb.Ab5) 及人源化 Ab5(L1-L5 及 H1-H13) CCR8 mAb 的序列的輕鏈可變區 ( 圖 6A) 及重鏈可變區 ( 圖 6B 至 6D) 比對。引入 CDR L3 中之 C90Q 突變，以去除將在製造過程中產生不利影響之未配對半胱胺酸。根據變異體抗體之結合評估，輕鏈 (L1) 上的 V4、P43 及 F46 以及重鏈上的 G49、K71 及 S73 (H13) 被確定為關鍵的兔游標殘基。實例中提供了 CDR、可變區、恆定區及全長序列。 圖 7A 至 7D示出對 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3mAb 之基於細胞的親和力測量之結果，該親和力測量使用放射性標記之 IgG 及穩定表現人 CCR8 或食蟹獼猴 (「cyno」) CCR8 之 CHO 細胞株。資料示出 hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab5.H13L1mAb 對人類及食蟹獼猴 CCR8 具有類似的親和力，其指示期望之交叉反應性 (比較 圖 7A與 圖 7B，並且比較 圖 7C與 圖 7D)。實例中提供了來自該等研究之 Kd (nM) 親和力資料。 圖 8A 至 8B示出 hu.Ab4.H12L3 ( 圖 8A)及 hu.Ab5.H13L1 ( 圖 8B)mAb 與一組硫酸化 GPCR 之結合資料，並再次確認該等 Ab4及 Ab5變異體，與提供於 圖 4B及 圖 4C中之 Ab4及 Ab5資料類似，示出對 CCR8 之選擇性。由於與 hCCR8 的 N 端 FLAG 標籤之結合較弱 (其影響與 Ab5的 N 端表位之結合；參見 圖 16)，具有 C 端 FLAG 之 CCR8 構建體也提供於 圖 4C中。 圖 9A 至 9B示出抗 CCR8 mAbs hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab5.H13L1對 CCR8 活化之影響，如藉由 Ca 2+流入測定 ( 圖 9A) 及 CCR8 CCL1 配體結合 ( 圖 9B) 所確定。與 圖 3A資料類似， 圖 9A再次確認在不存在 CCR8 配體 CCL1 的情況下 Ab4及 Ab5抗 CCR8 mAb 變異體均未示出促效作用。與 圖 3B資料類似， 圖 9B再次確認 Ab4變異體表明針對 CCR8 配體 CCL1 (20 nM 配體) 之拮抗作用，而 Ab5變異體在研究濃度下未表明配體阻斷活性。實例中提供了配體阻斷活性之 IC 50值。 圖 10A 至 10E示出相比於人源化抗人 Yoshida CCR8 mAb 及商用抗體鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)， hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab5.H13L1對含有 (hCCR8.TPST1/2 NTC) 以及不含酪胺醯基蛋白轉磺酶 (TPST) 1 及酪胺醯基蛋白轉磺酶 (TPST) 2 (hCCR8.TPST1/2 KO) 的 CCR8 + HEK293 細胞之染色差異。 hu.Ab4.H12L3( 圖 10A) 及 hu.Ab5.H13L1( 圖 10B) 對兩種細胞株 (hCCR8.TPST1/2 NTC 及 hCCR8.TPST1/2 KO) 示出類似的結合/染色，表明它們不依賴酪胺酸硫酸化 (「不依賴硫酸化」) 結合 CCR8。相比之下，人源化抗人 Yoshida CCR8 抗體 ( 圖 10C) 及商用抗體鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences)( 圖 10D) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend)( 圖 10E) 未能結合 TPST1/2 KO 細胞，表明它們需要 CCR8 之酪胺酸硫酸化以用於結合，並且因此被認為是「硫酸化依賴性」。 圖 11A 至 11D示出相比於針對穩定表現 hCCR8 的 CHO 細胞、使用 NK-92 F158 ( 圖 11A) 及 NK-92 V158 ( 圖 11B) 作為效應細胞之其岩藻醣基化 CCR8 對應物 hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3，去岩藻醣基化 CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3示出增強的 (改善 ＞ 10 倍) ADCC 活性，並且相比於人源化抗人 Yoshida 抗 CCR8 抗體 ( 圖 11C)，還示出 ADCC 活性改善 10-20 倍。商用抗 CCR8 mAb 鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend) 表明 (如所預期) 無 ADCC 活性，因為所用測定主要與包含人 Fc 區域之抗體相關 ( 圖 11C)。 圖 11D示出鼠抗人 CCR8 mAb 433H (BD Biosciences) 及 鼠抗人 CCR8 mAb L263G8 (Biolegend) 具有使用對包含鼠 Fc 區域的抗體具有特異性的測定之 ADCC 活性以及人抗 CCR8 活性。實例中還提供了活性資料。 圖 12A 至 12D示出當用去岩藻醣基化、岩藻醣基化 (hIgG1) 及去岩藻醣基化同型對照 mAb (「gD.afuc」) 及作為效應細胞之初代 NK 細胞孵育時，相比於來自周邊血單核細胞 (PBMC) 之常規人 CD4 T 細胞，針對人 Treg 細胞之選擇性 ADCC 活性，該人 CD4 T 細胞在轉移到 NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠中以誘導 CCR8 表現後回收。藉由計算回收的 Treg 細胞與回收的 CD8 細胞 (Treg/CD8) 或常規 CD4 T 細胞與回收的 CD8 T 細胞 (CD4conv/CD8) 之比率來測量針對 Treg 細胞之 ADCC 活性。相比於常規 CD4 T 細胞 ( 圖 12B)，CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab4.H12L3選擇性介導的針對 Treg 細胞 ( 圖 12A) 之 ADCC 活性，其中去岩藻醣基化變異體表明 ADCC 活性增加。類似地，相比於常規 CD4 T 細胞 ( 圖 12D)，CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab5.H13L1選擇性介導的針對 Treg 細胞 ( 圖 12C) 之 ADCC 活性，其中去岩藻醣基化變異體表明 ADCC 活性增加。 圖 13A 至 13D示出當人分離腎細胞癌 (RCC) 細胞用去岩藻醣基化、岩藻醣基化 (hIgG1) 及去岩藻醣基化同型對照 mAb (「gD.afuc」) 及作為效應細胞之初代 NK 細胞孵育時，相比於常規 CD4 T 細胞，針對人 Treg 細胞之選擇性 ADCC 活性。藉由計算回收的 Treg 細胞與回收的 CD8 細胞 (Treg/CD8) 或常規 CD4 T 細胞與回收的 CD8 T 細胞 (CD4conv/CD8) 之比率來測量針對 Treg 細胞之 ADCC 活性。相比於常規 CD4 T 細胞 ( 圖 13B)，CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab4.H12L3及 hu.Ab4.H12L3選擇性介導的針對 Treg 細胞 ( 圖 13A) 之 ADCC 活性，其中去岩藻醣基化變異體表明 ADCC 活性增加。類似地，相比於常規 CD4 T 細胞 ( 圖 13D)，CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab5.H13L1選擇性介導的針對 Treg 細胞 ( 圖 13C) 之 ADCC 活性，其中去岩藻醣基化變異體表明 ADCC 活性增加。 圖 14A 至 14E示出在來自四個不同供體 (其 FcgRIIa (H131R)/FcgRIIIa (V158F) 基因型為 HR/FF ( 圖 14A)、RR/FF ( 圖 14B)、HR/VF ( 圖 14C) 及 RR/VF ( 圖 14D)) 的 CD14 +單核細胞衍生之巨噬細胞中，相比於岩藻醣基化 mAb hu.Ab5.H13L1及 hu.Ab4.H12L3，去岩藻醣基化抗 CCR8 mAbs Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3展示出增強的 ADCP 活性，並且還示出相比於人源化抗人 Yoshida 抗 CCR8 抗體 ( 圖 14E)，ADCP 活性改善 3-4 倍。實例中還提供了活性資料。 圖 15A 至 15D示出在來自四個不同供體 (其 FcgRIIa (H131R)/FcgRIIIa (V158F) 基因型為基因型 HR/FF ( 圖 15A)、RR/FF ( 圖 15B)、HR/VF ( 圖 15C) 及 RR/VF ( 圖 15D)) 的 CD14 +單核細胞衍生之巨噬細胞中，相比於 FcgRIIa 增強之 G236A.I332E 變異體 Afuc.hu.Ab5.H13L1.G236A.I332E，去岩藻醣基化抗 CCR8 mAb Afuc.hu.Ab5.H13L1展示出類似的改善的 ADCP 活性。 圖 16A 至 16B示出 hu.Ab5.H13L1( 圖 16A) 及 hu.Ab4.H12L3( 圖 16B) mAb 之表位圖。如 圖 16A所示，其中產生了構建體，該構建體編碼在具有 C 端 FLAG 標籤的 hCCR8 中位置 2-24 處之個別丙胺酸點突變， hu.Ab5.H13L1不結合 D2A、Y3A、L5A 及 D6A，表明該表位至少包括人類 CCR8 N 端之 DYTLD 區域。如 圖 16B所示，其中產生了構建體，該構建體編碼人類 CCR8.CCR5 嵌合體 (N-term1、N-term2、ECL1、ECL2 及 ECL3)，在該嵌合體中 hCCR8 之不同細胞外區域被來自具有 C 端 FLAG 標籤之 CCR5 的對應區域替換， hu.Ab4.H12L3不結合 ECL1 及 ECL2 嵌合體，表明此抗體之表位至少包括 CCR8 huCCR8 N 端之 ECL1 及 ECL2 區域：MDYTLDLSVTTVTDYYYPDIFSSP (SEQ ID NO: 110)。 圖 17A 至 17I示出在注射單一劑量之遞增濃度介於 0.003 至 5 mg/kg 之間的小鼠替代抗 CCR8 mAb 三天後，在 CT26 荷瘤小鼠中的腫瘤 ( 圖 17A) 中而非脾臟 ( 圖 17B) 或腫瘤引流淋巴結 ( 圖 17C) 中之 Treg 細胞 (測量為具有 CD45+ 白血球之 Treg 細胞的分數) 進展性消耗。. 抗 CCD8 mAb 治療不會導致 CD4 常規 T 細胞 ( 圖 17D 至 17F) 或 CD8 T 細胞耗竭 ( 圖 17G 至 17I)。使用同型對照抗體 (抗 gp120)。 圖 18A 至 18D示出相比於用抗 CD25 mAb ( 圖 18D) 或同型對照 mAb (抗 gp120)( 圖 18A) 治療，在患有所建立的 CT26 同基因腫瘤之小鼠中用單一劑量 ( 圖 18B) 或每週兩次給藥 ( 圖 18C) 小鼠替代抗 CCR8 mAb 治療後之腫瘤生長抑制。當腫瘤體積達到 150 至 250 mm 3之間時開始治療。隨時間推移測量腫瘤體積。灰色線代表個別小鼠，黑色線代表組擬合。 圖 19A 至 19E示出用在腫瘤接種時投予之效應能力小鼠替代抗 CCR8 mAb ( 圖 19B) 或腫瘤達到 150 至 250 mm 3( 圖 19D) 時，觀察到的 CT26 腫瘤之生長抑制。用同一配體阻斷抗 CCR8 mAb 之效應無能 LALAPG 變異體 ( 圖 19C 及 19E) 時，未觀察到腫瘤生長抑制。隨時間推移測量腫瘤體積。灰色線代表個別小鼠，黑色線代表組擬合。使用同型對照 mAb (抗 gp120)( 圖 19A)。 圖 20A 至 20D示出在 EMT6 腫瘤之生長抑制中，小鼠替代抗 CCR8 mAb 及抗 PDL1 mAb 之組合 ( 圖 20D) 比單獨的抗 CCR8 mAb ( 圖 20B) 或單獨的抗 PDL1 mAb ( 圖 20C) 出乎意料地更有效。當腫瘤達到 150 至 250 mm 3時開始治療。隨時間推移測量腫瘤體積。灰色線代表個別小鼠，黑色線代表組擬合。使用同型對照 mAb (抗 gp120)( 圖 20A)。 圖 21示出在單一劑量 10 mg/kg IV 推注注射後，食蟹獼猴中抗 gD (對照) 以及測試抗 CCR8 mAb Afuc.hu.Ab5.H13L1及 Afuc.hu.Ab4.H12L3之血清藥物動力學曲線 (平均值 ± SD)。 Afuc.hu.Ab5.H13L1在給藥後 35 天期間展示出所需之持續血清濃度水平，預計這將引發更為持續之標靶接合，這可能轉化為更佳的抗癌活性及更少的給藥頻率。 圖 22A 至 22C示出 9 隻雄性食蟹獼猴之總 Treg 細胞計數的全血流式細胞術分析之結果，經由靜脈內注射向該等雄性食蟹獼猴給藥 10 mg/kg 去岩藻醣基化抗 gD (對照；第 1 組，指定為 1001、1002、1003； 圖 22A)、 Afuc.hu.Ab5.H13L1(第 2 組，指定為 2001、2002、2003； 圖 22B) 或 Afuc.hu.Ab4.H12L3(第 3 組，指定為 3001、3002、3003； 圖 22C)。在給藥後多達 840 小時內，兩種測試抗 CCR8 mAb 均未顯著降低全血中總 T-reg 細胞絕對計數。 圖 23A 至 23I示出 9 隻雄性食蟹獼猴之 CCR8+FoxP3+ Treg 細胞減少的全血流式細胞術分析之結果，向該等雄性食蟹獼猴給藥去岩藻醣基化抗 gD (對照；第 1 組，指定為 1001 ( 圖 23A)、1002 ( 圖 23B)、1003 ( 圖 23C))、 Afuc.hu.Ab4.H12L3(第 3 組，指定為 3001 ( 圖 23D)、3002 ( 圖 23E)、3003 ( 圖 23F)) 或 Afuc.hu.Ab5.H13L1(第 2 組，指定為 2001 ( 圖 23G)、2002 ( 圖 23H)、2003 ( 圖 23I))。在給藥前 (「預研究」) 以及第 1 天 0 小時 (「預給藥」) 從每隻動物收集血液。然後經由靜脈內注射向每隻動物投予單一劑量之 10 mg/kg 去岩藻醣基化抗 gD (對照組)、 Afuc.hu.Ab5.H13L1(第 2 組) 或 Afuc.hu.Ab4.H12L3(第 3 組)。然後從動物收集血液，並在流式細胞術分析之前經歷以下處理：(i) 未加標任何測試 CCR8 mAb (「未加標」) 之血樣，(ii) 進一步加標飽和濃度的 Afuc.hu.Ab5.H13L1之血樣，及 (iii) 進一步加標飽和濃度的 Afuc.hu.Ab4.H12L3之血樣。後續用標記之山羊抗人 IgG 抗體處理每個未加標及加標之樣品，並藉由流式細胞術分析。如 圖 23A 至 23C可見，最初用對照 (第 1 組) 處理但未加標之血液的流式細胞術表明總 CCR8+ T-reg 細胞沒有調節。此外，加標之血液的流式細胞術對總 CCR8+ T-reg 細胞計數之影響也很小。關於第 3 組，如 圖 23D 至 23F可見，在三隻動物中之各者中分析的血液之流式細胞術表明在給藥後多達 168 小時內，CCR8+ T-reg 細胞降低。關於第 2 組，如 圖 23G 至 23I可見，在動物 2002 及 2003 中，分析的血液之流式細胞術表明 CCR8+ T-reg 細胞降低。第 2 組和第 3 組動物均表明對總 Treg 細胞計數幾乎沒有影響 ( 圖 22A 至 22C)，但在投予後表明周邊血 CCR8+ T-reg 細胞數目減少 ( 圖 23D 至 23I)，無論加標或未加標，這與所提出之作用機制一致 (參見 圖 2A)。
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Claims (92)

  1. 一種與 C-C 模體趨化因子受體 8 (CCR8) 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 30 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 31 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 27 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 28 之胺基酸序列。
  2. 如請求項 1 之抗體，其不依賴 CCR8 硫酸化而與 CCR8 結合。
  3. 如請求項 1 或 2 之抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 2 至 6 中之一者或多者組成的表位結合。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之抗體，其包含：VH 序列，其與 SEQ ID NO: 47 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 VL 序列，其與 SEQ ID NO: 48 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之抗體，其中該 VL 包含 V4M 突變、P43A 突變、F46L 突變、C90Q 突變或其組合。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之抗體，其中該 VH 包含 G49S 突變、K71R 突變、S73N 突變或其組合。
  10. 如請求項 1 至 9 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 55 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
  11. 如請求項 1 至 9 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 60 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
  12. 如請求項 1 至 9 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 111 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
  13. 如請求項 1 至 9 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 113 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 56 之輕鏈胺基酸序列。
  14. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 35 至 47 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 48 至 52 所組成之群組的 VL 序列。
  15. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含 SEQ ID NO: 47 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 48 之 VL 序列。
  16. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 4 或 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列。
  17. 如請求項 16 之抗體，其不依賴 CCR8 硫酸化而與 CCR8 結合。
  18. 如請求項 16 或 17 之抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 91 至 104 及 172 至 193 中之一者或多者組成的表位結合。
  19. 如請求項 16 至 18 中任一項之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  20. 如請求項 16 至 19 中任一項之抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列。
  21. 如請求項 16 至 20 中任一項之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  22. 如請求項 16 至 21 中任一項之抗體，其包含：VH 序列，其與 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 VL 序列，其與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性。
  23. 如請求項 16 至 22 中任一項之抗體，其中該 VL 包含 Y2I 突變。
  24. 如請求項 16 至 23 中任一項之抗體，其中該 VH 包含 S73N 突變、V78L 突變、T76N 突變、F91Y 突變及 P105Q 突變、或其組合。
  25. 如請求項 16 至 24 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 57 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
  26. 如請求項 16 至 24 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 61 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
  27. 如請求項 16 至 24 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 112 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
  28. 如請求項 16 至 24 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 114 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 58 之輕鏈胺基酸序列。
  29. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含選自由 SEQ ID NO: 10 至 21 所組成之群組的 VH 序列，以及選自由 SEQ ID NO: 22 至 25 所組成之群組的 VL 序列。
  30. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其包含 SEQ ID NO: 21 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 24 之 VL 序列。
  31. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 82 或 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
  32. 如請求項 31 之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 95 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 94 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  33. 如請求項 31 或 32 之抗體，其包含 SEQ ID NO: 95 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 94 之 VL 序列。
  34. 如請求項 31 至 33 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 101 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 100 之輕鏈胺基酸序列。
  35. 如請求項 31 至 33 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 115 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 100 之輕鏈胺基酸序列。
  36. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 86 或 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 88 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 89 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列。
  37. 如請求項 36 之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 97 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 96 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  38. 如請求項 36 或 37 之抗體，其包含 SEQ ID NO: 97 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 96 之 VL 序列。
  39. 如請求項 36 至 38 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 103 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 之輕鏈胺基酸序列。
  40. 如請求項 36 至 38 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 116 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 之輕鏈胺基酸序列。
  41. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 90 或 SEQ ID NO: 91 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 92 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 93 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列。
  42. 如請求項 41 之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 99 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 98 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  43. 如請求項 41 或 42 之抗體，其包含 SEQ ID NO: 99 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 98 之 VL 序列。
  44. 如請求項 41 至 43 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 105 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列。
  45. 如請求項 41 至 44 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 117 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列。
  46. 一種與 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體不依賴 CCR8 硫酸化而與 CCR8 結合。
  47. 如請求項 46 之抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 2 至 6 中之一者或多者組成的表位結合。
  48. 如請求項 46 之抗體，其中該抗體與由 SEQ ID NO: 106 之胺基酸殘基 91 至 104 及 172 至 193 中之一者或多者組成的表位結合。
  49. 一種與小鼠 CCR8 結合之單株抗體，其中該抗體包含：重鏈可變域 (VH)，其包含：(a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 65 或 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列；以及輕鏈可變域 (VL)，其包含：(d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列；及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列。
  50. 如請求項 49 之抗體，其包含選自由以下所組成之群組的序列： (a) VH 序列，其與 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性； (b) VL 序列，其與 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列具有至少約 95%、至少約 96%、至少約 97%、至少約 98% 或至少約 99% 的同一性；以及 (c) 如 (a) 中所定義之 VH 序列及如 (b) 中所定義之 VL 序列。
  51. 如請求項 49 或 50 之抗體，其包含 SEQ ID NO: 70 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 69 之 VL 序列。
  52. 如請求項 49 至 51 中任一項之抗體，其包含 SEQ ID NO: 72 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 71 之輕鏈胺基酸序列。
  53. 如請求項 1 至 48 中任一項之抗體，其為人類抗體。
  54. 如請求項 1 至 48 中任一項之抗體，其為人源化抗體。
  55. 如請求項 1 至 52 中任一項之抗體，其為嵌合抗體。
  56. 如請求項 1 至 55 中任一項之抗體，其為與 CCR8 結合之抗體片段。
  57. 如請求項 1 至 56 中任一項之抗體，其為全長抗體。
  58. 如請求項 57 之抗體，其為全長 IgG1 抗體。
  59. 如請求項 1 至 58 中任一項之抗體，其包含 IgG1 恆定域，該 IgG1 恆定域包含 SEQ ID NO: 53 或 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
  60. 如請求項 1 至 59 中任一項之抗體，其包含 κ 恆定域，該 κ 恆定域包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列。
  61. 如請求項 1 至 60 中任一項之抗體，其中該抗體以約 1 × 10 -12M 至約 1 × 10 -11M 之結合親和力 (K d) 與 CCR8 結合。
  62. 如請求項 1 至 48 中任一項之抗體，其中該 CCR8 為人類 CCR8。
  63. 如請求項 1 至 62 中任一項之抗體，其中該抗體為去岩藻醣基化。
  64. 一種分離之核酸，其編碼如請求項 1 至 63 中任一項之抗體。
  65. 一種宿主細胞，其包含如請求項 64 之核酸。
  66. 一種生產與 CCR8 結合之抗體的方法，其包含在適合於表現該抗體之條件下培養如請求項 65 之宿主細胞。
  67. 如請求項 66 之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
  68. 一種抗體，其藉由如請求項 67 之方法生產。
  69. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 63 中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  70. 如請求項 69 之醫藥組成物，其進一步包含另外的治療劑。
  71. 如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物，其用為藥物。
  72. 如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物，其用於治療癌症。
  73. 一種如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物在製造用於治療癌症之藥物中的用途。
  74. 一種如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物在製造用於消耗調節性 T 細胞之藥物中的用途。
  75. 一種治療有此需要之個體的癌症之方法，其包含向該個體投予有效量之如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物。
  76. 一種消耗患有癌症之個體的腫瘤微環境中之調節性 T 細胞的方法，其包含向該個體投予有效量之如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物，該有效量足以消耗該腫瘤微環境中之該等調節性 T 細胞。
  77. 一種消耗患有癌症之個體的腫瘤微環境外部之調節性 T 細胞的方法，其包含向該個體投予有效量之如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物，該有效量足以消耗該腫瘤微環境外部之該等調節性 T 細胞。
  78. 一種消耗來自癌細胞群體中之調節性 T 細胞的活體外方法，其包含使該細胞群體與一定量之如請求項 1 至 63 中任一項之抗體或如請求項 69 至 70 中任一項之醫藥組成物接觸，該一定量足以消耗來自該細胞群體中之該等調節性 T 細胞。
  79. 如請求項 73 至 78 中任一項之用途或方法，其中該癌症係選自由以下所組成之群組：膀胱癌、胚細胞瘤、血癌、骨癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、腎臟癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、皮膚癌、睾丸癌及子宮癌。
  80. 如請求項 74、76、78 及 79 中任一項之用途或方法，其中存在於該癌症之該腫瘤微環境中的該等調節性 T 細胞被消耗。
  81. 如請求項 74、77、78 及 79 中任一項之用途或方法，其中該癌症之該腫瘤微環境外部的該等調節性 T 細胞被消耗。
  82. 如請求項 73 至 81 中任一項之用途或方法，其進一步包含投予另外的治療劑。
  83. 如請求項 82 之用途或方法，其中該另外的治療劑為抗癌劑。
  84. 如請求項 83 之用途或方法，其中該抗癌劑係選自由以下所組成之群組：微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑、抗血管生成劑、免疫調節劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑或細胞生長抑制劑、細胞凋亡活化劑、增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑、細胞激素、抗癌疫苗或溶瘤病毒、類鐸受體 (TLR) 劑、雙特異性抗體、細胞療法及免疫細胞接合物。
  85. 如請求項 83 或 84 之用途或方法，其中該抗癌劑為 PD-L1 結合拮抗劑。
  86. 如請求項 85 之用途或方法，其中該 PD-L1 結合拮抗劑為阿替利珠單抗(atezolizumab)。
  87. 如請求項 73 至 85 中任一項之用途或方法，其中該個體為人類。
  88. 如請求項 73 至 85 中任一項之用途或方法，其中該個體為小鼠。
  89. 一種治療小鼠之疾病的方法，其包含向該小鼠投予有效量之如請求項 49 至 52 中任一項之單株抗體以治療該疾病。
  90. 如請求項 89 之方法，其中該小鼠包含異種移植體。
  91. 如請求項 63 之抗體，其中該去岩藻醣基化之比例係在約 80% 至約 95% 之間。
  92. 如請求項 1 至 15 及 46 至 48 中任一項之抗體，其中在第 1 天靜脈內投予單一 10 mg/kg 劑量後之平均清除率在 35 天期間係在約 3 至約 5 mL/天/kg 之間。
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