JP2019518012A - 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法 - Google Patents

修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的な改善された抗体、特に、種間交差反応性が改善されたドメイン特異的抗ＴｎＣ抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、前記抗体を産生する方法及び疾患の治療におけるそれらの使用方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的な改善された抗体、特に、種間交差反応性が改善されたドメイン特異的抗ＴｎＣ抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、前記抗体を産生する方法及び疾患の治療におけるそれらの使用方法に関する。
ＴｎＣ及び抗ＴｎＣ抗体
テネイシンは、脊椎動物に見られる、大きい多量体細胞外マトリックス（ＥＣＭ）糖タンパク質の高度に保存されるファミリーである。テネイシンＣ（ＴｎＣ）、テネイシンＲ、テネイシンＸ及びテネイシンＷと称される４つのテネイシンパラログが、哺乳動物において同定されている。テネイシンファミリータンパク質は、Ｎ末端７アミノ酸リピート、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピート、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインリピート及びＣ末端フィブリノーゲン様球状ドメインを含む、共通の一次構造を有する。Ｎ末端オリゴマー化ドメインによって、個々のサブユニットは、集合してトリマーになり、又はさらにはテネイシンＣの場合のようにヘキサマーになる。
哺乳動物ＴｎＣモノマーは、典型的に、１．４５個のＥＧＦ様リピート及び８個のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインリピートを有し、これらは、全てのＴｎＣアイソフォームにより共有される。しかし、９個以下のさらなるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ドメインＡ１からＤ）を独立して選択的スプライシングにより含めること又は排除することができ、その結果、多数のＴｎＣアイソフォームが生じる（例えば、Hsia及びSchwarzbauer、J Biol Chem 280、26641-26644(2005)を参照されたい）。
ＴｎＣは、発生中の胚において一過性発現されるが、実際上、成体組織には存在しない。しかし、テネイシンＣは、ある特定の病的状態、例えば創傷治癒、炎症及びがんを含む、再形成過程を経る組織において再び現れる（Chiquet-Ehrismann及びChiquet、J Pathol 200、488-499(2003)に概説がある）。
重要なこととして、ＴｎＣは、脳、乳房、結腸、肺、皮膚及び他の器官の腫瘍を含む、悪性固形腫瘍の大多数において高度に発現され（Orend及びChiquet-Ehrismann、Cancer Letters 244、143-163(2006)に概説がある）、これらの器官における腫瘍微小環境では形質転換上皮細胞によってはもちろん間質細胞によっても発現され得る（Yoshida等、J Pathol 182、421-428(1997)、Hanamura等、Int J Cancer 73、10-15(1997)）。特に、選択的スプライシングを受けたドメインＡ１からＤを含有するＴｎＣの「大型アイソフォーム」は、浸潤癌では発現されるが、健常成体組織ではほぼ検出不能である（Borsi等、Int J Cancer 52、688-692(1992)、Carnemolla等、Eur J Biochem 205、561-567(1992)）。
その発現パターンにより、ＴｎＣ、特に、その選択的スプライシングを受けたドメイン、腫瘍を標的とする応用の有望な候補抗原になり、その結果、このタンパク質の幾つかのドメインに対する多数の抗体が開発された（例えば、ＴｎＣのＡ１ドメインに対する抗体が記載されているBrack等、Clin Cancer Res 12、3200-3208 (2006)若しくは欧州特許第１８１７３４５号；ＴｎＣのＣドメインに対する抗体が記載されているSilacci等、Prot Eng Des Sel 19、471-478 (2006)若しくは欧州特許第１１７３７６６号；ＴｎＣのＤドメインに対する抗体が記載されているWang等、Hybridoma 29、13-16 (2010)；又はヒトテネイシンの異なるドメインに対する幾つかの抗体が記載されているBalza等、FEBS 332、39-43 (1993)を参照されたい）。最近、ヒトＴｎＣのＡ２ドメイン内の特定のエピトープを認識する抗体も記載されている（国際公開第２００９／０８９９９８号及び国際公開第２０１２／０２００３８号）。
それでもなお、ヒトの治療についての治療可能性が向上されたテネイシン抗体が依然として必要とされている。高いアフィニティー及び種間交差反応性を有し、特異的にテネイシンを標的とするアイソフォームは、ヒトのものを含むがこれに限定されないがん治療の向上のために切望されている。
本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体であって、高いアフィニティー及び／又は向上した種間交差反応性を有する抗体を提供する。
一実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体であって、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも１つ（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５又は６つ）を含む抗体に関する。一実施態様では、抗体は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４から選択される、３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。
一実施態様では、抗体は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合し、前記抗体は、
（ａ）配列番号４９及び配列番号５２の群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５０及び配列番号５３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５１及び配列番号５４の群から選択される重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
（ａ）配列番号３７及び配列番号４０の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３８及び配列番号４１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３９及び配列番号４２の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む。
特定の実施態様では、抗体は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合し、前記抗体は、
（ａ）配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
（ａ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む。
別の特定の実施態様では、抗体は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合し、前記抗体は、
（ａ）配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
（ａ）配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む。
一実施態様では、抗体は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に記載の重鎖及び軽鎖可変領域配列から選択される、抗体重鎖可変領域及び／又は抗体軽鎖可変領域、特に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方を含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の実施態様では、抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様では、抗体は、Ｆｃ領域を含むか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む。一実施態様では、抗体は、Ｆｃ領域、特に、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。さらなる実施態様では、抗体は、完全長抗体、特に、ＩｇＧクラス抗体である。別の実施態様では、抗体は、ヒト抗体定常領域を含む。一実施態様では、抗体は、ヒト抗体である。一実施態様では、抗体は、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６５及び配列番号６６に記載の重鎖及び軽鎖領域配列から選択される、抗体重鎖領域及び／又は抗体軽鎖領域、特に、重鎖領域と軽鎖領域の両方を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖領域、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。さらなる実施態様では、抗体は、ＩｇＧクラス重鎖領域を含む、完全長抗体である。
一実施態様では、本発明の抗体は、向上したアフィニティーを有する。別の実施態様では、抗体は、ヒトＴｎＣと、約１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは約１０ｎＭ未満、最も好ましくは約１ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。特定の実施態様では、抗体は、ヒトＴｎＣと約１ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。一実施態様では、抗体は、ヒト組織中のＴｎＣと結合する。さらなる実施態様では、抗体は、種間交差反応性を有する。一実施態様では、前記抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと、約１μＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは約１０ｎＭ未満、最も好ましくは約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。特定の実施態様では、前記抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと、約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。別の特定の実施態様では、前記抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、マウスＴｎＣと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、カニクイザルＴｎＣと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択される前記ＫＤ値の全てが、約２ｎＭ未満である。さらに別の特定の態様では、前記抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、マウスＴｎＣと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、カニクイザルＴｎＣと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択される前記ＫＤ値の全てが、２ｎＭから０．１ｎＭの範囲内である。一実施態様では、抗体は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤからなる群から選択されるＴｎＣドメインのうちの少なくとも１つに特異的である。特定の実施態様では、前記抗体は、ＴｎＣドメインＡ１及びＡ４に特異的である。特定の実施態様では、前記抗体は、ＴｎＣドメインＣに特異的である。
一実施態様では、抗体は、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、前記抗体の親非置換重鎖領域は、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換Ｆｃ領域は、親非置換Ｆｃ領域と比べて、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。別の実施態様では、置換Ｆｃ領域を含む抗体は、親非置換重鎖領域を含む抗体と比較して、エフェクター機能が低下している、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下している。一実施態様では、抗体は、親非置換重鎖領域と比べて、アミノ酸置換Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合が消失される、及び／又はＦｃ媒介エフェクター機能が消失される。さらに別の実施態様では、前記エフェクター機能の消失は、ＡＤＣＣの消失である。特定の実施態様では、置換Ｆｃ領域を含む抗体は、配列番号６５及び配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。
一実施態様では、抗体は、Ｆｃ領域に修飾されたオリゴ糖を有するように糖改変される。一実施態様では、抗体は、非糖改変抗体と比較して、Ｆｃ領域内の非フコシル化された及び／又は二分されたオリゴ糖の割合が増加されている。別の実施態様では、前記Ｆｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が、フコシル化されていない。さらなる実施態様では、前記抗体は、非糖改変抗体と比較して、前記Ｆｃ領域内の二分されたオリゴ糖の割合が増加されている。なおさらなるの実施態様では、前記Ｆｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が、二分されている。具体的な実施態様では、前記Ｆｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約５０％が、二分されており、フコシル化されていない。さらなる実施態様では、抗体は、エフェクター機能が増加されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが増大されている。特定の実施態様では、エフェクター機能の増加は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加である。
一態様では、本発明は、抗体に関連したポリペプチド、ポリヌクレオチド、宿主細胞及び発現ベクターにも関する。さらなる態様では、本発明は、抗体の作製方法に関する。さらなる態様では、本発明は、抗体の使用方法、特に、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患、例えばがん、の治療のための、抗体の使用方法に関する。
図１は、抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４及び抗ＴｎＣクローン１１Ｃ７で染色したときの、倍率１００倍でのＬＳ１７４Ｔ異種移植片腫瘍における免疫組織学的染色を示す図である。染色パターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。クローン１８Ｄ４とクローン１１Ｃ７両方についてのＴｎＣ染色は、全体的に見て、中等度の強度で発現される。ネガティブアイソタイプコントロールシグナルは、この手法の特異性を確証する。 図２は、ヒト腫瘍アレイにおけるウサギアイソタイプコントロールでの免疫組織学的染色の結果を示す図である。試験した全ての組織において、ネガティブアイソタイプコントロールシグナルは、この手法の特異性を確証する。 図３は、ヒト腫瘍アレイにおける抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４での免疫組織学的染色の結果を示す図である。染色パターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される。 図４は、抗ＴｎＣクローン１１Ｃ７でのヒト腫瘍アレイにおける免疫組織学的染色の結果を示す図である。染色パターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される。
Ｉ．定義
本明細書での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義されるようなヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含むこともあり、又はある特定のアミノ酸配列変化を有することもある。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。一部の実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列の点で、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
「アフィニティー」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合アフィニティー」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１相互作用を表す固有の結合アフィニティーを指す。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティーは、解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆとｋｏｎ）の比である、解離定数（ＫＤ）によって一般に表すことができる。したがって、同等のアフィニティーは、速度定数の比が同じままであるならば、異なる速度定数を含むこともある。アフィニティーは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。結合アフィニティーの測定についての説明に役立つ例示的な具体的実施態様は、下記で説明される。
「アフィニティー成熟した」抗体は、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ)（例えば、ＣＤＲ）に改変（例えば、アミノ酸突然変異）を、そのような改変を有さない親抗体と比較して１つ又は複数有し、そのような改変は、抗原に対する抗体のアフィニティーの向上をもたらす。典型的に、アフィニティー成熟した抗体は、親抗体と同じエピトープと結合する。
用語「抗ＴｎＣ抗体」及び「ＴｎＣと結合する抗体」は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に十分なアフィニティーで結合することができる抗体を指し、したがって、前記抗体は、ＴｎＣを標的とする点で診断及び／又は治療剤として有用である。一実施態様では、無関係の非ＴｎＣタンパク質への抗ＴｎＣ抗体の結合度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、ＴｎＣへの抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ＴｎＣと結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０ｎＭから０．１ｎＭ、例えば、５ｎＭから０．１ｎＭ、例えば、２ｎＭから０．１ｎＭ）の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施態様では、抗ＴｎＣ抗体は、異なる種からのＴｎＣ間で保存されるＴｎＣエピトープと結合する。ある特定の実施態様では、ＴｎＣのエピトープと結合する抗体は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤからなる群から選択されるドメインのうちの少なくとも１つに特異的である。ある特定の実施態様では、ＴｎＣ Ａ１及びＴｎＣ Ａ４ドメインに特異的な抗体が提供される。ある特定の実施態様では、ＴｎＣ Ｃドメインに特異的な抗体が提供される。
本明細書での用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、そのような抗体構造には、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が含まれ、抗体断片も、それらが所望の抗原結合活性を呈示するのであれば、含まれる。Ｆｃ領域を有する抗体断片、及び免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質も、含まれる。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
参照抗体と「同じエピトープと結合する抗体」は、競合アッセイで参照分子のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に言うと、参照分子は、競合アッセイで抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。例示的競合アッセイは、本明細書で提供される。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全てと特異的に結合する領域であって抗原の一部又は全てと相補的である領域を含む、抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと称される抗原の特定の部分のみと結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によってもたらされることがある。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の源又は種に由来するが、その重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる源又は種に由来する抗体を指す。キメラ抗体については、例えば、非抗原結合成分は、チンパンジー及びヒトなどの霊長類を含む、多種多様な種に由来し得る。ヒト化抗体は、キメラ抗体の特に好ましい形態である。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つの主要抗体クラスがあり、これらのうちの幾つかは、さらに、サブクラス（アイタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ。α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
「輸注反応」である「サイトカイン放出症候群」は、抗体の輸注の使用に伴って発生する一般的な即時型副作用である。発病機序は、抗体がＴ細胞受容体と結合して前記Ｔ細胞を活性化することを特徴とする。活性化Ｔ細胞により放出されるサイトカインは、高血圧、発熱及び悪寒を特徴とする重症感染症の際に見られるものに類似したタイプの全身性炎症反応を生じさせる。サイトカイン放出症候群に起因する死亡が報告されており、サイトカイン放出症候群は、患者が水分過負荷状態になると、致死性肺水腫を引き起こし得る。
本明細書で使用される用語「細胞毒性剤」は、細胞機能を阻害する若しくは妨げる及び／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤としては、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤若しくは化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びそれらの断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；毒素、例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の低分子毒素又は酵素的に活性な毒素（それらの断片及び／又は変異体を含む）；並びに下で開示される様々な抗腫瘍又は抗がん剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「種間交差反応性」は、ある特定の抗体が抗体のそれぞれの標的抗原と特異的に結合できることを指し、ここで前記標的抗原は、異なる種（例えば、ヒト、マウス、カニクイザル等）に由来し得る。種間交差反応性抗体は、少なくとも２つの異なる種に由来するそのそれぞれの標的抗原と約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは約１０ｎＭ未満、より好ましくは約５ｎＭ未満、最も好ましくは約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。用語「少なくとも２つの異なる種に由来するそのそれぞれの標的抗原と〜未満のＫＤ値で結合する」は、それぞれの抗体が、指定された種の各々に由来する標的抗原と、指定されたＫＤ値未満の解離定数ＫＤで結合することを意味する。好ましい実施態様では、種間交差反応性抗体は、指定された全ての種からの標的抗原と、同様のアフィニティーで、好ましくは、１０ｎＭから０．１ｎＭ、より好ましくは５ｎＭから０．１ｎＭ、最も好ましくは２ｎＭから０．１ｎＭのＫＤ範囲内で結合する。一部の実施態様では、数種に由来する抗原に対する同様のアフィニティーは、目的の全ての種に対して狭いＫＤ範囲内（例えば、１０ｎＭから０．１ｎＭの範囲内又はそれより狭い範囲内）での標的抗原の結合を意味し、例えば、ヒト疾患の診断アッセイ又は動物モデルに有利である。さらに好ましい実施態様では、種間交差反応性抗体は、指定された全ての種（例えば、ヒト、マウス及びカニクイザル）からの標的抗原と、同様のアフィニティーで、特に、１００倍のＫＤ範囲内、５０倍のＫＤ範囲内、２０倍のＫＤ範囲内、１０倍のＫＤ範囲内、５倍のＫＤ範囲内で結合する。好ましい実施態様では、種間交差反応性抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルからの標的抗原と、同様のアフィニティーで、特に１０倍のＫＤ範囲内で結合する。明確にするために言えば、種間交差反応性抗体は、指定された他の種と比較して最も高いアフィニティーを有する指定された種の１つと結合する。したがって、種間交差反応性抗体は、指定された他の種と比較して最も低いアフィニティーを有する指定された種の１つと結合する。定義された倍数ＸのＫＤ範囲内とは、最高のアフィニティーを有する指定された種に対するアフィニティーが、最低のアフィニティーを有する指定された種に対するアフィニティーのＸ倍以下であることを意味する。言い換えると、最低のアフィニティーを有する指定された種のＫＤ値は、最高のアフィニティーを有する指定された種のＫＤ値のＸ分の１以下である。指定された全ての種のＫＤ測定に同じ条件が適用されるのであれば、何れのアフィニティー又はアヴィディティー測定方法を使用して、種間交差反応性抗体が、指定された全ての種からの標的抗原と本明細書に記載の所与のＫＤ倍数範囲内で結合することを検証してもよいことは、明らかである。好ましくは、ＫＤ値は、ＳＰＲを使用して、特に２５℃で測定される。好ましくは、アフィニティーは、種間交差反応性抗体をＦａｂ断片として使用して測定される。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の発現低下、及びＢ細胞活性化が挙げられる。エフェクター機能と関連して本明細書で使用される用語「低下された」又は「増加された」は、Ｆｃ領域の修飾を含まない対応する親抗体により誘導されるエフェクター機能と比較して、修飾されたＦｃ領域を含む本発明の抗体により誘導されるエフェクター機能の測定可能な低下又は増加を指す。エフェクター機能は、本明細書で開示されるように、及び本明細書で開示される実施例を参照して、測定することができる。エフェクター機能と関連して本明細書で使用される用語「強く低下された」、「消失された」及び「残留の」は、Ｆｃ領域に修飾を含まない対応する親抗体により誘導されるエフェクター機能と比較して、修飾されたＦｃ領域を含む本発明の抗体により誘導される指名エフェクター機能の低下を指す。「強く低下された」は、対応する親非修飾（例えば、非置換）抗体により誘導されるそれぞれのエフェクター機能と比較して、５０％以下への低下を意味し、「消失された」は、１０％未満への低下を意味し、「残留の」は、１０％超えを意味する。したがって、Ｆｃ変異体を含む本発明の抗体は、次の特性のうちの少なくとも１つ又は複数を含む：ＡＤＣＣの低下又は消失、ＣＤＣの低下又は消失、ＡＤＣＰの低下又は消失、Ｆｃ受容体への結合の低減又は消失、Ｃ１ｑへの結合の低減又は消失、及び輸注反応（サイトカイン放出症候群）の低減又は消失。
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、必要な投薬量で、必要な期間にわたって、所望の治療又は予防結果を達成するために、有効な量を指す。
本明細書での用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端にわたる。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在しなくてもよい。本明細書中で別途定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ番号付けシステムによるものである。
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体はもちろん、置換、付加又は欠失を生じさせる改変だが免疫グロブリンのエフェクター機能を媒介する能力（例えば、抗体依存性細胞傷害）を実質的に低下させない改変を有する変異体も含むことを意図したものである。例えば、生物学的機能を実質的に失うことなく、１つ又は複数のアミノ酸を免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。当該技術分野で公知の一般的規則に従って、活性に対してわずかな影響しか及ぼさないような変異体を選択することができる（例えば、Bowie, J. U.等、Science 247:1306-10(1990)を参照されたい）。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）（又はＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４という４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）内に、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４という配列で出現する。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために、本明細書では同義で使用される。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、同義で使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて、含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらには、初代形質転換細胞、及び継代数を問わずそれらに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量の点で親細胞と完全に同一でないこともあり、突然変異を含有することもある。最初に形質転換された細胞の中でスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が、ここに含まれる。一実施態様では、宿主細胞は、修飾されたオリゴ糖を有する抗体の産生を可能にするように操作される。ある特定の実施態様では、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する増加されたレベルの１つ又は複数のポリペプチドを発現するように、さらに操作されたものである。宿主細胞には、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げれば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞等の、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれている細胞も含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応する、又はヒト抗体レパートリーを用いる若しくはヒト抗体をコードする他の配列を用いる非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、厳密に言えば、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も多く存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、１−３巻におけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについてのサブグループは、上掲のＫａｂａｔ等におけるようなサブグループカッパＩである。一実施態様では、ＶＨについてのサブグループは、上掲のＫａｂａｔ等におけるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定実施態様ではヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つの、典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を任意選択的に含んでいてもよい。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される用語「超可変領域」、又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変性である、及び／又は構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、超可変ループからの及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、ＣＤＲは、配列可変性が最も高い及び／又は抗原認識に関与するものである。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、本明細書では抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及する際に同義で使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって及びＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、これらの文献における定義は、互いに比較したとき、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それでもなお、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及するためのどちらかの定義の適用は、本明細書中で定義され、使用されるこの用語の範囲内であると考えている。上記引用参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として下の表１に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズによって変わることになる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考えれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
1 表1中の全てのCDR定義の番号付けは、カバット等により記載された番号付け規定によるものである(下記参照)。
2 表1中で使用されている小文字「b」を伴う「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるようなCDRを指す。
カバット等は、任意の抗体に適用することができる可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体以外の何れの実験データにも頼らずに、「カバット番号付け」のこのシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される「カバット番号付け」は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって記載された番号付けシステムを指す。別途定めがない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムによるものである。
ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」、すなわち「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含有される。一般に、所与のＣＤＲ内の残基の５分の１から３分の１のみが抗原結合に関与する。特定のＣＤＲ内の特異性決定残基は、例えば、Ｐａｄｌａｎ等、ＦＡＳＥＢ Ｊ．９（１）：１３３−１３９（１９９５）に記載の方法に従って三次元モデル化からの原子間接触の計算及び所与の残基位置における配列可変性の決定により、同定することができる。例示的ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０−５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９−９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１−３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０−５８、及びＨ３のアミノ酸残基９５−１０２に存在する。（Almagro及びFransson、Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)を参照されたい）。別途指示がない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
「抗体コンジュゲート」又は「イムノコンジュゲート」は、細胞毒性剤にコンジュゲートしている抗体である。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から分離されたものである。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）により判定して、９５％又は９９％より高い純度に精製される。抗体純度の評定方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
「単離されたポリヌクレオチド」は、その天然の環境の成分から分離されたポリヌクレオチド分子を指す。単離されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド分子を元々含有する細胞に含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、前記ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその自然な染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗ＴｎＣ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を、単一のベクター又は別々のベクター内のそのようなポリヌクレオチド分子、及び宿主細胞内の１つ又は複数の位置に存在するそのようなポリヌクレオチド分子を含めて、指す。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体、例えば、天然に存在する突然変異を含有する変異抗体又はモノクローナル抗体の産生中に生じる変異抗体であって、一般に少量で存在するそのような変異体を除いて、同一である、及び／又は同一のエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られた場合の抗体の特徴を示すものであり、何れかの特定の方法による抗体の産生を求めるものとみなすべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な手法により作製することができ、そのような方法及びモノクローナル抗体の他の例示的作製方法は、本明細書中で説明される。
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在することもある。
「天然抗体」は、様々な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から構成されている、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの一方に割り当てることができる。
「実質的交差反応性がない」は、分子（例えば、抗体）が、その分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、その抗原と近縁の抗原）を認識せず、そのような抗原に、特にその実際の標的抗原と比較して、特異的に結合もしないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原の約１０％未満から約５％未満に結合することがあり、又は実際の標的抗原とは異なる前記抗原に、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、若しくは０．１％未満、好ましくは、約２％、１％、又は０．５％未満からなる群から選択される量で、最も好ましくは、実際の標的細胞抗原とは異なる抗原約０．２％又は０．１％未満に、結合することもある。
用語「添付文書」は、治療用製品の市販のパッケージの中に通例含まれている説明書であって、そのような治療用製品に関する適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
用語「親」抗体は、変異体の調製の出発点又は基礎として使用される抗体を指す。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大パーセントの配列同一性を達成するようにギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義する。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当該技術分野での技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、果たすことができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアライメントに適しているパラメータを決定することができる。しかし、本明細書では、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作物であり、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザー文書と共に出願され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であり、又はＡＬＩＧＨＮ−２プログラムをソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムを、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ操作システムでの使用用にコンパイルしたほうがよい。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変わらない。
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に利用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれに対するある特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、次のように算出される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により該プログラムのＡとＢのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同一でない場合、ＡのＢに対しての％アミノ酸配列同一性が、ＢのＡに対しての％アミノ酸配列同一性と同一にならないことは理解されるであろう。別途特に指定のない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸同一異性は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直ぐ前の段落で説明したように得たものである。
同様に、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個毎に５つ以下の点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図したものである。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％以下を欠失させてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換してもよく、又は参照配列中の全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの改変を、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置で行ってもよく、或いは参照配列内の残基又は参照配列内の１つ若しくは複数の近接する基内の残基間に個々に散在する、これらの末端位置の間のどこで行ってもよい。実際問題として、何れかの特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、上に列挙したもの等の、公知のコンピュータプログラムを使用して従来通りに決定することができる。
用語「薬学的製剤」は、含有する活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態である調製物であって、その製剤が投与されることになる対象にとって許容できないほど毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤物中の活性成分以外の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体としては、バッファー、添加剤、安定剤又は防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「テネイシンＣ」又は「ＴｎＣ」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然ＴｎＣを指す。この用語は、「完全長」のプロセッシングされていないＴｎＣ、並びに細胞内でのプロセッシングの結果として得られる任意の形態のＴｎＣを包含する。この用語は、ＴｎＣの天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴｎＣ抗原配列（Ｎ末端ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ、並びにＣ末端ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグを有する）のアミノ酸配列は、配列番号４で示される。例示的マウスＴｎＣ抗原配列（Ｎ末端ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ、並びにＣ末端ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグを有する）のアミノ酸配列は、配列番号５で示される。例示的カニクイザルＴｎＣ抗原配列（Ｎ末端ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ、並びにＣ末端ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグを有する）のアミノ酸配列は、配列番号６で示される。ヒトＴｎＣ分子に関して、５番目の定常フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインと６番目の定常フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン間に挿入され得る、９つ以下の選択的スプライシングを受けたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインが公知である（ＴｎＣのドメイン構造の模式図については、例えば、Orend及びChiquet-Ehrismann、Cancer Letters 244、143-163(2006)を参照されたい）。同様に、マウスＴｎＣ分子に関して、６つの選択的スプライシングを受けたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインが（例えば、Joestner and Faissner、J Biol Chem 274、17144-17151(1999)に）記載されている。
本明細書で使用される「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」等の文法上の語尾変化形）は、治療を受ける個体の疾患の自然な経過を改変しようとする臨床的介入を指し、予防のために行われることもあり、又は臨床病理検査の過程において行われることもある。治療の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症候の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を緩徐化するために使用される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、同様の構造を一般に有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔ等、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ｐ．９１（２００７）を参照されたい）。抗原結合特異性を付与するには単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離して、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、核酸分子であって、その核酸分子が連結されている別の核酸を伝達することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターはもちろん、導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含む。ある特定のベクターは、そのベクターが動作可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。
本明細書で使用される用語「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合マンノシドへのβ１−４結合におけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒することができるポリペプチドを指す。この用語には、特定の生物学的アッセイにおいて測定して、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）に従ってβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）としても公知のβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性と必ずしも同一の酵素活性とは限らないが同様の酵素活性を、用量に依存して又は依存せずに呈示する、融合タンパク質が含まれる。用量依存性が存在する場合、その用量依存性は、ＧｎＴＩＩＩのものと同一である必要はなく、むしろＧｎＴＩＩＩと比較して所与の活性に関するその用量依存性と実質的に同様である（すなわち、候補ポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩと比べて大きい活性を呈示するか、又はその約２５分の１以下、好ましくは約１０分の１以下の活性、最も好ましくは３分の１以下の活性を呈示することになる）。
本明細書で使用される用語「ゴルジ局在ドメイン」は、ゴルジ複合体内の位置へのポリペプチドの固定に関与するゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般に、局在ドメインは、酵素のアミノ末端「テール」を含む。
本明細書で使用される用語「操作する、操作された、操作すること」、特に接頭語「糖（glyco-）」を伴うもの、加えて用語「グリコシル化操作」は、天然に存在するポリペプチド若しくは組換えポリペプチド又はその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むと考えられる。グリコシル化操作には、細胞において発現された糖タンパク質のグリコシル化の改変を果たすためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作が含まれる。さらに、グリコシル化操作には、グリコシル化に対する突然変異及び細胞環境の作用が含まれる。一実施態様では、グリコシル化操作は、グルコシルトランスフェラーゼ活性の改変である。特定の実施態様では、この操作の結果として、グルコシルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性が改変されることになる。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ媒介細胞傷害性」は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及びヒトＦｃ領域を含有する可溶型Ｆｃ融合タンパク質により媒介される細胞傷害性を含む。これは、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「標的細胞」の溶解につながる免疫機構である。
本明細書で使用される用語「ヒト免疫エフェクター細胞」は、白血球の表面にＦｃ受容体を提示し、それによって抗体のＦｃ領域又はＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域と結合し、エフェクター機能を果たす、白血球の集団を指す。そのような集団としては、これらに限定されないが、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を挙げることができる。
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、Ｆｃ領域を含む抗原結合分子（例えば、Ｆｃ領域を含む抗体若しくはそれらの断片）又はＦｃ融合タンパク質が特異的に結合する細胞を指す。抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域のＮ末端側にあるタンパク質部分によって標的細胞と結合する。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ媒介細胞傷害性の増加」は、上で定義されたＦｃ媒介細胞傷害性機序による、所与の時間内に所与の抗体濃度若しくは所与のＦｃ融合タンパク質濃度で標的細胞を包囲する培地に溶解される「標的細胞」の数の増加、及び／又はＦｃ媒介細胞傷害性機序による、所与の時間内に所与の数の「標的細胞」の溶解を果たすために必要な、標的細胞を包囲する培地中の抗体若しくはＦｃ融合タンパク質の濃度の低下、のどちらかと定義される。Ｆｃ媒介細胞傷害性の増加は、同じ標準的産生、精製、製剤化及び保管方法（これらは、当業者に公知である）を使用して同じ型の宿主細胞により産生された同じ抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質だが、本明細書に記載の方法により改変されたグリコシル化パターンを有するように（例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、若しくは他のグルコシルトランスフェラーゼを発現するように）操作された宿主細胞により産生されたものではない抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質によって媒介される細胞傷害性と比べての増加である。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ媒介細胞傷害性の低下」は、上で定義されたＦｃ媒介細胞傷害性機序による、所与の時間内に所与の抗体濃度若しくは所与のＦｃ融合タンパク質濃度で標的細胞を包囲する培地に溶解される「標的細胞」の数の減少、及び／又はＦｃ媒介細胞傷害性機序による、所与の時間内に所与の数の「標的細胞」の溶解を果たすために必要な、標的細胞を包囲する培地中の抗体若しくはＦｃ融合タンパク質の濃度の増加、のどちらかと定義される。Ｆｃ媒介細胞傷害性の低下は、同じ標準的産生、精製、製剤化及び保管方法（これらは、当業者に公知である）を使用して同じ型の宿主細胞により産生された同じ抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質だが、抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸置換により修飾されていない抗原結合分子又はＦｃ融合タンパク質によって媒介される細胞傷害性と比べての低下である。
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増加又は低下された抗体は、この用語が本明細書中で定義される通り、当業者に公知の任意の好適な方法により判定してＡＤＣＣの増加又は低下を誘導する。１つの受入れられているインビトロＡＤＣＣアッセイは、次の通りである：
１）このアッセイは、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが公知である標的細胞を使用する、
２）このアッセイは、無作為に選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用する、
３）このアッセイは、次のプロトコールに従って行われる：
ｉ）標準的密度遠心分離手順を使用してＰＢＭＣを単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地に細胞５ｘ１０６個／ｍｌで懸濁させる、
ｉｉ）標的細胞を標準的組織培養法により増殖させ、９０％より高い生存率で指数増殖期から回収し、ＲＰＭＩ細胞培養培地で洗浄し、１００マイクロキューリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、細胞培養培地に細胞１０５個／ｍｌの密度で再懸濁させる、
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記最終標的細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す、
ｉｖ）抗体を細胞培養培地中４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌに段階希釈し、５０マイクロリットルの得られた抗体溶液を９６ウェルマイクロタイタープレートの標的細胞に添加し、上記全濃度範囲をカバーする様々な抗体濃度を３連で試験する、
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールについては、標識された標的細胞を収容しているプレートの３つのさらなるウェルに、抗体溶液（上記ポイントｉｖ）ではなく、５０マイクロリットルの非イオン性界面活性剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の２％（Ｖ／Ｖ）水溶液を加える、
ｖｉ）自然放出（ＳＲ）コントロールについては、標識された標的細胞を収容しているプレートの３つのさらなるウェルに、抗体溶液（上記ポイントｉｖ）ではなく、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を加える、
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを１分間、５０ｘｇで遠心分離し、そして１時間、４℃でインキュベートする、
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記ポイントｉ）を各ウェルに添加して、２５：１のエフェクター：標的細胞比を得、プレートを３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーターの中に４時間入れておく、
ｉｘ）各ウェルから無細胞上清を回収し、ガンマカウンターを使用して実験的放出放射能（ＥＲ）を定量する、
ｘ）各抗体濃度についての特異的溶解率を、式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００（式中、ＥＲは、その抗体濃度について定量された平均放射能（上記ポイントｉｘ参照）であり、ＭＲは、ＭＲコントロール（上記ポイントｖ参照）について定量された平均放射能（上記ポイントｉｘ参照）であり、ＳＲは、ＳＲコントロール（上記ポイントｖｉ参照）について定量された平均放射能（上記ポイントｉｘ参照）である）に従って算出する、
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上で試験した抗体濃度範囲内で観察される最大特異的溶解率の増加、及び／又は上で試験した抗体濃度範囲内で観察される最大特異的溶解率の２分の１を達成するために必要される抗体の濃度の低下、のどちらかと定義される。ＡＤＣＣの増加は、当業者に公知である同じ標準的産生、精製、製剤化及び保管方法を使用して同じ型の宿主細胞により産生された同じ抗体だが、ＧｎＴＩＩＩを過剰発現するように操作された宿主細胞により産生されたものではない抗体よって媒介される、上記アッセイで測定される、ＡＤＣＣと比べての増加である。「ＡＤＣＣの低下」は、上で試験した抗体濃度範囲内で観察される最大特異的溶解率の低下、及び／又は上で試験した抗体濃度範囲内で観察される最大特異的溶解率の２分の１を達成するために必要とされる抗体の濃度の増加、のどちらかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、当業者に公知である同じ標準的産生、精製、製剤化及び保管方法を使用して同じ型の宿主細胞により産生された同じ抗体だが、抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸置換により修飾されていない抗体によって媒介される、上記アッセイで測定される、ＡＤＣＣと比べての低下である。
ＩＩ．組成物及び方法
テネイシンＣ（ＴｎＣ）の選択的スプライシングを受けた異なるアイソフォームは、ある特定の病的状態で特異的に発現されるが健常成人組織には本質的に存在せず、したがって、ＴｎＣ標的抗体には大きな治療上の可能性がある。本発明は、ＴｎＣと結合する抗体、特に、高いアフィニティー及び向上した種間交差反応性を有する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えば、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患、例えばがん、の診断又は治療に有用である。
本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、ＴｎＣに特異的結合する抗体であって、アフィニティー及び／又は種間交差反応性が向上された抗体を提供する。
一実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗体は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５若しくは６つ）の重鎖若しくは軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は前記ＣＤＲの特異性決定残基（ＳＤＲ）を少なくとも含有する領域の変異体若しくは切断型を含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、（ａ）配列番号４９及び配列番号５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５０及び配列番号５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５１及び配列番号５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全ての重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号４９及び配列番号５２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５０及び配列番号５３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５１及び配列番号５４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、又は前記ＣＤＲについてのＳＤＲを少なくとも含有する重鎖可変領域の変異体若しくは切断型を含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、（ａ）配列番号３７及び配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３８及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号３９及び配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全ての軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。さらなる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号３７及び配列番号４０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３８及び配列番号４１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号３９及び配列番号４２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３、を含む、軽鎖可変領域、又は前記ＣＤＲについてのＳＤＲを少なくとも含有する軽鎖可変領域の変異体若しくは切断型を含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号４９及び配列番号５２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１と、配列番号５０及び配列番号５３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２と、配列番号５１及び配列番号５４からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１とを含む、重鎖可変領域；及び配列番号３７及び配列番号４０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号３８及び配列番号４１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号３９及び配列番号４２からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１とを含む、軽鎖可変領域；又は前記ＣＤＲについてのＳＤＲを少なくとも含有する可変領域の変異体若しくは切断型を含む。
さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１と、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２と、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域；及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１と、配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２と、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域；及び配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号２８及び配列番号３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号２８及び配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
ある特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ＴｎＣ抗体は、ＴｎＣと結合する能力を保持する。ある特定の実施態様では、配列番号２８又は配列番号３０における合計１から１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲ又はＣＤＲ外の領域で（すなわち、ＦＲ内で）行われる。任意選択的に、本発明による抗ＴｎＣ抗体は、配列番号２８又は配列番号３０のＶＨ配列を含み、この配列は、この配列の後翻訳修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３について配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４に記載の配列から選択される１、２又は３つの重鎖ＣＤＲを含む。
別の実施態様では、本発明の抗体は、配列番号２７及び配列番号２９からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の実施態様では、抗体は、配列番号２７及び配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ＴｎＣ抗体は、ＴｎＣと結合する能力を保持する。ある特定の実施態様では、配列番号２７又は配列番号２９における合計１から１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲ又はＣＤＲ外の領域で（すなわち、ＦＲ内で）行われる。任意選択的に、本発明の抗ＴｎＣ抗体は、配列番号２７又は配列番号２９のＶＬ配列を含み、この配列は、この配列の後翻訳修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３について配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２に記載の配列から選択される１、２又は３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
別の態様では、上で提供された実施態様の何れかにおけるようなＶＨと、上で提供された実施態様の何れかにおけるようなＶＬとを含む、抗ＴｎＣ抗体が提供される。一実施態様では、抗体は、配列番号２８及び配列番号３０の群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７及び配列番号２９の群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗体は、配列番号２８又は配列番号３０及び配列番号２７又は配列番号２９のＶＨ及びＶＬ配列をそれぞれ含み、これらの配列は、これらの配列の後翻訳修飾を含む。
具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様では、上記実施態様の何れかによる抗体は、さらに、Ｆｃ領域を含むか、又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域、特にＩｇＧ Ｆｃ領域、最も特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。特定の実施態様では、本発明の抗体は、完全長抗体、特にＩｇＧクラス抗体、最も特にＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。別の実施態様では、本発明の抗体は、ｓｄＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片の群から選択される、抗体断片である。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を有する抗体断片であるか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質である。一実施態様では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、キメラのものであり、より具体的にはヒト化されたものである。特定の実施態様において、本発明の抗体は、ヒトのものである。別の実施態様では、本発明の抗体は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、最も特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ定常領域、特にヒトＩｇＧ１定常領域である。一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖領域を含み、前記重鎖領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ重鎖領域、特にヒトＩｇＧ１重鎖領域である。具体的な実施態様では、抗体は、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖領域を含む。別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号５９及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖領域を含む。さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖領域、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖領域、及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体であって、ａ）Ｆｃ領域を含むか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む、配列番号６０及び配列番号６２からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖領域、又は配列番号５９及び配列番号６１からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖領域、又はこれらの組合せを含む、抗体を提供する。
一実施態様では、向上したアフィニティーを有する、本発明の抗体を提供する。一実施態様では、本発明の抗体は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）と、約１μＭ未満から約０．０１ｎＭの解離定数（ＫＤ）値、特に約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。具体的な実施態様では、本発明の抗体は、ヒトテネイシンＣ（ＴｎＣ）と、約１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣと結合する。一実施態様では、本発明の抗体は、種間交差反応性を有する。別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＣドメインと結合する。一実施態様では、本発明の抗体は、種間交差反応性を有する。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満又は２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。具体的な実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗体は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗体は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、約１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満又は２ｎＭ未満である。なおさらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗体は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗体は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、１０ｎＭから０．１ｎＭの範囲、５ｎＭから０．１ｎＭの範囲、又は２ｎＭから０．１ｎＭの範囲である。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗体は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗体は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、２０倍のＫＤ範囲内である。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗体は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗体は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、１０倍のＫＤ範囲内である。一実施態様では、本発明の抗体は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤからなる群から選択されるＴｎＣドメインのうちの少なくとも１つに特異的である。一実施態様では、Ａ１、Ａ４及びＣからなる群から選択されるＴｎＣドメインのうちの少なくとも１つと特異的に結合することができる抗体が提供される。一実施態様では、本発明の抗体は、ＴｎＣドメインＡ１及びＡ４に特異的である。一実施態様では、本発明の抗体は、ＴｎＣドメインＣに特異的である。具体的な実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣの、Ａ１ドメインと及びＡ４ドメインと結合する。別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＣドメインと結合する。一実施態様では、本発明の抗体は、種間交差反応性を有する。より具体的な実施態様では、本発明の抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣ Ａ１のＡ１ドメインと、並びにヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣ Ａ４のＡ４ドメインと、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満又は約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。ＫＤ値は、抗体をＦａｂ又はＩｇＧとして使用して表面プラズモン共鳴により決定される。一実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗体は、ヒト組織内のＴｎＣに結合する。
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含み、前記抗体は、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む本発明の抗体は、親非置換Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、エフェクター機能が低下されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている。具体的な実施態様では、前記親非置換Ｆｃ領域は、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換Ｆｃ領域は、親非置換Ｆｃ領域と比べて、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体であって、ａ）配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖領域と、配列番号５９及び配列番号６１からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖領域とを含む、抗体を提供する。具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号６５及び配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖領域を含む。さらなる実施態様では、置換Ｆｃ領域を含む抗体は、親非置換重鎖領域を含む抗体と比較して、エフェクター機能が低下されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている。さらなる具体的な実施態様では、前記置換Ｆｃ領域を含む本発明の抗体は、親非置換Ｆｃ領域と比べてアミノ酸置換Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ＦｃγＲ及びＣ１ｑとの結合が消失される、及び／又はＦｃ媒介エフェクター機能が消失される。一実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能が低下されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている。一実施態様では、エフェクター機能の低下及び／又はＦｃ受容体結合の減少は、抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸置換の結果である。エフェクター機能の低下は、これらに限定されないが、次のうちの１つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介細胞傷害性の低下（抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下を含む）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の減少、マクロファージへの結合の減少、単球への結合の減少、多形核細胞への結合の減少、樹状細胞成熟の減少、又はＴ細胞プライミングの減少。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの低下である。別の特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの消失である。Ｆｃ受容体結合の減少は、好ましくは、活性化Ｆｃ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の減少である。一実施態様では、本発明の抗体は、治療有効量で個体に投与されたとき、臨床的に有意なレベルの毒性の原因とならない。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体であって、ａ）配列番号２８及び配列番号３０からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号２７及び配列番号２９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又はこれらの組合せと、ｂ）Ｆｃ領域、又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域とを含む、抗体を提供する。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域は、糖改変Ｆｃ領域である。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、Ｆｃ領域に修飾オリゴ糖を有するように糖改変される。具体的な実施態様では、抗体は、非糖改変抗体と比較して、Ｆｃ領域内の二分されたオリゴ糖の割合が増加されている。より具体的な実施態様では、抗体のＦｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％は、二分されている。二分されたオリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。別の具体的な実施態様では、本発明の抗体は、非糖改変抗体と比較して、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている。より具体的な実施態様では、抗体のＦｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％は、フコシル化されていない。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。特定の実施態様では、本発明の抗体は、非糖改変抗体と比較して、Ｆｃ領域内の二分された非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている。具体的には、抗体は、Ｎ結合型オリゴ糖の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、少なくとも約３５％又は少なくとも約５０％が、二分されており、フコシル化されていない、Ｆｃ領域を含む。二分された非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。一実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能が増加されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが増大されている。エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、例えば、抗体の糖改変及び／又はアフィニティー成熟に起因し得る。一実施態様では、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、抗体のＦｃ領域の糖改変の結果である。別の実施態様では、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、アフィニティーの増大と糖改変の組合せの結果である。エフェクター機能の増加は、これらに限定されないが、次のうちの１つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加を含む）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。特定の実施態様では、エフェクター機能の増加は、ＡＤＣＣの増加である。Ｆｃ受容体結合の増加は、好ましくは、活性化Ｆｃ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。一実施態様では、本発明の抗体は、治療有効量で個体に投与されたとき、臨床的に有意なレベルの毒性の原因とならない。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーの増大を有するように糖改変されている、抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーの増大を有するように糖改変されている、抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、抗体であり、親非置換Ｆｃ領域が、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換されているＦｃ領域が、親非置換Ｆｃ領域と比べてＬｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み、置換されているＦｃ領域を含む当該抗体が、親非置換Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、エフェクター機能が低下されており、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている、抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、抗体であり、親非置換Ｆｃ領域が、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換されているＦｃ領域が、親非置換Ｆｃ領域と比べてＬｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み、置換されているＦｃ領域を含む当該抗体が、親非置換Ｆｃ領域を含む抗体と比較して、エフェクター機能が低下されており、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている、抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ａ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ａ）配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖領域と、配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域とを含む抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖領域と、配列番号６１の群から選択されるアミノ酸を含む軽鎖領域とを含む、抗体を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗体を提供する。
別の特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている、及び／又は二分されたオリゴ糖の割合が増加されている、抗体を提供する。別の特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗体であって、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている、及び／又は二分されたオリゴ糖の割合が増加されている、抗体を提供する。
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体であって、親抗体の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗体を提供する。例えば、抗体は、親抗体の１つ又は複数の超可変領域又はＣＤＲ（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの超可変領域又はＣＤＲ）に、少なくとも１つの、例えば、約１つから約１０（すなわち、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）、特に、約２つから約５つの置換を含み得る。
加えて、抗体は、親抗体と比較して、重鎖又は軽鎖どちらかの１つ又は複数のフレームワーク領域に１つ又は複数の付加、欠失及び／又は置換も含み得る。一実施態様では、少なくとも１つのＣＤＲにおける前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、その親抗体と比較して、抗体の結合アフィニティーの増加の一因となる。別の実施態様では、前記抗体は、ＴｎＣに対して親抗体より少なくとも約２倍から約１０倍大きいアフィニティーを（本発明の抗体と親抗体を同じ形式、例えばＦａｂ形式で比較したとき）有する。さらに、親抗体に由来する抗体は、本発明の抗体に関して上段で説明した特徴の何れかを、単独で又は組合せで取り入れることができる。
本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドも提供する。一態様では、本発明は、上文に記載の本発明による抗ＴｎＣ抗体の一部を形成するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。一実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、上文に記載の本発明による抗ＴｎＣ抗体の一部を構成する、抗体重鎖及び／又は軽鎖をコードする。
一実施態様では、本発明は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４に記載の重鎖若しくは軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５若しくは６つ）をコードする配列、又は前記ＣＤＲについての特異性決定残基（ＳＤＲ）を少なくとも含有する配列の変異体若しくは切断型を含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４から選択される３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）若しくは３つの軽鎖ＣＤＲ（例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）をコードする配列、又は前記３つの相補性決定領域の各々についてのＳＤＲを少なくとも含有する配列の変異体若しくは切断型を含む。さらに別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４から選択される３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖軽鎖ＣＤＲ（例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）をコードする配列を含む。特定の実施態様では、１つ又は複数のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８のＣＤＲヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２８及び配列番号３０の群から選択される重鎖可変領域をコードする配列、並びに／又は配列番号２７及び配列番号２９の群から選択される軽鎖可変領域をコードする配列を含む。特定の実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６からなる可変領域ヌクレオチド配列の群からなる群から選択される選択される配列、又はそれらの組合せを含む。
具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２８及び配列番号３０の群から選択される重鎖可変領域をコードする配列と、重鎖定常領域、特にヒト重鎖定常領域、をコードする配列とを含む。特定の実施態様では、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域、特にヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。別の具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７及び配列番号２９の群から選択される軽鎖可変領域をコードする配列と、軽鎖定常領域、特にヒト軽鎖定常領域、をコードする配列とを含む。
一実施態様では、本発明は、配列番号５９及び配列番号６１からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第１の単離されたポリヌクレオチドと、配列番号６０及び配列番号６２からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第２の単離されたポリヌクレオチドとを含む、組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号５９及び配列番号６１からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む第１の単離されたポリヌクレオチドと、配列番号６５及び配列番号６６からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む第２の単離されたポリヌクレオチドとを含む、組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、上文に記載の本発明によるポリヌクレオチドの何れかによりコードされている、単離されたポリペプチドにも関する。
さらなる態様では、上記実施態様の何れによる抗ＴｎＣ抗体も、下記セクション１−７で説明されるような特徴の何れかを、単独で又は組合せで取り入れることができる。
１．抗体アフィニティー
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。一実施態様では、ＫＤは、下記のアッセイにより説明されるような、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって、測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合アフィニティーは、非標識抗原の滴定系列の存在下、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡させ、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコートされたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することにより測定される（例えば、Chen等、J. Mol.Biol.293:865-881(1999)を参照されたい）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が５０ｍＭ 炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングされ、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２から５時間、室温（おおよそ２３℃）でブロックされる。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［１２５Ｉ］−抗原が目的のＦａｂの段階希釈物（例えば、Presta等、Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２、の評定と一致する）と混合される。次いで、目的のＦａｂが一晩インキュベートされるが、確実に平衡に達するためにこのインキュベーションをより長期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物は、室温での（例えば１時間の）インキュベーションのために捕捉プレートに移される。次いで、溶液が除去され、プレートは、ＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄される。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）が添加され、プレートはＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントされる。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度が競合結合アッセイでの使用に選択される。
別の実施態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、２５℃で、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ）を供給業者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、その後、おおよそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を獲得するために５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、１Ｍ エタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。反応速度論的な測定のために、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中のＦａｂの２倍段階希釈物（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、おおよそ２５μｌ／分の流速で注入する。単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、結合及び解離センソグラムの同時フィッティングにより、結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。会合速度が、上記表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合には、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定されるような、漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭ 抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ、放出＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することにより、会合速度を決定することができる。
２．抗体断片
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ断片、並びに下記の他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加されている、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の論考については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。
ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０、６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部分又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照されたい）である。
抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の様々な手法によって作製することができる。
３．キメラ及びヒト化抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又は非ヒト霊長類、例えばサル、に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。
ある特定の実施態様では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的に、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及びアフィニティーを保持しながらヒトに対する免疫原性が低下されるようにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ（又はそれらの部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はそれらの部分）がヒト抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部分も任意選択的に含むことになる。一部の実施態様では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又はアフィニティーを回復又は向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９−１６３３（２００８）に概説があり、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４（２００５）（該文献にはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化が記載されている）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９−４９８（１９９１）（該文献には「リサーフェーシング」が記載されている）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（該文献には「ＦＲシャッフリング」が記載されている）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８３：２５２−２６０（２０００）（該文献にはＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチが記載されている）に記載されている。
ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims等、J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照されたい）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:4285 (1992)；及びPresta等、J. Immunol.、151:2623 (1993)を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク（例えば、Almagro及びFransson、Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照されたい）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングから誘導されたフレームワーク領域（例えば、Baca等、J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及びRosok等、J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
４．ヒト抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な手法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に一般的に記載されている。
ヒト抗体は、抗原曝露に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。そのような動物は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座に置き換わっている、又は染色体外に存在する若しくはその動物の染色体に無作為に組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部分を典型的に有する。そのようなトランスジェニックマウスの場合、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術が記載されている米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号、ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術が記載されている米国特許第５７７０４２９号、Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術が記載されている米国特許第７０４１８７０号、並びにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術が記載されている米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物により生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾することができる。
ヒト抗体を、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫（heteromyeloma）細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol.、133: 3001 (1984)；Brodeur等、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、p51-63（Marcel Dekker, Inc.、New York、1987）；及びBoerner等、J. Immunol.、147: 86 (1991)を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体も、Ｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生が記載されている）及びＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマが記載されている）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７−９３７（２００５）、並びにＶｏｌｌｍｅｒｓ及びＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成することもできる。その後、そのような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する手法は、下で説明される。
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性（一又は複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成するための、及び所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための、様々な方法が、当該技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）に概説があり、例えば、さらに、ｔｈｅ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ及びＢｒａｄｂｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）；Ｓｉｄｈｕ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；並びにＬｅｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。
ある特定のファージディスプレイ方法では、Ｗｉｎｔｅｒ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーの中で無作為に再び組み合わせられ、次いで、それらが抗原結合ファージについてスクリーニングされる。ファージは、概して、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として提示するか、又はＦａｂ断片として提示する。免疫化された源からのライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高アフィニティー抗体が得られる。或いは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、ＥＭＢＯ Ｊ、１２：７２５−７３４（１９９３）により記載されているように、一切の免疫化なしに、天然レパートリーを（例えばヒトから）クローニングして広範な非自己及びまた自己抗原に対する抗体の単一の源を得ることができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１−３８８（１９９２）により記載されているように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングすること、並びに高可変性ＣＤＲ３領域をコードするために及びインビトロで再配列を果たすためにランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することにより、天然ライブラリーを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許公報としては、例えば、米国特許第５７５０３７３号並びに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体断片と見なされる。
６．多重特異性抗体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性断片である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、結合特異性の一方は、ＴｎＣに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＴｎＣの２つの異なるエピトープと結合することができる。二重特異性抗体を使用して、ＴｎＣを発現する細胞に細胞傷害性剤を局在させることもできる。二重特異性抗体を完全長抗体として又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製する技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現（Milstein及びCuello、Nature 305: 537 (1983)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等、EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照されたい）、及び「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５７３１１６８を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するために静電的ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号Ａ１）、２つ以上の抗体又は断片を架橋させること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan等、Science、229: 81 (1985)を参照されたい）、二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny等、J. Immunol.、148(5):1547-1553 (1992)を参照されたい）、二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444-6448 (1993)を参照されたい）、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber等、J. Immunol.、152:5368 (1994)を参照されたい）、並びに例えばTutt等、J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように三重特異性抗体を調製することにより、多重特異性抗体を作製することもできる。
「オクトパス抗体」をはじめとする、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する操作された抗体もここに含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号Ａ１を参照されたい）。
本明細書における抗体又は断片には、ＴｎＣとはもちろん別の異なる抗原とも結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」すなわち「ＤＡＦ」（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号）も含まれる。
７．抗体変異体
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合アフィニティー及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、該抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって、調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／又は前記アミノ酸配列への残基の挿入、及び／又は前記アミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有するのであれば、欠失、挿入及び置換をどのように組み合わせて最終コンストラクトに達してもよい。
ａ）置換、挿入及び欠失変異体
ある特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異の対象となる部位としては、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換は、表２中の「保存的置換」という見出しの下に示される。より大きな変化は、表２中の「例示的置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスに関しては下でさらに説明される通りである。目的の抗体にアミノ酸置換を導入し、それらの産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの向上についてスクリーニングすることができる。
アミノ酸を共通側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１クラスのメンバーを別のクラスと交換することを必然的に伴うことになる。
１つのタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる研究に選択される、結果として得られる変異体は、親抗体と比較してある特定の生物学的特性の修飾（例えば、向上）（例えば、アフィニティーの増大、免疫原性の低下）を有することになり、及び／又は親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持していることになる。例示的な実質的変異体は、アフィニティー成熟した抗体であり、この抗体は、例えば、ファージディスプレイに基づくアフィニティー成熟手法、例えば本明細書に記載の手法を使用して生成することができる。簡単に言うと、１つ又は複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングする。
例えば抗体アフィニティーを向上させるために、ＨＶＲに改変（例えば、置換）を加えることができる。ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞突然変異プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされている残基（例えば、Chowdhury、Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照されたい）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）に、そのような改変を加えて、結果として得られる変異ＶＨ又はＶＬを結合アフィニティーについて試験することができる。二次ライブラリーからの構築及び再選択によるアフィニティー成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、（２００１）に記載されている。アフィニティー成熟の一部の実施態様では、様々な方法の何れか（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、又はオリゴヌクレオチド指定変異）により、成熟について選択された可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作出される。次いで、所望のアフィニティーを有する任意の抗体変異体を同定するためにそのライブラリーがスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、１度に４−６残基）が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して、抗原結合に関与するＨＶＲ残基を特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は標的とされることが多い。
ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失を、そのような改変が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させないのであれば、１つ又は複数のＨＶＲ内で行うことができる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。そのような変異は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外部に存在することもある。上記で提供された変異ＶＨ及びＶＬ配列の一部の実施態様では、各ＨＶＲは、改変されないか、又は１つ、２つ若しくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、荷電残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ）の残基又は群が同定され、中性又は負荷電アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換され、それによって、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが判定される。最初の置換に対する官能基の感受性を立証するために、さらなる置換がアミノ酸位置に導入してもよい。或いは、又は加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原間の接点を同定することができる。そのような接触残基及び隣接残基を置換の候補として、標的にしてもよく、又は除去してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを判定してもよい。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまで長さに幅があるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。前記抗体分子の他の挿入変異体は、前記抗体の血清半減期を増加させる、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのためのもの）又はポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端の融合を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
一部の実施態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾を行って、ある特定の特性向上を有する抗体変異体を作出することができる。一態様では、本発明は、抗体依存性細胞傷害をはじめとするエフェクター機能が増加された抗ＴｎＣ抗体のグリコフォームを提供する。抗体のグリコシル化操作は、以前に記載されている。例えば、その全内容が本明細書に参照により援用される米国特許第６６０２６８４号を参照されたい。グリコシル化に関与する遺伝子の活性が改変された宿主細胞から抗ＴｎＣ抗体を産生する方法も、本明細書で詳細に説明される（例えば、下記の「組換え方法及び組成物」という表題のセクションを参照されたい）。
二分されたオリゴ糖を有する抗体であって、例えば、抗体のＦｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている抗体が提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有することができる。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ等）、米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａ等）、及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ等）に記載されている。
一実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗体は、Ｆｃ領域内の二分されたオリゴ糖の割合が、本発明の方法によるそれらのオリゴ糖の修飾の結果として増加されている。一実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗体のＦｃ領域内の二分されたＮ結合型オリゴ糖のパーセンテージは、全オリゴ糖の少なくとも約１０％から約１００％、具体的には、少なくとも約５０％、より具体的には、少なくとも約も６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０−９５％である。二分されたオリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。
別の実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗体は、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が、本発明の方法によるそれらのオリゴ糖の修飾の結果として増加されている。一実施態様では、非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、少なくとも約２０％から約１００％、具体的には、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％から約７０％、より具体的には、少なくとも約７５％である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。
フコースの量は、例えば亜国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定されるＡｓｎ２９７に結合している全ての糖構造体（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造体）の合計に対して糖鎖内のＡｓｎ２９７におけるフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体内の小さい配列差異に起因して２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流に、すなわち、２９４位と３００位の間に位置することもある。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによりＮ−グリコシダーゼＦ処理試料（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造体）において同定された全ての糖構造体に対するフコース含有構造体のパーセンテージである。そのようなフコシル化変異体は、ＡＤＣＣ機能の向上を有することができる。
本発明の抗ＴｎＣ抗体と共に使用することができる糖鎖工学方法論は、より詳細に、米国特許第６６０２６８４号、米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号Ａ１、米国特許出願公開第２００３／０１７５８８４号Ａ１、米国特許仮出願第６０／４４１３０７号及び国際公開第２００４／０６５５４０号に記載されており、前記特許文献の全内容は、その全内容が本明細書に参照により援用される。或いは、本発明の抗ＴｎＣ抗体を、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に、又は欧州特許第１１７６１９５号Ａ１、国際公開第０３／０８４５７０、国際公開第０３／０８５１１９号及び米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、同第２００４／０９３６２１号、同第２００４／１１０２８２号、同第２００４／１１０７０４号、同第２００４／１３２１４０号、Ｎｉｗａ等、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６、１５１／１６０（２００６）、米国特許第６９４６２９２号（協和発酵工業株式会社）に開示されている手法に従って、Ｆｃ領域内のフコース残基が低減されるように糖改変することができる。米国特許出願公開第６０／３４４１６９号及び国際公開第０３／０５６９１４（ＧｌｙｃｏＦｉ，Ｉｎｃ．）に又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第２００４／０２４９２７号（Ｇｒｅｅｎｏｖａｔｉｏｎ）に教示されているもの等の、修飾糖タンパク質を産生する発現系で、本発明の糖改変抗ＴｎＣ抗体を産生することもできる。
「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する公表文献さらなる例としては、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka等、Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１、Ａｄａｍｓ等、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki等、Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等、Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）が挙げられる。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、該抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。グリコシル化部位の抗体への付加又はグリコシル化部位の欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作出又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって果たすことができる。
Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣ機能の向上を有することができる。そのような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（（Ｐａｔｅｌ等）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
本発明の抗ＴｎＣ抗体のＡＤＣＣ又は他のエフェクター機能の増加は、ＴｎＣに対する抗原結合分子のアフィニティーを増加させることにより、例えば、アフィニティー成熟若しくは他のアフィニティー向上方法（Tang等、J. Immunol. 2007、179:2815-2823を参照されたい）により、又は下で説明されるようなＦｃ領域のアミノ酸修飾により、果たすことができる。これらの手法の組み合わせも本発明により包含される。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することによってＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る
ある特定の実施態様では、本発明は、抗体変異体であって、インビボでの抗体の半減期は重要であるがある特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）は不必要又は有害である応用のための望ましい候補に該抗体をする、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を企図している。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／喪失を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠いている（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）がＦｃＲｎ結合能力を保持することを保証することができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩしか発現しないが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、本明細書に、並びに米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I.等、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号（Bruggemann, M.等、J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照されたい）に記載されている。或いは、非放射性方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているもの等の動物モデルにおいて、評定することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認することもできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro等、Ｊ Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等、Blood 101:1045-1052 (2003)；並びにCragg, M.S.及びM.J. Glennie、Blood 103:2738-2743 (2004)を参照されたい）。当技術分野において公知の方法（例えば、Petkova, S.B.等、Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照されたい）を使用して、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定を行うこともできる。
一態様では、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合アフィニティー及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的に、同じ１つ又は複数のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５位（ＥＵ番号付け）並びに／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より特に、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む、本発明による抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ突然変異を指す。アミノ酸置換の組合せ「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」は、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、国際特許出願公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載されており、この参考特許文献には、そのような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びその特性、例えば、Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能を判定する方法も記載されている。
Ｆｃ受容体結合が低減された及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ又は複数についての置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２カ所以上に置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許７３３２５８１号）。
別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合アフィニティーの低下及びエフェクター機能の低下を呈示する。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）にアミノ酸置換を含む、特に、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン突然変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
ＦｃＲへの結合が改善又は減少されたさらなる抗体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields等、J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照されたい）。ある特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを向上させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。一部の実施態様では、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の改変（すなわち、向上又は減少、のどちらか）をもたらす改変がＦｃ領域に加えられる。
Ｆｃドメインのエフェクター機能、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣの測定に好適なアッセイは、本明細書で説明される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３、７０５９−７０６３（１９８６）；及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２、１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６、１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。或いは、非放射性アッセイの方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、６５２−６５６（１９９８）に開示されているもの等の動物モデルにおいて、評定することができる。
一部の実施態様では、補体成分への、特にＣ１ｑへの、Ｆｃドメインの結合が低減される。したがって、エフェクター機能を低下させるようにＦｃドメインを操作する一部の実施態様では、前記エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下を含む。本発明の抗体が、Ｃ１ｑに結合することができるかどうか、及びそれ故にＣＤＣ活性を有するかどうかを判定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行ってもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro等、J Immunol Methods 202、163(1996);Cragg等、Blood 101、1045-1052(2003);並びにCragg及びGlennie、Blood 103、2738-2743(2004)を参照されたい）。
半減期の増加、及び胎児への母性ＩｇＧの伝達に関与する新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の向上（Guyer等、J. Immunol. 117:587 (1976)、及びKim等、J. Immunol. 24:249 (1994)）を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ等）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる１つ又は複数の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ又は複数における置換、例えば、Ｆｃ残基４３４の置換（米国特許第７３７１８２６号）を有するものが含まれる。
Ｆｃ領域変異体に関するさらなる例については、米国特許出願第６０／４３９４９８号、同第６０／４５６０４１号、同第６０／５１４５４９号；又は国際公開第２００４／０６３３５１号（アミノ酸修飾に起因して結合アフィニティーが増大された変異Ｆｃ領域）；又は米国特許出願第１０／６７２２８０号若しくは国際公開第２００４／０９９２４９号（アミノ酸修飾に起因してＦｃγＲへの結合が改変されたＦｃ変異体）、Ｄｕｎｃａｎ及びＷｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５６４８２６０号、米国特許第５６２４８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある特定の態様では、システイン操作抗体、例えば、当該抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作出することが望ましいこともある。特定の実施態様では、置換される残基は、抗体の到達可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、その結果として反応性チオール基は抗体の到達可能な部位に位置し、その反応性チオール基を使用して抗体を他の部分、例えば、薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせて、本明細書中でさらに説明されるようなイムノコンジュゲートを作出することができる。ある特定の実施態様では、次の残基の何れか１つ又は複数をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成することができる。
ｅ）抗体誘導体
ある特定の実施態様では、当該技術分野で公知であり、容易に利用できる、さらなる非タンパク質性部分を含有するように、本明細書で提供される抗体をさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーが含むが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体のどちらか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、何れの分子量のものであってもよく、及び分岐していてもよく、又は分岐していなくてもよい。抗体に結合しているポリマーの数は様々であってよく、１つより多くのポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、これらに限定されないが、抗体の向上させるべき特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されることになるかどうか等を含む、考慮事項に基づいて、決定することができる。
別の実施態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することができる、抗体と非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブ（Kam等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605(2005)）である。放射線は、何れの波長のものであってもよく、抗体−非タンパク質性部分の近位にある細胞が殺滅される温度に非タンパク質性部分を加熱するが通常の細胞を害さない波長を含むが、これに限定されない。
組換え方法及び組成物
例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して抗体を産生することができる。一実施態様では、本明細書に記載の抗ＴｎＣ抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。そのようなポリヌクレオチドは、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。さらなる実施態様では、そのようなポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）が提供される。さらなる実施態様では、そのようなポリヌクレオチド又はそのようなベクターを含む、宿主細胞が提供される。１つのそのような実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列と抗体のＶＨを含むアミノ酸配列とをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、ポリシストロニックベクター）、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む（例えば、それらで形質転換されている）。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＴｎＣ抗体を作製する方法であって、上で提供したような抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該抗体の発現に好適な条件下で培養するステップ、及び任意選択で、前記宿主細胞(又は宿主細胞培養培地）から前記抗体を回収するステップを含む方法が提供される。
抗ＴｎＣ抗体の組換え産生の場合、抗体、例えば上記の抗体、をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、単離され、１つ又は複数のベクターに挿入される。当業者に周知である方法を使用して、抗ＴｎＣ抗体のコード配列を適切な転写／翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、組換えＤＮＡ手法、合成手法及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載されている手法を参照されたい。
一実施態様では、抗ＴｎＣ抗体をコードする１つ又は幾つかのポリヌクレオチドを構成的プロモーター又は代替的に調節発現系の制御下で発現させることができる。好適な調節発現系としては、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、ｌａｃ−ｓｗｉｔｃｈ発現系、グルココルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーターシステム、及びメタロチオネイン金属誘導性発現系が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体をコードする幾つかの異なるポリヌクレオチドが宿主細胞系内に含まれている場合、それらの一部を構成的プロモーターの制御下で発現させることができるが、他のものは、調節プロモーターの制御下で発現される。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核及び真核細胞が含まれる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、抗体を細菌において産生させてもよい。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号及び同第５８４０５２３号を参照されたい。（大腸菌における抗体断片の発現が記載されている、Charlton、Methods in Molecular Biology、248巻（B.K.C. Lo編、Humana Press、Totowa、NJ、2003）、p245-254も参照されたい）。発現後、抗体を可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、そしてさらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、抗体をコードするベクターのための好適なクローニング又は発現宿主であり、そのような糸状菌又は酵母等の真核微生物には、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的又は完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生することになる、真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２、１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ等、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４、２１０−２１５（２００６）を参照されたい。そのような発現系は、米国特許出願第６０／３４４１６９及び国際公開第０３／０５６９１４（非ヒト真核生物宿主細胞においてヒト様糖タンパク質を産生する方法）にも教示されている。
グリコシル化された抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。非常に多数のバキュロウイルス株が同定されており、それらは、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用され得る。植物細胞培養物も宿主として用いることができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号を参照されたい（これらの特許文献には、トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術が記載されている）。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態での増殖に適応する哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎臓系（例えば、Graham等、J Gen Virol 36:59(1977)に記載の、２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather、Biol. Reprod. 23:243-251(1980)に記載の、ＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等、Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982)に記載のもの）；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980)）をはじめとするチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に好適な哺乳動物宿主細胞の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（B.K.C. Lo編、Humana Press、Totowa、NJ）、ｐ２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
安定的発現は、一過性発現より、再現性の高い結果を概して達成し、大規模産生にもより適しているため、一般に好ましいが、特定の状況にとって一過性発現のほうがよいかどうかを判定することは、当業者の技能の範囲内である。
本発明は、抗ＴｎＣ抗体を産生する方法であって、（ａ）本発明による抗ＴｎＣ抗体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、培地中で、前記抗体の発現を可能にする条件下で培養するステップ、及び（ｂ）前記抗体を回収するステップを含む方法にも関する。
本発明は、宿主細胞により産生される本発明の抗ＴｎＣ抗体のグリコシル化プロファイルを修飾する方法であって、前記宿主細胞において、抗ＴｎＣ抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとグルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを発現させる又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターを発現させることを含む方法に、さらに関する。一般に、上述の細胞株を含む、任意のタイプの培養細胞株を使用して、グリコシル化パターンが改変された抗ＴｎＣ抗体の産生用の細胞株を生成することができる。好ましい細胞株としては、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、及び他の哺乳動物細胞が挙げられる。グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、及びβ（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）が挙げられる。一実施態様では、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの組み合わせが宿主細胞において発現される（例えば、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎ ＩＩ）。同様に、前記方法は、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊された又は別様に不活性化された宿主細胞（例えば、α１，６コアフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の活性がノックアウトされた宿主細胞）における、抗ＴｎＣ抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドの発現も包含する。特定の実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに発現する宿主細胞において本発明の抗ＴｎＣ抗体を発現させて、前記抗体のグリコシル化パターンを修飾することができる。特定の実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドである。別の特定の実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明の抗ＴｎＣ抗体の発現は、Ｆｃ受容体結合アフィニティーが増大された及び／又はエフェクター機能が増加された抗ＴｎＣ抗体をもたらす。したがって、一実施態様では、本発明は、（ａ）ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドと、（ｂ）本発明の抗ＴｎＣ抗体をコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドとを含む、宿主細胞に関する。特定の実施態様では、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインとゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインとを含む、融合ポリペプチドである。特に、前記ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼＩＩのゴルジ局在ドメインである。そのような融合ポリペプチドを生成する方法、及びエフェクター機能が増加された抗体を産生するためにそれらを使用する方法は、それらの全内容が本明細書に参照により明確に援用される国際公開第２００４／０６５５４０号、米国特許仮出願第６０／４９５１４２号及び米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号に開示されている。別の実施態様では、宿主細胞は、マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。抗ＴｎＣ抗体をコードするポリヌクレオチドのような、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、構成的プロモーター又は代替的に調節発現系の制御下で発現させることができる。そのようなシステムは、当該技術分野で周知であり、上述のシステムを含む。
抗ＴｎＣ抗体のコード配列及び／又はグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列を含有する宿主細胞であって、生物活性遺伝子産物を発現する宿主細胞は、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ若しくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；「マーカー」遺伝子機能の存在若しくは非存在；宿主細胞中のそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現により測定されるような転写レベルの評定；又はイムノアッセイにより若しくはその生物活性により測定されるような遺伝子産物の検出−当該技術分野で周知の方法−によって、同定することができる。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性は、例えば、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎＩＩの生合成産物と結合するレクチンを用いることにより、それぞれ検出することができる。そのようなレクチンの例は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを含有するオリゴ糖と優先的に結合するＥ４−ＰＨＡレクチンである。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドの生合成産物（すなわち、特異的オリゴ糖構造体）は、前記ポリペプチドを発現する細胞により産生される糖タンパク質から放出されるオリゴ糖の質量分光分析によっても検出することができる。或いは、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて操作された細胞により産生される抗体により媒介されるＦｃ受容体結合の増加又はエフェクター機能の増加を測定する、機能性アッセイを使用してもよい。
本発明は、修飾されたオリゴ糖を有する抗ＴｎＣ抗体を産生する方法であって、（ａ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するように操作された宿主細胞を本発明による抗ＴｎＣ抗体の産生を可能にする条件下で培養するステップ（ここで、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドは、前記宿主細胞により産生される前記抗ＴｎＣ抗体のＦｃ領域内のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現される）、及び（ｂ）前記抗ＴｎＣ抗体を単離するステップを含む方法にも関する。一実施態様では、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩである。別の実施態様では、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのポリペプチドが存在する。特定の実施態様では、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する２つのペプチドは、ＧｎＴＩＩＩ及びＭａｎＩＩである。別の実施態様では、グルコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。より具体的な実施態様では、融合ポリペプチドは、ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインをさらに含む。特に、ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在ドメイン、最も特にマンノシダーゼＩＩの局在ドメインである。或いは、ゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼＩの局在ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在ドメイン、及びα１，６コアフコシルトランスフェラーゼの局在ドメインからなる群から選択される。
特定の実施態様では、宿主細胞又は上記の方法により産生される修飾された抗ＴｎＣ抗体は、Ｆｃ領域を含むＩｇＧ定常領域又はその断片を有する。別の特定の実施態様では、抗ＴｎＣ抗体は、Ｆｃ領域を含むヒト化若しくはヒト抗体又はその断片である。
宿主細胞又は上記の方法により産生されるグリコシル化が改変された抗ＴｎＣ抗体は、宿主細胞の（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現による）修飾の結果として、Ｆｃ受容体結合アフィニティーの増大及び／又はエフェクター機能の増加を概して呈示する。好ましくは、Ｆｃ受容体結合アフィニティーの増大は、活性化Ｆｃγ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａ受容体への結合の増加である。エフェクター機能増加は、好ましくは、次のうちの１つ又は複数の増加を含み得る：抗体依存性細胞傷害性の増加、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込みの増加、Ｆｃ媒介細胞障害性の増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、多形核細胞（ＰＭＮＣ）への結合の増加、単球への結合の増加、標的結合抗体の架橋の増加、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の増加、樹状細胞成熟の増加、及びＴ細胞プライミングの増加。
アッセイ
本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体を、当該技術分野で公知の様々なアッセイにより、同定することができ、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性についてスクリーニングすること又は特徴を明らかにすることができる。
ａ）結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、その抗原結合活性について、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット等のような公知の方法により試験される。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＴｎＣへの結合について他の抗ＴｎＣ抗体と競合する抗体を同定することができる。ある特定の実施態様では、そのような競合抗体は、前記他の特定の抗ＴｎＣ抗体が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープの詳細な例示的マッピング方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６巻（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供されている。
例示的競合アッセイでは、固定化抗原は、ＴｎＣと結合する第１の標識抗体（例えば、実施例に記載の１８Ｄ４抗体）と、ＴｎＣへの結合について前記第１の抗体と競合するその能力について試験されることになる第２の非標識抗体とを含む溶液中で、インキュベートされる。第二の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化ＴｎＣが、第１の標識抗体を含むが第２の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体のＴｎＣへの結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が除去され、固定化ＴｎＣと結合している標識の量が測定される。固定化ＴｎＣと結合している標識の量が、試験試料においてコントロール試料と比べて実質的に低減された場合には、それは、第２の抗体が第１の抗体とＴｎＣへの結合について競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第１４章（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。
ｂ）活性アッセイ
一態様では、生物活性を有するその抗ＴｎＣ抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性としては、例えば、標的細胞の溶解、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、又はアポトーシスの誘導を挙げることができる。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。
ある特定の実施態様では、本発明の抗体は、そのような生物活性について試験される。ＡＤＣＣを試験するための例示的アッセイは、下文で説明される（「定義」：「ＡＤＣＣが増加された抗体」の下を参照されたい）。細胞溶解を（例えば、ＬＤＨ放出の測定により）検出するためのアッセイ又はアポトーシスを（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して）検出するアッセイは、当該技術分野で周知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するためのアッセイは、その全内容が本明細書に参照により援用される国際公開第２００４／０６５５４０にも記載されている（この特許文献中の実施例１を参照されたい）。
イムノコンジュゲート
本発明は、１つ又は複数の細胞毒性剤、例えば、化学療法剤若しくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素的に活性な毒素、又はそれらの断片）又は放射性同位体にコンジュゲートしている、本明細書の抗ＴｎＣ抗体を含むイムノコンジュゲートも提供する。
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が１つ又は複数の薬物にコンジュゲートしている抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、前記薬物が、これらに限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、同第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１を参照されたい）；アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号及び同第７４９８２９８を参照されたい）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号及び同第５８７７２９６号；Hinman等、Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；並びにLode等、Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照されたい）；アントラサイクリン、例えば、ダウノマイシン又はドキソルビシン（Kratz等、Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等、Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等、Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等、Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等、J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照されたい）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル及びオルタタキセル；トリコテセン；並びにＣＣ１０６５を含む、ＡＤＣである。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている本明細書に記載の抗体であって、前記毒素又はその断片が、これらに限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含む、抗体を含む。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成している、本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生成に利用可能である。例としては、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、及びＬｕの放射性同位体を挙げることができる。放射性コンジュゲートは、検出に使用される場合、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、９９ｍＴｃ若しくは１２３Ｉ、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉ、としても公知）用のスピン標識、例えば、この場合もやはりヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン若しくは鉄を含み得る。
抗体と細胞傷害性剤のコンジュゲートは、様々な二機能性タンパク質カップリング剤、例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアン酸塩（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにリシンイムノトキシンを調製することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を助長する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari等、Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５２０８０２０号）を使用することができる。
本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、Ｕ．Ｓ．Ａから）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ、ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、及びｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸エステル）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるそのようなコンジュゲートを、これに限定されないが、明確に企図している。
診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体の何れも、生物学的試料中のＴｎＣの存在の検出に有用である。本明細書で使用される用語「検出すること」は、定量的又は定性的検出を包含する。ある特定の実施態様では、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば、脳、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、小腸、胃又は子宮からの細胞又は組織を、これらの器官の細胞又は組織腫瘍も含めて、含む。
一実施態様では、診断又は検出方法に使用するための抗ＴｎＣ抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＴｎＣの存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施態様では、方法は、生物学的試料と本明細書に記載の抗ＴｎＣ抗体を、ＴｎＣへの前記抗ＴｎＣ抗体の結合が可能な条件下で接触させるステップ、及び前記抗ＴｎＣ抗体とＴｎｃ間で複合体が形成されるかどうかを検出するステップを含む。そのような方法は、インビトロ法であってもよく、又はインビボ法であってもよい。一実施態様では、抗ＴｎＣ抗体は、抗ＴｎＣ抗体での治療に適格な対象を選択するために使用され、例えば、この場合、ＴｎＣが患者の選択のためのバイオマーカーである。
ある特定の実施態様では、標識された抗ＴｎＣ抗体が提供される。標識は、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識）、並びに間接的に、例えば、酵素反応又は分子相互作用によって検出される部分、例えば酵素又はリガンドを含むが、これらに限定されない。例示的標識としては、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、色素前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼ、とカップリングされた複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル等が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＴｎＣ抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を１つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol, A.編(1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に非毒性であり、これらに限定されないが、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン；単糖類、二糖類及び他の糖（グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。本明細書での例示的な薬学的に許容される担体としては、侵入型の薬物分散剤、例えば、可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶型ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ又は複数のグルコサミノグリカナーゼと併用される。
例示的凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸塩バッファーを含む。
本明細書における製剤はまた、治療することになる特定の適応症のための活性成分、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものも、必要に応じて１つより多く含有することができる。例えば、治療することになる疾患ががんである場合、１つ又は複数の抗がん剤、例えば、化学療法剤、腫瘍細胞増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤をさらに提供することが望ましいこともある。そのような活性成分は、好適には、所期の目的に有効である量での組合せで存在する。
活性成分を、例えば、コアセルベーション手法により若しくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入してもよい。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている
徐放性調製物を調製してもよい。徐放調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。
インビボでの投与に使用されることになる製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜による濾過により、容易に果たすことができる。
本明細書に記載の分子は、溶液又は懸濁液、錠剤、ピル、粉末、座剤、高分子マイクロカプセル又はマイクロベシクル、リポソーム、及び注射可能な又は注入可能な溶液を含むがこれらに限定されない、様々な剤形であり得る。好ましい形は、投与様式及び治療応用に依存するが、典型的には注射可能な又は注入可能な溶液であろう。
治療方法及び治療用組成物
本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体又は抗ＴｎＣ抗体を含む薬学的製剤の何れを治療方法に使用してもよい。
本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体は、ＴｎＣ発現、特に、同じ細胞型の正常組織と比較してＴｎＣの異常な発現（例えば、過剰発現、又は細胞における異なるパターンでの発現）を特徴とする疾患の治療に使用することができる。ＴｎＣは、多くのヒト腫瘍において同じ細胞型の非腫瘍組織と比較して異常に発現される（過剰発現される）。したがって、本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体は、腫瘍形成の予防、腫瘍の根絶及び腫瘍増殖又は転移の阻害に特に有用である。本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体は、ＴｎＣを発現する任意の腫瘍を治療するために使用することができる。本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体により治療することができる特定の悪性腫瘍としては、例えば、肺がん、結腸がん、胃がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がん、肝臓がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、骨格筋のがんが挙げられる。
本明細書で開示される抗ＴｎＣ抗体は、腫瘍増殖を阻害するために又は腫瘍細胞を殺滅するために使用することができる。例えば、抗ＴｎＣ抗体は、がん性細胞（腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞）の膜又は細胞表面上にあるＴｎＣと結合して、例えば、がん性細胞に対するＡＤＣＣ又は他のエフェクター媒介殺滅を惹起することができる。
或いは、抗ＴｎＣ抗体は、ＴｎＣの機能を、特に、別の化合物へのその結合に物理的に干渉することにより、ブロックするために使用することができる。例えば、抗原結合分子は、ＴｎＣにより媒介される細胞の接着、伸展又は遊走をブロックするために使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための抗ＴｎＣ抗体が提供される。さらなる態様では、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患の治療に使用するための抗ＴｎＣ抗体が提供される。ある特定の実施態様では、治療方法に使用するための抗ＴｎＣ抗体が提供される。ある特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患を有する個体を治療する方法に使用するための抗ＴｎＣ抗体を提供し、前記方法は、前記抗ＴｎＣ抗体の有効量を前記個体に投与することを含む。１つのそのような実施態様では、方法は、例えば下で説明されるような、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、細胞の溶解を誘導するために使用するための抗ＴｎＣ抗体を提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、個体における細胞の溶解を誘導する方法に使用するための抗ＴｎＣ抗体を提供し、前記方法は、細胞の溶解を誘導するために前記抗ＴｎＣ抗体の有効量を前記個体に投与することを含む。上記実施態様の何れによる「個体」も好ましくはヒトである。上記実施態様の何れによる「ＴｎＣの発現を特徴とする疾患」も、好ましくは、がん、最も好ましくは、肺がん、結腸がん、胃がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がん、肝臓がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、骨格筋のがんの群から選択されるがんである。上記実施態様の何れによる「細胞」も、好ましくは、腫瘍内に存在する細胞、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞、最も好ましくは、腫瘍細胞である。上記実施態様の何れによる「ＴｎＣ発現」も、好ましくは、同じ細胞型の正常組織と比較して異常な発現、例えば、過剰発現、又は細胞における異なるパターンでの発現である。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＴｎＣ抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患の治療のためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患を治療する方法に使用するためのものであり、前記方法は、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患を有する個体に前記医薬の有効量を投与することを含む。１つのそのような実施態様では、方法は、例えば下で説明されるような、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、細胞の溶解を誘導するためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、個体における細胞の溶解を誘導する方法に使用するためのものであり、前記方法は、細胞の溶解を誘導するために前記医薬の有効量を前記個体に投与することを含む。上記実施態様の何れによる「個体」も好ましくはヒトである。上記実施態様の何れによる「ＴｎＣの発現を特徴とする疾患」も、好ましくは、がん、最も好ましくは、肺がん、結腸がん、胃がん、乳がん、皮膚がん、肝臓がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、骨格筋のがんの群から選択されるがんである。上記実施態様の何れによる「細胞」も、好ましくは、腫瘍内に存在する細胞、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞、最も好ましくは、腫瘍細胞である。上記実施態様の何れによる「ＴｎＣ発現」も、好ましくは、同じ細胞型の正常組織と比較して異常な発現、例えば、過剰発現、又は細胞における異なるパターンでの発現である。
さらなる態様では、本発明は、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、方法は、ＴｎＣの発現を特徴とするそのような疾患を有する個体に抗ＴｎＣ抗体の有効量を投与することを含む。１つのそのような実施態様では、方法は下で説明されるような少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、個体における細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、細胞の溶解を誘導するために抗ＴｎＣ抗体の有効量を個体に投与することを含む。上記実施態様の何れによる「個体」もヒトであり得る。上記実施態様の何れによる「ＴｎＣの発現を特徴とする疾患」も、好ましくは、がん、最も好ましくは、肺がん、結腸がん、胃がん、乳がん、皮膚がん、肝臓がん、腎臓がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、骨格筋のがんの群から選択されるがんである。上記実施態様の何れによる「細胞」も、好ましくは、腫瘍内に存在する細胞、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞、最も好ましくは、腫瘍細胞である。上記実施態様の何れによる「ＴｎＣ発現」も、好ましくは、同じ細胞型の正常組織と比較して異常な発現、例えば、過剰発現、又は細胞における異なるパターンでの発現である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体の何れかを含む薬学的製剤であって、例えば、上記治療方法の何れかにおいて使用するための薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体の何れかと、１つ又は複数の薬学的に許容される担体とを含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗ＴｎＣ抗体の何れかと、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば下で説明されるような治療剤とを含む。
本発明の抗体は、治療の際に単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体を少なくとも１つのさらなる治療剤と共投与してもよい。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、抗がん剤である。好適な抗がん剤は、例えば、化学療法剤、腫瘍細胞増殖の阻害剤、又は腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤である。
上述のそのような併用療法は、併用投与（この場合、２つ以上の治療剤が同じ又は別々の組成物に含まれている）及び別々の投与を包含し、別々の投与の場合、本発明の抗体の投与を、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与より前に、投与と同時に、及び／又は投与の後に行うことができる。本発明の抗体を放射線療法と組み合わせて使用することもできる。本発明の抗体（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口投与、肺内投与及び鼻腔内投与、並びに局所治療のために必要に応じて病巣内投与を含む、任意の好適な手段により投与することができる。非経口投与は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。静脈内投与が概して好ましい。しかし、腹腔内経路は、例えば結腸直腸腫瘍の治療の際に、特に有用であると予想される。投薬は、投与が短期的であるか慢性的であるかに一部は依存して、何れの好適な経路によるものであってもよく、例えば、静脈内若しくは皮下注射等の注射によるものであってもよい。単回投与又は様々な時点にわたっての複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図されている。
本発明の抗体を、医学行動規範と一致した様式で製剤化、投薬及び投与されることになる。これに関連して考慮する因子としては、治療されることになる特定の障害、治療されることになる特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に公知の他の因子が挙げられる。抗体は、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤と共に製剤化される必要はないが、任意選択でそれらと共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ、及び上で論じた他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量で及び同じ投薬経路で、又は本明細書に記載の投薬量の約１から９９％で、又は適切であると実験的に／臨床的に判定される、任意の投薬量で及び任意の経路により使用される。
疾患の予防又は治療のための、本発明の抗体の（単独で使用される場合、又は１つ若しくは複数の他のさらなる治療剤と併用される場合の）適切な投薬量は、治療されることになる疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるのか又は治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴及び抗体への応答、並びに主治医の裁量に依存することになる。抗体は、単回、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存して、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回の投与若しくは複数回の別々の投与によるか、連続注入によるかを問わず、患者への投与のための最初の候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたり得る。状態に応じて数日又はそれより長きにわたる反復投与については、一般に、病徴の所望の抑制が起こるまでその治療が持続されることになる。抗体の１つの例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つ又は複数の用量（又はこれらの任意の組合せ）を患者に投与してもよい。そのような用量を、間欠的に、例えば、週に１回又は３週間に１回（例えば、患者が、約２から約２０用量、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）投与してもよい。より高い初期負荷用量、その後、より低い１用量又は複数の用量を投与してもよい。しかし、他の投与レジメンが有用であることもある。この治療の進展は、従来の手法及びアッセイによって容易にモニターされる。
当然のことながら、上記製剤又は治療方法の何れも、抗ＴｎＣ抗体の代わりに又は抗ＴｎＣ抗体に加えて本発明の抗体コンジュゲートを使用して行うことができる。
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、その容器上の又はその容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されたものであり得る。容器は、単独である組成物を保持するか、又は状態の治療、予防及び／若しくは診断に有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグであってもよく、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選ばれた状態の治療に使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が中に入っている第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又は別の治療剤を含む組成物が中に入っている第２の容器を含むことができる。本発明のこの実施態様での製造品は、特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。或いは、又は加えて、製造品は、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液等の、薬学的に許容されるバッファーを含む、第２の（又は第３の）容器をさらに含むことができる。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及び注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
当然のことながら、上記製造品の何れも、抗ＴｎＣ抗体の代わりに又は抗ＴｎＣ抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを含んでいてもよい。
特定の実施態様
１． テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列番号４９及び配列番号５２の群から選択される重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５０及び配列番号５３の群から選択される重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５１及び配列番号５４の群から選択される重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
（ａ）配列番号３７及び配列番号４０の群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３８及び配列番号４１の群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３９及び配列番号４２の群から選択される軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
２． テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合する抗体であって、
（ｉ）配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｉｉ）配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含み、種間交差反応性を有する抗体。
３． （ａ）配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
（ａ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、実施態様１又は２の何れか一実施態様の抗体。
４． （ａ）配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、並びに
（ａ）配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、実施態様１又は２の何れか一実施態様の抗体。
５． 配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様１から４の何れか一実施態様の抗体。
６． 配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様１から４の何れか一実施態様の抗体。
７． Ｆｃ領域を含むか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む、実施態様１から６の何れか一実施態様の抗体。
８． 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、実施態様１から７の何れか一実施態様の抗体。
９． 完全長ＩｇＧ１クラス抗体である、実施態様１から８の何れか一実施態様の抗体。
１０． ヒト定常領域を含む、実施態様１から９の何れか一実施態様の抗体。
１１． ヒト抗体である、実施態様１から１０の何れか一実施態様の抗体。
１２． 配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域、及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む、実施態様１から１１の何れか一実施態様の抗体。
１３． 配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖領域、及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む、実施態様１から１２の何れか一実施態様の抗体。
１４． 向上したアフィニティーを有する、実施態様１から１３の何れか一実施態様の抗体。
１５． ヒトＴｎＣと約１ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、実施態様１から１４の何れか一実施態様の抗体。
１６． 種間交差反応性を有する、実施態様１から１５の何れか一実施態様の抗体。
１７． ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、実施態様１から１６の何れか一実施態様の抗体。
１８． ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣと結合する、実施態様１から１７のいずれか一実施態様の抗体。
１９． 指定された全ての種からの標的抗原と同様のアフィニティーで結合する、実施態様１から１８の何れか一実施態様の抗体。
２０． 指定された全ての種からの標的抗原と同様のアフィニティー、特に、１００倍のＫＤ範囲内、５０倍のＫＤ範囲内、２０倍のＫＤ範囲内、１０倍のＫＤ範囲内、５倍のＫＤ範囲内で結合する、実施態様１から１９の何れか一実施態様の抗体。
２１． 指定された全ての種からの標的抗原と同様の１０倍のＫＤ範囲内のアフィニティーで結合する、実施態様１から２０の何れか一実施態様の抗体。
２２． ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、マウスＴｎＣと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、カニクイザルＴｎＣと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択される前記ＫＤ値の全てが、約２ｎＭ未満である、実施態様１から２１の何れか一実施態様の抗体。
２３． ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、マウスＴｎＣと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、カニクイザルＴｎＣと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択される前記ＫＤ値の全てが、２ｎＭから０．１ｎＭの範囲内である、実施態様１から２２の何れか一実施態様の抗体。
２４． Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤからなる群から選択されるＴｎＣドメインのうちの少なくとも１つに特異的である、実施態様１から２３の何れか一実施態様の抗体。
２５． ＴｎＣドメインＡ１及びＡ４に特異的である、実施態様１、２、３、５又は１２の何れか一実施態様の抗体。
２６． ＴｎＣドメインＣに特異的である、実施態様１、２、４、６又は１３の何れか一実施態様の抗体。
２７． Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施態様１から２６の何れか一実施態様の抗体。
２８． 親非置換Ｆｃ領域が、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換Ｆｃ領域が、前記親非置換Ｆｃ領域と比べて、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む、実施態様２７の抗体。
２９． 前記置換Ｆｃ領域を含む抗体は、親非置換重鎖領域を含む抗体と比較して、エフェクター機能が低下している、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下している、実施態様２８の抗体。
３０． 親非置換Ｆｃ領域と比べて、アミノ酸置換Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合が消失される、及び／又はＦｃ媒介エフェクター機能が消失される、実施態様２７から２９のいずれか一実施態様の抗体。
３１． 前記エフェクターの機能の消失が、ＡＤＣＣの消失である、実施態様３０の抗体。
３２． 配列番号６５及び配列番号６６の群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む、実施態様１から３１のいずれか一実施態様の抗体。
３３． 糖改変Ｆｃ領域を含む、実施態様１から３２の何れか一実施態様の抗体。
３４． 非糖改変抗体と比較して、前記Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている、実施態様３３の抗体。
３５． 前記Ｆｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が、フコシル化されていない、実施態様３３又は３４の抗体。
３６． 非糖改変抗体と比較して、前記Ｆｃ領域内の二分されたオリゴ糖の割合が増加されている、実施態様３３から３５の何れか一実施態様の抗体。
３７． 前記Ｆｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約１００％が、二分されている、実施態様３３から３６の何れか一実施態様の抗体。
３８． 前記Ｆｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％から約５０％が、二分されており、フコシル化されていない、実施態様３３から３７の何れか一実施態様の抗体。
３９． エフェクター機能が増加されている、及び／又はＦｃ領域結合アフィニティーが増大されている、実施態様３３から３８の何れか一実施態様の抗体。
４０． 前記エフェクターの機能の増加が、ＡＤＣＣの増加である、実施態様３９の抗体。
４１． 多重特異性抗体である、実施態様１から４０の何れか一実施態様の抗体。
４２． 二重特異性抗体である、実施態様１から４１の何れか一実施態様の抗体。
４３． １から４２いずれか一実施態様の抗体の一部を形成するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
４４． ４３のポリペプチドによりコードされた、単離されたポリペプチド。
４５． 配列番号６０、配列番号６２、配列番号６５及び配列番号６６の群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする第１の単離されたポリヌクレオチドと、配列番号５９及び配列番号６１の群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする第２の単離されたポリヌクレオチドとを含む組成物。
４６． ４３のポリヌクレオチドを含むベクター。
４７． ４３のポリヌクレオチド、実施態様４５の組成物又は実施態様４６のベクターを含む、宿主細胞。
４８． ＧｎＴＩＩＩ活性を有する増加されたレベルの１つ又は複数のポリペプチドを発現するように操作された、実施態様４７の宿主細胞。
４９． ＧｎＴＩＩＩ活性を有する前記ポリペプチドが、ＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインとＭａｎＩＩのゴルジ局在ドメインとを含む融合ポリペプチドである、実施態様４８の宿主細胞。
５０． ＭａｎＩＩ活性を有する増加されたレベルの１つ又は複数のポリペプチドを発現するようにさらに操作された、実施態様４８又は４９の宿主細胞。
５１． ＴｎＣと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
ａ）実施態様４７から５０の何れか一実施態様の宿主細胞を、培地中で、前記抗体の発現を可能にする条件下で培養するステップ、及び
ｂ）前記抗体を回収するステップ
を含む方法。
５２． ＴｎＣと特異的に結合する抗体を産生する方法であって、
ａ）実施態様４８から５０の何れか一実施態様の宿主細胞を、培地中で、前記抗体の発現と、前記抗体のＦｃ領域上に存在するオリゴ糖のＧｎＴＩＩＩ活性を有する前記ポリペプチドによる修飾とを可能にする条件下で培養するステップ、及び
ｂ）前記抗体を回収するステップ
を含む方法。
５３． ５１又は５２の方法により産生される、ＴｎＣと特異的に結合する抗体。
５４． １から４０の何れか一実施態様の抗体と細胞毒性剤とを含む抗体コンジュゲート。
５５． １から４２の何れか一実施態様の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤。
５６． さらなる治療剤をさらに含む、実施態様５５の薬学的製剤。
５７． 医薬として使用するための、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体。
５８． ＴｎＣの発現を特徴とする疾患の治療に使用するための、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体。
５９． 前記疾患が、がんである、実施態様５８の抗体。
６０． 腫瘍細胞又は腫瘍の間質細胞の細胞溶解の誘導に使用するための、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体。
６１． ＴｎＣの発現を特徴とする疾患の治療用の医薬の製造における、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体の使用。
６２． 前記疾患が、がんである、実施態様６１の使用。
６３． 腫瘍細胞又は腫瘍の間質細胞の溶解を誘導するための医薬の製造のための、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体の使用。
６４． ＴｎＣ発現を特徴とする疾患を有する個体を治療する方法であって、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体又は実施態様５５若しくは５６の薬学的製剤の有効量を前記個体に投与することを含む方法。
６５． さらなる治療剤を前記抗体に投与することをさらに含む、実施態様６４の方法。
６６． 前記疾患が、がんである、実施態様６４又は６５の方法。
６７． 腫瘍細胞又は腫瘍の間質細胞の細胞溶解を誘導する方法であって、前記腫瘍細胞又は間質細胞と実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体とを接触させることを含む方法。
６８． 前記細胞溶解が、前記抗体の抗体依存性細胞傷害により誘導される、実施態様６７の方法。
６９． 個体における疾患を診断する方法であって、診断剤の有効量を前記抗体に投与することを含み、前記診断剤が、実施態様１から４２の何れか一実施態様の抗体、及び前記診断剤とＴｎＣの複合体の検出を可能にする標識を含む、方法。
７０． 上文に記載の本発明。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。当然のことながら、上で提供した一般的な説明を考慮して様々な実施態様を実施することができる。
組換えＤＮＡ手法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されているような標準的方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定した。一部のケースでは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が自動遺伝子合成により合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から所望の遺伝子セグメントを調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している遺伝子セグメントを、述べるプラスミドにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。好適な制限部位を用いて、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするように遺伝子セグメントを設計した。
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２に与えられている。発現のために、全てのコンストラクトは、真核細胞内での分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含有した。それらをコードする例示的リーダーペプチド及びポリヌクレオチド配列を配列６７から配列番号７５に与える。
実施例１
ＴｎＣ抗原配列及び抗原の産生
表３及び表４の全てのコンストラクトをＧＳＴのＣ末端に融合させ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させる。部位特異的ビオチン化のために、テネイシン配列のＣ末端にＡｖｉタグを付加させ、ＢｉｒＡビオチンリガーゼを別のプラスミド（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）上で共発現させた。増殖培地は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２ＹＴであった。ビオチンを添加して５０μＭの最終濃度にした。１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて２２℃で一晩、タンパク質発現を誘導した。細胞を遠心分離により回収し、Ｂ−ＰＥＲ試薬（ｐｉｅｒｃｅ ７８２６０）及び１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｌ６８７６）の存在下での超音波処理により細胞溶解を行った。溶解物を遠心分離し、清澄化された溶解物をグルタチオンセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；製品番号１７−０７５６−０１）に負荷した。洗浄後、ＴｎＣ分子をトロンビン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号１０６０２４００００１）によって一晩、４℃でＧＳＴから切断した。溶出は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％グリセロール中で行った。最終精製ステップは、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。試料は、処理するまで液体窒素中で急速冷凍しておいた。
実施例２
一般的Ｆａｂライブラリーからの抗ＴｎＣ抗体の選択
抗ＴｎＣ抗体を、ＤＰ８８−４（クローン１８Ｄ４）及びラムダＤＰ４７（クローン１１Ｃ７）という２つの異なる一般的ファージディスプレイライブラリーから選択した。
ライブラリー構築
Ｄｐ８８−４ライブラリーは、軽鎖（Ｌ３、３つの異なる長さ）のＣＤＲ３及び重鎖（Ｈ３、３つの異なる長さ）のＣＤＲ３内に無作為化配列空間を含むＶｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）のＶドメインペアリングを使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、スプライシングを利用するオーバーラップ伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲによる３つのｐＰＣＲ増幅断片のアセンブリーによって行った。断片１は、無作為化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３からＨ３に及ぶ中心コンストラクト断片であるのに対して、断片３は、無作為化Ｈ３、及び抗体遺伝子の３’部分を含む。次のプライマーの組合せをそれぞれ使用して、ＤＰ８８−４ライブラリー用のこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）及び断片３（リバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせたフォワードプライマーＤＰ８８−ｖ４−４又はＤＰ８８−ｖ４−６又はＤＰ８８−ｖ４−８）。ライブラリー断片の生成のためのＰＣＲパラメータは、９４℃での５分の初期変性、１分９４℃、１分５８℃、１分７２℃の２５サイクル、そして１０分間７２℃での末端伸長であった。等モル比のゲル精製された単一断片を鋳型として使用するアセンブリーＰＣＲのためのパラメータは、９４℃で３分の初期変性、そして３０秒９４℃、１分５８℃、２分７２℃の５サイクルであった。この段階で、外部プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、さらなる２０サイクルを行った後、１０分間７２℃で末端伸長を行った。十分な量の完全長無作為化Ｆａｂコンストラクトのアセンブリー後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲーションした。精製されたライゲーション体を、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への〜６０回の形質転換に使用した。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、選択に使用することができるようにＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製した。これらのライブラリー構築ステップを３回繰り返して、４．４ｘ１０９の最終ライブラリーサイズを得た。機能性クローンのパーセンテージは、ドットブロットでのＣ末端タグ検出により判定して、それぞれ、軽鎖については９２．６％、重鎖については９３．７％であった。
ラムダＤＰ４７ライブラリーは、次のＶドメインペアリングを使用してヒト生殖系列遺伝子に基づいて構築した：Ｖｌ３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖。ライブラリーを軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３及び重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３に関して無作為化し、「オーバーラップ伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲにより３つの断片からのアセンブリーを行った。断片１は、無作為化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３の終点からＨ３の始点に及ぶ中心コンストラクト断片であるのに対して、断片３は、無作為化Ｈ３、及びＦａｂ断片の３’部分を含む。次のプライマーの組合せを使用して、ライブラリー用のライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３−Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０−ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ））及び断片３（ＤＰ４７−ｖ４−４／ＤＰ４７−ｖ４−６／ＤＰ４７−ｖ４−８−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリー断片の産生のためのＰＣＲパラメータは、９４℃での５分の初期変性、６０秒９４℃、６０秒５５℃、６０秒７２℃の２５サイクル、そして１０分間７２℃での末端伸長であった。等モル比の３つの断片を鋳型として使用するアセンブリーＰＣＲのためのパラメータは、９４℃で３分の初期変性、そして６０秒９４℃、６０秒５５℃、１２０秒７２℃の５サイクルであった。この段階で、外部プライマーを添加し、さらなる２０サイクルを行った後、１０分間７２℃で末端伸長を行った。十分な量の完全長無作為化Ｆａｂコンストラクトのアセンブリー後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、並行してアクセプターファージミドベクターを同様に処理した。１５μｇのＦａｂライブラリーインサートを１３．３μｇのファージミドベクターとライゲーションした。精製されたライゲーション体を６０回の形質転換に使用し、その結果、１．５ｘ１０９の形質転換体を得た。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、選択に使用することができるようにＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製した。
ファージディスプレイ選択及びＥＬＩＳＡスクリーニング
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＧＳＴ融合ＴＮＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６を大腸菌において発現させ、融合タンパク質のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現によりインビボで部位特異的にビオチン化した（抗原の産生は実施例１に従い、配列は表４から導かれる）。この抗原は、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン５と６の間に位置するヒトＴｎＣ追加スプライスドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ及びＣを含む。ファージディスプレイ選択は、これらの追加スプライスドメインの何れかへの結合物質の選択を目的するものであった。後続のステップでより少数の追加スプライスドメインを含むさらなる抗原コンストラクトを使用して表面プラズモン共鳴によりドメイン特異性を判定する。
選択ラウンド（バイオパニング）は、次のパターンに従って溶液中で行った：１．３つの異なるタグを認識する抗体のライブラリーを枯渇させるための、無関係のＧＳＴ融合タンパク質を有し、ＴｎＣ標的抗原と同様のａｖｉタグ及びＨｉｓ６タグも有する、〜１０１２個のファージミド粒子の予備清浄化；２．総体積１ｍｌ中のタグ結合物質のさらなる枯渇のための、上清中の予備清浄化したファージミド粒子と、１００ｎＭ ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴＮＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６との、無関係の非ビオチン化ＧＳＴ融合タンパク質の存在下で０．５時間のインキュベーション；３．ニュートラアビジン予備被覆マイクロタイタープレートの４ウェルへの１０分間の移入による、ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴＮＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６及び付着した特異的に結合しているファージの捕捉（ラウンド１及び３）；４．５ｘＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５ｘＰＢＳを使用するそれぞれのウェルの洗浄；５．１０分間の１ウェル当り２５０μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）の添加によるファージ粒子の溶出及び４ウェルからプールした溶出物への５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和；６．溶出したファージ粒子の上清による対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、３０℃で一晩の振盪機でのインキュベーション、そして次の選択ラウンドで使用されることになるファージミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。１００ｎＭの一定抗原濃度を使用して３ラウンドにわたって選択を行った。ラウンド２では、ニュートラアビジンへの結合物質の濃縮を回避するために、５．４ｘ１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加により抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。ラウンド２及び３の後に次のようにＥＬＩＳＡにより特異的結合物質を同定した：１００μｌの１００ｍＭ ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴＮＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６でニュートラアビジンプレートを被覆した。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＰＲ二次抗体を使用して結合ＦａｂをそれらのＦｌａｇタグによって検出した。ヒトＧＳＴ融合ＴＮＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６に関するシグナルを提示するクローンであって、標的と同じタグを有する無関係のＧＳＴ融合タンパク質に関してネガティブであるクローンを、さらなる分析の最終選考に残した。それらを培養体積０．５リットルで細菌により発現させ、アフィニティー精製し、マウスＴｎＣとの交差反応性を試験するために、及び抗体が認識する追加スプライスドメインを決定するために、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析によりさらに特徴を明らかにした。
ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析
ニュートラアビジン捕捉によりＮＬＣチップ上に固定化したビオチン化ヒト及びマウスＴｎＣ抗原に関して２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により選択クローンのアフィニティー（ＫＤ）を測定した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで３０μｌ／分で垂直の向きに注入した。被分析物の注入：「ワンショット動態（one-shot kinetics）」測定のために、注入方向を水平の向きに変え、精製Ｆａｂの２倍希釈系列を別々のチャネル１−５に沿って同時に注入し、２００秒の結合時間及び２４０秒の解離時間をそれぞれ用いた。参照用の「インライン」ブランクを得るために、バッファー（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルに沿って注入した。ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純１対１ラングミュア結合モデルを使用して、結合センソグラムと解離センソグラムの同時フィッティングにより、結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。表５は、種及び追加スプライスドメインの組成が異なる幾つかのＴｎＣ抗原についての２つの選択クローン１８Ｄ４及び１１Ｃ７の平衡解離定数（ＫＤ）を収載するものである。
下線付きの塩基:60%所与の配列及び40%N;イタリック体の塩基:60%所与の配列及び40%M。
1: G/D = 20%, E/V/S = 10%, A/P/R/L/T/Y=5%; 2: G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E = 4,6%; 3: G/A/Y = 20%, P/W/S/D/T = 8%; 4: F = 46%, L/M = 15%, G/I/Y = 8%.
無作為化プライマー中のトリヌクレオチド混合物:1 (G/D=20%, E/V/S=10%, A/P/R/L/T/Y=5%); 2 (G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E=4,6%); 3 (G/A/Y=20, P/W/S/D/T=8%); 4 (F=46%, L/M=15%, G/I/Y=8%); 5 (K=70%, R=30%)
実施例３
可変抗体ドメインの発現ベクターへのクローニング
選択抗ＴｎＣ結合物質（表１４から表１９）の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域をヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。抗体を、野生型ヒトＩｇＧ１骨格として調製したか、又は特許出願公開番号・国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従ってＦｃガンマ受容体への結合を妨げるために導入されるＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含有する変異体として調製した。
抗ＴｎＣ結合物質のＣＤＲ配列を表１６から表１９に示す。抗ＴｎＣ ＩｇＧの塩基対及びアミノ酸配列を表２０及び表２１に示す。抗ＴｎＣ Ｐ３１９ＧＬＡＬＡ ＩｇＧの塩基対及びアミノ酸配列を表２２及び表２３に示す。キメラＭＰＳＶプロモーターでインサートの転写を駆動する発現ベクターであって、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含有する発現ベクターに、抗体をコードする配列全てをクローニングした。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。
ファージディスプレイにより選択される１１Ｃ７クローンのＬＣＤＲ３（ＮＳＩＮＳＴＲＮＥＶ）は、潜在的Ｎグリコシル化部位、すなわちＮＳＴを含有し、これは、均一な産物の産生を助長するためにアミノ酸置換により除去され得る可能性がある。それでもやはり、標的への結合を保持しなければならない。Ｎ（１位）をＱ、Ｓ又はＴによって優先的に置換することができるだろう。或いは、Ｓ（２位）をＰに置換することができるだろう。或いは、Ｔ（３位）を、Ｇ若しくはＮに、又はＳ若しくはＣを除く任意の他のタンパク質構成アミノ酸に、優先的に置換することができるだろう。何れにせよ最良であろう置換を当業者は実験によって決定することができる。
実施例４
抗ＴｎＣ ＩｇＧの精製
ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で全ての遺伝子を一過性に発現させた。発現ベクターは、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）含有宿主細胞におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含有する。
抗ＴｎＣ ＩｇＧは、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクトすることにより産生させた。対応する発現ベクターを１：１比（「ベクターＨＣ」：「ベクターＨＬＣ」）で細胞にトランスフェクトした。
５００ｍＬ振盪フラスコ内での２００ｍＬの産生のために、サプリメントを含有するＥｘｃｅｌｌ培地に２億５千万個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を５分間、２１０ｘｇで遠心分離し、上清を予温ＣＤ−ＣＨＯ培地に置換した。ＤＮＡの最終量が２００μｇになるように発現ベクターを２０ｍＬ ＣＤ−ＣＨＯ培地に混入した。５４０μＬ ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）の添加後、溶液を１５秒間ボルテックスし、１０分間、室温でインキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気を有する、１６５ｒｐｍで振盪するインキュベーターの中で、３時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含有する１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を添加し、細胞を２４時間培養した。この時点で、バルプロ酸濃度は１ｍＭである（培地は、ｇ／ＬのＰｅｐＳｏｙ及び６ｍＭのＬ−グルタミンをさらに含む）。トランスフェクションの２４時間後、細胞にアミノ酸及びグルコースフィードを１２％最終体積（２４ｍＬ）で補充し、３ｇ／Ｌのグルコース（５００ｇ／Ｌのストックからの１．２ｍＬ）を補充する。７日間の培養後、細胞上清を４５分間の２０００−３０００ｘｇでの遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるようにアジ化ナトリウムを補充し、４℃で保持した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清からの抗ＴｎＣ ＩｇＧの精製を行った。タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０の０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
アフィニティークロマトグラフィーのために、３６ｍＬの２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡させたＰｒｏｔＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を負荷した。２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含有する、６−１０カラム容積のバッファーで洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０の、１５ＣＶの塩化ナトリウム（２０から１００％）の線形ｐＨ勾配を使用して、非結合タンパク質を溶出した。次いで、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０を含有する、４カラム容積の溶液でカラムを洗浄し、その後、再平衡ステップを行った。
収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０の添加により調整した。タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでＯＤを測定することにより精製ＩｇＧのタンパク質濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在及び非存在下でのＣＥ−ＳＤＳにより、ＩｇＧの純度及び分子量を分析した。精製タンパク質の凝集物含有量は、２５℃で２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌ−アルギニン・一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で平衡させたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を使用して分析した（表２５）。
実施例５
表面プラズモン共鳴（ＴｎＣ結合）
ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣ（表４による抗原）への、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １８Ｄ４の結合、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １１Ｃ７の結合、及び抗ＴｎＣ １８Ｄ４のＦａｂ断片の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評定した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
固定化ウィザード機能を使用して１００ＲＵまでの固定化を目指して、ビオチン化ヒト、マウス又はカニクイザルＴｎＣの２０μｇ／ｍｌの保存液をＳＡチップに注入した。最終固定化レベルは、７９−４００ＲＵの間であった。
次いで直ちに、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １８Ｄ４（ＰＧＬＡＬＡ及びｗｔＦｃ）、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １１Ｃ７（ｒｂ ＩｇＧ）、及び１８Ｄ４ Ｆａｂ断片に、０．０２−１２．５ｎＭの範囲の濃度（ＩｇＧ）及び０．０２−５０ｎＭの範囲の濃度（Ｆａｂ断片）で、１８０秒間、３０μｌ／分の流量でチップ表面を通過させ、その後、１８０秒の解離ステップを行った。最高濃度のＩｇＧについては、１８００秒のさらなる解離ステップを行った。各ステップ後、６０秒間の１０ｍＭ グリセリン ｐＨ２．１の２回の逐次的注入の結果として表面を再生した。ＴＮＣのない参照フローセルで得た応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。ラングミュア１：１動態モデルを使用して、アフィニティー及びアヴィディティーを計算した。しかし、二価相互作用の１：１フィッティングについてのＫＤは、見掛けの値に過ぎないので、比較にしか使用するべきでない。
抗ＴｎＣ結合物質１８Ｄ４は、ｐＭ範囲の同様のアヴィディティーでマウス及びカニクイザルＴｎＣと交差反応する。１８Ｄ４ Ｆａｂ断片のＴｎＣへの一価結合は、低ｎＭ範囲のＫＤをもたらす。抗ＴＮＣ結合物質１１Ｃ７もまたｐＭ範囲でヒトＴｎＣに結合する。このＢｉａｃｏｒｅ実験で使用したマウス及びカニクイザルＴＮＣコンストラクトにはＣドメインが存在しなかったため、結合物質１１Ｃ７については種間交差反応性を評定することができなかった（表２６）。
熱安定性
静的光散乱（ＳＬＳ）により、及び加えた温度ストレスに対する固有タンパク質蛍光を測定することにより、熱安定性をモニターした。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する３０μｇの濾過したタンパク質試料をＯｐｔｉｍ ２装置（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ）に２回ずつ適用した。半径及び全散乱強度を収集しながら、温度を０．１℃／分で２５℃から８５℃に上昇させた。固有タンパク質蛍光の決定のために、試料を２６６ｎｍで励起させ、放出を２７５ｎｍと４６０ｎｍの間で収集した。
両方のＩｇＧは、６２℃の凝集温度を有する（表２７）。
実施例６
ＬＳ１７４Ｔ異種移植片由来腫瘍組織及びヒト組織アレイにおけるＴｎＣ染色の結果
免疫組織化学手法でのＴｎＣの検出のために、ＬＳ１７４Ｔ異種移植片由来腫瘍組織及びヒト組織アレイにおいてウサギＩｇＧ抗体としての抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４及び１１Ｃ７を試験した。
ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸癌凍結腫瘍試料をクリオスタットで１２μｍ厚の切片にし、スーパーフロスト（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ）スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントした。ペアの正常試料と腫瘍試料を含むヒト組織アレイの凍結試料をＢｉｏｃｈａｉｎ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）から購入した。組織切片を３０分間放置して解凍した。スライドをＰＢＳで洗浄し、冷アセトンで１０分間固定し、水中の０．０３％水素ペルオキシダーゼのインキュベーションステップを行って、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次いで、切片をＰＢＳ中の５％ヤギ血清と共に１時間インキュベートし、その後、０．５μｇ／ｍｌの抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４若しくは１１Ｃ７又はアイソタイプコントロール抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳで３回、各々５分間洗浄し、ペルオキシダーゼＲａｂｂｉｔ Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＡＢＣキット（ＰＫ−６１０１、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して現像した。次いで、漸増濃度のエタノールでスライドを脱水し、２分間、キシレン中でインキュベートした。１滴のＰｅｒｍｏｕｎｔ封入剤（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を切片及びカバースリップに添加した。ＯｌｙｍｐｕｓスキャナーＶＳ１２０（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を得て分析した。
ＬＳ１７４Ｔ異種移植片腫瘍における組織学的染色のパターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応した（図１）。クローン１８Ｄ４とクローン１１Ｃ７両方についてのＴｎＣ染色は、全体的に見て中等度の強度で発現される。ネガティブアイソタイプコントロールシグナルは、この手法の特異性を確証する。ウサギアイソタイプコントロールでの対応する組織学的染色におけるネガティブアイソタイプコントロールシグナルによって、染色の特異性を確証する（図２）。抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４でのヒト腫瘍アレイにおける組織学的染色は、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される（図３）。抗ＴｎＣクローン１１Ｃ７でのヒト腫瘍アレイにおける組織学的染色は、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される（図４）。
上述の本発明は、明白な理解のために実例及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、これらの説明及び実施例を本発明の範囲の限定と解釈すべきでない。本明細書に引用した全ての特許及び科学文献の開示は、それらの全内容が本明細書に参照により明確に援用される。

Claims (23)

  1. テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合する抗体であって、
    （ｉ）配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
    （ｉｉ）配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
    を含み、種間交差反応性を有する抗体。
  2. （ａ）配列番号４９の重鎖ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号５０の重鎖ＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号５１の重鎖ＣＤＲ３
    を含む重鎖可変領域、並びに
    （ａ）配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ２、及び
    （ｃ）配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ３
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. （ａ）配列番号５２の重鎖ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号５３の重鎖ＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号５４の重鎖ＣＤＲ３
    を含む重鎖可変領域、並びに
    （ａ）配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号４１の軽鎖ＣＤＲ２、及び
    （ｃ）配列番号４２の軽鎖ＣＤＲ３
    を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１に記載の抗体。
  4. 配列番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
  5. 配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１又は３の何れか一項に記載の抗体。
  6. Ｆｃ領域を含むか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の抗体。
  7. 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項１から６の何れか一項に記載の抗体。
  8. ヒト抗体である、請求項１から７の何れか一項に記載の抗体。
  9. 向上したアフィニティーアフィニティーを有する、請求項１から８の何れか一項に記載の抗体。
  10. ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、請求項１から９の何れか一項に記載の抗体。
  11. ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣと結合する、請求項１から１０の何れか一項に記載の抗体。
  12. 指定された全ての種からの標的抗原と、同様のアフィニティーで結合する、請求項１０又は１１の何れか一項に記載の抗体。
  13. 指定された全ての種からの標的抗原と、同様のアフィニティー、特に、１０倍のＫＤ範囲内で結合する、請求項１０から１２の何れか一項に記載の抗体。
  14. 多重特異性抗体である、請求項１から１３の何れか一項に記載の抗体。
  15. 二重特異性抗体である、請求項１から１４の何れか一項に記載の抗体。
  16. 請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体を含む薬学的製剤。
  17. 医薬としての使用のための、請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体。
  18. ＴｎＣの発現を特徴とする疾患の治療における使用のための、請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体。
  19. 前記疾患ががんである、請求項１８に記載の使用のための抗体。
  20. がんを治療するための医薬の製造のための、請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体の使用。
  21. 医薬が、腫瘍細胞又は腫瘍の間質細胞の溶解を誘起するためのものである、請求項２０に記載の使用。
  22. ＴｎＣ発現を特徴とする疾患を有する個体を治療する方法であって、請求項１から１５の何れか一項に記載の抗体又は請求項１６に記載の薬学的製剤の有効量を個体に投与することを含む方法。
  23. 前記疾患ががんである、請求項２２に記載の方法。
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