TW202241940A

TW202241940A - 具有改善的細胞液穿透活性的抗原結合分子

Info

Publication number: TW202241940A
Application number: TW110148070A
Authority: TW
Inventors: 井川佑理; 瀬堀那沙
Original assignee: 日商中外製藥股份有限公司
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-11-01
Also published as: JP2024500267A; WO2022138692A1; AR124471A1; EP4267745A1; US20240124614A1; CN116648262A

Abstract

本發明提供一種具有改善的細胞液穿透能力的抗原結合分子(例如抗體)或其抗原結合片段(抗體片段)，此分子在選自由在輕鏈可變區中的CDRL1、CDRL2和CDRL3所組成的群組中的至少一者上包含胺基酸取代；及包含此抗原結合分子的醫藥組合物；將抗原結合分子特異性遞送至靶細胞的細胞液中的方法；藉由使用抗原結合分子，以靶細胞特異性方式去除、抑制或活化細胞液抗原的方法；及包含所述抗原結合分子之用於診斷、預防或治療對象中的疾病的醫藥組合物。

Description

具有改善的細胞液穿透活性的抗原結合分子

本揭露係關於具有改善的細胞液穿透能力的抗原結合分子(例如抗體)、及在選自由在輕鏈可變區中的CDRL1、CDRL2和CDRL3所組成的群組中的至少一者上包含胺基酸突變的細胞液穿透抗原結合分子(例如抗體)、或其抗原結合片段(抗體片段)；及包含抗原結合分子的醫藥組合物；將抗原結合分子特異性遞送至靶細胞的細胞液中的方法；藉由使用抗原結合分子，以靶細胞特異性方式去除、抑制或活化細胞液抗原的方法；及用於診斷、預防或治療對象中的疾病之包含所述抗原結合分子醫藥組合物。

抗體是以高親和力特異性結合至抗原的蛋白質。已知從低分子量化合物到蛋白質的各種分子都可為抗原。自從開發出生產單株抗體的技術以來，抗體修飾技術已有進步，使得獲得辨認特定分子的抗體變得容易。抗體作為醫藥受到關注，因為它們在血漿中高度穩定且具有較少的副作用。抗體不僅結合至抗原且表現出促效或拮抗作用，而且還誘導效應子細胞調控的細胞毒性活性(也稱為效應子功能)，包含 ADCC (抗體依賴性細胞毒性)、ADCP (抗體依賴性細胞吞噬作用)和CDC (補體依賴性細胞毒性)。利用這些抗體功能，已開發出用於癌症、免疫疾病、慢性疾病、感染等的醫藥(Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223. (NPL 1))。

同時，抗體醫藥靶向的抗原受限於細胞膜上的抗原或細胞外的抗原，因為全長IgG分子具有高分子量(約150kDa)，且通常不表現出細胞穿透性。因此，內抗體(intrabody)(在細胞內表現的抗體或抗體片段)、藉由與細胞穿透胜肽(cell penetrating peptide，CPP)融合產生的抗體-CPP複合物、蛋白質轉染方法等已開發且報導為允許抗體作用於細胞內抗原的技術(MAbs. 2011 Jan-Feb;3(1):3-16. (NPL 2))。

已知一些天然存在的全長抗體具有細胞穿透能力。例如，據報導，從全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)病人和MRL-mpj/lpr狼瘡模型小鼠中鑑定出的抗DNA自體抗體顯示出細胞穿透能力(Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12022. (NPL 3), Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt B):377-87. (NPL 4))。除了細胞穿透能力外，一些抗DNA抗體還顯示出DNA水解活性或DNA修復抑制活性且表現出細胞毒性(WO 2012135831 (PTL 1), Sci Rep. 2014 Aug 5;4:5958 (NPL) 5))。也有關於藉由將從SLE模型小鼠中分離出的具有從內體逃逸至細胞液中的能力的抗體人源化，且其與可結合至活化的Ras的重鏈可變區組合而製備的抗體的報導(WO2016013871A1專利文獻2))。 [引用列表] [專利文獻]

[PTL 1] WO2012/135831 [PTL 2] WO2016/013871A1 [非專利文獻]

[NPL 1] Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223. [NPL 2] MAbs. 2011 Jan-Feb;3(1):3-16. [NPL 3] Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12022. [NPL 4] Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt B):377-87. [NPL 5] Sci Rep. 2014 Aug 5;4:5958

[技術問題]

目前為止開發出的大多數抗體療法不能靶向細胞液分子，因為它們僅靶向表面暴露或分泌的分子，因此需要開發出一種透過細胞膜遞送抗體的方法。在一非限制性實施例中，本發明的一目的是提供一種會有效率地特異性被遞送至靶細胞的細胞液抗原結合分子(例如抗體)、包含抗原結合分子的醫藥組合物、抗原結合分子的使用方法、抗原結合分子的產生方法及將抗原結合分子特異性地遞送至靶細胞的細胞液中的方法。 [解決問題的手段]

本發明是根據上述需要而產生的，且提供具有改善的細胞質穿透性的抗原結合分子(例如抗體)，且確認抗原結合分子或抗體對細胞質具有改善的穿透性。在一非限制性實施例中，本發明係關於一種具有增強的細胞液穿透能力或活性的抗原結合分子(例如抗體)或其片段，其包括包含序列辨識號：4中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3的胺基酸序列且在選自CDRL1、CDRL2和CDRL3，較佳選自CDRL1和CDRL3中的至少一者中包含一或多個胺基酸取代的輕鏈可變區。

在一非限制性實施例中，本發明人已鑑定出具有改善或增強的細胞液穿透能力或活性且在(1)抗體表現程度、(2)減少的胞外基質(extracellular matrix，ECM)結合數據(profile)、和/或 (3)較低的聚集趨勢所表示之良好的物理化學特性的方面，同時額外具有優異特性的抗原結合分子(抗體)(可改善體內半衰期或藥物動力學)。

在一面向中，本揭露提供： [1] 一種細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其包括包含序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3的胺基酸序列的輕鏈可變區，其中輕鏈可變區在選自CDRL1、CDRL2和CDRL3中的至少一者中包含一或多個胺基酸取代。 [2] 如[1]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中的Kabat編號第24至34和89至97位包含一或多個胺基酸取代。 [3] 如[2]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈可變區在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中的Kabat編號第24至32和93至97位包含一或多個胺基酸取代。 [4] 如[3]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中所述一或多個胺基酸取代選自由下述所組成的群組(根據Kabat編號的位置)：：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中， (a) 用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y取代第24位的胺基酸K； (b) 用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y取代第25位的胺基酸S； (c) 用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V取代第26位的胺基酸S； (d) 用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y取代第27位的胺基酸Q； (e) 用D取代第27a位的胺基酸S； (f) 用I、P、Q、T或V取代第27b位的胺基酸L； (g) 用A、D、E、I、M、N、S、W或Y取代第27c位的胺基酸F； (h) 用A、D、E、F、H、N或Q取代第27d位的胺基酸N； (i) 用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y取代第27e位的胺基酸S； (j) 用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y取代第27f位的胺基酸R； (k) 用E、H、I、Q、S、V、W或Y取代第28位的胺基酸T； (l) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第29位的胺基酸R； (m) 用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第30位的胺基酸K； (n) 用D、M、S或T取代第31位的胺基酸N； (o) 用D、E、G、H或Q取代第32位的胺基酸Y； (p) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (q) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (r) 用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W取代第93位的胺基酸Y； (s) 用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第94位的胺基酸H； (t) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第95位的胺基酸M； (u) 用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V取代第96位的胺基酸Y；以及 (v) 用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V取代第97位的胺基酸T。 [4A] 如[4]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區中的CDRL1和CDRL3各自包含二或更多個選自[4](a)至(v)中定義的群組的胺基酸取代。 [5] 如[1]至[4A]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中與沒有所述取代且包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的參考抗體或其片段相比，所述胺基酸取代增強抗體或其片段的細胞液穿透活性。 [5A] 如[1]至[5]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其與沒有所述取代且包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的參考抗體或其片段相比，表現出至少增強1%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、 20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80 %、90%、100%、200%或500%或1000%的細胞液穿透活性，較佳地使用如參考實施例1中所述的Split Nluc測定法來確定。 [5B] 如[1]至[5A]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中細胞液穿透活性是藉由抗體或其片段穿透至細胞膜、和/或抗體或其片段穿透細胞膜後的內體逃逸(endosomal escape)所調控的。 [5C] 如[1]至[5B]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其相對於參考抗體表現出一或多種特性，其中一或多種特性選自由下述所組成的群組： (a) 相對於參考抗體，抗體表現程度增加； (b) 相對於參考抗體，對胞外基質(ECM)的結合活性降低，較佳藉由參考實施例2中所述的方法來確定；及 (c) 相對於參考抗體，物理化學特性得到改善，較佳地藉由尺寸排阻層析法(size-exclusion chromatography，SEC)分析所確定之更高的單體峰百分比所表示。 [6] 如[1]至[5C]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含選自由下述所組成的群組的一、二、三或更多個胺基酸取代(根據 Kabat 編號的位置)：序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) 用N取代第24位的胺基酸K； (b) 用E取代第27位的胺基酸Q； (c) 用D取代第27a位的胺基酸S； (d) 用D或E取代第27d位的胺基酸N； (e) 用D或E取代第27e位的胺基酸S； (f) 用D、H、K、L、S或V取代第27f位的胺基酸R； (g) 用D取代第28位的胺基酸T； (h) 用E、G、M或S取代第29位的胺基酸R； (i) 用L或Q取代第30位的胺基酸K； (j) 用E取代第32位的胺基酸Y； (k) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (l) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (m) 用E取代第93位的胺基酸Y； (n) 用E、P或Q取代第94位的胺基酸H； (o) 用D、N 或P取代第95位的胺基酸M；及 (p) 用E或P取代第96位的胺基酸Y。 [6A] 如[6]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區中的CDRL1和CDRL3各自包含二或更多個選自[6](a)至(p)中定義的群組的胺基酸取代。 [7] 如[6]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含選自由下述所組成的群組的胺基酸取代的組合(根據Kabat編號的位置)： (a) S27eD/R27fK； (b) S27eD/R27fH； (c) N27dE/S27eD； (d) S27eD/T28D； (e) S27eD/R29E； (f) S27eD/R29S； (g) K24N/S27eD； (h) N27dD/R27fK； (i) N27dE/R27fK； (j) R27fK/T28D； (k) R27fK/R29E； (l) R27fK/R29S； (m) K24N/R27fK； (n) K24N/N27dD； (o) N27dD/T28D； (p) N27dD/R29E； (q) N27dD/R29S； (r) S27eD/Q89H； (s) N27dD/Q89H； (t) R27fK/Q89H； (u) S27eD/Y91E； (v) N27dD/Y91E； (w) R27fK/Y91E； (x) Q89H/H94P； (y) Y91E/H94P； (z) H94P/M95N； (aa) H94P/M95D； (bb) H94P/M95P； (cc) H94E/Y96P； (dd) H94E/M95N； (ee) H94E/M95D； (ff) H94E/M95P； (gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P； (hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P； (ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P； (ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P； (mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P； (nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P； (oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P； (pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P； (qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P； (rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P； (ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P； (tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P； (uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P； (vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P； (ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P； (xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P； (zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P； (aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q； (fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q； (ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P； (lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P； (nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P； (ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P； (ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P； (qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P； (rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P； (sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；及 (ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。 [8] 如[1]至[7]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含人類框架區(framework region，FR)。 [8A] 如[8]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中根據Kabat編號，輕鏈可變區包含第2位的胺基酸I和/或第3位的胺基酸Q。 [8B] 如[8]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR1序列。 [8C] 如[8]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含人類V kappa 3 FR3序列。 [8D] 如[8]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR1、人類V kappa 1 FR2和人類V kappa 3 FR3序列。 [8E] 如[8]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含在序列辨識號：123中包含的一、二、三或四個FR結構域(FR1、FR2、FR3和FR4)。 [8F] 如[2]至[8E]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區在CDRL2中更包含一、二、三或更多個胺基酸取代。 [9] 如[1]至[8F]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區更包含一、二、三或更多個選自由下述所組成的群組的胺基酸取代(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的CDRL2的胺基酸序列中， (a) 用A、G、I、T或V取代第50位的胺基酸W； (b) 用F或I取代第52位的胺基酸S； (c) 用N或Y取代第53位的胺基酸T；及 (d) 用K或V取代第54位的胺基酸R。 [10] 如[9]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈可變區包含選自由下述所組成的群組的胺基酸取代的組合(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列， (a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q； (b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q； (c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q； (d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q； (e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q； (f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q； (g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q； (h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q； (i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q； (j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q； (k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q； (l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q及 (m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。 [11-1] 如[1]至[10]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，包含具有選自由序列辨識號：14-150和161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [11-2] 如[11-1]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，包含具有選自由序列辨識號：123-150所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [11-3] 如[11-1]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，包含具有選自由序列辨識號：161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [11A] 如[1]至[11-3]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其以Fab或scFv的形式存在。 [11B] 如[1]至[11A]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，更包含重鏈可變區，可選地重鏈可變區包含序列辨識號：158的胺基酸。 [11C] 如[1]至[11B]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其為多功能抗體。 [11D] 如[11C]所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其包含細胞表面抗原結合域、細胞液抗原結合域和細胞液穿透域；其中細胞液穿透域包含[1]至[11A]中任一者所述的輕鏈可變區。 [12] 一種編碼如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段的核酸。 [13] 一種包含[12]所述的核酸的載體。 [14] 一種包含如[12]所述的核酸或如[13]所述的載體的宿主細胞。 [15] 如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段的產生方法，包含步驟a)在適合抗體或其片段表現的條件下培養如[14]所述的宿主細胞和b)回收抗體或其片段。 [16] 一種用於將生物活性分子遞送至細胞質中的組合物或醫藥組合物，包含如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段。 [17] 如[16]所述的組合物或醫藥組合物，其中生物活性分子為選自由胜肽、蛋白質、毒素、抗體、抗體片段、RNA、DNA、小分子藥物、奈米顆粒和脂質體所組成的群組中的至少一者；其中生物活性分子與細胞液穿透抗體或抗原結合片段偶聯(conjugate)或融合(fuse)。 [18] 一種免疫偶聯物(immunoconjugate)：如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段；及生物活性分子。 [19] 如[18]所述的免疫偶聯物，其中生物活性分子選自由胜肽、蛋白質、毒素、抗體、抗體片段、RNA、DNA、小分子藥物、奈米顆粒和脂質體所組成的群組。 [20] 一種透過細胞膜遞送如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段或如[18]或[19]所述的免疫偶聯物且將其置於細胞質中的方法。 [21] 一種藉由使用如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段來靶向、抑制或活化細胞液抗原的方法，其中抗體或其片段特異性結合至細胞液抗原。 [21A] 一種對樣品細胞中的細胞液抗原進行成像的方法，包含使如[1]至[11D]中任一者所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段接觸樣品細胞，其中抗體或其片段被標記且特異性結合至細胞液抗原。 [22] 一種細胞液穿透抗體或其抗原結合片段的產生方法，其中方法包含： (a) 提供包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的親本細胞液穿透抗原結合分子； (b) 在親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區中，在選自CDRL1和CDRL3中的至少一者中導入一或多個胺基酸取代；及 (c) 鑑定和/或選擇包含一或多個胺基酸取代之細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其與親本細胞液穿透抗原結合分子相比，表現出增強的細胞液穿透能力。 [22A] 如[22]所述的方法，更包含鑑定和/或選擇相對於親本抗體表現出一或多種特性的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中一或多種特性選自由下述所組成的群組： (a) 抗體表現程度增加； (b) 與胞外基質(ECM)的結合活性降低，較佳藉由參考實施例2中所述的方法來測定；及 (c)物理化學特性得到改善，較佳地藉由尺寸排阻層析法(size-exclusion chromatography，SEC)分析所確定之更高的單體峰百分比所表示。 [23] 如[22]至[22A]中任一者所述的方法，更包含： (d) 獲得包含編碼藉由如[22]所述的方法所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段的基因和可操作連接的合適啟動子的表現載體； (e) 將載體導入宿主細胞並培養宿主細胞以產生細胞液穿透抗體或其抗原結合片段；及 (f) 從宿主細胞培養物中回收細胞液穿透抗體或其抗原結合片段。 [24] 如[22]至[23]中任一者的方法，其中一或多個胺基酸取代位於序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的Kabat編號第24至34和89至97位。 [25] 如[24]所述的方法，其中一或多個胺基酸取代位於序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的Kabat編號第24至32和93至97位。 [26] 如[22]至[25]中任一者的方法，其中一或多個胺基酸取代選自由下述所組成的群組(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列， (a) 用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y取代第24位的胺基酸K； (b) 用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y取代第25位的胺基酸S； (c) 用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V取代第26位的胺基酸S； (d) 用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y取代第27位的胺基酸Q； (e) 用D取代第27a位的胺基酸S； (f) 用I、P、Q、T或V取代第27b位的胺基酸L； (g) 用A、D、E、I、M、N、S、W或Y取代第27c位的胺基酸F； (h) 用A、D、E、F、H、N或Q取代第27d位的胺基酸N； (i) 用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y取代第27e位的胺基酸S； (j) 用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y取代第27f位的胺基酸R； (k) 用E、H、I、Q、S、V、W或Y取代第28位的胺基酸T； (l) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第29位的胺基酸R； (m) 用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第30位的胺基酸K； (n) 用D、M、S或T取代第31位的胺基酸N； (o) 用D、E、G、H或Q取代第32位的胺基酸Y； (p) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (q) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (r) 用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W取代第93位的胺基酸Y； (s) 用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第94位的胺基酸H； (t) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第95位的胺基酸M； (u) 用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V取代第96位的胺基酸Y；及 (v) 用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V取代第97位的胺基酸T。 [26A] 如[26]所述的方法，其中輕鏈可變區中的CDRL1和CDRL3各自包含二或更多個選自[26](a)至(v)中定義的群組的胺基酸取代。 [27] 如[22]至[26]中任一者所述的方法，其中與沒有所述取代且包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的參考抗體或其片段相比，所述一或多個胺基酸取代增強了抗體或其片段的細胞液穿透活性。 [28] 如[22]至[27]中任一者所述的方法，其中一或多個胺基酸取代選自由下述所組成的群組(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列， (a) 用N取代第24位胺基酸K； (b) 用E取代第27位的胺基酸Q； (c) 用D取代第27a位的胺基酸S； (d) 用D或E取代第27d位的胺基酸N； (e) 用D或E取代第27e位的胺基酸S； (f) 用D、H、K、L、S或V取代第27f位的胺基酸R； (g) 用D取代第28位的胺基酸T； (h) 用E、G、M或S取代第29位的胺基酸R； (i) 用L或Q取代第30位的胺基酸K； (j) 用E取代第32位的胺基酸Y； (k) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (l) 用E、F或N取代第91位胺基酸Y； (m) 用E取代第93位的胺基酸Y； (n) 用E、P 或Q取代第94位的胺基酸H； (o) 用D、N或P取代第95位的胺基酸M；及 (p) 用E或P取代第96位的胺基酸Y。 [28A] 如[28]所述的方法，其中輕鏈可變區中的CDRL1和CDRL3各自包含二或更多個選自由[28](a)至(p)中定義的群組的胺基酸取代。 [29] 如[22]至[28]中任一者所述的方法，其中一或多個胺基酸取代包含選自由下述所組成的群組的胺基酸取代的組合(根據Kabat編號的位置)： (a) S27eD/R27fK； (b) S27eD/R27fH； (c) N27dE/S27eD； (d) S27eD/T28D； (e) S27eD/R29E； (f) S27eD/R29S； (g) K24N/S27eD； (h) N27dD/R27fK； (i) N27dE/R27fK； (j) R27fK/T28D； (k) R27fK/R29E； (l) R27fK/R29S； (m) K24N/R27fK； (n) K24N/N27dD； (o) N27dD/T28D； (p) N27dD/R29E； (q) N27dD/R29S； (r) S27eD/Q89H； (s) N27dD/Q89H； (t) R27fK/Q89H； (u) S27eD/Y91E； (v) N27dD/Y91E； (w) R27fK/Y91E； (x) Q89H/H94P； (y) Y91E/H94P； (z) H94P/M95N； (aa) H94P/M95D； (bb) H94P/M95P； (cc) H94E/Y96P； (dd) H94E/M95N； (ee) H94E/M95D； (ff) H94E/M95P； (gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P； (hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P； (ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P； (ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P； (mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P； (nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P； (oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P； (pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P； (qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P； (rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P； (ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P； (tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P； (uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P； (vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P； (ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P； (xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P； (zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P； (aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q； (fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q； (ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P； (lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P； (nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P； (ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P； (ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P； (qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P； (rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P； (sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；及 (ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。 [30] 如[22]至[29]中任一者所述的方法，更包含用人類框架區(framework region，FR)取代輕鏈可變區的框架區(FR)。 [30A] 如[30]所述的方法，其中根據Kabat編號，輕鏈可變區包含第2位的胺基酸I和/或第3位的胺基酸Q。 [30B] 如[30]所述的方法，其中輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR1序列。 [30C] 如[30]所述的方法，其中輕鏈可變區包含人類V kappa 3 FR3序列。 [30D] 如[30]所述的方法，其中輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR1、人類V kappa 1 FR2和人類V kappa 3 FR3序列。 [30E] 如[30]所述的方法，其中輕鏈可變區包含在序列辨識號：123中所包含的一、二、三或四個FR結構域(FR1、FR2、FR3和FR4)。 [30F] 如[22]至[30]中任一者所述的方法，更包含在輕鏈可變區的CDRL2中導入一、二、三或更多個胺基酸取代。 [31] 如[22]至[30F]中任一者所述的方法，更包含導入一、二、三或更多個選自由下述所組成的群組的胺基酸取代(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的CDRL2的胺基酸序列， (a) 用A、G、I、T或V取代第50位的胺基酸W； (b) 用F或I取代第52位的胺基酸S； (c) 用N或Y取代第53位的胺基酸T；及 (d) 用K或V取代第54位的胺基酸R。 [32] 如[22]至[31]中任一者所述的方法，其中導入至輕鏈可變區的胺基酸取代包含選自由下述所組成的群組的胺基酸取代的組合(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列， (a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q； (b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q； (c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q； (d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q； (e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q； (f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q； (g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q； (h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q； (i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q； (j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q； (k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q； (l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；及 (m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。 [33-1] 如[22]至[32]中任一者所述的方法，其中細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包含具有選自由序列辨識號：14-150和161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [33-2] 如[33-1]所述的方法，其中細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包含具有選自由序列辨識號：123-150所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [33-3] 如[33-1]所述的方法，其中細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包含具有選自由序列辨識號：161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。 [34] 如[22]至[33-3]中任一者所述的方法，其中細胞液穿透抗體或其抗原結合片段以Fab或scFv的形式存在。 [35] 如[22]至[33-3]中任一者所述的方法，其中細胞液穿透抗體或其抗原結合片段更包含重鏈可變區，可選地包含包括序列辨識號：158的胺基酸的重鏈可變區。

在另一非限制性實施例中，本發明係關於多功能抗原結合分子(抗體或其抗原結合片段)，其包含細胞液穿透域、細胞表面抗原結合域和/或細胞液抗原結合域的組合，可以靶細胞特異性的方式遞送至細胞液中。在一非限制性實施例中，每個結構域源自於抗體。在一非限制性實施例中，預期這些抗原結合分子結合至細胞表面抗原，從而以靶細胞特異性的方式進行內化且轉移至細胞液中。

具體地，本揭露涵蓋以下所述的雙功能或多功能抗原結合分子的實施例，例如： [36] 一種包含細胞表面抗原結合域、細胞液抗原結合域和細胞液穿透域的抗原結合分子，其中細胞液穿透域包含如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區。 [36A] 如[36]所述的抗原結合分子，其不結合至在細胞表面上表現之不同於前述細胞表面抗原的抗原。 [36B] 如[36]所述的抗原結合分子，其中細胞液抗原結合域和細胞液穿透域不結合至在細胞表面上表現之不同於前述細胞表面抗原的抗原。 [36C] 如[36]或[36B]所述的抗原結合分子，其中細胞液抗原結合域和細胞液穿透域不結合至在細胞表面上表現的抗原。 [36D] 如[36]至[36C]任一者所述的抗原結合分子，其中抗原結合分子是多功能抗體或多功能抗體衍生物。 [37] 一種包含第一和第二Fab區的抗原結合分子，其中 (a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原，且 (b) 第二Fab區包含(i) 一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區(VH)和如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區(VL)。 [38] 一種包含第一和第二Fab區及單鏈單元的抗原結合分子，其中 (a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原， (b) 第二個Fab區具有細胞液穿透能力，及 (c) 單鏈單元特異性結合至細胞液抗原，且其中第二Fab區包含如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區(VL)。 [39] 一種包含第一和第二Fab區及單鏈單元的抗原結合分子，其中 (a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原， (b) 第二個Fab區具有細胞液穿透能力，及 (c) 單鏈單元特異性結合至細胞表面抗原，且其中第二Fab區包含如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區(VL)。 [40] 一種包含第一和第二Fab區及單鏈單元的抗原結合分子，其中 (a) 第一和第二Fab區包含(i) 一對特異性結合至細胞表面抗原的重鏈可變區(VH)及如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區(VL)，及 (b) 單鏈單元特異性結合至細胞液抗原。 [41] 一種包含第一、第二、第三和第四Fab區及Fc區的抗原結合分子，其中 (a) 選自第一、第二、第三和第四Fab區的一Fab區特異性結合至細胞表面抗原， (b) 除(a)之外的三個Fab區包含(i) 一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區及如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區， (c) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元， (d) 第一Fab區的重鏈的C端與第一Fc次單元的N端融合，第二Fab區的重鏈的C端與第二Fc次單元的N端融合，第三Fab區的重鏈的C端與第一Fab區的重鏈的N端融合，且第四Fab區的重鏈的C端與第二Fab區的重鏈的N端融合。 [42] 一種包含如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區和Fc區的抗原結合分子，其中Fc區包含一或多個增強抗原結合分子的多聚體(multimer)的形成的胺基酸改變，且其中與包括不包含一或多個胺基酸改變的親本Fc區的抗原結合分子相比，抗原結合分子具有提高的細胞液穿透能力。 [43] 一種包含第一和第二Fab區和Fc區的抗原結合分子，其中 (a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原， (b) 第二Fab區包含(i) 一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區(VH)和如[1]至[11]中任一者所述的輕鏈可變區(VL)，及 (c) Fc區包含一或多個增強抗原結合分子的多聚體的形成的胺基酸改變。 [44] 如[37]至[43]中任一者所述的抗原結合分子，其中包含如[1]至[11-3]中任一者所述的輕鏈可變區的Fab區不結合至在細胞表面上表現之不同於前述細胞表面抗原的抗原。 [45] 如[37]至[44]中任一者所述的抗原結合分子，其中細胞表面抗原是特異性在靶細胞上表現的抗原，且其中抗原結合分子被特異性地遞送至靶細胞的細胞液中。 [46] 一種醫藥組合物，包含如[37]至[45]中任一者所述的抗原結合分子和醫藥上可接受的載體。 [47] 一種將如[37]至[45]中任一者所述的抗原結合分子特異性遞送至靶細胞的細胞液中的方法，其中細胞表面抗原是特異性在靶細胞上表現的抗原。 [48] 一種藉由使用如[37]至[45]中任一者所述的抗原結合分子以靶細胞特異性方式去除、抑制或活化細胞液抗原的方法，其中細胞表面抗原是特異性在靶細胞上表現的抗原。 [49] 一種用於診斷、預防或治療對象中的疾病的醫藥組合物，其中患病細胞表現如[37]至[45]中任一者所述的抗原結合分子所特異性結合的細胞表面抗原及細胞液抗原，且其中醫藥組合物包含如[37]至[45]中任一者所述的抗原結合分子及醫藥上可接受的載體。

1. 定義就本文的目的而言，「受體人類框架(acceptor human framework)」是包含衍生自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的輕鏈可變域(variable domain，VL)框架或重鏈可變域(variable domain，VH)框架的胺基酸序列的框架，如下所定義。「衍生自(derived from)」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架的受體人類框架可包含與其相同的胺基酸序列，或它可含有胺基酸序列改變。在一些實施例中，胺基酸改變的數目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實施例中，VL受體人類框架與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列在序列上相同。

術語「抗原結合分子」在其最廣義上是指特異性結合至抗原的決定基的分子。在一實施例中，抗原結合分子是抗體、抗體片段、抗體的抗原結合片段或抗體衍生物。

術語「親合力(affinity)」是指分子(例如抗體)的一個結合位與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價交互作用的總和的強度。除非另有說明厭在本文中，「結合親合力(binding affinity)」是指反應出結合對的成員(例如抗體和抗原)之間的1：1交互作用的內在結合親合力。分子X對其配偶體Y的結合活性通常可用解離常數(KD) 或「每單位量配體的結合的分析物的量」表示。或者，結合(association)和解離速率(Kon和Koff)可用來評價結合。可藉由本發明所屬技術領域中已知的常用方法，包含本文所述的那些，來測量親合力。後續描述用於測量結合親合力的具體說明性和示例性實施例。

「親和力成熟(affinity matured)」的抗體是指，與不攜帶以下那種改變的親本抗體相比，在一或多個高度可變區(hypervariable region，HVR)中具有一或多個改變的抗體，且這種改變導致抗體對抗原的親和力改善。

「結合活性(binding activity)」是指分子(例如抗體)的一或多個結合位與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價交互作用的總和的強度。在本文中，結合活性不嚴格限制於反應出結合對的成員(例如抗體和抗原)之間的1：1交互作用。例如，當結合對的成員既能以單價和多價結合的方法來結合至彼此時，結合活性是這些結合的總和的強度。分子X對其配偶體Y的結合活性通常可用解離常數(KD)或「每單位量配體的結合的分析物的量」表示。後續描述用於測量結合活性的具體說明性和示例性實施例。

本文中的術語「抗體」以最廣義使用，且涵蓋各種抗體結構，包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現出期望的抗原結合活性。

如本文所用，「促效(agonist)」抗原結合分子或「促效」抗體是顯著增強其所結合的抗原的生物學活性的抗體。

如本文所用，「阻斷」抗原結合分子或「阻斷」抗體或「拮抗」抗原結合分子或「拮抗」抗體是顯著抑制(部分或完全)其所結合的抗原的生物學活性的抗體。

術語「抗體片段」和「抗原結合片段」是指除完整抗體以外，包含完整抗體的一部分的分子。抗體片段的範例包含但不限於Fv (VH和VL)、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) ₂；雙抗體(diabody)；線性抗體(linear antibody)；單鏈抗體分子(例如scFv)；和由抗體片段形成的多功能抗能和多特異性抗體。

與參考抗體「結合至相同抗原決定基的抗體」是指在競爭測定中阻斷參考抗體對其抗原的結合達50%或更多的抗體，且相反地，在競爭測定中參考抗體阻斷抗體對其抗原的結合達50%或更多。本文提供了示例性競爭測定。

術語「嵌合(chimeric)」抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分是衍生自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。

抗體的「類別(class)」是指其重鏈所擁有的恆定域或恆定區的類型。抗體有五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中一些可進一步分為亞類別(同型)，例如IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁和IgA ₂。對應至不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為alpha、delta、epsilon、gamma和mu。

如本文所使用地，術語「細胞毒殺劑」是指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞死亡或破壞的物質。細胞毒殺劑包含但不限於放射性同位素(例如 ²¹¹At、 ¹³¹I、 ¹²⁵I、 ⁹⁰Y、 ¹⁸⁶Re、 ¹⁸⁸Re、 ¹⁵³Sm、 ²¹²Bi、 ³²P、 ²¹²Pb和Lu的放射性同位素)；化療劑或藥物(例如甲胺蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamycin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依妥普賽(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酵素及其片段例如溶核酶(nucleolytic enzyme)；抗生素；毒素例如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酵素活性毒素，包含其片段和/或變異體；及以下揭露的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。

「效應子功能(effector function)」是指可歸因於抗體的Fc區的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應子功能的範例包含：C1q結合和補體依賴性細胞毒殺性(complement dependent cytotoxicity，CDC)； Fc受體結合；抗體依賴性之細胞調控的細胞毒殺性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)；胞噬作用(phagocytosis)；細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調；和B細胞活化。

試劑例如醫藥製劑的「有效量」是指在所需的劑量和時間段內有效達到期望的治療或預防結果的量。

本文中的術語「Fc區」用於定義含有恆定區的至少一部分的免疫球蛋白重鏈的C端區。此術語包含天然序列Fc區和變異Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc區的C端離胺酸(Lys447)或麩胺酸-離胺酸(殘基446-447)可存在或可不存在。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。

在本文中，Fc區或恆定區內的胺基酸改變或取代可由EU編號系統和胺基酸的組合來表示。例如，S424N代表EU編號中第424位從絲胺酸(Ser)到天冬醯胺(Asn)的取代。EU424N代表EU編號中第424位從胺基酸(任何類型)到天冬醯胺(Asn)的取代。

術語「Fc受體」或「FcR」是指結合至抗體Fc區的受體。Fc受體是例如自然殺手細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞的免疫細胞表面的蛋白質。Fc受體結合至附著於受感染細胞或入侵病原體的抗體的Fc (可結晶片段)區，刺激吞噬細胞或細胞毒性細胞，從而藉由抗體調控的吞噬作用或抗體依賴性細胞調控的細胞毒性，來破壞微生物或受感染細胞。在一些實施例中，FcR是天然人類FcR。在一些實施例中，FcR是結合IgG抗體(gamma受體)並且包括Fc gamma RI、Fc gamma RII和Fc gamma RIII次類別的受體，包含那些受體的等位變異體和可變剪接形式的FcR。Fc gamma RII受體包含Fc gamma RIIA (一種「活化性受體」)和Fc gamma RIIB (一種「抑制性受體」)，它們具有類似的胺基酸序列，主要在其細胞質域中不同。活化性受體Fc gamma RIIA在其細胞質域中含有一個基於免疫受體酪胺酸的活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。抑制性受體Fc gamma RIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)。(參閱例如，Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。例如在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中回顧FcR。本文中的術語「FcR」涵蓋了其他FcR，包含將來會被鑑定出的那些。

術語「Fc受體」或「FcR」還包含新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))和免疫球蛋白恆定的調節。測量與FcRn結合的方法是已知的(參閱例如，Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton et al))。

可例如在表現人類FcRn的轉基因小鼠或轉染人類細胞系中，或在投予具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中，測定人類FcRn高親和力結合多肽之體內與人類FcRn的結合和血漿半衰期。WO 2000/42072 (Presta) 描述了與 FcR 結合增加或減少的抗體變異體。也參閱例如，Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。

本文中的術語「包含Fc區的抗體」是指包含Fc區的抗體。例如，在抗體純化的期間或藉由編碼抗體的核酸的重組工程，可去除Fc區的C端離胺酸(根據EU編號系統的殘基447)或C端甘胺酸-離胺酸(殘基446-447)。因此，根據本揭露之包含具有Fc區的抗體的組合物可包含具有G446-K447、具有G446和不具有K447、去除所有G446-K447的抗體，或上述三種類型抗體的混合物。

本文中的術語「Fc域的次單元」和「Fc次單元」表示形成二聚體Fc區的兩個多肽之一，換句話說，是包含免疫球蛋白重鏈的C端恆定區之能夠穩定的自我連結的多肽。例如，IgG的Fc域的次單元包含IgG CH2和IgG CH3恆定域。

「增強第一Fc次單元和第二Fc次單元連結的修飾」是胜肽骨架的工程或Fc域次單元上之減少或阻止多肽與相同種類的多肽連結的轉譯後修飾，前述多肽包含能夠形成同質二聚體的Fc域次單元。本文使用的增強連結的修飾包含單獨的修飾，每個修飾都是針對需要連結的兩個Fc域次單元之一(即，Fc域的第一和第二次單元)的，前述修飾與彼此互補，這樣它增強了兩個Fc域次單元的連結。例如，連結增強的修飾可改變Fc域中一或兩者的結構或電荷，以使其在空間或靜電上的連結是需要的。因此，在包含第一Fc域次單元的多肽和包含第二Fc域次單元的多肽之間發生(異質)二聚體化，這些多肽可能是不同的，因為與每個次單元融合的其他成分(例如，抗原結合部分)是不同的。在一些實施例中，連結增強的修飾包含Fc域內的胺基酸突變，特別是胺基酸取代。在某實施例中，連結增強的修飾在Fc域的兩個次單元的每一者中包含不同的胺基酸突變，特別是胺基酸取代。

在一實施例中，上述修飾是所謂的「旋鈕入孔(knob into hole)」修飾，包含在Fc域的兩個次單元之一者中的旋鈕修飾和在Fc域的兩個次單元之另一者中的孔修飾。例如，在美國專利號5,731,168；美國專利號 7,695,936；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)；和Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中描述了旋鈕入孔技術。通常，此方法包含在第一多肽的界面導入突起(旋鈕)和在第二多肽的界面處導入相應的空腔(孔)，所以突起可填充至空腔中以增強異質二聚體的形成，同時防止同質二聚體的形成。可藉由用較大的側鏈(例如，甲狀腺素或色胺酸)取代來自第一多肽界面的胺基酸的小側鏈來構建突起。可藉由用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大的胺基酸側鏈，以在第二多肽的界面處產生與突起相同或更小的互補空腔。

「框架(framework)」或「FR」是指高度可變區(hypervariable region，HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域的FR通常由四個FR結構域所組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常依以下順序出現於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體(full length antibody)」、「完整抗體(intact antibody)」和「全抗體(whole antibody)」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構大抵上相似的結構或具有含有本文定義的Fc區的重鏈的抗體。

術語「宿主細胞(host cell)」、「宿主細胞系(host cell line)」和「宿主細胞培養物(host cell culture)」可互換使用，且是指已將外源核酸導入至其中的細胞，包含此種細胞的後代(progency)。宿主細胞包含「轉形株(transformant)」和「轉形細胞(transformed cell)」，其包含初代轉形細胞和從其衍生的後代，而與繼代次數無關。後代的核酸含量可能不與親代細胞完全相同，但可能含有突變。具有與在原始轉形細胞中所篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變後代包含在本文中。

「人類抗體」是一種擁有對應至由人類或人類細胞所產生或衍生自使用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列的非人類來源的抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體的此定義具體地排除了包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。

「人類共有框架(human consensus framework)」是代表在選擇的人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中，最常出現的胺基酸殘基的框架。通常，選擇的人類免疫球蛋白VL或VH序列是來自可變域序列的子群(subgroup)。通常，序列的子群是如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3中的子群。在一實施例中，對於VL，子群是如上文Kabat等人中的子群kappa I。在一實施例中，對於VH，子群是如上文Kabat等人中的子群III。

「人源化(humanized)」抗體是指包含來自非人類HVR的胺基酸殘基和來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包含至少一個且通常是兩個可變域的大抵上全部，其中所有或大抵上所有的HVR(例如CDR)都對應至非人類抗體的那些，且所有或大抵上所有的FR都對應至人類抗體的那些。人源化抗體可可選地包含衍生自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體例如非人類抗體的「人源化形式」是指已接受人源化的抗體。

如本文所使用地，術語「高度可變區(hypervariable region)」或「HVR」是指抗體可變域之序列上高度可變(「互補決定區(complementarity determining regions)」或「CDRs」)和/或形成結構上定義的環(「高度可變環(hypervariable loops)」)和/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)的每個區域。通常，抗體包含六個HVR：三個(H1、H2、H3)在VH中和三個(L1、L2、L3)在VL中。本文中的示例性HVR包含： (a) 出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)的高度可變環 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) 出現在胺基酸殘基24-34 (CDRL1)、50-56 (CDRL2)、89-97 (CDRL3)、31-35b (CDRH1)、50-65 (CDRH2)和95-102 (CDRH3)的CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 出現在胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)和93-101 (H3)的抗原接觸(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b)和/或(c)的組合，包含HVR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)和94-102 (H3)。除非另有說明，否則可變域中的HVR殘基和其他殘基(例如FR殘基)在本文中是根據上述之Kabat等人來編號，例如supra。

「免疫偶聯物(immunoconjugate)」是偶聯至一或多個異源分子的抗體，包含但不限於細胞毒殺劑。

「個體(individual)」或「對象(subject)」是哺乳類。哺乳類包含但不限於馴化動物(例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如人類和非人類之靈長類例如猴)、兔和囓齒類(例如小鼠和大鼠)。在某些實施例中，個體或對象為人類。

「單離(isolated)」抗體是已經從其天然存在的環境的組成中分離出來的抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%的純度，其藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)、毛細管電泳(capillary electrophoresis))或層析法(例如離子交換或逆相HPLC)來確定。對於抗體純度的評價(assessment)方法的回顧，參閱例如，Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。

「單離」核酸分子是已經從其自然環境的成分中分離的核酸分子。單離核酸分子包含通常含有此核酸分子的細胞中所含有的核酸分子，但此核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然存在的染色體位置的染色體位置。

「編碼細胞液穿透抗原結合分子的單離核酸」是指編碼細胞液穿透抗原結合分子的一或多個核酸分子，其包含單一載體或個別載體上攜帶的核酸分子、及存在於宿主細胞內的單一位點或多個位點的核酸分子。在TR細胞液穿透抗原結合分子是抗體的情況下，「編碼細胞液穿透抗原結合分子的單離核酸」是指編碼重鏈和輕鏈(或其片段)的一或多個核酸分子，其包含單一載體或個別載體上攜帶的核酸分子、及存在於宿主細胞內的單一位點或多個位點的核酸分子。

如本文所使用的術語「單株抗體」是指從大抵上均質的抗體，亦即除了例如含有天然存在的突變或在單株抗體製品(preparation)的生產過程中所產生的可能的變異抗體之外，構成此群體的各個抗體是相同和/或結合相同的抗原決定基，中獲得的抗體，這種變異體通常以少量存在。與通常包含針對不同決定基(抗原決定基)的不同抗體的多株抗體製品對比，單株抗體製品中的每個單株抗體是針對抗原上的單一決定基。因此，修飾語「單株」指出抗體的特性為大抵上同質的抗體群體中獲得，而不應視為要求藉由任何特定方法來生產抗體。例如，可藉由多種技術包含但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有全部或部分的人類免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，來製造根據本發明使用的單株抗體，本文描述了這些方法和其他製造單株抗體的示例性方法。

「裸抗體(naked antibody)」是指未偶聯至異源部分(例如細胞毒殺部分)或放射性標記的抗體。裸抗體可存在於醫藥製劑中。

「天然抗體(native antibody)」是指具有變化結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道耳頓(dalton)、由以雙硫鍵結合的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈所構成的異質四聚體糖蛋白。從N至C端，每條重鏈都具有可變區(VH)，也稱為可變重域或重鏈可變域，接著是三個恆定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈都具有可變區(VL)，也稱為可變輕域或輕鏈可變域，接著是恆定輕(CL)域。可基於其恆定域的胺基酸序列，抗體的輕鏈可分配至稱為kappa和lambda兩種類型之一。

術語「細胞液穿透抗原結合分子」或「細胞液穿透抗體或其抗原結合片段」是指可穿透至活細胞的細胞液的抗原結合分子或細胞液穿透抗體或其抗原結合片段。穿透至細胞液中的模式沒有特別限制，且抗原結合分子可透過胞吞(endocytosis)過程被攝取，然後經過內體逃逸(endosome escape)或可進行其他過程。除了內體逃逸以外的範例包含抗原結合分子直接穿透通過細胞膜的情況。相同的抗原結合分子可藉由兩種模式(即內體逃逸和細胞膜的直接穿透)穿透至細胞液中。報導了能夠透過內體逃逸以外的方法穿透至細胞液的抗原結合分子(例如，WO 2013102659)。在一實施例中，細胞液穿透抗原結合分子是抗體或抗體衍生物。在另一實施例中，細胞液穿透抗原結合分子包含細胞液穿透域。

術語「細胞液穿透域」和「具有細胞液穿透能力/活性的區域」可交換使用，指的是允許穿透至活細胞的細胞液的結構域。不希望受理論束縛，對細胞液的穿透模式沒有特別限制，且可透過胞吞過程被攝取和隨後的內體逃逸，或可透過其他過程。從內體逃逸的模式沒有特別限制。例如，藉由內體(酸性 pH)中的細胞液穿透域與內體膜交互作用，以在內體膜上產生孔洞，從而實現轉移至細胞液。除了內體逃逸以外的範例包含抗原結合分子直接穿透通過細胞膜的情況。相同的抗原結合分子可藉由兩種方式(即內體逃逸和細胞膜的直接穿透)穿透至細胞液中。在一實施例中，細胞液穿透域具有內體逃逸能力和細胞膜穿透能力中的一或兩者。在一實施例中，細胞液穿透域不具有藉由胞吞作用被攝取的能力。在另一實施例中，細胞液穿透域具有藉由胞吞作用被攝取的能力。細胞液穿透域可為任何類型，只要它具有細胞液穿透能力，但在一較佳實施中，細胞液穿透域是抗體或其片段。在細胞液穿透域為抗體或其片段的情況下，細胞液穿透域包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)的組合的全部或部分；或單域抗體可變區，例如重鏈抗體可變區(重鏈抗體的重鏈的可變區(Variable region of Heavy chain of Heavy chain)：VHH)、抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)、及免疫球蛋白新抗原受體(immunoglobulin new antigen receptor，IgNAR)(VNAR)的可變區。具有細胞液穿透能力的抗體或其片段的範例包含，例如包含展現出細胞液穿透能力的輕鏈可變區的Cytotransmab (Nat Commun.2017 May 10；8:15090)。細胞液穿透域的其他範例是「scFv (單鏈 Fv)」、「單鏈抗體」、「Fv」、「scFv2 (單鏈Fv2)」、「Fab」或「F(ab’)2」等等。細胞液穿透域可與胜肽部分或具有細胞穿透活性的核酸部分組合使用。具有細胞穿透活性的胜肽部分的範例包含細胞穿透胜肽(cell-penetrating peptide，CPP)、蛋白質轉導域(protein transduction domain，PTD)等(參閱例如WO 2017156630)。具有細胞穿透活性的核酸部分的範例包含具有硫代磷酸酯骨架的寡核酸(參閱例如WO 2015031837)。可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種方法，來檢查感興趣的結構域是否為細胞液穿透域(感興趣的結構域是否具有細胞液穿透能力)。例如，可藉由將感興趣的結構域與不具有細胞液穿透能力的分子(例如，抗原結合分子)融合，將融合的分子與細胞接觸，然後看融合的分子是否在細胞的細胞液中檢測到。已知用於檢測細胞液中感興趣的分子的存在的各種方法，例如，分別在以下參考例1和3中描述的使用分裂NanoLuc(註冊商標)系統的測定和使用螢光顯微鏡的成像分析是已知的。BirA測定和使用分裂GFP系統的測定也可用於檢測細胞液中感興趣的分子的存在。在一實施例中，細胞液穿透域可與細胞表面抗原和/或細胞液抗原交互作用。

抗原結合分子的「細胞液運輸(cytosol-trafficking)」能力是指抗原結合分子運輸至細胞液的能力，且術語「穿透」、「運輸」或「運輸」可交互使用。抗原結合分子的術語「細胞液穿透能力/活性」、「細胞液運輸能力/活性」、「細胞質滲透性」和「對細胞質的滲透性」在本文中可交互使用，用來指抗原結合分子將自身從內體轉運到細胞液中，或運輸到細胞液中的能力。

抗原結合分子(抗體)的「減少的胞外基質(extracellular matrix，ECM)結合」或「較低的ECM結合」是指與參照抗體相比，抗原結合分子與ECM的結合減少。ECM (胞外基質)是一種胞外成分，且位於體內的不同部位。因此，已知強烈結合至ECM的抗體在血液中具有較差的動力學(半衰期較短)(WO2012093704 A1)。因此，較佳選擇包含增強細胞液穿透活性但不增加ECM結合的胺基酸取代的抗原結合分子作為在抗體文中出現的抗原結合分子變異體。

可參考 WO2012093704 A1藉由以下流程，評估每個抗體與ECM (胞外基質)的結合：用TBS將ECM無酚紅(BD Matrigel #356237)稀釋至2 mg/mL，且將5 micro L添加至在冰上冷卻的ECL測定盤(L15XB-3，MSD KK，高結合)的每個孔的中心。然後，將塗佈的盤密封且在4度C下保持隔夜。然後在第二天於室溫下進行測定。將150 micro L的ECL阻斷緩衝液(補充有0.5% BSA和0.05% Tween 20的PBS)添加到塗佈的盤的每個孔中，且在室溫下將盤靜置2小時或更久。然後，去除阻斷緩衝液。用ACES-T將每個抗體樣品稀釋至 9 micro g/mL，且用ECLDB (補充有0.1% BSA和0.01% Tween 20的PBS)進一步稀釋至 3 micro g/mL。將50 micro L的稀釋的抗體溶液添加至每個孔中，且在30 度C下以 600 rpm搖動培養1小時。然後藉由敲擊倒置的盤，來去移樣品。然後，將50 micro L的戊二醛(glutaraldehyde)添加至每個孔中，以固定樣品且在室溫下培養10分鐘。然後，用 PBS-T (補充有0.05% Tween 20的PBS)洗滌孔三次。用ECLDB將二抗稀釋至1 micro g/mL，且將50 micro L的二抗溶液添加至盤的每個孔中。將盤密封且在30度C下以600rpm培養1小時，同時避光。接下來，去除二抗溶液。在添加READ緩衝液(MSD K.K.)之前，再次用PBS-T洗滌盤三次，緩衝液以150 micro L/孔添加，然後使用Sector Imager 2400 (MSD K.K.)立即檢測發光訊號。

術語抗原結合分子的「較低聚集趨勢(lower aggregation tendency)」是指與參考抗原結合分子相比，抗原結合分子彼此的自身連結，即單體之間的交互作用減少。對於每個變異體，使用UPLC (Acquity H-Class bio, Waters)藉由尺寸排阻層析(size-exclusion chromatography，SEC) 分析，來評估聚集特徵(aggregation profile)。50 mM磷酸鹽/300 mM NaCl (pH 7.0)用來運行緩衝液，且BEH200管柱 (Waters, #186005225)作為分析管柱。藉由220 nM UV吸收來記錄層析圖。使用 Empower3 軟體(Waters)來處理數據，且計算在單體峰的單體峰百分比和半峰全寬(full width at half maximum)。高單體峰百分比和尖銳對稱峰形(窄峰寬)被認為是具有良好的物理化學特性。

「融合(fuse)/融合(fusing)/融合(fusion)」是指成分(例如，Fab區和Fc域次單元)直接或經由一或多個胜肽連接子(linker)透過胜肽鍵連接在一起。

術語「仿單(package insert)」用於指通常包含於治療產品的商業包裝中的指示，其含有關於使用此類治療產品的適應症(indication)、用法、劑量、投予、組合療法、禁忌症(contraindication)和/或警告的資訊。

相對於參考多肽序列的「胺基酸序列相同度百分比(%)」定義為在比對序列且若有必要的話，則將間隙導入以達到最大的序列相同度百分比，且不將任何保守取代視為序列相同度的一部分後，候選序列中與參考多肽序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可用本發明所屬領域技術內的各種方式，來實現用於確定胺基酸序列相同度百分比的比對，例如，使用公開可用的電腦軟體例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體或GENETYX(註冊商標)(Genetyx Co., Ltd.)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可確定用於比對序列的合適參數，包含在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。

ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫，且來源碼已與用戶文件一起歸檔(file)於U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559中，且註冊於美國版權註冊號TXU510087中。ALIGN-2程式可從Genentech, Inc., South San Francisco, California公開獲得，或也可從來源碼中進行編譯。ALIGN-2程式應編譯為在UNIX操作系統(包含數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設置，且沒有改變。在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較的情況下，給定的胺基酸序列A對、和或及給定的胺基酸序列B (可替代地表示為具有或包含對、和或及給定的胺基酸序列B某百分比的胺基酸序列相同的給定的胺基酸序列A)胺基酸序列相同度百分比的計算如下：分數X/Y的100倍其中X是在此程式的A和B的比對中被序列比對程式ALIGN-2計為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中胺基酸殘基的總數目。應理解的是，若胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度，則A對B的胺基酸序列相同度%將不等於B對A的胺基酸序列相同度%。除非另有具體說明，否則如前一段落所述，使用ALIGN-2電腦程式，來獲得本文使用的所有胺基酸序列相同度%同一性值。

術語「醫藥製劑」是指形式為使其中所含活性成分的生物活性有效，且不含有對此製劑所投予的對象有不可接受地毒性的額外成分的製品。

「醫藥上可接受的載劑」是指醫藥製劑中除活性成分以外，對對象無毒的成分。醫藥上可接受的載劑包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文所使用地，「治療」(及其文法變化例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)是指試圖改變被治療個體的自然病程的臨床干預，且可於預防或在臨床病理過程的期間執行。期待的治療效果包含但不限於，疾病的發生或復發的預防、症狀的緩和(alleviation)、疾病的任何直接或間接病理後果的減少(diminishment)、預防轉移、降低疾病進展的速度、疾病狀態的緩解(amelioration)或減輕(palliation)、和趨緩(remission)或預後(prognosis)改善。在一些實施例中，本發明的抗體用於延遲疾病的發展或減慢疾病的進展。

術語「可變區」或「可變域」是指涉及使抗體結合至抗原的抗體重或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，其中每個結構域均包含四個保守框架區(framework region，FR)和三個高度可變區(hypervariable region，HVR)。(請參閱例如，Kindt et al. Kuby Immunology, 6 ^thed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)。)單一VH或VL域可能足以賦予抗原結合特異性。再者，可使用來自結合抗原的抗體的VH或VL域，來單離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補的VL或VH域的資料庫(library)。請參閱例如，Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature352:624-628 (1991)。

如本文所使用地，術語「載體(vector)」是指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。此術語包含作為自我複製核酸結構的載體，以及合併至已導入至宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠引導與其可操作連接的核酸的表現。這樣的載體在本文中稱為「表現載體(expression vector)」。

如本文所使用地，詞組「基本上降低」、「基本上增加」或「基本上不同」是指兩個數值(通常一者與分子相關，而另一者與參考/比較分子相關)之間的差異夠高程度，使得本發明所屬技術領域中具有通常知識者會認為在由所述值(例如KD值)測量的生物特性的背景下，這兩個值之間的差異具有統計顯著性。

如本文所使用地，詞組「基本上類似」、「基本上不改變」或「基本上相同」是指兩個數值(通常一者與分子相關，而另一者與參考/比較分子相關)之間的相似度夠高程度，使得本發明所屬技術領域中具有通常知識者會認為在由所述值(例如KD值)測量的生物特性的背景下，這兩個值之間的差異很少或沒有生物學和統計上顯著性。

本文使用的表示「基本上未檢測到」是指某物處於或低於本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準檢測技術(例如西方墨點法、毛細管免疫測定、螢光顯微鏡成像等)的檢測極限，這意味著完全沒有檢測到某物，或者即使檢測到，檢測程度接近背景或噪音。具體地，本揭露的抗原結合分子被稱為基本上未檢測到，例如，當本揭露的抗原結合分子的測量值與負對照的測量值基本上相似或基本上相同時(例如，之間沒有統計上顯著性)。表示「基本上未遞送」是指在用於檢測遞送的標準檢測技術中，基本上未檢測到某物的遞送。例如，對於遞送至細胞的細胞液中，當在已與抗原結合分子或其複合物接觸的細胞的細胞液中，本發明的抗原結合分子或其複合物的量與未接觸過的細胞的細胞液中的量基本相似或基本相同(例如，之間沒有統計顯著性)。類似地，基本上不去除、抑制或活化的表示意味著在用於檢測它們的標準檢測技術中，基本上沒有檢測到去除、抑制、活化。例如，對於細胞液抗原的去除、抑制、活化，在使用本揭露的抗原結合分子或其複合物的情況下進行測定的量與對照的測量基本上類似或基本上相同(例如，沒有統計顯著性)時，細胞液抗原被稱為實質上不被去除、不被抑制或不被活化。

II. 組合物及方法在一面向中，本揭露部分基於與已存在的細胞液穿透抗體輕鏈可變區(h3D8抗體的VL：在WO2016/013870中揭露的hT4VL)相比，發現包含具有改善的細胞液穿透能力或活性的輕鏈可變區的抗原結合分子(例如抗體)。本揭露進一步地部分基於發現具有改善的細胞液穿透抗體的抗原結合分子(抗體)進一步顯示出改善的表現程度、減少的ECM (胞外基質)結合和/或由較低的聚集趨勢所指出的改善的物理化學特性。在某些實施例中，本文提供的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)或其片段包括包含hT4VL.FRv4 (序列辨識號：4)的CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區，其與hT4VL的區別僅在於具有人類V kappa 3 (VK3) FR3以取代人類V kappa 1 FR3且在選自CDRL1、CDRL2和CDRL3，較佳選自CDRL1和CDRL3中的至少一者中包含一或多個胺基酸取代。在另一面向中，本文提供的多功能抗原結合分子包含細胞液穿透抗體或其抗體的片段、結合至細胞表面抗原的抗體或其抗體的片段、和/或結合至細胞液抗原的抗體或其抗體的片段的組合。以靶細胞特異性方式，將多功能抗原結合分子遞送至細胞液中。在某些實施例中，本文提供的多功能抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域、細胞液抗原結合域和包含前述輕鏈可變區的細胞液穿透域。本揭露的抗原結合分子於例如診斷、預防或治療由細胞液抗原所引起的疾病。

A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體) 在一實施例中，本揭露的抗原結合分子是具有改善的(增強的)細胞液穿透能力(活性)的抗原結合分子。在一實施例中，與已存在的細胞穿透抗體相比，更有效地將本揭露的細胞液穿透抗原結合分子遞送(轉位)至細胞液。在一實施例中，與相同量的已存在的細胞液穿透抗體的情況相比，當將固定量的本揭露的細胞液穿透抗原結合分子投予至對象或與細胞接觸時，將更大量的抗原結合分子遞送至靶細胞的細胞液。在一實施例中，與已存在的細胞穿透抗體相比，本揭露的抗原結合分子進一步顯示出改善的表現程度、降低的ECM (胞外基質)結合和/或由更低的聚集趨勢指示的改善的物理化學特性。

在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包括包含序列辨識號：4中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3的胺基酸序列(即，在序列辨識號：4中所示的胺基酸中包含的CDRL1、CDRL2、CDRL3)，其中輕鏈可變區在選自CDRL1、CDRL2和CDRL3中的至少一者中包含一或多個胺基酸取代。在另一較佳實施例中，輕鏈可變區在選自CDRL1和CDRL3中的至少一者中包含一或多個胺基酸取代。

在一較佳實施例中，輕鏈可變區在序列辨識號：4所示的胺基酸序列的Kabat編號第24至34和89至97位包含一或多個胺基酸取代。更佳地，一或多個胺基酸取代位於序列辨識號：4所示的胺基酸序列中的Kabat編號第24至32和93至97位。

在一較佳實施例中，本揭露的抗原結合分子的輕鏈可變區包含一或多個選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組的胺基酸取代：在序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) 用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y取代第24位的胺基酸K； (b) 用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y取代第25位的胺基酸S； (c) 用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V取代第 26 位的胺基酸S； (d) 用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y取代第27位的胺基酸 Q； (e) 用D取代第27a位的胺基酸S； (f) 用I、P、Q、T或V取代第 27b 位的胺基酸 L； (g) 用A、D、E、I、M、N、S、W或Y取代第27c位的胺基酸F； (h) 用A、D、E、F、H、N或Q取代第27d位的胺基酸N； (i) 用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y取代第27e位的胺基酸S； (j) 用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y取代第27f位的胺基酸S； (k) 用E、H、I、Q、S、V、W或Y取代第28位的胺基酸T； (l) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第29位的胺基酸R； (m) 用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第30位的胺基酸K； (n) 用D、M、S或T取代第31位的胺基酸N； (o) 用D、E、G、H或Q取代第32位的胺基酸Y； (p) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (q) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (r) 用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W取代第93位的胺基酸Y； (s) 用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第94位的胺基酸H； (t) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第95位的胺基酸M； (u) 用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V取代第96位的胺基酸Y；及 (v) 用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V取代第97位的胺基酸 T；

在一較佳實施例中，本揭露的輕鏈可變區中的上述一或多個胺基酸取代與參考抗體或沒有取代且包含具有序列辨識號：4所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，增強抗體或其片段的細胞液穿透活性。在另一較佳實施例中，與沒有取代且包含具有序列辨識號：4所示胺基酸序列的輕鏈可變區的的參考抗體或其片段相比，本揭露的抗體或其片段表現出增強至少1%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或500%或1000%的細胞穿透活性，較佳地如參考實施例1中所述地使用分裂Nluc測定法確定的。在一實施例中，細胞液穿透活性是藉由抗體或其片段穿透至細胞膜和/或內體逃逸來調控的。

在一較佳實施例中，本揭露的輕鏈可變區包含一、二、三或更多個選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組的胺基酸取代：在序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) 用N取代第24位的胺基酸K； (b) 用E取代第27位的胺基酸Q； (c) 用D取代第27a位的胺基酸S； (d) 用D或E取代第27d位的胺基酸N； (e) 用D或E取代第27e位的胺基酸S； (f) 用D、H、K、L、S或V取代第27f位的胺基酸R； (g) 用D取代第28位的胺基酸T； (h) 用E、G、M或S取代第29位的胺基酸R； (i) 用L或Q取代第30位的胺基酸K； (j) 用E取代第32位的胺基酸Y； (k) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (l) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (m) 用E取代第93位的胺基酸Y； (n) 用E、P或Q取代第94位的胺基酸H； (o) 用D、N或P取代第95位的胺基酸M；及 (p) 用E或P取代第96位的胺基酸Y。

在一較佳實施例中，本揭露的輕鏈可變區包含選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組的胺基酸取代的組合： (a) S27eD/R27fK； (b) S27eD/R27fH； (c) N27dE/S27eD； (d) S27eD/T28D； (e) S27eD/R29E； (f) S27eD/R29S； (g) K24N/S27eD； (h) N27dD/R27fK； (i) N27dE/R27fK； (j) R27fK/T28D； (k) R27fK/R29E； (l) R27fK/R29S； (m) K24N/R27fK； (n) K24N/N27dD； (o) N27dD/T28D； (p) N27dD/R29E； (q) N27dD/R29S； (r) S27eD/Q89H； (s) N27dD/Q89H； (t) R27fK/Q89H； (u) S27eD/Y91E； (v) N27dD/Y91E； (w) R27fK/Y91E； (x) Q89H/H94P； (y) Y91E/H94P； (z) H94P/M95N； (aa) H94P/M95D； (bb) H94P/M95P； (cc) H94E/Y96P； (dd) H94E/M95N； (ee) H94E/M95D； (ff) H94E/M95P； (gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P； (hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P； (ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P； (ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P； (mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P； (nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P； (oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P； (pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P； (qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P； (rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P； (ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P； (tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P； (uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P； (vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P； (ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P； (xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P； (zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P； (aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q； (fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q； (ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P； (lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P； (nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P； (ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P； (ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P； (qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P； (rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P； (sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；及 (ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。

在一較佳實施例中，本揭露的輕鏈可變區包含人類框架區(framework region(s)，FR(s))。在某些實施例中，根據Kabat編號，輕鏈可變區在第2位包含胺基酸I，和/或在第3位包含胺基酸Q。

在一較佳實施例中，本發明的輕鏈可變區可包含人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa 3 FR1序列。更佳地，輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR1序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區可包含人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa 3 FR2序列。更佳地，輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR2序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區可包含人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa 3 FR3序列。更佳地，輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR3序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa 3 FR3序列。

在一較佳實施例中，本揭露的輕鏈可變區包括在序列辨識號： 123中包含的FR結構域(FR1、FR2、FR3和FR4)中的一、二、三或四個。

在一較佳實施例中，本揭露的輕鏈可變區在CDRL2中還包含一、二、三或更多個胺基酸取代。在一較佳實施例中，一、二、三或更多個胺基酸取代位於序列辨識號：4所示的胺基酸序列中的Kabat編號第50-56位。在一具體實施例中，CDRL2中的一、二、三或更多個胺基酸取代選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組：在序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) 用A、G、I、T或V取代第50位的胺基酸W； (b) 用F或I取代第52位的胺基酸S； (c) 用N或Y取代第53位的胺基酸T；及 (d) 用K或V取代第54位的胺基酸R。

在一些實施例中，本揭露的輕鏈可變區包含選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組的胺基酸取代的組合：在序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q； (b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q； (c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q； (d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q； (e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q； (f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q； (g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q； (h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q； (i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q； (j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q； (k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q； (l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；及 (m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。

在一較佳實施例中，本發明的細胞液穿透抗原結合分子包含具有選自由序列辨識號：14-150和161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一實施例中，本發明的細胞液穿透抗原結合分子或所產生的其片段包含具有選自由序列辨識號：123-150所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一實施例中，本發明的細胞液穿透抗原結合分子或所產生的其片段包含具有選自由序列辨識號：161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。

在另一較佳實施例中，本發明的細胞液穿透抗原結合分子可為scFv (單鏈Fv)、單鏈抗體、Fv、scFv2 (單鏈Fv2)、Fab或F(ab’)2。在另一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子可以Fab或scFv的形式存在。

在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透分子更包含重鏈可變區。本揭露的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段可更包含單域抗體可變區，例如VHH。

A-2. 具有細胞液穿透能力的示例性多功能抗原結合分子在一些實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子是多功能抗原結合分子(抗體)。在一實施例中，多功能抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域、細胞液抗原結合域和包含上述輕鏈可變區的細胞液穿透域。

在一較佳實施例中，本揭露的多功能抗原結合分子不結合至在細胞的表面上表現之與上述細胞表面抗原不同的抗原。在一較佳實施例中，細胞液抗原結合域和/或細胞液穿透域(i)不結合至在細胞的表面上表現之與上述細胞表面抗原不同的抗原；或(ii) 不結合至細胞的表面上表現的任何抗原。

已知一種已存在的細胞穿透抗體Tmab4 (重鏈：3D8，輕鏈：hT4VL)藉由細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白聚醣(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)依賴性胞吞作用被吸收(uptake)到胞內內體中，在內體中在酸性pH下經歷輕鏈的結構變化，且與內體膜交互作用，以在膜上產生孔，從而實現轉位至細胞液中(J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175)。亦報導了，被制成對HSPG的結合減少的抗體(Tmab4-03 (重鏈：3D8，輕鏈：hT4VL.03)已失去其被胞吞作用吸收的能力，同時在pH5.5下保持形成孔的能力(J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175)。這意味著Tmab4-03就目前的形式而言，不能以細胞特異性方式實現轉位至細胞中。此外，預期透過Tmab4與內體膜上的分子交互作用的膜變形對在內體膜中形成孔是至關重要的(PNAS,2011 Oct.108;41;16883-16888)。因此，在一實施例中，期望存在與內體膜交互作用的多價細胞液穿透域，以改善細胞液穿透能力。

另一方面，如上所述，Tmab4透過在上皮細胞上普遍表現的HSPG進行胞吞作用，因此難以以靶細胞特異性方式，來遞送細胞液抗原結合抗體。換句話說，預期在全身投予時，細胞液抗原結合抗體至靶組織的遞送將是低的。有鑑於此，在一實施例中，本發明人想到了使用單價細胞液穿透域，來抑制非特異性吸收，添加靶細胞表面結合域以提高靶特異性，同時創造抗體和內體膜以多價方式發生交互作用的條件，以保持或改善細胞液穿透能力。

與上述已存在的抗體不同，在一實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域、細胞液抗原結合域和細胞液穿透域。因此，在一實施例中，對於本揭露的細胞液穿透抗原結合分子，預期其結合至靶細胞上的細胞表面抗原，從而以靶細胞特異性方式進行胞吞作用，然後其從內體將自己轉位至細胞液。在一實施例中，與已存在的細胞液穿透抗體相比，將本揭露的細胞液穿透抗原結合分子更選擇性地遞送至靶細胞的細胞液中。在一實施例中，與相同量的已存在的細胞液穿透抗體的情況相比，當將固定量的本揭露的細胞液穿透抗原結合分子投予至對象或與細胞接觸時，將更大量的抗原結合分子遞送至靶細胞的細胞液。在一實施例中，將本揭露的細胞液穿透抗原結合分子特異性遞送至靶細胞的細胞液中，同時基本上不遞送至不表現抗原結合分子特異性結合的細胞表面抗原的細胞。在一實施例中，當本揭露的細胞液穿透抗原結合分子作為醫藥時，與現有的細胞液穿透性抗體相比，細胞液穿透抗原結合分子發揮更強的藥效和/或引起較少的副作用。在一實施例中，與包含已存在的細胞液穿透抗體的醫藥組合物相比，包含本揭露的細胞液穿透抗原結合分子的醫藥組合物可以以更少的投予量和/或更少的投予次數發揮藥效。

在另一較佳實施例中，本揭露的多功能細胞液穿透抗原結合分子可為下述分子形式1至8中的任一者。

1. 包含第一和第二Fab區的細胞液穿透抗原結合分子(圖4和圖6) 在本發明的一較佳實施例中，細胞液穿透抗原結合分子包含第一和第二Fab區。在某實施例中，(a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 第二Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區(VH)和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)。在另一某實施例中，(a) 第一Fab區包含一對特異性結合至細胞表面抗原的重鏈可變區(VH)和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)，(b) 第二Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區(VH)和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)。這些實施例中的細胞液穿透性抗原結合分子可更包含Fc區，且Fc區可包含增強第一Fc次單元和第二Fc次單元連結的修飾。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)如A-1. 示例性細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中所定義。

2. 包含第一和第二Fab區和單鏈單元的細胞液穿透抗原結合分子(圖7) 在本揭露的一較佳實施例中，細胞液穿透抗原結合分子包含第一和第二Fab區及單鏈單元。在某實施例中，(a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 第二Fab區具有細胞液穿透能力； (c) 單鏈單元特異性結合至細胞液抗原。在另一某實施例中，(a) 第一Fab區特異性結合至細胞液抗原；(b) 第二Fab區具有細胞液穿透能力；(c) 單鏈單元特異性結合至細胞表面抗原。在又一某實施例中，(a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原； (b) 第二Fab區特異性結合至細胞液抗原；(c) 單鏈單元具有細胞液穿透能力。在又一某實施例中，(a) 第一和第二Fab區包含一對特異性結合至細胞表面抗原的重鏈可變區(VH)和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)。在某實施例中，單鏈單元融合至(i)第一Fab區的重鏈可變區(VH)的N端和/或第二Fab區的重鏈可變區(VH)的N端；(ii) 第一Fab區的輕鏈可變區(VL)的N端和/或第二Fab區的輕鏈可變區的N端；或(iii) 第一Fab區的輕鏈恆定區(CL)的C端和/或第二Fab區的輕鏈恆定區(CL)的C端。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子可更包括包含第一Fc次單元和第二Fc次單元的Fc區，且單鏈單元可融合至(i) 第一Fc次單元的C端或(ii) 第二Fc次單元的C端。第一Fc次單元和第二Fc次單元可為IgG抗體的重鏈恆定區CH2和CH3域，且可包含增強第一Fc次單元和第二Fc次單元的連結的修飾。在這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含的單鏈單元可為單域抗體可變區或單鏈抗體(scFv)。單域抗體可變區的範例包含但不限於重鏈抗體可變區(VHH)、重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)和免疫球蛋白新抗原受體(VNAR)的可變區。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含的具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)如A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中所定義。這些實施例的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透能力和具有細胞液穿透能力的單鏈單元的Fab區也包含具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區。

3. 包含第一和第二單域抗體可變區及單鏈單元的細胞液穿透抗原結合分子(圖8) 在本發明的一較佳實施例中，細胞液穿透抗原結合分子包含第一和第二單域抗體可變區及單鏈單元。在某實施例中，(a) 第一單域抗體可變區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 第二單域抗體可變區具有細胞液穿透能力；(c) 單鏈單元特異性結合至細胞液抗原。在某實施例中，單鏈單元與第一單域抗體可變區的N端和/或第二單域抗體可變區的N端融合。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子可更包括包含第一Fc次單元和第二Fc次單元的Fc區，且單鏈單元可融合至(i) 第一Fc次單元的C端或(ii) 第二Fc次單元的C端。第一Fc次單元和第二Fc次單元可為IgG抗體的重鏈恆定區CH2和CH3域，且可包含增強第一Fc次單元和第二Fc次單元連結的修飾。在這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含的單鏈單元可為單域抗體可變區或單鏈抗體(scFv)。單域抗體可變區的範例包含但不限於重鏈抗體可變區(VHH)、重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)及免疫球蛋白新抗原受體(VNAR)的可變區。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透的單域抗體可變區包含A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中定義的具有細胞液穿透的輕鏈可變區(VL)。

4. 具有DVD-Ig分子形式的細胞液穿透抗原結合分子(註冊商標)(圖9) 在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含第一和第二多肽鏈且具有稱為DVD-Ig (註冊商標)的分子形式。在某實施例中，(a) 第一多肽鏈包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特異性結合至細胞液抗原的第一重鏈可變區，VD2是特異性結合至細胞表面抗原的第二重鏈可變區，C是重鏈恆定區CH1，X1是除了CH1之外的連接子，X2是Fc區，且n為0或1； (b) 第二多肽鏈包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特異性結合至細胞液抗原的第一輕鏈可變區，VD2是特異性結合至細胞表面抗原的第二輕鏈可變區，C是輕鏈恆定區CL，X1是除了CL之外的連接子，X2不包含Fc區，且n為0或1。在另一某實施例中，(a) 第一多肽鏈包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是具有細胞液穿透能力的第一重鏈可變區，VD2是特異性結合至細胞表面抗原的第二重鏈可變區，C是重鏈恆定區CH1，X1是除了CH1之外的連接子，X2是Fc區，且n為0或1；(b) 第二多肽鏈包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是具有細胞液穿透能力的第一輕鏈可變區，VD2是特異性結合至細胞表面抗原的第二輕鏈可變區，C是輕鏈恆定區CL，X1是除了CL之外的連接子，X2不包含Fc區，且n為0或1。在又一某實施例中，(a) 第一多肽鏈包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特異性結合至細胞表面抗原的第一重鏈可變區，VD2是特異性結合至細胞液抗原的第二重鏈可變區，C是重鏈恆定區CH1，X1是除了CH1之外的連接子，X2是Fc區，且n為0或1；(b) 第二多肽鏈包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特異性結合至細胞表面抗原的第一輕鏈可變區，VD2是具有細胞液穿透能力的第二輕鏈可變區，C是輕鏈恆定區CL，X1是除了CL之外的連接子，X2不包含Fc區，且n為0或1。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區如A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中所定義。

5. 包含第一、第二和第三Fab區的細胞液穿透抗原結合分子(圖10) 在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含第一、第二和第三Fab區。在某實施例中，(a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 第二和第三Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區；(c) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元；(d) 第一Fab區的重鏈的C端融合至第一Fc次單元的N端，第二Fab區的重鏈的C端融合至第二Fc次單元的N端，且第三Fab區的重鏈的C端融合至第二Fab區的重鏈的N端。在另一某實施例中，(a) 第一和第三Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區；(b) 第二Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(c) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元；(d) 第一Fab區的重鏈的C端融合至第一Fc次單元的N端，第二Fab區的重鏈的C端融合至第二Fc次單元的N端，且第三Fab區的重鏈的C端融合至第二Fab區的重鏈的N端。在又一某實施例中，(a) 第一Fab區和第二Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區；(b) 第三Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(c) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元；(d) 第一Fab區的重鏈的C端融合至第一Fc次單元的N端，第二Fab區的重鏈的C端融合至第二Fc次單元的N端，且第三Fab區的重鏈的C端融合至第二Fab區的重鏈的N端。在某實施例中，第一Fab區和/或第二Fab區包含選自(i) Fab輕鏈可變區(VL)和Fab重鏈可變區(VH)之間的交換；(ii) Fab輕鏈恆定區(CL)和Fab重鏈恆定區(CH1)之間的交換；及(iii) Fab輕鏈(VL-CL)和Fab重鏈(VH-CH1)之間的交換中的任一交換，且第一Fab區和第二Fab區不包含相同的交換。在這些實施例中，第一Fc次單元和第二Fc次單元可為IgG抗體的重鏈恆定區CH2和CH3域，且可包含增強第一Fc次單元和第二Fc次單元連結的修飾。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)如A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中所定義。

6. 包含第一、第二、第三和第四Fab區的細胞液穿透抗原結合分子(圖11) 在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含第一、第二、第三和第四Fab區。在某實施例中， (a) 選自第一、第二、第三和第四Fab區的一Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 除了(a)之外的三個Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區；(d) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元； (e) 第一Fab區的重鏈的C端融合至第一Fc次單元的N端，第二Fab區的重鏈的C端融合至第二Fc次單元的N端，第三Fab區的重鏈的C端融合至第一Fab區的重鏈的N端，且第四Fab區的重鏈的C端融合至第二Fab區的重鏈的N端。在另一某實施例中，(a) 選自第一、第二、第三和第四Fab區的兩個Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 除了(a)之外的兩個Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區；(d) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元；(e) 第一Fab區的重鏈的C端融合至第一Fc次單元的N端，第二Fab區的重鏈的C端融合至第二Fc次單元的N端，第三Fab區的重鏈的C端融合至第一Fab區的重鏈的N端，且第四Fab區的重鏈的C端融合至第二Fab區的重鏈的N端。在又一某實施例中，(a) 選自第一、第二、第三和第四Fab區的三個Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 除了(a)之外的一Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區；(d) Fc區包含第一Fc次單元和第二Fc次單元；(e) 第一Fab區的重鏈的C端融合至第一Fc次單元的N端，第二Fab區的重鏈的C端融合至第二Fc次單元的N端，第三Fab區的重鏈的C端融合至第一Fab區的重鏈的N端，且第四Fab區的重鏈的C端融合至第二Fab區的重鏈的N端融合第二個 Fab 區的重鏈。在某實施例中，第一Fab區和/或第二Fab區包含選自(i) Fab輕鏈可變區(VL)和Fab重鏈可變區(VH)之間的交換；(ii) Fab輕鏈恆定區(CL)和Fab重鏈恆定區(CH1)之間的交換；及(iii) Fab輕鏈(VL-CL)和Fab重鏈(VH-CH1)之間的交換中的任一交換，且第一Fab區和第二Fab區不包含相同的交換。在另一某實施例中，第三Fab區和/或第四Fab區包含選自(i) Fab輕鏈可變區(VL)和Fab重鏈可變區(VH)之間的交換；(ii) Fab輕鏈恆定區(CL)和Fab重鏈恆定區(CH1)之間的交換；及(iii) Fab輕鏈(VL-CL)和Fab重鏈(VH-CH1)之間的交換中的任一交換，且第三Fab區和第四Fab區不包含相同的交換。在這些實施例中，第一Fc次單元和第二Fc次單元可為IgG抗體的重鏈恆定區CH2和CH3域，且可包含增強第一Fc次單元和第二Fc次單元連結的修飾。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)如A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中所定義。

7. 包含增強多聚體的形成之經改變的Fc區的細胞液穿透抗原結合分子(圖5) 在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含具有細胞液穿透能力的區域和Fc區，前述Fc區包含一或多個增強抗原結合分子的多聚體的形成的胺基酸改變，前述抗原結合分子與包括不包含一或多個胺基酸改變的親本Fc區的細胞液穿透抗原結合分子相比，具有提高的細胞液穿透能力。細胞液穿透抗原結合分子可更包含細胞表面抗原結合域和細胞液抗原結合域。在某實施例中，細胞液穿透抗原結合分子包含第一和第二Fab區及Fc區，且(a)第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原；(b) 第二Fab區包含一對特異性結合至細胞液抗原的重鏈可變區(VH)和具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)；(c) Fc區包含增強抗原結合分子的多聚體的形成的一或多個胺基酸改變。與包括不包含一或多個胺基酸改變的親本Fc區的細胞液穿透抗原結合分子相比，包含這種改變的Fc區的細胞液穿透抗原結合分子具有提高的細胞液穿透能力，且可允許包含多個細胞液穿透抗原結合分子的細胞液穿透抗原結合分子的多聚體複合物的形成。多聚體可為二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體。胺基酸改變可為組合E345R/E430G/S440Y或組合T437R/K248E (數字代表根據EU編號的取代位置)。在這些實施例中，第一Fc次單元和第二Fc次單元可為IgG抗體的重鏈恆定區CH2和CH3域，且可包含增強第一Fc次單元和第二Fc次單元連結的修飾。這些實施例中的細胞液穿透抗原結合分子中所包含之具有細胞液穿透能力的輕鏈可變區(VL)如A-1. 示例性的細胞液穿透抗原結合分子(抗體)中所定義。

8. 與異源部分偶聯的細胞液穿透抗原結合分子在一面向中，本揭露的抗原結合分子是細胞液穿透抗原結合分子，其與異源部分偶聯。在一實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域和細胞液穿透域，且不包含細胞液抗原結合域。在一較佳實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子不結合至在細胞的表面上表現且不同於上述細胞表面抗原的抗原。在一較佳實施例中，細胞液穿透域和/或異源部分(i) 不結合至在細胞的表面上表現且不同於上述細胞表面抗原的抗原；或(ii) 不結合至細胞的表面表現的任何抗原。

在一面向中，如上所述，本發明人想到了使用單價細胞液穿透域來抑制非特異性攝取，添加靶細胞表面結合域以提高靶特異性，且同時創造抗體和內體膜的交互作用以多價方式發生的條件，以保持或改善細胞液穿透能力。

在一實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域和細胞液穿透域。因此，在一實施例中，就本揭露的細胞液穿透抗原結合分子，預期其結合至靶細胞上的細胞表面抗原，從而以靶細胞特異性方式進行胞吞作用，然後將自身從內體轉位至細胞液，從而將異源部分遞送至細胞液中。

在一實施例中，與現有的細胞液穿透抗體相比，更選擇性地將本揭露的細胞液穿透抗原結合分子遞送至靶細胞的細胞液中，使得本揭露的細胞液穿透抗原結合分子可更選擇性地將異源部分遞送至靶細胞的細胞液中。在一實施例中，與相同量之偶聯至已存在的細胞液穿透抗體的異源部分的情況相比，當將固定量之本揭露的細胞液穿透抗原結合分子投予或與對象接觸時，將更大量之偶聯至抗原結合分子的異源部分遞送至靶細胞的細胞液。在一實施例中，將偶聯至本揭露的細胞液穿透抗原結合分子的異源部分特異性地遞送至靶細胞的細胞液中，而基本上不被遞送至不表現抗原結合分子所特異性結合的細胞表面抗原的細胞中。

在一實施例中，當本揭露的細胞液穿透抗原結合分子作為醫藥時，與偶聯至現有的細胞液穿透抗體的異源部分相比，偶聯至細胞液穿透抗原結合分子的異源部分發揮更強的藥效和/或引起較少的副作用。在一實施例中，與包含偶聯至已存在的細胞液穿透抗體的異源部分的醫藥組合物相比，包含偶聯至本揭露的細胞液穿透抗原結合分子的醫藥組合物可以以更少的投予量和/或更少的投予次數發揮藥效。

在一實施例中，細胞液穿透抗原結合分子包含第一和第二Fab區，其中(a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原，且(b) 第二Fab區具有細胞液穿透能力，且其中抗原結合分子偶聯至異源部分。在一較佳實施例中，異源部分偶聯至抗原結合分子的L鏈的C端(較佳地，生物素化的C端)。

在一實施例中，偶聯至細胞液穿透抗原結合分子的異源部分是胜肽、核酸、化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活性毒素或其片段)、或放射性同位素。在一實施例中，異源部分是胜肽。

A-3. 在一面向中，根據任何上述實施例中任一者的抗原結合分子可合併下述任何特徵。

術語「抗原結合域」和「(抗體的)抗原結合片段」在本文中可交互使用來指抗原結合分子(抗體)的一部分，此部分包含特異性結合且與抗原的全部或部分互補。如果抗原是高分子量，則抗原結合域可僅結合至抗原的特定部分。此特定部分稱為「抗原決定基」。可對抗原結合域提供一或多個抗體可變域。在一較佳實施例中，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)的組合的全部或部分；或單域抗體可變區，例如抗體重鏈可變區(VHH)、抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)和免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)(VNAR)的可變區。抗原結合域的其他範例是「scFv (單鏈Fv)」、「單鏈抗體」、「Fv」、「scFv2 (單鏈Fv2)」、「Fab」或「F(ab’)2」等。

此處使用的術語「單域抗體」、「單域抗體可變區」、「一域抗體」和「一域抗體可變區」不受結構限制，只要此結構域本身可發揮抗原的結合活性。已知典型的抗體，例如IgG抗體，在可變區由VH和VL配對所形成的狀態下顯示出抗原結合活性，而單域抗體的自身域結構本身可發揮出抗原結合活性而不用與另一結構域配對。通常，單域抗體的分子量相對較低，且以單體形式存在。單域抗體的範例包含但不限於先天性缺乏輕鏈的抗原結合分子，例如駱駝科的動物的VHH和鯊魚VNAR (免疫球蛋白新抗原受體的可變區：IgNAR)，和含有抗體VH域的全部或部分或抗體VL域的全部或部分的抗體片段。含有抗體VH或VL域的全部或一部分的抗體片段的單域抗體的範例包含但不限於如美國專利號 6,248,516 B1等中所述之源自人類抗體VH或人類抗體VL的人工製備的單域抗體。在本發明的一些實施例中，一單域抗體具有三個CDR (CDR1、CDR2和CDR3)。可從能夠產生單域抗體的動物或藉由能夠產生單域抗體的動物的免疫，來獲得單域抗體。能夠產生單域抗體的動物的範例包含但不限於駱駝科動物和攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物。駱駝科的動物包含駱駝、喇嘛(lama)、羊駝(alpaca)、駝峰駱駝和原駝(guanaco)等。攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物的範例包含但不限於國際公開號WO2015/143414和美國專利公開號US2011/0123527 A1中所述的轉基因動物。從動物獲得的單域抗體的框架序列可轉化為人類種系序列(human germline sequence)或與其相似的序列，以獲得人源化單域抗體。人源化單域抗體(例如人源化VHH)也是本發明的單域抗體的一實施例。「人源化單域抗體」是指包含來自非人類CDR的胺基酸殘基和來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合單域抗體。在一實施例中，在人源化單域抗體中，所有或基本上所有CDR對應至非人類抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應至人類抗體的那些。即使在人源化抗體中FR殘基的一部分不對應至來自人類抗體的情況下，也可認為是基本上所有的FR對應至來自人類抗體的那些的情況的一範例。例如，為了將VHH人源化，單域抗體的一實施例，FR殘基的一部分必須是不對應至人類抗體中的那些的殘基(C Vincke et al., The Journal of Biological Chemistry 284, 3273-3284)。可藉由ELISA、淘選等從含有單域抗體的多肽庫中獲得單域抗體。含有單域抗體的多肽庫的範例包含但不限於從各種動物或人類獲得的初始抗體庫(例如，Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)；和 Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319))，藉由各種動物的免疫來獲得的抗體庫(例如，Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536))，及從各種動物或人類的抗體基因製備的合成抗體庫(例如，Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)；Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)；和 AIDS 2016 30:11 (1691-1701))。

本文所用的「特異性結合/結合」的表示是指特異性結合分子之一在其基本上不結合至除了其一或多種結合配偶分子以外的分子的條件下，顯示結合。當抗原結合域對抗原中所含有的多個抗原決定基中的特定抗原決定基具有特異性時，也使用此表示。在抗原結合域所結合的抗原決定基是含在多種不同的抗原中的情況下，具有那抗原結合域的抗原結合分子可結合至含有此抗原決定基的各種抗原結合。

本揭露的抗原結合分子中的「細胞表面抗原結合域」可結合至存在於細胞的表面上表現的抗原的抗原決定基。「細胞表面抗原」代表由細胞表現且存在於細胞的表面上，使得抗原結合域可接近它的抗原結構。在一實施例中，本揭露的細胞液穿透抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域，因此，被特異性合併至表現細胞表面抗原的細胞(靶細胞)中。這使細胞液穿透抗原結合分子能夠特異性遞送至靶細胞。在一實施例中，可對細胞表面抗原結合域提供一或多個抗體可變域，且可為如上例示為「抗原結合域」的任何形式。

本揭露的抗原結合分子中的「細胞液抗原結合域」可結合至存在於細胞液中表現的抗原中的抗原決定基。「細胞液抗原」代表由細胞表現且存在於細胞液中的抗原結構。細胞液抗原可為蛋白質、核酸例如DNA或RNA，或在胞器例如細胞核和粒腺體中表現的分子。本揭露的細胞液抗原結合分子包含細胞液抗原結合域，因此可結合至靶細胞的細胞液中的細胞液抗原，從而中和、抑制或活化等抗原的功能。在一實施例中，對細胞液抗原結合域提供一或多個抗體可變域，且可為如上例示為「抗原結合域」的任何形式。在另一實施例中，細胞液抗原結合域可為酵素或shRNA等。

在本文中，「抗原結合分子具有改善(增強)的細胞液穿透能力(活性)」是指a) 在使抗原結合分子接觸細胞後的任意時間點，細胞的細胞液中的抗原結合分子的量增加至少1%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或500%或1000%或更多，與b) 存在於細胞的細胞液中的參考抗原結合分子在相同時間點的量相比。在一實施例中，參考抗原結合分子包括在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中所包含的CDRL1、CDRL2和CDRL3，且在CDRL2、CDRL2和CDRL3中沒有任何取代的輕鏈可變區。在一實施例中，參考抗原結合分子包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例中，當存在於細胞液中的抗原結合分子在任意時間點的量用HRP發光訊號或螢光訊號或發光訊號表示時，a) 在使抗原結合分子接觸細胞後，在任意時間點的HRP發光訊號強度或螢光訊號強度或發光訊號強度為b) 藉由參考抗原結合分子在同一時間點獲得的HRP發光訊號強度或螢光訊號強度或發光訊號強度的0.01倍或更多、0.05倍或更多、0.08倍或更多、0.1倍或更多、0.12倍或更多、0.15倍或更多、0.18倍或更多、0.2倍或更多、0.25倍或更多、0.3倍或更多、0.35倍或更多、0.4倍或更多、0.5倍或更多、0.6倍或更多、0.7倍或更多、0.8倍或更多、0.9倍或更多、1倍或更多、2倍或更多、5倍或更多、或10倍或更多。在一實施例中，當使用包含表現生物素連接酶(BirA)的細胞的方法時，可藉由HRP發光訊號來表示存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量。在一不同實施例中，當使用分裂蛋白質系統(例如參考實施例1中所述的方法)時，可藉由發光訊號來表示存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量。在一實施例中，參考抗原結合分子包括在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中所包含的CDRL1、CDRL2和CDRL3，且在CDRL2、CDRL2和CDRL3中沒有任何取代的輕鏈可變區。在一實施例中，參考抗原結合分子包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例中，當細胞液穿透抗原結合分子據說以靶細胞特異性方式遞送至細胞液中時，是指，a) 在使細胞穿透性抗原結合分子接觸靶細胞和非靶細胞後，存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量的任意時間點的非靶細胞的量是少的或顯著減少，與b) 存在於靶細胞的細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在同一時間點的量相比。在一較佳實施例中，在使細胞液穿透抗原結合分子接觸非靶細胞後，基本上未從非靶細胞的細胞液中檢測到本揭露的細胞液穿透抗原結合分子。在一較佳實施例中，細胞是衍生自Hela細胞系、CHO細胞系、MDCK細胞或HepG2細胞系的細胞，其表現或不表現細胞表面抗原。可自由選擇接觸細胞的細胞液穿透抗原結合分子的量，但上述a)的細胞液穿透抗原結合分子的量和上述b)的細胞液穿透抗原結合分子的量是相同的。細胞液穿透抗原結合分子與細胞之間的接觸可藉由任何方法進行，包含培養。

在一實施例中，在使細胞液穿透抗原結合分子與細胞接觸的時間後的0小時、0.25小時、0.5小時、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時，5小時，5.5小時，6小時，6.5小時，7小時，7.5小時，8小時，8.5小時，9小時，9.5小時，10小時，11小時，12小時，13小時，14小時、15小時和/或16小時，測量存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子的量。在使細胞液穿透抗原結合分子與細胞接觸後，可僅測定一次、或兩次或更多次存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子的量。藉由多次測定存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子的量，可觀察存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子之隨時間變化的量。

在一較佳實施例中，a) 在使細胞液穿透抗原結合分子與靶細胞和非靶細胞接觸後，存在於非靶細胞的細胞液中存在的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量是b) 存在於靶細胞的細胞液的細胞液穿透抗原結合分子在同一時間點的量的50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少、10%或更少、或5%或更少。

在一實施例中，當存在於細胞液中的抗原結合分子在任意時間點的量用HRP發光訊號或螢光訊號或發光訊號表示時，a) 在使細胞液穿透抗原結合分子接觸非靶細胞和靶細胞後，在任意時間點之藉由非靶細胞獲得的HRP發光訊號強度或螢光訊號強度或發光訊號強度為b) 藉由靶細胞在同一時間點獲得的HRP發光訊號強度或螢光訊號強度或發光訊號強度的0.5倍或更少、0.4倍或更少、0.3倍或更少、0.2倍或更少、0.1倍或更少、0.05倍或更少。在一實施例中，當使用包含表現生物素連接酶(BirA)的細胞的方法時，可藉由HRP發光訊號來表示存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量。在一不同實施例中，當使用成像分析(例如實施例4和參考實施例3中所述的方法)時，可藉由發光訊號來表示存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量。在一不同實施例中，當使用分裂蛋白質系統(例如參考實施例1中所述的方法)時，可藉由發光訊號來表示存在於細胞液中的細胞液穿透抗原結合分子在任意時間點的量。

在本發明的一工作實施例中，胜肽連接子可用於融合細胞表面抗原結合域和細胞液穿透域、細胞表面抗原結合域和細胞液抗原結合域、細胞液穿透域和細胞液抗原結合域、細胞表面抗原結合域和Fc次單元、細胞液穿透域和Fc次單元、細胞液抗原結合域和Fc次單元。此外，胜肽連接子可用於具有下述分子形式1至7的抗原結合分子中，以將一Fab區融合至另一Fab區且將Fab區融合至Fc次單元。例如，包含自由地選自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala 等的胺基酸，特別是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，特別是Gly和Ser，尤其是Gly。

本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以很容易地選擇合適的胜肽連接子，且合適的胜肽連接子可選自不同長度的那些，例如1個胺基酸(Gly等)至21個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、或3個胺基酸至12個胺基酸(例如4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸)。

胜肽連接子的範例包含但不限於甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包含例如(GS)n、(GSGGS：序列辨識號：184)n和(GGGS：序列辨識號：175)n，其中n是至少1的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和常規技術中眾所皆知的其他靈活連接子。其中，甘胺酸和甘胺酸-絲胺酸聚合物受到關注，因為這些胺基酸相對非結構化，容易在成分之間起到中性束縛作用。由甘胺酸-絲胺酸聚合物所組成的靈活連接子的範例包含但不限於， Ser Gly-Ser (GS) Ser-Gly (SG) Gly-Gly-Ser (GGS) Gly-Ser-Gly (GSG) Ser-Gly-Gly (SGG) Gly-Ser-Ser (GSS) Ser-Ser-Gly (SSG) Ser-Gly-Ser (SGS) Gly-Gly-Gly-Ser (GGGS：序列辨識號：175) Gly-Gly-Ser-Gly (GGSG：序列辨識號：176) Gly-Ser-Gly-Gly (GSGG：序列辨識號：177) Ser-Gly-Gly-Gly (SGGG：序列辨識號：178) Gly-Ser-Ser-Gly (GSSG：序列辨識號：179) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS：序列辨識號：180) Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (GGGSG：序列辨識號：181) Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (GGSGG：序列辨識號：182) Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (GSGGG：序列辨識號：183) Gly-Ser-Gly-Gly-Ser (GSGGS：序列辨識號：184) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SGGGG：序列辨識號：185) Gly-Ser-Ser-Gly-Gly (GSSGG：序列辨識號：186) Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (GSGSG：序列辨識號：187) Ser-Gly-Gly-Ser-Gly (SGGSG：序列辨識號：188) Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (GSSSG：序列辨識號：189) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGGS：序列辨識號：190) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SGGGGG：序列辨識號：191) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGGGS：序列辨識號：192) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SGGGGGG：序列辨識號：193) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS：序列辨識號：194))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SGGGG：序列辨識號：195))n [其中n是1或更大的整數] 應注意的是，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據目的適當地選擇胜肽連接子的長度和序列。

本文所述的胺基酸序列中所含有的胺基酸可進行轉譯後修飾(例如，藉由焦麩胺醯化(pyroglutamylation)將N端麩醯胺酸(glutamine)修飾為焦麩胺酸(pyroglutamic acid)是本發明所屬技術領域中具有通常知識者眾所皆知的)。自然地，具有轉譯後修飾的胺基酸的此類序列也包含在本文所述的胺基酸序列中。

B. 抗體在本揭露的另一面向中，根據上述實施例中任一者的抗原結合分子是抗體，且在一較佳實施中，是單株抗體，包含嵌合抗體、人源化抗體或人類抗體。在一實施例中，抗原結合分子是抗體片段(抗原結合片段)，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’) ₂片段。在另一實施例中，抗體是全長抗體，例如完整的IgG1抗體或本文定義的其他抗體類別或同種型的全長抗體。

在另一面向中，根據上述實施例的任一者的抗體可單獨或組合合併下述第1至7項中描述的任何特徵。

1. 抗體的結合活性和親和力在某些實施例中，本文提供的抗體的結合活性或親和力是解離常數(KD)為1 micro M或更小、100 nM或更小、10 nM或更小、1 nM或更小、0.1 nM或更小、0.01 nM或更小，或0.001 nM或更小(例如，10 ^-8M或更小，例如，10 ^-8M至10 ^-13M，且例如，10 ^-9M到10 ^-13M)。

2. 抗體片段在某些實施例中，本文提供的抗體是抗體片段。抗體片段包含但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’) ₂、Fv和scFv片段及以下描述的其他片段。對於某些抗體片段的回顧(review)，請參閱Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)。對於scFv片段的回顧，請參閱例如Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)；亦請參閱WO 93/16185；及美國專利號5,571,894和5,587,458。對於包含挽救受體結合抗原決定基殘基(salvage receptor binding epitope residue)且已增加體內半衰期的Fab和F(ab’) ₂片段的討論，請參閱美國專利號5,869,046。

雙抗體是可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位的抗體片段。參閱例如EP 404,097；WO 1993/01161； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；和Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。亦於Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)中描述三抗體(triabody)和四抗體(tetrabody)。

單域抗體是包含抗體的全部或部分重鏈可變域或全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體是人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參閱，例如美國專利號6,248,516 B1)。

可藉由各種技術包含但不限於如本文所述之完整抗體的蛋白裂解消化以及重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)的生產，來製備抗體片段。

3. 嵌合和人源化抗體在某些實施例中，本文提供的抗體是嵌合抗體。於例如美國專利號4,816,567；和Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)中描述了某些嵌合抗體。在一範例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物例如猴子的可變區)和人類恆定區。在又一範例中，嵌合抗體是其中類別或次類別已經從親本抗體的類別或次類別改變的「類別轉換(class switched)」抗體。嵌合抗體包含其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人類抗體人源化，以降低對人類的免疫原性，同時保留親本非人類抗體的特異性和結合活性。通常，人源化抗體包含一或多個可變域，其中HVR例如CDR(或其部分)衍生自非人類抗體，而FR(或其部分)衍生自人類抗體序列。人源化抗體可選地亦會包含人類恆定區的至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些FR殘基被來自非人類抗體(例如衍生自HVR殘基的抗體)的對應殘基取代，例如以恢復或改善抗體特異性或親合力。

在例如Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中回顧人源化抗體及其製造方法，且更在例如Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利號5, 821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(描述特異性決定區(specificity determining region，SDR)嫁接)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「重整(resurfacing)」)；Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (描述「FR改組(FR shuffling)」；和Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)及Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (描述FR改組的「指導選擇(guided selection)」方法)中描述。

4. 人類抗體在某些實施例中，本文提供的抗體是人類抗體。可使用本發明所屬技術領域中已知的各種技術，來產生人類抗體。在van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)中一般性地描述人類抗體。

5. 衍生自資料庫之抗體(Library-Derived Antibodies) 可藉由篩選組合庫中具有期望的活性的抗體，來單離出本發明的抗體。例如，本發明所屬技術領域中已知多種用於產生噬菌體展示庫且篩選此類資料庫中擁有期望的結合特性的抗體的方法。例如在Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)中回顧，且例如在the McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)中進一步描述此種方法。

6. 多功能抗體在某些實施例中，本文提供的抗體是多功能抗體。多功能抗體是在至少兩個不同位置具有彼此不同的功能的單株抗體。例如，多功能抗體是具有兩種功能的單株抗體，即(i) 結合特異性和(ii) 除了結合特異性以外的功能。除了結合特異性以外的功能的範例包含細胞液穿透能力。在一實施例中，多功能抗體是雙功能抗體(具有抗原結合特異性和細胞液穿透能力兩種功能)。在一實施例中，多功能抗體是多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。多特異性抗體是在至少兩個不同位點具有結合特異性的單株抗體。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。在一實施例中，多功能抗體具有對抗原的結合特異性和細胞液穿透能力。在一實施例中，多功能抗體具有對至少兩種不同抗原的結合特異性和細胞液穿透能力。

製備多特異性抗體的技術包含但不限於具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))、WO 93/08829和Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991))和「旋鈕入孔(knob-in-hole)」工程(參閱例如美國專利號5,731,168)。亦可藉由將靜電操縱效應(electrostatic steering effect) 工程化來製備抗體Fc-異質二聚體分子(WO 2009/089004A1)；交聯二或更多種抗體或片段(參閱例如美國專利號4,676,980和Brennan et al., Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸(leucine)拉鍊來產生雙特異性抗體(參閱例如Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；使用製備雙特異性抗體片段的「雙抗體」科技(參閱例如Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；且使用單鏈Fv (scFv)二聚體(參閱例如Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994))；且如例如Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)中所述地製備三特異性抗體，來製備多特異性抗體。應當理解的是，為了製備多功能抗體，可使用與上述製備多特異性抗體的技術類似的技術。

本文亦包含具有三或更多個功能性抗原結合位的工程化抗體，其包含「章魚抗體(Octopus antibody)」(參閱例如US 2006/0025576A1)。

本文的抗體或片段亦包含「雙重作用Fab (Dual Acting Fab)」或「DAF」 (例如參閱US 2008/0069820)。

7. 抗體變異體在某些實施例中，考慮了本文提供的抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能期望改善抗體的結合活性和/或其他生物學特性，例如細胞液穿透能力。可藉由將適當的修飾導入至編碼抗體的核苷酸序列中或藉由胜肽合成，來製備抗體的胺基酸序列變異體。此種修飾包含，例如抗體的胺基酸序列內殘基的缺失和/或插入和/或取代。如果最終的構建體(construct)擁有期望的特徵例如抗原結合，則可進行缺失、插入和取代的任何組合，以得到最終的構建體。

a) 取代、插入和缺失變異體在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代的抗體變異體。感興趣的取代突變誘發的位置包含HVR和FR。在表1的「較佳取代」標題下顯示出保守取代。在表1的「示例性取代」的標題下提供了更多實質的變化，且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步描述。可將胺基酸取代導入至感興趣的抗體中，且篩選具有期望的活性的產物，例如保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

[表1]

可根據常見的側鏈特性將胺基酸分組： (1) 疏水性：正白胺酸(Norleucine)、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈方向的殘基：Gly、Pro； (6) 芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代會需要將其中一個類別的成員交換成另一個類別。

一種類型的取代變異體涉及取代親本抗體(例如人源化或人類抗體)的一或多個高度可變區殘基。通常，相對於親本抗體，選來用於進一步研究的所得變異體會在某些生物學特性方面具有修飾(例如增加的結合活性、降低的免疫原性)和/或大抵上會保留親本抗體的某些生物學特性。示例性取代的變異體是結合活性成熟的抗體，其可例如使用基於噬菌體展示的結合活性成熟技術例如本文所述的那些方便地產生。簡而言之，將一或多個HVR殘基突變，且在噬菌體上展示變異體抗體並篩選特定的生物活性(例如結合親合力)。

可在HVR中進行改變(例如取代)，例如以改善抗體親合力。這樣的改變可在HVR「熱點」中進行，即由在體細胞成熟過程中以高頻發生突變的密碼子所編碼的殘基(參閱例如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008))、和/或與抗原接觸的殘基，其中測試所得的變異體VH或VL的結合親合力。例如，在Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))中，已描述了藉由構建和從二級庫中再選擇而產生的親合力成熟。在親合力成熟的一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中的任一者，將多樣性導入至被選來成熟的可變基因中。然後創建二級庫。然後篩選此資料庫以鑑定出具有期望的親合力的任何抗體變異體。將多樣性導入的另一方法涉及HVR定向方法，其中幾個HVR殘基(例如一次4至6個殘基)是隨機的。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或建模，來特異性地鑑定出涉及抗原結合的HVR殘基。特別經常以CDR-H3和CDR-L3為目標。

在某些實施例中，可在一或多個HVR內發生取代、插入或缺失，只要這樣的改變大抵上不降低抗體結合抗原的能力。例如，可在HVR中進行大抵上不降低結合活性的保守改變(例如，本文提供的保守取代)。這樣的改變可例如在HVR中的抗原接觸殘基之外。在上文提供的變異VH和VL序列的某些實施例中，每個HVR未被改變，或含有不超過一、二或三個胺基酸取代。

如Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述，用於鑑定可靶向為突變誘發的抗體的殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」。在此方法中，鑑定出目標殘基或一群目標殘基(例如帶電殘基，例如arg、asp、his、lys和glu)，且用中性或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)替換，以確定抗體與抗原的交互作用是否受到影響。可在對初始取代展現出功能敏感性的胺基酸位置將其它取代導入。替代地或額外地，可分析抗原-抗體複合體的晶體結構，以鑑定出抗體和抗原之間的接觸點。這樣的接觸殘基和鄰近殘基可被靶向或消除作為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否含有期望的特性。

胺基酸序列插入包含從一個殘基至含有一百或更多個殘基的多肽的長度範圍內的胺基和/或羧基端融合，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。端插入的範例包含具有N端甲硫醯基殘基的抗體。抗體分子的其他插入變異體包含酵素(例如用於ADEPT)或增加抗體的血漿半衰期的多肽融合至抗體的N或C端。

b) 糖基化變異體在某些實施例中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體糖基化的程度。可藉由改變胺基酸序列來方便地實現對抗體中糖基化位的添加或缺失，以產生或去除一或多個糖基化位。

當抗體包含Fc區時，與其相連的碳水化合物可被改變。由哺乳類細胞所產生的天然抗體通常包含通常經N-鏈接(linkage)連接至Fc區的CH2域的Asn297的分支的雙觸角寡糖。參閱例如Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包含各種碳水化合物例如，甘露糖(mannose)、N-乙醯葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及在雙觸角寡糖結構的「主幹(stem)」中連接至GlcNAc的岩藻糖(fucose)。在一些實施例中，可對本發明的抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善的特性的抗體變異體。

在一實施例中，提供了具有缺少(直接或間接)連接至Fc區的岩藻糖的碳水化合物結構的抗體變異體。例如，此類抗體中的岩藻糖量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。例如，如WO 2008/077546中所述，相對於藉由MALDI-TOF質譜法來測量的連接至Asn 297的所有糖結構(例如，複合、混合(hybrid)和高甘露糖結構)的總和，藉由計算在Asn297的糖鏈內的岩藻糖平均量，來確定岩藻糖量。Asn297是指位於Fc區中約第297位的天冬醯胺酸(asparagine)殘基(Fc區殘基的EU編號)；然而，由於抗體中的微小序列變化，Asn297也可位於約第297位的上游或下游約+/- 3個胺基酸，即在第294和300位之間。這樣的岩藻糖基化變異體可具有改善的ADCC功能。參閱例如，美國專利公開號US 2003/0157108 (Presta, L.)；和US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏的」抗體變異體有關的公開物的範例包含：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體的細胞系的範例包含缺乏蛋白質岩藻糖基化的Lec13 CHO細胞(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請號US 2003/0157108 A1, Presta, L；和WO 2004/056312 A1, Adams et al.,尤其是實施例11)、及敲除細胞系例如alpha-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、敲除CHO細胞(參閱例如，Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；和WO2003/085107)。

更對抗體變異體提供一分為二的寡糖，例如其中連接至抗體的Fc區的雙觸角寡糖被GlcNAc一分為二。這樣的抗體變異體可具有減少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。例如於WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.)；美國專利號6,602,684 (Umana et al.)；和US 2005/0123546 (Umana et al.)中所述的此種抗體變異體的範例。亦提供了在寡糖中具有至少一個連接至Fc區的半乳糖殘基的抗體變異體。這樣的抗體變異體可具有改善的CDC功能。例如於WO 1997/30087 (Patel et al.)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；和WO 1999/22764 (Raju, S.)中描述此類抗體變異體。

c) Fc區變異體在某些實施例中，一或多個胺基酸改變可導入至本文提供的抗體的Fc區，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。

在某些實施例中，本揭露考慮擁有一些但不是全部效應子功能的抗原結合分子，這使其成為其中抗體的體內半衰期很重要但某些效應子功能(例如 ADCC)是不必要的或有害的應用的理想候選物。可進行體外和/或體內細胞毒性測定，以測量CDC和/或ADCC活性。例如，可進行Fc受體(FcR)結合測定，以確認抗體是否具有Fc gamma R結合(因此可能具有ADCC活性)和/或 FcRn結合能力。調控ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表現Fc gamma RIII，而單核細胞表現Fc gamma RI、Fc gamma RII和Fc gamma RIII。在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)的第 464 頁的表3中總結造血幹細胞上的FcR表現。美國專利號5,500,362 (參閱例如Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059- 7063 (1986))和Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參閱Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))。或者，可使用非放射性測定法(參閱例如，流式細胞術的ACT1 ^TM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；和 CytoTox 96 (註冊商標)非放射性細胞毒性測定(Promega, Madison, WI)。用於此類測定的有用的效應子細胞包含週邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 和自然殺手(Natural Killer，NK) 細胞。替代地或另外地，例如，可在例如Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998)揭露的動物模型中，體內評價感興趣的分子的ADCC活性。也可進行Clq結合測定以確認抗體是否能夠結合Clq，因此具有CDC活性。參閱例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c結合ELISA。為了評價補體活化，可進行 CDC測定(參閱例如，Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；和Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。例如使用熱滅活的血清或補體成分耗盡的血清之用於評價病毒感染性的補體依賴性裂解或補體依賴性降低的已知方法也可用於評價Clq結合/補體活化。也可使用本發明所屬領域中已知的方法(參閱例如，Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))，來進行FcRn結合和體內清除率/半衰期的確定。

包含具有減弱的效應子功能的抗體包含在Fc區殘基238、265、269、270、297、327和329 (美國專利號6,737,056)中的一或多處具有取代的那些抗體。此種Fc突變體包含在第265、269、270、297和327位胺基酸中的二或更多處具有取代的Fc突變體，包含將殘基265和297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利號7,332,581)。

描述了與FcR結合增加或減少的某些抗體變異體。(參閱例如，美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312和Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。)

在某些實施例中，抗體變異體包含具有改善ADCC的一或多個胺基酸取代的Fc區，例如在Fc區的第298、333和/或334位的取代(殘基的EU編號)。

在一些實施例中，例如如美國專利號6,194,551、WO 99/51642及Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所述，在Fc區中進行導致C1q結合和/或補體依賴性細胞毒殺性(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)改變(即增加或減少)的改變。

在US2005/0014934A1 (Hinton et al.)中描述具有增加的半衰期和增加的對新生兒Fc受體(FcRn)的結合的抗體，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))。那些抗體包含於其中具有一或多個增加Fc區與FcRn結合的取代的Fc區。此類Fc變異體包含在一或多個Fc區殘基處具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434的取代(美國專利號7,371,826)。

亦參閱Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；和關於Fc區變異體的其他範例的WO 94/29351。

d) 經半胱胺酸工程化的抗體變異體在某些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸工程化的抗體，例如「thioMAb」，其中抗體的一或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代的殘基發生在抗體的可接近位置。藉由用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基因此定位於抗體的可接近位置，且可用於將抗體偶聯至其他部分例如藥物部分或連接子-藥物部分，以產生免疫偶聯物，如本文進一步所述。在某些實施例中，可用半胱胺酸取代以下任一或多個殘基：輕鏈的V205 (Kabat編號)；重鏈的A118 (EU編號)；和重鏈Fc區的S400 (EU編號)。可如例如美國專利號7,521,541中所述地，產生經半胱胺酸工程化的抗體。

e) 抗體衍生物在某些實施例中，本文提供的抗體可被進一步修飾，以含有本發明所屬技術領域中已知且容易獲得的額外非蛋白質部分。適合抗體衍生化的部分包含但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性範例包含但不限於聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙二醇(ethylene glycol)/聚丙二醇(propylene glycol)的共聚物、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)、葡聚糖(dextran)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚-1,3-二氧戊環(poly-1,3-dioxolane)、聚-1,3,6-三惡烷(poly-1,3,6-trioxane)、乙烯(ethylene)/馬來酸酐(maleic anhydride)共聚物、聚胺基酸(polyaminoacid)(同質聚合物或無規共聚物(random copolymer))和葡聚糖(dextran)或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇(poly(n-vinyl pyrrolidone)polyethylene glycol)、聚丙二醇同質聚合物(polypropylene glycol homopolymer)、聚環氧丙烷(polypropylene oxide)/環氧乙烷(ethylene oxide)共聚物、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyol)(例如甘油)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)及前述之混合物。聚乙二醇丙醛(polyethylene glycol propionaldehyde)由於在水中的穩定性而在製造中可能具有優勢。聚合物可為任何分子量，且可為支鏈或無支鏈的。連接至抗體的聚合物的數量可以變化，且如果連接多於一種聚合物，則它們可為相同或不同的分子。通常可基於以下考慮因素，包含但不限於待改善的抗體的特定特性或功能、抗體衍生物是否會用於在定義的條件下的治療中等，來確定用於衍生化的聚合物的數量和/或類型。

在另一實施例中，提供了可藉由暴露於輻射而選擇性加熱之抗體和非蛋白質部分的偶聯物。在一實施例中，非蛋白質部分是碳奈米管(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可為任何波長，且包含但不限於不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死鄰近抗體-非蛋白質部分的細胞的溫度的波長。

C. 重組方法及組合物可使用重組方法和組合物來產生抗體，例如如美國專利號4,816,567中所述。在一實施例中，提供了編碼本文所述之抗抗原結合分子的單離核酸。這樣的核酸可編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。在又一實施例中，提供了包含此類核酸的一或多種載體(例如表現載體)。在又一實施例中，提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經用以下所述轉形)：(1) 載體，其包含編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和包含抗體的VH的胺基酸序列的核酸、或(2) 第一載體，其包含編碼包含抗體的VL的胺基酸序列的核酸及第二載體，其包含編碼包含抗體的VH的胺基酸序列的核酸。在一實施例中，宿主細胞是真核的，例如中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或類淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp2/0細胞)。在一實施例中，提供了一種製備本揭露的抗原結合分子的方法，其中此方法包含在適合表現抗體的條件下，培養包含如上所述之包含編碼抗體的核酸的宿主細胞，和可選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。

為了重組產生本揭露的抗原結合分子，將例如如上所述之編碼抗體的核酸單離，且將其插入至一或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖和/或表現。可使用常規流程(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)輕易地將此類核酸單離和定序。

當本揭露的抗原結合分子為抗體時，用於選殖或表現編碼抗體的載體的合適宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是在不需要糖基化和Fc效應子功能時。對於在細菌中表現抗體片段和多肽，參閱例如，美國專利號5,648,237、5,789,199和5,840,523。 (亦參閱Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254，其描述了在大腸桿菌中表現抗體片段。)表現之後，可從細菌細胞糊的可溶級分中單離出抗體，且可進一步純化。

除了原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母菌，也是抗體編碼載體的合適選殖或表現宿主，包含其糖基化路徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而產生具有部分或完全人類糖基化模式的抗體。參閱Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。

用於表現糖基化抗體的合適宿主細胞也衍生自多細胞有機體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的範例包含植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株(baculoviral strain)，其可與昆蟲細胞結合使用，特別是用於節食斜紋夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda cell)的轉染。

植物細胞培養物也可作為宿主。參閱例如美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429 (描述了在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIES ^TM科技)。

脊椎動物細胞也可作為宿主。例如，適應在懸浮液中生長的哺乳類細胞可能是有用的。有用的哺乳類宿主細胞系的其他範例是由SV40 (COS-7)轉形的猴腎CV1系；人類胚胎腎細胞系(293或293細胞，如Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述)；嬰兒倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠史托利細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，例如Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76);人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK);水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562); TRI細胞，例如Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5細胞；和FS4細胞。其他有用的哺乳類宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，其包含DHFR ^-CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；和骨髓瘤細胞系例如Y0、NS0和Sp2/0。適合產生抗體的某些哺乳類宿主細胞系的回顧，參閱例如Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)。

D. 測定法可藉由本發明所屬技術領域中各種已知的測定法，來鑑定、篩選或特徵化(characterize)本文提供的抗原結合分子的物理/化學特性和/或生物活性。

1. 結合活性和親合力的測量在一實施例中，為了測量抗體的結合活性或親合力，使用用BIACORE (註冊商標)T200或BIACORE (註冊商標)4000 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，其依賴於表面電漿共振分析法作為測量原理的配體捕捉方法。BIACORE (註冊商標)控制軟體用於裝置的操作。在一實施例中，根據製造商的說明書，使用胺偶聯試劑組(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，以使用於配體捕捉的分子例如抗標籤抗體、抗IgG抗體、蛋白A等固定在塗佈有羧甲基葡聚醣(carboxymethyldextran)的感測晶片(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)上。在適當的pH值下用10 mM乙酸鈉溶液來稀釋捕捉配體的分子，且以適當的流速和適當的注入時間來注入。使用含有0.05%聚山梨酯20(其它名稱為Tween(註冊商標)-20)的緩衝液作為測量緩衝液，以10-30微升/分鐘的流速，且在較佳地在25度C或37度C的測量溫度下，來測量結合活性。對於用被捕捉配體的分子所捕捉的抗體作為配體來進行的測量，將抗體注入以使目標量的抗體被捕捉，然後將使用測量緩衝液製備的抗原和/或Fc受體(分析物)的系列稀釋液注入。對於藉由使配體捕獲分子捕獲作為配體的抗體來進行的測量，將抗體注入以捕獲目標量的抗體，然後將使用測量緩衝液來製備的系列稀釋抗原和/或Fc受體(分析物)注入。對於藉由使配體捕獲分子捕獲作為配體的抗體和/或Fc受體來進行的測量，將抗體和/或Fc受體注入以捕獲目標量之前述配體，然後將使用測量緩衝液來製備的系列稀釋抗原(分析物)注入。

在一實施例中，使用BIACORE (註冊商標)評估軟體來分析測量結果。例如，藉由使用1：1結合模型來同時擬合結合和解離的感測圖，以進行動力學參數分析，且可計算結合速率(kon或ka)、解離速率(koff或kd)和平衡解離常數(KD)。對於弱結合活性的情況，特別是對於解離快且動力學參數難以計算的情況，可使用穩定態模型來計算平衡解離常數(KD)。作為關於結合活性的額外參數，可藉由將特定濃度下的分析物的結合量(共振單位：RU)除以經捕捉的配體的量，來計算「每單位配體量的分析物的結合量」。

2. 細胞液中的抗原結合分子的測量在一實施例中，在使抗原結合分子接觸細胞接觸之後，在任意時間點測量細胞液中的抗原結合分子。可藉由包含培養的任何方法，來實現抗原結合分子與細胞之間的接觸。當藉由培養使抗原結合分子接觸細胞時，培養的持續時間及培養之後和細胞液中之抗原結合分子的測量之前的時間段是任意選擇的。例如，在使存在於細胞液內的抗原結合分子接觸細胞後僅測量一次的情況下，將抗原結合分子與細胞培養1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時，在那之後，去除含有抗原結合分子的培養基，且可立即測定細胞液中的抗原結合分子。例如，在使存在於細胞液內的抗原結合分子接觸細胞後測量二或更多次的情況下，將抗原結合分子與細胞培養1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時，在那之後，去除含有抗原結合分子的培養基，使用不含抗原結合分子的新培養基進行另外的培養0小時、0.25小時、0.5小時、1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、6.5小時、7小時、7.5小時、8小時、8.5小時、9小時、9.5小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時和/或16小時，然後可測量細胞液中的抗原結合分子。藉由在使抗原結合分子接觸細胞接觸後，檢測任意時間點的細胞液中的抗原結合分子，也可檢測或評價抗原結合分子的細胞液穿透能力。因此可理解的是，本揭露還提供了一種檢測抗原結合分子的細胞液穿透能力的方法。

a) BirA測定在一實施例中，可藉由使用標記的生物素結合蛋白質，來檢測生物素化的Avi標籤和抗原結合分子的融合，以在BirA測定中評估存在於細胞液中的抗原結合分子在任意時間點的量。使用抗生物素蛋白-過氧化酶偶聯物和適當的基質，來測量生物素標記的Avi標籤。例如，當使用鏈黴親和素-HRP來檢測生物素化的Avi標籤時，可用HRP發光訊號強度來表示存在於細胞液中的抗原結合分子的量。BirA測定是本發明所屬技術領域中具有通知識者中廣為人知的方法，且例如在 W.P.R. Verdurmen et al., Journal of Controlled Release 200 (2015) 13-22和本揭露的實施例中描述。用於確定存在於細胞液中的抗原結合分子的量的測定的條件可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇，因此沒有特別限制。可進一步用可檢測或測量的另一標記物質，來標記生物素化的Avi標籤與細胞液中的抗原結合分子的融合。具體地，放射性標記和螢光標記是已知的。可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者中已知的方法，適當地檢測BirA測定中標記的生物素結合蛋白質(例如，在鏈黴親和素-HRP的情況下檢測HRP發光訊號)。具體地，已知西方墨點法或毛細管免疫測定法(ProteinSimple，Inc.)等。

b) 螢光顯微鏡成像在另一實施例中，可藉由使用結合至抗原結合分子的標記蛋白質來檢測，以評價存在於細胞液中的抗原結合分子在任意時間點的量。例如，當抗原結合分子包含IgG抗體時，可使用標記的抗IgG抗體，來檢測存在於細胞液中的抗原結合分子。關於標記，例如放射性標記和螢光標記是已知的。可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法，來適當地檢測標記的抗原結合分子。例如，可藉由使用螢光顯微鏡對螢光訊號進行成像，來檢測標記的抗原結合分子，如本文和本揭露的實施例中所述。

c) 分裂GFP 在另一實施例中，可藉由檢測分裂-GFP互補系統中的GFP螢光訊號，來評估存在於細胞液中的抗原結合分子在任意時間點的量。具體方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知的且例如於WO 2016/013870中所述。具體地，當綠色螢光蛋白質(green fluorescent protein，GFP)被分裂為片段1-10和片段11時，去除GFP的顯示螢光的特徵，但如果這兩個片段靠近且互相結合，則可恢復顯示螢光的特徵(Cabantous et al., 2005)。為了利用這一點，在細胞液中表現GFP1-10的片段，且GFP11的片段融合至抗原結合分子上的任意位點。如果在此方法中觀察到GFP螢光，則顯示出兩個GFP片段結合在一起，即抗原結合分子存在於細胞液中。

d) 改善的分裂蛋白質系統在另一實施例中，可藉由檢測分裂蛋白質系統中的發光和/或螢光訊號，來評估存在於細胞液中的抗原結合分子在任意時間點的量。在一實施例中，分裂蛋白質系統包含(i) 包含粒腺體外膜蛋白質和發光蛋白質的第一片段的胜肽，和(ii) 發光蛋白質的第二片段，其中發光蛋白質的第一片段和第二片段為一起含有發光蛋白質的完整補體。在分裂蛋白質系統中，發光蛋白質的第一片段和第二片段不具有發光的特徵，但當胜肽中所包含的發光蛋白質的第一片段結合至第二片段時，恢復發光特徵。報導了使用Nanoluc互補，來評估細胞液穿透能力的方法(Schaub et al., Cancer Res. (2015) 75(23):5023, Dixon et al., ACS Chem Biol. (2016) 11(2):400)，但這些方法的背景發光和/或螢光訊號仍然很高。鑑於這些，在一實施例中，本發明人得出了在分裂蛋白質系統中使用粒腺體外膜蛋白質，以降低背景訊號的想法。

在一實施例中，分裂發光蛋白質是分裂NanoLuc(註冊商標)。 NanoLuc是一種由深海發光蝦工程化而成之19kDa的小型螢光素酶。分裂 NanoLuc測定利用被切割成兩個次單元的NanoLuc—一個小的1.3kDa的BiT (SmBiT)(序列辨識號：202)和一個較大的18kDa的BiT (LgBiT)(序列辨識號：203)。藉由使用NanoLuc Live Cell Assay System (Promega)，在活細胞中觀察到作為來自基質上的酵素反應之發光LgBiT和SmBiT的互補。在分裂NanoLuc測定中，HeLa細胞經過基因修飾以在細胞內穩定表現NanoLuc LgBiT。通常，NanoLuc LgBiT可表示為游離的細胞液蛋白質。然而，在一實施例中，當NanoLuc LgBiT束縛於細胞液內的胞內結構時，例如粒腺體外膜。本發明人驚訝地發現，與NanoLuc LgBiT以游離細胞液蛋白質表示時相比，NanoLuc LgBiT與粒腺體外膜的束縛導致顯著較低的背景訊號和更好的測定靈敏度。另一方面，SmBiT偶聯物可融合至抗原結合分子上的任意位點。較佳地，抗原結合分子是抗體且發光蛋白質的第二片段融合至抗體的重鏈的C端。抗原結合分子-SmBiT偶聯物穿透進入細胞液中，從而與NanoLuc LgBiT互補形成螢光素酶，其可藉由增強發光來檢測。

在一範例中，本揭露提供了改善的分裂蛋白質系統，其包含(i) 包含粒腺體外膜蛋白質和發光蛋白質的第一片段的胜肽，和(ii) 發光蛋白質的第二片段，其中發光蛋白質的第一片段和第二片段一起含有發光蛋白質的完整補體。在另一範例中，本揭露提供了用於改善的分裂蛋白質系統的胜肽，其中胜肽包含粒腺體外膜蛋白質和發光蛋白質的第一片段，且其中發光蛋白質的第一片段和第二片段一起含有發光蛋白質的完整補體。

發光蛋白質的第一片段的一範例是NanoLuc Large BiT (LgBiT)。發光蛋白質的第二片段的一範例是NanoLuc SmBiT (SmBiT)。在另一實施例中，包含粒腺體外膜蛋白質和發光蛋白質的第一片段的胜肽更包含綠色螢光蛋白質(GFP)或其變異體。較佳地，包含粒腺體外膜蛋白質、發光蛋白質的第一片段和GFP變異體的胜肽包含序列辨識號：196的胺基酸序列。

在改善的分裂蛋白質系統中使用的粒腺體外膜蛋白質可為位於粒腺體外膜上的任何蛋白質。粒腺體外膜蛋白質可為例如，AKAP1、BAK1、FIS1、CYB5B、FISS、FUNDC1、GDAP1、MARC1、MARC2、MFN1、MFN2、MFN3、MIEF1、MIEF2、MID49、MID51、MIGA1、MIGA2、MIRO1、MIRO2、MSTO1、MTX1、MTX2、MTX3、PGAM5、PLD6、RAB32、RMDN3、SYNJ2BP、TOM5、TOM6、TOM7、TOM20、TOM22、TOM34、TOM70、TSPO和/或UBP30。在一較佳實施例中，粒腺體外膜蛋白質是額外的粒腺體激酶錨定蛋白質1 (AKAP1；亦稱為A-激酶錨定蛋白質1)。在一較佳實施例中，粒腺體外膜蛋白質包含序列辨識號：197的胺基酸序列。在一較佳實施例中，包含發光蛋白質的第一片段的胜肽包含序列辨識號：196的胺基酸序列(AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit)。

在一實施例中，本揭露提供了編碼包含粒腺體外膜蛋白質和螢光蛋白質的第一片段的胜肽的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述核酸或所述載體的細胞、或包含所述蛋白質、核酸、載體或細胞的套組(kit)。在又一實施例中，本揭露提供了一種用於檢測存在於細胞液中的靶分子的方法，其包括(i) 提供包含編碼包含粒腺體外膜蛋白質和螢光蛋白質的第一片段的胜肽的核酸的細胞，(ii) 提供與螢光蛋白質的第二片段偶聯的靶分子，(iii) 使(i)的細胞接觸(ii)的靶分子，且(iv) 檢測(iii)的細胞中的發光訊號，其中螢光蛋白質的第一片段和第二片段一起含有螢光蛋白質的完整補體。與除了(i)的胜肽不包含粒腺體外膜蛋白質之外的都相同的方法相比，本文提供的方法具有較低的背景發光訊號。在一較佳實施例中，靶分子是細胞液穿透抗原結合分子。

在另一實施例中，在改善的分裂蛋白系統中，可使用位於細胞液內的任何胞內結構上的任何蛋白質代替粒腺體外膜蛋白質。位於胞內結構上的蛋白質的一範例是核外膜蛋白質，且核外膜蛋白質可為位於核外膜上的任何蛋白質。核外膜蛋白質可為例如NUP37、NUP43、NUP96、NUP85、NUP88、NUP107、NUP133、NUP160、NUP214和/或NUP358。

E. 產生抗原結合分子的方法、篩選抗原結合分子的方法和使細胞液抗原成像的方法 1. 產生抗原結合分子的方法在一面向中，本揭露提供了產生本揭露的抗原結合分子的方法。

在一實施例中，產生方法包含： (a) 獲得包含編碼抗原結合分子的基因和可操作地連接的合適啟動子的表現載體， (b) 將載體導入至宿主細胞且培養宿主細胞以產生抗原結合分子，及 (c) 從宿主細胞培養物中回收抗原結合分子。

在一實施例中，方法更包含： (d) 獲得包含編碼所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段的基因和可操作地連接的合適啟動子的表現載體； (e) 將載體導入至宿主細胞且培養宿主細胞以產生細胞液穿透抗體或其抗原結合片段；及 (f) 從宿主細胞培養物中回收細胞液穿透抗體或其抗原結合片段。

在另一實施例中，產生方法包含： (a) 提供親本細胞液穿透抗原結合分子； (b) 在親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區中之選自CDRL1和CDRL3的至少一者中導入一或多個胺基酸取代；及 (c) 鑑定和/或選擇包含一或多個胺基酸取代的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，與親本細胞液穿透抗原結合分子相比，前述一或多個胺基酸取代表現出增強的細胞液穿透能力。在一較佳實施例中，親本細胞液穿透抗原結合分子包括包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區。在另一較佳實施例中，親本細胞液穿透抗原結合分子包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。

在一實施例中，導入至親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區中的一或多個胺基酸取代位於序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中的Kabat編號第24至34和89至97位。在一較佳實施例中，一或多個胺基酸取代位於序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中的Kabat編號第24至32和93至97位。

在一實施例中，導入至親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區中的一或多個胺基酸取代選自由下述所組成的群組(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) 用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y取代第24位的胺基酸K； (b) 用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y取代第25位的胺基酸S； (c) 用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V取代第26位的胺基酸S； (d) 用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y取代第27位的胺基酸Q； (e) 用D取代第27a位的胺基酸S； (f) 用I、P、Q、T或V取代第27b位的胺基酸L； (g) 用A、D、E、I、M、N、S、W或Y取代第27c位的胺基酸 F； (h) 用A、D、E、F、H、N或Q取代第27d位的胺基酸N； (i) 用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y取代第27e位的胺基酸S； (j)用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y取代第27f位的胺基酸R； (k) 用E、H、I、Q、S、V、W或Y取代第28位的胺基酸T； (l) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第29位的胺基酸R； (m) 用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第30位的胺基酸K； (n) 用D、M、S或T取代第31位的胺基酸N； (o) 用D、E、G、H或Q取代第32位的胺基酸Y； (p) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (q) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (r) 用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W取代第93位的胺基酸Y； (s) 用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第94位的胺基酸H； (t) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第95位的胺基酸M； (u) 用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V取代第96位的胺基酸Y；及 (v) 用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V取代第97位的胺基酸T。

在一實施例中，與不具有所述取代且包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的參考抗體或其片段相比，導入至親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區的一或多個胺基酸取代增強抗體或其片段的細胞液穿透活性。

在一實施例中，導入至親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區中的一或多個胺基酸取代選自由下述所組成的群組(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4所示的胺基酸序列中， (a) 用N取代第24位的胺基酸K； (b) 用E取代第27位的胺基酸Q； (c) 用D取代第27a位的胺基酸S； (d) 用D或E取代第27d位的胺基酸N； (e) 用D或E取代第27e位的胺基酸S； (f) 用D、H、K、L、S或V取代第27f位的胺基酸R； (g) 用D取代第28位的胺基酸T； (h) 用E、G、M或S取代第29位的胺基酸R； (i) 用L或Q取代第30位的胺基酸K； (j) 用E取代第32位的胺基酸Y； (k) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (l) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (m) 用E取代第93位的胺基酸Y； (n) 用E、P或Q取代第94位的胺基酸H； (o) 用D、N或P取代第95位的胺基酸M；及 (p) 用E或P取代第96位的胺基酸 Y。

在一實施例中，導入至親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區的一或多個胺基酸取代包含選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組的胺基酸取代的組合： (a) S27eD/R27fK； (b) S27eD/R27fH； (c) N27dE/S27eD； (d) S27eD/T28D； (e) S27eD/R29E； (f) S27eD/R29S； (g) K24N/S27eD； (h) N27dD/R27fK； (i) N27dE/R27fK； (j) R27fK/T28D； (k) R27fK/R29E； (l) R27fK/R29S； (m) K24N/R27fK； (n) K24N/N27dD； (o) N27dD/T28D； (p) N27dD/R29E； (q) N27dD/R29S； (r) S27eD/Q89H； (s) N27dD/Q89H； (t) R27fK/Q89H； (u) S27eD/Y91E； (v) N27dD/Y91E； (w) R27fK/Y91E； (x) Q89H/H94P； (y) Y91E/H94P； (z) H94P/M95N； (aa) H94P/M95D； (bb) H94P/M95P； (cc) H94E/Y96P； (dd) H94E/M95N； (ee) H94E/M95D； (ff) H94E/M95P； (gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P； (hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P； (ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P； (ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P； (mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P； (nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P； (oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P； (pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P； (qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P； (rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P； (ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P； (tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P； (uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P； (vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P； (ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P； (xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P； (zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P； (aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q； (fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q； (ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P； (lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P； (nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P； (ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P； (ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P； (qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P； (rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P； (sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；及 (ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。

在一實施例中，方法更包含用人類框架區(FR)取代輕鏈可變區的框架區(FR)。

在一實施例中，方法更包含根據Kabat編號，用I取代第2位的胺基酸L，和/或用Q取代第3位的胺基酸V。

在一較佳實施例中，輕鏈可變區的FR1序列被人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa3 FR1序列取代，更佳地被人類V kappa 1 FR1序列取代。在一較佳實施例中，輕鏈可變區的FR2序列被人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa3 FR2序列取代，更佳地被人類V kappa 1 FR2序列取代。在一較佳實施例中，輕鏈可變區的FR3序列被人類V kappa 1、V kappa 2或V kappa3 FR3序列取代，更佳地被人類V kappa 3 FR3序列取代。在一實施例中，輕鏈可變區包含人類V kappa 1 FR1、人類V kappa 1 FR2和人類V kappa 3 FR3序列。

在一實施例中，具有改善的細胞液穿透能力的抗體的輕鏈可變區包括在序列辨識號：123中所包含的FR結構域(FR1、FR2、FR3和FR4)中的一、二、三或四。

在一實施例中，方法更包含在親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區的CDRL2中導入一、二、三或更多個胺基酸取代。在一較佳實施例中，在CDRL2中導入的取代係選自由下述(根據 Kabat 編號的位置)所組成的群組：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的CDRL2中， (a) 用A、G、I、T或V取代第50位的胺基酸W； (b) 用F或I取代第52位的胺基酸S； (c) 用N或Y取代第53位的胺基酸T；及 (d) 用K或V取代第54位的胺基酸R。

在一較佳實施例中，導入至親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區的一或多個胺基酸取代包含選自由下述(根據Kabat編號的位置)所組成的群組的胺基酸取代的組合：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的CDRL2中， (a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q； (b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q； (c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q； (d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q； (e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q； (f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q； (g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q； (h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q； (i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q； (j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q； (k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q； (l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；及 (m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。

在一實施例中，所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包含具有選自由序列辨識號：14-150和161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一實施例中，所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包含具有選自由序列辨識號：123-150所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一實施例中，所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包含具有選自由序列辨識號：161-173所組成的群組的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一實施例中，產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段以Fab或scFv的形式存在。在一實施例中，所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段更包含重鏈可變區。

2. 篩選細胞液穿透抗原結合分子的方法在一面向中，本揭露提供了篩選細胞液穿透抗原結合分子的方法。在一實施例中，篩選方法包含： (a) 提供包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的親本細胞液穿透抗原結合分子； (b) 在親本細胞液穿透抗原結合分子的輕鏈可變區中之選自CDRL1和CDRL3的至少一者中導入一或多個胺基酸取代；及 (c) 鑑定和/或選擇包含一或多個胺基酸取代的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，與親本細胞液穿透抗原結合分子相比，前述一或多個胺基酸取代表現出增強的細胞液穿透能力。

在一實施例中，方法更包含： (c) 獲得包含編碼所產生的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段的基因和可操作地連接的合適啟動子的表現載體； (d) 將載體導入至宿主細胞且培養宿主細胞，以產生細胞液穿透抗體或其抗原結合片段；及 (e) 從宿主細胞培養物中回收細胞液穿透抗體或其抗原結合片段。

3. 細胞液抗原的成像方法在另一面向中，本揭露提供對細胞液抗原進行成像的方法，包含使用本揭露的抗原結合分子、藉由上述產生方法產生的抗原結合分子、或藉由上述篩選方法鑑定為合適的分子的細胞液穿透抗原結合分子。在另一面向中，本揭露提供本揭露的抗原結合分子、藉由上述產生方法產生的抗原結合分子、或藉由上述之用於將樣品細胞中的細胞液抗原成像的篩選方法鑑定為合適分子的細胞液穿透抗原結合分子。在又一面向中，本揭露提供本揭露的抗原結合分子、藉由上述產生方法產生的抗原結合分子、或藉由上述之在將細胞液抗原成像的試劑的製造中的篩選方法鑑定為合適分子的細胞液穿透抗原結合分子。在這些面向的某些實施例中，要使用的抗原結合分子是標記的。

F. 免疫偶聯物本揭露亦提供了包含本文之與生物活性分子偶聯的抗原結合分子的免疫偶聯物。在一實施例中，生物活性分子選自由胜肽、蛋白質、毒素、抗體、抗體片段、RNA、DNA、小分子藥物、奈米顆粒和脂質體所組成的群組。在一實施例中，免疫偶聯物包含本文中之與一或多種細胞毒殺劑例如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活性毒素或其片段)偶聯的抗原結合分子或放射性同位素。

G. 將抗原結合分子特異性遞送至靶細胞的細胞液中的方法和增強細胞液穿透抗原結合分子的細胞液穿透能力的方法在一面向中，本揭露提供了將抗原結合分子特異性遞送至靶細胞的細胞液中的方法，在此方法中，抗原結合分子所結合的細胞表面抗原是特異性在靶細胞上表現的抗原。在一實施例中，此方法包含使抗原結合分子接觸靶細胞。在一實施例中，抗原結合分子是多功能抗原結合分子，其包含細胞液穿透抗體或抗體片段、結合至細胞表面抗原或抗體片段的抗體和/或結合至細胞液抗原或抗體片段的抗體的組合。在某一實施例中，上述方法基本上不將抗原結合分子遞送至不表現細胞表面抗原的細胞。在某一實施例中，抗原結合分子結合至對靶細胞特異性的細胞表面抗原，從而被靶細胞特異性內化且轉移至細胞液中。在某一實施例中，抗原結合分子形成多聚體，且顯示出高的細胞液穿透能力。在另一面向中，本揭露提供了與親本細胞液穿透抗原結合分子相比增強細胞液穿透抗原結合分子的細胞液穿透能力的方法，此方法包含將一或多個用於增強多聚體形成的胺基酸改變導入至Fc區，親本細胞液穿透抗原結合分子包括不包含一或多個胺基酸改變的親本Fc區。

在另一面向中，本揭露提供一種將異源部分特異性遞送至靶細胞的細胞液中的方法，其中異源部分偶聯至抗原結合分子，前述抗原結合分子包含細胞表面抗原結合域和細胞液穿透域。較佳地，抗原結合分子包含第一和第二Fab區，其中(a) 第一Fab區特異性結合至細胞表面抗原，及(b) 第二Fab區具有細胞液穿透能力，且其中抗原結合分子偶聯至異源部分。更佳地，抗原結合分子是雙功能抗體且不包含細胞液抗原結合域。在一實施例中，抗原結合分子所結合的細胞表面抗原是特異性在靶細胞上表現的抗原。在一實施例中，此方法包含使偶聯至異源部分的所述抗原結合分子接觸靶細胞。在一較佳實施例中，此方法包含將異源部分特異性遞送至靶細胞的細胞液中。在一較佳實施例中，此方法基本上不將異源部分遞送至不表現細胞表面抗原的細胞。

H. 靶向細胞液抗原的方法在某一實施例中，本揭露的抗原結合分子具有提高之去除或抑制靶細胞中細胞液抗原的能力。因此，本文提供的抗原結合分子於在蛋白質程度上剔除靶細胞中的細胞液抗原是有用的。本文使用的術語「剔除(knock down)」是指某種蛋白質的表現量或豐富度降低。具體地，當細胞液抗原在蛋白質程度上被剔除時，每細胞的細胞液抗原量會減少。在另一某實施例中，本揭露的抗原結合分子具有提高的活化靶細胞中細胞液抗原的能力。

I. 用於診斷和檢測的方法和組合物在某實施例中，本文提供的抗原結合分子於檢測生物樣品中之靶細胞中的細胞液抗原的存在是有用的。本文使用的術語「檢測(detection)/檢測(detecting)」涵蓋定量或定性檢測。

在一實施例中，提供了用於診斷方法或檢測方法的抗原結合分子。在另一面向中，提供了檢測生物樣品中之靶細胞中的細胞液抗原的存在的方法。在某實施例中，此方法包含在允許抗原結合分子結合至細胞液抗原的條件下，使本文所述的抗原結合分子與生物樣品結合，且檢測抗原結合分子和細胞液抗原之間是否形成複合物。此種方法可為體外方法或體內方法。在一不同實施例中，本揭露的抗原結合分子對於藉由成像或此類方法，來檢測細胞溶質抗原是有用的。

在某些實施例中，提供了本揭露之標記的抗原結合分子。標記包含但不限於直接檢測的標記或部分(例如螢光、發色團、電子緻密、化學發光和放射性標記)，及間接檢測的部分例如透過酵素反應或分子交互作用，例如酵素或配體。示例性標記包含但不限於放射性同位素 ³²P、 ¹⁴C、 ¹²⁵I、 ³H和 ¹³¹I、螢光團例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯基(dansyl)、繖形酮(umbelliferone)、螢光素酶(luceriferase)例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)、螢光素(luciferin)、2,3-二氫鄰苯二甲二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、beta-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、溶菌酶(lysozyme)、醣類氧化酶(saccharide oxidase)例如葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)、與使用過氧化氫來氧化染料前體例如HRP、乳過氧化物酶(lactoperoxidase)或微過氧化物酶(microperoxidase))的酵素偶聯的雜環氧化酶(heterocyclic oxidase)例如尿酸酶(uricase)和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定的自由基等等。

J. 醫藥製劑藉由將具有期望純度的抗體與一或多種可選之醫藥上可接受的載劑混合，來製備出凍乾製劑或水溶液形式的本文所述的抗原結合分子的醫藥製劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。醫藥上可接受的載劑通常在所採用的劑量和濃度下對受體無毒，且包含但不限於：緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包含抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；六甲基氯化銨(hexamethonium chloride)；氯化苯索寧(benzalkonium chloride)；苯酚(phenol)、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環己醇(cyclohexanol)；3-戊醇和間甲酚(m-cresol))；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽的相對離子例如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。本文中的示例性醫藥上可接受的載劑更包含間質藥物分散劑(interstitial drug dispersion agent)，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein，sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20 (HYLENEX(註冊商標), Baxter International, Inc.)。在美國專利公開號2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包含rHuPH20。在一面向中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺聚醣酶(glycosaminoglycanase) 組合例如軟骨素酶(chondroitinase)。

在美國專利號6,267,958中描述示例性凍乾抗體製劑。水性抗體製劑包含美國專利號6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，後者的製劑包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

本文的製劑亦可含有超過一種之對所治療的特定適應症所需的活性成分，較佳為具有不會互相不利影響的互補活性的那些。此種活性成分適當地以對預期目的有效的量組合存在。

活性成分可被包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面製備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳劑、奈米顆粒和奈米膠囊)中或大乳劑中的羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)或明膠-微膠囊(gelatin-microcapsule)和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊(poly-(methylmethacrylate) microcapsule)。於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中揭露此類技術。

可製備持續釋放製品。持續釋放製品的合適範例包含含有抗體的固體疏水性聚合物的半透性基質，此基質為定型物品的形式，例如膜或微膠囊。

用於體內投予的製劑通常是無菌的。例如藉無菌濾膜來過濾，可輕易地實現無菌。

K. 治療方法和組合物在一面向中，本文提供的抗原結合分子可用於治療方法。在一實施例中，提供了作為醫藥的本揭露的抗原結合分子。在某些實施例中，提供了用於治療方法的本揭露的抗原結合分子。在這些實施例之一者中，此方法更包含對對象投予有效量的至少一額外治療劑的步驟(例如，如下文描述的那些)。根據任何上述實施例的「對象」較佳為人類。

在另一面向中，本揭露提供了本揭露的抗原結合分子在藥物的製造或製備中的用途。在此種實施例之一者中，此方法更包含對對象投予有效量的至少一額外治療劑的步驟(例如，如下文描述的那些)。根據任何上述實施例的「對象」較佳為人類。

在另一面向中，本揭露提供了，例如用於任何上述治療方法中之包含本文提供的抗原結合分子中的任一者的醫藥製劑。在一實施例中，醫藥製劑包含本文提供的抗原結合分子中的任一者和醫藥上可接受的載體。在另一實施例中，醫藥製劑包含本文提供的抗原結合分子中的任一者和至少一額外治療劑。

可藉由任何合適的方法包括腸胃外(parenteral)、肺內和鼻內且如果需要局部治療，則病灶內(intralesional)投予，來投予本揭露的抗原結合分子(和任何額外治療劑)。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹腔內或皮下投予。可藉由任何合適的途徑例如藉由注射例如靜脈內或皮下注射來給藥，部分取決於投予是短暫或長期。本文考量到了各種給藥時程，包含但不限於在各個時間點上的單次或多次投予、推注投予和脈衝輸注。

本揭露的抗原結合分子將以與良好醫學實踐一致的方式配製、給藥和投予。在此上下文中考慮的因素包含所治療的特定病症、所治療的特定哺乳動物、個別病人的臨床狀況、病症的原因、試劑的遞送位置、投予方法、投予時間表及其他醫學從業人員已知的因素。抗原結合分子不需要，但可選地與目前用來預防或治療所討論的病症的一或多個試劑一起配製。這些其他試劑的有效量取決於製劑中所存在的抗原結合分子的量、病症或治療的類型及上面討論的其他因素。這些通常以與本文所述相同的劑量和施用途徑使用，或以本文所述的劑量的約1-99％，或以經驗/臨床確定為適當的任何劑量和任何途徑使用。通常以與本文所述相同的劑量和投予途徑、或以本文所述的劑量的約1至99%、或以經驗/臨床確定為合適的任何劑量和任何途徑使用來使用這些。

為了預防或治療疾病，本揭露的抗原結合分子的適當劑量(當單獨或與一或多個其他其他治療劑聯合使用時)將取決於要治療的疾病類型、抗體類型當本揭露的抗原結合分子為抗體時、疾病的嚴重程度和病程、是否出於預防或治療目的而投予抗原結合分子、先前的治療、病人的臨床病史和對抗原結合分子的反應及主治醫師的判斷力。可一次或透過一系列的治療，來將抗原結合分子適當地投予至病人。根據疾病的類型和嚴重程度，不論是例如，藉由一或多次分開投予、或藉由連續注入，約1 micro g/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg -10 mg/kg)的抗原結合分子可為投予至病人的初始候選劑量。取決於上述因素，一種典型的每日劑量可在約1 micro g/k至100 mg/kg或更大的範圍。對於幾天或更長時間的重複投予，取決於病情，持續治療通常會持續到出現發生所需的疾病症狀抑制。抗原結合分子的一示例性劑量會在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg的範圍。因此，可將一或多劑量的約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)投予至病人。可間歇地投予這樣的劑量，例如每週或每三週(例如使病人接受約二至約二十劑，或例如約六劑抗原結合分子)。可以給予較高的初始加載劑量，然後投予一或多個較低的劑量。然而，其他給藥方案可能是有用的。藉由常規技術和測定法可容易地監測此療法的進展。

應理解的是，可使用本發明的免疫偶聯物代替抗C1s抗體或除抗C1s抗體之外，還使用本發明的免疫偶聯物，來進行任何上述製劑或治療方法。

L. 製品在本揭露的另一面向中，提供了含有對上述失調(disorder)的治療、預防和/或診斷有用的材料的製品。製品包含容器和在容器上的標籤或與容器有關的仿單。合適的容器包含例如瓶子、小玻璃瓶(vial)、注射器(syringe)、IV溶液袋等。容器可由多種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器容納組成物本身或與對治療、預防和/或診斷狀況有效之另一組成物組合的組成物，且可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可藉由皮下注射針頭刺穿的瓶塞的玻璃瓶)。組成物中的至少一種活性成分是本揭露的抗原結合分子。標籤或仿單指出組成物用於治療所選狀況。此外，製品可包含：(a)含有組成物於其中的第一容器，其中組成物包含本揭露的抗原結合分子；和(b)含有組成物於其中的第二容器，其中組成物包含另外的細胞毒殺或其它治療劑。在本揭露的此實施例中的製品可更包含指示組合物可用於治療特定狀況的仿單。或者或此外，製品可更包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受的緩衝液例如注射用的抑菌水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸鹽緩衝食鹽水(phosphate-buffered saline)、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液(dextrose solution)。其可更包含其他商業和用戶的所需的材料，包含其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。

應理解的是，上述任何製品均可包含本揭露的免疫偶聯物來代替抗原結合分子，或除了抗原結合分子之外還包含本揭露的免疫偶聯物。 [範例]

以下是本發明的方法和組成物的實施例。應理解的是，鑑於以上所提供的一般性描述，可實踐各種其他實施例。

儘管出於清楚理解的目的，已經藉由圖式和範例的方式詳細地描述了前述發明，但是這些描述和範例不被視為限制本發明的範圍。本文引用的所有專利和科學文獻的揭露內容明確地全文引入作為參考。

實施例1：改善親本輕鏈可變區(VL) hT4VL.FRv4的細胞液運輸能力和抗體表現程度的綜合誘變(mutagenesis)方法本發明提供了細胞液穿透抗體，特別是與先前報導的細胞液穿透抗體h3D8相比，特別是與WO2016013870中揭露的h3D8的VL (即hT4VL)相比具有改善的細胞質滲透能力的輕鏈可變區(VL)；且證實抗原結合分子或抗體具有改善之對細胞質的滲透能力。

本發明人先將hT4VL (序列辨識號：174) 的每個框架(FR)轉化為表2中列出的人類V kappa 1或V kappa 3種系序列(germline sequence)。因此，就表現產量、單一SEC峰揭示的聚集特徵(aggregation profile)和細胞液穿透活性的組合之進一步改善而言，最終選擇與hT4VL的區別僅在於具有人類V kappa 3 (VK3) FR3的hT4VL.FRv4 (序列辨識號：4)作為最佳VL候選物。隨後，選擇hT4VL.FRv4 (序列辨識號：4)作為親本VL，以將除了半胱胺酸外的胺基酸修飾全面(comprehensively)導入至CDRL1和CDRL3中的所有位置，以找到可改善細胞液運輸能力和抗體表現程度的突變。將編碼VL變異體的基因與輕鏈恆定區(KT0，序列辨識號：12)組合且使用 Expi293細胞系 (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)與重鏈表現載體(3D8H-SG1. SmBiTb，序列辨識號：13)一起瞬時表現。藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法進行表現和純化。變異體的表現程度總結在表3中。與具有hT4VL.FRv4的親本抗體相比，表現程度提高的變異體以粗體顯示。為了評估細胞液運輸能力，如參考實施例1中所述地，本發明人進行分裂Nanolu (Split Nluc)測定。 [表2] hT4VL的框架變異體的列表

設計名稱	FR1	FR2	FR3	序列辨識號
hT4VL.FRv1	VK3	VK1	VK1	1
hT4VL.FRv2	VK3 (I2L, L4M)	VK1	VK1	2
hT4VL.FRv3	VK1 (I2L, Q3V)	VK3	VK1	3
hT4VL.FRv4	VK1 (I2L, Q3V)	VK1	VK3	4
hT4VL.FRv5	VK3	VK3	VK1	5
hT4VL.FRv6	VK3 (I2L, L4M)	VK3	VK1	6
hT4VL.FRv7	VK3	VK1	VK3	7
hT4VL.FRv8	VK3 (I2L, L4M)	VK1	VK3	8
hT4VL.FRv9	VK3	VK3	VK3	9
hT4VL.FRv10	VK3 (I2L, L4M)	VK3	VK3	10
hT4VL.FRv11	VK1 (I2L, Q3V)	VK3	VK3	11
hT4VL	VK1 (I2L, Q3V)	VK1	VK1	174

[表3]

[表4]

實施例2：具有改善hT4VL.FRv4的細胞液穿透力和其他特性的胺基酸突變的變異體基於實施例1的結果，選擇多個變異體以導入進一步胺基酸突變(表5)且測試Ab表現程度、細胞液運輸能力和胞外基質(ECM)結合。具有低ECM結合的抗體被認為更有利，因為高ECM結合可能使抗體藥物動力學較差(US2014/0080153)。如參考實施例2中所述地進行ECM結合研究。在表5和表6-1和6-2中總結結果。與親本抗體 hT4VL.FRv4相比，具有更好抗體表現水平、更高的分裂Nanoluc訊號和較低的ECM結合的變異體以粗體顯示。酸性殘基(D或E)似乎在第27、27a、27d、27e和28位(Kabat編號)更好，第27f位(Kabat編號)的離胺酸或絲胺酸，以及在第94位(Kabat編號)的脯胺酸或麩醯胺酸似乎在各自的位置是很好的胺基酸殘基。重要的是，表6-1和6-2中列出的大多數組合變異體顯示出比親本Ab (hT4VL.FRv4)更好的數據。與其他組合相比，特別是突變組合S27eD/R27fK、N27dE/R27fK、N27dD/Q89H、R27fK/Y91E、H94E/M95P、N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P、N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P、N27dE/R27fS/Q H94E/M95P、N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P、S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P、S27eD/R27fK/Y91F/H94Q 和 S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P (Kabat編號)顯示更高的分裂Nluc訊號，同時顯示低ECM結合。 [表5] 選擇的變異體的單一胺基酸突變

結構域名稱	突變	Ab表現程度(mg/mL)	分裂Nluc (倍數變化vs親本Ab)	ECM結合vs對照Ab (pH7.4)	ECM結合vs對照Ab (pH5.8)	序列辨識號
hT4VL.FRv40010	K24N	0.57	1.45	8.4	102.3	14
hT4VL.FRv40057	Q27E	0.66	1.35	9.0	103.4	15
hT4VL.FRv40074	S27aD	0.52	1.29	6.8	96.1	16
hT4VL.FRv40128	N27dD	0.91	1.43	4.7	36.3	17
hT4VL.FRv40129	N27dE	1.03	1.52	6.7	59.3	18
hT4VL.FRv40146	S27eD	1.37	1.39	5.3	61.6	19
hT4VL.FRv40147	S27eE	1.34	1.42	5.6	75.8	20
hT4VL.FRv40164	R27fD	1.29	1.24	1.3	12.3	21
hT4VL.FRv40168	R27fH	1.32	1.34	5.1	97.0	22
hT4VL.FRv40170	R27fK	0.93	1.31	8.5	92.9	23
hT4VL.FRv40171	R27fL	1.13	1.40	2.9	28.1	24
hT4VL.FRv40176	R27fS	1.14	1.56	3.3	35.4	25
hT4VL.FRv40178	R27fV	1.03	1.51	2.6	27.7	26
hT4VL.FRv40182	T28D	1.19	1.46	5.2	34.5	27
hT4VL.FRv40201	R29E	1.06	1.27	3.5	58.2	28
hT4VL.FRv40203	R29G	1.15	1.46	5.3	90.2	29
hT4VL.FRv40208	R29M	0.78	1.33	5.2	80.1	30
hT4VL.FRv40212	R29S	1.16	1.52	6.1	93.9	31
hT4VL.FRv40224	K30L	0.48	1.45	8.6	76.9	32
hT4VL.FRv40228	K30Q	0.73	1.23	7.7	63.7	33
hT4VL.FRv40255	Y32E	0.71	1.30	4.5	31.3	34
hT4VL.FRv40312	Q89H	0.79	1.16	14.0	100.3	35
hT4VL.FRv40313	Q89I	0.44	1.02	14.5	102.0	36
hT4VL.FRv40321	Q89T	0.45	1.14	19.3	101.9	37
hT4VL.FRv40324	Q89Y	0.72	1.29	14.0	98.1	38
hT4VL.FRv40345	Y91E	0.95	1.15	9.6	97.2	39
hT4VL.FRv40346	Y91F	0.53	1.30	16.3	99.2	40
hT4VL.FRv40353	Y91N	0.54	1.21	15.2	101.4	41
hT4VL.FRv40381	Y93E	0.94	1.36	7.3	97.4	42
hT4VL.FRv40399	H94E	0.98	1.40	8.6	53.1	43
hT4VL.FRv40407	H94P	1.01	1.28	13.1	81.3	44
hT4VL.FRv40408	H94Q	0.94	1.44	15.9	93.8	45
hT4VL.FRv40416	M95D	0.80	1.29	10.4	95.9	46
hT4VL.FRv40424	M95N	0.66	1.35	11.0	98.2	47
hT4VL.FRv40425	M95P	0.77	1.25	12.1	98.5	48
hT4VL.FRv40435	Y96E	0.95	1.24	15.0	97.8	49
hT4VL.FRv40444	Y96P	0.71	1.26	14.9	96.4	50
hT4VL.FRv4	親本	0.51	1.00	15.5	99.1	4

[表6-1] 具有二或更多個胺基酸突變的組合的變異體

結構域名稱	突變	Ab表現程度(mg/mL)	分裂Nluc (倍數變化vs親本Ab)	ECM結合vs對照Ab (pH7.4)	ECM結合vs對照Ab (pH5.8)	序列辨識號
hT4VL.FRv40469	S27eD,R27fK	0.40	1.41	3.34	33.93	51
hT4VL.FRv40470	S27eD,R27fH	0.84	1.15	2.85	49.64	52
hT4VL.FRv40471	N27dE,S27eD	0.86	1.18	2.50	18.21	53
hT4VL.FRv40472	S27eD,T28D	0.82	1.07	1.97	10.01	54
hT4VL.FRv40473	S27eD,R29E	0.77	1.15	1.46	15.09	55
hT4VL.FRv40474	S27eD,R29S	1.44	1.16	2.69	25.90	56
hT4VL.FRv40475	K24N,S27eD	1.08	1.19	3.84	49.04	57
hT4VL.FRv40476	N27dD,R27fK	0.81	1.15	2.95	17.91	58
hT4VL.FRv40477	N27dE,R27fK	0.82	1.31	3.73	30.43	59
hT4VL.FRv40478	R27fK,T28D	0.85	1.23	3.41	18.57	60
hT4VL.FRv40479	R27fK,R29E	1.06	1.23	1.90	18.35	61
hT4VL.FRv40480	R27fK,R29S	0.68	1.26	3.38	42.51	62
hT4VL.FRv40481	K24N,R27fK	0.80	1.19	6.21	73.82	63
hT4VL.FRv40482	K24N,N27dD	0.94	1.16	2.83	22.08	64
hT4VL.FRv40483	N27dD,T28D	1.04	1.22	2.11	11.05	65
hT4VL.FRv40484	N27dD,R29E	1.31	0.98	1.07	10.43	66
hT4VL.FRv40485	N27dD,R29S	1.29	1.27	2.36	13.09	67
hT4VL.FRv40486	S27eD,Q89H	1.16	1.17	6.00	46.28	68
hT4VL.FRv40487	N27dD,Q89H	0.72	1.40	6.94	31.78	69
hT4VL.FRv40488	R27fK,Q89H	0.70	1.20	9.74	74.48	70
hT4VL.FRv40489	S27eD,Y91E	1.08	1.26	3.92	53.76	71
hT4VL.FRv40490	N27dD,Y91E	1.67	1.21	4.37	33.26	72
hT4VL.FRv40491	R27fK,Y91E	0.98	1.32	6.17	69.49	73
hT4VL.FRv40492	Q89H,H94P	1.17	1.28	12.43	64.97	74
hT4VL.FRv40493	Y91E,H94P	1.42	1.22	11.25	66.06	75
hT4VL.FRv40494	H94P,M95N	1.15	1.21	10.37	59.58	76
hT4VL.FRv40495	H94P,M95D	1.04	1.11	12.88	47.53	77
hT4VL.FRv40496	H94P,M95P	1.12	1.16	10.82	62.82	78
hT4VL.FRv40497	H94E,Y96P	1.06	1.20	8.21	37.46	79
hT4VL.FRv40498	H94E,M95N	1.06	1.28	7.71	44.04	80
hT4VL.FRv40499	H94E,M95D	1.33	1.30	6.90	41.94	81
hT4VL.FRv40500	H94E,M95P	1.10	1.41	7.03	60.03	82
hT4VL.FRv4	親本	0.63	1.00	13.05	71.42	4

[表6-2] 具有二或更多個胺基酸突變的組合的變異體

結構域名稱	突變	Ab表現程度(mg/mL)	分裂Nluc (倍數變化vs親本Ab)	ECM結合vs對照Ab (pH7.4)	ECM結合vs對照Ab (pH5.8)	序列辨識號
hT4VL.FRv40501	N27dE,R27fK,Q89H ,H94E,M95P	0.80	1.41	1.04	7.52	83
hT4VL.FRv40502	N27dE,R27fK,Q89Y,H94E,M95P	0.74	1.77	1.65	19.26	84
hT4VL.FRv40503	N27dE,R27fK,Y91E,H94E,M95P	0.89	1.37	1.10	14.14	85
hT4VL.FRv40504	N27dE,R27fK,Y91F,H94E,M95P	0.92	1.41	1.57	12.86	86
hT4VL.FRv40505	N27dE,R27fS,Q89H,H94E,M95P	0.87	1.08	0.66	4.21	87
hT4VL.FRv40506	N27dE,R27fS,Q89Y,H94E,M95P	0.97	1.36	1.04	11.59	88
hT4VL.FRv40507	N27dE,R27fS,Y91E,H94E,M95P	1.09	0.86	0.77	8.26	89
hT4VL.FRv40508	N27dE,R27fS,Y91F, H94E,M95P	0.96	1.14	0.78	5.73	90
hT4VL.FRv40509	N27dE,R27fS,Q89H,H94Q,M95P	0.99	1.38	1.02	6.26	91
hT4VL.FRv40510	N27dE,R27fS,Q89Y, H94Q,M95P	1.20	1.51	1.70	17.72	92
hT4VL.FRv40511	N27dE,R27fS,Y91E,H94Q,M95P	1.32	0.98	1.14	13.05	93
hT4VL.FRv40512	N27dE,R27fS,Y91F, H94Q,M95P	1.13	1.32	1.21	8.43	94
hT4VL.FRv40513	N27dE,R27fV,Q89H,H94E,M95P	0.76	0.94	0.63	3.49	95
hT4VL.FRv40514	N27dE,R27fV,Q89Y,H94E,M95P	0.82	1.12	1.23	12.97	96
hT4VL.FRv40515	N27dE,R27fV,Y91E,H94E,M95P	1.09	0.86	0.85	11.88	97
hT4VL.FRv40516	N27dE,R27fV,Y91F,H94E,M95P	0.93	1.12	0.86	6.99	98
hT4VL.FRv40517	N27dE,R29S,Q89H, H94E,M95P	0.66	1.08	0.85	3.34	99
hT4VL.FRv40518	N27dE,R29S,Q89Y, H94E,M95P	0.94	1.13	1.32	8.30	100
hT4VL.FRv40519	N27dE,K30L,Q89H, H94E,M95P	0.91	1.11	1.51	4.80	101
hT4VL.FRv40520	N27dE,K30L,Q89Y,H94E,M95P	0.81	1.18	2.36	7.03	102
hT4VL.FRv40521	S27eD,R27fK,Y91E,H94E,M95P	1.01	1.11	1.15	17.89	103
hT4VL.FRv40522	S27eD,R27fK,Y91F,H94E,M95P	0.89	1.01	1.95	17.00	104
hT4VL.FRv40523	S27eD,R27fK,Y91E,H94Q,M95P	1.28	1.28	2.57	30.18	105
hT4VL.FRv40524	S27eD,R27fK,Y91F,H94Q,M95P	1.16	1.44	3.20	26.77	106
hT4VL.FRv40525	S27eD,R27fK,Y91E,H94Q	1.22	1.41	2.41	24.81	107
hT4VL.FRv40526	S27eD,R27fK,Y91F,H94Q	0.98	1.45	2.83	15.70	108
hT4VL.FRv40527	S27eE,R27fK,Y91E,H94E,M95P	1.03	0.98	1.51	18.54	109
hT4VL.FRv40528	S27eE,R27fK,Y91F,H94E,M95P	1.21	1.25	2.11	18.23	110
hT4VL.FRv40529	S27eE,R27fK,Y91E,H94Q,M95P	1.19	1.08	2.35	26.72	111
hT4VL.FRv40530	S27eE,R27fK,Y91F,H94Q,M95P	1.13	1.43	3.49	28.07	112
hT4VL.FRv40531	R27fS,R29S,Q89H,H94E,M95P	1.09	0.59	0.43	1.41	113
hT4VL.FRv40532	R27fS,R29S,Q89Y,H94E,M95P	0.99	0.64	0.58	6.44	114
hT4VL.FRv40533	R27fS,R29S,Y91E,H94E,M95P	1.06	0.62	0.44	2.36	115
hT4VL.FRv40534	R27fS,R29S,Y91F,H94E,M95P	0.97	0.79	0.48	1.80	116
hT4VL.FRv40535	R27fS,R29S,Q89H,H94Q,M95P	1.16	0.84	0.49	2.14	117
hT4VL.FRv40536	R27fS,R29S,Q89Y,H94Q,M95P	1.10	0.82	0.70	15.71	118
hT4VL.FRv40537	R27fS,R29S,Y91E,H94Q,M95P	1.00	0.63	0.51	2.87	119
hT4VL.FRv40538	R27fS,R29S,Y91F, H94Q,M95P	1.33	0.56	0.72	3.84	120
hT4VL.FRv40539	N27dE,R27fS,R29S,Q89Y,H94Q,M95P	1.10	1.00	1.27	10.29	121
hT4VL.FRv40540	N27dE,R27fS,R29S,Y91F,H94Q,M95P	1.25	0.60	1.03	4.09	122
hT4VL.FRv4	親本	0.68	1.00	11.96	91.86	4
hT4VL	hT4VL (原始)	0.40	1.22	14.22	86.07	174

實施例3：具有FR1突變的變異體在先前的報導中，hT4VL是在人類VK1的FR1中具有兩個非人類種系殘基(對應至小鼠VK1的FR1第2位的白胺酸和第3位的纈胺酸)的人源化VL，其中第2位的小鼠殘基白胺酸被報導為細胞液運輸活性所需要的 (Dong-Ki Choi et al., mAbs 6:6, 1402--1414; November/December 2014; WO2016013870)。在本案的實施例1和實施例2中，在FR重新選擇的期間，使用相同的修飾人類VK1 FR1。

選擇實施例2中鑑定的28個變異體，以將第2位的白胺酸取代為異白胺酸(L2I)及第3位的纈胺酸取代為麩醯胺酸(V3Q)額外導入至FR1中(即，將小鼠殘基回復突變(back mutation)為對應的人類VK1 FR1殘基))，使得變異體具有野生型人類種系VK1 FR1序列(表 7)。我們設想這種具有完全人類VK1 FR1的抗體變異體更接近人類種系，因此具有較低的免疫原性風險。評估了表7中所示的變異體的Ab表現程度、細胞液運輸能力、ECM結合及尺寸排阻層析(size-exclusion chromatography，SEC)數據。

對於每個變異體，使用UPLC (Acquity H-Class bio, Waters)藉由尺寸排阻層析(SEC)分析，來評估聚集特徵。使用50 mM 磷酸鹽/300 mM NaCl (pH 7.0)作為運行緩衝液(running buffer)，而BEH200管柱 (Waters, #186005225)作為分析管柱。藉由220 nM UV吸收來記錄層析圖(chromatogram)。使用Empower3軟體(Waters)來處理數據，且計算單體峰的單體峰百分比和半峰全寬。高單體峰百分比和尖銳對稱峰形(窄峰寬)被認為是具有良好的物理化學性質。在表7中總結SEC分析結果(與原始hT4VL相比，顯示出更好數據的變異體以粗體顯示)。原始hT4VL的單體峰百分比低於70%，且由於其不對稱峰形而無法計算峰寬，而表7中列出的所有突變變異體均顯示出更好的單體峰百分比和更尖銳的峰形，如圖1中所示。

值得注意的是，與需要VK1 FR1的非人類種系殘基來保持其細胞液運輸能力的hT4VL的情況相比，具有L2I/V3Q突變的變異體(對應至野生型完全人類VK1 FR1序列)出乎意料地表現出改善的或強的細胞液運輸能力(表7)、及改善的Ab表現程度、較低的ECM結合及更好的SEC (尺寸排阻層析)數據。

基於所有結果，選擇hT4VL.FRv40563 (L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91F/ H94Q，序列辨識號：145)作為模板抗體(template antibody)用於進一步的CDRL2最佳化。作為對CDRL2區進行了全面誘變的結果，與模板抗體相比，許多突變(例如W50A/G/I/T/V、S52F/I、T53N/Y、R54K/V及那些組合)顯著地改善分裂Nluc訊號，同時保持低 ECM 結合(表 8)。 [表7] 所選之具有FR1突變的28個變異體(L2I/V3Q)

結構域名稱	突變	Ab表現程度(mg/mL)	分裂Nluc (倍數變化vs原始hT4VL)	ECM結合vs對照Ab (pH7.4)	ECM結合vs對照Ab (pH5.8)	SEC單體峰%	SEC峰寬@50%	SEC保留時間	序列辨識號
hT4VL.FRv40541	L2I/V3Q/N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P	1.20	1.33	1.81	20.5	98.4	0.15	4.00	123
hT4VL.FRv40542	L2I/V3Q/N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P	1.22	1.08	2.64	38.5	98.8	0.16	4.03	124
hT4VL.FRv40543	L2I/V3Q/N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P	1.35	1.13	2.49	32.0	98.6	0.20	4.08	125
hT4VL.FRv40544	L2I/V3Q/N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P	1.26	1.32	2.86	33.0	98.5	0.19	4.07	126
hT4VL.FRv40545	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P	1.42	1.14	1.28	8.6	97.4	0.14	4.00	127
hT4VL.FRv40546	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P	1.55	1.00	1.54	22.3	98.2	0.14	4.02	128
hT4VL.FRv40547	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P	1.59	1.04	1.51	21.1	98.1	0.14	4.02	129
hT4VL.FRv40548	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P	1.52	1.21	1.92	12.2	97.8	0.14	4.02	130
hT4VL.FRv40549	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P	1.24	1.14	2.58	27.8	98.3	0.14	4.05	131
hT4VL.FRv40550	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P	1.88	1.23	2.12	27.7	98.6	0.15	4.05	132
hT4VL.FRv40551	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P	1.63	1.25	2.19	24.1	98.3	0.15	4.03	133
hT4VL.FRv40552	L2I/V3Q/N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P	1.55	0.91	2.02	24.0	98.2	0.14	4.05	134
hT4VL.FRv40553	L2I/V3Q/N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P	1.70	1.04	1.84	25.8	98.1	0.15	4.07	135
hT4VL.FRv40554	L2I/V3Q/N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P	1.34	0.85	1.15	7.2	97.7	0.14	3.98	136
hT4VL.FRv40555	L2I/V3Q/N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P	1.63	1.08	1.98	19.5	98.3	0.14	4.01	137
hT4VL.FRv40556	L2I/V3Q/N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P	1.23	0.90	2.49	8.3	96.8	0.14	4.00	138
hT4VL.FRv40557	L2I/V3Q/N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P	1.28	1.09	2.65	9.6	98.2	0.14	4.04	139
hT4VL.FRv40558	L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P	1.57	1.28	2.31	46.2	98.7	0.21	4.07	140
hT4VL.FRv40559	L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P	1.28	1.30	2.40	41.9	98.7	0.21	4.08	141
hT4VL.FRv40560	L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P	1.29	1.12	3.13	56.7	98.8	0.25	4.14	142
hT4VL.FRv40561	L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P	1.41	1.37	3.83	59.1	98.9	0.25	4.14	143
hT4VL.FRv40562	L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91E/H94Q	1.40	1.23	2.03	31.1	98.8	0.23	4.10	144
hT4VL.FRv40563	L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91F/H94Q	1.62	1.38	3.01	25.1	98.8	0.21	4.08	145
hT4VL.FRv40564	L2I/V3Q/S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P	1.90	1.18	2.65	42.5	98.6	0.21	4.07	146
hT4VL.FRv40565	L2I/V3Q/S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P	1.75	1.43	2.62	39.7	98.6	0.22	4.09	147
hT4VL.FRv40566	L2I/V3Q/S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P	1.69	1.29	3.24	50.0	98.8	0.27	4.15	148
hT4VL.FRv40567	L2I/V3Q/S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P	1.55	1.30	3.81	49.2	98.9	0.26	4.15	149
hT4VL.FRv40568	L2I/V3Q/N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P	1.18	0.94	1.76	11.8	97.4	0.14	4.01	150
hT4VL.FRv4	親本	1.15	0.89	9.89	79.7	90.8	0.28	4.04	4
hT4VL	原始	0.57	1.00	11.29	72.7	66.9		4.50	174

[表8] 在hT4VL.FRv40563的CDRL2區中具有進一步突變的變異體

結構域名稱	突變	Ab表現程度(mg/mL)	分裂Nluc (倍數變化vs原始hT4VL)	ECM結合vs對照Ab (pH7.4)	ECM結合vs對照Ab (pH5.8)	SEC單體峰%	SEC峰寬@50%	序列辨識號
hT4VL.FRv40569	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50A,Y91F,H94Q	1.07	1.48	2.70	23.0	92.37	0.182807	161
hT4VL.FRv40573	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50G,Y91F,H94Q	1.56	1.27	3.13	20.9	99.19	0.17619	162
hT4VL.FRv40575	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50I,Y91F,H94Q	1.39	1.41	3.83	19.0	99.48	0.188645	163
hT4VL.FRv40584	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50T,Y91F,H94Q	1.53	1.34	3.46	24.1	99.12	0.1945	164
hT4VL.FRv40585	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50V,Y91F,H94Q	1.10	1.60	3.64	21.4	99.39	0.276359	165
hT4VL.FRv40608	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,S52F,Y91F,H94Q	0.91	1.04	3.91	17.8	99.22	0.185157	166
hT4VL.FRv40611	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,S52I,Y91F,H94Q	1.22	1.14	3.66	19.3	98.92	0.200182	167
hT4VL.FRv40633	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,T53N,Y91F,H94Q	1.73	1.40	4.08	18.7	98.69	0.279574	168
hT4VL.FRv40640	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,T53Y,Y91F,H94Q	1.44	1.19	5.01	22.4	98.61	0.295898	169
hT4VL.FRv40648	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,R54K,Y91F,H94Q	1.41	1.15	3.12	13.4	98.88	0.19084	170
hT4VL.FRv40696	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50I,S52F,Y91F,H94Q	0.97	1.15	3.98	18.0	99.92	0.30921	171
hT4VL.FRv40697	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50I,T53N,Y91F,H94Q	1.21	1.32	4.40	16.8	93.43	0.682695	172
hT4VL.FRv40698	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,W50I,R54V,Y91F,H94Q	1.22	1.20	2.23	8.6	99.34	0.145848	173
hT4VL.FRv40563	L2I,V3Q,S27eD,R27fK,Y91F,H94Q (模板)	1.45	1.05	3.64	16.0	98.93	0.271813	145
hT4VL	原始	1.55	1.00	13.71	69.2	68.08	N.A.	174

實施例4：包含細胞液穿透域和細胞表面抗原結合域的雙功能抗體的製備；和ASGPR表現細胞系中的雙功能抗體的細胞液運輸的成像分析嘗試從實施例3中鑑定的細胞液穿透抗體和針對細胞表面抗原的抗體構建雙功能和多價抗體，以便以細胞表面抗原依賴性方式，將雙功能抗體特異性遞送至靶細胞的細胞液，如WO2020022262中所報導。

進行成像分析，來以受體依賴性方式評估雙功能抗體的細胞液穿透能力。使用Expi293細胞系 (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA)瞬時表現抗體，且藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法進行純化。表9中所列的抗體用來製備表10中所列的雙功能抗體。藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法製備雙功能抗體。為了靶向ASGPR，使用抗ASGPR抗體 AGA0078 (VH：序列辨識號：159、VL：序列辨識號：156)。

在成像分析中，使用參考實施例3中描述的ASGPR表現的HeLa細胞系(HeLa/ASGPR/BirA)。在含有10% FBS (Sigma Aldrich, Cat# 172012-500ML)、青黴素-鏈黴素(Gibco, Cat# 15140-122)、750 micro g/mL 遺傳黴素(Geneticin)(Thermo Fisher Scientific，Cat# 10131-027)和100 micro g/mL 吉歐黴素(zeocin)(Thermo Fisher Scientific，Cat#R25001)的最小必需培養基Eagle(Minimum Essential Medium Eagle) (Sigma, Cat# M4655-500ML)中培養HeLa/ASGPR/BirA細胞。以50 micro L /孔(6 x 10 ³個細胞/孔)將HeLa/ASGPR/BirA的懸浮液接種在BioCoat膠原蛋白I多孔盤96孔黑色/透明(Corning, Cat# 354649)中。然後，在加濕的5% CO ₂、37度C的培養箱中將細胞培養隔夜。去除培養上清液後，在加濕的5% CO ₂、37度C的培養箱中，在 50 micro L /孔的培養基中將細胞與3 micro M的抗體一起培養3小時。培養後，在200 mM 甘胺酸(Wako Pure Chemical Industries，Cat#077-00735)-HCl (Wako Pure Chemical Industries，Cat# 083-01095)、150 mM NaCl(Wako Pure Chemical Industries，Cat#191-01665)、pH 2.5中將細胞洗滌兩次。然後，用 4% 多聚甲醛-磷酸鹽(paraformaldehyde-phosphate)緩衝液(Nacalai Tesque，Cat# 09154-56)在室溫下固定細胞15分鐘，然後用含有0.5% Triton X-100 (Bio-Rad, Cat# 161-0407)的PBS和5% FBS來滲透(permeabilize)細胞。用於滲透的溶液也用於後續之與二抗一起培養和洗滌的步驟。將細胞與1/500稀釋的山羊抗人類IgG-AF488(SouthernBiotech，Cat#2040-30)和1/2000稀釋的Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific，Cat#H3570)在室溫下一起培養30分鐘。洗滌兩次後，使用Operetta CLS High-Content Analysis System (Perkin Elmer)對細胞進行成像分析。使用Harmony 軟體(Perkin Elmer)評估Alexa488的螢光強度。

因此，實施例3中所選擇之具有抗ASGPR抗體(AGA0078)的雙功能分子形式的抗體顯示出比具有抗KLH抗體(IC17)的雙功能分子形式更高的Alexa488螢光強度(圖2)。這表示雙功能抗體可藉由ASGPR依賴性方式遞送至HeLa/ASGPR/BirA 細胞中，支持實施例3中藉由分裂NanoLuc測定觀察到的受體依賴性細胞液運輸。 [表9] 用於製備雙功能抗體和對照抗體的親本抗體列表

簡稱	樣品名稱	VH	VH 序列辨識	CH	CH 序列辨識	VL	VL 序列辨識	CL	CL 序列辨識
FRv40541n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40541-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40541	123	KT0	12
40542-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40542-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40542	124	KT0	12
40543-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40543-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40543	125	KT0	12
40544-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40544-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40544	126	KT0	12
40545-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40545-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40545	127	KT0	12
40546-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40546-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40546	128	KT0	12
40547-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40547-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40547	129	KT0	12
40548-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40548-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40548	130	KT0	12
40549-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40549-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40549	131	KT0	12
40550-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40550-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40550	132	KT0	12
FRv40551n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40551-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40551	133	KT0	12
FRv40552n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40552-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40552	134	KT0	12
40553-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40553-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40553	135	KT0	12
40554-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40554-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40554	136	KT0	12
40555-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40555-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40555	137	KT0	12
40556-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40556-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40556	138	KT0	12
40557-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40557-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40557	139	KT0	12
FRv40558n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40558-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40558	140	KT0	12
FRv40559n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40559-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40559	141	KT0	12
FRv40560n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40560-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40560	142	KT0	12
40561-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40561-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40561	143	KT0	12
40562-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40562-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40562	144	KT0	12
FRv40563n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40563-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40563	145	KT0	12
FRv40564n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40564-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40564	146	KT0	12
40565-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40565-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40565	147	KT0	12
40566-KTn	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40566-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40566	148	KT0	12
FRv40567n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40567-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40567	149	KT0	12
FRv40568n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40568-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv40568	150	KT0	12
3D8n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL	174	KT0	12
FRv4n	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv4-KT0	3D8VH	158	SG1.S3n	154	hT4VL.FRv4	4	KT0	12
AGA0078p	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0	AGA0078 Ha	159	SG1.S3p	155	AGA0078La	156	KT0	12
IC17p	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0	IC17HdK	160	SG1.S3p	155	IC17L	157	KT0	12

[表10] 成像分析中使用的雙功能抗體和對照抗體列表

雙功能抗體	第一臂	第二臂
FRv40542n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40542-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40543n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40543-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40544n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40544-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40545n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40545-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40546n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40546-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40547n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40547-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40548n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40548-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40549n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40549-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40550n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40550-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40553n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40553-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40554n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40554-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40555n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40555-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40556n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40556-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40557n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40557-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40561n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40561-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40562n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40562-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40565n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40565-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40566n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40566-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40542n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40542-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40543n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40543-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40544n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40544-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40545n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40545-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40546n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40546-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40547n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40547-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40548n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40548-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40549n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40549-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40550n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40550-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40553n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40553-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40554n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40554-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40555n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40555-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40556n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40556-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40557n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40557-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40561n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40561-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40562n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40562-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40565n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40565-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40566n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40566-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40541n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40541-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40551n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40551-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40552n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40552-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40558n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40558-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40559n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40559-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40560n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40560-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40563n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40563-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40564n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40564-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40567n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40567-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40568n//AGA0078p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40568-KT0	AGA0078Ha-SG1.S3p/AGA0078La-KT0
FRv40541n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40541-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40551n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40551-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40552n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40552-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40558n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40558-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40559n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40559-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40560n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40560-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40563n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40563-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40564n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40564-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40567n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40567-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
FRv40568n//IC17p	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv40568-KT0	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0
3D8	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL-KT0	-
FRv4	3D8VH-SG1.S3n/hT4VL.FRv4-KT0	-
IC17	IC17HdK-SG1.S3p/IC17L-KT0	-

實施例5：用非3D8重鏈確認細胞液運輸能力儘管在上述實施例1-4中使用了相同的3D8 (序列辨識號：13)的重鏈，但本發明人進一步評估了當與其他非3D8重鏈組合時，實施例1-4中新鑑定的輕鏈(VL)變異體是否仍保留其細胞液運輸能力。為此目的，使用抗IL6R重鏈AL1W8P226 (序列辨識號：151)作為對照，以與實施例1-4中鑑定的VL變異體組合。製備包含抗IL6R重鏈和實施例1-4中鑑定的VL變異體的雙功能抗體，且使用在細胞表面固有表現IL6R的HepG2細胞藉由分裂Nluc測定，來測試細胞液運輸能力。結果顯示，與二價抗IL6R抗體(重鏈序列辨識號：152、輕鏈序列辨識號：153)以及包含具有負對照輕鏈IC17L (序列辨識號：154)的AL1W8P226的抗體相比，包含具有AL1W8P226的VL變異體的抗體顯示出更高的分裂Nluc訊號，表示VL變異體展現出細胞液運輸活性且靶細胞(IL6R)特異性細胞液運輸可藉由IL6R結合來調控 (圖 3)。

實施例6：最佳化的變異體的抗體藥物動力學(PK)數據如實施例2和實施例3中所示，本發明人成功地鑑定出具有顯著改善的物理化學性質例如ECM結合和可影響抗體PK的SEC數據的細胞穿透抗體。對選擇的其中之一變異體3D8H/hT4VL.FRv40563 (VH：序列辨識號：158、VL：序列辨識號：145)進行小鼠靜脈內投予測試。抗體投予後，隨時間採集血液且獲得血漿。然後藉由ELISA方法測量血漿中投予的抗體的濃度。用WinNonlin ver 7.0 (Certara) 分析血漿中抗體濃度的時程數據，以計算抗體清除率(clearance，CL)。結果顯示，與3D8 (3D8H/hT4VL)相比，新鑑定的變異體(3D8H/hT4VL.FRv40563)的抗體PK數據得到了顯著改善(圖12)。再者，亦評價了包含細胞液穿透域(FRv40563)和細胞表面抗原結合域(抗ASGPR抗體，AGA0078)的雙功能抗體的PK。ASGPR主要在肝臟中表現，且二價抗ASGPR抗體顯示出非常快的消除。如圖13中所示，與其對照抗體FRv40563n//IC17p相比，FRv40563n//AGA0078p顯示出更快的清除，表示雙功能抗體FRv40563n//AGA0078p可藉由ASGPR依賴性方式遞送至肝臟。此外，FRv40563n//AGA0078p顯示出比IC17n//AGA0078p更快的清除率。這可支持體內(in vivo)ASGPR依賴性細胞液運輸。

參考實施例1：分裂NanoLuc 測定以評價細胞液運輸能力 (1) 分裂NanoLuc測定的概念 NanoLuc是一種由深海發光蝦經工程化而成之19kDa的小型螢光素酶。分裂NanoLuc測定利用被切割成兩個次單元-一個小的1.3kDa的小BiT (Small BiT，SmBiT)和一個較大的18kDa的大BiT (Large BiT，LgBiT)的NanoLuc。藉由使用 NanoLuc Live Cell Assay System (Promega)，以活細胞中基質上的酵素反應的發光觀察到LgBiT和SmBiT的互補。在分裂NanoLuc測定中，對 HeLa 細胞進行基因改造以在胞內穩定表現NanoLuc LgBiT。NanoLuc LgBiT以游離細胞液蛋白質的形式表現，或被束縛在細胞液內的胞內結構上，例如粒腺體外膜。與NanoLuc LgBiT作為游離細胞液蛋白質表現時相比，NanoLuc LgBiT束縛於粒腺體外膜導致顯著較低的背景訊號和更好的測定靈敏度。儘管如GFP所確定的那樣，束縛的NanoLuc LgBiT具有整體較低的表現。SmBiT與測試的抗體融合或偶聯。抗體-SmBiT偶聯物穿透至細胞液將補充NanoLuc LgBiT，以形成螢光素酶酵素，其可透過增強發光來檢測。

(2) 細胞系構建為了產生穩定表現人類ASGPR的HeLa細胞，使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)分別以2：1的比例，用編碼人類ASGPR-H1 (序列辨識號：198)和ASGPR-H2 (序列辨識號：199)次單元的質體，來轉染細胞。將ASGPR-H1和ASGPR-H2選殖至使用CAG啟動子且編碼新黴素抗生素抗性基因的質體pCXND3中。藉由在 FACSAria III (BD)上進行細胞分選，進一步富集了抗生素抗性細胞，以實現ASGPR的高度表現。然後藉由限制稀釋和塗盤單離富集的細胞，且藉由顯微鏡(Solentim，Cell Metric CLD)鑑定為單細胞選殖體(clone)。為了產生同時表現ASGPR和eGFP-Nanoluc LgBiT的細胞及表現ASGPR和AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiT的細胞，使用Cell Line Optimization 4D-NucleofectorTM X Kit (Lonza)和 4D-Nucleofector Core unit和4D-Nucleofector X unit (Lonza)，使用 HeLa的預設核轉染程式對穩定表現ASGPR的HeLa細胞進行核轉染(nucleofected)。將LgBiT構建體選殖至使用CAG啟動子且編碼吉歐黴素抗生素抗性基因的質體pCXZD1中。第一個是與eGFP的C端偶聯的NanoLuc LgBit (eGFP-NanoLuc LgBit；序列辨識號：200)。第二個是與eGFP的N端偶聯的額外粒腺體激酶錨定蛋白質1 (mitochondrial kinase anchoring protein 1，AKAP1) (AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit；序列辨識號：196)。藉由在FACSAria III (BD)上進行細胞分選，進一步富集了抗生素抗性細胞，以實現eGFP的高度表現。然後藉由限制稀釋和塗盤，來單離富集的細胞，且藉由顯微鏡(Solentim，Cell Metric CLD)鑑定為單細胞選殖體。

在有10% v/v 胎牛血清、1% v/v MEM非必需胺基酸溶液 (Gibco)、1% v/v 丙酮酸鈉(Gibco)和1% v/v 青黴素-鏈黴素(Gibco)的標準培養基中培養HeLa細胞。用補充有1 mg/mL遺傳黴素(G418硫酸鹽)(Gibco)的標準培養基培養表現亞洲糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的HeLa選殖體。在有1 mg/mL遺傳黴素和 600 micro g/mL吉歐黴素(Invivogen)的標準培養基中培養表現ASGPR和eGFP-NanoLuc LgBiT、或ASGPR和AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiT的HeLa細胞。所有細胞類型都在加濕的5% CO ₂、37度C的培養箱中培養。

(3) 測定組條件用DPBS、無鈣、無鎂(Gibco)潤洗表現ASGPR和eGFP-NanoLuc LgBiT (以下稱為HeLa-Nluc)的 HeLa 細胞、及表現ASGPR和AKAP1-eGFP-Nanoluc LgBiT (以下稱為HeLa-AKAP1_Nluc)的HeLa細胞。然後在室溫下用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco)對細胞進行胰蛋白酶處理，直到從培養瓶中脫離。然後在含有 10% FBS的過量培養基中中和胰蛋白酶。藉由在4度C以200 x g 離心5分鐘以使細胞沉澱，且用冷的Opti-MEM (Gibco)潤洗兩次。以1 x 10 ⁶個細胞/mL的濃度，將細胞懸浮在冷的Opti-MEM中，且在使用前保持冷藏長達30分鐘。在組胺酸緩衝液、20mM His-HCl + 150mM NaCl (Nacalai Tesque)中，將待測抗體稀釋至測試濃度的11倍。在室溫下製備來自NanoLuc Live Cell Assay System (Promega, Cat#N2011)的5倍基質。以每孔100 micro L (Perkin Elmer, Cat#6005688) 轉移1 x 10 ⁵個細胞，將10 micro L的11倍抗體直接添加至細胞中且藉由移液管混合。然後在混合後立即將5倍基質添加至細胞和抗體混合物中。

立即將盤放置於預熱的37度C發光盤讀取器(Promega, Glomax Explorer)中。每5分鐘進行2步驟讀取循環，共12個循環—在讀取發光之前，以400rpm將盤搖動1分鐘。參考緩衝孔的倍數變化總結在表4-8中。與親本抗體相比顯示出優異倍數變化的變異體以粗體顯示。

參考實施例2：抗體之胞外基質(ECM)結合的定性參考WO2012093704 A1，藉由以下流程評估每個抗體與ECM (胞外基質)的結合：用TBS將ECM無酚紅(BD Matrigel #356237)稀釋至2 mg/mL，且將5 micro L添加至在冰上冷卻的ECL測定盤(L15XB-3，MSD KK，高結合)的每個孔的中心。然後，將塗佈的盤密封且在4度C下保持隔夜。然後隔天在室溫下進行測定。將150 micro L的ECL阻斷緩衝液(補充有0.5% BSA和0.05% Tween 20的PBS)添加至塗佈的盤的每個孔中，且在室溫下將盤靜置2小時或更久。接著，去除阻斷緩衝液。用ACES-T將每個抗體樣品稀釋至 9 micro g/mL，且用ECLDB (補充有 0.1% BSA和0.01% Tween 20的PBS)進一步稀釋至 3 micro g/mL。將50 micro L的稀釋抗體溶液添加至每個孔中，且在30度C下以600 rpm搖動培養1小時。然後藉由敲擊倒置的盤去除樣品。接著，將50 micro L的戊二醛添加至每個孔中，以固定樣品且在室溫下培養10分鐘。然後用 PBS-T (添加0.05% Tween 20 的 PBS)將孔洗滌三次。用ECLDB將二抗稀釋至1 micro g/mL，且將50 micro L的二抗溶液添加至盤的每個孔中。將盤密封且在30度C下以600 rpm培養1小時，同時避光。接著，去除二抗溶液。在添加READ緩衝液(MSD K.K.)之前，再次用PBS-T將盤洗滌三次，以150 micro L/孔添加前述READ緩衝液，然後使用Sector Imager 2400 (MSD K.K.)立即檢測發光訊號。

參考實施例3：用於成像分析的細胞系構建為了產生穩定表現人類ASGPR (HeLa/ASGPR)的HeLa細胞，使用Lipofectamine 3000 (Theromo Fisher Scientific)，用編碼人類ASGPR-H1 (序列辨識號：198)和ASGPR-H2 (序列辨識號：199)蛋白質次單元的質體，分別以2：1的比例轉染細胞。將ASGPR-H1和ASGPR-H2選殖至使用CAG啟動子且編碼新黴素抗生素抗性基因的質體pCXND3中。然後藉由限制稀釋和塗盤，來單離富集的細胞，且藉由顯微鏡(Solentim，Cell Metric CLD)鑑定為單細胞選殖體。

將編碼BirA蛋白質(序列辨識號：201)的基因選殖至使用CAG啟動子且編碼吉歐黴素抗生素抗性基因的質體pCXZD1中。使用Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)，用pCXZD1 BirA質體轉染HeLa/ASGPR細胞。藉由在 FACSAria IIu 分選儀(Beckton Dickinson)上進行細胞分選，進一步富集抗生素抗性細胞，以實現BirA的高度表現。然後藉由限制稀釋和塗佈來單離富集的細胞，且藉由顯微鏡鑑定為單細胞選殖體。然後擴增所選的選殖體。使用FACS Verse (Beckton Dickinson)和抗ASGPR抗體和山羊抗人類IgG-Alexa Fluor 647 (Southern Biotech, Cat# 2040-31)的流式細胞術分析證實了ASGPR表現。也藉由使用Simple Western Wes (Protein Simple) 的毛細管免疫測定法(capillary immunoassay)，來證實BirA表現。此穩定表現ASGPR和BirA的HeLa細胞系(HeLa/ASGPR/BirA)用來成像分析。對於測定，在含有10% FBS (Sigma Aldrich, Cat# 172012-500ML)、青黴素-鏈黴素(Gibco, Cat# 15140-122)、750 micro g/mL遺傳黴素 (Thermo Fisher Scientific, Cat# 10131-027)和100 micro g/mL的吉歐黴素(Thermo Fisher Scientific, Cat# R25001)的最低必需培養基Eagle (Sigma, Cat# M4655-500ML)中培養HeLa/ASGPR/BirA細胞。

無

[圖1]圖1顯示了代表性hT4VL.FRv04變異體的尺寸排阻層析(Size Exclusion Chromatography，SEC)的層析圖。高單體峰(monomer peak)百分比和尖銳的對稱峰形(窄峰寬)表示具有良好的物理化學特性。表6中列出的所有突變變異體都顯示出更好的單體峰百分比和更尖銳的峰形，如圖1所示。 [圖2]圖2顯示了在ASGPR表現HeLa細胞系(HeLa/ASGPR/BirA細胞)中的雙功能抗體的細胞液運輸的成像分析結果。具有抗ASGPR (AGA0078)抗體的雙功能分子形式的所選抗體顯示出比具有抗KLH抗體的雙功能分子形式的抗體(IC17 = 對照) 更高的Alexa488螢光強度。這表示所選的雙功能抗體可藉由ASGPR依賴性方式遞送至HeLa/ASGPR/BirA細胞中，支持藉由分裂NanoLuc測定法所觀察到的受體依賴性細胞液運輸(ASGPR Ab調控的ASGPR表現細胞特異性細胞液運輸)。 [圖3]圖3顯示了在細胞表面固有表現IL6R的HepG2細胞中，包含hT4VL變異體和抗IL6R重鏈的雙功能抗體的細胞液運輸的分裂Nluc測定法(Split Nluc assay)的結果。 [圖4]圖4是顯示本揭露的抗原結合分子的概念的示意圖。在圖4中，顯示雙功能抗體形式的抗原結合分子，以例如說明本揭露的抗原結合分子的靶細胞特異性遞送的概念。 [圖5]圖5是顯示多價抗體的分子形式的示意圖，作為本揭露的抗原結合分子的分子形式的範例。 [圖6]圖6是顯示本揭露的抗原結合分子的示例性分子形式的示意圖。抗原結合分子包含第一和第二Fab區。 [圖7]圖7是顯示本揭露的抗原結合分子的示例性分子形式的示意圖。抗原結合分子包含第一和第二Fab區及及單鏈單元。 [圖8]圖8是顯示本揭露的抗原結合分子的示例性分子形式的示意圖。抗原結合分子包含第一和第二單域抗體可變區和單鏈單元。 [圖9]圖9是顯示本揭露的抗原結合分子的示例性分子形式的示意圖。抗原結合分子具有DVD-Ig(註冊商標)的分子形式。 [圖10]圖10是顯示本揭露的抗原結合分子的示例性分子形式的示意圖。抗原結合分子包含第一、第二和第三Fab區。 [圖11]圖11是顯示本揭露的抗原結合分子的示例性分子形式的示意圖。抗原結合分子包含第一、第二、第三和第四Fab區。 [圖12]圖12顯示了最佳化的抗體變異體3D8H/hT4VL.FRv40563及包含相同野生型人類IgG1恆定區的親本3D8抗體(3D8H/hT4VL)的PK比較。 [圖13]圖13顯示了包含細胞液穿透域(FRv40563)和細胞表面抗原結合域(抗ASGPR抗體，AGA0078)的雙功能抗體的PK。與對照抗體FRv40563n//IC17p相比，FRv40563n//AGA0078p的清除速度更快，表示雙功能抗體FRv40563n//AGA0078p可藉由ASGPR依賴性方式遞送至肝臟。此外，FRv40563n//AGA0078p顯示出比IC17n//AGA0078p更快的清除率。這可支持體內ASGPR依賴性的細胞液運輸。

Claims

一種細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，包括一包含序列辨識號：4中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3的胺基酸序列的輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由下述所組成的群組的一或多個胺基酸取代(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的胺基酸序列中， (a) 用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y取代第24位的胺基酸K； (b) 用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y取代第25位的胺基酸S； (c) 用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V取代第26位的胺基酸S； (d) 用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y取代第27位的胺基酸Q； (e) 用D取代第27a位的胺基酸S； (f) 用I、P、Q、T或V取代第27b位的胺基酸L； (g) 用A、D、E、I、M、N、S、W或Y取代第27c位的胺基酸F； (h) 用A、D、E、F、H、N或Q取代第27d位的胺基酸N； (i) 用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y取代第27e位的胺基酸S； (j) 用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y取代第27f位的胺基酸R； (k) 用E、H、I、Q、S、V、W或Y取代第28位的胺基酸T； (l) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第29位的胺基酸R； (m) 用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y取代第30位的胺基酸K； (n) 用D、M、S或T取代第31位的胺基酸N； (o) 用D、E、G、H或Q取代第32位的胺基酸Y； (p) 用H、I、T或Y取代第89位的胺基酸Q； (q) 用E、F或N取代第91位的胺基酸Y； (r) 用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W取代第93位的胺基酸Y； (s) 用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第94位的胺基酸H； (t) 用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y取代第95位的胺基酸M； (u) 用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V取代第96位的胺基酸Y；以及 (v) 用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V取代第97位的胺基酸T。
如請求項1所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中與沒有該取代且包含具有序列辨識號：4中所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的參考抗體或其片段相比，該一個或多個胺基酸取代增強了該抗體或其片段的該細胞液穿透活性。
如請求項1或2所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區中的CDRL1和CDRL3中的每一者皆包括兩個或更多個選自請求項1 (a)至(v)中所定義的群組的胺基酸取代。
如請求項1至3中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包括選自由下述所組成的群組的胺基酸取代的組合(根據Kabat編號的位置)： (a) S27eD/R27fK； (b) S27eD/R27fH； (c) N27dE/S27eD； (d) S27eD/T28D； (e) S27eD/R29E； (f) S27eD/R29S； (g) K24N/S27eD； (h) N27dD/R27fK； (i) N27dE/R27fK； (j) R27fK/T28D； (k) R27fK/R29E； (l) R27fK/R29S； (m) K24N/R27fK； (n) K24N/N27dD； (o) N27dD/T28D； (p) N27dD/R29E； (q) N27dD/R29S； (r) S27eD/Q89H； (s) N27dD/Q89H； (t) R27fK/Q89H； (u) S27eD/Y91E； (v) N27dD/Y91E； (w) R27fK/Y91E； (x) Q89H/H94P； (y) Y91E/H94P； (z) H94P/M95N； (aa) H94P/M95D； (bb) H94P/M95P； (cc) H94E/Y96P； (dd) H94E/M95N； (ee) H94E/M95D； (ff) H94E/M95P； (gg) N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P； (hh) N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P； (ii) N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (jj) N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (kk) N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P； (ll) N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P； (mm) N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P； (nn) N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P； (oo) N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P； (pp) N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P； (qq) N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P； (rr) N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P； (ss) N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P； (tt) N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P； (uu) N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P； (vv) N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P； (ww) N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P； (xx) N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (yy) N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P； (zz) N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P； (aaa) S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (bbb) S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (ccc) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (ddd) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (eee) S27eD/R27fK/Y91E/H94Q； (fff) S27eD/R27fK/Y91F/H94Q； (ggg) S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P； (hhh) S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P； (iii) S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P； (jjj) S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P； (kkk) R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P； (lll) R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P； (mmm) R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P； (nnn) R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P； (ooo) R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P； (ppp) R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P； (qqq) R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P； (rrr) R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P； (sss) N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；及 (ttt) N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
如請求項1至4中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包括人類框架區(framework region，FR)。
如請求項5所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中根據Kabat編號，該輕鏈可變區包括第2位的胺基酸I和/或第3位的胺基酸Q。
如請求項5所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包括在序列辨識號：123中所包括的一、二、三或四個FR結構域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
如請求項1至7中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區更包括在CDRL2中的一、二、三或更多個胺基酸取代。
如請求項1至8中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區更包括一、二、三或更多個選自下述所成的群組的胺基酸取代(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4中所示的CDRL2的胺基酸序列中， (a) 用A、G、I、T或V取代第50位的胺基酸W； (b) 用F或I取代第52位的胺基酸S； (c) 用N或Y取代第53位的胺基酸T；及 (d) 用K或V取代第54位的胺基酸R。
如請求項1至9中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包括選自由下述所組成的群組的胺基酸取代的組合(根據Kabat編號的位置)：在序列辨識號：4的胺基酸序列中， (a) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q； (b) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q； (c) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q； (d) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q； (e) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q； (f) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q； (g) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q； (h) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q； (i) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q； (j) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q； (k) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q； (l) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；及 (m) L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
如請求項1至10中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，包括具有選自由序列辨識號：14-150和161-173所組成的群組的一胺基酸序列的一輕鏈可變區。
如請求項11所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包括具有選自由序列辨識號：123-150所組成的群組的一胺基酸序列的一輕鏈可變區。
如請求項11所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段，其中該細胞液穿透抗體或其抗原結合片段包括具有選自由序列辨識號：161-173所組成的群組的一胺基酸序列的一輕鏈可變區。
一種多功能抗體，包括一細胞表面抗原結合域、一細胞液抗原結合域和一細胞液穿透域；其中該細胞液穿透域包括請求項1至13中任一項所述的輕鏈可變區。
一種用於將一生物活性分子遞送至一細胞質的組合物或醫藥組合物，包括請求項1至13中任一項所述的細胞液穿透抗體或其抗原結合片段或請求項14所述的多功能抗體。